ヘモグロビン類の分析方法及び蛋白質の分析方法
【課題】保持時間の長い蛋白質の溶出速度を選択的に速くすることができる蛋白質の分析方法を提供する。また、該蛋白質の分析方法を用いるヘモグロビン類の分離、定量方法を提供する。
【解決手段】等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類を含有する血液試料を、イオン交換基を有する固定相が充填された分離カラムに通して前記ヘモグロビン類を固定相に保持させ、分離カラムに溶離液を流すことで前記ヘモグロビン類を溶出させて分析するイオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の分析方法であって、前記溶離液は、イオン対試薬を含有し、かつ、前記少なくとも２種類のヘモグロビン類の等電点の間のｐＨを有するものである蛋白質の分析方法。
【解決手段】等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類を含有する血液試料を、イオン交換基を有する固定相が充填された分離カラムに通して前記ヘモグロビン類を固定相に保持させ、分離カラムに溶離液を流すことで前記ヘモグロビン類を溶出させて分析するイオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の分析方法であって、前記溶離液は、イオン対試薬を含有し、かつ、前記少なくとも２種類のヘモグロビン類の等電点の間のｐＨを有するものである蛋白質の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類を含有する血液試料のヘモグロビン類の分析方法、特に、保持時間の長いヘモグロビン類の溶出速度を選択的に速くすることができるヘモグロビン類の分析方法に関する。また、本発明は、等電点の異なる少なくとも２種類の蛋白質を含有する試料の蛋白質の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン交換液体クロマトグラフィーは、血液中のヘモグロビン類の分析をはじめ、各種蛋白質の分析に利用されている。
例えば、血液中のヘモグロビン類の分析では、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの量は、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映しているため、全ヘモグロビン類の中の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合であるヘモグロビンＡ１ｃ値（％）が、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。なお、ヘモグロビンＡ１ｃは、ヘモグロビンＡに血液中の糖であるグルコースが結合した糖化ヘモグロビンであり、可逆的に結合したものは不安定型ヘモグロビンＡ１ｃと呼ばれ、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃを経て不可逆的に結合したものは安定型ヘモグロビンＡ１ｃと呼ばれている。
【０００３】
安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値を測定する方法の１つとしてイオン交換液体クロマトグラフィーが利用されており、近年のメタボリック症侯群や成人病への関心の高まりから、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）をより迅速かつ高精度に測定することが望まれている。安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値は、全ヘモグロビン類の中の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合であって、イオン交換液体クロマトグラフィーでは、得られるクロマトグラムの全ヘモグロビンピークの合計面積に対する安定型ヘモグロビンＡ１ｃピークの面積の比率（％）を求めることにより測定される。即ち、迅速かつ精度良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値を測定するためには、安定型ヘモグロビンＡ１ｃピークの面積だけでなく、全ヘモグロビンピークの面積も迅速かつ精度良く求める必要がある。
【０００４】
陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用い、溶血させた血液試料中のヘモグロビン類を充分な時間を掛けて分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ及びヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣの順に溶出する。分離カラムの固定相との保持力が強い成分ほど保持時間が長く、ヘモグロビンＣのような保持力の強いヘモグロビンの溶出が分析での律速となる。
【０００５】
特許文献１、特許文献２には、イオン交換液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液に過塩素酸ナトリウム等のカオトロピック塩を添加することによって、短時間でヘモグロビン類を分析する方法が開示されている。しかしながら、特許文献１、特許文献２に開示されている方法では、全てのヘモグロビン類の溶出速度が速くなるため、溶出ピークが近いヘモグロビン類があった場合には、これらの分離性能が低下するという問題がある。例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの分析を行う場合、最後に溶出するヘモグロビンＣの溶出速度が速くなって測定時間が短縮できるものの、ヘモグロビンＡ０とヘモグロビンＳの溶出速度も速くなるため、これらのピークの重なりが多くなり分離性能が低下するという問題がある（図２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−０５５８９９号公報
【特許文献２】特開２０００−１１１５３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類を含有する血液試料のヘモグロビン類の分析方法、特に、保持時間の長いヘモグロビン類の溶出速度を選択的に速くすることができるヘモグロビン類の分析方法を提供することを目的とする。また、本発明は、等電点の異なる少なくとも２種類の蛋白質を含有する試料の蛋白質の分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類を含有する血液試料を、イオン交換基を有する固定相が充填された分離カラムに通して上記ヘモグロビン類を固定相に保持させ、分離カラムに溶離液を流すことで上記ヘモグロビン類を溶出させて分析する、イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の分析方法であって、上記溶離液は、イオン対試薬を含有し、かつ、上記少なくとも２種類のヘモグロビン類の等電点の間のｐＨを有するヘモグロビン類の分析方法である。
