フナクイムシのＧＨＦ−１セルラーゼとその遺伝子
【課題】フナクイムシの新規セルラーゼと、このセルラーゼ遺伝子を提供する。
【解決手段】フナクイムシTeredo navalisから単離精製された特定のアミノ酸配列からなるGHF-1セルラーゼと、このGHF-1セルラーゼをコードする特定の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【解決手段】フナクイムシTeredo navalisから単離精製された特定のアミノ酸配列からなるGHF-1セルラーゼと、このGHF-1セルラーゼをコードする特定の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明はフナクイムシのGHF-1セルラーゼとこの遺伝子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物細胞壁の主要な構成成分であるセルロースは、地球上に最も多く存在する炭水化物である。セルラーゼ等の酵素によりグルコースに加水分解され、さらに発酵を経てエタノールに変換することが可能であるため、新たなエネルギー資源として期待されている。酵母を利用してグルコースからエタノールを産生するアルコール発酵の技術は既に実用化されていることから、さらに効率よくエタノールを得るためには、活性の高いセルラーゼとそれを大量に生産する技術の開発が望まれている。
【０００３】
セルラーゼの大量生産のための技術として、セルラーゼ遺伝子を大腸菌等の微生物に導入し、この微生物にセルラーゼを産生させる技術が提案されている（例えば、特許文献１）。
【０００４】
このような遺伝子工学的なセルラーゼの製造に使用するセルラーゼ遺伝子としては主に微生物由来のものが知られている。例えば、特許文献１のフミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、バチルス（Bacillus）属微生物（例えば、特許文献２など）、ラクトバクター（Lactobacter）属微生物（特許文献３）、シロアリ共生原生動物（特許文献４）などのセルラーゼ遺伝子が知られている。また、シロアリそれ自体のセルラーゼ遺伝子（特許文献５）も知られている。
【０００５】
さらに、海洋生物であるヤマトシジミCorbicula japonica（非特許文献１）や、ロブスターの一種であるCherax quadricarinatus（非特許文献２）に由来するセルラーゼ遺伝子も報告されている。また、樹木のセルロースを分解してその中に生息するフナクイムシの近縁種である穿孔性二枚貝Psiloteredo headiの共生細菌Teredinobacter turnerdeから単離されたセルラーゼは比活性および熱安定性が高いことも報告されている（非特許文献３）。
【特許文献１】特開平8-56663号公報
【特許文献２】特開2005-287441号公報
【特許文献３】特開2008-48675号公報
【特許文献４】特開2003-70475号公報
【特許文献５】特開平11-46764号公報
【非特許文献１】Sakamoto et al., 2007, Fish. Sci. 73, 675-683
【非特許文献２】Byrne et al., 1999, Gene, 239, 317-324
【非特許文献３】Freer et al., 2001, ACC Symp. Ser. 769, 39-54
【非特許文献４】Sakamoto et al., 2009, Comp. Biochem. Physiol. 152B, 390-396
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
セルラーゼは複数のセルロース分解酵素の総称で、それぞれの酵素の存在比によってセルロース分解活性が大きく変化することが知られている。
【０００７】
前記のとおり、フナクイムシの近縁種である穿孔性二枚貝Psiloteredo headiの共生細菌に由来するセルラーゼは優れたセルロース分解活性を有することから、フナクイムシそれ自体のセルラーゼも高い活性を有することが期待される。
【０００８】
そこで本願発明は、フナクイムシのGHF-1セルラーゼと、このGHF-1セルラーゼ遺伝子、およびこの遺伝子を利用する手段を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明は、前記の課題を解決するものとして以下を提供する。
(１)フナクイムシTeredo navalisから単離精製された、配列番号１のアミノ酸配列からなるGHF-1セルラーゼ。
(２)フナクイムシTeredo navalisのGHF-1セルラーゼをコードし、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(３)前記(２)のポリヌクレオチドを保有する発現ベクター。
(４)前記(３)の発現ベクターが導入された形質転換体細胞。
(５)前記(４)の形質転換体細胞が産生する組換えGHF-1セルラーゼ。
【発明の効果】
【００１０】
