プロトプラスト形質転換効率の向上方法
【課題】形質転換効率の高いプロトプラスト形質転換方法の提供。
【解決手段】宿主微生物の細胞膜脂質の生合成に係るｕｇｔＰ遺伝子を欠失又は不活性化すること。
【解決手段】宿主微生物の細胞膜脂質の生合成に係るｕｇｔＰ遺伝子を欠失又は不活性化すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロトプラスト形質転換効率の向上方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、あるいは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。更に、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（非特許文献１）、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＭＧ１６５５（非特許文献２）、コリネバクテリウムＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３２０３２などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。
【０００４】
また、特に最近では、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われている。ＤＮＡなどの核酸分子を外部から枯草菌に導入して形質転換する場合、自然形質転換法（コンピテントセル法）（非特許文献３）、プロトプラスト法（非特許文献４）、エレクトロポレーション法（非特許文献５）が主に用いられる。これらの方法のうち、自然形質転換法は、コンピテント培養により調製した、ＤＮＡ取り込み能を有する細胞（コンピテント細胞）を用いた形質転換である。この自然形質転換は、枯草菌マーブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ）系の菌株（１６８、１６６、１６０株）でのみ生じるが、納豆菌等では自然形質転換の頻度は極めて低く、これらは形質転換能（コンピテンシー）を有しないともいわれる。一方で、プロトプラスト法及びエレクトロポレーション法は、多くの菌種に適用可能である。ここで、プロトプラスト法とは、等張液中で細胞壁をリゾチームによって分解してプロトプラスト細胞を調製し、ＤＮＡとプロトプラスト細胞を高濃度ポリエチレングリコールにより凝集させ、更にポリエチレングリコールの濃度を急激に低下させることでＤＮＡを取り込ませる手法である。またエレクトロポレーション法とは、細胞懸濁液に電気パルスを負荷して細胞膜に微小な孔を形成させ、そこからＤＮＡを細胞内に導入する手法である（非特許文献６）。
【０００５】
しかしながら枯草菌を含む多くの細菌では、導入された外来ＤＮＡが修飾（メチル化）されている自己のＤＮＡと区別され、更に当該外来ＤＮＡが、そのＤＮＡ中の特定の塩基配列を認識して切断する制限酵素により分解されるため、形質転換は一般には起こりにくい。形質転換においてはこれらの制限修飾系が少ないほど好ましいと考えられ、例えば魚住らは、枯草菌マーブルグ系の株を基に、制限修飾能を欠失させた株ＲＭ１２５株を作製し、形質転換能を１０〜１００倍に向上させている（非特許文献７）。
【０００６】
ｕｇｔＰ遺伝子は１，２−ジアシルグリセロールにグルコース残基を付加するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。Ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験から、本酵素は１，２−ジアシルグリセロールにグルコースを４個まで連続して付加することが可能であることがわかっているが、生体内ではジグリコシルアシルグリセロールが主要な糖脂質である（非特許文献８）。ｕｇｔＰ遺伝子に関しては、その欠損により細胞の膜脂質の脂肪酸組成に影響を与えることが報告されている（非特許文献９）が、ｕｇｔＰ遺伝子と形質転換効率の向上との関係についてはこれまで報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，３９０（６６５７），ｐ２４９−２５６（１９９７）
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７（５３３１），ｐ１４５３−１４６２（１９９７）
【非特許文献３】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１，ｐ７４１（１９６１）
【非特許文献４】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８，ｐ１１１（１９７９）
【非特許文献５】ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５，ｐ１３５（１９９０）
【非特許文献６】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．ら，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ｐ９８−１０３
【非特許文献７】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｎｅ．，１５２,ｐ６５−９（１９７７）
【非特許文献８】Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９８，２９（２），ｐ．４１９−４３０
【非特許文献９】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００８，１９０，７７９７−７８０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、形質転換効率の高いプロトプラスト形質転換方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み検討した結果、宿主微生物の細胞膜脂質の生合成に係るｕｇｔＰ遺伝子を欠失又は不活性化することにより、プロトプラスト形質転換効率が向上することを見出した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下に関する。
（１） ｕｇｔＰ遺伝子が欠失又は不活性化された宿主微生物のプロトプラストを用いることを特徴とする、形質転換方法。
（２） 前記宿主微生物がグラム陽性細菌である、前記（１）記載の形質転換方法。
（３） 前記宿主微生物がバチルス属細菌である、前記（２）記載の形質転換方法。
（４） 前記宿主微生物が枯草菌である、前記（３）記載の形質転換方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の形質転換方法を用いることにより、目的のＤＮＡ、例えば目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を宿主微生物に効率的に導入することが可能となる。その結果、例えばタンパク質又はポリペプチドを高生産する優良株の選抜が容易になり、更に当該タンパク質又はポリペプチドの生産性向上が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＳＯＥ−ＰＣＲによる遺伝子欠失用ＤＮＡ断片の調製、及び当該ＤＮＡ断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示した図。
【図２】遺伝子欠失用プラスミドを用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示した図。
【図３】形質転換効率を示すグラフ。（ａ）はｐＨＹ３００ＰＬＫ、（ｂ）はｐＣ１９４を用いて形質転換した場合の、１６８株（野生株）及びΔｕｇｔＰ株における結果である。結果はＮ＝３の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の方法においては、宿主微生物のｕｇｔＰ遺伝子が、欠失又は不活性化されている。このｕｇｔＰ遺伝子は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）において、遺伝子番号 ＢＧ１１６１１として登録・公開されている（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／、２００６年１月１８日更新）。
