プラスミドＤＮＡ精製方法において一般的なツーコア単位操作の代替の操作を包含する、大規模な発酵体制を含む製造プロセスから、臨床等級のプラスミドＤＮＡを単離する方法が開示されている。本明細書に開示されている新規上流及び下流の精製方法は、製造コストの低下と方法の頑強性の増加をもたらす。ここに開示されている精製方法の一方又は両方は、ＤＮＡプラスミド精製技術に関連する本分野において公知の追加の精製工程と組み合わせて使用され得る。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００５年１月３１日に出願された米国仮出願６０／６４８，６７０号の利益を主張し、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、プラスミドＤＮＡ精製プロセスにおいて一般的なツーコア単位操作の代替法を包含する、大規模発酵方式を含む製造プロセスから臨床等級のプラスミドＤＮＡを単離する方法に関する。本明細書に開示されている新規上流及び下流精製プロセスは、製造コストの低下とプロセスの頑強性の増加をもたらす。本発明の一部として記載されている新規上流精製プロセスは、まず、プラスミドＤＮＡを含有する宿主細胞可溶化液が生成され、次いで、宿主細胞細片の凝集によって清澄化される２段階溶解／可溶化液清澄化プロセスを含む。本発明の一部として記載されている新規下流精製プロセスは、プラスミドＤＮＡが濃縮された宿主細胞可溶化液からのプラスミドＤＮＡの沈殿と、及び接線流ろ過モード下での前記沈殿されたＤＮＡの精密ろ過を包含する。本明細書に開示された精製プロセスの一方又は両方は、プラスミドＤＮＡ精製技術と関連する本分野で公知のさらなる精製工程と組み合わせて使用し得る。
【背景技術】
【０００３】
ポリヌクレオチドワクチンは、特定の疾病に対して防御免疫を誘導するための画期的アプローチであり、中和抗体を生成するとともに、より好ましい細胞媒介性免疫反応を活性化する（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６９：２４４−２４７；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９）。目的の抗原をコードする遺伝子と哺乳動物細胞中で活性なプロモーターとを含むプラスミドＤＮＡが身体に投与され、筋肉細胞によって内部に取り込まれる。抗原ＤＮＡは転写及び翻訳され、発現されたタンパク質は、Ｔ細胞提示のために細胞表面へと輸送される。疾病モデルでのＤＮＡワクチンの前臨床免疫原性と有効性は、多数の感染性疾患に対して実証されている（総説として、Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：９２７−９７４を参照。）。プラスミドＤＮＡは、さらに、機能的遺伝子の体内への投与、標的細胞への前記遺伝子の送達及び疾病状態を選択的に調節するための治療用産物の発現を包含する遺伝子治療処置について是認されている。
【０００４】
従って、遺伝子治療は、遺伝的欠陥の予防、治療又は治癒に対する代替法となる。プラスミドＤＮＡをベースとした多くの遺伝子治療臨床試験が開始されている（総説として、Ｍｏｕｎｔａｉｎ，Ａ．，２０００，ＴＩＢＴＥＣＨ １８：１１９−１２８；ａｎｄ Ｆｅｒｂｅｒ，Ｄ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４：１６３８−１６４２を参照）。
【０００５】
医薬等級のプラスミドＤＮＡの大量の製造及び精製は、ポリヌクレオチドワクチン及び遺伝子治療プロトコールの両者の適用性にとって極めて重要である。予防又は治療計画の一環として、疾病を撲滅するためにＤＮＡワクチン又は遺伝子治療処置を使用する可能性があるヒト使用者の数は極めて多く、臨床等級プラスミドＤＮＡに対する大きな需要をもたらしている。従って、ＤＮＡワクチンと遺伝子治療処置の選択肢が何れも提供しなければならない利点を完全に開発し、及び活用するために、高収率のプラスミドＤＮＡ産生プロセス及び精製プロセスが必要である（Ｓｈａｍｌｏｕ，Ｐ．Ａ．，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７７:２０７−２１８）。小規模プラスミドＤＮＡ精製法に関する従来の調査にも関わらず、臨床等級プラスミドＤＮＡの製造及び精製の規模を拡大することには問題が存在することが明らかとなっている（Ｐｒａｚｅｒｅｓ，Ｄ．Ｍ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＴｌＢＴＥＣＨ １７：１６９−１７４）。さらに、画期的な大規模製造プロセスは、最適化と市場化への早さに対する要求及び必要性に対する経済的な関心との釣り合いをとらなければならない（Ｓｈａｍｌｏｕ，２００３，上記）。本発明は、生産コストを低下させ、プロセスの頑強性を増加させるプラスミドＤＮＡの精製のための、高度に生産性があり、拡張可能であり、及び再現性のあるプロセスを開示する。本プロセスは、宿主細胞細片のポリマー凝集を含む新しい溶解及び可溶化液清澄化手法を開示する。この新規溶解及び凝集手法は、（ポリエチレングリコール又はアルコールを使用する）プラスミドＤＮＡの沈殿と、及び接線流ろ過モード下でのその後の精密ろ過を包含する新規下流仕上げ工程と組み合わせ得る。
【０００６】
増殖培地から細菌細胞を単離するために、化学的凝集が一般に使用され、遠心より安価な代替法となっている（例えば、Ｌｅｅ，Ｊ．ａｎｄ Ｃ．Ｖ．Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ，１９７４，Ｌａｂ．Ｐｒａｃｔ．２３：２９７−２９８；Ｃｕｍｍｉｎｇ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ６：１７−２３）。凝集の機序は複雑であり、温度、イオン環境、生理的熟成、凝集剤、表面剪断及び凝集されるべき材料など多くの変化要因に依存する（ＭｃＧｒｅｇｏｒ，Ｗ．Ｃ．ａｎｄＲ．Ｋ．Ｆｉｎｎ，１９６９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１：１２７−１３８）。細菌細胞細片に関しては、数個の研究が本機序について分析しているに過ぎない。ＰｅｒｓｓｏｎＩ．−Ｌ．及びＢ．Ｌｉｎｄｍａｎ（“Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｄｅｂｒｉｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ，”Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｅｄ．Ｙ．Ａ．Ａｔｔｉａ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８７，４２９−４３９）は、研究室及び予備生産研究でＥ．コリ細胞細片を凝集させるために、陽イオン性多価電解質、キトサン及びポリエチレンイミンの組み合わせを使用した。正に帯電したポリマー粒子は、Ｅ．コリ細胞細片を凝集させるためにも使用されている（Ｋｉｍ，Ｃ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅｂｒｉｓ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ Ｃｈａｒｇｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”，Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｅｄ．Ｙ．Ａ．Ａｔｔｉａ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８７，４２９−４３９）。しかしながら、ポリマー凝集剤を使用して、拡張可能なプロセスの設計のために清澄化された細菌可溶化液を生成可能であることは認識されていなかった。
【０００７】
微生物細胞発酵から臨床等級プラスミドＤＮＡを精製する際の最後の工程は、先行する上流精製工程から持ち込まれた、宿主細胞由来の全ての残留不純物及び／又はプロセス夾雑物を除去すること、並びに最終の産物を濃縮すること及び緩衝液交換を包含する。本発明は、プラスミドＤＮＡ精製を完結させるための最終仕上げ操作において、接線流ろ過モードでの精密ろ過と組み合わせて、ポリエチレングリコール（例えば、Ｌｉｓ，Ｊ．Ｔ．ａｎｄ Ｒ．Ｓｃｈｌｅｉｆ，１９７５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２：３８３−３８９；Ｓａｄｈｕ，Ｃ．ａｎｄ Ｌ．Ｇｅｄａｍｕ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｍｓ ６：２０−２１；Ｙｅｕｎｇ，Ｍ．Ｃ．ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｌａｕ，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：３８１−３８２；ａｎｄ Ｈｏｒｎ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：５６５−５７３を参照）又はアルコール（例えば、Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｍ．，“Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｄｓ．Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ａ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ，１９８７，４１−４８；Ｓｅｒｇｈｉｎｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：３６０４参照）を用いてＤＮＡを沈殿させるという周知の方法を使用する。本プロセスは、最終仕上げプロセスにおいて一般に使用されている限外ろ過操作に必要とされる高い再循環速度及び大きな膜面積を省略する。
【０００８】
１９９６年１０月１日に、Ｍａｒｑｕｅｔ，Ｍ．らに対して発行された米国特許第５，５６１，０６４号は、医薬等級プラスミドＤＮＡの精製中に使用された分画的ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）沈殿戦略を開示する。重要なことに、第一のＰＥＧ沈殿工程は、清澄化された可溶化液の生産後及び陰イオン交換クロマトグラフィーのサイズ排除前に実施する。
【０００９】
１９９８年１月１３日にＨｏｒｎ，Ｎ．らに発行された米国特許第５，７０７，８１２号は、クロマトグラフィーマトリックス（プラスミドＤＮＡは、その後、クロマトグラフィーマトリックスから、ＰＥＧを含有する緩衝液中に溶出される。）へのプラスミドＤＮＡの結合を増強させるための縮合剤としてＰＥＧを使用することを開示している。
【発明の開示】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、微生物細胞から医薬等級のプラスミドＤＮＡを単離する方法に関し、本方法は、製造プロセスからのプラスミドＤＮＡの精製に代わる要素となり、大規模発酵方式を含み、製造コストの低下とプロセスの頑強性の増加をもたらす。本発明は、さらに、新規上流（すなわち、宿主細胞可溶化液の清澄化の前及び宿主細胞可溶化液の清澄化を含む。）及び新規下流（すなわち、可溶化液清澄化後）精製工程を含むプラスミドＤＮＡ精製プロセスにおいて一般的なツーコア単位操作に関する。より具体的には、本明細書に開示されている上流精製工程は、目的の高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する宿主細胞からまず細胞可溶化液が生成され、次いで、宿主細胞細片を除去するための凝集によって前記細胞可溶化液が清澄化される２つの部分からなる溶解／可溶化液清澄化操作を含む。本発明の新規下流精製方プロセスは、残留不純物を除去するために上流及び先行する下流精製工程を介して高次コイルプラスミドＤＮＡが濃縮された細胞可溶化液をまず沈殿させた後、接線流ろ過モード下での精密ろ過に供される最終濃縮／仕上げ操作を包含する。これらの工程は、本分野で公知のさらなる精製工程とさらに組み合わせて使用することができ、及び／又は、好ましくはＤＮＡプラスミド精製技術に関連する本分野で公知の他の方法と組み合わせて、上記工程の少なくとも１つが省略される。
【００１１】
本発明の一実施形態において、本明細書に記載されている方法は、細菌細胞、植物細胞、酵母及びバキュロウイルスを含む（但し、これらに限定されない。）微生物細胞（エシェリヒア・コリ（「Ｅ．コリ」）が好ましい微生物宿主である。）からの臨床等級ＤＮＡプラスミドの精製を可能とする。本明細書に記載されている方法によって精製された臨床等級プラスミドＤＮＡは、ワクチンとして又は遺伝子治療ビヒクルとして、ヒトに投与するのに極めて有用である。本発明の方法は、臨床等級ＤＮＡプラスミド精製の微生物細胞からの精製について具体的に述べられているが、前記方法の適用は、微生物細胞からの精製に限定されない。従って、本発明は、さらに、本明細書に開示されている新規工程の１つ又はそれ以上を用いて、哺乳動物細胞から精製された臨床等級プラスミドＤＮＡの単離並びに様々な宿主細胞（例えば、微生物又は哺乳動物）からの別の生物分子（例えば、タンパク質）の単離及び精製に関する。
【００１２】
本発明は、（ａ）高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する微生物宿主細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、及び（ｂ）宿主細胞細片を凝集させることによって、工程（ａ）の前記可溶化液を清澄化すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。宿主微生物細胞の溶解は、リゾチームの存在下又は不存在下で行うことができる。本発明の一実施形態において、宿主細胞細片は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）で凝集される。細胞可溶化液を清澄化させるために使用されるＰＥＧを含む（これに限定されない。）凝集剤は、溶解緩衝液（例えば、標準的なＳＴＥＴ緩衝液）の成分として含めることができ、又は溶解が起こった後に、細胞可溶化液に添加することができる。凝集された宿主細胞細片は、例えば、沈降及びデカント又は遠心法（連続的遠心を含むが、これに限定されない。）によって宿主細胞可溶化液から除去することが可能であり、清澄化された細胞可溶化液をもたらす。凝集された細胞細片が除去された後、清澄化された細胞可溶化液中の高次コイルプラスミドＤＮＡは、さらに、下流の精製プロセスによって、残留夾雑物から精製される。従って、本発明の一実施形態は、本明細書に記載されている新規上流精製プロセスを用いて、高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する清澄化された宿主細胞可溶化液を生成する方法に関する。
【００１３】
本発明は、さらに、（ａ）高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する微生物宿主細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、（ｂ）工程（ａ）の宿主細胞可溶化液をアルカリｐＨシフト及びその後の中和に供すること、並びに（ｃ）宿主細胞細片を凝集させることによって、前記ｐＨシフトされた工程（ｂ）の細胞可溶化液を清澄化すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。本明細書に記載されているアルカリｐＨシフト及びその後の中和工程は、凝集操作のために宿主細胞可溶化液を調製するのに役立つが、前記ｐＨシフトは、前記可溶化液への凝集剤の添加前又は添加後の何れにおいても行うことが可能である。本発明の一実施形態において、当初細胞可溶化液のｐＨは、濃縮された塩基溶液の添加により、アルカリ値（例えば、約ｐＨ１２−１３）へとシフトされ、可溶性宿主細胞染色体ＤＮＡの変性を可能とする。アルカリシフトされた細胞可溶化液は、次いで、濃縮された酸溶液の添加により、概ね、最初の溶解緩衝液のｐＨまで中和され、好ましくは、約８−９の間のｐＨを有する細胞可溶化液をもたらす。従って、本発明の一実施形態は、（ａ）生理的緩衝溶液中で、高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する微生物宿主細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、（ｂ）塩基の添加により前記可溶化液のｐＨを約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間のｐＨまで上昇させることによって、工程（ａ）の宿主細胞可溶化液をアルカリｐＨシフトに供すること、（ｃ）アルカリシフトされた工程（ｂ）の細胞可溶化液を、概ね、細胞がその中に溶解された生理的緩衝液のｐＨまで中和すること、及び（ｄ）凝集剤（ＰＥＧを含むが、これに限定されない。）で宿主細胞細片を凝集させることによって、前記ｐＨシフトされ、中和された細胞可溶化液を清澄化すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。
【００１４】
本発明の上流溶解及び可溶化液清澄化技術の後に、（ｉ）ＣＴＡＢを含む（これに限定されない。）陽イオン性界面活性剤を用いた、清澄化された可溶化液からのプラスミドＤＮＡの沈殿、（ｉｉ）塩溶液によるプラスミドの溶解、（ｉｉｉ）水和したケイ酸カルシウム上への残留不純物の吸着、及び（ｉｖ）臨床等級プラスミド調製物の最終調合に先立つ、ポリエチレングリコール又はアルコールによる精製されたプラスミドＤＮＡの沈殿、を含む（これらに限定されない。）多数の下流精製プロセスが続くことが可能である。
【００１５】
本発明は、さらに、大規模発酵方式から臨床等級プラスミドＤＮＡを単離するための新規下流精製プロセスに関し、粉末化されたプラスミドＤＮＡ産物をもたらす最終濃縮／仕上げ工程に相当する。本発明の下流精製プロセスは、先行する精製工程の結果、高次コイルプラスミドＤＮＡが濃縮された細胞可溶化液から残留不純物を除去するように作用する。従って、本発明は、（ａ）前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、及び（ｂ）接線流ろ過モード下での精密ろ過によって、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。工程（ａ）における高次コイルプラスミドＤＮＡの沈殿は、ポリエチレングリコール又はアルコール（エタノール、メタノール及びイソプロパノールを含むが、これらに限定されない。）を用いた周知の方法によって行い得る。工程（ｂ）の精密ろ過プロセスは、プラスミドＤＮＡ精製プロセスの最終濃縮／緩衝液交換操作において一般に使用されている限外ろ過操作を直接置換することができ、再循環速度、フィルター膜面積及び総バッチ容積を最小限に抑える。
【００１６】
本発明の一実施形態において、高次コイルプラスミドＤＮＡは、本明細書に開示されている新規下流濃縮／仕上げ精製プロセスにおける第一の工程として、濃縮され、清澄化された細胞可溶化液（すなわち、上流及び先行する下流精製プロセスにより、高次コイルプラスミドＤＮＡが濃縮された宿主細胞可溶化液）からＰＥＧを用いて沈殿される。前記沈殿されたプラスミドＤＮＡは、次いで、接線流ろ過モード下で稼働される精密ろ過に供せられる。従って、本発明の一実施形態は、（ａ）ＰＥＧで前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、及び（ｂ）接線流ろ過モード下での精密ろ過によって、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。本発明の精密ろ過プロセスは、段階的なろ過プロセスの一環であり得る。従って、本発明の一実施形態において、上記ＰＥＧ沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡは、精密ろ過及びその後の透析ろ過が沈殿されたプラスミドＤＮＡスラリーを濃縮し、並びに残留ＲＮＡ及び不純物を清澄化する第一のろ過工程を含む段階的ろ過プロセスを介して濃縮される。第二のろ過工程は、ＤＮＡ沈殿内のＰＥＧをエタノールと置き換え、さらに、プラスミドＤＮＡを濃縮し、微細な粉末化された形態を得るために乾燥させることが可能な脱水されたプラスミドＤＮＡの最終湿潤産物が得られる。この第二のろ過工程は、撹拌された細胞操作下でのフィルター乾燥装置（例えば、単一プレートＮｕｔｓｃｈｅフィルター乾燥機）中で行うことが可能であり、圧力ろ過及び真空乾燥を可能とする。従って、本発明は、（ａ）ＰＥＧで前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、及び（ｂ）接線流ろ過モードでの精密ろ過を含む段階的ろ過プロセスを用いて、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。前記段階的なろ過プロセスは、（ａ）接線流ろ過の下での精密ろ過を含む第一のろ過濃縮工程と、（ｂ）高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿された状態に保つのに十分なＰＥＧの濃度を含有し、及び場合により十分な塩の濃度を含有するＰＥＧ含有透析ろ過緩衝液に対する第一の透析ろ過工程と、（ｃ）沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡがエタノールの添加によって部分的に脱水される脱水工程と、（ｄ）第二のろ過濃縮工程と、並びに（ｅ）１００％（ｖ／ｖ）エタノールに対する第二の透析ろ過工程と、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。さらなる実施形態において、（ｄ）及び（ｅ）の第二のろ過及び透析工程は、圧力ろ過の下で、及び撹拌された細胞モードで、単一プレートＮｕｔｓｃｈｅフィルター乾燥機を含む（但し、これに限定されない。）フィルター乾燥機中で行われる。
【００１７】
さらに、本発明は、（ａ）エタノール、メタノール及びイソプロパノールを含む（但し、これらに限定されない。）アルコールで前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、及び（ｂ）接線流ろ過下での精密ろ過によって、前記沈殿されたプラスミドＤＮＡを濃縮すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。本発明の本部分の一実施形態において、前記精密ろ過濃縮工程は、（ａ）接線流ろ過の下での精密ろ過を含む第一のろ過濃縮工程と、（ｂ）エタノール性溶液のエタノール濃度が高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿された状態に保つのに十分であるエタノール性溶液に対する第一の透析ろ過工程と、（ｃ）第二のろ過濃縮工程と、並びに（ｄ）１００％（ｖ／ｖ）エタノールに対する第二の透析ろ過工程と、を含む段階的ろ過プロセスの一部である。さらなる実施形態において、（ｃ）及び（ｄ）の第二のろ過及び透析工程は、圧力ろ過の下で、及び撹拌された細胞モードで、単一プレートＮｕｔｓｃｈｅフィルター乾燥機を含む（但し、これに限定されない。）フィルター乾燥機中で行われる。
【００１８】
本明細書において互換的に使用される「臨床等級のプラスミドＤＮＡ」と「医薬等級のプラスミドＤＮＡ」という用語は、遺伝子治療及び／又はポリヌクレオチドワクチン接種用途を含む（但し、これらに限定されない。）あらゆる公知の予防的又は治療的適応症のためのヒトへの投与に対して許容される純度のレベルである、宿主細胞から単離されたプラスミドＤＮＡの調製物を表す。
【００１９】
本明細書において使用される「非高次コイルプラスミドＤＮＡ」とは、切れ目が入った、開放環状及び直鎖などのプラスミドＤＮＡの他のあらゆる形態を含む高次コイルプラスミドＤＮＡでないあらゆるＤＮＡ並びに宿主ゲノムＤＮＡを表す。
【００２０】
本明細書において使用される「ＮＴＵ」とは、標準化された濁度単位（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ｕｎｉｔ）を表す。濁度とは、浸漬されたプローブの光場によって通過する粒子の「計数」として定義される。溶液の濁度は、レーザーをベースとした光散乱装置を用いてモニタリングすることが可能である。
【００２１】
本明細書において使用される「ＰＥＧ」とは、ポリエチレングリコールを表す。
【００２２】
本明細書において使用される「ＯＤ_６００」とは、６００ｎｍでの光学密度、ｍＬ当りの細胞の数の光散乱、分光学光度法測定を表す。
【００２３】
本明細書において使用される「Ｌ．Ｏ．Ｄ」とは、検出限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を表す。
【００２４】
本明細書において使用される「ＭＷ」とは、ダルトンで表した分子量を表す。
【００２５】
本明細書において使用される「ＬＲＡ^ＴＭ」とは、Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｍｏｖａｌ Ａｇｅｎｔ^ＴＭを表す。
【００２６】
本明細書において使用される「ＣＴＡＢ」とは、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド又はセチルトリメチルアンモニウムブロミドを表す。
【００２７】
本明細書において使用される「ｈｃＣａＳｉＯ_３」とは、水和され、結晶化されたケイ酸カルシウムを表す。
【００２８】
本明細書において使用される「ＩＰＡ」とは、イソプロパノールを表す。
【００２９】
本明細書において使用される「ＭＦ」とは、精密ろ過を表す。
【００３０】
本明細書において使用される「ＵＦ」とは、限外ろ過を表す。
【００３１】
本明細書において使用される「ＳＴＥＴ緩衝液」とは、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（約ｐＨ７．０−９．０）、約５０−１００ｍＭのＥＤＴＡ、約８％スクロース及び約２％Ｔｒｉｔｏｎ^（Ｒ）−Ｘ−１００を含む緩衝液を表す。
【００３２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、生産コストの減少とプロセスの頑強性の増加をもたらす、臨床等級プラスミドＤＮＡを精製する大規模化可能な方法に関する。プラスミドＤＮＡ精製のための主要な単位操作は、細胞溶解、ろ過（精密ろ過／限外ろ過）及びクロマトグラフィーを含むと、しばしば考えられている。しかしながら、大規模なスケールで医薬等級プラスミドＤＮＡを単離する場合、前記特定された主要な単位操作は、最低の単位コストで大きな量と高い品質をともに得るという本プロセスの最終目標に適合させるために調整しなければならない。例えば、複数のクロマトグラフィー工程のための、樹脂及び緩衝液などの原材料の支出は、大規模なプラスミドＤＮＡ精製プロセスに適用される場合、非常に高い単位コストと乏しい能力をもたらすことが明らかとされている。最近開示された米国特許出願０９／８７５，３７９号（米国公開番号ＵＳ２００２／００１２９９０）は、臨床等級品質（すなわち、少なくともヒトワクチン接種及びヒト遺伝子治療用途において有用）のプラスミドＤＮＡのグラム量の単離を確保しながら、相対的に高価なクロマトグラフィー工程を不要とする別のプラスミドＤＮＡ精製プロセスを明らかにした。本発明は、さらに、臨床等級プラスミドＤＮＡの精製のための経済的で、大規模化可能なプロセスを与えるという最終目標に拡張される。この目的のために、本発明は、プラスミドＤＮＡ精製プロセスのツーコア操作の代替操作として、清澄化された細胞可溶化液の生成及び高次コイルプラスミドＤＮＡの最終濃縮／仕上げを特定する。
【００３３】
