フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法
【課題】フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法。
【解決手段】サンプル微小球体の測定中、測定システムのパラメータを監視するステップを含む。また、監視を基にしてリアル・タイムでパラメータを変更するステップを含む。別の方法は、測定システムの近傍の温度を監視するステップを含み、経験的に導出されたデータを使用して温度に応答してアバランシェ・フォト・ダイオードのバイアス電圧を変更するステップを含む。また、特性曲線を使用して前記温度に応答して光電子増倍管の出力信号を変更するステップを含む。いくつかの方法は、その中にサンプル微小球体が配置されている流体の温度を監視するステップを含む。流体は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムを通って流れる。この方法はまた、その温度での流体の粘性から測定システム内のサンプル微小球体の速度を決定するステップを含む。
【解決手段】サンプル微小球体の測定中、測定システムのパラメータを監視するステップを含む。また、監視を基にしてリアル・タイムでパラメータを変更するステップを含む。別の方法は、測定システムの近傍の温度を監視するステップを含み、経験的に導出されたデータを使用して温度に応答してアバランシェ・フォト・ダイオードのバイアス電圧を変更するステップを含む。また、特性曲線を使用して前記温度に応答して光電子増倍管の出力信号を変更するステップを含む。いくつかの方法は、その中にサンプル微小球体が配置されている流体の温度を監視するステップを含む。流体は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムを通って流れる。この方法はまた、その温度での流体の粘性から測定システム内のサンプル微小球体の速度を決定するステップを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法に関する。ある実施態様は、パラメータの監視に基づいてリアル・タイムでフロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを変更することを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の説明と例は、この節にそれらを含めていることにより、従来技術であるとは限らない。
【０００３】
一般に、フロー・サイトメータは、フロー・チャンバを直線状に通過するときのレーザ励起されたポリスチレン・ビードまたはセルの蛍光強度の測定を提供する。しかし、フロー・サイトメータは、他の粒子の１つまたは複数の特性の測定を提供するために使用されることもある。いくつかのシステムは、励起源に対して９０°または１８０°で粒子によって散乱される光のレベルの測定、粒子の「同一性」である分類を決定するために使用される蛍光性の２つ以上の測定、当該化学反応を定量化するために通常使用される「レポータ」として公知である追加の蛍光性の測定を行うように構成されている。蛍光性測定のそれぞれは異なる波長で行われる。
【０００４】
フロー・サイトメータ・タイプ測定機器の測定能力が改善されたため、フロー・サイトメータが有用な測定を提供することができる用途が、劇的に増加した。たとえば、フロー・サイトメータは、生物学的分析法（たとえば置換または比較分析、非比較分析、酵素分析）、核酸解析、コンビナトリアル・ケミストリなどの用途のためのデータを提供するのにますます有用になっている。特に、フロー・サイトメータ測定の人気は、他の分析方法（たとえば従来型の酵素と結合された免疫付着剤分析「ＥＬＩＳＡ」法など）と特に比較して、分析が行われる速度のため、劇的に増加している。
【０００５】
通常の状況下では、フロー・サイトメータの較正は、正確であり信頼性の高い分析結果を得るための適切な使用と測定のために機器を準備するための１つまたは複数の準備ステップとして行われる。また、各フロー・サイトメータの蛍光性チャネルが読み取るために較正されていない場合、サンプルの間での変動源に関する保証はない。ロバストで完全な較正方法が採用されていない場合、ある機器が異なる日に同じサンプルに対して異なる読取値を与えることもある。同様に、フロー・サイトメータが、サンプル内のセル間を同定し、区別するより良い測定を提供するが、正確に調整されている場合でさえも２つの機器が同じ結果を提供するという保証はなく、医療機器としてのその使用は減少する。
【０００６】
したがって、フロー・サイトメータを較正するための多種多様な方法が開発されてきた。最初に、較正の精度を増加させるために較正でのオペレータの関与のレベルを減少させる較正方法を開発するためにかなりの作業が行われた。この作業は、大部分で、フロー・サイトメータの較正の多くのステップの自動化に至った。また、較正の精度を他の方式で改善するためにかなりの作業が行われた。たとえば、この作業は、一様かつ一定の特性を有する較正標準を使用するなどした較正の進行に至った。特に、生物学的サンプルの特性は、時間とともに変化することがあるため、フロー・サイトメータのための生物学的較正標準が、より安定した特性を有する合成較正標準（たとえばポリマー微小球体(microsphere)または微小粒子など）に一般に置換される。また、通常較正微小球体は、試験微小球体の特性とほぼ同様の（すなわちできる限り近い）特性（たとえば、サイズ、体積、表面特性、粒度特性、反射率、蛍光性など）を有する。このような較正微小球体は、試験中に予想される値に可能な限り近い値で較正を行うことによってフロー・サイトメータの精度を増加させると信じられていた。
【０００７】
フロー・サイトメータの較正を改善しようとする試みは、較正によって考慮されるフロー・サイトメータのパラメータの数を増加させることにも至っている。たとえば、フロー・サイトメータ測定システムのレーザ励起部、検知器、電子部品は、時間とともに変化し、このことは最終的な測定値に影響を与える。したがって、通常、フロー・サイトメータのこれらの、ときにはその他のパラメータが、較正方法によって考慮される。
【０００８】
制御することがより困難である他のパラメータもまた、フロー・サイトメータの測定に影響を与える。このようなパラメータの１つはサンプル速度である。サンプル速度を測定するための方法の一例が、本明細書で完全に説明されるかのように参照によって本明細書に組み込まれる、Ｏｒｔｙｎ他に対する米国特許第６，５３２，０６１号に示されている。この方法では、物体が、感知または測定容器を通って流される流体の流れの中に引き込まれる。これらの測定の各場合で、ほぼ一様なピッチを有する光学格子が、移動中の物体から受信される光を変調させるために採用される。変調された光は、電気信号に変換され、デジタル化されて、次に、物体の速度を決定するために高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を使用して処理される。しかし、サンプル速度を測定するためにＯｒｔｙｎ他によって記載された方法とシステムにはいくつかの欠点がある。たとえば、この方法は、かなり複雑な光学格子とソフトウェアを必要とする。また、光学格子のために必要とされる精度や製造の複雑性のため、光学格子はかなり高価になるかもしれない。また、サンプル速度測定は、たとえば、移動中の物体によって検知される光の光学的ひずみのため、いくらか不正確である。
【０００９】
しかし、フロー・サイトメータ測定内で最も重大な誤差の寄与は、一般に温度変化によって生じる。また、フロー・サイトメータによって行われる測定への温度変化の影響は、現在使用可能な較正方法によって十分に対処されないことが発見された。たとえば、Ｏｒｔｙｎ他によって記載された方法とシステムは、いくつかのパラメータを修正しようと試みているが、温度変化と温度変化がフロー・サイトメータの測定にどのように影響を与えるかを考慮していない。したがって、多種多様な較正方法が使用可能であるが、これらの方法のそれぞれへの追加の改良が、異なるフロー・サイトメータ測定中または個々のフロー・サイトメータ測定中の温度変化をより正確に計上することによって行われることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、リアル・タイムの較正スキームを作成するために結合されることができる、フロー・サイトメータ測定システムの少なくとも主要な誤差に寄与する構成要素を制御するための方法を開発することが有利である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記で詳細に説明したように、フロー・サイトメータで最も重要な誤差の寄与は、一般に温度変化によって生じる。温度が測定される量であるため、その影響の背後の物理学は公知であり、最も危険であるこれらの誤差源を減少させること、さらには無効にすることさえも可能である。
【００１２】
いくつかの測定誤差に寄与するもの、および測定誤差に寄与するものに対するリアル・タイム較正技術が確認された。また、微小球体サンプルの混合に含まれる、測定されているものと少なくともわずかに異なる直径を介して独自に同定可能である較正微小球体を使用するリアル・タイムの微調整方法が、作成された。微調整プロセスの追加の特徴は、システムの健康性のリアル・タイムの同定、１つまたは複数のチャネル内での非直線性の修正、および／またはフロー・サイクロメータ測定システムの有用なレポータ・ダイナミック・レンジのかなりの拡張を含んでいる。ここに記載した実施態様は、主に温度によるシステム変動を補償するために有用であり、したがって較正された動作範囲を拡張する。
【００１３】
また、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法のいくつかの異なる実施態様が、本明細書に記載されていることに留意されたい。方法のそれぞれは、別々に使用され、実行されてもよいことを理解されたい。また、２つ以上の方法が、たとえば、測定システムの様々な構成要素の変化および／または測定システムの所望の精度に応じて組み合わせて使用または実行されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本明細書に記載された方法を実施するために使用されることができる測定システムの一例の概略図である。
【図２】温度の関数としての、１３０ボルトの逆バイアス電圧（Ｖ６０）を有するＡＰＤの応答を示す複数のバイアス曲線の一例を示すグラフである。
【図３】温度の関数としての様々なＰＭＴの応答を示すグラフである。
【図４】ＰＭＴバイアス電圧の対数の関数としてのＰＭＴのゲインの対数の一例を示すグラフである。
【図５】フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法の一実施形態を示すフロー・チャートである。
【図６】本明細書に記載された少なくとも１つの方法を実施するために使用されることのできる測定システムの一部分の一実施形態の断面図を示す概略図である。
【図７】本明細書に記載された方法の実施形態の１つで測定されることができるパルス列（すなわち、異なる時間で測定された散乱光）の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法に関する。この方法は、測定システムによるサンプル微小球体の測定中、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを監視するステップを含む。この方法はまた、監視を基にしてリアル・タイムで１つまたは複数のパラメータを変更するステップを含む。
【００１６】
一実施態様では、１つまたは複数のパラメータを監視するステップが、較正微小球体の測定を使用して１つまたは複数のパラメータを監視するステップを含んでいる。較正微小球体が、サンプル微小球体の直径とは異なる（たとえばそれよりも小さい）直径を有する。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のパラメータが、測定システムの検知器によって作成された出力信号を含んでいる。出力信号は、サンプル微小球体によって散乱された光に応答する。
【００１７】
別の実施態様では、１つまたは複数のパラメータを監視するステップが、較正微小球体の測定を使用して１つまたは複数のパラメータを監視するステップを含んでいる。この実施態様では、較正微小球体が、サンプル微小球体の直径とは異なる（たとえばそれよりも小さい）直径を有し、較正微小球体の少なくともいくつかが異なるスペクトル・アドレスを有する。このような一実施態様では、１つまたは複数のパラメータが、測定システムのダイナミック・レンジを備えてもよい。別の実施態様では、パラメータを変更するステップが、測定システムの１つまたは複数のチャネルの線形ダイナミック・レンジを拡張するステップを含んでいる。追加の実施態様では、１つまたは複数のパラメータが、システム健全性の測定を含んでいる。システム健全性の測定が、分類チャネルの健全性、レポータ・チャネルの健全性、またはそれらの組合せを含んでいる。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のパラメータが、サンプル微小球体の測定の線形性を含んでいる。このような実施態様では、測定が、分類チャネルの測定、レポータ・チャネルの測定、またはそれらの組合せを含んでいる。このような別の実施態様では、パラメータを変更するステップが、測定のいかなる非線形性もほぼ修正するステップを含んでいる。
【００１８】
いくつかの実施態様では、パラメータが、測定システムのアバランシェ・フォト・ダイオードのパラメータを含んでいる。このような一実施態様の方法は、経験的に導出されたデータを使用してパラメータを変更するステップで使用される修正係数を決定するステップをさらに含んでいる。別の実施態様では、複数のパラメータが、測定システムの光電子増倍管のパラメータを含んでいる。
【００１９】
さらなる実施態様では、パラメータがサンプル微小球体の速度を含んでいる。このような一実施態様では、パラメータを監視するステップが、サンプル微小球体が中に配置されている流体の温度を監視するステップ、温度からサンプル微小球体の速度を決定するステップを含んでいる。いくつかの実施態様では、方法は、サンプル微小球体の測定の前に１つまたは複数のパラメータを較正するステップをも含んでいる。上記に記載した方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載した他のいかなるステップをも含んでいる。
【００２０】
別の実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法に関する。この方法は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの近傍の温度を監視するステップを含む。この方法はまた温度によるアバランシェ・フォト・ダイオードのゲインの変化をほぼ修正するために、経験的に導出されたデータを使用して温度に応答して測定システムのアバランシェ・フォト・ダイオードのバイアス電圧を変更するステップを含む。
【００２１】
一実施態様では、この方法はまた、１つまたは複数の温度でのアバランシェ・フォト・ダイオードに対してほぼ一定の光レベルを付加することによって経験的に導出されたデータを生成するステップと、１つまたは複数の温度での多重バイアス電圧に対するアバランシェ・フォト・ダイオードの電流出力を記録するステップをさらに含む。別の実施態様では、パラメータを変更するステップが、測定システムによってサンプル測定が行われる前に行われる。このような実施態様では、バイアス電圧が、サンプル測定全体を通じてほぼ一定であってもよい。異なる実施態様では、パラメータを監視するステップとパラメータを変更するステップがリアル・タイムで行われる。
【００２２】
いくつかの実施態様では、方法はまた、公知の強度の光を放出する較正微小球体が測定システムによって測定されている間、所定の信号レベルがアバランシェ・フォト・ダイオードから得られるまで、アバランシェ・フォト・ダイオードのバイアス電圧を変更するステップを含んでいる。このような一実施態様では、方法は、アバランシェ・フォト・ダイオードのための逆バイアス電圧、所定の信号レベルでのバイアス電圧、温度から、アバランシェ・フォト・ダイオードのための対応する相対電流を決定するステップをさらに含んでいる。方法のこの実施態様は、対応する相対電流、温度、逆バイアス電圧、経験的に導出されたデータを使用してバイアス電圧を決定するステップをさらに含んでいる。上記に記載された方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００２３】
追加の実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法に関する。この方法は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの近傍の温度を監視するステップを含む。方法はまた、光電子増倍管の出力信号のゲインの変化を実質上修正するために、光電子増倍管に対する特性曲線を使用して温度に応答して測定システムの光電子増倍管の出力信号を変更するステップとを含む。光電子増倍管のゲインが、温度に応答して近似的に線形に変化する。いくつかの実施態様では、光電子増倍管が、測定システムのレポータ・チャネルの一部である。別の実施態様では、光電子増倍管のための特性曲線が、光電子増倍管の検知波長と陰極構成とともに変化する。上記に記載された方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００２４】
別の実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法の異なる実施態様にさらに関する。この方法は、測定システムの光電子増倍管の電圧を第１の値と第２の値に設定するステップを含む。方法はまた、第１と第２の値での光電子増倍管の出力電流を測定するステップを含む。また、この方法は、第１と第２の値の対数対第１と第２の値の出力電流の対数から光電子増倍管の較正電圧を決定するステップを含む。本方法はさらに、較正電圧を光電子増倍管に印加するステップを含む。本方法はまた、光電子増倍管の１つまたは複数のパラメータが所定の公差内にあるかを否か決定するために光電子増倍管を試験するステップを含む。上記に記載された方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００２５】
追加の実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための別の方法に関する。この方法は、連続的な近似を使用して測定システムの検知器の較正電圧を決定するステップを含む。方法はまた、較正電圧を検知器に印加するステップを含む。一実施態様では、検知器が、アバランシェ・フォト・ダイオードを備えてもよい。異なる実施態様では、検知器が、光電子増倍管を備えてもよい。
【００２６】
一実施態様では、方法は、較正電圧を検知器の遮断電圧と比較するステップと、較正電圧が遮断電圧を超えているか否かを決定するステップを繰り返すステップとを含んでいる。方法の異なる実施態様は、検知器信号レベルを決定するために検知器サンプルを収集し、処理するステップを含む。このような一実施態様では、方法は、検知器信号レベルを較正目標信号レベルと比較し、検知器信号レベルが、較正目標信号レベルを超えている場合、検知器のバイアス電圧を低下させ、較正電圧を決定するステップを繰り返すステップを含んでいる。別のこのような実施態様では、方法は、検知器信号レベルを、較正目標信号レベルと比較し、検知器信号レベルが、較正目標信号レベルの所定の範囲内にない場合、すべての所望の検知器電圧レベルが達成されるまで、較正電圧を決定するステップを繰り返すステップを含んでいる。上記に記載された方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００２７】
さらなる実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための異なる方法に関する。この方法は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムを通って流れる流体の温度を監視するステップを含む。サンプル微小球体が流体内に配置される。本方法はまた、温度での流体の粘性から測定システム内のサンプル微小球体の速度を決定するステップを含む。
【００２８】
一実施態様では、方法は、サンプル微小球体の１つが、速度を基にして測定システムの検知ウィンドウ内に存在する時間の長さを決定するステップを含んでいる。いくつかの実施態様では、方法は、サンプル微小球体の１つが速度を基にした測定システムの一方の検知ウィンドウから測定システムの別の検知ウィンドウへ移動する時間の長さを決定するステップを含んでいる。別の実施態様では、方法は、サンプル微小球体の１つが、速度を基にした測定システムの検知ウィンドウ内にいつ存在するかを決定するステップを含んでいる。さらに別の実施態様では、方法は、速度を補償するための測定システムの１つまたは複数の検知ウィンドウに対してサンプリング間隔を制御するステップを含んでいる。
【００２９】
追加の実施態様では、パラメータを監視するステップと速度を決定するステップが、測定システムによるサンプル微小球体の測定を実行する前に行われる。いくつかの実施態様では、方法は、速度から測定システムの出力信号の１つまたは複数の特性を決定するステップを含んでいる。このような一実施態様では、方法は修正係数を使用して速度による誤差に対して出力信号を修正するステップを含んでいる。修正係数が経験的な測定を使用して決定される。別の実施態様では、測定システムが、サンプル微小球体の測定中、流体のほぼ一定の圧力を維持するように構成されている。
【００３０】
一実施態様では、速度を決定するステップが、表から、ポアズイユの式から、または速度対温度の所定の値から速度を決定するステップを含んでいる。このようないくつかの実施態様では、方法は、速度を基にしたサンプル微小球体の測定中、流体の圧力を制御するステップを含んでいる。上記に記載された方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００３１】
