ブロメライン成分を含む製薬組成物及び同ブロメライン成分を薬剤の調製に使用する方法
【課題】ブロメライン成分を含む製薬組成物の新規な用途を提供すること。
【解決手段】 製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含み、細胞の成長及び増殖を制御する細胞内シグナル伝達経路を調節することができる。具体的には、同製薬組成物は、ｉ．Ｔ細胞の活性化、ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化、又はｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産、により媒介される疾病又は状態の治療又は予防、又は癌の治療又は予防が可能である。
【解決手段】 製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含み、細胞の成長及び増殖を制御する細胞内シグナル伝達経路を調節することができる。具体的には、同製薬組成物は、ｉ．Ｔ細胞の活性化、ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化、又はｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産、により媒介される疾病又は状態の治療又は予防、又は癌の治療又は予防が可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はブロメラインの成分に関する。特に、本発明は医薬、特に抗癌剤及び免疫抑制剤におけるこのブロメライン成分の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステム・ブロメライン（ブロメライン）は植物ブロメリアセーの組織に見出されるタンパク分解酵素に対する集合的名称である。それは、パイナップル植物（アナナス・コモスス）の茎から誘導される種々の部分の混合物である。ブロメラインは少なくとも５個のタンパク分解酵素を含んでいることが知られているが、酸性ホスファターゼやペルオキシダーゼなどの非−タンパク分解酵素をも含んでいる。それはアミラーゼやセルラーゼ活性をも含んでいる。さらに、種々の他の成分が存在する。
【０００３】
ブロメラインは炎症を含む種々の状態の治療、特に下痢の治療に、従来から使用されてきた。感染性下痢の治療におけるブロメラインの使用は特許文献１に記述されており、ここでは、ブロメラインがタンパク分解により病原体に対する小腸の受容体を破壊することにより作用すると示唆されている。そして、特許文献２にも記述されており、これはブロメラインが小腸受容体から病原体を分離することを教示する。
【０００４】
非特許文献１及び非特許文献２は両者とも、ブロメラインが腫瘍の成長を阻止するのに有用でありうることを示唆する。特許文献３、特許文献４及び特許文献５も癌の治療におけるブロメラインの使用を開示する。特許文献３はブロメラインが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を誘導することができることを教示するが、特許文献４はブロメラインが腫瘍表面タンパク質ＣＤ４４の構造的修飾により転移を防止することができることを教示する。
【０００５】
特許文献６では、タンパク分解酵素、特にブロメラインが分泌を阻害することができることを証明する種々の実験が記述された。この出願はブロメラインが毒物結合活性を減少させることができ、そして熱不安定性毒素（ＬＴ）やコレラ毒素（ＣＴ）などの毒素さらには熱安定性毒素（ＳＴ）などの毒素の分泌効果を阻害することができることをも開示する。これは、ＳＴがＬＴやＣＴとは極めて異なる作用様式を持つという事実にもかかわらずである。これらの観察はブロメライン混合物である、ステムブロメラインプロテアーゼの一つの成分が環状ヌクレオチド経路を調節することができるようにみえるという事実により説明された。そしてこれは特許文献７によりさらに論じられた。さらに、ブロメラインはカルシウム依存経路により惹起される分泌を阻害することも証明された。
【０００６】
本発明者らはブロメラインの種々の生物学的効果、特に細胞内シグナル伝達の十分に立証されたモデル、すなわちＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３シグナル発信及びＩＬ−２生産におけるその効果を研究してきた。近年における重要な進歩により、ＴＣＲ結合の後に起こる生化学的事象の理解がもたらされた（非特許文献３）。従って、ＴＣＲシグナル発信は生物学的活性化合物の効果の解明のための優れたモデルを提供する。効果的なＴ細胞活性化は二つのシグナルを必要とする。第１のシグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される抗原ぺプチドとの結合の後にＴＣＲ／ＣＤ３複合体により形成される（非特許文献３）。第２の共刺激性のシグナルは、Ｔ細胞上のＣＤ２８受容体のＡＰＣ上のリガンドのＢ７ファミリーとの連結により形成される。受容体で開始されたシグナルを核に伝達する際に関与するシグナル発信経路における重要な要素はマイトジェン−活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰｋ）のファミリーである。これらのキナーゼの中で最も良く研究されたものは、細胞外のシグナル−調節タンパク質キナーゼ（ＥＲＫ）−１及びＥＲＫ−２（それぞれ、ｐ４４ＭＡＰｋ及びｐ４２ＭＡＰｋとも呼ばれる）である。ＥＲＫは、チロシン残基とトレオニン残基がリン酸化されると活性化されるセリン／トレオニンキナーゼである。イン・ビトロでは、この活性化は、何れかの残基が脱リン酸化されると、逆転される。ＭＡＰｋファミリーの比較的新しく発見されたメンバーは、ｃ−Ｊｕｎ・ＮＨ２−末端キナーゼ（ＪＮＫ）である。これは４６ｋＤａ及び５５ｋＤａの形で存在し、これも活性化にリン酸化を必要とする。ＥＲＫ活性化はｐ５６Ｌｃｋ及びＴＣＲ／ＣＤ３複合体のｐ２１Ｒａｓへの結合、それに続くＲａｆ−１／ＭＥＫ１／ＥＲＫキナーゼカスケードの活性化に依存する。ＪＮＫ活性化もｐ２１Ｒａｓ並びにＰＡＫ／ＭＥＫＫ／ＳＥＫ／ＪＮＫキナーゼカスケードを誘導する（Ｒａｃ１又はＣｄｃ４２などの）ＧＴＰ（グアノシン−三−リン酸）−結合タンパク質を活性化するＣＤ２８共刺激性受容体により形成されるシグナルを必要とする。活性化されたＥＲＫはＥｌｋ−１をリン酸化し、今度はこれがＪＮＫによるｃ−ｊｕｎのリン酸化の後にｃ−ｆｏｓ活性の誘導を媒介する。活性化されたｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎは結合してＩＬ−２合成に必要なＡＰ−１タンパク質を形成する。上の事象は図１に要約してある。タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の阻害剤は、Ｔ細胞活性化やＩＬ−２生産を含む、ＴＣＲ刺激と関連する多くの事象を阻害するから、上述のシグナル発信事象はすべて、チロシンのリン酸化を必要とする。
【０００７】
特許文献８で、本発明者らはブロメラインが、チロシンのリン酸化そしてＴＣＲ経由で刺激された又はホルボールエステルとカルシウムイオノホアとの組合せで刺激されたＴ細胞中のＥＲＫ−２の活性化を阻害することができることを明らかにした。本発明者らは、今度は、ＥＲＫ活性の減少と共に、ブロメラインはホルボールエステルとカルシウムイオノホアで刺激されたＴ細胞中でのＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γｍＲＮＡの蓄積を減少させるが、ＴＣＲ経由で刺激された細胞中でのサイトカインｍＲＮＡの蓄積には影響しないことを発見した。このデータはＴ細胞中でサイトカイン生産に関与するＴＣＲ−活性化、ＥＲＫ−依存性の経路の存在を示唆する。
【０００８】
先行技術から、ブロメラインは種々の異なる生理学的効果を有する混合物であることは明らかである。ブロメライン混合物の成分の全てが特性決定された訳ではなく、従って、本発明者らがその活性を記述してきたステムブロメラインプロテアーゼを除き、どの成分がブロメラインの種々の異なる効果のどれに対して責任があるのかは明らかでない。これは、勿論、ブロメライン混合物を薬物として投与すべきときの主要な不利益である。何故なら、ブロメラインの一つの成分は望ましい効果を与える一方、ブロメライン混合物の他のある成分の作用から生ずる望ましくない副作用が十分にありうるからである。
【０００９】
従って、もし特定の医薬としての活性を生ずるブロメラインの個々の成分が単離され、副作用の可能性を減少させるように、別々に投与されるならば、有益である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第９３／０１８００号
【特許文献２】国際公開第８８／０１５０６号
【特許文献３】米国特許５２２３４０６号明細書
【特許文献４】独国特許出願公開第４３０２０６０号明細書
【特許文献５】特開昭５９−２２５１２２号公報
【特許文献６】国際公開第９４／００１４７号
【特許文献７】国際公開第９５／００１６９号
【特許文献８】国際公開第９６／０００８２号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】タウシックら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，１９８５，５３８−５３９
【非特許文献２】マウラーら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，１９８８，３７７−３８１
【非特許文献３】カントレルによる総説、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４，２５９−２７４（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、特定されたブロメライン成分を含む製薬組成物の新規な用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記した目的を解決するために、請求項１に記載の発明は、細胞の成長及び増殖を制御する細胞内シグナル発信経路を調節するための製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物を提供する。
【００１４】
請求項２に記載の発明は、細胞による成長因子及びサイトカインの生産を阻害するための製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物を提供する。
【００１５】
請求項３に記載の発明は、ＭＡＰキナーゼ経路の活性を減少又は防止するための製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物を提供する。
【００１６】
請求項４に記載の発明は、Ｔ細胞の活性を減少又は防止するための製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物を提供する。
【００１７】
請求項５に記載の発明は、免疫抑制剤として使用される製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物を提供する。
【００１８】
請求項６に記載の発明は、ｉ．Ｔ細胞の活性化；ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化；又はｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産：により媒介される疾病及び状態を治療又は予防するための、或いは癌を治療又は予防するための、製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物、を提供する。
【００１９】
請求項７に記載の発明は、成長因子及び他のサイトカインの生産を阻止するための、又は、自己免疫疾患、宿主による移植拒否、アレルギー反応、毒物ショック、アポプトシス、寄生体若しくは病原体の感染、又は癌を治療又は予防するための、製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物を提供する。
【００２０】
請求項８に記載の発明は、炎症性疾患又は炎症症状を治療又は予防するための製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物を提供する。
【００２１】
請求項９に記載の発明は、細胞の成長及び増殖を制御する細胞内シグナル発信経路を調節するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
【００２２】
請求項１０に記載の発明は、細胞による成長因子及びサイトカインの生産を阻害するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
【００２３】
請求項１１に記載の発明は、ＭＡＰキナーゼ経路の活性を減少又は防止するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
【００２４】
請求項１２に記載の発明は、Ｔ細胞の活性を減少又は防止するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
【００２５】
請求項１３に記載の発明は、免疫抑制剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
請求項１４に記載の発明は、ｉ．Ｔ細胞の活性化；ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化；又はｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産：により媒介される疾病及び状態を治療又は予防するための、或いは癌を治療又は予防するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
【００２６】
請求項１５に記載の発明は、成長因子及び他のサイトカインの生産を阻止するための、又は、自己免疫疾患、宿主による移植拒否、アレルギー反応、毒物ショック、アポプトシス、寄生体若しくは病原体の感染、又は癌を治療又は予防するための、薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
【００２７】
請求項１６に記載の発明は、炎症性疾患又は炎症症状を治療又は予防するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
【００２８】
本発明者らは今やＥＲＫ活性化を阻害し、従ってＭＡＰキナーゼ経路を阻止するその能力に責任のある粗ブロメラインの活性画分を同定した。１個のタンパク質ではないが、この画分は二、三の成分しか含んでおらず、従って、患者に投与されるときの副作用の可能性は粗ブロメラインと比較したとき大きく減少する。
【００２９】
本発明のその画分は、本発明者らはＣＣＳと呼んだが、一般に行われている方法により、例えばクロマトグラフィーにより、ブロメライン混合物から単離することができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）はこの目的に適しており、ブロメラインタンパク質の特に良好な分離は、Ｓ−セファロースなどのカラム充填剤を用いるファスト・プロテイン・リキッド・クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ（登録商標））により達成することができる。実施例でより詳細に記述するように、３００ｍｌを越える酢酸バッファー中の０〜０．８Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配を用いるＳ−セファロース上のクロマトグラフィーで、本発明のタンパク質はカラムから溶出した最後の２本ピークであった。
【００３０】
本発明の第１の側面では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき約１５．０７ｋＤａ、２５．８５ｋＤａ及び２７．４５ｋＤａの分子量を持つタンパク質を含み、１０．４及び１０．４５の等電点を持ち、そして下記の方法、すなわち
ｉ．ｐＨ５．０で酢酸バッファーにブロメラインを溶解し；
ｉｉ．Ｓ−セファロース上、３００ｍｌを越える酢酸バッファー中の０〜０．８Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配で溶出するファスト・フロー高速液体クロマトグラフィーによりブロメラインの成分を分離し、；
ｉｉｉ．カラムから溶出する最後の２本ピークに対応する画分を集め、そして；
ｉｖ．（ｉｉｉ）で集められた画分からタンパク質を単離する方法、により取得できるブロメラインの成分が提供される。
【００３１】
ＣＣＳと名付けられたこの画分は潜在的に有用な幾つかの諸活性を持つことが見出された。まず、本発明者らは、それがＥＲＫ−２リン酸化を阻止し、従ってＭＡＰキナーゼカスケードを阻止することを見出した。さらに、それはＩＬ−２生産及びＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を阻止した。しかしながら、ＣＣＳは脾臓細胞の増殖には影響を与えなかった。このことはそれが選択的作用様式を持つことを示唆する。ＣＣＳは卵巣、肺、結腸、メラノーマ及び乳房の腫瘍を含むヒト腫瘍細胞系の成長を差別して阻止した。異なる細胞系に対するＣＣＳの差別的活性は、ＣＣＳが選択的作用様式を持つこと及びそれが抗癌剤として作用することもできることをさらに示唆する。選択的システインプロテアーゼ阻害剤であるＥ−６４はＣＣＳの効果を阻止し得るから、ＥＲＫ−２に対するＣＣＳの阻害効果はそのタンパク分解活性に依存する。
【００３２】
ＷＯ−Ａ−９７２４１３８号では、本発明者らは、一般にプロテアーゼはＭＡＰキナーゼ活性化を減少させることができると述べたが、トリプシンがＴ細胞シグナル発信を阻止せず、そして実際、他の研究ではＭＡＰｋの活性化を増強することが示された（ベルハムら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３２０，９３９−９４６）ことから、本発明者らは今回、これはそうではないことを見出した。血液凝固カスケードに関与するプロテアーゼであるトロンビンはＭＡＰキナーゼ活性化を増強することも示された（ブーレット−クラビアリら、１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８９，２０９−２１４）。本発明者らは今回、粗ブロメライン混合物の中に含まれる他のプロテアーゼがＭＡＰキナーゼ経路の活性化を阻止しないことをも示した。Ｔ細胞におけるＭＡＰキナーゼ経路に対するＣＣＳの効果が細胞表面における特異的タンパク分解効果により媒介される可能性がある。ブロメラインがＣＤ４５ＲＡイソ型を切断しそしてヒトＰＢＭＣから他の表面分子を選択的に除去することが知られている。ブロメラインはＴ細胞表面からＣＤ４を部分的に除去もする。ＣＤ４５とＣＤ４はＴＣＲに媒介されるＴ細胞活性化において絶対的な刺激的役割を果しているから、ＣＣＳはこれらの分子に影響することによりＴＣＲシグナル発信を妨害することができる。ＣＤ４５とＣＤ４の重要性はＴＣＲ開始シグナル伝達については良く認識されているが、ホルボールエステル及びカルシウムイオノホアの使用によるＴ細胞の活性化に対してはその要求はバイパスすることが可能である。ホルボールエステルとイオノホアの組合せの使用により、チロシンキナーゼ阻害剤の使用によるＴＣＲ刺激に抵抗性があるとされ、又はＣＤ４５又はｐ５６Ｌｃｋを欠如しているＴ細胞に正常な機能が回復する。
【００３３】