従って、本発明は、新規上流（すなわち、宿主細胞可溶化液の清澄化の前及び宿主細胞可溶化液の清澄化を含む。）及び新規下流（すなわち、可溶化液清澄化より後）精製操作を含むプラスミドＤＮＡ精製プロセスに共通するツーコア単位操作に関する。開示されている上流精製工程は、高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する宿主細胞（微生物細胞を含むが、これに限定されない。）からまず細胞可溶化液が生成され、次いで、前記細胞可溶化液を凝集によって清澄化し、宿主細胞細片を除去する、２つの部分からなる溶解／可溶化液清澄化手順を含む。目的のプラスミドＤＮＡは清澄化された可溶化液中に残存し、目的のプラスミドＤＮＡは、下流プロセスを介して、清澄化された可溶化液からさらに精製される。本発明の開示された下流精製工程は、先行する前記濃縮手順後に残存する残留不純物の除去を助けるために、まず、（先行精製工程の結果）プラスミドＤＮＡが濃縮された溶液からプラスミドＤＮＡを沈殿させ、接線流ろ過モードで精密ろ過（「ＭＦ」）に供されるプロセスを含む採集濃縮／仕上げ工程を包含する。次いで、プラスミドＤＮＡ産物粉末を形成するために、精製されたプラスミドＤＮＡを乾燥させることができる。本明細書にさらに記載され、及び例示されているように、本発明の上流及び下流精製工程は、米国特許出願０９／８７５，３７９号（上記）に開示されている精製方法を含む（但し、これに限定されない。）さらなる精製プロセスを伴う。このため、臨床等級プラスミドＤＮＡの回収をもたらす大規模化可能な総合的精製プロセスを策定するために、本明細書に記載されている精製工程の一方又は両方を使用することは、本発明の範囲に属する。プラスミドＤＮＡ及び必要とされるプラスミドＤＮＡの品質の特定のロットに対して必要とされる精製スキームを適切に改変することは、当業者の裁量に属する。本発明の新規精製工程を使用する様々な実施例が、本明細書に記載されているが、これらの実施例は、決して、本明細書の開示を限定することを意図したものではない。
【００３４】
本発明の一実施形態は、（ａ）高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する微生物宿主細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、及び（ｂ）宿主細胞細片を凝集させることによって、工程（ａ）の前記可溶化液を清澄化すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。本発明のさらなる実施形態において、宿主細胞細片は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）で凝集される。従って、本発明の一実施形態は、（ａ）高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する微生物宿主細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、及び（ｂ）宿主細胞細片をＰＥＧで凝集させることによって、工程（ａ）の前記可溶化液を清澄化すること、を含む、大規模な微生物発酵から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。
【００３５】
微生物宿主細胞は、溶解前に発酵溶媒から採集され、適切な希釈になるように、滅菌された生理的に許容可能な緩衝液（例えば、標準的なＳＴＥＴ緩衝液）中に再懸濁される。当業者であれば、最適な溶解条件が、部分的に、溶解緩衝液内の微生物宿主細胞の濃度に依存することを認識する。最適な溶解が生じる溶解緩衝液中の宿主細胞濃度（ＯＤ_６００）は、下記実施例１において、Ｅ．コリ宿主細胞を用いて示されるように、容易に測定することが可能である。最適な溶解条件は、宿主細胞の乾燥細胞重量（「ＤＣＷ」）希釈に関して測定することも可能である。本発明の新規溶解／可溶化液清澄化プロセスによってＥ．コリ宿主細胞を溶解した場合には、７０の当初ＯＤ_６００が好ましいものであり得る（実施例１参照）。あるいは、本明細書において、本発明者らは、約２３ｇ／ＬのＤＣＷで、目的の高次コイルプラスミドＤＮＡを含有するＥ．コリ細胞の溶解が強固な溶解をもたらすことも決定した。前記宿主細胞の溶解は、精製されるべき染色体外高次コイルプラスミドＤＮＡ、可溶性の宿主細胞染色体ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ及び宿主細胞細片（例えば、不溶性の宿主細胞染色体ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ、細胞膜、細胞小器官及び修飾された固体）を含む（但し、これらに限定されない。）溶液を生成する。本発明の本実施形態の細胞溶解工程は、酵素リゾチームの存在下又は不存在下の何れにおいても起こり得る。細菌細胞中で、リゾチームは、細菌のペプチドグリカン細胞壁を分解するように作用して、ペプチドグリカン層のＮ−アセチルムラミン酸（ＮＡＭ）及びＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）の間のβ結合を加水分解する。これは、内部細胞膜を露出させ、例えば、界面活性剤によるさらなる破壊に対して、内部細胞膜を脆弱な状態とする。従って、リゾチームの添加は、細菌細胞を溶解する穏やかな方法に相当し、より大きなプラスミドの機械的破壊が生じる可能性をより少なくする。
【００３６】
本明細書の実施例中に教示されているとおり、最終的なプロセスの収率に対するリゾチーム添加の効果は、容易に決定される。目的の高次コイルプラスミドＤＮＡをその中で増幅するために選択された微生物の、好ましくは細菌の宿主細胞に応じて、当業者は、リゾチーム添加が前記プラスミドの精製をさらに補助する（例えば、精製されたプラスミドＤＮＡの収率を最終的に最大化する。）かどうかを経験的に決定することが可能である。本発明の一実施形態において、Ｅ．コリ細胞を用いた本明細書の実施例中に例示されているように、目的の高次コイルプラスミドＤＮＡを含む宿主微生物細胞は、リゾチームの存在下で、標準的なＳＴＥＴ緩衝液（例えば、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、２％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ^（Ｒ）−Ｘ−１００、８％ｗ／ｖのスクロース、ｐＨ８．２）中で溶解される。本明細書に開示されている全ての塩基性緩衝液再懸濁の処方に対して改変を行い得ること、及び、本発明での使用に適していることが、当業者に自明である。従って、本発明のプロセスの結果に対して実質的に影響を与えず又は変化させない全ての塩基性緩衝液の処方が、本明細書に記載されているプロセスの範囲に属するものとされる。しかしながら、特に、下流のＣＴＡＢをベースとした沈殿が想定されている場合、本発明の溶解工程は、Ｍｇ^＋＋及びＣ^＋＋などの二価陽イオンを効果的に除去するキレート物質（例えば、ＥＤＴＡ）、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ^（Ｒ）をベースとする界面活性剤）並びにスクロースを含む生理的に許容される緩衝液の存在下で実施する。ＥＤＴＡは、ＥＤＴＡによって会合されなければＤＮＡｓｅを活性化する二価の金属イオンを会合させることにより、ＤＮＡｓｅ活性を阻害する。二価の金属イオンはプラスミドのＣＴＡＢとの錯化を妨げるので、ＥＤＴＡは、ＣＴＡＢをベースとした下流沈殿工程において好ましい役割を果たし続ける。さらに、プラスミドＤＮＡを沈殿させるＣＴＡＢの濃度範囲は、Ｔｒｉｔｏｎ^（Ｒ）及びＤＮＡ濃度の両方に依存する（例えば、米国特許出願０９／８７５，３７９号参照、上記。）。緩衝液のｐＨ範囲は、特定の微生物株に対して決定された最良の結果に従って調整し得るが、好ましいｐＨ範囲は約７．０−９．０の間であり、約８．０−８．５のｐＨ範囲が最適である。
【００３７】
本発明の別の実施形態において、完全な細胞溶解は、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９７４９号（公開番号ＷＯ９６／０２６５８）及びＰＣＴ／ＵＳ９６／０７０８３（ＷＯ９６／３６７０６）（参照により本明細書に組み込まれる。）中に開示されている熱交換装置に宿主細胞を通過させることを含むことができ、前記細胞は、リゾチームで処理されてもよく、処理されなくてもよいが、好ましくは、熱に曝露する前に、リゾチームで処理される。著しい流体の動的力を生成することが知られている高圧ホモゲナイザーは、高次コイルプラスミドＤＮＡを損傷するリスク及び／又は所望されるプラスミドのサイズと同等のサイズまでゲノムＤＮＡを剪断するリスクのために、本発明の宿主細胞溶解工程に対しては好ましくない。しかしながら、剪断損傷からＤＮＡを保護することが明らかとなっている機械的細胞溶解技術（例えば、２００２年１２月２６日にＵＳ２００２０１９７６３７号として公開された米国特許出願１０／１５８，７５３号に記載されているような、圧縮剤、核酸を凝集させる小さなポリカチオン、の存在下での溶解）を使用することができる。
【００３８】
本発明のさらなる態様には、上述のように、工程（ａ）で生成された宿主微生物細胞可溶化液を、アルカリｐＨシフトに供した後に、細胞が最初にその中で溶解された緩衝液によって規定される前記可溶化液の当初ｐＨまで、概ね中和される。従って、本発明の一実施形態において、（ａ）高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する宿主微生物細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、（ｂ）工程（ａ）の宿主細胞可溶化液をアルカリｐＨシフト及びその後の中和に供すること、並びに（ｃ）宿主細胞細片を凝集させることによって、前記ｐＨシフトされた工程（ｂ）の可溶化液を清澄化すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。さらなる実施形態において、前記ｐＨシフトされた可溶化液は、ＰＥＧを用いて、宿主細胞細片を凝集させることによって清澄化される。宿主細胞可溶化液のアルカリｐＨシフト及びその後の中和は、凝集剤の可溶化液への添加の前に行い得る。あるいは、凝集剤は、初期溶解緩衝液の成分として、宿主細胞可溶化液中に存在し、又はアルカリｐＨシフト及び中和工程の前に、溶解が起こった後に添加され得る。本発明の一実施形態において、当初細胞可溶化液のｐＨは、その中に細胞が最初に懸濁及び溶解される緩衝液（例えば、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、２％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ^（Ｒ）−Ｘ−１００、８％ｗ／ｖのスクロースからなる標準的なＳＴＥＴ緩衝液、ｐＨ８．２）の結果、概ね約ｐＨ７．０と約ｐＨ９．０の間、好ましくは約ｐＨ８．０と約ｐＨ８．５の間にある。アルカリｐＨシフトは、可溶性宿主細胞染色体ＤＮＡの完全な変性を可能とする値まで（例えば、概ね、約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間）、可溶化液のｐＨをシフトさせることを含む。時間が経過するにつれて、この上昇されたｐＨに高次コイルプラスミドＤＮＡを曝露させることにより、プラスミドの変性も引き起こされるが、プラスミドＤＮＡのサイズが小さいために、条件が中和されると、容易に再度のアニーリングを行う。可溶化液のｐＨは、プラスミドＤＮＡが急速に変性し、剪断損傷に対して増加した感受性を有する約ｐＨ１３を超えて上昇されないことが重要である。可溶化液のｐＨは、５Ｎの水酸化ナトリウム（「ＮａＯＨ」）を含む（但し、これに限定されない。）濃縮された塩基溶液の添加によって上昇させることが可能であり、次いで、染色体ＤＮＡを確実に変性させるために、ある一定の長さの時間にわたり（例えば、約６０分）、ｐＨシフトされた細胞可溶化液を上昇されたｐＨに保つ。次いで、細胞可溶化液のｐＨは、濃縮された酸溶液（濃縮された酢酸溶液（例えば、約１．７と２．５の間の規定度を有する酢酸）を含むが、これに限定されない。）の添加によって、中和され、宿主細胞がその中で最初に溶解された緩衝液のｐＨまで、概ね可溶化液のｐＨを減少させる。
【００３９】
理論に拘泥するものではないが、本明細書に記載されているｐＨシフトは、ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙによって最初に記載された古典的なアルカリ溶解技術（１９７９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．７：１５１３−１５２３）に、大まかに比較し得る。ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙのアルカリ溶解法は、変性により、宿主細胞のゲノムＤＮＡとタンパク質を同時に除去できること、及び、次いで、変性された材料を選択的に沈殿させ得ることで周知である。伝統的なアルカリ溶解操作は、グルコース又はフルクトースを加えたＴｒｉｓ緩衝液を含む細胞再懸濁溶液を使用し、この懸濁液には、高塩基溶液及びドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）界面活性剤が細胞溶解のために添加される。高塩基は、高分子量染色体ＤＮＡを選択的且つ完全に変性させる。次いで、ｐＨ５．５の（酢酸を加えた）３Ｍ酢酸カリウムの添加によって可溶化液が中和されると染色体ＤＮＡは沈殿するが、プラスミドＤＮＡは上清中に保持される。しかしながら、重要なことには、大きなプロセス容量、複数のプロセス容器が必要であること、高ｐＨ及び酢酸ナトリウムの高レベルでのＤＮＡの剪断感受性が報告されていることなど（これらに限定されない。）、プラスミドＤＮＡの大規模な精製のためにこの伝統的なアルカリ溶解方法の使用に付随する大きな欠点が存在する（Ｃｈａｍｓａｒｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５：３８７−３９２参照）。上記説明のとおり、本発明の本実施形態の塩基性ｐＨシフトは、当初微生物細胞可溶化液中に存在する染色体ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを変性させるためにも重要である。高次コイルプラスミドＤＮＡに対する高ｐＨ（例えば、ｐＨ１２）の影響を調べた本明細書に記載されている実験は（実施例７に記載されている。下記。）、高い羽根車先端速度で、１時間超にわたり、ｐＨ１２に曝露されたときに、高次コイルプラスミドＤＮＡに対する損傷が存在しないことを示している。本明細書に記載されているアルカリｐＨシフト及びその後の中和工程が宿主ゲノムＤＮＡの一部を溶液から除去するのに対して、完全な排除は達成されず、続いて行われる凝集操作が必要となる。従って、本発明の塩基性ｐＨシフト工程及びその後の中和工程は、凝集操作のための宿主細胞可溶化液を調製するために実施されるのであって、細胞を溶解させ、又は可溶化液それ自体を清澄化させるために行われるのではない。従って、特定の理論に拘泥するものではないが、本発明のｐＨシフトは、細胞細片のその後の凝集のために重要な調製工程であることが明らかとなっている（さらに以下に記載されている。実施例１参照。）。
【００４０】
同じく、本発明の一実施形態は、（ａ）高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する宿主微生物細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、及び（ｂ）宿主細胞細片を凝集させることによって、工程（ａ）の前記可溶化液を清澄化すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。宿主細胞可溶化液が生成された後、並びに、上記アルカリｐＨシフト及びその後の中和工程に場合により供した後、宿主細胞細片（例えば、不溶性ゲノム宿主細胞ＤＮＡ、細胞膜、修飾された固体）を除去するために、宿主細胞可溶化液は凝集され、高次コイルプラスミドＤＮＡ及び可溶性染色体ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含む（これらに限定されない。）成分を含有する清澄化された可溶化液を生成する。本発明の一実施形態において、宿主細胞細片の凝集を達成する凝集剤が、当初溶解緩衝液の成分である。あるいは、前記凝集剤は、溶解が起こった後に、宿主細胞可溶化液に添加することが可能である。本明細書に開示されている方法による細胞可溶化液の凝集は、前記微生物細胞可溶化液の分離可能性を大幅に増大させる。低カット界面活性剤沈殿工程（例えば、ＣＴＡＢ）は、可溶性タンパク質のレベルをさらに減少させるために、凝集後に実施することが可能である。細胞細片は、凝集後に溶液から沈降することができ（例えば、沈降／デカント）、又は、連続的遠心を含む（但し、これに限定されない。）遠心（例えば、１５，０００×ｇ、１５分）を介して、容易に除去することが可能である。可溶化液から残留固体を除去するために、遠心に加えて、仕上げろ過（例えば、セルロース又は珪藻土をベースとしたデプスフィルターを使用）も使用することが可能である。凝集された細胞細片が除去された後、可溶化液上清中に残存する高次コイルプラスミドＤＮＡは、次いで、当業者に公知の精製プロセス（例えば、米国特許出願０９／８７５，３７９号、上記）を包含する下流精製プロセス及び／又は本発明の一部として開示された新規下流工程によって、他の夾雑物からさらに精製除去される。
【００４１】
宿主細胞細片の凝集とは、細胞粒子の凝集、すなわち細胞細片凝集塊の形成を表す。「凝集剤」又は「凝集因子」とは、粒子状懸濁液を清澄化するために使用される物質（例えば、ポリマー）であり、前記物質は、懸濁液に添加されたときに、凝集塊の形成を誘導する。凝集された物質（不溶性の粒子状物質に相当する。）は、通常、重力下で沈降する。しかしながら、本明細書に記載されている細胞細片浮遊塊を含む巨大な不溶性浮遊塊（すなわち、凝集の結果として形成される凝集された物質）は、低速遠心又は単純なろ過方法によって、溶液から容易に分離することが可能である。表面電荷、凝集されるべき物質の化学的及び物理的特徴、凝集剤の吸着速度及び濃度、粒子衝突速度及び濃度並びに懸濁液の混合条件を含む（これらに限定されない。）多くの異なる因子が、凝集の程度に影響を与え得る。凝集は、添加された凝集剤の電荷（「電荷中和」）又はその分子量（「架橋凝集」）の何れかの結果として起こると考えられる（Ｃｕｍｍｉｎｇ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ６：１７−２３参照）。電荷中和を介した凝集は、凝集されるべき物質の電荷とは反対の電荷を有する凝集剤間の接着によって起こり、表面電荷の全体的な中和又は電荷の局所的な反転を引き起こし、効果的な粒子の衝突と増加された浮遊塊の成長を可能とする。電荷中和機序を介した凝集の効率性は、凝集剤の分子量又はそのポリマー化の程度に依存しない。これと比べて、架橋凝集による細胞物質の凝集は、帯電した凝集剤又は非イオン性凝集剤とともに起こり得、凝集剤の分子量及び／又はポリマー化の程度に一層依存する。架橋凝集は、通常、コロイド状粒子の分散液に高分子量ポリマーを添加することによって達成される。凝集剤は、ループ及び尾部高次構造で粒子の２以上の表面に吸着することにより、これらを一緒に連結する。
【００４２】
本明細書に記載されている宿主細胞細片を凝集させるために、帯電した（例えば、陰イオン性又は陽イオン性）又は帯電していない、合成（例えば、ポリエチレングリコール）又は天然に存在する（例えば、キトサン）ポリマーなど（但し、これらに限定されていない。）、多数の異なる凝集剤を使用することが可能である。従って、本発明の一実施形態において、上述のように作製された宿主細胞可溶化液中で細胞細片凝集を引き起こすために、ポリマー凝集剤が使用される。本プロセスにおける細胞細片の凝集塊形成に影響を与えるために凝集剤の種類を選択する場合には、凝集され、その後廃棄されることが予定されている物質の特徴及び留保される（すなわち、精製される）ことが予定されている物質の特徴をともに検討することが重要である。プラスミドＤＮＡ精製体制において、検討すべき重要事項は、ＤＮＡが負に帯電した生体分子であるので、細菌の細胞細片を凝集することが最も一般的に知られている凝集剤である正に帯電した凝集剤は望ましくないということである。正に帯電した凝集剤は、精製されることが予定されたプラスミドＤＮＡとともに細胞細片を凝集させる。従って、本明細書に記載されている凝集工程を実施するために、負に帯電したポリマーを選択することが好ましく、より好ましくは帯電していないポリマーが選択される。この目的のために、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）は、プラスミドを含有する可溶化液に対する費用対効果が優れた無毒の凝集剤であることが本明細書に示されている。ＰＥＧは、４００から１５，０００超までの分子量ポリマーの範囲を作製する反復単位（−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）から構成される非イオン性ポリマーである（例えば、最大４００，０００の分子量を有するＰＥＧポリマーが市販されている。）。ＰＥＧは、殆どの有機溶媒と適合性があり、優れた水溶解性を有する。ＰＥＧは、さらに、多くの市販薬及び軟膏中の成分であるので、証明された安全性特性を有している。本明細書の実施例に示されているように、ＰＥＧは、微生物可溶化溶液から宿主細胞細片の凝集を誘導するが、ＰＥＧによって誘導されるこの凝集の正確な機序は明確でない。ＰＥＧは、細胞細片がポリマーと直接相互作用する伝統的な架橋凝集機序を介して作用して、ポリマー表面上に吸着することが可能である。あるいは、ＰＥＧは、可溶化液の特定されていない成分を溶液から排除することができ、この排除された物質は、次いで、宿主細胞細片を凝集させるように作用する。従って、本明細書において、ＰＥＧは、微生物宿主細胞細片の凝集剤として特定されており、ここで、「凝集剤」は、直接又は間接的な機序を介して、宿主細胞細片の凝集を誘導する物質として定義される。
【００４３】
十分なＰＥＧ濃度はＤＮＡを沈殿させることが可能であることがＬｉｓとＳｃｈｌｅｉｆ（１９７５；上記）によって示されており、従って、本明細書に記載されている方法において凝集剤としてＰＥＧが選択されるのであれば、使用されるＰＥＧの濃度は、本発明の凝集工程の間にプラスミドＤＮＡ沈殿の可能性を最小限に抑えることが重要である。上述のように、ＰＥＧは非イオン性ポリマーであるので、凝集の程度は、ポリマーの分子量及びポリマー化の程度の両方に依存する可能性がある。当業者であれば、精製されるべきプラスミドＤＮＡのサイズ及びプラスミドＤＮＡ増幅のために使用される具体的な宿主細胞など、様々な要因に留意しながら、宿主細胞細片の最も効率的な凝集を達成するために、ＰＥＧの最も適切な濃度及び分子量を経験的に決定することが可能である。本明細書において使用される、特定の宿主細胞可溶化液を凝集するために使用されるＰＥＧポリマーの最も適切な濃度及び分子量は、前記可溶化液の最も効率的な凝集（すなわち、プラスミドＤＮＡ沈殿の最小量と組み合される、凝集された細胞細片の最大量を達成する。）をもたらすものを表す。例えば、高濃度の低分子量ＰＥＧを使用する場合と同様、高分子量ＰＥＧを用いることにより、低濃度の比較的に効率的な凝集が達成され得る。従って、ＰＥＧポリマー濃度と分子量の間に密接な相互作用が存在すること、従って、凝集目的のために、本明細書に開示されている全ての具体的なＰＥＧ濃度及びＰＥＧ分子量は指針と考えるべきであり、総じて、本発明に対する限定ではないことを理解すべきである。
【００４４】
実施例１において、細菌細胞細片の沈降に対するＰＥＧ凝集の効果を一般的に特徴付けるために、最初に、スクリーニング研究を実施した。ＰＥＧは、特に、Ｅ．コリ細胞可溶化液の塩基／酸処理後（例えば、約ｐＨ８．５から約１２．５までのｐＨシフト、次いで、約ｐＨ８．５まで戻る。）において、Ｅ．コリ細胞細片の高度に効率的な凝集剤であることが決定された。目的のプラスミドＤＮＡを含有するＥ．コリ発酵から得られる細菌細胞可溶化液は、（１）ＳＴＥＴ緩衝液（上記）中に細胞を再懸濁し、及び２０℃でリゾチームとともに温置すること、（２）ＳＴＥＴ緩衝液中に細胞を再懸濁し、２０℃でリゾチームとともに温置し、次いで、可溶化液を塩基／酸処理に供すること、並びに（４）３％ＰＥＧ３０００を含有するＳＴＥＴ緩衝液中に細胞を再懸濁し、２０℃でリゾチームとともに温置し、可溶化液を塩基／酸処理に供すること、という（図１に示されているような）４つの異なる方法によって作製された。図１からの結果は、重力のみにより、２日間にわたって物質を沈降させた後の、ｐＨシフトされ、ＰＥＧ処理された可溶化液（可溶化液＃４）中の細胞細片の高度に効率的な凝集を示している。図１に示されている可溶化液及びその変形は、観察されたＰＥＧ誘導性凝集を特徴付けるためにさらに検査された（図２参照）。前記可溶化液の一定分量を１５分間温置し、次いで遠心した。濁度測定（図３）は、塩基／酸処理に供された可溶化液に添加された場合の、凝集剤としてのＰＥＧの作用を示しており、対照可溶化液（可溶化液＃２）の７３０ＮＴＵに比べて、５％ＰＥＧ３０００で凝集した後には（可溶化液＃６）、１６ＮＴＵの溶液濁度であることを示している。プラスミドＤＮＡ含有懸濁液から凝集された物質を分離するための清澄化戦略として、連続的な遠心を使用することが可能であり、清澄化された可溶化液を調製するための仕上げろ過を用いずに、２０ＮＴＵ未満の清澄度が達成されることを、これらの結果は示している。実施例１は、さらに、細菌細胞細片の凝集に対するＰＥＧ濃度及び分子量の効果を示しており、宿主細胞細片の最も効率的な凝集を達成するための戦略を設計する場合に、当業者が、どのようにして、適切なＰＥＧ濃度及び分子量を特定できるかについて記載している。プラスミドＤＮＡを含有する宿主細菌細胞からの細胞細片の凝集に対するＰＥＧ濃度及び分子量の効果は、細胞細片の沈降性能に基づく迅速なスクリーニング法を用いて調べた。まず、プラスミドＤＮＡを含有するＥ．コリ細胞をリゾチームの存在下で溶解し、上述のように、塩基／酸処理に供した。様々なＰＥＧ原溶液（ＰＥＧ４００−６０００）を、可溶化液の１０ｍＬ分取試料中に混合して、約１％と１５％（ｗ／ｖ）の間のＰＥＧ濃度を得る。次いで、混合物を、約１６時間、室温で沈降させた。沈降された固体の容積及び上清の濁度（ＯＤ_６００）を測定した（図４Ａ参照）。さらに、ＰＥＧ３０００を凝集剤として用いて、ＤＮＡ濃度（ＡＥＸアッセイによって測定）及び上清の濁度を調べた（図４Ｂ）。これらの結果は、例えば、細胞細片は凝集するが、ＤＮＡは沈殿しないＰＥＧ３０００濃度範囲が存在することを示している（図４Ｂ参照）。約０％と１０％％（ｗ／ｖ）の間の濃度範囲にわたって、類似のプラスミドＤＮＡ沈殿曲線もＰＥＧ６０００に対して作製した（図５参照）。
【００４５】
従って、本発明の一実施形態において、高次コイルプラスミドＤＮＡは、（ａ）高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する宿主細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、及び（ｂ）ポリマー（ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を含むが、これに限定されない。）で宿主細胞細片を凝集させることによって、工程（ａ）の前記可溶化液を清澄化すること、を含む方法によって、大規模な微生物発酵から精製される。工程（ａ）の宿主細胞は、生理的緩衝液（例えば、上述のような標準的ＳＴＥＴ緩衝液）中、リゾチームの存在下又は不存在下で、好ましくはリゾチームの存在下で溶解することが可能である。あるいは、採集された宿主細胞は、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９７４９（上記）及びＰＣＴ／ＵＳ９６／０７０８３（上記）中に開示されているような熱交換装置への通過を介して溶解することが可能である。ポリマー（ＰＥＧを含むが、これに限定されない。）による工程（ｂ）の宿主細胞細片の凝集は、細胞細片の最大量が浮遊塊へと凝集されるように行われ、前記浮遊塊は沈殿されたプラスミドＤＮＡの最小量を含有する。本発明の一実施形態において、宿主細胞細片は、ＰＥＧ、好ましくは約１０００超、より好ましくは約１４５０と約１５，０００の間の分子量のＰＥＧ、最も好ましくはＰＥＧ６００の添加によって、約２％と約５％（ｗ／ｖ）の間、より好ましくは約３％と約４％（ｗ／ｖ）の間、最も好ましくは、約３．７％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで、凝集される。
【００４６】
