プロトロンビン時間を決定する方法
【課題】
【解決手段】
本発明は、経口抗凝血療法及び肝細胞癌（ＨＣＣ）をモニタするための試験に関する。具体的には、本発明は、ビタミンＫ欠乏性タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ａｂｓｅｎｃｅ）又はアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）（Ｐｉｖｋａ）の凝固時間及びＩＮＲ結果に関する効果を考慮して、血漿又は全血試料のプロントロンビン時間を決定する方法を提供する。本発明の主な目的は、国際標準化率（ＩＮＲ）結果についてのプロトロンビン時間法を調整し、ＩＮＲｐｉｖｋａを測定することである。
【解決手段】
本発明は、経口抗凝血療法及び肝細胞癌（ＨＣＣ）をモニタするための試験に関する。具体的には、本発明は、ビタミンＫ欠乏性タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ａｂｓｅｎｃｅ）又はアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）（Ｐｉｖｋａ）の凝固時間及びＩＮＲ結果に関する効果を考慮して、血漿又は全血試料のプロントロンビン時間を決定する方法を提供する。本発明の主な目的は、国際標準化率（ＩＮＲ）結果についてのプロトロンビン時間法を調整し、ＩＮＲｐｉｖｋａを測定することである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、経口抗凝固剤療法及び肝細胞癌（ＨＣＣ）をモニタするＩＮＲ単位に基づいた試験に関する。具体的には、本発明は、ビタミンＫ欠乏性タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ａｂｓｅｎｃｅ）又はアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）（Ｐｉｖｋａ）がＩＮＲに及ぼす影響を考慮して、血漿又は全血試料のプロトロンビン時間を決定する方法を提供する。本発明の目的は、国際標準比率（ＩＮＲ）結果に対してプロトロンビン時間を調整し、また、ＩＮＲ単位としてＰｉｖｋａ効果（即ち、ＩＮＲＰｉｖｋａ）を測定することである。
【０００２】
本発明の背景
プロトロンビン時間（ＰＴ）試験は、血栓性素因等の血栓疾患に罹患している患者を治療するのに用いられる経口抗凝固療法（ＯＡＴ）を管理するために導入された。この療法は、肝臓の凝固因子（Ｆ ＩＩ、Ｆ ＶＩＩ、Ｆ ＩＸ及びＦ Ｘ）の合成を阻害するワルファリン（又はクマリン）等のビタミンＫアンタゴニストに基づいている。現在、ＯＡＴの必要性は、世界的に高まってきている。例えば、フィンランドでは、２００３年にはワルファリン投薬が人口の１．７％に処方され、患者の数は、高齢者人口によって増大している。ＯＡＴ投与は、血栓症又は出血の深刻な影響を防ぐために継続した管理を必要とするので、毎年８億のＰＴ試験が世界中で実施されていることは、驚くに値しない。最も一般的に用いられているＰＴ試験は、Ｑｕｉｃｋ一段法（Ｑｕｉｃｋ’ｓ ｏｎｅ−ｓｔａｇｅ ＰＴ）及びＯｗｒｅｎ法（Ｏｗｒｅｎ’ｓ ｍｅｔｈｏｄ）に基づくものである。後者は、日本と同様に北欧諸国やベネルクス諸国で広く用いられており、一方で、Ｑｕｉｃｋ ＰＴは、他の国で用いられているアプローチであり、実施されている全ＰＴ試験の約９５％を数える。
【０００３】
国際標準比率（ＩＮＲ）及び国際感度指数（ＩＳＩ）が、世界保健機構によって導入された時、その目的は、経口抗凝固療法（５）についてのＰＴ結果を調整することであった：ある種の血漿又は全血試料についてのＰＴ結果は、用いられる試薬、機器、又は方法に関わらずＩＮＲ単位で同じであるべきである。今日、ＰＴについての各市販の凝固試薬（即ち、トロンボプラスチン）は、主要なＷＨＯ参照調製に対して標準化されている。この結果を用いて、ＩＳＩ（国際感度指数）で公表されているトロンボプラスチン試薬の相対感度を計算する。次いで、このＩＮＲ結果を、式：ＩＮＲ＝［ＰＴ率］ＩＳＩによって計算する。しかし、ＩＮＲ規格の使用の増加により、その限界が認識され、最近、多数の（又は、恐らくほとんどの）市販のＩＮＲ法間で同意はなされず、臨床学的に過剰のＩＮＲの変形例が存在し、従って、患者の良い治療を危険にさらしてきた（９、１０）。
【０００４】
Ｈｅｍｋｅｒと同僚（１、２）は、ビタミンＫ欠乏性タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ａｂｓｅｎｃｅ）又はアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）（Ｐｉｖｋａ）の役割を最初に特徴付けた。彼らは、内因性拮抗凝固阻害剤（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）とクマリン療法が関連することを発見した。これは、後にＰｉｖｋａと名付けられた。問題のタンパク質は、ビタミンＫ依存性因子の前段階であった。これらのタンパク質は、恐らく、凝固因子Ｘ（Ｆ Ｘ）に対して、プロトロンビン変換複合体を阻害した（３）。Ｐｉｖｋａ因子は、カルシウム結合に必要であり、これによって、リン酸脂質面へのこれらの因子の「吸着」に必要であるガンマカルボキシグルタミン酸が欠乏していることが分かった。従って、これらは、活性凝固因子（４、５）に対する不活性類似体である。
【０００５】
Ｔａｌｓｔａｄは、なぜＰＴの標準化が問題であるかという問いを熟考し、Ｐｉｖｋａ阻害剤の補正によるＰＴ標準化を提案している（１５、１６）。Ｈｅｃｋｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．は、酵素速度論に基づいた機能性凝固因子及び拮抗Ｐｉｖｋａ阻害剤の同時定量方法を開示している（１７）。更に、Ｐｉｖｋａについての免疫化学アッセイも知られている（例えば、米国特許第５，５１６，６４０号参照。）しかしながら、ＰＴ試験におけるＰｉｖｋａ補正についての容易で実際的な方法は、先行技術には導入されていない。従って、本発明の目的は、Ｐｉｖｋａ効果を更に研究し、様々な試薬を用いることによってＰｉｖｋａを考慮してＱｕｉｃｋ法とＯｗｒｅｎ ＰＴ法を比較することであった。結果として、本発明は、Ｐｉｖｋａ効果の問題を克服したＰＴ試験用の直接的な方法を提供する。
【０００６】
本発明の概要
本発明は：
ａ）経口抗凝固剤療法（ＯＡＴ）を受けている患者、又は肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する患者から得られた血漿又は全血試料の、又はキャリブレータ又は対照血漿試料の少なくとも２つの異なる希釈液のプロトロンビン時間を測定して、前記試料についてのｔｍｉｎ又はＩＮＲｍｉｎ値を決定するステップと；
ｂ）阻害剤の入っていない血漿又は全血試料の少なくとも２つの異なる希釈液のプロトロンビン時間を測定して、標準血漿についてのｔｍｉｎ又はＩＮＲｍｉｎ値を決定するステップと；
ｃ）ステップａ）及びｂ）の結果からｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を計算するステップと；
ｄ）ステップａ）で測定されたプロトロンビン時間からステップｃ）で得られたｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を引くことによって、ステップａ）の前記試料について前記Ｐｉｖｋａを補正したＰＴを決定するステップと；
を具える、プロトロンビン時間（ＰＴ）を補正したＰｉｖｋａを決定する方法に関する。
【０００７】
また、本発明は、本発明の方法を実施するようにプログラムした凝固分析器又はポイントオブケア機器（ＰＯＣＴ）等のデバイスを提供する。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は：
ａ）経口抗凝固剤療法（ＯＡＴ）を受けている患者、又は肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する患者から採取した血漿又は全血試料、又はキャリブレータ又は対照血漿試料の、少なくとも２つの異なる希釈液のプロトロンビン時間を測定して、前記試料についてのｔｍｉｎ又はＩＮＲｍｉｎ値を決定するステップと；
ｂ）阻害剤の入っていない血漿又は全血試料の少なくとも２つの異なる希釈液のプロトロンビン時間を測定して、標準血漿についてのｔｍｉｎ又はＩＮＲｍｉｎ値を決定するステップと；
ｃ）ステップａ）及びｂ）の結果からｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を計算するステップと；
ｄ）ステップａ）で測定されたプロトロンビン時間からステップｃ）で得られたｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を引くことによって、ステップａ）の前記試料について前記Ｐｉｖｋａを補正したＰＴを決定するステップと；
を具える、ＩＮＲ単位のＰｉｖｋａ効果と、プロトロンビン時間（ＰＴ）を補正したＰｉｖｋａを決定する方法を提供する。
【０００９】
この試料についてのＩＮＲｍｉｎ又はｔｍｉｎ値は、それぞれ、試料希釈又は試料体積（Ｘ軸）とＩＮＲ単位又は秒単位の凝固時間（Ｙ軸）との間の関係をプロットすることによって得られる。回帰直線は、様々な試料の希釈又は体積のＩＮＲ値又は凝固時間に相当する点を通って描かれる。この回帰直線は、ＩＮＲｍｉｎ又はｔｍｉｎでＹ軸と交わる（図１参照）。
【００１０】
好ましくは、測定したプロトロンビン時間のＰｉｖｋａ効果についての値は、式：
ＩＮＲＰｉｖｋａ＝ＩＮＲｍｉｎ（患者試料、キャリブレータ、又は対照）−ＩＮＲｍｉｎ（標準血漿）
又は
ｔＰｉｖｋａ＝ｔｍｉｎ（患者試料、キャリブレータ、又は対照）−ｔｍｉｎ（標準血漿）
を用いて計算される。
【００１１】
また、ｔＰｉｖｋａ値をＩＮＲ単位に変換することも可能である。
【００１２】
この方法のステップｄ）で、患者試料のＰＴに関するＰｉｖｋａ効果は、好ましくは、次式のうちの１つを用いて補正される：
ＩＮＲｃｏｒｒｅｃｔｅｄ＝ＩＮＲｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ−ＩＮＲＰｉｖｋａ
又は、
ｔｃｏｒｒｅｃｔｅｄ＝ｔｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ−ｔＰｉｖｋａ
ここで、式中、
ＩＮＲｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ又はｔｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌは、前記方法のステップａ）で測定された試料のプロトロンビン時間であり、ＩＮＲＰｉｖｋａ又はｔＰｉｖｋａは、前記方法のステップｃ）で計算した値である。好ましくは、前記ＩＮＲｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ又はｔｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌは、未希釈試料、即ち、それぞれＩＮＲｔｏｔａｌ又はｔｔｏｔａｌのプロトロンビン時間である。
