プロテアーゼ活性を有する抽出物
本発明は、ペプチド結合の加水分解によってタンパクを分解するプロテアーゼ活性を実質的に有するストレブラスアスパー（Ｓｔｒｅｂｌｕｓ ａｓｐｅｒ）のタンパク様抽出物を含む組成物を開示する。本発明によるストレブラスアスパーのタンパク様抽出物は、食品加工業界で食肉改質剤及び凝乳剤として、並びに、洗剤の製造時に添加剤としての使用に好適である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、タンパク様組成物に関する。更に詳細には、本発明は、プロテアーゼ活性を実質的に有するストレブラスアスパー（Ｓｔｒｅｂｌｕｓ ａｓｐｅｒ）のタンパク様抽出物を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解によってタンパクを分解する酵素である。タンパク分解性酵素は、医薬、皮革の軟化、洗濯用洗剤、及び食品加工の分野で実用されている。食品業界では、プロテアーゼは、焼いた食品、ビール及びワイン、シリアル、乳、肉の軟化、魚加工品、及び豆で用いられていると共に、タンパク加水分解物及びフレーバー抽出物の製造に用いられている。
【０００３】
食品加工で用いられているプロテアーゼには、チーズ製造用の凝乳酵素がある。乳を凝固させてチーズにするためには、凝乳酵素を加えて乳を液状に保つタンパクを分解しなければならない。更に詳細には、タンパクが変性又は改質されると乳はその液体構造を失って凝固し始める。
【０００４】
レンネットという皺胃（仔ウシの第四胃）から得られる凝乳酵素が長年、チーズの製造に用いられている。仔ウシのレンネットから抽出される主な酵素はキモシンである。しかし、仔ウシのレンネットは高価であると共に、キモシンの原料をもたらす仔ウシの慢性的な不足が原因となって入手が困難である。
【０００５】
動物、植物、及び微生物起源の様々な凝乳酵素が、キモシンの代替物として同定されており、チーズ製造における試験が行われている。それでも今なおキモシンの代替物として実際に用いられる凝乳酵素は、ペプシン（動物由来）と、各種糸状菌、例えばクリ胴枯病菌（Ｅｎｄｏｔｈｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）、ムコールプシルス（Ｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、及びムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）由来の微生物レンネットのみである。
【０００６】
米国特許第４，５２６，７９２号には、チーズの製造にＲ．ミエヘイ（Ｒ． ｍｉｅｈｅｉ）を微生物レンネットとして用いることが開示されている。Ｒ．ミエヘイはキモシンを含有していないが、その代わりに、機能の面でキモシンと似ている酸性プロテアーゼを含有している。
【０００７】
凝乳酵素を抽出及び精製する方法が数多く知られており、その一例としてアフィニティゲルクロマトグラフィーを行った後に吸着した酵素を溶出するものが挙げられる。例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉらの“Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍｉｌｋ−ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｂｙ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−（ｏｒ Ｎ−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌ）−ｐｅｐｓｔａｔｉｎ−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｇａｒｏｓｅ” Ａｎａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２２： ３０８−３１２ （１９８２）には、Ｎ−アセチルペプスタチンを親和性リガンドとして用いるアフィニティゲルカラムを利用して、Ｒ．ミエヘイから微生物レンネットを精製することが教示されている。また、Ｄｅａｄらの“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｒｉａｚｉｎｅ ｄｙｅｓ，” Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， １６５： ３０１−３１９ （１９７９）、及びＢｕｒｇｅｔｔらの“Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３ＧＡ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”， Ａｍ． Ｌａｂ．， ９（５）： ７４， ７８−８３ （１９７７）に開示されているように、酵素はＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３ＧＡ（「ＣＢ」）を用いるアフィニティゲルカラムで分離することもできる。いずれの文献にも、例えばキナーゼやヌクレアーゼなどの酵素をＣＢカラムで分離することが説明されている。米国特許第４，７４３，５５１号には、青色色素の親和性リガンドを用いると共に、吸着したレンネットを溶出して、精製Ｒ．ミエヘイレンネットを生成することが記載されている。
【０００８】
近年の研究では、植物誘導体であると共に、環境に優しい新たな凝乳酵素の発見に焦点が当てられている。ストレブラスアスパー（Ｋｅｓｉｎａｉ）の葉の抽出物はプロテアーゼ、すなわち凝乳因子を含有することが分かっており、レンネットの代替物となる可能性がある。
【０００９】
したがって、プロテアーゼ活性を実質的に有するストレブラスアスパーの抽出物を含む組成物を提供することは有益である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４，５２６，７９２号
【特許文献２】米国特許第４，７４３，５５１号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、“Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍｉｌｋ−ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｂｙ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−（ｏｒ Ｎ−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌ）−ｐｅｐｓｔａｔｉｎ−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｇａｒｏｓｅ” Ａｎａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２２： ３０８−３１２ （１９８２）
【非特許文献２】Ｄｅａｄら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｒｉａｚｉｎｅ ｄｙｅｓ，” Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， １６５： ３０１−３１９ （１９７９）