本発明のさらなる実施形態において、宿主細胞細片の凝集の前に、特に、記載されている可溶化液清澄化プロセスのための凝集剤としてＰＥＧが選択される場合、宿主細胞可溶化液は、本明細書に記載されているように、アルカリｐＨシフト及びその後の中和工程へと供される。従って、前記実施形態は、（ａ）高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する宿主細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、（ｂ）工程（ａ）の宿主細胞可溶化液をアルカリｐＨシフト及びその後の中和に供すること、並びに（ｃ）ポリマー（ポリエチレングリコールを含むが、これに限定されない。）で宿主細胞細片を凝集させることによって、工程（ｂ）の前記ｐＨシフトされた可溶化液を清澄化することを含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法を含む。本発明の一実施形態において、当初細胞可溶化液のｐＨは、その中に宿主細胞が最初に懸濁及び溶解される緩衝液（例えば、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、２％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ^（Ｒ）−Ｘ−１００、８％ｗ／ｖのスクロースからなる標準的なＳＴＥＴ緩衝液、ｐＨ８．２）の結果、概ね約ｐＨ７と約ｐＨ９の間、好ましくは約ｐＨ８．０とｐＨ８．５の間にある。次いで、細胞可溶化液のｐＨは、可溶性染色体ＤＮＡの完全な変性を可能とする値まで（例えば、概ね、約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間）までシフトされる。上述のように、ｐＨは、５ＮのＮａＯＨなどの（但し、これに限定されない。）濃縮された塩基溶液の添加によって上昇させることが可能であり、次いで、染色体ＤＮＡを確実に変性させるために、ある一定の長さの時間にわたり（例えば、６０分）、ｐＨシフトされた細胞可溶化液を上昇されたｐＨに保つ。しかしながら、ｐＨは、プラスミドＤＮＡが急速に変性し、剪断損傷に対して増加した感受性を示すような程度まで（すなわち、約ｐＨ１３超）上昇されないことが重要である。次いで、細胞可溶化液のｐＨは、濃縮された酸溶液（（例えば、約１．７と２．５の間の規定度を有する）濃縮された酢酸溶液を含むが、これに限定されない。）の添加によって、中和され、宿主細胞がその中で最初に溶解された緩衝液のｐＨまで、概ね可溶化液のｐＨを減少させる。従って、本発明の一実施形態は、（ａ）生理的緩衝溶液中で、高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する宿主細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、（ｂ）前記可溶化液のｐＨを約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間のｐＨまで上昇させることにより、工程（ａ）の宿主細胞可溶化液をアルカリｐＨシフトに供すること、（ｃ）アルカリシフトされた工程（ｂ）の細胞可溶化液を、概ね、宿主細胞がその中に溶解された当初の生理的緩衝液のｐＨまで、好ましくは約ｐＨ７と約ｐＨ９の間のｐＨまで、より好ましくは約ｐＨ８．０とｐＨ８．５の間のｐＨまで中和すること、並びに（ｄ）ポリマー（ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を含むが、これに限定されない。）で宿主細胞細片を凝集させることによって、前記ｐＨシフトされ、中和された細胞可溶化液を清澄化すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。細胞がその中で溶解される生理的緩衝液（例えば、本明細書に記載されているような標準的ＳＴＥＴ緩衝液は、リゾチームを含有してもよく、又は含有しなくてもよい。これに代えて、アルカリｐＨシフト及びその後の中和工程は、ＰＥＧを細胞可溶化液に添加した後に行うことが可能である。例えば、ＰＥＧは、宿主細胞細片を凝集させるために経験的に決定された濃度で、当初の溶解緩衝液中に存在することができ、ここにおいて、前記ＰＥＧ含有細胞可溶化液は、次いで、前記細胞細片の効率的凝集を達成するために、本明細書に記載されているアルカリｐＨシフト／中和工程に供される（実施例１参照）。本発明は、さらに、（ａ）生理的緩衝溶液中で、高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する宿主細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、（ｂ）前記可溶化液のｐＨを約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間のｐＨまで上昇させることにより、工程（ａ）の宿主細胞可溶化液をアルカリｐＨシフトに供すること、（ｃ）アルカリシフトされた工程（ｂ）の細胞可溶化液を、概ね、工程（ａ）の宿主細胞可溶化液のｐＨまで中和すること、（ｄ）ＰＥＧ６０００の前記可溶化液への添加で宿主細胞細片を凝集させることによって、工程（ｃ）の細胞可溶化液を清澄化すること、及び（ｅ）工程（ｄ）の前記凝集された宿主細胞細片を遠心し、高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する上清を取得すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。本発明の本部分の一実施形態において、工程（ａ）の生理的溶解緩衝液は、リゾチームを含有し、及び約ｐＨ７と約ｐＨ９の間のｐＨ、好ましくは約ｐＨ８と約ｐＨ８．５の間のｐＨを有する標準的なＳＴＥＴ緩衝液である。別の実施形態において、濃縮されたＰＥＧ６０００溶液は、約３．７％（ｗ／ｖ）の濃度になるように、前記可溶化液に添加される。本発明の本部分のさらなる実施形態において、ＰＥＧ凝集剤は、連続的な遠心条件下で、アルカリシフトされ、中和された宿主細胞可溶化液へ、工程（ｄ）において供給され、上清中に残存するプラスミドＤＮＡを有する凝集された細胞細片の沈殿物を取得する。
【００４７】
本発明の一実施形態において、高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する微生物宿主細胞は、リゾチームの存在下又は不存在下で、好ましくはリゾチームの存在下で、生理的緩衝液中において温置され、塩基性ｐＨシフト及びその後の中和工程（上述のとおり）に供される。これは、高次コイルプラスミドＤＮＡを上清中に保持しながら、細胞細片（例えば、不溶性の、ゲノム又は染色体宿主細胞ＤＮＡ、細胞膜及び修飾された固体）を凝集することによって清澄化するために前記微生物細胞可溶化液をさらに調製する新規溶解手法に相当する。この溶解手法は、Ｌｅｅ及びＳａｇａｒに付与された米国特許第６，１９７，５５３号に記載されており、リゾチーム溶解後に急速な加熱及び冷却を含む大規模なプラスミドＤＮＡの精製のための以前に開示された溶解プロセスの濃縮を２回行うことが可能である。従って、本発明の新規溶解／可溶化液清澄化プロセスは、プロセス容積の大幅な減少を可能とする。さらに、本明細書に記載されている新規溶解プロセスは、より以前に開示された溶解技術に比べて、より単純な手法である。例えば、米国特許第６，１９７，５３３号の熱溶解手法に必要とされる２つの巨大なタンクと比べて、１つのタンク中で実施できるので、大幅な資本コストが節約され、複雑な直列の熱交換機ではなく、成分の混合と添加のみを必要とする。さらに、本発明の新規溶解及び凝集手法は、凝集された細胞細片の沈降及びプラスミドＤＮＡ含有上清のデカント及び遠心など（これらに限定されない。）、細胞細片が容易に除去されるフィードを生成する。プラスミドＤＮＡ含有上清が形成されるにつれて、これを連続的に除去するバッチ又は連続的遠心の何れも使用することが可能である。（宿主細胞細片の凝集を介した）本発明の新規溶解及び可溶化液清澄化技術の後には、（ｉ）陽イオン性界面活性剤（好ましくは、ＣＴＡＢ）を用いた、清澄化された可溶化液からのプラスミドＤＮＡの沈殿、（ｉｉ）塩溶液によるプラスミドの溶解、及び（ｉｉｉ）水和されたケイ酸カルシウム上への残留不純物の吸着を含む（但し、これらに限定されない。）下流精製プロセスが続くことが可能である。好ましい下流工程は、ＰＥＧ又はアルコールの何れかによって誘導された沈殿後の精密ろ過分離による高次コイルプラスミドＤＮＡの濃縮及び仕上げである（下記参照）。従って、本発明の別の実施形態は、本明細書に新規に開示されている新規２工程溶解／可溶化液清澄化プロセス以外のさらなる精製工程に依拠する。本発明の一部として含まれるプロセス工程の組み合わせには、例えば、以下のもの：（ｉ）リゾチームの存在下又は不存在下、好ましくはリゾチームの存在下での細胞溶解、（ｉｉ）ＰＥＧによって誘導された凝集などの（但し、これに限定されない。）細胞細片の凝集を介した可溶化液清澄化、（ｉｉｉ）ＣＴＡＢなどの界面活性剤を用いたプラスミドＤＮＡの単回又は段階的沈殿、（ｉｖ）塩溶液によるプラスミドの選択的溶解、（ｖ）ｈｃＣａＳｉＯ_３上への単回又は段階的吸着による残留不純物の除去、及び（ｖｉ）濃縮された製剤溶液を容易にそこから調製することができる安定なバルク産物を与える、精製されたプラスミドＤＮＡの、ＰＥＧ又はアルコール（例えば、エタノール性）によって誘導された沈殿が含まれ得る。
【００４８】
本発明の一実施形態において、本明細書に記載されている方法は、細菌細胞、植物細胞、酵母及びバキュロウイルスを含む（但し、これらに限定されない。）微生物細胞（Ｅ．コリ）が好ましい微生物宿主である。）からの臨床等級プラスミドＤＮＡの精製を可能とする。従って、Ｅ．コリ発酵以外の微生物発酵が本発明における使用に適していることが、当業者に自明である。さらに、本発明の方法は、専ら微生物細胞から臨床等級プラスミドＤＮＡを精製することに限定されるものではなく、従って、哺乳動物細胞を含む他の細胞種から前記プラスミドＤＮＡを精製することを含み、適切な細胞密度が達成されると推測される。従って、哺乳動物培養系中で、又は微生物発酵から増幅された臨床等級プラスミドＤＮＡの精製が、本発明の一部として想定される。異なる宿主細胞種の特異性に対して調整するために、本発明の細部を改変し、及び最適化することは、当業者の能力の範疇に属する。例えば、選択された宿主細胞に応じて、可溶化液凝集のための準備的工程として、アルカリｐＨシフト及びその後の中和に、増幅されたプラスミドＤＮＡを含有する当初細胞可溶化液を供することは不要であり得る。リゾチーム温置のみ、及び／又は熱溶解と組み合わせたリゾチーム温置は、凝集し易い細胞可溶化液を効果的に調製するのに十分であり得る。当業者であれば、細菌細胞からの精製について本明細書に詳しく開示されている採集及び溶解／可溶化液清澄化プロセスを、哺乳動物細胞からの精製に容易に適合させることが可能である。例えば、前記当業者は、細菌細胞の溶解を補助するのに有効なリゾチームの添加が、哺乳動物細胞の溶解には必要でないことに気付く。代わりに、本明細書に記載されているアルカリｐＨシフトは、完全な哺乳動物細胞の溶解をもたらし得る。同様に、酵母細胞からのプラスミドＤＮＡの精製は、リゾチームを酵母溶解酵素（例えば、リトカーゼ）に置換することによって有利となる可能性があるが、本明細書に開示されているアルカリｐＨシフトが好ましく、酵母溶解酵素は不要であり得る。従って、当業者は、本明細書の開示及び詳細な実施例を用いて、本発明の一部として記載されている方法を容易に改変することが可能であり、プラスミドＤＮＡを増幅するために選択された宿主細胞がどのような種類であれ、これを適用できる。従って、本願は、大規模な「微生物発酵」からのプラスミドＤＮＡの精製に焦点を絞って書かれているが、この用語は、本発明を微生物発酵に限定するものではない。従って、本明細書を通じて、「微生物発酵」という用語は、宿主細胞増殖又は増幅プロセスのあらゆる種類に対するものとして読み替えることができる。
【００４９】
本明細書に開示されている方法によって単離及び精製されるべきプラスミドは、実質的にあらゆるサイズのあらゆる染色体外ＤＮＡ分子（例えば、高コピー数又は低コピー数／細胞）であり得る。従って、宿主細胞（好ましくは、微生物宿主細胞）中で増幅できる実質的にあらゆるプラスミドを、本発明の方法によって単離することができることが当業者に自明である。本明細書に記載されている方法によって精製された臨床等級プラスミドＤＮＡは、ワクチンとして又は遺伝子治療ビヒクルとして、ヒトに投与するのに極めて有用である。
【００５０】
詳しく上述されているように、（微生物細胞細片の凝集を介した）本発明の新規溶解／可溶化液清澄化プロセスについて提案されている使用は、例えば、ポリヌクレオチドワクチン又は遺伝子治療ベクターとして使用するための大規模微生物発酵から臨床等級プラスミドＤＮＡを精製することである。さらに、本発明は、本明細書に記載されている新規溶解／可溶化液清澄化プロセスを含む、高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する清澄化された宿主細胞可溶化液を生成する方法に関する。重要なことには、本明細書に記載されている新規溶解／可溶化液清澄化技術は、タンパク質、モノクローナル抗体、融合タンパク質、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質及び多糖など（但し、これらに限定されない。）、あらゆる組換え生物分子の微生物宿主からの精製に拡張することが可能である。従って、（ｉ）宿主細胞可溶化液の生成、（ｉｉ）場合によって行われる、塩基性ｐＨシフト及びその後の中和工程、並びに（ｉｉｉ）宿主細胞細片の凝集による前記細胞可溶化液の清澄化を包含する、本明細書に記載されている溶解／可溶化液清澄化プロセスは、例えば、Ｅ．コリ、他の細菌宿主、他の微生物宿主（例えば、酵母）又は哺乳動物細胞を用いた、あらゆる組換え生物分子の産生に拡張され得る。特定の宿主細胞種及び精製されるべき特定の生成物生物分子の両方の特異性に対して調整するために、（凝集を介した）本発明の溶解／可溶化液清澄化プロセスを改変することは、当業者の能力の範疇に属する。例えば、プラスミドＤＮＡ以外の生物分子の精製のために本発明に開示されているものに関連する効率的及び効果的な溶解／可溶化液清澄化プロセスを設計する場合、最大のｐＨ安定性に加えて、本明細書に記載されているアルカリｐＨシフト／中和工程の間に上昇したｐＨ条件に曝露される時間を考慮する必要がある。アルカリｐＨシフトを含む本明細書に記載されている上流精製工程は、上昇したｐＨへの短期間の曝露に対して、精製されるべき生物分子が耐えることができる限り、及びポリエチレングリコールの低レベルによって沈殿されない限り、魅力的な精製工程である。さらに、ＤＮＡが夾雑物であると考えられるプロセス（例えば、タンパク質精製プロセス）において、ＰＥＧ濃度は、凝集された細胞細片とともにＤＮＡを沈殿させるためにＰＥＧ濃度を上昇させることが可能である。
【００５１】
本発明の大規模な微生物発酵は、選択された微生物細胞の増殖にとって適切であるいずれかの液体培地中で培養され得る。同じく、本発明は、哺乳動物細胞の増殖に適した全ての培地を使用することが可能である大規模な哺乳動物細胞培養からプラスミドＤＮＡを精製する方法を提供するために容易に適合させることが可能である。開示されている方法は、より小さな発酵又は培養容量に対して適用可能であるが、本発明の特に有用な態様は、大規模な細胞発酵又は培養への拡張可能性である。本明細書において使用される「大規模」という用語は、約５リットルを超える総細胞発酵容量又は約５リットルを超える発酵容量から採集された細胞であると考えられる。本発明の大規模な発酵法は、約３００〜２０００リットルの発酵に相当する（但し、これらに限定されない。）臨床サイズロットに適用可能である。本発明の一部として記載されている上流精製プロセスの場合、目的の高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する宿主細胞は、まず、細胞ペースト又はスラリーを提供するために、培地から採集される。採集工程の最終目標は、精製において使用するための細胞を濃縮及び洗浄することである。遠心又は精密ろ過など（但し、これらに限定されない。）、液体培地から細胞を採集する全ての慣用的手段が適切である。例えば、採集工程は、（ｉ）５００ｋＤａの見かけの分子量のＡ／ＧＴｅｃｈ膜を横切る接線流ろ過を用いて細胞を濃縮すること、及び（ｉｉ）滅菌された生理的食塩水を用いて、濃縮された細胞を透析ろ過することを含むろ過プロセスからなり得る。このようなろ過プロセス中の重要なパラメータには、膜間圧力、入口圧力、クロスフロー速度、濃度因子及び流量が含まれる。さらに、細胞は、連続的遠心を用いて採集され得る。細菌細胞に対する採集手法の詳しい記載については、以下の実施例の部９を参照されたい。
【００５２】
本発明は、さらに、大規模発酵体制から臨床等級プラスミドＤＮＡを単離するための新規下流精製プロセスに関し、粉末化されたプラスミドＤＮＡ産物をもたらす最終濃縮／仕上げ工程に相当する。プラスミドＤＮＡ精製体制に関する場合のように、本明細書において使用される下流精製プロセスとは、上流精製プロセスの結果（例えば、本発明の一部として記載されている上流精製プロセスの凝集工程後）、当初の宿主細胞可溶化液が清澄化された後に起こる精製プロセスを表す。目的のプラスミドＤＮＡは、前記上流精製プロセス後に、清澄化された可溶化液中に残存する。本発明の最終濃縮／仕上げ工程は、上流プロセス及び先行する下流プロセスの両方の結果として、高次コイルプラスミドＤＮＡが濃縮された細胞可溶化液から残留不純物を除去するために使用される下流精製技術を表す。前記残留不純物には、宿主細胞ゲノムＤＮＡ、先行する精製プロセス後に残存する細胞タンパク質又は先行する精製工程の結果として存在するプロセス成分（例えば、プラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させるために使用される界面活性剤）が含まれ得る。本発明の一部として記載される新規下流精製工程は、高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮し、及びより実行可能な緩衝液容量中への再懸濁を可能としながら、残留不純物から最終的に高次コイルプラスミドＤＮＡを精製するためのより初期の工程のあらゆる様々な組み合わせとともに使用され得る。従って、本明細書に記載及び例示されているように、本発明の新規下流精製工程は、米国特許出願０９／８７５，３７９号（上記）に開示されている精製方法及び本発明の一部として開示された新規上流精製プロセスを含む（但し、これに限定されない。）さらなる精製プロセスを伴う。臨床等級プラスミドＤＮＡの回収をもたらす拡張可能な総合的精製プロセスを設計する場合に、最終濃縮／仕上げ精製技術に相当する、本明細書に記載されている新規下流精製工程を含めることは、本発明の範囲に属する。プラスミドＤＮＡ及び必要とされるプラスミドＤＮＡの品質の特定のロットに対して必要とされる精製スキームを適切に改変することは、当業者の裁量に属する。
【００５３】
従って、本発明の一実施形態は、下流濃縮／仕上げ工程を包含し、前記下流精製工程は、（ａ）前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、及び（ｂ）接線流ろ過モード（「ＴＦＦ」）下での精密ろ過（「ＭＦ」）によって、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮することを含む大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。プラスミドＤＮＡ精製体制の最終仕上げ工程の一部としてプラスミドＤＮＡを濃縮するために、限外ろ過（「ＵＦ」）ではなく、ＭＦを用いた沈殿を使用することは、数多くの理由のために好ましい。まず、溶液相プラスミドＤＮＡは、工場生産量を精製するために限外ろ過法を大規模化した場合に、剪断損傷を受け易い。さらに、溶液粘度は、精密ろ過条件下で低下するので、増加した濃度でより管理可能であり、及びフィルター面積を減少させる物質を与える。これにより、透析ろ過緩衝液に対して必要な容量を大幅に低下させることもできる。上記（ａ）において沈殿させるべき高次コイルプラスミドＤＮＡは、先行する上流及び下流プロセスの結果として、細胞可溶化液が濃縮されており、従って、本発明の濃縮／仕上げ精製技術は、全プラスミド精製体制における最後のプロセスの１つとなっている。例えば、本発明の一実施形態において、高次コイルプラスミドＤＮＡは、以下の工程：（ｉ）リゾチームの存在下又は不存在下での、好ましくはリゾチームの存在下での細胞溶解、（ｉｉ）本明細書に記載されているポリマー（例えば、ＰＥＧ）による細胞細片の凝集など（但し、これに限定されない。）可溶化液の清澄化、（ｉｉｉ）陽イオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）など、界面活性剤による、プラスミドＤＮＡの単回又は段階的沈殿、（ｉｖ）塩溶液を用いた、プラスミドＤＮＡの選択的溶解、（ｖ）ｈｃＣａＳｉＯ_３上への単回又は段階的な吸着による残留不純物の除去、及び（ｖｉ）接線流ろ過モード下での前記沈殿されたプラスミドの沈殿及び精密ろ過を介したプラスミドＤＮＡの濃縮を含む（但し、これらに限定されない。）プロセスによって、大規模微生物発酵の細胞可溶化液から精製される。このリストのうち、本発明の最終濃縮／仕上げ工程は、単位操作（ｖｉ）に相当する。上に列記されているさらなる精製プロセスは、当業者に公知であるか、又は、例えば、本願及び／又は米国特許出願０９／８７５，３７９号（上記）（参照により、本明細書に組み込まれる。）中に詳しく記載されている。
【００５４】
本発明の最終下流濃縮／仕上げ精製工程を実行する前に、先行する上流及び下流精製プロセスの結果、高次コイルプラスミドＤＮＡは宿主細胞可溶化液中に濃縮されている。例えば、本発明の前記最終濃縮／仕上げ精製工程は、米国特許出願０９／８７５，３７９号（上記）に例示されている複数プロセスのプラスミドＤＮＡ精製方式内に組み込むことが可能であり、粉末化された形態の臨床等級プラスミドＤＮＡの大量をもたらし、これは、所望であれば、選択した液体製剤中に再懸濁することが可能である。一例として、（例えば、本発明の一部として記載されている新規上流精製プロセスを含む（但し、これらに限定されない。）上流精製プロセスによって）微生物宿主細胞可溶化液の清澄化後、前記清澄化された可溶化液からプラスミドＤＮＡを沈殿させるために、陽イオン性界面活性剤（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド又はクロリド（ＣＴＡＢ））を使用し得る。プラスミドＤＮＡの選択的沈殿のためにはＣＴＡＢが好ましいが、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド又はクロリド（ＴＴＡ）、アルキルトリメチルアンモニウムクロリド、アルキルアリールトリメチルアンモニムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド又はクロリド、ドデシルジメチル−２−フェノキシエチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルアミン：クロリド又はブロミド塩、ドデシルアミン又はクロリド塩及びセチルジメチルエチルアンモニウムブロミド又はクロリドを含む（但し、これらに限定されない。）その他のモノアルキルトリメチルアミノ塩を使用し得る。さらに、プラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させるために、モノアルキルジメチルベンジルアンモニウム塩（例には、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド及びベンゾエトニウムクロリド（ＢＴＣ）が含まれる。）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩（市販の製品には、ドミフェンブロミド（ＤＢ）、ジデシルジメチルアンモニウムハロゲン化物及びオクチルドデシルジメチルアンモニウムクロリド又はブロミドが含まれる。）、ヘテロ芳香族アンモニウム塩（市販の製品には、セチルピリジニウムハロゲン化物（ＣＰＣ又は臭化物塩及びヘキサデシルピリジニウムブロミド又はクロリド）が含まれる。）、シス異性体１−［３−クロロアリル］−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタン、アルキル−イソキノリニウムブロミド、及びアルキルジメチルナフチルメチルアンモニウムクロリド（ＢＴＣＨ１１０）、多置換された四級アンモニウム塩（市販の製品には、アルキルジメチルベンジルアンモニウムサッカリナート及びアルキルジメチルエチルベンジルアンモニウムシクロヘキシルスルファマート）、ビス四級アンモニウム塩（製品例には、１，１０−ビス（２−メチル−４−アミノキノリニウムクロリド）−デカン、１，６−ビス［１−メチル−３−（２，２，６−トリメチルシクロヘキシル）−プロピルジメチルアンモニウムクロリド］ヘキサン又はトリクロロビソニウムクロリドＢｕｃｋｍａｎ ＢｒｏｃｈｕｒｅｓによってＣＤＱと称されるビスクアット（ｂｉｓｑｕａｔ）並びにポリマー製四級アンモニウム塩（ポリ［オキシエチレン（ジメチルイミニオ）エチレン（ジメチルイミニオ）エチレンジクロリド］、ポリ［Ｎ−３−ジメチルアンモニオ］プロピル］Ｎ−［３−エチレンオキシエチレンジメチルアンモニオ）プロピル］尿素ジクロリド及びα−４−［１−トリス（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムクロリド］などのポリイオネンを含む。）などの、別の四級アンモニウム化合物を使用することが可能である。
【００５５】
単回又は段階的様式の何れかで、凝集され及び／又は清澄化された宿主細胞可溶化液からプラスミドＤＮＡを沈殿させるために、ＣＴＡＢを含む（但し、これに限定されない。）陽イオン性界面活性剤を使用することが可能であり、その例は、米国特許出願０９／８７５，３７９号（上記）中に開示されている。段階的な沈殿プロセスには、低カット及び高カット沈殿工程が含まれる。細胞細片及び非高次コイルプラスミドＤＮＡを細胞可溶化液から沈殿させるのを助けるために低カット沈殿工程を使用することが可能であり、目的の高次コイルプラスミドＤＮＡは上清中に残存する。本発明の一実施形態において、前記細胞可溶化液は、凝集されるが、凝集された物質を未だ除去しなくてもよく、又は既に清澄化されていてもよい（すなわち、例えば、凝集された物質の遠心を介した後凝集及び可溶化液の清澄）。この低カット沈殿の後には、高カット沈殿工程が続くことが可能であり、これにより、目的の高次コイルプラスミドＤＮＡは、タンパク質、ＲＮＡ及びエンドトキシンなどの可溶性不純物から沈殿除去される。米国特許出願０９／８７５，３７９号（上記）に詳述されているように、陽イオン性界面活性剤ＣＴＡＢの段階的添加は、ＳＴＥＴ緩衝液中の清澄化された可溶化液に２％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ溶液を供給すること、約０．２５％〜約０．３５％（ｗ／ｖ）のＣＴＡＢ、より好ましくは、約０．１％から０．２％（ｗ／ｖ）のＣＴＡＢからＣＴＡＢによって誘導された第一の沈殿を生成した後、約０．４０％〜約０．６０％からＣＴＡＢによって誘導された第二の沈殿を生成することを含むことができ、前記範囲は、標準的なＳＴＥＴ溶解緩衝液（例えば、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約ｐＨ７．０−９．０、約５０−１００ｍＭのＥＤＴＡ、約８％のスクロース及び約２％のＴｒｉｔｏｎ^（Ｒ）−Ｘ−１００）と同時に使用するのが最良である。様々な緩衝液系の何れかの特性に対して調整するために沈殿範囲を変化させることは当業者の能力の範疇に属する。従って、本発明の一実施形態において、低カット界面活性剤沈殿工程は、凝集後に細胞可溶化液を含有するＤＮＡ−プラスミドから残留タンパク質及びエンドトキシンをさらに除去するために使用される（実施例１、下記参照。）。より具体的には、ホットスポットろ過を防ぐために、約１時間にわたって、約０．１５％の最終濃度まで、４０ｍＭのＮａＣｌ中の２％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢを細胞可溶化液に添加することが可能である。この低カット界面活性剤沈殿工程が、凝集された可溶化液に対して、前記可溶化液の清澄化前に（すなわち、凝集された細胞細片の除去前に）行われる場合には、前記可溶化液は、続いて、遠心法のみによって、又は仕上げろ過工程と組み合わせた遠心法によって清澄化することが可能である。本発明のさらなる実施形態において、単回の高カット界面活性剤沈殿工程は、全下流プラスミドＤＮＡ精製プロセスにおける第一の工程として（すなわち、可溶化液清澄化後に）使用することが可能である。従って、一実施形態において、約０．４０％と約０．６０％の間の最終濃度まで、本発明の新規上流精製プロセスによって作成された、凝集された及び／又は清澄化された可溶化液にＣＴＡＢが添加され、前記範囲は、上記標準的なＳＴＥＴ溶解緩衝液とともに使用すると最良である。同じく、様々な緩衝液系の何れかの特性に対して調整するために前記沈殿範囲を変化させることは当業者の能力の範疇に属する。従って、（例えば、単独で、又は仕上げろ過と組み合わせた、沈降／デカント又は遠心方法によって）宿主細胞細片浮遊塊を除去する前又は除去する後に、何れかの残留タンパク質及びエンドトキシン（低カット工程）及び／又は高次コイルプラスミドＤＮＡ（高カット工程）が沈殿されるような最終濃度まで、細胞可溶化液に２％（ｗ／ｖ）界面活性剤溶液を供給することによって、陽イオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）を添加することが可能であり、ここで、両界面活性剤沈殿工程は、プラスミドＤＮＡを不純物からさらに分離させる機能を果たす。（米国特許出願０９／８７５，３７９号、上記に記載されているような）その後の塩溶解のために、（高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する）フィルターケーキ沈殿物を生じさせるために、単回又は段階的な陽イオンベースの界面活性剤工程には、ろ過工程を伴う。（高次コイルされたプラスミドＤＮＡを含む）回収されたフィルターケーキの塩溶解は、最適なイオン強度及び組成の緩衝溶液中で行われる。様々な塩の増分で、溶液中の高次コイルプラスミドの濃度を測定することによって、又は、間接的に、溶液粘度を測定することによって濃度が測定される。