また、等電点の異なる少なくとも２種類の蛋白質を含有する試料を、イオン交換基を有する固定相が充填された分離カラムに通して上記蛋白質を固定相に保持させ、分離カラムに溶離液を流すことで上記蛋白質を溶出させて分析する、イオン交換液体クロマトグラフィーによる蛋白質の分析方法であって、上記溶離液は、イオン対試薬を含有し、かつ、上記少なくとも２種類の蛋白質の等電点の間のｐＨを有する蛋白質の分析方法もまた、本発明の１つである。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明者らは、イオン交換液体クロマトグラフィーでヘモグロビン類又はその他の蛋白質を分析する際に、溶離液として、分析対象である少なくとも２種類のヘモグロビン類又はその他の蛋白質の等電点の間のｐＨを有するものを用い、かつ、この溶離液にイオン対試薬を含有させることにより、溶離液中で一方の符号の電荷を有するヘモグロビン類又はその他の蛋白質の溶出速度が選択的に速くなることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
例えば、本発明の分析方法を用いて、ヘモグロビンＡ０（等電点７．０）、ヘモグロビンＳ（等電点７．２）及びヘモグロビンＣ（等電点７．４）を含有する、溶血させた血液試料の分析を行う場合、陽イオン交換基を有する固定相が充填された分離カラムを用い、かつ、溶離液としてｐＨが７．２で、溶離液中において正の電荷を有するイオン対試薬を含有するものを用いることによって、保持時間の長いヘモグロビンＣの溶出速度が選択的に速くなる（図１）。
ヘモグロビンＣの保持時間が選択的に速くなる理由は、以下の通りであると考えられる。
【００１１】
陽イオン交換液体クロマトグラフィーにおいて、ヘモグロビン類等の蛋白質の保持時間は、蛋白質と固定相とのイオン交換作用だけではなく、蛋白質と固定相との疎水性相互作用にも影響を受ける。溶離液のｐＨよりもヘモグロビン類又はその他の蛋白質の等電点が高くなるほどイオン交換作用による影響が大きくなり、溶離液のｐＨよりもヘモグロビン類又はその他の蛋白質の等電点が低くなるほど疎水性相互作用の影響が大きくなる。
上記血液試料の分析の例では、正の電荷を有するイオン対試薬を含有する溶離液を分離カラムに流すと、固定相の陽イオン交換基にイオン対試薬が吸着する。イオン対試薬が固定相の陽イオン交換基に吸着することで、上記溶離液中においてヘモグロビンＣと固定相とのイオン交換作用が弱まる。また、上記溶離液として、ヘモグロビンＣの等電点より低いｐＨを有するものを用いているので、ヘモグロビンＣは上記溶離液中で正の電荷を有する。従って、イオン対試薬はヘモグロビンＣにほとんど吸着せず、固定相とヘモグロビンＣとの疎水性相互作用はあまり強まらないと考えられる。従って、ヘモグロビンＣの保持力が弱まり、ヘモグロビンＣの保持時間が短くなる。
一方、上記イオン対試薬が上記固定相の陽イオン交換基に吸着することで、ヘモグロビンＡ０と固定相とのイオン交換作用も弱まる。また、上記溶離液として、ヘモグロビンＡ０の等電点より高いｐＨを有するものを用いているので、ヘモグロビンＡ０は溶離液中で負の電荷を有する。従って、上記イオン対試薬はヘモグロビンＡ０にも吸着し、ヘモグロビンＡ０の荷電が抑えられてイオン交換作用が弱まる。しかしながら、固定相の陽イオン交換基に吸着したイオン対試薬の疎水性基と、ヘモグロビンＡ０に吸着したイオン対試薬の疎水性基とにより、ヘモグロビンＡ０と固定相との疎水性相互作用は強まる。イオン交換作用を弱める効果と疎水性相互作用を強める効果とがつり合うように、上記溶離液のｐＨや、上記イオン対試薬の濃度、種類等を選択すれば、ヘモグロビンＡ０の保持時間は、イオン対試薬を含有する溶離液を用いない場合と比べてほとんど変化しない。
また、上記溶離液のｐＨはヘモグロビンＳの等電点と等しいので、上記溶離液中においてヘモグロビンＳは正味の電荷を有さない。このようなヘモグロビンＳは固定相とのイオン交換作用がもともと弱く、イオン対試薬が固定相の陽イオン交換気に吸着してもヘモグロビンＳのイオン交換作用はほとんど変わらないと考えられる。ヘモグロビンＳには上記イオン対試薬はほとんど吸着しないため、ヘモグロビンＳと固定相との疎水性相互作用もあまり強まらないと考えられる。従って、上記イオン対試薬は、ヘモグロビンＳの保持力にほとんど影響を与えず、ヘモグロビンＳの保持時間は、イオン対試薬を含有する溶離液を用いない場合と比べてほとんど変化しない。
同様のメカニズムにより、本発明の分析方法を用いれば、溶離液中において一方の符号の電荷を有する蛋白質の溶出速度を選択的に速くすることができる。
【００１２】
本発明の分析方法に用いる溶離液は、イオン対試薬を含有する。
上記イオン対試薬は、疎水性基を有し、かつ、溶離液中において正又は負の電荷を有する。
溶離液中において正の電荷を有する上記イオン対試薬としては、例えば、第四級アンモニウム塩、第三級アミン等が挙げられる。
溶離液中において負の電荷を有する上記イオン対試薬としては、例えば、アルキルスルホン酸塩、過塩素酸塩等が挙げられる。
【００１３】
上記第四級アンモニウム塩としては、例えば、テトラアルキルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、１，４―ジメチルピリジニウム塩、トリメチルシクロプロピルアンモニウム塩等が挙げられ、塩としては、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硫酸水素塩等が挙げられる。
上記テトラアルキルアンモニウム塩としては、例えば、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化テトラエチルアンモニウム、塩化テトラプロピルアンモニウム、塩化テトラブチルアンモニウム、塩化ブチルトリエチルアンモニウム、塩化テトラペンチルアンモニウム、塩化テトラヘキシルアンモニウム、塩化テトラヘプチルアンモニウム、塩化テトラオクチルアンモニウム、塩化トリオクチルメチルアンモニウム、塩化テトラデシルアンモニウム、塩化トリデシルメチルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化テトラドデシルアンモニウム、塩化トリドデシルメチルアンモニウム、塩化ジドデシルジメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリエチルアンモニウム、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム、塩化テトラヘキサデシルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルジメチルエチルアンモニウム、塩化テトラオクタデシルアンモニウム、塩化オクタデシルトリメチルアンモニウム、塩化オクタデシルトリエチルアンモニウム等や、これらの塩化物塩に対応する臭化物塩、ヨウ化物塩、硫酸水素塩等が挙げられる。