異なる実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための別の方法に関する。この方法は、微小球体が、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの第１の検知ウィンドウから、測定システムの第２の検知ウィンドウへ移動する時間を測定するステップを含む。本方法はまた、時間がほぼ一定であるように測定システムに付加される圧力を変更するステップを含む。一実施態様では、時間は平均時間である。微小球体はサンプル微小球体または較正微小球体であってもよい。時間を測定するステップが、第１と第２の検知ウィンドウ内の微小球体によって散乱される光を測定するステップを含んでいる。別の実施態様では、時間を測定するステップが、１つの検知器で第１と第２の検知ウィンドウ内の微小球体によって散乱される光を測定するステップを含んでいる。第１と第２の検知ウィンドウ内の微小球体によって散乱された光が、１つのビーム・スプリッタによって１つの検知器へ向けられてもよい。本方法は、リアル・タイムで行われても行われなくてもよい。上記に記載された方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００３２】
さらなる実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための異なる方法に関する。この方法は、微小球体が、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの第１の検知ウィンドウから、測定システムの第２の検知ウィンドウへ移動する平均時間を測定するステップを含む。微小球体が、サンプル微小球体、較正微小球体、または較正微小球体とサンプル微小球体を含んでいる。本方法はまた、基準微小球体が第１の検知ウィンドウから第２の検知ウィンドウへ移動した基準時間と平均時間を比較するステップを含む。また、本方法は、平均時間と基準時間の間の差が所定の値よりも大きい場合、測定システムに付加される圧力を変更するステップを含む。
【００３３】
一実施態様では、付加される圧力を変更するステップが、平均時間が基準時間よりも大きい場合、付加される圧力を増加させるステップを含む。別法として、付加される圧力を変更するステップが、平均時間が基準時間よりも小さい場合、付加される圧力を低下させるステップを含む。いくつかの実施態様では、所定の値が、測定システムの公知の時間変動機構を補償するように選択される。この方法は、リアル・タイムで行われても行われなくてもよい。上記に記載された方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００３４】
本発明の他の目的および利点は、以下の詳細な説明を読み、添付の図面を参照にすれば明らかにあるであろう。
【００３５】
本発明は、様々な修正形態と代替となる形態が可能であるが、その特定の実施形態が図面で一例として示されており、ここで詳細に説明される。しかし、図面とそれに対する詳細な説明は、本発明をここに開示された特定の形態に限定するように意図されておらず、逆に、本発明は、頭記の特許請求の範囲で定義されたような本発明の精神および範囲内にあるすべての修正形態、等価物、代替形態をカバーするものであることを理解されたい。
【００３６】
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法のいくつかの異なる実施形態が、ここで説明される。上記で述べたように、方法のそれぞれは、別々に使用され、実行される。また、方法の２つ以上が、たとえば、測定システムの様々な構成要素の変動性および／または測定システムの所望の精度に応じて、組み合わせて使用または実行されてもよい。
【００３７】
実施形態は、微小球体またはポリスチレン・ビードに関してここで説明されているが、測定システムと方法は、マイクロ粒子、金ナノ粒子、ビード、マイクロ・ビード、ラテックス粒子、ラテックス・ビード、蛍光ビード、蛍光粒子、着色粒子、着色ビード、セルとともに使用されてもよいことを理解されたい。微小球体は、分子反応のための媒体の働きをする。適切な微小球体、ビード、粒子の例が、本明細書で完全に説明されるかのように参照によって組み込まれる、Ｆｕｌｔｏｎに対する米国特許第５７３６３３０号、Ｃｈａｎｄｌｅｒ他に対する第５９８１１８０号、Ｆｕｌｔｏｎに対する第６０５７１０７号、Ｃｈａｎｄｌｅｒ他に対する第６２６８２２２号、Ｃｈａｎｄｌｅｒ他に対する第６４４９５６２号、Ｃｈａｎｄｌｅｒ他に対する第６５１４２９５号、Ｃｈａｎｄｌｅｒ他に対する第６５２４７９３号、Ｃｈａｎｄｌｅｒに対する第６５２８１６５号に示されている。本明細書に記載された測定システムと方法は、これらの特許に記載された微小球体、ビード、粒子のいずれかとともに使用されてもよい。また、フロー・サイトメトリで使用するための微小球体は、テキサス州オースチンのＬｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．などの製造業者から得られる。「ビード」、「微小球体」という用語は、本明細書では交換可能に使用されている。
【００３８】
図１は、本明細書に記載された方法を行うために使用される測定システムの一例を示している。特に、図１に示した測定システムの１つまたは複数のパラメータは、本明細書に記載された方法に従って決定、監視、変更、および／または制御される。本明細書に記載された図面は一定の縮尺で描かれていないことに留意されたい。特に、図面の要素のいくつかの縮尺は、要素の特性を強調するために大きく誇張されている。測定システムのいくつかの要素は、明確化のために図面に含まれない。
【００３９】
図１では、測定システムが、微小球体１０がそれを通って流れるキュベット１２の断面を通る平面に沿って示されている。ある例では、キュベットは、標準的なフロー・サイトメータで使用されているものなどの標準的なクオーツ・キュベットである。しかし、他の適切なタイプの視認または移送チャンバが、解析用のサンプルを移送するために使用されてもよい。測定システムは、光源１４を備える。光源１４は、レーザなどの当技術分野で公知のいずれかの適切な光源である。光源は、青色光または緑色光などの１つまたは複数の波長を有する光を放出するように構成されてもよい。光源１４は、微小球体がキュベットを通って流れるとき微小球体を照射するように構成される。照射は、微小球体に１つまたは複数の波長または波長域を有する蛍光を放出させる。いくつかの実施形態では、システムは、光源からの光を微小球体または流路上に合焦させるように構成された１つまたは複数のレンズ（図示せず）を備えている。システムはまた、２つ以上の光源を有してもよい。一実施形態では、光源は、異なる波長または波長域を有する光（たとえば、青色光および緑色光）で微小球体を照射するように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、光源は、異なる方向で微小球体を照射するように構成されてもよい。
【００４０】
微小球体から前方に散乱された光は、折りミラー１８または別の適切な光を向ける構成要素によって検知システム１６へ向けられる。別法として、検知システム１６は、前方に散乱された光の経路内に直接配置されてもよい。このように、折りミラーまたはその他の光検知構成要素は、システム内に備えられなくてもよい。一実施形態では、前方に散乱された光は、図１に示すように、光源１４によって照射方向から約１８０°の角度で微小球体によって散乱された光であってもよい。前方に散乱された光の角度は、光源からの入射光が検知システムの光感受性の表面に影響を与えることのないように、照射方向から厳密に１８０°でなくてもよい。たとえば、前方に散乱された光は、照射方向から１８０°よりも小さいまたは大きい角度で微小球体によって散乱された光（たとえば、約１７０°、約１７５°、約１８５°、または約１９０°の角度で散乱された光）である。
【００４１】
照射方向から約９０°の角度で微小球体によって散乱された光も収集される。一実施形態では、この散乱された光が、１つまたは複数のビーム・スプリッタまたはダイクロイックミラーによって２つ以上の光線に分離される。たとえば、照射方向に対して約９０°の角度で散乱された光が、ビーム・スプリッタ２０によって２つの異なる光線に分離される。２つの異なる光線が、４つの異なる光線を作成するためにビーム・スプリッタ２２、２４によって再び分離される。光線のそれぞれは、１つまたは複数の検知器を備える異なる検知システムへ向けられる。たとえば、４つの光線のうちの１つが、検知システム２６へ向けられてもよい。検知システム２６は、微小球体によって散乱された光を検知するように構成される。
【００４２】
検知システム１６および／または検知システム２６によって検知される散乱された光は、光源によって照射されている粒子の体積にほぼ比例する。したがって、検知システム１６の出力信号および／または検知システム２６の出力信号が、照射ゾーンまたは検知ウィンドウ内にある粒子の直径を決定するために使用される。また、検知システム１６および／または検知システム２６の出力信号が、互いに重なっているまたは照射ゾーンをほぼ同時に通過する２つ以上の粒子を同定するためにも使用される。したがって、このような粒子は、他のサンプル微小球体と較正微小球体とは区別される。さらに、検知システム１６および／または検知システム２６の出力信号が、サイズに基づいて本明細書に記載されるようにサンプル微小球体と較正微小球体を区別するためにも使用される。
【００４３】
他の３つの光線が、検知システム２８、３０、３２へ向けられる。検知システム２８、３０、３２は、微小球体によって放出される蛍光を検知するように構成される。検知システムのそれぞれは、異なる波長と異なる波長範囲の蛍光を検知するように構成されてもよい。たとえば、検知システムのあるものが緑色蛍光を検知するように構成される。検知システムの別のものが、黄橙色蛍光を検知するように構成され、他の検知システムが赤色蛍光を検知するように構成されてもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態では、スペクトル・フィルタ３４、３６、３８が、それぞれ検知システム２８、３０、３２と結合されている。スペクトル・フィルタは、検知システムがそれを検知するように構成されているもの以外の波長の蛍光を阻止するように構成されてもよい。また、１つまたは複数のレンズ（図示せず）が、検知システムのそれぞれと光学的に結合されてもよい。レンズは、散乱された光または放出された蛍光を検知器の光感受性の表面上に合焦するように構成される。
【００４５】
検知器の出力電流は、それに入射する蛍光に比例し、電流パルスを結果として生じさせる。電流パルスは、電圧パルスに変換され、ローパス・フィルタをかけられ、その後Ａ／Ｄ変換器によってデジタル化される。ＤＳＰなどのプロセッサ４０が、蛍光の大きさを表す数を作成するためにパルスの下の面積を積分する。また、プロセッサは、本明細書に記載された追加の機能（たとえば、フロー・サイトメータ・タイプ測定システム１つまたは複数のパラメータを監視すること、１つまたは複数のパラメータを監視されたパラメータに基づいてリアル・タイムで変更することなど）を行ってもよい。図１に示すように、プロセッサ４０は、伝送媒体４２を介して検知器２６と結合されている。プロセッサ４０は、伝送媒体４２やＡ／Ｄ変換器などの１つまたは複数の他の構成要素（図示せず）を介して間接的に検知器２６と結合されてもよい。プロセッサは、同様にしてシステムの他の検知器と結合されてもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、微小球体によって放出された蛍光から発生される出力信号が、微小球体の同一性と微小球体の表面上で起こっている反応についての情報を決定するために使用されてもよい。たとえば、検知システムのうちの２つの出力信号が微小球体の同一性を決定するために使用され、他の検出システムの出力信号が、微小球体の表面上で起こっている反応を決定するために使用されてもよい。したがって、検知器とスペクトル・フィルタの選択は、微小球体に組み込まれているか結合されている色素のタイプ（すなわち反応に含まれる反応剤に組み込まれているか結合されている色素）に応じて様々であってもよい。
【００４７】
サンプル微小球体の同一性を決定するために使用される検知システム（たとえば、検知システム２８および３０）は、ＡＰＤ、ＰＭＴまたは別の光検知器であってよい。ＡＰＤは、本明細書に記載されているような温度の関数としてのゲイン変動に対してリアル・タイムで修正されてもよい。微小球体の表面で起こっている反応を同定するために使用される検知システム（たとえば検知システム３２）は、ＰＭＴ、ＡＰＤ、または別の形態の光検知器であってよい。ＰＭＴは、本明細書に記載されているようなＰＭＴの出力信号に適用できるＰＭＴ特性曲線から導出された単純な乗数を使用して修正されてもよい。検知器と測定システムは、本明細書に記載されているようにさらに構成されてもよい。
【００４８】
図１のシステムは、異なる色素特性を有する微小球体の間を区別するための２つの異なる検知ウィンドウを有する２つの検知システムを備えるように示されているが、システムは３つ以上のこのような検知ウィンドウ（すなわち、３つの検知ウィンドウ、４つの検知ウィンドウなど）を備えてもよいことを理解されたい。このような実施形態では、システムは、追加のビーム・スプリッタや、他の検知ウィンドウを有する追加の検知システムを備えてもよい。また、スペクトル・フィルタおよび／またはレンズが、追加の検知システムのそれぞれと結合されてもよい。
【００４９】
別の実施形態では、システムは、微小球体の表面上で反応された異なる材料の間を区別するように構成された２つ以上の検知システムを備えてもよい。異なる反応剤材料は、微小球体の色素特性とは異なる色素特性を有していてもよい。
【００５０】
本明細書に記載された方法を行うために使用される測定システムの追加の例が、本明細書で完全に説明されるかのように参照によって組み込まれる、Ｃｈａｎｄｌｅｒ他に対する米国特許第５９８１１８０号、Ｃｈａｎｄｌｅｒに対する第６０４６８０７号、Ｃｈａｎｄｌｅｒに対する第６１３９８００号、Ｃｈａｎｄｌｅｒに対する第６３６６３５４号、Ｃｈａｎｄｌｅｒに対する第６４１１９０４号、Ｃｈａｎｄｌｅｒ他に対する第６４４９５６２号、およびＣｈａｎｄｌｅｒ他に対する第６５２４７９３号に示されている。本明細書に記載された測定システムは、これらの特許に記載されているようにさらに構成されてもよい。
【００５１】
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムでは、散乱された光とビードの同一性の検知は、光センサとしてのアバランシェ・フォト・ダイオード（ＡＰＤ）を使用して一般に行われる。ＡＰＤは、ＡＰＤの出力電流レベルすなわち「ゲイン」が、逆バイアス電圧の印加を通じて広範囲にわたって変化するため、他の検知器よりも有利である。一定数の入力光子の結果として流れる電子の観点から表現されるゲインは、印加されるバイアス電圧の大きさに比例する。不運なことに、入力光子から出力電子への変換は、温度にかなり依存する。したがって、ＡＰＤは、かなり温度に依存し、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの他のいかなる要素よりも依存する。
【００５２】
したがって、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法の一実施形態は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの近傍の温度を監視することを含む。方法はまた、温度に応答して測定システムのＡＰＤのバイアス電圧を変更することをも含んでもよい。
【００５３】
各ＡＰＤは、ほぼ同一の照射の下でシリコーン・ダイオードの出力電流よりも６０倍大きい出力電流を達成する逆バイアス電圧（Ｖ６０）の観点で製造業者によってランク付けされている。個々のデバイスに応じて、Ｖ６０は、１０ボルトから１００ボルトを超える範囲になり得る。
【００５４】
ＡＰＤの出力は、温度に対して非線形であるため、ＡＰＤの全動作範囲にわたって一定の補償係数を使用することができない。電流出力対温度の経験的な測定を、包括的な補償方法を開発するのに使用することができる。言い換えれば、ＡＰＤのパラメータを変更するのに使用される修正係数を、経験的に導出されたデータを使用して決定してもよい。特に、ＡＰＤのバイアス電圧は、温度によるアバランシェ・フォト・ダイオードのゲインの変化を実質上修正するために経験的に導出されたデータを使用して変更されてもよい。
【００５５】
経験的に導出されたデータによってＡＰＤの応答を特徴付けるために、ほぼ一定の光レベルが、１つまたは複数の温度でＡＰＤに加えられる。１つまたは複数の所与の温度で、ＡＰＤの電流出力が複数のバイアス電圧に対して記録される。温度が（たとえば全度増分で）変更され、電流測定が、複数のバイアス電圧で再び繰り返される。結果のデータの収集（図２に示すものなど）は、照射対温度による特定のＶ６０デバイスの電圧プロファイルを完全に示している。複数の異なるデバイスの応答を捕捉するために、これらの測定が、異なるＶ６０定格のＡＰＤに対して繰り返される。
【００５６】
一実施形態では、バイアス曲線表が、以下のようにして温度に対して修正するために使用される。最初のシステム較正中、既知の強度の光を放出する較正微小球体が、システムに導入される。較正微小球体がシステムを通って流れ、較正微小球体が測定システムによって測定されている間、所定の信号レベルがＡＰＤから得られるまでバイアス電圧を変更する。検知器に対するＶ６０、所定の信号レベルでのバイアス電圧、および温度が、ＡＰＤの電流読取値を表内へ挿入するためにＡＰＤ応答表への指標として次に使用される（Ｒ値）。
【００５７】
別の実施形態では、バイアス曲線表が、以下のようにして作成される。発光ダイオード（ＬＥＤ）などの一定の光出力源が、光ファイバ・ケーブルを介して間接的にＡＰＤの光感受性の領域を照射するために使用される。次に、ＡＰＤが、ＡＰＤが曝露される周囲温度を変更する能力を有する周囲のチャンバ内に配置される。温度とＡＰＤへのバイアス電圧の両方が変更されるが、測定システムがそのとき、ＡＰＤの電流出力（Ｒ値）を記録する。
【００５８】
通常のサンプルが行われている間、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの近傍の温度を監視する。次に、所望の相対電流、温度、経験的に導出されたデータを使用してバイアス電圧を決定する。たとえば、Ｒ値、測定された温度、Ｖ６０パラメータが、対応するバイアス電圧を見出すためにＡＰＤ応答表への入力として使用される。測定された温度が表入力値の間にある場合、最も近い温度入力値に対応する読取値が、最良のバイアス電圧を見出すように補間される。表から得られたバイアス電圧が、その温度によるゲイン変化を修正するためにＡＰＤに印加される。サンプル動作は通常継続時間２分未満であり、温度がこの量の時間にわたってほとんど変化しないため、サンプル動作の最初に単一回のバイアス修正を行い、動作の継続時間の間このバイアスを保持することで、ほぼ十分である。言い換えれば、測定システムによってサンプル測定が行われる前に、バイアス電圧が変更され、バイアス電圧はサンプル測定を通じてほぼ一定である。しかし、測定システム近傍の温度が、サンプル動作中の時間にわたって監視され、ＡＰＤのバイアス電圧がそれに応じて変更されてもよい。このようにして、温度を監視することとＡＰＤのバイアス電圧を変更することをリアル・タイムで行うことができる。
【００５９】
いくつかのフロー・サイトメータ測定システムのレポータ・チャネルは、光感受性の検知器として光電子増倍管（ＰＭＴ）を備える。レポータ・チャネルが、微小球体の表面上で起こっている反応に含まれる材料または微小球体の表面と結合された材料を同定するために使用されるチャネルとして一般に定義されてもよい。ＰＭＴが、光電陰極を照射する光の量、印加されたバイアス電圧、ＰＭＴ内の内部ダイノードの数に比例して電流を発生させる。フロー・サイトメータ内では、ＰＭＴのバイアス電圧が、所与のレベルの蛍光のための電流出力を正規化するための「制御」点として通常使用される。較正手順の間に正規化された電圧を発見するために現在使用されている方法は、測定が行われ、熟練した推測が、所望の値により近い出力の結果を生じさせそうなＰＭＴバイアス設定に関して行われるという点で、経験的である。しばしば、出力誤差レベルが許容可能な範囲内になる前に多くの反復計算が必要である。したがって、較正時間を短縮し、このようにして、最良のＰＭＴ電圧を見出すために使用される較正試薬の量を減少させることが有利であろう。現在使用可能であるものよりも較正プロセスを高速化するいくつかの異なる方法が以下で説明される。
【００６０】
温度に対するほぼ線形の応答のため、ＰＭＴは、ＡＰＤよりも温度変化を補償することがずっと簡単である。たとえば、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法の一実施形態は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの近傍の温度を監視することを含む。温度は、ＰＭＴのできる限り近傍で通常測定されるが、ＰＭＴの比較的穏やかな温度変化速度のため正確な位置は重要でない。方法はまた、ＰＭＴが、温度によるＰＭＴの出力信号のゲインの変化を実質上修正するために、特定曲線を使用する温度に応答して測定システムのＰＭＴの出力信号を変更することを含む。ＰＭＴのゲインは、温度に応答して近似的に線形に変化する。また、ＰＭＴに対する特性曲線は、検知波長と陰極構成とともに変化する。このようにして、所与の検知波長と陰極構成に対して、温度に対するＰＭＴの応答は、本明細書で完全に説明されるかのように、参照によって本明細書に組み込まれる、「Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ ｔｕｂｅ−Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｋ．Ｋ．，１９９４から取った図３に示すように、単純な線形関係を介して表現できる。
【００６１】