【００５６】
本発明の一部として記載されている新規濃縮／仕上げ工程を介して、そこから高次コイルプラスミドＤＮＡが精製される、プラスミドＤＮＡが濃縮された細胞可溶化液の生成を補助するために使用され得る別の先行する下流精製技術は、合成の水和されたケイ酸カルシウムＬＲＡ^ＴＭ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｎｅｒａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｍｐｏｃ，ＣＡ ９３４３８）など、水和され、結晶化されたケイ酸カルシウム（ｈｃＣａＳｉＯ_３）上に、単回又は段階的な様式で、残存不純物を吸着させることである。米国特許出願０９／８７５，３７９（上記）中に詳しく記載されているように、微生物宿主細胞可溶化液へのｈｃＣａＳｉＯ_３の添加により、高次コイルプラスミドＤＮＡから離れて残留不純物が吸着される。水和されたケイ酸カルシウムは、様々な不純物（界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ、Ｔｒｉｔｏｎ^（Ｒ））、エンドトキシン、ゲノムＤＮＡ、プラスミド分解物、タンパク質及びＲＮＡを含むが、これらに限定されない。）に結合する。添加に必要とされるｈｃＣａＳｉＯ_３の正確な量は、（ｉ）存在する不純物の量、（ｉｉ）緩衝液の状態（例えば、塩濃度）、（ｉｉｉ）溶液中の総ＤＮＡの量、（ｉｖ）溶液の容量によって支配され、並びに、おそらくは（ｖ）精製プロセスを通じて使用される塩の温度及び種類を含む他の変数によって支配される。従って、具体的な精製操作中に添加されるべきｈｃＣａＳｉＯ_３の量は変動し得ることが明白である。添加されるべきｈｃＣａＳｉＯ_３の量は、上述の条件に応じて、及び特定の操作に対して利用可能なｈｃＣａＳｉＯ_３のロットに応じて生じ得る差に応じて、最大約２００ｇのｈｃＣａＳｉＯ_３／総ＤＮＡのグラムの範囲にある。実施例の部８は、約８から約２００グラムのｈｃＣａＳｉＯ_３／総ＤＮＡのグラムの範囲についての指針を与える。典型的なプラスミドＤＮＡ精製操作の間、添加されたｈｃＣａＳｉＯ_３の好ましい範囲は、約１２５から２００グラムのｈｃＣａＳｉＯ_３／総ＤＮＡのグラム、より好ましくは、約３０と約７０グラムのｈｃＣａＳｉＯ_３／総ＤＮＡのグラムである。本発明者らは、典型的なプラスミド精製操作には、約３０−７０ｇのｈｃＣａＳｉＯ_３／総ＤＮＡのグラムが必要であることを見出した。但し、この場合にも、ｈｃＣａＳｉＯ_３吸着条件は、上で説明された条件に関して、上方向又は下方向に規模を変動させることができ、従って、２００グラムのｈｃＣａＳｉＯ_３／総ＤＮＡグラムまで、前記範囲の高い方の末端でｈｃＣａＳｉＯ_３を添加する必要がある可能性がある。例えば、ＮａＣｌのより高い濃度は、ＤＮＡ及びその他の不純物に対するＬＲＡ^ＴＭの能力を増加させる。従って、幾つかの例では、より高い塩濃度を検討することが有用であり、これは、必要とされるｈｃＣａＳｉＯ_３の量を減少させるはずである。有用な塩濃度は、例えば、最大約５ＭのＮａＣｌのＮａＣｌを用いた範囲であり得ると予測される。上述のように、ｈｃＣａＳｉＯ_３上への不純物の吸着は、単回又は段階的な様式で起こり得る。本明細書の実施例８に記載されているように、第一の吸着工程が、界面活性剤によって誘導された沈殿されたプラスミドＤＮＡの塩溶解と組み合わされる段階的ＬＲＡ吸着プロセスは、より頑強な再溶解をもたらす。次いで、（ａ）再懸濁中のケイ酸カルシウムの量を最小化するために、及び（ｂ）残留宿主細胞ゲノム、開環プラスミド及び直鎖プラスミドＤＮＡを低下させるための最初の仕上げ工程として作用するために、第二段階のケイ酸カルシウムバッチ吸着が使用される。
【００５７】
先行する様々な上流及び下流両精製技術の結果として高次コイルプラスミドＤＮＡが濃縮された細胞可溶化液を生成すると共に、一般に、全プロセスの最終産物精製工程に相当する濃縮及び最終緩衝液交換工程の幾つかの種類が実施される。この最終濃縮／仕上げ工程によって、実質的に全ての残留不純物がプラスミドＤＮＡ含有溶液から除去され、前記プラスミドＤＮＡを、生理的に許容される緩衝液中に所望の産物濃度に濃縮することが確保される。本発明は、接線流ろ過モードでの精密ろ過と組み合わせて、ＤＮＡ沈殿剤（例えば、ポリエチレングリコール、アルコール、ＰＥＩ、ポリアミン、陽イオン性界面活性剤、込み合ったポリマー（ｃｒｏｗｄｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ）、三重螺旋剤（ｔｒｉｐｌｅｘ ａｇｅｎｔ）及びその他の有機剤）を用いる周知の方法によるプラスミドＤＮＡの沈殿を含む新規最終濃縮／仕上げ工程の開示に関する。本明細書に記載されている新規濃縮／仕上げ工程の最終目標は、粉末製剤をもたらすプラスミドＤＮＡの精製である。しかしながら、前記粉末化された産物が所望の液体中に再懸濁される場合には、液体製剤も実現することができる。本発明のこの部分は、大規模なプラスミドＤＮＡ精製体制をしばしば悩ませるスケールアップの問題を解決する。例えば、精密ろ過濃縮と組み合わせた、ＰＥＧ又はアルコールの何れかによるプラスミドＤＮＡ沈殿を使用することにより、プラスミドＤＮＡ精製プロセスのための最終緩衝液交換／濃縮手法において一般的に使用される最終限外ろ過手法を直接置き換えることが可能である。限外ろ過は、しばしば、高い再循環速度と大きな膜面積を必要とし、夾雑物の排除を最小にする。以前の出願である米国特許出願０９／８７５，３７９（上記）に開示されているバッチアルコール沈殿ベースのバッチプロセスは、これらの限界を回避し、必要な膜面積と再循環速度を劇的に減少させ、粉末化されたＤＮＡを作製して大量貯蔵の必要性を最小化する。しかしながら、バッチアルコール沈殿は、大きな溶媒比と過剰な溶媒廃棄物の廃棄を必要とし、大規模な溶媒沈殿に対しては非実用的である。精密ろ過をベースとした本発明のプロセスは、別の液体大量限外ろ過アプローチに必要とされる膜面積を大幅に減少させ、アルコール沈殿とともに使用されると、連続的な溶媒回収系が、アルコール沈殿された産物のバッチ型ろ過にしばしば伴う困難を回避する。
【００５８】
従って、本発明は、（ａ）前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、及び（ｂ）接線流ろ過モード下での精密ろ過によって、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。本発明の一実施形態において、前記高次コイルプラスミドＤＮＡは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びアルコール（エタノール、メタノール及びイソプロパノールを含むが、これらに限定されない。）からなる群から選択される沈殿剤を用いて、工程（ａ）において沈殿される。工程（ａ）において高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させるために使用され得るさらなるＤＮＡ沈殿剤には、ＰＥＩ、ポリアミン、陽イオン性界面活性剤、込み合ったポリマー、三重螺旋剤及びその他の有機溶媒が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
従って、本発明は、（ａ）ポリエチレングリコールで前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、及び（ｂ）接線流ろ過モード下での精密ろ過によって、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。ＰＥＧによるプラスミドＤＮＡの沈殿は急速且つ穏やかであり、ＤＮＡに対してほとんど損傷を引き起こさない（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ，Ｇ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．３８３：４５７−４６３）。本明細書において先述されているように、プラスミドＤＮＡのＰＥＧ沈殿は、ＤＮＡ溶液中のポリマーの濃度に高度に依存する（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ｅｔ ａｌ．，１９７５、上記参照）。１０％の最終濃度になるように、清澄化された細胞質抽出物にＰＥＧを添加することは、前記抽出物内に含有された全てのプラスミドＤＮＡを沈殿させ、幾つかのＲＮＡ及び多くのタンパク質を溶液中に残存させることが示された（Ｐｕｌｌｅｙｂｌａｎｋ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｏｌｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１９１−１９５）。Ｌｉｓ及びＳｃｈｌｉｅｆ（１９７５、上記）は、ＰＥＧを用いて、異なる分子量のＤＮＡ分子を分離できることを示した。より高い分子量のＤＮＡがより低いＰＥＧ濃度で優先的に沈殿することを決定した後、彼らは、様々なＰＥＧ濃度を用いて前記分子を沈殿させることを基礎とした、プラスミドＤＮＡ分子用のサイズ分画法を開発した。ＰＥＧは、伸長されたコイル状態からコンパクトな球状状態へのＤＮＡ分子の凝集を促進し（Ｍｉｎａｇａｗａ， Ｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３４：５５５−５５８）、ここにおいて、前記ＤＮＡ分子は、一次相転移を行う （Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：９２９−９３０）。ＰＥＧの低濃度において、ＤＮＡ分子は伸長されたコイルとして留まるが、高い濃度では、ＤＮＡ分子は小さな球状高次構造へと収縮する。いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、ＰＥＧがプラスミド含有溶液に添加されるにつれて、ＰＥＧは、ＤＮＡとではなく、水分子と相互作用するように、ＰＥＧは体積排除によってＤＮＡを沈殿させるものと考えられる。ＤＮＡは、その負の表面電荷の故に、ＰＥＧとは相互作用しない。より多くのＰＥＧが添加されるにつれて、この排除効果は、局所ＤＮＡ濃度が最終的に溶解度の限界を超えるまで、より多くのＤＮＡを小さなポケット中に無理に詰め込む。本明細書の実施例に示されているように、完全な沈殿に必要とされるＰＥＧの濃度は、主に、塩濃度、ＰＥＧ分子量、産物の不純度及びプラスミドサイズの関数である。
【００６０】
上述のように、プラスミドＤＮＡの、ＰＥＧによって誘導された沈殿の機序は、プラスミドＤＮＡ含有溶液中のＰＥＧ沈殿剤の濃度及び分子量の両方に大きく依存する。下記の実施例の部に記載されているように、４００から１０，０００ＤａまでのＰＥＧ分子量が、溶液からプラスミドＤＮＡを沈殿させる能力について調べた（図７Ｂ）。前記研究は、ＤＮＡが１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４００中で完全に可溶性であるが、ＰＥＧの分子量が増加するにつれて、ＤＮＡを沈殿させるのに必要なＰＥＧの臨界質量が減少することを示している。従って、本明細書に例示されている精製プロセスは、本発明のこの本部分についての沈殿剤として、ＰＥＧ６０００又はＰＥＧ８０００の何れかを使用するが、当業者であれば、プラスミドＤＮＡを効果的に沈殿させるために、実質的にあらゆる分子量のＰＥＧ、特に、約３，０００〜約２０，０００のＰＥＧ分子量範囲の間で使用することが可能なことを理解する。しかしながら、本明細書に記載されている最終濃縮／仕上げ技術の一部として、高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させる具体的な分子量のＰＥＧを選択する場合、前記ＰＥＧ分子量を補完するためにＰＥＧ濃度を調整しなければならない。特に本願の教示に照らして、この決定を行うことは当業者の能力の範疇に属する。例えば、ＬＲＡ後のろ液からプラスミドＤＮＡを完全に沈殿させるためのＰＥＧ８０００の適切な濃度を決定することは、本明細書に示されている（実施例の部３）。０．３と１．０ｍｇ／ｍＬの間のＤＮＡ濃度は大規模な精製手法において遭遇する可能性があるので、この０．３と１．０ｍｇ／ｍＬの間でＤＮＡ濃度を変動させて、異なる温度及び総ＤＮＡ濃度の下でこの試験を行った。ＰＥＧ濃度が約２％（ｗ／ｖ）を上回ると、ＰＥＧ８０００の溶液中でＤＮＡ溶解度の急減が認められた（図７Ａ参照）。しかしながら、調べた範囲については、溶液温度又はＤＮＡ濃度によるＤＮＡ溶解度に対する影響は存在しなかった。図７Ａ中の結果は、検査した濃度範囲内のＤＮＡが約４％のＰＥＧ８０００によって完全に沈殿されることを示しているのに対して、実施例の部３に記載されている研究の残りでは８％のＰＥＧ８０００濃度が選択され、２倍の安全係数を与えた。あるいは、実施例８に例示されている精製プロセスは、プラスミドＤＮＡを沈殿させるために１０％のＰＥＧ６０００溶液を使用する。図５に示されている濃度範囲は、プラスミドＤＮＡが、少なくとも８％のＰＥＧ６０００溶液中に完全に沈殿されることを示している。従って、本発明の一実施形態において、本発明の新規下流濃縮／仕上げプロセスにおける第一の工程として、濃縮されたＰＥＧ６０００溶液（例えば、５０％ｗ／ｖ）は、（例えば、ＣＴＡＢによって誘導されるプラスミドＤＮＡの選択的沈殿及び水和されたケイ酸カルシウム上への不純物の吸着など（但し、これらに限定されない）の先行する精製プロセスの結果）、１０％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで高次コイルプラスミドＤＮＡが濃縮された細胞可溶化液に供給される。ＤＮＡ沈殿を確実に完結させるために、プラスミドＤＮＡ含有細胞可溶化液をＰＥＧとともに温置する時間を評価することも重要である。ＰＥＧ添加後の保持時間がＤＮＡ沈殿を完結させるのに十分であることを確保するために、ＰＥＧ沈殿の速度論を調べることが可能である。下記の実施例の部（実施例３）に開示されている研究において、ＰＥＧとの約５分の温置期間後にＤＮＡの９９％超が沈殿し（図８参照）、例えば、本明細書に例示されている精製プロセスに使用されているように、２時間の保持時間が十分すぎることを示している。
【００６１】
下記の実施例の部に詳述されているように、米国特許出願０９／８７５，３７９（上記）に開示されている従来のＤＮＡ精製プロセスは、濃縮されたプラスミドＤＮＡを含有するＥ．コリ細胞可溶化液（例えば、ＬＲＡ後のろ液などの、ケイ酸カルシウム後のろ液）からプラスミドＤＮＡを精製するための最終仕上げプロセスの一部として、膜限外ろ過／濃縮工程を使用した。この後に、調合緩衝液ＰＢＳ中への緩衝液交換のために１０倍の透析ろ過を行った（図６Ａ参照）。この最終仕上げ工程は、約１００Ｌ又はこれ以下の容量で満足できるが、これより大きな製造規模の精製プロセスは、ポンプサイズ及び流速が技術の限界に達し始めることを示した。従って、プロセスのスケールアップという問題の多い課題を回避するために、本発明は、プラスミドＤＮＡ精製方式において一般的に用いられる最終仕上げ技術（例えば、第一の限外ろ過、濃縮工程後の透析ろ過、緩衝液交換工程）を、ＰＥＧ沈殿工程後に行われる、接線流ろ過下での精密ろ過を含むＤＮＡ濃縮プロセスを置き換えることに関する（図６Ａを図６Ｂと比較されたい。）。接線流ろ過下での精密ろ過は、段階的ろ過プロセスの一要素に相当し（前記精密ろ過（及びその後の透析ろ過）は、前記プロセスの第一の部分である。）、沈殿されたＤＮＡ溶液から残留ＲＮＡ及び不純物を排除するのに役立つ。第二のろ過工程（及びその後の透析ろ過）は何れも、ＤＮＡをさらに濃縮し、ＰＥＧをエタノールと置換して、微細な粉末化された形態を取得するために最終の湿潤産物を完全な真空下で乾燥できるように、ＤＮＡを脱水する。この最終濃縮／仕上げ技術には、先に開示されたプロセス（図６を参照）の限外ろ過／透析ろ過技術に比べて、より多くの工程を必要とするが、本明細書に記載されているＰＥＧ沈殿プロセスは、産物の品質を損なうことなく、又は極端に大きなポンプ及び流速の使用を必要とすることなく、大きな製造容積により容易に拡張することが可能である。重要なことに、この新しいプロセスは、さらに不純物を低下させる最終精製工程を含むが、先行するプロセスは、濃縮及び緩衝液交換のために使用されるに過ぎなかった。さらに、前記工程が無菌的に実施される限り、上記第二のろ過／透析ろ過工程中にエタノールを添加するために、ＤＮＡ産物が乾燥された後の滅菌ろ過の必要性がなくなっている。重要なことに、粉末化された産物は、液体製剤中に再懸濁することも可能である。従って、本明細書に記載されている新規単位操作の利点は、おそらく２桁又はそれ以上、残留ＲＮＡレベルをさらに低下させること、過剰な流速及び大きなポンプが必要なくなること、サイクル時間が短縮すること、並びに粉末化された産物が生成されることであり、必要な保存スペースが減少し、おそらくは、より安定な産物が得られる。
【００６２】
プラスミドＤＮＡが、一旦、上述のようにＰＥＧにより沈殿されたら、ＰＥＧによって沈殿されたプラスミドＤＮＡスラリーを同時に濃縮する精密ろ過工程を介して、溶液から不純物が排除され、ここにおいて、前記精密ろ過工程は、接線流ろ過モード下で行われる。従って、この精密ろ過プロセスは、浸透液とともに失われた不純物を消費して、沈殿されたプラスミドＤＮＡを保持液中に濃縮する。膜ろ過は、精製体制において広く使用されている分離技術である。膜の種類に応じて、膜ろ過は、精密ろ過又は限外ろ過として分類することが可能である。精密ろ過は、約０．１〜約１０．０ミクロンの間の典型的な膜孔径を用いた、サイズ排除圧力駆動膜プロセスを表す。（１）シングルパス、デッドエンド又はダイレクトフローろ過（「ＤＦＦ」）及び（２）クロスフロー又は接線流ろ過（「ＴＦＦ」）という２つの主要な膜ろ過方法が存在する。ＤＦＦを使用すると、沈殿されたプラスミドＤＮＡスラリーから排除されるべき不純物は、しばしば、沈殿されたプラスミドＤＮＡとともに膜表面に目詰まりした状態になり得ることが見出された。ＴＦＦは、沈殿されたプラスミド溶液を再循環させることによって、この目詰まりの問題を解決し、溶液が、膜の表面まで接線方向に流れるようにする（クロスフローという用語と同義）。液体の掃引作用は、ゲル層の形成及び表面の汚損を最小限に抑えるように作用し、従って、ＴＦＦは、しばしば、ＤＦＦより速く、より効率的である。全ての接線流技術に関連する２つの重要な変数、すなわち、膜間圧力（すなわち、フィルターの孔を通じて不純物を押す力）及びクロスフロー速度（すなわち、膜を横切った可溶化液の流速）が存在する。液体は、フィルターの膜表面を横切って（クロスフロー）、試料フィードから汲み出され、保持液として、試料フィード中に戻される。締め具又はバルブによって保持液チューブに負荷される背圧は、膜孔より小さな不純物を、フィルターを通じて、ろ液（又は浸透液）画分中に誘導する膜間圧を生み出す。クロスフローは、膜の表面上に保持されているより大きな分子を掃引して、保持液としてフィードに戻す。従って、ＴＦＦを効率的に用いるための重要なポイントは、試料の最大容量が、孔の目詰まりを作り出すことなしにろ過できるように、膜間圧及びクロスフロー速度を制御することである。
【００６３】
下記実施例の部は、精密ろ過の間にＴＦＦを使用することは、沈殿されたプラスミドＤＮＡを濃縮し（すなわち、作業容積を低下させる。）、沈殿後に溶液中に残された全ての残留ＲＮＡ及び非産物可溶性物質を洗浄除去するように作用する。開示されている特定の実施例では、米国特許出願０９／８７５，３７９号（上記）に定義されているＬＲＡ後のろ液は、３ＭのＮａＣｌ、１．０ｍｇ／ｍＬの精製されたＤＮＡ及び幾らかの残留ＲＮＡのプラスミド含有溶液である。プラスミドＤＮＡを沈殿させるためにＰＥＧ８０００ＭＷを使用し、最終溶液濃度が約８％（ｗ／ｖ）になるまで、１５分にわたって、約３３％（ｗ／ｖ）の濃縮された溶液として添加した。沈殿を２時間放置した後、０．４５ミクロンの中空ファイバー膜、接線流フィルターを用いて濃縮した。膜上への搭載は、１８０ｇのＤＮＡ／膜面積ｍ^２であった。再循環速度は９Ｌ／ｍ^２／分であり、流量は、２．５Ｌ／ｍ^２／分に調節した。２０倍濃縮が達成されるまで、浸透液を収集した。本発明の一実施形態において、ＴＦＦ下で精密ろ過を用いて、本明細書に記載されているように、ＰＥＧによって沈殿されたＤＮＡが濃縮された後、次いで、ＰＥＧ溶液に対して沈殿を透析ろ過し、ここにおいて、前記透析ろ過緩衝液は、プラスミドＤＮＡが透析ろ過中に沈殿された状態を確実に保つのに十分な濃度のＰＥＧ及び塩を含有する。例えば、透析ろ過緩衝液が、先行する沈殿工程中で使用されたＰＥＧの概ね同じパーセント（例えば、上記例では、及び実施例の部３でさらに記載されているように、８％ｗ／ｖＰＥＧ８０００）及び約１．２ＭのＮａＣｌを含有する場合には、プラスミドＤＮＡは、沈殿された状態を保つ。実験は、約１００と約６００ｍＭのＮａＣｌの間の塩濃度が、５０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液中にＤＮＡを沈殿させ続けるのに好ましいことを示している。従って、以下でさらに記載されている第二のろ過／透析ろ過工程が６００ｍＭ付近のＮａＣｌ限界で稼働するためには、第一の透析ろ過から出る塩濃度は約１．２Ｍであることが好ましい。より高いＮａＣｌ濃度値を使用することが可能であるが、これは、その後のエタノール添加／脱水工程（以下でさらに記載されている。）の間に、残留塩のより大量の沈殿を引き起こし得る。あるいは、より低いＮａＣｌ濃度（例えば、１００ｍＭ）を加えた緩衝液に対して、沈殿されたＤＮＡを透析ろ過することが可能であるが、これらの条件下では、前記緩衝液のＰＥＧ濃度は、低い塩を補うように増加させるべきである。本明細書の実施例に示されているように、プラスミドＤＮＡは、まず、約８％（ｗ／ｖ）の最終溶液濃度のＰＥＧ８０００を用いて沈殿された場合には、上記ＴＦＦ精密ろ過後に、沈殿されたＤＮＡスラリーを透析ろ過するために、約１．２ＭのＮａＣｌを加えた約８％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００溶液が好ましい。ＰＥＧは体積排除によってＤＮＡを沈殿させ、エタノール沈殿を用いた場合のように脱水によって沈殿させるのではないので、ＰＥＧによって沈殿されたプラスミドは、混合によって、より小さな片へと解離され得る柔らかなゲル様沈殿を形成する。
【００６４】
プラスミドＤＮＡが、まず、ＰＥＧで沈殿される、本発明の最終濃縮仕上げ工程の第二のろ過／透析ろ過プロセスは、（ａ）エタノールの添加により、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを部分的に脱水すること、（ｂ）ろ過によって、工程（ａ）の脱水されたプラスミドＤＮＡ沈殿を濃縮すること、及び（ｃ）１００％エタノールに対して、沈殿されたプラスミドＤＮＡを透析ろ過することを含む。ＰＥＧによって沈殿され、（先行するＭＦ／透析ろ過工程を介して）濃縮されたプラスミドは、沈殿の特徴が体積排除から脱水機序へと変化するような最終エタノール濃度になるように、透析ろ過された沈殿へ、エタノール性溶液（例えば、１００％又は２００アルコール度数）を供給することによって脱水することが可能である。その結果、沈殿されたプラスミドＤＮＡの物理的特性は、ゲル様物質から、より硬く、より圧縮可能な沈殿へと変化する。得られた沈殿は、多孔性の構造へと詰め込まれて、第二のろ過工程（上記工程（ｂ））において、優れた流量と高い搭載能力をもたらす。本発明によれば、約１００％（ｖ／ｖ）未満のエタノールを含有するエタノール性溶液中で沈殿したＤＮＡを温置すると、沈殿した高次コイルプラスミドＤＮＡのエタノールによる部分的脱水が生じる。従って、上記工程（ａ）の部分的脱水を達成するために、異なるエタノール濃度を使用することが可能であるが、約３０−８０％（ｖ／ｖ）の間の範囲内の最終エタノール濃度が好ましい。約３０％（ｖ／ｖ）を下回る濃度は、ＤＮＡを再び溶液中に再溶解させるリスクがあるのに対して、約８０％（ｖ／ｖ）を上回る濃度は、プラスミドＤＮＡとともに、塩を沈殿させ始める。本発明の一実施形態において、ＰＥＧによって沈殿され、（上記先行するＭＦ／透析ろ過工程を介して）濃縮されたプラスミドは、５０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで、１００％（２００アルコール度数）のエタノールの添加によって脱水される。プラスミドＤＮＡ沈殿を脱水させた後、前記沈殿されたＤＮＡスラリーは、ろ過によってさらに（例えば、約３０ｇ／Ｌまで）濃縮され、次いで、真空乾燥の準備のために、１００％エタノールに対して透析ろ過される。本明細書に記載されている実施例において、脱水されたプラスミドＤＮＡスラリーは、圧力ろ過及び真空乾燥（一般に、単一プレートＮｕｔｓｃｈｅフィルター乾燥機として知られている。）を可能とする撹拌された細胞操作下において、フィルター乾燥機中での前記第二のろ過によって濃縮される。前記系の撹拌された細胞操作は、チャンネルを通じた前記溶液の再循環によるのではなく、羽根車によって、フィルター表面上に、アルコール沈殿されたＤＮＡ溶液の流れを作り出す。本明細書に開示された第二のろ過／透析ろ過プロセスを例示するために使用されたフィルター乾燥機には、２５μｍのステンレス鋼メッシュフィルターが装着される。従って、新規下流濃縮／仕上げプロセスの本部分の第二のろ過工程は、撹拌された細胞モード下で、約０．１μｍ未満と１００μｍの間の孔径、好ましくは、約２５μｍの孔径のフィルターを有する単一プレートＮｕｔｓｃｈｅフィルターを使用して行われる。孔径は、ろ液及び全ての付随する不純物をフィルターに通過させながら、プラスミドＤＮＡ沈殿物をフィルター上に捕捉するためにのみ重要である。下記の実施例において、濃縮されたＤＮＡ沈殿物は、次いで、同じフィルター−乾燥機ユニット中、３．２Ｌ／ｍ^２／分に制御された流量、１００％（２００アルコール度数）アルコールに対して透析ろ過される。ろ過に引き続き、２５〜３７℃で約２４時間、粉末を真空下で乾燥し、微細な産物粉末を形成する。あるいは、粉末化されたＤＮＡ産物は、選択した製剤緩衝液中に再懸濁することも可能である。この第二のろ過／透析ろ過操作は、残存する全てのＰＥＧを溶液から除去するために、産物をさらに脱水するために、及び可能な限り多くの塩を除去するために実施される。
【００６５】
