ヘムタンパク質分離法およびヘムタンパク質吸着剤
【課題】ヘムタンパク質を、このヘムタンパク質を含有する溶液中から、選択的に分離することができるヘムタンパク質分離法を提供すること。
【解決手段】本発明のヘムタンパク質分離法は、ヘムタンパク質を含有する溶液中から、当該ヘムタンパク質を分離するものであり、少なくとも表面付近が、主として下記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されている吸着剤３に、前記溶液を接触させることにより、前記ヘムタンパク質を優先的に吸着させて、前記溶液から分離するものである。
（Ｃａ１−ａＭａ）１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２ ・・・（Ｉ）
［ただし、組成式（Ｉ）中、Ｍは原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種を示し、Ｘはハロゲン元素のうちの少なくとも１種を示し、０＜ａ≦１、０≦ｂ≦１である。］
【解決手段】本発明のヘムタンパク質分離法は、ヘムタンパク質を含有する溶液中から、当該ヘムタンパク質を分離するものであり、少なくとも表面付近が、主として下記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されている吸着剤３に、前記溶液を接触させることにより、前記ヘムタンパク質を優先的に吸着させて、前記溶液から分離するものである。
（Ｃａ１−ａＭａ）１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２ ・・・（Ｉ）
［ただし、組成式（Ｉ）中、Ｍは原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種を示し、Ｘはハロゲン元素のうちの少なくとも１種を示し、０＜ａ≦１、０≦ｂ≦１である。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘムタンパク質分離法およびヘムタンパク質吸着剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロキシアパタイトは、生体親和性に優れることから、従来から、液体クロマトグラフィー用カラム（吸着装置）に使用する吸着剤として広く利用され、この液体クロマトグラフィー用カラムにタンパク質等を含有する溶液を通液することにより、目的とするタンパク質を選択的に吸着・分離するタンパク質の分離法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
ところで、近年、例えば、糖尿病の診断をする際の指標として、ヘムタンパク質の１種であるヘモグロビンＡ１ｃが用いられ、このヘモグロビンＡ１ｃを効率良く分離し得るヘムタンパク質の分離法が求められている。しかしながら、現在のところ、ヘムタンパク質を効率良く分離し得るヘムタンパク質の分離法は認められていない。
【０００４】
【特許文献１】特許第３４３５２６５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ヘムタンパク質を、このヘムタンパク質を含有する溶液中から、選択的に分離することができるヘムタンパク質分離法およびヘムタンパク質吸着剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような目的は、下記の（１）〜（９）の本発明により達成される。
（１） ヘムタンパク質を含有する溶液中から、当該ヘムタンパク質を分離するヘムタンパク質分離法であって、
少なくとも表面付近が、主として下記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されている吸着剤に、前記溶液を接触させることにより、前記ヘムタンパク質を優先的に吸着させて、前記溶液から分離することを特徴とするヘムタンパク質分離法。
（Ｃａ１−ａＭａ）１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２ ・・・（Ｉ）
［ただし、組成式（Ｉ）中、Ｍは原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種を示し、Ｘはハロゲン元素のうちの少なくとも１種を示し、０＜ａ≦１、０≦ｂ≦１である。］
【０００７】
これにより、Ｍに対して高い親和性（高い結合力）で結合し得る部分と推察されるプロトポルフィリン骨格を有するヘムタンパク質が、特異的に吸着剤に吸着するようになる。その結果、吸着剤は、ヘムタンパク質以外の化合物と比較して、ヘムタンパク質に対して高い選択性を示すようになる。その結果、ヘムタンパク質を含有する溶液中から、ヘムタンパク質を分離することができる。
【０００８】
（２） 前記ヘムタンパク質は、ミオグロビンおよびシトクロム−ｃのうちの少なくとも１種である上記（１）に記載のヘムタンパク質分離法。
【０００９】
これらのヘムタンパク質は、原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素に対して、特に優れた親和性を有している。そのため、これらのヘムタンパク質をより優れた選択性をもって、吸着剤に吸着させることができ、試料に含まれるこれらのヘムタンパク質と、他のタンパク質とを、より確実に分離することができる。
【００１０】
（３） 前記ランタノイド系の金属元素は、Ｌｕである上記（１）または（２）に記載のヘムタンパク質分離法。
【００１１】
Ｌｕは、ヘムタンパク質に対して、特に優れた親和性を有していることから、ヘムタンパク質をより優れた選択性をもって、吸着剤に吸着させることができる。その結果、試料に含まれるヘムタンパク質を、他のタンパク質と確実に分離することができる。
【００１２】
（４） 前記組成式（Ｉ）中の前記ａは、０．５〜１である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【００１３】
かかる範囲内に設定することにより、ヘムタンパク質の特異的吸着能を吸着剤に十分に付与することができる。
【００１４】
（５） 前記組成式（Ｉ）中の前記Ｘは、Ｆを主とするハロゲン元素である上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【００１５】
これにより、アパタイトを構成する各元素（イオン）の間の結合力が増大し、アパタイトの耐久性および耐溶剤性（特に耐酸性）を向上させることができる。
【００１６】
（６） 前記Ｘは、Ｆを含み、その割合が前記Ｘ全体に対し８０％以上である上記（１）ないし（５）のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【００１７】
これにより、Ｆの特性（性質）がより顕著に発揮され、アパタイト（吸着剤）の耐久性および耐溶剤性（特に耐酸性）をより向上させることができる。
【００１８】
（７） 前記組成式（Ｉ）中の前記ｂは、０．３〜１である上記（１）ないし（６）のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【００１９】
ｂが小さ過ぎると、Ｘの種類等によっては、アパタイト（吸着剤）の耐久性や耐溶剤性を十分に向上させることができないおそれがある。
【００２０】
（８） 前記吸着剤は、粒状をなしている上記（１）ないし（７）のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【００２１】
吸着剤を粒状とすることにより、その表面積を増大させることができ、ヘムタンパク質の吸着量をより増大させることができる。
【００２２】
（９） 吸着剤充填空間を有するカラムと、前記吸着剤充填空間の少なくとも一部に充填された前記吸着剤とを有する吸着装置を用い、前記吸着剤充填空間に前記溶液を通液することにより、前記ヘムタンパク質を前記溶液から分離する上記（１）ないし（８）のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【００２３】
かかる吸着装置を用い、前記溶液をこの吸着装置に通液することにより、ヘムタンパク質を確実に溶液中から分離することができる。
【００２４】
（１０） ヘムタンパク質を含有する溶液中から、当該ヘムタンパク質を分離するヘムタンパク質吸着剤であって、
少なくとも表面付近が、主として下記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されており、前記溶液を接触させることにより、前記ヘムタンパク質を優先的に吸着して、前記溶液から分離することを特徴とするヘムタンパク質吸着剤。
（Ｃａ１−ａＭａ）１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２ ・・・（Ｉ）
［ただし、組成式（Ｉ）中、Ｍは原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種を示し、Ｘはハロゲン元素のうちの少なくとも１種を示し、０＜ａ≦１、０≦ｂ≦１である。］
【００２５】
これにより、Ｍに対して高い親和性（高い結合力）で結合し得る部分と推察されるプロトポルフィリン骨格を有するヘムタンパク質が、特異的に吸着剤に吸着するようになる。その結果、吸着剤は、ヘムタンパク質以外の化合物と比較して、ヘムタンパク質に対して高い選択性を示すようになる。その結果、ヘムタンパク質を含有する溶液中から、ヘムタンパク質を分離し得るヘムタンパク質吸着剤とすることができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のヘムタンパク質分離法によれば、目的物質であるヘムタンパク質を、高い選択性をもって吸着剤に吸着させることができるため、ヘムタンパク質を含有する溶液から、ヘムタンパク質を効率的に分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明のヘムタンパク質分離法およびヘムタンパク質吸着剤の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２８】
＜吸着装置＞
まず、本発明のヘムタンパク質分離法について説明するのに先立って、本発明のヘムタンパク質吸着剤を備える吸着装置の一例について説明する。
【００２９】
図１は、本発明の吸着剤を備える吸着装置の実施形態を示す縦断面図である。なお、以下の説明では、図１中の上側を「流入側」、下側を「流出側」と言う。
【００３０】
ここで、流入側とは、目的とするヘムタンパク質を分離（精製）する際に、例えば、試料（ヘムタンパク質を含有する溶液）、溶出液等の液体を、吸着装置に供給する側のことを言い、一方、流出側とは、前記流入側と反対側、すなわち、前記液体が吸着装置から流出する側のことを言う。
【００３１】
図１に示す吸着装置１は、カラム２と、粒状の吸着剤３と、２枚のフィルタ部材４、５とを有している。
【００３２】
カラム２は、カラム本体２１と、このカラム本体２１の流入側端部および流出側端部に、それぞれ装着されるキャップ（蓋体）２２、２３とで構成されている。
【００３３】
カラム本体２１は、例えば円筒状の部材で構成されている。カラム本体２１を含めカラム２を構成する各部（各部材）の構成材料としては、例えば、各種ガラス材料、各種樹脂材料、各種金属材料、各種セラミックス材料等が挙げられる。
【００３４】
カラム本体２１には、その流入側開口および流出側開口を、それぞれ塞ぐようにフィルタ部材４、５を配置した状態で、その流入側端部および流出側端部に、それぞれキャップ２２、２３が螺合により装着される。
【００３５】
このような構成のカラム２では、カラム本体２１と各フィルタ部材４、５とにより、吸着剤充填空間２０が画成されている。そして、この吸着剤充填空間２０の少なくとも一部に（本実施形態では、ほぼ満量で）、吸着剤３が充填されている。
【００３６】
また、カラム本体２１に各キャップ２２、２３を装着した状態で、これらの間の液密性が確保されるように構成されている。
【００３７】
各キャップ２２、２３のほぼ中央には、それぞれ、流入管２４および流出管２５が液密に固着（固定）されている。この流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に、前記液体が供給される。また、吸着剤３に供給された液体は、吸着剤３同士の間（間隙）を通過して、フィルタ部材５および流出管２５を介して、カラム２外へ流出する。このとき、試料に含まれるヘムタンパク質は、吸着剤３に対する吸着性の差異に基づいて、吸着剤３に優先的に吸着し、試料中に含まれる他のタンパク質と分離することができる。
【００３８】
各フィルタ部材４、５は、それぞれ、吸着剤充填空間２０から吸着剤３が流出するのを防止する機能を有するものである。これらのフィルタ部材４、５は、それぞれ、例えば、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエーテルポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等の合成樹脂からなる不織布、発泡体（連通孔を有するスポンジ状多孔質体）、織布、メッシュ等で構成されている。
【００３９】
吸着剤３は、主としてその少なくとも表面付近が、下記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されている。
【００４０】
（Ｃａ１−ａＭａ）１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２ ・・・（Ｉ）
［ただし、組成式（Ｉ）中、Ｍは原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種を示し、Ｘはハロゲン元素のうちの少なくとも１種を示し、０＜ａ≦１、０≦ｂ≦１である。］
【００４１】