ＰＭＴのゲインが、前に議論したＡＰＤよりもずっと低い温度とともに変化するため、ゲインを変更したり、バイアス電圧を決定したりすることによって、デバイスを補償することは一般に必要ない。その代わりに、図３に示すもののようなＰＭＴ特性曲線から導かれた簡単な乗数を使用することで十分である。これは、記録ソフトウェアを介して最終的なＰＭＴ読取値に加えられる。
【００６２】
ＰＭＴを較正するために、公知の量の蛍光を有する較正微小球体が、機器のために表され、通常のサンプルと同時にシステムを通る流れが得られる。較正微小球体が測定システムによって測定されている間、バイアス電圧が、所定の信号レベルが得られるまで変更される。
【００６３】
この方法は、１組の微小球体読取値の統計値が計算され、所望の公差が満たされた場合プロセスを終了するために使用される反復計算プロセスである。誤差が十分に小さくない場合、前の２つの反復計算による結果が、次のＰＭＴバイアス設定を予測するために使用されてもよい。線ｙ＝ｍ＊ｘ＋ｂの式が、プロセスに採用される。ここで、傾きｍは、前のバイアスと、結果としての蛍光性測定によって定義される。ＰＭＴのバイアス電圧の電流ゲインへの変換関数が線形である場合、最終的な解が直接得られ、１つの追加の測定で試験される。しかし、電流ゲイン変換関数に対するＰＭＴのバイアスが、バイアス電流とともに指数的に増加するため、線形方法は、曲線の比較的小さい部分に対してしか働かず、したがって、最終的な公差要求を満たすためにいくつかの反復計算を必要とする。
【００６４】
興味深いことに、ゲインに対するＰＭＴ電圧が、対数−対数グラフ（図４参照）にプロットされるとき、変換関数は直線として表される。図４のデータは、「Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ−Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｋ．Ｋ．，１９９４から引用されている。
【００６５】
上記で述べたように、内部ダイノード・カウントと印加されるバイアス電圧が、ＰＭＴの電流増幅を支配する。式１に示すように、固定されたレベルの光に対して、出力電流は、Ｎ次のパワーへ上昇されたＶに比例する。ここで、Ｖは印加されるバイアス電圧であり、Ｎはダイノードの数であり、Ａは、ＰＭＴのいくつかの物理的態様を含む比例定数である。
ｉ＝Ａ＊ＶN （１）
式１の両辺の対数をとると、以下の式になる。
ｌｏｇ（ｉ）＝Ｎ＊ｌｏｇ（Ｖ）＋ｌｏｇ（Ａ） （２）
これは、以下の簡単で見慣れた一次の線形式に書き直される。
ｙ＝ｍ＊ｘ＋ｂ （３）
ここで、ｙ＝ｌｏｇ（ｉ）、ｍ＝Ｎ、ｘ＝ｌｏｇ（Ｖ）、ｂ＝ｌｏｇ（Ａ）。この対数変形を使用して、わずか３つのサンプル測定によって短縮された較正操作を行うことが可能である。
【００６６】
たとえば、一実施形態では、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するために方法は、測定システムのＰＭＴの電圧を第１の値と第２の値に設定することを含む。方法はまた、第１と第２の値のＰＭＴの出力電流を測定することを含む。また、方法は、第１と第２の値の対数対第１と第２の値の出力電流の対数からＰＭＴの較正電圧を決定することを含む。方法は、較正電圧をＰＭＴに印加すること、およびＰＭＴの１つまたは複数のパラメータが所定の公差内にあるかを判定するためにＰＭＴを試験することをさらに含む。
【００６７】
このような方法のある特定の例は、以下の１から７のステップにまとめられる。
１．値の範囲に近接するまたはその範囲の下端での値（Ｖ＝ＶL）にＰＭＴ電圧を設定し、測定値（ｉ＝ｉL）を得る。
２．値の範囲に近接するまたはその範囲の上端での値（Ｖ＝ＶH）にＰＭＴ電圧を設定し、測定値（ｉ＝ｉH）を得る。
３．４つの値すべての対数をとる。
４．傾きｍと切片ｂを計算する。
５．目標ＰＭＴ設定値（対数空間での）ｘcalを解く。
６．ＰＭＴ較正電圧Ｖcalを得るためにｘcalの逆対数をとる。
７．Ｖcalを印加し、所望の公差が満たされているか否かを判定するために試験する。
【００６８】
この方法は、試験され、公差内に毎回成功して収束される。公差が満たされない場合、許容可能な答えが、前に計算したＶcal、ｉcalとＶH、ｉHを使用して対数空間内に新しい傾きと区切りを生成することによって生じる。点Ｖcal、ｉcalは、最終的なＰＭＴ電圧に比較的近くなりそうであり、新しい線に沿った短い通過のみが、許容可能な答えの作成に必要とされる。この場合、４つのサンプル測定が、正確な較正電圧を見出すために使用されることになる。
【００６９】
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの検知器を較正するための別の有利な方法は、連続的な近似を使用することによって較正反復計算を減少させることである。一実施形態では、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法は、図５のステップ５０に示すように、連続的な近似を使用して測定システムの検知器の較正電圧を決定することを含む。較正の成功を達成することなく考えられるすべての較正電圧が検知器に印加されたとき、方法は、ステップ５２に示すように、較正が失敗に終わる。検知器はＡＰＤ、ＰＭＴまたは測定システムに適した他のいずれの検知器であってもよいため、ステップ５４に示すように、各検知器電圧が検知器電圧限界と比較される。較正電圧が電圧限界を超えている場合、異なる較正電圧が、少なくともステップ５０を繰り返すことによって決定できる。
【００７０】
ステップ５６、５８、６０に示すように、方法は、較正電圧を検知器に印加し、検知器からデータを収集し、収集されたデータのヒストグラムを構成し、ヒストグラムのピーク値を計算し、ヒストグラムのピーク値を較正目標ピーク値と比較することを含んでいる。ヒストグラムのピーク値が較正目標ピーク値に十分近い場合、ステップ６２に示すように、較正を終了してもよい。
【００７１】
方法はまた、ステップ６４に示すように、ヒストグラムのピーク値が較正目標ピーク値を超えているか否かを判定することを含んでいる。ステップ６４の出力が、ステップ５０の連続的な近似法によって生成される次の較正電圧を修正するために使用される。
【００７２】
方法は、ヒストグラムに関して上記で説明されているが、方法は、いかなる適切な統計的測定を使用して行われてもよいことを理解されたい。たとえば、検知器信号レベルを決定するいかなる適切な方法が使用されてもよく、これは、平均値、中央値などのビード・サンプルの収集から測定値を決定する統計的方法を含んでいるが、必ずしもそうである必要はない。
【００７３】
特に、連続的な近似は、命令文中のビットを設定し、クリアすることによって、測定された値を目標値と等しくするためにＮ回まで試行するのみである。一実施形態では、方法は、検知信号レベルを決定するために検知サンプルを収集し、処理することを含んでいる。このような実施形態では、方法は、検知信号レベルを較正目標信号レベルと比較することを含み、検知信号レベルが較正目標信号レベルを超えている場合、検知器バイアス電圧を減少させて、較正電圧の決定を繰り返す。別のこのような実施形態では、方法は、検知信号レベルを較正目標信号レベルと比較することを含み、検知信号レベルが、較正目標信号レベルの所定の範囲内にない場合、すべての所望の検知器電圧レベルが試行されるまで、較正電圧の決定を繰り返す。
【００７４】
このような方法のある特定の例は以下のステップを含んでいる。
１．ビット・マスクとＤａｃＣｍｄ値を２Nに初期化する。１２ビットのＤａｃ（「デジタル・アナログ変換器」）に対して、Ｎ＝１２である。この例では、ビット・マスク＝４０９６、ＤａｃＣｍｄ値＝４０９６である。Ｄａｃは、マサチューセッツ州、ノーウッドのＡｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．から市販されているものなどのあらゆる適切なＤａｃを含んでいる。
２．ＤａｃＣｍｄ内の対応するビットをクリアするために現在のマスク・ビットを使用する。目標を超えるか、検知器の最大電圧制限を越えるかのいずれかである。
３．マスクを右へ１ビット移動させる（たとえば次の最も重大なビットへ移動させる）。
４．マスクが０である場合、考えられるすべてのビットが試験され、十分な較正が達成されなかった。方法はステップ１２へ進んでもよい。
５．そうでない場合、次に最も重要なビットを設置するためにＤａｃＣｍｄ内をマスクする。
６．このＤａｃＣｍｄバイナリ値に対応する検知器電圧を決定する。検知器電圧を検知器遮断または最大電圧と比較する。電圧が検知器遮断電圧を超える場合、ステップ２へ戻る。
７．ＤａｃＣｍｄ値（たとえば電圧）を測定システムに送信する。
８．電圧変化が有効になるのを待つ。
９．新しいヒストグラム・ピーク値を、このチャネルのための較正目標ピーク値と比較する。ヒストグラム・ピークが較正目標を超えている場合、ステップ２に戻る。
１０．ヒストグラム・ピークが所望の目標に十分近接していない場合、ステップ３へ行く。
１１．較正は成功した。方法を完了する。
１２．較正は失敗した。方法を完了する。
ステップ１〜１２に記載した例の方法は、本明細書に記載した他のいずれかのステップを含んでいる。
【００７５】
いくつかのフロー・サイトメータ測定システムは、ビードが２つの検知ウィンドウを通過するとき、個々の測定に対してビードを分離させるために静水圧集束技術を使用する。検知ウィンドウは固定されたサイズと物理的な分離を有する。たとえば、測定システム内の光源の照射されるスポットの間の距離が、分離を決める。
【００７６】
潜在的な流体移動の速度変化が、ビードが検知ウィンドウ内に存在する時間の長さと、１つのウィンドウから次のウィンドウへ通過するための分離時間を変化させる。最終的な読取は、ビードが各検知ウィンドウ内に存在する時間の長さに比例する。また、システムは、第２の検知ウィンドウをいつ活動化させるか（すなわち、いつビードが測定のために第２の検知ウィンドウ内に配置されるか）を決定するためにウィンドウ間移行時間も使用する。実際のビードの存在に対するサンプル測定の時間に関する配列が、較正中に得られた値と異なる場合、または照射ウィンドウ内での継続（存在）時間が異なる場合、測定精度が劣化されることになる。
【００７７】
測定システムが、サンプル微小球体の測定中ほぼ一定の流体圧力を維持するように構成されている場合、温度の影響が、流体速度の変化を通じた速度変化に最大に寄与するものとなる。粘性の定義は、流体の流れに対する抵抗の測定値である。圧力Ｐで半径Ｒ、長さＬのチューブを通って単位時間当たりに流れる流体の体積は、ポアズイユの式を使用して表される。
Ｖ／Ｔ＝（π＊Ｒ4＊Ｐ）／（８＊Ｎ＊Ｌ） （４）
ここで、Ｖ／Ｔは単位時間当たりの体積（速度に比例する）であり、Ｎはポアズ単位での粘性である。フロー・チャンバの毛細管は、円形でなく矩形の寸法を有するが、単純なチューブとして扱われることができる。したがって、ビード速度は、上記のポアズイユの式で定義された流体移送の粘性に反比例する。
【００７８】
フロー・サイトメータ測定システムのビード移送として使用される流体の主な構成要素は水である。１５℃から３０℃の動作温度範囲にわたって、粘性は、１．１３９センチポアズから０．７９７５センチポアズへ変化し、これは大きい４３％の変化である。上記の粘性値は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｐｈｙｓｉｃｓ，第６１版，「Ｔｈｅ Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｔｅｒ ０ ｔｏ １００℃）」から得られた。シースとサンプル流体の速度もまたビードの速度が変化するように、約４３％だけ変化する。したがって、動作温度が測定され、流体の粘性を決定するために使用されてもよい。したがって、流体の速度は、表から、ポアズイユの式から、または速度対温度の所定の値から決定されてもよい。このような実施形態では、方法は、速度を基にしたサンプル微小球体の測定中、流体の圧力を制御することを含んでいる。
【００７９】
また、流体の粘性が、ビードの速度を決定するために使用されてもよい。このようにして、移行時間が抽出され、リアル・タイムで修正することができる。流体の温度がサンプル測定中実質上変化しない場合、温度を監視することと速度を決定することを、測定システムによってサンプル微小球体の測定を行う前に行ってもよい。しかし、この方法のステップはまた、リアル・タイムで行われてもよい。
【００８０】
したがって、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための一方法は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムを通って流れる流体の温度を監視することを含む。サンプル微小球体が流体内に配置される。方法は、温度での流体の粘性から測定システム内のサンプル微小球体の速度を決定することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル微小球体の１つが、速度を基にした測定システムの検知ウィンドウ内に存在する時間の長さを決定することを含んでもよい。別の実施形態では、方法はまた、サンプル微小球体の１つが、速度を基にした測定システムのある検知ウィンドウから測定システムの別の検知ウィンドウへ移動する時間の長さを決定することを含んでもよい。また、方法は、サンプル微小球体の１つが、いつ速度ベースの測定システムの検知ウィンドウ内に存在するのかを決定することを含んでもよい。さらに、方法は、速度を補償するための測定システムの１つまたは複数の検知ウィンドウに対してサンプリング間隔を制御することを含んでもよい。
【００８１】
ウィンドウ間移行時間が測定され、システムの不揮発性メモリ、または初期較正手順中システムを制御するコンピュータに保存されてもよい。次に測定された移行時間が、第２の検知ウィンドウのサンプリング間隔を適切に刻時するために次のサンプル動作中に使用されてもよい。ウィンドウ間移行時間は、粘性変化を補償するために短縮または延長されてもよい。システムが較正されたときの温度対現在の温度が、適用される修正の量を決定するために使用される。温度対粘性係数の簡単な表が、システムを制御するコンピュータかシステムの不揮発性メモリのいずれかに記憶される。いずれの場合でも、移行時間修正係数が、表から計算され、サンプル動作が開始する前に適用されてもよい。別法として、当技術分野で公知の他のいかなる適切な方法も、修正係数を決定するために使用することができる。
【００８２】
方法はまた、速度から測定システムの出力信号の１つまたは複数の特性を決定することを含んでいる。たとえば、ビードが検知ウィンドウ内に存在する時間の長さは、検知器の出力電気パルスの振幅と形状を決定する。次に、パルスがアナログ・ローパス・フィルタを通過する。これは、振幅と形状の両方に重大な影響を有し、振幅を減少させ、パルス幅を伸長させる傾向がある。フィルタ後のパルスがデジタル化され、パルスの下の面積が測定され、光のレベルに近似的に比例する値の結果となる。
【００８３】
また、方法は、修正係数を使用して速度による誤差に対して出力信号を修正することを含んでいる。修正係数は経験的な測定を使用して決定されてもよい。流速の変化によるパルス幅変化に対する修正係数の表が、経験的な測定を使用して構成されてもよいことは当然である。表は、システムのメモリまたはシステムと結合された制御コンピュータに記憶される。
【００８４】
温度変化による速度変化を補償するための別の方法は、粘性の変化に比例して付加される流体圧力を変更することである。このことは、速度が一定であるという結果となり、したがって、各測定ウィンドウ内のまたは測定ウィンドウ間の時間が、さほど変化しないことによる。方法は、適切な圧力を動的に設定するために、ポアズイユの式を使用して直接リアル・タイムで、またはサンプル動作の最初に、またはポアズイユの式から計算された所定の表を介して、または別の方法を介して実行されてもよい。
【００８５】
これらの方法は、一定の圧力スキームにわたって大きく改良することが証明されたが、温度変化に対する追加の補償が望ましい。したがって、微調整機構を提供するために、上記に記載された方法とは別々に、または上記に記載された方法と組み合わせて使用される、別の方法が本明細書で説明される。上記に記載された方法とは違って、この方法は光学機構を採用している。また、方法は、測定と制御アルゴリズムを使用してもよい。しかし、本明細書に記載されているように、追加された光学機構とアルゴリズムにもかかわらず、方法は比較的低価格であり、迅速である。
【００８６】
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムが組立てられたとき、照射スポット（たとえばレーザ・スポット）の間の距離が最初に設定される。照射スポット（たとえば、または光線）の間の距離が減少するにつれて、ビードが検知ウィンドウの間を移動するのでより短い距離を有するため、ビード移送時間の速度変化の影響が、最小化される。
【００８７】
最小分離距離が、各光線の鉛直方向照射プロファイル（すなわち、微小球体が測定システムを通って流れる方向に対してほぼ平行な方向での各光線のプロファイル）によってさらに決まる。たとえば、光線の強度がピークからショルダへ迅速に低下し、第２の最大値がない場合、光源が、他の光源の照射スポット内に波及する傾向がないため、光線を互いに相対的に近接して配置することが可能である。このような重なりは、分類やレポータ・チャネルの間で複雑な補償スキームを必要とし、それによって感受性の損失を生じさせるため、光線の重なりを回避するように留意されたい。
【００８８】
前に説明したように、照射スポットの間のビード移行時間をほぼ一定に保持すること、さらに、速度と微小球体が各照射ウィンドウ内で消費する時間を実質上固定することは重要である。
【００８９】
ほぼ一定のビード移行時間を維持するための１つの方法は、ビードが２つの検知ウィンドウを移行するためにかかる平均時間をリアル・タイムで測定し、移行時間を一定に保持するために必要に応じて付加される圧力を制御することを含む。一実施形態によると、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法は、微小球体が、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの第１の検知ウィンドウから測定システムの第２の検知ウィンドウへ移動する時間を測定することを含む。一実施形態では、時間は平均時間であってよい。微小球体は、サンプル微小球体または較正微小球体であってよい。時間を測定することは、第１と第２の検知ウィンドウで微小球体によって散乱される光を測定することを含んでいる。別の実施形態では、時間を測定することは、１つの検知器によって第１と第２の検知ウィンドウで微小球体によって散乱される光を測定することを含んでいる。このような一実施形態では、第１と第２の検知ウィンドウで微小球体によって散乱された光が、１つのビーム・スプリッタによって１つの検知器に向けられる。方法はまた、時間がほぼ一定であるように測定システムの付加される圧力を変更することを含む。方法はリアル・タイムで行われてもよい。上記に記載された実施形態は、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００９０】
不運なことに、大部分のフロー・サイトメータ・タイプ測定システムの最近の光学的デザインは、通常、事前に知られていない蛍光の放出が、ビードごとに一定ではなく、あるビードに対してはまさにゼロとなることがあるので、レポータ蛍光がちょうど測定されるところの第２の検知ウィンドウを通過する各ビードを検知することを不可能にする。明確な解決法は、ビードによって散乱される第２の照射源の光を測定するために追加の光検知器を追加することであるが、このことは、追加の電子部品とデジタル処理チェーンが新しい信号を処理するために追加されなければならないため、システムにかなりのコストを追加する。
【００９１】
提案された解決法は、両方の検知ウィンドウでの散乱を測定するために同じ散乱光検知器を使用することを含むため、簡単と低価格の両方である。現在の光学レイアウトは、第２の（レポータ）ウィンドウ内の散乱光が、散乱検知器に到達することを妨ぐため、検知器を、ビードから放出または反射されるすべての光を受けるように再配置することが必要である。これが行われた場合、各光源からの散乱に近似的に比例する顕著なピークが、下流の電子部品によって別々に識別できることになる。
【００９２】
図６は、本明細書に記載された方法を行うために使用できる測定システムの一実施形態を示している。図６に示すように、測定システムは、光源７０、７２を備える。光源７０は、たとえば、約６３９ｎｍの波長を有する光を放出するレーザである。このレーザは、測定システムの分類チャネルのための照射を供給するのに適している。光源７２は、たとえば、、約５３２ｎｍの波長を有する光を放出するレーザであってもよい。このレーザは、測定システムのレポータ・チャネルのための照射を供給するのに適している。各レーザの照射ゾーンは、ビード流（図示せず）の軸に沿って一致していないことに留意されたい。他の光源が、上記に記載された例の代わりに使用されてもよい。たとえば、光源と光源の波長は、測定されるサンプルに応じて変えてもよい。
【００９３】
図６に示すように、光源７０、７２の両方がキュベット７４を照射する。特に、光源７０、７２は、ビードがキュベット７４を通って流れるとき、ビード７６を照射するように構成されている。図６にさらに示されているように、光源７０、７２は、照射とほぼ反対の角度でビードを照射するように構成されている。しかし、光源が照射のいかなる適切な角度でビードを照射してもよいことを理解されたい。
【００９４】
両方の光源による照射によりビードによって散乱される光は、レンズ７８によって捕集される。レンズ７８は、当技術分野で知られているいかなる適切なレンズでもよい。また、レンズ７８は、反射性光コレクタと交換されてもよい、またはシステムに備えられなくてもよい。レンズ７８は、約９０°（光源７０、７２に対して）の捕集角で光を捕集するように示されているが、レンズが、光源に対していかなる適切な捕集角度で配置されてもよいことに理解されたい。
【００９５】