しかしながら、本研究では、本発明者らは、Ｔ細胞をＰＭＡ＋イオノホアで処理するとき、予めＣＣＳで前処理したＴ細胞には正常な機能の回復はみられないことを示した。ＥＲＫ−２に対するＣＣＳの阻害効果は、こうして、Ｔ細胞上のＣＤ４５又はＣＤ４に対する効果を経由して媒介されるものとは考えられない。ＣＣＳはこれまで未同定の表面分子に影響を与え、そしてこれが今度はＭＡＰキナーゼ経路に影響を与える可能性がある。サイトカイン生産に対するＣＣＳの阻害効果は、こうして、Ｔ細胞上のＣＤ４５又はＣＤ４に対するその効果を経由して媒介されるとは考えられない。ＣＣＳは脾臓細胞又はＧＡ１５細胞の生存性に影響しなかったから、Ｔ細胞シグナル伝達に対するＣＣＳの阻害効果はその化合物の毒性のためではなかった。細胞の生存性は４８時間よりも長い期間ＣＣＳの存在下に培養することにより有意な影響を受けなかった。
【００３４】
粗ブロメラインからのＣＣＳ画分はＭＡＰキナーゼ経路の活性化を阻止しそしてＴ細胞の活性化を阻止することを本発明者らは示したから、ＣＣＳはＴ細胞により媒介される疾病の治療に有用でありうる。
【００３５】
ＩＬ−２生産及びＴ細胞活性化に対するその重要性に加えて、ＭＡＰキナーゼ経路は表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＧＤＦ）及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ）などの成長因子の生産にも重要である。従って、ＣＣＳはこれら及び他の成長因子の生産やＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＧＳＦ及び他の多くのものなどの他のサイトカインの生産を阻止する。
【００３６】
また、上に簡単に述べたように、ＣＣＳは癌の治療にも有用である。
こうして、ＣＣＳは：
ｉ．Ｔ細胞の活性化；
ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化；又は
ｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産；
により媒介される疾病又は状態の治療又は予防のための方法に有用であり、又は癌の治療又は予防に有用である。
【００３７】
本発明の第２の側面では、従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、約１５．０７ｋＤａ、２５．８５ｋＤａ及び２７．４５ｋＤａの分子量を持つタンパク質を含み、１０．４及び１０．４５の等電点を持ちそして下記の方法、すなわち：
ｉ．ｐＨ５．０の酢酸バッファーにブロメラインを溶解し；
ｉｉ．３００ｍｌ以上の酢酸バッファー中０〜０．８Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配で溶出するＳ−セファロース上のファスト・フロー高速液体クロマトグラフィーによりブロメラインの成分を分離し；
ｉｉｉ．そのカラムから溶出する最後の２本ピークに対応する画分を集め、そして；
ｉｖ．（ｉｉｉ）で集めた画分からタンパク質を単離する方法；
により取得できるブロメラインの成分が
医薬品、特に
ｉ．Ｔ細胞の活性化；
ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化；又は
ｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産、により媒介される疾病及び状態の治療又は予防に使用するため、又は癌の治療又は予防に使用するために提供される。
【００３８】
ブロメラインのＣＣＳ画分のさらなる分析に基づいて、本発明者らは、それが二つ以上の成分を含むことを見出した。この画分中のタンパク質の配列決定から、それがシステインプロテアーゼであるアナナイン（ａｎａｎａｉｎ）とコモサイン（ｃｏｍｏｓａｉｎ）から成りさらに種々の他の成分を含むことが明らかになった。
【００３９】
こうして、アナナインとコモサインの両方又はこの二つの混合物がブロメラインのＣＣＳ画分の活性に責任があるようである。
従って、本発明のさらなる側面では：
ｉ．Ｔ細胞の活性化；
ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化；又は
ｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産、により媒介される疾病又は状態の治療又は予防、又は癌の治療又は予防のための薬品の製造における、アナナイン、コモサイン、アナナインとコモサインの混合物又はブロメラインのＣＣＳ画分の使用が提供される。
【００４０】
本発明者らの先の出願である特許文献８では、本発明者らは粗ブロメラインによるＭＡＰキナーゼカスケードの阻害を論じた。しかしながら、あの時点では、本発明者らは、それがステムブロメラインのプロテアーゼであるかも知れないと推測したものの、粗ブロメライン混合物のどの成分がこの活性に責任があるのかを決定することはできなかった。本発明者らは、今や、環状ヌクレオチド経路の阻止に加えて、ステムブロメラインプロテアーゼがＭＡＰキナーゼ経路に対してもある活性を確かに持つことを発見した。しかしながら、それはＭＡＰキナーゼカスケードの阻止において本発明のブロメラインのＣＣＳ画分よりも遙かに小さな効果である。実際、本発明者らは今や、ブロメラインのＣＣＳ画分は、ステムブロメラインプロテアーゼがＭＡＰキナーゼ活性化を阻止するよりも１０乗（ｏｒｄｅｒ）の大きさの範囲でより活性が強いことを見出した。
【００４１】
ＩＬ−２を生産しそしてＴ細胞のクローン増大を駆動するためのＴ細胞におけるＭＡＰキナーゼ経路の活性化は免疫応答の本質的部分である。このプロセスの非存在は、Ｔ細胞欠陥を生ずるエイズ又は遺伝的突然変異を患う人々で観察されうるように、致命的結果を招来することができる。しかしながら、Ｔ細胞の活性化は悪い結果を招くこともできる。例えば、もし自己反応性のＴ細胞が活性化されると、自己免疫疾患が生じ得る。従って、ＣＣＳは、リューマチ性関節炎、１型糖尿病、多発性硬化症、クローン病及び狼瘡などの自己免疫疾患の治療に有用である可能性が高い。
【００４２】
また、移植された組織に特異的なＴ細胞の活性化は移植拒否に至ることができ、従って、ＣＣＳはこれを予防するのに有用でもあり得る。
アレルゲン特異的Ｔ細胞の活性化はアレルギー反応を惹起することができる。炎症性サイトカイン類及びヒスタミンなどの他の細胞生産物は、アレルゲンと接触した後細胞から放出される。ヒスタミンや炎症性サイトカインの放出はＭＡＰキナーゼ経路を含み、こうしてＣＣＳによるＭＡＰキナーゼ経路の阻止はアレルギーの有効な治療である可能性が高い。
【００４３】
さらに、ＣＣＳは中毒性ショック及び細菌の内毒素の過剰生産により媒介される他の疾患の予防に有用である可能性が高い。中毒性ショックはグラム陰性細菌によるリポ多糖類（ＬＰＳ）の生産により媒介される。ＬＰＳは、マクロファージにおけるＭＡＰキナーゼ経路の活性化を経てＴＮＦ−α及びインターロイキン−１の生産の引金を引く。これらのサイトカインの分泌は免疫系（Ｔ細胞を含む）の他の細胞からのサイトカイン生産のカスケードを誘い出し、これが白血球増多症、ショック、血管内凝固及び死をもたらす。
【００４４】
ＣＣＳのさらなる使用は、プログラムされた細胞死（アポプトシス）の予防においてである。これは、細胞がそれ自身のＤＮＡを破壊するように刺激されそして死ぬ特殊な事象である。それは、（多過ぎる細胞の蓄積を防止するための）多くの免疫応答における本質的な事象であるが、しかしＨＩＶ感染や多過ぎる細胞が死に、感染と闘うには不十分な細胞しか残されていないような加齢などの場合には、免疫抑制的結果を持つことができる（ペランドンズら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，３５２１−３５２９）。アプトプシスの開始は、ＭＡＰキナーゼ経路の活性化を含む、特定の細胞のシグナル発信事象に依存するから、ＣＣＳはアポプトシスを阻止する効果を持つ可能性が高い。
【００４５】
慢性疾患の間におけるＴ細胞の連続的活性化は、結核様ライ、住血吸虫症及び内蔵リーシュマニア症などの慢性肉芽腫症などのある種の慢性寄生体感染に見出すことができるような、病理学的結果をもたらすこともできる。さらに、寄生体や病原体の侵入、及び細胞内でのその後の生存は、これらの生物が宿主細胞のシグナル発信経路を利用するか否かに依存している（ブリスカら、１９９３、Ｃｅｌｌ，７３，９０３−９２０）。例えば、サルモネラはＭＡＰキナーゼをリン酸化することが証明され、これが細菌をマクロファージによるエンドサイトーシスさせることになる（ガランら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ，３５７，５８８−５８９）。次いで、この細菌が増殖しそしてその細胞を破壊する。ＣＣＳは宿主のシグナル発信経路を修飾することが示されたから、そして特にＭＡＰキナーゼを阻害することが示されたから、別の潜在的適用は寄生体又は病原体による侵入及び細胞内でのそれらの生存を防止することである。
【００４６】
ＣＣＳは癌の治療に有用でもある。実際、本発明者らは、ＣＣＳがイン・ビトロでヒトの腫瘍成長を阻止することができることを示した。ＣＣＳの作用の抗−腫瘍メカニズムは解明されていないが、ＥＲＫ−２経路の活性化の阻止の結果であるように思われる。
【００４７】
前にも述べたように、ＭＡＰキナーゼの活性化は、重要なオンコジーンであるｐ２１Ｒａｓ及びＲａｆ−１に依存している。ｐ２１Ｒａｓ及びＲａｆ−１タンパク質はその細胞表面上の成長因子受容体からのシグナルをＭＡＰキナーゼへ中継し、細胞の増殖又は分化を刺激するのを助ける。オンコジーン（又は突然変異体）であるｐ２１Ｒａｓ又はＲａｆ−１遺伝子は、外的に供給される成長因子からの独立性を獲得した欠陥タンパク質を生産し、そして同時に、外部の成長阻害シグナルにもはや応答しない。突然変異体のｐ２１Ｒａｓ又はＲａｆ−１タンパク質はこうして、永続的に高活性であり続け、そしてそれらの拘束から開放された触媒活性が細胞成長の制御に対し悪影響を及ぼすのである。従って、オンコジーンｐ２１Ｒａｓ又はＲａｆ−１遺伝子は、細胞の増殖及び分化に対する正常な制御を破壊することにより癌及び腫瘍の形成を促進する。ヒト癌の約３０％がｐ２１Ｒａｓ遺伝子に突然変異を有する。
【００４８】
ｐ２１Ｒａｓ及びＲａｆ−１により伝達されたシグナルがＭＡＰキナーゼを経て阻止することができるとすれば、ＣＣＳは癌及び腫瘍の成長を阻止すると期待されるであろう。従って、本発明のタンパク質画分は、卵巣、結腸、乳房又は肺の癌及びメラノーマなどの固体癌や非固体腫瘍及び白血病を含む多くの異なるタイプの癌を治療するのに有用であろう。
【００４９】
本発明のブロメライン画分は、通常、患者に投与される前に製剤化される。従って、本発明のさらなる側面では、ブロメラインのＣＣＳ画分を、薬学的に又は獣医学的に許容され得る賦形剤と共に含んで成る薬学的又は獣医学的組成物が提供される。
【００５０】
このＣＣＳ画分は経腸的投与、例えば、経口投与、経鼻投与、バッカル投与、局所的投与もしくは肛門投与又は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内又は腹腔内経路による非経口投与を含む種々の経路により投与することができる。
【００５１】
多くの場合、経口投与は、しばしば患者が最も受け入れ易い経路であるので、好ましい。タンパク質の投与量が多く要求される場合に、この経口ルートは特に有用である。
経口投与が選ばれるとき、胃を通過するときの残存を助けるため、腸溶被覆製剤でＣＣＳ画分を製剤化することが望ましい。また、別の経口的に投与可能な投与剤形、例えばシロップ、エリキシル又は硬又は柔ゼラチンカプセル、腸溶被覆された硬又は柔ゼラチンカプセル、を使用することができる。
【００５２】
しかしながら、ある状況の下では、非経口的経路を使用するのがさらに便利である。非経口投与では、このタンパク質は蒸留水又は別の薬学的に許容され得る溶媒又は懸濁剤の中で製剤化してもよい。
【００５３】
患者に投与されるべきＣＣＳ画分の適当な投与量は臨床医が定めることができる。しかしながら、基準として、適当な投与量はｋｇ体重当たり約０．５〜２０ｍｇである。多くの場合、この投与量はｋｇ体重当たり約１〜１５ｍｇであることが期待され、そしてｋｇ体重当たり１〜１０ｍｇであることが好ましい。従って、約７０ｋｇの体重のヒトについては、典型的な投与量は約７０〜７００ｍｇとなるであろう。
【発明の効果】
【００５４】
本発明によれば、細胞の成長及び増殖を制御する細胞内シグナル伝達経路を調節するための製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物を提供できた。同製薬組成物は、ｉ．Ｔ細胞の活性化、ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化、又はｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産、により媒介される疾病又は状態の治療又は予防、又は癌の治療又は予防が可能である。具体的には、同製薬組成物は、自己免疫疾患、宿主による移植拒否、アレルギー反応、毒物ショック、アポプトシス、寄生体若しくは病原体の感染、炎症性疾患又は炎症症状、及び癌を治療又は予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＩＬ−２生産に至るＴ細胞活性化と関連するシグナル伝達事象の図式的表示である。
【図２】ＳＰ・セファロース高性能媒体上でのカチオン交換クロマトグラフィーの後の粗ブロメラインの紫外溶出プロフィルである。
【図３】ＳＰ・セファロース高性能媒体上でのカチオン交換クロマトグラフィーの後の粗ブロメライン画分のタンパク分解活性及びタンパク含量を示すプロットである。
【図４】ＳＰ・セファロース高性能クロマトグラフィーのプールした画分の、４〜２０％Ｔ勾配ゲル上で行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥであって、レーン１〜４及びレーン６〜９はそれぞれタンパク質ＣＣＴ、ＣＣＶ、ＣＣＸ及びＣＣＺ及びＣＣＹ、ＣＣＷ、ＣＣＵ及びＣＣＳを含み、そしてレーン５及びレーン１０は分子量マーカーを含む。
【図５】ｐＨ３〜１１の勾配ゲル上で行われたプールした画分の等電点電気泳動であって、レーン１、１１、及び１２は高ＩＥＦマーカーを示し、レーン２及び１３は粗ブロメラインを示し、そしてレーン３〜１０はそれぞれタンパク質ＣＣＴ、ＣＣＶ、ＣＣＸ、ＣＣＺ、ＣＣＹ、ＣＣＷ、ＣＣＵ及びＣＣＳを示す。
【図６】抗ホスホチロシンｍＡｂを用いるウエスタンブロットであって、ＣＣＳがｐ４２ｋＤａ（ＥＲＫ−２）タンパク質のチロシンリン酸化を減少させることを証明する。Ｔｈ０細胞をブロメライン画分（５０μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、洗浄し、ついでＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）とイオノホア（１μＭ）の組合せで５分間刺激した。刺激しなかった細胞を対照として用いた。次いで、細胞を溶解し、ポストヌクレア上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに付した。この図では、黒記号はＰＭＡとイオノホアの組合せでリン酸化されたタンパク質を示す。白抜き記号はＣＣＳ処理によって減少したＥＲＫ−２タンパク質を示す。
【図７】抗ホスホチロシンｍＡｂをもちいたウエスタンブロットであって、ＣＣＳがタンパク質基質のチロシンリン酸化を増加させることを証明する。Ｔｈ０細胞をＣＣＳ、粗ブロメライン（Ｂｒｏｍ）、ステムブロメラインプロテアーゼ（ＳＢＰ）又はＣＣＴ画分（５０μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、洗浄し、そして次いでＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノホア（１μＭ）の組合せで５分間刺激した。刺激しなかった細胞は対照（Ｃｏｎｔ）として使用した。次に、細胞を溶解し、そしてポストヌクレア上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットに付した。この図では、黒記号はＣＣＳによってリン酸化されたが他の処理ではリン酸化されなかったタンパク質を示す。白抜き記号はＣＣＳ及び粗ブロメライン処理によって減少したリンタンパク質を示す。
【図８】抗ホスホチロシンｍＡｂを用いたウエスタンブロットであって、ＥＲＫ−２に対するＣＣＳの阻害効果が、そのタンパク分解活性に依存し、そして投与量依存的に起こることを示す。Ｔｈ０細胞をＣＣＳ（０〜２５μｇ／ｍｌ）又は選ばれたプロテアーゼ阻害剤であるＥ６４とインキュベートされたＣＣＳで３０分間処理した。次いで、細胞を洗浄し、次にＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノホア（１μＭ）の組合せで５分間刺激した。次に、細胞を溶解し、ポストヌクレア上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットに付した。この図では、黒記号はＣＣＳによりリン酸化されたタンパク質を示す。白抜き記号は活性なＣＣＳにより阻害されたが、不活性なＣＣＳでは阻害されなかったＥＲＫ−２リンタンパク質を示す。
【図９】ＣＣＳによって阻害された４２ｋＤａリンタンパク質がＥＲＫ−２であることを確認するイムノブロットである。Ｔｈ０細胞をＣＣＳ（５０μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し又は処理せず、ついで洗浄し、そてＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）とイオノホア（１μＭ）の組合せで５分間刺激した。細胞溶解物を抗ＥＲＫ−２ｍＡｂでイムノブロットを行った。
【図１０】抗ホスホチロシンｍＡｂを用いたウエスタンブロットであって、架橋した抗ＣＤ３εｍＡｂが複数タンパク質のチロシンリン酸化を誘導することを示す。Ｔｈ０細胞を架橋した抗ＣＤ３εｍＡｂで０〜２０分間刺激した。ついで、細胞を溶解しそしてポストヌクレア上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットに付した。黒記号は抗ＣＤ３εｍＡｂに誘導されたチロシンリン酸化タンパク質を示す。
【図１１】抗ホスホチロシンｍＡｂを用いたウエスタンブロットであって、ＣＣＳがＴＣＲにより刺激されたＴ細胞でのチロシンリン酸化を阻害することを証明する。Ｔｈ０細胞をＣＣＳ（０〜５μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、洗浄し、ついで、架橋した抗ＣＤ３εｍＡｂで５分間刺激した。ついで細胞を溶解しポストヌクレア上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットに付した。この図では、記号は抗ＣＤ３εｍＡｂで誘導したＥＲＫ−２のチロシンリン酸化であって、ＣＣＳにより減少したものを示す。
【図１２】抗Ｒａｆ−１ｍＡｂを用いたウエスタンブロットであって、ＣＣＳがＲａｆ−１の移動度シフトを阻害することを示す。Ｔｈ０細胞をＣＣＳ（０〜５０μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、洗浄し、ついで（Ａ）ＰＭＡとイオノホアとの組合せでか又は（Ｂ）ついで架橋した抗ＣＤ３εｍＡｂで５分間刺激した。ついで細胞を溶解し、ポストヌクレア上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットに付した。