【００１４】
上記イオン対試薬は、分析対象となるヘモグロビン類又はその他の蛋白質の種類によって適宜選択されるが、テトラアルキルアンモニウム塩が好ましく、より好ましくはテトラブチルアンモニウム塩であり、更に好ましくは臭化テトラブチルアンモニウムである。
特に、固定相に陽イオン交換体を用いてヘモグロビンＡ０（等電点７．０）、ヘモグロビンＳ（等電点７．２）及びヘモグロビンＣ（等電点７．４）を含有する溶血させた血液試料の分析において、ヘモグロビンＣの溶出速度のみを選択的に速くする場合に、上記イオン対試薬として臭化テトラブチルアンモニウムを用いることが好適である。臭化テトラブチルアンモニウムより疎水性の低いイオン対試薬を用いると、ヘモグロビンＡ０やヘモグロビンＳ等のヘモグロビンＣ以外の成分の溶出速度も速くなることがある。臭化テトラブチルアンモニウムより疎水性の高いイオン対試薬を用いると、疎水性相互作用への影響が強くなりすぎて、ヘモグロビンＡ０の溶出速度が遅くなって分離性能が悪くなったり、ヘモグロビンＣが溶出しにくくなったりすることがある。また、イオン交換液体クロマトグラフィーは溶離液として水系溶媒を用いるが、臭化テトラブチルアンモニウムより疎水性の高いイオン対試薬を用いると、イオン対試薬の水系溶媒への溶解性が低下するため、イオン対試薬を含有させた効果が発現し難くなることがある。
【００１５】
上記溶離液中におけるイオン対試薬の濃度は、イオン対試薬の種類や、分析対象となるヘモグロビン類又はその他の蛋白質の種類によって適宜選択されるが、好ましい下限は５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は２５ｍｍｏｌ／Ｌである。特に、イオン対試薬が臭化テトラブチルアンモニウムであり、その溶離液中での濃度が５〜２５ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
上記イオン対試薬の濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、ヘモグロビンＣ等の保持力の強い成分の溶出速度があまり速くならないことがある。上記イオン対試薬の濃度が２５ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、イオン対試薬を含有させたことによる疎水性相互作用への影響が強くなりすぎ、溶出速度を調整する必要のない成分の溶出速度が遅くなり、分離性能が悪くなることがある。例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有する血液試料の場合では、ヘモグロビンＡ０の溶出速度が遅くなって分離性能が悪くなることがある。
【００１６】
上記溶離液は、分析対象である少なくとも２種類のヘモグロビン類又はその他の蛋白質の等電点の間のｐＨを有する。上記溶離液は、少なくとも２種類のヘモグロビン類又はその他の蛋白質の、最も高い等電点と最も低い等電点との間のｐＨを有することがより好ましい。上記溶離液が、上記少なくとも２種類のヘモグロビン類又はその他の蛋白質の等電点の間のｐＨを有することにより、等電点の高い、即ち保持時間の長いヘモグロビン類又はその他の蛋白質と、等電点の低い、即ち保持時間の短いヘモグロビン類又はその他の蛋白質とは、溶離液中においてそれぞれ逆の符号の電荷を有する。
例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有する血液試料を分析する場合、上記溶離液のｐＨは７．１〜７．３の範囲にあることが好ましい。
【００１７】
上記溶離液としては、従来からイオン交換液体クロマトグラフィーに用いられる緩衝液が挙げられ、分析対象である少なくとも２種類のヘモグロビン類又はその他の蛋白質の等電点の間のｐＨに調整される。
上記緩衝液は、水等の水系溶媒に酸、塩基、塩等の緩衝試薬が含有されたものである。
上記酸の緩衝試薬としては、例えば、クエン酸、酢酸、酒石酸、ホウ酸、リン酸等が挙げられる。
上記塩基の緩衝試薬としては、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、トリスヒドロキシメチルアミノメタン等が挙げられる。
上記塩の緩衝試薬としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸リチウム、酢酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム等挙げられる。
【００１８】
上記溶離液中における塩の濃度は特に限定されないが、好ましい上限は５００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記塩の濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、塩が析出しシステムに悪影響を及ぼすことがある。上記塩の濃度のより好ましい上限は２００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１９】
本発明の分析方法で用いる分離カラムは、カラム本体に固定相が充填されたものである。固定相としては、充填剤粒子、多孔質体等が挙げられ、充填剤粒子が好ましい。
充填剤粒子としては、無機系粒子、有機系粒子等が挙げられる。
上記無機系粒子としては、シリカ、ジルコニア等で構成される粒子が挙げられる。
上記有機系粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子が挙げられる。
【００２０】
上記固定相は、イオン交換基を有する。イオン交換基としては、分析対象となるヘモグロビン類又はその他の蛋白質の種類によって陽イオン交換基又は陰イオン交換基が適宜選択される。
上記陽イオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。上記陰イオン交換基としては、３級アミノ基、４級アミノ基等が挙げられる。
ヘモグロビン類を分析する場合は、陽イオン交換基を有する固定相を用いることが好ましい。