このアパタイトは、Ｃａの少なくとも一部がＭ、すなわち、原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種で置換されてなるものである。これにより、Ｍに対して高い親和性（高い結合力）で結合し得る部分と推察されるプロトポルフィリン骨格を有するヘムタンパク質が、特異的に吸着剤３に吸着するようになる。その結果、吸着剤３は、ヘムタンパク質以外の化合物と比較して、ヘムタンパク質に対して高い選択性を示すようになる。その結果、試料に含まれるヘムタンパク質を、他のタンパク質と効率良く分離することができる。
【００４２】
そして、この吸着剤３では、特に、吸着サイトとなるＭが、アパタイトの結晶構造中にＣａに置換して導入されている。したがって、Ｍが吸着剤３に強固に保持され、吸着剤３からの離脱が防止される。その結果、カラム２（吸着装置１）から流出する液体中へのＭ（またはそのイオン）の混入が防止されるとともに、吸着剤３の吸着能が長期間に亘って維持される。
【００４３】
原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素としては、Ｙｂ（イッテルビウム）およびＬｕ（ルテチウム）が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができるが、中でも、Ｌｕであるのが好ましい。原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素は、アパタイトが有するＣａと置換し易く、アパタイトの結晶格子内に効率よく導入される。さらに、Ｌｕは、ヘムタンパク質に対して、特に優れた親和性を有していることから、ヘムタンパク質をより優れた選択性をもって、吸着剤３に吸着させることができる。その結果、試料に含まれるヘムタンパク質を、他のタンパク質とより効率良く分離することができる。
【００４４】
なお、Ｃａを主にＬｕで置換する場合、その割合は、Ｍ全体に対し、７０％以上であるのが好ましく、８０％以上であるのがより好ましい。これにより、Ｌｕの特性（性質）がより顕著に発揮される。
【００４５】
また、前記組成式（Ｉ）中のａ、すなわち、Ｍの置換率は、できるだけ大きい方が好ましく、特に限定されるものではないが、０．５〜１程度であるのが好ましく、０．７〜１程度であるのがより好ましい。前記ａが小さ過ぎると、Ｍの種類等によっては、吸着剤３に、前述したヘムタンパク質の特異的吸着能を十分に付与することができないおそれがある。
【００４６】
さらに、前記組成式（Ｉ）に示すアパタイトは、水酸基が無置換のものであってもよいが、その少なくとも一部がハロゲン基（ハロゲン元素Ｘ）で置換されているのが好ましい。これにより、アパタイトを構成する各元素（イオン）の間の結合力が増大し、アパタイト（吸着剤３）の耐久性および耐溶剤性（特に耐酸性）を向上させることができる。
【００４７】
Ｘとしては、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ａｔのうちの１種または２種以上を適宜選択することができるが、これらの中でも、特に、Ｆを主とするものが好ましい。フッ化物イオンは、他のハロゲン化物イオンと比較して、電気陰性度が高いため、水酸基の少なくとも一部をフルオロ基で置換することにより、前記効果をより向上させることができる。
【００４８】
また、水酸基を主にＦで置換する場合、その割合は、Ｘ全体に対し、８０％以上であるのが好ましく、９０％以上であるのがより好ましい。これにより、Ｆの特性（性質）がより顕著に発揮される。
【００４９】
前記組成式（Ｉ）中のｂ、すなわち、Ｘの置換率も、できるだけ大きい方が好ましく、特に限定されるものではないが、０．３〜１程度であるのが好ましく、０．５〜１程度であるのがより好ましい。前記ｂが小さ過ぎると、Ｘの種類等によっては、吸着剤３の耐久性や耐溶剤性を十分に向上させることができないおそれがある。
【００５０】
ここで、ヘムタンパク質としては、プロトポルフィリン骨格を有するものであればよく、特に限定されないが、例えば、ミオグロビン（ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）、シトクロム−ａ、シトクロム−ｂ、シトクロム−ｃのようなシトクロム（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）、ヘモグロビンＡ１ｃのようなヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）およびペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）等が挙げられる。これらのヘムタンパク質は、Ｍとの間に配位結合を形成する。配位結合は、通常の吸着（電気的な結合）より強固なものとなるため、Ｃａの少なくとも一部をＭで置換したアパタイトで構成される吸着剤３を用いることにより、ヘムタンパク質を確実に吸着させ、他のタンパク質と相互に分離することができる。すなわち、ヘムタンパク質を含有する試料中から、ヘムタンパク質を精製すること（単離すること）ができる。
【００５１】
また、ヘムタンパク質は、上記のものの中でも、特に、ミオグロビンおよびシトクロム−ｃのうちの少なくとも１種であるのが好ましい。これらのヘムタンパク質は、原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素に対して、特に優れた親和性を有していることから、これらのヘムタンパク質をより優れた選択性をもって、吸着剤３に吸着させることができ、試料に含まれるこれらのヘムタンパク質と、他のタンパク質とを、より確実に分離することができる。
【００５２】
以上のような吸着剤３の形態（形状）は、図１に示すように、粒状（顆粒状）のものであるのが好ましいが、その他、例えばペレット状（小塊状）、ブロック状（例えば、隣接する空孔同士が互いに連通する多孔質体、ハニカム形状）等とすることもできる。吸着剤３を粒状とすることにより、その表面積を増大させることができ、ヘムタンパク質の吸着量をより増大させることができる。
【００５３】
粒状の吸着剤３の平均粒径は、特に限定されないが、０．５〜１５０μｍ程度であるのが好ましく、１〜４０μｍ程度であるのがより好ましい。このような平均粒径の吸着剤３を用いることにより、前記フィルタ部材５の目詰まりを確実に防止しつつ、吸着剤３の表面積を十分に確保することができる。
【００５４】
なお、吸着剤３は、その全体が前記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されたものであってもよく、その表面付近が前記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されたものであってもよい。
【００５５】
また、本実施形態のように、吸着剤３を吸着剤充填空間２０にほぼ満量充填する場合には、吸着剤３は、吸着剤充填空間２０の各部において、ほぼ同一の組成をなしているのが好ましい。これにより、吸着装置１は、ヘムタンパク質の分離（精製）能が特に優れたものとなる。
【００５６】
なお、吸着剤充填空間２０の一部（例えば流入管２４側の一部）に吸着剤３を充填し、その他の部分には他の吸着剤を充填するようにしてもよい。
【００５７】
このような吸着装置１は、各種方法により製造することができるが、例えば、次のＩまたはIIの方法を用いて製造することができる。
【００５８】
Ｉ：カラム２の吸着剤充填空間２０に、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２［ただし、０≦ｂ≦１である。］で表されるアパタイト粉体を充填した状態で、吸着剤充填空間２０に、原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種のイオンを含む溶液を通液する方法。
【００５９】
II：カラム２の吸着剤充填空間２０に、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２で表されるアパタイト粉体（ハイドロキシアパタイト粉体）を充填した状態で、吸着剤充填空間２０に、原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種のイオンを含む溶液（以下、「溶液Ａ」という。）と、少なくとも１種のハロゲン元素のイオンを含む溶液（以下、「溶液Ｂ」という。）とを、順次またはほぼ同時に通液する方法。
【００６０】
以上のＩまたはIIの方法によれば、容易かつ短時間で、前記アパタイト粉体の少なくとも表面付近の一部（好ましくは表面付近のほぼ全て）を、前記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトに転化させて、吸着剤３を得ることができる。つまり、ＩまたはIIの方法によれば、容易かつ短時間で、吸着装置１を製造することができる。
【００６１】
また、前述したように、吸着装置１では、吸着剤３は吸着剤充填空間２０にほぼ満量充填され、そのほぼ全てが同一の構成（好ましくは、吸着剤充填空間２０の各部において、ほぼ同一の組成）とされているのが好ましいが、前記ＩまたはIIの方法を用いることにより、吸着剤３の構成（組成）にバラツキが生じるのを防止することができるという利点もある。
【００６２】
このようなＩおよびIIの方法によれば、溶液Ａや溶液Ｂの条件（イオンの含有量、総通液量、通液速度）を適宜設定することにより、アパタイト粉体における原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素での置換率やハロゲン基での置換率を、所望のものにコントロールすることができる。
【００６３】
また、前記ＩおよびIIの方法において、各溶液Ａ、Ｂの通液方向は、任意である。すなわち、例えば、Ｉの方法において、所定量の溶液Ａを流入側から流出側に向かって吸着剤充填空間２０に通液した後、通液方向を変更し、所定量の溶液Ａを吸着剤充填空間２０に通液することができる。また、例えば、IIの方法において、所定量の溶液Ａを流入側から流出側に向かって吸着剤充填空間２０に通液した後、通液方向を変更し、所定量の溶液Ｂを吸着剤充填空間２０に通液することができる。さらに、このような通液操作を、複数回繰り返し行ってもよい。
【００６４】
なお、ＩまたはIIの方法の他、例えば、溶液Ａ中にＣａ１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２［ただし、０≦ｂ≦１である。］で表されるアパタイト粉体を浸漬した状態で攪拌し、その後、このアパタイト粉体をカラム２の吸着剤充填空間２０に充填する方法によっても吸着装置１を製造することができる。
【００６５】
＜ヘムタンパク質分離法＞
次に、上述したような吸着装置を用いた場合の本発明のヘムタンパク質分離法について説明する。
【００６６】
［１］ まず、試料として、ヘムタンパク質を含む複数種のタンパク質を緩衝液に溶解した溶液を用意する。
【００６７】
なお、試料（ヘムタンパク質を含有する溶液）としては、ヘムタンパク質を含有していればよく、例えば、上述したようなヘムタンパク質を緩衝液に溶解した溶液の他、例えば、血液、尿、リンパ液、髄液、細胞液等の体液等を緩衝液に溶解した溶液が挙げられる。
【００６８】
また、緩衝液には、例えば、リン酸緩衝液、ｇｏｏｄ ｂｕｆｆｅｒ、イミダゾール緩衝液等を用いることができる。
【００６９】
［２］ 次に、この試料を、流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に供給して、カラム２内を通過させて、吸着剤３に接触させる。
【００７０】
これにより、ヘムタンパク質以外の吸着剤３に吸着しない成分、または吸着能の低い成分（ヘムタンパク質以外のタンパク質）は、フィルタ部材５および流出管２５を介してカラム２内から流出する。そして、吸着剤３に対して吸着能が高いヘムタンパク質は、カラム２内に保持される。すなわち、吸着剤３にヘムタンパク質を優先的に吸着させることができる。
【００７１】
なお、試料中に含まれる緩衝液の種類によっては、ヘムタンパク質以外のタンパク質、すなわち吸着能の低いタンパク質であっても、カラム２内から流出することなく、吸着剤３に吸着する場合がある。この場合、本工程［２］では、ヘムタンパク質と、ヘムタンパク質以外のタンパク質とが、吸着剤３に吸着していることとなる。
【００７２】
［３］ 次に、流入管２４からカラム２内へ溶出液を供給し、カラム２の流出管２５から流出する溶出液を採取する。
【００７３】
ここで、ヘムタンパク質だけが吸着剤３に吸着している場合、吸着剤３に溶出液が接触すると、吸着剤３に吸着したヘムタンパク質は、吸着剤３から離脱して、溶出液中に混入し、流出管２５から流出する溶出液中に回収される。これにより、試料（ヘムタンパク質を含有する溶液）中から、ヘムタンパク質を分離することができる。
【００７４】
また、ヘムタンパク質と、ヘムタンパク質以外のタンパク質とが吸着剤３に吸着している場合、吸着剤３に溶出液が接触すると、吸着剤３に吸着しているタンパク質は、その吸着剤３に対する吸着能の差に基づいて、順次、吸着剤３から離脱する。
【００７５】
すなわち、ヘムタンパク質と、ヘムタンパク質以外のタンパク質とでは、上記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトに含まれる原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素に対して高い親和性で結合するヘムタンパク質の方が、吸着剤３に対して高い吸着を有している。そのため、吸着剤３に溶出液が接触すると、まず、ヘムタンパク質以外のタンパク質が吸着剤３から離脱し、続いて、ヘムタンパク質が吸着剤３から離脱する。
【００７６】
したがって、流出管２５から流出する溶出液中にも、ヘムタンパク質以外のタンパク質と、ヘムタンパク質とが、この順で混入している。そのため、ヘムタンパク質以外のタンパク質が混入している溶出液が流出管２５から流出した後に、流出管２５から流出する溶出液を分注する。これにより、主としてヘムタンパク質が混入している溶出液を回収することができる。これにより、試料中から、ヘムタンパク質を分離することができる。
【００７７】
ヘムタンパク質の溶出に用いる溶出液には、吸着剤３に吸着したタンパク質よりも吸着剤３に対する吸着能が高い物質（競合試薬）、キレート剤等を含有する緩衝液、リン酸緩衝液等の前記緩衝液より塩濃度の高い緩衝液、前記緩衝液よりｐＨの低い（ｐＨ４．５〜６程度）の緩衝液等を用いることができる。
