プロトプラストを形質移入するための改善された技術
本発明は、植物細胞プロトプラストにおける１以上の注目する分子の導入方法であって、植物細胞プロトプラストを準備すること、ミスマッチ修復系および非相同末端再結合からなる群から選択される１以上の経路の制御を変更することができる組成物ならびに／またはＤＳＢを導入することができる組成物を用いてこの植物細胞プロトプラストの第１の形質移入を実施すること、変異原性オリゴヌクレオチドなどの１以上の注目する分子を用いてこの植物細胞プロトプラストの第２の形質移入を実施すること、ならびに細胞壁が形成されるのを許容することによる、方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物細胞プロトプラストにおける注目する異種分子の導入方法に関する。本発明はさらに、形質移入された植物細胞プロトプラストに、および当該方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子修飾は、生細胞の、またはその細胞が一部を形成するかまたはその細胞が再生することができる場所となる生物の、１以上の遺伝子的にコードされた生物学的特性を改変する目的をもって、生細胞の遺伝子材料の変化を意図的に作成するプロセスである。これらの変化は、遺伝子材料の一部分の欠失、外因性の遺伝子材料の付加、または遺伝子材料の既存のヌクレオチド配列における置換のような変化の形をとることができる。
【０００３】
真核生物の遺伝子修飾の方法は、２０年を超える年月にわたって知られており、農業、ヒトの健康、食品の品質および環境保護の分野における改善のために、植物および動物の細胞ならびに微生物において幅広い応用例を見出してきた。
【０００４】
遺伝子修飾の一般的な方法は、外因性のＤＮＡ断片を細胞のゲノムに付加することからなり、これは、後に、すでに存在する遺伝子によってコードされる特性に勝り上回る新しい特性をその細胞またはその生物に与えることになる（これにより既存の遺伝子の発現が抑制されることになる応用例を含む）。多くのこのような例は所望の特性を入手する上で効果的であるが、とはいうものの、これらの方法はあまり正確ではない。なぜなら、外因性のＤＮＡ断片が挿入されるゲノムの位置に対する（従って、発現の最終的なレベルに対する）制御がないからであり、所望の効果は、もともとのそしてよくバランスがとれたゲノムによってコードされる自然の特性に勝って顕在化する必要があるからである。遭遇する一般的な問題は、宿主のゲノムＤＮＡの中への外因性のＤＮＡ断片のランダムな組み込みに起因して、必須または有益な遺伝子が不活性化または改変され、宿主の望ましい特徴の望まれない喪失を引き起こすということである。
【０００５】
反対に、所定のゲノム遺伝子座におけるヌクレオチドの付加、欠失または変換を生じることになる遺伝子修飾の方法は、既存の遺伝子の正確な修飾を可能にするであろう。
【０００６】
過去数十年間にわたるゲノミクスの出現を得て、今では、動物、植物および細菌のゲノムをより素早くかつ費用効率よく解読することが可能である。これは、動物における疾患感受性または植物における収量特性などの表現型に関連づけることができる豊富な遺伝子および調節配列をもたらした。これは、ある配列の推定上の機能が素早く確立されるようにするであろうが、観察される表現型に遺伝子が関与するという究極的なエビデンスは、予想される変更された表現型を示す変異体系統を創出することにより得られる必要がある。
【０００７】
動物細胞とは異なり、植物細胞は、多糖およびタンパク質の混合物から構成される厚い細胞壁によって取り囲まれており、しかも動物細胞が異種分子の導入を容易に受けるのに対して、植物細胞はより扱いにくく、いくらかはより侵襲的な方法を必要とする。異種分子を植物細胞に導入するための先行技術の手順は、２つのカテゴリーに分類することができる。
【０００８】
第１のカテゴリーは、植物細胞壁に穴をあけることによる、植物細胞の中への注目する分子の機械的な導入を利用するすべての方法をまとめる。これは、微粒子銃による送達によって成し遂げることができ、この微粒子銃による送達については、注目する分子は金属ビーズ、金またはタングステン上にコーティングされており、これらは、気体加圧式デバイスを使用して細胞の中へと噴射される。しかしながらこのようなアプローチの効率はかなり低く、そして、すべての細胞が形質転換されるわけではないので、選択が必要であり、このことが、標的の数を制限する。別のアプローチは、細胞壁を貫通して植物細胞の中へと化合物を直接注入するためのマイクロマニピュレータに接続されたマイクロニードルまたはナノニードルを使用する。しかしながら、マイクロインジェクションは、特別仕様の設備およびかなりの熟練を必要とする。この方法は、単調で退屈なものでもあり時間もかかり、微粒子銃による送達に勝る利点をほとんどもたらさない。さらに別の方法は、注目する分子を含有しかつ末端が細胞壁を消化する酵素でコーティングされている炭素ナノチューブを利用する。このナノチューブは、細胞壁を局所的に分解し、細胞膜に穴をあけ、チューブの内容物を宿主細胞の中へと送達することを可能にすると想定されるであろう。マイクロインジェクションまたは微粒子銃照射ほどには侵襲的ではないものの、上記の制約はここでも当てはまる。
【０００９】
第２のカテゴリーは、注目する分子の導入に先立って植物細胞壁全体が酵素により除去されるすべての方法をまとめる。細胞壁の完全な除去は細胞間の連結を破壊して、個別化された細胞の均質な懸濁液を生成し、これにより、より均一で大スケールの形質移入実験が可能になる。この方法は、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム介在性形質移入、およびポリエチレングリコール介在性形質移入を含むが、これらに限定されない。それゆえ、プロトプラスト調製は、数百万の細胞を生成するための、非常に信頼性が高くかつ安価な方法であり、その融通性、効率および収量については他の方法よりも好ましいことが多い。
【００１０】
プロトプラストは、ほとんどあらゆる植物組織から単離することができる。プロトプラストの主要な源は葉肉組織であり、葉肉組織は、新鮮重１グラムあたり大量のプロトプラストを与える。他のタイプの組織の使用は、たいていは、考慮対象の系についての既存の手順の利用可能性および実験の最終目的に依存する。
【００１１】
すべてではないとしても多くの生物学的プロセスは、空間的および時間的に制御されている。細胞は自身の生物時計を有し、細胞周期はその最も明らかな代表例である。１つの細胞はすべて、成長（Ｇ０、Ｇ２）、ＤＮＡ複製（Ｓ）、分裂（Ｍ）および静止（Ｇ０）などの一連の発生段階を経ることになる。それゆえ、特定の経路と相互作用する意図の実験を計画するときには、検討対象の系の状態を扱うことが妥当である。注目する分子の導入は、検討されるプロセスに合致するために、慎重に時期を合わされる必要がある。注目する分子は、その分子がその作用を発揮することができるまで長期間にわたって細胞環境の中で安定である必要があるか、または検討対象のプロセスが始まる前に短時間のうちに送達される必要があるかのいずれかである。例えば、標識されたチューブリンを細胞の中に導入することによる、前期前微小管束形成の間の微小管動力学の研究において、標識されたチューブリンが、前期前微小管束形成が始まるまで酵素による分解に耐えるほどに十分安定でなければ、チューブリンが、前期前微小管束形成の前に短時間に送達されることが確実にされる必要がある。その特別の例については、別の考慮事項は、前期前微小管束以外の構造の中への蛍光性チューブリンの組み込み、従って所望の時期にこのプローブを送達する必要性であろう。
【００１２】
残念ながら、細胞懸濁培養液の稀なケースを除き、プロトプラストの由来のもとになることができる葉肉細胞は、静止状態（Ｇ０）にあり、プロトプラストが適正なホルモンバランスで誘発されるときだけ、プロトプラストは、細胞周期に再び入り、活発に流動（ｓｔｒｅａｍｉｎｇ）を開始することになる。１つの静止状態のプロトプラストが１ラウンドの細胞周期を経るために必要とされる時間は、系ごとに大きく異なり、数時間〜数日かかる可能性がある。さらには、プロトプラストを生成するために使用される酵素混合物が洗い流されるとすぐに、プロトプラストは、その細胞壁を再形成することを開始し、これは、細胞壁再形成を遅くするかまたは防止するための予防措置がとられなければ、異種分子の導入を減少または完全に阻むことさえするであろう。それゆえ、プロトプラストは、注目する分子が送達されるべきである適切な段階にプロトプラストが到達するまで細胞壁を伴わないまま置かれることすらできず、細胞壁再形成は積極的に防止される必要があるが、同時にプロトプラストの流動能は保持されるべきである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは当該技術分野のこれらの不都合を克服しようとして、プロトプラストおよび細胞周期を制御でき、かつより効率的におよびより制御可能な態様でプロトプラストを形質移入することができる方法を考案した。
【００１４】
本発明者らは、２つの形質移入工程の組み合わせによって、プロトプラストにおけるいくつかの生物学的プロセスの詳細な制御が可能になるということを、本発明において見出した。２つの形質移入工程のこの組み合わせは、細胞壁阻害剤の使用、および／または細胞期の同期化工程と組み合わせられてもよい。本発明者らは、第１の形質移入工程において特定の経路と相互作用し、かつ／または二本鎖ＤＮＡ切断を導入する種々の組成物および異種分子を用いた形質移入が実施される第２の工程の導入によって、形質移入プロセスに対して改善された効率および制御が可能になるということを見出した。さらに本発明者らは、セルロースシンターゼ、セルロース沈着を阻害することまたは新生のセルロース微細線維を捕捉することによるなどで細胞壁形成に干渉する１以上の非酵素の化学的化合物をプロトプラストに添加することにより、異種分子の導入のタイミングおよび効率が、細胞周期の中の所望の期に時間的により近いところでの異種分子の送達の可能性を通して、高められかつ最適化されうるということを見出した。本発明者らは、特定の細胞期に細胞を同期化することにより、形質移入の増大が成し遂げられうるということも見出した。
【００１５】
より広い観点では、ミスマッチ修復系および／もしくはＮＨＥＪ経路の（一過性）抑制ならびに／または二本鎖ＤＮＡ切断の導入ならびに（ｉｉ）任意にプロトプラスト系における細胞壁再形成の一過性阻害および／または細胞周期の期の同期化と組み合わせた、変異原性オリゴヌクレオチドなどの注目する異種分子を用いたプロトプラストの形質移入は、細胞系が、プロトプラストの単離の時点から時間的に遠い特定の生物学的／生化学的プロセスにおいてその細胞が能力ある細胞周期の特定の段階で、形質移入される必要があるとき、非常に価値がある。さらには、プロトプラスト系における細胞壁再形成の一過性阻害は、一過性に発現されたプラスミドの連続的な導入を許容し、この複合的な作用が所望の成果を導く。例えば、ＺＦＮコンストラクトが、あるとき、例えばドナーコンストラクトが導入される４、６、１２、１８または２４時間前に導入されるならば、遺伝子標的指向化は、より効率的である。これによりＺＦＮが発現されることができ、かつ適正な遺伝子標的指向化事象が起こるために必要なＤＳＢを誘導するようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ミスマッチ認識後のＭＭＲ下流のシグナル伝達についての略図。
【図２】ＢｒａｎｚｅｉおよびＦｏｉａｎｉ、−、２００８年、第８巻、第９号、１０３８−４６頁から採ったＮＨＥＪおよびＨＲについての略図。
【図３】ＤＳＢ末端の成熟の略図。
【図４】相同組み換えの略図。
【図５】植物プロトプラストにおけるフットプリント形成についての実験計画。
【図６】遺伝子標的指向化事象についての実験計画。
【図７】ＢＹ−２プロトプラストにおけるｍｅＧＦＰ回復についての実験計画。
【図８】ｄｓＲＮＡの添加の後のタバコおよびトマトのプロトプラストにおけるＭＳＨ２のレベル。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
第１の態様では、本発明は、植物細胞プロトプラストにおける１以上の注目する分子の導入方法であって、
− 植物細胞から細胞壁を酵素により分解し、かつ／または植物細胞から細胞壁を取り除くことにより、前記植物細胞プロトプラストを準備する工程と、
− （ｉ）ミスマッチ修復系、非相同末端再結合からなる群から選択される１以上の経路の制御を変更することができる第１の組成物、および／または
（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる第２の組成物
を用いてこの植物細胞プロトプラストの第１の形質移入を実施する工程と、
− １以上の注目する分子を用いてこの植物細胞プロトプラストの第２の形質移入を実施する工程と、
− 細胞壁を形成させる工程と
を含み、この第２の形質移入は第１の形質移入の後に実施される方法、に関する。
【００１８】
用語「および（かつ）／または」は、本発明に関する範囲では、第１の組成物を用いた形質移入、または第２の組成物を用いた形質移入、または両方を用いた形質移入のいずれかを実施することができるということを意味するということを当業者は理解するであろう。そこで、本発明に係る第１の形質移入、およびすべてのその実施形態では、第１の組成物または第２の組成物またはその両方を含んでもよい。
【００１９】
当該方法の第１の工程では、プロトプラストは植物細胞から準備される。プロトプラストは、植物細胞プロトプラストの生成について使用される一般的な手順を使用して（例えばマセラーゼｍａｃｅｒａｓｅ）を使用して）準備することができる。植物細胞プロトプラスト系は、これまでのところトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍ）および他の多くのもの（セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃｃａ ｓａｔｉｖａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））について記載がある。本発明は、本願明細書に列挙されるプロトプラスト系（これらに限定されない）を含めて、一般にいずれのプロトプラスト系にも適用できる。
【００２０】
プロトプラストは、葉肉細胞（活発に分裂していない）に、成長点培養物（活発に分裂している）に、および細胞懸濁液（活発に分裂している）に由来することができる。
【００２１】
当該プロトプラストは、ミスマッチ修復系、非相同末端再結合（Ｎｏｎ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｎｄ Ｊｏｉｎｉｎｇ）経路からなる群から選択される経路のうちの１以上の制御を変更することができる第１の組成物を用いて形質移入されることができる。好ましくは、この形質移入は一過性である。好ましくは、このミスマッチ修復系、非相同末端再結合経路は下方制御される。
【００２２】
これらの経路の制御は、好ましくは、これらの経路を制御することができるｄｓＲＮＡの使用を通して成し遂げられる。適切な組成物の選択および設計のための例および指針は、本願明細書に以下で提示される。１つの実施形態では、この第１の組成物は、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬ、ＭｕｔＨ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＳＨ７、ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、ＤＮＡ−ＰＫ複合体 Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、Ｋｕ８６、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０、ＲＡＤ５１、ＸＲＣＣ４、Ｎｂｓ１のうちの１以上の制御を変更することができる。
【００２３】
ミスマッチ修復系
多くの病変は、いわゆるミスマッチ修復系（ＭＭＲ）によって修復される。大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）では、ＭＭＲは、３つの主要な複合体、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬおよびＭｕｔＨからなる。ＭｕｔＳは、ミスマッチの認識のおよびＭｕｔＨを動員する第２の複合体ＭｕｔＬに向かうシグナル伝達に関わる。ＭｕｔＨは、ミスマッチを含有する新しく合成されたＤＮＡ鎖にニックを導入することになるニッキング活性を保有する。新しく合成された鎖の中のニックの存在は、エキソヌクレアーゼに、分解される対象のＤＮＡ（ミスマッチヌクレオチドを含む）の一続きのもの（ｓｔｒｅｔｃｈ）を合図する。そのあとＤＮＡポリメラーゼが娘鎖の中のギャップを埋めるであろう。大腸菌のＭＭＲ遺伝子のオルソログは、ＭｕｔＬによって機能が実施されるＭｕｔＨを除き、すべての真核生物において見出すことができる（総説として、ＫｏｌｏｄｎｅｒおよびＭａｒｓｉｓｈｋｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、１９９９年、第９巻、８９−９６頁を参照）。植物では、４つのＭｕｔＳオルソログ（ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６およびＭＳＨ７）ならびに４つのＭｕｔＬオルソログ（ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＭＬＨ３およびＰＭＳ１）が存在する。塩基−塩基ミスペアまたは単独のヘリックス外のヌクレオチドのミスマッチ認識は、ＭｕｔＳα（ＭＳＨ２：：ＭＳＨ６ヘテロ二量体）によって成し遂げられ、他方で、より大きいヘリックス外のループアウト（ｌｏｏｐｏｕｔ）は、ＭｕｔＳβ（ＭＳＨ２：：ＭＳＨ３ヘテロ二量体）によって認識される。ＭＳＨ７遺伝子は植物では特定されているが、これまでのところ動物では特定されていない。ＭＳＨ７は、ＭＳＨ６に非常に類似しており、同じくＭＳＨ２とヘテロ二量体（ＭｕｔＳγ）を形成する（ＣｕｌｌｉｇａｎおよびＨａｙｓ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２０００年、第１２巻、９９１−１００２頁）。ＭＭＲ経路は、Ｌｉ、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、第１８巻、８５−９８頁から採った図１に図示されている。
【００２４】
最近、植物プロトプラストにおける特定のｍＲＮＡの一過性抑制のための方法が提案されており（Ａｎら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３年、第６７巻、２６７４−２６７７頁）、これは植物における（内因性の）ＭＭＲ遺伝子の一過性抑制のための価値あるツールであるということが本発明で見出された。
【００２５】
上記経路、例えばｄｓＲＮＡの生成、の制御を変更するために使用される組成物において使用することができるＭＭＲ経路に関連する遺伝子（ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＳＨ７、ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＭＬＨ３およびＰＭＳ１など）の配列は、ＡｔＭＳＨ２についてのＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ００２７０６．１などの公共のデータベースから入手でき、本願明細書中の別の箇所に記載される。所望の植物特異的配列は、例えば入手できるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）配列に基づいてプライマーを設計し、その後所望のオルソログを特定することにより特定することができる。
【００２６】
最も有毒な病変は二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）である。ＤＳＢは、活性酸素種 −とりわけヒドロキシルラジカル−、電離放射線または化学物質（癌の処置のために使用される化学療法剤を含む）などの内因性のまたは外因性の遺伝毒性の剤の作用から生じる可能性がある。他の種類のＤＮＡ病変の修復、またはＤＮＡ複製などの細胞プロセスも、ＤＳＢを生じる。例えば、ヌクレオチド除去修復または塩基除去修復によるＤＮＡ修復にはエンドヌクレアーゼが関与し、このエンドヌクレアーゼは、一本鎖ニックを導入する。２本のＤＮＡ鎖上での一本鎖ニックまたはギャップの同時発生は、ＤＳＢの形成を導く。同様にして、複製フォークの上流の一本鎖ニックまたはギャップは、ＤＮＡ二重らせんの巻き戻しによりＤＳＢへとプロセシングされる可能性がある（Ｂｌｅｕｙａｒｄら、ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ、２００６年、第５巻、１−１２頁）。２つの競争的経路（図２、ＢｒａｎｚｅｉおよびＦｏｉａｎｉ、２００８年、第８巻、第９号、１０３８−４６頁から）がＤＳＢを修復するために存在し、つまりそれらは、非相同末端再結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）および相同組み換え（ＨＲ）である。二本鎖切断（ＤＳＢ）は、好ましくは、Ｇ１期の間の非相同末端再結合（ＮＨＥＪ）によって、および細胞周期のＳ期およびＧ２期の間の相同組み換え（ＨＲ）によって修復される。Ｋｕヘテロ二量体がＤＳＢに結合することで、ＤＮＡ−ＰＫ触媒的サブユニットの動員およびＮＨＥＪによるＤＳＢの封着が開始される。対照的に、Ｓ期およびＧ２期に発生するＤＳＢは、ＭＲＥ１１１−ＲＡＤ５０−ＮＢＳ１複合体を通してＡＴＭを優先的に活性化する。細胞周期のＳ期およびＧ２期に特異的であるより高いサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）活性はＤＳＢ切除を促進し、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の３’オーバーハングを露出させる。３’オーバーハングのｓｓＤＮＡが複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）で被覆されるとき、それはＡＴＲを活性化する。ＲＰＡは、ＲＡＤ５２などのメディエータータンパク質の助けを借りて除去され、ＲＡＤ５１によって置き換えられうる。これは、ＲＡＤ５１シナプス前フィラメントの形成を導き、これが、二本鎖の中の相同領域に侵入することによりＨＲを開始し、ＤＮＡ合成によってさらに伸長されることができるＤループ（Ｄ−ｌｏｏｐ）と呼ばれるＤＮＡ連結部を形成する。ＤＮＡヘリカーゼによるこの中間体の鎖（ストランド）置換は、上記反応を合成依存的鎖アニーリング（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ、ＳＤＳＡ）に向かって導く。あるいは、第２のＤＳＢ末端は、捕捉されて二重ホリデイジャンクション中間体を生じることができ、この中間体は、エンドヌクレアーゼによって分解されうるし、またはヘリカーゼ（ＢＬＭ）およびトポイソメラーゼ（ＴＯＰ３）の複合された作用によって溶解されうる。
【００２７】
非相同末端再結合経路
ＮＨＥＪは、ＤＳＢ修復の支配的な経路であり、平滑末端または短いオーバーハングを有する末端を再結合することを含み、切断された末端の認識および並立で始まる。これは、ＫＵヘテロ二量体（Ｋｕ７０およびＫｕ８０［またはＫｕ８６］）およびＤＮＡ−ＰＫ触媒的サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）からなるＤＮＡ−ＰＫ複合体によって促進される。ＤＳＢ末端の成熟はＡｒｔｅｍｉｓよって実施され（図３、出典はＧｏｏｄａｒｚｉら、２００６年）、再封着はＸｒｃｃ４／ＤＮＡリガーゼＩＶ複合体によって実施される。ＮＨＥＪは、比較的不正確なプロセスであり、ＤＮＡ配列の挿入および欠失を伴うことが多い（Ｂｌｅｕｙａｒｄら、２００６年、Ｇｏｏｄａｒｚｉら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ、２００６年、第２５巻、３８８０−３８８９頁）。ＫＵ７０、ＫＵ８０、およびＰＡＲＰ−１を含めたいくつかの遺伝子は、ＮＨＥＪにおいてある役割を果たすことが公知である。
【００２８】
ＮＨＥＪ経路、例えばｄｓＲＮＡの生成、の制御を変更するために使用される組成物において使用することができるＮＨＥＪ経路に関連する遺伝子の配列は、ＡｔＫＵ７０についてのＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ２８３７５９．１などの公共のデータベースから入手でき、本願明細書中の別の箇所に記載される。所望の植物特異的配列は、例えば入手できるシロイヌナズナ配列に基づいてプライマーを設計し、その後所望のオルソログを特定することにより特定することができる。
【００２９】
相同組み換え経路
ＨＲは、姉妹染色分体を鋳型として使用する正確な修復プロセスであり、それゆえ修復の忠実度を確実にする。ＨＲ修復に向かう第１の工程は、一本鎖３’オーバーハングを形成するためのＤＳＢの切除である。この末端プロセシングは、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１タンパク質からなるＭＲＮ複合体によって実施される。アクセサリータンパク質の助けを借りて、Ｒａｄ５１は、一本鎖末端に動員され、相同的な二本鎖の侵入を促進する（図４。出典はＳｕｇｉｙａｍａら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ、２００６年、１−１０頁）。
【００３０】
捕捉された鎖は、次に、ＤＮＡ合成によって伸長され、第２のＤＳＢ末端が捕捉され、二重ホリデイの形成が生じ、これは、エンドヌクレアーゼによって分解されてクロスオーバーの形成を生じうるし、またはヘリカーゼおよびトポイソメラーゼの複合された作用によって溶解されうる（Ｂｌｅｕｙａｒｄら、２００６年；ＢｒａｎｚｅｉおよびＦｏｉａｎｉ、２００８年）。
【００３１】
１つの実施形態では、第１の形質移入は、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる第２の組成物を用いて実施することができる。例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼ（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ、フランス）、およびＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（Ｂｏｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９年、３２６巻、１５０９−１５１２頁；Ｍｏｓｃｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９年、第３２６巻、１５０１頁）である。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、好ましくは所望の位置で二本鎖切断を誘導するように、公知の技術を使用して設計され、その場合、標的にされる変異生成に関連するある実施形態では、第２の形質移入は、変異原性オリゴヌクレオチド由来の変異を導入することを意図する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、特定のＤＮＡ配列を切るようにカスタム設計されたタンパク質である。ジンクフィンガードメインは、およそ３０個のアミノ酸から構成され、これらのアミノ酸は、亜鉛イオンによって安定化されるときに特徴的な構造へと折り畳まれる。ジンクフィンガードメインは、ＤＮＡらせんの深いほうの溝（ｍａｊｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）へと入り込むことによりＤＮＡに結合することができる。各ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガーのαヘリックス領域にある鍵となるアミノ酸残基を介して特定のＤＮＡトリプレット（３ｂｐｓ）に結合することができる。従って、これらの鍵となるアミノ酸を変えることにより、特定のトリプレットに対するジンクフィンガーの認識特異性を変更し、これにより注目する配列に意図的に向けられたジンクフィンガーコンストラクトを作成することが可能である。この系の融通性は、ジンクフィンガードメインが連続して一緒に連結されて、長いＤＮＡ配列に結合することができるという事実に由来する。例えば、連続する６つのジンクフィンガードメインは、複雑な真核生物のゲノムにおいてユニークであるのに十分長い特定の１８ｂｐｓ配列を認識する。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ヌクレアーゼＦｏｋＩに融合された一連のジンクフィンガーから構成される。このＺＦＮは細胞へと導入され、特定のゲノム配列を認識しそれに結合することになる。ＦｏｋＩヌクレアーゼは二量体として切るので、切断部位の反対のＤＮＡ鎖上にある特定の配列を認識する第２のＺＦＮが必要とされる。次いでＤＮＡを切ること、または二本鎖切断（ＤＳＢ）が、これら２つの標的にされたＤＮＡ配列間で作製される（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２００７年、第２５巻、第７号、７７８−７８５頁；ＣａｔｈｏｍｅｎおよびＪｏｕｎｇ、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２００８年、第１６巻、第７号、１２００−１２０７頁；Ｆｏｌｅｙら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、２００９年、第４巻、第２号、ｅ４３４８頁）。姉妹染色分体であるかまたはドナー ＤＮＡコンストラクトであるかのいずれであってもよい相同配列の存在下で、ＤＳＢは、ＨＲによって修復されることができる。これは、姉妹染色分体が修復のために使用されるのではなく、情報は細胞へと導入されるドナーコンストラクトからコピーされる、遺伝子標的指向化のプロセスの基礎である。このドナーコンストラクトは、もともとの染色体の遺伝子座と比較して変更箇所を含有し、従ってＨＲのプロセスは、これらの変更箇所をゲノムに組み込む。
【００３２】
第１の形質移入は、第１の組成物および第２の組成物の両方を、同時にまたは（互いに）連続的に用いた形質移入を含んでもよい。
【００３３】