【００１４】
ｕｇｔＰ遺伝子（配列番号１）と塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上の同一性を有し、１，２−ジアシルグリセロールにグルコース残基を付加するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も、当該ｕｇｔＰ遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失又は不活性化されるｕｇｔＰ遺伝子に含まれるものとする。
【００１５】
アミノ酸配列及び塩基配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法 （Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算することができる。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１６】
また、枯草菌ＵｇｔＰのホモログをＫＥＧＧ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ＤａｔａＢａｓｅ（ＳＳＤＢ）にて検索を行った結果、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓのＳｃａ＿０６１９（Ｓｏｃ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．（１９９０）１９，４９Ｓ−５３Ｓ）、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅのＤｈａｆ＿３１７８、及びＤＳＹ３２０６（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，（２００６）３０，７０６−７３３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｒｅｄｕｃｅｎｓのＤｒｅｄ＿１９６６（Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００９）１２，３００７−３０１７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍのＣｃｅｌ＿００３４（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００５）２９，７４１−７６４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのＣｔｈｅ＿２４１４（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，（２００５）６９，１２４−１５４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのＣｌｏｃｅｌ＿３０８６（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（２００４）５８，５２１−５５４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのＣＬＪＵ＿ｃ０２１６０（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ．Ｅｎｇ．，（２００９）３２，３６９−３８０）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓのＢＢＲ４７＿４１０８０（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９８８）８６：３５８９−９３）、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓのＶａｐａｒ＿４９８６及びＶａｒｐａ＿５６８２（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（２０００），１７４，１１１−１１９）、及びＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓのＤＲ＿１０７６（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０００）１１，２８０−２８５）は枯草菌ＵｇｔＰのホモログと推察されることより、これらをコードする遺伝子は本発明において欠失又は不活性化されるｕｇｔＰ遺伝子に含まれるものとする。
【００１７】
本発明で使用される宿主微生物としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌や、上述のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ブレビバシラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌等のグラム陽性細菌が挙げられ、中でもバチルス属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。
【００１８】
上記宿主微生物からのｕｇｔＰ遺伝子の欠失又は不活性化は、標的遺伝子の一部若しくは全部をゲノム中から除去するか又は他の遺伝子と置き換える、当該遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、あるいは当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行い、好適には当該遺伝子を物理的に欠失させる。より具体的には、ｕｇｔＰ遺伝子を計画的に欠失又は不活性化する方法、及びランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行って所望の変異を選択する方法が挙げられる。
【００１９】
ｕｇｔＰ遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、ｕｇｔＰ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、ｕｇｔＰ遺伝子の一部領域における相同組換えによって宿主微生物ゲノム上のｕｇｔＰ遺伝子を分断して不活性化することが可能である。あるいは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化したｕｇｔＰ遺伝子、又は図１のようにｕｇｔＰ遺伝子の上流、下流領域を含むがｕｇｔＰ遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを宿主微生物細胞内に取り込ませて宿主微生物ゲノムのｕｇｔＰ遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又はｕｇｔＰ遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上のｕｇｔＰ遺伝子を欠失あるいは他の遺伝子断片と置換させることによって不活性化させることが可能である。
【００２０】
例えば、本発明の方法に使用する微生物を構築するための宿主微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えによりｕｇｔＰ遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既に幾つかの報告例があり（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２３，２６８，１９９０等）、かかる方法を繰り返すことにより、本発明で用いられる微生物を得ることができる。
【００２１】
また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化については、ランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、宿主微生物にγ線等を照射する方法等が実施可能である。