また、陽イオン交換基を有する固定相を用いる場合は、上記イオン対試薬として溶離液中で正の電荷を有するものを用いることが好ましく、陰イオン交換基を有する固定相を用いる場合は、上記イオン対試薬として溶離液中で負の電荷を有するものを用いることが好ましい。
従って、溶血させた血液試料のヘモグロビン類を分析する場合は、陽イオン交換基を有する固定相を用い、かつ、溶離液に含有させるイオン対試薬は溶離液中で正の電荷を有するものを用いることが好ましい。
陽イオン交換基を有する固定相を用いる場合、上記溶離液中において正電荷を有する蛋白質（等電点が上記溶離液のｐＨより高い蛋白質）の溶出速度が遅く、律速となる。この蛋白質の溶出速度を選択的に速くする場合、上記イオン対試薬として溶離液中において正の電荷を有するイオン対試薬を用いる。
一方、陰イオン交換基を有する固定相を用いる場合、上記溶離液中において負電荷を有する蛋白質（等電点が上記溶離液のｐＨより低い蛋白質）の溶出速度が遅く、律速となる。この蛋白質の溶出速度を選択的に速くする場合、上記イオン対試薬として溶離液中において負の電荷を有するイオン対試薬を用いる。
【００２１】
本発明の分析方法は、溶血させた血液試料中の等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類の分析、又は、試料中の等電点の異なる少なくとも２種類のその他の蛋白質の分析に用いられる。
上記ヘモグロビン類又は上記その他の蛋白質の等電点の好ましい下限は３、好ましい上限は１１である。上記ヘモグロビン類又は上記その他の蛋白質の等電点は、高すぎても低すぎても、上記イオン対試薬を含有させた溶離液を流した際に疎水性相互作用とイオン交換作用とのつり合いが取りにくくなり、特定の成分の溶出速度を選択的に調整するのが難しくなることがある。上記ヘモグロビン類又は上記その他の蛋白質の等電点のより好ましい下限は５、より好ましい上限は１０である。
上記ヘモグロビン類としては、安定型ヘモグロビンＡ１ｃや不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ等のヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＦ、ヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＥ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ等が挙げられ、なかでも、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣが好ましい。
即ち、試料としては、ヘモグロビン類を含有する溶血した血液試料が好ましく、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有する溶血した血液試料がより好ましい。本発明の分析方法では、分離性能を低下させることなく、より迅速に分析が行えるので、ヘモグロビン類を含有する血液試料のように、検出だけではなく、特定成分の定量も必要となる試料の分析に用いることが好ましい。
また、上記その他の蛋白質としては、アルブミン類、フィブリノーゲン、グロブリン類、インシュリン、ハプトグロビン等が挙げられる。
【００２２】
本発明の分析方法に使用される液体クロマトグラフとしては、公知の装置が用いられる。液体クロマトグラフは、一般的には、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、分離カラム、検出器等から構成される。また、他の付属装置（カラムオーブンやデガッサー等）が適宜付属されてもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の分析方法によれば、等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類を含有する血液試料からヘモグロビン類を分析する際、保持時間の長いヘモグロビン類の溶出速度を選択的に速くするので、分離性能を低下させることなく、より迅速にヘモグロビン類が分析される。
本発明の分析方法は、ヘモグロビン類だけではなく、等電点の異なる少なくとも２種類の蛋白質を含有する試料にも用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明のヘモグロビン類の分析方法を用いてヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分析したときのクロマトグラムを示した模式図である。
【図２】カオトロピック塩を含有する溶離液を用いてヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分析したときのクロマトグラムを示した模式図である。
【図３】評価基準及び実施例２、５、７で得られたクロマトグラムを示した図である。
【図４】溶離液中の臭化テトラブチルアンモニウムの濃度に対するヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの保持時間を示した図である。
【図５】評価基準及び比較例１〜３で得られたクロマトグラムを示した図である。
【図６】溶離液中の過塩素酸ナトリウムの濃度に対するヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの保持時間を示した図である。
【図７】評価基準及び比較例４〜６で得られたクロマトグラムを示した図である。
【図８】評価基準及び比較例７〜９で得られたクロマトグラムを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。
【００２６】
（評価基準）
ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有するＡＦＳＣコントロール（ヘレナ研究所社製）１ｍＬを、希釈液（ｐＨ７．０、０．１重量％のトリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液）で５０倍に希釈したものを測定試料とした。
表面にスルホン酸基を有する架橋性アクリル酸エステルと非架橋性アクリル酸エステルとの共重合により合成した粒子表面をスルホン酸基で置換した充填剤粒子が充填された分離カラム、検出器（商品名「ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ」、島津製作所社製）、送液ポンプ（商品名「ＬＣ−２０ＡＤ」、島津製作所社製）、デガッサー（商品名「ＤＧＵ−２０Ａ５」、島津製作所社製）、カラムオーブン（商品名「ＣＴＯ−２０ＡＣ」、島津製作所社製）、オートサンプラ（商品名「ＳＩＬ−２０ＡＣ」、島津製作所社製）を備えた液体クロマトグラフを用い、以下の条件で上記測定試料の分析を行った。