本発明に係る方法では、第２の形質移入は、１以上の注目する分子を導入するために実施される。
【００３４】
この注目する分子は、化学物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、オリゴヌクレオチド、およびペプチドからなる群から選択されることができる。ある実施形態では、この注目する分子は、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プラスミド、変異原性オリゴヌクレオチド、より好ましくは変異原性オリゴヌクレオチドから選択される。
【００３５】
ある実施形態では、注目する分子として、ＺＦＮコンストラクトをコードするプラスミドを使用することができる。次に第２の形質移入工程は、発現後に、フットプリント（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇ）において使用することができるＤＳＢを誘導することができるＺＦＮコンストラクトを導入する。
【００３６】
ある実施形態では、変異原性オリゴヌクレオチドを、注目する分子として使用することができる。この変異原性オリゴヌクレオチドは、ひとたびプロトプラストへと形質移入されると、プロトプラストのＤＮＡにおいて変更をもたらすことができる。好ましくは、変異原性オリゴヌクレオチドについての標的ＤＮＡは核内ＤＮＡに由来する。あるいは、葉緑体またはミトコンドリアのＤＮＡを使用することができる。原理上は、これまでに当該技術分野で記載されたいずれの変異原性オリゴヌクレオチド、例えばＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド、ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート、プロピン置換などを使用することができる。
【００３７】
このように、注目する分子としての、変異原性オリゴヌクレオチドの使用は、オリゴヌクレオチド依存性標的化ヌクレオチド交換（ＯＤＴＮＥ）を提供する。
【００３８】
オリゴヌクレオチド依存性標的化ヌクレオチド交換（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ、ＯＤＴＮＥ）
オリゴヌクレオチド依存性標的化ヌクレオチド交換（ＯＤＴＮＥ）は、変異（複数可）、例えば１つの点変異または欠失／挿入を導入すること、それゆえもともとの遺伝子機能を回復することによりゲノムの遺伝子座を修正または変更するための一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を指す。この概念は、遺伝子治療およびテーラーメイド医療の基礎であり、世界中で精力的に研究されている（Ｐａｒｅｋｈ−Ｏｌｍｅｄｏら、Ｎｅｕｒｏｎ、２００２年、第３３巻、４９５−４９８頁；Ｍａｄｓｅｎら、ＰＮＡＳ、２００８年、第１０５巻、第１０号、３９０９−３９１４頁；Ｌｅｃｌｅｒｃら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００９年、第９巻、第３５号、１−１６頁）。ＯＤＴＮＥの有効性および効率に影響を及ぼすいくつかのパラメータが特定されており、いくつかはまだ検証を必要とするが、機能的ＭＭＲ系がＯＤＴＮＥを妨げることは現在十分に確立されている（Ｉｇｏｕｃｈｅｖａら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００８年、第１８巻、１１１−１２２頁；Ｋｅｎｎｅｄｙ ＭａｇｕｉｒｅおよびＫｍｉｅｃ、Ｇｅｎｅ、２００７年、第３８６巻、１０７−１１４頁；Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕら、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．、２００９年、第１１巻、２６７−２７４頁）。ＯＤＴＮＥの使用ならびにこの技術において機能的であるオリゴヌクレオチドの構造および設計は、とりわけ、国際公開第９８／５４３３０号パンフレット、国際公開第９９／２５８５３号パンフレット、国際公開第０１／２４６１５号パンフレット、国際公開第０１／２５４６０号パンフレット、国際公開第２００７／０８４２９４号パンフレット、国際公開第２００７０７３１４９号パンフレット、国際公開第２００７０７３１６６号パンフレット、国際公開第２００７０７３１７０号パンフレット、国際公開第２００９００２１５０号パンフレットに十分に記載されている。本願明細書に開示される変異原性オリゴヌクレオチドの構造的特徴および標的配列（変更対象の遺伝子）からの配列情報に基づいて、当業者は、第２の形質移入工程で使用されるべき所望の変異原性オリゴヌクレオチドを設計することができる。本発明で使用される変異原性オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で使用される他の変異原性オリゴヌクレオチドと同程度の長さ、すなわち典型的には１０〜６０ヌクレオチド、好ましくは２０〜５５ヌクレオチド、より好ましくは２５〜５０ヌクレオチドを有する。
【００３９】
変異原性オリゴヌクレオチドを使用する本発明は、例えば、細胞を変更するため、野生型への回復によって変異を修正するため、変異を誘導するため、コード領域の破壊により酵素を不活化するため、コード領域を変更することにより酵素の生理活性を改変するため、コード領域を破壊することによりタンパク質を改変するため、ｍｉＲＮＡ標的を改変するため、前駆体遺伝子を改変するためおよびより多くの目的のために使用することができる。
【００４０】
ある実施形態では、注目する分子はＤＮＡコンストラクトである。ＤＮＡコンストラクトは、細胞の中に導入されることが所望される配列情報（遺伝子標的指向化）を含有するＤＮＡ配列である。このＤＮＡコンストラクトは、ＺＦＮコンストラクトであることができる。
【００４１】
形質移入（第１の形質移入および第２の形質移入の両方）は、当該技術分野で記載される方法、例えば電気穿孔、微粒子銃、ＰＥＧ介在性形質移入などを使用して成し遂げることができる。ＰＥＧ介在性形質移入が好ましい。ＰＥＧ介在性形質移入（好ましい）または微粒子銃などの従来の形質移入は、最高技術水準の方法（Ｓｐｏｒｌｅｉｎら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９１年、第８２巻、７１２−７２２頁；ＭａｔｈｕｒおよびＫｏｎｃｚ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第８２巻、「Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｊ．Ｍａｒｉｎｅｚ−ＺａｐａｔｅｒおよびＪ．Ｓａｌｉｎａｓ編、ニュージャージー州、トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．；Ｇｏｌｄｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９３年、第１１巻、９５−１００頁）を使用して実施することができる。
【００４２】
遺伝子標的指向化は、極めて強力な技術であり、医学および農業の両方において多くの応用例を有する。遺伝子標的指向化はゲノムの正確な操作を可能にし、これにより、生物学者らが、遺伝子機能を研究開発することができる。しかしながら、ＨＲは、染色体の遺伝子座にＤＳＢが存在することに頼るので、ほとんどすべての細胞のタイプにおけるＨＲの効率は低い。従って、ＺＦＮの有用性は、いずれの染色体の遺伝子座においてもＤＳＢを誘導することができることであり、ＺＦＮが使用されて、遺伝子標的指向化の効率が１００倍改善された。ＤＳＢが生成されると、ＤＳＢはＮＨＥＪ経路またはＨＲ経路のいずれかによって修復されうる。ＨＲ、従って遺伝子標的指向化、の効率は、ＤＳＢがＨＲによって修復されうるようにＮＨＥＪ経路を阻害することにより、高めることができる。これは、ヒトおよび真菌の細胞において実際に当てはまることが示されている（Ｆａｔｔａｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００８年、第１０５巻、８７０３−８７０８頁；Ｍｅｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００７年、第１２８巻、７７０−７７５頁；Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００９年、第４１巻、１０６−１１４頁）。ＮＨＥＪとＨＲとの間の選択は、細胞周期の期に依存する可能性もあり、Ｇ１では、相同的な鋳型の不存在に起因してＮＨＥＪが優勢であり、他方で、相同的な姉妹染色分体が存在するＧ２／ＭではＨＲがより活性である（ＢｒａｎｚｅｉおよびＦｏｉａｎｉ、Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、２００８年）。
【００４３】
植物の育種におけるＯＤＴＮＥおよびＺＦＮ
植物の育種では、従来の交配により植物のパフォーマンスを改善するために、自然の遺伝的変異が使用される。しかしながら、自然の変異は限られており、育種プログラムが価値ある新しい変種を生成するために多くの年月を要する。遺伝的変異は、人工的におよび伝統的に作成することができ、これは、宿主植物のゲノムに多くの変異を導入する化学的な変異生成によって行われる。最終的にいくつかの変異が注目する表現型を与えるであろうから、それを育種プログラムにおいて使用することができる。しかしながら、これらの方法は、残留する変異を取り除くための多くの戻し交配が必要であることおよびこのような化学物質によって導入される変異の範囲が限られることなどの欠点を有する。それゆえ、ＯＤＴＮＥおよびＺＦＮなどの技術は、植物において指向的でクリーンな方法で遺伝子変異を導入するための魅力的な解決策を代表する。しかしながら、動物系を植物系へと移すことは、とりわけ、標的にされた遺伝子変化を促進することが公知の生理的条件を複製するという大きな課題を突きつける。
【００４４】
機能的ＭＭＲ系はＯＤＴＮＥを妨げ、遺伝子修復の実質的な増大が、ｓｉＲＮＡを使用してＭＳＨ２をノックアウトした後に観察された。しかしながら、これらの方法は、安定に統合されたｓｉＲＮＡコンストラクトを利用し、それゆえＭＳＨ２は、構成的に抑制されるが、これは好ましいことではない。なぜなら、長期的に見れば、得られた変異誘発物の表現型は、その植物の死につながるからである。ＯＤＴＮＥは、細胞周期のＳ期において蓄積する細胞において促進されるということも示されている。
【００４５】
植物プロトプラストにおける特異的ｍＲＮＡの一過性抑制のための方法が記載されており（Ａｎら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３年、第６７巻、２６７４−２６７７頁）、これは、植物における（内因性の）ＭＭＲ遺伝子の一過性抑制のための価値あるツールである可能性があるということが本発明で見出された。Ｓ期における細胞の蓄積は、ヒドロキシ尿素またはアフィディコリンなどの化学物質を使用して容易に成し遂げることができる。本発明者らは、当該オリゴヌクレオチドの送達に関するこれらの種々のパラメータの調整によって各々の個々のパラメータの効果が増進される可能性があるということを見出した。これを成し遂げるために、本発明は、細胞が細胞周期のＳ期において蓄積している間のＭＭＲ抑制、およびそのあとの、注目する遺伝子の修正を促進するためのオリゴヌクレオチドの導入を提供する。
【００４６】
遺伝子標的指向化についても同じことが妥当し、ドナーコンストラクトの導入に先立って、細胞周期のＳ／Ｇ２／Ｍ期にある細胞の割合の増加が望ましく、ＮＨＥＪが抑制され、ＺＦＮが発現され、ＤＳＢが生成される。
【００４７】
植物細胞では、細胞における異種分子の導入は、非常に厚い細胞の存在のため、動物細胞におけるほどには容易ではなく、この非常に厚い細胞は、注目する分子がプロトプラストに到達するために除去される必要がある。これは、セルロース分解性酵素およびペクチン分解性酵素を用いた細胞壁の酵素による消化によって成し遂げられるが、酵素混合物が洗い流されるとすぐに、細胞は細胞壁を再形成することを開始する。それゆえ、長い期間にわたって、例えば少なくとも１０、３０、６０分間、または１、２、４、６、８、１０、１２、１６、または２４時間、またはこれより長く、例えば１０分間〜２４時間の間、プロトプラストの形質転換可能性（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｂｉｌｉｔｙ）を保持したい場合には、細胞壁再形成を防止することが非常に重要である。好都合なことに、細胞壁合成に影響を及ぼし、かつ注目する種々の分子を用いて形質移入されるまでプロトプラストを裸のまま維持するために使用することができる化学物質が存在する。本願では、このような細胞壁阻害剤の使用により、植物プロトプラストにおける連続的な異種分子の導入が可能になり、オリゴヌクレオチド依存性標的化遺伝子変化、およびＺＦＮを使用する遺伝子標的指向化の効率の改善につながるというエビデンスが提供される。
【００４８】
従って、本発明のある実施形態では、細胞壁の再形成を防止するために、非酵素組成物がプロトプラスト培養物に加えられる。細胞が細胞周期における適切な段階に到達するまで細胞壁再形成を破壊、防止、低下および／または遅延することにより、より多くの異種分子が細胞へと送達されることができ、形質移入の効率の上昇を成し遂げることができる。例えば洗浄するかまたは培地を細胞壁の再形成を阻害する化合物を含有しない培地で置き換えることによる、非酵素組成物の除去によって、細胞壁が形成されるようになり細胞は細胞周期を続けるようになる。
【００４９】
非酵素組成物は、所望の形質移入の特定の状況に応じて、植物細胞プロトプラストに加えることができる。この組成物は、
− 第１の形質移入の前もしくは第１の形質移入と同時に、
− 第１の形質移入と第２の形質移入との間に、
− 第２の形質移入の前もしくは第２の形質移入と同時に、または
第２の形質移入の後に
加えることができる。
【００５０】
細胞壁の形成を阻害または防止するこの非酵素組成物は、
− 第１の形質移入の前もしくは第１の形質移入と同時に、
− 第１の形質移入と第２の形質移入との間に、
− 第２の形質移入の前もしくは第２の形質移入と同時に、または
− 第２の形質移入の後でかつ細胞壁が形成されるのを許容する前に
除去することができる。
【００５１】
このようにして、細胞壁の再形成は、所望の形質移入を考慮して阻害することができる。例えば、図５に示されるトマトＡＬＳ遺伝子座でのフットプリント形成については、当該組成物は、第１の形質移入工程の前に加えられる。他の例では（図６および図７を参照）、当該組成物は、第１の形質移入と（ほとんど）同時に加えられる。同様に、細胞壁の再形成を短時間（１〜２４時間）許容し、次いで第１の形質移入に先立って細胞壁のさらなる形成を止めることも可能である。
【００５２】
第１の形質移入と第２の形質移入との間の期間は、少なくとも１０、３０、６０分間、または１、２、４、６、８、１０、１２、１６、２４時間から、数日まで、例えば９６時間まで、またはさらに長くまで変わってもよい。典型的には、この期間は１時間〜７２時間、好ましくは２〜４８時間、より好ましくは４〜４２時間、さらにより好ましくは１２〜３６時間である。
【００５３】
（阻害、破壊、遅延および／または低下による）細胞壁（再）形成へ干渉することは、プロトプラスト培地に、例えば、セルロース沈着を阻害するかまたは新生のセルロース微細線維を捕捉し、従って組織化された細胞壁へのそれらの組み込みを防止する１以上の化学的（すなわち非酵素）化合物を加えるによって成し遂げられる（Ｐａｒｅｋｈ−Ｏｌｍｅｄｏら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、２００３年、第１００２巻、４３−５６頁；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００２年、第１５９巻、６１−６７頁；ＭｅｙｅｒおよびＨｅｒｔｈ、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ｉｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ． ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」、Ｐｌａｎｔ、１９７８年、第１４２巻、第３号、２５３−２６２頁）。
【００５４】
本発明で使用される化学的化合物は、本願では「細胞壁形成阻害剤」と呼ばれる。これらの化学的化合物は、セルロース細胞壁の形成を防止、破壊、阻害および／または遅延することができ、これは、本願明細書中では「細胞壁形成を阻害すること（細胞壁形成の阻害）」と示される。
【００５５】
プロトプラスト培養物は、細胞壁の形成がないだけの状態で、または少なくとも細胞壁の形成の低下を伴うだけで、その通常の発生サイクルを経ることが許容されてもよい。このプロトプラストは、その発生サイクルを経て、ＤＮＡ合成が開始することが所望される期に到ったとき、当該細胞壁形成阻害剤は、例えば洗浄することによりまたは培地の置き換えにより、プロトプラスト培養物から実質的に除去することができる。
【００５６】
従って、当該細胞壁形成阻害剤を用いたプロトプラストの処理は、阻害剤（複数可）が加えられた瞬間から例えば、少なくとも１２〜６０時間、または２４〜４８時間、細胞壁形成を禁じる。従って、細胞壁形成を十分な期間阻害することにより、細胞が、通常は形質移入を受け入れない細胞周期におけるある時期に、従来の形質移入技術を使用することが可能になる。当該阻害剤の使用は、典型的には、細胞周期の進行に影響を及ぼさない。
【００５７】
考慮対象の化学物質は、好ましくは、細胞周期の進行と著しく干渉することなく、また使用される濃度でプロトプラストに有害であることもなく、細胞壁再形成を防止するべきである。これに関して、「著しく干渉することなく」は、当該化学物質が、細胞周期の進行が細胞周期の通常の速度、すなわちその化学物質の不存在下での速度の少なくとも５０％、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％で続くことを許容するということを意味する。これに関して、「有害である」は、プロトプラストのうちの少なくとも５０％、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％が、とりわけ本願明細書に記載される細胞壁再形成の阻害以外のいずれの他の点でも当該化学物質によって影響を受けないということを意味する。
【００５８】
種々の化学物質が細胞壁形成に干渉する。それらの化学物質のうちの多くは、除草剤として一般に使用される。例えば、２，６−ジクロロベンゾニトリル（ＤＣＢ）（ＤｅＢｏｌｔら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００７年、第１４５巻、３３４−３３８頁；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００２年、第１５９巻、６１−６７頁）は、セルロースシンターゼを阻害すること、それゆえ細胞板形成を破壊することにより作用する周知の除草剤である（Ｖａｕｇｈｎら、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ、１９９６年、第１９４巻、１１７−１３２頁）。ＤＣＢは、細胞膜へのセルロースシンターゼ複合体の送達に影響を及ぼすことなく、セルロースシンターゼ複合体の運動性を阻害することが示されている（ＤｅＢｏｌｔら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００７年、第１４５巻、３３４−３３８頁）。さらには、当該技術に関しては細胞周期の進行が当然に重要であるので、好ましい細胞壁形成阻害剤は、細胞周期の進行に影響を及ぼさないか（ＧａｌｂｒａｉｔｈおよびＳｈｉｅｌｄｓ、「Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ、１９８２年、第５５巻、第１号、２５−３０頁；ＭｅｙｅｒおよびＨｅｒｔｈ、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ｉｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」、Ｐｌａｎｔ、１９７８年、第１４２巻、第３号、２５３−２６２頁）、または限られた程度までしか影響を及ぼさない。ＤＣＢは、細胞周期の進行を制限せず、従って好ましい細胞壁形成阻害剤である。
【００５９】
他の化学物質としては、除草剤イソキサベン（ＤｅＢｏｌｔら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００７年、第１４５巻、３３４−３３８頁）が挙げられ、これは、細胞膜におけるセルロースシンターゼ複合体の統合を阻害し、既存のセルロースシンターゼ複合体を破壊する。従って、好ましい実施形態では、セルロース合成阻害剤はセルロースシンターゼ阻害剤である。別の実施形態では、当該化学物質は、セルロース合成に関与する遺伝子、例えばＣＥＳＡ遺伝子に干渉する。カルコフロールホワイトは、蛍光光沢剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｂｒｉｇｈｔｅｎｅｒ）とも呼ばれ、セルロース微細線維と競争して、調整された（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ）ネットワークへのセルロース微細線維の統合を防止する（ＲｏｎｃｅｒｏおよびＤｕｒａｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９８５年、第１６３巻、第３号、１１８０−１１８５頁、Ｈａｉｇｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８０年、第２１０巻、第４４７２号、９０３−９０６頁）。
【００６０】
他の細胞壁形成阻害剤は、例えば、ニトリル、ベンズアミドおよび／もしくはトリアゾロカルボキシアミド除草剤などのセルロース生合成阻害剤、ジニトロアニリン、ホスホロアミダート、ピリジン、ベンズアミドおよび／もしくはベンゼンジカルボン酸除草剤などの微小管集合阻害剤ならびに／またはセルロース沈着の阻害剤である。
【００６１】
ある実施形態では、セルロース生合成阻害剤は、ジクロベニル、クロルチアミド、フルポキサム、トリアゾフェナミド、フトキサゾリンＡ、フトラマイシン、タクストミンＡ、ブレフェルジンＡからなる群から選択される。
【００６２】
ある実施形態では、微小管集合阻害剤は、コブトリン（ｃｏｂｔｏｒｉｎ）、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル プロピザミド＝プロナミド、テブタム（ｔｅｂｕｔａｍ） ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）からなる群から選択される。
【００６３】
ある実施形態では、セルロース沈着の阻害剤はキンクロラックである。
【００６４】
ある実施形態では、細胞壁形成阻害剤は、モルリン（ｍｏｒｌｉｎ）（７−エトキシ−４−メチルクロメン−２−オン）、イソキサベン（ＣＡＳ ８２５５８−５０−７、Ｎ−［３−（１−エチル−１−メチルプロピル）−１，２−オキサゾール−５−イル］−２，６−ジメトキシベンズアミド）、ＡＥ Ｆ１５０９４４（Ｎ２−（１−エチル−３−フェニルプロピル）−６−（１−フルオロ−１−メチルエチル）−１，３，５，−トリアジン−２，４−ジアミン）、ジクロベニル（ジクロロベンゾニトリル）、カルコフロールおよび／またはカルコフロールホワイト（４，４’−ビス（（４−アニリノ−６−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−ｓ−トリアジン−２−イル）アミノ）−、２，２’−スチルベン二スルホン酸およびその塩）、オリザリン（ＣＡＳＲＮ １９０４４−８８−３、４−（ジプロピルアミノ）−３，５−ジニトロベンゼンスルホンアミド）、５−ｔｅｒｔ−ブチル−カルバモイルオキシ−３−（３−トリフルオロメチル）フェニル−４−チアゾリジノン、クマリン、３，４ デヒドロプロリン、
【化１】
、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル プロピザミド＝プロナミド、テブタム、ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、キンクロラックからなる群から選択される。
【００６５】
ある実施形態では、上に列挙された化学物質のうちの２以上の混合物を使用することができる。これらは、同時にまたは連続してプロトプラスト試料に加えることができる。
【００６６】
非酵素組成物の量および濃度は、種々の化学物質およびプロトプラスト系（の混合物）ごとに異なるであろうが、いくつかの初期の基礎的実験と一緒に本願明細書で引用される利用可能な文献に基づいて、当業者によって容易に決定されることが可能である。
【００６７】
植物細胞は双子葉植物または単子葉植物であってよい。
【００６８】
これに関して、好ましい双子葉植物は、モクレン科（Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ）、キンポウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）、サボテン科（Ｃａｃｔａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、ブナ科（Ｆａｇａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、モクセイ科（Ｏｌｅａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、およびセリ科（Ｕｍｂｅｌｉｆｅｒｅａｅ）からなる群から選択される。
【００６９】
これに関して、好ましい単子葉植物は、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、ラン科（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）、アヤメ科（Ｉｒｉｄａｃｅａｅ）、ウキクサ科（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）、およびネギ科（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）からなる群から選択される。
【００７０】
好ましい作物は、ジャガイモ、トウモロコシ、トマト、タバコ、綿、大豆、菜種である。
【００７１】
新しく単離されたプロトプラストは、通常は、自然にＧ０に同期化される（ＧａｌｂｒａｉｔｈおよびＳｈｉｅｌｄｓ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ、１９８２年、第５５巻、第１号、２５−３０頁）。所望の形質移入および所望の細胞期（Ｓ期、Ｍ期、Ｇ１期および／またはＧ２期）に依存して、プロトプラストの追加の同期化の必要性が、ある実施形態では、プロセス全体のまたは形質移入工程の効率をさらに高めるために、有利である場合がある。葉肉、分裂組織、または細胞懸濁液に由来するものなどの異なるプロトプラストは、活発に分裂していてもよいし活発に分裂していなくてもよいが、細胞期の同期化は、十分な形質移入を成し遂げるために望ましい場合がある。
【００７２】
従って、ある実施形態では、当該方法は、植物細胞または植物細胞プロトプラストの細胞期を同期化する工程をさらに含む。
【００７３】
細胞期の同期化は、リン酸飢餓、硝酸飢餓、イオン飢餓、血清飢餓、スクロース飢餓、オーキシン飢餓などの栄養欠乏によって成し遂げることができる。同期化は、同期化剤（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）をプロトプラスト試料に添加することにより成し遂げることもできる。
【００７４】
この同期化は、
− 植物細胞プロトプラストが植物細胞から形成される前に、または
− 第１の形質移入の前に、または
− 第２の形質移入の前に、または
− 第１の形質移入と第２の形質移入との間に
行うことができる。
【００７５】
同期化工程は、同期化剤が、
− 植物細胞プロトプラストが植物細胞から形成される前に、または
− 第１の形質移入の前に、または
− 第２の形質移入の前に、または
− 第１の形質移入と第２の形質移入との間に、または
− 第２の形質移入の後もしくは第２の形質移入と同時に、
例えば洗浄することによりまたは培地の置き換えにより除去される工程も含んでもよい。
【００７６】
同期化する工程は、植物細胞プロトプラストを、細胞壁の（再）形成を阻害または防止する非酵素組成物と接触させる工程とは独立に（例えば、前に、後にまたは同時に）実施されてもよい。
【００７７】
従って、ある実施形態では、同期化剤は、プロトプラスト試料に加えることができる。アフィディコリン（好ましい）、ヒドロキシ尿素（好ましい）、チミジン、コルヒチン、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル プロピザミド＝プロナミド、テブタム ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、ミモシン、アニソマイシン、α アマニチン、ロバスタチン、ジャスモン酸、アブサイシン酸、メナジオン、クリプトゲイン、熱、過酸化水素、過マンガン酸ナトリウム、インドメタシン、エポキソミシン（ｅｐｏｘｏｍｙｃｉｎ）、ラクタシスチン、ｉｃｒｆ １９３、オロモウシン、ロスコビチン、ボヘミン、スタウロスポリン、Ｋ２５２ａ、オカダ酸、エンドタール（ｅｎｄｏｔｈａｌ）、カフェイン、ＭＧ１３２、サイクリン依存性キナーゼおよびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤などの同期化剤、ならびにこれらの標的機構、量および濃度およびそれらの関連する細胞周期の期は、例えば「Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．Ｄｏｌｅｚｅｌ ｃ．ｓ．編、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ、２００７年、３２７頁以降に記載されている。アフィディコリンおよび／またはヒドロキシ尿素が好ましい。
【００７８】