レンズ７８によって捕集された光が、ビーム・スプリッタ８０へ向けられる。ビーム・スプリッタ８０は、ガラス板または二色フィルタなどの当技術分野で知られているいかなる適切な光学構成要素を備えてもよい。ビーム・スプリッタ８０は、レンズによって捕集された光の一部分を検知器８２へ向けるように構成されている。検知器８２は、両方の（または複数の）光源による照射によりビードによって散乱された光を検知するように構成されてもよい。このようにして、上記で提供された光源の例に対して、検知器８２が、約５３２ｎｍと約６３９ｎｍの波長を有するビードによって散乱された光を検知するようにされてもよい。検知器は、ＣＣＤデバイスなどの当技術分野で公知のいかなる適切な検知器を備えてもよい。
【００９６】
したがって、検知器８２は、単一のビードに対して２つの異なる散乱信号を検知する。散乱信号は、光源の波長に基づいて決定される異なる波長で検知される。ビードがキュベットを通るとき各光源が異なる時間にビードを照射するので、測定システムの第１の検知ウィンドウから測定システムの第２の検知ウィンドウへビードまたは微小球体が移動する時間を測定するために、異なる散乱信号が検知される時間を使用することができる。
【００９７】
また、ビーム・スプリッタ８０は、レンズによって捕集された光の他の部分を伝送するように構成されている。光の伝送される部分は、光学構成要素８４によってシステムの検知サブ・システムの分類部分８６へ向けられてもよい。光学構成要素８４は、たとえば、折りミラー、二色ビーム・スプリッタ、部分的に透過性のミラー、または当技術分野で公知の他のいかなる適切な構成要素を含んでいる。別法として、光学構成要素８４が、たとえば、検知サブ・システムの分類部分の配置に応じてシステムに備えられなくてもよい。検知サブ・システムの分類部分は、当技術分野で公知のいかなる適切な構成要素を備えてもよい。いくつかの実施形態では、検知サブ・システムの分類部分は、図１に記載され、示されているように構成されてもよい。ビーム・スプリッタ８０によって伝送される光の別の部分は、検知サブ・システムのレポータ・チャネル（図示せず）へ向けられても良い。このシステムは、分類のために第１の照射ゾーンを、レポータ信号のために第２の照射ゾーンを使用するが、この技術を採用しているデバイス内での使用は、これらの測定に限定されない。蛍光性のまたは散乱された光を、セル、ビードまたはその他の粒子内の蛍光レポータまたはその他の色素の測定などの、別の目的のために使用することができる。
【００９８】
ビーム・スプリッタ８０によって検知器８２へ向けられる蛍光の放出は、たとえあるとしても、それらの大きさは散乱される光の大きさをかなり下回るため、散乱信号に追加するが、少しも重要でない。上記に記載されたように、図６に示す例は、散乱された光を、再配置された検知器へ向け、分類検知器に付加されるスペクトルを修正しないためにビーム・スプリッタに依存する波長であるビーム・スプリッタ８０を採用している。明らかに、他の実施形態が可能である。たとえば、追加の部分が何も設けられないように検知器を構成することが考えられる。図６に示すシステムは、本明細書で記載されたようにさらに構成されてもよい。
【００９９】
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法の別の実施形態は、微小球体が、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの第１の検知ウィンドウから測定システムの第２の検知ウィンドウへ移動する平均時間を測定することを含む。微小球体は、サンプル微小球体、較正微小球体、またはそれらの組合せを備えてもよい。方法は、平均時間を、基準微小球体が第１の検知ウィンドウから第２の検知ウィンドウへ移動する基準時間と比較することを含む。方法は、基準時間を含んでも含まなくてもよい。また、方法は、平均時間と基準時間の間の差が所定の値よりも大きい場合、測定システムに付加される圧力を変更することを含む。いくつかの実施形態では、所定の値が、測定システムの既知の時間変化機構を補償するように選択される。一実施形態では、付加される圧力を変更することは、平均時間が基準時間よりも大きい場合、付加される圧力を増加させることを含む。異なる実施形態では、付加される圧力を変更することは、平均時間が基準時間よりも小さい場合、付加される圧力を減少させることを含む。この方法もまた、リアル・タイムで行われてもよい。
【０１００】
上記に記載された方法は、連続する散乱パルスの間の時間がほぼ一定であるようにシステム圧力を直接制御するための技術を提供する。この技術は、電子ハードウェア（たとえば、カウンタ、デジタル補償器など）、またはデジタル信号プロセッサまたは別の適切なプロセッサによって測定されたサンプルされた信号を使用するソフトウェアを使用して、実現できる。いずれの実施形態でも、方法は類似的であり、同じ結果が得られる。アルゴリズムの高いレベルの説明が、以下のステップ１〜６で提供され、パルス列の例が図７に示されている。
【０１０１】
１．システムが、既知の圧力と温度で較正されるとき、連続する散乱パルス・ピークの間の平均移行時間が、測定され、後の参照のために保存される。
２．通常のサンプル取得中、赤色レーザ（または最初にビードを照射する他のいかなる光源）からの第１の散乱パルスがタイマを始動させる。たとえば、図７に示すように、ｔ1で、６３９ｎｍの波長を有するレーザによる照射に対応する散乱パルスが検知される。したがって、タイマは、ｔ1で始動される。
３．第２の散乱パルスが到達したとき、タイマが停止される。たとえば、５３２ｎｍの波長を有するレーザによる照射に対応する散乱パルスが図７に示すようにｔ2で検知され、そのときタイマが停止する。
４．そのとき、タイマの値が、較正操作中に計測された移行時間と比較される。
５．タイマの値が較正時間よりもかなり大きいとき、圧力源（たとえばポンプ）の１つまたは複数のパラメータが、その圧力を増加させるように変更される。圧力源のパラメータは、プロセッサによって変更されてもよい。別法として、ｔ2とｔ1の間の差がｔcalよりも大きい場合、圧力源の圧力が増加されてもよい。ｔcalは、ビードの移行時間の許容可能な変化を定義する所定の値である。
６．タイマ値が、較正時間よりもかなり小さい場合、圧力源の１つまたは複数のパラメータが、その圧力を減少させるように変更される。１つまたは複数のパラメータは、プロセッサによって変更されてもよい。別法として、ｔ2とｔ1の間の差がｔcalよりも小さい場合、圧力源の圧力が減少されてもよい。ステップ５、６で使用されるｔcalは、同じ値であってもよい。
【０１０２】
この「制御システム」を比較的安定して保持するために、考慮に入れることができるいくつかのことがある。たとえば、方法は、システムが、試行するために、およびシステムを通過する各ビード事象に対して正または負の圧力修正を行うために、制御されないように行われる。いくつかの平均方法が、少なくとも部分的にサンプル・コアの速度勾配の結果生じると考えられている「ビード・ジッター」と呼ばれる知られている時間変化機構を補償するために採用されてもよい。また、圧力修正を生じさせる時間誤差の閾値は注意深く選択されるべきである。誤差の大きさは、圧力修正の量を決定するコントローラへの入力として最もよく使用される。古典的な積分微分コントローラを性能のよい動作のために使用できることはもちろんである。
【０１０３】
上記で列挙された修正係数を、サンプル微小球体の測定の前に測定誤差の主要な部分を修正するために使用できるが、上記の技術が実施された後に存在することがある残留誤差を補償する測定プロセス中に細かい修正が行われてもよい。たとえば、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための一方法は、測定システムによるサンプル微小球体の測定中、測定システムの１つまたは複数のパラメータを監視することを含む。方法はまた、監視されたパラメータを基にしてリアル・タイムで１つまたは複数のパラメータを変更することを含む。たとえば、上記で記載されたように、監視され、変更された１つまたは複数のパラメータは、測定システムのＰＭＴのパラメータを含んでいる。また、この説明で同定されたもの以外の誤差源が、この手法を使用して除去されてもよい。
【０１０４】
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムは、微小球体に対して内側の２つ以上の色素の測定された強度を基にしてシステムを通過する微小球体を同定する。この同定技術は、すべてのチャネル（リポータおよび分類の両方）に既知の量の蛍光強度を含む較正微小球体を同定するために使用されることもある。較正微小球体測定が知られた後、サンプル微小球体測定のためにレポータおよび／または分離チャネルに微修正係数を適用する。
【０１０５】
較正微小球体をサンプル微小球体と区別するとき、この技術の複雑性が生じる。たとえば、較正微小球体のための新しいスペクトル・アドレスが、色素レベルの組合せを基にして作成されるが、これは、Ｎ−１によるシステムの多重化能力を減少させる。別の技術は、較正微小球体の直径をサンプル微小球体の直径よりも大きくまたは小さくすることによって、較正微小球体を同定することである。
【０１０６】
測定システムは、微小球体によって、照射平面に対して９０°で散乱された光を測定してもよい。散乱された光のレベルが、グループで互いに積み重ねられる、または照射ゾーンをほぼ同時に通過する、複数の微小球体を同定するために使用される。たとえば、散乱された光は、照射ゾーン内に存在するすべての粒子の体積に一般に比例する。したがって、複数の微小球体は、単一の微小球体よりも大きい散乱信号を有することになる。微小球体の大部分が、集団事象で見ることによって、単一の物体として照射ゾーンを通常通過することになるため、単一のビードに属していないこれらの事象を同定することは容易である。一般に、２つ、ときどき３つの微小球体が統合して、単一の微小球体によって作成されるものよりも高い散乱信号を作成する。分析フォーマットが散乱信号に影響を有することがあるため、通常、単一の微小球体に対する散乱信号レベルは分析作業中に測定される。
【０１０７】
照射ゾーンを通過するいかなる複数の微小球体の組合せから較正微小球体を同定することがより簡単であるため、サンプル微小球体の直径よりも大きくない、小さい直径を有する較正微小球体を使用することが望ましい。したがって、測定デバイスのパラメータを監視することは、サンプル微小球体の直径よりも小さい直径を有する較正微小球体の測定を使用して行われてもよい。また、監視され、変更される１つまたは複数のパラメータが、サンプル微小球体によって散乱される光に応答する測定システムの検知器によって作成された出力信号を含んでいる。たとえば、サンプル微小球体の直径に対する較正微小球体の直径の比が公知である場合、散乱測定レベルを微調整するために較正微小球体を使用することも同様に可能である。
【０１０８】
較正微小球体の少なくともいくつかが、異なるスペクトル・アドレスを有してもよい。このようにして、一連の異なる較正微小球体が、上記の較正方法を強化するために使用されてもよい。たとえば、第１の弁別器として直径を使用することによって、較正微小球体のスペクトル・アドレスが、サンプル空間内であるように、較正空間内の第２の弁別器となってもよい。微小球体の同一性を弁別するために分類空間内で十分に分離された、複数の較正レベルを有することは、以下の例で使用される。
【０１０９】
たとえば、監視され、変更される１つまたは複数のパラメータは、サンプル微小球体の測定の線形性を備えている。測定デバイスのパラメータが監視され、変更される間の測定は、測定システムの分類チャネルの測定を含んでいる。測定デバイスのパラメータを変更することは、この実施形態では、測定のいかなる非線形性を好ましくは修正する。このようにして、複数の較正レベルを、分類空間の非線形性を検知し、修正するために使用してもよい。現在の測定システムは、単点較正を使用しており、システムの非線形性によるこのような誤差を修正することができない。２次元で表された２色素ビード・システムでは、この非線形性を、分類微小球体の観測された位置に基づいた平面内での分類空間の変形として考えることができる。非線形性を修正することは、その平面内の微小球体の分類精度を改善する。この技術は、同様の効果を有するいかなる数の次元に拡張されることもできる。
【０１１０】
複数の較正レベルが、レポータ信号の非線形性を検知し、修正するために使用されてもよい。上記に記載された技術と同様に、レポータ・チャネルは、現在の測定システム内で単一の較正点を受けてもよい。レポータ・チャネル内で非線形性を検知し、修正することが、上記に記載されたように行われてもよい。たとえば、その間に測定システムのパラメータが監視され、変更される測定は、測定システムのレポータ・チャネルの測定を含んでいる。さらに、測定システムのパラメータが監視され、変更される間の測定は、測定システムのレポータ・チャネルと分類チャネルの測定を含んでいる。このようにして、分類とレポータ・チャネル内の非線形性を、ほぼ同時に監視し、修正することができる。
【０１１１】
別の例では、測定システムの、監視され、変更される１つまたは複数のパラメータが、測定システムのダイナミック・レンジを含む。たとえば、複数の較正レベルが、システムのダイナミック・レンジのリアル・タイムの決定のために使用される。測定システムは、微小な線形範囲を有する。１つまたは複数の独自に同定された較正微小球体に異なるレポータ較正レベルを使用することによって、信号のクリッピングによりシステムが非線形になる検知の下限および／または検知の上限を同定することが可能である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、複数の較正レベルが、分類システムの健全性の決定のために使用される。このようにして、監視され、変更される１つまたは複数のパラメータが、測定システムの健全性を含んでいる。測定システムの健全性は、分類チャネルの健全性、レポータ・チャネルの健全性、またはそれらの組合せを含んでいる。たとえば、上記に記載された個々の解決法の集まりが、温度またはその他の影響に対してシステムを補償することに失敗した場合、較正微小球体蛍光分類レベルは、その予想された値からさらに遠くなる傾向がある。閾値レベルが設定され、較正微小球体蛍光分類レベルが閾値レベルと比較される。較正微小球体蛍光分類レベルが閾値レベルの選択された側にある場合、警告がシステム・オペレータに表示されるか、結果に問題があることを測定システムと結合されたコンピュータに送信する。警告は、視覚的な出力信号および／または聴覚的な出力信号であってもよい。同様にして、複数の較正レベルが、レポータ・システムの健全性の決定のために使用されてもよい。分類システムの健全性の決定と同様に、レポータ・システム内の修正不可能な誤差が同定され、システム・オペレータまたは測定システムと結合されたコンピュータに報告される。
【０１１３】
さらに、複数の較正レベルが、レポータ・チャネルの線形ダイナミック・レンジを拡張するために使用されてもよい。このようにして、測定システムのパラメータを変更することは、測定システムのレポータ・チャネルの線形ダイナミック・レンジを拡張することを含んでいる。非線形領域に存在するいくつかのレベルの明較正微小球体を含むことによって、蛍光性レベルの線形の等価物に対して実際に測定された蛍光性レベルをマッピングすることが可能である。測定曲線から予想曲線への滑らかなマッピングが、個々の較正微小球体の値の間を補間することによって較正データから構成されることができる。すなわち、システムの線形の、有用な測定範囲が、非線形領域内のサンプル微小球体が曲線を使用して調整される場合、かなり拡張される。
【０１１４】
上記の説明では、いくつかの測定誤差に寄与するもの、およびそれぞれに対するリアル・タイム修正技術が示された。また、微小球体サンプル混合物に含ませることができる小直径の較正微小球体を使用したリアル・タイム微調整方法が創造された。微調整プロセスの追加の形態は、システムの健全性のリアル・タイムの同定、１つまたは複数のチャネルの非線形性の修正、測定システムの有用なレポータ・ダイナミック・レンジのかなりの拡張を含む。
【０１１５】
本明細書に記載されたものなどの方法を実現するプログラム命令が、搬送媒体上で送信または記憶されてもよい。搬送媒体は、電線、ケーブルまたは無線伝送リンクなどの伝送媒体、またはこのような電線、ケーブルまたはリンクに沿った信号移送であってよい。搬送媒体はまた、読取専用メモリ、ランダム・アクセス・メモリ、磁気または光ディスク、または磁気テープなどの記憶媒体であってもよい。
【０１１６】
一実施形態では、プロセッサが、上記の実施形態による実装された方法をコンピュータに行わせるためのプログラム命令を実行するように構成されてもよい。プロセッサは、デジタル信号処理チップまたはフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイを採用している専用処理ボード、パーソナル・コンピュータ・システム、大型コンピュータ・システム、ワーク・ステーション、ネットワーク装置、インターネット装置、携帯情報端末（「ＰＤＡ」、テレビジョン・システムまたはその他のデバイスなどの様々な形態を取ってよい。一般に、「コンピュータ・システム」という用語は、１つまたは複数のデジタル信号処理要素またはその他の処理要素を有するいかなるデバイスも包含するように広く定義されている。
【０１１７】
プログラム命令は、手順ベースの技術、構成要素ベースの技術、および／またはオブジェクト指向技術などの様々な方法のいずれかで実装されてもよい。たとえば、プログラム命令は、ＡｃｔｉｖｅＸ制御、Ｃ＋＋オブジェクト、Ｊａｖａ（登録商標）Ｂｅａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｃｌａｓｓ（「ＭＦＣ」）、または必要に応じて、その他の技術または方法論を使用して実装されてもよい。ＦＰＧＡの実装の場合、ＶＨＤＬなどの高レベルの言語の使用が、デバイス内に埋め込まれた信号処理回路を設計するために採用されてもよい。
【０１１８】
本発明が、フロー・サイトメータ・タイプの測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法を提供するように考えられていることは、この開示の利益を有する当業者なら理解されよう。本発明の様々な態様のさらなる修正形態や代替となる実施形態は、この説明の観点から当業者なら明らかであろう。したがって、この説明は、単に例示的なものとみなされるべきであり、本発明を実行する一般的な方式を当業者に教示する目的のためである。本明細書に図示され、説明された本発明の形態が、現在の好ましい実施形態として考えられるべきであることを理解されたい。本発明のこの説明の利益を得た後の当業者にすべて明らかであるように、要素および材料は、本明細書に図示し、説明されたものに代替されてもよく、部品およびプロセスが反転されてもよく、本発明のある特徴が独立して使用されてもよい。頭記の特許請求の範囲に記載したような本発明の精神および範囲を逸脱することなく本明細書に記載された要素に変更が行われてもよい。
【符号の説明】
【０１１９】
１０ 微小球体、１２、７４ キュベット、１４、７０、７２ 光、１６、２６、２８、３０、３２ 検知システム、１８ 折りミラー、２０、２２、２４、８０ ビーム・スプリッタ、３４、３６、３８ スペクトル・フィルタ、４０ プロセッサ、４２ 伝送媒体
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法に関する。ある実施態様は、パラメータの監視に基づいてリアル・タイムでフロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを変更することを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の説明と例は、この節にそれらを含めていることにより、従来技術であるとは限らない。
【０００３】
一般に、フロー・サイトメータは、フロー・チャンバを直線状に通過するときのレーザ励起されたポリスチレン・ビードまたはセルの蛍光強度の測定を提供する。しかし、フロー・サイトメータは、他の粒子の１つまたは複数の特性の測定を提供するために使用されることもある。いくつかのシステムは、励起源に対して９０°または１８０°で粒子によって散乱される光のレベルの測定、粒子の「同一性」である分類を決定するために使用される蛍光性の２つ以上の測定、当該化学反応を定量化するために通常使用される「レポータ」として公知である追加の蛍光性の測定を行うように構成されている。蛍光性測定のそれぞれは異なる波長で行われる。
【０００４】
フロー・サイトメータ・タイプ測定機器の測定能力が改善されたため、フロー・サイトメータが有用な測定を提供することができる用途が、劇的に増加した。たとえば、フロー・サイトメータは、生物学的分析法（たとえば置換または比較分析、非比較分析、酵素分析）、核酸解析、コンビナトリアル・ケミストリなどの用途のためのデータを提供するのにますます有用になっている。特に、フロー・サイトメータ測定の人気は、他の分析方法（たとえば従来型の酵素と結合された免疫付着剤分析「ＥＬＩＳＡ」法など）と特に比較して、分析が行われる速度のため、劇的に増加している。
【０００５】
通常の状況下では、フロー・サイトメータの較正は、正確であり信頼性の高い分析結果を得るための適切な使用と測定のために機器を準備するための１つまたは複数の準備ステップとして行われる。また、各フロー・サイトメータの蛍光性チャネルが読み取るために較正されていない場合、サンプルの間での変動源に関する保証はない。ロバストで完全な較正方法が採用されていない場合、ある機器が異なる日に同じサンプルに対して異なる読取値を与えることもある。同様に、フロー・サイトメータが、サンプル内のセル間を同定し、区別するより良い測定を提供するが、正確に調整されている場合でさえも２つの機器が同じ結果を提供するという保証はなく、医療機器としてのその使用は減少する。
【０００６】