【図１３】ＣＣＳが、精製したＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−２の生産及び増殖を減少させることを示す一対のプロットである。Ｔ細胞をＣＣＳ（５０μｇ／ｍｌ）で処理し、洗浄し、ついで培地単独か又は固定化した抗ＣＤ３εｍＡｂ及び抗ＣＤ２８ｍＡｂを含む培地かで培養した。（Ａ）ＩＬ−２生産は実施例５に記述したＣＴＬ−Ｌ検定法により測定した。（Ｂ）増殖は３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定した。ｍＡｂ（刺激剤）の非存在下に培養したＣＤ４＋Ｔ細胞は検出可能なＩＬ−２を生産せずそして増殖もしなかった。
【図１４】ＣＣＳが脾臓細胞によるＩＬ−２生産を減少させるが脾臓細胞の増殖を阻害しないことを示す一対のプロットである。脾臓細胞をＣＣＳ（（５０μｇ／ｍｌ）で処理し、洗浄し、ついで培地単独か又は固定化した抗ＣＤ３εｍＡｂを含む培地かで培養した。（Ａ）ＩＬ−２生産は、実施例５に記述したようなＣＴＬ−Ｌ検定法で測定した。（Ｂ）増殖は３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定した。ｍＡｂ（刺激剤）の非存在下に培養した脾臓細胞は検出可能なＩＬ−２を生産せず、増殖もしなかった。
【図１５】ＣＣＳがイン・ビトロで腫瘍細胞の成長を阻害することを示すプロットである。癌細胞系をＣＣＳ（５０、１０、２．５、１及び０．２５μｇ／ｍｌ）で処理し、又は対照として水で処理した。９６時間処理した後、腫瘍細胞の成長に対するＣＣＳの効果を評価した。カラムはＣＣＳの５０％阻害濃度（ＩＣ５０μｇ／ｍｌ）（腫瘍細胞の成長の５０％を阻害するために必要なＣＣＳの量）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明を下記の実施例及び図を参照してさらに記述する。
【実施例１】
【００５７】
ブロメラインタンパク質の精製
ａ．材料
試薬．ブロメライン（Ｅ．Ｃ．３．４．２２．４；タンパク分解活性，１，５４１ ｎＭ／分／ｍｇ）はソルベイ・インク（ドイツ）から入手した。ファスト・フロー・Ｓ・セファロース、ファルマライト３−１０（登録商標）、アンホリン９−１１（登録商標）、レディミックスＩＥＦ（登録商標）（アクリルアミド、ビスアクリルアミド）及びＩＥＦ（登録商標）マーカーはファルマシア・バイオテクから入手した。プレカスト４−２０％アクリルアミドゲル及び広域分子量マーカーはバイオ−ラド・ラボラトリーズから入手した。他のすべての試薬類は分析グレードであり、シグマ・ケミカル・コウ．か又はブリティッシュ・ドラッグ・ハウスから入手した。
【００５８】
ｂ．プロテイナーゼ検定
ブロメラインのタンパク分解活性は、合成基質Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｐＮＡを用いるイン・ハウス・ミクロタイター・プレートに基づく検定法を使用して測定した。この検定法はフィリッポバらのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４３，２９３−２９７（１９８４）に記述されたものに基づいていた。この基質はナッパーらのＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０１，７２７−７３５（１９９４）に記述されたＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｐＮＡであった。
【００５９】
ｃ．タンパク質検定
タンパク質は、ローリーら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５１）１９３，２６５−２７５）の改良法であるバイオ・ラドが供給するキットを用いて測定した。試料は０．９％食塩水か又は２０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．０中で調製されたウシ血清アルブミン標準（０〜１．５ｍｇ／ｍｌ）を適当なものとして、それと比較した。
【００６０】
ｄ．ブロメラインの調製
以下の工程は全て周囲温度（２０〜２５℃）で行った。ブロメラインの溶液（３０ｍｇ／ｍｌ）は４５０ｍｇの粉末を０．１ｍＭのＥＤＴＡナトリウム塩を含む２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）の１５ｍｌに溶解することにより調製した。この溶液を１０×１．５ｍｌミクロ遠心分離チューブ中に分配し、１３，０００×ｇで１０分間遠心分離して不溶性物質を除去した。澄明な上清をプールし、クロマトグラフィー用に使用した。
【００６１】
ｅ．ファスト・フロー・Ｓ−セファロース高速クロマトグラフィー
ファスト・フロー・Ｓ−セファロースカラムは２５ｍｌの培体をＸＫ１６／２０（登録商標）カラム（ファルマシア・バイオテク）中に充填し、ＦＰＬＣ（登録商標）システム上で０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で３ｍｌ／分で平衡化することにより調製した。５ｍｌのブロメライン溶液をそのカラムに注入した。結合しないタンパク質を集め、そしてそのカラムを１００ｍｌの酢酸バッファーで洗浄した。そのカラムに結合したタンパク質は３００ｍｌを越える酢酸バッファー中０〜０．８ＭのＮａＣｌの直線勾配を用いて溶出した。その勾配を通して５ｍｌの画分を集めた。図２はこの手順から得られる粗ブロメラインの典型的なＵ．Ｖ．クロマトグラムを示す。
【００６２】
次に、この画分は、上記のようにタンパク質及びタンパク分解活性について分析した。図３は合成ぺプチドＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｐＮＡに対するタンパク分解活性及び個々の画分のタンパク質含量を示す。このタンパク質含量プロフィルは、予想された通り、Ｕ．Ｖ．のそれと全くの鏡像である。しかし、その主要タンパク分解活性はブロメライン・プロテアーゼ（ＳＢＰ）のそれに対応する二つの主要ピークに限定される。小さな活性がそのクロマトグラムの他の領域にも観察される。これはアナナイン及びコモサインを含む、遅く溶出するＣＣＳ画分などのＳＢＰとは異なる他のプロテアーゼに対応しうる。
【００６３】
Ｕ．Ｖ．プロフィルから確認された主要ピークは続く反復実施で集め、そして表１に示すように名づけた。プールした画分は物理化学的特性決定のために使用した。プールした画分を限外濾過で濃縮し、そしてＰＤ１０カラムを用いて等張食塩水（０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ）にバッファー交換を行った。そのタンパク質含量及びＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｐＮＡ活性は生物学的テストの前に計算した。これらは表２に示してある。
【００６４】
プールした画分は下記のように、分析のために処理した。
ｆ．プールした画分の処理
プールした画分のタンパク分解活性及びタンパク質含量を測定し、そしてその濃度を、１０ｋＤａの名目分子量カット−オフの限外濾過膜を含むフィルトロン（登録商標）攪拌セルを用いて、タンパク質の１．４ｍｇ／ｍｌか又はタンパク分解活性の１０５ナノモル／分／ｍｌかにほぼ調整した。ついで、この画分をＰＤ１０（登録商標）カラム（ファルマシア・バイオテク）を用いて等張食塩水（０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ）にバッファー交換を行い、無菌濾過（０．２μｍ）を行い、そしてタンパク質含量又はタンパク分解活性を調整した。試料を次に−８０℃で凍結し、下記のイン・ビトロ研究に使用した。
【００６５】
【表１】
【００６６】
【表２】
ｇ．ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
プールしたＦＰＬＣ（登録商標）試料は、予め作成した４〜２０％Ｔ勾配ゲル上でドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。１００μｌに等容量の２０％ｗ／ｖトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を混合する酸沈澱により電気泳動用の試料を調製した。沈澱したタンパク質を１３，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより集め、上清は捨てた。このペレットを０．５ｍｌのジエチルエーテルで２回洗浄し、そして周囲温度の空気で乾燥した。次いで、このペレットを３００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファー（１０％ｖ／ｖグリセロール、２％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム及び４０ｍＭジチオトレイトールを含む６２．５ｍＭのトリス−塩酸ｐＨ６．８）中に溶解し、そして水浴中９５℃で加熱した。
【００６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファー中に１：２０で希釈したＳＤＳ−ＰＡＧＥ広範囲分子量標準を同様に処理し、そして試料と共に使用した。ゲルは、バイオ−ラドのプロトコールに従って、ミニ・プロテアンＩＩ（登録商標）電気泳動システム上で２４０Ｖで使用し、色素先端がゲルの末端に到達するまで（３０〜４５分）行った。
【００６８】
電気泳動の後、分離したタンパク質を、１．５％ｖ／ｖリン酸、１１．２５％ｗ／ｖ硫酸アンモニウム及び２５％ｖ／ｖメタノールを含む０．０７５％ｗ／ｖコロイダル・ブリリアント・ブルーＧ−２５０の溶液中で軌道攪拌しながら一晩染色した。クリアな背景を得るため、２５％ｖ／ｖメタノール及び１０％ｖ／ｖ酢酸の溶液中でゲルを脱染色した。
【００６９】
結果
画分の純度は、図４中のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示す。カラムの素通り（ＣＣＴ）を除き、プールした画分は全て、存在する主要なタンパク質がほぼ２５〜２８ｋＤａの間の分子量を持つものであることを示した。これは、他の著者（ローアンら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，（１９９４），２４４，５５５−５６８）によりブロメラインから単離されたシステインプロテイナーゼの分子量に相当する。画分ＣＣＸ、ＣＣＺ、ＣＣＹ及びＣＣＷの純度は高いように思われる。より低い分子量の小さな成分が幾つかの画分、特にＣＣＴ、ＣＣＶ、ＣＣＸ及びＣＣＳで観察することができる。プールした画分ＣＣＵ及びＣＣＳは２５〜２８ｋＤａに２重のバンドを含む。画分ＣＣＸ、ＣＣＺ、ＣＣＹ及びＣＣＷのより高いゲル負荷を行うと、これらの画分にも二重のバンドが存在することが分かる。成分及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したプール画分の計算されたそれらの分子量の概要は表３に示してある。
【００７０】
【表３】
プールした画分ＣＣＸ、ＣＣＺ、ＣＣＹ＋ＣＣＷ及びＣＣＵ中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にウエスタンブロットによりニトロセルロース上に移し、そして精製したステムブロメラインプロテアーゼ（ＳＢＰ）に対して作成されたウサギ抗血清を用いてプローブした（結果は示していない）。これらのプールした画分の全てのタンパク質バンドはその血清中の抗体により認識された。このことは、免疫学的に類似のタンパク質、多分システインプロテイナーゼ・ファミリーの酵素に属するものであることを示す。
【００７１】
ｈ． 等電点電気泳動
プールした画分（０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ）を脱イオン水で１：３に希釈し、そしてｐＨ３〜１１の勾配ゲル上で泳動させた。ゲルは、レディ・ミックスＩＥＦ（登録商標）を用いて、１０％ｖ／ｖグリセロール、５．０％ファルマライト３−１０（登録商標）及び２．５％アンホリン９−１１（登録商標）を含む５．５％Ｔ、３％Ｃポリアクリルアミドゲルを作成した。簡単に述べると、１０μｌの試料と高等電点マーカーを７００Ｖで予めフォーカシングした後のゲルの上に載せた。試料のエントリは５００Ｖで１０分間、フォーカシングは２５００Ｖで１．５時間、そしてバンドシャープニングは３０００Ｖで１０分間であった。電気泳動の後、タンパク質を２０％ｗ／ｖＴＣＡ溶液で３０分間固定し、ＴＣＡを除去するため脱色液中で３０分間洗浄し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥについて述べたように（上を参照）、ブリリアント・ブルーＧ−２５０で染色した。
結果
図５は、ＣＣＸを除き、全ての画分が９．３ｐＩマーカーを越えてフォーカスする塩基性タンパク質を含んでいたことを示す。局在化された電荷とクロマトグラフィー用培体の官能基との相互作用がＣＣＸでのｐＩ３．８と３．８５のタンパク質が何故ｐＨ５．０でカチオン交換樹脂上に吸着されたかを説明するかも知れない。ＣＣＺはｐＩ９．７の１本のバンドとして現れたが、一方プールした画分ＣＣＹ、ＣＣＷ、及びＣＣＵはｐＨ９．５〜９．８の範囲に等電点を持つ複数のバンドを含んでいた。この不均一性の少なくとも一部は共通のステムブロメラインタンパク質骨格の炭水化物部分における変動により説明することができる。その値はブロメラインに対するｐＩ９．４５〜９．５５という文献（ローアンら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，（１９９４），２４４，５５５−５６８）に報告されたものと一致している。プールした画分ＣＣＳは１０．２５よりも大きなｐＩの二つの塩基性タンパク質を含んでいる。外挿による推定は１０．４及び１０．４５のｐＩを与える。これらはアナナイン及びコモサインに相当し、そして１０よりも大きなｐＩの他の推定値（ローアンら、上記）と一致する。プールした画分のそれぞれにおけるタンパク質のｐＩは表４にまとめてある。
【００７２】
【表４】
【実施例２】
【００７３】
ブロメライン成分のＮＨ２末端アミノ酸分析
別の実験では、ブロメラインのプールした画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてＰＶＤＦ膜上に上記のようにブロットした。この膜を４０％ｖ／ｖメタノールに溶解した０．０２５％ｗ／ｖクーマシーブルーＲ−２５０で１０分間染色し、その後５０％ｖ／ｖメタノール中で脱色した。この膜を室温で空気乾燥し、染色したタンパク質のＮＨ２−末端アミノ酸配列決定を行った。簡単にのべると、そのタンパク質バンドをその膜から切断し、シーケンサーの上部カートリッジ内に置いた。ブロメライン成分のＮＨ２−末端アミノ酸分析は、オン−ライン・フェニルチオヒダントイン・アミノ酸アナライザーを具備した気相シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ）を用いるエドマン分解により測定された。表５は、ＣＣＺ、ＣＣＸ、ステムブロメラインプロテアーゼ、アナナイン及びコモサインの最初の２１個のＮＨ２−末端アミノ酸を示す。
【００７４】
【表５】
全てのタンパク質は配列相同性を共有する。アナナインとコモサインは、ステムブロメラインプロテアーゼと比較すると、２０アミノ酸のうちの２個だけ異なる。ＣＣＺは、ステムブロメラインプロテアーゼと比較すると、２１アミノ酸のうち８個だけ異なる。ＣＣＺはアナナイン及びコモサインと２０アミノ酸のうち６個だけ異なる。コモサインはアナナインとは２アミノ酸だけ異なる。これらのタンパク質は構造的に関連していることは明らかであるが、それらは全て別物であり、相互に相違を示す。これらのプロテイナーゼはそれらのプロテイナーゼ基質特異性及びそれらの生物学的活性も異なっている。
【実施例３】
【００７５】
画分ＣＣＳはｐ４２ｋＤａリンタンパク質のチロシンリン酸化を阻害する。
ａ．材料
抗体
抗ＣＤ３ε−鎖ｍＡｂ（１４５−２Ｃ１１）及び抗ＣＤ２８ｍＡｂ（ＰＶ−１）はファーミンゲン（サンジエゴ、ＣＡ）から購入し、そしてヤギ抗ハムスターＩｇＧ・Ａｂはシグマ（ドーセット、ＵＫ）から購入した。マウス抗ホスホチロシンｍＡｂ（４Ｇ１０）、マウス抗ＭＡＰｋ・Ｒ２（ＥＲＫ−２）ｍＡｂ及びマウス抗Ｒａｆ−１ｍＡｂはＵＢＩ（レイクプラシド、ＮＹ）から購入した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したヤギ抗マウス及びヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体はバイオ−ラド（ヘメル ヘムステッド、ハートフォードシャー、ＵＫ）から購入した。チロシンリン酸化ｐ４４及びｐ４２ＭＡＰｋを認識するウサギポリクローナル・ホスホ−特異的ＭＡＰｋ・ＩｇＧはニューイングランド・バイオラボズ（ヒチン、ハートフォードシャー、ＵＫ）から購入した。
【００７６】
試薬
ホルボ−ル１２ミリステート１３アセテート（ＰＭＡ）及びカルシウムイオノホアＡ２３１８７はシグマから購入した。ブロメライン（Ｅ．Ｃ３．４．２２．４、タンパク分解活性、１．５４１ｎＭ／分／ｍｇ）はソルベイ・インク（ドイツ）から入手した。Ｅ−６４（Ｌ−トランスエポキシスクシニルロイシルアミド−（４−グアニジノ）ブタン、選択的システインプロテアーゼ阻害剤はシグマから入手した。
【００７７】
細胞
Ｔ細胞ハイブリドーマＧＡ１５はビー．フォックス（イムロジック・ファーマシューティカル・コーポレーション、ボストン、ＭＡ）から恵与された。ＧＡ１５は胸腺腫ＢＷ５１４７をＩ−Ａｂと会合してＫＬＨに特異的なＴｈ２クローンＦ４と融合させることにより形成され、そして先に記述された（フォックス、１９９３、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，３２３−３３０）ように維持された。ＧＡ１５は、架橋した抗ＣＤ３εｍＡｂで刺激した後にＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γを生産するから、Ｔｈ０細胞の表現型を示す（フォックス、１９９３）。
【００７８】
ｂ．Ｔ細胞の刺激
ＲＰＭＩ１６４０に懸濁した細胞（２×１０７）を食塩水（０．９％（ｗ／ｖ））で希釈したＣＣＳ（１〜５０μｇ／ｍｌ）で３７℃で３０分間処理した。モック処理細胞は等容量の食塩水（希釈液）で処理した。ＣＣＳの高濃度（５０又は１００μｇ／ｍｌ）では、粗ブロメラインで研究したときに既に注目したように、細胞の凝集が起こった。処理後、細胞の凝集物を新鮮なＲＰＭＩで３回細胞を洗浄することにより穏和に分散させ、次いで新鮮なＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞は、ＴＣＲに架橋したｍＡｂ（抗ＣＤ３ε）を用いて細胞表面経由で、又はＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）とイオノホア（１μＭ）の組合せを用いて直接的に、図の説明及びテキストに記載した回数で刺激した。
【００７９】