選択された遺伝子座におけるフットプリント形成に向けられた本発明の方法の好ましい実施形態では、当該方法は、プロトプラストを生成するための細胞壁消化、細胞壁形成阻害剤（好ましくはＤＣＢ）を含む組成物による細胞壁阻害、同期化剤（好ましくはヒドロキシ尿素）の（第１の形質移入と同時にまたは第１の形質移入に先立つ）の添加、ＫＵ７０に対するｄｓＲＮＡ（第１の組成物）の添加、（好ましくは例えば、約６、１２、１８または２４時間の期間の後の）ＺＦＮコンストラクト（第２の組成物または第２の形質移入）の添加、（第２の形質移入と同時または第２の形質移入の直前の）同期化剤の除去の工程を含む。
【００７９】
遺伝子標的指向化事象を目的とした好ましい実施形態では、本発明に係る方法は、植物細胞プロトプラストの形成、細胞壁形成阻害剤の添加、例えばＫＵ７０（ＮＨＥＪ）（これに限定されない）に対する同期化剤、ＺＦＮコンストラクトおよび／またはｄｓＲＮＡの添加（第１の形質移入）、ならびに例えば６、１２、１８または２４時間の同期化の期間の後の、同期化剤の除去を伴う、ドナーコンストラクトの第２の形質移入を含む。
【００８０】
プロトプラストにおけるＯＤＴＮＥを目的とした好ましい実施形態では、植物細胞は、プロトプラスト形成前の４８時間まで同期化剤を与えられる。細胞壁の消化の後、細胞壁阻害剤は、ＭＭＲ（ＭＳＨ２または他のＭＭＲ関連遺伝子）に対して、ｄｓＲＮＡと一緒に加えられる（第１の形質移入）。所望の細胞周期の期において、細胞壁阻害が解除され、同期化剤が除去され、第２の形質移入のために変異原性オリゴヌクレオチドが加えられ、そして当該細胞は細胞周期を続けるようにされる。
【００８１】
本発明は、植物細胞プロトプラストを形質移入するためのキットであって、第１の組成物、第２の組成物、細胞壁の形成を阻害または防止する非酵素組成物、同期化剤、および１以上の注目する異種分子からなる群から選択される２以上を含むキット、にも関する。
【００８２】
本発明は、以下の非限定的な項目によって要約することができる。
（１）植物細胞プロトプラストにおける１以上の注目する分子の導入方法であって、
− 植物細胞から細胞壁を酵素により分解し、かつ／または植物細胞から前記細胞壁を取り除くことにより、植物細胞プロトプラストを準備する工程と、
− （ｉ）ミスマッチ修復系、非相同末端再結合からなる群から選択される１以上の経路の制御を変更することができる第１の組成物、および／または
（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる第２の組成物
を用いて前記植物細胞プロトプラストの第１の形質移入を実施する工程と、
− １以上の注目する分子を用いて前記植物細胞プロトプラストの第２の形質移入を実施する工程と、
− 前記細胞壁を形成させる工程と
を含み、前記第２の形質移入は前記第１の形質移入の後に実施される、方法。
【００８３】
（２）二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる前記第２の組成物は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡコンストラクトからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
【００８４】
（３）前記第１の組成物および前記第２の組成物は、実質的に同時に前記植物細胞プロトプラストへと与えられる、項目１に記載の方法。
【００８５】
（４）前記第１の組成物は、前記第２の組成物の前に加えられる、項目１に記載の方法。
【００８６】
（５）前記第２の組成物は、前記第１の組成物の前に加えられる、項目１に記載の方法。
【００８７】
（６）前記制御を変更することは、前記経路のうちの１以上の下方制御、好ましくは前記経路の一過性の下方制御である、項目１に記載の方法。
【００８８】
（７）前記方法は、
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と第２の形質移入との間に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の後に、
前記植物細胞プロトプラストを、前記細胞壁の（再）形成を阻害または防止する非酵素組成物と接触させる工程をさらに含み、前記方法は、
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と第２の形質移入との間に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の後で、
かつ前記細胞壁が形成されるのを許容する前に、
細胞壁の形成を阻害または防止する前記非酵素組成物を除去する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
【００８９】
（８）前記植物細胞または植物細胞プロトプラストの細胞周期の期を同期化する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
【００９０】
（９）前記同期化は、好ましくは
− 前記植物細胞プロトプラストが前記植物細胞から形成される前もしくは前記植物細胞プロトプラストが前記植物細胞から形成されるのと同時に、または
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と前記第２の形質移入との間に、
前記植物細胞または植物細胞プロトプラストを、同期化剤と接触させることにより成し遂げられる、項目８に記載の方法。
【００９１】
（１０）前記方法は、
− 前記植物細胞プロトプラストが前記植物細胞から形成される前に、または
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と前記第２の形質移入との間に、
前記同期化剤を除去する工程をさらに含む、項目９に記載の方法。
【００９２】
（１１）前記同期化する工程は、前記植物細胞プロトプラストを、前記細胞壁の（再）形成を阻害または防止する非酵素組成物と接触させる工程とは独立に（例えば、前に、後にまたは同時に）実施される、項目８に記載の方法。
【００９３】
（１２）細胞壁の形成を阻害する前記非酵素組成物は、
（ａ）セルロース生合成阻害剤、
（ｂ）微小管集合阻害剤、
（ｃ）セルロース沈着の阻害剤、
（ｄ）他の細胞壁形成阻害剤
からなる群から選択される１以上の細胞壁形成阻害剤を含有する、項目７に記載の方法。
【００９４】
（１３）前記セルロース生合成阻害剤は、ジクロベニル、クロルチアミド、フルポキサム、トリアゾフェナミド、フトキサゾリンＡ、フトラマイシン、タクストミンＡ、ブレフェルジンＡからなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
【００９５】
（１４）前記微小管集合阻害剤は、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル プロピザミド＝プロナミド、テブタム ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
【００９６】
（１５）前記セルロース沈着の阻害剤はキンクロラックである、項目１２に記載の方法。
【００９７】
（１６）前記他の細胞壁形成阻害剤は、モルリン（７−エトキシ−４−メチルクロメン−２−オン）、イソキサベン（ＣＡＳ ８２５５８−５０−７、Ｎ−［３−（１−エチル−１−メチルプロピル）−１，２−オキサゾール−５−イル］−２，６−ジメトキシベンズアミド）、ＡＥ Ｆ１５０９４４（Ｎ２−（１−エチル−３−フェニルプロピル）−６−（１−フルオロ−１−メチルエチル）−１，３，５，−トリアジン−２，４−ジアミン）、ジクロベニル（ジクロロベンゾニトリル）、カルコフロールおよび／またはカルコフロールホワイト（４，４’−ビス（（４−アニリノ−６−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−ｓ−トリアジン−２−イル）アミノ）−、２，２’−スチルベン二スルホン酸およびその塩）、オリザリン（ＣＡＳＲＮ １９０４４−８８−３、４−（ジプロピルアミノ）−３，５−ジニトロベンゼンスルホンアミド）、５−ｔｅｒｔ−ブチル−カルバモイルオキシ−３−（３−トリフルオロメチル）フェニル−４−チアゾリジノン、クマリン、３，４ デヒドロプロリン、
【化２】
、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル、プロピザミド＝プロナミド、テブタム、ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、キンクロラックからなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
【００９８】
（１７）前記第１の組成物は、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬ、ＭｕｔＨ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＳＨ７、ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、ＤＮＡ−ＰＫ複合体 Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、Ｋｕ８６、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０、ＲＡＤ５１、ＸＲＣＣ４、Ｎｂｓ１、ＰＡＲＰ−１のうちの１以上の制御を変更することができる、項目１に記載の方法。
【００９９】
（１８）前記第１の組成物はｄｓＲＮＡを含む、項目１に記載の方法。
【０１００】
（１９）前記第２の形質移入における前記１以上の分子は、化学物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、プラスミド、リポソーム、変異原性オリゴヌクレオチドからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
【０１０１】
（２０）細胞周期の期の前記同期化は、前記プロトプラストを細胞周期のＳ期、Ｍ期、Ｇ１および／またはＧ２期に同期化する、項目８に記載の方法。
【０１０２】
（２１）細胞周期の期の前記同期化は、リン酸飢餓、硝酸飢餓、イオン飢餓、血清飢餓、スクロース飢餓、オーキシン飢餓などの栄養欠乏により成し遂げられる、項目８に記載の方法。
【０１０３】
（２２）前記同期化剤は、アフィディコリン、ヒドロキシ尿素、チミジン、コルヒチン、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル プロピザミド＝プロナミド、テブタム ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、ミモシン、アニソマイシン、α アマニチン、ロバスタチン、ジャスモン酸、アブサイシン酸、メナジオン、クリプトゲイン、熱、過酸化水素、過マンガン酸ナトリウム、インドメタシン、エポキソミシン、ラクタシスチン、ｉｃｒｆ １９３、オロモウシン、ロスコビチン、ボヘミン、スタウロスポリン、Ｋ２５２ａ、オカダ酸、エンドタール、カフェイン、ＭＧ１３２、サイクリン依存性キナーゼおよびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤からなる群のうちの１以上から選択される、項目９に記載の方法。
【０１０４】
（２３）項目１９に記載の異種分子を用いて形質移入された植物細胞プロトプラスト。
【０１０５】
（２４）植物細胞プロトプラストを形質移入するためのキットであって、第１の組成物、第２の組成物、細胞壁の形成を阻害または防止する非酵素組成物、同期化剤、および１以上の注目する異種分子からなる群から選択される２以上を含むキット。
【実施例】
【０１０６】
植物ミスマッチ修復遺伝子および非相同末端再結合遺伝子
ＭＭＲ経路（ＭＳＨ２）およびＮＨＥＪ経路（Ｋｕ７０）に関わる遺伝子と相同性を共有するタバコおよびトマトのＥＳＴについて公共のデータベースをスクリーニングした。ｄｓＲＮＡを生成するために使用される領域に下線を引いてある。ｄｓＲＮＡは、当該技術分野で周知のプロトコルに従って生成した。加えて、注目する遺伝子のいずれかと著しい相同性を示さないプラスミドに由来する非特異的ｄｓＲＮＡ種を生成した。これを、ｄｓＲＮＡそれ自体の存在は特定のｍＲＮＡの抑制に関与しないことを実証するための対照として使用した。
【０１０７】
トマトＫｕ７０
ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＡＧＣＴＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＡＴＧＴＴＴＡＡＧＡＡＧＣＧＣＡＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＡＣＴＴＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＧＧＡＴＴＡＴＣＴＡＴＣＧＡＡＣＴＴＡＡＣＡＣＣＴＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＣＣＡＡＣＴＡＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＡＣＴＴＧＧＣＴＴＧＡＴＴＣＧＡＴＧＡＣＴＡＡＴＣＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＴＴＣＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＧＣＴＡＴＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＣＣＴＣＴＡＡＡＡＣＧＣＴＴＴＣＡＧＴＣＴＴＡＣＡＡＡＡＡＴＧＡＧＡＡＴＧＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＣＧＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＡＧＡＧＴＴＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＧＴＣＴＧＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＴＧＧＴＴＧＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＴＣＴＴＴＴＣＧＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＴＣＡＡＴＧＴＴＧＣＧＧＣＴＴＡＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＴＴＣＴＡＴＧＧＧＡＡＴＴＴＡＡＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＴＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＴＴＧＣＡＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＧＴＣＡＡＧＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＣＡＴＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＴＡＣＴＧＡＴＣＣＴＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＣＴＴＴＡＧＴＧＡＧＡＣＧＴＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＣＡＡＴＴＴＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＣＡＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧ［配列番号１］
【０１０８】
タバコＭＳＨ２
ＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧＡＴＡＧＡＴＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＡＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＧＧＧＣＣＧＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＡＣＣＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＧＣＴＡＴＴＴＧＴＧＡＧＣＡＣＡＴＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＡＣＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＧＴＡＡＣＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＡＧＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＧＡＴＡＧＣＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＣＴＡＡＴＣＧＣＡＡＧＣＴＡＡＣＴＡＴＧＣＴＴＴＡＣＡＡＧＧＴＴＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＧＴＧＡＴＣＡＧＡＧＴＴＴＴＧＧＴＡＴＴＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＧＡＧＴＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＡＧＴＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＣＴＣＴＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＴＡＡＴＴＣＣＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＣＴＴＣＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＴＧＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＣＧＴＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧＧＡＴＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴＧＣＣＡＣＴＧＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＧＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＧＡＴＧＣＡＧＴＴＧＡＣＴＣＴＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＡＴＴＣＴＴＴＴＡＧＴＴＣＴＴＣＡＧＡＴＴＡＧＡＡＣＴＡＴＡＴＣＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＧＡＡＴＧＡＴＡＧＴＧＡＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＡＴＡＡＣＴＴＡＧＣＣＴＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＧＴＴＴＡＡＡＴＣＣＴＴＡＣＣＣＣＡＡＡＣＡＴＧＡＴＴＣＴＣＴＧＴＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＴＧＴＡＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＧＴＴＡＡＡＴＡＧＴＡＡＡＣＧＴＴＡＴＣＴＴＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＡＡＣＡＴＴＧＧＴＡＧＴＡＧＴＣＴＡＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＣＣＴＴＣＡＣＡＡＣＧＡＣＴＡＡＡＣＡＡＣＣＴＴＣＣＣＴＴＣＴＣＴＴＡＡＡＡＣＡＣＣＣＴＡＡＡＣＴ［配列番号２］
【０１０９】
ＮｔＭＳＨ２およびＬｅＫｕ７０の下方制御の評価
ＬｅＫｕ７０またはＭｉｌｌｉＱ水に対するｄｓＲＮＡを用いたプロトプラストの形質移入の２４時間後に、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを単離した。Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡ合成を実施した。Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ装置（Ｒｏｃｈｅ）を使用して内因性のＬｅＫｕ７０のレベルを測定した。ｍＲＮＡ定量化のために使用したプライマーを、下記に列挙する。
【表１】
【０１１０】
トマトプロトプラストの単離
トマトＭ８２栽培品種のインビトロでのシュート培養物（ｓｈｏｏｔ ｃｕｌｔｕｒｅ）を、２５℃および６０〜７０％ＲＨで、２０００ｌｕｘの１６／８時間の光周期を用いて、０．８％ Ｍｉｃｒｏ−Ａｇａｒを補ったＭＳ２０培地上で維持する。１グラムの若葉をＣＰＷ９Ｍの中でやさしくスライスし、酵素溶液（２％ セルロースｏｎｏｚｕｋａ ＲＳ、０．４％ ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ１０、２．４−Ｄ（２ｍｇ／ｍｌ）、ＮＡＡ（２ｍｇ／ｍｌ）、ＢＡＰ（２ｍｇ／ｍｌ） ｐＨ５．８）、およびヒドロキシ尿素（２ｍＭ）を含有するＣＰＷ９Ｍ）に移す。消化を、暗所で、２５℃で一晩進行させる。翌朝、ペトリ皿を１時間やさしく渦を巻かせ、プロトプラストを遊離させる。このプロトプラスト懸濁液を５０μｍメッシュのステンレス鋼製ふるいに通して濾過し、室温で、８５×ｇで５分間の遠心分離によってプロトプラストを回収する。このプロトプラストペレットを、２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補ったＣＰＷ９Ｍに再懸濁し、各チューブの底に、３ｍＬのＣＰＷ１８Ｓを加える。遠心分離（１０分間、室温、８５×ｇ）の間に２つの層の間の界面に蓄積する生プロトプラストを集め、血球計算器を使用してそれらの密度を評価する。プロトプラストを、室温で、８５×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補ったＭａＭｇ培地に、１０６／ｍＬの最終密度に再懸濁する。
【０１１１】
トマトプロトプラスト形質移入
フットプリント形成（実施例１）
各形質移入について、２５００００のプロトプラストを、２５μｇのトマトＫｕ７０に対する二本鎖ＲＮＡおよび２５０μＬのＰＥＧ溶液（４０％ ＰＥＧ４０００（Ｆｌｕｋａ 番号８１２４０）、０．１Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２、０．４Ｍ マンニトール）と混合する。形質移入を、室温で２０分間進行させる。５ｍＬの０．２７５Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２を滴下し、十分に混合する。形質移入されたプロトプラストを室温で、８５×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、ＣＰＷ９Ｍの中で２回洗浄する。最後に、プロトプラストを、２ｍｇ．Ｌ−１ジクロベニルおよび２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補ったＫ８ｐに、２５００００／ｍＬの最終密度に再懸濁し、暗所で、２５℃で一晩インキュベーションする。翌朝、プロトプラストを室温で、８５×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補ったＣＰＷ９Ｍの中で１回洗浄し、生プロトプラストを上記のとおり単離する。生プロトプラストを、ＭａＭｇに、１０６／ｍＬの最終密度に再懸濁し、２０μｇのＺＦＮコンストラクト（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年）を用いて上記のとおり形質移入する。次いでプロトプラストをアルギン酸（塩）中に包埋し、Ｋ８ｐ培地中で培養する。
【０１１２】
遺伝子標的指向化（実施例２）
各形質移入について、２５００００のプロトプラストを、２５μｇのトマトＫｕ７０に対する二本鎖ＲＮＡ、２０μｇのＺＦＮコンストラクト（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年）および２５０μＬのＰＥＧ溶液（４０％ ＰＥＧ４０００（Ｆｌｕｋａ 番号８１２４０）、０．１Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２、０．４Ｍ マンニトール）と混合する。形質移入を、室温で２０分間進行させる。５ｍＬの０．２７５Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２を滴下し、十分に混合する。形質移入されたプロトプラストを、室温で、８５×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、ＣＰＷ９Ｍの中で２回洗浄する。最後に、プロトプラストを、２ｍｇ．Ｌ−１ジクロベニルおよび２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補ったＫ８ｐに、２５００００／ｍＬの最終密度に再懸濁し、暗所で、２５℃で一晩インキュベーションする。翌朝、プロトプラストを室温で、８５×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補ったＣＰＷ９Ｍの中で１回洗浄し、生プロトプラストを上記のとおり単離する。生プロトプラストを、ＭａＭｇに、１０６／ｍＬの最終密度に再懸濁し、２０μｇのドナーコンストラクトを用いて上記のとおり形質移入する。次いでプロトプラストをアルギン酸（塩）中に包埋し、Ｋ８ｐ培地中で培養する。
【０１１３】
フットプリントの検出（実施例１）
３日の培養後、アルギン酸（塩）の皿をクエン酸ナトリウムに溶解させ、プロトプラストを遠心分離によって回収し、あとのＤＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するＤＮＡ抽出のために液体窒素の中で凍結する。全長ＡＬＳオープンリーディングフレームを、校正Ｔａｑポリメラーゼを使用してＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ ＸＬ ＰＣＲクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換する。１００μｇ．ｍＬ−１カルベニシリンを補ったＬＢ寒天上に細菌をプレーティングし、３７℃で一晩インキュベーションする。翌朝、４００の個々のクローンを取り上げ、ＡＬＳ遺伝子座にミスマッチを有するクローンを特定するためのＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ装置（Ｒｏｃｈｅ）での高分解能融解曲線分析のために使用する。陽性のクローンをシーケンシングによって確認する。
【０１１４】
遺伝子標的指向化事象の検出（実施例２）
１４日の培養後、アルギン酸（塩）の皿を５ｍｍの細片へと切断し、０．８％ ｍｉｃｒｏ ａｇａｒを用いて固形化しかつ２０ｎＭ クロルスルフロンを補ったＴＭ−ＤＢ培地の表面上に配置する。遺伝子標的指向化事象から生じるカルスは、クロルスルフロンに対して耐性を持つであろうから、６〜８週間発育するであろう。耐性のカルスをサンプリングし、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｅａｓｙキットを使用してＤＮＡを抽出する。ＡＬＳ遺伝子の全長コード配列をＰＣＲによって増幅し、変異の存在をシーケンシングによって確認する。
【０１１５】
実施例３
植物細胞株
非機能的なＥＧＦＰ遺伝子を含有するタバコＢｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２細胞の懸濁液を、このタンパク質の発色団領域に、未熟の終止コドンの形成を生じる点変異を導入することにより、生成した。この株は、オリゴヌクレオチド依存性標的化遺伝子修復によるＥＧＦＰ遺伝子の修復に対する種々のパラメータの影響を試験するためのレポーター系として使用する。
【０１１６】
ＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡ［配列番号７］
【０１１７】
変異したＥＧＦＰ（ｍＥＧＦＰ）のｃＤＮＡ配列において、変異の位置は、下線付きおよび太字（Ｇ→Ｔ）で示されている。
【０１１８】
修復および対照オリゴヌクレオチド配列
ＧＦＰ ７ 配列番号８ Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊ＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＣ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ
ＧＦＰ ８ 配列番号９ Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊ＣＡＧＣＴＣＣＴＡＧＣＣＣＴＴＧＣ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ
＊は、ホスホロチオエート修飾を示す。
【０１１９】
タバコプロトプラストの単離