したがって、フロー・サイトメータを較正するための多種多様な方法が開発されてきた。最初に、較正の精度を増加させるために較正でのオペレータの関与のレベルを減少させる較正方法を開発するためにかなりの作業が行われた。この作業は、大部分で、フロー・サイトメータの較正の多くのステップの自動化に至った。また、較正の精度を他の方式で改善するためにかなりの作業が行われた。たとえば、この作業は、一様かつ一定の特性を有する較正標準を使用するなどした較正の進行に至った。特に、生物学的サンプルの特性は、時間とともに変化することがあるため、フロー・サイトメータのための生物学的較正標準が、より安定した特性を有する合成較正標準（たとえばポリマー微小球体(microsphere)または微小粒子など）に一般に置換される。また、通常較正微小球体は、試験微小球体の特性とほぼ同様の（すなわちできる限り近い）特性（たとえば、サイズ、体積、表面特性、粒度特性、反射率、蛍光性など）を有する。このような較正微小球体は、試験中に予想される値に可能な限り近い値で較正を行うことによってフロー・サイトメータの精度を増加させると信じられていた。
【０００７】
フロー・サイトメータの較正を改善しようとする試みは、較正によって考慮されるフロー・サイトメータのパラメータの数を増加させることにも至っている。たとえば、フロー・サイトメータ測定システムのレーザ励起部、検知器、電子部品は、時間とともに変化し、このことは最終的な測定値に影響を与える。したがって、通常、フロー・サイトメータのこれらの、ときにはその他のパラメータが、較正方法によって考慮される。
【０００８】
制御することがより困難である他のパラメータもまた、フロー・サイトメータの測定に影響を与える。このようなパラメータの１つはサンプル速度である。サンプル速度を測定するための方法の一例が、本明細書で完全に説明されるかのように参照によって本明細書に組み込まれる、Ｏｒｔｙｎ他に対する米国特許第６，５３２，０６１号に示されている。この方法では、物体が、感知または測定容器を通って流される流体の流れの中に引き込まれる。これらの測定の各場合で、ほぼ一様なピッチを有する光学格子が、移動中の物体から受信される光を変調させるために採用される。変調された光は、電気信号に変換され、デジタル化されて、次に、物体の速度を決定するために高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を使用して処理される。しかし、サンプル速度を測定するためにＯｒｔｙｎ他によって記載された方法とシステムにはいくつかの欠点がある。たとえば、この方法は、かなり複雑な光学格子とソフトウェアを必要とする。また、光学格子のために必要とされる精度や製造の複雑性のため、光学格子はかなり高価になるかもしれない。また、サンプル速度測定は、たとえば、移動中の物体によって検知される光の光学的ひずみのため、いくらか不正確である。
【０００９】
しかし、フロー・サイトメータ測定内で最も重大な誤差の寄与は、一般に温度変化によって生じる。また、フロー・サイトメータによって行われる測定への温度変化の影響は、現在使用可能な較正方法によって十分に対処されないことが発見された。たとえば、Ｏｒｔｙｎ他によって記載された方法とシステムは、いくつかのパラメータを修正しようと試みているが、温度変化と温度変化がフロー・サイトメータの測定にどのように影響を与えるかを考慮していない。したがって、多種多様な較正方法が使用可能であるが、これらの方法のそれぞれへの追加の改良が、異なるフロー・サイトメータ測定中または個々のフロー・サイトメータ測定中の温度変化をより正確に計上することによって行われることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、リアル・タイムの較正スキームを作成するために結合されることができる、フロー・サイトメータ測定システムの少なくとも主要な誤差に寄与する構成要素を制御するための方法を開発することが有利である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記で詳細に説明したように、フロー・サイトメータで最も重要な誤差の寄与は、一般に温度変化によって生じる。温度が測定される量であるため、その影響の背後の物理学は公知であり、最も危険であるこれらの誤差源を減少させること、さらには無効にすることさえも可能である。
【００１２】
いくつかの測定誤差に寄与するもの、および測定誤差に寄与するものに対するリアル・タイム較正技術が確認された。また、微小球体サンプルの混合に含まれる、測定されているものと少なくともわずかに異なる直径を介して独自に同定可能である較正微小球体を使用するリアル・タイムの微調整方法が、作成された。微調整プロセスの追加の特徴は、システムの健康性のリアル・タイムの同定、１つまたは複数のチャネル内での非直線性の修正、および／またはフロー・サイクロメータ測定システムの有用なレポータ・ダイナミック・レンジのかなりの拡張を含んでいる。ここに記載した実施態様は、主に温度によるシステム変動を補償するために有用であり、したがって較正された動作範囲を拡張する。
【００１３】
また、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法のいくつかの異なる実施態様が、本明細書に記載されていることに留意されたい。方法のそれぞれは、別々に使用され、実行されてもよいことを理解されたい。また、２つ以上の方法が、たとえば、測定システムの様々な構成要素の変化および／または測定システムの所望の精度に応じて組み合わせて使用または実行されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本明細書に記載された方法を実施するために使用されることができる測定システムの一例の概略図である。
【図２】温度の関数としての、１３０ボルトの逆バイアス電圧（Ｖ６０）を有するＡＰＤの応答を示す複数のバイアス曲線の一例を示すグラフである。
【図３】温度の関数としての様々なＰＭＴの応答を示すグラフである。
【図４】ＰＭＴバイアス電圧の対数の関数としてのＰＭＴのゲインの対数の一例を示すグラフである。
【図５】フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法の一実施形態を示すフロー・チャートである。
【図６】本明細書に記載された少なくとも１つの方法を実施するために使用されることのできる測定システムの一部分の一実施形態の断面図を示す概略図である。
【図７】本明細書に記載された方法の実施形態の１つで測定されることができるパルス列（すなわち、異なる時間で測定された散乱光）の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法に関する。この方法は、測定システムによるサンプル微小球体の測定中、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを監視するステップを含む。この方法はまた、監視を基にしてリアル・タイムで１つまたは複数のパラメータを変更するステップを含む。
【００１６】
一実施態様では、１つまたは複数のパラメータを監視するステップが、較正微小球体の測定を使用して１つまたは複数のパラメータを監視するステップを含んでいる。較正微小球体が、サンプル微小球体の直径とは異なる（たとえばそれよりも小さい）直径を有する。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のパラメータが、測定システムの検知器によって作成された出力信号を含んでいる。出力信号は、サンプル微小球体によって散乱された光に応答する。
【００１７】
別の実施態様では、１つまたは複数のパラメータを監視するステップが、較正微小球体の測定を使用して１つまたは複数のパラメータを監視するステップを含んでいる。この実施態様では、較正微小球体が、サンプル微小球体の直径とは異なる（たとえばそれよりも小さい）直径を有し、較正微小球体の少なくともいくつかが異なるスペクトル・アドレスを有する。このような一実施態様では、１つまたは複数のパラメータが、測定システムのダイナミック・レンジを備えてもよい。別の実施態様では、パラメータを変更するステップが、測定システムの１つまたは複数のチャネルの線形ダイナミック・レンジを拡張するステップを含んでいる。追加の実施態様では、１つまたは複数のパラメータが、システム健全性の測定を含んでいる。システム健全性の測定が、分類チャネルの健全性、レポータ・チャネルの健全性、またはそれらの組合せを含んでいる。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のパラメータが、サンプル微小球体の測定の線形性を含んでいる。このような実施態様では、測定が、分類チャネルの測定、レポータ・チャネルの測定、またはそれらの組合せを含んでいる。このような別の実施態様では、パラメータを変更するステップが、測定のいかなる非線形性もほぼ修正するステップを含んでいる。
【００１８】
いくつかの実施態様では、パラメータが、測定システムのアバランシェ・フォト・ダイオードのパラメータを含んでいる。このような一実施態様の方法は、経験的に導出されたデータを使用してパラメータを変更するステップで使用される修正係数を決定するステップをさらに含んでいる。別の実施態様では、複数のパラメータが、測定システムの光電子増倍管のパラメータを含んでいる。
【００１９】
さらなる実施態様では、パラメータがサンプル微小球体の速度を含んでいる。このような一実施態様では、パラメータを監視するステップが、サンプル微小球体が中に配置されている流体の温度を監視するステップ、温度からサンプル微小球体の速度を決定するステップを含んでいる。いくつかの実施態様では、方法は、サンプル微小球体の測定の前に１つまたは複数のパラメータを較正するステップをも含んでいる。上記に記載した方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載した他のいかなるステップをも含んでいる。
【００２０】
別の実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法に関する。この方法は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの近傍の温度を監視するステップを含む。この方法はまた温度によるアバランシェ・フォト・ダイオードのゲインの変化をほぼ修正するために、経験的に導出されたデータを使用して温度に応答して測定システムのアバランシェ・フォト・ダイオードのバイアス電圧を変更するステップを含む。
【００２１】
一実施態様では、この方法はまた、１つまたは複数の温度でのアバランシェ・フォト・ダイオードに対してほぼ一定の光レベルを付加することによって経験的に導出されたデータを生成するステップと、１つまたは複数の温度での多重バイアス電圧に対するアバランシェ・フォト・ダイオードの電流出力を記録するステップをさらに含む。別の実施態様では、パラメータを変更するステップが、測定システムによってサンプル測定が行われる前に行われる。このような実施態様では、バイアス電圧が、サンプル測定全体を通じてほぼ一定であってもよい。異なる実施態様では、パラメータを監視するステップとパラメータを変更するステップがリアル・タイムで行われる。
【００２２】
いくつかの実施態様では、方法はまた、公知の強度の光を放出する較正微小球体が測定システムによって測定されている間、所定の信号レベルがアバランシェ・フォト・ダイオードから得られるまで、アバランシェ・フォト・ダイオードのバイアス電圧を変更するステップを含んでいる。このような一実施態様では、方法は、アバランシェ・フォト・ダイオードのための逆バイアス電圧、所定の信号レベルでのバイアス電圧、温度から、アバランシェ・フォト・ダイオードのための対応する相対電流を決定するステップをさらに含んでいる。方法のこの実施態様は、対応する相対電流、温度、逆バイアス電圧、経験的に導出されたデータを使用してバイアス電圧を決定するステップをさらに含んでいる。上記に記載された方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００２３】
追加の実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法に関する。この方法は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの近傍の温度を監視するステップを含む。方法はまた、光電子増倍管の出力信号のゲインの変化を実質上修正するために、光電子増倍管に対する特性曲線を使用して温度に応答して測定システムの光電子増倍管の出力信号を変更するステップとを含む。光電子増倍管のゲインが、温度に応答して近似的に線形に変化する。いくつかの実施態様では、光電子増倍管が、測定システムのレポータ・チャネルの一部である。別の実施態様では、光電子増倍管のための特性曲線が、光電子増倍管の検知波長と陰極構成とともに変化する。上記に記載された方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００２４】
別の実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法の異なる実施態様にさらに関する。この方法は、測定システムの光電子増倍管の電圧を第１の値と第２の値に設定するステップを含む。方法はまた、第１と第２の値での光電子増倍管の出力電流を測定するステップを含む。また、この方法は、第１と第２の値の対数対第１と第２の値の出力電流の対数から光電子増倍管の較正電圧を決定するステップを含む。本方法はさらに、較正電圧を光電子増倍管に印加するステップを含む。本方法はまた、光電子増倍管の１つまたは複数のパラメータが所定の公差内にあるかを否か決定するために光電子増倍管を試験するステップを含む。上記に記載された方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００２５】
追加の実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための別の方法に関する。この方法は、連続的な近似を使用して測定システムの検知器の較正電圧を決定するステップを含む。方法はまた、較正電圧を検知器に印加するステップを含む。一実施態様では、検知器が、アバランシェ・フォト・ダイオードを備えてもよい。異なる実施態様では、検知器が、光電子増倍管を備えてもよい。
【００２６】
一実施態様では、方法は、較正電圧を検知器の遮断電圧と比較するステップと、較正電圧が遮断電圧を超えているか否かを決定するステップを繰り返すステップとを含んでいる。方法の異なる実施態様は、検知器信号レベルを決定するために検知器サンプルを収集し、処理するステップを含む。このような一実施態様では、方法は、検知器信号レベルを較正目標信号レベルと比較し、検知器信号レベルが、較正目標信号レベルを超えている場合、検知器のバイアス電圧を低下させ、較正電圧を決定するステップを繰り返すステップを含んでいる。別のこのような実施態様では、方法は、検知器信号レベルを、較正目標信号レベルと比較し、検知器信号レベルが、較正目標信号レベルの所定の範囲内にない場合、すべての所望の検知器電圧レベルが達成されるまで、較正電圧を決定するステップを繰り返すステップを含んでいる。上記に記載された方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００２７】
さらなる実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための異なる方法に関する。この方法は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムを通って流れる流体の温度を監視するステップを含む。サンプル微小球体が流体内に配置される。本方法はまた、温度での流体の粘性から測定システム内のサンプル微小球体の速度を決定するステップを含む。
【００２８】
一実施態様では、方法は、サンプル微小球体の１つが、速度を基にして測定システムの検知ウィンドウ内に存在する時間の長さを決定するステップを含んでいる。いくつかの実施態様では、方法は、サンプル微小球体の１つが速度を基にした測定システムの一方の検知ウィンドウから測定システムの別の検知ウィンドウへ移動する時間の長さを決定するステップを含んでいる。別の実施態様では、方法は、サンプル微小球体の１つが、速度を基にした測定システムの検知ウィンドウ内にいつ存在するかを決定するステップを含んでいる。さらに別の実施態様では、方法は、速度を補償するための測定システムの１つまたは複数の検知ウィンドウに対してサンプリング間隔を制御するステップを含んでいる。
【００２９】
追加の実施態様では、パラメータを監視するステップと速度を決定するステップが、測定システムによるサンプル微小球体の測定を実行する前に行われる。いくつかの実施態様では、方法は、速度から測定システムの出力信号の１つまたは複数の特性を決定するステップを含んでいる。このような一実施態様では、方法は修正係数を使用して速度による誤差に対して出力信号を修正するステップを含んでいる。修正係数が経験的な測定を使用して決定される。別の実施態様では、測定システムが、サンプル微小球体の測定中、流体のほぼ一定の圧力を維持するように構成されている。
【００３０】
一実施態様では、速度を決定するステップが、表から、ポアズイユの式から、または速度対温度の所定の値から速度を決定するステップを含んでいる。このようないくつかの実施態様では、方法は、速度を基にしたサンプル微小球体の測定中、流体の圧力を制御するステップを含んでいる。上記に記載された方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００３１】
異なる実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための別の方法に関する。この方法は、微小球体が、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの第１の検知ウィンドウから、測定システムの第２の検知ウィンドウへ移動する時間を測定するステップを含む。本方法はまた、時間がほぼ一定であるように測定システムに付加される圧力を変更するステップを含む。一実施態様では、時間は平均時間である。微小球体はサンプル微小球体または較正微小球体であってもよい。時間を測定するステップが、第１と第２の検知ウィンドウ内の微小球体によって散乱される光を測定するステップを含んでいる。別の実施態様では、時間を測定するステップが、１つの検知器で第１と第２の検知ウィンドウ内の微小球体によって散乱される光を測定するステップを含んでいる。第１と第２の検知ウィンドウ内の微小球体によって散乱された光が、１つのビーム・スプリッタによって１つの検知器へ向けられてもよい。本方法は、リアル・タイムで行われても行われなくてもよい。上記に記載された方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００３２】
さらなる実施態様は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための異なる方法に関する。この方法は、微小球体が、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの第１の検知ウィンドウから、測定システムの第２の検知ウィンドウへ移動する平均時間を測定するステップを含む。微小球体が、サンプル微小球体、較正微小球体、または較正微小球体とサンプル微小球体を含んでいる。本方法はまた、基準微小球体が第１の検知ウィンドウから第２の検知ウィンドウへ移動した基準時間と平均時間を比較するステップを含む。また、本方法は、平均時間と基準時間の間の差が所定の値よりも大きい場合、測定システムに付加される圧力を変更するステップを含む。
【００３３】
一実施態様では、付加される圧力を変更するステップが、平均時間が基準時間よりも大きい場合、付加される圧力を増加させるステップを含む。別法として、付加される圧力を変更するステップが、平均時間が基準時間よりも小さい場合、付加される圧力を低下させるステップを含む。いくつかの実施態様では、所定の値が、測定システムの公知の時間変動機構を補償するように選択される。この方法は、リアル・タイムで行われても行われなくてもよい。上記に記載された方法の実施態様のそれぞれは、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００３４】
本発明の他の目的および利点は、以下の詳細な説明を読み、添付の図面を参照にすれば明らかにあるであろう。
【００３５】
本発明は、様々な修正形態と代替となる形態が可能であるが、その特定の実施形態が図面で一例として示されており、ここで詳細に説明される。しかし、図面とそれに対する詳細な説明は、本発明をここに開示された特定の形態に限定するように意図されておらず、逆に、本発明は、頭記の特許請求の範囲で定義されたような本発明の精神および範囲内にあるすべての修正形態、等価物、代替形態をカバーするものであることを理解されたい。
【００３６】
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法のいくつかの異なる実施形態が、ここで説明される。上記で述べたように、方法のそれぞれは、別々に使用され、実行される。また、方法の２つ以上が、たとえば、測定システムの様々な構成要素の変動性および／または測定システムの所望の精度に応じて、組み合わせて使用または実行されてもよい。
【００３７】
実施形態は、微小球体またはポリスチレン・ビードに関してここで説明されているが、測定システムと方法は、マイクロ粒子、金ナノ粒子、ビード、マイクロ・ビード、ラテックス粒子、ラテックス・ビード、蛍光ビード、蛍光粒子、着色粒子、着色ビード、セルとともに使用されてもよいことを理解されたい。微小球体は、分子反応のための媒体の働きをする。適切な微小球体、ビード、粒子の例が、本明細書で完全に説明されるかのように参照によって組み込まれる、Ｆｕｌｔｏｎに対する米国特許第５７３６３３０号、Ｃｈａｎｄｌｅｒ他に対する第５９８１１８０号、Ｆｕｌｔｏｎに対する第６０５７１０７号、Ｃｈａｎｄｌｅｒ他に対する第６２６８２２２号、Ｃｈａｎｄｌｅｒ他に対する第６４４９５６２号、Ｃｈａｎｄｌｅｒ他に対する第６５１４２９５号、Ｃｈａｎｄｌｅｒ他に対する第６５２４７９３号、Ｃｈａｎｄｌｅｒに対する第６５２８１６５号に示されている。本明細書に記載された測定システムと方法は、これらの特許に記載された微小球体、ビード、粒子のいずれかとともに使用されてもよい。また、フロー・サイトメトリで使用するための微小球体は、テキサス州オースチンのＬｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．などの製造業者から得られる。「ビード」、「微小球体」という用語は、本明細書では交換可能に使用されている。