溶離液の流速：１．７ｍＬ／ｍｉｎ
検出器の検出波長：４１５ｎｍ
オートサンプラによる試料注入量：１０μＬ
溶離条件：
試料を分離カラムに注入した後、０〜３０秒は溶離液１（ｐＨ５．４、１１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液）を分離カラムに流し、３０秒を超え９０秒までは溶離液２（ｐＨ７．２、２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液）を分離カラムに流し、９０秒を超え９６秒までは溶離液３（ｐＨ８．０、０．８重量％のトリトンＸ−１００及び３００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）を分離カラムに流し、９６秒を超え１２０秒までは、次の測定を行う前の平衡化のために溶離液１を分離カラムに流して、ヘモグロビン類を溶出させ、分析を行った。
【００２７】
（実施例１）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、５ｍｍｏｌ／Ｌの臭化テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００２８】
（実施例２）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、１０ｍｍｏｌ／Ｌの臭化テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００２９】
（実施例３）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、１５ｍｍｏｌ／Ｌの臭化テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３０】
（実施例４）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、２０ｍｍｏｌ／Ｌの臭化テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３１】
（実施例５）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、２５ｍｍｏｌ／Ｌの臭化テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３２】
（実施例６）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、３０ｍｍｏｌ／Ｌの臭化テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３３】
（実施例７）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、４０ｍｍｏｌ／Ｌの臭化テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３４】
評価基準及び実施例２、５、７で得られたクロマトグラムを図３に示した。図３において、（ｂ）は得られたクロマトグラムの拡大図である。
評価基準及び実施例１〜７におけるヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの溶出時間から、溶離液中の臭化テトラブチルアンモニウムの濃度に対するヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの保持時間を図４に示した。
【００３５】
（比較例１）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、５ｍｍｏｌ／Ｌの過塩素酸ナトリウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３６】
（比較例２）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、１０ｍｍｏｌ／Ｌの過塩素酸ナトリウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３７】
（比較例３）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、１５ｍｍｏｌ／Ｌの過塩素酸ナトリウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３８】
評価基準及び比較例１〜３で得られたクロマトグラムを図５に示した。図５において、（ｂ）は得られたクロマトグラムの拡大図である。
評価基準及び比較例１〜３におけるヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの溶出時間から、溶離液中の過塩素酸ナトリウムの濃度に対するヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの保持時間を図６に示した。
【００３９】
（比較例４）
溶離液２を、ｐＨ７．０で、５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。尚、ヘモグロビンＣは１２０秒経過後も溶出しなかった。
【００４０】
（比較例５）
溶離液２を、ｐＨ６．８で、１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。尚、ヘモグロビンＣは１２０秒経過後も溶出しなかった。
【００４１】
（比較例６）
溶離液２を、ｐＨ６．７で、１５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。尚、ヘモグロビンＣは１２０秒経過後も溶出しなかった。
【００４２】
評価基準及び比較例４〜６で得られたクロマトグラムを図７に示した。図７において、（ｂ）は得られたクロマトグラムの拡大図である。
【００４３】
（比較例７）
溶離液２を、ｐＨ７．７で、３ｍｍｏｌ／Ｌのテトラブチルアンモニウムヒドロキシドを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００４４】
（比較例８）
溶離液２を、ｐＨ１１．０で、５ｍｍｏｌ／Ｌのテトラブチルアンモニウムヒドロキシドを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００４５】
（比較例９）
溶離液２を、ｐＨ１２．０で、１０ｍｍｏｌ／Ｌのテトラブチルアンモニウムヒドロキシドを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００４６】