従って、本発明は、（ａ）ポリエチレングリコールで前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、及び（ｂ）接線流ろ過モードでの精密ろ過を含む段階的ろ過プロセスを用いて、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。この段階的なろ過プロセスは、（ａ）接線流ろ過モード下での精密ろ過を含む第一のろ過濃縮工程と、（ｂ）高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿された形態に保つのに十分なＰＥＧの十分な濃度を含有し、及び高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿された形態に保つのに十分な塩を場合により含有するＰＥＧ含有透析ろ過緩衝液に対する第一の透析ろ過工程と、（ｃ）沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡがエタノールの添加によって部分的に脱水される脱水工程と、（ｄ）第二のろ過濃縮工程と、並びに（ｅ）１００％（ｖ／ｖ）エタノールに対する第二の透析ろ過工程と、を含む。好ましい実施形態において、工程（ｂ）の透析ろ過緩衝液は、約１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ６０００と約１．２ＭのＮａＣｌを含有する。この沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡは、精密ろ過及び第一の透析ろ過工程後に、約３０％と約８０％（ｖ／ｖ）の間の最終濃度になるようにエタノールを添加することにより、工程（ｃ）において脱水することができる。好ましい実施形態において、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡは、精密ろ過／透析ろ過保持液へのエタノールの添加により、約５０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで部分的に脱水される。さらなる好ましい実施形態において、上記工程（ｄ）及び（ｅ）の第二のろ過及び透析ろ過は、撹拌された細胞モードで動作される単一プレートＮｕｔｓｃｈｅフィルター乾燥機を含む（但し、これに限定されない。）ステンレス鋼のメッシュ（またな均等物）スクリーンが装着されたフィルター乾燥機中で行われる。従って、本発明は、（ａ）ＰＥＧで前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、（ｂ）接線流ろ過下での精密ろ過を用いて、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮すること、（ｃ）エタノールの添加により、前記濃縮された、沈殿されたＤＮＡを部分的に脱水すること、及び（ｄ）撹拌された細胞フィルター乾燥機中で前記部分的に脱水された、沈殿されたＤＮＡを濃縮すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。
【００６６】
本発明は、さらに、（ａ）前記高次コイルプラスミドＤＮＡを、アルコール（エタノール、メタノール及びイソプロパノールを含むが、これらに限定されない。）沈殿させること、及び（ｂ）接線流ろ過モード下での精密ろ過によって、前記沈殿されたプラスミドＤＮＡを濃縮することを含む大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。前記限外ろ過が、標準的なポンプ（例えば、ローブポンプ）を用いた工場規模の製造方法に改変される場合に、溶液相プラスミドが剪断損傷を受け易いので、産物プラスミドＤＮＡを濃縮するために、限外ろ過ではなく、（ＰＥＧ又はアルコールの何れかによる）沈殿の使用が好まれる。米国特許出願０９／８７５，３７９（上記）中に記載されている、より初期の開発作業は、プラスミドＤＮＡの乾燥粉末形態を得るためにバッチモードで沈殿溶媒としてエタノールを使用できることを示した。しかしながら、このアプローチは、沈殿後ろ過及び洗浄工程に関して一貫しておらず、洗浄グラジエントを徐々に負荷しなければ、遅いろ過速度と著しいケーキの圧縮を示す。従って、本発明の一実施形態において、本発明の最終下流濃縮／仕上げ工程は、プラスミドＤＮＡの精製された原末形態を最終的に生成するために、接線流ろ過モードでの精密ろ過によって増強されたアルコール沈殿を特徴とする。本アプローチの強化として、精密ろ過を同時に行う連続的沈殿は、バッチアルコール沈殿法に比べて、容器容積を著しく減少させ得る。
【００６７】
前述されているように、細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させる（ＰＥＧ又はアルコールにより沈殿させることを含むが、これに限定されない。）という第一の工程を包含する本発明の最終下流濃縮／仕上げ工程を実施する前に、上流精製プロセス及び先行する下流精製プロセス（上で詳しく記載されている。）の両方の結果として、前記細胞可溶化液中では高次コイルプラスミドＤＮＡが濃縮されている。高次コイルプラスミドＤＮＡが濃縮された細胞可溶化液が生成されたら、前記プラスミドＤＮＡ含有可溶化液は、全ての残留不純物を除去するためにさらに処理され、プラスミドＤＮＡ精製体制中の最終仕上げ工程に相当する。アルコール沈殿を含む本発明の最終下流濃縮／仕上げ工程を実証するために、まず、（米国特許出願０９／８７５，３７９号（上記）に記載されているように）ＬＲＡ後のろ液から、高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させる。何らかの特定の理論に拘泥するものではないが、様々な溶媒（エタノール、イソプロパノール及びメタノール）及び塩がプラスミドＤＮＡを沈殿する能力を調べる、本明細書の実施例の部に記されている実験は、ＤＮＡ沈殿の機序に対して洞察を与える。ＤＮＡは、互いに反発する、負に帯電したリン酸基に加えて、疎水性の塩基対を含有する。ホスファートの反発が克服されれば、疎水性領域が堆積し、ＤＮＡが溶液から沈殿する。図９Ｂは、プラスミドの溶解度が、塩又は溶媒の何れかを添加することによって減少することを示している。溶液のイオン強度（塩濃度）は、静電的に溶解度に対して影響を与え、ここで、陽イオンは、負に帯電したホスファート基の反発を遮蔽する。当業者は、本明細書に記載されている調査及び本分野で既に開示されている調査を用いて、本発明の最終濃縮／仕上げ精製工程中の第一の工程として、プラスミドＤＮＡをアルコールで沈殿させるときの、溶媒と塩の間の相互作用を理解する。
【００６８】
上述のように、本発明の一実施形態は、（ａ）エタノールで前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、及び（ｂ）接線流ろ過モード下での精密ろ過によって、前記沈殿されたプラスミドＤＮＡを濃縮すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。本明細書の実施例の部に詳しく記載されている研究は、約３０％と３３％（ｖ／ｖ）の間のエタノール濃度及び約１．８と３．４Ｍの間のＮａＣｌ濃度により、０．５ｇ／Ｌのプラスミド溶液中で、プラスミドＤＮＡの溶解度の鋭い減少が起こることを示す。上述のように、当業者であれば、アルコールによるプラスミドＤＮＡ沈殿の効率において、溶液イオン強度（塩濃度）が役割を果たしていることを認識し、従って、前記プラスミドの沈殿を達成するために特定のＤＮＡ濃度のプラスミド溶液に対して十分な濃度で塩及びエタノールを与える必要があることを認識する。さらに、プラスミドＤＮＡがその後のろ過及び洗浄工程の間に沈殿された状態を確実に保つために、前記成分の適切な濃度を維持することの重要性が、当業者によって認識される。本発明の一実施形態において、本明細書に開示されている下流濃縮／仕上げプロセス（上記工程（ａ））の第一の工程として、約４０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで、プラスミドＤＮＡが濃縮された細胞可溶化液（細胞可溶化液は、概ね約３ＭのＮａＣｌを含有する。）にエタノールを添加することにより、高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させる。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態において、プラスミドＤＮＡがアルコール（エタノール、メタノール及びイソプロパノールを含むが、これらに限定されない。）によって沈殿された後に、前記沈殿されたプラスミドは、次いで、段階的ろ過プロセスを介して濃縮される。前記段階的なろ過プロセスは、（ａ）接線流ろ過モード下での精密ろ過を含む第一のろ過濃縮工程と、（ｂ）エタノール性溶液のエタノール濃度が高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿された状態に保つのに十分であるエタノール性溶液に対する第一の透析ろ過工程と、（ｃ）第二のろ過濃縮工程と、並びに（ｄ）１００％（ｖ／ｖ）エタノールに対する第二の透析ろ過工程と、を含む。本明細書に記載されている実施例において、枝付きフラスコ及び０．２ミクロンの膜フィルター（２．１ｃｍ^２のフィルター面積）を用いて、直接フローろ過の下、８０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨに対して、沈殿したプラスミド溶液（約４０％（ｖ／ｖ）エタノール及び約３Ｍ ＮａＣｌで沈殿された０．８６ｇ／Ｌのプラスミド溶液）を透析ろ過する試みが行われた。ろ過が進行するにつれて、流動の著しい減少が顕著であり、ゲル様フィルターケーキの形成がもたらされた。大規模なバッチろ過の場合、従って、５フィートの直径の０．２ミクロンフィルター（１９．６平方フィートの膜面積）を用いると、直接フロー下でのろ過は、２４３時間後に完了すると推定された。この非実用的なろ過時間のために、表面積の大きな接線流ろ過（「ＴＦＴ（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」）膜が代替法として検討された。この目的のために、０．２２μｍＰＶＤＦ接線流ろ過膜を用いて、約４０％（ｖ／ｖ）エタノール及び約３ＭのＮａＣｌで沈殿されたプラスミドＤＮＡを精密ろ過した。懸濁液は１５ｍＬ／分で容易にろ過され、実験中、浸透液の流量は減少しない。このことは、膜表面から固体が自由に除去され、ケーキ層を形成しなかったことを示している。
【００７０】
アルコールによって誘導されるプラスミド沈殿を伴う段階的ろ過プロセスの精密ろ過工程及び第一の透析ろ過工程は、残留塩及び過剰の水を溶液からともに除去するために、並びに同時に、アルコール沈殿された（例えば、エタノール沈殿された）プラスミドＤＮＡを濃縮するために行われる。このプロセスは、浸透液とともに失われた塩及び水を消費して、沈殿されたプラスミドＤＮＡを保持液中に濃縮する（すなわち、作業容積を減少する。）。濃縮され、沈殿されたプラスミドＤＮＡは、次いで、透析ろ過され、同じく、塩の除去を補助する。本発明の一実施形態において、ＴＥＦ精密ろ過によって濃縮された、エタノールで沈殿されたプラスミドＤＮＡは、続いて、約６０％と約１００％の間のエタノールを含む溶液に対して透析ろ過される。プラスミドＤＮＡは、塩の不存在下でさえ、８０％ｖ／ｖエタノール溶液中に完全に不溶性であるので、プラスミドＤＮＡが不溶性である条件を維持しながら、懸濁液からＮａＣｌを除去するために、８０％エタノールを用いた透析ろ過を使用することが可能である。次いで、沈殿されたプラスミドＤＮＡスラリーを、第二のろ過工程によってさらに濃縮し、１００％（アルコール度数２００）エタノールに対して、二度目の透析ろ過を行う。本発明の一実施形態において、この第二のろ過／透析ろ過プロセスは、上述のように、単一プレートＮｕｔｓｃｈｅフィルター乾燥機を含む（但し、これに限定されない。）フィルター乾燥機中で実施される。湿潤粉末は（例えば、２５〜３７℃で）真空乾燥することが可能であり、得られた粉末化されたＤＮＡ産物は、選択した調合緩衝液中に再懸濁され得る。
【００７１】
バッチモードでの、アルコールによって誘導されたプラスミド沈殿は、バッチ容量及び沈殿のために必要とされるエタノールの量の両方を保持するのに十分大きな容器を必要とする。しかしながら、一定の容量を維持するために精密ろ過がそこから同時に液体を除去する、より小さな中間の容器中に、フィード及びエタノールの両方を連続的に汲み入れることができるのであれば、高い溶媒比で沈殿が実施される場合でも、大きな沈殿容器はもはや必要とされない。このモードでは、溶媒廃棄液は、浸透液を継続的に蒸留し、沈殿容器へとリサイクルすることによっても最小化することが可能である。従って、本発明の一実施形態は、（ａ）アルコール（エタノール、メタノール及びイソプロパノールを含むが、これらに限定されない。）を用いて前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、及び（ｂ）接線流ろ過モード下での精密ろ過によって、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮することを含み、工程（ａ）及び工程（ｂ）が、連続的な沈殿／精密ろ過条件下で行われる、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを生成する方法に関する。前記連続的沈殿／精密ろ過プロセスは、精密ろ過が同じ容器から同時に実施されて一定容積を保ちながら、撹拌された容器に、エタノールとプラスミド溶液が連続的に添加される場合に行われる。このアプローチに対する補助として、浸透液の連続的な蒸留は、濃縮されたエタノールの沈殿へのリサイクルを提供して、必要とされる溶媒容量を最小化し、より高く、より好ましいアルコール濃度での沈殿を可能とする。従って、本発明の一部として含まれる連続的な沈殿／精密ろ過プロセスは、アルコール（例えば、エタノール）の回収を含んでもよく、又は含まなくてもよい。以下の実施例の部に詳しく記載されているように、精密ろ過膜の目詰まりを避けるために、精密ろ過の開始前に、プラスミド粒子が完全に脱水できる十分な待機時間が必要である。沈殿されたプラスミドＤＮＡが完全に脱水されることを確実にすることは、水和された大きな粒子によるチャネルの目詰まりのために引き起こされ得る圧力の増加をなくすことにも役立つ。連続的な沈殿／精密ろ過アプローチは、沈殿のために高いアルコールレベルを必要とするある種の調製に対して特に魅力的であり得る。
【００７２】
本発明の一実施形態において、本明細書に記載されている新規上流及び新規下流精製プロセスは、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から得られる高次コイルプラスミドＤＮＡの単離のための単一のプロセス中に組み合わされる。従って、本発明は、さらに、（ａ）生理的緩衝液中に、高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する微生物宿主細胞を溶解して、宿主細胞可溶化液を形成させること、（ｂ）宿主細胞細片を凝集することによって前記宿主細胞可溶化液を清澄化させ、高次コイルプラスミドＤＮＡを溶液中に保持すること、（ｃ）前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、及び （ｄ）接線流ろ過モード下での精密ろ過を用いて、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮すること、を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。本発明の本部分の一実施形態において、上記工程（ａ）の宿主細胞可溶化液は、リゾチームを含有する標準的なＳＴＥＴ緩衝液中での微生物宿主細胞の溶解によって作製される。本発明の本部分の別の実施形態において、工程（ａ）の宿主細胞可溶化液は、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９７４９号及びＰＣＴ／ＵＳ９６／０７０８３号に開示されているように、熱交換装置を通じて微生物宿主細胞を通過させることによって作製される。詳しく上述されているように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、微生物細胞からの高次コイルプラスミドＤＮＡの下流精製のための準備において、清澄化された細胞可溶化液を作製するための、宿主細胞細片の効果的な凝集剤であることが本明細書において示されている。従って、本発明の本部分の一実施形態において、宿主細胞可溶化液は、ＰＥＧを用いて、上記工程（ｂ）において清澄化される。ＰＥＧ凝集剤は、当初の溶解緩衝液の成分であることができ、又は溶解が起こった後に、細胞可溶化液に添加することができる。上で説明されているように、宿主細胞可溶化液を清澄化するために使用されるＰＥＧ凝集剤の量は、その分子量に依存する。本発明の好ましい実施形態において、本明細書に記載されているように、宿主細胞細片を凝集するために、約３．７％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ６０００が使用されるが、凝集の達成に対するＰＥＧポリマー濃度と分子量の間の密接な相互関係の故に、本明細書に開示されている全ての具体的ＰＥＧ濃度及びＰＥＧ分子量は指針と解するべきであり、全体として本発明を限定すると解するべきではない。凝集用の細胞可溶化液を調製するために、前記可溶化液は、アルカリｐＨシフトに供されることができ、続いて、凝集の前に中和に供されることができる。アルカリｐＨシフトは、濃縮された塩基の添加により、宿主細胞可溶化液のｐＨを約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間のアルカリ値へと上昇させることを含む。アルカリシフトされた宿主細胞可溶化液のその後の中和は、約ｐＨ７と約ｐＨ９の間の値まで、前記細胞可溶化液のｐＨを低下させる（すなわち、アルカリシフト前の可溶化液の概ね同じレベルまでｐＨを低下させる。）ことを含む。アルカリｐＨシフト及びその後の中和プロセスは、ＰＥＧ凝集剤の添加前又は添加後の何れにおいても行い得る。従って、本発明は、（ａ）リゾチームを含有するＳＴＥＴ緩衝液中で、高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する微生物宿主細胞を溶解させること、（ｂ）アルカリｐＨシフト及びその後の中和へ、前記宿主細胞可溶化液を供すること、（ｃ）ＰＥＧ凝集剤で宿主細胞細片を凝集させることにより、前記宿主細胞可溶化液を清澄化すること、（ｄ）前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、並びに（ｅ）接線流ろ過モード下での精密ろ過を用いて、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮することを含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法に関する。本発明の一実施形態において、溶液中に存在する高次コイルプラスミドＤＮＡは、アルコール（例えば、４０％ｖ／ｖエタノール）及びＰＥＧ（例えば、１０％ｗ／ｖＰＥＧ６０００）からなる群から選択される沈殿剤を用いて、工程（ｄ）において沈殿される。さらに、上記工程（ｅ）の濃縮工程は、段階的なろ過プロセスであり得る。前記プラスミドＤＮＡが、まず、ＰＥＧで沈殿されるのであれば、前記段階的ろ過プロセスは、（ａ）接線流ろ過の下での精密ろ過を含む第一のろ過濃縮工程、（ｂ）高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿された状態に保つのに十分なＰＥＧ及び塩を含有するＰＥＧ含有透析ろ過緩衝液に対する第一の透析ろ過工程と、（ｃ）沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡがエタノールの添加によって部分的に脱水される脱水工程と、（ｄ）第二のろ過濃縮工程と、並びに（ｅ）１００％（ｖ／ｖ）エタノールに対する第二の透析ろ過工程と、を含む。前記プラスミドＤＮＡが、まず、アルコール（例えば、エタノール）で沈殿されるのであれば、前記段階的ろ過プロセスは、（ａ）接線流ろ過の下での精密ろ過を含む第一のろ過濃縮工程、（ｂ）アルコール性溶液の濃度が前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿されたままに保つのに十分であるアルコール性溶液（例えば、エタノール）に対する第一の透析ろ過工程と、（ｃ）第二のろ過濃縮工程と、並びに（ｄ）１００％（ｖ／ｖ）アルコール（例えば、１００％エタノール）に対する第二の透析ろ過工程と、を含む。
【００７３】
この目的のために、本発明は、さらに、（ａ）発酵ブロス又は培地から微生物宿主細胞を採集すること、（ｂ）生理的溶解溶液の十分量の中で宿主細胞を溶解させること、（ｃ）前記可溶化液のｐＨを約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間のｐＨまで上昇させることにより、宿主細胞可溶化液をアルカリｐＨシフトに供すること、（ｄ）アルカリシフトされた細胞可溶化液を、概ね、溶解緩衝液のｐＨまで中和すること、（ｅ）ＰＥＧで宿主細胞細片を凝集させることによって、工程（ｄ）の細胞可溶化液を清澄化すること、（ｆ）前記凝集された宿主細胞細片を除去すること、（ｇ）ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドによって誘導される沈殿を用いて、高次コイルプラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させること、（ｈ）最適化されたイオン強度の、水和され、結晶化されたケイ酸カルシウムをさらに含有する十分に確定された緩衝液中に前記高次コイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、及び不純物を吸着させること、（ｉ）水和され、結晶化された、ケイ酸カルシウムによって誘導される第二の吸着により、残留不純物を吸着させること、（ｊ）ＰＥＧで高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、（ｋ）接線流ろ過モード下での精密ろ過を用いて、前記沈殿された高次コイルＤＮＡを濃縮すること、（ｌ）エタノールの添加により、前記沈殿された高次コイルＤＮＡを部分的に脱水すること、（ｍ）撹拌された細胞フィルター乾燥機中で前記脱水された高次コイルＤＮＡを濃縮すること、並びに（ｎ）エタノールを除去するために乾燥させ、微細な粉末化されたＤＮＡ産物を残存させることを含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する組み合わされた方法に関する。本発明の一実施形態では、直前に記載されている精製プロセスにおいて、段階的な界面活性剤の沈殿が使用される。前記段階的プロセスは、細胞可溶化液から残留タンパク質とエンドトキシンを除去するための第一の低カット沈殿工程に続き、プラスミドＤＮＡを沈殿させるための高カット沈殿工程を含む。第一の低カット工程は、凝集された宿主細胞細片の除去の前に実施することが可能である。このような事例では、高カット沈殿工程は、清澄化された可溶化液を用いて（すなわち、宿主細胞細片の除去後に）行われ、上記工程（ｇ）によって代表される。
【００７４】
本発明は、（ａ）発酵ブロス又は培地から微生物宿主細胞を採集すること、（ｂ）リゾチームを含有する標準的なＳＴＥＴ緩衝液の十分量に宿主細胞を溶解させること、（ｃ）宿主細胞可溶化液のｐＨを約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間のｐＨまで上昇させることにより、宿主細胞可溶化液をアルカリｐＨシフトに供すること、（ｄ）アルカリシフトされた細胞可溶化液を、概ね、ＳＴＥＴ緩衝液のｐＨまで中和すること、（ｅ）ＰＥＧで宿主細胞細片を凝集させることによって、工程（ｄ）の細胞可溶化液を清澄化すること、（ｆ）前記凝集された宿主細胞細片を除去すること、（ｇ）ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドによって誘導される沈殿を用いて、高次コイルプラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させること、（ｈ）最適化されたイオン強度の、及び水和され、結晶化されたケイ酸カルシウムをさらに含有する十分に確定された緩衝液中に前記沈殿されたプラスミドＤＮＡを再溶解し、及び不純物を吸着させること、（ｉ）水和され、結晶化された、ケイ酸カルシウムによって誘導される第二の吸着により、残留不純物を吸着させること、（ｊ）ＰＥＧで高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、（ｋ）接線流ろ過モード下での精密ろ過を用いて、前記沈殿された高次コイルＤＮＡを濃縮すること、（ｌ）エタノールの添加により、前記沈殿された高次コイルＤＮＡを部分的に脱水すること、（ｍ）撹拌された細胞フィルター乾燥機中で前記脱水された高次コイルＤＮＡを濃縮すること、並びに （ｎ）エタノールを除去するために乾燥させ、微細な粉末化されたＤＮＡ産物を残存させることを含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する組み合わされたプロセスに関する。本発明の一実施形態において、直前に記載されている精製プロセスにおいて、段階的な界面活性剤の沈殿が使用される。前記段階的プロセスは、細胞可溶化液から残留タンパク質とエンドトキシンを除去するための第一の低カット沈殿工程に続き、プラスミドＤＮＡを沈殿させるための高カット沈殿工程を含む。第一の低カット工程は、凝集された宿主細胞細片の除去の前に実施することが可能である。前記高カット沈殿工程は、清澄化された可溶化液を用いて（すなわち、宿主細胞細片の除去後に）行われ、上記工程（ｇ）によって代表される。
【００７５】
本発明は、さらに、（ａ）発酵ブロス又は培地から微生物宿主細胞を採集すること、（ｂ）生理的溶解溶液の十分量の中で宿主細胞を溶解させること、（ｃ）宿主細胞可溶化液のｐＨを約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間のｐＨまで上昇させることにより、宿主細胞可溶化液をアルカリｐＨシフトに供すること、（ｄ）アルカリシフトされた細胞可溶化液を、概ね、溶解緩衝液のｐＨまで中和すること、（ｅ）ＰＥＧで宿主細胞細片を凝集させることによって、工程（ｄ）の細胞可溶化液を清澄化すること、（ｆ）前記凝集された宿主細胞細片を除去すること、（ｇ）ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドによって誘導される沈殿を用いて、高次コイルプラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させること、（ｈ）最適化されたイオン強度の、及び水和され、結晶化されたケイ酸カルシウムをさらに含有する十分に確定された緩衝液中に前記沈殿されたプラスミドＤＮＡを再溶解し、及び不純物を吸着させること、（ｉ）水和され、結晶化された、ケイ酸カルシウムによって誘導される第二の吸着により、残りの不純物を吸着させること、（ｊ）エタノールで高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、（ｋ）接線流ろ過モード下での精密ろ過を用いて、前記沈殿された高次コイルＤＮＡを濃縮すること、（ｌ）撹拌された細胞フィルター乾燥機中で前記脱水された高次コイルＤＮＡをさらに濃縮すること、並びに（ｍ）エタノールを除去するために乾燥させ、微細な粉末化されたＤＮＡ産物を残存させることを含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する組み合わされたプロセスに関する。本発明の一実施形態において、直前に記載されている精製プロセスにおいて、段階的な界面活性剤の沈殿が使用される。前記段階的プロセスは、細胞可溶化液から残留タンパク質とエンドトキシンを除去するための第一の低カット沈殿工程に続き、プラスミドＤＮＡを沈殿させるための高カット沈殿工程を含む。第一の低カット工程は、凝集された宿主細胞細片の除去の前に実施することが可能である。このような事例では、高カット沈殿工程は、次いで、清澄化された可溶化液を用いて（すなわち、宿主細胞細片の除去後に）行われ、上記工程（ｇ）によって代表される。
【００７６】
本発明は、（ａ）発酵ブロス又は培地から微生物宿主細胞を採集すること、（ｂ）リゾチームを含有する標準的なＳＴＥＴ緩衝液の十分量で宿主細胞を溶解させること、（ｃ）前記可溶化液のｐＨを約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間のｐＨまで上昇させることにより、宿主細胞可溶化液をアルカリｐＨシフトに供すること、（ｄ）アルカリシフトされた細胞可溶化液を、概ね、ＳＴＥＴ緩衝液のｐＨまで中和すること、（ｅ）ＰＥＧで宿主細胞細片を凝集させることによって、工程（ｄ）の細胞可溶化液を清澄化すること、（ｆ）前記凝集された宿主細胞細片を除去すること、（ｇ）ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドによって誘導される沈殿を用いて、高次コイルプラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させること、（ｈ）最適化されたイオン強度の、及び水和され、結晶化されたケイ酸カルシウムをさらに含有する十分に確定された緩衝液中に前記沈殿されたプラスミドＤＮＡを再溶解し、及び不純物を吸着させること、（ｉ）水和され、結晶化された、ケイ酸カルシウムによって誘導される第二の吸着により、残留不純物を吸着させること、（ｊ）エタノールで高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、（ｋ）接線流ろ過モード下での精密ろ過を用いて、前記沈殿された高次コイルＤＮＡを濃縮すること、（ｌ）撹拌された細胞フィルター乾燥機中で前記脱水された高次コイルＤＮＡをさらに濃縮すること、並びに（ｍ）エタノールを除去するために乾燥させ、微細な粉末化されたＤＮＡ産物を残存させることを含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する組み合わされたプロセスにも関する。本発明の一実施形態において、直前に記載されている精製プロセスにおいて、段階的な界面活性剤の沈殿が使用される。前記段階的プロセスは、細胞可溶化液から残留タンパク質とエンドトキシンを除去するための第一の低カット沈殿工程に続き、プラスミドＤＮＡを沈殿させるための高カット沈殿工程を含む。第一の低カット工程は、凝集された宿主細胞細片の除去の前に実施することが可能である。次いで、前記高カット沈殿工程が、清澄化された可溶化液を用いて（すなわち、宿主細胞細片の除去後に）行われ、上記工程（ｇ）によって代表される。