【００１３】
ＰＴ試料についての初期ＩＮＲ値は：
ＩＮＲ＝（試料ｓｅｃ／標準ｓｅｃ）ＩＳＩ
の式で計算される。ここで、式中、試料ｓｅｃは、秒単位で測定した患者試料（又はキャリブレータ、又は対照試料）のプロトロンビン時間であり、標準ｓｅｃは、秒単位で測定した標準血漿の試料のプロトロンビン時間であり、ＩＳＩは、ＰＴ試験で用いられる凝固試薬の相対感度である。ＩＳＩ値は、試薬の製造者によって通常与えられているか、又はＩＳＩキャリブレータキットを用いて測定される。
【００１４】
ＰＴ試験用血漿試料は、好ましくは、生理食塩水又はその他の好適な緩衝液で希釈される。しかしながら、測定に様々な試料体積を用いる場合、試料希釈は必要ではない。簡略化するために、様々な試料体積及び試験試薬のこれらの混合物も、ここでは「希釈液」と呼ぶ。更に、「少なくとも二の希釈液」の表現は、ここでは試料セットも意味しており、この試料の１つは未希釈試料である。
【００１５】
好ましくは、本法のステップｂ）は、ある種の凝固試薬（即ち、トロンボプラスチン）について、１回のみ実施され、得られた結果は、複数の患者、キャリブレータ、又は同じ試薬で試験された対照試料用にステップｃ）で用いられる。これは、標準血漿がＰｉｖｋａを含まないので可能であり、従って、標準血漿のｔｍｉｎ又はＩＮＲｍｉｎ値は、ある種の凝固試薬について常に一定である。好ましくは、ステップｂ）では、阻害剤を含まない血漿又は全血試料を、健康であることが分かっている対象（即ち、標準血漿の試料）から採取する。「阻害剤が含まれていない血漿又は全血試料」の表現は、ここでは、血漿又は全血試料がＰｉｖｋａ阻害剤のような阻害剤を含まないことを意味する。
【００１６】
また、本発明の方法は、現在の分析器は、試料パターンを送り、本法の実行に必要な計算を行うように容易にプログラムできるので、全自動凝固分析器で実施することもできる。従って、本発明は、本発明の方法を実行するようにプログラムされた凝固分析器又はポイントオブケア機器（ＰＯＣＴ）等のデバイスに関するものである。流体試料の凝固を分析するデバイス及び方法は、当該分野でよく知られている（例えば、米国特許第６，７５０，０５３号参照）。ポイントオブケア機器は、限定はされないが、研究室、病院又は医療センター等の場所でプロトロンビン時間（ＰＴ）及びＩＮＲを迅速に決定するように開発された携帯用デバイスである。患者は、例えば、自宅で自分で試験するためのポイントオブケア機器を用いることができる。
【００１７】
また、本発明は、本発明を実施するための凝固分析器又はポイントオブケア機器（ＰＯＣＴ）等のデバイスの使用に関するものである。
【００１８】
本発明は、更に、本法のステップａ）及びｂ）の結果からｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を計算し、前記ステップａ）で測定したプロトロンビン時間から本法のステップｃ）で得られたｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を引くことによって、前記ステップａ）の試料についてのＰＴを補正したＰｉｖｋａを決定するためのコンピュータ等のデバイス又は前記デバイスの使用に関するものである。
【００１９】
実験セクション
【００２０】
例１
【００２１】
材料及び方法
【００２２】
患者及び血液採取
全ての手順は、１９７５年のヘルシンキ宣言に従って、我々の機関の責任ある委員会によって承認された。我々は、病院及び医療センターの患者の中から無作為に選択した標準試料とＯＡＴ患者試料を分析した。０．２ｍＬの０．１０９ｍｏｌ／Ｌ（３．２％）クエン酸溶液を含むクエン酸凝固管（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ社製、Ｖａｃｕｅｔｔｅ ｃａｔ．ｎｏ．４５４３２２、９ＮＣ）内に、１０人の標準患者及び１０人のＯＡＴ患者から血液（１．８ｍＬ）を採取した。試料針（Ｔｅｒｕｍｏ社製、Ｖｅｎｏｊｅｃｔ ｎｅｅｄｌｅ、Ｑｕｉｃｋ Ｆｉｔ、ｃａｔ．ｎｏ．ＭＮ−２１３８ＭＱ）は、０．８×４０ｍｍであった。試料管を１８５０ｇ、２０℃で１０分間遠心分離して、血漿を分離した。全測定は、血液採取後８時間内に同時に開始した。
【００２３】
ＰＴ時間の決定
ＰＴ凝固時間を、完全自動ＢＣＳ凝固分析器（独国マールブルク所在のＤａｄｅｂｅｈｒｉｎｇ社製Ｔｈｅ Ｄａｄｅｂｅｈｒｉｎｇ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて測定した。Ｑｕｉｃｋを用いた一段階プロトロンビン時間用に、１００μＬの凝固試薬を５０μＬのクエン酸血漿に加えた。４つの試験試薬は：
（ｉ） ネオプラスチンＣＬプラス（Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｎｅ ＣＬ Ｐｌｕｓ）、ｃａｔ．ｎｏ．００３７６（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社製ウサギ脳トロンボプラスチン）、ｌｏｔ０３１５８１、ＩＳＩ１．３０（器具についての記載なし）、ＩＳＩ値１．４２；
（ｉｉ） ＰＴ−フィブリノゲン組み換え体、ｃａｔ．ｎｏ．２０００５０００（イリノイ州所在のＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製組み換え型ウサギ組織トロンボプラスチン）、ｌｏｔ ＮＯ ４２５８６９、ＡＣＬ用にＩＳＩ１．０３、ＩＳＩ値ｌ．０８；
（ｉｉｉ）ＰＴ−フィブリノゲンＨＳプラス、ｃａｔ．ｎｏ．０８４６９８１０（イリノイ州所在のＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製ウサギ脳トロンボプラスチン）、ｌｏｔ ＮＯ３２５７２９、ＡＣＬ用にＩＳＩ１．１３、ＩＳＩ値１．２５；
（ｉｖ） デイドイノビン（Ｄａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ）ｃａｔ．ｎｏ．Ｂ４２１２−５０（ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ Ｍａｒｂｕｒｇ ＧｍｂＨ社製組み換え型ヒト組織トロンボプラスチン）、ｌｏｔ Ｎｏ．５２６９８７、ＢＣＳ用にＩＳＩ０．９０、ＩＳＩ値ｌ．０４；
であった。
【００２４】
Ｏｗｒｅｎ ＰＴ（トロンボプラスチン試薬と併用した）について、凝固反応は、１０μＬのクエン酸試料血漿、５０μＬの希釈剤、及び１５０μＬの試薬を含んでいた。３つの試験試薬は：
（ｖ） ２５ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２（ｃａｔ．ｎｏ．ＧＨＩ１５５）及びＧＨＩ社製希釈剤、ｌｏｔ Ｃ４１４Ｆ（Ｏｗｒｅｎの緩衝液、ｃａｔ．ｎｏ ＧＨＩ１５０）を含むＯｗｒｅｎ’ｓ ＰＴ、ｃａｔ．ｎｏ．ＧＨＩ（Ｇｌｏｂａｌ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社）１３１−１０（ウサギ脳トロンボプラスチン）、最適な方法についてＩＳＩ１．０９、ＩＳＩ値１．１７；
（ｖｉ） Ｎｙｃｏｔｅｓｔ ＰＴ、ｃａｔ．ｎｏ．１００２４８８（ウサギ脳トロンボプラスチン）及びＡｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ ａｓ社製希釈剤（Ｎｙｃｏｔｅｓｔ ＰＴ、希釈液、ｃａｔ．ｎｏ．１００２４８５）、ｌｏｔ１０１０７３５３、トロンボトラックについてＩＳＩ１．１３、ＩＳＩ値０．９５；
（ｖｉｉ）ＳＰＡ、５０ ｃａｔ．ｎｏ．００１０５（組織トロンボプラスチン）及びＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社製希釈剤（ＳＰＡ緩衝液ｃａｔ．ｎｏ．００１２４）、ｌｏｔ０２２０７１、ＩＳＩ０．９８（器具についての記載なし）、ＩＳＩ値０．９３；
であった。
【００２５】
２つの方法（４＋３試薬）は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社製ｌｏｔ０２１９６４の同じキャリブレータＥｔａｌｏｑｕｉｃｋ ｃａｔ．ｎｏ．００４９６で、ＩＳＩを測定した。
【００２６】
血漿希釈１：２は、Ｋａｂｉ社製生理食塩水（Ｎａｔｒｉｕｍｋｌｏｒｉｄ ９ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｌ）で作られた。
【００２７】
ＰＴ決定の分析における不正確
７つのＰＴ試験の稼働中の不正確性を、治療範囲内のＩＮＲ値、即ち、約２．２ＩＮＲを有する１人の患者血漿試料（ｎ＝１０回測定）を用いて測定した。各ＣＶは：ネオプラスチンＣＬプラス（Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｎｅ ＣＬ Ｐｌｕｓ）が２．３％、ＰＴ−ファブリノゲン組み換え体（ＰＴ−Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）が２．７％、ＰＴ−ファブリノゲンＨＳプラス（ＰＴ−Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ＨＳ Ｐｌｕｓ）が１．１％、デイドイノビン（Ｄａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ）が２．６％、Ｏｗｒｅｎ’ｓ ＰＴが１．４％、Ｎｙｃｏｔｅｓｔ ＰＴが１．６％、及びＳＰＡが１．０％であった。
【００２８】
Ｐｉｖｋａ決定及び統計
我々は、標準血漿及びＯＡＴ血漿について、ｙ軸に凝固時間を、ｘ軸に血漿希釈度をプロットした。一次方程式から、我々は、一の試料（３、１１）についての無数の凝固因子を有するいわゆる最小凝固時間（ｔｍｉｎ）と呼ばれるｙ軸上の線切片を得た。標準血漿とＯＡＴ血漿との間の切片（ｙ軸）の差は、キャリブレーション効果のない秒単位のＰｉｖｋａの作用を示す。我々は、ＩＮＲ単位で切片の差を計算した（ＯＡＴ切片−標準血漿切片、図１）。
【００２９】
ＩＮＲ結果は、式：
ＩＮＲ＝（試料ｓｅｃ／標準ｓｅｃ）ＩＳＩ
を用いて秒単位で計算した。
【００３０】
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ５．０プログラムを用いて、相関関数及びＩＮＲ結果を得た。
【００３１】
結果