【００２２】
以下に、具体例として、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，１９８９）によって調製される欠失用ＤＮＡ断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明における遺伝子欠失又は不活性化方法は下記に限定されるものではない。
【００２３】
欠失用ＤＮＡ断片は、例えば、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約１．０ｋｂ断片と、同じく下流に隣接する約１．０ｋｂ断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、１回目のＰＣＲによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側１０〜３０塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側１０〜３０塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
【００２４】
次いで、１回目に調製した３種類のＰＣＲ断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列において、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、ＰＣＲ増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したＤＮＡ断片を得ることができる（図２）。以上のＰＣＲは、市販のＰＣＲ用酵素キット等を用いて、成書（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ２５１，１９９３、Ｇｅｎｅ，７７，６１，１９８９）等に示される通常の条件により行うことができる。
【００２５】
かくして得られた遺伝子欠失用ＤＮＡ断片を、コンピテント法あるいは下記のプロトプラスト法等の定法によって微生物細胞内に導入すると、対応する欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域において、細胞内での遺伝子組換えが生じ、ｕｇｔＰ遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換された細胞、あるいはｕｇｔＰ遺伝子内に薬剤耐性遺伝子が挿入された細胞が生じ得る（図２）。これを薬剤耐性マーカーによる選択によって分離する。即ち、遺伝子導入した微生物を、上記薬剤を含む寒天培地上で培養し、生育するコロニーを分離した後、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法などによってゲノム上のｕｇｔＰ遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換されていることを確認すれば良い。
【００２６】
上記により得られた、ｕｇｔＰ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物は、プロトプラストとして調製することにより、外部からの核酸分子の導入を効率的に行うことができる。ここで、微生物のプロトプラストの調製は、公知の方法に従い実施でき、例えば細菌のプロトプラストを調製する場合には、まず一般的に用いられる細菌培養用培地（ＬＢ培地等）に該細菌を接種して培養し、菌体を得、次いでこの菌体を、浸透圧を調整する物質（スクロース、ソルビトール等）を含有する高張緩衝液に懸濁し、更にリゾチームなどの細胞壁分解酵素を作用させて細胞壁を除去することにより、プロトプラストを調製することができる。
【００２７】
上記で得られたプロトプラストを、例えば、ポリエチレングリコール及び薬剤耐性マーカーを有する核酸分子（プラスミドＤＮＡ等）と混合することにより、プラスミドが当該プロトプラスト内に取り込まれ、宿主微生物が形質転換される。
【００２８】
下記の実施例に示すように、ｕｇｔＰ遺伝子を欠失させた宿主微生物のプロトプラストを用いてプラスミドにより形質転換することにより、その形質転換効率は、当該ｕｇｔＰ遺伝子が欠失又は不活性化されていない微生物を用いた場合と比較し高い。
【００２９】
上記により宿主微生物を形質転換した後、形質転換された宿主微生物のクローンを得る場合、例えば一定時間培養した後、クロラムフェニコール等の薬剤を含む再生培地で培養し、導入された核酸分子上に存在する薬剤耐性マーカーによる選抜を行えばよい（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８，１１１（１９７９））。
【００３０】
また、本発明のプロトプラスト形質転換に用いる核酸分子は、形質転換された微生物の用途に応じて適宜選択でき、特に限定されない。例えば、宿主微生物に導入される核酸分子は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を有するプラスミドであってもよく、当該目的タンパク質又は目的ポリペプチドには、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが挙げられる。産業用酵素としては、機能別に、酸化還元酵素（オキシドレダクターゼ）、転移酵素（トランスフェラーゼ）、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）、脱離酵素（リアーゼ）、異性化酵素（イソメラーゼ）、合成酵素（リガーゼ／シンセターゼ）等が含まれる。好適には、セルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素やクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等の転移酵素が挙げられ、より好適には、セルラーゼが挙げられる。
【実施例】
【００３１】
以下に、本発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法について具体的に説明する。
【００３２】
以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてＤＮＡ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを２．５Ｕ添加して、反応液総量を５０μＬとした。ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１分間）の３段階の温度変化を３０回繰り返した後、７２℃で５分間反応させる条件で行った。
【００３３】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の開始コドンの５’側に続く領域のことを示し、一方、下流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の終始コドンの３’側に続く領域のことを示す。
【００３４】
更に、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）で報告され、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）でインターネット公開（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／、２００４年３月１０日更新）された枯草菌ゲノムデータの記載に基づくものである。
【００３５】