【００３８】
図１は、本明細書に記載された方法を行うために使用される測定システムの一例を示している。特に、図１に示した測定システムの１つまたは複数のパラメータは、本明細書に記載された方法に従って決定、監視、変更、および／または制御される。本明細書に記載された図面は一定の縮尺で描かれていないことに留意されたい。特に、図面の要素のいくつかの縮尺は、要素の特性を強調するために大きく誇張されている。測定システムのいくつかの要素は、明確化のために図面に含まれない。
【００３９】
図１では、測定システムが、微小球体１０がそれを通って流れるキュベット１２の断面を通る平面に沿って示されている。ある例では、キュベットは、標準的なフロー・サイトメータで使用されているものなどの標準的なクオーツ・キュベットである。しかし、他の適切なタイプの視認または移送チャンバが、解析用のサンプルを移送するために使用されてもよい。測定システムは、光源１４を備える。光源１４は、レーザなどの当技術分野で公知のいずれかの適切な光源である。光源は、青色光または緑色光などの１つまたは複数の波長を有する光を放出するように構成されてもよい。光源１４は、微小球体がキュベットを通って流れるとき微小球体を照射するように構成される。照射は、微小球体に１つまたは複数の波長または波長域を有する蛍光を放出させる。いくつかの実施形態では、システムは、光源からの光を微小球体または流路上に合焦させるように構成された１つまたは複数のレンズ（図示せず）を備えている。システムはまた、２つ以上の光源を有してもよい。一実施形態では、光源は、異なる波長または波長域を有する光（たとえば、青色光および緑色光）で微小球体を照射するように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、光源は、異なる方向で微小球体を照射するように構成されてもよい。
【００４０】
微小球体から前方に散乱された光は、折りミラー１８または別の適切な光を向ける構成要素によって検知システム１６へ向けられる。別法として、検知システム１６は、前方に散乱された光の経路内に直接配置されてもよい。このように、折りミラーまたはその他の光検知構成要素は、システム内に備えられなくてもよい。一実施形態では、前方に散乱された光は、図１に示すように、光源１４によって照射方向から約１８０°の角度で微小球体によって散乱された光であってもよい。前方に散乱された光の角度は、光源からの入射光が検知システムの光感受性の表面に影響を与えることのないように、照射方向から厳密に１８０°でなくてもよい。たとえば、前方に散乱された光は、照射方向から１８０°よりも小さいまたは大きい角度で微小球体によって散乱された光（たとえば、約１７０°、約１７５°、約１８５°、または約１９０°の角度で散乱された光）である。
【００４１】
照射方向から約９０°の角度で微小球体によって散乱された光も収集される。一実施形態では、この散乱された光が、１つまたは複数のビーム・スプリッタまたはダイクロイックミラーによって２つ以上の光線に分離される。たとえば、照射方向に対して約９０°の角度で散乱された光が、ビーム・スプリッタ２０によって２つの異なる光線に分離される。２つの異なる光線が、４つの異なる光線を作成するためにビーム・スプリッタ２２、２４によって再び分離される。光線のそれぞれは、１つまたは複数の検知器を備える異なる検知システムへ向けられる。たとえば、４つの光線のうちの１つが、検知システム２６へ向けられてもよい。検知システム２６は、微小球体によって散乱された光を検知するように構成される。
【００４２】
検知システム１６および／または検知システム２６によって検知される散乱された光は、光源によって照射されている粒子の体積にほぼ比例する。したがって、検知システム１６の出力信号および／または検知システム２６の出力信号が、照射ゾーンまたは検知ウィンドウ内にある粒子の直径を決定するために使用される。また、検知システム１６および／または検知システム２６の出力信号が、互いに重なっているまたは照射ゾーンをほぼ同時に通過する２つ以上の粒子を同定するためにも使用される。したがって、このような粒子は、他のサンプル微小球体と較正微小球体とは区別される。さらに、検知システム１６および／または検知システム２６の出力信号が、サイズに基づいて本明細書に記載されるようにサンプル微小球体と較正微小球体を区別するためにも使用される。
【００４３】
他の３つの光線が、検知システム２８、３０、３２へ向けられる。検知システム２８、３０、３２は、微小球体によって放出される蛍光を検知するように構成される。検知システムのそれぞれは、異なる波長と異なる波長範囲の蛍光を検知するように構成されてもよい。たとえば、検知システムのあるものが緑色蛍光を検知するように構成される。検知システムの別のものが、黄橙色蛍光を検知するように構成され、他の検知システムが赤色蛍光を検知するように構成されてもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態では、スペクトル・フィルタ３４、３６、３８が、それぞれ検知システム２８、３０、３２と結合されている。スペクトル・フィルタは、検知システムがそれを検知するように構成されているもの以外の波長の蛍光を阻止するように構成されてもよい。また、１つまたは複数のレンズ（図示せず）が、検知システムのそれぞれと光学的に結合されてもよい。レンズは、散乱された光または放出された蛍光を検知器の光感受性の表面上に合焦するように構成される。
【００４５】
検知器の出力電流は、それに入射する蛍光に比例し、電流パルスを結果として生じさせる。電流パルスは、電圧パルスに変換され、ローパス・フィルタをかけられ、その後Ａ／Ｄ変換器によってデジタル化される。ＤＳＰなどのプロセッサ４０が、蛍光の大きさを表す数を作成するためにパルスの下の面積を積分する。また、プロセッサは、本明細書に記載された追加の機能（たとえば、フロー・サイトメータ・タイプ測定システム１つまたは複数のパラメータを監視すること、１つまたは複数のパラメータを監視されたパラメータに基づいてリアル・タイムで変更することなど）を行ってもよい。図１に示すように、プロセッサ４０は、伝送媒体４２を介して検知器２６と結合されている。プロセッサ４０は、伝送媒体４２やＡ／Ｄ変換器などの１つまたは複数の他の構成要素（図示せず）を介して間接的に検知器２６と結合されてもよい。プロセッサは、同様にしてシステムの他の検知器と結合されてもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、微小球体によって放出された蛍光から発生される出力信号が、微小球体の同一性と微小球体の表面上で起こっている反応についての情報を決定するために使用されてもよい。たとえば、検知システムのうちの２つの出力信号が微小球体の同一性を決定するために使用され、他の検出システムの出力信号が、微小球体の表面上で起こっている反応を決定するために使用されてもよい。したがって、検知器とスペクトル・フィルタの選択は、微小球体に組み込まれているか結合されている色素のタイプ（すなわち反応に含まれる反応剤に組み込まれているか結合されている色素）に応じて様々であってもよい。
【００４７】
サンプル微小球体の同一性を決定するために使用される検知システム（たとえば、検知システム２８および３０）は、ＡＰＤ、ＰＭＴまたは別の光検知器であってよい。ＡＰＤは、本明細書に記載されているような温度の関数としてのゲイン変動に対してリアル・タイムで修正されてもよい。微小球体の表面で起こっている反応を同定するために使用される検知システム（たとえば検知システム３２）は、ＰＭＴ、ＡＰＤ、または別の形態の光検知器であってよい。ＰＭＴは、本明細書に記載されているようなＰＭＴの出力信号に適用できるＰＭＴ特性曲線から導出された単純な乗数を使用して修正されてもよい。検知器と測定システムは、本明細書に記載されているようにさらに構成されてもよい。
【００４８】
図１のシステムは、異なる色素特性を有する微小球体の間を区別するための２つの異なる検知ウィンドウを有する２つの検知システムを備えるように示されているが、システムは３つ以上のこのような検知ウィンドウ（すなわち、３つの検知ウィンドウ、４つの検知ウィンドウなど）を備えてもよいことを理解されたい。このような実施形態では、システムは、追加のビーム・スプリッタや、他の検知ウィンドウを有する追加の検知システムを備えてもよい。また、スペクトル・フィルタおよび／またはレンズが、追加の検知システムのそれぞれと結合されてもよい。
【００４９】
別の実施形態では、システムは、微小球体の表面上で反応された異なる材料の間を区別するように構成された２つ以上の検知システムを備えてもよい。異なる反応剤材料は、微小球体の色素特性とは異なる色素特性を有していてもよい。
【００５０】
本明細書に記載された方法を行うために使用される測定システムの追加の例が、本明細書で完全に説明されるかのように参照によって組み込まれる、Ｃｈａｎｄｌｅｒ他に対する米国特許第５９８１１８０号、Ｃｈａｎｄｌｅｒに対する第６０４６８０７号、Ｃｈａｎｄｌｅｒに対する第６１３９８００号、Ｃｈａｎｄｌｅｒに対する第６３６６３５４号、Ｃｈａｎｄｌｅｒに対する第６４１１９０４号、Ｃｈａｎｄｌｅｒ他に対する第６４４９５６２号、およびＣｈａｎｄｌｅｒ他に対する第６５２４７９３号に示されている。本明細書に記載された測定システムは、これらの特許に記載されているようにさらに構成されてもよい。
【００５１】
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムでは、散乱された光とビードの同一性の検知は、光センサとしてのアバランシェ・フォト・ダイオード（ＡＰＤ）を使用して一般に行われる。ＡＰＤは、ＡＰＤの出力電流レベルすなわち「ゲイン」が、逆バイアス電圧の印加を通じて広範囲にわたって変化するため、他の検知器よりも有利である。一定数の入力光子の結果として流れる電子の観点から表現されるゲインは、印加されるバイアス電圧の大きさに比例する。不運なことに、入力光子から出力電子への変換は、温度にかなり依存する。したがって、ＡＰＤは、かなり温度に依存し、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの他のいかなる要素よりも依存する。
【００５２】
したがって、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法の一実施形態は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの近傍の温度を監視することを含む。方法はまた、温度に応答して測定システムのＡＰＤのバイアス電圧を変更することをも含んでもよい。
【００５３】
各ＡＰＤは、ほぼ同一の照射の下でシリコーン・ダイオードの出力電流よりも６０倍大きい出力電流を達成する逆バイアス電圧（Ｖ６０）の観点で製造業者によってランク付けされている。個々のデバイスに応じて、Ｖ６０は、１０ボルトから１００ボルトを超える範囲になり得る。
【００５４】
ＡＰＤの出力は、温度に対して非線形であるため、ＡＰＤの全動作範囲にわたって一定の補償係数を使用することができない。電流出力対温度の経験的な測定を、包括的な補償方法を開発するのに使用することができる。言い換えれば、ＡＰＤのパラメータを変更するのに使用される修正係数を、経験的に導出されたデータを使用して決定してもよい。特に、ＡＰＤのバイアス電圧は、温度によるアバランシェ・フォト・ダイオードのゲインの変化を実質上修正するために経験的に導出されたデータを使用して変更されてもよい。
【００５５】
経験的に導出されたデータによってＡＰＤの応答を特徴付けるために、ほぼ一定の光レベルが、１つまたは複数の温度でＡＰＤに加えられる。１つまたは複数の所与の温度で、ＡＰＤの電流出力が複数のバイアス電圧に対して記録される。温度が（たとえば全度増分で）変更され、電流測定が、複数のバイアス電圧で再び繰り返される。結果のデータの収集（図２に示すものなど）は、照射対温度による特定のＶ６０デバイスの電圧プロファイルを完全に示している。複数の異なるデバイスの応答を捕捉するために、これらの測定が、異なるＶ６０定格のＡＰＤに対して繰り返される。
【００５６】
一実施形態では、バイアス曲線表が、以下のようにして温度に対して修正するために使用される。最初のシステム較正中、既知の強度の光を放出する較正微小球体が、システムに導入される。較正微小球体がシステムを通って流れ、較正微小球体が測定システムによって測定されている間、所定の信号レベルがＡＰＤから得られるまでバイアス電圧を変更する。検知器に対するＶ６０、所定の信号レベルでのバイアス電圧、および温度が、ＡＰＤの電流読取値を表内へ挿入するためにＡＰＤ応答表への指標として次に使用される（Ｒ値）。
【００５７】
別の実施形態では、バイアス曲線表が、以下のようにして作成される。発光ダイオード（ＬＥＤ）などの一定の光出力源が、光ファイバ・ケーブルを介して間接的にＡＰＤの光感受性の領域を照射するために使用される。次に、ＡＰＤが、ＡＰＤが曝露される周囲温度を変更する能力を有する周囲のチャンバ内に配置される。温度とＡＰＤへのバイアス電圧の両方が変更されるが、測定システムがそのとき、ＡＰＤの電流出力（Ｒ値）を記録する。
【００５８】
通常のサンプルが行われている間、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの近傍の温度を監視する。次に、所望の相対電流、温度、経験的に導出されたデータを使用してバイアス電圧を決定する。たとえば、Ｒ値、測定された温度、Ｖ６０パラメータが、対応するバイアス電圧を見出すためにＡＰＤ応答表への入力として使用される。測定された温度が表入力値の間にある場合、最も近い温度入力値に対応する読取値が、最良のバイアス電圧を見出すように補間される。表から得られたバイアス電圧が、その温度によるゲイン変化を修正するためにＡＰＤに印加される。サンプル動作は通常継続時間２分未満であり、温度がこの量の時間にわたってほとんど変化しないため、サンプル動作の最初に単一回のバイアス修正を行い、動作の継続時間の間このバイアスを保持することで、ほぼ十分である。言い換えれば、測定システムによってサンプル測定が行われる前に、バイアス電圧が変更され、バイアス電圧はサンプル測定を通じてほぼ一定である。しかし、測定システム近傍の温度が、サンプル動作中の時間にわたって監視され、ＡＰＤのバイアス電圧がそれに応じて変更されてもよい。このようにして、温度を監視することとＡＰＤのバイアス電圧を変更することをリアル・タイムで行うことができる。
【００５９】
いくつかのフロー・サイトメータ測定システムのレポータ・チャネルは、光感受性の検知器として光電子増倍管（ＰＭＴ）を備える。レポータ・チャネルが、微小球体の表面上で起こっている反応に含まれる材料または微小球体の表面と結合された材料を同定するために使用されるチャネルとして一般に定義されてもよい。ＰＭＴが、光電陰極を照射する光の量、印加されたバイアス電圧、ＰＭＴ内の内部ダイノードの数に比例して電流を発生させる。フロー・サイトメータ内では、ＰＭＴのバイアス電圧が、所与のレベルの蛍光のための電流出力を正規化するための「制御」点として通常使用される。較正手順の間に正規化された電圧を発見するために現在使用されている方法は、測定が行われ、熟練した推測が、所望の値により近い出力の結果を生じさせそうなＰＭＴバイアス設定に関して行われるという点で、経験的である。しばしば、出力誤差レベルが許容可能な範囲内になる前に多くの反復計算が必要である。したがって、較正時間を短縮し、このようにして、最良のＰＭＴ電圧を見出すために使用される較正試薬の量を減少させることが有利であろう。現在使用可能であるものよりも較正プロセスを高速化するいくつかの異なる方法が以下で説明される。
【００６０】
温度に対するほぼ線形の応答のため、ＰＭＴは、ＡＰＤよりも温度変化を補償することがずっと簡単である。たとえば、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法の一実施形態は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの近傍の温度を監視することを含む。温度は、ＰＭＴのできる限り近傍で通常測定されるが、ＰＭＴの比較的穏やかな温度変化速度のため正確な位置は重要でない。方法はまた、ＰＭＴが、温度によるＰＭＴの出力信号のゲインの変化を実質上修正するために、特定曲線を使用する温度に応答して測定システムのＰＭＴの出力信号を変更することを含む。ＰＭＴのゲインは、温度に応答して近似的に線形に変化する。また、ＰＭＴに対する特性曲線は、検知波長と陰極構成とともに変化する。このようにして、所与の検知波長と陰極構成に対して、温度に対するＰＭＴの応答は、本明細書で完全に説明されるかのように、参照によって本明細書に組み込まれる、「Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ ｔｕｂｅ−Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｋ．Ｋ．，１９９４から取った図３に示すように、単純な線形関係を介して表現できる。
【００６１】
ＰＭＴのゲインが、前に議論したＡＰＤよりもずっと低い温度とともに変化するため、ゲインを変更したり、バイアス電圧を決定したりすることによって、デバイスを補償することは一般に必要ない。その代わりに、図３に示すもののようなＰＭＴ特性曲線から導かれた簡単な乗数を使用することで十分である。これは、記録ソフトウェアを介して最終的なＰＭＴ読取値に加えられる。
【００６２】
ＰＭＴを較正するために、公知の量の蛍光を有する較正微小球体が、機器のために表され、通常のサンプルと同時にシステムを通る流れが得られる。較正微小球体が測定システムによって測定されている間、バイアス電圧が、所定の信号レベルが得られるまで変更される。
【００６３】
この方法は、１組の微小球体読取値の統計値が計算され、所望の公差が満たされた場合プロセスを終了するために使用される反復計算プロセスである。誤差が十分に小さくない場合、前の２つの反復計算による結果が、次のＰＭＴバイアス設定を予測するために使用されてもよい。線ｙ＝ｍ＊ｘ＋ｂの式が、プロセスに採用される。ここで、傾きｍは、前のバイアスと、結果としての蛍光性測定によって定義される。ＰＭＴのバイアス電圧の電流ゲインへの変換関数が線形である場合、最終的な解が直接得られ、１つの追加の測定で試験される。しかし、電流ゲイン変換関数に対するＰＭＴのバイアスが、バイアス電流とともに指数的に増加するため、線形方法は、曲線の比較的小さい部分に対してしか働かず、したがって、最終的な公差要求を満たすためにいくつかの反復計算を必要とする。
【００６４】
興味深いことに、ゲインに対するＰＭＴ電圧が、対数−対数グラフ（図４参照）にプロットされるとき、変換関数は直線として表される。図４のデータは、「Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ−Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｋ．Ｋ．，１９９４から引用されている。
【００６５】
上記で述べたように、内部ダイノード・カウントと印加されるバイアス電圧が、ＰＭＴの電流増幅を支配する。式１に示すように、固定されたレベルの光に対して、出力電流は、Ｎ次のパワーへ上昇されたＶに比例する。ここで、Ｖは印加されるバイアス電圧であり、Ｎはダイノードの数であり、Ａは、ＰＭＴのいくつかの物理的態様を含む比例定数である。
ｉ＝Ａ＊ＶN （１）
式１の両辺の対数をとると、以下の式になる。
ｌｏｇ（ｉ）＝Ｎ＊ｌｏｇ（Ｖ）＋ｌｏｇ（Ａ） （２）
これは、以下の簡単で見慣れた一次の線形式に書き直される。
ｙ＝ｍ＊ｘ＋ｂ （３）
ここで、ｙ＝ｌｏｇ（ｉ）、ｍ＝Ｎ、ｘ＝ｌｏｇ（Ｖ）、ｂ＝ｌｏｇ（Ａ）。この対数変形を使用して、わずか３つのサンプル測定によって短縮された較正操作を行うことが可能である。
【００６６】
たとえば、一実施形態では、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するために方法は、測定システムのＰＭＴの電圧を第１の値と第２の値に設定することを含む。方法はまた、第１と第２の値のＰＭＴの出力電流を測定することを含む。また、方法は、第１と第２の値の対数対第１と第２の値の出力電流の対数からＰＭＴの較正電圧を決定することを含む。方法は、較正電圧をＰＭＴに印加すること、およびＰＭＴの１つまたは複数のパラメータが所定の公差内にあるかを判定するためにＰＭＴを試験することをさらに含む。
【００６７】
このような方法のある特定の例は、以下の１から７のステップにまとめられる。
１．値の範囲に近接するまたはその範囲の下端での値（Ｖ＝ＶL）にＰＭＴ電圧を設定し、測定値（ｉ＝ｉL）を得る。
２．値の範囲に近接するまたはその範囲の上端での値（Ｖ＝ＶH）にＰＭＴ電圧を設定し、測定値（ｉ＝ｉH）を得る。
３．４つの値すべての対数をとる。
４．傾きｍと切片ｂを計算する。
５．目標ＰＭＴ設定値（対数空間での）ｘcalを解く。
６．ＰＭＴ較正電圧Ｖcalを得るためにｘcalの逆対数をとる。
７．Ｖcalを印加し、所望の公差が満たされているか否かを判定するために試験する。
【００６８】
この方法は、試験され、公差内に毎回成功して収束される。公差が満たされない場合、許容可能な答えが、前に計算したＶcal、ｉcalとＶH、ｉHを使用して対数空間内に新しい傾きと区切りを生成することによって生じる。点Ｖcal、ｉcalは、最終的なＰＭＴ電圧に比較的近くなりそうであり、新しい線に沿った短い通過のみが、許容可能な答えの作成に必要とされる。この場合、４つのサンプル測定が、正確な較正電圧を見出すために使用されることになる。
【００６９】