平均切片は、標準血漿については、０．０３から０．１４ＩＮＲの範囲でＱｕｉｃｋ ＰＴを用いて、また、０．０１から０．０３ＩＮＲの範囲でＯｗｒｅｎ ＰＴを用いて変化させる。平均切片は、ＯＡＴ血漿については、０．４０から１．４６ＩＮＲの範囲でＱｕｉｃｋ ＰＴを用いて、また、０．２０から０．２８ＩＮＲの範囲でＯｗｒｅｎ ＰＴを用いて変化させる。Ｑｕｉｃｋ ＰＴ法及びＯｗｒｅｎ ＰＴを用いた標準血漿（０．０７ＩＮＲ）及びＯＡＴ血漿（０．７２ＩＮＲ）についての切片の平均ＳＤは、０．０２ＩＮＲ；０．２３ＩＮＲであった。Ｑｕｉｃｋ ＰＴのＰｉｖｋａ効果の平均は、０．３６ＩＮＲ（ＳＤ ０．４３ＩＮＲ）（イノビン（Ｉｎｎｏｖｉｎ）試薬０．１５ＩＮＲなしで；ＳＤ０．１４）、Ｏｗｒｅｎ ＰＴのＰｉｖｋａ効果の平均は、０．３６ＩＮＲ（ＳＤ０．２４ＩＮＲ）である。Ｐｉｖｋａ補正を用いた、ＯＡＴ血漿からの平均ＩＮＲ結果は、Ｑｕｉｃｋ ＰＴについては２．５８ＩＮＲ（ＳＤ０．１１）であり、Ｏｗｒｅｎ ＰＴについては２．５１ＩＮＲ（ＳＤ０．１６）であった（表１）。
【００３２】
考察
ＩＮＲ結果の調和は、患者のケア及び科学文献の実用性を改善する点で実質的な目的である。患者のケアについてのＩＮＲ単位の治療範囲が調和し、医師が容易に用いることができる。問題は、世界中のＩＮＲ結果を統一することであり、これは、臨床検査室の課題である。実際には、検査室は、機器についての製造者のＩＳＩ、製造者の又は「局地的」（ある国又は地域）キャリブレータキットを使用する。それでは、同じ試料からのＩＮＲ結果は、同じであるべきである。ＩＳＩキャリブレーションは、ＩＮＲ結果を調和させる点で重要である。ＰＴ試薬の多様性（トロンボプラスチン、ｐＨ、イオン濃度、及び質、添加剤等）は世界的に考えることができ、これは、ＩＮＲの調和を非常に困難なものにしている。
【００３３】
ＰＴ試薬は、低ＩＳＩ、即ち１．０付近であるべきである。このため、我々は、この研究用に高感度Ｏｗｒｅｎ及びＱｕｉｃｋ試薬を選択する。べき関数としてのＩＳＩ（キャリブレーション）の効果は、治療範囲内でＩＮＲ値が高くなると上昇する（９）。これによって、結果に、治療範囲でより調和することが求められている。ＰＴ測定についての分析基準は、ＯＡＴ患者の顕著な生物学的変化に部分的に起因して、非常に厳しい（バイアス＜０．２０ＩＮＲ及びＣＶ＜５％）（１２）。
【００３４】
Ｐｉｖｋａ因子は、治療領域及び測定それ自体のキャリブレーションの効果の理由によってＩＮＲ結果の調和に大きな役割を有する。我々は、イノビン（Ｉｎｎｏｖｉｎ）結果（ヒトトロンボプラスチン）を除外するのであれば、ＰｉｖｋａとＰＴ法の関係を見出すことができる：Ｑｕｉｃｋ ＰＴについてのＰｉｖｋａの平均は、０．１５ＩＮＲであり、Ｏｗｒｅｎ ＰＴについては、０．３６ＩＮＲである。これは、Ｏｗｒｅｎ ＰＴ法についてより大きなＰｉｖｋａ感度と、より大きな阻害性（０．２１ＩＮＲ）を意味する（表１）。これは、Ｑｕｉｃｋ ＰＴと比較してＯｗｒｅｎ ＰＴについてより低いＩＮＲとなることを説明している（６、１３、１４）。抗凝固療法では、患者は、ケア管理用にＯｗｒｅｎ ＰＴを用いて、より多くの投薬（０．２１ＩＮＲ）を受ける。
【００３５】
両方法で、同じ製造者であるＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社は、Ｐｉｖｋａ感度が非常に小さい試薬を有する。我々は、イノビン（Ｉｎｎｏｖｉｎ）（０．９８ＩＮＲ）を用いた、最も大きなＰｉｖｋａ効果を発見した。その試薬は、組み換え型ヒト組織トロンボプラスチンを含み、一方で、その他の全ての試薬がウサギ起源のトロンボプラスチンを含む。このＰｉｖｋａは、様々な試薬を用いて変化し、部分的にトロンボプラスチン依存性である。標準血漿及びＯＡＴ血漿についての切片ＳＤは、明らかにＯｗｒｅｎ ＰＴ（０．０１から０．０３ＩＮＲ、０．２０から０．２８ＩＮＲ）よりもＱｕｉｃｋ ＰＴ（０．０３から０．１４ＩＮＲ、０．４０から１．４６ＩＮＲ）がより変化する。これらの結果は、Ｏｗｒｅｎ ＰＴ法を用いて、我々は、様々な試薬について、より広範囲でＩＮＲ結果を調和させることができるという見方を確認するものである。我々のより早い時期の発見によれば、我々は、Ｏｗｒｅｎ ＰＴ法が優れているとの結論を出した（６、７、８）。
【００３６】
表１では、様々なＰＴ試薬及び方法を用いて、ＯＡＴ血漿−Ｐｉｖｋａ阻害からのＩＮＲ結果の平均間でほとんど同じ結果であり、と最小分散を参照する。これは、Ｐｉｖｋａ計算が、正しいことを確認するものである（全試薬についての同じキャリブレーション）。Ｐｉｖｋａ阻害は、世界的なＩＮＲ結果の調和という点で問題を引き起こす（キャリブレーション、様々な試薬、機器、及びＰＴ法）（９）。ＯＡＴ患者からのＩＳＩキャリブレータ（より高いＩＮＲ値）は、Ｐｉｖｋａ凝固因子も含んでおり、これは、ＩＮＲ系を複雑にする。キャリブレータのＩＮＲ値は、Ｐｉｖｋａ効果なしのものであるべきである。
【００３７】
本発明の方法は、様々な希釈及び単純な数学的計算について、１人の患者の試料につき少なくとも２つのＰＴ測定を必要とするだけである。結果として、本法は、異なる種類の機器に適用することが容易である。理論的に、ＰＴ法は、活性Ｋ依存性凝固因子及び不活性因子（Ｐｉｖｋａ阻害）を含む、血液凝固についての抗凝固薬の全効果を測定するべきである。この方法論的選択は、Ｐｉｖｋａ感受性トロンボプラスチンの使用及び活性及び不活性凝固因子の合計を測定する方法を意味する。別の方法論的可能性は、この研究にあるように、凝固阻害剤無しで活性凝固因子のみを測定することである。この新しい方法は、最も良い主要な可能性についてのＩＮＲ系を開発するのを助けて、経口抗凝固治療についてのＩＮＲを世界的に調和させる。
【００３８】
例２
【００３９】
材料及び方法
【００４０】
患者及び血液採取
静脈血試料を、１０人の標準対象と、経口抗凝固療法のモニタリングにＰＴ時間試験が必要とされる２１０人の病院及び医療センターの患者から得た。我々の領域では、「Ｐ−ＩＮＲ」試験コードをこの目的に用いる。従って、患者試料は、抗凝固の起こり得る全ての相：（ｉ）治療前、（ｉｉ）投与調整相、及び（ｉｉｉ）定状状態相を示した。全ての手順は、１９７５年のヘルシンキ宣言に従って、我々の機関の責任ある委員会によって承認された。０．２ｍＬの０．１０９ｍｏｌ／Ｌ（３．２％）クエン酸溶液を含むクエン酸凝固管（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ社、Ｖａｃｕｅｔｔｅ ｃａｔ．ｎｏ．４５４３２２、９ＮＣ）内に、血液（１．８ｍＬ）を採取した。試料針（Ｔｅｒｕｍｏ社、Ｖｅｎｏｊｅｃｔ ｎｅｅｄｌｅ、Ｑｕｉｃｋ Ｆｉｔ、ｃａｔ．ｎｏ．ＭＮ−２１３８ＭＱ）は、０．８×４０ｍｍであった。試料管を１８５０ｇ、２０℃で１０分間遠心分離して、血漿を分離した。血液採取後８時間以内に同時に全測定を開始した。
【００４１】
ＰＴ決定
ＰＴ凝固時間を完全自動ＢＣＳ凝固分析器（独国マールブルク所在のＤａｄｅｂｅｈｒｉｎｇ社製Ｔｈｅ Ｄａｄｅｂｅｈｒｉｎｇ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて測定した。Ｑｕｉｃｋを用いた一段プロトロンビン時間について、１００μＬの凝固試薬を５０μＬのクエン酸血漿に加えた。また、希釈試料用に、１００μＬ＋２５μＬ＋２５μＬ（Ｋａｂｉ社製生理食塩水、「Ｎａｔｒｉｕｍｋｌｏｒｉｄ ９ｍｇ／ｍＬ」、５００ｍＬ）を加えた。試験試薬は：デイドイノビン（Ｄａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ）ｃａｔ．ｎｏ．Ｂ４２１２−５０（組み換え型ヒト組織トロンボプラスチン、ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ Ｍａｒｂｕｒｇ ＧｍｂＨ社）、ｌｏｔ５３６９２８、ＩＳＩ＝０．９２であった。
【００４２】
Ｏｗｒｅｎ ＰＴ（併用トロンボプラスチン試薬）用に、凝固反応は、１０μＬのクエン酸試料血漿、６０μＬの希釈剤、及び１４０μＬの試薬、及び「希釈測定」用の体積：５μＬ＋６５μＬ＋１４０μＬ、７μＬ＋６３μＬ＋１４０μＬ、又は１４μＬ＋５６μＬ＋１４０μＬを含んでいた。試験試薬は：Ｎｙｃｏｔｅｓｔ ＰＴ、ｃａｔ．ｎｏ．１００２４８８（ウサギ脳トロンボプラスチン）、及びｌｏｔ１０１１２９５４、ＩＳＩ＝１．０７として、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社製希釈剤（Ｎｙｃｏｔｅｓｔ ＰＴ、希釈液、ｃａｔ．ｎｏ．１００２４８５）であった。
【００４３】
ＩＳＩ較正
２つのローカルＩＳＩキャリブレータキット：（ｉ）Ｅｑｕａｌｉｓ社製「Ｓｖｅｎｓｋ ｎａｔｉｏｎｅｌｌ ｋａｌｉｂｒａｔｏｒ ｆｏｒ ｐｒｏｔｒｏｍｂｉｎｋｏｍｐｌｅｘａｋｔｉｖｉｅｔ」、ｌｏｔ１１、１２、Ｃａｌ １＝０．８５ＩＮＲ及びＣａｌ ２＝３．１９ＩＮＲ（主に瑞国及び諾国で用いられる）、（ｉｉ）Ｂｉｏｃｌｉｎ社製「ＩＳＩ−ｋａｌｉｂｒａａｔｔｏｒｉｋｉｔｔｉ」、ｃａｔ．ｎｏ．Ｂ１００００１５０、ｌｏｔ ８、Ｃａｌ １＝２．０７ＩＮＲ、Ｃａｌ ２＝３．５２ＩＮＲ及びＣａｌ ３＝１．０ＩＮＲ（主に芬国で用いられる）を用いた。
【００４４】
更に、２つの市販の（製造者キャリブレーション）ＩＳＩキャリブレーションキット：（ｉ）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社製Ｅｔａｌｏｑｕｉｃｋ ｃａｔ．ｎｏ．００４９６、ｌｏｔ０４１５５５、Ｃａｌ １＝０．９１ＩＮＲ、Ｃａｌ ２＝３．２４ＩＮＲ及びＣａｌ ３＝４．９０ＩＮＲ、（ｉｉ）ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ社製ＰＴ−Ｍｕｌｔｉ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｃａｔ．ｎｏ．ＯＰＡＴ０３５、ｌｏｔ３５４２２、Ｃａｌ １＝１．０１ＩＮＲ、Ｃａｌ ２＝１．３０ＩＮＲ、Ｃａｌ ３＝１．６５ＩＮＲ、Ｃａｌ ４＝２．９７ＩＮＲ、Ｃａｌ ５＝４．００ＩＮＲ、Ｃａｌ ６＝５．２９ＩＮＲを用いた。
【００４５】
最小ＰＴ時間及び各ＩＮＲの決定
数秒で阻害を測定する手順を、Ｈｅｍｋｅｒと協働者によって記載されたように実行した（１、２、３）。我々は、様々なキャリブレータついてと同様に、標準血漿及びＯＡＴ血漿についてのＰＴ（秒）対Ｄ（Ｄ＝血漿又はキャリブレータ希釈因子）プロットを構成した。これは、経口抗凝固剤を有する非拮抗阻害法則と調和する（１８）。この一次方程式から、ｙ軸切片を計算する。これは、所謂無数の凝固因子を有する最小凝固時間（ｔｍｉｎ）である（３）。標準血漿とＯＡＴ血漿との間の切片（ｙ軸）の差は、キャリブレーション効果のない数秒でのＰＩＶＫＡの作用を示している。更に我々は、ＩＮＲ単位の切片の差を計算して全ＩＮＲからそれを差し引いた：
ＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄ＝ＩＮＲＴｏｔａｌ−ＩＮＲＰｉｖｋａ
【００４６】
ＩＮＲの値は、式：ＩＮＲ＝（試料ｓｅｃ／標準ｓｅｃ）ＩＳＩを用いて計算した。Ｑｕｉｃｋ ＰＴ線形性チェックについての希釈因子は：０．９１；１．００；１．２５；１．６７ ２．００であり、Ｏｗｒｅｎ ＰＴ線形性チェックについての希釈因子は：０．６７；１．００；１．２５；１．６７；２．５０であった。
【００４７】
分析に基づく不正確性及び統計