枯草菌の形質転換はコンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９３，１９２５（１９６７））にて行った。すなわち、枯草菌をＳＰＩ培地（０．２０％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、１．４０％（ｗ／ｖ）リン酸水素二カリウム、０．６０％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、０．１０％（ｗ／ｖ）クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％（ｗ／ｖ）グルコース、０．０２％（ｗ／ｖ）カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．２５μＭ塩化マンガン、５０μｇ／ｍｌトリプトファン）において、３７℃で、生育度（ＯＤ600）の値が１程度になるまで振盪培養し、振盪培養後、培養液の一部を９倍量のＳＰＩＩ培地（０．２０％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、１．４０％（ｗ／ｖ）リン酸水素二カリウム、０．６０％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、０．１０％（ｗ／ｖ）クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％（ｗ／ｖ）グルコース、０．０１％（ｗ／ｖ）カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．４０μＭ塩化マンガン、５μｇ／ｍＬトリプトファン）に接種し、更に生育度（ＯＤ600）の値が０．４程度になるまで振盪培養して枯草菌のコンピテントセルを調製し、次いで得られたコンピテントセルをＳＰＩＩ培地で懸濁し、当該懸濁液１００μＬに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μＬを添加し、３７℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１．５％（ｗ／ｖ）寒天）に全量を塗沫し、３７℃で静置培養した後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。更に得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって、目的とするゲノム構造の改変がなされたことを確認した。
【００３６】
目的のタンパク質を発現するプラスミドの宿主微生物への導入は、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９））により行った。
【００３７】
実施例１（ｕｇｔＰ欠失株の構築）
表１に示したｙｐｆＰ−３３７ＦとｙｐｆＰ＋２０１Ｒ及びｙｐｆＰ＋８２７ＦとｙｐｆＰ＋５２９Ｒの各プライマーセットを用いて、配列番号１に示すｕｇｔＰ遺伝子の上流を含む５’末端側の５０４ｂｐ断片（Ａ）、及びｕｇｔＰ遺伝子の下流を含む３’末端側の８２３ｂｐ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。得られた断片（Ａ）はＳｐｈＩ及びＳａｌＩ、（Ｂ）はＢａｍＨＩ及びＳｃａＩ処理した。一方、プラスミドｐＤＧ７８０（Ｇｅｎｅ，１６７，３３５，（１９９５））のＳａｌＩ及びＳｍａＩ制限酵素切断点よりカナマイシン耐性遺伝子領域を切り出した（Ｃ）。次に、３断片を（Ａ）（Ｃ）（Ｂ）の順になる様に、ｐＵＣ１１９（ＴＡＫＡＲＡ）に（Ａ）はＳｐｈＩ及びＳａｌＩ、（Ｃ）はＳａｌＩ及びＢａｍＨＩ、（Ｂ）はＢａｍＨＩ及びＳｍａＩ制限酵素切断点にそれぞれ挿入した。この結果得られた組換えプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで処理して直鎖状ＤＮＡにし、形質転換用の供与体ＤＮＡとした（図２参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法による枯草菌１６８株の形質転換を行い、カナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってｕｇｔＰ遺伝子が欠失してカナマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。また相同組換えに利用した領域の（Ａ）及び（Ｂ）のＤＮＡ配列についてシーケンスを行った。（Ａ）領域でｕｇｔＰ遺伝子上流−９ｂｐのＴがＣに置換されていたが、ｕｇｔＰ遺伝子の上流ｍｅｔＡ遺伝子及び下流ｃｓｐＤ遺伝子の発現に影響を及ぼさないことを確認した。以上の様にして、枯草菌のｕｇｔＰ遺伝子が欠失した菌株を構築し、ΔｕｇｔＰ株と命名した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
実施例２（形質転換効率の算出）
プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．，６０，４８５（１９８５））及びｐＣ１９４（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５０，８１５（１９８２））を用いて、実施例１にて構築したΔｕｇｔＰ株及び親株である１６８株の形質転換をプロトプラスト法により行った。ｐＨＹ３００ＰＬＫはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＤＳ−５由来のプラスミドｐＡＭα１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１７，２８３（１９７４））由来であり、ｐＣ１９４はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のプラスミドである。ｐＨＹ３００ＰＬＫは大腸菌ＨＢ１０１株（タカラバイオ）を用いて調製し、ｐＣ１９４は枯草菌１６８株を用いて調製した。プロトプラスト法は以下の手順で行った。まず、各菌をＬＢ液体培地（１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）にて、３０℃、１５０ｒｐｍで１０時間培養した培養液を、再度ＬＢ液体培地に１％植菌し、３時間培養した。培養液を１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した後、４ｍｇ／ｍＬ リゾチームを含むＳＭＭＰ溶液（３５ｇ／Ｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ ３、１７１．５ｇ／Ｌ スクロース、３．２ｇ／Ｌ マレイン酸２ナトリウム、４．０６ｇ／Ｌ 塩化マグネシウム６水和物）５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間静置した。３５００ｒｐｍで１０分間遠心した後、ＳＭＭＰ溶液４００μＬに懸濁し、そのうち１３μＬを５０ｎｇのプラスミドＤＮＡと混合した。更にＰＥＧを１００μＬ添加し、ボルテックスした後、ＳＭＭＰを３５０μＬ添加して転倒混和した。その後、３０℃、１５０ｒｐｍで１時間培養した後１００μＬを抗生物質（ｐＨＹ３００ＰＬＫの場合５０ｍｇ／Ｌ テトラサイクリン、ｐＣ１９４の場合２０ｍｇ／Ｌ クロラムフェニコール）を含むＤＭ３再生培地（８１ｇ／Ｌ コハク酸ナトリウム６水和物、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ カザミノ酸、１０ｇ／Ｌ 寒天、１０ｇ／Ｌ カルボキシメチルセルロース、１．５ｇ／Ｌ リン酸２水素カリウム、３．５ｇ／Ｌ リン酸水素２カリウム、０．５ｇ／Ｌ グルコース、０．０１ｇ／Ｌ ＢＳＡ、０．００５ｇ／Ｌ トリパンブルー、２０ｍＭ 塩化マグネシウム）に塗布した。また、生菌数を測定する目的で、抗生物質を含まないＤＭ３再生培地にも等量塗布した。３０℃で３日間静置培養し、コロニー数をカウントした。形質転換効率を図２に示す。抗生物質を含むプレート上のコロニー数を、抗生物質を含まないプレート上のコロニー数で割った値を、形質転換効率とした。図２より、ΔｕｇｔＰ株は親株である１６８株よりも有意に形質転換効率が向上していることが判明した（Ｐ＜０．０５、ｔ−検定）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロトプラスト形質転換効率の向上方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、あるいは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。更に、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（非特許文献１）、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＭＧ１６５５（非特許文献２）、コリネバクテリウムＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３２０３２などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。