【非特許文献３】Ｂｕｒｇｅｔｔら、“Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３ＧＡ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”， Ａｍ． Ｌａｂ．， ９（５）： ７４， ７８−８３ （１９７７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ペプチド結合の加水分解によってタンパクを分解するプロテアーゼ活性を実質的に有するストレブラスアスパーのタンパク様抽出物を含む組成物に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の効果は、食品加工業界で食肉改質剤及び凝乳剤として、並びに、洗剤の製造時に添加剤として用いるのに好適なストレブラスアスパーのタンパク様抽出物を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】ストレブラスアスパー（Ｋｅｓｉｎａｉ）のタンパク様抽出物の７０００倍の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。
【図１Ｂ】ストレブラスアスパー（Ｋｅｓｉｎａｉ）のタンパク様抽出物の３０，０００倍の透過電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）である。
【図２】精製プロテアーゼのドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動像（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。
【図３Ａ】精製プロテアーゼのタンパク分解活性の最適温度を示すグラフである。
【図３Ｂ】精製プロテアーゼの温度安定性を示しているグラフである。
【図４】添加された塩化カルシウムの濃度がストレブラスアスパー（Ｋｅｓｉｎａｉ）のタンパク様抽出物による凝乳時間に及ぼす作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、プロテアーゼ活性を実質的に有するＫｅｓｉｎａｉ、すなわちストレブラスアスパーのタンパク様葉抽出物に関する。
【００１６】
未精製の葉抽出物を調製すると望ましくない非常に濃い褐色となるため、この褐変を防止すれば、本発明の葉抽出物の有用性を高めることができる。褐変を防止し、かつ、許容可能な色の粗抽出物を得るために、クエン酸、Ｌ−システイン、及びメタ重亜硫酸ナトリウムのような褐変防止剤が用いられる。これによって葉抽出物の主な問題が解決されたと共に、その凝乳剤、食肉改質剤、及び洗剤業界用の添加剤としての潜在的な有用性が高まった。
【００１７】
メタ重亜硫酸塩は、本発明の葉抽出物の酵素による褐変に対する有効な防止剤であることが分かった。メタ重亜硫酸塩は、２ｍＭの濃度で褐変を防止し、得られた抽出物は褐色抽出物の褐色凝固体と比べると白い凝乳であった。得られた抽出物は、８５℃まで熱安定性があり（最適温度は７０℃）、その最適ｐＨは７．２である。６ｍＭの添加塩化カルシウムは、凝乳活性に最適であった。
【００１８】
酵素による褐変の防止と、粗抽出物の特性評価がうまくいくことにより、凝乳の生理化学的特性、凝乳プロテアーゼの精製及び特性評価を検証する基礎が形成される。凝乳プロテアーゼの使用は、チーズ製造に不可欠な工程である。凝乳の強度、シネレシス及び収率は、用いるレンネットの種類によって大きく左右される。テクスチャーはチーズの最も重要な特徴の１つであり、凝乳の種類によって影響を受けることがある。テクスチャーの相違は、凝乳の網構造に関連している。テクスチャー特性を調べるには粗抽出物の微細構造とシネレシスが、レンネット代替物としての凝乳プロテアーゼの潜在的適合性の評価に有用である。このために、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）及び透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）での検査用にストレブラスアスパー（Ｋｅｓｉｎａｉ）を用いて新鮮な牛乳から凝乳を調製した。これらの検査により、凝乳の有孔度、テクスチャー及びシネレシスを定量化した。
【００１９】
最後に、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６、ＭＯＮＯＱ ＨＲ ５／５を用いたＦＰＬＣイオン交換、及びＲｏｔｏｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いた等電点電気泳動法（ＩＥＦ）による限外ろ過（ＵＦ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）ゲルろ過によって、Ｋｅｓｉｎａｉから得られた粗酵素抽出物を精製した（精製倍率２５、回収率１８％）。
【００２０】
図２によると、精製されたプロテアーゼはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で一つのバンドとして現れ、分子量は３１．３ｋＤａであった。この精製プロテアーゼの特性評価を行ったところ、最適ｐＨが７．２であるセリンプロテアーゼであり、ｐＨ５．０〜９．５の範囲で安定的であり、等電点（Ｐｌ）が５．２であり得ることが示された。この精製プロテアーゼは８５℃まで熱安定性があり、最適温度は７０℃である。電気泳動像解析によって、プロテアーゼ活性が凝乳活性と関連することが示された。Ｋｅｓｉｎａｉプロテアーゼは、短期熟成チーズ類の製造に用いることができる。
【００２１】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例１】
【００２２】
葉抽出物の調製
新鮮なストレブラスアスパーの葉を洗浄し、室温にて０．５〜１０ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウムを含む２００ｍｌの１００ｍＭトリス−ＨＣＬバッファー（ｐＨ６〜９）中でホモジナイズした。このホモジネートをろ過し、１０，０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離した。その上清を粗酵素抽出物として回収した。粗酵素抽出物を限外ろ過し、室温にて、４３ｍｍの円形膜によって、攪拌セルＡｍｉｃｏｎ ８０５０を用いて濃縮した。濃縮物およびろ液を別々に回収した。続いて、基質として１００ｍＭのトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）中のアゾカゼイン（０．０５％（重量／体積））を用いて、プロテアーゼ活性を特定した。１００μｌの酵素を１ｍｌの基質で１時間、室温にてインキュベートした。３００μｌのトリクロロ酢酸を加えることによって反応を停止させた。続いて、この混合物を遠心分離し、上清を回収し、その吸光度をブランクとしての基質とバッファーとの混合物に対して測定した。４１０ナノメートルで吸光度の変化を測定し、１．０単位＝０．０１の吸光度単位の変化として酵素活性を表した。
【００２３】