ＰＴ試験の同時正確性を、治療範囲、即ち、ほぼ２．２ＩＮＲでのＩＮＲ値を有する一の患者血漿試料（ｎ＝１０回測定）を用いて測定した。各ＣＶは：デイドイノビン（Ｄａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ）が２．６％、Ｎｙｃｏｔｅｓｔ ＰＴが１．６％であった。これは、試薬のスペクトラムがより幅広い我々の以前の観察と調和する（９）。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ５．０プログラムを用いて、最小二乗法を用いて相関関数及びＩＮＲ結果を得た。
【００４８】
結果
ＰＩＶＫＡ阻害は、１より大きいＩＮＲ値を有する全てのキャリブレータで実証できた。期待されているように、この阻害は、キャリブレータＩＮＲ値の増加と共に増加した（表２）。しかしながら、ＰＩＶＫＡ阻害はキャリブレータキット間で変動し、２つの異なるＰＴ法で異なっていたことは、注目に値する。
【００４９】
我々は、同じキャリブレータを用いた場合でさえ、ＰＴ法に依存して、２００人のＯＡＴ患者の場合で、ＩＮＲ結果の顕著な差があることを示した。従来のＩＮＲについての平均は、Ｑｕｉｃｋ法及びＯｗｒｅｎ法それぞれによって測定した場合に、３．８９及び２．６８であった。ＰＩＶＫＡ補正後、この平均は、ＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄと表され、２．４９及び２．３０ＩＮＲ単位であった。これらの結果によって、我々は２．１３ＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄ単位の標的点を確立することが可能となり、この範囲は１．６−２．６ＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄ単位であった。様々な希釈を用いる線形性は、Ｑｕｉｃｋ法及びＯｗｒｅｎ ＰＴ法に効果的であった。我々は、２００人のＯＡＴ患者の場合で、従来のＰＴ測定と活性凝固（ＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄ）を測定する新しい方法との間の差−より高いＩＮＲ値に向けて増加する−があることを示した。個々の元の値と補正した（ＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄ）値を図２に示す。凝固阻害の個々の変動は、図３に示すようにＯＡＴ患者試料に対して、様々なＩＮＲレベル（Ｏｗｒｅｎ ＰＴ）で注目に値する。
【００５０】
考察
この新しい方法は、一の患者試料について、２つのＰＴ測定と数学的計算：ＩＮＲｃｏｒｒｅｃｔｅｄ＝ＩＮＲｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ−ＩＮＲＰｉｖｋａを必要とする。様々な種類の機器に容易に適合する。試薬にかかる費用は、自動機器が、非常に小さい液体体積をピペットで取ることができるので、ＰＴ測定に半分の体積を用いるのと同じである。
【００５１】
表１ Ｑｕｉｃｋ及びＯｗｒｅｎ ＰＴ法を用いるＰｉｖｋａ阻害の測定及びＱｕｉｃｋ及びＯｗｒｅｎ ＰＴ法用の様々な試薬
【００５２】
表２ ２つの異なるＰＴ法を用いた４つのキャリブレータキットで得たＩＮＲ阻害
ａ増加するＩＮＲ値に応じてアレンジする。
ｂ製造者によって与えた通り。
ｃ各キャリブレータについてのＩＮＲ（ｙ軸）：Ｃ（Ｃ＝キャリブレータ希釈因子）（ｘ軸）プロットを構築した。より高い値を有するキャリブレータ、即ち、ＰＩＶＫＡを含むキャリブレータから最も低いＩＮＲ値の各キャリブレータのｙ切片（ＩＮＲ）値を順次減じることによって、阻害率を計算した。詳しくは、材料及び方法、及び図１を参照。
ｄＩＮＲ対１／Ｃ線のｙ軸切片：即ち、阻害剤不存在での理論上の凝固時間、又はＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄを表す
【００５３】
参考文献
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１３．Ｈｏｒｓｔｉ Ｊ．Ｔｈｅ Ｑｕｉｃｋ ａｎｄ Ｏｗｒｅｎ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｉｍｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｏｒａｌ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｏ ｎｏｔ ａｇｒｅｅ ｗｅｌｌ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｒａｔｉｏ（ＩＮＲ）ｕｎｉｔｓ．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３；６３：４５５−６．
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１７．Ｈｅｃｋｅｍａｎｎ Ｈ．−Ｊ．，Ｒｕｂｙ Ｃｈ．ａｎｄ Ｒｏｓｓｎｅｒ Ｋ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ（ＰＩＶＫＡ−）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｆｏｌｉａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．，Ｌｅｉｐｚｉｇ １９８８；１１５（４）：５３３−５３７．
１８．Ｈｅｎｒｙ ＪＢ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｂｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０ｔｈ ｅｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，２００１：２８４−５．
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、Ｐｉｖｋａ計算のモデルである。標準血漿のｔｍｉｎ値は、一の試薬ロットについて一定である。患者の血漿についてのｔｍｉｎ値は、１人の患者についてのみである。一次方程式を計算するには、一の患者試料について少なくとも２つの測定値が必要とされる。
【図２】図２は、Ｏｗｒｅｎ ＰＴによって決定される従来のＩＮＲ（ＩＮＲＴｏｔａｌ）と、Ｅｔａｌｏｑｕｉｃｋキャリブレーションを用いて増加する順にした２００人のＯＡＴ患者血漿についての活性凝固因子（ＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄ）及び阻害効果（ＩＮＲＰｉｖｋａ）である。
【図３】図３は、ＩＮＲ単位として２００人ＯＡＴ患者試料のＯｗｒｅｎ ＰＴのＰＩＶＫＡ阻害（阻害因子Ｆ ＩＩ、Ｆ ＶＩＩ及びＦ Ｘ）である。
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、経口抗凝固剤療法及び肝細胞癌（ＨＣＣ）をモニタするＩＮＲ単位に基づいた試験に関する。具体的には、本発明は、ビタミンＫ欠乏性タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ａｂｓｅｎｃｅ）又はアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）（Ｐｉｖｋａ）がＩＮＲに及ぼす影響を考慮して、血漿又は全血試料のプロトロンビン時間を決定する方法を提供する。本発明の目的は、国際標準比率（ＩＮＲ）結果に対してプロトロンビン時間を調整し、また、ＩＮＲ単位としてＰｉｖｋａ効果（即ち、ＩＮＲＰｉｖｋａ）を測定することである。
【０００２】
本発明の背景
プロトロンビン時間（ＰＴ）試験は、血栓性素因等の血栓疾患に罹患している患者を治療するのに用いられる経口抗凝固療法（ＯＡＴ）を管理するために導入された。この療法は、肝臓の凝固因子（Ｆ ＩＩ、Ｆ ＶＩＩ、Ｆ ＩＸ及びＦ Ｘ）の合成を阻害するワルファリン（又はクマリン）等のビタミンＫアンタゴニストに基づいている。現在、ＯＡＴの必要性は、世界的に高まってきている。例えば、フィンランドでは、２００３年にはワルファリン投薬が人口の１．７％に処方され、患者の数は、高齢者人口によって増大している。ＯＡＴ投与は、血栓症又は出血の深刻な影響を防ぐために継続した管理を必要とするので、毎年８億のＰＴ試験が世界中で実施されていることは、驚くに値しない。最も一般的に用いられているＰＴ試験は、Ｑｕｉｃｋ一段法（Ｑｕｉｃｋ’ｓ ｏｎｅ−ｓｔａｇｅ ＰＴ）及びＯｗｒｅｎ法（Ｏｗｒｅｎ’ｓ ｍｅｔｈｏｄ）に基づくものである。後者は、日本と同様に北欧諸国やベネルクス諸国で広く用いられており、一方で、Ｑｕｉｃｋ ＰＴは、他の国で用いられているアプローチであり、実施されている全ＰＴ試験の約９５％を数える。
【０００３】
国際標準比率（ＩＮＲ）及び国際感度指数（ＩＳＩ）が、世界保健機構によって導入された時、その目的は、経口抗凝固療法（５）についてのＰＴ結果を調整することであった：ある種の血漿又は全血試料についてのＰＴ結果は、用いられる試薬、機器、又は方法に関わらずＩＮＲ単位で同じであるべきである。今日、ＰＴについての各市販の凝固試薬（即ち、トロンボプラスチン）は、主要なＷＨＯ参照調製に対して標準化されている。この結果を用いて、ＩＳＩ（国際感度指数）で公表されているトロンボプラスチン試薬の相対感度を計算する。次いで、このＩＮＲ結果を、式：ＩＮＲ＝［ＰＴ率］ＩＳＩによって計算する。しかし、ＩＮＲ規格の使用の増加により、その限界が認識され、最近、多数の（又は、恐らくほとんどの）市販のＩＮＲ法間で同意はなされず、臨床学的に過剰のＩＮＲの変形例が存在し、従って、患者の良い治療を危険にさらしてきた（９、１０）。
【０００４】
Ｈｅｍｋｅｒと同僚（１、２）は、ビタミンＫ欠乏性タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ａｂｓｅｎｃｅ）又はアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）（Ｐｉｖｋａ）の役割を最初に特徴付けた。彼らは、内因性拮抗凝固阻害剤（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）とクマリン療法が関連することを発見した。これは、後にＰｉｖｋａと名付けられた。問題のタンパク質は、ビタミンＫ依存性因子の前段階であった。これらのタンパク質は、恐らく、凝固因子Ｘ（Ｆ Ｘ）に対して、プロトロンビン変換複合体を阻害した（３）。Ｐｉｖｋａ因子は、カルシウム結合に必要であり、これによって、リン酸脂質面へのこれらの因子の「吸着」に必要であるガンマカルボキシグルタミン酸が欠乏していることが分かった。従って、これらは、活性凝固因子（４、５）に対する不活性類似体である。
【０００５】