【０００４】
また、特に最近では、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われている。ＤＮＡなどの核酸分子を外部から枯草菌に導入して形質転換する場合、自然形質転換法（コンピテントセル法）（非特許文献３）、プロトプラスト法（非特許文献４）、エレクトロポレーション法（非特許文献５）が主に用いられる。これらの方法のうち、自然形質転換法は、コンピテント培養により調製した、ＤＮＡ取り込み能を有する細胞（コンピテント細胞）を用いた形質転換である。この自然形質転換は、枯草菌マーブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ）系の菌株（１６８、１６６、１６０株）でのみ生じるが、納豆菌等では自然形質転換の頻度は極めて低く、これらは形質転換能（コンピテンシー）を有しないともいわれる。一方で、プロトプラスト法及びエレクトロポレーション法は、多くの菌種に適用可能である。ここで、プロトプラスト法とは、等張液中で細胞壁をリゾチームによって分解してプロトプラスト細胞を調製し、ＤＮＡとプロトプラスト細胞を高濃度ポリエチレングリコールにより凝集させ、更にポリエチレングリコールの濃度を急激に低下させることでＤＮＡを取り込ませる手法である。またエレクトロポレーション法とは、細胞懸濁液に電気パルスを負荷して細胞膜に微小な孔を形成させ、そこからＤＮＡを細胞内に導入する手法である（非特許文献６）。
【０００５】
しかしながら枯草菌を含む多くの細菌では、導入された外来ＤＮＡが修飾（メチル化）されている自己のＤＮＡと区別され、更に当該外来ＤＮＡが、そのＤＮＡ中の特定の塩基配列を認識して切断する制限酵素により分解されるため、形質転換は一般には起こりにくい。形質転換においてはこれらの制限修飾系が少ないほど好ましいと考えられ、例えば魚住らは、枯草菌マーブルグ系の株を基に、制限修飾能を欠失させた株ＲＭ１２５株を作製し、形質転換能を１０〜１００倍に向上させている（非特許文献７）。
【０００６】
ｕｇｔＰ遺伝子は１，２−ジアシルグリセロールにグルコース残基を付加するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。Ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験から、本酵素は１，２−ジアシルグリセロールにグルコースを４個まで連続して付加することが可能であることがわかっているが、生体内ではジグリコシルアシルグリセロールが主要な糖脂質である（非特許文献８）。ｕｇｔＰ遺伝子に関しては、その欠損により細胞の膜脂質の脂肪酸組成に影響を与えることが報告されている（非特許文献９）が、ｕｇｔＰ遺伝子と形質転換効率の向上との関係についてはこれまで報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，３９０（６６５７），ｐ２４９−２５６（１９９７）
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７（５３３１），ｐ１４５３−１４６２（１９９７）
【非特許文献３】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１，ｐ７４１（１９６１）
【非特許文献４】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８，ｐ１１１（１９７９）
【非特許文献５】ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５，ｐ１３５（１９９０）
【非特許文献６】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．ら，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ｐ９８−１０３
【非特許文献７】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｎｅ．，１５２,ｐ６５−９（１９７７）
【非特許文献８】Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９８，２９（２），ｐ．４１９−４３０
【非特許文献９】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００８，１９０，７７９７−７８０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、形質転換効率の高いプロトプラスト形質転換方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み検討した結果、宿主微生物の細胞膜脂質の生合成に係るｕｇｔＰ遺伝子を欠失又は不活性化することにより、プロトプラスト形質転換効率が向上することを見出した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下に関する。
（１） ｕｇｔＰ遺伝子が欠失又は不活性化された宿主微生物のプロトプラストを用いることを特徴とする、形質転換方法。
（２） 前記宿主微生物がグラム陽性細菌である、前記（１）記載の形質転換方法。
（３） 前記宿主微生物がバチルス属細菌である、前記（２）記載の形質転換方法。
（４） 前記宿主微生物が枯草菌である、前記（３）記載の形質転換方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の形質転換方法を用いることにより、目的のＤＮＡ、例えば目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を宿主微生物に効率的に導入することが可能となる。その結果、例えばタンパク質又はポリペプチドを高生産する優良株の選抜が容易になり、更に当該タンパク質又はポリペプチドの生産性向上が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＳＯＥ−ＰＣＲによる遺伝子欠失用ＤＮＡ断片の調製、及び当該ＤＮＡ断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示した図。
【図２】遺伝子欠失用プラスミドを用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示した図。
【図３】形質転換効率を示すグラフ。（ａ）はｐＨＹ３００ＰＬＫ、（ｂ）はｐＣ１９４を用いて形質転換した場合の、１６８株（野生株）及びΔｕｇｔＰ株における結果である。結果はＮ＝３の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の方法においては、宿主微生物のｕｇｔＰ遺伝子が、欠失又は不活性化されている。このｕｇｔＰ遺伝子は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）において、遺伝子番号 ＢＧ１１６１１として登録・公開されている（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／、２００６年１月１８日更新）。
【００１４】
ｕｇｔＰ遺伝子（配列番号１）と塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上の同一性を有し、１，２−ジアシルグリセロールにグルコース残基を付加するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も、当該ｕｇｔＰ遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失又は不活性化されるｕｇｔＰ遺伝子に含まれるものとする。
【００１５】