本願発明によって、新規のフナクイムシ・GHF-1セルラーゼを等品質かつ大量に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】GHF1セルラーゼのアミノ酸の生物種での差異を示す。↓のE（グルタミン酸）、W（トリプトファン）は酵素活性の中心、灰色部分はフナクイムシのものと同じ部分、＊は完全に一致した部分、他は異なる部分。↓＋灰色/全数＝56％となる。T. navalis フナクイムシ( TnCel 1), Corbicula japonica シジミ( CjCel 1), Aspergilus thaliana 菌類の一種( AtCel 1), Humicola grisea( HgCel 1)。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００１２】
Rneasy Lipid Tissue Kit（Qiagen）をその製造者プロトコールで用い、フナクイムシから高品質のRNAを25μg抽出した。ビーズを満たした2mLマイクロチューブにQIAzol溶解液とフナクイムシ（Teredo navalis）を入れ、Precelleys 24 Tissue Homogenizer（Bertin Technologies, Saint Queentin en Yveline, France）を用いて良く攪拌し、フナクイムシ全身を均質化した。poly A+ RNAの質と容量は、Bechman DU 530 Life Science Spectrophotpmeter(Beckman Coulter, Bea, California, USA)で測定し、SYBR Safe DNA gel stain（Invitrogen, Eugene, Oregon, USA）を含む1％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で変性電気泳動することによって確認した。
【００１３】
トータルRNAから分離したmRNAを逆転写し、cDNAを得た。標的配列は、次世代シークエンサーGenome Sequencer FLX（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）を用い、エマルションPCR（emPCR）とピロシークエンシング（pyrosequencing）法により配列決定した。長いセグメントを短い成分に切断することによって、cDNA断片からランダムcDNAライブラリーを構築した。小断片をラベルし、ビーズに貼り付けた。各ビーズは、油中水滴型エマルジョンの液滴で包埋し、各ビーズ毎にPCR増幅し、数百万のDNAテンプレートのコピーを得た。エマルジョンを壊し、ビーズに結合した二本鎖DNAを変性した一本鎖とした。得られたcDNA鎖のフリー3’末端にシークエンシングプライマーをアニールした。ビーズはさらに、ピロシークエンシング混合物を含むPicoTiterPlate（PTP）の75pLウェル内に単離された。PTPはシークエンサーのフローチャンバーに挿入され、CCDカメラで撮影された。ヌクレオチドはPTPに曝され、cDNA合成とその分析が同時に行なわれた。ピロシークエンシングの主な特徴は、ヌクレオチドの添加後の化学量論的な光発射にある。すなわち、ヌクレオチドの組込みは、スルフリラーゼによって順次にATPに変換される遊離ピロリン酸塩を放出し、発光を促すルシフェリン酸化を生じさせる。放出光子はCCDSカメラで捕捉した。GS FLXは1億塩基対の解読能力を有し、平均解読範囲は240塩基対以上である。ESTsが構築されたために、多くのシークエンスタッグ断片は実際に同一mRNAの異なる部分に対応していた。GS De Novo Assembler Softwareを用いて短いEST配列を解析し、コンティグに再編成した。配列決定の前に標準化しなかったため、異なる転写産物の表示の食い違いは、ESTの冗長性を反映する。実際、シークエンシングによって得られた幾つかのETSは、cDBAが全長または部分的配列であることを理由に、反復的である。同一起源からのDNA配列を重ね合わせて、コンティグを構築し、データはBlast2GO online softwate（http://blast2go.bioinfo.cipf/es/）を用いて解析した。
【００１４】
その結果、フナクイムシのGHF-1セルラーゼcDNAの塩基配列およびアミノ酸配列は配列番号１のとおりであった。また、他の生物種のGHF-1セルラーゼとのアミノ酸配列の比較から、このフナクイムシGHF-1セルラーゼは、ヤマトシジミCorbicula japonica ( CjCel 1)のGHF-1と57％一致していた。また、他の真核生物のセルラーゼとの比較では、活性領域のアミノ酸残基は保存されていた。
【技術分野】
【０００１】
本願発明はフナクイムシのGHF-1セルラーゼとこの遺伝子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物細胞壁の主要な構成成分であるセルロースは、地球上に最も多く存在する炭水化物である。セルラーゼ等の酵素によりグルコースに加水分解され、さらに発酵を経てエタノールに変換することが可能であるため、新たなエネルギー資源として期待されている。酵母を利用してグルコースからエタノールを産生するアルコール発酵の技術は既に実用化されていることから、さらに効率よくエタノールを得るためには、活性の高いセルラーゼとそれを大量に生産する技術の開発が望まれている。