Ｔａｌｓｔａｄは、なぜＰＴの標準化が問題であるかという問いを熟考し、Ｐｉｖｋａ阻害剤の補正によるＰＴ標準化を提案している（１５、１６）。Ｈｅｃｋｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．は、酵素速度論に基づいた機能性凝固因子及び拮抗Ｐｉｖｋａ阻害剤の同時定量方法を開示している（１７）。更に、Ｐｉｖｋａについての免疫化学アッセイも知られている（例えば、米国特許第５，５１６，６４０号参照。）しかしながら、ＰＴ試験におけるＰｉｖｋａ補正についての容易で実際的な方法は、先行技術には導入されていない。従って、本発明の目的は、Ｐｉｖｋａ効果を更に研究し、様々な試薬を用いることによってＰｉｖｋａを考慮してＱｕｉｃｋ法とＯｗｒｅｎ ＰＴ法を比較することであった。結果として、本発明は、Ｐｉｖｋａ効果の問題を克服したＰＴ試験用の直接的な方法を提供する。
【０００６】
本発明の概要
本発明は：
ａ）経口抗凝固剤療法（ＯＡＴ）を受けている患者、又は肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する患者から得られた血漿又は全血試料の、又はキャリブレータ又は対照血漿試料の少なくとも２つの異なる希釈液のプロトロンビン時間を測定して、前記試料についてのｔｍｉｎ又はＩＮＲｍｉｎ値を決定するステップと；
ｂ）阻害剤の入っていない血漿又は全血試料の少なくとも２つの異なる希釈液のプロトロンビン時間を測定して、標準血漿についてのｔｍｉｎ又はＩＮＲｍｉｎ値を決定するステップと；
ｃ）ステップａ）及びｂ）の結果からｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を計算するステップと；
ｄ）ステップａ）で測定されたプロトロンビン時間からステップｃ）で得られたｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を引くことによって、ステップａ）の前記試料について前記Ｐｉｖｋａを補正したＰＴを決定するステップと；
を具える、プロトロンビン時間（ＰＴ）を補正したＰｉｖｋａを決定する方法に関する。
【０００７】
また、本発明は、本発明の方法を実施するようにプログラムした凝固分析器又はポイントオブケア機器（ＰＯＣＴ）等のデバイスを提供する。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は：
ａ）経口抗凝固剤療法（ＯＡＴ）を受けている患者、又は肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する患者から採取した血漿又は全血試料、又はキャリブレータ又は対照血漿試料の、少なくとも２つの異なる希釈液のプロトロンビン時間を測定して、前記試料についてのｔｍｉｎ又はＩＮＲｍｉｎ値を決定するステップと；
ｂ）阻害剤の入っていない血漿又は全血試料の少なくとも２つの異なる希釈液のプロトロンビン時間を測定して、標準血漿についてのｔｍｉｎ又はＩＮＲｍｉｎ値を決定するステップと；
ｃ）ステップａ）及びｂ）の結果からｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を計算するステップと；
ｄ）ステップａ）で測定されたプロトロンビン時間からステップｃ）で得られたｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を引くことによって、ステップａ）の前記試料について前記Ｐｉｖｋａを補正したＰＴを決定するステップと；
を具える、ＩＮＲ単位のＰｉｖｋａ効果と、プロトロンビン時間（ＰＴ）を補正したＰｉｖｋａを決定する方法を提供する。
【０００９】
この試料についてのＩＮＲｍｉｎ又はｔｍｉｎ値は、それぞれ、試料希釈又は試料体積（Ｘ軸）とＩＮＲ単位又は秒単位の凝固時間（Ｙ軸）との間の関係をプロットすることによって得られる。回帰直線は、様々な試料の希釈又は体積のＩＮＲ値又は凝固時間に相当する点を通って描かれる。この回帰直線は、ＩＮＲｍｉｎ又はｔｍｉｎでＹ軸と交わる（図１参照）。
【００１０】
好ましくは、測定したプロトロンビン時間のＰｉｖｋａ効果についての値は、式：
ＩＮＲＰｉｖｋａ＝ＩＮＲｍｉｎ（患者試料、キャリブレータ、又は対照）−ＩＮＲｍｉｎ（標準血漿）
又は
ｔＰｉｖｋａ＝ｔｍｉｎ（患者試料、キャリブレータ、又は対照）−ｔｍｉｎ（標準血漿）
を用いて計算される。
【００１１】
また、ｔＰｉｖｋａ値をＩＮＲ単位に変換することも可能である。
【００１２】
この方法のステップｄ）で、患者試料のＰＴに関するＰｉｖｋａ効果は、好ましくは、次式のうちの１つを用いて補正される：
ＩＮＲｃｏｒｒｅｃｔｅｄ＝ＩＮＲｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ−ＩＮＲＰｉｖｋａ
又は、
ｔｃｏｒｒｅｃｔｅｄ＝ｔｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ−ｔＰｉｖｋａ
ここで、式中、
ＩＮＲｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ又はｔｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌは、前記方法のステップａ）で測定された試料のプロトロンビン時間であり、ＩＮＲＰｉｖｋａ又はｔＰｉｖｋａは、前記方法のステップｃ）で計算した値である。好ましくは、前記ＩＮＲｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ又はｔｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌは、未希釈試料、即ち、それぞれＩＮＲｔｏｔａｌ又はｔｔｏｔａｌのプロトロンビン時間である。
【００１３】
ＰＴ試料についての初期ＩＮＲ値は：
ＩＮＲ＝（試料ｓｅｃ／標準ｓｅｃ）ＩＳＩ
の式で計算される。ここで、式中、試料ｓｅｃは、秒単位で測定した患者試料（又はキャリブレータ、又は対照試料）のプロトロンビン時間であり、標準ｓｅｃは、秒単位で測定した標準血漿の試料のプロトロンビン時間であり、ＩＳＩは、ＰＴ試験で用いられる凝固試薬の相対感度である。ＩＳＩ値は、試薬の製造者によって通常与えられているか、又はＩＳＩキャリブレータキットを用いて測定される。
【００１４】
ＰＴ試験用血漿試料は、好ましくは、生理食塩水又はその他の好適な緩衝液で希釈される。しかしながら、測定に様々な試料体積を用いる場合、試料希釈は必要ではない。簡略化するために、様々な試料体積及び試験試薬のこれらの混合物も、ここでは「希釈液」と呼ぶ。更に、「少なくとも二の希釈液」の表現は、ここでは試料セットも意味しており、この試料の１つは未希釈試料である。
【００１５】
好ましくは、本法のステップｂ）は、ある種の凝固試薬（即ち、トロンボプラスチン）について、１回のみ実施され、得られた結果は、複数の患者、キャリブレータ、又は同じ試薬で試験された対照試料用にステップｃ）で用いられる。これは、標準血漿がＰｉｖｋａを含まないので可能であり、従って、標準血漿のｔｍｉｎ又はＩＮＲｍｉｎ値は、ある種の凝固試薬について常に一定である。好ましくは、ステップｂ）では、阻害剤を含まない血漿又は全血試料を、健康であることが分かっている対象（即ち、標準血漿の試料）から採取する。「阻害剤が含まれていない血漿又は全血試料」の表現は、ここでは、血漿又は全血試料がＰｉｖｋａ阻害剤のような阻害剤を含まないことを意味する。
【００１６】
また、本発明の方法は、現在の分析器は、試料パターンを送り、本法の実行に必要な計算を行うように容易にプログラムできるので、全自動凝固分析器で実施することもできる。従って、本発明は、本発明の方法を実行するようにプログラムされた凝固分析器又はポイントオブケア機器（ＰＯＣＴ）等のデバイスに関するものである。流体試料の凝固を分析するデバイス及び方法は、当該分野でよく知られている（例えば、米国特許第６，７５０，０５３号参照）。ポイントオブケア機器は、限定はされないが、研究室、病院又は医療センター等の場所でプロトロンビン時間（ＰＴ）及びＩＮＲを迅速に決定するように開発された携帯用デバイスである。患者は、例えば、自宅で自分で試験するためのポイントオブケア機器を用いることができる。
【００１７】
また、本発明は、本発明を実施するための凝固分析器又はポイントオブケア機器（ＰＯＣＴ）等のデバイスの使用に関するものである。
【００１８】
本発明は、更に、本法のステップａ）及びｂ）の結果からｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を計算し、前記ステップａ）で測定したプロトロンビン時間から本法のステップｃ）で得られたｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を引くことによって、前記ステップａ）の試料についてのＰＴを補正したＰｉｖｋａを決定するためのコンピュータ等のデバイス又は前記デバイスの使用に関するものである。
【００１９】
実験セクション
【００２０】
例１
【００２１】
材料及び方法
【００２２】
患者及び血液採取
全ての手順は、１９７５年のヘルシンキ宣言に従って、我々の機関の責任ある委員会によって承認された。我々は、病院及び医療センターの患者の中から無作為に選択した標準試料とＯＡＴ患者試料を分析した。０．２ｍＬの０．１０９ｍｏｌ／Ｌ（３．２％）クエン酸溶液を含むクエン酸凝固管（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ社製、Ｖａｃｕｅｔｔｅ ｃａｔ．ｎｏ．４５４３２２、９ＮＣ）内に、１０人の標準患者及び１０人のＯＡＴ患者から血液（１．８ｍＬ）を採取した。試料針（Ｔｅｒｕｍｏ社製、Ｖｅｎｏｊｅｃｔ ｎｅｅｄｌｅ、Ｑｕｉｃｋ Ｆｉｔ、ｃａｔ．ｎｏ．ＭＮ−２１３８ＭＱ）は、０．８×４０ｍｍであった。試料管を１８５０ｇ、２０℃で１０分間遠心分離して、血漿を分離した。全測定は、血液採取後８時間内に同時に開始した。
【００２３】
ＰＴ時間の決定
ＰＴ凝固時間を、完全自動ＢＣＳ凝固分析器（独国マールブルク所在のＤａｄｅｂｅｈｒｉｎｇ社製Ｔｈｅ Ｄａｄｅｂｅｈｒｉｎｇ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて測定した。Ｑｕｉｃｋを用いた一段階プロトロンビン時間用に、１００μＬの凝固試薬を５０μＬのクエン酸血漿に加えた。４つの試験試薬は：
（ｉ） ネオプラスチンＣＬプラス（Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｎｅ ＣＬ Ｐｌｕｓ）、ｃａｔ．ｎｏ．００３７６（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社製ウサギ脳トロンボプラスチン）、ｌｏｔ０３１５８１、ＩＳＩ１．３０（器具についての記載なし）、ＩＳＩ値１．４２；
（ｉｉ） ＰＴ−フィブリノゲン組み換え体、ｃａｔ．ｎｏ．２０００５０００（イリノイ州所在のＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製組み換え型ウサギ組織トロンボプラスチン）、ｌｏｔ ＮＯ ４２５８６９、ＡＣＬ用にＩＳＩ１．０３、ＩＳＩ値ｌ．０８；