アミノ酸配列及び塩基配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法 （Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算することができる。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１６】
また、枯草菌ＵｇｔＰのホモログをＫＥＧＧ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ＤａｔａＢａｓｅ（ＳＳＤＢ）にて検索を行った結果、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓのＳｃａ＿０６１９（Ｓｏｃ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．（１９９０）１９，４９Ｓ−５３Ｓ）、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅのＤｈａｆ＿３１７８、及びＤＳＹ３２０６（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，（２００６）３０，７０６−７３３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｒｅｄｕｃｅｎｓのＤｒｅｄ＿１９６６（Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００９）１２，３００７−３０１７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍのＣｃｅｌ＿００３４（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００５）２９，７４１−７６４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのＣｔｈｅ＿２４１４（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，（２００５）６９，１２４−１５４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのＣｌｏｃｅｌ＿３０８６（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（２００４）５８，５２１−５５４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのＣＬＪＵ＿ｃ０２１６０（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ．Ｅｎｇ．，（２００９）３２，３６９−３８０）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓのＢＢＲ４７＿４１０８０（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９８８）８６：３５８９−９３）、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓのＶａｐａｒ＿４９８６及びＶａｒｐａ＿５６８２（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（２０００），１７４，１１１−１１９）、及びＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓのＤＲ＿１０７６（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０００）１１，２８０−２８５）は枯草菌ＵｇｔＰのホモログと推察されることより、これらをコードする遺伝子は本発明において欠失又は不活性化されるｕｇｔＰ遺伝子に含まれるものとする。
【００１７】
本発明で使用される宿主微生物としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌や、上述のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ブレビバシラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌等のグラム陽性細菌が挙げられ、中でもバチルス属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。
【００１８】
上記宿主微生物からのｕｇｔＰ遺伝子の欠失又は不活性化は、標的遺伝子の一部若しくは全部をゲノム中から除去するか又は他の遺伝子と置き換える、当該遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、あるいは当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行い、好適には当該遺伝子を物理的に欠失させる。より具体的には、ｕｇｔＰ遺伝子を計画的に欠失又は不活性化する方法、及びランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行って所望の変異を選択する方法が挙げられる。
【００１９】
ｕｇｔＰ遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、ｕｇｔＰ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、ｕｇｔＰ遺伝子の一部領域における相同組換えによって宿主微生物ゲノム上のｕｇｔＰ遺伝子を分断して不活性化することが可能である。あるいは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化したｕｇｔＰ遺伝子、又は図１のようにｕｇｔＰ遺伝子の上流、下流領域を含むがｕｇｔＰ遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを宿主微生物細胞内に取り込ませて宿主微生物ゲノムのｕｇｔＰ遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又はｕｇｔＰ遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上のｕｇｔＰ遺伝子を欠失あるいは他の遺伝子断片と置換させることによって不活性化させることが可能である。
【００２０】
例えば、本発明の方法に使用する微生物を構築するための宿主微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えによりｕｇｔＰ遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既に幾つかの報告例があり（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２３，２６８，１９９０等）、かかる方法を繰り返すことにより、本発明で用いられる微生物を得ることができる。
【００２１】
また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化については、ランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、宿主微生物にγ線等を照射する方法等が実施可能である。
【００２２】
以下に、具体例として、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，１９８９）によって調製される欠失用ＤＮＡ断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明における遺伝子欠失又は不活性化方法は下記に限定されるものではない。
【００２３】
欠失用ＤＮＡ断片は、例えば、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約１．０ｋｂ断片と、同じく下流に隣接する約１．０ｋｂ断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、１回目のＰＣＲによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側１０〜３０塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側１０〜３０塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