【００７８】
また、溶出液は、溶質の濃度を経時的に変化させつつカラム２内へ供給（吸着剤充填空間２０に通液）するようにしてもよい。
【００７９】
以上、本発明のヘムタンパク質分離法およびヘムタンパク質吸着剤について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８０】
例えば、前記実施形態では、ヘムタンパク質を分離する吸着装置として、カラム中に粒状の吸着剤を充填したものを用いる場合について説明したが、このような場合に限定されず、例えば、吸着剤をフィルタ状に形成し、この吸着剤に試料を透過させるような構成の吸着装置を用いることができる。
【実施例】
【００８１】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．吸着装置の製造
（サンプルＮｏ．１）
−１− まず、カルシウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｃａ−ＨＡＰ）（粒子径４０μｍ、Ｔｙｐｅ−II、ペンタックス社製）を用意し、５０ｍＬファルコンチューブ内に、このＣａ−ＨＡＰ（４ｇ）を入れた。その後、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液（５０ｍＬ）を加えた。なお、カルシウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｃａ−ＨＡＰ）とは、Ｃａが他の金属元素で置換されていない、通常のハイドロキシアパタイトビーズを表す。
【００８２】
−２− 次に、ファルコンチューブの蓋を閉め、水溶液中にＣａ−ＨＡＰが均一に分散するように、手でファルコンチューブに振動を加えた後、ファルコンチューブをローテーター（「ＲＯＴＡＴＯＲ ＲＴ−５０」、ＴＡＩＴＥＣ社製）にセットし、毎秒半回転の速さで１０分間転倒混和した。これにより、Ｃａ−ＨＡＰが有するＣａをＹｂで置換したイッテルビウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｙｂ−ＨＡＰ）を得た。
【００８３】
−３− 次に、ファルコンチューブを、ローテーターから取り外した後、垂直な状態を保つことにより、Ｙｂ−ＨＡＰをファルコンチューブの底に沈降させた。そして、上澄液をアスピレーターを用いて取り除いた。その後、ファルコンチューブに超純水５０ｍＬを加え、蓋を閉めた状態で、手でファルコンチューブに振動を加えた。
【００８４】
以上のようにしてＹｂ−ＨＡＰを洗浄したが、この洗浄工程−３−を合計３回繰返して行った。
【００８５】
−４− 次に、ファルコンチューブに超純水５０ｍＬを加え、蓋を閉めた状態で、手でファルコンチューブに振動を加えた後、ファルコンチューブ内の水溶液を、２００ｍＬビーカー内に移し変えた。そして、Ｙｂ−ＨＡＰがビーカーの底に沈降した後、上澄液をアスピレーターを用いて取り除いた。
【００８６】
−５− 次に、ビーカーの口をアルミニウム箔で被った状態で、ビーカーを乾燥機（「Hot Air Sterilizer Azisai」、ＩＳＵＺＵ社製）内に入れて、２００℃×１時間の条件で加熱し、その後、乾燥機内が３０℃となるまで放置することにより、Ｙｂ−ＨＡＰを乾燥させた。
【００８７】
−６− 次に、Ｙｂ−ＨＡＰを、１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁させ、得られた懸濁液をカラム（内径４ｍｍ×長さ１００ｍｍ）の吸着剤充填空間に通液することにより、吸着剤充填空間に充填した。
【００８８】
以上のような工程を経て、サンプルＮｏ．１の吸着装置を製造した。
なお、吸着剤充填空間に充填されたＹｂ−ＨＡＰの量は、１ｇ（約１ｍｍｏｌ）であった。
【００８９】
また、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＹｂで置換されていることが確認された。
【００９０】
この元素分析法は、元素分析装置（島津製作所社製、「イオンクロマトＨＩＣ−ＳＰ」）を用いて行った。
【００９１】
（サンプルＮｏ．２）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの硝酸ルテチウムｎ水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ルテチウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｌｕ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【００９２】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＬｕで置換されていることが確認された。
【００９３】
（サンプルＮｏ．１’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの塩化ランタン七水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ランタンハイドロキシアパタイトビーズ（Ｌａ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【００９４】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＬａで置換されていることが確認された。
【００９５】
（サンプルＮｏ．２’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１０ｍＭの硝酸セリウム（III）六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、セリウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｃｅ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【００９６】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＣｅで置換されていることが確認された。
【００９７】
（サンプルＮｏ．３’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの硝酸プラセオジム（III）ｎ水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、プラセオジムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｐｒ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【００９８】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＰｒで置換されていることが確認された。
【００９９】
（サンプルＮｏ．４’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの硝酸ネオジム六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ネオジムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｎｄ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１００】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＮｄで置換されていることが確認された。
【０１０１】
（サンプルＮｏ．５’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの塩化サマリウム六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、サマリウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｓｍ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１０２】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＳｍで置換されていることが確認された。
【０１０３】
（サンプルＮｏ．６’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの塩化ユウロピウム（III）六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ユウロピウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｅｕ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１０４】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＥｕで置換されていることが確認された。
【０１０５】
（サンプルＮｏ．７’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１０ｍＭの硝酸ガドリニウム六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ガドリニウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｇｄ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１０６】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＧｄで置換されていることが確認された。
【０１０７】
（サンプルＮｏ．８’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１ｍＭの硝酸テルビウム（III）六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、テルビウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｔｂ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１０８】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＴｂで置換されていることが確認された。
【０１０９】
（サンプルＮｏ．９’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの塩化ジスプロシウム六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ジスプロシウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｄｙ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１１０】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＤｙで置換されていることが確認された。
【０１１１】
（サンプルＮｏ．１０’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの硝酸ホルミウムｎ水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ホルミウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｈｏ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１１２】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＨｏで置換されていることが確認された。
【０１１３】
（サンプルＮｏ．１１’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの硝酸エルビウム六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、エルビウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｅｒ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１１４】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＥｒで置換されていることが確認された。
【０１１５】
（サンプルＮｏ．１２’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの硝酸ツリウム（III）六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ツリウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｔｍ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１１６】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＴｍで置換されていることが確認された。
【０１１７】
（サンプルＮｏ．１３’）
前記工程−１−〜−５−を省略し、Ｃａのランタノイド系の金属元素による置換を行うことなく、Ｃａ−ＨＡＰを吸着剤充填空間に充填した以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、カルシウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｃａ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１１８】