ＴＣＲ経由の刺激は、まずＴ細胞を抗ＣＤ３εｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）と氷上で３０分間インキュベートすることにより行った。ついで、過剰のｍＡｂを４℃で１回の洗浄により除去し、そして抗ＣＤ３εｍＡｂをヤギ抗ハムスターＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）と３７℃で架橋した。刺激は溶解氷冷したバッファー（２５ｍＭトリス，ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のトリトンＸ−１００、２ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭのフッ化ナトリウム、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、７４μｇ／ｍｌのロイペプチン、７４０μＭのＰＭＳＦ及び７４μｇ／ｍｌのアプロチニン）を添加し、４℃で３０分間連続的に攪拌することにより終結させた。溶解液は澄明にし（１４，０００×ｇ、１０分間）、そしてポストヌクレア上清に等容量の２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファー（５０ｍＭトリス，ｐＨ７、７００ｍＭの２−ＭＥ、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）を添加した。タンパク質を１００℃で５分間可溶化しそして１×１０６細胞当量を含む試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。
【００８０】
ｃ．イムノブロッティング
分離したタンパク質をニトロセルロース膜（バイオ−ラド）に移し、ついで、それをトリス緩衝化食塩水（１７０ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのトリス，ｐＨ７．４、ＴＢＳ）中の５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（シグマ、フラクションＶ、ＢＳＡ）、０．１％ノニデットＰ−４０（登録商標）でブロックした。イムノブロットを図の説明に記した適当な抗体と共にインキュベートした。主な抗体はＴＢＳ中の０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン−２０からなる抗体希釈バッファーで４℃で２時間希釈し、その後抗体希釈バッファーで希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した適当な二次抗体で４℃で１時間検出した。各インキュベーション工程の後、膜はＴＢＳ中の０．１％のトゥイーン−２０で十分に洗浄した。免疫反応性はＥＣＬ化学発光検出システム（アマシャム・コープ．、アーリントンハイツ、ＩＬ）を用いて測定した。
【００８１】
ｄ．ＣＣＳのタンパク分解活性の阻害
ＣＣＳのタンパク分解活性を失活させるため、特異的システインプロテアーゼ阻害剤であるＥ−６４を使用した。３μＭジチオトレイトール中に希釈したＣＣＳ（２５μｇ／ｍｌ）、１００μＭのＥ−６４、６０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を３０℃で１０分間インキュベートした。次いで、失活したＣＣＳを食塩水中４℃で一晩透析した。粗ブロメラインを用いた初期の研究により、これらの条件は、Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｐＮＡ基質（上を参照）で検定したとき、タンパク分解活性の９９．５％の失活を誘導するのに十分であることが示されている。Ｔ細胞をＥ−６４で失活させたＣＣＳ（２５μｇ／ｍｌ）で処理しそしてＰＭＡプラスイオノホアで刺激した無処理のＣＣＳ及びモック処理Ｔ細胞と比較した。
【００８２】
結果
ａ．画分ＣＣＳはｐ４２ｋＤａリンタンパク質のチロシンリン酸化を阻害する
本発明者らはブロメラインが、ＰＭＡ＋イオノホアカルシウムの組合せでＴ細胞を刺激した後ＥＲＫ−２のチロシンリン酸化を阻止することを先に示した（特許文献８）。Ｔ細胞のホルボールエステルとイオノホアによる刺激はＩＬ−２分泌、ＩＬ−２受容体の発現、及びＴ細胞の増殖などのＴＣＲ刺激の多くの特徴を再現するように相乗的に働く（トルネーら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ，３１３，３１８−３２０、レイターら、１９９２、ＥＭＢＯ，１１，４５４９−４５５６）。ホルボールエステルは抗原受容体引金を模倣することができ、そしてＴＣＲ誘導タンパク質チロシンキナーゼをバイパスしてＰＫＣ及びｐ２１Ｒａｓに対する直接のアゴニスト作用によりＥＲＫ−２を活性化する。カルシウムイオノホアであるＡ２３１８７はＣａ２＋の細胞内放出の増加を誘導し、従って、イノシトール１，４，５−トリスホスフェート（ＩＰ３）の作用を模倣する。ホルボールエステル及びイオノホアは、しかしながら、ＴＣＲにより制御されないＰＫＣ経路（イズキールドら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２，３３０５−３３１２）を刺激する。これはＴ細胞の機能を調節するＴ細胞内の別の細胞内経路を示唆する。従って、本発明者らはブロメラインのどの画分がＴＣＲに無関係な経路を経るＴ細胞システム発信を阻止することができるかを、ＰＭＡ及びイオノホア誘導チロシンリン酸化に対するその効果を検討することにより研究した。
【００８３】
イオノホアとＰＭＡの組合せでＴ細胞を刺激すると、約１００ｋＤａ、８５ｋＤａ、４２ｋＤａ及び３８ｋＤａのタンパク質を含む幾つかのタンパク質のチロシンリン酸化が誘導された。ＣＣＳ（５０μｇ／ｍｌ）の前処理はｐ４２ｋＤａタンパク質のチロシンリン酸化を減少させ、そして他の基質のどれのリン酸化も有意に阻害しなかった（図６）。二つの実験で、ＣＣＳは、約３６ｋＤａ、３８ｋＤａ、８５ｋＤａ、９４ｋＤａ及び１０２ｋＤａタンパク質のチロシンリン酸化を増加させたが、他の画分は増加させなかった（図７及び図８）。
【００８４】
４２ｋＤａリンタンパク質のチロシンリン酸化を阻止するＣＣＳの能力は投与量依存性であり（図８）そしてＥ−６４がｐ４２ｋＤａリン酸化に対するＣＣＳの阻害効果を完全に打ち消した（図８）から、この能力はそのタンパク分解活性に依存するものであった。Ｔ細胞のＥ−６４処理はＰＭＡ及びイオノホアに誘導されるＴ細胞システム発信に影響を与えなかった。
【００８５】
ＣＣＳはＥＲＫ−２チロシンリン酸化を阻害する。
本発明者らはＣＣＳにより阻害された４２ｋＤａリンタンパク質がＭＡＰｋ・ＥＲＫ−２ではないかと疑った。そこで、本発明者らは、Ｔｙｒ２０４でのリン酸化により触媒的に活性化されるとＥＲＫ−１及びＥＲＫ−２のみを特異的に検出する、特異的な抗ＥＲＫ−２ｍＡｂ及び抗ホスホＭＡＰｋ抗体を用いてイムノブロット分析を行った。ＰＭＡ＋イオノホアで刺激したＣＣＳ処理細胞のイムノブロットにより、ｐ４２ｋＤａリンタンパク質が実際にＥＲＫ−２であったことが確認された（図９）。
【００８６】
ＣＣＳはＥＲＫのＴＣＲ誘導チロシンリン酸化を減少させる。
本発明者らは次にＴＣＲにより媒介されるシグナル伝達に対するＣＣＳの効果を架橋抗ＣＤ３εｍＡｂで刺激したＧＡ１５の基質チロシンリン酸化を評価することにより研究した。特異的抗ホスホチロシンｍＡｂを用いるＧＡ１５溶解物のイムノブロットにより、約１２０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８５ｋＤａ、７６ｋＤａ、７０ｋＤａ、４２ｋＤａ及び４０ｋＤａのタンパク質を含む多数のタンパク質のチロシンリン酸化を増加させることが明らかにされた。これはＴＣＲ連結の後の他のＴ細胞系で観察されたリンタンパク質と一致した（ジュンら、１９９０、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，１５９１−１５９９及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，７７２２−７７２６、非特許文献３）（図１０）。チロシンリン酸化タンパク質は刺激後２〜５分間で容易に検出されそして少なくとも１０分間はリン酸化された状態に留まった（図１０）。抗ＣＤ３εｍＡｂ単独で又は架橋Ａｂで刺激されたＧＡ１５細胞はどの細胞基質のチロシンリン酸化をも誘導しなかった（データは示していない）。再び、ＧＡ１５の３０分間のＣＣＳ前処理は、投与量に依存して、ＥＲＫ−２のＴＣＲに誘導されるタンパク質のチロシンリン酸化の減少を惹起した（図１１）。ＣＣＳは、他のＴＣＲ誘導リンタンパク質のチロシンリン酸化に顕著な影響を与えなかった。このことはＣＣＳが選択的な作用様式を持っていることを示唆する。
【実施例４】
【００８７】
ＣＣＳはＲａｆ−１の移動度シフトを遅らせる
Ｒａｆ−１はＥＲＫ−２を活性化するＭＥＫ−１の直ぐ上流のアクチベーターである。Ｒａｆ−１の活性化は特定のセリン残基及びトレオニン残基のリン酸化を必要とする（アブルチら、１９９４、ＴＩＢＳ，１９，２７９−２８３）。ＭＡＰキナーゼカスケードにおけるＥＲＫ−２から上流の他の基質にＣＣＳが影響を与えるか否かを研究するため、本発明者らはＲａｆ−１に対するＣＣＳの影響を研究した。Ｔ細胞をＣＣＳ（０〜５０μｇ／ｍｌ）で処理し、ついで抗ＣＤ３εｍＡｂか又はＰＭＡ＋イオノホアの組合せかで前に述べたように刺激した。結果はＣＣＳがＲａｆ−１の移動度シフトを阻止することを示す。このことはＣＣＳがそのタンパク質リン酸化を、従って活性化を阻止することを示す。このデータから、ＣＣＳがＭＡＰキナーゼカスケードに対し効果を持つこと（図１２）そしてＣＣＳのこの効果はＥＲＫ−２に対する直接的なものではなく、ＭＡＰｋカスケード中の上流の基質に対するものであることが確認される。
【実施例５】
【００８８】
ＩＬ−２生産及びＴ細胞増殖に対するＣＣＳの効果
ａ．材料
細胞
脾臓細胞は、先に特許文献８に記述したように、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）から単離した。高度に精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞は磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）を用いて脾臓細胞から単離した。
【００８９】
ｂ．インターロイキン２生産。
ＰＲＭＩで希釈したＴ細胞をＣＣＳ（５０μｇ／ｍｌ）又は食塩水で３７℃で３０分間処理し、新鮮なＲＰＭＩで洗浄し、ついで培養培地に再懸濁した。Ｔ細胞は、固定化抗ＣＤ３ε（４μｇ／ｍｌ）及び可溶性抗ＣＤ２８（１０μｇ／ｍｌ）により、サイトカインｍＲＮＡを生産するように刺激した。ＰＢＳで希釈した抗ＣＤ３εｍＡｂを、４℃で１６時間インキュベートすることにより、２４ウエルの平底ミクロ培養プレート（コーニング、コーニング、ＮＹ）に固定した。ついで、ウエルをＰＢＳで３回洗浄した後、加湿５％ＣＯ２中で３７℃で２４時間インキュベートした脾臓細胞か又は精製ＣＤ４＋Ｔ細胞（２．５〜５×１０６細胞／ウエル）の培養物を３連で添加した。培養上清中のＩＬ−２のレベルはＣＴＬ−Ｌバイオアッセイ（ギリスら、１９７８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２０，２０２７−２０３２）を用いて測定した。
【００９０】
ｃ．Ｔ細胞増殖。
Ｔ細胞はＣＣＳ（５０μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、ＲＰＭＩ中で洗浄し、ついで固定化抗ＣＤ３εｍＡｂ単独で又は抗ＣＤ３εｍＡｂプラス抗ＣＤ２８ｍＡｂの組合せで刺激した。次に、細胞を、９６ウエル平底プレート（ヌンク）中、ウエル当たり１０５細胞で、３６時間培養した。培養は、グラスファイバーフィルター上で収穫する１２時間前に、０．５μＣｉの〔３Ｈ〕ＴｄＲでパルスした。
【００９１】
結果
ａ．ＣＣＳはＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−２生産及び増殖を阻害する
ｐ２１Ｒａｓ、Ｒａｆ−１、ＭＥＫ−１及びＥＲＫの活性化はＴ細胞におけるＩＬ−２転写の誘導のために必須である（イズキールドら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８，１１９９）。ＩＬ−２はＴ細胞の増殖を誘導する主要なオートクリン（自己分泌性）Ｔ細胞成長因子である。従って、ここに明らかにしたＥＲＫ活性化の欠如はＩＬ−２生産及びＴ細胞増殖を阻害すると予想することができる。従って、本発明者らはＣＣＳがＴ細胞シグナル発信の機能的結果、すなわちマウス脾臓細胞及び高度に精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２生産及び増殖を達成できるかどうかを研究した。精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＣＳ（５０μｇ／ｍｌ）処理は、ＥＲＫ経路が抗ＣＤ３εｍＡｂで刺激されたとき、ＩＬ−２生産及び増殖の両方を減少させた（図１３ａ及び１３ｂ）。ＣＣＳは脾臓細胞によるＩＬ−２生産をも阻止した。しかしながら、それは脾臓細胞の増殖には影響を与えなかった（図１４ａ及び１４ｂ）。このことはこれまで未同定のＣＣＳ中の成分が脾臓細胞培養の附属の細胞集団、例えばＢ細胞やマクロファージなどに作用していたことを示唆する。ブロメラインはＢ細胞に対する作用を介してＴ細胞への共刺激性のシグナルを増加させることができる。附属細胞に対するＣＣＳの推定的効果に関係なく、データは、ＣＣＳが精製ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−２生産及び増殖を阻止することを明瞭に示しており、このことはＣＣＳがＴ細胞の活性化を阻止することを示唆する。ＩＬ−２生産及び増殖は、組織培養培地単独で培養された細胞ではサイトカインは検出されなかったから、抗ＴＣＲ抗体による細胞刺激に依存していた（図１３及び図１４）。
【実施例６】
【００９２】
イン・ビトロでのヒト腫瘍細胞の成長に対するＣＣＳの効果
ａ．材料
細胞
腫瘍細胞系はエル．ケランド（インスティチュート・オブ・キャンサー・リサーチ、サットン、ＵＫ）から提供された。それは次のものであった。卵巣（ＳＫＯＶ−３、ＣＨ−１、Ａ２７８０）、結腸（ＨＴ２９、ＢＥ、ＬＯＶＯ）、乳房（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ３６１）、肺（Ａ５４９、ＣＯＲＬ２３、ＭＯＲ）及びメラノーマ（Ｇ３６１、ＢＯＯ８、ＳＫＭｅ１２４）。
【００９３】
ｂ．ヒト腫瘍細胞系の成長阻害。
研究は、エル．ケランド（インスティチュート・オブ・キャンサー・リサーチ、サットン、ＵＫ）により行われた。細胞系をトリプシン処理し、個々の生存細胞を、４×１０３細胞／ウエルの密度で１６０μｌの成長培地を含む９６ウエルミクロタイタープレート中に蒔いた。一晩接着させた後、次に４０μｌの成長培地中のＣＣＳを最終濃度が５０、１０、２．５、１及び０．２５μｇ／ｍｌとなるように、４連のウエルに添加した。８個のウエルを対照、無処理のウエルとして使用した。ＣＣＳは細胞に添加する直前に無菌水で希釈した。細胞へのＣＣＳの接触は９６時間であった。そこで、各ウエルの細胞数を、先に記述された（ケランドら、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３，２５８１−２５８６）ように１％酢酸中の０．４％スルホロ−ダミンＢで染色することにより測定した。ついで、５０％阻害濃度（ＩＣ５０値、μｇ／ｍｌ）を濃度対対照（％）吸光度（５４０ｎｍでの読み）のプロットから計算した。
【００９４】
結果
ａ．ＣＣＳはイン・ビトロでヒト腫瘍の成長を阻害する。
ｐ２１Ｒａｓ及びＲａｆ−１は重要なオンコジーンであり、突然変異すると、制御できない細胞成長及び増殖を惹き起こし、癌をもたらす。本発明者らはＣＣＳがｐ２１Ｒａｓ／Ｒａｆ−１／ＭＥＫ１／ＥＲＫキナーゼシグナル発信カスケードの効果を阻止することを示したから、ＣＣＳが腫瘍の成長を阻止することができるか否かを研究した。ヒト腫瘍細胞のＣＣＳ処理は幾つかの異なる卵巣、肺、結腸、乳房及びメラノーマ腫瘍細胞系の成長をイン・ビトロで減少させる結果を生じた（図１５）。ＣＣＳはすべての細胞系に等しく影響することはなかった。このことはＣＣＳが選択的作用を有していることを示唆する。
【技術分野】
【０００１】
本発明はブロメラインの成分に関する。特に、本発明は医薬、特に抗癌剤及び免疫抑制剤におけるこのブロメライン成分の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステム・ブロメライン（ブロメライン）は植物ブロメリアセーの組織に見出されるタンパク分解酵素に対する集合的名称である。それは、パイナップル植物（アナナス・コモスス）の茎から誘導される種々の部分の混合物である。ブロメラインは少なくとも５個のタンパク分解酵素を含んでいることが知られているが、酸性ホスファターゼやペルオキシダーゼなどの非−タンパク分解酵素をも含んでいる。それはアミラーゼやセルラーゼ活性をも含んでいる。さらに、種々の他の成分が存在する。
【０００３】
ブロメラインは炎症を含む種々の状態の治療、特に下痢の治療に、従来から使用されてきた。感染性下痢の治療におけるブロメラインの使用は特許文献１に記述されており、ここでは、ブロメラインがタンパク分解により病原体に対する小腸の受容体を破壊することにより作用すると示唆されている。そして、特許文献２にも記述されており、これはブロメラインが小腸受容体から病原体を分離することを教示する。
【０００４】
非特許文献１及び非特許文献２は両者とも、ブロメラインが腫瘍の成長を阻止するのに有用でありうることを示唆する。特許文献３、特許文献４及び特許文献５も癌の治療におけるブロメラインの使用を開示する。特許文献３はブロメラインが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を誘導することができることを教示するが、特許文献４はブロメラインが腫瘍表面タンパク質ＣＤ４４の構造的修飾により転移を防止することができることを教示する。
【０００５】
特許文献６では、タンパク分解酵素、特にブロメラインが分泌を阻害することができることを証明する種々の実験が記述された。この出願はブロメラインが毒物結合活性を減少させることができ、そして熱不安定性毒素（ＬＴ）やコレラ毒素（ＣＴ）などの毒素さらには熱安定性毒素（ＳＴ）などの毒素の分泌効果を阻害することができることをも開示する。これは、ＳＴがＬＴやＣＴとは極めて異なる作用様式を持つという事実にもかかわらずである。これらの観察はブロメライン混合物である、ステムブロメラインプロテアーゼの一つの成分が環状ヌクレオチド経路を調節することができるようにみえるという事実により説明された。そしてこれは特許文献７によりさらに論じられた。さらに、ブロメラインはカルシウム依存経路により惹起される分泌を阻害することも証明された。
【０００６】