ＢＹ−２培地（Ｎａｇａｔａら、Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ、１９９９年）に一週間維持した５ｍＬの７日齢のタバコＢｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２（ＢＹ−２）細胞懸濁培養液を、２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補った４５ｍＬのＢＹ−２培地が入っている５０ｍＬの三角フラスコに移す。細胞を２４時間分裂させ、室温で、１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって回収する。押し固められた細胞容積に、ＭＤＥ（全量９００ｍｌの中に、０．２５ｇのＫＣｌ、１．０ｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．１３６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのポリビニルピロリドン（ＭＷ １０，０００）、６ｍｇのナフタレン酢酸および２ｍｇの６−ベンジルアミノプリン。この溶液の浸透圧を、ソルビトールを用いて６００ｍＯｓｍ．ｋｇ−１に調整する。ｐＨ ５．７）中のＢＹ−２酵素混合物（１％（ｗ／ｖ）セルラーゼＯｎｏｚｕｋａ ＲＳ、０．０５％ ペクチナーゼ Ｙ２３、０．２％ ドリセラーゼ（ｄｒｉｓｅｌａｓｅ）（担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ ｓｐ）由来））２５ｍＬを加える。細胞をＴＣ品質のペトリ皿に移し、緩やかな撹拌（４０ｒｐｍ）のもとで消化を、２５℃で４時間進行させる。このプロトプラスト懸濁液を５０μｍメッシュのステンレス鋼製のふるいに通して濾過し、５℃で、８００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収する。プロトプラストを、２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補った氷冷したＫＣ洗浄用培地（０．２％ ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１．７％ ＫＣｌ、ＫＣｌを用いて５４０ｍＯｓｍ．Ｋｇ−１、ｐＨ ５．７）に再懸濁し、５℃で、８００ｒｐｍで５分間遠心分離する。プロトプラストを２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補ったＫＣ洗浄用培地に再懸濁し、各チューブの底に、３ｍＬのＣＰＷ１８Ｓを加える。生プロトプラストは、５℃で、８００ｒｐｍで１０分間の遠心分離の際に２つの培地の界面に蓄積するであろう。生プロトプラストを回収し、血球計算器を使用してそれらの密度を評価する。プロトプラスト密度を、氷冷したＫＣ洗浄用培地を使用して１０６／ｍＬに調整する。
【０１２０】
タバコプロトプラスト形質移入
トマトプロトプラストについてと同様に、タバコプロトプラスト形質移入を実施する。タバコプロトプラストを、１２．５μｇのタバコＭＳＨ２に対するｄｓＲＮＡ用いて形質移入する。形質移入されたプロトプラストを、２ｍＭ ヒドロキシ尿素および２ｍｇ．Ｌ−１ジクロベニルを補ったＴｏ培地２．５ｍＬに再懸濁する。Ｔｏ培地は、（１リットルあたり、ｐＨ ５．７）９５０ｍｇ ＫＮＯ３、８２５ｍｇ ＮＨ４ＮＯ３、２２０ｍｇ ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１８５ｍｇ ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、８５ｍｇ ＫＨ２ＰＯ４、２７．８５ｍｇ ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、３７．２５ｍｇ Ｎａ２ＥＤＴＡ．２Ｈ２Ｏ、Ｈｅｌｌｅｒの培地（Ｈｅｌｌｅｒ，Ｒ．、Ａｎｎ Ｓｃｉ Ｎａｔ Ｂｏｔ Ｂｉｏｌ Ｖｅｇ、１９５３年）に係る微量栄養素、ＭｏｒｅｌおよびＷｅｔｍｏｒｅの培地（Ｍｏｒｅｌ，Ｇ．およびＲ．Ｈ．Ｗｅｔｍｏｒｅ、Ａｍｅｒ．Ｊ． Ｂｏｔ．、１９５１年）に係るビタミン、２％（ｗ／ｖ）スクロース、３ｍｇ ナフタレン酢酸、１ｍｇ ６−ベンジルアミノプリン、および浸透圧を５４０ｍＯｓｍ．ｋｇ−１にするための量のマンニトールを含有しており、これを３５ｍｍペトリ皿に移した。翌日、プロトプラストを遠心分離によって回収し、２ｍＭ ヒドロキシ尿素および２ｍｇ．Ｌ−１ ジクロベニルを補った氷冷したＫＣ洗浄用培地で洗浄する。生プロトプラストを回収し、１．６ｎｍｏｌの、転写された鎖に相補的でかつ標的にされた配列との１つのミスマッチを含有する（ＧＦＰ ７）かまたは含有しない（ＧＦＰ ８）オリゴヌクレオチドを用いて上記のとおり形質移入する。３’末端および５’末端の両方にある４つのホスホロチオエート連結によって、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ分解から保護する。プロトプラストを、最終的に、ヒドロキシ尿素もジクロベニルも含まないＴｏ培地に再懸濁する。２４時間後、バンドパス（ｂａｎｄ ｐａｓｓ） ＧＦＰフィルターキューブ（ｆｉｌｔｅｒ ｃｕｂｅ）を取り付け、ＣＦＩ Ｓｕｐｅｒ Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ ＥＬＷＤ ２０ＸＣ対物レンズを取り付けたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＳ１００−Ｆを使用してＥＧＦＰ回復を採点する。
【０１２１】
結果
タバコおよびトマトＭＳＨ２の下方制御
結果を図８に提示する。これらの結果は、ＭＳＨ ｍＲＮＡのレベルが単離後に上昇するということを実証する。大多数の葉プロトプラストは、活発に分裂していない葉肉細胞に由来する。単離後、培地中のホルモンは、これらの細胞が細胞周期へと再進入すること、および結果としてＭＭＲ遺伝子のレベルの誘導を誘導する。非特異的ｄｓＲＮＡ（ＭＳＨ２と相同性を共有しない）の添加は発現レベルに影響を及ぼさないが、他方で、ＭＳＨ２ ｄｓＲＮＡは、ＭＳＨ２ ｍＲＮＡレベルを、単離後にプロトプラストにおいて見出されるＭＳＨ２ ｍＲＮＡレベルの５〜２０％まで低下させることにおいて有効である。本発明者らは、ＭＬＨ１およびＫＵ７０の両方に標的化されたｄｓＲＮＡについて同様の結果を見出した。
【０１２２】
トマトＡＬＳ遺伝子座でのフットプリント形成（実施例１、図５）
すべての試料を、２ｍＭ ヒドロキシ尿素で処理した（材料および方法を参照）。
【表２】
【０１２３】
トマトＡＬＳ遺伝子座での遺伝子標的指向化事象（実施例２、図６）
実施例２：植物プロトプラストにおける効率的な遺伝子標的指向化についての実験計画、図６を参照。
すべての試料を、２ｍＭ ヒドロキシ尿素で処理した（材料および方法を参照）。
【表３】
ＢＹ−２プロトプラストにおけるｍｅＧＦＰ回復
【０１２４】
実施例３：植物プロトプラストにおける効率的なＯＤＴＮＥについての実験計画、図７を参照。すべての試料を、２ｍＭ ヒドロキシ尿素で処理した（材料および方法を参照）。
【表４】
【０１２５】
上記の実施例から、細胞壁阻害を用いるフットプリント形成、遺伝子標的指向化またはＯＤＴＮＥについて必要とされる事象の順序の最適化によって、すべての記載されたプロセスにおける実質的な改善が導かれるということが明らかである。
【０１２６】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ
＜１１０＞ Ｋｅｙｇｅｎｅ ＮＶ
＜１２０＞ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
＜１３０＞ Ｐ３００３９ＰＣ００
＜１５０＞ ＵＳ ６１／２８８４７４
＜１５１＞ ２００９−１２−２１
＜１５０＞ ＮＬ２００４０２０
＜１５１＞ ２００９−１２−２４
＜１６０＞ ９
＜１７０＞ ＰａｔｅｎｔＩｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．３
＜２１０＞ １
＜２１１＞ ７７６
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
＜２２０＞
＜２２１＞ ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２３＞ ＫＵ７０
＜４００＞ １
ｇｇａａｇａｔｃｔｇ ａａｃｇａｃｃａｇｃ ｔｔａｇｇａａａｃｇ ｃａｔｇｔｔｔａａｇ ａａｇｃｇｃａｇａｇ ｔｔｃｇａａｇａｃｔ ６０
ｔｃｇａｃｔｔｇｔａ ａｔｔｔｔｔａａｔｇ ｇａｔｔａｔｃｔａｔ ｃｇａａｃｔｔａａｃ ａｃｃｔａｔｇｃｔｔ ｔｇａｔｃｃｇｔｃｃ １２０
ａａｃｔａａｔｃｃａ ｇｇｇａｃａａｔｔａ ｃｔｔｇｇｃｔｔｇａ ｔｔｃｇａｔｇａｃｔ ａａｔｃｔｔｃｃｔｔ ｔｇａａｇａｃｔｇａ １８０
ｇａｇａａｃｃｔｔｃ ａｔａｔｇｔｇｃｔｇ ａｔａｃｔｇｇｔｇｃ ｔａｔａｇｔｔｃａｇ ｇａｇｃｃｔｃｔａａ ａａｃｇｃｔｔｔｃａ ２４０
ｇｔｃｔｔａｃａａａ ａａｔｇａｇａａｔｇ ｔｃａｔｃｔｔｔｔｃ ｔｇｃｇｇａｔｇａｇ ｃｔｔｔｃａｇａａｇ ｔｃａａａａｇａｇｔ ３００
ｔｔｃａａｃｔｇｇａ ｃａｔｃｔｔｃｇｔｃ ｔｇｔｔｇｇｇｃｔｔ ｃａａｇｃｃｔｔｔｇ ａｇｃｔｇｃｔｔａａ ａａｇａｃｔａｔｃａ ３６０
ｔａａｃｃｔｇａａｇ ｃｃａｇｃａａｃｔｔ ｔｔｇｔｃｔｔｔｃｃ ｃａｇｔｇａｔｇａｇ ｇａａｇｔｇｇｔｔｇ ｇａａｇｃａｃｔｔｇ ４２０
ｔｃｔｔｔｔｃｇｔｔ ｇｃｔｃｔｃｃａａａ ｇａｔｃａａｔｇｔｔ ｇｃｇｇｃｔｔａａｇ ｃｇｔｔｔｔｇｃａｇ ｔｔｇｃｔｔｔｃｔａ ４８０
ｔｇｇｇａａｔｔｔａ ａｇｔｃａｔｃｃｔｃ ａａｔｔｇｇｔｔｇｃ ｔｃｔｔｇｔｔｇｃａ ｃａａｇａｔｇａａｇ ｔａａｔｇａｃｔｃｃ ５４０
ｔａｇｔｇｇｔｃａａ ｇｔｃｇａｇｃｃａｃ ｃａｇｇｇａｔｇｃａ ｔｃｔｇａｔｔｔａｔ ｃｔｔｃｃａｔａｔｔ ｃｔｇａｔｇａｔａｔ ６００
ｃａｇａｃａｔｇｔｔ ｇａａｇａｇｃｔｔｃ ａｔａｃｔｇａｔｃｃ ｔａａｔｔｃｃｇｔｇ ｃｃｔｃａｔｇｃｃａ ｃｔｇａｔｇａｃｃａ ６６０
ｇａｔａａａｇａａｇ ｇｃｃｔｃｃｇｃｔｔ ｔａｇｔｇａｇａｃｇ ｔａｔｔｇａｃｃｔｃ ａａａｇａｔｔｔｔｔ ｃｔｇｔｇｔｇｇｃａ ７２０
ａｔｔｔｇｃｔａａｔ ｃｃｔｇｃａｔｔｇｃ ａｇａｇａｃａｔｔａ ｔｇｃａｇｔａｔｔａ ｃａａｇｃｔｃｔｔｇ ｃａｃｔｔｇ ７７６
＜２１０＞ ２
＜２１１＞ ８８４
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ
＜４００＞ ２
ｇｇａｇｃｔａｃｔｇ ａｔａｇａｔｃａｔｔ ｇａｔｔａｔａａｔｔ ｇａｔｇａｇｔｔｇｇ ｇｃｃｇｔｇｇｔａｃ ａｔｃａａｃｃｔａｔ ６０
ｇａｔｇｇｃｔｔｔｇ ｇｔｔｔａｇｃｔｔｇ ｇｇｃｔａｔｔｔｇｔ ｇａｇｃａｃａｔｔｇ ｔｔｇａａｇａａａｔ ｔａａｇｇｃａｃｃａ １２０
ａｃａｔｔｇｔｔｔｇ ｃｃａｃｔｃａｃｔｔ ｔｃａｔｇａｇｃｔｇ ａｃｔｇｃａｔｔｇｇ ｃｃａａｃａａｇａａ ｔｇｇｔａａｃａａｔ １８０
ｇｇａｃａｔａａｇｃ ａａａａｔｇｃｔｇｇ ｇａｔａｇｃａａａｔ ｔｔｔｃａｔｇｔｔｔ ｔｔｇｃａｃａｃａｔ ｔｇａｃｃｃｔｔｃｔ ２４０
ａａｔｃｇｃａａｇｃ ｔａａｃｔａｔｇｃｔ ｔｔａｃａａｇｇｔｔ ｃａａｃｃａｇｇｔｇ ｃｔｔｇｔｇａｔｃａ ｇａｇｔｔｔｔｇｇｔ ３００
ａｔｔｃａｔｇｔｔｇ ｃｔｇａａｔｔｔｇｃ ａａａｔｔｔｔｃｃａ ｃｃｇａｇｔｇｔｔｇ ｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃ ｃａｇａｇａａａａｇ ３６０
ｇｃａｔｃｔｇａｇｔ ｔｇｇａｇｇａｔｔｔ ｃｔｃｔｃｃｔａｔｔ ｇｃｃａｔａａｔｔｃ ｃａａａｔｇａｃａｔ ｔａａａｇａｇｇｃａ ４２０
ｇｃｔｔｃａａａａｃ ｇｇａａｇａｇａｇａ ａｔｔｔｇａｃｃｃｔ ｃａｔｇａｃｇｔｇｔ ｃｔａｇａｇｇｔａｃ ｔｇｃｃａｇａｇｃｔ ４８０
ｃｇｇｃａａｔｔｃｔ ｔａｃａｇｇａｔｔｔ ｃｔｃｔｃａｇｔｔｇ ｃｃａｃｔｇｇａｔａ ａｇａｔｇｇａｔｃｃ ａａｇｃｇａｇｇｔｃ ５４０
ａｇｇｃａａｃａｇｔ ｔｇａｇｃａａａａｔ ｇａａａａｃｃｇａｃ ｃｔｇｇａｇａｇｇｇ ａｔｇｃａｇｔｔｇａ ｃｔｃｔｃａｃｔｇｇ ６００
ｔｔｔｃａｇｃａａｔ ｔｃｔｔｔｔａｇｔｔ ｃｔｔｃａｇａｔｔａ ｇａａｃｔａｔａｔｃ ｔｔｃｔａｔｔｃｔｇ ｔｇａａｇｃｔｔｇｇ ６６０
ｇｇｇａａｔｇａｔａ ｇｔｇａｔｇｇｇｔｔ ｔｔｇｔｇｇａｔａｔ ａａｃｔｔａｇｃｃｔ ａａｇｔｇｔａａａｇ ｔｔｔｃｇｔｔｔａａ ７２０
ａｔｃｃｔｔａｃｃｃ ｃａａａｃａｔｇａｔ ｔｃｔｃｔｇｔａａｔ ｃａｇｇｇｇａｃｔｔ ｔｔｇｔａｔｇｃａｔ ｃｃｔｇｔｇｔｔａａ ７８０
ａｔａｇｔａａａｃｇ ｔｔａｔｃｔｔａｔｇ ｇｔｃａｇｃｔａａｃ ａｔｔｇｇｔａｇｔａ ｇｔｃｔａｔｔｇａａ ｔｔａｔｔｃｃｔｔｃ ８４０
ａｃａａｃｇａｃｔａ ａａｃａａｃｃｔｔｃ ｃｃｔｔｃｔｃｔｔａ ａａａｃａｃｃｃｔａ ａａｃｔ ８８４
＜２１０＞ ３
＜２１１＞ １８
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
＜２２０＞
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞ ３
ａｃｃａｇｃｔｔａｇ ｇａａａｃｇｃａ
＜２１０＞ ４
＜２１１＞ １８
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞ ４
ａｇｃａｃｃａｇｔａ ｔｃａｇｃａｃａ
＜２１０＞ ５
＜２１１＞ ２３
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
＜２２０＞
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞ ５
ｃａｃａｃａｔｔｇａ ｃｃｃｔｔｃｔａａｔ ｃｇｃ ２３
＜２１０＞ ６
＜２１１＞ ２３
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
＜２２０＞
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞ ６
ａｇａａａｔｃｃｔｃ ｃａａｃｔｃａｇａｔ ｇｃｃ ２３
＜２１０＞ ７
＜２１１＞ ７８６
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ
＜４００＞ ７
ａｔｇｇｇａａｇａｇ ｇａｔｃｇｃａｔｃａ ｃｃａｃｃａｔｃａｔ ｃａｔａａｇｃｔｔｃ ｃａａａｇａａｇａａ ｇａｇｇａａｇｇｔｔ ６０
ｃｔｃｇａｇａｔｇｇ ｔｇａｇｃａａｇｇｇ ｃｔａｇｇａｇｃｔｇ ｔｔｃａｃｃｇｇｇｇ ｔｇｇｔｇｃｃｃａｔ ｃｃｔｇｇｔｃｇａｇ １２０
ｃｔｇｇａｃｇｇｃｇ ａｃｇｔａａａｃｇｇ ｃｃａｃａａｇｔｔｃ ａｇｃｇｔｇｔｃｃｇ ｇｃｇａｇｇｇｃｇａ ｇｇｇｃｇａｔｇｃｃ １８０
ａｃｃｔａｃｇｇｃａ ａｇｃｔｇａｃｃｃｔ ｇａａｇｔｔｃａｔｃ ｔｇｃａｃｃａｃｃｇ ｇｃａａｇｃｔｇｃｃ ｃｇｔｇｃｃｃｔｇｇ ２４０
ｃｃｃａｃｃｃｔｃｇ ｔｇａｃｃａｃｃｃｔ ｇａｃｃｔａｃｇｇｃ ｇｔｇｃａｇｔｇｃｔ ｔｃａｇｃｃｇｃｔａ ｃｃｃｃｇａｃｃａｃ ３００
ａｔｇａａｇｃａｇｃ ａｃｇａｃｔｔｃｔｔ ｃａａｇｔｃｃｇｃｃ ａｔｇｃｃｃｇａａｇ ｇｃｔａｃｇｔｃｃａ ｇｇａｇｃｇｃａｃｃ ３６０
ａｔｃｔｔｃｔｔｃａ ａｇｇａｃｇａｃｇｇ ｃａａｃｔａｃａａｇ ａｃｃｃｇｃｇｃｃｇ ａｇｇｔｇａａｇｔｔ ｃｇａｇｇｇｃｇａｃ ４２０
ａｃｃｃｔｇｇｔｇａ ａｃｃｇｃａｔｃｇａ ｇｃｔｇａａｇｇｇｃ ａｔｃｇａｃｔｔｃａ ａｇｇａｇｇａｃｇｇ ｃａａｃａｔｃｃｔｇ ４８０
ｇｇｇｃａｃａａｇｃ ｔｇｇａｇｔａｃａａ ｃｔａｃａａｃａｇｃ ｃａｃａａｃｇｔｃｔ ａｔａｔｃａｔｇｇｃ ｃｇａｃａａｇｃａｇ ５４０
ａａｇａａｃｇｇｃａ ｔｃａａｇｇｔｇａａ ｃｔｔｃａａｇａｔｃ ｃｇｃｃａｃａａｃａ ｔｃｇａｇｇａｃｇｇ ｃａｇｃｇｔｇｃａｇ ６００
ｃｔｃｇｃｃｇａｃｃ ａｃｔａｃｃａｇｃａ ｇａａｃａｃｃｃｃｃ ａｔｃｇｇｃｇａｃｇ ｇｃｃｃｃｇｔｇｃｔ ｇｃｔｇｃｃｃｇａｃ ６６０
ａａｃｃａｃｔａｃｃ ｔｇａｇｃａｃｃｃａ ｇｔｃｃｇｃｃｃｔｇ ａｇｃａａａｇａｃｃ ｃｃａａｃｇａｇａａ ｇｃｇｃｇａｔｃａｃ ７２０
ａｔｇｇｔｃｃｔｇｃ ｔｇｇａｇｔｔｃｇｔ ｇａｃｃｇｃｃｇｃｃ ｇｇｇａｔｃａｃｔｃ ｔｃｇｇｃａｔｇｇａ ｃｇａｇｃｔｇｔａｃ ７８０
ａａｇｔａａ ７８６
＜２１０＞ ８
＜２１１＞ ２５
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
＜２２０＞
＜２２３＞ ｍｕｔａｇｅｎｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
＜２２０＞
＜２２１＞ ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂａｓｅ
＜２２２＞ （１） ．． （４）
＜２２３＞ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
＜２２０＞
＜２２１＞ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｓｅ
＜２２２＞ （２２） ．． （２５）
＜２２３＞ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
＜４００＞ ８
ｔｇａａｃａｇｃｔｃ ｃｔｃｇｃｃｃｔｔｇ ｃｔｃａｃ ２５
＜２１０＞ ９
＜２１１＞ ２５
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
＜２２０＞
＜２２３＞ ｍｕｔａｇｅｎｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
＜２２０＞
＜２２１＞ ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂａｓｅ
＜２２２＞ （１） ．． （４）
＜２２３＞ ｐｈｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
＜２２０＞
＜２２１＞ ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂａｓｅ
＜２２２＞ （２２） ．． （２５）
＜２２３＞ ｐｈｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
＜４００＞ ９
ｔｇａａｃａｇｃｔｃ ｃｔａｇｃｃｃｔｔｇ ｃｔｃａｃ ２５
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物細胞プロトプラストにおける注目する異種分子の導入方法に関する。本発明はさらに、形質移入された植物細胞プロトプラストに、および当該方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子修飾は、生細胞の、またはその細胞が一部を形成するかまたはその細胞が再生することができる場所となる生物の、１以上の遺伝子的にコードされた生物学的特性を改変する目的をもって、生細胞の遺伝子材料の変化を意図的に作成するプロセスである。これらの変化は、遺伝子材料の一部分の欠失、外因性の遺伝子材料の付加、または遺伝子材料の既存のヌクレオチド配列における置換のような変化の形をとることができる。
【０００３】
真核生物の遺伝子修飾の方法は、２０年を超える年月にわたって知られており、農業、ヒトの健康、食品の品質および環境保護の分野における改善のために、植物および動物の細胞ならびに微生物において幅広い応用例を見出してきた。
【０００４】
遺伝子修飾の一般的な方法は、外因性のＤＮＡ断片を細胞のゲノムに付加することからなり、これは、後に、すでに存在する遺伝子によってコードされる特性に勝り上回る新しい特性をその細胞またはその生物に与えることになる（これにより既存の遺伝子の発現が抑制されることになる応用例を含む）。多くのこのような例は所望の特性を入手する上で効果的であるが、とはいうものの、これらの方法はあまり正確ではない。なぜなら、外因性のＤＮＡ断片が挿入されるゲノムの位置に対する（従って、発現の最終的なレベルに対する）制御がないからであり、所望の効果は、もともとのそしてよくバランスがとれたゲノムによってコードされる自然の特性に勝って顕在化する必要があるからである。遭遇する一般的な問題は、宿主のゲノムＤＮＡの中への外因性のＤＮＡ断片のランダムな組み込みに起因して、必須または有益な遺伝子が不活性化または改変され、宿主の望ましい特徴の望まれない喪失を引き起こすということである。
【０００５】
反対に、所定のゲノム遺伝子座におけるヌクレオチドの付加、欠失または変換を生じることになる遺伝子修飾の方法は、既存の遺伝子の正確な修飾を可能にするであろう。
【０００６】
過去数十年間にわたるゲノミクスの出現を得て、今では、動物、植物および細菌のゲノムをより素早くかつ費用効率よく解読することが可能である。これは、動物における疾患感受性または植物における収量特性などの表現型に関連づけることができる豊富な遺伝子および調節配列をもたらした。これは、ある配列の推定上の機能が素早く確立されるようにするであろうが、観察される表現型に遺伝子が関与するという究極的なエビデンスは、予想される変更された表現型を示す変異体系統を創出することにより得られる必要がある。
【０００７】
動物細胞とは異なり、植物細胞は、多糖およびタンパク質の混合物から構成される厚い細胞壁によって取り囲まれており、しかも動物細胞が異種分子の導入を容易に受けるのに対して、植物細胞はより扱いにくく、いくらかはより侵襲的な方法を必要とする。異種分子を植物細胞に導入するための先行技術の手順は、２つのカテゴリーに分類することができる。
【０００８】
第１のカテゴリーは、植物細胞壁に穴をあけることによる、植物細胞の中への注目する分子の機械的な導入を利用するすべての方法をまとめる。これは、微粒子銃による送達によって成し遂げることができ、この微粒子銃による送達については、注目する分子は金属ビーズ、金またはタングステン上にコーティングされており、これらは、気体加圧式デバイスを使用して細胞の中へと噴射される。しかしながらこのようなアプローチの効率はかなり低く、そして、すべての細胞が形質転換されるわけではないので、選択が必要であり、このことが、標的の数を制限する。別のアプローチは、細胞壁を貫通して植物細胞の中へと化合物を直接注入するためのマイクロマニピュレータに接続されたマイクロニードルまたはナノニードルを使用する。しかしながら、マイクロインジェクションは、特別仕様の設備およびかなりの熟練を必要とする。この方法は、単調で退屈なものでもあり時間もかかり、微粒子銃による送達に勝る利点をほとんどもたらさない。さらに別の方法は、注目する分子を含有しかつ末端が細胞壁を消化する酵素でコーティングされている炭素ナノチューブを利用する。このナノチューブは、細胞壁を局所的に分解し、細胞膜に穴をあけ、チューブの内容物を宿主細胞の中へと送達することを可能にすると想定されるであろう。マイクロインジェクションまたは微粒子銃照射ほどには侵襲的ではないものの、上記の制約はここでも当てはまる。
【０００９】
第２のカテゴリーは、注目する分子の導入に先立って植物細胞壁全体が酵素により除去されるすべての方法をまとめる。細胞壁の完全な除去は細胞間の連結を破壊して、個別化された細胞の均質な懸濁液を生成し、これにより、より均一で大スケールの形質移入実験が可能になる。この方法は、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム介在性形質移入、およびポリエチレングリコール介在性形質移入を含むが、これらに限定されない。それゆえ、プロトプラスト調製は、数百万の細胞を生成するための、非常に信頼性が高くかつ安価な方法であり、その融通性、効率および収量については他の方法よりも好ましいことが多い。
【００１０】
プロトプラストは、ほとんどあらゆる植物組織から単離することができる。プロトプラストの主要な源は葉肉組織であり、葉肉組織は、新鮮重１グラムあたり大量のプロトプラストを与える。他のタイプの組織の使用は、たいていは、考慮対象の系についての既存の手順の利用可能性および実験の最終目的に依存する。
【００１１】
すべてではないとしても多くの生物学的プロセスは、空間的および時間的に制御されている。細胞は自身の生物時計を有し、細胞周期はその最も明らかな代表例である。１つの細胞はすべて、成長（Ｇ０、Ｇ２）、ＤＮＡ複製（Ｓ）、分裂（Ｍ）および静止（Ｇ０）などの一連の発生段階を経ることになる。それゆえ、特定の経路と相互作用する意図の実験を計画するときには、検討対象の系の状態を扱うことが妥当である。注目する分子の導入は、検討されるプロセスに合致するために、慎重に時期を合わされる必要がある。注目する分子は、その分子がその作用を発揮することができるまで長期間にわたって細胞環境の中で安定である必要があるか、または検討対象のプロセスが始まる前に短時間のうちに送達される必要があるかのいずれかである。例えば、標識されたチューブリンを細胞の中に導入することによる、前期前微小管束形成の間の微小管動力学の研究において、標識されたチューブリンが、前期前微小管束形成が始まるまで酵素による分解に耐えるほどに十分安定でなければ、チューブリンが、前期前微小管束形成の前に短時間に送達されることが確実にされる必要がある。その特別の例については、別の考慮事項は、前期前微小管束以外の構造の中への蛍光性チューブリンの組み込み、従って所望の時期にこのプローブを送達する必要性であろう。
【００１２】
残念ながら、細胞懸濁培養液の稀なケースを除き、プロトプラストの由来のもとになることができる葉肉細胞は、静止状態（Ｇ０）にあり、プロトプラストが適正なホルモンバランスで誘発されるときだけ、プロトプラストは、細胞周期に再び入り、活発に流動（ｓｔｒｅａｍｉｎｇ）を開始することになる。１つの静止状態のプロトプラストが１ラウンドの細胞周期を経るために必要とされる時間は、系ごとに大きく異なり、数時間〜数日かかる可能性がある。さらには、プロトプラストを生成するために使用される酵素混合物が洗い流されるとすぐに、プロトプラストは、その細胞壁を再形成することを開始し、これは、細胞壁再形成を遅くするかまたは防止するための予防措置がとられなければ、異種分子の導入を減少または完全に阻むことさえするであろう。それゆえ、プロトプラストは、注目する分子が送達されるべきである適切な段階にプロトプラストが到達するまで細胞壁を伴わないまま置かれることすらできず、細胞壁再形成は積極的に防止される必要があるが、同時にプロトプラストの流動能は保持されるべきである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは当該技術分野のこれらの不都合を克服しようとして、プロトプラストおよび細胞周期を制御でき、かつより効率的におよびより制御可能な態様でプロトプラストを形質移入することができる方法を考案した。
【００１４】
本発明者らは、２つの形質移入工程の組み合わせによって、プロトプラストにおけるいくつかの生物学的プロセスの詳細な制御が可能になるということを、本発明において見出した。２つの形質移入工程のこの組み合わせは、細胞壁阻害剤の使用、および／または細胞期の同期化工程と組み合わせられてもよい。本発明者らは、第１の形質移入工程において特定の経路と相互作用し、かつ／または二本鎖ＤＮＡ切断を導入する種々の組成物および異種分子を用いた形質移入が実施される第２の工程の導入によって、形質移入プロセスに対して改善された効率および制御が可能になるということを見出した。さらに本発明者らは、セルロースシンターゼ、セルロース沈着を阻害することまたは新生のセルロース微細線維を捕捉することによるなどで細胞壁形成に干渉する１以上の非酵素の化学的化合物をプロトプラストに添加することにより、異種分子の導入のタイミングおよび効率が、細胞周期の中の所望の期に時間的により近いところでの異種分子の送達の可能性を通して、高められかつ最適化されうるということを見出した。本発明者らは、特定の細胞期に細胞を同期化することにより、形質移入の増大が成し遂げられうるということも見出した。
【００１５】
より広い観点では、ミスマッチ修復系および／もしくはＮＨＥＪ経路の（一過性）抑制ならびに／または二本鎖ＤＮＡ切断の導入ならびに（ｉｉ）任意にプロトプラスト系における細胞壁再形成の一過性阻害および／または細胞周期の期の同期化と組み合わせた、変異原性オリゴヌクレオチドなどの注目する異種分子を用いたプロトプラストの形質移入は、細胞系が、プロトプラストの単離の時点から時間的に遠い特定の生物学的／生化学的プロセスにおいてその細胞が能力ある細胞周期の特定の段階で、形質移入される必要があるとき、非常に価値がある。さらには、プロトプラスト系における細胞壁再形成の一過性阻害は、一過性に発現されたプラスミドの連続的な導入を許容し、この複合的な作用が所望の成果を導く。例えば、ＺＦＮコンストラクトが、あるとき、例えばドナーコンストラクトが導入される４、６、１２、１８または２４時間前に導入されるならば、遺伝子標的指向化は、より効率的である。これによりＺＦＮが発現されることができ、かつ適正な遺伝子標的指向化事象が起こるために必要なＤＳＢを誘導するようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ミスマッチ認識後のＭＭＲ下流のシグナル伝達についての略図。
【図２】ＢｒａｎｚｅｉおよびＦｏｉａｎｉ、−、２００８年、第８巻、第９号、１０３８−４６頁から採ったＮＨＥＪおよびＨＲについての略図。
【図３】ＤＳＢ末端の成熟の略図。
【図４】相同組み換えの略図。
【図５】植物プロトプラストにおけるフットプリント形成についての実験計画。
【図６】遺伝子標的指向化事象についての実験計画。
【図７】ＢＹ−２プロトプラストにおけるｍｅＧＦＰ回復についての実験計画。
【図８】ｄｓＲＮＡの添加の後のタバコおよびトマトのプロトプラストにおけるＭＳＨ２のレベル。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
第１の態様では、本発明は、植物細胞プロトプラストにおける１以上の注目する分子の導入方法であって、
− 植物細胞から細胞壁を酵素により分解し、かつ／または植物細胞から細胞壁を取り除くことにより、前記植物細胞プロトプラストを準備する工程と、
− （ｉ）ミスマッチ修復系、非相同末端再結合からなる群から選択される１以上の経路の制御を変更することができる第１の組成物、および／または
（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる第２の組成物
を用いてこの植物細胞プロトプラストの第１の形質移入を実施する工程と、
− １以上の注目する分子を用いてこの植物細胞プロトプラストの第２の形質移入を実施する工程と、
− 細胞壁を形成させる工程と
を含み、この第２の形質移入は第１の形質移入の後に実施される方法、に関する。
【００１８】
用語「および（かつ）／または」は、本発明に関する範囲では、第１の組成物を用いた形質移入、または第２の組成物を用いた形質移入、または両方を用いた形質移入のいずれかを実施することができるということを意味するということを当業者は理解するであろう。そこで、本発明に係る第１の形質移入、およびすべてのその実施形態では、第１の組成物または第２の組成物またはその両方を含んでもよい。
【００１９】