２．吸着装置によるヘムタンパク質の分離
（実施例１）
以下に示すようにして、サンプルＮｏ．１の吸着装置を用いて、試料中に含まれるヘムタンパク質を分離した。
【０１１９】
まず、サンプルＮｏ.１の吸着装置のカラム内における液体を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に置換した。
【０１２０】
次に、ヘムタンパク質として、ミオグロビン（ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ：５ｍｇ／ｍＬ）およびシトクロム−ｃ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ−ｃ：５ｍｇ／ｍＬ）を、ヘムタンパク質以外のタンパク質として、α−キモトリプシノーゲンＡ（α−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎＡ：５ｍｇ／ｍＬ）およびオバルブミン（ｏｂａｌｂｕｍｉｎ：１０ｍｇ／ｍＬ）を含有し、それぞれの含有量が括弧内に示す濃度となるように、前記と同様のリン酸緩衝液に溶解した試料２ｍＬをカラム内に供給して、カラム内を通過させた。
【０１２１】
次に、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を流速１ｍＬ／ｍｉｎで２５分間、カラム内に供給して、カラム内から流出するリン酸緩衝液の波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定するとともに、このリン酸緩衝液を回収することにより、試料中に含まれるヘムタンパク質を分離した。
【０１２２】
なお、この際、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）は、１０ｍＭリン酸緩衝液に対する４００ｍＭリン酸緩衝液の混合率が、０〜１５分の間で０％〜７５％まで増加するようにし、１５分後からの１０分間では、４００ｍＭリン酸緩衝液の混合率が１００％となるように通液した。
【０１２３】
（実施例２）
サンプルＮｏ．１の吸着装置に代えて、サンプルＮｏ．２の吸着装置を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、試料中に含まれるヘムタンパク質を分離した。
【０１２４】
（比較例１〜１３）
サンプルＮｏ．１の吸着装置に代えて、それぞれ、サンプルＮｏ．１’〜１３’の吸着装置を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、試料中に含まれるヘムタンパク質を分離した。
【０１２５】
３．評価
各実施例および各比較例で測定された、カラム内から流出するリン酸緩衝液の波長２８０ｎｍにおける吸光度曲線を図２〜図１６に示す。
【０１２６】
ここで、図１６に示した比較例１３のように、Ｃａ−ＨＡＰが吸着剤充填空間に充填された吸着装置を用いて試料中のヘムタンパク質を分離すると、波長２８０ｎｍにおける吸光度曲線には、１．５分付近に第１のピーク、６．５分付近に第２のピーク、８．５分付近に第３のピーク、さらに１２分付近に第４のピークが認められた。
【０１２７】
これに対して、Ｃａ−ＨＡＰに含まれるＣａをランタノイド系の金属元素で置換すると、図４〜図１１に示した比較例１〜比較例８のように、ランタノイド系の金属元素の原子量が大きくなるにしたがって、第２のピークと第３のピークとが徐々に接近する傾向を示した。
【０１２８】
そして、さらに原子量が大きいランタノイド系の金属元素でＣａを置換すると、図１、図２および図１２〜図１５に示した比較例９〜比較例１２、実施例１および実施例２のように、第２のピークと第３のピークとにより１つのピークが形成され、特に、実施例１および実施例２では、この１つのピークが吸光度曲線の右側でブロードする傾向を示した。
【０１２９】
そこで、各ピークで溶出しているタンパク質の種類を同定することを目的に、ミオグロビン（５ｍｇ／ｍＬ）、シトクロム−ｃ（５ｍｇ／ｍＬ）、α−キモトリプシノーゲンＡ（５ｍｇ／ｍＬ）およびオバルブミン（１０ｍｇ／ｍＬ）を、それぞれ単独で、前記と同様のリン酸緩衝液に溶解した試料２ｍＬを用意した。そして、前記実施例１で各タンパク質が混合している試料を通液したのと同様の条件で、サンプルＮｏ．１、２および１０’〜１３’の吸着装置を代表として、各タンパク質が単独で溶解している試料を、それぞれ、各吸着装置内を通液させた。
【０１３０】
その結果を、図１７〜図２２に示す。
なお、図１７〜図２２に示すクロマトグラムは、各タンパク質を含有する試料を通液した際に測定された吸光度曲線を、各サンプルＮｏ．の吸着装置毎に、重ね合わせたものである。
【０１３１】
ここで、図２２に示す、サンプルＮｏ．１３’（Ｃａ−ＨＡＰ）の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線（クロマトグラム）から明らかなように、第１のピークはオバルブミンに由来するピークであり、第２のピークはミオグロビンに由来するピークであり、第３のピークはα−キモトリプシノーゲンＡに由来するピークであり、さらに第４のピークはシトクロム−ｃに由来するピークであることが分った。
【０１３２】
また、図１９に示すサンプルＮｏ．１０’（Ｈｏ−ＨＡＰ）、図２０に示すサンプルＮｏ．１１’（Ｅｒ−ＨＡＰ）、図２１に示すサンプルＮｏ．１２’（Ｔｍ−ＨＡＰ）の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線では、いずれも第２のピーク（ミオグロビン）と第３のピーク（α−キモトリプシノーゲンＡ）とが重なり合っている。
【０１３３】
ところが、図１７に示すサンプルＮｏ．１（Ｙｂ−ＨＡＰ）、図１８に示すサンプルＮｏ．２（Ｌｕ−ＨＡＰ）の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線では、第２のピーク（ミオグロビン）と第３のピーク（α−キモトリプシノーゲンＡ）とは完全には重なり合わず、第２のピークと第３のピークとが逆転して、第３のピーク（α−キモトリプシノーゲンＡ）が認められた後に、第２のピーク（ミオグロビン）が認められる傾向を示した。
【０１３４】
すなわち、Ｃａが原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素で置換されていることに起因して、ヘムタンパク質が吸着剤に優先的に吸着され、ヘムタンパク質の溶出が遅くなる傾向を示した。
【０１３５】
そのため、サンプルＮｏ．１およびサンプルＮｏ．２の吸着装置を用いて各タンパク質が混合した試料を分離した実施例１および実施例２では、第３のピークがほぼ消失した後に、各吸着装置から溶出するリン酸緩衝液を回収することにより、ヘムタンパク質（ミオグロビンおよびシトクロム−ｃの混合物）を分離し得ることが分った。
【０１３６】
より具体的には、実施例１では１３分後から溶出するリン酸緩衝液を、実施例２では１３．５分後から溶出するリン酸緩衝液を回収すれば、ヘムタンパク質を分離し得ることが分った。
【０１３７】
以上のことから、Ｃａが原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素で置換されているカルシウムハイドロキシアパタイトビーズ（吸着剤）を備える吸着装置を用いることにより、複数のタンパク質が混合している試料中から、ヘムタンパク質を選択的に分離し得ることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】本発明の吸着装置の実施形態を示す縦断面図である。
【図２】実施例１でサンプルＮｏ．１の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図３】実施例２でサンプルＮｏ．２の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図４】比較例１でサンプルＮｏ．１’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図５】比較例２でサンプルＮｏ．２’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図６】比較例３でサンプルＮｏ．３’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図７】比較例４でサンプルＮｏ．４’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図８】比較例５でサンプルＮｏ．５’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図９】比較例６でサンプルＮｏ．６’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１０】比較例７でサンプルＮｏ．７’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１１】比較例８でサンプルＮｏ．８’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１２】比較例９でサンプルＮｏ．９’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１３】比較例１０でサンプルＮｏ．１０’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１４】比較例１１でサンプルＮｏ．１１’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１５】比較例１２でサンプルＮｏ．１２’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１６】比較例１３でサンプルＮｏ．１３’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１７】サンプルＮｏ．１の吸着装置に、各タンパク質を含有する試料をそれぞれ単独で通液した際に測定された吸光度曲線を、重ね合わせたものである。
【図１８】サンプルＮｏ．２の吸着装置に、各タンパク質を含有する試料をそれぞれ単独で通液した際に測定された吸光度曲線を、重ね合わせたものである。
【図１９】サンプルＮｏ．１０’の吸着装置に、各タンパク質を含有する試料をそれぞれ単独で通液した際に測定された吸光度曲線を、重ね合わせたものである。
【図２０】サンプルＮｏ．１１’の吸着装置に、各タンパク質を含有する試料をそれぞれ単独で通液した際に測定された吸光度曲線を、重ね合わせたものである。
【図２１】サンプルＮｏ．１２’の吸着装置に、各タンパク質を含有する試料をそれぞれ単独で通液した際に測定された吸光度曲線を、重ね合わせたものである。
【図２２】サンプルＮｏ．１３’の吸着装置に、各タンパク質を含有する試料をそれぞれ単独で通液した際に測定された吸光度曲線を、重ね合わせたものである。
【符号の説明】
【０１３９】
１ 吸着装置
２ カラム
２０ 吸着剤充填空間
２１ カラム本体
２２、２３ キャップ
２４ 流入管
２５ 流出管
３ 吸着剤
４、５ フィルタ部材
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘムタンパク質分離法およびヘムタンパク質吸着剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロキシアパタイトは、生体親和性に優れることから、従来から、液体クロマトグラフィー用カラム（吸着装置）に使用する吸着剤として広く利用され、この液体クロマトグラフィー用カラムにタンパク質等を含有する溶液を通液することにより、目的とするタンパク質を選択的に吸着・分離するタンパク質の分離法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
ところで、近年、例えば、糖尿病の診断をする際の指標として、ヘムタンパク質の１種であるヘモグロビンＡ１ｃが用いられ、このヘモグロビンＡ１ｃを効率良く分離し得るヘムタンパク質の分離法が求められている。しかしながら、現在のところ、ヘムタンパク質を効率良く分離し得るヘムタンパク質の分離法は認められていない。
【０００４】
【特許文献１】特許第３４３５２６５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ヘムタンパク質を、このヘムタンパク質を含有する溶液中から、選択的に分離することができるヘムタンパク質分離法およびヘムタンパク質吸着剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような目的は、下記の（１）〜（９）の本発明により達成される。
（１） ヘムタンパク質を含有する溶液中から、当該ヘムタンパク質を分離するヘムタンパク質分離法であって、
少なくとも表面付近が、主として下記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されている吸着剤に、前記溶液を接触させることにより、前記ヘムタンパク質を優先的に吸着させて、前記溶液から分離することを特徴とするヘムタンパク質分離法。
（Ｃａ１−ａＭａ）１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２ ・・・（Ｉ）
［ただし、組成式（Ｉ）中、Ｍは原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種を示し、Ｘはハロゲン元素のうちの少なくとも１種を示し、０＜ａ≦１、０≦ｂ≦１である。］
【０００７】
これにより、Ｍに対して高い親和性（高い結合力）で結合し得る部分と推察されるプロトポルフィリン骨格を有するヘムタンパク質が、特異的に吸着剤に吸着するようになる。その結果、吸着剤は、ヘムタンパク質以外の化合物と比較して、ヘムタンパク質に対して高い選択性を示すようになる。その結果、ヘムタンパク質を含有する溶液中から、ヘムタンパク質を分離することができる。
【０００８】