塩化カルシウムを新鮮な乳に溶解させて１〜１０ｍＭの塩化カルシウム濃度とすることにより、塩化カルシウムが凝乳時間に及ぼす作用を調べた。塩化カルシウムを加えなかった新鮮な乳をコントロールとして用いた。乳（２ｍｌ）を５分間、６５℃のウォーターバス中で粘度調節してから、２００μｌの粗葉抽出物を加えた。ウォーターバスを振盪することなく、この乳と酵素との混合物を上記の設定温度にてインキュベートした。図４を参照すると、塩化カルシウムを１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、及び１０ｍＭの濃度で新鮮な乳に加えたところ、凝乳活性が向上した。凝乳活性は、加えた塩化カルシウムの濃度が６ｍＭになるまでは塩化カルシウム濃度の上昇と共に向上し、６ｍＭを超えた濃度では、凝乳活性の向上度は小さかった。
【００２４】
この実施例では、メタ重亜硫酸ナトリウムが粗葉抽出物の酵素による褐変を防止する作用を調べた。このため、上記の方法によって調製した粗抽出物の色を（分光光度計で吸光度単位を測定することによって）測定するとともに、凝乳活性を測定した。
【実施例２】
【００２５】
凝乳活性の決定
本発明の葉抽出物が１２．５％の還元乳を凝固させるのに要する時間を測定することによって、凝乳活性を決定した。サンプルを予め６５℃で５分間インキュベートしてから、２００μｌの当該葉抽出物を加え、この混合物を６５℃でインキュベートした。１５秒毎にチューブを約４５°傾けた。凝乳の最初の可視的兆候が見えるまでに要した時間を凝乳時間として記録した。凝乳活性の１単位は、上記の測定条件下で１分間に１ｍｌの乳を凝固させることであり、比凝乳活性は、１ｍｇのタンパク当たりの活性単位である。沸騰させた酵素をコントロールとして用いた。
【００２６】
表１に示される測定結果より、抽出バッファー中で１０ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウムを用いることにより許容可能な色の粗抽出物が得られた。メタ重亜硫酸塩を用いて調製した抽出物では、プロテアーゼ活性を保持する高い凝乳活性が示された。メタ重亜硫酸ナトリウムは、食品業界において多機能性添加剤として広く用いられていると共に、化学保存料として用いても安全なもの（ＧＲＡＳ）として認識されている。葉抽出物の褐変を防止する目的でこの調査で用いる亜硫酸塩のレベルは低く、乳と葉抽出物との混合物の官能検査では検出されないであろう（前記混合物における亜硫酸塩のレベルは３８ｐｐｍ（パーツパーミリオン）であり、官能検査における亜硫酸塩の最小閾値は約５０ｐｐｍ（パーツパーミリオン）である）。
【００２７】
得られた粗葉抽出物の最適ｐＨは７．２であり、この粗葉抽出物は広範なｐＨで安定である。この粗葉抽出物は熱的に安定であり、最適温度は７０℃である。
【００２８】
表１ 各種濃度のメタ重亜硫酸ナトリウムが粗葉抽出物の褐変に及ぼす作用
【表１】
【実施例３】
【００２９】
凝乳の調製
凝乳の調製のために、０．２ｍＭの塩化カルシウムと、２ｍｇの脱色したストレブラスアスパー（ｋｅｓｉｎａｉ）抽出物を１００ｍｌの新鮮な牛乳に加えた。続いて、凝乳が形成されるまで、この混合物をインキュベートした。調製した凝乳を小片にカットし、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）と透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。ＳＥＭ写真及びＴＥＭ写真の分割区域の孔を定量化することによって、上記の凝乳の有孔度を決定した。テクスチャーについては、テクスチャーアナライザーを用いることによって凝乳強度を決定した。
【００３０】
サンプルの体積を測定してから、ろ過によって凝乳から分離できた乳清の体積を測定することによって、シネレシスの程度を決定した。
【００３１】
上記の凝乳をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。その結果は、以下のように観察された。
【００３２】
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で調べたところ、本発明の葉抽出物の凝乳の微細構造は、スポンジ様であった。本発明の葉抽出物によるスポンジ様構造網の形成は、葉抽出物中のフェノール化合物に起因するカゼインミセル間の新たな架橋結合に加えて、本発明の葉抽出物の性質及びタンパク分解特性によるものであった。
【００３３】
本発明の葉抽出物は、有孔度が低く、カゼイン網の密度が高い凝乳を生成させることが分かった。図１ａ及び図１ｂを参照すると、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）による有孔度定量結果においても、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）による有孔度定量結果においても、Ｋｅｓｉｎａｉの凝乳の有孔度が低いことが示された。カゼインのシーズ収率への寄与には、それ自体の重量に加えて付随する水分とミネラルが含まれるので、これは、チーズの製造において望ましい特性である。また、放出される乳清（乳の血清相）も少なくなる。
【００３４】
凝乳と乳清の硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動像（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、本発明の葉抽出物のタンパク分解活性が高いことが示された。
【実施例４】
【００３５】
ｋｅｓｉｎａｉの凝乳プロテアーゼの精製及び特性評価
（ｉ）高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）ゲルろ過クロマトグラフィー
メタ重亜硫酸ナトリウムを用いてＫｅｓｉｎａｉの葉から調製した粗酵素抽出物をベッドボリューム２０ｍｌの高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）カラムＳｕｐｅｒｐｏｓｅ−６（ろ過の前に、１００ｍＭのトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）で平衡化した）に充填した。
【００３６】
平衡化バッファーによって毎分３ｍｌの流速でタンパクを溶出した。ろ過によって、４．２６倍に精製された（収率６９．８４％）。画分を含むプロテアーゼをプールし、Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５カラムによる高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）イオン交換クロマトグラフィーによって更に精製した。０．３５〜０．４０Ｍの塩濃度でカラムから酵素を溶出した。イオン交換精製工程によって、２３．７６倍に精製された（収率２４．３４％）。イオン交換クロマトグラフィー工程から溶出したプロテアーゼ活性画分をプールし、蒸留水で透析し、Ｒｏｔｏｆｏｒ装置を用いた等電点電気泳動法によって精製した。最終収率１８％で２５．１０倍に精製された。
【００３７】
タンパクベースで、タンパクが１４０倍に回収された。
【００３８】
（ｉｉ）Ｋｅｓｉｎａｉプロテアーゼの特性評価
硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動像（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分子質量を推測した。標準的タンパクのｌｏｇ分子質量対相対移動度の標準曲線をプロットしてから、精製プロテアーゼの相対移動度を用いて、上記の標準曲線から精製プロテアーゼの分子質量を推測した。
【００３９】
この結果は、精製プロテアーゼがおそらく単一のサブユニットからなるモノマーであることを示唆している。図２を参照すると、精製プロテアーゼ（レーン６及び７）の分子質量を決定する電気泳動実験によって、約３１．３ｋＤＡに相当する分子量を有する単一のバンドが示された。このように低いプロテアーゼの分子量は、セリンプロテアーゼの分子量に類似する（セリンプロテアーゼは一般に低分子量であり、通常は１５，０００〜３０，０００である）。
【００４０】
精製プロテアーゼの等電点電気泳動像から精製プロテアーゼの等電点を決定した（プロテアーゼはｐＨ５．２における単一ピークとして溶出され、これに基づき、その等電点（ｐｉ）をｐＨ５．２と推測した）。また、ｐＨ８．３及び室温での電気泳動後でも、Ｋｅｓｉｎａｉ由来の精製プロテアーゼが乳を凝固できることも結果により示された。
【００４１】
５〜９の範囲のｐＨ値、１時間のインキュベーション時間、３７℃における精製プロテアーゼのタンパク分解活性の最適活性ｐＨによって、アゾカゼインの加水分解に最適なｐＨが７．２であることが示された。これらの条件下において、前記酵素のｐＨ６．２における最大活性は６０％であり、当該ｐＨはスターターカルチャーによってチーズ乳が酸性化されるｐＨであると考えられる。
【００４２】
Ｋｅｓｉｎａｉ由来の精製プロテアーゼのｐＨ安定性を決定するため、Ｋｅｓｉｎａｉ由来の酵素を４．５〜９．５の間で変化させたｐＨにて１時間、室温でインキュベートした。その後、残留プロテアーゼの活性を決定した。その結果、室温で１時間インキュベートした場合のプロテアーゼは５〜８．５のｐＨ範囲で安定的であることが示された。この条件では、プロテアーゼは、ｐＨ５において活性の１０％を維持した。
【００４３】
温度がプロテアーゼ活性に及ぼす作用を決定するため、精製プロテアーゼを５分間、５〜９５℃の範囲の温度で平衡化した。続いて、基質（トリス−ＨＣＬバッファー（ｐＨ＝７．２）中のアゾカゼイン、０．０５％ｗ／ｖ）を加えて得た混合物を試験温度で１時間インキュベートし、標準的な測定方法に従って、タンパク分解活性を測定した。図３Ａに示される結果によって、精製プロテアーゼの最適温度が約７０℃であることが明らかになった。
【００４４】
Ｋｅｓｉｎａｉ由来の精製プロテアーゼの温度安定性を決定するため、酵素を５〜９５℃の間で変化させた温度で１時間インキュベートしてから氷中で急冷した。アゾカゼイン（０．０５％ｗ／ｖ）を基質として用いて、残留タンパク分解活性を３７℃で測定した。プロテアーゼの温度安定性を図３Ｂに示す。図３Ｂを参照すると、酵素を１時間インキュベートした場合、７５℃まで安定的であった。８０℃で１時間インキュベートした後の酵素活性は最大活性の４４％、８５℃でインキュベートした後は２６％、９０℃でインキュベートした後では１４％であった。
【００４５】
精製プロテアーゼの温度安定性は、前記精製プロテアーゼが従来の乳及び乳清の低温殺菌条件に耐えられることを示している。これは、レンネット代替物として望ましくない特性である。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明に従ってＫｅｓｉｎａｉから得た粗抽出物は、食肉を適度な軟らかさに改質する食肉改質剤として好適に利用でき、処置した食肉に望ましくない後味を付与することもない。更に、食肉改質剤として用いたときのこの酵素は酵素不活化温度が比較的低いので、家庭用及び産業用として非常に有用であると同時に、温度管理又は不活化が容易である。
【００４７】
また、前記粗抽出物の温度安定性と高いタンパク分解活性は、洗剤業界でも望ましい特性であり、その精製酵素は、洗剤業界のプロセスで有用であり得る。この酵素を洗剤製品で用いると、洗浄温度を低くすることができてエネルギーを節約することができると共に、生体分解性であるために有害な残留物を出さない。この酵素は、汚水処理プロセスに環境的な悪影響を及ぼさず、また、水生生物に対するリスクももたらさない。
【００４８】
ストレブラスアスパーの葉抽出物の褐変は、フェノール化合物とポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）（いずれも潜在的な産業用途がある）が豊富であることを示している。ポリフェノールオキシダーゼは、抗酸化剤としてのフラボノイド由来着色剤の製造、及び水域環境からのエストロゲン物質の除去を含む多くの更なる産業用途において潜在的に有用である。フェノール化合物が豊富な植物抽出物は乳の熱安定性とコロイド安定性を大きく向上させることが新たな証拠により示されていることから、フェノール化合物の豊富な供給源であるストレブラスアスパーの葉抽出物は、濃縮乳の温度安定性とコロイド安定性を向上させるのに有用であり得る。
【００４９】
本発明の実例的な実施形態について詳細に説明してきたが、当業者には、様々な他の修正が明らかであると共に、当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、このような修正を容易に行うことができることが分かる。したがって、添付の特許請求の範囲を上記の実施例及び説明に限定することは意図しておらず、むしろ、特許請求の範囲は、本発明に関連する当業者から本発明の同等物として扱われるすべての特徴を含め、本発明に属するすべての特許性のある新規性の特徴を網羅するものと解釈するように意図されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、タンパク様組成物に関する。更に詳細には、本発明は、プロテアーゼ活性を実質的に有するストレブラスアスパー（Ｓｔｒｅｂｌｕｓ ａｓｐｅｒ）のタンパク様抽出物を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解によってタンパクを分解する酵素である。タンパク分解性酵素は、医薬、皮革の軟化、洗濯用洗剤、及び食品加工の分野で実用されている。食品業界では、プロテアーゼは、焼いた食品、ビール及びワイン、シリアル、乳、肉の軟化、魚加工品、及び豆で用いられていると共に、タンパク加水分解物及びフレーバー抽出物の製造に用いられている。
【０００３】
食品加工で用いられているプロテアーゼには、チーズ製造用の凝乳酵素がある。乳を凝固させてチーズにするためには、凝乳酵素を加えて乳を液状に保つタンパクを分解しなければならない。更に詳細には、タンパクが変性又は改質されると乳はその液体構造を失って凝固し始める。
【０００４】
レンネットという皺胃（仔ウシの第四胃）から得られる凝乳酵素が長年、チーズの製造に用いられている。仔ウシのレンネットから抽出される主な酵素はキモシンである。しかし、仔ウシのレンネットは高価であると共に、キモシンの原料をもたらす仔ウシの慢性的な不足が原因となって入手が困難である。
【０００５】