評価基準及び比較例７〜９で得られたクロマトグラムを図８に示した。図８において、（ｂ）は得られたクロマトグラムの拡大図である。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によれば、等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類を含有する血液試料のヘモグロビン類の分析方法、特に、保持時間の長いヘモグロビン類の溶出速度を選択的に速くすることができるヘモグロビン類の分析方法を提供することができる。また、本発明によれば、等電点の異なる少なくとも２種類の蛋白質を含有する試料の蛋白質の分析方法を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類を含有する血液試料のヘモグロビン類の分析方法、特に、保持時間の長いヘモグロビン類の溶出速度を選択的に速くすることができるヘモグロビン類の分析方法に関する。また、本発明は、等電点の異なる少なくとも２種類の蛋白質を含有する試料の蛋白質の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン交換液体クロマトグラフィーは、血液中のヘモグロビン類の分析をはじめ、各種蛋白質の分析に利用されている。
例えば、血液中のヘモグロビン類の分析では、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの量は、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映しているため、全ヘモグロビン類の中の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合であるヘモグロビンＡ１ｃ値（％）が、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。なお、ヘモグロビンＡ１ｃは、ヘモグロビンＡに血液中の糖であるグルコースが結合した糖化ヘモグロビンであり、可逆的に結合したものは不安定型ヘモグロビンＡ１ｃと呼ばれ、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃを経て不可逆的に結合したものは安定型ヘモグロビンＡ１ｃと呼ばれている。
【０００３】
安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値を測定する方法の１つとしてイオン交換液体クロマトグラフィーが利用されており、近年のメタボリック症侯群や成人病への関心の高まりから、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）をより迅速かつ高精度に測定することが望まれている。安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値は、全ヘモグロビン類の中の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合であって、イオン交換液体クロマトグラフィーでは、得られるクロマトグラムの全ヘモグロビンピークの合計面積に対する安定型ヘモグロビンＡ１ｃピークの面積の比率（％）を求めることにより測定される。即ち、迅速かつ精度良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値を測定するためには、安定型ヘモグロビンＡ１ｃピークの面積だけでなく、全ヘモグロビンピークの面積も迅速かつ精度良く求める必要がある。
【０００４】
陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用い、溶血させた血液試料中のヘモグロビン類を充分な時間を掛けて分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ及びヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣの順に溶出する。分離カラムの固定相との保持力が強い成分ほど保持時間が長く、ヘモグロビンＣのような保持力の強いヘモグロビンの溶出が分析での律速となる。
【０００５】
特許文献１、特許文献２には、イオン交換液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液に過塩素酸ナトリウム等のカオトロピック塩を添加することによって、短時間でヘモグロビン類を分析する方法が開示されている。しかしながら、特許文献１、特許文献２に開示されている方法では、全てのヘモグロビン類の溶出速度が速くなるため、溶出ピークが近いヘモグロビン類があった場合には、これらの分離性能が低下するという問題がある。例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの分析を行う場合、最後に溶出するヘモグロビンＣの溶出速度が速くなって測定時間が短縮できるものの、ヘモグロビンＡ０とヘモグロビンＳの溶出速度も速くなるため、これらのピークの重なりが多くなり分離性能が低下するという問題がある（図２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−０５５８９９号公報
【特許文献２】特開２０００−１１１５３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類を含有する血液試料のヘモグロビン類の分析方法、特に、保持時間の長いヘモグロビン類の溶出速度を選択的に速くすることができるヘモグロビン類の分析方法を提供することを目的とする。また、本発明は、等電点の異なる少なくとも２種類の蛋白質を含有する試料の蛋白質の分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類を含有する血液試料を、イオン交換基を有する固定相が充填された分離カラムに通して上記ヘモグロビン類を固定相に保持させ、分離カラムに溶離液を流すことで上記ヘモグロビン類を溶出させて分析する、イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の分析方法であって、上記溶離液は、イオン対試薬を含有し、かつ、上記少なくとも２種類のヘモグロビン類の等電点の間のｐＨを有するヘモグロビン類の分析方法である。