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの検知器を較正するための別の有利な方法は、連続的な近似を使用することによって較正反復計算を減少させることである。一実施形態では、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法は、図５のステップ５０に示すように、連続的な近似を使用して測定システムの検知器の較正電圧を決定することを含む。較正の成功を達成することなく考えられるすべての較正電圧が検知器に印加されたとき、方法は、ステップ５２に示すように、較正が失敗に終わる。検知器はＡＰＤ、ＰＭＴまたは測定システムに適した他のいずれの検知器であってもよいため、ステップ５４に示すように、各検知器電圧が検知器電圧限界と比較される。較正電圧が電圧限界を超えている場合、異なる較正電圧が、少なくともステップ５０を繰り返すことによって決定できる。
【００７０】
ステップ５６、５８、６０に示すように、方法は、較正電圧を検知器に印加し、検知器からデータを収集し、収集されたデータのヒストグラムを構成し、ヒストグラムのピーク値を計算し、ヒストグラムのピーク値を較正目標ピーク値と比較することを含んでいる。ヒストグラムのピーク値が較正目標ピーク値に十分近い場合、ステップ６２に示すように、較正を終了してもよい。
【００７１】
方法はまた、ステップ６４に示すように、ヒストグラムのピーク値が較正目標ピーク値を超えているか否かを判定することを含んでいる。ステップ６４の出力が、ステップ５０の連続的な近似法によって生成される次の較正電圧を修正するために使用される。
【００７２】
方法は、ヒストグラムに関して上記で説明されているが、方法は、いかなる適切な統計的測定を使用して行われてもよいことを理解されたい。たとえば、検知器信号レベルを決定するいかなる適切な方法が使用されてもよく、これは、平均値、中央値などのビード・サンプルの収集から測定値を決定する統計的方法を含んでいるが、必ずしもそうである必要はない。
【００７３】
特に、連続的な近似は、命令文中のビットを設定し、クリアすることによって、測定された値を目標値と等しくするためにＮ回まで試行するのみである。一実施形態では、方法は、検知信号レベルを決定するために検知サンプルを収集し、処理することを含んでいる。このような実施形態では、方法は、検知信号レベルを較正目標信号レベルと比較することを含み、検知信号レベルが較正目標信号レベルを超えている場合、検知器バイアス電圧を減少させて、較正電圧の決定を繰り返す。別のこのような実施形態では、方法は、検知信号レベルを較正目標信号レベルと比較することを含み、検知信号レベルが、較正目標信号レベルの所定の範囲内にない場合、すべての所望の検知器電圧レベルが試行されるまで、較正電圧の決定を繰り返す。
【００７４】
このような方法のある特定の例は以下のステップを含んでいる。
１．ビット・マスクとＤａｃＣｍｄ値を２Nに初期化する。１２ビットのＤａｃ（「デジタル・アナログ変換器」）に対して、Ｎ＝１２である。この例では、ビット・マスク＝４０９６、ＤａｃＣｍｄ値＝４０９６である。Ｄａｃは、マサチューセッツ州、ノーウッドのＡｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．から市販されているものなどのあらゆる適切なＤａｃを含んでいる。
２．ＤａｃＣｍｄ内の対応するビットをクリアするために現在のマスク・ビットを使用する。目標を超えるか、検知器の最大電圧制限を越えるかのいずれかである。
３．マスクを右へ１ビット移動させる（たとえば次の最も重大なビットへ移動させる）。
４．マスクが０である場合、考えられるすべてのビットが試験され、十分な較正が達成されなかった。方法はステップ１２へ進んでもよい。
５．そうでない場合、次に最も重要なビットを設置するためにＤａｃＣｍｄ内をマスクする。
６．このＤａｃＣｍｄバイナリ値に対応する検知器電圧を決定する。検知器電圧を検知器遮断または最大電圧と比較する。電圧が検知器遮断電圧を超える場合、ステップ２へ戻る。
７．ＤａｃＣｍｄ値（たとえば電圧）を測定システムに送信する。
８．電圧変化が有効になるのを待つ。
９．新しいヒストグラム・ピーク値を、このチャネルのための較正目標ピーク値と比較する。ヒストグラム・ピークが較正目標を超えている場合、ステップ２に戻る。
１０．ヒストグラム・ピークが所望の目標に十分近接していない場合、ステップ３へ行く。
１１．較正は成功した。方法を完了する。
１２．較正は失敗した。方法を完了する。
ステップ１〜１２に記載した例の方法は、本明細書に記載した他のいずれかのステップを含んでいる。
【００７５】
いくつかのフロー・サイトメータ測定システムは、ビードが２つの検知ウィンドウを通過するとき、個々の測定に対してビードを分離させるために静水圧集束技術を使用する。検知ウィンドウは固定されたサイズと物理的な分離を有する。たとえば、測定システム内の光源の照射されるスポットの間の距離が、分離を決める。
【００７６】
潜在的な流体移動の速度変化が、ビードが検知ウィンドウ内に存在する時間の長さと、１つのウィンドウから次のウィンドウへ通過するための分離時間を変化させる。最終的な読取は、ビードが各検知ウィンドウ内に存在する時間の長さに比例する。また、システムは、第２の検知ウィンドウをいつ活動化させるか（すなわち、いつビードが測定のために第２の検知ウィンドウ内に配置されるか）を決定するためにウィンドウ間移行時間も使用する。実際のビードの存在に対するサンプル測定の時間に関する配列が、較正中に得られた値と異なる場合、または照射ウィンドウ内での継続（存在）時間が異なる場合、測定精度が劣化されることになる。
【００７７】
測定システムが、サンプル微小球体の測定中ほぼ一定の流体圧力を維持するように構成されている場合、温度の影響が、流体速度の変化を通じた速度変化に最大に寄与するものとなる。粘性の定義は、流体の流れに対する抵抗の測定値である。圧力Ｐで半径Ｒ、長さＬのチューブを通って単位時間当たりに流れる流体の体積は、ポアズイユの式を使用して表される。
Ｖ／Ｔ＝（π＊Ｒ4＊Ｐ）／（８＊Ｎ＊Ｌ） （４）
ここで、Ｖ／Ｔは単位時間当たりの体積（速度に比例する）であり、Ｎはポアズ単位での粘性である。フロー・チャンバの毛細管は、円形でなく矩形の寸法を有するが、単純なチューブとして扱われることができる。したがって、ビード速度は、上記のポアズイユの式で定義された流体移送の粘性に反比例する。
【００７８】
フロー・サイトメータ測定システムのビード移送として使用される流体の主な構成要素は水である。１５℃から３０℃の動作温度範囲にわたって、粘性は、１．１３９センチポアズから０．７９７５センチポアズへ変化し、これは大きい４３％の変化である。上記の粘性値は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｐｈｙｓｉｃｓ，第６１版，「Ｔｈｅ Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｔｅｒ ０ ｔｏ １００℃）」から得られた。シースとサンプル流体の速度もまたビードの速度が変化するように、約４３％だけ変化する。したがって、動作温度が測定され、流体の粘性を決定するために使用されてもよい。したがって、流体の速度は、表から、ポアズイユの式から、または速度対温度の所定の値から決定されてもよい。このような実施形態では、方法は、速度を基にしたサンプル微小球体の測定中、流体の圧力を制御することを含んでいる。
【００７９】
また、流体の粘性が、ビードの速度を決定するために使用されてもよい。このようにして、移行時間が抽出され、リアル・タイムで修正することができる。流体の温度がサンプル測定中実質上変化しない場合、温度を監視することと速度を決定することを、測定システムによってサンプル微小球体の測定を行う前に行ってもよい。しかし、この方法のステップはまた、リアル・タイムで行われてもよい。
【００８０】
したがって、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための一方法は、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムを通って流れる流体の温度を監視することを含む。サンプル微小球体が流体内に配置される。方法は、温度での流体の粘性から測定システム内のサンプル微小球体の速度を決定することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル微小球体の１つが、速度を基にした測定システムの検知ウィンドウ内に存在する時間の長さを決定することを含んでもよい。別の実施形態では、方法はまた、サンプル微小球体の１つが、速度を基にした測定システムのある検知ウィンドウから測定システムの別の検知ウィンドウへ移動する時間の長さを決定することを含んでもよい。また、方法は、サンプル微小球体の１つが、いつ速度ベースの測定システムの検知ウィンドウ内に存在するのかを決定することを含んでもよい。さらに、方法は、速度を補償するための測定システムの１つまたは複数の検知ウィンドウに対してサンプリング間隔を制御することを含んでもよい。
【００８１】
ウィンドウ間移行時間が測定され、システムの不揮発性メモリ、または初期較正手順中システムを制御するコンピュータに保存されてもよい。次に測定された移行時間が、第２の検知ウィンドウのサンプリング間隔を適切に刻時するために次のサンプル動作中に使用されてもよい。ウィンドウ間移行時間は、粘性変化を補償するために短縮または延長されてもよい。システムが較正されたときの温度対現在の温度が、適用される修正の量を決定するために使用される。温度対粘性係数の簡単な表が、システムを制御するコンピュータかシステムの不揮発性メモリのいずれかに記憶される。いずれの場合でも、移行時間修正係数が、表から計算され、サンプル動作が開始する前に適用されてもよい。別法として、当技術分野で公知の他のいかなる適切な方法も、修正係数を決定するために使用することができる。
【００８２】
方法はまた、速度から測定システムの出力信号の１つまたは複数の特性を決定することを含んでいる。たとえば、ビードが検知ウィンドウ内に存在する時間の長さは、検知器の出力電気パルスの振幅と形状を決定する。次に、パルスがアナログ・ローパス・フィルタを通過する。これは、振幅と形状の両方に重大な影響を有し、振幅を減少させ、パルス幅を伸長させる傾向がある。フィルタ後のパルスがデジタル化され、パルスの下の面積が測定され、光のレベルに近似的に比例する値の結果となる。
【００８３】
また、方法は、修正係数を使用して速度による誤差に対して出力信号を修正することを含んでいる。修正係数は経験的な測定を使用して決定されてもよい。流速の変化によるパルス幅変化に対する修正係数の表が、経験的な測定を使用して構成されてもよいことは当然である。表は、システムのメモリまたはシステムと結合された制御コンピュータに記憶される。
【００８４】
温度変化による速度変化を補償するための別の方法は、粘性の変化に比例して付加される流体圧力を変更することである。このことは、速度が一定であるという結果となり、したがって、各測定ウィンドウ内のまたは測定ウィンドウ間の時間が、さほど変化しないことによる。方法は、適切な圧力を動的に設定するために、ポアズイユの式を使用して直接リアル・タイムで、またはサンプル動作の最初に、またはポアズイユの式から計算された所定の表を介して、または別の方法を介して実行されてもよい。
【００８５】
これらの方法は、一定の圧力スキームにわたって大きく改良することが証明されたが、温度変化に対する追加の補償が望ましい。したがって、微調整機構を提供するために、上記に記載された方法とは別々に、または上記に記載された方法と組み合わせて使用される、別の方法が本明細書で説明される。上記に記載された方法とは違って、この方法は光学機構を採用している。また、方法は、測定と制御アルゴリズムを使用してもよい。しかし、本明細書に記載されているように、追加された光学機構とアルゴリズムにもかかわらず、方法は比較的低価格であり、迅速である。
【００８６】
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムが組立てられたとき、照射スポット（たとえばレーザ・スポット）の間の距離が最初に設定される。照射スポット（たとえば、または光線）の間の距離が減少するにつれて、ビードが検知ウィンドウの間を移動するのでより短い距離を有するため、ビード移送時間の速度変化の影響が、最小化される。
【００８７】
最小分離距離が、各光線の鉛直方向照射プロファイル（すなわち、微小球体が測定システムを通って流れる方向に対してほぼ平行な方向での各光線のプロファイル）によってさらに決まる。たとえば、光線の強度がピークからショルダへ迅速に低下し、第２の最大値がない場合、光源が、他の光源の照射スポット内に波及する傾向がないため、光線を互いに相対的に近接して配置することが可能である。このような重なりは、分類やレポータ・チャネルの間で複雑な補償スキームを必要とし、それによって感受性の損失を生じさせるため、光線の重なりを回避するように留意されたい。
【００８８】
前に説明したように、照射スポットの間のビード移行時間をほぼ一定に保持すること、さらに、速度と微小球体が各照射ウィンドウ内で消費する時間を実質上固定することは重要である。
【００８９】
ほぼ一定のビード移行時間を維持するための１つの方法は、ビードが２つの検知ウィンドウを移行するためにかかる平均時間をリアル・タイムで測定し、移行時間を一定に保持するために必要に応じて付加される圧力を制御することを含む。一実施形態によると、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法は、微小球体が、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの第１の検知ウィンドウから測定システムの第２の検知ウィンドウへ移動する時間を測定することを含む。一実施形態では、時間は平均時間であってよい。微小球体は、サンプル微小球体または較正微小球体であってよい。時間を測定することは、第１と第２の検知ウィンドウで微小球体によって散乱される光を測定することを含んでいる。別の実施形態では、時間を測定することは、１つの検知器によって第１と第２の検知ウィンドウで微小球体によって散乱される光を測定することを含んでいる。このような一実施形態では、第１と第２の検知ウィンドウで微小球体によって散乱された光が、１つのビーム・スプリッタによって１つの検知器に向けられる。方法はまた、時間がほぼ一定であるように測定システムの付加される圧力を変更することを含む。方法はリアル・タイムで行われてもよい。上記に記載された実施形態は、本明細書に記載された他のいかなるステップをも含んでいる。
【００９０】
不運なことに、大部分のフロー・サイトメータ・タイプ測定システムの最近の光学的デザインは、通常、事前に知られていない蛍光の放出が、ビードごとに一定ではなく、あるビードに対してはまさにゼロとなることがあるので、レポータ蛍光がちょうど測定されるところの第２の検知ウィンドウを通過する各ビードを検知することを不可能にする。明確な解決法は、ビードによって散乱される第２の照射源の光を測定するために追加の光検知器を追加することであるが、このことは、追加の電子部品とデジタル処理チェーンが新しい信号を処理するために追加されなければならないため、システムにかなりのコストを追加する。
【００９１】
提案された解決法は、両方の検知ウィンドウでの散乱を測定するために同じ散乱光検知器を使用することを含むため、簡単と低価格の両方である。現在の光学レイアウトは、第２の（レポータ）ウィンドウ内の散乱光が、散乱検知器に到達することを妨ぐため、検知器を、ビードから放出または反射されるすべての光を受けるように再配置することが必要である。これが行われた場合、各光源からの散乱に近似的に比例する顕著なピークが、下流の電子部品によって別々に識別できることになる。
【００９２】
図６は、本明細書に記載された方法を行うために使用できる測定システムの一実施形態を示している。図６に示すように、測定システムは、光源７０、７２を備える。光源７０は、たとえば、約６３９ｎｍの波長を有する光を放出するレーザである。このレーザは、測定システムの分類チャネルのための照射を供給するのに適している。光源７２は、たとえば、、約５３２ｎｍの波長を有する光を放出するレーザであってもよい。このレーザは、測定システムのレポータ・チャネルのための照射を供給するのに適している。各レーザの照射ゾーンは、ビード流（図示せず）の軸に沿って一致していないことに留意されたい。他の光源が、上記に記載された例の代わりに使用されてもよい。たとえば、光源と光源の波長は、測定されるサンプルに応じて変えてもよい。
【００９３】
図６に示すように、光源７０、７２の両方がキュベット７４を照射する。特に、光源７０、７２は、ビードがキュベット７４を通って流れるとき、ビード７６を照射するように構成されている。図６にさらに示されているように、光源７０、７２は、照射とほぼ反対の角度でビードを照射するように構成されている。しかし、光源が照射のいかなる適切な角度でビードを照射してもよいことを理解されたい。
【００９４】
両方の光源による照射によりビードによって散乱される光は、レンズ７８によって捕集される。レンズ７８は、当技術分野で知られているいかなる適切なレンズでもよい。また、レンズ７８は、反射性光コレクタと交換されてもよい、またはシステムに備えられなくてもよい。レンズ７８は、約９０°（光源７０、７２に対して）の捕集角で光を捕集するように示されているが、レンズが、光源に対していかなる適切な捕集角度で配置されてもよいことに理解されたい。
【００９５】
レンズ７８によって捕集された光が、ビーム・スプリッタ８０へ向けられる。ビーム・スプリッタ８０は、ガラス板または二色フィルタなどの当技術分野で知られているいかなる適切な光学構成要素を備えてもよい。ビーム・スプリッタ８０は、レンズによって捕集された光の一部分を検知器８２へ向けるように構成されている。検知器８２は、両方の（または複数の）光源による照射によりビードによって散乱された光を検知するように構成されてもよい。このようにして、上記で提供された光源の例に対して、検知器８２が、約５３２ｎｍと約６３９ｎｍの波長を有するビードによって散乱された光を検知するようにされてもよい。検知器は、ＣＣＤデバイスなどの当技術分野で公知のいかなる適切な検知器を備えてもよい。
【００９６】
したがって、検知器８２は、単一のビードに対して２つの異なる散乱信号を検知する。散乱信号は、光源の波長に基づいて決定される異なる波長で検知される。ビードがキュベットを通るとき各光源が異なる時間にビードを照射するので、測定システムの第１の検知ウィンドウから測定システムの第２の検知ウィンドウへビードまたは微小球体が移動する時間を測定するために、異なる散乱信号が検知される時間を使用することができる。
【００９７】
また、ビーム・スプリッタ８０は、レンズによって捕集された光の他の部分を伝送するように構成されている。光の伝送される部分は、光学構成要素８４によってシステムの検知サブ・システムの分類部分８６へ向けられてもよい。光学構成要素８４は、たとえば、折りミラー、二色ビーム・スプリッタ、部分的に透過性のミラー、または当技術分野で公知の他のいかなる適切な構成要素を含んでいる。別法として、光学構成要素８４が、たとえば、検知サブ・システムの分類部分の配置に応じてシステムに備えられなくてもよい。検知サブ・システムの分類部分は、当技術分野で公知のいかなる適切な構成要素を備えてもよい。いくつかの実施形態では、検知サブ・システムの分類部分は、図１に記載され、示されているように構成されてもよい。ビーム・スプリッタ８０によって伝送される光の別の部分は、検知サブ・システムのレポータ・チャネル（図示せず）へ向けられても良い。このシステムは、分類のために第１の照射ゾーンを、レポータ信号のために第２の照射ゾーンを使用するが、この技術を採用しているデバイス内での使用は、これらの測定に限定されない。蛍光性のまたは散乱された光を、セル、ビードまたはその他の粒子内の蛍光レポータまたはその他の色素の測定などの、別の目的のために使用することができる。
【００９８】
ビーム・スプリッタ８０によって検知器８２へ向けられる蛍光の放出は、たとえあるとしても、それらの大きさは散乱される光の大きさをかなり下回るため、散乱信号に追加するが、少しも重要でない。上記に記載されたように、図６に示す例は、散乱された光を、再配置された検知器へ向け、分類検知器に付加されるスペクトルを修正しないためにビーム・スプリッタに依存する波長であるビーム・スプリッタ８０を採用している。明らかに、他の実施形態が可能である。たとえば、追加の部分が何も設けられないように検知器を構成することが考えられる。図６に示すシステムは、本明細書で記載されたようにさらに構成されてもよい。
【００９９】
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法の別の実施形態は、微小球体が、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの第１の検知ウィンドウから測定システムの第２の検知ウィンドウへ移動する平均時間を測定することを含む。微小球体は、サンプル微小球体、較正微小球体、またはそれらの組合せを備えてもよい。方法は、平均時間を、基準微小球体が第１の検知ウィンドウから第２の検知ウィンドウへ移動する基準時間と比較することを含む。方法は、基準時間を含んでも含まなくてもよい。また、方法は、平均時間と基準時間の間の差が所定の値よりも大きい場合、測定システムに付加される圧力を変更することを含む。いくつかの実施形態では、所定の値が、測定システムの既知の時間変化機構を補償するように選択される。一実施形態では、付加される圧力を変更することは、平均時間が基準時間よりも大きい場合、付加される圧力を増加させることを含む。異なる実施形態では、付加される圧力を変更することは、平均時間が基準時間よりも小さい場合、付加される圧力を減少させることを含む。この方法もまた、リアル・タイムで行われてもよい。
【０１００】
上記に記載された方法は、連続する散乱パルスの間の時間がほぼ一定であるようにシステム圧力を直接制御するための技術を提供する。この技術は、電子ハードウェア（たとえば、カウンタ、デジタル補償器など）、またはデジタル信号プロセッサまたは別の適切なプロセッサによって測定されたサンプルされた信号を使用するソフトウェアを使用して、実現できる。いずれの実施形態でも、方法は類似的であり、同じ結果が得られる。アルゴリズムの高いレベルの説明が、以下のステップ１〜６で提供され、パルス列の例が図７に示されている。
【０１０１】