（２） 前記ヘムタンパク質は、ミオグロビンおよびシトクロム−ｃのうちの少なくとも１種である上記（１）に記載のヘムタンパク質分離法。
【０００９】
これらのヘムタンパク質は、原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素に対して、特に優れた親和性を有している。そのため、これらのヘムタンパク質をより優れた選択性をもって、吸着剤に吸着させることができ、試料に含まれるこれらのヘムタンパク質と、他のタンパク質とを、より確実に分離することができる。
【００１０】
（３） 前記ランタノイド系の金属元素は、Ｌｕである上記（１）または（２）に記載のヘムタンパク質分離法。
【００１１】
Ｌｕは、ヘムタンパク質に対して、特に優れた親和性を有していることから、ヘムタンパク質をより優れた選択性をもって、吸着剤に吸着させることができる。その結果、試料に含まれるヘムタンパク質を、他のタンパク質と確実に分離することができる。
【００１２】
（４） 前記組成式（Ｉ）中の前記ａは、０．５〜１である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【００１３】
かかる範囲内に設定することにより、ヘムタンパク質の特異的吸着能を吸着剤に十分に付与することができる。
【００１４】
（５） 前記組成式（Ｉ）中の前記Ｘは、Ｆを主とするハロゲン元素である上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【００１５】
これにより、アパタイトを構成する各元素（イオン）の間の結合力が増大し、アパタイトの耐久性および耐溶剤性（特に耐酸性）を向上させることができる。
【００１６】
（６） 前記Ｘは、Ｆを含み、その割合が前記Ｘ全体に対し８０％以上である上記（１）ないし（５）のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【００１７】
これにより、Ｆの特性（性質）がより顕著に発揮され、アパタイト（吸着剤）の耐久性および耐溶剤性（特に耐酸性）をより向上させることができる。
【００１８】
（７） 前記組成式（Ｉ）中の前記ｂは、０．３〜１である上記（１）ないし（６）のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【００１９】
ｂが小さ過ぎると、Ｘの種類等によっては、アパタイト（吸着剤）の耐久性や耐溶剤性を十分に向上させることができないおそれがある。
【００２０】
（８） 前記吸着剤は、粒状をなしている上記（１）ないし（７）のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【００２１】
吸着剤を粒状とすることにより、その表面積を増大させることができ、ヘムタンパク質の吸着量をより増大させることができる。
【００２２】
（９） 吸着剤充填空間を有するカラムと、前記吸着剤充填空間の少なくとも一部に充填された前記吸着剤とを有する吸着装置を用い、前記吸着剤充填空間に前記溶液を通液することにより、前記ヘムタンパク質を前記溶液から分離する上記（１）ないし（８）のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【００２３】
かかる吸着装置を用い、前記溶液をこの吸着装置に通液することにより、ヘムタンパク質を確実に溶液中から分離することができる。
【００２４】
（１０） ヘムタンパク質を含有する溶液中から、当該ヘムタンパク質を分離するヘムタンパク質吸着剤であって、
少なくとも表面付近が、主として下記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されており、前記溶液を接触させることにより、前記ヘムタンパク質を優先的に吸着して、前記溶液から分離することを特徴とするヘムタンパク質吸着剤。
（Ｃａ１−ａＭａ）１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２ ・・・（Ｉ）
［ただし、組成式（Ｉ）中、Ｍは原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種を示し、Ｘはハロゲン元素のうちの少なくとも１種を示し、０＜ａ≦１、０≦ｂ≦１である。］
【００２５】
これにより、Ｍに対して高い親和性（高い結合力）で結合し得る部分と推察されるプロトポルフィリン骨格を有するヘムタンパク質が、特異的に吸着剤に吸着するようになる。その結果、吸着剤は、ヘムタンパク質以外の化合物と比較して、ヘムタンパク質に対して高い選択性を示すようになる。その結果、ヘムタンパク質を含有する溶液中から、ヘムタンパク質を分離し得るヘムタンパク質吸着剤とすることができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のヘムタンパク質分離法によれば、目的物質であるヘムタンパク質を、高い選択性をもって吸着剤に吸着させることができるため、ヘムタンパク質を含有する溶液から、ヘムタンパク質を効率的に分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明のヘムタンパク質分離法およびヘムタンパク質吸着剤の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２８】
＜吸着装置＞
まず、本発明のヘムタンパク質分離法について説明するのに先立って、本発明のヘムタンパク質吸着剤を備える吸着装置の一例について説明する。
【００２９】
図１は、本発明の吸着剤を備える吸着装置の実施形態を示す縦断面図である。なお、以下の説明では、図１中の上側を「流入側」、下側を「流出側」と言う。
【００３０】
ここで、流入側とは、目的とするヘムタンパク質を分離（精製）する際に、例えば、試料（ヘムタンパク質を含有する溶液）、溶出液等の液体を、吸着装置に供給する側のことを言い、一方、流出側とは、前記流入側と反対側、すなわち、前記液体が吸着装置から流出する側のことを言う。
【００３１】
図１に示す吸着装置１は、カラム２と、粒状の吸着剤３と、２枚のフィルタ部材４、５とを有している。
【００３２】
カラム２は、カラム本体２１と、このカラム本体２１の流入側端部および流出側端部に、それぞれ装着されるキャップ（蓋体）２２、２３とで構成されている。
【００３３】
カラム本体２１は、例えば円筒状の部材で構成されている。カラム本体２１を含めカラム２を構成する各部（各部材）の構成材料としては、例えば、各種ガラス材料、各種樹脂材料、各種金属材料、各種セラミックス材料等が挙げられる。
【００３４】
カラム本体２１には、その流入側開口および流出側開口を、それぞれ塞ぐようにフィルタ部材４、５を配置した状態で、その流入側端部および流出側端部に、それぞれキャップ２２、２３が螺合により装着される。
【００３５】
このような構成のカラム２では、カラム本体２１と各フィルタ部材４、５とにより、吸着剤充填空間２０が画成されている。そして、この吸着剤充填空間２０の少なくとも一部に（本実施形態では、ほぼ満量で）、吸着剤３が充填されている。
【００３６】
また、カラム本体２１に各キャップ２２、２３を装着した状態で、これらの間の液密性が確保されるように構成されている。
【００３７】
各キャップ２２、２３のほぼ中央には、それぞれ、流入管２４および流出管２５が液密に固着（固定）されている。この流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に、前記液体が供給される。また、吸着剤３に供給された液体は、吸着剤３同士の間（間隙）を通過して、フィルタ部材５および流出管２５を介して、カラム２外へ流出する。このとき、試料に含まれるヘムタンパク質は、吸着剤３に対する吸着性の差異に基づいて、吸着剤３に優先的に吸着し、試料中に含まれる他のタンパク質と分離することができる。
【００３８】
各フィルタ部材４、５は、それぞれ、吸着剤充填空間２０から吸着剤３が流出するのを防止する機能を有するものである。これらのフィルタ部材４、５は、それぞれ、例えば、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエーテルポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等の合成樹脂からなる不織布、発泡体（連通孔を有するスポンジ状多孔質体）、織布、メッシュ等で構成されている。
【００３９】
吸着剤３は、主としてその少なくとも表面付近が、下記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されている。
【００４０】
（Ｃａ１−ａＭａ）１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２ ・・・（Ｉ）
［ただし、組成式（Ｉ）中、Ｍは原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種を示し、Ｘはハロゲン元素のうちの少なくとも１種を示し、０＜ａ≦１、０≦ｂ≦１である。］
【００４１】
このアパタイトは、Ｃａの少なくとも一部がＭ、すなわち、原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種で置換されてなるものである。これにより、Ｍに対して高い親和性（高い結合力）で結合し得る部分と推察されるプロトポルフィリン骨格を有するヘムタンパク質が、特異的に吸着剤３に吸着するようになる。その結果、吸着剤３は、ヘムタンパク質以外の化合物と比較して、ヘムタンパク質に対して高い選択性を示すようになる。その結果、試料に含まれるヘムタンパク質を、他のタンパク質と効率良く分離することができる。
【００４２】
そして、この吸着剤３では、特に、吸着サイトとなるＭが、アパタイトの結晶構造中にＣａに置換して導入されている。したがって、Ｍが吸着剤３に強固に保持され、吸着剤３からの離脱が防止される。その結果、カラム２（吸着装置１）から流出する液体中へのＭ（またはそのイオン）の混入が防止されるとともに、吸着剤３の吸着能が長期間に亘って維持される。
【００４３】
原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素としては、Ｙｂ（イッテルビウム）およびＬｕ（ルテチウム）が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができるが、中でも、Ｌｕであるのが好ましい。原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素は、アパタイトが有するＣａと置換し易く、アパタイトの結晶格子内に効率よく導入される。さらに、Ｌｕは、ヘムタンパク質に対して、特に優れた親和性を有していることから、ヘムタンパク質をより優れた選択性をもって、吸着剤３に吸着させることができる。その結果、試料に含まれるヘムタンパク質を、他のタンパク質とより効率良く分離することができる。
【００４４】
なお、Ｃａを主にＬｕで置換する場合、その割合は、Ｍ全体に対し、７０％以上であるのが好ましく、８０％以上であるのがより好ましい。これにより、Ｌｕの特性（性質）がより顕著に発揮される。
【００４５】
また、前記組成式（Ｉ）中のａ、すなわち、Ｍの置換率は、できるだけ大きい方が好ましく、特に限定されるものではないが、０．５〜１程度であるのが好ましく、０．７〜１程度であるのがより好ましい。前記ａが小さ過ぎると、Ｍの種類等によっては、吸着剤３に、前述したヘムタンパク質の特異的吸着能を十分に付与することができないおそれがある。
【００４６】
さらに、前記組成式（Ｉ）に示すアパタイトは、水酸基が無置換のものであってもよいが、その少なくとも一部がハロゲン基（ハロゲン元素Ｘ）で置換されているのが好ましい。これにより、アパタイトを構成する各元素（イオン）の間の結合力が増大し、アパタイト（吸着剤３）の耐久性および耐溶剤性（特に耐酸性）を向上させることができる。
【００４７】
Ｘとしては、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ａｔのうちの１種または２種以上を適宜選択することができるが、これらの中でも、特に、Ｆを主とするものが好ましい。フッ化物イオンは、他のハロゲン化物イオンと比較して、電気陰性度が高いため、水酸基の少なくとも一部をフルオロ基で置換することにより、前記効果をより向上させることができる。
【００４８】
また、水酸基を主にＦで置換する場合、その割合は、Ｘ全体に対し、８０％以上であるのが好ましく、９０％以上であるのがより好ましい。これにより、Ｆの特性（性質）がより顕著に発揮される。
【００４９】
前記組成式（Ｉ）中のｂ、すなわち、Ｘの置換率も、できるだけ大きい方が好ましく、特に限定されるものではないが、０．３〜１程度であるのが好ましく、０．５〜１程度であるのがより好ましい。前記ｂが小さ過ぎると、Ｘの種類等によっては、吸着剤３の耐久性や耐溶剤性を十分に向上させることができないおそれがある。
【００５０】
ここで、ヘムタンパク質としては、プロトポルフィリン骨格を有するものであればよく、特に限定されないが、例えば、ミオグロビン（ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）、シトクロム−ａ、シトクロム−ｂ、シトクロム−ｃのようなシトクロム（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）、ヘモグロビンＡ１ｃのようなヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）およびペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）等が挙げられる。これらのヘムタンパク質は、Ｍとの間に配位結合を形成する。配位結合は、通常の吸着（電気的な結合）より強固なものとなるため、Ｃａの少なくとも一部をＭで置換したアパタイトで構成される吸着剤３を用いることにより、ヘムタンパク質を確実に吸着させ、他のタンパク質と相互に分離することができる。すなわち、ヘムタンパク質を含有する試料中から、ヘムタンパク質を精製すること（単離すること）ができる。
【００５１】