当該方法の第１の工程では、プロトプラストは植物細胞から準備される。プロトプラストは、植物細胞プロトプラストの生成について使用される一般的な手順を使用して（例えばマセラーゼｍａｃｅｒａｓｅ）を使用して）準備することができる。植物細胞プロトプラスト系は、これまでのところトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍ）および他の多くのもの（セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃｃａ ｓａｔｉｖａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））について記載がある。本発明は、本願明細書に列挙されるプロトプラスト系（これらに限定されない）を含めて、一般にいずれのプロトプラスト系にも適用できる。
【００２０】
プロトプラストは、葉肉細胞（活発に分裂していない）に、成長点培養物（活発に分裂している）に、および細胞懸濁液（活発に分裂している）に由来することができる。
【００２１】
当該プロトプラストは、ミスマッチ修復系、非相同末端再結合（Ｎｏｎ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｎｄ Ｊｏｉｎｉｎｇ）経路からなる群から選択される経路のうちの１以上の制御を変更することができる第１の組成物を用いて形質移入されることができる。好ましくは、この形質移入は一過性である。好ましくは、このミスマッチ修復系、非相同末端再結合経路は下方制御される。
【００２２】
これらの経路の制御は、好ましくは、これらの経路を制御することができるｄｓＲＮＡの使用を通して成し遂げられる。適切な組成物の選択および設計のための例および指針は、本願明細書に以下で提示される。１つの実施形態では、この第１の組成物は、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬ、ＭｕｔＨ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＳＨ７、ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、ＤＮＡ−ＰＫ複合体 Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、Ｋｕ８６、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０、ＲＡＤ５１、ＸＲＣＣ４、Ｎｂｓ１のうちの１以上の制御を変更することができる。
【００２３】
ミスマッチ修復系
多くの病変は、いわゆるミスマッチ修復系（ＭＭＲ）によって修復される。大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）では、ＭＭＲは、３つの主要な複合体、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬおよびＭｕｔＨからなる。ＭｕｔＳは、ミスマッチの認識のおよびＭｕｔＨを動員する第２の複合体ＭｕｔＬに向かうシグナル伝達に関わる。ＭｕｔＨは、ミスマッチを含有する新しく合成されたＤＮＡ鎖にニックを導入することになるニッキング活性を保有する。新しく合成された鎖の中のニックの存在は、エキソヌクレアーゼに、分解される対象のＤＮＡ（ミスマッチヌクレオチドを含む）の一続きのもの（ｓｔｒｅｔｃｈ）を合図する。そのあとＤＮＡポリメラーゼが娘鎖の中のギャップを埋めるであろう。大腸菌のＭＭＲ遺伝子のオルソログは、ＭｕｔＬによって機能が実施されるＭｕｔＨを除き、すべての真核生物において見出すことができる（総説として、ＫｏｌｏｄｎｅｒおよびＭａｒｓｉｓｈｋｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、１９９９年、第９巻、８９−９６頁を参照）。植物では、４つのＭｕｔＳオルソログ（ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６およびＭＳＨ７）ならびに４つのＭｕｔＬオルソログ（ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＭＬＨ３およびＰＭＳ１）が存在する。塩基−塩基ミスペアまたは単独のヘリックス外のヌクレオチドのミスマッチ認識は、ＭｕｔＳα（ＭＳＨ２：：ＭＳＨ６ヘテロ二量体）によって成し遂げられ、他方で、より大きいヘリックス外のループアウト（ｌｏｏｐｏｕｔ）は、ＭｕｔＳβ（ＭＳＨ２：：ＭＳＨ３ヘテロ二量体）によって認識される。ＭＳＨ７遺伝子は植物では特定されているが、これまでのところ動物では特定されていない。ＭＳＨ７は、ＭＳＨ６に非常に類似しており、同じくＭＳＨ２とヘテロ二量体（ＭｕｔＳγ）を形成する（ＣｕｌｌｉｇａｎおよびＨａｙｓ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２０００年、第１２巻、９９１−１００２頁）。ＭＭＲ経路は、Ｌｉ、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、第１８巻、８５−９８頁から採った図１に図示されている。
【００２４】
最近、植物プロトプラストにおける特定のｍＲＮＡの一過性抑制のための方法が提案されており（Ａｎら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３年、第６７巻、２６７４−２６７７頁）、これは植物における（内因性の）ＭＭＲ遺伝子の一過性抑制のための価値あるツールであるということが本発明で見出された。
【００２５】
上記経路、例えばｄｓＲＮＡの生成、の制御を変更するために使用される組成物において使用することができるＭＭＲ経路に関連する遺伝子（ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＳＨ７、ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＭＬＨ３およびＰＭＳ１など）の配列は、ＡｔＭＳＨ２についてのＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ００２７０６．１などの公共のデータベースから入手でき、本願明細書中の別の箇所に記載される。所望の植物特異的配列は、例えば入手できるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）配列に基づいてプライマーを設計し、その後所望のオルソログを特定することにより特定することができる。
【００２６】
最も有毒な病変は二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）である。ＤＳＢは、活性酸素種 −とりわけヒドロキシルラジカル−、電離放射線または化学物質（癌の処置のために使用される化学療法剤を含む）などの内因性のまたは外因性の遺伝毒性の剤の作用から生じる可能性がある。他の種類のＤＮＡ病変の修復、またはＤＮＡ複製などの細胞プロセスも、ＤＳＢを生じる。例えば、ヌクレオチド除去修復または塩基除去修復によるＤＮＡ修復にはエンドヌクレアーゼが関与し、このエンドヌクレアーゼは、一本鎖ニックを導入する。２本のＤＮＡ鎖上での一本鎖ニックまたはギャップの同時発生は、ＤＳＢの形成を導く。同様にして、複製フォークの上流の一本鎖ニックまたはギャップは、ＤＮＡ二重らせんの巻き戻しによりＤＳＢへとプロセシングされる可能性がある（Ｂｌｅｕｙａｒｄら、ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ、２００６年、第５巻、１−１２頁）。２つの競争的経路（図２、ＢｒａｎｚｅｉおよびＦｏｉａｎｉ、２００８年、第８巻、第９号、１０３８−４６頁から）がＤＳＢを修復するために存在し、つまりそれらは、非相同末端再結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）および相同組み換え（ＨＲ）である。二本鎖切断（ＤＳＢ）は、好ましくは、Ｇ１期の間の非相同末端再結合（ＮＨＥＪ）によって、および細胞周期のＳ期およびＧ２期の間の相同組み換え（ＨＲ）によって修復される。Ｋｕヘテロ二量体がＤＳＢに結合することで、ＤＮＡ−ＰＫ触媒的サブユニットの動員およびＮＨＥＪによるＤＳＢの封着が開始される。対照的に、Ｓ期およびＧ２期に発生するＤＳＢは、ＭＲＥ１１１−ＲＡＤ５０−ＮＢＳ１複合体を通してＡＴＭを優先的に活性化する。細胞周期のＳ期およびＧ２期に特異的であるより高いサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）活性はＤＳＢ切除を促進し、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の３’オーバーハングを露出させる。３’オーバーハングのｓｓＤＮＡが複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）で被覆されるとき、それはＡＴＲを活性化する。ＲＰＡは、ＲＡＤ５２などのメディエータータンパク質の助けを借りて除去され、ＲＡＤ５１によって置き換えられうる。これは、ＲＡＤ５１シナプス前フィラメントの形成を導き、これが、二本鎖の中の相同領域に侵入することによりＨＲを開始し、ＤＮＡ合成によってさらに伸長されることができるＤループ（Ｄ−ｌｏｏｐ）と呼ばれるＤＮＡ連結部を形成する。ＤＮＡヘリカーゼによるこの中間体の鎖（ストランド）置換は、上記反応を合成依存的鎖アニーリング（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ、ＳＤＳＡ）に向かって導く。あるいは、第２のＤＳＢ末端は、捕捉されて二重ホリデイジャンクション中間体を生じることができ、この中間体は、エンドヌクレアーゼによって分解されうるし、またはヘリカーゼ（ＢＬＭ）およびトポイソメラーゼ（ＴＯＰ３）の複合された作用によって溶解されうる。
【００２７】
非相同末端再結合経路
ＮＨＥＪは、ＤＳＢ修復の支配的な経路であり、平滑末端または短いオーバーハングを有する末端を再結合することを含み、切断された末端の認識および並立で始まる。これは、ＫＵヘテロ二量体（Ｋｕ７０およびＫｕ８０［またはＫｕ８６］）およびＤＮＡ−ＰＫ触媒的サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）からなるＤＮＡ−ＰＫ複合体によって促進される。ＤＳＢ末端の成熟はＡｒｔｅｍｉｓよって実施され（図３、出典はＧｏｏｄａｒｚｉら、２００６年）、再封着はＸｒｃｃ４／ＤＮＡリガーゼＩＶ複合体によって実施される。ＮＨＥＪは、比較的不正確なプロセスであり、ＤＮＡ配列の挿入および欠失を伴うことが多い（Ｂｌｅｕｙａｒｄら、２００６年、Ｇｏｏｄａｒｚｉら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ、２００６年、第２５巻、３８８０−３８８９頁）。ＫＵ７０、ＫＵ８０、およびＰＡＲＰ−１を含めたいくつかの遺伝子は、ＮＨＥＪにおいてある役割を果たすことが公知である。
【００２８】
ＮＨＥＪ経路、例えばｄｓＲＮＡの生成、の制御を変更するために使用される組成物において使用することができるＮＨＥＪ経路に関連する遺伝子の配列は、ＡｔＫＵ７０についてのＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ２８３７５９．１などの公共のデータベースから入手でき、本願明細書中の別の箇所に記載される。所望の植物特異的配列は、例えば入手できるシロイヌナズナ配列に基づいてプライマーを設計し、その後所望のオルソログを特定することにより特定することができる。
【００２９】
相同組み換え経路
ＨＲは、姉妹染色分体を鋳型として使用する正確な修復プロセスであり、それゆえ修復の忠実度を確実にする。ＨＲ修復に向かう第１の工程は、一本鎖３’オーバーハングを形成するためのＤＳＢの切除である。この末端プロセシングは、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１タンパク質からなるＭＲＮ複合体によって実施される。アクセサリータンパク質の助けを借りて、Ｒａｄ５１は、一本鎖末端に動員され、相同的な二本鎖の侵入を促進する（図４。出典はＳｕｇｉｙａｍａら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ、２００６年、１−１０頁）。
【００３０】
捕捉された鎖は、次に、ＤＮＡ合成によって伸長され、第２のＤＳＢ末端が捕捉され、二重ホリデイの形成が生じ、これは、エンドヌクレアーゼによって分解されてクロスオーバーの形成を生じうるし、またはヘリカーゼおよびトポイソメラーゼの複合された作用によって溶解されうる（Ｂｌｅｕｙａｒｄら、２００６年；ＢｒａｎｚｅｉおよびＦｏｉａｎｉ、２００８年）。
【００３１】
１つの実施形態では、第１の形質移入は、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる第２の組成物を用いて実施することができる。例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼ（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ、フランス）、およびＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（Ｂｏｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９年、３２６巻、１５０９−１５１２頁；Ｍｏｓｃｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９年、第３２６巻、１５０１頁）である。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、好ましくは所望の位置で二本鎖切断を誘導するように、公知の技術を使用して設計され、その場合、標的にされる変異生成に関連するある実施形態では、第２の形質移入は、変異原性オリゴヌクレオチド由来の変異を導入することを意図する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、特定のＤＮＡ配列を切るようにカスタム設計されたタンパク質である。ジンクフィンガードメインは、およそ３０個のアミノ酸から構成され、これらのアミノ酸は、亜鉛イオンによって安定化されるときに特徴的な構造へと折り畳まれる。ジンクフィンガードメインは、ＤＮＡらせんの深いほうの溝（ｍａｊｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）へと入り込むことによりＤＮＡに結合することができる。各ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガーのαヘリックス領域にある鍵となるアミノ酸残基を介して特定のＤＮＡトリプレット（３ｂｐｓ）に結合することができる。従って、これらの鍵となるアミノ酸を変えることにより、特定のトリプレットに対するジンクフィンガーの認識特異性を変更し、これにより注目する配列に意図的に向けられたジンクフィンガーコンストラクトを作成することが可能である。この系の融通性は、ジンクフィンガードメインが連続して一緒に連結されて、長いＤＮＡ配列に結合することができるという事実に由来する。例えば、連続する６つのジンクフィンガードメインは、複雑な真核生物のゲノムにおいてユニークであるのに十分長い特定の１８ｂｐｓ配列を認識する。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ヌクレアーゼＦｏｋＩに融合された一連のジンクフィンガーから構成される。このＺＦＮは細胞へと導入され、特定のゲノム配列を認識しそれに結合することになる。ＦｏｋＩヌクレアーゼは二量体として切るので、切断部位の反対のＤＮＡ鎖上にある特定の配列を認識する第２のＺＦＮが必要とされる。次いでＤＮＡを切ること、または二本鎖切断（ＤＳＢ）が、これら２つの標的にされたＤＮＡ配列間で作製される（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２００７年、第２５巻、第７号、７７８−７８５頁；ＣａｔｈｏｍｅｎおよびＪｏｕｎｇ、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２００８年、第１６巻、第７号、１２００−１２０７頁；Ｆｏｌｅｙら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、２００９年、第４巻、第２号、ｅ４３４８頁）。姉妹染色分体であるかまたはドナー ＤＮＡコンストラクトであるかのいずれであってもよい相同配列の存在下で、ＤＳＢは、ＨＲによって修復されることができる。これは、姉妹染色分体が修復のために使用されるのではなく、情報は細胞へと導入されるドナーコンストラクトからコピーされる、遺伝子標的指向化のプロセスの基礎である。このドナーコンストラクトは、もともとの染色体の遺伝子座と比較して変更箇所を含有し、従ってＨＲのプロセスは、これらの変更箇所をゲノムに組み込む。
【００３２】
第１の形質移入は、第１の組成物および第２の組成物の両方を、同時にまたは（互いに）連続的に用いた形質移入を含んでもよい。
【００３３】
本発明に係る方法では、第２の形質移入は、１以上の注目する分子を導入するために実施される。
【００３４】
この注目する分子は、化学物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、オリゴヌクレオチド、およびペプチドからなる群から選択されることができる。ある実施形態では、この注目する分子は、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プラスミド、変異原性オリゴヌクレオチド、より好ましくは変異原性オリゴヌクレオチドから選択される。
【００３５】
ある実施形態では、注目する分子として、ＺＦＮコンストラクトをコードするプラスミドを使用することができる。次に第２の形質移入工程は、発現後に、フットプリント（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇ）において使用することができるＤＳＢを誘導することができるＺＦＮコンストラクトを導入する。
【００３６】
ある実施形態では、変異原性オリゴヌクレオチドを、注目する分子として使用することができる。この変異原性オリゴヌクレオチドは、ひとたびプロトプラストへと形質移入されると、プロトプラストのＤＮＡにおいて変更をもたらすことができる。好ましくは、変異原性オリゴヌクレオチドについての標的ＤＮＡは核内ＤＮＡに由来する。あるいは、葉緑体またはミトコンドリアのＤＮＡを使用することができる。原理上は、これまでに当該技術分野で記載されたいずれの変異原性オリゴヌクレオチド、例えばＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド、ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート、プロピン置換などを使用することができる。
【００３７】
このように、注目する分子としての、変異原性オリゴヌクレオチドの使用は、オリゴヌクレオチド依存性標的化ヌクレオチド交換（ＯＤＴＮＥ）を提供する。
【００３８】
オリゴヌクレオチド依存性標的化ヌクレオチド交換（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ、ＯＤＴＮＥ）
オリゴヌクレオチド依存性標的化ヌクレオチド交換（ＯＤＴＮＥ）は、変異（複数可）、例えば１つの点変異または欠失／挿入を導入すること、それゆえもともとの遺伝子機能を回復することによりゲノムの遺伝子座を修正または変更するための一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を指す。この概念は、遺伝子治療およびテーラーメイド医療の基礎であり、世界中で精力的に研究されている（Ｐａｒｅｋｈ−Ｏｌｍｅｄｏら、Ｎｅｕｒｏｎ、２００２年、第３３巻、４９５−４９８頁；Ｍａｄｓｅｎら、ＰＮＡＳ、２００８年、第１０５巻、第１０号、３９０９−３９１４頁；Ｌｅｃｌｅｒｃら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００９年、第９巻、第３５号、１−１６頁）。ＯＤＴＮＥの有効性および効率に影響を及ぼすいくつかのパラメータが特定されており、いくつかはまだ検証を必要とするが、機能的ＭＭＲ系がＯＤＴＮＥを妨げることは現在十分に確立されている（Ｉｇｏｕｃｈｅｖａら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００８年、第１８巻、１１１−１２２頁；Ｋｅｎｎｅｄｙ ＭａｇｕｉｒｅおよびＫｍｉｅｃ、Ｇｅｎｅ、２００７年、第３８６巻、１０７−１１４頁；Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕら、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．、２００９年、第１１巻、２６７−２７４頁）。ＯＤＴＮＥの使用ならびにこの技術において機能的であるオリゴヌクレオチドの構造および設計は、とりわけ、国際公開第９８／５４３３０号パンフレット、国際公開第９９／２５８５３号パンフレット、国際公開第０１／２４６１５号パンフレット、国際公開第０１／２５４６０号パンフレット、国際公開第２００７／０８４２９４号パンフレット、国際公開第２００７０７３１４９号パンフレット、国際公開第２００７０７３１６６号パンフレット、国際公開第２００７０７３１７０号パンフレット、国際公開第２００９００２１５０号パンフレットに十分に記載されている。本願明細書に開示される変異原性オリゴヌクレオチドの構造的特徴および標的配列（変更対象の遺伝子）からの配列情報に基づいて、当業者は、第２の形質移入工程で使用されるべき所望の変異原性オリゴヌクレオチドを設計することができる。本発明で使用される変異原性オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で使用される他の変異原性オリゴヌクレオチドと同程度の長さ、すなわち典型的には１０〜６０ヌクレオチド、好ましくは２０〜５５ヌクレオチド、より好ましくは２５〜５０ヌクレオチドを有する。
【００３９】
変異原性オリゴヌクレオチドを使用する本発明は、例えば、細胞を変更するため、野生型への回復によって変異を修正するため、変異を誘導するため、コード領域の破壊により酵素を不活化するため、コード領域を変更することにより酵素の生理活性を改変するため、コード領域を破壊することによりタンパク質を改変するため、ｍｉＲＮＡ標的を改変するため、前駆体遺伝子を改変するためおよびより多くの目的のために使用することができる。
【００４０】
ある実施形態では、注目する分子はＤＮＡコンストラクトである。ＤＮＡコンストラクトは、細胞の中に導入されることが所望される配列情報（遺伝子標的指向化）を含有するＤＮＡ配列である。このＤＮＡコンストラクトは、ＺＦＮコンストラクトであることができる。
【００４１】
形質移入（第１の形質移入および第２の形質移入の両方）は、当該技術分野で記載される方法、例えば電気穿孔、微粒子銃、ＰＥＧ介在性形質移入などを使用して成し遂げることができる。ＰＥＧ介在性形質移入が好ましい。ＰＥＧ介在性形質移入（好ましい）または微粒子銃などの従来の形質移入は、最高技術水準の方法（Ｓｐｏｒｌｅｉｎら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９１年、第８２巻、７１２−７２２頁；ＭａｔｈｕｒおよびＫｏｎｃｚ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第８２巻、「Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｊ．Ｍａｒｉｎｅｚ−ＺａｐａｔｅｒおよびＪ．Ｓａｌｉｎａｓ編、ニュージャージー州、トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．；Ｇｏｌｄｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９３年、第１１巻、９５−１００頁）を使用して実施することができる。
【００４２】
遺伝子標的指向化は、極めて強力な技術であり、医学および農業の両方において多くの応用例を有する。遺伝子標的指向化はゲノムの正確な操作を可能にし、これにより、生物学者らが、遺伝子機能を研究開発することができる。しかしながら、ＨＲは、染色体の遺伝子座にＤＳＢが存在することに頼るので、ほとんどすべての細胞のタイプにおけるＨＲの効率は低い。従って、ＺＦＮの有用性は、いずれの染色体の遺伝子座においてもＤＳＢを誘導することができることであり、ＺＦＮが使用されて、遺伝子標的指向化の効率が１００倍改善された。ＤＳＢが生成されると、ＤＳＢはＮＨＥＪ経路またはＨＲ経路のいずれかによって修復されうる。ＨＲ、従って遺伝子標的指向化、の効率は、ＤＳＢがＨＲによって修復されうるようにＮＨＥＪ経路を阻害することにより、高めることができる。これは、ヒトおよび真菌の細胞において実際に当てはまることが示されている（Ｆａｔｔａｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００８年、第１０５巻、８７０３−８７０８頁；Ｍｅｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００７年、第１２８巻、７７０−７７５頁；Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００９年、第４１巻、１０６−１１４頁）。ＮＨＥＪとＨＲとの間の選択は、細胞周期の期に依存する可能性もあり、Ｇ１では、相同的な鋳型の不存在に起因してＮＨＥＪが優勢であり、他方で、相同的な姉妹染色分体が存在するＧ２／ＭではＨＲがより活性である（ＢｒａｎｚｅｉおよびＦｏｉａｎｉ、Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、２００８年）。
【００４３】
植物の育種におけるＯＤＴＮＥおよびＺＦＮ
植物の育種では、従来の交配により植物のパフォーマンスを改善するために、自然の遺伝的変異が使用される。しかしながら、自然の変異は限られており、育種プログラムが価値ある新しい変種を生成するために多くの年月を要する。遺伝的変異は、人工的におよび伝統的に作成することができ、これは、宿主植物のゲノムに多くの変異を導入する化学的な変異生成によって行われる。最終的にいくつかの変異が注目する表現型を与えるであろうから、それを育種プログラムにおいて使用することができる。しかしながら、これらの方法は、残留する変異を取り除くための多くの戻し交配が必要であることおよびこのような化学物質によって導入される変異の範囲が限られることなどの欠点を有する。それゆえ、ＯＤＴＮＥおよびＺＦＮなどの技術は、植物において指向的でクリーンな方法で遺伝子変異を導入するための魅力的な解決策を代表する。しかしながら、動物系を植物系へと移すことは、とりわけ、標的にされた遺伝子変化を促進することが公知の生理的条件を複製するという大きな課題を突きつける。
【００４４】
機能的ＭＭＲ系はＯＤＴＮＥを妨げ、遺伝子修復の実質的な増大が、ｓｉＲＮＡを使用してＭＳＨ２をノックアウトした後に観察された。しかしながら、これらの方法は、安定に統合されたｓｉＲＮＡコンストラクトを利用し、それゆえＭＳＨ２は、構成的に抑制されるが、これは好ましいことではない。なぜなら、長期的に見れば、得られた変異誘発物の表現型は、その植物の死につながるからである。ＯＤＴＮＥは、細胞周期のＳ期において蓄積する細胞において促進されるということも示されている。
【００４５】
植物プロトプラストにおける特異的ｍＲＮＡの一過性抑制のための方法が記載されており（Ａｎら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３年、第６７巻、２６７４−２６７７頁）、これは、植物における（内因性の）ＭＭＲ遺伝子の一過性抑制のための価値あるツールである可能性があるということが本発明で見出された。Ｓ期における細胞の蓄積は、ヒドロキシ尿素またはアフィディコリンなどの化学物質を使用して容易に成し遂げることができる。本発明者らは、当該オリゴヌクレオチドの送達に関するこれらの種々のパラメータの調整によって各々の個々のパラメータの効果が増進される可能性があるということを見出した。これを成し遂げるために、本発明は、細胞が細胞周期のＳ期において蓄積している間のＭＭＲ抑制、およびそのあとの、注目する遺伝子の修正を促進するためのオリゴヌクレオチドの導入を提供する。
【００４６】
遺伝子標的指向化についても同じことが妥当し、ドナーコンストラクトの導入に先立って、細胞周期のＳ／Ｇ２／Ｍ期にある細胞の割合の増加が望ましく、ＮＨＥＪが抑制され、ＺＦＮが発現され、ＤＳＢが生成される。
【００４７】
植物細胞では、細胞における異種分子の導入は、非常に厚い細胞の存在のため、動物細胞におけるほどには容易ではなく、この非常に厚い細胞は、注目する分子がプロトプラストに到達するために除去される必要がある。これは、セルロース分解性酵素およびペクチン分解性酵素を用いた細胞壁の酵素による消化によって成し遂げられるが、酵素混合物が洗い流されるとすぐに、細胞は細胞壁を再形成することを開始する。それゆえ、長い期間にわたって、例えば少なくとも１０、３０、６０分間、または１、２、４、６、８、１０、１２、１６、または２４時間、またはこれより長く、例えば１０分間〜２４時間の間、プロトプラストの形質転換可能性（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｂｉｌｉｔｙ）を保持したい場合には、細胞壁再形成を防止することが非常に重要である。好都合なことに、細胞壁合成に影響を及ぼし、かつ注目する種々の分子を用いて形質移入されるまでプロトプラストを裸のまま維持するために使用することができる化学物質が存在する。本願では、このような細胞壁阻害剤の使用により、植物プロトプラストにおける連続的な異種分子の導入が可能になり、オリゴヌクレオチド依存性標的化遺伝子変化、およびＺＦＮを使用する遺伝子標的指向化の効率の改善につながるというエビデンスが提供される。
【００４８】
従って、本発明のある実施形態では、細胞壁の再形成を防止するために、非酵素組成物がプロトプラスト培養物に加えられる。細胞が細胞周期における適切な段階に到達するまで細胞壁再形成を破壊、防止、低下および／または遅延することにより、より多くの異種分子が細胞へと送達されることができ、形質移入の効率の上昇を成し遂げることができる。例えば洗浄するかまたは培地を細胞壁の再形成を阻害する化合物を含有しない培地で置き換えることによる、非酵素組成物の除去によって、細胞壁が形成されるようになり細胞は細胞周期を続けるようになる。
【００４９】
非酵素組成物は、所望の形質移入の特定の状況に応じて、植物細胞プロトプラストに加えることができる。この組成物は、