本発明者らはブロメラインの種々の生物学的効果、特に細胞内シグナル伝達の十分に立証されたモデル、すなわちＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３シグナル発信及びＩＬ−２生産におけるその効果を研究してきた。近年における重要な進歩により、ＴＣＲ結合の後に起こる生化学的事象の理解がもたらされた（非特許文献３）。従って、ＴＣＲシグナル発信は生物学的活性化合物の効果の解明のための優れたモデルを提供する。効果的なＴ細胞活性化は二つのシグナルを必要とする。第１のシグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される抗原ぺプチドとの結合の後にＴＣＲ／ＣＤ３複合体により形成される（非特許文献３）。第２の共刺激性のシグナルは、Ｔ細胞上のＣＤ２８受容体のＡＰＣ上のリガンドのＢ７ファミリーとの連結により形成される。受容体で開始されたシグナルを核に伝達する際に関与するシグナル発信経路における重要な要素はマイトジェン−活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰｋ）のファミリーである。これらのキナーゼの中で最も良く研究されたものは、細胞外のシグナル−調節タンパク質キナーゼ（ＥＲＫ）−１及びＥＲＫ−２（それぞれ、ｐ４４ＭＡＰｋ及びｐ４２ＭＡＰｋとも呼ばれる）である。ＥＲＫは、チロシン残基とトレオニン残基がリン酸化されると活性化されるセリン／トレオニンキナーゼである。イン・ビトロでは、この活性化は、何れかの残基が脱リン酸化されると、逆転される。ＭＡＰｋファミリーの比較的新しく発見されたメンバーは、ｃ−Ｊｕｎ・ＮＨ２−末端キナーゼ（ＪＮＫ）である。これは４６ｋＤａ及び５５ｋＤａの形で存在し、これも活性化にリン酸化を必要とする。ＥＲＫ活性化はｐ５６Ｌｃｋ及びＴＣＲ／ＣＤ３複合体のｐ２１Ｒａｓへの結合、それに続くＲａｆ−１／ＭＥＫ１／ＥＲＫキナーゼカスケードの活性化に依存する。ＪＮＫ活性化もｐ２１Ｒａｓ並びにＰＡＫ／ＭＥＫＫ／ＳＥＫ／ＪＮＫキナーゼカスケードを誘導する（Ｒａｃ１又はＣｄｃ４２などの）ＧＴＰ（グアノシン−三−リン酸）−結合タンパク質を活性化するＣＤ２８共刺激性受容体により形成されるシグナルを必要とする。活性化されたＥＲＫはＥｌｋ−１をリン酸化し、今度はこれがＪＮＫによるｃ−ｊｕｎのリン酸化の後にｃ−ｆｏｓ活性の誘導を媒介する。活性化されたｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎは結合してＩＬ−２合成に必要なＡＰ−１タンパク質を形成する。上の事象は図１に要約してある。タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の阻害剤は、Ｔ細胞活性化やＩＬ−２生産を含む、ＴＣＲ刺激と関連する多くの事象を阻害するから、上述のシグナル発信事象はすべて、チロシンのリン酸化を必要とする。
【０００７】
特許文献８で、本発明者らはブロメラインが、チロシンのリン酸化そしてＴＣＲ経由で刺激された又はホルボールエステルとカルシウムイオノホアとの組合せで刺激されたＴ細胞中のＥＲＫ−２の活性化を阻害することができることを明らかにした。本発明者らは、今度は、ＥＲＫ活性の減少と共に、ブロメラインはホルボールエステルとカルシウムイオノホアで刺激されたＴ細胞中でのＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γｍＲＮＡの蓄積を減少させるが、ＴＣＲ経由で刺激された細胞中でのサイトカインｍＲＮＡの蓄積には影響しないことを発見した。このデータはＴ細胞中でサイトカイン生産に関与するＴＣＲ−活性化、ＥＲＫ−依存性の経路の存在を示唆する。
【０００８】
先行技術から、ブロメラインは種々の異なる生理学的効果を有する混合物であることは明らかである。ブロメライン混合物の成分の全てが特性決定された訳ではなく、従って、本発明者らがその活性を記述してきたステムブロメラインプロテアーゼを除き、どの成分がブロメラインの種々の異なる効果のどれに対して責任があるのかは明らかでない。これは、勿論、ブロメライン混合物を薬物として投与すべきときの主要な不利益である。何故なら、ブロメラインの一つの成分は望ましい効果を与える一方、ブロメライン混合物の他のある成分の作用から生ずる望ましくない副作用が十分にありうるからである。
【０００９】
従って、もし特定の医薬としての活性を生ずるブロメラインの個々の成分が単離され、副作用の可能性を減少させるように、別々に投与されるならば、有益である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第９３／０１８００号
【特許文献２】国際公開第８８／０１５０６号
【特許文献３】米国特許５２２３４０６号明細書
【特許文献４】独国特許出願公開第４３０２０６０号明細書
【特許文献５】特開昭５９−２２５１２２号公報
【特許文献６】国際公開第９４／００１４７号
【特許文献７】国際公開第９５／００１６９号
【特許文献８】国際公開第９６／０００８２号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】タウシックら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，１９８５，５３８−５３９
【非特許文献２】マウラーら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，１９８８，３７７−３８１
【非特許文献３】カントレルによる総説、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４，２５９−２７４（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、特定されたブロメライン成分を含む製薬組成物の新規な用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記した目的を解決するために、請求項１に記載の発明は、細胞の成長及び増殖を制御する細胞内シグナル発信経路を調節するための製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物を提供する。
【００１４】
請求項２に記載の発明は、細胞による成長因子及びサイトカインの生産を阻害するための製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物を提供する。
【００１５】
請求項３に記載の発明は、ＭＡＰキナーゼ経路の活性を減少又は防止するための製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物を提供する。
【００１６】
請求項４に記載の発明は、Ｔ細胞の活性を減少又は防止するための製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物を提供する。
【００１７】
請求項５に記載の発明は、免疫抑制剤として使用される製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物を提供する。
【００１８】
請求項６に記載の発明は、ｉ．Ｔ細胞の活性化；ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化；又はｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産：により媒介される疾病及び状態を治療又は予防するための、或いは癌を治療又は予防するための、製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物、を提供する。
【００１９】
請求項７に記載の発明は、成長因子及び他のサイトカインの生産を阻止するための、又は、自己免疫疾患、宿主による移植拒否、アレルギー反応、毒物ショック、アポプトシス、寄生体若しくは病原体の感染、又は癌を治療又は予防するための、製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物を提供する。
【００２０】
請求項８に記載の発明は、炎症性疾患又は炎症症状を治療又は予防するための製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む製薬組成物を提供する。
【００２１】
請求項９に記載の発明は、細胞の成長及び増殖を制御する細胞内シグナル発信経路を調節するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
【００２２】
請求項１０に記載の発明は、細胞による成長因子及びサイトカインの生産を阻害するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
【００２３】
請求項１１に記載の発明は、ＭＡＰキナーゼ経路の活性を減少又は防止するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
【００２４】
請求項１２に記載の発明は、Ｔ細胞の活性を減少又は防止するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
【００２５】
請求項１３に記載の発明は、免疫抑制剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
請求項１４に記載の発明は、ｉ．Ｔ細胞の活性化；ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化；又はｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産：により媒介される疾病及び状態を治療又は予防するための、或いは癌を治療又は予防するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
【００２６】
請求項１５に記載の発明は、成長因子及び他のサイトカインの生産を阻止するための、又は、自己免疫疾患、宿主による移植拒否、アレルギー反応、毒物ショック、アポプトシス、寄生体若しくは病原体の感染、又は癌を治療又は予防するための、薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
【００２７】
請求項１６に記載の発明は、炎症性疾患又は炎症症状を治療又は予防するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法を提供する。
【００２８】
本発明者らは今やＥＲＫ活性化を阻害し、従ってＭＡＰキナーゼ経路を阻止するその能力に責任のある粗ブロメラインの活性画分を同定した。１個のタンパク質ではないが、この画分は二、三の成分しか含んでおらず、従って、患者に投与されるときの副作用の可能性は粗ブロメラインと比較したとき大きく減少する。
【００２９】
本発明のその画分は、本発明者らはＣＣＳと呼んだが、一般に行われている方法により、例えばクロマトグラフィーにより、ブロメライン混合物から単離することができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）はこの目的に適しており、ブロメラインタンパク質の特に良好な分離は、Ｓ−セファロースなどのカラム充填剤を用いるファスト・プロテイン・リキッド・クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ（登録商標））により達成することができる。実施例でより詳細に記述するように、３００ｍｌを越える酢酸バッファー中の０〜０．８Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配を用いるＳ−セファロース上のクロマトグラフィーで、本発明のタンパク質はカラムから溶出した最後の２本ピークであった。
【００３０】
本発明の第１の側面では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき約１５．０７ｋＤａ、２５．８５ｋＤａ及び２７．４５ｋＤａの分子量を持つタンパク質を含み、１０．４及び１０．４５の等電点を持ち、そして下記の方法、すなわち
ｉ．ｐＨ５．０で酢酸バッファーにブロメラインを溶解し；
ｉｉ．Ｓ−セファロース上、３００ｍｌを越える酢酸バッファー中の０〜０．８Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配で溶出するファスト・フロー高速液体クロマトグラフィーによりブロメラインの成分を分離し、；
ｉｉｉ．カラムから溶出する最後の２本ピークに対応する画分を集め、そして；
ｉｖ．（ｉｉｉ）で集められた画分からタンパク質を単離する方法、により取得できるブロメラインの成分が提供される。
【００３１】
ＣＣＳと名付けられたこの画分は潜在的に有用な幾つかの諸活性を持つことが見出された。まず、本発明者らは、それがＥＲＫ−２リン酸化を阻止し、従ってＭＡＰキナーゼカスケードを阻止することを見出した。さらに、それはＩＬ−２生産及びＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を阻止した。しかしながら、ＣＣＳは脾臓細胞の増殖には影響を与えなかった。このことはそれが選択的作用様式を持つことを示唆する。ＣＣＳは卵巣、肺、結腸、メラノーマ及び乳房の腫瘍を含むヒト腫瘍細胞系の成長を差別して阻止した。異なる細胞系に対するＣＣＳの差別的活性は、ＣＣＳが選択的作用様式を持つこと及びそれが抗癌剤として作用することもできることをさらに示唆する。選択的システインプロテアーゼ阻害剤であるＥ−６４はＣＣＳの効果を阻止し得るから、ＥＲＫ−２に対するＣＣＳの阻害効果はそのタンパク分解活性に依存する。
【００３２】
ＷＯ−Ａ−９７２４１３８号では、本発明者らは、一般にプロテアーゼはＭＡＰキナーゼ活性化を減少させることができると述べたが、トリプシンがＴ細胞シグナル発信を阻止せず、そして実際、他の研究ではＭＡＰｋの活性化を増強することが示された（ベルハムら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３２０，９３９−９４６）ことから、本発明者らは今回、これはそうではないことを見出した。血液凝固カスケードに関与するプロテアーゼであるトロンビンはＭＡＰキナーゼ活性化を増強することも示された（ブーレット−クラビアリら、１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８９，２０９−２１４）。本発明者らは今回、粗ブロメライン混合物の中に含まれる他のプロテアーゼがＭＡＰキナーゼ経路の活性化を阻止しないことをも示した。Ｔ細胞におけるＭＡＰキナーゼ経路に対するＣＣＳの効果が細胞表面における特異的タンパク分解効果により媒介される可能性がある。ブロメラインがＣＤ４５ＲＡイソ型を切断しそしてヒトＰＢＭＣから他の表面分子を選択的に除去することが知られている。ブロメラインはＴ細胞表面からＣＤ４を部分的に除去もする。ＣＤ４５とＣＤ４はＴＣＲに媒介されるＴ細胞活性化において絶対的な刺激的役割を果しているから、ＣＣＳはこれらの分子に影響することによりＴＣＲシグナル発信を妨害することができる。ＣＤ４５とＣＤ４の重要性はＴＣＲ開始シグナル伝達については良く認識されているが、ホルボールエステル及びカルシウムイオノホアの使用によるＴ細胞の活性化に対してはその要求はバイパスすることが可能である。ホルボールエステルとイオノホアの組合せの使用により、チロシンキナーゼ阻害剤の使用によるＴＣＲ刺激に抵抗性があるとされ、又はＣＤ４５又はｐ５６Ｌｃｋを欠如しているＴ細胞に正常な機能が回復する。
【００３３】
しかしながら、本研究では、本発明者らは、Ｔ細胞をＰＭＡ＋イオノホアで処理するとき、予めＣＣＳで前処理したＴ細胞には正常な機能の回復はみられないことを示した。ＥＲＫ−２に対するＣＣＳの阻害効果は、こうして、Ｔ細胞上のＣＤ４５又はＣＤ４に対する効果を経由して媒介されるものとは考えられない。ＣＣＳはこれまで未同定の表面分子に影響を与え、そしてこれが今度はＭＡＰキナーゼ経路に影響を与える可能性がある。サイトカイン生産に対するＣＣＳの阻害効果は、こうして、Ｔ細胞上のＣＤ４５又はＣＤ４に対するその効果を経由して媒介されるとは考えられない。ＣＣＳは脾臓細胞又はＧＡ１５細胞の生存性に影響しなかったから、Ｔ細胞シグナル伝達に対するＣＣＳの阻害効果はその化合物の毒性のためではなかった。細胞の生存性は４８時間よりも長い期間ＣＣＳの存在下に培養することにより有意な影響を受けなかった。
【００３４】
粗ブロメラインからのＣＣＳ画分はＭＡＰキナーゼ経路の活性化を阻止しそしてＴ細胞の活性化を阻止することを本発明者らは示したから、ＣＣＳはＴ細胞により媒介される疾病の治療に有用でありうる。
【００３５】
ＩＬ−２生産及びＴ細胞活性化に対するその重要性に加えて、ＭＡＰキナーゼ経路は表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＧＤＦ）及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ）などの成長因子の生産にも重要である。従って、ＣＣＳはこれら及び他の成長因子の生産やＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＧＳＦ及び他の多くのものなどの他のサイトカインの生産を阻止する。
【００３６】
また、上に簡単に述べたように、ＣＣＳは癌の治療にも有用である。
こうして、ＣＣＳは：
ｉ．Ｔ細胞の活性化；
ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化；又は
ｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産；
により媒介される疾病又は状態の治療又は予防のための方法に有用であり、又は癌の治療又は予防に有用である。
【００３７】
本発明の第２の側面では、従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、約１５．０７ｋＤａ、２５．８５ｋＤａ及び２７．４５ｋＤａの分子量を持つタンパク質を含み、１０．４及び１０．４５の等電点を持ちそして下記の方法、すなわち：
ｉ．ｐＨ５．０の酢酸バッファーにブロメラインを溶解し；
ｉｉ．３００ｍｌ以上の酢酸バッファー中０〜０．８Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配で溶出するＳ−セファロース上のファスト・フロー高速液体クロマトグラフィーによりブロメラインの成分を分離し；
ｉｉｉ．そのカラムから溶出する最後の２本ピークに対応する画分を集め、そして；
ｉｖ．（ｉｉｉ）で集めた画分からタンパク質を単離する方法；
により取得できるブロメラインの成分が
医薬品、特に
ｉ．Ｔ細胞の活性化；
ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化；又は
ｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産、により媒介される疾病及び状態の治療又は予防に使用するため、又は癌の治療又は予防に使用するために提供される。
【００３８】
ブロメラインのＣＣＳ画分のさらなる分析に基づいて、本発明者らは、それが二つ以上の成分を含むことを見出した。この画分中のタンパク質の配列決定から、それがシステインプロテアーゼであるアナナイン（ａｎａｎａｉｎ）とコモサイン（ｃｏｍｏｓａｉｎ）から成りさらに種々の他の成分を含むことが明らかになった。
【００３９】
こうして、アナナインとコモサインの両方又はこの二つの混合物がブロメラインのＣＣＳ画分の活性に責任があるようである。
従って、本発明のさらなる側面では：
ｉ．Ｔ細胞の活性化；
ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化；又は
ｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産、により媒介される疾病又は状態の治療又は予防、又は癌の治療又は予防のための薬品の製造における、アナナイン、コモサイン、アナナインとコモサインの混合物又はブロメラインのＣＣＳ画分の使用が提供される。
【００４０】
本発明者らの先の出願である特許文献８では、本発明者らは粗ブロメラインによるＭＡＰキナーゼカスケードの阻害を論じた。しかしながら、あの時点では、本発明者らは、それがステムブロメラインのプロテアーゼであるかも知れないと推測したものの、粗ブロメライン混合物のどの成分がこの活性に責任があるのかを決定することはできなかった。本発明者らは、今や、環状ヌクレオチド経路の阻止に加えて、ステムブロメラインプロテアーゼがＭＡＰキナーゼ経路に対してもある活性を確かに持つことを発見した。しかしながら、それはＭＡＰキナーゼカスケードの阻止において本発明のブロメラインのＣＣＳ画分よりも遙かに小さな効果である。実際、本発明者らは今や、ブロメラインのＣＣＳ画分は、ステムブロメラインプロテアーゼがＭＡＰキナーゼ活性化を阻止するよりも１０乗（ｏｒｄｅｒ）の大きさの範囲でより活性が強いことを見出した。