（ｉｉｉ）ＰＴ−フィブリノゲンＨＳプラス、ｃａｔ．ｎｏ．０８４６９８１０（イリノイ州所在のＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製ウサギ脳トロンボプラスチン）、ｌｏｔ ＮＯ３２５７２９、ＡＣＬ用にＩＳＩ１．１３、ＩＳＩ値１．２５；
（ｉｖ） デイドイノビン（Ｄａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ）ｃａｔ．ｎｏ．Ｂ４２１２−５０（ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ Ｍａｒｂｕｒｇ ＧｍｂＨ社製組み換え型ヒト組織トロンボプラスチン）、ｌｏｔ Ｎｏ．５２６９８７、ＢＣＳ用にＩＳＩ０．９０、ＩＳＩ値ｌ．０４；
であった。
【００２４】
Ｏｗｒｅｎ ＰＴ（トロンボプラスチン試薬と併用した）について、凝固反応は、１０μＬのクエン酸試料血漿、５０μＬの希釈剤、及び１５０μＬの試薬を含んでいた。３つの試験試薬は：
（ｖ） ２５ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２（ｃａｔ．ｎｏ．ＧＨＩ１５５）及びＧＨＩ社製希釈剤、ｌｏｔ Ｃ４１４Ｆ（Ｏｗｒｅｎの緩衝液、ｃａｔ．ｎｏ ＧＨＩ１５０）を含むＯｗｒｅｎ’ｓ ＰＴ、ｃａｔ．ｎｏ．ＧＨＩ（Ｇｌｏｂａｌ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社）１３１−１０（ウサギ脳トロンボプラスチン）、最適な方法についてＩＳＩ１．０９、ＩＳＩ値１．１７；
（ｖｉ） Ｎｙｃｏｔｅｓｔ ＰＴ、ｃａｔ．ｎｏ．１００２４８８（ウサギ脳トロンボプラスチン）及びＡｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ ａｓ社製希釈剤（Ｎｙｃｏｔｅｓｔ ＰＴ、希釈液、ｃａｔ．ｎｏ．１００２４８５）、ｌｏｔ１０１０７３５３、トロンボトラックについてＩＳＩ１．１３、ＩＳＩ値０．９５；
（ｖｉｉ）ＳＰＡ、５０ ｃａｔ．ｎｏ．００１０５（組織トロンボプラスチン）及びＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社製希釈剤（ＳＰＡ緩衝液ｃａｔ．ｎｏ．００１２４）、ｌｏｔ０２２０７１、ＩＳＩ０．９８（器具についての記載なし）、ＩＳＩ値０．９３；
であった。
【００２５】
２つの方法（４＋３試薬）は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社製ｌｏｔ０２１９６４の同じキャリブレータＥｔａｌｏｑｕｉｃｋ ｃａｔ．ｎｏ．００４９６で、ＩＳＩを測定した。
【００２６】
血漿希釈１：２は、Ｋａｂｉ社製生理食塩水（Ｎａｔｒｉｕｍｋｌｏｒｉｄ ９ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｌ）で作られた。
【００２７】
ＰＴ決定の分析における不正確
７つのＰＴ試験の稼働中の不正確性を、治療範囲内のＩＮＲ値、即ち、約２．２ＩＮＲを有する１人の患者血漿試料（ｎ＝１０回測定）を用いて測定した。各ＣＶは：ネオプラスチンＣＬプラス（Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｎｅ ＣＬ Ｐｌｕｓ）が２．３％、ＰＴ−ファブリノゲン組み換え体（ＰＴ−Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）が２．７％、ＰＴ−ファブリノゲンＨＳプラス（ＰＴ−Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ＨＳ Ｐｌｕｓ）が１．１％、デイドイノビン（Ｄａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ）が２．６％、Ｏｗｒｅｎ’ｓ ＰＴが１．４％、Ｎｙｃｏｔｅｓｔ ＰＴが１．６％、及びＳＰＡが１．０％であった。
【００２８】
Ｐｉｖｋａ決定及び統計
我々は、標準血漿及びＯＡＴ血漿について、ｙ軸に凝固時間を、ｘ軸に血漿希釈度をプロットした。一次方程式から、我々は、一の試料（３、１１）についての無数の凝固因子を有するいわゆる最小凝固時間（ｔｍｉｎ）と呼ばれるｙ軸上の線切片を得た。標準血漿とＯＡＴ血漿との間の切片（ｙ軸）の差は、キャリブレーション効果のない秒単位のＰｉｖｋａの作用を示す。我々は、ＩＮＲ単位で切片の差を計算した（ＯＡＴ切片−標準血漿切片、図１）。
【００２９】
ＩＮＲ結果は、式：
ＩＮＲ＝（試料ｓｅｃ／標準ｓｅｃ）ＩＳＩ
を用いて秒単位で計算した。
【００３０】
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ５．０プログラムを用いて、相関関数及びＩＮＲ結果を得た。
【００３１】
結果
平均切片は、標準血漿については、０．０３から０．１４ＩＮＲの範囲でＱｕｉｃｋ ＰＴを用いて、また、０．０１から０．０３ＩＮＲの範囲でＯｗｒｅｎ ＰＴを用いて変化させる。平均切片は、ＯＡＴ血漿については、０．４０から１．４６ＩＮＲの範囲でＱｕｉｃｋ ＰＴを用いて、また、０．２０から０．２８ＩＮＲの範囲でＯｗｒｅｎ ＰＴを用いて変化させる。Ｑｕｉｃｋ ＰＴ法及びＯｗｒｅｎ ＰＴを用いた標準血漿（０．０７ＩＮＲ）及びＯＡＴ血漿（０．７２ＩＮＲ）についての切片の平均ＳＤは、０．０２ＩＮＲ；０．２３ＩＮＲであった。Ｑｕｉｃｋ ＰＴのＰｉｖｋａ効果の平均は、０．３６ＩＮＲ（ＳＤ ０．４３ＩＮＲ）（イノビン（Ｉｎｎｏｖｉｎ）試薬０．１５ＩＮＲなしで；ＳＤ０．１４）、Ｏｗｒｅｎ ＰＴのＰｉｖｋａ効果の平均は、０．３６ＩＮＲ（ＳＤ０．２４ＩＮＲ）である。Ｐｉｖｋａ補正を用いた、ＯＡＴ血漿からの平均ＩＮＲ結果は、Ｑｕｉｃｋ ＰＴについては２．５８ＩＮＲ（ＳＤ０．１１）であり、Ｏｗｒｅｎ ＰＴについては２．５１ＩＮＲ（ＳＤ０．１６）であった（表１）。
【００３２】
考察
ＩＮＲ結果の調和は、患者のケア及び科学文献の実用性を改善する点で実質的な目的である。患者のケアについてのＩＮＲ単位の治療範囲が調和し、医師が容易に用いることができる。問題は、世界中のＩＮＲ結果を統一することであり、これは、臨床検査室の課題である。実際には、検査室は、機器についての製造者のＩＳＩ、製造者の又は「局地的」（ある国又は地域）キャリブレータキットを使用する。それでは、同じ試料からのＩＮＲ結果は、同じであるべきである。ＩＳＩキャリブレーションは、ＩＮＲ結果を調和させる点で重要である。ＰＴ試薬の多様性（トロンボプラスチン、ｐＨ、イオン濃度、及び質、添加剤等）は世界的に考えることができ、これは、ＩＮＲの調和を非常に困難なものにしている。
【００３３】
ＰＴ試薬は、低ＩＳＩ、即ち１．０付近であるべきである。このため、我々は、この研究用に高感度Ｏｗｒｅｎ及びＱｕｉｃｋ試薬を選択する。べき関数としてのＩＳＩ（キャリブレーション）の効果は、治療範囲内でＩＮＲ値が高くなると上昇する（９）。これによって、結果に、治療範囲でより調和することが求められている。ＰＴ測定についての分析基準は、ＯＡＴ患者の顕著な生物学的変化に部分的に起因して、非常に厳しい（バイアス＜０．２０ＩＮＲ及びＣＶ＜５％）（１２）。
【００３４】
Ｐｉｖｋａ因子は、治療領域及び測定それ自体のキャリブレーションの効果の理由によってＩＮＲ結果の調和に大きな役割を有する。我々は、イノビン（Ｉｎｎｏｖｉｎ）結果（ヒトトロンボプラスチン）を除外するのであれば、ＰｉｖｋａとＰＴ法の関係を見出すことができる：Ｑｕｉｃｋ ＰＴについてのＰｉｖｋａの平均は、０．１５ＩＮＲであり、Ｏｗｒｅｎ ＰＴについては、０．３６ＩＮＲである。これは、Ｏｗｒｅｎ ＰＴ法についてより大きなＰｉｖｋａ感度と、より大きな阻害性（０．２１ＩＮＲ）を意味する（表１）。これは、Ｑｕｉｃｋ ＰＴと比較してＯｗｒｅｎ ＰＴについてより低いＩＮＲとなることを説明している（６、１３、１４）。抗凝固療法では、患者は、ケア管理用にＯｗｒｅｎ ＰＴを用いて、より多くの投薬（０．２１ＩＮＲ）を受ける。
【００３５】
両方法で、同じ製造者であるＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社は、Ｐｉｖｋａ感度が非常に小さい試薬を有する。我々は、イノビン（Ｉｎｎｏｖｉｎ）（０．９８ＩＮＲ）を用いた、最も大きなＰｉｖｋａ効果を発見した。その試薬は、組み換え型ヒト組織トロンボプラスチンを含み、一方で、その他の全ての試薬がウサギ起源のトロンボプラスチンを含む。このＰｉｖｋａは、様々な試薬を用いて変化し、部分的にトロンボプラスチン依存性である。標準血漿及びＯＡＴ血漿についての切片ＳＤは、明らかにＯｗｒｅｎ ＰＴ（０．０１から０．０３ＩＮＲ、０．２０から０．２８ＩＮＲ）よりもＱｕｉｃｋ ＰＴ（０．０３から０．１４ＩＮＲ、０．４０から１．４６ＩＮＲ）がより変化する。これらの結果は、Ｏｗｒｅｎ ＰＴ法を用いて、我々は、様々な試薬について、より広範囲でＩＮＲ結果を調和させることができるという見方を確認するものである。我々のより早い時期の発見によれば、我々は、Ｏｗｒｅｎ ＰＴ法が優れているとの結論を出した（６、７、８）。
【００３６】
表１では、様々なＰＴ試薬及び方法を用いて、ＯＡＴ血漿−Ｐｉｖｋａ阻害からのＩＮＲ結果の平均間でほとんど同じ結果であり、と最小分散を参照する。これは、Ｐｉｖｋａ計算が、正しいことを確認するものである（全試薬についての同じキャリブレーション）。Ｐｉｖｋａ阻害は、世界的なＩＮＲ結果の調和という点で問題を引き起こす（キャリブレーション、様々な試薬、機器、及びＰＴ法）（９）。ＯＡＴ患者からのＩＳＩキャリブレータ（より高いＩＮＲ値）は、Ｐｉｖｋａ凝固因子も含んでおり、これは、ＩＮＲ系を複雑にする。キャリブレータのＩＮＲ値は、Ｐｉｖｋａ効果なしのものであるべきである。
【００３７】
本発明の方法は、様々な希釈及び単純な数学的計算について、１人の患者の試料につき少なくとも２つのＰＴ測定を必要とするだけである。結果として、本法は、異なる種類の機器に適用することが容易である。理論的に、ＰＴ法は、活性Ｋ依存性凝固因子及び不活性因子（Ｐｉｖｋａ阻害）を含む、血液凝固についての抗凝固薬の全効果を測定するべきである。この方法論的選択は、Ｐｉｖｋａ感受性トロンボプラスチンの使用及び活性及び不活性凝固因子の合計を測定する方法を意味する。別の方法論的可能性は、この研究にあるように、凝固阻害剤無しで活性凝固因子のみを測定することである。この新しい方法は、最も良い主要な可能性についてのＩＮＲ系を開発するのを助けて、経口抗凝固治療についてのＩＮＲを世界的に調和させる。
【００３８】
例２
【００３９】
材料及び方法
【００４０】
患者及び血液採取