また、等電点の異なる少なくとも２種類の蛋白質を含有する試料を、イオン交換基を有する固定相が充填された分離カラムに通して上記蛋白質を固定相に保持させ、分離カラムに溶離液を流すことで上記蛋白質を溶出させて分析する、イオン交換液体クロマトグラフィーによる蛋白質の分析方法であって、上記溶離液は、イオン対試薬を含有し、かつ、上記少なくとも２種類の蛋白質の等電点の間のｐＨを有する蛋白質の分析方法もまた、本発明の１つである。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明者らは、イオン交換液体クロマトグラフィーでヘモグロビン類又はその他の蛋白質を分析する際に、溶離液として、分析対象である少なくとも２種類のヘモグロビン類又はその他の蛋白質の等電点の間のｐＨを有するものを用い、かつ、この溶離液にイオン対試薬を含有させることにより、溶離液中で一方の符号の電荷を有するヘモグロビン類又はその他の蛋白質の溶出速度が選択的に速くなることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
例えば、本発明の分析方法を用いて、ヘモグロビンＡ０（等電点７．０）、ヘモグロビンＳ（等電点７．２）及びヘモグロビンＣ（等電点７．４）を含有する、溶血させた血液試料の分析を行う場合、陽イオン交換基を有する固定相が充填された分離カラムを用い、かつ、溶離液としてｐＨが７．２で、溶離液中において正の電荷を有するイオン対試薬を含有するものを用いることによって、保持時間の長いヘモグロビンＣの溶出速度が選択的に速くなる（図１）。
ヘモグロビンＣの保持時間が選択的に速くなる理由は、以下の通りであると考えられる。
【００１１】
陽イオン交換液体クロマトグラフィーにおいて、ヘモグロビン類等の蛋白質の保持時間は、蛋白質と固定相とのイオン交換作用だけではなく、蛋白質と固定相との疎水性相互作用にも影響を受ける。溶離液のｐＨよりもヘモグロビン類又はその他の蛋白質の等電点が高くなるほどイオン交換作用による影響が大きくなり、溶離液のｐＨよりもヘモグロビン類又はその他の蛋白質の等電点が低くなるほど疎水性相互作用の影響が大きくなる。
上記血液試料の分析の例では、正の電荷を有するイオン対試薬を含有する溶離液を分離カラムに流すと、固定相の陽イオン交換基にイオン対試薬が吸着する。イオン対試薬が固定相の陽イオン交換基に吸着することで、上記溶離液中においてヘモグロビンＣと固定相とのイオン交換作用が弱まる。また、上記溶離液として、ヘモグロビンＣの等電点より低いｐＨを有するものを用いているので、ヘモグロビンＣは上記溶離液中で正の電荷を有する。従って、イオン対試薬はヘモグロビンＣにほとんど吸着せず、固定相とヘモグロビンＣとの疎水性相互作用はあまり強まらないと考えられる。従って、ヘモグロビンＣの保持力が弱まり、ヘモグロビンＣの保持時間が短くなる。
一方、上記イオン対試薬が上記固定相の陽イオン交換基に吸着することで、ヘモグロビンＡ０と固定相とのイオン交換作用も弱まる。また、上記溶離液として、ヘモグロビンＡ０の等電点より高いｐＨを有するものを用いているので、ヘモグロビンＡ０は溶離液中で負の電荷を有する。従って、上記イオン対試薬はヘモグロビンＡ０にも吸着し、ヘモグロビンＡ０の荷電が抑えられてイオン交換作用が弱まる。しかしながら、固定相の陽イオン交換基に吸着したイオン対試薬の疎水性基と、ヘモグロビンＡ０に吸着したイオン対試薬の疎水性基とにより、ヘモグロビンＡ０と固定相との疎水性相互作用は強まる。イオン交換作用を弱める効果と疎水性相互作用を強める効果とがつり合うように、上記溶離液のｐＨや、上記イオン対試薬の濃度、種類等を選択すれば、ヘモグロビンＡ０の保持時間は、イオン対試薬を含有する溶離液を用いない場合と比べてほとんど変化しない。
また、上記溶離液のｐＨはヘモグロビンＳの等電点と等しいので、上記溶離液中においてヘモグロビンＳは正味の電荷を有さない。このようなヘモグロビンＳは固定相とのイオン交換作用がもともと弱く、イオン対試薬が固定相の陽イオン交換気に吸着してもヘモグロビンＳのイオン交換作用はほとんど変わらないと考えられる。ヘモグロビンＳには上記イオン対試薬はほとんど吸着しないため、ヘモグロビンＳと固定相との疎水性相互作用もあまり強まらないと考えられる。従って、上記イオン対試薬は、ヘモグロビンＳの保持力にほとんど影響を与えず、ヘモグロビンＳの保持時間は、イオン対試薬を含有する溶離液を用いない場合と比べてほとんど変化しない。
同様のメカニズムにより、本発明の分析方法を用いれば、溶離液中において一方の符号の電荷を有する蛋白質の溶出速度を選択的に速くすることができる。
【００１２】
本発明の分析方法に用いる溶離液は、イオン対試薬を含有する。
上記イオン対試薬は、疎水性基を有し、かつ、溶離液中において正又は負の電荷を有する。
溶離液中において正の電荷を有する上記イオン対試薬としては、例えば、第四級アンモニウム塩、第三級アミン等が挙げられる。
溶離液中において負の電荷を有する上記イオン対試薬としては、例えば、アルキルスルホン酸塩、過塩素酸塩等が挙げられる。
【００１３】
上記第四級アンモニウム塩としては、例えば、テトラアルキルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、１，４―ジメチルピリジニウム塩、トリメチルシクロプロピルアンモニウム塩等が挙げられ、塩としては、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硫酸水素塩等が挙げられる。
上記テトラアルキルアンモニウム塩としては、例えば、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化テトラエチルアンモニウム、塩化テトラプロピルアンモニウム、塩化テトラブチルアンモニウム、塩化ブチルトリエチルアンモニウム、塩化テトラペンチルアンモニウム、塩化テトラヘキシルアンモニウム、塩化テトラヘプチルアンモニウム、塩化テトラオクチルアンモニウム、塩化トリオクチルメチルアンモニウム、塩化テトラデシルアンモニウム、塩化トリデシルメチルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化テトラドデシルアンモニウム、塩化トリドデシルメチルアンモニウム、塩化ジドデシルジメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリエチルアンモニウム、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム、塩化テトラヘキサデシルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルジメチルエチルアンモニウム、塩化テトラオクタデシルアンモニウム、塩化オクタデシルトリメチルアンモニウム、塩化オクタデシルトリエチルアンモニウム等や、これらの塩化物塩に対応する臭化物塩、ヨウ化物塩、硫酸水素塩等が挙げられる。
【００１４】
上記イオン対試薬は、分析対象となるヘモグロビン類又はその他の蛋白質の種類によって適宜選択されるが、テトラアルキルアンモニウム塩が好ましく、より好ましくはテトラブチルアンモニウム塩であり、更に好ましくは臭化テトラブチルアンモニウムである。