【００４１】
ＩＬ−２を生産しそしてＴ細胞のクローン増大を駆動するためのＴ細胞におけるＭＡＰキナーゼ経路の活性化は免疫応答の本質的部分である。このプロセスの非存在は、Ｔ細胞欠陥を生ずるエイズ又は遺伝的突然変異を患う人々で観察されうるように、致命的結果を招来することができる。しかしながら、Ｔ細胞の活性化は悪い結果を招くこともできる。例えば、もし自己反応性のＴ細胞が活性化されると、自己免疫疾患が生じ得る。従って、ＣＣＳは、リューマチ性関節炎、１型糖尿病、多発性硬化症、クローン病及び狼瘡などの自己免疫疾患の治療に有用である可能性が高い。
【００４２】
また、移植された組織に特異的なＴ細胞の活性化は移植拒否に至ることができ、従って、ＣＣＳはこれを予防するのに有用でもあり得る。
アレルゲン特異的Ｔ細胞の活性化はアレルギー反応を惹起することができる。炎症性サイトカイン類及びヒスタミンなどの他の細胞生産物は、アレルゲンと接触した後細胞から放出される。ヒスタミンや炎症性サイトカインの放出はＭＡＰキナーゼ経路を含み、こうしてＣＣＳによるＭＡＰキナーゼ経路の阻止はアレルギーの有効な治療である可能性が高い。
【００４３】
さらに、ＣＣＳは中毒性ショック及び細菌の内毒素の過剰生産により媒介される他の疾患の予防に有用である可能性が高い。中毒性ショックはグラム陰性細菌によるリポ多糖類（ＬＰＳ）の生産により媒介される。ＬＰＳは、マクロファージにおけるＭＡＰキナーゼ経路の活性化を経てＴＮＦ−α及びインターロイキン−１の生産の引金を引く。これらのサイトカインの分泌は免疫系（Ｔ細胞を含む）の他の細胞からのサイトカイン生産のカスケードを誘い出し、これが白血球増多症、ショック、血管内凝固及び死をもたらす。
【００４４】
ＣＣＳのさらなる使用は、プログラムされた細胞死（アポプトシス）の予防においてである。これは、細胞がそれ自身のＤＮＡを破壊するように刺激されそして死ぬ特殊な事象である。それは、（多過ぎる細胞の蓄積を防止するための）多くの免疫応答における本質的な事象であるが、しかしＨＩＶ感染や多過ぎる細胞が死に、感染と闘うには不十分な細胞しか残されていないような加齢などの場合には、免疫抑制的結果を持つことができる（ペランドンズら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，３５２１−３５２９）。アプトプシスの開始は、ＭＡＰキナーゼ経路の活性化を含む、特定の細胞のシグナル発信事象に依存するから、ＣＣＳはアポプトシスを阻止する効果を持つ可能性が高い。
【００４５】
慢性疾患の間におけるＴ細胞の連続的活性化は、結核様ライ、住血吸虫症及び内蔵リーシュマニア症などの慢性肉芽腫症などのある種の慢性寄生体感染に見出すことができるような、病理学的結果をもたらすこともできる。さらに、寄生体や病原体の侵入、及び細胞内でのその後の生存は、これらの生物が宿主細胞のシグナル発信経路を利用するか否かに依存している（ブリスカら、１９９３、Ｃｅｌｌ，７３，９０３−９２０）。例えば、サルモネラはＭＡＰキナーゼをリン酸化することが証明され、これが細菌をマクロファージによるエンドサイトーシスさせることになる（ガランら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ，３５７，５８８−５８９）。次いで、この細菌が増殖しそしてその細胞を破壊する。ＣＣＳは宿主のシグナル発信経路を修飾することが示されたから、そして特にＭＡＰキナーゼを阻害することが示されたから、別の潜在的適用は寄生体又は病原体による侵入及び細胞内でのそれらの生存を防止することである。
【００４６】
ＣＣＳは癌の治療に有用でもある。実際、本発明者らは、ＣＣＳがイン・ビトロでヒトの腫瘍成長を阻止することができることを示した。ＣＣＳの作用の抗−腫瘍メカニズムは解明されていないが、ＥＲＫ−２経路の活性化の阻止の結果であるように思われる。
【００４７】
前にも述べたように、ＭＡＰキナーゼの活性化は、重要なオンコジーンであるｐ２１Ｒａｓ及びＲａｆ−１に依存している。ｐ２１Ｒａｓ及びＲａｆ−１タンパク質はその細胞表面上の成長因子受容体からのシグナルをＭＡＰキナーゼへ中継し、細胞の増殖又は分化を刺激するのを助ける。オンコジーン（又は突然変異体）であるｐ２１Ｒａｓ又はＲａｆ−１遺伝子は、外的に供給される成長因子からの独立性を獲得した欠陥タンパク質を生産し、そして同時に、外部の成長阻害シグナルにもはや応答しない。突然変異体のｐ２１Ｒａｓ又はＲａｆ−１タンパク質はこうして、永続的に高活性であり続け、そしてそれらの拘束から開放された触媒活性が細胞成長の制御に対し悪影響を及ぼすのである。従って、オンコジーンｐ２１Ｒａｓ又はＲａｆ−１遺伝子は、細胞の増殖及び分化に対する正常な制御を破壊することにより癌及び腫瘍の形成を促進する。ヒト癌の約３０％がｐ２１Ｒａｓ遺伝子に突然変異を有する。
【００４８】
ｐ２１Ｒａｓ及びＲａｆ−１により伝達されたシグナルがＭＡＰキナーゼを経て阻止することができるとすれば、ＣＣＳは癌及び腫瘍の成長を阻止すると期待されるであろう。従って、本発明のタンパク質画分は、卵巣、結腸、乳房又は肺の癌及びメラノーマなどの固体癌や非固体腫瘍及び白血病を含む多くの異なるタイプの癌を治療するのに有用であろう。
【００４９】
本発明のブロメライン画分は、通常、患者に投与される前に製剤化される。従って、本発明のさらなる側面では、ブロメラインのＣＣＳ画分を、薬学的に又は獣医学的に許容され得る賦形剤と共に含んで成る薬学的又は獣医学的組成物が提供される。
【００５０】
このＣＣＳ画分は経腸的投与、例えば、経口投与、経鼻投与、バッカル投与、局所的投与もしくは肛門投与又は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内又は腹腔内経路による非経口投与を含む種々の経路により投与することができる。
【００５１】
多くの場合、経口投与は、しばしば患者が最も受け入れ易い経路であるので、好ましい。タンパク質の投与量が多く要求される場合に、この経口ルートは特に有用である。
経口投与が選ばれるとき、胃を通過するときの残存を助けるため、腸溶被覆製剤でＣＣＳ画分を製剤化することが望ましい。また、別の経口的に投与可能な投与剤形、例えばシロップ、エリキシル又は硬又は柔ゼラチンカプセル、腸溶被覆された硬又は柔ゼラチンカプセル、を使用することができる。
【００５２】
しかしながら、ある状況の下では、非経口的経路を使用するのがさらに便利である。非経口投与では、このタンパク質は蒸留水又は別の薬学的に許容され得る溶媒又は懸濁剤の中で製剤化してもよい。
【００５３】
患者に投与されるべきＣＣＳ画分の適当な投与量は臨床医が定めることができる。しかしながら、基準として、適当な投与量はｋｇ体重当たり約０．５〜２０ｍｇである。多くの場合、この投与量はｋｇ体重当たり約１〜１５ｍｇであることが期待され、そしてｋｇ体重当たり１〜１０ｍｇであることが好ましい。従って、約７０ｋｇの体重のヒトについては、典型的な投与量は約７０〜７００ｍｇとなるであろう。
【発明の効果】
【００５４】
本発明によれば、細胞の成長及び増殖を制御する細胞内シグナル伝達経路を調節するための製薬組成物であって、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物を提供できた。同製薬組成物は、ｉ．Ｔ細胞の活性化、ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化、又はｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産、により媒介される疾病又は状態の治療又は予防、又は癌の治療又は予防が可能である。具体的には、同製薬組成物は、自己免疫疾患、宿主による移植拒否、アレルギー反応、毒物ショック、アポプトシス、寄生体若しくは病原体の感染、炎症性疾患又は炎症症状、及び癌を治療又は予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＩＬ−２生産に至るＴ細胞活性化と関連するシグナル伝達事象の図式的表示である。
【図２】ＳＰ・セファロース高性能媒体上でのカチオン交換クロマトグラフィーの後の粗ブロメラインの紫外溶出プロフィルである。
【図３】ＳＰ・セファロース高性能媒体上でのカチオン交換クロマトグラフィーの後の粗ブロメライン画分のタンパク分解活性及びタンパク含量を示すプロットである。
【図４】ＳＰ・セファロース高性能クロマトグラフィーのプールした画分の、４〜２０％Ｔ勾配ゲル上で行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥであって、レーン１〜４及びレーン６〜９はそれぞれタンパク質ＣＣＴ、ＣＣＶ、ＣＣＸ及びＣＣＺ及びＣＣＹ、ＣＣＷ、ＣＣＵ及びＣＣＳを含み、そしてレーン５及びレーン１０は分子量マーカーを含む。
【図５】ｐＨ３〜１１の勾配ゲル上で行われたプールした画分の等電点電気泳動であって、レーン１、１１、及び１２は高ＩＥＦマーカーを示し、レーン２及び１３は粗ブロメラインを示し、そしてレーン３〜１０はそれぞれタンパク質ＣＣＴ、ＣＣＶ、ＣＣＸ、ＣＣＺ、ＣＣＹ、ＣＣＷ、ＣＣＵ及びＣＣＳを示す。
【図６】抗ホスホチロシンｍＡｂを用いるウエスタンブロットであって、ＣＣＳがｐ４２ｋＤａ（ＥＲＫ−２）タンパク質のチロシンリン酸化を減少させることを証明する。Ｔｈ０細胞をブロメライン画分（５０μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、洗浄し、ついでＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）とイオノホア（１μＭ）の組合せで５分間刺激した。刺激しなかった細胞を対照として用いた。次いで、細胞を溶解し、ポストヌクレア上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに付した。この図では、黒記号はＰＭＡとイオノホアの組合せでリン酸化されたタンパク質を示す。白抜き記号はＣＣＳ処理によって減少したＥＲＫ−２タンパク質を示す。
【図７】抗ホスホチロシンｍＡｂをもちいたウエスタンブロットであって、ＣＣＳがタンパク質基質のチロシンリン酸化を増加させることを証明する。Ｔｈ０細胞をＣＣＳ、粗ブロメライン（Ｂｒｏｍ）、ステムブロメラインプロテアーゼ（ＳＢＰ）又はＣＣＴ画分（５０μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、洗浄し、そして次いでＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノホア（１μＭ）の組合せで５分間刺激した。刺激しなかった細胞は対照（Ｃｏｎｔ）として使用した。次に、細胞を溶解し、そしてポストヌクレア上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットに付した。この図では、黒記号はＣＣＳによってリン酸化されたが他の処理ではリン酸化されなかったタンパク質を示す。白抜き記号はＣＣＳ及び粗ブロメライン処理によって減少したリンタンパク質を示す。
【図８】抗ホスホチロシンｍＡｂを用いたウエスタンブロットであって、ＥＲＫ−２に対するＣＣＳの阻害効果が、そのタンパク分解活性に依存し、そして投与量依存的に起こることを示す。Ｔｈ０細胞をＣＣＳ（０〜２５μｇ／ｍｌ）又は選ばれたプロテアーゼ阻害剤であるＥ６４とインキュベートされたＣＣＳで３０分間処理した。次いで、細胞を洗浄し、次にＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノホア（１μＭ）の組合せで５分間刺激した。次に、細胞を溶解し、ポストヌクレア上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットに付した。この図では、黒記号はＣＣＳによりリン酸化されたタンパク質を示す。白抜き記号は活性なＣＣＳにより阻害されたが、不活性なＣＣＳでは阻害されなかったＥＲＫ−２リンタンパク質を示す。
【図９】ＣＣＳによって阻害された４２ｋＤａリンタンパク質がＥＲＫ−２であることを確認するイムノブロットである。Ｔｈ０細胞をＣＣＳ（５０μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し又は処理せず、ついで洗浄し、そてＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）とイオノホア（１μＭ）の組合せで５分間刺激した。細胞溶解物を抗ＥＲＫ−２ｍＡｂでイムノブロットを行った。
【図１０】抗ホスホチロシンｍＡｂを用いたウエスタンブロットであって、架橋した抗ＣＤ３εｍＡｂが複数タンパク質のチロシンリン酸化を誘導することを示す。Ｔｈ０細胞を架橋した抗ＣＤ３εｍＡｂで０〜２０分間刺激した。ついで、細胞を溶解しそしてポストヌクレア上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットに付した。黒記号は抗ＣＤ３εｍＡｂに誘導されたチロシンリン酸化タンパク質を示す。
【図１１】抗ホスホチロシンｍＡｂを用いたウエスタンブロットであって、ＣＣＳがＴＣＲにより刺激されたＴ細胞でのチロシンリン酸化を阻害することを証明する。Ｔｈ０細胞をＣＣＳ（０〜５μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、洗浄し、ついで、架橋した抗ＣＤ３εｍＡｂで５分間刺激した。ついで細胞を溶解しポストヌクレア上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットに付した。この図では、記号は抗ＣＤ３εｍＡｂで誘導したＥＲＫ−２のチロシンリン酸化であって、ＣＣＳにより減少したものを示す。
【図１２】抗Ｒａｆ−１ｍＡｂを用いたウエスタンブロットであって、ＣＣＳがＲａｆ−１の移動度シフトを阻害することを示す。Ｔｈ０細胞をＣＣＳ（０〜５０μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、洗浄し、ついで（Ａ）ＰＭＡとイオノホアとの組合せでか又は（Ｂ）ついで架橋した抗ＣＤ３εｍＡｂで５分間刺激した。ついで細胞を溶解し、ポストヌクレア上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットに付した。
【図１３】ＣＣＳが、精製したＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−２の生産及び増殖を減少させることを示す一対のプロットである。Ｔ細胞をＣＣＳ（５０μｇ／ｍｌ）で処理し、洗浄し、ついで培地単独か又は固定化した抗ＣＤ３εｍＡｂ及び抗ＣＤ２８ｍＡｂを含む培地かで培養した。（Ａ）ＩＬ−２生産は実施例５に記述したＣＴＬ−Ｌ検定法により測定した。（Ｂ）増殖は３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定した。ｍＡｂ（刺激剤）の非存在下に培養したＣＤ４＋Ｔ細胞は検出可能なＩＬ−２を生産せずそして増殖もしなかった。
【図１４】ＣＣＳが脾臓細胞によるＩＬ−２生産を減少させるが脾臓細胞の増殖を阻害しないことを示す一対のプロットである。脾臓細胞をＣＣＳ（（５０μｇ／ｍｌ）で処理し、洗浄し、ついで培地単独か又は固定化した抗ＣＤ３εｍＡｂを含む培地かで培養した。（Ａ）ＩＬ−２生産は、実施例５に記述したようなＣＴＬ−Ｌ検定法で測定した。（Ｂ）増殖は３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定した。ｍＡｂ（刺激剤）の非存在下に培養した脾臓細胞は検出可能なＩＬ−２を生産せず、増殖もしなかった。
【図１５】ＣＣＳがイン・ビトロで腫瘍細胞の成長を阻害することを示すプロットである。癌細胞系をＣＣＳ（５０、１０、２．５、１及び０．２５μｇ／ｍｌ）で処理し、又は対照として水で処理した。９６時間処理した後、腫瘍細胞の成長に対するＣＣＳの効果を評価した。カラムはＣＣＳの５０％阻害濃度（ＩＣ５０μｇ／ｍｌ）（腫瘍細胞の成長の５０％を阻害するために必要なＣＣＳの量）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明を下記の実施例及び図を参照してさらに記述する。
【実施例１】
【００５７】
ブロメラインタンパク質の精製
ａ．材料
試薬．ブロメライン（Ｅ．Ｃ．３．４．２２．４；タンパク分解活性，１，５４１ ｎＭ／分／ｍｇ）はソルベイ・インク（ドイツ）から入手した。ファスト・フロー・Ｓ・セファロース、ファルマライト３−１０（登録商標）、アンホリン９−１１（登録商標）、レディミックスＩＥＦ（登録商標）（アクリルアミド、ビスアクリルアミド）及びＩＥＦ（登録商標）マーカーはファルマシア・バイオテクから入手した。プレカスト４−２０％アクリルアミドゲル及び広域分子量マーカーはバイオ−ラド・ラボラトリーズから入手した。他のすべての試薬類は分析グレードであり、シグマ・ケミカル・コウ．か又はブリティッシュ・ドラッグ・ハウスから入手した。
【００５８】
ｂ．プロテイナーゼ検定
ブロメラインのタンパク分解活性は、合成基質Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｐＮＡを用いるイン・ハウス・ミクロタイター・プレートに基づく検定法を使用して測定した。この検定法はフィリッポバらのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４３，２９３−２９７（１９８４）に記述されたものに基づいていた。この基質はナッパーらのＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０１，７２７−７３５（１９９４）に記述されたＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｐＮＡであった。
【００５９】
ｃ．タンパク質検定
タンパク質は、ローリーら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５１）１９３，２６５−２７５）の改良法であるバイオ・ラドが供給するキットを用いて測定した。試料は０．９％食塩水か又は２０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．０中で調製されたウシ血清アルブミン標準（０〜１．５ｍｇ／ｍｌ）を適当なものとして、それと比較した。
【００６０】
ｄ．ブロメラインの調製
以下の工程は全て周囲温度（２０〜２５℃）で行った。ブロメラインの溶液（３０ｍｇ／ｍｌ）は４５０ｍｇの粉末を０．１ｍＭのＥＤＴＡナトリウム塩を含む２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）の１５ｍｌに溶解することにより調製した。この溶液を１０×１．５ｍｌミクロ遠心分離チューブ中に分配し、１３，０００×ｇで１０分間遠心分離して不溶性物質を除去した。澄明な上清をプールし、クロマトグラフィー用に使用した。
【００６１】
ｅ．ファスト・フロー・Ｓ−セファロース高速クロマトグラフィー
ファスト・フロー・Ｓ−セファロースカラムは２５ｍｌの培体をＸＫ１６／２０（登録商標）カラム（ファルマシア・バイオテク）中に充填し、ＦＰＬＣ（登録商標）システム上で０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で３ｍｌ／分で平衡化することにより調製した。５ｍｌのブロメライン溶液をそのカラムに注入した。結合しないタンパク質を集め、そしてそのカラムを１００ｍｌの酢酸バッファーで洗浄した。そのカラムに結合したタンパク質は３００ｍｌを越える酢酸バッファー中０〜０．８ＭのＮａＣｌの直線勾配を用いて溶出した。その勾配を通して５ｍｌの画分を集めた。図２はこの手順から得られる粗ブロメラインの典型的なＵ．Ｖ．クロマトグラムを示す。