静脈血試料を、１０人の標準対象と、経口抗凝固療法のモニタリングにＰＴ時間試験が必要とされる２１０人の病院及び医療センターの患者から得た。我々の領域では、「Ｐ−ＩＮＲ」試験コードをこの目的に用いる。従って、患者試料は、抗凝固の起こり得る全ての相：（ｉ）治療前、（ｉｉ）投与調整相、及び（ｉｉｉ）定状状態相を示した。全ての手順は、１９７５年のヘルシンキ宣言に従って、我々の機関の責任ある委員会によって承認された。０．２ｍＬの０．１０９ｍｏｌ／Ｌ（３．２％）クエン酸溶液を含むクエン酸凝固管（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ社、Ｖａｃｕｅｔｔｅ ｃａｔ．ｎｏ．４５４３２２、９ＮＣ）内に、血液（１．８ｍＬ）を採取した。試料針（Ｔｅｒｕｍｏ社、Ｖｅｎｏｊｅｃｔ ｎｅｅｄｌｅ、Ｑｕｉｃｋ Ｆｉｔ、ｃａｔ．ｎｏ．ＭＮ−２１３８ＭＱ）は、０．８×４０ｍｍであった。試料管を１８５０ｇ、２０℃で１０分間遠心分離して、血漿を分離した。血液採取後８時間以内に同時に全測定を開始した。
【００４１】
ＰＴ決定
ＰＴ凝固時間を完全自動ＢＣＳ凝固分析器（独国マールブルク所在のＤａｄｅｂｅｈｒｉｎｇ社製Ｔｈｅ Ｄａｄｅｂｅｈｒｉｎｇ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて測定した。Ｑｕｉｃｋを用いた一段プロトロンビン時間について、１００μＬの凝固試薬を５０μＬのクエン酸血漿に加えた。また、希釈試料用に、１００μＬ＋２５μＬ＋２５μＬ（Ｋａｂｉ社製生理食塩水、「Ｎａｔｒｉｕｍｋｌｏｒｉｄ ９ｍｇ／ｍＬ」、５００ｍＬ）を加えた。試験試薬は：デイドイノビン（Ｄａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ）ｃａｔ．ｎｏ．Ｂ４２１２−５０（組み換え型ヒト組織トロンボプラスチン、ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ Ｍａｒｂｕｒｇ ＧｍｂＨ社）、ｌｏｔ５３６９２８、ＩＳＩ＝０．９２であった。
【００４２】
Ｏｗｒｅｎ ＰＴ（併用トロンボプラスチン試薬）用に、凝固反応は、１０μＬのクエン酸試料血漿、６０μＬの希釈剤、及び１４０μＬの試薬、及び「希釈測定」用の体積：５μＬ＋６５μＬ＋１４０μＬ、７μＬ＋６３μＬ＋１４０μＬ、又は１４μＬ＋５６μＬ＋１４０μＬを含んでいた。試験試薬は：Ｎｙｃｏｔｅｓｔ ＰＴ、ｃａｔ．ｎｏ．１００２４８８（ウサギ脳トロンボプラスチン）、及びｌｏｔ１０１１２９５４、ＩＳＩ＝１．０７として、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社製希釈剤（Ｎｙｃｏｔｅｓｔ ＰＴ、希釈液、ｃａｔ．ｎｏ．１００２４８５）であった。
【００４３】
ＩＳＩ較正
２つのローカルＩＳＩキャリブレータキット：（ｉ）Ｅｑｕａｌｉｓ社製「Ｓｖｅｎｓｋ ｎａｔｉｏｎｅｌｌ ｋａｌｉｂｒａｔｏｒ ｆｏｒ ｐｒｏｔｒｏｍｂｉｎｋｏｍｐｌｅｘａｋｔｉｖｉｅｔ」、ｌｏｔ１１、１２、Ｃａｌ １＝０．８５ＩＮＲ及びＣａｌ ２＝３．１９ＩＮＲ（主に瑞国及び諾国で用いられる）、（ｉｉ）Ｂｉｏｃｌｉｎ社製「ＩＳＩ−ｋａｌｉｂｒａａｔｔｏｒｉｋｉｔｔｉ」、ｃａｔ．ｎｏ．Ｂ１００００１５０、ｌｏｔ ８、Ｃａｌ １＝２．０７ＩＮＲ、Ｃａｌ ２＝３．５２ＩＮＲ及びＣａｌ ３＝１．０ＩＮＲ（主に芬国で用いられる）を用いた。
【００４４】
更に、２つの市販の（製造者キャリブレーション）ＩＳＩキャリブレーションキット：（ｉ）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社製Ｅｔａｌｏｑｕｉｃｋ ｃａｔ．ｎｏ．００４９６、ｌｏｔ０４１５５５、Ｃａｌ １＝０．９１ＩＮＲ、Ｃａｌ ２＝３．２４ＩＮＲ及びＣａｌ ３＝４．９０ＩＮＲ、（ｉｉ）ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ社製ＰＴ−Ｍｕｌｔｉ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｃａｔ．ｎｏ．ＯＰＡＴ０３５、ｌｏｔ３５４２２、Ｃａｌ １＝１．０１ＩＮＲ、Ｃａｌ ２＝１．３０ＩＮＲ、Ｃａｌ ３＝１．６５ＩＮＲ、Ｃａｌ ４＝２．９７ＩＮＲ、Ｃａｌ ５＝４．００ＩＮＲ、Ｃａｌ ６＝５．２９ＩＮＲを用いた。
【００４５】
最小ＰＴ時間及び各ＩＮＲの決定
数秒で阻害を測定する手順を、Ｈｅｍｋｅｒと協働者によって記載されたように実行した（１、２、３）。我々は、様々なキャリブレータついてと同様に、標準血漿及びＯＡＴ血漿についてのＰＴ（秒）対Ｄ（Ｄ＝血漿又はキャリブレータ希釈因子）プロットを構成した。これは、経口抗凝固剤を有する非拮抗阻害法則と調和する（１８）。この一次方程式から、ｙ軸切片を計算する。これは、所謂無数の凝固因子を有する最小凝固時間（ｔｍｉｎ）である（３）。標準血漿とＯＡＴ血漿との間の切片（ｙ軸）の差は、キャリブレーション効果のない数秒でのＰＩＶＫＡの作用を示している。更に我々は、ＩＮＲ単位の切片の差を計算して全ＩＮＲからそれを差し引いた：
ＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄ＝ＩＮＲＴｏｔａｌ−ＩＮＲＰｉｖｋａ
【００４６】
ＩＮＲの値は、式：ＩＮＲ＝（試料ｓｅｃ／標準ｓｅｃ）ＩＳＩを用いて計算した。Ｑｕｉｃｋ ＰＴ線形性チェックについての希釈因子は：０．９１；１．００；１．２５；１．６７ ２．００であり、Ｏｗｒｅｎ ＰＴ線形性チェックについての希釈因子は：０．６７；１．００；１．２５；１．６７；２．５０であった。
【００４７】
分析に基づく不正確性及び統計
ＰＴ試験の同時正確性を、治療範囲、即ち、ほぼ２．２ＩＮＲでのＩＮＲ値を有する一の患者血漿試料（ｎ＝１０回測定）を用いて測定した。各ＣＶは：デイドイノビン（Ｄａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ）が２．６％、Ｎｙｃｏｔｅｓｔ ＰＴが１．６％であった。これは、試薬のスペクトラムがより幅広い我々の以前の観察と調和する（９）。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ５．０プログラムを用いて、最小二乗法を用いて相関関数及びＩＮＲ結果を得た。
【００４８】
結果
ＰＩＶＫＡ阻害は、１より大きいＩＮＲ値を有する全てのキャリブレータで実証できた。期待されているように、この阻害は、キャリブレータＩＮＲ値の増加と共に増加した（表２）。しかしながら、ＰＩＶＫＡ阻害はキャリブレータキット間で変動し、２つの異なるＰＴ法で異なっていたことは、注目に値する。
【００４９】
我々は、同じキャリブレータを用いた場合でさえ、ＰＴ法に依存して、２００人のＯＡＴ患者の場合で、ＩＮＲ結果の顕著な差があることを示した。従来のＩＮＲについての平均は、Ｑｕｉｃｋ法及びＯｗｒｅｎ法それぞれによって測定した場合に、３．８９及び２．６８であった。ＰＩＶＫＡ補正後、この平均は、ＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄと表され、２．４９及び２．３０ＩＮＲ単位であった。これらの結果によって、我々は２．１３ＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄ単位の標的点を確立することが可能となり、この範囲は１．６−２．６ＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄ単位であった。様々な希釈を用いる線形性は、Ｑｕｉｃｋ法及びＯｗｒｅｎ ＰＴ法に効果的であった。我々は、２００人のＯＡＴ患者の場合で、従来のＰＴ測定と活性凝固（ＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄ）を測定する新しい方法との間の差−より高いＩＮＲ値に向けて増加する−があることを示した。個々の元の値と補正した（ＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄ）値を図２に示す。凝固阻害の個々の変動は、図３に示すようにＯＡＴ患者試料に対して、様々なＩＮＲレベル（Ｏｗｒｅｎ ＰＴ）で注目に値する。
【００５０】
考察
この新しい方法は、一の患者試料について、２つのＰＴ測定と数学的計算：ＩＮＲｃｏｒｒｅｃｔｅｄ＝ＩＮＲｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ−ＩＮＲＰｉｖｋａを必要とする。様々な種類の機器に容易に適合する。試薬にかかる費用は、自動機器が、非常に小さい液体体積をピペットで取ることができるので、ＰＴ測定に半分の体積を用いるのと同じである。
【００５１】
表１ Ｑｕｉｃｋ及びＯｗｒｅｎ ＰＴ法を用いるＰｉｖｋａ阻害の測定及びＱｕｉｃｋ及びＯｗｒｅｎ ＰＴ法用の様々な試薬
【００５２】
表２ ２つの異なるＰＴ法を用いた４つのキャリブレータキットで得たＩＮＲ阻害
ａ増加するＩＮＲ値に応じてアレンジする。
ｂ製造者によって与えた通り。
ｃ各キャリブレータについてのＩＮＲ（ｙ軸）：Ｃ（Ｃ＝キャリブレータ希釈因子）（ｘ軸）プロットを構築した。より高い値を有するキャリブレータ、即ち、ＰＩＶＫＡを含むキャリブレータから最も低いＩＮＲ値の各キャリブレータのｙ切片（ＩＮＲ）値を順次減じることによって、阻害率を計算した。詳しくは、材料及び方法、及び図１を参照。
ｄＩＮＲ対１／Ｃ線のｙ軸切片：即ち、阻害剤不存在での理論上の凝固時間、又はＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄを表す
【００５３】
参考文献
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１１．Ｈｅｍｋｅｒ ＨＣ，Ｖｅｌｔｋａｍｐ ＪＪ，Ｌｏｅｌｉｇｅｒ ＥＡ．Ｋｉｎｅｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ．３．Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｄｉａｔｈ Ｈａｅｍｏｒｒｈ．１９６８；１９：３４６−６３．
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１３．Ｈｏｒｓｔｉ Ｊ．Ｔｈｅ Ｑｕｉｃｋ ａｎｄ Ｏｗｒｅｎ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｉｍｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｏｒａｌ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｏ ｎｏｔ ａｇｒｅｅ ｗｅｌｌ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｒａｔｉｏ（ＩＮＲ）ｕｎｉｔｓ．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３；６３：４５５−６．