− 第１の形質移入の前もしくは第１の形質移入と同時に、
− 第１の形質移入と第２の形質移入との間に、
− 第２の形質移入の前もしくは第２の形質移入と同時に、または
第２の形質移入の後に
加えることができる。
【００５０】
細胞壁の形成を阻害または防止するこの非酵素組成物は、
− 第１の形質移入の前もしくは第１の形質移入と同時に、
− 第１の形質移入と第２の形質移入との間に、
− 第２の形質移入の前もしくは第２の形質移入と同時に、または
− 第２の形質移入の後でかつ細胞壁が形成されるのを許容する前に
除去することができる。
【００５１】
このようにして、細胞壁の再形成は、所望の形質移入を考慮して阻害することができる。例えば、図５に示されるトマトＡＬＳ遺伝子座でのフットプリント形成については、当該組成物は、第１の形質移入工程の前に加えられる。他の例では（図６および図７を参照）、当該組成物は、第１の形質移入と（ほとんど）同時に加えられる。同様に、細胞壁の再形成を短時間（１〜２４時間）許容し、次いで第１の形質移入に先立って細胞壁のさらなる形成を止めることも可能である。
【００５２】
第１の形質移入と第２の形質移入との間の期間は、少なくとも１０、３０、６０分間、または１、２、４、６、８、１０、１２、１６、２４時間から、数日まで、例えば９６時間まで、またはさらに長くまで変わってもよい。典型的には、この期間は１時間〜７２時間、好ましくは２〜４８時間、より好ましくは４〜４２時間、さらにより好ましくは１２〜３６時間である。
【００５３】
（阻害、破壊、遅延および／または低下による）細胞壁（再）形成へ干渉することは、プロトプラスト培地に、例えば、セルロース沈着を阻害するかまたは新生のセルロース微細線維を捕捉し、従って組織化された細胞壁へのそれらの組み込みを防止する１以上の化学的（すなわち非酵素）化合物を加えるによって成し遂げられる（Ｐａｒｅｋｈ−Ｏｌｍｅｄｏら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、２００３年、第１００２巻、４３−５６頁；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００２年、第１５９巻、６１−６７頁；ＭｅｙｅｒおよびＨｅｒｔｈ、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ｉｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ． ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」、Ｐｌａｎｔ、１９７８年、第１４２巻、第３号、２５３−２６２頁）。
【００５４】
本発明で使用される化学的化合物は、本願では「細胞壁形成阻害剤」と呼ばれる。これらの化学的化合物は、セルロース細胞壁の形成を防止、破壊、阻害および／または遅延することができ、これは、本願明細書中では「細胞壁形成を阻害すること（細胞壁形成の阻害）」と示される。
【００５５】
プロトプラスト培養物は、細胞壁の形成がないだけの状態で、または少なくとも細胞壁の形成の低下を伴うだけで、その通常の発生サイクルを経ることが許容されてもよい。このプロトプラストは、その発生サイクルを経て、ＤＮＡ合成が開始することが所望される期に到ったとき、当該細胞壁形成阻害剤は、例えば洗浄することによりまたは培地の置き換えにより、プロトプラスト培養物から実質的に除去することができる。
【００５６】
従って、当該細胞壁形成阻害剤を用いたプロトプラストの処理は、阻害剤（複数可）が加えられた瞬間から例えば、少なくとも１２〜６０時間、または２４〜４８時間、細胞壁形成を禁じる。従って、細胞壁形成を十分な期間阻害することにより、細胞が、通常は形質移入を受け入れない細胞周期におけるある時期に、従来の形質移入技術を使用することが可能になる。当該阻害剤の使用は、典型的には、細胞周期の進行に影響を及ぼさない。
【００５７】
考慮対象の化学物質は、好ましくは、細胞周期の進行と著しく干渉することなく、また使用される濃度でプロトプラストに有害であることもなく、細胞壁再形成を防止するべきである。これに関して、「著しく干渉することなく」は、当該化学物質が、細胞周期の進行が細胞周期の通常の速度、すなわちその化学物質の不存在下での速度の少なくとも５０％、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％で続くことを許容するということを意味する。これに関して、「有害である」は、プロトプラストのうちの少なくとも５０％、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％が、とりわけ本願明細書に記載される細胞壁再形成の阻害以外のいずれの他の点でも当該化学物質によって影響を受けないということを意味する。
【００５８】
種々の化学物質が細胞壁形成に干渉する。それらの化学物質のうちの多くは、除草剤として一般に使用される。例えば、２，６−ジクロロベンゾニトリル（ＤＣＢ）（ＤｅＢｏｌｔら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００７年、第１４５巻、３３４−３３８頁；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００２年、第１５９巻、６１−６７頁）は、セルロースシンターゼを阻害すること、それゆえ細胞板形成を破壊することにより作用する周知の除草剤である（Ｖａｕｇｈｎら、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ、１９９６年、第１９４巻、１１７−１３２頁）。ＤＣＢは、細胞膜へのセルロースシンターゼ複合体の送達に影響を及ぼすことなく、セルロースシンターゼ複合体の運動性を阻害することが示されている（ＤｅＢｏｌｔら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００７年、第１４５巻、３３４−３３８頁）。さらには、当該技術に関しては細胞周期の進行が当然に重要であるので、好ましい細胞壁形成阻害剤は、細胞周期の進行に影響を及ぼさないか（ＧａｌｂｒａｉｔｈおよびＳｈｉｅｌｄｓ、「Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ、１９８２年、第５５巻、第１号、２５−３０頁；ＭｅｙｅｒおよびＨｅｒｔｈ、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ｉｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」、Ｐｌａｎｔ、１９７８年、第１４２巻、第３号、２５３−２６２頁）、または限られた程度までしか影響を及ぼさない。ＤＣＢは、細胞周期の進行を制限せず、従って好ましい細胞壁形成阻害剤である。
【００５９】
他の化学物質としては、除草剤イソキサベン（ＤｅＢｏｌｔら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００７年、第１４５巻、３３４−３３８頁）が挙げられ、これは、細胞膜におけるセルロースシンターゼ複合体の統合を阻害し、既存のセルロースシンターゼ複合体を破壊する。従って、好ましい実施形態では、セルロース合成阻害剤はセルロースシンターゼ阻害剤である。別の実施形態では、当該化学物質は、セルロース合成に関与する遺伝子、例えばＣＥＳＡ遺伝子に干渉する。カルコフロールホワイトは、蛍光光沢剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｂｒｉｇｈｔｅｎｅｒ）とも呼ばれ、セルロース微細線維と競争して、調整された（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ）ネットワークへのセルロース微細線維の統合を防止する（ＲｏｎｃｅｒｏおよびＤｕｒａｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９８５年、第１６３巻、第３号、１１８０−１１８５頁、Ｈａｉｇｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８０年、第２１０巻、第４４７２号、９０３−９０６頁）。
【００６０】
他の細胞壁形成阻害剤は、例えば、ニトリル、ベンズアミドおよび／もしくはトリアゾロカルボキシアミド除草剤などのセルロース生合成阻害剤、ジニトロアニリン、ホスホロアミダート、ピリジン、ベンズアミドおよび／もしくはベンゼンジカルボン酸除草剤などの微小管集合阻害剤ならびに／またはセルロース沈着の阻害剤である。
【００６１】
ある実施形態では、セルロース生合成阻害剤は、ジクロベニル、クロルチアミド、フルポキサム、トリアゾフェナミド、フトキサゾリンＡ、フトラマイシン、タクストミンＡ、ブレフェルジンＡからなる群から選択される。
【００６２】
ある実施形態では、微小管集合阻害剤は、コブトリン（ｃｏｂｔｏｒｉｎ）、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル プロピザミド＝プロナミド、テブタム（ｔｅｂｕｔａｍ） ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）からなる群から選択される。
【００６３】
ある実施形態では、セルロース沈着の阻害剤はキンクロラックである。
【００６４】
ある実施形態では、細胞壁形成阻害剤は、モルリン（ｍｏｒｌｉｎ）（７−エトキシ−４−メチルクロメン−２−オン）、イソキサベン（ＣＡＳ ８２５５８−５０−７、Ｎ−［３−（１−エチル−１−メチルプロピル）−１，２−オキサゾール−５−イル］−２，６−ジメトキシベンズアミド）、ＡＥ Ｆ１５０９４４（Ｎ２−（１−エチル−３−フェニルプロピル）−６−（１−フルオロ−１−メチルエチル）−１，３，５，−トリアジン−２，４−ジアミン）、ジクロベニル（ジクロロベンゾニトリル）、カルコフロールおよび／またはカルコフロールホワイト（４，４’−ビス（（４−アニリノ−６−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−ｓ−トリアジン−２−イル）アミノ）−、２，２’−スチルベン二スルホン酸およびその塩）、オリザリン（ＣＡＳＲＮ １９０４４−８８−３、４−（ジプロピルアミノ）−３，５−ジニトロベンゼンスルホンアミド）、５−ｔｅｒｔ−ブチル−カルバモイルオキシ−３−（３−トリフルオロメチル）フェニル−４−チアゾリジノン、クマリン、３，４ デヒドロプロリン、
【化１】
、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル プロピザミド＝プロナミド、テブタム、ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、キンクロラックからなる群から選択される。
【００６５】
ある実施形態では、上に列挙された化学物質のうちの２以上の混合物を使用することができる。これらは、同時にまたは連続してプロトプラスト試料に加えることができる。
【００６６】
非酵素組成物の量および濃度は、種々の化学物質およびプロトプラスト系（の混合物）ごとに異なるであろうが、いくつかの初期の基礎的実験と一緒に本願明細書で引用される利用可能な文献に基づいて、当業者によって容易に決定されることが可能である。
【００６７】
植物細胞は双子葉植物または単子葉植物であってよい。
【００６８】
これに関して、好ましい双子葉植物は、モクレン科（Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ）、キンポウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）、サボテン科（Ｃａｃｔａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、ブナ科（Ｆａｇａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、モクセイ科（Ｏｌｅａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、およびセリ科（Ｕｍｂｅｌｉｆｅｒｅａｅ）からなる群から選択される。
【００６９】
これに関して、好ましい単子葉植物は、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、ラン科（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）、アヤメ科（Ｉｒｉｄａｃｅａｅ）、ウキクサ科（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）、およびネギ科（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）からなる群から選択される。
【００７０】
好ましい作物は、ジャガイモ、トウモロコシ、トマト、タバコ、綿、大豆、菜種である。
【００７１】
新しく単離されたプロトプラストは、通常は、自然にＧ０に同期化される（ＧａｌｂｒａｉｔｈおよびＳｈｉｅｌｄｓ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ、１９８２年、第５５巻、第１号、２５−３０頁）。所望の形質移入および所望の細胞期（Ｓ期、Ｍ期、Ｇ１期および／またはＧ２期）に依存して、プロトプラストの追加の同期化の必要性が、ある実施形態では、プロセス全体のまたは形質移入工程の効率をさらに高めるために、有利である場合がある。葉肉、分裂組織、または細胞懸濁液に由来するものなどの異なるプロトプラストは、活発に分裂していてもよいし活発に分裂していなくてもよいが、細胞期の同期化は、十分な形質移入を成し遂げるために望ましい場合がある。
【００７２】
従って、ある実施形態では、当該方法は、植物細胞または植物細胞プロトプラストの細胞期を同期化する工程をさらに含む。
【００７３】
細胞期の同期化は、リン酸飢餓、硝酸飢餓、イオン飢餓、血清飢餓、スクロース飢餓、オーキシン飢餓などの栄養欠乏によって成し遂げることができる。同期化は、同期化剤（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）をプロトプラスト試料に添加することにより成し遂げることもできる。
【００７４】
この同期化は、
− 植物細胞プロトプラストが植物細胞から形成される前に、または
− 第１の形質移入の前に、または
− 第２の形質移入の前に、または
− 第１の形質移入と第２の形質移入との間に
行うことができる。
【００７５】
同期化工程は、同期化剤が、
− 植物細胞プロトプラストが植物細胞から形成される前に、または
− 第１の形質移入の前に、または
− 第２の形質移入の前に、または
− 第１の形質移入と第２の形質移入との間に、または
− 第２の形質移入の後もしくは第２の形質移入と同時に、
例えば洗浄することによりまたは培地の置き換えにより除去される工程も含んでもよい。
【００７６】
同期化する工程は、植物細胞プロトプラストを、細胞壁の（再）形成を阻害または防止する非酵素組成物と接触させる工程とは独立に（例えば、前に、後にまたは同時に）実施されてもよい。
【００７７】
従って、ある実施形態では、同期化剤は、プロトプラスト試料に加えることができる。アフィディコリン（好ましい）、ヒドロキシ尿素（好ましい）、チミジン、コルヒチン、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル プロピザミド＝プロナミド、テブタム ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、ミモシン、アニソマイシン、α アマニチン、ロバスタチン、ジャスモン酸、アブサイシン酸、メナジオン、クリプトゲイン、熱、過酸化水素、過マンガン酸ナトリウム、インドメタシン、エポキソミシン（ｅｐｏｘｏｍｙｃｉｎ）、ラクタシスチン、ｉｃｒｆ １９３、オロモウシン、ロスコビチン、ボヘミン、スタウロスポリン、Ｋ２５２ａ、オカダ酸、エンドタール（ｅｎｄｏｔｈａｌ）、カフェイン、ＭＧ１３２、サイクリン依存性キナーゼおよびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤などの同期化剤、ならびにこれらの標的機構、量および濃度およびそれらの関連する細胞周期の期は、例えば「Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．Ｄｏｌｅｚｅｌ ｃ．ｓ．編、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ、２００７年、３２７頁以降に記載されている。アフィディコリンおよび／またはヒドロキシ尿素が好ましい。
【００７８】
選択された遺伝子座におけるフットプリント形成に向けられた本発明の方法の好ましい実施形態では、当該方法は、プロトプラストを生成するための細胞壁消化、細胞壁形成阻害剤（好ましくはＤＣＢ）を含む組成物による細胞壁阻害、同期化剤（好ましくはヒドロキシ尿素）の（第１の形質移入と同時にまたは第１の形質移入に先立つ）の添加、ＫＵ７０に対するｄｓＲＮＡ（第１の組成物）の添加、（好ましくは例えば、約６、１２、１８または２４時間の期間の後の）ＺＦＮコンストラクト（第２の組成物または第２の形質移入）の添加、（第２の形質移入と同時または第２の形質移入の直前の）同期化剤の除去の工程を含む。
【００７９】
遺伝子標的指向化事象を目的とした好ましい実施形態では、本発明に係る方法は、植物細胞プロトプラストの形成、細胞壁形成阻害剤の添加、例えばＫＵ７０（ＮＨＥＪ）（これに限定されない）に対する同期化剤、ＺＦＮコンストラクトおよび／またはｄｓＲＮＡの添加（第１の形質移入）、ならびに例えば６、１２、１８または２４時間の同期化の期間の後の、同期化剤の除去を伴う、ドナーコンストラクトの第２の形質移入を含む。
【００８０】
プロトプラストにおけるＯＤＴＮＥを目的とした好ましい実施形態では、植物細胞は、プロトプラスト形成前の４８時間まで同期化剤を与えられる。細胞壁の消化の後、細胞壁阻害剤は、ＭＭＲ（ＭＳＨ２または他のＭＭＲ関連遺伝子）に対して、ｄｓＲＮＡと一緒に加えられる（第１の形質移入）。所望の細胞周期の期において、細胞壁阻害が解除され、同期化剤が除去され、第２の形質移入のために変異原性オリゴヌクレオチドが加えられ、そして当該細胞は細胞周期を続けるようにされる。
【００８１】
本発明は、植物細胞プロトプラストを形質移入するためのキットであって、第１の組成物、第２の組成物、細胞壁の形成を阻害または防止する非酵素組成物、同期化剤、および１以上の注目する異種分子からなる群から選択される２以上を含むキット、にも関する。
【００８２】
本発明は、以下の非限定的な項目によって要約することができる。
（１）植物細胞プロトプラストにおける１以上の注目する分子の導入方法であって、
− 植物細胞から細胞壁を酵素により分解し、かつ／または植物細胞から前記細胞壁を取り除くことにより、植物細胞プロトプラストを準備する工程と、
− （ｉ）ミスマッチ修復系、非相同末端再結合からなる群から選択される１以上の経路の制御を変更することができる第１の組成物、および／または
（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる第２の組成物
を用いて前記植物細胞プロトプラストの第１の形質移入を実施する工程と、
− １以上の注目する分子を用いて前記植物細胞プロトプラストの第２の形質移入を実施する工程と、
− 前記細胞壁を形成させる工程と
を含み、前記第２の形質移入は前記第１の形質移入の後に実施される、方法。
【００８３】
（２）二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる前記第２の組成物は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡコンストラクトからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
【００８４】
（３）前記第１の組成物および前記第２の組成物は、実質的に同時に前記植物細胞プロトプラストへと与えられる、項目１に記載の方法。
【００８５】
（４）前記第１の組成物は、前記第２の組成物の前に加えられる、項目１に記載の方法。
【００８６】
（５）前記第２の組成物は、前記第１の組成物の前に加えられる、項目１に記載の方法。
【００８７】
（６）前記制御を変更することは、前記経路のうちの１以上の下方制御、好ましくは前記経路の一過性の下方制御である、項目１に記載の方法。
【００８８】
（７）前記方法は、
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と第２の形質移入との間に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の後に、
前記植物細胞プロトプラストを、前記細胞壁の（再）形成を阻害または防止する非酵素組成物と接触させる工程をさらに含み、前記方法は、
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と第２の形質移入との間に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の後で、
かつ前記細胞壁が形成されるのを許容する前に、
細胞壁の形成を阻害または防止する前記非酵素組成物を除去する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
【００８９】
（８）前記植物細胞または植物細胞プロトプラストの細胞周期の期を同期化する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
【００９０】
（９）前記同期化は、好ましくは
− 前記植物細胞プロトプラストが前記植物細胞から形成される前もしくは前記植物細胞プロトプラストが前記植物細胞から形成されるのと同時に、または
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と前記第２の形質移入との間に、
前記植物細胞または植物細胞プロトプラストを、同期化剤と接触させることにより成し遂げられる、項目８に記載の方法。
【００９１】
（１０）前記方法は、
− 前記植物細胞プロトプラストが前記植物細胞から形成される前に、または
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と前記第２の形質移入との間に、
前記同期化剤を除去する工程をさらに含む、項目９に記載の方法。
【００９２】
（１１）前記同期化する工程は、前記植物細胞プロトプラストを、前記細胞壁の（再）形成を阻害または防止する非酵素組成物と接触させる工程とは独立に（例えば、前に、後にまたは同時に）実施される、項目８に記載の方法。
【００９３】
（１２）細胞壁の形成を阻害する前記非酵素組成物は、
（ａ）セルロース生合成阻害剤、
（ｂ）微小管集合阻害剤、
（ｃ）セルロース沈着の阻害剤、
（ｄ）他の細胞壁形成阻害剤
からなる群から選択される１以上の細胞壁形成阻害剤を含有する、項目７に記載の方法。
【００９４】
（１３）前記セルロース生合成阻害剤は、ジクロベニル、クロルチアミド、フルポキサム、トリアゾフェナミド、フトキサゾリンＡ、フトラマイシン、タクストミンＡ、ブレフェルジンＡからなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
【００９５】
（１４）前記微小管集合阻害剤は、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル プロピザミド＝プロナミド、テブタム ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
【００９６】
（１５）前記セルロース沈着の阻害剤はキンクロラックである、項目１２に記載の方法。
【００９７】
（１６）前記他の細胞壁形成阻害剤は、モルリン（７−エトキシ−４−メチルクロメン−２−オン）、イソキサベン（ＣＡＳ ８２５５８−５０−７、Ｎ−［３−（１−エチル−１−メチルプロピル）−１，２−オキサゾール−５−イル］−２，６−ジメトキシベンズアミド）、ＡＥ Ｆ１５０９４４（Ｎ２−（１−エチル−３−フェニルプロピル）−６−（１−フルオロ−１−メチルエチル）−１，３，５，−トリアジン−２，４−ジアミン）、ジクロベニル（ジクロロベンゾニトリル）、カルコフロールおよび／またはカルコフロールホワイト（４，４’−ビス（（４−アニリノ−６−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−ｓ−トリアジン−２−イル）アミノ）−、２，２’−スチルベン二スルホン酸およびその塩）、オリザリン（ＣＡＳＲＮ １９０４４−８８−３、４−（ジプロピルアミノ）−３，５−ジニトロベンゼンスルホンアミド）、５−ｔｅｒｔ−ブチル−カルバモイルオキシ−３−（３−トリフルオロメチル）フェニル−４−チアゾリジノン、クマリン、３，４ デヒドロプロリン、
【化２】
、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル、プロピザミド＝プロナミド、テブタム、ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、キンクロラックからなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
【００９８】
（１７）前記第１の組成物は、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬ、ＭｕｔＨ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＳＨ７、ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、ＤＮＡ−ＰＫ複合体 Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、Ｋｕ８６、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０、ＲＡＤ５１、ＸＲＣＣ４、Ｎｂｓ１、ＰＡＲＰ−１のうちの１以上の制御を変更することができる、項目１に記載の方法。
【００９９】
（１８）前記第１の組成物はｄｓＲＮＡを含む、項目１に記載の方法。
【０１００】
（１９）前記第２の形質移入における前記１以上の分子は、化学物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、プラスミド、リポソーム、変異原性オリゴヌクレオチドからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
【０１０１】
（２０）細胞周期の期の前記同期化は、前記プロトプラストを細胞周期のＳ期、Ｍ期、Ｇ１および／またはＧ２期に同期化する、項目８に記載の方法。
【０１０２】
（２１）細胞周期の期の前記同期化は、リン酸飢餓、硝酸飢餓、イオン飢餓、血清飢餓、スクロース飢餓、オーキシン飢餓などの栄養欠乏により成し遂げられる、項目８に記載の方法。
【０１０３】
（２２）前記同期化剤は、アフィディコリン、ヒドロキシ尿素、チミジン、コルヒチン、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル プロピザミド＝プロナミド、テブタム ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、ミモシン、アニソマイシン、α アマニチン、ロバスタチン、ジャスモン酸、アブサイシン酸、メナジオン、クリプトゲイン、熱、過酸化水素、過マンガン酸ナトリウム、インドメタシン、エポキソミシン、ラクタシスチン、ｉｃｒｆ １９３、オロモウシン、ロスコビチン、ボヘミン、スタウロスポリン、Ｋ２５２ａ、オカダ酸、エンドタール、カフェイン、ＭＧ１３２、サイクリン依存性キナーゼおよびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤からなる群のうちの１以上から選択される、項目９に記載の方法。
【０１０４】
（２３）項目１９に記載の異種分子を用いて形質移入された植物細胞プロトプラスト。
【０１０５】
（２４）植物細胞プロトプラストを形質移入するためのキットであって、第１の組成物、第２の組成物、細胞壁の形成を阻害または防止する非酵素組成物、同期化剤、および１以上の注目する異種分子からなる群から選択される２以上を含むキット。
【実施例】
【０１０６】
植物ミスマッチ修復遺伝子および非相同末端再結合遺伝子
ＭＭＲ経路（ＭＳＨ２）およびＮＨＥＪ経路（Ｋｕ７０）に関わる遺伝子と相同性を共有するタバコおよびトマトのＥＳＴについて公共のデータベースをスクリーニングした。ｄｓＲＮＡを生成するために使用される領域に下線を引いてある。ｄｓＲＮＡは、当該技術分野で周知のプロトコルに従って生成した。加えて、注目する遺伝子のいずれかと著しい相同性を示さないプラスミドに由来する非特異的ｄｓＲＮＡ種を生成した。これを、ｄｓＲＮＡそれ自体の存在は特定のｍＲＮＡの抑制に関与しないことを実証するための対照として使用した。
【０１０７】
トマトＫｕ７０
ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＡＧＣＴＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＡＴＧＴＴＴＡＡＧＡＡＧＣＧＣＡＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＡＣＴＴＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＧＧＡＴＴＡＴＣＴＡＴＣＧＡＡＣＴＴＡＡＣＡＣＣＴＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＣＣＡＡＣＴＡＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＡＣＴＴＧＧＣＴＴＧＡＴＴＣＧＡＴＧＡＣＴＡＡＴＣＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＴＴＣＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＧＣＴＡＴＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＣＣＴＣＴＡＡＡＡＣＧＣＴＴＴＣＡＧＴＣＴＴＡＣＡＡＡＡＡＴＧＡＧＡＡＴＧＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＣＧＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＡＧＡＧＴＴＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＧＴＣＴＧＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＴＧＧＴＴＧＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＴＣＴＴＴＴＣＧＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＴＣＡＡＴＧＴＴＧＣＧＧＣＴＴＡＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＴＴＣＴＡＴＧＧＧＡＡＴＴＴＡＡＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＴＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＴＴＧＣＡＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＧＴＣＡＡＧＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＣＡＴＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＴＡＣＴＧＡＴＣＣＴＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＣＴＴＴＡＧＴＧＡＧＡＣＧＴＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＣＡＡＴＴＴＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＣＡＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧ［配列番号１］
【０１０８】
タバコＭＳＨ２
ＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧＡＴＡＧＡＴＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＡＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＧＧＧＣＣＧＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＡＣＣＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＧＣＴＡＴＴＴＧＴＧＡＧＣＡＣＡＴＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＡＣＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＧＴＡＡＣＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＡＧＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＧＡＴＡＧＣＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＣＴＡＡＴＣＧＣＡＡＧＣＴＡＡＣＴＡＴＧＣＴＴＴＡＣＡＡＧＧＴＴＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＧＴＧＡＴＣＡＧＡＧＴＴＴＴＧＧＴＡＴＴＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＧＡＧＴＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＡＧＴＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＣＴＣＴＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＴＡＡＴＴＣＣＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＣＴＴＣＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＴＧＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＣＧＴＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧＧＡＴＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴＧＣＣＡＣＴＧＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＧＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＧＡＴＧＣＡＧＴＴＧＡＣＴＣＴＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＡＴＴＣＴＴＴＴＡＧＴＴＣＴＴＣＡＧＡＴＴＡＧＡＡＣＴＡＴＡＴＣＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＧＡＡＴＧＡＴＡＧＴＧＡＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＡＴＡＡＣＴＴＡＧＣＣＴＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＧＴＴＴＡＡＡＴＣＣＴＴＡＣＣＣＣＡＡＡＣＡＴＧＡＴＴＣＴＣＴＧＴＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＴＧＴＡＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＧＴＴＡＡＡＴＡＧＴＡＡＡＣＧＴＴＡＴＣＴＴＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＡＡＣＡＴＴＧＧＴＡＧＴＡＧＴＣＴＡＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＣＣＴＴＣＡＣＡＡＣＧＡＣＴＡＡＡＣＡＡＣＣＴＴＣＣＣＴＴＣＴＣＴＴＡＡＡＡＣＡＣＣＣＴＡＡＡＣＴ［配列番号２］
【０１０９】
ＮｔＭＳＨ２およびＬｅＫｕ７０の下方制御の評価
ＬｅＫｕ７０またはＭｉｌｌｉＱ水に対するｄｓＲＮＡを用いたプロトプラストの形質移入の２４時間後に、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを単離した。Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡ合成を実施した。Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ装置（Ｒｏｃｈｅ）を使用して内因性のＬｅＫｕ７０のレベルを測定した。ｍＲＮＡ定量化のために使用したプライマーを、下記に列挙する。
【表１】
【０１１０】
トマトプロトプラストの単離
トマトＭ８２栽培品種のインビトロでのシュート培養物（ｓｈｏｏｔ ｃｕｌｔｕｒｅ）を、２５℃および６０〜７０％ＲＨで、２０００ｌｕｘの１６／８時間の光周期を用いて、０．８％ Ｍｉｃｒｏ−Ａｇａｒを補ったＭＳ２０培地上で維持する。１グラムの若葉をＣＰＷ９Ｍの中でやさしくスライスし、酵素溶液（２％ セルロースｏｎｏｚｕｋａ ＲＳ、０．４％ ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ１０、２．４−Ｄ（２ｍｇ／ｍｌ）、ＮＡＡ（２ｍｇ／ｍｌ）、ＢＡＰ（２ｍｇ／ｍｌ） ｐＨ５．８）、およびヒドロキシ尿素（２ｍＭ）を含有するＣＰＷ９Ｍ）に移す。消化を、暗所で、２５℃で一晩進行させる。翌朝、ペトリ皿を１時間やさしく渦を巻かせ、プロトプラストを遊離させる。このプロトプラスト懸濁液を５０μｍメッシュのステンレス鋼製ふるいに通して濾過し、室温で、８５×ｇで５分間の遠心分離によってプロトプラストを回収する。このプロトプラストペレットを、２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補ったＣＰＷ９Ｍに再懸濁し、各チューブの底に、３ｍＬのＣＰＷ１８Ｓを加える。遠心分離（１０分間、室温、８５×ｇ）の間に２つの層の間の界面に蓄積する生プロトプラストを集め、血球計算器を使用してそれらの密度を評価する。プロトプラストを、室温で、８５×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補ったＭａＭｇ培地に、１０６／ｍＬの最終密度に再懸濁する。
【０１１１】
トマトプロトプラスト形質移入
フットプリント形成（実施例１）
各形質移入について、２５００００のプロトプラストを、２５μｇのトマトＫｕ７０に対する二本鎖ＲＮＡおよび２５０μＬのＰＥＧ溶液（４０％ ＰＥＧ４０００（Ｆｌｕｋａ 番号８１２４０）、０．１Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２、０．４Ｍ マンニトール）と混合する。形質移入を、室温で２０分間進行させる。５ｍＬの０．２７５Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２を滴下し、十分に混合する。形質移入されたプロトプラストを室温で、８５×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、ＣＰＷ９Ｍの中で２回洗浄する。最後に、プロトプラストを、２ｍｇ．Ｌ−１ジクロベニルおよび２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補ったＫ８ｐに、２５００００／ｍＬの最終密度に再懸濁し、暗所で、２５℃で一晩インキュベーションする。翌朝、プロトプラストを室温で、８５×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補ったＣＰＷ９Ｍの中で１回洗浄し、生プロトプラストを上記のとおり単離する。生プロトプラストを、ＭａＭｇに、１０６／ｍＬの最終密度に再懸濁し、２０μｇのＺＦＮコンストラクト（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年）を用いて上記のとおり形質移入する。次いでプロトプラストをアルギン酸（塩）中に包埋し、Ｋ８ｐ培地中で培養する。
【０１１２】
遺伝子標的指向化（実施例２）
各形質移入について、２５００００のプロトプラストを、２５μｇのトマトＫｕ７０に対する二本鎖ＲＮＡ、２０μｇのＺＦＮコンストラクト（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年）および２５０μＬのＰＥＧ溶液（４０％ ＰＥＧ４０００（Ｆｌｕｋａ 番号８１２４０）、０．１Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２、０．４Ｍ マンニトール）と混合する。形質移入を、室温で２０分間進行させる。５ｍＬの０．２７５Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２を滴下し、十分に混合する。形質移入されたプロトプラストを、室温で、８５×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、ＣＰＷ９Ｍの中で２回洗浄する。最後に、プロトプラストを、２ｍｇ．Ｌ−１ジクロベニルおよび２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補ったＫ８ｐに、２５００００／ｍＬの最終密度に再懸濁し、暗所で、２５℃で一晩インキュベーションする。翌朝、プロトプラストを室温で、８５×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補ったＣＰＷ９Ｍの中で１回洗浄し、生プロトプラストを上記のとおり単離する。生プロトプラストを、ＭａＭｇに、１０６／ｍＬの最終密度に再懸濁し、２０μｇのドナーコンストラクトを用いて上記のとおり形質移入する。次いでプロトプラストをアルギン酸（塩）中に包埋し、Ｋ８ｐ培地中で培養する。
【０１１３】
フットプリントの検出（実施例１）
３日の培養後、アルギン酸（塩）の皿をクエン酸ナトリウムに溶解させ、プロトプラストを遠心分離によって回収し、あとのＤＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するＤＮＡ抽出のために液体窒素の中で凍結する。全長ＡＬＳオープンリーディングフレームを、校正Ｔａｑポリメラーゼを使用してＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ ＸＬ ＰＣＲクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換する。１００μｇ．ｍＬ−１カルベニシリンを補ったＬＢ寒天上に細菌をプレーティングし、３７℃で一晩インキュベーションする。翌朝、４００の個々のクローンを取り上げ、ＡＬＳ遺伝子座にミスマッチを有するクローンを特定するためのＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ装置（Ｒｏｃｈｅ）での高分解能融解曲線分析のために使用する。陽性のクローンをシーケンシングによって確認する。
【０１１４】
遺伝子標的指向化事象の検出（実施例２）
１４日の培養後、アルギン酸（塩）の皿を５ｍｍの細片へと切断し、０．８％ ｍｉｃｒｏ ａｇａｒを用いて固形化しかつ２０ｎＭ クロルスルフロンを補ったＴＭ−ＤＢ培地の表面上に配置する。遺伝子標的指向化事象から生じるカルスは、クロルスルフロンに対して耐性を持つであろうから、６〜８週間発育するであろう。耐性のカルスをサンプリングし、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｅａｓｙキットを使用してＤＮＡを抽出する。ＡＬＳ遺伝子の全長コード配列をＰＣＲによって増幅し、変異の存在をシーケンシングによって確認する。
【０１１５】
実施例３
植物細胞株
非機能的なＥＧＦＰ遺伝子を含有するタバコＢｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２細胞の懸濁液を、このタンパク質の発色団領域に、未熟の終止コドンの形成を生じる点変異を導入することにより、生成した。この株は、オリゴヌクレオチド依存性標的化遺伝子修復によるＥＧＦＰ遺伝子の修復に対する種々のパラメータの影響を試験するためのレポーター系として使用する。
【０１１６】
ＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡ［配列番号７］
【０１１７】
変異したＥＧＦＰ（ｍＥＧＦＰ）のｃＤＮＡ配列において、変異の位置は、下線付きおよび太字（Ｇ→Ｔ）で示されている。
【０１１８】
修復および対照オリゴヌクレオチド配列
ＧＦＰ ７ 配列番号８ Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊ＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＣ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ
ＧＦＰ ８ 配列番号９ Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊ＣＡＧＣＴＣＣＴＡＧＣＣＣＴＴＧＣ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ
＊は、ホスホロチオエート修飾を示す。
【０１１９】
タバコプロトプラストの単離
ＢＹ−２培地（Ｎａｇａｔａら、Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ、１９９９年）に一週間維持した５ｍＬの７日齢のタバコＢｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２（ＢＹ−２）細胞懸濁培養液を、２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補った４５ｍＬのＢＹ−２培地が入っている５０ｍＬの三角フラスコに移す。細胞を２４時間分裂させ、室温で、１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって回収する。押し固められた細胞容積に、ＭＤＥ（全量９００ｍｌの中に、０．２５ｇのＫＣｌ、１．０ｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．１３６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのポリビニルピロリドン（ＭＷ １０，０００）、６ｍｇのナフタレン酢酸および２ｍｇの６−ベンジルアミノプリン。この溶液の浸透圧を、ソルビトールを用いて６００ｍＯｓｍ．ｋｇ−１に調整する。ｐＨ ５．７）中のＢＹ−２酵素混合物（１％（ｗ／ｖ）セルラーゼＯｎｏｚｕｋａ ＲＳ、０．０５％ ペクチナーゼ Ｙ２３、０．２％ ドリセラーゼ（ｄｒｉｓｅｌａｓｅ）（担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ ｓｐ）由来））２５ｍＬを加える。細胞をＴＣ品質のペトリ皿に移し、緩やかな撹拌（４０ｒｐｍ）のもとで消化を、２５℃で４時間進行させる。このプロトプラスト懸濁液を５０μｍメッシュのステンレス鋼製のふるいに通して濾過し、５℃で、８００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収する。プロトプラストを、２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補った氷冷したＫＣ洗浄用培地（０．２％ ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１．７％ ＫＣｌ、ＫＣｌを用いて５４０ｍＯｓｍ．Ｋｇ−１、ｐＨ ５．７）に再懸濁し、５℃で、８００ｒｐｍで５分間遠心分離する。プロトプラストを２ｍＭ ヒドロキシ尿素を補ったＫＣ洗浄用培地に再懸濁し、各チューブの底に、３ｍＬのＣＰＷ１８Ｓを加える。生プロトプラストは、５℃で、８００ｒｐｍで１０分間の遠心分離の際に２つの培地の界面に蓄積するであろう。生プロトプラストを回収し、血球計算器を使用してそれらの密度を評価する。プロトプラスト密度を、氷冷したＫＣ洗浄用培地を使用して１０６／ｍＬに調整する。
【０１２０】
タバコプロトプラスト形質移入
トマトプロトプラストについてと同様に、タバコプロトプラスト形質移入を実施する。タバコプロトプラストを、１２．５μｇのタバコＭＳＨ２に対するｄｓＲＮＡ用いて形質移入する。形質移入されたプロトプラストを、２ｍＭ ヒドロキシ尿素および２ｍｇ．Ｌ−１ジクロベニルを補ったＴｏ培地２．５ｍＬに再懸濁する。Ｔｏ培地は、（１リットルあたり、ｐＨ ５．７）９５０ｍｇ ＫＮＯ３、８２５ｍｇ ＮＨ４ＮＯ３、２２０ｍｇ ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１８５ｍｇ ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、８５ｍｇ ＫＨ２ＰＯ４、２７．８５ｍｇ ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、３７．２５ｍｇ Ｎａ２ＥＤＴＡ．２Ｈ２Ｏ、Ｈｅｌｌｅｒの培地（Ｈｅｌｌｅｒ，Ｒ．、Ａｎｎ Ｓｃｉ Ｎａｔ Ｂｏｔ Ｂｉｏｌ Ｖｅｇ、１９５３年）に係る微量栄養素、ＭｏｒｅｌおよびＷｅｔｍｏｒｅの培地（Ｍｏｒｅｌ，Ｇ．およびＲ．Ｈ．Ｗｅｔｍｏｒｅ、Ａｍｅｒ．Ｊ． Ｂｏｔ．、１９５１年）に係るビタミン、２％（ｗ／ｖ）スクロース、３ｍｇ ナフタレン酢酸、１ｍｇ ６−ベンジルアミノプリン、および浸透圧を５４０ｍＯｓｍ．ｋｇ−１にするための量のマンニトールを含有しており、これを３５ｍｍペトリ皿に移した。翌日、プロトプラストを遠心分離によって回収し、２ｍＭ ヒドロキシ尿素および２ｍｇ．Ｌ−１ ジクロベニルを補った氷冷したＫＣ洗浄用培地で洗浄する。生プロトプラストを回収し、１．６ｎｍｏｌの、転写された鎖に相補的でかつ標的にされた配列との１つのミスマッチを含有する（ＧＦＰ ７）かまたは含有しない（ＧＦＰ ８）オリゴヌクレオチドを用いて上記のとおり形質移入する。３’末端および５’末端の両方にある４つのホスホロチオエート連結によって、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ分解から保護する。プロトプラストを、最終的に、ヒドロキシ尿素もジクロベニルも含まないＴｏ培地に再懸濁する。２４時間後、バンドパス（ｂａｎｄ ｐａｓｓ） ＧＦＰフィルターキューブ（ｆｉｌｔｅｒ ｃｕｂｅ）を取り付け、ＣＦＩ Ｓｕｐｅｒ Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ ＥＬＷＤ ２０ＸＣ対物レンズを取り付けたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＳ１００−Ｆを使用してＥＧＦＰ回復を採点する。
【０１２１】
結果
タバコおよびトマトＭＳＨ２の下方制御
結果を図８に提示する。これらの結果は、ＭＳＨ ｍＲＮＡのレベルが単離後に上昇するということを実証する。大多数の葉プロトプラストは、活発に分裂していない葉肉細胞に由来する。単離後、培地中のホルモンは、これらの細胞が細胞周期へと再進入すること、および結果としてＭＭＲ遺伝子のレベルの誘導を誘導する。非特異的ｄｓＲＮＡ（ＭＳＨ２と相同性を共有しない）の添加は発現レベルに影響を及ぼさないが、他方で、ＭＳＨ２ ｄｓＲＮＡは、ＭＳＨ２ ｍＲＮＡレベルを、単離後にプロトプラストにおいて見出されるＭＳＨ２ ｍＲＮＡレベルの５〜２０％まで低下させることにおいて有効である。本発明者らは、ＭＬＨ１およびＫＵ７０の両方に標的化されたｄｓＲＮＡについて同様の結果を見出した。
【０１２２】
トマトＡＬＳ遺伝子座でのフットプリント形成（実施例１、図５）
すべての試料を、２ｍＭ ヒドロキシ尿素で処理した（材料および方法を参照）。
【表２】
【０１２３】
トマトＡＬＳ遺伝子座での遺伝子標的指向化事象（実施例２、図６）
実施例２：植物プロトプラストにおける効率的な遺伝子標的指向化についての実験計画、図６を参照。
すべての試料を、２ｍＭ ヒドロキシ尿素で処理した（材料および方法を参照）。
【表３】
ＢＹ−２プロトプラストにおけるｍｅＧＦＰ回復
【０１２４】
実施例３：植物プロトプラストにおける効率的なＯＤＴＮＥについての実験計画、図７を参照。すべての試料を、２ｍＭ ヒドロキシ尿素で処理した（材料および方法を参照）。
【表４】
【０１２５】
上記の実施例から、細胞壁阻害を用いるフットプリント形成、遺伝子標的指向化またはＯＤＴＮＥについて必要とされる事象の順序の最適化によって、すべての記載されたプロセスにおける実質的な改善が導かれるということが明らかである。
【０１２６】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ
＜１１０＞ Ｋｅｙｇｅｎｅ ＮＶ
＜１２０＞ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
＜１３０＞ Ｐ３００３９ＰＣ００
＜１５０＞ ＵＳ ６１／２８８４７４
＜１５１＞ ２００９−１２−２１
＜１５０＞ ＮＬ２００４０２０
＜１５１＞ ２００９−１２−２４
＜１６０＞ ９
＜１７０＞ ＰａｔｅｎｔＩｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．３
＜２１０＞ １
＜２１１＞ ７７６
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
＜２２０＞
＜２２１＞ ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ
＜２２３＞ ＫＵ７０
＜４００＞ １
ｇｇａａｇａｔｃｔｇ ａａｃｇａｃｃａｇｃ ｔｔａｇｇａａａｃｇ ｃａｔｇｔｔｔａａｇ ａａｇｃｇｃａｇａｇ ｔｔｃｇａａｇａｃｔ ６０
ｔｃｇａｃｔｔｇｔａ ａｔｔｔｔｔａａｔｇ ｇａｔｔａｔｃｔａｔ ｃｇａａｃｔｔａａｃ ａｃｃｔａｔｇｃｔｔ ｔｇａｔｃｃｇｔｃｃ １２０
ａａｃｔａａｔｃｃａ ｇｇｇａｃａａｔｔａ ｃｔｔｇｇｃｔｔｇａ ｔｔｃｇａｔｇａｃｔ ａａｔｃｔｔｃｃｔｔ ｔｇａａｇａｃｔｇａ １８０
ｇａｇａａｃｃｔｔｃ ａｔａｔｇｔｇｃｔｇ ａｔａｃｔｇｇｔｇｃ ｔａｔａｇｔｔｃａｇ ｇａｇｃｃｔｃｔａａ ａａｃｇｃｔｔｔｃａ ２４０
ｇｔｃｔｔａｃａａａ ａａｔｇａｇａａｔｇ ｔｃａｔｃｔｔｔｔｃ ｔｇｃｇｇａｔｇａｇ ｃｔｔｔｃａｇａａｇ ｔｃａａａａｇａｇｔ ３００
ｔｔｃａａｃｔｇｇａ ｃａｔｃｔｔｃｇｔｃ ｔｇｔｔｇｇｇｃｔｔ ｃａａｇｃｃｔｔｔｇ ａｇｃｔｇｃｔｔａａ ａａｇａｃｔａｔｃａ ３６０
ｔａａｃｃｔｇａａｇ ｃｃａｇｃａａｃｔｔ ｔｔｇｔｃｔｔｔｃｃ ｃａｇｔｇａｔｇａｇ ｇａａｇｔｇｇｔｔｇ ｇａａｇｃａｃｔｔｇ ４２０
ｔｃｔｔｔｔｃｇｔｔ ｇｃｔｃｔｃｃａａａ ｇａｔｃａａｔｇｔｔ ｇｃｇｇｃｔｔａａｇ ｃｇｔｔｔｔｇｃａｇ ｔｔｇｃｔｔｔｃｔａ ４８０
ｔｇｇｇａａｔｔｔａ ａｇｔｃａｔｃｃｔｃ ａａｔｔｇｇｔｔｇｃ ｔｃｔｔｇｔｔｇｃａ ｃａａｇａｔｇａａｇ ｔａａｔｇａｃｔｃｃ ５４０
ｔａｇｔｇｇｔｃａａ ｇｔｃｇａｇｃｃａｃ ｃａｇｇｇａｔｇｃａ ｔｃｔｇａｔｔｔａｔ ｃｔｔｃｃａｔａｔｔ ｃｔｇａｔｇａｔａｔ ６００
ｃａｇａｃａｔｇｔｔ ｇａａｇａｇｃｔｔｃ ａｔａｃｔｇａｔｃｃ ｔａａｔｔｃｃｇｔｇ ｃｃｔｃａｔｇｃｃａ ｃｔｇａｔｇａｃｃａ ６６０
ｇａｔａａａｇａａｇ ｇｃｃｔｃｃｇｃｔｔ ｔａｇｔｇａｇａｃｇ ｔａｔｔｇａｃｃｔｃ ａａａｇａｔｔｔｔｔ ｃｔｇｔｇｔｇｇｃａ ７２０
ａｔｔｔｇｃｔａａｔ ｃｃｔｇｃａｔｔｇｃ ａｇａｇａｃａｔｔａ ｔｇｃａｇｔａｔｔａ ｃａａｇｃｔｃｔｔｇ ｃａｃｔｔｇ ７７６
＜２１０＞ ２
＜２１１＞ ８８４
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ
＜４００＞ ２
ｇｇａｇｃｔａｃｔｇ ａｔａｇａｔｃａｔｔ ｇａｔｔａｔａａｔｔ ｇａｔｇａｇｔｔｇｇ ｇｃｃｇｔｇｇｔａｃ ａｔｃａａｃｃｔａｔ ６０
ｇａｔｇｇｃｔｔｔｇ ｇｔｔｔａｇｃｔｔｇ ｇｇｃｔａｔｔｔｇｔ ｇａｇｃａｃａｔｔｇ ｔｔｇａａｇａａａｔ ｔａａｇｇｃａｃｃａ １２０
ａｃａｔｔｇｔｔｔｇ ｃｃａｃｔｃａｃｔｔ ｔｃａｔｇａｇｃｔｇ ａｃｔｇｃａｔｔｇｇ ｃｃａａｃａａｇａａ ｔｇｇｔａａｃａａｔ １８０
ｇｇａｃａｔａａｇｃ ａａａａｔｇｃｔｇｇ ｇａｔａｇｃａａａｔ ｔｔｔｃａｔｇｔｔｔ ｔｔｇｃａｃａｃａｔ ｔｇａｃｃｃｔｔｃｔ ２４０
ａａｔｃｇｃａａｇｃ ｔａａｃｔａｔｇｃｔ ｔｔａｃａａｇｇｔｔ ｃａａｃｃａｇｇｔｇ ｃｔｔｇｔｇａｔｃａ ｇａｇｔｔｔｔｇｇｔ ３００
ａｔｔｃａｔｇｔｔｇ ｃｔｇａａｔｔｔｇｃ ａａａｔｔｔｔｃｃａ ｃｃｇａｇｔｇｔｔｇ ｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃ ｃａｇａｇａａａａｇ ３６０
ｇｃａｔｃｔｇａｇｔ ｔｇｇａｇｇａｔｔｔ ｃｔｃｔｃｃｔａｔｔ ｇｃｃａｔａａｔｔｃ ｃａａａｔｇａｃａｔ ｔａａａｇａｇｇｃａ ４２０
ｇｃｔｔｃａａａａｃ ｇｇａａｇａｇａｇａ ａｔｔｔｇａｃｃｃｔ ｃａｔｇａｃｇｔｇｔ ｃｔａｇａｇｇｔａｃ ｔｇｃｃａｇａｇｃｔ ４８０
ｃｇｇｃａａｔｔｃｔ ｔａｃａｇｇａｔｔｔ ｃｔｃｔｃａｇｔｔｇ ｃｃａｃｔｇｇａｔａ ａｇａｔｇｇａｔｃｃ ａａｇｃｇａｇｇｔｃ ５４０
ａｇｇｃａａｃａｇｔ ｔｇａｇｃａａａａｔ ｇａａａａｃｃｇａｃ ｃｔｇｇａｇａｇｇｇ ａｔｇｃａｇｔｔｇａ ｃｔｃｔｃａｃｔｇｇ ６００
ｔｔｔｃａｇｃａａｔ ｔｃｔｔｔｔａｇｔｔ ｃｔｔｃａｇａｔｔａ ｇａａｃｔａｔａｔｃ ｔｔｃｔａｔｔｃｔｇ ｔｇａａｇｃｔｔｇｇ ６６０
ｇｇｇａａｔｇａｔａ ｇｔｇａｔｇｇｇｔｔ ｔｔｇｔｇｇａｔａｔ ａａｃｔｔａｇｃｃｔ ａａｇｔｇｔａａａｇ ｔｔｔｃｇｔｔｔａａ ７２０
ａｔｃｃｔｔａｃｃｃ ｃａａａｃａｔｇａｔ ｔｃｔｃｔｇｔａａｔ ｃａｇｇｇｇａｃｔｔ ｔｔｇｔａｔｇｃａｔ ｃｃｔｇｔｇｔｔａａ ７８０
ａｔａｇｔａａａｃｇ ｔｔａｔｃｔｔａｔｇ ｇｔｃａｇｃｔａａｃ ａｔｔｇｇｔａｇｔａ ｇｔｃｔａｔｔｇａａ ｔｔａｔｔｃｃｔｔｃ ８４０
ａｃａａｃｇａｃｔａ ａａｃａａｃｃｔｔｃ ｃｃｔｔｃｔｃｔｔａ ａａａｃａｃｃｃｔａ ａａｃｔ ８８４
＜２１０＞ ３
＜２１１＞ １８
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
＜２２０＞
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞ ３
ａｃｃａｇｃｔｔａｇ ｇａａａｃｇｃａ
＜２１０＞ ４
＜２１１＞ １８
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞ ４
ａｇｃａｃｃａｇｔａ ｔｃａｇｃａｃａ
＜２１０＞ ５
＜２１１＞ ２３
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
＜２２０＞
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞ ５
ｃａｃａｃａｔｔｇａ ｃｃｃｔｔｃｔａａｔ ｃｇｃ ２３
＜２１０＞ ６
＜２１１＞ ２３
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
＜２２０＞
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞ ６
ａｇａａａｔｃｃｔｃ ｃａａｃｔｃａｇａｔ ｇｃｃ ２３
＜２１０＞ ７
＜２１１＞ ７８６
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ
＜４００＞ ７
ａｔｇｇｇａａｇａｇ ｇａｔｃｇｃａｔｃａ ｃｃａｃｃａｔｃａｔ ｃａｔａａｇｃｔｔｃ ｃａａａｇａａｇａａ ｇａｇｇａａｇｇｔｔ ６０
ｃｔｃｇａｇａｔｇｇ ｔｇａｇｃａａｇｇｇ ｃｔａｇｇａｇｃｔｇ ｔｔｃａｃｃｇｇｇｇ ｔｇｇｔｇｃｃｃａｔ ｃｃｔｇｇｔｃｇａｇ １２０