動物、植物、及び微生物起源の様々な凝乳酵素が、キモシンの代替物として同定されており、チーズ製造における試験が行われている。それでも今なおキモシンの代替物として実際に用いられる凝乳酵素は、ペプシン（動物由来）と、各種糸状菌、例えばクリ胴枯病菌（Ｅｎｄｏｔｈｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）、ムコールプシルス（Ｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、及びムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）由来の微生物レンネットのみである。
【０００６】
米国特許第４，５２６，７９２号には、チーズの製造にＲ．ミエヘイ（Ｒ． ｍｉｅｈｅｉ）を微生物レンネットとして用いることが開示されている。Ｒ．ミエヘイはキモシンを含有していないが、その代わりに、機能の面でキモシンと似ている酸性プロテアーゼを含有している。
【０００７】
凝乳酵素を抽出及び精製する方法が数多く知られており、その一例としてアフィニティゲルクロマトグラフィーを行った後に吸着した酵素を溶出するものが挙げられる。例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉらの“Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍｉｌｋ−ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｂｙ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−（ｏｒ Ｎ−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌ）−ｐｅｐｓｔａｔｉｎ−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｇａｒｏｓｅ” Ａｎａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２２： ３０８−３１２ （１９８２）には、Ｎ−アセチルペプスタチンを親和性リガンドとして用いるアフィニティゲルカラムを利用して、Ｒ．ミエヘイから微生物レンネットを精製することが教示されている。また、Ｄｅａｄらの“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｒｉａｚｉｎｅ ｄｙｅｓ，” Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， １６５： ３０１−３１９ （１９７９）、及びＢｕｒｇｅｔｔらの“Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３ＧＡ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”， Ａｍ． Ｌａｂ．， ９（５）： ７４， ７８−８３ （１９７７）に開示されているように、酵素はＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３ＧＡ（「ＣＢ」）を用いるアフィニティゲルカラムで分離することもできる。いずれの文献にも、例えばキナーゼやヌクレアーゼなどの酵素をＣＢカラムで分離することが説明されている。米国特許第４，７４３，５５１号には、青色色素の親和性リガンドを用いると共に、吸着したレンネットを溶出して、精製Ｒ．ミエヘイレンネットを生成することが記載されている。
【０００８】
近年の研究では、植物誘導体であると共に、環境に優しい新たな凝乳酵素の発見に焦点が当てられている。ストレブラスアスパー（Ｋｅｓｉｎａｉ）の葉の抽出物はプロテアーゼ、すなわち凝乳因子を含有することが分かっており、レンネットの代替物となる可能性がある。
【０００９】
したがって、プロテアーゼ活性を実質的に有するストレブラスアスパーの抽出物を含む組成物を提供することは有益である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４，５２６，７９２号
【特許文献２】米国特許第４，７４３，５５１号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、“Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍｉｌｋ−ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｂｙ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−（ｏｒ Ｎ−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌ）−ｐｅｐｓｔａｔｉｎ−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌａｇａｒｏｓｅ” Ａｎａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２２： ３０８−３１２ （１９８２）
【非特許文献２】Ｄｅａｄら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｒｉａｚｉｎｅ ｄｙｅｓ，” Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， １６５： ３０１−３１９ （１９７９）
【非特許文献３】Ｂｕｒｇｅｔｔら、“Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３ＧＡ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”， Ａｍ． Ｌａｂ．， ９（５）： ７４， ７８−８３ （１９７７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ペプチド結合の加水分解によってタンパクを分解するプロテアーゼ活性を実質的に有するストレブラスアスパーのタンパク様抽出物を含む組成物に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の効果は、食品加工業界で食肉改質剤及び凝乳剤として、並びに、洗剤の製造時に添加剤として用いるのに好適なストレブラスアスパーのタンパク様抽出物を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】ストレブラスアスパー（Ｋｅｓｉｎａｉ）のタンパク様抽出物の７０００倍の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。
【図１Ｂ】ストレブラスアスパー（Ｋｅｓｉｎａｉ）のタンパク様抽出物の３０，０００倍の透過電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）である。
【図２】精製プロテアーゼのドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動像（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。
【図３Ａ】精製プロテアーゼのタンパク分解活性の最適温度を示すグラフである。
【図３Ｂ】精製プロテアーゼの温度安定性を示しているグラフである。
【図４】添加された塩化カルシウムの濃度がストレブラスアスパー（Ｋｅｓｉｎａｉ）のタンパク様抽出物による凝乳時間に及ぼす作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、プロテアーゼ活性を実質的に有するＫｅｓｉｎａｉ、すなわちストレブラスアスパーのタンパク様葉抽出物に関する。