【００７７】
本明細書に挙げられている全ての公報は、本発明に関連して使用され得る方法及び材料を記載及び開示する目的で含められる。本明細書の記載は、以前の発明に基づいて、本発明がこのような開示の日付に先行させる権利を有しないことを認めるものと解釈すべきではない。
【００７８】
添付の図面を参照しながら本発明の好ましい実施形態について記載してきたが、本発明はこれらの厳密な実施形態に限定されないこと、及び添付の特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、本発明の中に様々な変化及び改変が当業者によって実施され得ることを理解すべきである。
【００７９】
以下の実施例は、本発明を例示するが、本発明を以下の実施例に限定するものではない。
【実施例１】
【００８０】
ＰＥＧによる宿主細胞細片の凝集
分析方法―利用される分析方法は、（ｉ）陰イオン交換（「ＡＥＸ」）ＨＰＬＣアッセイ、（ｉｉ）Ｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；臭化エチジウム含有０．８％アガロース）を使用するゲル電気泳動、及び（ｉｉｉ）ＴａｑｍａｎＰＣＲアッセイを使用するｑＰＣＲを含む。Ｅゲルは、ウェルあたり２０μＬの負荷で、６０Ｖで５０分間行った。Ｅゲルアッセイを行う前に、試料をエタノール沈殿（２当量）により前処理し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管中で５分間遠心分離し、上清を注ぎ移し、ペレットを、５分間乾燥させた後、ｐＨ８．０の１０ｍＭトリス緩衝液中に再懸濁した。その後、前処理した試料を１×ＴＡＥ緩衝液中に希釈した後、Ｅゲルに負荷した。ｑＰＣＲ分析に提供される試料にういて、同一の前処理を実施した。
【００８１】
リゾチームによる溶解―まず、Ｅ．コリの可溶化研究を実施して、溶解性能に及ぼすリゾチームの影響、塩基／酸処理（ｐＨ１２−１３になるように塩基添加及びその後、ｐＨ約７−９なるように、酸の添加により中和）及び温度を評価した。４５のＯＤ_６００になるように再懸濁した細胞を使用して、細胞の可溶化を評価した。リゾチームなしでの可溶化は温度又は塩基／酸処理にかかわらず、より低い収量をもたらした。標準的なＳＴＥＴ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ^（Ｒ）−Ｘ−１００、８％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ８．２）中で、塩基／酸処理を行わずに、リゾチーム（５００Ｕ／ｍＬ Ｒｅａｄｙ−Ｌｙｓｅ^ＴＭ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて２０℃で行った溶解は、３７℃での溶解と比較したとき、より低いプラスミドＤＮＡ回収（約０．３ｇ／ＬのプラスミドＤＮＡ濃度）を生じた。リゾチーム温置（５００Ｕ／ｍＬ）の使用後に塩基／酸処理を行うことによって、最大収量が達成された。塩基／酸処理は、濃ＮａＯＨ（５Ｍストック；０．２５Ｍの最終溶液濃度）の添加、１５分の温置及び酢酸（５Ｍストック；０．２５Ｍの最終溶液濃度）の添加からなった。プラスミドＤＮＡ収量は、２０℃又は３７℃のいずれかで温置され、塩基／酸処理へ供された、ＯＤ_６００が４５の可溶化液から、約０．５ｇ／Ｌであった。
【００８２】
可溶化液凝集研究―スクリーニング研究を実施して、細胞細片の沈殿に及ぼすＰＥＧ凝集の効果を特徴付けた。図１は、ＯＤ_６００が４５の異なるＥ．コリ可溶化液（プラスミドＤＮＡ含有）の入った４つのＮａｌｇｅｎｅ瓶を示す。瓶１は、ＳＴＥＴ緩衝液（上述）中に細胞を再懸濁し、２０℃でリゾチーム（５００Ｕ／ｍＬ Ｒｅａｄｙ−Ｌｙｓｅ（商標））とともに温置することによって生成された可溶化液を含有する。瓶２は、瓶１と同じ可溶化液を含有するが、塩基／酸工程は、リゾチーム温置後に実施した（ｐＨシフトは約８．５から約１２．５まで進み、約８．５へ戻る）。３％のＰＥＧ３０００を含有するＳＴＥＴ緩衝液中に細胞を再懸濁し、２０℃でリゾチーム（５００Ｕ／ｍＬ）とともに温置することによって、瓶３中の可溶化液を生成した。瓶４は、瓶３と同じ可溶化液を含有するが、塩基／酸工程は、リゾチーム温置後に実施した。ｐＨのシフトされ、ＰＥＧ処理された材料は、２日にわたって重力のみにより沈殿し、遠心分離中の成果の改善が得られるであろうことを示した。ＰＥＧは、細胞細片の、特に宿主細胞可溶化液の塩基／酸処理後（すなわち、ｐＨシフトはｐＨ約８．５からｐＨ約１２．５まで進んだ後、ｐＨ約８．５まで戻った；上述のとおり）の凝集剤として特によく作用すると判定した。実際、ＰＥＧの添加は、逆の効果をもたらし、すなわち、塩基／酸処理へ供されなかった可溶化液へ適用された場合、細片はペレットにするのがより困難となった。
【００８３】
ＰＥＧにより誘導される凝集をさらに検査するため、図２に記載のように処理された様々な細胞可溶化液を５０ｍＬの遠心管へ一定分量に分けた。瓶を回転式ミキサーにおいて１５分間温置した後、遠心分離した。図２に示された結果は、塩基／酸処理へ供された可溶化液へ添加されたときの、凝集剤としてのＰＥＧの作用を示す。図３は、図２において検査された６つの試料の上清についての濁度測定結果を示す。コントロールの７３０ＮＴＵ濁度（チューブ２）と比較した、５％の最終ＰＥＧ濃度での遠心分離後の１５．５ＮＴＵの溶液濁度（チューブ６）を示した。このことは、遠心分離が、仕上げのろ過を使用せずに２０未満のＮＴＵ清澄に到達する清澄戦略として使用できることを示す。これらの結果は、ＰＥＧは、塩基／酸処理前又は後のいずれかで添加される場合、効果的な凝集剤であることも示す。
【００８４】
細胞細片の凝集に及ぼすＰＥＧ分子量の効果―細胞細片の沈殿性能に基づいた迅速スクリーニング法を使用して、凝集に及ぼすＰＥＧの濃度及び分子量の効果を研究した。リゾチーム（５００Ｕ／ｍＬ）の存在下で細胞を温置し、上述の塩基／酸処理へ供した。様々なＰＥＧストック溶液を可溶化液の１０ｍＬ量へと混合し、生じた混合物を室温で約１６時間沈殿させた。沈殿した固体の体積及び上清の濁度（ＯＤ_６００）を測定した（図４Ａ）。高濃度のＰＥＧは、公知のＤＮＡ沈殿剤であり、ＤＮＡ濃度も測定した。図４Ｂは、ＰＥＧ３０００を使用した研究に関する（ＡＥＸアッセイによって測定される）ＤＮＡ濃度及び上清濁度の両者を示す。細胞細片は凝集するがＤＮＡは沈殿しないＰＥＧ３０００濃度範囲があることも結果は示す。結果は、ＰＥＧ３０００濃度が約５％より上に増加された場合、ＤＮＡが沈殿することも示す。
【００８５】
ＰＥＧ６０００ＤＮＡ凝集実験―アルカリによりｐＨシフトされた後中和された可溶化液を利用して、プラスミドＤＮＡ沈殿曲線をＰＥＧ６０００に関して作成した。沈殿曲線を図５に示す。このデータから、本発明の可溶化／可溶化液清澄化工程の間の約３．７％のＰＥＧ６０００濃度が、宿主細胞細片の凝集の間にプラスミドＤＮＡを沈殿させる何らかの危険性を十分に排除する（６％超のＰＥＧ６０００）。
【００８６】
効果的な可溶化に関する細胞スラリー濃度の上限―リゾチーム温置後の、可溶化液の清澄化のための塩基／酸処理及びＰＥＧ添加を含む、上述の新規の可溶化法を使用して可溶化できる細胞の最大濃度を測定するための研究を実施した。幾つかの細胞スラリー濃度（６００ｎｍでの光学密度ＯＤ_６００に関して表される。）を研究した。７０の初期のＯＤ６００が最適であることを決定し、約０．７ｇ／Ｌの全ＤＮＡ濃度で可溶化液が清澄化された。この初期の細胞可溶化液へ塩基、酸及びＰＥＧ溶液を添加した後、そのもとの値から〜６０までＯＤ_６００をわずかに希釈する。
【００８７】
ＣＴＡＢ低カット不純物沈殿―ＰＥＧ６０００による凝集の後、溶解性タンパク質のレベルを低下させるために（可溶化液の清澄化の前に）凝集された可溶化液へ、ＣＴＡＢが添加されうることがわかった。４０ｍＭのＮａＣｌ中の２％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢを０．１５％（ｗ／ｖ）の最終濃度へ１時間かけて添加することによって、このことを実施した。図１８は、最終的なＣＴＡＢ濃度の関数としてＢＣＡアッセイによって測定されたタンパク質レベルを示す。０．１％（ｗ／ｖ）と０．２％（ｗ／ｖ）との間のＣＴＡＢで最小のタンパク質濃度が得られる。
【００８８】
凝集手法時の連続的な遠心分離―連続的な遠心分離条件をシミュレートするため、高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する宿主細胞可溶化液のＰＥＧ凝集を、（ＣＴＣ３）Ｗｅｓｔｆａｌｉａ遠心分離モデルで検査した。この遠心分離モデルは、固体を除去することはできないが、より大きな生成量の遠心分離と同じ内部幾何学構造を有する。前記遠心分離は、固体に関する保持能力１Ｌの２Ｌボールを有する。（リゾチーム温置、アルカリｐＨシフト及びその後の中和を介して生成される）関心対象の高次コイルプラスミドＤＮＡを含有し、ＰＥＧ６０００で凝集された宿主細胞可溶化液は、２５０ｍＬ／分で１０，０００×ｇで作動するユニットを通過した。可溶化液の約１８Ｌが、ボールを充填する前にユニットを通過できた。固体は非常に厚く、圧縮されたが、実施の時間経過にわたってＤＮＡ濃度に損失はなかった。濁度は、最終清澄化可溶化液において３０ＮＴＵ未満であった。
【００８９】
仕上げろ過―上述の遠心分離手法に加え、遠心分離された可溶化液から残留固体を除去するために、仕上げ深層ろ過が利用できる。例えば、セルロース又は珪藻土をベースとした深層フィルター（例、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＤＥ４０又はＣＥ５０フィルター）は、約７０Ｌ／ｍ^２の概算負荷で使用できる。
【実施例２】
【００９０】
リゾチーム温置、塩基／酸処理及びＰＥＧ凝集後のプラスミドＤＮＡ精製
分析方法―実施例１の方法を参照してほしい。
３０Ｌの可溶化：２，０００ＬのＥ．コリ発酵工程から回収される高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する凍結細胞を、温かい（約３５℃の）水槽中で解凍し、５インチのＡ３１０羽根車を備えた５０ＬのＬｅｅ Ｔａｎｋ中のＳＴＥＴ緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ^（Ｒ）Ｘ−１００、８％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ８．２）を使用して、ＯＤ_６００が７０になるよう希釈した。３０Ｌの再懸濁容積を達成した。Ｒｅａｄｙ−Ｌｙｓｅ^ＴＭリゾチーム（５００Ｕ／ｍＬ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を添加し、生じた細胞スラリーを３７℃で約２時間温置した。細胞スラリーをその後２０℃へ冷却し、５ＭＮａＯＨを６０分間かけて表面下モードでゆっくり添加し、リゾチームの可溶化液のｐＨを約１２まで増大させた。３０分の保持時間の後、２．５Ｍ酢酸を６０分かけて添加し、ｐＨを８ないし９へ低下させた。ＲＣＭ６（塩類溶液、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中のＰＥＧ３０００（５０％（ｗ／ｖ））をその後ゆっくり添加して、５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧの最終濃度にした。ＮａＯＨ、酢酸、及びＰＥＧ３０００の添加後の総可溶化液容積は、３０Ｌ（約７０のＯＤ_６００）から３５Ｌ（約６０のＯＤ_６００）まで増大した。ＰＥＧで凝集された可溶化液をその後、１ＬのＪＬＡ８．１０００遠心瓶に移し、１５．９ｋＧで１５分間遠心した。上清をプールし、約１７ＮＴＵの濁度を有する清澄化した可溶化液を生じた。プールした清澄化可溶化液をその後、４℃で保存した。
【００９１】
４．３Ｌの溶解：直径３インチのＡ３１０羽根車を有する７Ｌのジャケットのついたガラス容器を使用して、高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する１ＬのＥ．コリ発酵から同じ４．３Ｌの溶解を完了した。容器は丸底で、直径は１０インチであり、液体レベルは約８インチであった。羽根車を、概ね１５度の角度で配置し、４００ｒｐｍの速度で作動させた。Ｒｅａｄｙ−Ｌｙｓｅ^ＴＭリゾチーム（５００Ｕ／ｍＬ）を添加し、ｐＨシフト前に３７℃で２．５時間温置した。その後、温度を２０ないし２５℃まで低下させ、６０分かけて、５ＮＮａＯＨ（０．０１５０Ｌ、０．２５Ｍの最終溶液濃度）を添加した。塩基添加後のｐＨは１２．５であった。塩基の添加後、（羽根車の剪断によるいずれかのＤＮＡ分解を防止するのを補助するために）混合速度を２５０ｒｐｍまで下げ、可溶化液を高ｐＨで３０分間温置した。６０分かけて、０．２５Ｍの最終溶液濃度になるように、濃酢酸（２．５Ｎ、０．３Ｌ）を添加した。酸添加の５分間、より良好な混合のために、羽根車速度を３５０ｒｐｍまで上昇させた。酸添加後の最終的なｐＨは８．４であった。その後１時間かけて、濃縮したＰＥＧ３０００（５０％；０．４７５Ｌ）ストックを添加した。約３０分間置いた後、１ＬのＢｅｃｋｍａｎ遠心瓶中に、可溶化液を一定分量に分け、１５ｋＧで１５分間遠心分離した。２０μｍ、直径４インチのステンレス鋼スクリーンを通じて、得られた上清を１０ＬのＮａｌｇｅｎｅ容器中に傾斜して移し、全ての大きな粒子を捕捉した。
【００９２】
結果―実施例１に記載のプローブ実験の結果のように、４．３Ｌの溶解手法を実施した。清澄化された可溶化液の総ＤＮＡ濃度は、ゲル電気泳動アッセイによって測定されたところによれば、０．８ｇ／Ｌであった。宿主ゲノムＤＮＡ濃度のｑＰＣＲ分析から得られた結果を表１に示す。清澄化された可溶化液は、約２％のゲノムＤＮＡを含有するに過ぎないことが測定され、これは、熱溶解法を使用して典型的に達成されるゲノムＤＮＡレベルの有意な低下（約１０ないし１５％）である。このゲノムＤＮＡの低下は、プラスミドＤＮＡと比較して、Ｅ．コリゲノムＤＮＡの低い拡散能による。Ｅ．コリゲノムＤＮＡが約４００ｋｂであり、典型的なプラスミドＤＮＡ分子が約１０ｋｂであるため、質量の差は、劇的に異なる拡散能を引き起こす。塩基性条件下でＤＮＡを変性させると、プラスミドＤＮＡは迅速に再アニールできるのに対し、ゲノムＤＮＡは再アニールできないので、細胞細片との二次的な相互作用を生じ及び総ゲノムＤＮＡレベルの低下を生じる。
【００９３】
【表１】

【００９４】
溶解手法を、３０Ｌ規模でも実施した。結果は、８７％のピーク３を有する、総ＤＮＡの０．７４ｇ／Ｌの収量であり、ピーク３の百分率（％）は、２つの陰イオン交換ピークの比であり、高次コイルのＤＮＡの百分率と相関している。この相関は、ピーク３の百分率が高ければ高いほど、高次コイルプラスミドＤＮＡの百分率が高いことになる。表２は、溶解時の異なる工程でのＡＥＸアッセイの結果を示す。表２の最後の列は、本明細書に記載されている上流精製プロセスで到達可能な増大されたＤＮＡ濃度を示す。さらに、清澄化可溶化液の最終濁度は、１２．１ＮＴＵであった。
【００９５】
【表２】

【００９６】
本明細書に記載されている新規溶解は、約０．９ｇ／ＬのＤＮＡ濃度及び７０のＯＤ_６００で実施できる。従って、この高濃度のために、タンクを実質的により小さくすることができ、熱可溶化手法と比べ、大きな処理容器を必要としない。この溶解は、従来のプラスミドＤＮＡ生産処理の濃度のほぼ２倍で実施でき、単一のタンクを利用し、Ｅ．コリ染色体ＤＮＡレベルを低下させ、及び新規のＰＥＧをベースとした凝集工程を介する下流の固体分離を簡素化する。
【実施例３】
【００９７】
最終的なＤＮＡ仕上げプロセス：
ＰＥＧ沈殿及びＰＥＧ沈殿物の精密ろ過法
参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第０９／８７５，３７９号（米国公報番号ＵＳ２００２／００１２９９０）に記載されている従来のＤＮＡ精製処理は、ケイ酸カルシウム（例、ＬＲＡ）のろ液を、約７＋ｍｇ／ｍＬのＤＮＡまで濃縮するために、プロセスの終了時に限外ろ過（「ＵＦ」）工程を利用し、その後、製剤緩衝液ＰＢＳへの緩衝液交換のための１０×の透析ろ過を利用した（図６Ａ参照）。この最終的な仕上げ工程は、約１００Ｌ以下の容積では満足のいくものであったが、より大きな製造規模の精製処理は、ポンプサイズ及び流速が技術の限界に到達し始めることを示した。これらのプロセス規模の拡大の問題を回避するため、プラスミドＤＮＡプロセスの最終ＵＦ工程を、ＰＥＧ沈殿手法及びその後の２つの個別のろ過／透析ろ過工程と置換した（図６Ｂ参照）。接線流ろ過モードの下での微量ろ過を含む第一のろ過／透析ろ過工程は、沈殿したスラリーを濃縮し、残留ＲＮＡ及び不純物を除去する。第二のろ過／透析ろ過工程は、ＰＥＧをエタノールと置換し、ＤＮＡを脱水する。最終湿潤生成物を十分な真空下で乾燥させ、ＤＮＡの微細粉末形態を得る。この工程を無菌的に実施する限り、エタノール添加により生成物を乾燥させた後にろ過滅菌する必要はない。従来の仕上げ処理は、新規のＰＥＧ沈殿処理の４工程と比較して、２つの工程を必要とするだけであったが、ＰＥＧ処理は、生成物の品質に欠陥を生じたり、非常に大きなポンプ及び流速の使用を必要としたりせずに、製造容積に対して大規模に実現可能である。新規の処理には、不純物をさらに低下させるためのさらなる精製工程も含まれるのに対し、従来の処理は、プラスミドを濃縮し、緩衝液交換のために提供されるのみであった。この新規のユニット操作には、残留ＲＮＡレベルをおそらくは２対数以上まで低下させる能力があり、過剰の流速及び大きなポンプを必要とせず、周期時間を短縮し、必要な貯蔵空間を削減し、おそらくはより安定した生成物を提供する粉末化した生成物を提供する。
【００９８】
ＰＥＧ中のＤＮＡ溶解性（沈殿のキネティクス）―ＬＲＡ後のろ液中のプラスミドＤＮＡを完全に沈殿させる必要のあるＰＥＧ８０００の濃度を、変動する温度及び総ＤＮＡ濃度の下で検討した。ＤＮＡ濃度は０．３ｍｇ／ｍＬと１．０ｍｇ／ｍＬとの間で変動させた。何故ならばこれが大規模精製手法において遭遇する値と見込まれるからである。図７Ａは、ＰＥＧ濃度が２％（ｗ／ｖ）超であるとき、ＰＥＧ８０００の溶液中のＤＮＡの溶解度の急激な低下があることを示す。研究された範囲に関する溶液温度又はＤＮＡ濃度によって、ＤＮＡ溶解度に何ら影響はなかった。図７Ａの結果は、ＤＮＡが約４％のＰＥＧ８０００によって完全に沈殿することを示すが、しかしながら、２×の安全要素を提供するため、本研究の残りにおいて８％のＰＥＧ８０００濃度を選択した。
【００９９】
別のサイズのポリマーが沈殿により適しているかどうかを決定するため、ＰＥＧの異なる分子量を評価した。図７Ｂは、研究された範囲に関して４００分子量のＰＥＧ中でＤＮＡが完全に溶解性であることを示し、ポリマーの分子量が増大するにつれ、ＤＮＡを沈殿させるのに必要なＰＥＧの臨界的な質量は低下する。このことは、例えば、分子量３，０００と１０，０００の間の何らかのＰＥＧがＤＮＡを効果的に沈殿させるのに使用でき、結果的にＰＥＧ濃度が調整されることを示す。
【０１００】
ＰＥＧ添加後の２時間の保持時間が、ＤＮＡ沈殿を完了させるのに十分であることを確認するため、ＰＥＧ沈殿のキネティクスを研究した。図８は、約５分後、ＤＮＡの９９％超が沈殿することを示し、２時間の保持時間が十分すぎることを示す。
【０１０１】
実験手法―残留ＲＮＡ及び他の溶解性不純物を除去することによってプラスミドＤＮＡをさらに精製するため、以下の仕上げプロセスを開発し、高次コイルＤＮＡ及び幾らかの残留塩からなる最終的な粉末化した生成物を生じた。粉末化した生成物は、液体製剤中再懸濁できる。
【０１０２】
本発明の新規の下流濃縮／仕上げ処理を示すために使用される出発溶液は、米国特許出願第０９／８７５，３７９号（上述）に記載のＬＲＡ後のろ液である。溶液の組成は、３ＭＮａＣｌ、１．０ｍｇ／ｍＬの精製されたＤＮＡ及び幾らかの残留ＲＮＡである。ＰＥＧ８０００分子量（Ｆｌｕｋａ）を使用して、ＤＮＡを沈殿させ、３０００ないし１０，０００の分子量範囲を検討した。ＬＲＡ後のろ液をまず２０℃に加温し、中程度の速度（５０ｒｐｍ）で撹拌バーを使用して撹拌した。最終溶液濃度が８％（ｗ／ｖ）になるまで、約３３％（ｗ／ｖ）の濃縮ストック溶液としてＰＥＧ８０００を１５分かけて添加した。沈殿物を２時間寝かした後、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の０．４５ミクロンの中空のファイバー膜の接線流フィルターを使用して濃縮した。膜上での負荷は、膜の面積１ｍ^２あたり１８０ｇのＤＮＡであった。再循環速度は、９Ｌ／ｍ^２／分であり、流量を２．５Ｌ／ｍ^２／分で調節した。２０×濃度に到達するまで、透過を調節し、濃縮した保持液をその後、５透析容積のための１．２ＭのＮａＣｌ中の８％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００に対して透析ろ過した。この保持液を回収し、膜の４．５Ｌ／ｍ^２の容積で１．２ＭのＮａＣｌ中の８％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００を使用して膜を洗浄した。この洗浄を保持液産物と組み合わせることができる。２００度数のエタノールの１当量の表面下の添加によって、最終的な保持液を５０％（ｖ／ｖ）エタノールまで調整した。エタノール添加の間、沈殿したスラリーを十分に撹拌したままにし、エタノールの「ホットスポット」の形成を回避した。２５０ミクロンの３１６Ｌステンレス鋼（ＳＳ）フィルタースクリーンが装備されたフィルター乾燥機中で、この溶液を約３０ｇ／Ｌの沈殿したＤＮＡスラリーまで濃縮した後、６透析容積のための２００度数のエタノールに対して透析ろ過し、流量は３．２Ｌ／ｍ^２／分に調節した。スラリーを懸濁したままにするために、この透析ろ過の間、中程度の撹拌を使用した。フィルターの負荷は０．３ｋｇＤＮＡ／ｍ^２であったが、この数は不十分負荷のフィルターを使用して実施した実験から得られたため、この負荷は下限値であると考慮されるべきである。ろ過後、粉末を真空下で、２５ないし３７℃で２４時間乾燥させた。
【０１０３】
分析方法―２６０、２８０、及び３２０ｎｍの波長での紫外線分光法によって、ＤＮＡ濃度を得た。ＤＮＡは、２６０ｎｍの波長での１吸収単位あたり５０（μｇ／ｍＬ）^−１（ｃｍ）^−１の消衰係数を有する。純度を評価するために、２６０／２８０ｎｍの比を算出した。１ｃｍ経路長のクォーツ微量キュベットへ試料（５００μＬ）を負荷した。フーリエ変換赤外分光法（「ＦＴＩＲ」）を使用して、ＰＥＧ濃度を評価した。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイによって、ＲＮＡ濃度を評価した。
【０１０４】
ＰＥＧにより沈殿したスラリーの濃縮（ＴＦＦでの精密ろ過法を含む第一のろ過／透析ろ過工程）―ＰＥＧ沈殿の後、接線流ろ過（「ＴＦＦ」）モードでの精密ろ過法、続く透析ろ過を介する第一の濃縮工程（図６Ｂ参照）を使用して、生成物の作業容積を低下させ、沈殿後の溶液中に残留するいずれもの残留ＲＮＡ及び非生成物可溶性物質を除去した。透析ろ過緩衝液は、透析ろ過中にプラスミドＤＮＡが沈殿したままになっていることを確かにするために適切なＰＥＧ濃度及び塩濃度であるべきである。例えば、透析緩衝液が従来の沈殿工程において使用されているＰＥＧのほぼ同一の百分率（例えば、上述の実施例中の８％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ）及び約１．２ＭのＮａＣｌを含有する場合、プラスミドＤＮＡは沈殿したままである。上述の実施例条件において、ＮａＣｌ濃度が１．２Ｍをはるかに下回って低下する場合、ＤＮＡを沈殿したままにするためにさらなるＰＥＧが必要であり得る。実験は、１００ｍＭと６００ｍＭの間のＮａＣｌの最小の必要な塩濃度が、５０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液中でＤＮＡを沈殿したままにするのに必要であることを示している。従って、上限の６００ｍＭのＮａＣｌ近くで操作するため、第一透析ろ過後の塩濃度は、少なくとも１．２ＭＮａＣｌである必要がある。１．２ＭＮａＣｌの値は、その後のエタノール添加工程のためにも十分効果がある。
【０１０５】
本明細書に記載のＰＥＧ沈殿、それに続く精密ろ過法／透析ろ過工程は、ＲＮＡの相当な低下を示す。表３は、上述の精製処理の１．２ＭのＮａＣｌ中の８％ＰＥＧに対する第一の透析ろ過工程にわたるＲＮＡクリアランスを示す。表４は、ＰＥＧ沈殿工程にわたる総クリアランスを示す。表３は、ＲＮＡのほとんどが初期の透析容積の後に除去され、第三の値まで定量可能な限界を下回ることを示す。表４は、残留ＲＮＡがほぼ２対数まで低下することを示す。この低下は、ＲＮＡの供給濃度がより高い場合、おそらくより大きくなる。最終生成物のＲＮＡ濃度は、Ｌ．Ｏ．Ｄ．近くであった。
【０１０６】
【表３】

【０１０７】
【表４】

【０１０８】
ＰＥＧクリアランス（第二ろ過／透析ろ過工程）―プラスミドＤＮＡを濃縮し不純物を除去するための、第一ろ過（すなわち精密ろ過法）並びにＰＥＧ及びＮａＣｌに対する透析工程の後、２００度数のエタノールを１５分かけて供給することによって、５０％（ｖ／ｖ）エタノールになるように、プラスミドＤＮＡ生成物を調整した。これにより、沈殿の特徴を容積排除から脱水機序まで変化させ、沈殿したＤＮＡの物理的特性をゲル状の物質からより硬質のほとんど圧縮できない沈殿物へと変化させる。得られた沈殿は、第二のろ過工程での良好な流量及び高い負荷容量に至る多孔性構造へと充填する。異なるエタノール濃度が、調整工程について可能であるが、約３０％（ｖ／ｖ）と８０％（ｖ／ｖ）の間の範囲内のエタノール濃度が好ましい。３０％の危険性を下回る濃度は、ＤＮＡを溶液へと再溶解する一方、８０％を上回る濃度は、ＤＮＡとともに塩を沈殿し始める。
【０１０９】
第二ろ過工程後の２００度数のエタノールに対する透析ろ過（図６Ｂ参照）を使用して、溶液中のいずれもの残留ＰＥＧを除去し、粉末をさらに脱水し、できるだけ多くの塩を除去した。撹拌されたセルモードのもとでのフィルター乾燥機システムでのろ過の後、２００度数のエタノールに対する６×透析ろ過によって、エタノールで調整されたフィードを５０ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ濃度まで低下させた。上述の実施例において、フィルター負荷は、０．３ｋｇ ＤＮＡ／ｍ^２であったが、この負荷は、使用されたフィルターの設定は不十分負荷であるため、下限値であると考慮される。フィルターを通じての流量を、３．２Ｌ／ｍ^２／分で調節した。最終ＰＥＧ濃度をＦＴＩＲによってアッセイしたとき、全ての読み取りは検出限界を下回った（０．０５％ＰＥＧ未満）。湿潤粉末をその後回収し、２５ないし３７℃で真空乾燥した。乾燥した生成物中に過剰の塩が残留する場合、硬く光沢があり、再溶解するのが非常に困難になる。
【０１１０】
検査されたプラスミドＤＮＡの最終収率は、９０％を超えており、約９０％のＤＮＡ、５％のＮａＣｌ、残留水、残留エタノール、及びおそらくは残留ＰＥＧの純度を有する。
【実施例４】
【０１１１】
アルコールによるプラスミドＤＮＡ沈殿
材料及び方法―米国特許出願第０９／８７５，３７９号（上述）で記載の方法により、以下の実験に使用されるプラスミドＤＮＡを精製した後、表記の濃度になるように希釈した。エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、塩化ナトリウム及び酢酸ナトリウムをＦｉｓｈｅｒから購入した。渦巻撹拌で混合した検査チューブの実験において、プラスミド溶解性データを得た。沈殿剤をプラスミド溶液へ添加した後、シリンジフィルターを使用して上清試料を採取し、ろ過した試料中のプラスミドの濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓによる紫外線プレートリーダーで測定した。アルコールは紫外線光を吸収するため、ＳｐｅｅｄＶａｃを使用してアルコールを含有する全ての試料を乾燥させ、測定前に水中で再溶解した。ジクロロフルオレセインを指示薬として使用して、硝酸銀で滴定することによって、塩化ナトリウムイオン濃度を測定した。