【０００３】
セルラーゼの大量生産のための技術として、セルラーゼ遺伝子を大腸菌等の微生物に導入し、この微生物にセルラーゼを産生させる技術が提案されている（例えば、特許文献１）。
【０００４】
このような遺伝子工学的なセルラーゼの製造に使用するセルラーゼ遺伝子としては主に微生物由来のものが知られている。例えば、特許文献１のフミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、バチルス（Bacillus）属微生物（例えば、特許文献２など）、ラクトバクター（Lactobacter）属微生物（特許文献３）、シロアリ共生原生動物（特許文献４）などのセルラーゼ遺伝子が知られている。また、シロアリそれ自体のセルラーゼ遺伝子（特許文献５）も知られている。
【０００５】
さらに、海洋生物であるヤマトシジミCorbicula japonica（非特許文献１）や、ロブスターの一種であるCherax quadricarinatus（非特許文献２）に由来するセルラーゼ遺伝子も報告されている。また、樹木のセルロースを分解してその中に生息するフナクイムシの近縁種である穿孔性二枚貝Psiloteredo headiの共生細菌Teredinobacter turnerdeから単離されたセルラーゼは比活性および熱安定性が高いことも報告されている（非特許文献３）。
【特許文献１】特開平8-56663号公報
【特許文献２】特開2005-287441号公報
【特許文献３】特開2008-48675号公報
【特許文献４】特開2003-70475号公報
【特許文献５】特開平11-46764号公報
【非特許文献１】Sakamoto et al., 2007, Fish. Sci. 73, 675-683
【非特許文献２】Byrne et al., 1999, Gene, 239, 317-324
【非特許文献３】Freer et al., 2001, ACC Symp. Ser. 769, 39-54
【非特許文献４】Sakamoto et al., 2009, Comp. Biochem. Physiol. 152B, 390-396
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
セルラーゼは複数のセルロース分解酵素の総称で、それぞれの酵素の存在比によってセルロース分解活性が大きく変化することが知られている。
【０００７】
前記のとおり、フナクイムシの近縁種である穿孔性二枚貝Psiloteredo headiの共生細菌に由来するセルラーゼは優れたセルロース分解活性を有することから、フナクイムシそれ自体のセルラーゼも高い活性を有することが期待される。
【０００８】
そこで本願発明は、フナクイムシのGHF-1セルラーゼと、このGHF-1セルラーゼ遺伝子、およびこの遺伝子を利用する手段を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明は、前記の課題を解決するものとして以下を提供する。
(１)フナクイムシTeredo navalisから単離精製された、配列番号１のアミノ酸配列からなるGHF-1セルラーゼ。
(２)フナクイムシTeredo navalisのGHF-1セルラーゼをコードし、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(３)前記(２)のポリヌクレオチドを保有する発現ベクター。
(４)前記(３)の発現ベクターが導入された形質転換体細胞。
(５)前記(４)の形質転換体細胞が産生する組換えGHF-1セルラーゼ。
【発明の効果】
【００１０】
本願発明によって、新規のフナクイムシ・GHF-1セルラーゼを等品質かつ大量に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】GHF1セルラーゼのアミノ酸の生物種での差異を示す。↓のE（グルタミン酸）、W（トリプトファン）は酵素活性の中心、灰色部分はフナクイムシのものと同じ部分、＊は完全に一致した部分、他は異なる部分。↓＋灰色/全数＝56％となる。T. navalis フナクイムシ( TnCel 1), Corbicula japonica シジミ( CjCel 1), Aspergilus thaliana 菌類の一種( AtCel 1), Humicola grisea( HgCel 1)。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００１２】
Rneasy Lipid Tissue Kit（Qiagen）をその製造者プロトコールで用い、フナクイムシから高品質のRNAを25μg抽出した。ビーズを満たした2mLマイクロチューブにQIAzol溶解液とフナクイムシ（Teredo navalis）を入れ、Precelleys 24 Tissue Homogenizer（Bertin Technologies, Saint Queentin en Yveline, France）を用いて良く攪拌し、フナクイムシ全身を均質化した。poly A+ RNAの質と容量は、Bechman DU 530 Life Science Spectrophotpmeter(Beckman Coulter, Bea, California, USA)で測定し、SYBR Safe DNA gel stain（Invitrogen, Eugene, Oregon, USA）を含む1％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で変性電気泳動することによって確認した。