【００６２】
次に、この画分は、上記のようにタンパク質及びタンパク分解活性について分析した。図３は合成ぺプチドＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｐＮＡに対するタンパク分解活性及び個々の画分のタンパク質含量を示す。このタンパク質含量プロフィルは、予想された通り、Ｕ．Ｖ．のそれと全くの鏡像である。しかし、その主要タンパク分解活性はブロメライン・プロテアーゼ（ＳＢＰ）のそれに対応する二つの主要ピークに限定される。小さな活性がそのクロマトグラムの他の領域にも観察される。これはアナナイン及びコモサインを含む、遅く溶出するＣＣＳ画分などのＳＢＰとは異なる他のプロテアーゼに対応しうる。
【００６３】
Ｕ．Ｖ．プロフィルから確認された主要ピークは続く反復実施で集め、そして表１に示すように名づけた。プールした画分は物理化学的特性決定のために使用した。プールした画分を限外濾過で濃縮し、そしてＰＤ１０カラムを用いて等張食塩水（０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ）にバッファー交換を行った。そのタンパク質含量及びＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｐＮＡ活性は生物学的テストの前に計算した。これらは表２に示してある。
【００６４】
プールした画分は下記のように、分析のために処理した。
ｆ．プールした画分の処理
プールした画分のタンパク分解活性及びタンパク質含量を測定し、そしてその濃度を、１０ｋＤａの名目分子量カット−オフの限外濾過膜を含むフィルトロン（登録商標）攪拌セルを用いて、タンパク質の１．４ｍｇ／ｍｌか又はタンパク分解活性の１０５ナノモル／分／ｍｌかにほぼ調整した。ついで、この画分をＰＤ１０（登録商標）カラム（ファルマシア・バイオテク）を用いて等張食塩水（０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ）にバッファー交換を行い、無菌濾過（０．２μｍ）を行い、そしてタンパク質含量又はタンパク分解活性を調整した。試料を次に−８０℃で凍結し、下記のイン・ビトロ研究に使用した。
【００６５】
【表１】
【００６６】
【表２】
ｇ．ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
プールしたＦＰＬＣ（登録商標）試料は、予め作成した４〜２０％Ｔ勾配ゲル上でドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。１００μｌに等容量の２０％ｗ／ｖトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を混合する酸沈澱により電気泳動用の試料を調製した。沈澱したタンパク質を１３，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより集め、上清は捨てた。このペレットを０．５ｍｌのジエチルエーテルで２回洗浄し、そして周囲温度の空気で乾燥した。次いで、このペレットを３００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファー（１０％ｖ／ｖグリセロール、２％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム及び４０ｍＭジチオトレイトールを含む６２．５ｍＭのトリス−塩酸ｐＨ６．８）中に溶解し、そして水浴中９５℃で加熱した。
【００６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファー中に１：２０で希釈したＳＤＳ−ＰＡＧＥ広範囲分子量標準を同様に処理し、そして試料と共に使用した。ゲルは、バイオ−ラドのプロトコールに従って、ミニ・プロテアンＩＩ（登録商標）電気泳動システム上で２４０Ｖで使用し、色素先端がゲルの末端に到達するまで（３０〜４５分）行った。
【００６８】
電気泳動の後、分離したタンパク質を、１．５％ｖ／ｖリン酸、１１．２５％ｗ／ｖ硫酸アンモニウム及び２５％ｖ／ｖメタノールを含む０．０７５％ｗ／ｖコロイダル・ブリリアント・ブルーＧ−２５０の溶液中で軌道攪拌しながら一晩染色した。クリアな背景を得るため、２５％ｖ／ｖメタノール及び１０％ｖ／ｖ酢酸の溶液中でゲルを脱染色した。
【００６９】
結果
画分の純度は、図４中のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示す。カラムの素通り（ＣＣＴ）を除き、プールした画分は全て、存在する主要なタンパク質がほぼ２５〜２８ｋＤａの間の分子量を持つものであることを示した。これは、他の著者（ローアンら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，（１９９４），２４４，５５５−５６８）によりブロメラインから単離されたシステインプロテイナーゼの分子量に相当する。画分ＣＣＸ、ＣＣＺ、ＣＣＹ及びＣＣＷの純度は高いように思われる。より低い分子量の小さな成分が幾つかの画分、特にＣＣＴ、ＣＣＶ、ＣＣＸ及びＣＣＳで観察することができる。プールした画分ＣＣＵ及びＣＣＳは２５〜２８ｋＤａに２重のバンドを含む。画分ＣＣＸ、ＣＣＺ、ＣＣＹ及びＣＣＷのより高いゲル負荷を行うと、これらの画分にも二重のバンドが存在することが分かる。成分及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したプール画分の計算されたそれらの分子量の概要は表３に示してある。
【００７０】
【表３】
プールした画分ＣＣＸ、ＣＣＺ、ＣＣＹ＋ＣＣＷ及びＣＣＵ中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にウエスタンブロットによりニトロセルロース上に移し、そして精製したステムブロメラインプロテアーゼ（ＳＢＰ）に対して作成されたウサギ抗血清を用いてプローブした（結果は示していない）。これらのプールした画分の全てのタンパク質バンドはその血清中の抗体により認識された。このことは、免疫学的に類似のタンパク質、多分システインプロテイナーゼ・ファミリーの酵素に属するものであることを示す。
【００７１】
ｈ． 等電点電気泳動
プールした画分（０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ）を脱イオン水で１：３に希釈し、そしてｐＨ３〜１１の勾配ゲル上で泳動させた。ゲルは、レディ・ミックスＩＥＦ（登録商標）を用いて、１０％ｖ／ｖグリセロール、５．０％ファルマライト３−１０（登録商標）及び２．５％アンホリン９−１１（登録商標）を含む５．５％Ｔ、３％Ｃポリアクリルアミドゲルを作成した。簡単に述べると、１０μｌの試料と高等電点マーカーを７００Ｖで予めフォーカシングした後のゲルの上に載せた。試料のエントリは５００Ｖで１０分間、フォーカシングは２５００Ｖで１．５時間、そしてバンドシャープニングは３０００Ｖで１０分間であった。電気泳動の後、タンパク質を２０％ｗ／ｖＴＣＡ溶液で３０分間固定し、ＴＣＡを除去するため脱色液中で３０分間洗浄し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥについて述べたように（上を参照）、ブリリアント・ブルーＧ−２５０で染色した。
結果
図５は、ＣＣＸを除き、全ての画分が９．３ｐＩマーカーを越えてフォーカスする塩基性タンパク質を含んでいたことを示す。局在化された電荷とクロマトグラフィー用培体の官能基との相互作用がＣＣＸでのｐＩ３．８と３．８５のタンパク質が何故ｐＨ５．０でカチオン交換樹脂上に吸着されたかを説明するかも知れない。ＣＣＺはｐＩ９．７の１本のバンドとして現れたが、一方プールした画分ＣＣＹ、ＣＣＷ、及びＣＣＵはｐＨ９．５〜９．８の範囲に等電点を持つ複数のバンドを含んでいた。この不均一性の少なくとも一部は共通のステムブロメラインタンパク質骨格の炭水化物部分における変動により説明することができる。その値はブロメラインに対するｐＩ９．４５〜９．５５という文献（ローアンら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，（１９９４），２４４，５５５−５６８）に報告されたものと一致している。プールした画分ＣＣＳは１０．２５よりも大きなｐＩの二つの塩基性タンパク質を含んでいる。外挿による推定は１０．４及び１０．４５のｐＩを与える。これらはアナナイン及びコモサインに相当し、そして１０よりも大きなｐＩの他の推定値（ローアンら、上記）と一致する。プールした画分のそれぞれにおけるタンパク質のｐＩは表４にまとめてある。
【００７２】
【表４】
【実施例２】
【００７３】
ブロメライン成分のＮＨ２末端アミノ酸分析
別の実験では、ブロメラインのプールした画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてＰＶＤＦ膜上に上記のようにブロットした。この膜を４０％ｖ／ｖメタノールに溶解した０．０２５％ｗ／ｖクーマシーブルーＲ−２５０で１０分間染色し、その後５０％ｖ／ｖメタノール中で脱色した。この膜を室温で空気乾燥し、染色したタンパク質のＮＨ２−末端アミノ酸配列決定を行った。簡単にのべると、そのタンパク質バンドをその膜から切断し、シーケンサーの上部カートリッジ内に置いた。ブロメライン成分のＮＨ２−末端アミノ酸分析は、オン−ライン・フェニルチオヒダントイン・アミノ酸アナライザーを具備した気相シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ）を用いるエドマン分解により測定された。表５は、ＣＣＺ、ＣＣＸ、ステムブロメラインプロテアーゼ、アナナイン及びコモサインの最初の２１個のＮＨ２−末端アミノ酸を示す。
【００７４】
【表５】
全てのタンパク質は配列相同性を共有する。アナナインとコモサインは、ステムブロメラインプロテアーゼと比較すると、２０アミノ酸のうちの２個だけ異なる。ＣＣＺは、ステムブロメラインプロテアーゼと比較すると、２１アミノ酸のうち８個だけ異なる。ＣＣＺはアナナイン及びコモサインと２０アミノ酸のうち６個だけ異なる。コモサインはアナナインとは２アミノ酸だけ異なる。これらのタンパク質は構造的に関連していることは明らかであるが、それらは全て別物であり、相互に相違を示す。これらのプロテイナーゼはそれらのプロテイナーゼ基質特異性及びそれらの生物学的活性も異なっている。
【実施例３】
【００７５】
画分ＣＣＳはｐ４２ｋＤａリンタンパク質のチロシンリン酸化を阻害する。
ａ．材料
抗体
抗ＣＤ３ε−鎖ｍＡｂ（１４５−２Ｃ１１）及び抗ＣＤ２８ｍＡｂ（ＰＶ−１）はファーミンゲン（サンジエゴ、ＣＡ）から購入し、そしてヤギ抗ハムスターＩｇＧ・Ａｂはシグマ（ドーセット、ＵＫ）から購入した。マウス抗ホスホチロシンｍＡｂ（４Ｇ１０）、マウス抗ＭＡＰｋ・Ｒ２（ＥＲＫ−２）ｍＡｂ及びマウス抗Ｒａｆ−１ｍＡｂはＵＢＩ（レイクプラシド、ＮＹ）から購入した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したヤギ抗マウス及びヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体はバイオ−ラド（ヘメル ヘムステッド、ハートフォードシャー、ＵＫ）から購入した。チロシンリン酸化ｐ４４及びｐ４２ＭＡＰｋを認識するウサギポリクローナル・ホスホ−特異的ＭＡＰｋ・ＩｇＧはニューイングランド・バイオラボズ（ヒチン、ハートフォードシャー、ＵＫ）から購入した。
【００７６】
試薬
ホルボ−ル１２ミリステート１３アセテート（ＰＭＡ）及びカルシウムイオノホアＡ２３１８７はシグマから購入した。ブロメライン（Ｅ．Ｃ３．４．２２．４、タンパク分解活性、１．５４１ｎＭ／分／ｍｇ）はソルベイ・インク（ドイツ）から入手した。Ｅ−６４（Ｌ−トランスエポキシスクシニルロイシルアミド−（４−グアニジノ）ブタン、選択的システインプロテアーゼ阻害剤はシグマから入手した。
【００７７】
細胞
Ｔ細胞ハイブリドーマＧＡ１５はビー．フォックス（イムロジック・ファーマシューティカル・コーポレーション、ボストン、ＭＡ）から恵与された。ＧＡ１５は胸腺腫ＢＷ５１４７をＩ−Ａｂと会合してＫＬＨに特異的なＴｈ２クローンＦ４と融合させることにより形成され、そして先に記述された（フォックス、１９９３、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，３２３−３３０）ように維持された。ＧＡ１５は、架橋した抗ＣＤ３εｍＡｂで刺激した後にＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γを生産するから、Ｔｈ０細胞の表現型を示す（フォックス、１９９３）。
【００７８】
ｂ．Ｔ細胞の刺激
ＲＰＭＩ１６４０に懸濁した細胞（２×１０７）を食塩水（０．９％（ｗ／ｖ））で希釈したＣＣＳ（１〜５０μｇ／ｍｌ）で３７℃で３０分間処理した。モック処理細胞は等容量の食塩水（希釈液）で処理した。ＣＣＳの高濃度（５０又は１００μｇ／ｍｌ）では、粗ブロメラインで研究したときに既に注目したように、細胞の凝集が起こった。処理後、細胞の凝集物を新鮮なＲＰＭＩで３回細胞を洗浄することにより穏和に分散させ、次いで新鮮なＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞は、ＴＣＲに架橋したｍＡｂ（抗ＣＤ３ε）を用いて細胞表面経由で、又はＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）とイオノホア（１μＭ）の組合せを用いて直接的に、図の説明及びテキストに記載した回数で刺激した。
【００７９】
ＴＣＲ経由の刺激は、まずＴ細胞を抗ＣＤ３εｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）と氷上で３０分間インキュベートすることにより行った。ついで、過剰のｍＡｂを４℃で１回の洗浄により除去し、そして抗ＣＤ３εｍＡｂをヤギ抗ハムスターＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）と３７℃で架橋した。刺激は溶解氷冷したバッファー（２５ｍＭトリス，ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のトリトンＸ−１００、２ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭのフッ化ナトリウム、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、７４μｇ／ｍｌのロイペプチン、７４０μＭのＰＭＳＦ及び７４μｇ／ｍｌのアプロチニン）を添加し、４℃で３０分間連続的に攪拌することにより終結させた。溶解液は澄明にし（１４，０００×ｇ、１０分間）、そしてポストヌクレア上清に等容量の２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファー（５０ｍＭトリス，ｐＨ７、７００ｍＭの２−ＭＥ、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）を添加した。タンパク質を１００℃で５分間可溶化しそして１×１０６細胞当量を含む試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。
【００８０】
ｃ．イムノブロッティング
分離したタンパク質をニトロセルロース膜（バイオ−ラド）に移し、ついで、それをトリス緩衝化食塩水（１７０ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのトリス，ｐＨ７．４、ＴＢＳ）中の５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（シグマ、フラクションＶ、ＢＳＡ）、０．１％ノニデットＰ−４０（登録商標）でブロックした。イムノブロットを図の説明に記した適当な抗体と共にインキュベートした。主な抗体はＴＢＳ中の０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン−２０からなる抗体希釈バッファーで４℃で２時間希釈し、その後抗体希釈バッファーで希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した適当な二次抗体で４℃で１時間検出した。各インキュベーション工程の後、膜はＴＢＳ中の０．１％のトゥイーン−２０で十分に洗浄した。免疫反応性はＥＣＬ化学発光検出システム（アマシャム・コープ．、アーリントンハイツ、ＩＬ）を用いて測定した。
【００８１】
ｄ．ＣＣＳのタンパク分解活性の阻害
ＣＣＳのタンパク分解活性を失活させるため、特異的システインプロテアーゼ阻害剤であるＥ−６４を使用した。３μＭジチオトレイトール中に希釈したＣＣＳ（２５μｇ／ｍｌ）、１００μＭのＥ−６４、６０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を３０℃で１０分間インキュベートした。次いで、失活したＣＣＳを食塩水中４℃で一晩透析した。粗ブロメラインを用いた初期の研究により、これらの条件は、Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｐＮＡ基質（上を参照）で検定したとき、タンパク分解活性の９９．５％の失活を誘導するのに十分であることが示されている。Ｔ細胞をＥ−６４で失活させたＣＣＳ（２５μｇ／ｍｌ）で処理しそしてＰＭＡプラスイオノホアで刺激した無処理のＣＣＳ及びモック処理Ｔ細胞と比較した。
【００８２】
結果
ａ．画分ＣＣＳはｐ４２ｋＤａリンタンパク質のチロシンリン酸化を阻害する
本発明者らはブロメラインが、ＰＭＡ＋イオノホアカルシウムの組合せでＴ細胞を刺激した後ＥＲＫ−２のチロシンリン酸化を阻止することを先に示した（特許文献８）。Ｔ細胞のホルボールエステルとイオノホアによる刺激はＩＬ−２分泌、ＩＬ−２受容体の発現、及びＴ細胞の増殖などのＴＣＲ刺激の多くの特徴を再現するように相乗的に働く（トルネーら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ，３１３，３１８−３２０、レイターら、１９９２、ＥＭＢＯ，１１，４５４９−４５５６）。ホルボールエステルは抗原受容体引金を模倣することができ、そしてＴＣＲ誘導タンパク質チロシンキナーゼをバイパスしてＰＫＣ及びｐ２１Ｒａｓに対する直接のアゴニスト作用によりＥＲＫ−２を活性化する。カルシウムイオノホアであるＡ２３１８７はＣａ２＋の細胞内放出の増加を誘導し、従って、イノシトール１，４，５−トリスホスフェート（ＩＰ３）の作用を模倣する。ホルボールエステル及びイオノホアは、しかしながら、ＴＣＲにより制御されないＰＫＣ経路（イズキールドら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２，３３０５−３３１２）を刺激する。これはＴ細胞の機能を調節するＴ細胞内の別の細胞内経路を示唆する。従って、本発明者らはブロメラインのどの画分がＴＣＲに無関係な経路を経るＴ細胞システム発信を阻止することができるかを、ＰＭＡ及びイオノホア誘導チロシンリン酸化に対するその効果を検討することにより研究した。
【００８３】
イオノホアとＰＭＡの組合せでＴ細胞を刺激すると、約１００ｋＤａ、８５ｋＤａ、４２ｋＤａ及び３８ｋＤａのタンパク質を含む幾つかのタンパク質のチロシンリン酸化が誘導された。ＣＣＳ（５０μｇ／ｍｌ）の前処理はｐ４２ｋＤａタンパク質のチロシンリン酸化を減少させ、そして他の基質のどれのリン酸化も有意に阻害しなかった（図６）。二つの実験で、ＣＣＳは、約３６ｋＤａ、３８ｋＤａ、８５ｋＤａ、９４ｋＤａ及び１０２ｋＤａタンパク質のチロシンリン酸化を増加させたが、他の画分は増加させなかった（図７及び図８）。