また、ヘムタンパク質は、上記のものの中でも、特に、ミオグロビンおよびシトクロム−ｃのうちの少なくとも１種であるのが好ましい。これらのヘムタンパク質は、原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素に対して、特に優れた親和性を有していることから、これらのヘムタンパク質をより優れた選択性をもって、吸着剤３に吸着させることができ、試料に含まれるこれらのヘムタンパク質と、他のタンパク質とを、より確実に分離することができる。
【００５２】
以上のような吸着剤３の形態（形状）は、図１に示すように、粒状（顆粒状）のものであるのが好ましいが、その他、例えばペレット状（小塊状）、ブロック状（例えば、隣接する空孔同士が互いに連通する多孔質体、ハニカム形状）等とすることもできる。吸着剤３を粒状とすることにより、その表面積を増大させることができ、ヘムタンパク質の吸着量をより増大させることができる。
【００５３】
粒状の吸着剤３の平均粒径は、特に限定されないが、０．５〜１５０μｍ程度であるのが好ましく、１〜４０μｍ程度であるのがより好ましい。このような平均粒径の吸着剤３を用いることにより、前記フィルタ部材５の目詰まりを確実に防止しつつ、吸着剤３の表面積を十分に確保することができる。
【００５４】
なお、吸着剤３は、その全体が前記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されたものであってもよく、その表面付近が前記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されたものであってもよい。
【００５５】
また、本実施形態のように、吸着剤３を吸着剤充填空間２０にほぼ満量充填する場合には、吸着剤３は、吸着剤充填空間２０の各部において、ほぼ同一の組成をなしているのが好ましい。これにより、吸着装置１は、ヘムタンパク質の分離（精製）能が特に優れたものとなる。
【００５６】
なお、吸着剤充填空間２０の一部（例えば流入管２４側の一部）に吸着剤３を充填し、その他の部分には他の吸着剤を充填するようにしてもよい。
【００５７】
このような吸着装置１は、各種方法により製造することができるが、例えば、次のＩまたはIIの方法を用いて製造することができる。
【００５８】
Ｉ：カラム２の吸着剤充填空間２０に、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２［ただし、０≦ｂ≦１である。］で表されるアパタイト粉体を充填した状態で、吸着剤充填空間２０に、原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種のイオンを含む溶液を通液する方法。
【００５９】
II：カラム２の吸着剤充填空間２０に、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２で表されるアパタイト粉体（ハイドロキシアパタイト粉体）を充填した状態で、吸着剤充填空間２０に、原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種のイオンを含む溶液（以下、「溶液Ａ」という。）と、少なくとも１種のハロゲン元素のイオンを含む溶液（以下、「溶液Ｂ」という。）とを、順次またはほぼ同時に通液する方法。
【００６０】
以上のＩまたはIIの方法によれば、容易かつ短時間で、前記アパタイト粉体の少なくとも表面付近の一部（好ましくは表面付近のほぼ全て）を、前記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトに転化させて、吸着剤３を得ることができる。つまり、ＩまたはIIの方法によれば、容易かつ短時間で、吸着装置１を製造することができる。
【００６１】
また、前述したように、吸着装置１では、吸着剤３は吸着剤充填空間２０にほぼ満量充填され、そのほぼ全てが同一の構成（好ましくは、吸着剤充填空間２０の各部において、ほぼ同一の組成）とされているのが好ましいが、前記ＩまたはIIの方法を用いることにより、吸着剤３の構成（組成）にバラツキが生じるのを防止することができるという利点もある。
【００６２】
このようなＩおよびIIの方法によれば、溶液Ａや溶液Ｂの条件（イオンの含有量、総通液量、通液速度）を適宜設定することにより、アパタイト粉体における原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素での置換率やハロゲン基での置換率を、所望のものにコントロールすることができる。
【００６３】
また、前記ＩおよびIIの方法において、各溶液Ａ、Ｂの通液方向は、任意である。すなわち、例えば、Ｉの方法において、所定量の溶液Ａを流入側から流出側に向かって吸着剤充填空間２０に通液した後、通液方向を変更し、所定量の溶液Ａを吸着剤充填空間２０に通液することができる。また、例えば、IIの方法において、所定量の溶液Ａを流入側から流出側に向かって吸着剤充填空間２０に通液した後、通液方向を変更し、所定量の溶液Ｂを吸着剤充填空間２０に通液することができる。さらに、このような通液操作を、複数回繰り返し行ってもよい。
【００６４】
なお、ＩまたはIIの方法の他、例えば、溶液Ａ中にＣａ１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２［ただし、０≦ｂ≦１である。］で表されるアパタイト粉体を浸漬した状態で攪拌し、その後、このアパタイト粉体をカラム２の吸着剤充填空間２０に充填する方法によっても吸着装置１を製造することができる。
【００６５】
＜ヘムタンパク質分離法＞
次に、上述したような吸着装置を用いた場合の本発明のヘムタンパク質分離法について説明する。
【００６６】
［１］ まず、試料として、ヘムタンパク質を含む複数種のタンパク質を緩衝液に溶解した溶液を用意する。
【００６７】
なお、試料（ヘムタンパク質を含有する溶液）としては、ヘムタンパク質を含有していればよく、例えば、上述したようなヘムタンパク質を緩衝液に溶解した溶液の他、例えば、血液、尿、リンパ液、髄液、細胞液等の体液等を緩衝液に溶解した溶液が挙げられる。
【００６８】
また、緩衝液には、例えば、リン酸緩衝液、ｇｏｏｄ ｂｕｆｆｅｒ、イミダゾール緩衝液等を用いることができる。
【００６９】
［２］ 次に、この試料を、流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に供給して、カラム２内を通過させて、吸着剤３に接触させる。
【００７０】
これにより、ヘムタンパク質以外の吸着剤３に吸着しない成分、または吸着能の低い成分（ヘムタンパク質以外のタンパク質）は、フィルタ部材５および流出管２５を介してカラム２内から流出する。そして、吸着剤３に対して吸着能が高いヘムタンパク質は、カラム２内に保持される。すなわち、吸着剤３にヘムタンパク質を優先的に吸着させることができる。
【００７１】
なお、試料中に含まれる緩衝液の種類によっては、ヘムタンパク質以外のタンパク質、すなわち吸着能の低いタンパク質であっても、カラム２内から流出することなく、吸着剤３に吸着する場合がある。この場合、本工程［２］では、ヘムタンパク質と、ヘムタンパク質以外のタンパク質とが、吸着剤３に吸着していることとなる。
【００７２】
［３］ 次に、流入管２４からカラム２内へ溶出液を供給し、カラム２の流出管２５から流出する溶出液を採取する。
【００７３】
ここで、ヘムタンパク質だけが吸着剤３に吸着している場合、吸着剤３に溶出液が接触すると、吸着剤３に吸着したヘムタンパク質は、吸着剤３から離脱して、溶出液中に混入し、流出管２５から流出する溶出液中に回収される。これにより、試料（ヘムタンパク質を含有する溶液）中から、ヘムタンパク質を分離することができる。
【００７４】
また、ヘムタンパク質と、ヘムタンパク質以外のタンパク質とが吸着剤３に吸着している場合、吸着剤３に溶出液が接触すると、吸着剤３に吸着しているタンパク質は、その吸着剤３に対する吸着能の差に基づいて、順次、吸着剤３から離脱する。
【００７５】
すなわち、ヘムタンパク質と、ヘムタンパク質以外のタンパク質とでは、上記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトに含まれる原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素に対して高い親和性で結合するヘムタンパク質の方が、吸着剤３に対して高い吸着を有している。そのため、吸着剤３に溶出液が接触すると、まず、ヘムタンパク質以外のタンパク質が吸着剤３から離脱し、続いて、ヘムタンパク質が吸着剤３から離脱する。
【００７６】
したがって、流出管２５から流出する溶出液中にも、ヘムタンパク質以外のタンパク質と、ヘムタンパク質とが、この順で混入している。そのため、ヘムタンパク質以外のタンパク質が混入している溶出液が流出管２５から流出した後に、流出管２５から流出する溶出液を分注する。これにより、主としてヘムタンパク質が混入している溶出液を回収することができる。これにより、試料中から、ヘムタンパク質を分離することができる。
【００７７】
ヘムタンパク質の溶出に用いる溶出液には、吸着剤３に吸着したタンパク質よりも吸着剤３に対する吸着能が高い物質（競合試薬）、キレート剤等を含有する緩衝液、リン酸緩衝液等の前記緩衝液より塩濃度の高い緩衝液、前記緩衝液よりｐＨの低い（ｐＨ４．５〜６程度）の緩衝液等を用いることができる。
【００７８】
また、溶出液は、溶質の濃度を経時的に変化させつつカラム２内へ供給（吸着剤充填空間２０に通液）するようにしてもよい。
【００７９】
以上、本発明のヘムタンパク質分離法およびヘムタンパク質吸着剤について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８０】
例えば、前記実施形態では、ヘムタンパク質を分離する吸着装置として、カラム中に粒状の吸着剤を充填したものを用いる場合について説明したが、このような場合に限定されず、例えば、吸着剤をフィルタ状に形成し、この吸着剤に試料を透過させるような構成の吸着装置を用いることができる。
【実施例】
【００８１】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．吸着装置の製造
（サンプルＮｏ．１）
−１− まず、カルシウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｃａ−ＨＡＰ）（粒子径４０μｍ、Ｔｙｐｅ−II、ペンタックス社製）を用意し、５０ｍＬファルコンチューブ内に、このＣａ−ＨＡＰ（４ｇ）を入れた。その後、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液（５０ｍＬ）を加えた。なお、カルシウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｃａ−ＨＡＰ）とは、Ｃａが他の金属元素で置換されていない、通常のハイドロキシアパタイトビーズを表す。
【００８２】
−２− 次に、ファルコンチューブの蓋を閉め、水溶液中にＣａ−ＨＡＰが均一に分散するように、手でファルコンチューブに振動を加えた後、ファルコンチューブをローテーター（「ＲＯＴＡＴＯＲ ＲＴ−５０」、ＴＡＩＴＥＣ社製）にセットし、毎秒半回転の速さで１０分間転倒混和した。これにより、Ｃａ−ＨＡＰが有するＣａをＹｂで置換したイッテルビウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｙｂ−ＨＡＰ）を得た。
【００８３】
−３− 次に、ファルコンチューブを、ローテーターから取り外した後、垂直な状態を保つことにより、Ｙｂ−ＨＡＰをファルコンチューブの底に沈降させた。そして、上澄液をアスピレーターを用いて取り除いた。その後、ファルコンチューブに超純水５０ｍＬを加え、蓋を閉めた状態で、手でファルコンチューブに振動を加えた。
【００８４】
以上のようにしてＹｂ−ＨＡＰを洗浄したが、この洗浄工程−３−を合計３回繰返して行った。
【００８５】
−４− 次に、ファルコンチューブに超純水５０ｍＬを加え、蓋を閉めた状態で、手でファルコンチューブに振動を加えた後、ファルコンチューブ内の水溶液を、２００ｍＬビーカー内に移し変えた。そして、Ｙｂ−ＨＡＰがビーカーの底に沈降した後、上澄液をアスピレーターを用いて取り除いた。
【００８６】
−５− 次に、ビーカーの口をアルミニウム箔で被った状態で、ビーカーを乾燥機（「Hot Air Sterilizer Azisai」、ＩＳＵＺＵ社製）内に入れて、２００℃×１時間の条件で加熱し、その後、乾燥機内が３０℃となるまで放置することにより、Ｙｂ−ＨＡＰを乾燥させた。
【００８７】
−６− 次に、Ｙｂ−ＨＡＰを、１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁させ、得られた懸濁液をカラム（内径４ｍｍ×長さ１００ｍｍ）の吸着剤充填空間に通液することにより、吸着剤充填空間に充填した。
【００８８】
以上のような工程を経て、サンプルＮｏ．１の吸着装置を製造した。
なお、吸着剤充填空間に充填されたＹｂ−ＨＡＰの量は、１ｇ（約１ｍｍｏｌ）であった。
【００８９】
また、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＹｂで置換されていることが確認された。
【００９０】
この元素分析法は、元素分析装置（島津製作所社製、「イオンクロマトＨＩＣ−ＳＰ」）を用いて行った。
【００９１】
（サンプルＮｏ．２）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの硝酸ルテチウムｎ水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ルテチウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｌｕ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【００９２】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＬｕで置換されていることが確認された。