【００１６】
未精製の葉抽出物を調製すると望ましくない非常に濃い褐色となるため、この褐変を防止すれば、本発明の葉抽出物の有用性を高めることができる。褐変を防止し、かつ、許容可能な色の粗抽出物を得るために、クエン酸、Ｌ−システイン、及びメタ重亜硫酸ナトリウムのような褐変防止剤が用いられる。これによって葉抽出物の主な問題が解決されたと共に、その凝乳剤、食肉改質剤、及び洗剤業界用の添加剤としての潜在的な有用性が高まった。
【００１７】
メタ重亜硫酸塩は、本発明の葉抽出物の酵素による褐変に対する有効な防止剤であることが分かった。メタ重亜硫酸塩は、２ｍＭの濃度で褐変を防止し、得られた抽出物は褐色抽出物の褐色凝固体と比べると白い凝乳であった。得られた抽出物は、８５℃まで熱安定性があり（最適温度は７０℃）、その最適ｐＨは７．２である。６ｍＭの添加塩化カルシウムは、凝乳活性に最適であった。
【００１８】
酵素による褐変の防止と、粗抽出物の特性評価がうまくいくことにより、凝乳の生理化学的特性、凝乳プロテアーゼの精製及び特性評価を検証する基礎が形成される。凝乳プロテアーゼの使用は、チーズ製造に不可欠な工程である。凝乳の強度、シネレシス及び収率は、用いるレンネットの種類によって大きく左右される。テクスチャーはチーズの最も重要な特徴の１つであり、凝乳の種類によって影響を受けることがある。テクスチャーの相違は、凝乳の網構造に関連している。テクスチャー特性を調べるには粗抽出物の微細構造とシネレシスが、レンネット代替物としての凝乳プロテアーゼの潜在的適合性の評価に有用である。このために、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）及び透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）での検査用にストレブラスアスパー（Ｋｅｓｉｎａｉ）を用いて新鮮な牛乳から凝乳を調製した。これらの検査により、凝乳の有孔度、テクスチャー及びシネレシスを定量化した。
【００１９】
最後に、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６、ＭＯＮＯＱ ＨＲ ５／５を用いたＦＰＬＣイオン交換、及びＲｏｔｏｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いた等電点電気泳動法（ＩＥＦ）による限外ろ過（ＵＦ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）ゲルろ過によって、Ｋｅｓｉｎａｉから得られた粗酵素抽出物を精製した（精製倍率２５、回収率１８％）。
【００２０】
図２によると、精製されたプロテアーゼはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で一つのバンドとして現れ、分子量は３１．３ｋＤａであった。この精製プロテアーゼの特性評価を行ったところ、最適ｐＨが７．２であるセリンプロテアーゼであり、ｐＨ５．０〜９．５の範囲で安定的であり、等電点（Ｐｌ）が５．２であり得ることが示された。この精製プロテアーゼは８５℃まで熱安定性があり、最適温度は７０℃である。電気泳動像解析によって、プロテアーゼ活性が凝乳活性と関連することが示された。Ｋｅｓｉｎａｉプロテアーゼは、短期熟成チーズ類の製造に用いることができる。
【００２１】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例１】
【００２２】
葉抽出物の調製
新鮮なストレブラスアスパーの葉を洗浄し、室温にて０．５〜１０ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウムを含む２００ｍｌの１００ｍＭトリス−ＨＣＬバッファー（ｐＨ６〜９）中でホモジナイズした。このホモジネートをろ過し、１０，０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離した。その上清を粗酵素抽出物として回収した。粗酵素抽出物を限外ろ過し、室温にて、４３ｍｍの円形膜によって、攪拌セルＡｍｉｃｏｎ ８０５０を用いて濃縮した。濃縮物およびろ液を別々に回収した。続いて、基質として１００ｍＭのトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）中のアゾカゼイン（０．０５％（重量／体積））を用いて、プロテアーゼ活性を特定した。１００μｌの酵素を１ｍｌの基質で１時間、室温にてインキュベートした。３００μｌのトリクロロ酢酸を加えることによって反応を停止させた。続いて、この混合物を遠心分離し、上清を回収し、その吸光度をブランクとしての基質とバッファーとの混合物に対して測定した。４１０ナノメートルで吸光度の変化を測定し、１．０単位＝０．０１の吸光度単位の変化として酵素活性を表した。
【００２３】
塩化カルシウムを新鮮な乳に溶解させて１〜１０ｍＭの塩化カルシウム濃度とすることにより、塩化カルシウムが凝乳時間に及ぼす作用を調べた。塩化カルシウムを加えなかった新鮮な乳をコントロールとして用いた。乳（２ｍｌ）を５分間、６５℃のウォーターバス中で粘度調節してから、２００μｌの粗葉抽出物を加えた。ウォーターバスを振盪することなく、この乳と酵素との混合物を上記の設定温度にてインキュベートした。図４を参照すると、塩化カルシウムを１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、及び１０ｍＭの濃度で新鮮な乳に加えたところ、凝乳活性が向上した。凝乳活性は、加えた塩化カルシウムの濃度が６ｍＭになるまでは塩化カルシウム濃度の上昇と共に向上し、６ｍＭを超えた濃度では、凝乳活性の向上度は小さかった。
【００２４】
この実施例では、メタ重亜硫酸ナトリウムが粗葉抽出物の酵素による褐変を防止する作用を調べた。このため、上記の方法によって調製した粗抽出物の色を（分光光度計で吸光度単位を測定することによって）測定するとともに、凝乳活性を測定した。
【実施例２】
【００２５】
凝乳活性の決定
本発明の葉抽出物が１２．５％の還元乳を凝固させるのに要する時間を測定することによって、凝乳活性を決定した。サンプルを予め６５℃で５分間インキュベートしてから、２００μｌの当該葉抽出物を加え、この混合物を６５℃でインキュベートした。１５秒毎にチューブを約４５°傾けた。凝乳の最初の可視的兆候が見えるまでに要した時間を凝乳時間として記録した。凝乳活性の１単位は、上記の測定条件下で１分間に１ｍｌの乳を凝固させることであり、比凝乳活性は、１ｍｇのタンパク当たりの活性単位である。沸騰させた酵素をコントロールとして用いた。
【００２６】
表１に示される測定結果より、抽出バッファー中で１０ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウムを用いることにより許容可能な色の粗抽出物が得られた。メタ重亜硫酸塩を用いて調製した抽出物では、プロテアーゼ活性を保持する高い凝乳活性が示された。メタ重亜硫酸ナトリウムは、食品業界において多機能性添加剤として広く用いられていると共に、化学保存料として用いても安全なもの（ＧＲＡＳ）として認識されている。葉抽出物の褐変を防止する目的でこの調査で用いる亜硫酸塩のレベルは低く、乳と葉抽出物との混合物の官能検査では検出されないであろう（前記混合物における亜硫酸塩のレベルは３８ｐｐｍ（パーツパーミリオン）であり、官能検査における亜硫酸塩の最小閾値は約５０ｐｐｍ（パーツパーミリオン）である）。