【０１１２】
エタノールによるプラスミド沈殿―図９Ａは、３３、５０及び６７％のエタノールレベルで、１．８Ｍと３．４Ｍの間のＮａＣｌ供給濃度で回収されたプラスミドＤＮＡ溶解性データを示す。急激な溶解性の低下が、３０％エタノールと３３％エタノールの間で生じた。３０％エタノールで、プラスミドは、使用される塩濃度では沈殿しなかった。３３％以上のエタノールで、溶解性は、０．５ｇ／Ｌの初期のプラスミド濃度に関して約９９％の沈殿収率に対応した。エタノール添加前に基づいて全てのＮａＣｌ濃度を報告し、その報告は、最終溶液中のＮａＣｌ濃度が報告されたものよりも低かったことを意味する。図９Ａは、１．８ないし３．４Ｍのエタノール添加前濃度でのプラスミド溶解性に及ぼすＮａＣｌの効果がほとんどないことを示す。しかしながら、ＮａＣｌを使用しないとき、７０％の過剰量のエタノール濃度が、１．０ｇ／Ｌのフィード原液を使用して溶液からプラスミドを沈殿し始めるのに必要であることを観察した。従って、ＮａＣｌは、明らかにプラスミド溶解性にある役割を担っている。
【０１１３】
これをさらに探究するため、ＮａＣｌのより低い濃度を、エタノールの様々な濃度とともに使用した。結果を図９Ｂに要約する。点線は、沈殿が生じなかった場合の各溶液に関して存在するプラスミド濃度を表す。この値は、供給プラスミド濃度が一定のままであるため、エタノールレベルとともに変動する。明確な「塩析」効果を観察する。図９Ｂの結果は、ろ過したＤＮＡから塩を洗浄する重要性を提示する。例えば、プラグタイプの洗浄がほとんどなされない場合、低塩及び低アルコールの組み合わせが生じ得、プラスミドを再溶解する。プラスミドを溶解せずに塩化ナトリウムを除去する洗浄プロトコールの開発を援助するため、様々なエタノール組成でのＮａＣｌの溶解度を測定した。このデータを図１０に示す。
【０１１４】
イソプロパノール（「ＩＰＡ」）によるプラスミド沈殿―表５は、ＩＰＡ−ＮａＣｌ系の限界値を検査する実験に関して集められた全ての溶解度データを要約する。アルコール添加前に基づいて、ＮａＣｌ濃度を報告する。９５％超の収率が観察される条件を灰色で強調する。アルコール又は塩の濃度の増大がまず、プラスミド溶解度の低下を生じたことは明白である。しかしながら、高いアルコール濃度又は塩濃度では、さらなる添加が溶解度を増大させた。
【０１１５】
【表５】

【０１１６】
図１１は、２つのＩＰＡ濃度でのＩＰＡ−ＮａＣｌ系に関する「塩析」及び「塩溶」の極値を示す。この図は、塩のみの効果を示すが、表５は、この効果が一定の塩濃度でのＩＰＡに関しても達成されることを示す。これらの結果は、タンパク質沈殿に対して類似であり、そこでは静電遮蔽が「塩析」を生じるが、十分な濃度のカオトロープは「塩溶」を生じる。このことは、ＤＮＡ沈殿が塩基対間の分子間疎水性相互作用の結果であることを示す。穏やかにカオトロピックのＮａＣｌを使用して得られる結果と比較して、コスモトロープである酢酸ナトリウムを有するＩＰＡ中のプラスミドの溶解度を、様々な条件で測定した。図１２及び１２Ｂは、本実験の結果を要約する。６７％エタノールで、酢酸ナトリウムの存在は、プラスミドの溶解度を低下させるが、他の百分率点では、プラスミド溶解度は、ＮａＣｌの等しい濃度を用いた場合と比べて、酢酸ナトリウムを用いた場合に、実際により高い。
【０１１７】
メタノールによるプラスミド沈殿―１ないし３ＭのＮａＣｌと組み合わされた３３％及び５０％のメタノール濃度では、プラスミドを沈殿することができなかった。これは、プロセスへの使用に関してメタノールが望ましくなくなるが、６７％ではプラスミドを沈殿できた。表６は、これらの結果を表示する。「塩析」現象は、はっきりと明白である。
【０１１８】
【表６】

【０１１９】
アルコール沈殿実験の要約―３ＭのＮａＣｌを含有するプラスミド溶液へエタノールを添加すると、プラスミド溶解度の急激な低下が、３０％と３３％の間のエタノール濃度で生じる。３３％以上のエタノールで、０．５ｇ／Ｌのプラスミド溶液に関する溶解度をベースとした収率は、約９９％である。水−エタノール混合物中で、ＮａＣｌの濃度の増大は、プラスミドの溶解度を低下させる（すなわち「塩析」）。水−ＥＰＡ混合物中で、塩析濃度を超える塩の添加は、溶解度を増大させる（「塩溶」）。コスモトロピックの酢酸ナトリウムを置換するとき、塩析及び塩溶の両効果は低減した。メタノールには、高濃度の塩溶液からプラスミドを沈殿させる能力があるが、５０％超の溶媒レベルを必要とする。
【実施例５】
【０１２０】
最終的なＤＮＡ仕上げプロセス：アルコール沈殿
上述のように、ＴＦＦモードでのプラスミドＤＮＡのＰＥＧ沈殿及び精密ろ過法は、大規模プラスミドＤＮＡ精製処理の最終濃縮／仕上げ工程において限外ろ過を置換する実行可能な選択肢である。米国特許出願第０９／８７５，３７９号（上述）に記載の初期の開発作業は、エタノールが、沈殿溶媒として利用でき、プラスミドＤＮＡの乾燥粉末形態を獲得できることを示した。しかしながら、速度はゆっくりで、ケーキの極度の圧縮は、段階的な洗浄勾配を適用するにもかかわらず明白であった。本実施例は、精密ろ過法によって増大されるアルコール沈殿を特徴とするプラスミドＤＮＡの精製されたバルクの粉末形態を調製するための処理を記載する。本アプローチを強化するものとして、精密ろ過法と同時の連続的な沈殿が、バッチ法と比較して容器の容積を有意に低下させ得る。
【０１２１】
材料及び方法―実施例４の「材料及び方法」を参照してほしい。圧力ゲージ及び０．４５μｍシリンジフィルターつきのＰｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ精密ろ過カートリッジを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。真空ろ過装置及び膜をＦｉｓｈｅｒから購入した。
【０１２２】
バルクのプラスミド粉末を調製するための段階的なろ過／透析ろ過処理―プラスミド沈殿に関して必要な条件を溶解度データが一度確立した時点で、ろ過による沈殿した粉末の回収を試行した。
【０１２３】
メタノールに対するその少量の容積の必要性及びＩＰＡに対するその頑強性のため、沈殿のための最適な溶媒としてエタノールを選択した。
【０１２４】
沈殿したプラスミドをろ過する第一の試行において、０．８６ｇ／Ｌプラスミド及び３ＭＮａＣｌを含有するＬＲＡ後のろ液溶液２００ｍＬへエタノール１３４ｍＬをゆっくり添加し、４０％（ｖ／ｖ）エタノールの最終濃度を生じた。枝つきフラスコ及びフィルター面積が２．１ｃｍ^２の０．２ミクロンの膜フィルターを使用して、ろ過を試行した。枝つきフラスコに真空２０ｉｎを供給した。初期のろ過試行は、ろ過が進行するにつれ、流量の有意な低下を示し、ゲル状のフィルターケーキを形成した。使用されたフィルターは、酢酸セルロース及び硝酸セルロースからなるＦｉｓｈｅｒブランドの膜であった。図１３は、この懸濁液を使用する実験中に回収されるろ過データを示す。もとの４０％（ｖ／ｖ）エタノール濃度でデータを採取し、５０％（ｖ／ｖ）の濃度を生じるためにエタノールを添加した後に再度採取した。時間／容積（ｔ／Ｖ）対容積（Ｖ）のプロットにおける比較的に真っ直ぐな線は、ほぼ非圧縮性のケーキを示す。５０％エタノールによる有意に高いろ過速度を観察する。本データを使用して、直径５フィートのフィルター（１９．６平方フィートの膜面積）を使用する大規模バッチろ過に必要な時間を概算した。算出された概算値は、４０％エタノールを使用する場合には２４３時間であり、５０％（ｖ／ｖ）エタノールを使用する場合には４４時間である。これらの実用的でないろ過時間のため、大きな面積の接線流ろ過（「ＴＦＦ」）膜を代替法として検討した。
【０１２５】
沈殿したプラスミドの精密ろ過法での第一の試行には、０．２２μｍのＰＶＤＦ膜を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ ＴＦＦカートリッジを使用した。整流装置のついたガラス混合容器中で撹拌されたプラスミド溶液へエタノールをゆっくり添加することによって沈殿を達成し、４０（ｖ／ｖ）エタノールの濃度に到達した。プラスミド溶液の初期のＮａＣｌ濃度は３Ｍであった。沈殿剤を２時間かけて添加し、約３０分寝かした後、３０ｍＬ／分の再循環流速を使用して、精密ろ過法を試行した。図１４Ａは、経時的に回収された透過液の容積を示す。沈殿した懸濁液中のＤＮＡの初期濃度も、各データセットに関して示す。懸濁液は、１５ｍＬ／分で簡単にろ過し、実験の時間経過にわたって透過液流量に減少はなかった。供給圧力ゲージは、ろ過を通じて約１０ｐｓｉｇの読み取りを維持した。本結果は、固体を膜表面から自由に除去し、ケーキ層を形成しなかったことを示す。初期懸濁液の容積は、各場合において５００ｍＬであった。
【０１２６】
スラリーを脱水してろ過及び乾燥に適するようにするため、濃縮した懸濁液をその後、エタノールの高濃度に対して透析ろ過した。この透析ろ過は、単離前及びフィルター乾燥機中での乾燥の前にどのようなＮａＣｌも除去する。プラスミドは８０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液中で不溶性であるため、８０％（ｖ／ｖ）での透析ろ過を使用して、懸濁液からＮａＣｌを除去できる一方、プラスミドが不溶性である条件を維持できる。図１４Ｂは、透析ろ過中のエタノール及び塩の濃度を示し、図９Ｂは、エタノール濃度が８０％（ｖ／ｖ）に到達する前の残留する塩の少量が、再溶解からプラスミドを保護することを示す。ろ過を通じてのエタノール濃度でのＮａＣｌ溶解度も示す。沈殿した懸濁液の透析ろ過において、透過液の流量は、約１５ｍＬ／分で一定のままであった。
【０１２７】
乾燥粉末を調製する第一試行において、約４ｇ／ＬのＤＮＡになるように濃縮した後、８０％（ｖ／ｖ）エタノールの２つの容積に対してプラスミド懸濁液を透析した。その後、２５ｍｍ直径、０．２ミクロンのＰＥＳ膜での真空ろ過により、固体を回収した。一晩乾燥させた後、生成物の様相は、８９．４％エタノールでのエタノール／水の共沸混合物により、塊状になった。湿潤ケーキのエタノール濃度が共沸混合物の組成よりも低かったため、水の組成は乾燥中に濃縮され、固体を塊にした。その後の調合の試行も８０％（ｖ／ｖ）エタノールによる透析ろ過後のろ過を使用したが、その後、純粋なエタノールによる幾度ものケーキ透析ろ過洗浄を付加して、ケーキ中に残留する８０％（ｖ／ｖ）エタノールを置換した。洗浄は、湿潤ケーキ中のエタノールレベルが乾燥前の共沸混合物組成を超過することを確実にした。粉末を、３７℃で一晩真空乾燥させた。残りの材料は、乾燥した、自由に流動する白色粉末であった。水中の材料を再溶解し、２６０ｎｍでの吸光度を測定すると、粉末は９７％の純度であることが示された。沈殿及び精密ろ過に関する収率は９３％であった。
【０１２８】
要約―エタノール（４０ないし５０％（ｖ／ｖ））を使用して沈殿させたプラスミドの真空ろ過は、ゲル状にもかかわらず、ほぼ非圧縮性のケーキを生じたが、ろ過速度は受容できないほどゆっくりであり、接線流ろ過の必要性を示した。沈殿したプラスミドを濃縮した後（アルコール透析ろ過により）脱水するために、接線流精密ろ過法を首尾よく使用した。全量ろ過及びアルコールの多いスラリーの洗浄は実用的となり、真空乾燥によって自由に流動する粉末を生じた。沈殿、精密ろ過法、回収及び乾燥の組み合わせた工程に関する収率は９３％であり、固体は（Ａ_２６０による）９７％純度であった。研究室規模で観察される流量に基づいて、本処理は、膜面積２１５平方フィートを使用して８時間で４０，０００Ｌのバッチに関して実施できた。
【実施例６】
【０１２９】
プラスミドＤＮＡの連続的なアルコール沈殿及び精密ろ過法：容器及びアルコール容積の縮小
バッチモードでのプラスミド沈殿は、沈殿に必要なバッチ容積及びエタノール量の両者を保持するのに十分大きな容器を必要とする。精密ろ過法がアルコールを同時に除去して一定の容積を維持する比較的小さな中間的な容器へと、供給物及びエタノールの両者が連続的に汲み出され得る場合、大きな沈殿容器はもはや必要ではなく、高い溶媒比で沈殿が実施される場合でさえ不要である。このモードにおいて、溶媒廃棄物は、透過液を連続的に蒸留し、沈殿容器へとリサイクルすることによって最小化できる。
【０１３０】
エタノール回収のない連続的な沈殿／精密ろ過アプローチをまず、限外ろ過及び精密ろ過の両膜を使用して試行した。これらの実験において、エタノールを、撹拌した容器中のフィード溶液へゆっくり添加して、約４０％（ｖ／ｖ）のアルコール濃度に到達することによって、最初の５００ｍＬの沈殿した懸濁液を調製した。粒子は、約３０分かけて完全に脱水できた。ろ過面積５０ｃｍ^２のＰｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ ＴＦＦカートリッジを使用して、得られた懸濁液の精密ろ過を実施した。懸濁液の容積が一度約３００ｍＬまで低下すると、供給溶液及びエタノール溶液を添加して、懸濁液の容積を一定に維持した。図１５Ａは、１００ｋＤのＰＥＳ膜を使用する連続的な沈殿／精密ろ過に関するデータを示す。ろ過カートリッジに対する供給流速は、３０ｍＬ／分であった。図が示すように、透過液約２００ｍＬを連続処理の間に回収した後、流量は、その初期値の約２０％まで低下した。０．２２μｍカートリッジを使用する試行において、同様の流量の低下を観察した。カートリッジを経由する圧力の上昇は、添加開始直後に明らかであった。圧力のこの上昇は、観察されたバッチ精密ろ過においては存在しない。この試行は、大きさ１４、内径５／１６”の柔軟なＭａｓｔｅｒｆｌｅｘチューブを使用し、ろ過中に供給物及びエタノールを添加した。この柔軟なチューブは、バッチ沈殿に使用される細いチューブよりも大きかった。
【０１３１】
精密ろ過が成功裏に実施できるためには、先立って脱水時間が必要であるように考えられるため、容器とフィルターとの間の保持容積は、粒子が膜に到達する前に乾燥しきることができる時間のずれを作成することによって、ろ過速度を改善し得る。沈殿容器とフィルターとの間のチューブの長さを挿入して、３０ｍＬ／分の流速で１分の時間のずれを作成することによって、この理論を研究室規模で検査した。図１５Ｂは、容器とフィルターとの間の１分の時間のずれを挿入した試行に関するデータを示す。この試行は、４０％（ｖ／ｖ）エタノール及び３０ｍＬ／分へ設定された供給ポンプも使用したが、この場合、０．１ミクロンのＰＶＤＦ膜を使用した。時間のずれを伴う処理が、２００ｍＬの透過液の容積を上回って、図１５Ａで見られるよりも小さな流量％の損失を示すことは明白である。しかしながら、図１５Ａのデータよりも初期速度はゆっくりである。時間のずれを作成するために使用されるチューブの長さが、ペリスタポンプのスリップを生じ、撹拌した容器からの流速を低下させる摩擦抵抗をもたらすことが起こり得る。カートリッジを経由した迅速な圧力の増大を、ろ過中の供給物及びエタノールの添加のために１４サイズのＭａｓｔｅｒｆｌｅｘチューブも使用したこの試行に関して再度観察する。
【０１３２】
図１５Ｃは、エタノール濃度を５０％（ｖ／ｖ）に上昇させ、一方で図１５Ｂと同一の時間のずれの設定を使用した実験に関するデータを示す。この試行において、透過液流量のゆっくりとした低下は、４０％（ｖ／ｖ）エタノール試行から幾分小さくなったが、圧力の増大はさらにより劇的であった。圧力の増大により実行できなくなった３０分後にのみろ過を停止した。この試行はまた、ろ過中の供給物及びエタノールの添加のために１４サイズのＭａｓｔｅｒｆｌｅｘチューブを使用した。
【０１３３】
図１５ＡないしＣの迅速な圧力増大は、半連続的沈殿／精密ろ過処理の実行可能性に関する問題である。透過液の速度が受容可能である場合でさえ、望ましいスラリー濃度に到達する前にチャネル閉塞によって生じる圧力の増大は、ろ過を終結させる。チャネル閉塞は大きな水和した粒子によって生じるようである。連続処理アプローチの間により小さな粒子を作製する試行において、ろ過の間に供給物及びエタノールを添加するために、先行実験で使用された５／１６”のＭａｓｔｅｒｆｌｅｘチューブに替えて、細いＨＰＬＣチューブを使用した。図１６Ａは、ＨＰＬＣチューブを使用して、供給物及び４０％（ｖ／ｖ）エタノールを時間のずれなく添加した試行に関するデータを示す。カートリッジを介する圧力の増大は、先行実験ほどには劇的ではなく、図１５Ａに示すように、時間のずれのない先行実験と比較して相対的な流量の低下を改善する。細いチューブを出るより高い直線速度が、プラスミド溶液へのより細かなアルコール分散を生じ、それによりアルコールの局所的な過剰を回避するようである。アルコールの組成が不均一であるため、一連の沈殿及び再水和が生じ、膜チャネルを閉塞し得る大きな粘着性のある粒子が生じる。図１６Ｂは、５０％（ｖ／ｖ）エタノールによる同様の試行に関するデータを示す。透過液流量のゆっくりとした低下の速度は、５０％（ｖ／ｖ）エタノールでのより迅速な脱水により、図１６Ａよりも非常にゆっくりである。より高い溶媒濃度での性能の改善は、沈殿のためにエタノールを多量に使用する他の生成物に対して良好な兆しである。
【０１３４】
要約―プラスミド沈殿容器のサイズは、一定の容積を維持するように、同一の容器から精密ろ過を同時に実施しながら、撹拌した容器へエタノール及びプラスミド溶液を連続的に添加する連続的な処理によって縮小できる。このアプローチに付随して、透過液の連続的な蒸留は、沈殿への濃縮したエタノールのリサイクルを提供し、必要な溶媒容積を最小化し、より高くより好ましくさえあるアルコール濃度で沈殿を可能にする。精密ろ過及び限外ろ過の両膜を使用する連続沈殿／ろ過の実験運転において、バッチ沈殿後に得られる定常な透過液の流量とは対照的に、透過液の流量が低下した後、定常速度に到達した。バッチの場合とは対照的に、カートリッジを介する圧力の増大も観察した。ＬＡＳＥＮＴＥＣによるバッチの沈殿の粒子サイズのモニタリングは、たぶん凝集及び脱水が同時に起こることを反映するアルコールの添加後約１５分の寝かし時間をとって、粒子の平衡サイズを増大させる必要があることを示す。新たに形成された孔を目詰まりさせる粒子は接線フィルターへ直ちに引き抜かれるので、連続処理アプローチにおいて、この寝かし時間を提供できなかったことが、流量値の低下の原因と説明し得る。連続沈殿／精密ろ過アプローチにおける容器とフィルターとの間の粒子の寝かしを可能にする１分間のホールドアップ量の追加により、透過液の流量を改善した。半連続的アプローチの間の供給物及びエタノールの添加のためのより小さな直径のチューブの使用は、カートリッジを介する圧力を低下させ、流量も改善させた。細いチューブ口を出る液体のより高い直線的な速度は、バルクの懸濁液へのエタノール及び供給物の分散を改善しているようであり、これにより迅速に脱水し膜チャネルを詰まらせない、より均一でより小さな粒子を供給する。
【実施例７】
【０１３５】
ｐＨシフトされたＤＮＡ可溶化液への剪断
材料及び方法―７Ｌのジャケット付きガラス容器に、目的の高次コイルプラスミドＤＮＡを含有するＯＤ_６００＝３００のＥ．コリ細胞２Ｌを懸濁して、ＳＴＥＴ緩衝液中ＯＤ_６００＝７０にした。これに、組換えリゾチーム５００単位／ｍＬを添加し、３７±２℃に加温した。回収した細胞を、この可溶化緩衝液中で少なくとも２時間温置した。材料約５Ｌをさらなる研究のために採取し、残りの４．７Ｌを利用して、３００フィート／分から２０００フィート／分までの尖端速度を用いて、増加した剪断速度へこの可溶化液を暴露した。速度を最終的な尖端速度２０００ｆｔ／分まで、増大させる前に、各尖端速度で材料を１０分間保持した。最後に、尖端速度を３００ｆｔ／分まで低下させ、ｐＨ１２の可溶化液を一晩混合した。
【０１３６】
結果―本発明の上流の可溶化／可溶化液清澄化プロセスの実施（すなわち、リゾチームの可溶化／ｐＨシフト／ＰＥＧ凝集）による可能性ある分解問題を判断するため、多様な尖端速度へ暴露したｐＨ１２の可溶化液の剪断感度を測定した。表７は、ＤＮＡ濃度（ｇ／Ｌ）及び０．８％アガロースゲルによって測定された高次コイルプラスミドＤＮＡ含有量の百分率（「％ＳＣ」）を定量した結果を示す。尖端速度が２０００フィート／分に増大するまで、高い総ＤＮＡ濃度及び高次コイルプラスミドＤＮＡの百分率を維持した。従って、２０００フィート／分までの尖端速度ではプラスミドＤＮＡに対する損傷を記録せず、本発明の一部として開示される可溶化技術が、可溶化容器中でＤＮＡを剪断せずに宿主細菌細胞を可溶化するのに十分であることを示した。
【０１３７】
【表７】

【実施例８】
【０１３８】
プラスミドＤＮＡの精製
可溶化／可溶化液の清澄化―目的のプラスミドＤＮＡを含有するＥ．コリ細胞を、まず、ＳＴＥＴ緩衝液（５０ｍＭトリス、１００ｍＭのＥＤＴＡ、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び８％（ｗ／ｖ）スクロース、〜ｐＨ８．２）中で、ＯＤ_６００が約７０になるまで懸濁する。組換えリゾチームを１１６７Ｕ／ｍＬで添加し（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、混合物をまず３７±５℃にした後、２時間温置した。温置が完了した後、１時間かけて、５ＮＮａＯＨを可溶化液へ添加して、最終濃度を０．２４Ｎにし、１時間温置させた。０．５ないし１時間かけて、２．５Ｎ酢酸を添加することによって、溶液をｐＨ８．０±１．０に戻した。可溶化液をその後、５０％（ｗ／ｖ）スラリー（１５０ｍＭのＮａＣｌ中）に１時間かけて３．７％（ｗ／ｖ）になるまで添加したＰＥＧ６０００により凝集させた。凝集した可溶化液の清澄化を遠心分離（例、Ｓｈａｒｐｌｅｓ ＡＳ２６遠心分離機）により実施し、凝集した細胞細片を除去する（バッチの遠心分離も選択肢の一つであるが）。遠心分離後の濁度は３０ＮＴＵ未満である。遠心分離後のより低い値を望む場合、仕上げのろ過を使用して、残留する細胞細片を除去するのに役立てられる。例えば、約７０Ｌ／ｍ^２の負荷でＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＤＥ４０又はＣＥ５０デプスフィルターを有する１２インチのＣｕｎｏろ過ハウジングを使用して、１０ＮＴＵ未満の濁度に到達することができる。
【０１３９】
さらに、特に下流のＬＲＡＩＩろ過を実施する場合には、可溶性タンパク質及びエンドトキシンを除去するために、ＣＴＡＢ低カット沈殿工程を約０．１５％（ｗ／ｖ）まで実施することが可能である。これは、４０ｍＭのＮａＣｌ中の２％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢを、凝集した可溶化液へ１時間かけて添加してホストスポットろ過を防止することによって実施できる。材料はその後、上述の清澄化のために使用できる状態となる。
【０１４０】
ＣＴＡＢ沈殿―高次コイルプラスミドＤＮＡを、清澄化した宿主細胞可溶化液から、１０ｇ／ＬのＣｅｌｐｕｒｅ Ｐ３００（珪藻土）の存在下で０．５０％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢにより誘導される単一の沈殿工程により沈殿させる。４０ｍＭのＮａＣｌ中の２％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ溶液を、清澄化した可溶化液へ２時間かけて添加し、ホットスポット形成を防止する。可溶化液をろ過し、フィルターケーキをまず、５０ｍＭのＮａＣｌ含有の５％ＩＰＡのバッチ容積の４分の１で洗浄する。その後、５０ｍＭのＮａＣｌのバッチ容積の１０分の１で、フィルターケーキを洗浄する。ＣＴＡＢ及びＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００のミセルは、ＤＮＡ沈殿の原因である。遊離ＣＴＡＢを上回るプラスミドＤＮＡに関するＣＴＡＢ／ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ミセルの選択性の増大は、二本鎖ＤＮＡの主鎖上でのリン酸塩の電荷の配置によるミセル中でのＣＴＡＢの電荷の整列による。洗浄したケーキをその後、再溶解工程へ持ち込む。
【０１４１】
再溶解及びケイ酸カルシウムバッチ吸着―再溶解は、ＣＴＡＢ沈殿したＤＮＡ含有ケーキを、撹拌したフィルタータンクから手動で取り出すことを必要とする。このケーキをその後、３ＭＮａＣｌ中に再懸濁し、１．２ｇ／ＬのＤＮＡ濃度にする（ここで、該標的ＤＮＡ濃度は、約０．３ないし約１．２ｇ／Ｌの範囲であり得る。）。当初の３ＭＮａＣｌ負荷は、１ｇのＤＮＡあたり２５ｇのＬＲＡＩＩを含有し、最小４時間温置する。この最初のＬＲＡＩＩ温置は、段階的な処理で実施でき、ここで、１ｇのＤＮＡあたり１２．５ｇのＬＲＡＩＩの初期負荷を最小４時間温置した後、１ｇのＤＮＡあたり１２．５ｇの２回目のＬＲＡＩＩをさらなる時間（最小６時間）温置する。懸濁した材料をその後、濃度に関して（例、ＡＥＸアッセイ）、及びゲル電気泳動（６０Ｖで３０ないし５０分間のＥゲルでの泳動）によってアッセイする。この当初の温置工程の後、Ｅゲル電気泳動によって８５％ＳＣを下回る高次コイルの各百分率点について１ｇのＤＮＡあたり０．５ないし０．７５ｇのＬＲＡＩＩを添加する。この混合物を一晩寝かせ、濃度及び高次コイルになった百分率に関してバルクを再度アッセイする。材料が８５％ＳＣを超える場合、ろ過を開始し、８５％ＳＣを超えない場合、より多くのＬＲＡＩＩを添加する。
【０１４２】
バルク溶液中のＣｅｌｐｕｒｅ及びＬＲＡＩＩの総量に比例する膜面積を有する１２インチのＣｕｎｏハウジング（高さ４）を使用して、再溶解したプラスミドＤＮＡ溶液をろ過する。一般に、Ｃｅｌｐｕｒｅ又はＬＲＡＩＩ１ｇは、容積〜４ｍＬまでを必要とする。ＬＲＡ及びＣｅｌｐｕｒｅの総量に基づいて、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＣＥ５０深層ろ過カートリッジ（１２ｉｎ円、６セル）の適切な数を、上述のＣｕｎｏフィルターハウジングにおいて利用する。ろ過が完了した後、３ＭＮａＣｌの十分量を負荷して、ハウジングを充填し、３０分間再循環させる。この材料を保存し、洗浄を反復する。これらの洗浄工程は、Ｃｅｌｐｕｒｅ及びＬＲＡＩＩケーキに伴われているプラスミドＤＮＡの大きな百分率を回収するためである。第二のＬＲＡＩＩ処理のために、材料をその後、別のタンクの中に置く。
【０１４３】
第二のケイ酸カルシウムバッチ吸着―第二のＬＲＡＩＩ温置を実施し、残留するＥ．コリ宿主細胞ＤＮＡの実質的な除去を確実にする。１ｇのＤＮＡあたり約１０ｇのＬＲＡＩＩをプラスミド溶液へ添加し、４時間温置する。その後、ゲル電気泳動（Ｅゲルで６０Ｖで３０ないし５０分間）により溶液をアッセイし、高次コイルプラスミドＤＮＡ純度が９０％超に到達するまで２時間ごとに、１ｇのＤＮＡあたり２ｇでＬＲＡＩＩを負荷し、その後の各添加の前にアッセイする。この第二のＬＲＡＩＩ段階が、単一の３０”の０．４５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅフィルターを保持する１ないし２のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｅｒｉｅｓ ２０００ハウジングを利用する場合、ろ過は、適切なケーキ容量を有し、下流工程への水和したケイ酸カルシウムのバイパスを防止する。
【０１４４】
ＰＥＧに基づく沈殿及びエタノール粉末化―ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加による沈殿工程後の２つの個別のろ過／透析ろ過工程は、ＤＮＡ精製処理における最後の仕上げ工程である。５０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ６０００溶液を第二のＬＲＡＩＩろ液へ添加して、最終濃度を１０％（ｗ／ｖ）にし、１．２ＭのＮａＣｌの最終的な塩濃度に調製した。中空ファイバーのＭＦ膜工程を使用して第一のろ過工程を実施し、沈殿したスラリーを濃縮し、残留ＲＮＡ及び不純物を清澄化する。その後、５透析容積のための１．２ＭのＮａＣｌ中の１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００に対して、濃縮したスラリーを透析ろ過する。撹拌したフィルター容器をベースとした第二ろ過工程を使用して、その後、保持液をさらに濃縮する。まず、２００度数のエタノール１当量を３０分かけて表面下で添加することによって、５０％（ｖ／ｖ）エタノールになるように保持液を調整し、ＰＥＧをエタノールと置換し、ＤＮＡを脱水する。その後、２５μｍの孔サイズのステンレス鋼スクリーンを使用してユニットの中で溶液を濃縮し、６透析容積のための２００度数のエタノールに対して透析ろ過する。最終的なエタノール沈殿した生成物を真空乾燥して、ＤＮＡの微細な粉末形態を得る。粉末バルクが一度生じると、材料は再懸濁できる（例、５ないし９ｇ／Ｌ）。１５００ｍＬ／分／ｍ^２の流速で約４００ｇ／ｍ^２の負荷でＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｐａｋ ２００フィルター（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ）を使用して、再懸濁したＤＮＡ溶液のろ過滅菌を実施できる。