【００９３】
（サンプルＮｏ．１’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの塩化ランタン七水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ランタンハイドロキシアパタイトビーズ（Ｌａ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【００９４】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＬａで置換されていることが確認された。
【００９５】
（サンプルＮｏ．２’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１０ｍＭの硝酸セリウム（III）六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、セリウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｃｅ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【００９６】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＣｅで置換されていることが確認された。
【００９７】
（サンプルＮｏ．３’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの硝酸プラセオジム（III）ｎ水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、プラセオジムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｐｒ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【００９８】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＰｒで置換されていることが確認された。
【００９９】
（サンプルＮｏ．４’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの硝酸ネオジム六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ネオジムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｎｄ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１００】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＮｄで置換されていることが確認された。
【０１０１】
（サンプルＮｏ．５’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの塩化サマリウム六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、サマリウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｓｍ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１０２】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＳｍで置換されていることが確認された。
【０１０３】
（サンプルＮｏ．６’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの塩化ユウロピウム（III）六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ユウロピウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｅｕ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１０４】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＥｕで置換されていることが確認された。
【０１０５】
（サンプルＮｏ．７’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１０ｍＭの硝酸ガドリニウム六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ガドリニウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｇｄ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１０６】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＧｄで置換されていることが確認された。
【０１０７】
（サンプルＮｏ．８’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１ｍＭの硝酸テルビウム（III）六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、テルビウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｔｂ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１０８】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＴｂで置換されていることが確認された。
【０１０９】
（サンプルＮｏ．９’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの塩化ジスプロシウム六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ジスプロシウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｄｙ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１１０】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＤｙで置換されていることが確認された。
【０１１１】
（サンプルＮｏ．１０’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの硝酸ホルミウムｎ水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ホルミウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｈｏ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１１２】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＨｏで置換されていることが確認された。
【０１１３】
（サンプルＮｏ．１１’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの硝酸エルビウム六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、エルビウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｅｒ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１１４】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＥｒで置換されていることが確認された。
【０１１５】
（サンプルＮｏ．１２’）
前記工程−１−において、１０ｍＭの硝酸イッテルビウム水溶液に代えて、１００ｍＭの硝酸ツリウム（III）六水和物・水溶液（５０ｍＬ）を、ファルコンチューブ内に加えた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、ツリウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｔｍ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１１６】
なお、元素分析法により、吸着剤の表面のＣａ−ＨＡＰは、Ｃａのほぼ全てがＴｍで置換されていることが確認された。
【０１１７】
（サンプルＮｏ．１３’）
前記工程−１−〜−５−を省略し、Ｃａのランタノイド系の金属元素による置換を行うことなく、Ｃａ−ＨＡＰを吸着剤充填空間に充填した以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして、カルシウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｃａ−ＨＡＰ）が吸着剤充填空間に充填された吸着装置を製造した。
【０１１８】
２．吸着装置によるヘムタンパク質の分離
（実施例１）
以下に示すようにして、サンプルＮｏ．１の吸着装置を用いて、試料中に含まれるヘムタンパク質を分離した。
【０１１９】
まず、サンプルＮｏ.１の吸着装置のカラム内における液体を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に置換した。
【０１２０】
次に、ヘムタンパク質として、ミオグロビン（ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ：５ｍｇ／ｍＬ）およびシトクロム−ｃ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ−ｃ：５ｍｇ／ｍＬ）を、ヘムタンパク質以外のタンパク質として、α−キモトリプシノーゲンＡ（α−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎＡ：５ｍｇ／ｍＬ）およびオバルブミン（ｏｂａｌｂｕｍｉｎ：１０ｍｇ／ｍＬ）を含有し、それぞれの含有量が括弧内に示す濃度となるように、前記と同様のリン酸緩衝液に溶解した試料２ｍＬをカラム内に供給して、カラム内を通過させた。
【０１２１】
次に、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を流速１ｍＬ／ｍｉｎで２５分間、カラム内に供給して、カラム内から流出するリン酸緩衝液の波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定するとともに、このリン酸緩衝液を回収することにより、試料中に含まれるヘムタンパク質を分離した。
【０１２２】
なお、この際、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）は、１０ｍＭリン酸緩衝液に対する４００ｍＭリン酸緩衝液の混合率が、０〜１５分の間で０％〜７５％まで増加するようにし、１５分後からの１０分間では、４００ｍＭリン酸緩衝液の混合率が１００％となるように通液した。
【０１２３】
（実施例２）
サンプルＮｏ．１の吸着装置に代えて、サンプルＮｏ．２の吸着装置を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、試料中に含まれるヘムタンパク質を分離した。
【０１２４】
（比較例１〜１３）
サンプルＮｏ．１の吸着装置に代えて、それぞれ、サンプルＮｏ．１’〜１３’の吸着装置を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、試料中に含まれるヘムタンパク質を分離した。
【０１２５】
３．評価
各実施例および各比較例で測定された、カラム内から流出するリン酸緩衝液の波長２８０ｎｍにおける吸光度曲線を図２〜図１６に示す。
【０１２６】
ここで、図１６に示した比較例１３のように、Ｃａ−ＨＡＰが吸着剤充填空間に充填された吸着装置を用いて試料中のヘムタンパク質を分離すると、波長２８０ｎｍにおける吸光度曲線には、１．５分付近に第１のピーク、６．５分付近に第２のピーク、８．５分付近に第３のピーク、さらに１２分付近に第４のピークが認められた。
【０１２７】
これに対して、Ｃａ−ＨＡＰに含まれるＣａをランタノイド系の金属元素で置換すると、図４〜図１１に示した比較例１〜比較例８のように、ランタノイド系の金属元素の原子量が大きくなるにしたがって、第２のピークと第３のピークとが徐々に接近する傾向を示した。
【０１２８】
そして、さらに原子量が大きいランタノイド系の金属元素でＣａを置換すると、図１、図２および図１２〜図１５に示した比較例９〜比較例１２、実施例１および実施例２のように、第２のピークと第３のピークとにより１つのピークが形成され、特に、実施例１および実施例２では、この１つのピークが吸光度曲線の右側でブロードする傾向を示した。
【０１２９】
そこで、各ピークで溶出しているタンパク質の種類を同定することを目的に、ミオグロビン（５ｍｇ／ｍＬ）、シトクロム−ｃ（５ｍｇ／ｍＬ）、α−キモトリプシノーゲンＡ（５ｍｇ／ｍＬ）およびオバルブミン（１０ｍｇ／ｍＬ）を、それぞれ単独で、前記と同様のリン酸緩衝液に溶解した試料２ｍＬを用意した。そして、前記実施例１で各タンパク質が混合している試料を通液したのと同様の条件で、サンプルＮｏ．１、２および１０’〜１３’の吸着装置を代表として、各タンパク質が単独で溶解している試料を、それぞれ、各吸着装置内を通液させた。
【０１３０】
その結果を、図１７〜図２２に示す。
なお、図１７〜図２２に示すクロマトグラムは、各タンパク質を含有する試料を通液した際に測定された吸光度曲線を、各サンプルＮｏ．の吸着装置毎に、重ね合わせたものである。
【０１３１】