ｃｔｇｇａｃｇｇｃｇ ａｃｇｔａａａｃｇｇ ｃｃａｃａａｇｔｔｃ ａｇｃｇｔｇｔｃｃｇ ｇｃｇａｇｇｇｃｇａ ｇｇｇｃｇａｔｇｃｃ １８０
ａｃｃｔａｃｇｇｃａ ａｇｃｔｇａｃｃｃｔ ｇａａｇｔｔｃａｔｃ ｔｇｃａｃｃａｃｃｇ ｇｃａａｇｃｔｇｃｃ ｃｇｔｇｃｃｃｔｇｇ ２４０
ｃｃｃａｃｃｃｔｃｇ ｔｇａｃｃａｃｃｃｔ ｇａｃｃｔａｃｇｇｃ ｇｔｇｃａｇｔｇｃｔ ｔｃａｇｃｃｇｃｔａ ｃｃｃｃｇａｃｃａｃ ３００
ａｔｇａａｇｃａｇｃ ａｃｇａｃｔｔｃｔｔ ｃａａｇｔｃｃｇｃｃ ａｔｇｃｃｃｇａａｇ ｇｃｔａｃｇｔｃｃａ ｇｇａｇｃｇｃａｃｃ ３６０
ａｔｃｔｔｃｔｔｃａ ａｇｇａｃｇａｃｇｇ ｃａａｃｔａｃａａｇ ａｃｃｃｇｃｇｃｃｇ ａｇｇｔｇａａｇｔｔ ｃｇａｇｇｇｃｇａｃ ４２０
ａｃｃｃｔｇｇｔｇａ ａｃｃｇｃａｔｃｇａ ｇｃｔｇａａｇｇｇｃ ａｔｃｇａｃｔｔｃａ ａｇｇａｇｇａｃｇｇ ｃａａｃａｔｃｃｔｇ ４８０
ｇｇｇｃａｃａａｇｃ ｔｇｇａｇｔａｃａａ ｃｔａｃａａｃａｇｃ ｃａｃａａｃｇｔｃｔ ａｔａｔｃａｔｇｇｃ ｃｇａｃａａｇｃａｇ ５４０
ａａｇａａｃｇｇｃａ ｔｃａａｇｇｔｇａａ ｃｔｔｃａａｇａｔｃ ｃｇｃｃａｃａａｃａ ｔｃｇａｇｇａｃｇｇ ｃａｇｃｇｔｇｃａｇ ６００
ｃｔｃｇｃｃｇａｃｃ ａｃｔａｃｃａｇｃａ ｇａａｃａｃｃｃｃｃ ａｔｃｇｇｃｇａｃｇ ｇｃｃｃｃｇｔｇｃｔ ｇｃｔｇｃｃｃｇａｃ ６６０
ａａｃｃａｃｔａｃｃ ｔｇａｇｃａｃｃｃａ ｇｔｃｃｇｃｃｃｔｇ ａｇｃａａａｇａｃｃ ｃｃａａｃｇａｇａａ ｇｃｇｃｇａｔｃａｃ ７２０
ａｔｇｇｔｃｃｔｇｃ ｔｇｇａｇｔｔｃｇｔ ｇａｃｃｇｃｃｇｃｃ ｇｇｇａｔｃａｃｔｃ ｔｃｇｇｃａｔｇｇａ ｃｇａｇｃｔｇｔａｃ ７８０
ａａｇｔａａ ７８６
＜２１０＞ ８
＜２１１＞ ２５
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
＜２２０＞
＜２２３＞ ｍｕｔａｇｅｎｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
＜２２０＞
＜２２１＞ ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂａｓｅ
＜２２２＞ （１） ．． （４）
＜２２３＞ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
＜２２０＞
＜２２１＞ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｓｅ
＜２２２＞ （２２） ．． （２５）
＜２２３＞ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
＜４００＞ ８
ｔｇａａｃａｇｃｔｃ ｃｔｃｇｃｃｃｔｔｇ ｃｔｃａｃ ２５
＜２１０＞ ９
＜２１１＞ ２５
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
＜２２０＞
＜２２３＞ ｍｕｔａｇｅｎｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
＜２２０＞
＜２２１＞ ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂａｓｅ
＜２２２＞ （１） ．． （４）
＜２２３＞ ｐｈｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
＜２２０＞
＜２２１＞ ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂａｓｅ
＜２２２＞ （２２） ．． （２５）
＜２２３＞ ｐｈｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
＜４００＞ ９
ｔｇａａｃａｇｃｔｃ ｃｔａｇｃｃｃｔｔｇ ｃｔｃａｃ ２５
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞プロトプラストにおける１以上の注目する分子の導入方法であって、
− 植物細胞から細胞壁を酵素により分解し、かつ／または植物細胞から細胞壁を取り除くことにより、前記植物細胞プロトプラストを準備する工程と、
− （ｉ）ミスマッチ修復系、非相同末端再結合からなる群から選択される１以上の経路の制御を変更することができる第１の組成物、および／または
（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる第２の組成物
を用いて前記植物細胞プロトプラストの第１の形質移入を実施する工程と、
− １以上の注目する分子を用いて前記植物細胞プロトプラストの第２の形質移入を実施する工程と、
− 前記細胞壁が形成されるのを許容する工程と
を含み、前記第２の形質移入は前記第１の形質移入の後に実施される、方法。
【請求項２】
二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる前記第２の組成物は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするＤＮＡコンストラクト、メガヌクレアーゼをコードするＤＮＡコンストラクト、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼをコードするＤＮＡコンストラクトからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の組成物および前記第２の組成物は、実質的に同時に前記植物細胞プロトプラストへと与えられる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の組成物は、前記第２の組成物の前に加えられる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の組成物は、前記第１の組成物の前に加えられる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記制御を変更することは、前記経路のうちの１以上の下方制御、好ましくは前記経路の一過性の下方制御である、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と第２の形質移入との間に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の後に、
前記植物細胞プロトプラストを、前記細胞壁の（再）形成を阻害または防止する非酵素組成物と接触させる工程をさらに含み、前記方法は、
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と第２の形質移入との間に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の後で、
かつ前記細胞壁が形成されるのを許容する前に、
細胞壁の形成を阻害または防止する前記非酵素組成物を除去する工程をさらに含む、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記植物細胞または植物細胞プロトプラストの細胞周期の期を同期化する工程をさらに含む、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記同期化は、好ましくは、
− 前記植物細胞プロトプラストが前記植物細胞から形成される前または前記植物細胞プロトプラストが前記植物細胞から形成されるのと同時に、または
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と前記第２の形質移入との間に、
前記植物細胞または植物細胞プロトプラストを、同期化剤と接触させることにより成し遂げられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法は、
− 前記植物細胞プロトプラストが前記植物細胞から形成される前に、または
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と前記第２の形質移入との間に、または
− 前記第２の形質移入の後もしくは第２の形質移入と同時に、
前記同期化剤を除去する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記同期化する工程は、前記植物細胞プロトプラストを、前記細胞壁の（再）形成を阻害または防止する非酵素組成物と接触させる工程とは独立に（例えば前に、後にまたは同時に）実施される、請求項８から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞壁の形成を阻害する前記非酵素組成物は、
（ａ）セルロース生合成阻害剤、
（ｂ）微小管集合阻害剤、
（ｃ）セルロース沈着の阻害剤、
（ｄ）他の細胞壁形成阻害剤
からなる群から選択される１以上の細胞壁形成阻害剤を含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記セルロース生合成阻害剤は、ジクロベニル、クロルチアミド、フルポキサム、トリアゾフェナミド、フトキサゾリンＡ、フトラマイシン、タクストミンＡ、ブレフェルジンＡからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記微小管集合阻害剤は、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル プロピザミド＝プロナミド、テブタム ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記セルロース沈着の阻害剤はキンクロラックである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記他の細胞壁形成阻害剤は、モルリン（７−エトキシ−４−メチルクロメン−２−オン）、イソキサベン（ＣＡＳ ８２５５８−５０−７、Ｎ−［３−（１−エチル−１−メチルプロピル）−１，２−オキサゾール−５−イル］−２，６−ジメトキシベンズアミド）、ＡＥ Ｆ１５０９４４（Ｎ２−（１−エチル−３−フェニルプロピル）−６−（１−フルオロ−１−メチルエチル）−１，３，５，−トリアジン−２，４−ジアミン）、ジクロベニル（ジクロロベンゾニトリル）、カルコフロールおよび／またはカルコフロールホワイト（４，４’−ビス（（４−アニリノ−６−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−ｓ−トリアジン−２−イル）アミノ）−、２，２’−スチルベン二スルホン酸およびその塩）、オリザリン（ＣＡＳＲＮ １９０４４−８８−３、４−（ジプロピルアミノ）−３，５−ジニトロベンゼンスルホンアミド）、５−ｔｅｒｔ−ブチル−カルバモイルオキシ−３−（３−トリフルオロメチル）フェニル−４−チアゾリジノン、クマリン、３，４ デヒドロプロリン、
【化１】
、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル、プロピザミド＝プロナミド、テブタム、ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、キンクロラックからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の組成物は、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬ、ＭｕｔＨ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＳＨ７、ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、ＤＮＡ−ＰＫ複合体 Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、Ｋｕ８６、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０、ＲＡＤ５１、ＸＲＣＣ４、Ｎｂｓ１、ＰＡＲＰ−１のうちの１以上の制御を変更することができる、請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の組成物はｄｓＲＮＡを含む、請求項１から請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の形質移入における前記１以上の分子は、化学物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、プラスミド、リポソーム、変異原性オリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞周期の期の前記同期化は、前記プロトプラストを細胞周期のＳ期、Ｍ期、Ｇ１および／またはＧ２期に同期化する、請求項８から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞周期の期の前記同期化は、リン酸飢餓、硝酸飢餓、イオン飢餓、血清飢餓、スクロース飢餓、オーキシン飢餓などの栄養欠乏により成し遂げられる、請求項８から請求項１１および請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記同期化剤は、アフィディコリン、ヒドロキシ尿素、チミジン、コルヒチン、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル プロピザミド＝プロナミド、テブタム ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、ミモシン、アニソマイシン、α アマニチン、ロバスタチン、ジャスモン酸、アブサイシン酸、メナジオン、クリプトゲイン、熱、過酸化水素、過マンガン酸ナトリウム、インドメタシン、エポキソミシン、ラクタシスチン、ｉｃｒｆ １９３、オロモウシン、ロスコビチン、ボヘミン、スタウロスポリン、Ｋ２５２ａ、オカダ酸、エンドタール、カフェイン、ＭＧ１３２、サイクリン依存性キナーゼおよびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤からなる群のうちの１以上から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の形質移入と前記第２の形質移入との間の時間は、少なくとも１０、３０、６０分間、１、２、４、６、８、１０、１２、１６、または２４時間であるが、好ましくは９６時間未満であり、好ましくは前記時間は、１時間〜７２時間、より好ましくは２〜４８時間、さらにより好ましくは４〜４２時間、なおさらにより好ましくは１２〜３６時間である、請求項１から請求項２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の形質移入と前記第２の形質移入との間の時間は、少なくとも１０、３０、６０分間、１、２、４、６、８、１０、１２、１６、または２４時間であるが、好ましくは９６時間未満であり、好ましくは前記時間は１時間〜７２時間、より好ましくは２〜４８時間、さらにより好ましくは４〜４２時間、なおさらにより好ましくは１２〜３６時間であり、前記方法は、
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と第２の形質移入との間に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の後に
前記植物細胞プロトプラストを、前記細胞壁の（再）形成を阻害または防止する非酵素組成物と接触させる工程をさらに含み、前記方法は、
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と第２の形質移入との間に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の後で、
かつ前記細胞壁が形成されるのを許容する前に、
細胞壁の形成を阻害または防止する前記非酵素組成物を除去する工程をさらに含む、請求項１から請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１９に記載の異種分子を用いて形質移入された植物細胞プロトプラスト。
【請求項２６】
植物細胞プロトプラストを形質移入するためのキットであって、第１の組成物、第２の組成物、細胞壁の形成を阻害または防止する非酵素組成物、同期化剤、および１以上の注目する異種分子からなる群から選択される２以上を含むキット。
【請求項１】
植物細胞プロトプラストにおける１以上の注目する分子の導入方法であって、
− 植物細胞から細胞壁を酵素により分解し、かつ／または植物細胞から細胞壁を取り除くことにより、前記植物細胞プロトプラストを準備する工程と、
− （ｉ）ミスマッチ修復系、非相同末端再結合からなる群から選択される１以上の経路の制御を変更することができる第１の組成物、および／または
（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる第２の組成物
を用いて前記植物細胞プロトプラストの第１の形質移入を実施する工程と、
− １以上の注目する分子を用いて前記植物細胞プロトプラストの第２の形質移入を実施する工程と、
− 前記細胞壁が形成されるのを許容する工程と
を含み、前記第２の形質移入は前記第１の形質移入の後に実施される、方法。
【請求項２】
二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる前記第２の組成物は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするＤＮＡコンストラクト、メガヌクレアーゼをコードするＤＮＡコンストラクト、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼをコードするＤＮＡコンストラクトからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の組成物および前記第２の組成物は、実質的に同時に前記植物細胞プロトプラストへと与えられる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の組成物は、前記第２の組成物の前に加えられる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の組成物は、前記第１の組成物の前に加えられる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記制御を変更することは、前記経路のうちの１以上の下方制御、好ましくは前記経路の一過性の下方制御である、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と第２の形質移入との間に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の後に、
前記植物細胞プロトプラストを、前記細胞壁の（再）形成を阻害または防止する非酵素組成物と接触させる工程をさらに含み、前記方法は、
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と第２の形質移入との間に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の後で、
かつ前記細胞壁が形成されるのを許容する前に、
細胞壁の形成を阻害または防止する前記非酵素組成物を除去する工程をさらに含む、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記植物細胞または植物細胞プロトプラストの細胞周期の期を同期化する工程をさらに含む、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記同期化は、好ましくは、
− 前記植物細胞プロトプラストが前記植物細胞から形成される前または前記植物細胞プロトプラストが前記植物細胞から形成されるのと同時に、または
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と前記第２の形質移入との間に、
前記植物細胞または植物細胞プロトプラストを、同期化剤と接触させることにより成し遂げられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法は、
− 前記植物細胞プロトプラストが前記植物細胞から形成される前に、または
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と前記第２の形質移入との間に、または
− 前記第２の形質移入の後もしくは第２の形質移入と同時に、
前記同期化剤を除去する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記同期化する工程は、前記植物細胞プロトプラストを、前記細胞壁の（再）形成を阻害または防止する非酵素組成物と接触させる工程とは独立に（例えば前に、後にまたは同時に）実施される、請求項８から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞壁の形成を阻害する前記非酵素組成物は、
（ａ）セルロース生合成阻害剤、
（ｂ）微小管集合阻害剤、
（ｃ）セルロース沈着の阻害剤、
（ｄ）他の細胞壁形成阻害剤
からなる群から選択される１以上の細胞壁形成阻害剤を含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記セルロース生合成阻害剤は、ジクロベニル、クロルチアミド、フルポキサム、トリアゾフェナミド、フトキサゾリンＡ、フトラマイシン、タクストミンＡ、ブレフェルジンＡからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記微小管集合阻害剤は、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル プロピザミド＝プロナミド、テブタム ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記セルロース沈着の阻害剤はキンクロラックである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記他の細胞壁形成阻害剤は、モルリン（７−エトキシ−４−メチルクロメン−２−オン）、イソキサベン（ＣＡＳ ８２５５８−５０−７、Ｎ−［３−（１−エチル−１−メチルプロピル）−１，２−オキサゾール−５−イル］−２，６−ジメトキシベンズアミド）、ＡＥ Ｆ１５０９４４（Ｎ２−（１−エチル−３−フェニルプロピル）−６−（１−フルオロ−１−メチルエチル）−１，３，５，−トリアジン−２，４−ジアミン）、ジクロベニル（ジクロロベンゾニトリル）、カルコフロールおよび／またはカルコフロールホワイト（４，４’−ビス（（４−アニリノ−６−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−ｓ−トリアジン−２−イル）アミノ）−、２，２’−スチルベン二スルホン酸およびその塩）、オリザリン（ＣＡＳＲＮ １９０４４−８８−３、４−（ジプロピルアミノ）−３，５−ジニトロベンゼンスルホンアミド）、５−ｔｅｒｔ−ブチル−カルバモイルオキシ−３−（３−トリフルオロメチル）フェニル−４−チアゾリジノン、クマリン、３，４ デヒドロプロリン、
【化１】
、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル、プロピザミド＝プロナミド、テブタム、ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、キンクロラックからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の組成物は、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬ、ＭｕｔＨ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＳＨ７、ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、ＤＮＡ−ＰＫ複合体 Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、Ｋｕ８６、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０、ＲＡＤ５１、ＸＲＣＣ４、Ｎｂｓ１、ＰＡＲＰ−１のうちの１以上の制御を変更することができる、請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の組成物はｄｓＲＮＡを含む、請求項１から請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の形質移入における前記１以上の分子は、化学物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、プラスミド、リポソーム、変異原性オリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞周期の期の前記同期化は、前記プロトプラストを細胞周期のＳ期、Ｍ期、Ｇ１および／またはＧ２期に同期化する、請求項８から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞周期の期の前記同期化は、リン酸飢餓、硝酸飢餓、イオン飢餓、血清飢餓、スクロース飢餓、オーキシン飢餓などの栄養欠乏により成し遂げられる、請求項８から請求項１１および請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記同期化剤は、アフィディコリン、ヒドロキシ尿素、チミジン、コルヒチン、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン（ベンフルラリン）、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホス−メチル、ブタミホス ジチオピル、チアゾピル プロピザミド＝プロナミド、テブタム ＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、ミモシン、アニソマイシン、α アマニチン、ロバスタチン、ジャスモン酸、アブサイシン酸、メナジオン、クリプトゲイン、熱、過酸化水素、過マンガン酸ナトリウム、インドメタシン、エポキソミシン、ラクタシスチン、ｉｃｒｆ １９３、オロモウシン、ロスコビチン、ボヘミン、スタウロスポリン、Ｋ２５２ａ、オカダ酸、エンドタール、カフェイン、ＭＧ１３２、サイクリン依存性キナーゼおよびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤からなる群のうちの１以上から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の形質移入と前記第２の形質移入との間の時間は、少なくとも１０、３０、６０分間、１、２、４、６、８、１０、１２、１６、または２４時間であるが、好ましくは９６時間未満であり、好ましくは前記時間は、１時間〜７２時間、より好ましくは２〜４８時間、さらにより好ましくは４〜４２時間、なおさらにより好ましくは１２〜３６時間である、請求項１から請求項２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の形質移入と前記第２の形質移入との間の時間は、少なくとも１０、３０、６０分間、１、２、４、６、８、１０、１２、１６、または２４時間であるが、好ましくは９６時間未満であり、好ましくは前記時間は１時間〜７２時間、より好ましくは２〜４８時間、さらにより好ましくは４〜４２時間、なおさらにより好ましくは１２〜３６時間であり、前記方法は、
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と第２の形質移入との間に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の後に
前記植物細胞プロトプラストを、前記細胞壁の（再）形成を阻害または防止する非酵素組成物と接触させる工程をさらに含み、前記方法は、
− 前記第１の形質移入の前もしくは前記第１の形質移入と同時に、または
− 前記第１の形質移入と第２の形質移入との間に、または
− 前記第２の形質移入の前もしくは前記第２の形質移入と同時に、または
− 前記第２の形質移入の後で、
かつ前記細胞壁が形成されるのを許容する前に、
細胞壁の形成を阻害または防止する前記非酵素組成物を除去する工程をさらに含む、請求項１から請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１９に記載の異種分子を用いて形質移入された植物細胞プロトプラスト。
【請求項２６】
植物細胞プロトプラストを形質移入するためのキットであって、第１の組成物、第２の組成物、細胞壁の形成を阻害または防止する非酵素組成物、同期化剤、および１以上の注目する異種分子からなる群から選択される２以上を含むキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１３−５１４７６４（Ｐ２０１３−５１４７６４Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４４４２３（Ｐ２０１２−５４４４２３）
【出願日】平成２２年１２月２０日（２０１０．１２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２０１０／０５０８７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７８６６５
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５０９３５１３４０）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２０日（２０１０．１２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２０１０／０５０８７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７８６６５
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５０９３５１３４０）
【Ｆターム（参考）】
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