【００２４】
次いで、１回目に調製した３種類のＰＣＲ断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列において、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、ＰＣＲ増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したＤＮＡ断片を得ることができる（図２）。以上のＰＣＲは、市販のＰＣＲ用酵素キット等を用いて、成書（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ２５１，１９９３、Ｇｅｎｅ，７７，６１，１９８９）等に示される通常の条件により行うことができる。
【００２５】
かくして得られた遺伝子欠失用ＤＮＡ断片を、コンピテント法あるいは下記のプロトプラスト法等の定法によって微生物細胞内に導入すると、対応する欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域において、細胞内での遺伝子組換えが生じ、ｕｇｔＰ遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換された細胞、あるいはｕｇｔＰ遺伝子内に薬剤耐性遺伝子が挿入された細胞が生じ得る（図２）。これを薬剤耐性マーカーによる選択によって分離する。即ち、遺伝子導入した微生物を、上記薬剤を含む寒天培地上で培養し、生育するコロニーを分離した後、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法などによってゲノム上のｕｇｔＰ遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換されていることを確認すれば良い。
【００２６】
上記により得られた、ｕｇｔＰ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物は、プロトプラストとして調製することにより、外部からの核酸分子の導入を効率的に行うことができる。ここで、微生物のプロトプラストの調製は、公知の方法に従い実施でき、例えば細菌のプロトプラストを調製する場合には、まず一般的に用いられる細菌培養用培地（ＬＢ培地等）に該細菌を接種して培養し、菌体を得、次いでこの菌体を、浸透圧を調整する物質（スクロース、ソルビトール等）を含有する高張緩衝液に懸濁し、更にリゾチームなどの細胞壁分解酵素を作用させて細胞壁を除去することにより、プロトプラストを調製することができる。
【００２７】
上記で得られたプロトプラストを、例えば、ポリエチレングリコール及び薬剤耐性マーカーを有する核酸分子（プラスミドＤＮＡ等）と混合することにより、プラスミドが当該プロトプラスト内に取り込まれ、宿主微生物が形質転換される。
【００２８】
下記の実施例に示すように、ｕｇｔＰ遺伝子を欠失させた宿主微生物のプロトプラストを用いてプラスミドにより形質転換することにより、その形質転換効率は、当該ｕｇｔＰ遺伝子が欠失又は不活性化されていない微生物を用いた場合と比較し高い。
【００２９】
上記により宿主微生物を形質転換した後、形質転換された宿主微生物のクローンを得る場合、例えば一定時間培養した後、クロラムフェニコール等の薬剤を含む再生培地で培養し、導入された核酸分子上に存在する薬剤耐性マーカーによる選抜を行えばよい（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８，１１１（１９７９））。
【００３０】
また、本発明のプロトプラスト形質転換に用いる核酸分子は、形質転換された微生物の用途に応じて適宜選択でき、特に限定されない。例えば、宿主微生物に導入される核酸分子は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を有するプラスミドであってもよく、当該目的タンパク質又は目的ポリペプチドには、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが挙げられる。産業用酵素としては、機能別に、酸化還元酵素（オキシドレダクターゼ）、転移酵素（トランスフェラーゼ）、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）、脱離酵素（リアーゼ）、異性化酵素（イソメラーゼ）、合成酵素（リガーゼ／シンセターゼ）等が含まれる。好適には、セルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素やクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等の転移酵素が挙げられ、より好適には、セルラーゼが挙げられる。
【実施例】
【００３１】
以下に、本発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法について具体的に説明する。
【００３２】
以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてＤＮＡ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを２．５Ｕ添加して、反応液総量を５０μＬとした。ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１分間）の３段階の温度変化を３０回繰り返した後、７２℃で５分間反応させる条件で行った。
【００３３】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の開始コドンの５’側に続く領域のことを示し、一方、下流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の終始コドンの３’側に続く領域のことを示す。
【００３４】
更に、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）で報告され、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）でインターネット公開（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／、２００４年３月１０日更新）された枯草菌ゲノムデータの記載に基づくものである。
【００３５】
枯草菌の形質転換はコンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９３，１９２５（１９６７））にて行った。すなわち、枯草菌をＳＰＩ培地（０．２０％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、１．４０％（ｗ／ｖ）リン酸水素二カリウム、０．６０％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、０．１０％（ｗ／ｖ）クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％（ｗ／ｖ）グルコース、０．０２％（ｗ／ｖ）カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．２５μＭ塩化マンガン、５０μｇ／ｍｌトリプトファン）において、３７℃で、生育度（ＯＤ600）の値が１程度になるまで振盪培養し、振盪培養後、培養液の一部を９倍量のＳＰＩＩ培地（０．２０％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、１．４０％（ｗ／ｖ）リン酸水素二カリウム、０．６０％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、０．１０％（ｗ／ｖ）クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％（ｗ／ｖ）グルコース、０．０１％（ｗ／ｖ）カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．４０μＭ塩化マンガン、５μｇ／ｍＬトリプトファン）に接種し、更に生育度（ＯＤ600）の値が０．４程度になるまで振盪培養して枯草菌のコンピテントセルを調製し、次いで得られたコンピテントセルをＳＰＩＩ培地で懸濁し、当該懸濁液１００μＬに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μＬを添加し、３７℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１．５％（ｗ／ｖ）寒天）に全量を塗沫し、３７℃で静置培養した後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。更に得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって、目的とするゲノム構造の改変がなされたことを確認した。