ここで、図２２に示す、サンプルＮｏ．１３’（Ｃａ−ＨＡＰ）の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線（クロマトグラム）から明らかなように、第１のピークはオバルブミンに由来するピークであり、第２のピークはミオグロビンに由来するピークであり、第３のピークはα−キモトリプシノーゲンＡに由来するピークであり、さらに第４のピークはシトクロム−ｃに由来するピークであることが分った。
【０１３２】
また、図１９に示すサンプルＮｏ．１０’（Ｈｏ−ＨＡＰ）、図２０に示すサンプルＮｏ．１１’（Ｅｒ−ＨＡＰ）、図２１に示すサンプルＮｏ．１２’（Ｔｍ−ＨＡＰ）の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線では、いずれも第２のピーク（ミオグロビン）と第３のピーク（α−キモトリプシノーゲンＡ）とが重なり合っている。
【０１３３】
ところが、図１７に示すサンプルＮｏ．１（Ｙｂ−ＨＡＰ）、図１８に示すサンプルＮｏ．２（Ｌｕ−ＨＡＰ）の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線では、第２のピーク（ミオグロビン）と第３のピーク（α−キモトリプシノーゲンＡ）とは完全には重なり合わず、第２のピークと第３のピークとが逆転して、第３のピーク（α−キモトリプシノーゲンＡ）が認められた後に、第２のピーク（ミオグロビン）が認められる傾向を示した。
【０１３４】
すなわち、Ｃａが原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素で置換されていることに起因して、ヘムタンパク質が吸着剤に優先的に吸着され、ヘムタンパク質の溶出が遅くなる傾向を示した。
【０１３５】
そのため、サンプルＮｏ．１およびサンプルＮｏ．２の吸着装置を用いて各タンパク質が混合した試料を分離した実施例１および実施例２では、第３のピークがほぼ消失した後に、各吸着装置から溶出するリン酸緩衝液を回収することにより、ヘムタンパク質（ミオグロビンおよびシトクロム−ｃの混合物）を分離し得ることが分った。
【０１３６】
より具体的には、実施例１では１３分後から溶出するリン酸緩衝液を、実施例２では１３．５分後から溶出するリン酸緩衝液を回収すれば、ヘムタンパク質を分離し得ることが分った。
【０１３７】
以上のことから、Ｃａが原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素で置換されているカルシウムハイドロキシアパタイトビーズ（吸着剤）を備える吸着装置を用いることにより、複数のタンパク質が混合している試料中から、ヘムタンパク質を選択的に分離し得ることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】本発明の吸着装置の実施形態を示す縦断面図である。
【図２】実施例１でサンプルＮｏ．１の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図３】実施例２でサンプルＮｏ．２の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図４】比較例１でサンプルＮｏ．１’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図５】比較例２でサンプルＮｏ．２’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図６】比較例３でサンプルＮｏ．３’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図７】比較例４でサンプルＮｏ．４’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図８】比較例５でサンプルＮｏ．５’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図９】比較例６でサンプルＮｏ．６’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１０】比較例７でサンプルＮｏ．７’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１１】比較例８でサンプルＮｏ．８’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１２】比較例９でサンプルＮｏ．９’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１３】比較例１０でサンプルＮｏ．１０’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１４】比較例１１でサンプルＮｏ．１１’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１５】比較例１２でサンプルＮｏ．１２’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１６】比較例１３でサンプルＮｏ．１３’の吸着装置を用いて測定された吸光度曲線である。
【図１７】サンプルＮｏ．１の吸着装置に、各タンパク質を含有する試料をそれぞれ単独で通液した際に測定された吸光度曲線を、重ね合わせたものである。
【図１８】サンプルＮｏ．２の吸着装置に、各タンパク質を含有する試料をそれぞれ単独で通液した際に測定された吸光度曲線を、重ね合わせたものである。
【図１９】サンプルＮｏ．１０’の吸着装置に、各タンパク質を含有する試料をそれぞれ単独で通液した際に測定された吸光度曲線を、重ね合わせたものである。
【図２０】サンプルＮｏ．１１’の吸着装置に、各タンパク質を含有する試料をそれぞれ単独で通液した際に測定された吸光度曲線を、重ね合わせたものである。
【図２１】サンプルＮｏ．１２’の吸着装置に、各タンパク質を含有する試料をそれぞれ単独で通液した際に測定された吸光度曲線を、重ね合わせたものである。
【図２２】サンプルＮｏ．１３’の吸着装置に、各タンパク質を含有する試料をそれぞれ単独で通液した際に測定された吸光度曲線を、重ね合わせたものである。
【符号の説明】
【０１３９】
１ 吸着装置
２ カラム
２０ 吸着剤充填空間
２１ カラム本体
２２、２３ キャップ
２４ 流入管
２５ 流出管
３ 吸着剤
４、５ フィルタ部材
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘムタンパク質を含有する溶液中から、当該ヘムタンパク質を分離するヘムタンパク質分離法であって、
少なくとも表面付近が、主として下記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されている吸着剤に、前記溶液を接触させることにより、前記ヘムタンパク質を優先的に吸着させて、前記溶液から分離することを特徴とするヘムタンパク質分離法。
（Ｃａ１−ａＭａ）１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２ ・・・（Ｉ）
［ただし、組成式（Ｉ）中、Ｍは原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種を示し、Ｘはハロゲン元素のうちの少なくとも１種を示し、０＜ａ≦１、０≦ｂ≦１である。］
【請求項２】
前記ヘムタンパク質は、ミオグロビンおよびシトクロム−ｃのうちの少なくとも１種である請求項１に記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項３】
前記ランタノイド系の金属元素は、Ｌｕである請求項１または２に記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項４】
前記組成式（Ｉ）中の前記ａは、０．５〜１である請求項１ないし３のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項５】
前記組成式（Ｉ）中の前記Ｘは、Ｆを主とするハロゲン元素である請求項１ないし４のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項６】
前記Ｘは、Ｆを含み、その割合が前記Ｘ全体に対し８０％以上である請求項１ないし５のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項７】
前記組成式（Ｉ）中の前記ｂは、０．３〜１である請求項１ないし６のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項８】
前記吸着剤は、粒状をなしている請求項１ないし７のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項９】
吸着剤充填空間を有するカラムと、前記吸着剤充填空間の少なくとも一部に充填された前記吸着剤とを有する吸着装置を用い、前記吸着剤充填空間に前記溶液を通液することにより、前記ヘムタンパク質を前記溶液から分離する請求項１ないし８のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項１０】
ヘムタンパク質を含有する溶液中から、当該ヘムタンパク質を分離するヘムタンパク質吸着剤であって、
少なくとも表面付近が、主として下記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されており、前記溶液を接触させることにより、前記ヘムタンパク質を優先的に吸着して、前記溶液から分離することを特徴とするヘムタンパク質吸着剤。
（Ｃａ１−ａＭａ）１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２ ・・・（Ｉ）
［ただし、組成式（Ｉ）中、Ｍは原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種を示し、Ｘはハロゲン元素のうちの少なくとも１種を示し、０＜ａ≦１、０≦ｂ≦１である。］
【請求項１】
ヘムタンパク質を含有する溶液中から、当該ヘムタンパク質を分離するヘムタンパク質分離法であって、
少なくとも表面付近が、主として下記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されている吸着剤に、前記溶液を接触させることにより、前記ヘムタンパク質を優先的に吸着させて、前記溶液から分離することを特徴とするヘムタンパク質分離法。
（Ｃａ１−ａＭａ）１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２ ・・・（Ｉ）
［ただし、組成式（Ｉ）中、Ｍは原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種を示し、Ｘはハロゲン元素のうちの少なくとも１種を示し、０＜ａ≦１、０≦ｂ≦１である。］
【請求項２】
前記ヘムタンパク質は、ミオグロビンおよびシトクロム−ｃのうちの少なくとも１種である請求項１に記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項３】
前記ランタノイド系の金属元素は、Ｌｕである請求項１または２に記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項４】
前記組成式（Ｉ）中の前記ａは、０．５〜１である請求項１ないし３のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項５】
前記組成式（Ｉ）中の前記Ｘは、Ｆを主とするハロゲン元素である請求項１ないし４のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項６】
前記Ｘは、Ｆを含み、その割合が前記Ｘ全体に対し８０％以上である請求項１ないし５のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項７】
前記組成式（Ｉ）中の前記ｂは、０．３〜１である請求項１ないし６のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項８】
前記吸着剤は、粒状をなしている請求項１ないし７のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項９】
吸着剤充填空間を有するカラムと、前記吸着剤充填空間の少なくとも一部に充填された前記吸着剤とを有する吸着装置を用い、前記吸着剤充填空間に前記溶液を通液することにより、前記ヘムタンパク質を前記溶液から分離する請求項１ないし８のいずれかに記載のヘムタンパク質分離法。
【請求項１０】
ヘムタンパク質を含有する溶液中から、当該ヘムタンパク質を分離するヘムタンパク質吸着剤であって、
少なくとも表面付近が、主として下記組成式（Ｉ）で表されるアパタイトで構成されており、前記溶液を接触させることにより、前記ヘムタンパク質を優先的に吸着して、前記溶液から分離することを特徴とするヘムタンパク質吸着剤。
（Ｃａ１−ａＭａ）１０（ＰＯ４）６（（ＯＨ）１−ｂＸｂ）２ ・・・（Ｉ）
［ただし、組成式（Ｉ）中、Ｍは原子量１７３以上のランタノイド系の金属元素のうちの少なくとも１種を示し、Ｘはハロゲン元素のうちの少なくとも１種を示し、０＜ａ≦１、０≦ｂ≦１である。］
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２００９−２５１５４（Ｐ２００９−２５１５４Ａ）
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１８８４８５（Ｐ２００７−１８８４８５）
【出願日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【出願人】（０００１１３２６３）ＨＯＹＡ株式会社 (3,820)
【出願人】（５０３２０９４４５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【出願人】（０００１１３２６３）ＨＯＹＡ株式会社 (3,820)
【出願人】（５０３２０９４４５）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]