【００２７】
得られた粗葉抽出物の最適ｐＨは７．２であり、この粗葉抽出物は広範なｐＨで安定である。この粗葉抽出物は熱的に安定であり、最適温度は７０℃である。
【００２８】
表１ 各種濃度のメタ重亜硫酸ナトリウムが粗葉抽出物の褐変に及ぼす作用
【表１】
【実施例３】
【００２９】
凝乳の調製
凝乳の調製のために、０．２ｍＭの塩化カルシウムと、２ｍｇの脱色したストレブラスアスパー（ｋｅｓｉｎａｉ）抽出物を１００ｍｌの新鮮な牛乳に加えた。続いて、凝乳が形成されるまで、この混合物をインキュベートした。調製した凝乳を小片にカットし、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）と透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。ＳＥＭ写真及びＴＥＭ写真の分割区域の孔を定量化することによって、上記の凝乳の有孔度を決定した。テクスチャーについては、テクスチャーアナライザーを用いることによって凝乳強度を決定した。
【００３０】
サンプルの体積を測定してから、ろ過によって凝乳から分離できた乳清の体積を測定することによって、シネレシスの程度を決定した。
【００３１】
上記の凝乳をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。その結果は、以下のように観察された。
【００３２】
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で調べたところ、本発明の葉抽出物の凝乳の微細構造は、スポンジ様であった。本発明の葉抽出物によるスポンジ様構造網の形成は、葉抽出物中のフェノール化合物に起因するカゼインミセル間の新たな架橋結合に加えて、本発明の葉抽出物の性質及びタンパク分解特性によるものであった。
【００３３】
本発明の葉抽出物は、有孔度が低く、カゼイン網の密度が高い凝乳を生成させることが分かった。図１ａ及び図１ｂを参照すると、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）による有孔度定量結果においても、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）による有孔度定量結果においても、Ｋｅｓｉｎａｉの凝乳の有孔度が低いことが示された。カゼインのシーズ収率への寄与には、それ自体の重量に加えて付随する水分とミネラルが含まれるので、これは、チーズの製造において望ましい特性である。また、放出される乳清（乳の血清相）も少なくなる。
【００３４】
凝乳と乳清の硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動像（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、本発明の葉抽出物のタンパク分解活性が高いことが示された。
【実施例４】
【００３５】
ｋｅｓｉｎａｉの凝乳プロテアーゼの精製及び特性評価
（ｉ）高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）ゲルろ過クロマトグラフィー
メタ重亜硫酸ナトリウムを用いてＫｅｓｉｎａｉの葉から調製した粗酵素抽出物をベッドボリューム２０ｍｌの高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）カラムＳｕｐｅｒｐｏｓｅ−６（ろ過の前に、１００ｍＭのトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）で平衡化した）に充填した。
【００３６】
平衡化バッファーによって毎分３ｍｌの流速でタンパクを溶出した。ろ過によって、４．２６倍に精製された（収率６９．８４％）。画分を含むプロテアーゼをプールし、Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５カラムによる高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）イオン交換クロマトグラフィーによって更に精製した。０．３５〜０．４０Ｍの塩濃度でカラムから酵素を溶出した。イオン交換精製工程によって、２３．７６倍に精製された（収率２４．３４％）。イオン交換クロマトグラフィー工程から溶出したプロテアーゼ活性画分をプールし、蒸留水で透析し、Ｒｏｔｏｆｏｒ装置を用いた等電点電気泳動法によって精製した。最終収率１８％で２５．１０倍に精製された。
【００３７】
タンパクベースで、タンパクが１４０倍に回収された。
【００３８】
（ｉｉ）Ｋｅｓｉｎａｉプロテアーゼの特性評価
硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動像（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分子質量を推測した。標準的タンパクのｌｏｇ分子質量対相対移動度の標準曲線をプロットしてから、精製プロテアーゼの相対移動度を用いて、上記の標準曲線から精製プロテアーゼの分子質量を推測した。
【００３９】
この結果は、精製プロテアーゼがおそらく単一のサブユニットからなるモノマーであることを示唆している。図２を参照すると、精製プロテアーゼ（レーン６及び７）の分子質量を決定する電気泳動実験によって、約３１．３ｋＤＡに相当する分子量を有する単一のバンドが示された。このように低いプロテアーゼの分子量は、セリンプロテアーゼの分子量に類似する（セリンプロテアーゼは一般に低分子量であり、通常は１５，０００〜３０，０００である）。
【００４０】
精製プロテアーゼの等電点電気泳動像から精製プロテアーゼの等電点を決定した（プロテアーゼはｐＨ５．２における単一ピークとして溶出され、これに基づき、その等電点（ｐｉ）をｐＨ５．２と推測した）。また、ｐＨ８．３及び室温での電気泳動後でも、Ｋｅｓｉｎａｉ由来の精製プロテアーゼが乳を凝固できることも結果により示された。
【００４１】
５〜９の範囲のｐＨ値、１時間のインキュベーション時間、３７℃における精製プロテアーゼのタンパク分解活性の最適活性ｐＨによって、アゾカゼインの加水分解に最適なｐＨが７．２であることが示された。これらの条件下において、前記酵素のｐＨ６．２における最大活性は６０％であり、当該ｐＨはスターターカルチャーによってチーズ乳が酸性化されるｐＨであると考えられる。
【００４２】
Ｋｅｓｉｎａｉ由来の精製プロテアーゼのｐＨ安定性を決定するため、Ｋｅｓｉｎａｉ由来の酵素を４．５〜９．５の間で変化させたｐＨにて１時間、室温でインキュベートした。その後、残留プロテアーゼの活性を決定した。その結果、室温で１時間インキュベートした場合のプロテアーゼは５〜８．５のｐＨ範囲で安定的であることが示された。この条件では、プロテアーゼは、ｐＨ５において活性の１０％を維持した。
【００４３】