【００３６】
目的のタンパク質を発現するプラスミドの宿主微生物への導入は、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９））により行った。
【００３７】
実施例１（ｕｇｔＰ欠失株の構築）
表１に示したｙｐｆＰ−３３７ＦとｙｐｆＰ＋２０１Ｒ及びｙｐｆＰ＋８２７ＦとｙｐｆＰ＋５２９Ｒの各プライマーセットを用いて、配列番号１に示すｕｇｔＰ遺伝子の上流を含む５’末端側の５０４ｂｐ断片（Ａ）、及びｕｇｔＰ遺伝子の下流を含む３’末端側の８２３ｂｐ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。得られた断片（Ａ）はＳｐｈＩ及びＳａｌＩ、（Ｂ）はＢａｍＨＩ及びＳｃａＩ処理した。一方、プラスミドｐＤＧ７８０（Ｇｅｎｅ，１６７，３３５，（１９９５））のＳａｌＩ及びＳｍａＩ制限酵素切断点よりカナマイシン耐性遺伝子領域を切り出した（Ｃ）。次に、３断片を（Ａ）（Ｃ）（Ｂ）の順になる様に、ｐＵＣ１１９（ＴＡＫＡＲＡ）に（Ａ）はＳｐｈＩ及びＳａｌＩ、（Ｃ）はＳａｌＩ及びＢａｍＨＩ、（Ｂ）はＢａｍＨＩ及びＳｍａＩ制限酵素切断点にそれぞれ挿入した。この結果得られた組換えプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで処理して直鎖状ＤＮＡにし、形質転換用の供与体ＤＮＡとした（図２参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法による枯草菌１６８株の形質転換を行い、カナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってｕｇｔＰ遺伝子が欠失してカナマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。また相同組換えに利用した領域の（Ａ）及び（Ｂ）のＤＮＡ配列についてシーケンスを行った。（Ａ）領域でｕｇｔＰ遺伝子上流−９ｂｐのＴがＣに置換されていたが、ｕｇｔＰ遺伝子の上流ｍｅｔＡ遺伝子及び下流ｃｓｐＤ遺伝子の発現に影響を及ぼさないことを確認した。以上の様にして、枯草菌のｕｇｔＰ遺伝子が欠失した菌株を構築し、ΔｕｇｔＰ株と命名した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
実施例２（形質転換効率の算出）
プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．，６０，４８５（１９８５））及びｐＣ１９４（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５０，８１５（１９８２））を用いて、実施例１にて構築したΔｕｇｔＰ株及び親株である１６８株の形質転換をプロトプラスト法により行った。ｐＨＹ３００ＰＬＫはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＤＳ−５由来のプラスミドｐＡＭα１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１７，２８３（１９７４））由来であり、ｐＣ１９４はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のプラスミドである。ｐＨＹ３００ＰＬＫは大腸菌ＨＢ１０１株（タカラバイオ）を用いて調製し、ｐＣ１９４は枯草菌１６８株を用いて調製した。プロトプラスト法は以下の手順で行った。まず、各菌をＬＢ液体培地（１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）にて、３０℃、１５０ｒｐｍで１０時間培養した培養液を、再度ＬＢ液体培地に１％植菌し、３時間培養した。培養液を１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した後、４ｍｇ／ｍＬ リゾチームを含むＳＭＭＰ溶液（３５ｇ／Ｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ ３、１７１．５ｇ／Ｌ スクロース、３．２ｇ／Ｌ マレイン酸２ナトリウム、４．０６ｇ／Ｌ 塩化マグネシウム６水和物）５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間静置した。３５００ｒｐｍで１０分間遠心した後、ＳＭＭＰ溶液４００μＬに懸濁し、そのうち１３μＬを５０ｎｇのプラスミドＤＮＡと混合した。更にＰＥＧを１００μＬ添加し、ボルテックスした後、ＳＭＭＰを３５０μＬ添加して転倒混和した。その後、３０℃、１５０ｒｐｍで１時間培養した後１００μＬを抗生物質（ｐＨＹ３００ＰＬＫの場合５０ｍｇ／Ｌ テトラサイクリン、ｐＣ１９４の場合２０ｍｇ／Ｌ クロラムフェニコール）を含むＤＭ３再生培地（８１ｇ／Ｌ コハク酸ナトリウム６水和物、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ カザミノ酸、１０ｇ／Ｌ 寒天、１０ｇ／Ｌ カルボキシメチルセルロース、１．５ｇ／Ｌ リン酸２水素カリウム、３．５ｇ／Ｌ リン酸水素２カリウム、０．５ｇ／Ｌ グルコース、０．０１ｇ／Ｌ ＢＳＡ、０．００５ｇ／Ｌ トリパンブルー、２０ｍＭ 塩化マグネシウム）に塗布した。また、生菌数を測定する目的で、抗生物質を含まないＤＭ３再生培地にも等量塗布した。３０℃で３日間静置培養し、コロニー数をカウントした。形質転換効率を図２に示す。抗生物質を含むプレート上のコロニー数を、抗生物質を含まないプレート上のコロニー数で割った値を、形質転換効率とした。図２より、ΔｕｇｔＰ株は親株である１６８株よりも有意に形質転換効率が向上していることが判明した（Ｐ＜０．０５、ｔ−検定）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｕｇｔＰ遺伝子が欠失又は不活性化された宿主微生物のプロトプラストを用いることを特徴とする、形質転換方法。
【請求項２】
前記宿主微生物がグラム陽性細菌である、請求項１記載の形質転換方法。
【請求項３】
前記宿主微生物がバチルス属細菌である、請求項２記載の形質転換方法。
【請求項４】
前記宿主微生物が枯草菌である、請求項３記載の形質転換方法。
【請求項１】
ｕｇｔＰ遺伝子が欠失又は不活性化された宿主微生物のプロトプラストを用いることを特徴とする、形質転換方法。
【請求項２】
前記宿主微生物がグラム陽性細菌である、請求項１記載の形質転換方法。
【請求項３】
前記宿主微生物がバチルス属細菌である、請求項２記載の形質転換方法。
【請求項４】
前記宿主微生物が枯草菌である、請求項３記載の形質転換方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−２５４０４１（Ｐ２０１２−２５４０４１Ａ）
【公開日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１２９１８０（Ｐ２０１１−１２９１８０）
【出願日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
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