１．システムが、既知の圧力と温度で較正されるとき、連続する散乱パルス・ピークの間の平均移行時間が、測定され、後の参照のために保存される。
２．通常のサンプル取得中、赤色レーザ（または最初にビードを照射する他のいかなる光源）からの第１の散乱パルスがタイマを始動させる。たとえば、図７に示すように、ｔ1で、６３９ｎｍの波長を有するレーザによる照射に対応する散乱パルスが検知される。したがって、タイマは、ｔ1で始動される。
３．第２の散乱パルスが到達したとき、タイマが停止される。たとえば、５３２ｎｍの波長を有するレーザによる照射に対応する散乱パルスが図７に示すようにｔ2で検知され、そのときタイマが停止する。
４．そのとき、タイマの値が、較正操作中に計測された移行時間と比較される。
５．タイマの値が較正時間よりもかなり大きいとき、圧力源（たとえばポンプ）の１つまたは複数のパラメータが、その圧力を増加させるように変更される。圧力源のパラメータは、プロセッサによって変更されてもよい。別法として、ｔ2とｔ1の間の差がｔcalよりも大きい場合、圧力源の圧力が増加されてもよい。ｔcalは、ビードの移行時間の許容可能な変化を定義する所定の値である。
６．タイマ値が、較正時間よりもかなり小さい場合、圧力源の１つまたは複数のパラメータが、その圧力を減少させるように変更される。１つまたは複数のパラメータは、プロセッサによって変更されてもよい。別法として、ｔ2とｔ1の間の差がｔcalよりも小さい場合、圧力源の圧力が減少されてもよい。ステップ５、６で使用されるｔcalは、同じ値であってもよい。
【０１０２】
この「制御システム」を比較的安定して保持するために、考慮に入れることができるいくつかのことがある。たとえば、方法は、システムが、試行するために、およびシステムを通過する各ビード事象に対して正または負の圧力修正を行うために、制御されないように行われる。いくつかの平均方法が、少なくとも部分的にサンプル・コアの速度勾配の結果生じると考えられている「ビード・ジッター」と呼ばれる知られている時間変化機構を補償するために採用されてもよい。また、圧力修正を生じさせる時間誤差の閾値は注意深く選択されるべきである。誤差の大きさは、圧力修正の量を決定するコントローラへの入力として最もよく使用される。古典的な積分微分コントローラを性能のよい動作のために使用できることはもちろんである。
【０１０３】
上記で列挙された修正係数を、サンプル微小球体の測定の前に測定誤差の主要な部分を修正するために使用できるが、上記の技術が実施された後に存在することがある残留誤差を補償する測定プロセス中に細かい修正が行われてもよい。たとえば、フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための一方法は、測定システムによるサンプル微小球体の測定中、測定システムの１つまたは複数のパラメータを監視することを含む。方法はまた、監視されたパラメータを基にしてリアル・タイムで１つまたは複数のパラメータを変更することを含む。たとえば、上記で記載されたように、監視され、変更された１つまたは複数のパラメータは、測定システムのＰＭＴのパラメータを含んでいる。また、この説明で同定されたもの以外の誤差源が、この手法を使用して除去されてもよい。
【０１０４】
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムは、微小球体に対して内側の２つ以上の色素の測定された強度を基にしてシステムを通過する微小球体を同定する。この同定技術は、すべてのチャネル（リポータおよび分類の両方）に既知の量の蛍光強度を含む較正微小球体を同定するために使用されることもある。較正微小球体測定が知られた後、サンプル微小球体測定のためにレポータおよび／または分離チャネルに微修正係数を適用する。
【０１０５】
較正微小球体をサンプル微小球体と区別するとき、この技術の複雑性が生じる。たとえば、較正微小球体のための新しいスペクトル・アドレスが、色素レベルの組合せを基にして作成されるが、これは、Ｎ−１によるシステムの多重化能力を減少させる。別の技術は、較正微小球体の直径をサンプル微小球体の直径よりも大きくまたは小さくすることによって、較正微小球体を同定することである。
【０１０６】
測定システムは、微小球体によって、照射平面に対して９０°で散乱された光を測定してもよい。散乱された光のレベルが、グループで互いに積み重ねられる、または照射ゾーンをほぼ同時に通過する、複数の微小球体を同定するために使用される。たとえば、散乱された光は、照射ゾーン内に存在するすべての粒子の体積に一般に比例する。したがって、複数の微小球体は、単一の微小球体よりも大きい散乱信号を有することになる。微小球体の大部分が、集団事象で見ることによって、単一の物体として照射ゾーンを通常通過することになるため、単一のビードに属していないこれらの事象を同定することは容易である。一般に、２つ、ときどき３つの微小球体が統合して、単一の微小球体によって作成されるものよりも高い散乱信号を作成する。分析フォーマットが散乱信号に影響を有することがあるため、通常、単一の微小球体に対する散乱信号レベルは分析作業中に測定される。
【０１０７】
照射ゾーンを通過するいかなる複数の微小球体の組合せから較正微小球体を同定することがより簡単であるため、サンプル微小球体の直径よりも大きくない、小さい直径を有する較正微小球体を使用することが望ましい。したがって、測定デバイスのパラメータを監視することは、サンプル微小球体の直径よりも小さい直径を有する較正微小球体の測定を使用して行われてもよい。また、監視され、変更される１つまたは複数のパラメータが、サンプル微小球体によって散乱される光に応答する測定システムの検知器によって作成された出力信号を含んでいる。たとえば、サンプル微小球体の直径に対する較正微小球体の直径の比が公知である場合、散乱測定レベルを微調整するために較正微小球体を使用することも同様に可能である。
【０１０８】
較正微小球体の少なくともいくつかが、異なるスペクトル・アドレスを有してもよい。このようにして、一連の異なる較正微小球体が、上記の較正方法を強化するために使用されてもよい。たとえば、第１の弁別器として直径を使用することによって、較正微小球体のスペクトル・アドレスが、サンプル空間内であるように、較正空間内の第２の弁別器となってもよい。微小球体の同一性を弁別するために分類空間内で十分に分離された、複数の較正レベルを有することは、以下の例で使用される。
【０１０９】
たとえば、監視され、変更される１つまたは複数のパラメータは、サンプル微小球体の測定の線形性を備えている。測定デバイスのパラメータが監視され、変更される間の測定は、測定システムの分類チャネルの測定を含んでいる。測定デバイスのパラメータを変更することは、この実施形態では、測定のいかなる非線形性を好ましくは修正する。このようにして、複数の較正レベルを、分類空間の非線形性を検知し、修正するために使用してもよい。現在の測定システムは、単点較正を使用しており、システムの非線形性によるこのような誤差を修正することができない。２次元で表された２色素ビード・システムでは、この非線形性を、分類微小球体の観測された位置に基づいた平面内での分類空間の変形として考えることができる。非線形性を修正することは、その平面内の微小球体の分類精度を改善する。この技術は、同様の効果を有するいかなる数の次元に拡張されることもできる。
【０１１０】
複数の較正レベルが、レポータ信号の非線形性を検知し、修正するために使用されてもよい。上記に記載された技術と同様に、レポータ・チャネルは、現在の測定システム内で単一の較正点を受けてもよい。レポータ・チャネル内で非線形性を検知し、修正することが、上記に記載されたように行われてもよい。たとえば、その間に測定システムのパラメータが監視され、変更される測定は、測定システムのレポータ・チャネルの測定を含んでいる。さらに、測定システムのパラメータが監視され、変更される間の測定は、測定システムのレポータ・チャネルと分類チャネルの測定を含んでいる。このようにして、分類とレポータ・チャネル内の非線形性を、ほぼ同時に監視し、修正することができる。
【０１１１】
別の例では、測定システムの、監視され、変更される１つまたは複数のパラメータが、測定システムのダイナミック・レンジを含む。たとえば、複数の較正レベルが、システムのダイナミック・レンジのリアル・タイムの決定のために使用される。測定システムは、微小な線形範囲を有する。１つまたは複数の独自に同定された較正微小球体に異なるレポータ較正レベルを使用することによって、信号のクリッピングによりシステムが非線形になる検知の下限および／または検知の上限を同定することが可能である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、複数の較正レベルが、分類システムの健全性の決定のために使用される。このようにして、監視され、変更される１つまたは複数のパラメータが、測定システムの健全性を含んでいる。測定システムの健全性は、分類チャネルの健全性、レポータ・チャネルの健全性、またはそれらの組合せを含んでいる。たとえば、上記に記載された個々の解決法の集まりが、温度またはその他の影響に対してシステムを補償することに失敗した場合、較正微小球体蛍光分類レベルは、その予想された値からさらに遠くなる傾向がある。閾値レベルが設定され、較正微小球体蛍光分類レベルが閾値レベルと比較される。較正微小球体蛍光分類レベルが閾値レベルの選択された側にある場合、警告がシステム・オペレータに表示されるか、結果に問題があることを測定システムと結合されたコンピュータに送信する。警告は、視覚的な出力信号および／または聴覚的な出力信号であってもよい。同様にして、複数の較正レベルが、レポータ・システムの健全性の決定のために使用されてもよい。分類システムの健全性の決定と同様に、レポータ・システム内の修正不可能な誤差が同定され、システム・オペレータまたは測定システムと結合されたコンピュータに報告される。
【０１１３】
さらに、複数の較正レベルが、レポータ・チャネルの線形ダイナミック・レンジを拡張するために使用されてもよい。このようにして、測定システムのパラメータを変更することは、測定システムのレポータ・チャネルの線形ダイナミック・レンジを拡張することを含んでいる。非線形領域に存在するいくつかのレベルの明較正微小球体を含むことによって、蛍光性レベルの線形の等価物に対して実際に測定された蛍光性レベルをマッピングすることが可能である。測定曲線から予想曲線への滑らかなマッピングが、個々の較正微小球体の値の間を補間することによって較正データから構成されることができる。すなわち、システムの線形の、有用な測定範囲が、非線形領域内のサンプル微小球体が曲線を使用して調整される場合、かなり拡張される。
【０１１４】
上記の説明では、いくつかの測定誤差に寄与するもの、およびそれぞれに対するリアル・タイム修正技術が示された。また、微小球体サンプル混合物に含ませることができる小直径の較正微小球体を使用したリアル・タイム微調整方法が創造された。微調整プロセスの追加の形態は、システムの健全性のリアル・タイムの同定、１つまたは複数のチャネルの非線形性の修正、測定システムの有用なレポータ・ダイナミック・レンジのかなりの拡張を含む。
【０１１５】
本明細書に記載されたものなどの方法を実現するプログラム命令が、搬送媒体上で送信または記憶されてもよい。搬送媒体は、電線、ケーブルまたは無線伝送リンクなどの伝送媒体、またはこのような電線、ケーブルまたはリンクに沿った信号移送であってよい。搬送媒体はまた、読取専用メモリ、ランダム・アクセス・メモリ、磁気または光ディスク、または磁気テープなどの記憶媒体であってもよい。
【０１１６】
一実施形態では、プロセッサが、上記の実施形態による実装された方法をコンピュータに行わせるためのプログラム命令を実行するように構成されてもよい。プロセッサは、デジタル信号処理チップまたはフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイを採用している専用処理ボード、パーソナル・コンピュータ・システム、大型コンピュータ・システム、ワーク・ステーション、ネットワーク装置、インターネット装置、携帯情報端末（「ＰＤＡ」、テレビジョン・システムまたはその他のデバイスなどの様々な形態を取ってよい。一般に、「コンピュータ・システム」という用語は、１つまたは複数のデジタル信号処理要素またはその他の処理要素を有するいかなるデバイスも包含するように広く定義されている。
【０１１７】
プログラム命令は、手順ベースの技術、構成要素ベースの技術、および／またはオブジェクト指向技術などの様々な方法のいずれかで実装されてもよい。たとえば、プログラム命令は、ＡｃｔｉｖｅＸ制御、Ｃ＋＋オブジェクト、Ｊａｖａ（登録商標）Ｂｅａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｃｌａｓｓ（「ＭＦＣ」）、または必要に応じて、その他の技術または方法論を使用して実装されてもよい。ＦＰＧＡの実装の場合、ＶＨＤＬなどの高レベルの言語の使用が、デバイス内に埋め込まれた信号処理回路を設計するために採用されてもよい。
【０１１８】
本発明が、フロー・サイトメータ・タイプの測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法を提供するように考えられていることは、この開示の利益を有する当業者なら理解されよう。本発明の様々な態様のさらなる修正形態や代替となる実施形態は、この説明の観点から当業者なら明らかであろう。したがって、この説明は、単に例示的なものとみなされるべきであり、本発明を実行する一般的な方式を当業者に教示する目的のためである。本明細書に図示され、説明された本発明の形態が、現在の好ましい実施形態として考えられるべきであることを理解されたい。本発明のこの説明の利益を得た後の当業者にすべて明らかであるように、要素および材料は、本明細書に図示し、説明されたものに代替されてもよく、部品およびプロセスが反転されてもよく、本発明のある特徴が独立して使用されてもよい。頭記の特許請求の範囲に記載したような本発明の精神および範囲を逸脱することなく本明細書に記載された要素に変更が行われてもよい。
【符号の説明】
【０１１９】
１０ 微小球体、１２、７４ キュベット、１４、７０、７２ 光、１６、２６、２８、３０、３２ 検知システム、１８ 折りミラー、２０、２２、２４、８０ ビーム・スプリッタ、３４、３６、３８ スペクトル・フィルタ、４０ プロセッサ、４２ 伝送媒体
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小球体が、前記フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの第１の検知ウィンドウから、前記測定システムの第２の検知ウィンドウへ移動する時間を測定するステップと、
前記時間がほぼ一定であるように前記測定システムに付加される圧力を変更するステップとを含む
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法。
【請求項２】
前記時間が平均時間を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微小球体がサンプル微小球体または較正微小球体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記測定するステップが、前記第１と第２の検知ウィンドウ内の微小球体によって散乱される光を測定するステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記測定するステップが、１つの検知器で前記第１と第２の検知ウィンドウ内の微小球体によって散乱される光を測定するステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１と第２の検知ウィンドウ内の微小球体によって散乱された光が、１つのビーム・スプリッタによって１つの検知器へ向けられる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記方法がリアル・タイムで行われる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
微小球体が、前記フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの第１の検知ウィンドウから、前記測定システムの第２の検知ウィンドウへ移動する平均時間を測定するステップと、
前記平均時間を、基準微小球体が前記第１の検知ウィンドウから前記第２の検知ウィンドウへ移動した基準時間と比較するステップと、
前記平均時間と前記基準時間の間の差が所定の値よりも大きい場合、前記測定システムに付加される圧力を変更するステップとを含む、
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法。
【請求項９】
前記変更するステップが、前記平均時間が前記基準時間よりも大きい場合、付加される圧力を増加させるステップを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記変更するステップが、前記平均時間が前記基準時間よりも小さい場合、付加される圧力を低下させるステップを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記所定の値が、前記測定システムの公知の時間変動機構を補償するように選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記微小球体が、サンプル微小球体、較正微小球体、または較正およびサンプル微小球体を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法がリアル・タイムで行われる請求項８に記載の方法。
【請求項１】
微小球体が、前記フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの第１の検知ウィンドウから、前記測定システムの第２の検知ウィンドウへ移動する時間を測定するステップと、
前記時間がほぼ一定であるように前記測定システムに付加される圧力を変更するステップとを含む
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法。
【請求項２】
前記時間が平均時間を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微小球体がサンプル微小球体または較正微小球体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記測定するステップが、前記第１と第２の検知ウィンドウ内の微小球体によって散乱される光を測定するステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記測定するステップが、１つの検知器で前記第１と第２の検知ウィンドウ内の微小球体によって散乱される光を測定するステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１と第２の検知ウィンドウ内の微小球体によって散乱された光が、１つのビーム・スプリッタによって１つの検知器へ向けられる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記方法がリアル・タイムで行われる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
微小球体が、前記フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの第１の検知ウィンドウから、前記測定システムの第２の検知ウィンドウへ移動する平均時間を測定するステップと、
前記平均時間を、基準微小球体が前記第１の検知ウィンドウから前記第２の検知ウィンドウへ移動した基準時間と比較するステップと、
前記平均時間と前記基準時間の間の差が所定の値よりも大きい場合、前記測定システムに付加される圧力を変更するステップとを含む、
フロー・サイトメータ・タイプ測定システムの１つまたは複数のパラメータを制御するための方法。
【請求項９】
前記変更するステップが、前記平均時間が前記基準時間よりも大きい場合、付加される圧力を増加させるステップを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記変更するステップが、前記平均時間が前記基準時間よりも小さい場合、付加される圧力を低下させるステップを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記所定の値が、前記測定システムの公知の時間変動機構を補償するように選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記微小球体が、サンプル微小球体、較正微小球体、または較正およびサンプル微小球体を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法がリアル・タイムで行われる請求項８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−１９０９１０（Ｐ２０１０−１９０９１０Ａ）
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０６５９９（Ｐ２０１０−１０６５９９）
【出願日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【分割の表示】特願２００６−５２３３８２（Ｐ２００６−５２３３８２）の分割
【原出願日】平成１６年８月１３日（２００４．８．１３）
【出願人】（５０４１８７２４９）ルミネックス・コーポレーション (21)
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【分割の表示】特願２００６−５２３３８２（Ｐ２００６−５２３３８２）の分割
【原出願日】平成１６年８月１３日（２００４．８．１３）
【出願人】（５０４１８７２４９）ルミネックス・コーポレーション (21)
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