温度がプロテアーゼ活性に及ぼす作用を決定するため、精製プロテアーゼを５分間、５〜９５℃の範囲の温度で平衡化した。続いて、基質（トリス−ＨＣＬバッファー（ｐＨ＝７．２）中のアゾカゼイン、０．０５％ｗ／ｖ）を加えて得た混合物を試験温度で１時間インキュベートし、標準的な測定方法に従って、タンパク分解活性を測定した。図３Ａに示される結果によって、精製プロテアーゼの最適温度が約７０℃であることが明らかになった。
【００４４】
Ｋｅｓｉｎａｉ由来の精製プロテアーゼの温度安定性を決定するため、酵素を５〜９５℃の間で変化させた温度で１時間インキュベートしてから氷中で急冷した。アゾカゼイン（０．０５％ｗ／ｖ）を基質として用いて、残留タンパク分解活性を３７℃で測定した。プロテアーゼの温度安定性を図３Ｂに示す。図３Ｂを参照すると、酵素を１時間インキュベートした場合、７５℃まで安定的であった。８０℃で１時間インキュベートした後の酵素活性は最大活性の４４％、８５℃でインキュベートした後は２６％、９０℃でインキュベートした後では１４％であった。
【００４５】
精製プロテアーゼの温度安定性は、前記精製プロテアーゼが従来の乳及び乳清の低温殺菌条件に耐えられることを示している。これは、レンネット代替物として望ましくない特性である。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明に従ってＫｅｓｉｎａｉから得た粗抽出物は、食肉を適度な軟らかさに改質する食肉改質剤として好適に利用でき、処置した食肉に望ましくない後味を付与することもない。更に、食肉改質剤として用いたときのこの酵素は酵素不活化温度が比較的低いので、家庭用及び産業用として非常に有用であると同時に、温度管理又は不活化が容易である。
【００４７】
また、前記粗抽出物の温度安定性と高いタンパク分解活性は、洗剤業界でも望ましい特性であり、その精製酵素は、洗剤業界のプロセスで有用であり得る。この酵素を洗剤製品で用いると、洗浄温度を低くすることができてエネルギーを節約することができると共に、生体分解性であるために有害な残留物を出さない。この酵素は、汚水処理プロセスに環境的な悪影響を及ぼさず、また、水生生物に対するリスクももたらさない。
【００４８】
ストレブラスアスパーの葉抽出物の褐変は、フェノール化合物とポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）（いずれも潜在的な産業用途がある）が豊富であることを示している。ポリフェノールオキシダーゼは、抗酸化剤としてのフラボノイド由来着色剤の製造、及び水域環境からのエストロゲン物質の除去を含む多くの更なる産業用途において潜在的に有用である。フェノール化合物が豊富な植物抽出物は乳の熱安定性とコロイド安定性を大きく向上させることが新たな証拠により示されていることから、フェノール化合物の豊富な供給源であるストレブラスアスパーの葉抽出物は、濃縮乳の温度安定性とコロイド安定性を向上させるのに有用であり得る。
【００４９】
本発明の実例的な実施形態について詳細に説明してきたが、当業者には、様々な他の修正が明らかであると共に、当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、このような修正を容易に行うことができることが分かる。したがって、添付の特許請求の範囲を上記の実施例及び説明に限定することは意図しておらず、むしろ、特許請求の範囲は、本発明に関連する当業者から本発明の同等物として扱われるすべての特徴を含め、本発明に属するすべての特許性のある新規性の特徴を網羅するものと解釈するように意図されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ活性を実質的に有するストレブラスアスパーのタンパク様抽出物を含む組成物。
【請求項２】
前記ストレブラスアスパーのタンパク様抽出物の分子量が３１．３ｋＤＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ストレブラスアスパーのタンパク様抽出物の等電点がｐＨ５．２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ストレブラスアスパーのタンパク様抽出物が、ｐＨ５〜９の範囲内でプロテアーゼ活性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ストレブラスアスパーのタンパク様抽出物が、ｐＨ５〜８．５の範囲内でプロテアーゼ安定性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ストレブラスアスパーのタンパク様抽出物の活性の最適温度が７０℃である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１】
プロテアーゼ活性を実質的に有するストレブラスアスパーのタンパク様抽出物を含む組成物。
【請求項２】
前記ストレブラスアスパーのタンパク様抽出物の分子量が３１．３ｋＤＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ストレブラスアスパーのタンパク様抽出物の等電点がｐＨ５．２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ストレブラスアスパーのタンパク様抽出物が、ｐＨ５〜９の範囲内でプロテアーゼ活性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ストレブラスアスパーのタンパク様抽出物が、ｐＨ５〜８．５の範囲内でプロテアーゼ安定性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ストレブラスアスパーのタンパク様抽出物の活性の最適温度が７０℃である、請求項１に記載の組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【公表番号】特表２０１２−５０８５７２（Ｐ２０１２−５０８５７２Ａ）
【公表日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３６２６８（Ｐ２０１１−５３６２６８）
【出願日】平成２１年１１月１６日（２００９．１１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＭＹ２００９／０００１９５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５６１０８
【国際公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（５０５２９１４１３）ユニバーシティー プトラ マレーシア (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１６日（２００９．１１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＭＹ２００９／０００１９５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５６１０８
【国際公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（５０５２９１４１３）ユニバーシティー プトラ マレーシア (11)
【Ｆターム（参考）】
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