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【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、Ｐｉｖｋａ計算のモデルである。標準血漿のｔｍｉｎ値は、一の試薬ロットについて一定である。患者の血漿についてのｔｍｉｎ値は、１人の患者についてのみである。一次方程式を計算するには、一の患者試料について少なくとも２つの測定値が必要とされる。
【図２】図２は、Ｏｗｒｅｎ ＰＴによって決定される従来のＩＮＲ（ＩＮＲＴｏｔａｌ）と、Ｅｔａｌｏｑｕｉｃｋキャリブレーションを用いて増加する順にした２００人のＯＡＴ患者血漿についての活性凝固因子（ＩＮＲＣｏｒｒｅｃｔｅｄ）及び阻害効果（ＩＮＲＰｉｖｋａ）である。
【図３】図３は、ＩＮＲ単位として２００人ＯＡＴ患者試料のＯｗｒｅｎ ＰＴのＰＩＶＫＡ阻害（阻害因子Ｆ ＩＩ、Ｆ ＶＩＩ及びＦ Ｘ）である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｉｖｋａ−補正プロトロンビン時間（ＰＴ）の決定方法において：
ａ）経口抗凝固剤療法（ＯＡＴ）を受けている患者、又は肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する患者から採取した血漿又は全血試料、又はキャリブレータ又は対照血漿試料の少なくとも２つの異なる希釈液のプロトロンビン時間を測定して、前記試料についてのｔｍｉｎ又はＩＮＲｍｉｎ値を決定するステップと；
ｂ）阻害剤の入っていない血漿又は全血試料の少なくとも２つの異なる希釈液のプロトロンビン時間を測定して、標準血漿についてのｔｍｉｎ又はＩＮＲｍｉｎ値を決定するステップと；
ｃ）ステップａ）及びｂ）の結果からｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を計算するステップと；
ｄ）ステップａ）で測定したプロトロンビン時間からステップｃ）で得られたｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を引くことによって、ステップａ）の前記試料について前記Ｐｉｖｋａを補正したＰＴを決定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、ステップａ）の前記試料について前記Ｐｉｖｋａを補正したＰＴを、以下の式：
ＩＮＲｃｏｒｒｅｃｔｅｄ＝ＩＮＲｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ−ＩＮＲＰｉｖｋａ
又は
ｔｃｏｒｒｅｃｔｅｄ＝ｔｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ−ｔＰｉｖｋａ
ここで、式中、
ＩＮＲｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ又はｔｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌは、前記方法のステップａ）で測定した試料のＰＴであり、ＩＮＲＰｉｖｋａ又はｔＰｉｖｋａは、前記方法のステップｃ）で計算した値である、
のうちの１つを用いて、ステップｄ）で決定することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記方法を試料パターンと前記方法の実行に必要である計算を実行するようにプログラムされた完全自動凝固分析器で実行することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、ステップｂ）が、ある種の凝固試薬（即ち、トロンボプラスチン）について一度実施されて、得られた結果を、同じ試薬で試験された複数の患者、キャリブレーション、又は対照試料について、ステップｃ）で用いることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法を実施するようにプログラムされたことを特徴とするデバイス。
【請求項６】
請求項５に記載のデバイスにおいて、前記デバイスが、凝固分析器又はポイントオブケア機器（ＰＯＣＴ）であることを特徴とするデバイス。
【請求項７】
請求項１に記載の方法の前記ステップｃ）及びｄ）を実施するようにプログラムされたことを特徴とするデバイス。
【請求項８】
請求項１に記載の方法を実施するためのデバイスの使用。
【請求項９】
請求項８に記載の使用において、前記デバイスが、凝固分析器又はポイントオブケア機器（ＰＯＣＴ）であることを特徴とする使用。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法のステップａ）及びｂ）の結果からｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａを計算し、前記ステップａ）で測定したプロトロンビン時間から請求項１に記載の前記方法のステップｃ）で得たｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を引くことによって前記ステップａ）の前記試料についての前記Ｐｉｖｋａを補正したＰＴを決定するためのデバイスの使用。
【請求項１１】
請求項１０に記載の使用において、前記デバイスがコンピュータであることを特徴とする使用。
【請求項１】
Ｐｉｖｋａ−補正プロトロンビン時間（ＰＴ）の決定方法において：
ａ）経口抗凝固剤療法（ＯＡＴ）を受けている患者、又は肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する患者から採取した血漿又は全血試料、又はキャリブレータ又は対照血漿試料の少なくとも２つの異なる希釈液のプロトロンビン時間を測定して、前記試料についてのｔｍｉｎ又はＩＮＲｍｉｎ値を決定するステップと；
ｂ）阻害剤の入っていない血漿又は全血試料の少なくとも２つの異なる希釈液のプロトロンビン時間を測定して、標準血漿についてのｔｍｉｎ又はＩＮＲｍｉｎ値を決定するステップと；
ｃ）ステップａ）及びｂ）の結果からｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を計算するステップと；
ｄ）ステップａ）で測定したプロトロンビン時間からステップｃ）で得られたｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を引くことによって、ステップａ）の前記試料について前記Ｐｉｖｋａを補正したＰＴを決定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、ステップａ）の前記試料について前記Ｐｉｖｋａを補正したＰＴを、以下の式：
ＩＮＲｃｏｒｒｅｃｔｅｄ＝ＩＮＲｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ−ＩＮＲＰｉｖｋａ
又は
ｔｃｏｒｒｅｃｔｅｄ＝ｔｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ−ｔＰｉｖｋａ
ここで、式中、
ＩＮＲｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌ又はｔｐａｔｉｅｎｔ，ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌは、前記方法のステップａ）で測定した試料のＰＴであり、ＩＮＲＰｉｖｋａ又はｔＰｉｖｋａは、前記方法のステップｃ）で計算した値である、
のうちの１つを用いて、ステップｄ）で決定することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記方法を試料パターンと前記方法の実行に必要である計算を実行するようにプログラムされた完全自動凝固分析器で実行することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、ステップｂ）が、ある種の凝固試薬（即ち、トロンボプラスチン）について一度実施されて、得られた結果を、同じ試薬で試験された複数の患者、キャリブレーション、又は対照試料について、ステップｃ）で用いることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法を実施するようにプログラムされたことを特徴とするデバイス。
【請求項６】
請求項５に記載のデバイスにおいて、前記デバイスが、凝固分析器又はポイントオブケア機器（ＰＯＣＴ）であることを特徴とするデバイス。
【請求項７】
請求項１に記載の方法の前記ステップｃ）及びｄ）を実施するようにプログラムされたことを特徴とするデバイス。
【請求項８】
請求項１に記載の方法を実施するためのデバイスの使用。
【請求項９】
請求項８に記載の使用において、前記デバイスが、凝固分析器又はポイントオブケア機器（ＰＯＣＴ）であることを特徴とする使用。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法のステップａ）及びｂ）の結果からｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａを計算し、前記ステップａ）で測定したプロトロンビン時間から請求項１に記載の前記方法のステップｃ）で得たｔＰｉｖｋａ又はＩＮＲＰｉｖｋａ値を引くことによって前記ステップａ）の前記試料についての前記Ｐｉｖｋａを補正したＰＴを決定するためのデバイスの使用。
【請求項１１】
請求項１０に記載の使用において、前記デバイスがコンピュータであることを特徴とする使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００８−５３３４９６（Ｐ２００８−５３３４９６Ａ）
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０２４３０（Ｐ２００８−５０２４３０）
【出願日】平成１８年３月２０日（２００６．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００６／０５０１０４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１００３４６
【国際公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（５０７３１１９７９）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２０日（２００６．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００６／０５０１０４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１００３４６
【国際公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（５０７３１１９７９）
【Ｆターム（参考）】
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