【００８４】
４２ｋＤａリンタンパク質のチロシンリン酸化を阻止するＣＣＳの能力は投与量依存性であり（図８）そしてＥ−６４がｐ４２ｋＤａリン酸化に対するＣＣＳの阻害効果を完全に打ち消した（図８）から、この能力はそのタンパク分解活性に依存するものであった。Ｔ細胞のＥ−６４処理はＰＭＡ及びイオノホアに誘導されるＴ細胞システム発信に影響を与えなかった。
【００８５】
ＣＣＳはＥＲＫ−２チロシンリン酸化を阻害する。
本発明者らはＣＣＳにより阻害された４２ｋＤａリンタンパク質がＭＡＰｋ・ＥＲＫ−２ではないかと疑った。そこで、本発明者らは、Ｔｙｒ２０４でのリン酸化により触媒的に活性化されるとＥＲＫ−１及びＥＲＫ−２のみを特異的に検出する、特異的な抗ＥＲＫ−２ｍＡｂ及び抗ホスホＭＡＰｋ抗体を用いてイムノブロット分析を行った。ＰＭＡ＋イオノホアで刺激したＣＣＳ処理細胞のイムノブロットにより、ｐ４２ｋＤａリンタンパク質が実際にＥＲＫ−２であったことが確認された（図９）。
【００８６】
ＣＣＳはＥＲＫのＴＣＲ誘導チロシンリン酸化を減少させる。
本発明者らは次にＴＣＲにより媒介されるシグナル伝達に対するＣＣＳの効果を架橋抗ＣＤ３εｍＡｂで刺激したＧＡ１５の基質チロシンリン酸化を評価することにより研究した。特異的抗ホスホチロシンｍＡｂを用いるＧＡ１５溶解物のイムノブロットにより、約１２０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８５ｋＤａ、７６ｋＤａ、７０ｋＤａ、４２ｋＤａ及び４０ｋＤａのタンパク質を含む多数のタンパク質のチロシンリン酸化を増加させることが明らかにされた。これはＴＣＲ連結の後の他のＴ細胞系で観察されたリンタンパク質と一致した（ジュンら、１９９０、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，１５９１−１５９９及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，７７２２−７７２６、非特許文献３）（図１０）。チロシンリン酸化タンパク質は刺激後２〜５分間で容易に検出されそして少なくとも１０分間はリン酸化された状態に留まった（図１０）。抗ＣＤ３εｍＡｂ単独で又は架橋Ａｂで刺激されたＧＡ１５細胞はどの細胞基質のチロシンリン酸化をも誘導しなかった（データは示していない）。再び、ＧＡ１５の３０分間のＣＣＳ前処理は、投与量に依存して、ＥＲＫ−２のＴＣＲに誘導されるタンパク質のチロシンリン酸化の減少を惹起した（図１１）。ＣＣＳは、他のＴＣＲ誘導リンタンパク質のチロシンリン酸化に顕著な影響を与えなかった。このことはＣＣＳが選択的な作用様式を持っていることを示唆する。
【実施例４】
【００８７】
ＣＣＳはＲａｆ−１の移動度シフトを遅らせる
Ｒａｆ−１はＥＲＫ−２を活性化するＭＥＫ−１の直ぐ上流のアクチベーターである。Ｒａｆ−１の活性化は特定のセリン残基及びトレオニン残基のリン酸化を必要とする（アブルチら、１９９４、ＴＩＢＳ，１９，２７９−２８３）。ＭＡＰキナーゼカスケードにおけるＥＲＫ−２から上流の他の基質にＣＣＳが影響を与えるか否かを研究するため、本発明者らはＲａｆ−１に対するＣＣＳの影響を研究した。Ｔ細胞をＣＣＳ（０〜５０μｇ／ｍｌ）で処理し、ついで抗ＣＤ３εｍＡｂか又はＰＭＡ＋イオノホアの組合せかで前に述べたように刺激した。結果はＣＣＳがＲａｆ−１の移動度シフトを阻止することを示す。このことはＣＣＳがそのタンパク質リン酸化を、従って活性化を阻止することを示す。このデータから、ＣＣＳがＭＡＰキナーゼカスケードに対し効果を持つこと（図１２）そしてＣＣＳのこの効果はＥＲＫ−２に対する直接的なものではなく、ＭＡＰｋカスケード中の上流の基質に対するものであることが確認される。
【実施例５】
【００８８】
ＩＬ−２生産及びＴ細胞増殖に対するＣＣＳの効果
ａ．材料
細胞
脾臓細胞は、先に特許文献８に記述したように、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）から単離した。高度に精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞は磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）を用いて脾臓細胞から単離した。
【００８９】
ｂ．インターロイキン２生産。
ＰＲＭＩで希釈したＴ細胞をＣＣＳ（５０μｇ／ｍｌ）又は食塩水で３７℃で３０分間処理し、新鮮なＲＰＭＩで洗浄し、ついで培養培地に再懸濁した。Ｔ細胞は、固定化抗ＣＤ３ε（４μｇ／ｍｌ）及び可溶性抗ＣＤ２８（１０μｇ／ｍｌ）により、サイトカインｍＲＮＡを生産するように刺激した。ＰＢＳで希釈した抗ＣＤ３εｍＡｂを、４℃で１６時間インキュベートすることにより、２４ウエルの平底ミクロ培養プレート（コーニング、コーニング、ＮＹ）に固定した。ついで、ウエルをＰＢＳで３回洗浄した後、加湿５％ＣＯ２中で３７℃で２４時間インキュベートした脾臓細胞か又は精製ＣＤ４＋Ｔ細胞（２．５〜５×１０６細胞／ウエル）の培養物を３連で添加した。培養上清中のＩＬ−２のレベルはＣＴＬ−Ｌバイオアッセイ（ギリスら、１９７８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２０，２０２７−２０３２）を用いて測定した。
【００９０】
ｃ．Ｔ細胞増殖。
Ｔ細胞はＣＣＳ（５０μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、ＲＰＭＩ中で洗浄し、ついで固定化抗ＣＤ３εｍＡｂ単独で又は抗ＣＤ３εｍＡｂプラス抗ＣＤ２８ｍＡｂの組合せで刺激した。次に、細胞を、９６ウエル平底プレート（ヌンク）中、ウエル当たり１０５細胞で、３６時間培養した。培養は、グラスファイバーフィルター上で収穫する１２時間前に、０．５μＣｉの〔３Ｈ〕ＴｄＲでパルスした。
【００９１】
結果
ａ．ＣＣＳはＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−２生産及び増殖を阻害する
ｐ２１Ｒａｓ、Ｒａｆ−１、ＭＥＫ−１及びＥＲＫの活性化はＴ細胞におけるＩＬ−２転写の誘導のために必須である（イズキールドら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８，１１９９）。ＩＬ−２はＴ細胞の増殖を誘導する主要なオートクリン（自己分泌性）Ｔ細胞成長因子である。従って、ここに明らかにしたＥＲＫ活性化の欠如はＩＬ−２生産及びＴ細胞増殖を阻害すると予想することができる。従って、本発明者らはＣＣＳがＴ細胞シグナル発信の機能的結果、すなわちマウス脾臓細胞及び高度に精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２生産及び増殖を達成できるかどうかを研究した。精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＣＳ（５０μｇ／ｍｌ）処理は、ＥＲＫ経路が抗ＣＤ３εｍＡｂで刺激されたとき、ＩＬ−２生産及び増殖の両方を減少させた（図１３ａ及び１３ｂ）。ＣＣＳは脾臓細胞によるＩＬ−２生産をも阻止した。しかしながら、それは脾臓細胞の増殖には影響を与えなかった（図１４ａ及び１４ｂ）。このことはこれまで未同定のＣＣＳ中の成分が脾臓細胞培養の附属の細胞集団、例えばＢ細胞やマクロファージなどに作用していたことを示唆する。ブロメラインはＢ細胞に対する作用を介してＴ細胞への共刺激性のシグナルを増加させることができる。附属細胞に対するＣＣＳの推定的効果に関係なく、データは、ＣＣＳが精製ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−２生産及び増殖を阻止することを明瞭に示しており、このことはＣＣＳがＴ細胞の活性化を阻止することを示唆する。ＩＬ−２生産及び増殖は、組織培養培地単独で培養された細胞ではサイトカインは検出されなかったから、抗ＴＣＲ抗体による細胞刺激に依存していた（図１３及び図１４）。
【実施例６】
【００９２】
イン・ビトロでのヒト腫瘍細胞の成長に対するＣＣＳの効果
ａ．材料
細胞
腫瘍細胞系はエル．ケランド（インスティチュート・オブ・キャンサー・リサーチ、サットン、ＵＫ）から提供された。それは次のものであった。卵巣（ＳＫＯＶ−３、ＣＨ−１、Ａ２７８０）、結腸（ＨＴ２９、ＢＥ、ＬＯＶＯ）、乳房（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ３６１）、肺（Ａ５４９、ＣＯＲＬ２３、ＭＯＲ）及びメラノーマ（Ｇ３６１、ＢＯＯ８、ＳＫＭｅ１２４）。
【００９３】
ｂ．ヒト腫瘍細胞系の成長阻害。
研究は、エル．ケランド（インスティチュート・オブ・キャンサー・リサーチ、サットン、ＵＫ）により行われた。細胞系をトリプシン処理し、個々の生存細胞を、４×１０３細胞／ウエルの密度で１６０μｌの成長培地を含む９６ウエルミクロタイタープレート中に蒔いた。一晩接着させた後、次に４０μｌの成長培地中のＣＣＳを最終濃度が５０、１０、２．５、１及び０．２５μｇ／ｍｌとなるように、４連のウエルに添加した。８個のウエルを対照、無処理のウエルとして使用した。ＣＣＳは細胞に添加する直前に無菌水で希釈した。細胞へのＣＣＳの接触は９６時間であった。そこで、各ウエルの細胞数を、先に記述された（ケランドら、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３，２５８１−２５８６）ように１％酢酸中の０．４％スルホロ−ダミンＢで染色することにより測定した。ついで、５０％阻害濃度（ＩＣ５０値、μｇ／ｍｌ）を濃度対対照（％）吸光度（５４０ｎｍでの読み）のプロットから計算した。
【００９４】
結果
ａ．ＣＣＳはイン・ビトロでヒト腫瘍の成長を阻害する。
ｐ２１Ｒａｓ及びＲａｆ−１は重要なオンコジーンであり、突然変異すると、制御できない細胞成長及び増殖を惹き起こし、癌をもたらす。本発明者らはＣＣＳがｐ２１Ｒａｓ／Ｒａｆ−１／ＭＥＫ１／ＥＲＫキナーゼシグナル発信カスケードの効果を阻止することを示したから、ＣＣＳが腫瘍の成長を阻止することができるか否かを研究した。ヒト腫瘍細胞のＣＣＳ処理は幾つかの異なる卵巣、肺、結腸、乳房及びメラノーマ腫瘍細胞系の成長をイン・ビトロで減少させる結果を生じた（図１５）。ＣＣＳはすべての細胞系に等しく影響することはなかった。このことはＣＣＳが選択的作用を有していることを示唆する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の成長及び増殖を制御する細胞内シグナル発信経路を調節するための製薬組成物であって、前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項２】
細胞による成長因子及びサイトカインの生産を阻害するための製薬組成物であって、前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項３】
ＭＡＰキナーゼ経路の活性を減少又は防止するための製薬組成物であって、前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項４】
Ｔ細胞の活性を減少又は防止するための製薬組成物であって、前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項５】
免疫抑制剤として使用される製薬組成物であって、前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項６】
ｉ．Ｔ細胞の活性化；
ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化；又は
ｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産：
により媒介される疾病及び状態を治療又は予防するための、或いは癌を治療又は予防するための、製薬組成物であって、
前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項７】
成長因子及び他のサイトカインの生産を阻止するための、又は、自己免疫疾患、宿主による移植拒否、アレルギー反応、毒物ショック、アポプトシス、寄生体若しくは病原体の感染、又は癌を治療又は予防するための、製薬組成物であって、前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項８】
炎症性疾患又は炎症症状を治療又は予防するための製薬組成物であって、前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項９】
細胞の成長及び増殖を制御する細胞内シグナル発信経路を調節するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１０】
細胞による成長因子及びサイトカインの生産を阻害するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１１】
ＭＡＰキナーゼ経路の活性を減少又は防止するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞の活性を減少又は防止するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１３】
免疫抑制剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１４】
ｉ．Ｔ細胞の活性化；
ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化；又は
ｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産：
により媒介される疾病及び状態を治療又は予防するための、或いは癌を治療又は予防するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１５】
成長因子及び他のサイトカインの生産を阻止するための、又は、自己免疫疾患、宿主による移植拒否、アレルギー反応、毒物ショック、アポプトシス、寄生体若しくは病原体の感染、又は癌を治療又は予防するための、薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１６】
炎症性疾患又は炎症症状を治療又は予防するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１】
細胞の成長及び増殖を制御する細胞内シグナル発信経路を調節するための製薬組成物であって、前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項２】
細胞による成長因子及びサイトカインの生産を阻害するための製薬組成物であって、前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項３】
ＭＡＰキナーゼ経路の活性を減少又は防止するための製薬組成物であって、前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項４】
Ｔ細胞の活性を減少又は防止するための製薬組成物であって、前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項５】
免疫抑制剤として使用される製薬組成物であって、前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項６】
ｉ．Ｔ細胞の活性化；
ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化；又は
ｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産：
により媒介される疾病及び状態を治療又は予防するための、或いは癌を治療又は予防するための、製薬組成物であって、
前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項７】
成長因子及び他のサイトカインの生産を阻止するための、又は、自己免疫疾患、宿主による移植拒否、アレルギー反応、毒物ショック、アポプトシス、寄生体若しくは病原体の感染、又は癌を治療又は予防するための、製薬組成物であって、前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項８】
炎症性疾患又は炎症症状を治療又は予防するための製薬組成物であって、前記製薬組成物は、アナナイン、コモサイン又はそれらの混合物からなるブロメラインの成分を含む、製薬組成物。
【請求項９】
細胞の成長及び増殖を制御する細胞内シグナル発信経路を調節するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１０】
細胞による成長因子及びサイトカインの生産を阻害するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１１】
ＭＡＰキナーゼ経路の活性を減少又は防止するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞の活性を減少又は防止するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１３】
免疫抑制剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１４】
ｉ．Ｔ細胞の活性化；
ｉｉ．ＭＡＰキナーゼ経路の活性化；又は
ｉｉｉ．成長因子又はサイトカインの生産：
により媒介される疾病及び状態を治療又は予防するための、或いは癌を治療又は予防するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１５】
成長因子及び他のサイトカインの生産を阻止するための、又は、自己免疫疾患、宿主による移植拒否、アレルギー反応、毒物ショック、アポプトシス、寄生体若しくは病原体の感染、又は癌を治療又は予防するための、薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【請求項１６】
炎症性疾患又は炎症症状を治療又は予防するための薬剤の調製において、アナナイン、コモサイン又はアナナインとコモサインの混合物を使用する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１０−１４３９４５（Ｐ２０１０−１４３９４５Ａ）
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３７５３７（Ｐ２０１０−３７５３７）
【出願日】平成２２年２月２３日（２０１０．２．２３）
【分割の表示】特願平１０−５３７４２３の分割
【原出願日】平成１０年２月２５日（１９９８．２．２５）
【出願人】（５１００５０２２５）サランティス プロプライエタリィ リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＲＡＮＴＩＳ ＰＴＹ ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２３日（２０１０．２．２３）
【分割の表示】特願平１０−５３７４２３の分割
【原出願日】平成１０年２月２５日（１９９８．２．２５）
【出願人】（５１００５０２２５）サランティス プロプライエタリィ リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＲＡＮＴＩＳ ＰＴＹ ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
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