【００１３】
トータルRNAから分離したmRNAを逆転写し、cDNAを得た。標的配列は、次世代シークエンサーGenome Sequencer FLX（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）を用い、エマルションPCR（emPCR）とピロシークエンシング（pyrosequencing）法により配列決定した。長いセグメントを短い成分に切断することによって、cDNA断片からランダムcDNAライブラリーを構築した。小断片をラベルし、ビーズに貼り付けた。各ビーズは、油中水滴型エマルジョンの液滴で包埋し、各ビーズ毎にPCR増幅し、数百万のDNAテンプレートのコピーを得た。エマルジョンを壊し、ビーズに結合した二本鎖DNAを変性した一本鎖とした。得られたcDNA鎖のフリー3’末端にシークエンシングプライマーをアニールした。ビーズはさらに、ピロシークエンシング混合物を含むPicoTiterPlate（PTP）の75pLウェル内に単離された。PTPはシークエンサーのフローチャンバーに挿入され、CCDカメラで撮影された。ヌクレオチドはPTPに曝され、cDNA合成とその分析が同時に行なわれた。ピロシークエンシングの主な特徴は、ヌクレオチドの添加後の化学量論的な光発射にある。すなわち、ヌクレオチドの組込みは、スルフリラーゼによって順次にATPに変換される遊離ピロリン酸塩を放出し、発光を促すルシフェリン酸化を生じさせる。放出光子はCCDSカメラで捕捉した。GS FLXは1億塩基対の解読能力を有し、平均解読範囲は240塩基対以上である。ESTsが構築されたために、多くのシークエンスタッグ断片は実際に同一mRNAの異なる部分に対応していた。GS De Novo Assembler Softwareを用いて短いEST配列を解析し、コンティグに再編成した。配列決定の前に標準化しなかったため、異なる転写産物の表示の食い違いは、ESTの冗長性を反映する。実際、シークエンシングによって得られた幾つかのETSは、cDBAが全長または部分的配列であることを理由に、反復的である。同一起源からのDNA配列を重ね合わせて、コンティグを構築し、データはBlast2GO online softwate（http://blast2go.bioinfo.cipf/es/）を用いて解析した。
【００１４】
その結果、フナクイムシのGHF-1セルラーゼcDNAの塩基配列およびアミノ酸配列は配列番号１のとおりであった。また、他の生物種のGHF-1セルラーゼとのアミノ酸配列の比較から、このフナクイムシGHF-1セルラーゼは、ヤマトシジミCorbicula japonica ( CjCel 1)のGHF-1と57％一致していた。また、他の真核生物のセルラーゼとの比較では、活性領域のアミノ酸残基は保存されていた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(１)フナクイムシTeredo navalisから単離精製された、配列番号１のアミノ酸配列からなるGHF-1セルラーゼ。
【請求項２】
フナクイムシTeredo navalisのGHF-1セルラーゼをコードし、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２記載のポリヌクレオチドを保有する発現ベクター。
【請求項４】
請求項３記載の発現ベクターが導入された形質転換体細胞。
【請求項５】
請求項４記載の形質転換体細胞が産生する組換えGHF-1セルラーゼ。
【請求項１】
(１)フナクイムシTeredo navalisから単離精製された、配列番号１のアミノ酸配列からなるGHF-1セルラーゼ。
【請求項２】
フナクイムシTeredo navalisのGHF-1セルラーゼをコードし、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２記載のポリヌクレオチドを保有する発現ベクター。
【請求項４】
請求項３記載の発現ベクターが導入された形質転換体細胞。
【請求項５】
請求項４記載の形質転換体細胞が産生する組換えGHF-1セルラーゼ。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−２００１４５（Ｐ２０１１−２００１４５Ａ）
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６９２５０（Ｐ２０１０−６９２５０）
【出願日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【出願人】（３９１０４２７８２）日本エヌ・ユー・エス株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【出願人】（３９１０４２７８２）日本エヌ・ユー・エス株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]