【０１４５】
代表的な処理の収量／不純物（除去）データ―２つのＤＮＡプラスミドであるプラスミドＡ及びプラスミドＢに関する上述の処理の収量は、プラスミド１７．２ｇ及び１９．０ｇであった（図１７Ａ及びＢ参照）。図１７Ａは、両生産運転の高次コイルプラスミドＤＮＡの総収量を示し、図１７Ｂは、処理の時間経過にわたる重要な不純物レベルを示す。本アッセイ結果は、全ての重要な不純物が、アッセイの定量化レベルを下回って低下したことを示す。
【実施例９】
【０１４６】
細菌細胞採集手法
採集工程の目的は、精製において使用するために、目的の生体分子（高次コイルプラスミドＤＮＡを含むが、これに限定されるわけではない。）を含有する宿主細胞（細菌細胞、例えば、Ｅ．コリを含むが、これに限定されるわけではない。）を濃縮し、洗浄することである。この実施例は、目的の高次コイルプラスミドＤＮＡを保持するＥ．コリ宿主細胞の回収を記載する。
【０１４７】
５００ＭＷＣＯ（ＵＦＰ−５００−Ｅ−７５）の６×３．７ｍ^２のＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（旧Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈ）の、平行に置かれた中空ファイバーカートリッジ（合計２２．２ｍ^２）を操作する。重要なパラメータは、膜通過圧力（「ＴＭＰ」）、入り口圧、交差流速、濃縮因子及び流量である。回収時の培養物の光学密度は８０ないし１００のＯＤ_６００の範囲に及び容積生産性は約１ｇプラスミド／Ｌである。回収時に、発酵槽ブロスを１０℃未満に冷却する。精密ろ過及び分散を通じて、保持容器及び／又は保持回線の冷却によってこの温度を維持する。調節バルブによって保持液背圧を制御することによってＴＭＰを初期的に１０ｐｉｓｇに維持することによって、採集工程を操作する。交差流速を５０ｍＬ／分／ファイバー（２２．２ｍ^２には３００ＬＰＭ）に設定する。バッチが濃縮されると、供給圧力は増大する。供給圧力が２５ｐｓｉｇ（ＴＭＰ〜１５ｐｓｉｇ）に到達すると、〜２５ｐｓｉｇの供給圧力を維持する必要のため、交差流速は低下する。濃縮因子は、ＯＤ_６００測定結果と相関する乾燥細胞重量（ＤＣＷ）に基づく。３００の最終的なＯＤ_６００は、精製のための目標である。開発運転において得られた８０ないし１００の当初培養物のＯＤ_６００に基づいて、３ないし４倍の濃縮因子が必要である。
【０１４８】
目的の濃縮因子に到達するまで、又は（多量のバイオマス培養の場合）有意な流動性低下を観察されるまで、濃縮を実施する。流動性レベル限界値は、濃縮の終了のかぎとするために定義できる。濃縮の終了時に、リン酸ナトリウム溶液（ＲＣＭ６３５―０．１２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム（無水Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、１ｍＭ塩基性リン酸ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４１水和物））の約４透析容積を使用して、透析ろ過を実施し、濃縮した細胞を洗浄する。濃縮時に目的の濃縮因子に到達しなかった場合、透析ろ過終了時にバッチをさらに濃縮する。濃縮及び透析ろ過は、ブロスのタンクへの供給速度を調整して透過液の速度を補正することによって、保持液容器中で定常液体レベルを維持しながら、供給及び滲出モードで実施すべきである。
【０１４９】
透析ろ過の終了時において、細胞ペーストは、分配の間、１０℃未満にて十分に混合された状態で維持されるべきである。一定分量を、２ＬのＮａｌｇｅｎｅ瓶又は８ＬのＳｔｅｄｉｍバッグのいずれかに分配し、その後の保存のために−６０℃未満に凍結する。ドライアイス槽又は直立型冷凍庫中での静止凍結が、許容される凍結方法である。
【０１５０】
宿主細胞の回収に使用される処理装置の仕様の例を表８に列挙する。この例において、保持液容器と命名される６００Ｌ容器は、処理できる材料の量を制限する。３×の最小濃縮因子を仮定すると、培養物約１２００Ｌの最適な処理容積を回収し得る。この容積は、透析ろ過前の濃縮されたペーストの任意の希釈のための、タンク中における十分な上部空き高を確保にする。１２００Ｌの培養物容積による膜への負荷は、５４Ｌ／ｍ^２であろう。
【０１５１】
【表８】

【０１５２】
バッチのための濃縮因子はブロス光学密度のプロセス中の測定および濃縮後の約３００のＯＤ_６００の目的を基礎に算出されることが推奨される。この例を使用する場合、１２００Ｌの当初培養物容積は、下流処理のための細胞ペースト３００Ｌ超を生成する。バッチをまず少なくとも３倍に（又は多量のバイオマス培養物の場合、流量低下を観察するまで）濃縮した後、リン酸ナトリウム溶液の４透析容積で透析ろ過し、最終的に３００のＯＤ_６００の最終標的まで濃縮する。緩衝液最小１６００Ｌが透析ろ過に必要であり、さらなる４００Ｌが使用前の膜調整に必要とされる。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１は、２日間にわたって沈降させたＥ．コリ細胞可溶化液を示している。ボトル１中の可溶化液は、ＳＴＥＴ緩衝液（本明細書中に定義されている。）中に細胞を再懸濁し、２０℃にてリゾチームと共に（５００Ｕ／ｍＬ）温置することによって作製された。ボトル２中の可溶化液は、リゾチーム温置後に、ｐＨ１２までｐＨを上昇させるために第一の塩基が添加され、次いで、ｐＨを中和するために酸が添加されたことを除き、ボトル１中の可溶化液と同様である。ボトル３中の可溶化液は、３％のＰＥＧ３０００を含有するＳＴＥＴ緩衝液中に細胞を再懸濁し、２０℃にてリゾチームと共に温置することによって作製された。ボトル４の可溶化液は、アルカリｐＨシフトを誘導し、続いて中和を誘導するために、リゾチーム温置後に、ボトル２について記載されているとおりに塩基及び酸を順次添加したことを除き、ボトル３中の可溶化液と同様である。この図は、アルカリ可溶化液由来の細胞細片に対する凝集剤としてのＰＥＧの可能性を示している。
【図２】図２は、４５の当初ＯＤ_６００を有する様々な細胞可溶化液を含有し、及び１６，０００×ｇで５分間遠心された５０ｍＬの遠心管を示している。チューブ１中の可溶化液は、ＳＴＥＴ緩衝液中に細胞を再懸濁し、２０℃でリゾチームと共に温置することによって作製された。リゾチーム温置後にアルカリｐＨシフト及びその後の中和（図１に対して上述されているとおり。）に供されたことを除き、チューブ２中の可溶化液はチューブ１中の可溶化液と同じである。チューブ３中の可溶化液は、３％のＰＥＧ３０００を含有するＳＴＥＴ緩衝液中に細胞を再懸濁し、２０℃でリゾチームと共に温置することによって作製された。リゾチーム温置後にアルカリｐＨシフト及びその後の中和に供されたことを除き、チューブ４中の可溶化液はチューブ３中の可溶化液と同じである。アルカリｐＨシフト／中和工程後にＰＥＧが添加されたことを除き、チューブ５中の可溶化液はチューブ２中の可溶化液と同じである。アルカリｐＨシフト／中和工程後に５％のＰＥＧ３０００の最終濃度が添加されたことを除き、チューブ６中の可溶化液はチューブ２中の可溶化液と同じである。
【図３】図３は、図２に示されている可溶化液についての濁度測定を示す。Ｌｙｓ＝リゾチーム；ＰＳ＝ｐＨシフト；ＰＥＧ ＳＴＥＴ＝３％ＰＥＧ３０００＋ＳＴＥＴ。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、Ｅ．コリ細胞細片の凝集に対するＰＥＧ分子量の効果を示している。リゾチームの存在下で細胞を温置し、アルカリｐＨシフト／酸中和に供した。異なる分子量（ＰＥＧ４００−６０００）のＰＥＧ原溶液を、可溶化液の１０ｍＬ分取試料に添加して、約１．０％と１５．０％の間の最終ＰＥＧ濃度を達成する。得られた混合物を、約１６時間、室温で沈降させた後、ＯＤ_６００測定を行った（図４Ａ）。図４Ｂは、ＰＥＧ３０００のみを用いた検討について、ＯＤ_６００依存性及び溶液中のＤＮＡ濃度のプロットを示している。
【図５】図５は、リゾチーム／ｐＨシフトされた可溶化液中のＰＥＧ６０００の漸増濃度（０−８％ｗ／ｖ）に対するプラスミドＤＮＡ沈殿曲線を示している。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、大規模なプラスミドＤＮＡ精製プロセスの２つの最終濃縮／仕上げ操作の一般的なプロセスフロー図を比較している。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、異なるＰＥＧ溶液中でのＤＮＡの溶解度を図示している。図７Ａは、ＰＥＧ濃度が２％ｗ／ｖ超である場合に、ＰＥＧ８０００の溶液中のＤＮＡの溶解度が急減することを示していて、調べた範囲について溶液の温度又はＤＮＡ濃度に起因するＤＮＡ溶解度への影響は存在しない。図７Ｂは、研究した範囲について、ＤＮＡが４００ＭＷ ＰＥＧ中で完全に可溶性であるが、分子量が増加するにつれて、ＤＮＡを沈殿させるのに必要なＰＥＧの臨界質量が減少することを示している。
【図８】図８は、ＰＥＧ８０００溶液中でのＤＮＡ沈殿の速度論を図示している。図８は、約５分後に、当初ＤＮＡの９９％超が沈殿することを示している。
【図９】図９Ａ及び９Ｂは、プラスミドＤＮＡの水−エタノール混合物中溶解度データを示している。ＮａＣｌの濃度は、エタノールを除いた濃度に基づいている。図９Ａは、１．８〜３．４ＭのＮａＣｌ濃度は、プラスミドの溶解度に対して殆ど影響がないことを示している。図９Ｂでは、エタノールの様々な濃度を用いてＮａＣｌのより低濃度を研究した。破線は、沈殿が起こらないときに、各溶液について存在するであろうプラスミド濃度を表している。
【図１０】図１０は、様々なエタノール濃度でのＮａＣｌの溶解度を示している。
【図１１】図１１は、２つのＩＰＡ濃度でのＩＰＡ−ＮａＣｌ系についての「塩析」及び「塩溶」の極限を表している。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、塩化ナトリウム及び酢酸ナトリウム塩を加えた、２５％（Ａ）又は６７％（Ｂ）ＩＰＡ中でのプラスミド溶解度を図示している。
【図１３】図１３は、３ＭのＮａＣｌ溶液から沈殿されたプラスミドＤＮＡについてのデッドエンドろ過データのＶ_ｍａｘプロットを示している（０．２２ミクロンセルロース膜、２．１ｃｍ^２ろ過面積、２０インチＨｇ真空）。このろ過データは、まず、最初の４０％エタノール濃度から得られ、次いで、再び、５０％の濃度を得るためにエタノールを添加した後に得られた。ｔ／Ｖ対Ｖプロット中の相対的にまっすぐな線は、ほぼ非圧縮性のケーキを示している。５０％エタノールを用いると、有意により高いろ過速度が観察される。
【図１４】図１４Ａは、沈殿されたプラスミドの精密ろ過の間に経時的に収集された透過液の容量を示している。沈殿された懸濁液中のＤＮＡの当初濃度が、各データセットについて示されており、当初の懸濁液容量は５００ｍＬであった。懸濁液は１５ｍＬ／分で容易にろ過され、実験中、透過液の流量は減少せず、ろ過の全体を通じて、１０ｐｓｉｇの圧力測定値を維持した。図１４Ｂは、８０％ｖ／ｖエタノールを加えた沈殿されたプラスミド懸濁液の透析ろ過中のエタノール及びＮａＣｌ濃度を示している。
【図１５】図１５Ａ−Ｃは、ろ過時にフィード及びエタノールの添加をするためのＭａｓｔｅｒｆｌｅｘサイズ１４（５／１６’’）導管を用いる接線流ろ過（「ＴＦＦ」）条件下での精密ろ過の間に試みた３つの連続的アルコール沈殿を示している。図１５Ａは、１００ｋＤのＰＥＳ膜を使用し、４０％ｖ／ｖエタノールで沈殿させる連続的沈殿／精密ろ過研究から得られた結果を示している。ろ過カートリッジへのフィード流速は、約３０ｍＬ／分であった。浸透液の約２００ｍＬを集めた後、流量は、その初期値の約２０％まで減少した。図１５Ｂは、０．１ミクロンのＰＶＤＦ膜を使用し、４０％ｖ／ｖエタノールで沈殿させた連続的沈殿／精密ろ過研究から得られた結果を示している。フィード流速は、同じく約３０ｍＬ／分であったが、容器とフィルターの間に１分のラグタイムを導入した。図１５Ｃは、図１５Ｂ中の実験と同様に行われた実験（０．１μｍのＰＶＤＦ膜、１分のラグタイム）から得られた結果を示しているが、プラスミドＤＮＡを沈殿させるために、４０％のエタノールではなく５０％エタノールを使用した。浸透液流量の減少は、４０％ｖ／ｖエタノール実験（図１５Ｂ）から僅かに低下し、圧力の増加により、３０分を超えてろ過実験の実験を継続することは不可能であった。
【図１６】図１６Ａ及び１６Ｂは、ろ過時にフィード及びエタノールを添加するためのＨＰＬＣ導管を用いるＴＦＦ下での精密ろ過を用いて試みた２つの連続的アルコール沈殿を示している。図１６Ａは、４０％エタノール濃度を使用し、ラグタイムを用いない連続的沈殿／精密ろ過を示している。
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂは、実施例８に記載されているプラスミドＤＮＡ精製プロセスを用いた２つの精製操作のプロセス収率（Ａ）及び不純物レベル（Ｂ）を示している。各プラスミドの精製は、ＯＤ_６００＝７０の７５−８０Ｌ、１７．５−１８．６Ｌの発酵から得られたＥ．コリ可溶化液を用いて開始した。図１７Ａは、高次コイルプラスミドＤＮＡのグラムで表した量（「ｓｃＤＮＡ（ｇ）」）及び精製プロセスの様々な段階における高次コイルＤＮＡのパーセント（「％ｓｃＤＮＡ」）を比較している。細胞可溶化液（「Ｌｙｓ」）；宿主細胞細片の凝集後の清澄化された可溶化液（「ＣＬ」）；第一のケイ酸カルシウムバッチ吸着及びろ過後のＤＮＡスラリー（「ＬＲＡ１Ｆ」）、第二のケイ酸カルシウムバッチ吸着及びろ過後のＤＮＡスラリー（「ＬＲＡ２Ｆ」）、並びにＰＥＧ沈殿及びその後の精密ろ過工程の間に粉末化された、再懸濁されたＤＮＡ（「ＦＲＢ」）。図１７Ｂは、図１７Ａに記載されている精製プロセスの同じ段階でのエンドトキシン（ｌｏｇＥＵ／ｍＬ）、タンパク質（％）及びＲＮＡ（％）の量を比較している。
【図１８】図１８は、ＰＥＧ６０００で凝集された細胞可溶化液中の、最終ＣＴＡＢ濃度の関数としてのタンパク質レベル（ＢＣＡアッセイによって測定）を示しており、ここで、ＣＴＡＢは、４０ｍＭのＮａＣｌ中に２％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢを添加することによって、可溶化液中に導入される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する微生物宿主細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、及び
（ｂ）宿主細胞細片を凝集させることによって、前記宿主細胞可溶化液を清澄化すること
を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法。
【請求項２】
前記宿主細胞可溶化液がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）凝集剤により凝集される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）における宿主細胞がリゾチームを含有する標準的なＳＴＥＴ緩衝液中で溶解される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する微生物宿主細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、及び
（ｂ）ＰＥＧで宿主細胞細片を凝集させることによって、前記宿主細胞可溶化液を清澄化すること、
を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法。
【請求項５】
工程（ａ）における宿主細胞がリゾチームを含有する標準的なＳＴＥＴ緩衝液中で溶解される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＳＴＥＴ緩衝液がＰＥＧを含有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＰＥＧが、溶解後に、宿主細胞可溶化液に添加される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ＰＥＧ凝集剤の分子量が約１４５０Ｄａと約１５，０００Ｄａの間にある、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞可溶化液がアルカリｐＨシフトに供され、及び、ＰＥＧの添加前に、その後の中和に供される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
アルカリｐＨシフト及びその後の中和が、宿主細胞可溶化液のｐＨを約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間のアルカリ値に上昇させること、及び、その後、前記細胞可溶化液のｐＨを約ｐＨ７と約ｐＨ９の間の値に低下させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＥＧが、連続的遠心条件下で、前記アルカリシフトされ、中和された宿主細胞可溶化液に供給され、上清中に高次コイルプラスミドＤＮＡを有する凝集された細胞細片の沈殿物を取得する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞可溶化液がアルカリｐＨシフトに供され、及び、ＰＥＧの添加後に、その後の中和に供される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
アルカリｐＨシフト及びその後の中和が、ＰＥＧ含有宿主細胞可溶化液のｐＨを約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間のアルカリ値に上昇させること、及び、その後、前記可溶化液のｐＨを約ｐＨ７と約ｐＨ９の間の値に低下させることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）生理的緩衝溶液中で、高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する微生物宿主細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、
（ｂ）前記可溶化液のｐＨを約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間のｐＨまで上昇させることにより、工程（ａ）の宿主細胞可溶化液をアルカリｐＨシフトに供すること、
（ｃ）アルカリシフトされた工程（ｂ）の細胞可溶化液を、概ね、溶解緩衝液のｐＨまで中和すること、
（ｄ）ＰＥＧで宿主細胞細片を凝集させることによって、工程（ｃ）の細胞可溶化液を清澄化すること、及び
（ｅ）工程（ｄ）の前記凝集された宿主細胞細片を除去し、可溶性高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する溶液上清を取得すること、
を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法。
【請求項１５】
工程（ａ）の生理的溶解緩衝液が標準的なＳＴＥＴ緩衝液である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細片及び非高次コイルプラスミドを沈殿させるために、工程（ｄ）及び（ｅ）の間に界面活性剤によって誘導される沈殿工程が追加され、細胞可溶化液をさらに清澄化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
界面活性剤が、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、及び
（ｂ）接線流ろ過モード下での精密ろ過によって、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮すること、
を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法。
【請求項１９】
高次コイルプラスミドＤＮＡが、アルコール及びＰＥＧからなる群から選択される沈殿剤を用いて、工程（ａ）において沈殿される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
高次コイルプラスミドＤＮＡがＰＥＧによって沈殿される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記沈殿された高次コイルＤＮＡが、
（ａ）接線流ろ過の下での精密ろ過を含む第一のろ過工程と、
（ｂ）高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿された状態に保つのに十分なＰＥＧ及び塩を含有するＰＥＧ含有透析ろ過緩衝液に対する第一の透析ろ過工程と、
（ｃ）沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡがエタノールの添加によって部分的に脱水される脱水工程と、
（ｄ）第二のろ過濃縮工程と、並びに
（ｅ）１００％（ｖ／ｖ）エタノールに対する第二の透析ろ過工程と、
を含む段階的ろ過プロセスにおいて濃縮される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｂ）の前記透析ろ過緩衝液が、約１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００と約１．２ＭのＮａＣｌを含有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡが、エタノールの添加により、約５０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで部分的に脱水される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第二のろ過濃縮工程が、撹拌された細胞フィルター乾燥機中で起こる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
高次コイルプラスミドＤＮＡがエタノールによって沈殿される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡが、
（ａ）接線流ろ過の下での精密ろ過を含む第一のろ過濃縮工程と、
（ｂ）エタノール溶液中のエタノールの濃度が前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿された状態に保つのに十分であるエタノール溶液に対する第一の透析ろ過工程と、
（ｃ）第二のろ過濃縮工程と、並びに
（ｄ）１００％（ｖ／ｖ）エタノールに対する第二の透析ろ過工程と、
を含む段階的ろ過プロセスによって濃縮される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｂ）のエタノール溶液中のエタノールの濃度が約８０％（ｖ／ｖ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第二のろ過濃縮工程が、撹拌された細胞フィルター乾燥機中で起こる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）ＰＥＧで高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、
（ｂ）接線流ろ過下での精密ろ過によって、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮すること、
（ｃ）エタノールの添加により、前記濃縮され、沈殿されたＤＮＡを部分的に脱水すること、及び
（ｄ）撹拌された細胞フィルター乾燥機中で前記部分的に脱水され、沈殿されたＤＮＡを濃縮すること、
を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法。
【請求項３０】
（ａ）生理的緩衝溶液中にて、高次コイルプラスミドＤＮＡを含有する微生物宿主細胞を溶解し、宿主細胞可溶化液を形成すること、
（ｂ）ＰＥＧ凝集剤で宿主細胞細片を凝集させることによって、前記宿主細胞可溶化液を清澄化すること、
（ｃ）ＰＥＧにより前記高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、及び
（ｄ）接線流ろ過モード下での精密ろ過によって、前記沈殿された高次コイルプラスミドＤＮＡを濃縮すること、
を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法。
【請求項３１】
工程（ａ）中の前記宿主細胞が標準的なＳＴＥＴ緩衝液中で溶解される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
宿主細胞可溶化液がアルカリｐＨシフトに供され、及び、ＰＥＧ凝集剤の添加前に、その後の中和に供される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
アルカリｐＨシフト及びその後の中和が、宿主細胞可溶化液のｐＨを約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間のアルカリ値に上昇させること、及び、その後、前記可溶化液のｐＨを概ねアルカリシフト以前のそのｐＨまで低下させることを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）発酵ブロスから微生物宿主細胞を採集すること、
（ｂ）生理的溶解溶液の十分量の中で宿主細胞を溶解させること、
（ｃ）前記可溶化液のｐＨを約ｐＨ１２と約ｐＨ１３の間のｐＨまで上昇させることにより、宿主細胞可溶化液をアルカリｐＨシフトに供すること、
（ｄ）アルカリシフトされた細胞可溶化液を、概ね、溶解緩衝液のｐＨまで中和すること、
（ｅ）ＰＥＧの添加により宿主細胞細片を凝集させることによって、工程（ｄ）の細胞可溶化液を清澄化すること、
（ｆ）前記凝集された宿主細胞細片を除去すること、
（ｇ）ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドによって誘導される沈殿を用いて、高次コイルプラスミドＤＮＡを選択的に沈殿させること、
（ｈ）最適化されたイオン強度の、及び水和され、結晶化されたケイ酸カルシウムをさらに含有する十分に確定された緩衝液中に前記高次コイルプラスミドＤＮＡを再溶解し、及び不純物を吸着させること、
（ｉ）水和され、結晶化されたケイ酸カルシウムによって誘導される第二の吸着により、残りの不純物を吸着させること、
（ｊ）ＰＥＧで高次コイルプラスミドＤＮＡを沈殿させること、
（ｋ）接線流ろ過モード下での精密ろ過によって、前記沈殿された高次コイルＤＮＡを濃縮すること、
（ｌ）エタノールの添加により、前記沈殿された高次コイルＤＮＡを部分的に脱水すること、
（ｍ）撹拌された細胞フィルター乾燥機で前記脱水された高次コイルＤＮＡを濃縮すること、並びに
（ｎ）エタノールを除去するために乾燥させること、
を含む、大規模な微生物発酵の細胞可溶化液から高次コイルプラスミドＤＮＡを精製する方法。
【請求項３５】
前記微生物細胞が標準的なＳＴＥＴ緩衝液中で溶解される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
細片及び非高次コイルプラスミドを沈殿させるために、低カットヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドによって誘導される、工程（ｅ）及び（ｆ）の間の沈殿工程が追加され、細胞可溶化液をさらに清澄化する、請求項３４に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【公表番号】特表２００８−５２８０３５（Ｐ２００８−５２８０３５Ａ）
【公表日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５３２８３（Ｐ２００７−５５３２８３）
【出願日】平成１８年１月２７日（２００６．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００３０１５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８３７２１
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ　＆　ＣＯＭＰＡＮＹ　ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】