特に、固定相に陽イオン交換体を用いてヘモグロビンＡ０（等電点７．０）、ヘモグロビンＳ（等電点７．２）及びヘモグロビンＣ（等電点７．４）を含有する溶血させた血液試料の分析において、ヘモグロビンＣの溶出速度のみを選択的に速くする場合に、上記イオン対試薬として臭化テトラブチルアンモニウムを用いることが好適である。臭化テトラブチルアンモニウムより疎水性の低いイオン対試薬を用いると、ヘモグロビンＡ０やヘモグロビンＳ等のヘモグロビンＣ以外の成分の溶出速度も速くなることがある。臭化テトラブチルアンモニウムより疎水性の高いイオン対試薬を用いると、疎水性相互作用への影響が強くなりすぎて、ヘモグロビンＡ０の溶出速度が遅くなって分離性能が悪くなったり、ヘモグロビンＣが溶出しにくくなったりすることがある。また、イオン交換液体クロマトグラフィーは溶離液として水系溶媒を用いるが、臭化テトラブチルアンモニウムより疎水性の高いイオン対試薬を用いると、イオン対試薬の水系溶媒への溶解性が低下するため、イオン対試薬を含有させた効果が発現し難くなることがある。
【００１５】
上記溶離液中におけるイオン対試薬の濃度は、イオン対試薬の種類や、分析対象となるヘモグロビン類又はその他の蛋白質の種類によって適宜選択されるが、好ましい下限は５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は２５ｍｍｏｌ／Ｌである。特に、イオン対試薬が臭化テトラブチルアンモニウムであり、その溶離液中での濃度が５〜２５ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
上記イオン対試薬の濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、ヘモグロビンＣ等の保持力の強い成分の溶出速度があまり速くならないことがある。上記イオン対試薬の濃度が２５ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、イオン対試薬を含有させたことによる疎水性相互作用への影響が強くなりすぎ、溶出速度を調整する必要のない成分の溶出速度が遅くなり、分離性能が悪くなることがある。例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有する血液試料の場合では、ヘモグロビンＡ０の溶出速度が遅くなって分離性能が悪くなることがある。
【００１６】
上記溶離液は、分析対象である少なくとも２種類のヘモグロビン類又はその他の蛋白質の等電点の間のｐＨを有する。上記溶離液は、少なくとも２種類のヘモグロビン類又はその他の蛋白質の、最も高い等電点と最も低い等電点との間のｐＨを有することがより好ましい。上記溶離液が、上記少なくとも２種類のヘモグロビン類又はその他の蛋白質の等電点の間のｐＨを有することにより、等電点の高い、即ち保持時間の長いヘモグロビン類又はその他の蛋白質と、等電点の低い、即ち保持時間の短いヘモグロビン類又はその他の蛋白質とは、溶離液中においてそれぞれ逆の符号の電荷を有する。
例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有する血液試料を分析する場合、上記溶離液のｐＨは７．１〜７．３の範囲にあることが好ましい。
【００１７】
上記溶離液としては、従来からイオン交換液体クロマトグラフィーに用いられる緩衝液が挙げられ、分析対象である少なくとも２種類のヘモグロビン類又はその他の蛋白質の等電点の間のｐＨに調整される。
上記緩衝液は、水等の水系溶媒に酸、塩基、塩等の緩衝試薬が含有されたものである。
上記酸の緩衝試薬としては、例えば、クエン酸、酢酸、酒石酸、ホウ酸、リン酸等が挙げられる。
上記塩基の緩衝試薬としては、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、トリスヒドロキシメチルアミノメタン等が挙げられる。
上記塩の緩衝試薬としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸リチウム、酢酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム等挙げられる。
【００１８】
上記溶離液中における塩の濃度は特に限定されないが、好ましい上限は５００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記塩の濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、塩が析出しシステムに悪影響を及ぼすことがある。上記塩の濃度のより好ましい上限は２００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１９】
本発明の分析方法で用いる分離カラムは、カラム本体に固定相が充填されたものである。固定相としては、充填剤粒子、多孔質体等が挙げられ、充填剤粒子が好ましい。
充填剤粒子としては、無機系粒子、有機系粒子等が挙げられる。
上記無機系粒子としては、シリカ、ジルコニア等で構成される粒子が挙げられる。
上記有機系粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子が挙げられる。
【００２０】
上記固定相は、イオン交換基を有する。イオン交換基としては、分析対象となるヘモグロビン類又はその他の蛋白質の種類によって陽イオン交換基又は陰イオン交換基が適宜選択される。
上記陽イオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。上記陰イオン交換基としては、３級アミノ基、４級アミノ基等が挙げられる。
ヘモグロビン類を分析する場合は、陽イオン交換基を有する固定相を用いることが好ましい。
また、陽イオン交換基を有する固定相を用いる場合は、上記イオン対試薬として溶離液中で正の電荷を有するものを用いることが好ましく、陰イオン交換基を有する固定相を用いる場合は、上記イオン対試薬として溶離液中で負の電荷を有するものを用いることが好ましい。
従って、溶血させた血液試料のヘモグロビン類を分析する場合は、陽イオン交換基を有する固定相を用い、かつ、溶離液に含有させるイオン対試薬は溶離液中で正の電荷を有するものを用いることが好ましい。
陽イオン交換基を有する固定相を用いる場合、上記溶離液中において正電荷を有する蛋白質（等電点が上記溶離液のｐＨより高い蛋白質）の溶出速度が遅く、律速となる。この蛋白質の溶出速度を選択的に速くする場合、上記イオン対試薬として溶離液中において正の電荷を有するイオン対試薬を用いる。
一方、陰イオン交換基を有する固定相を用いる場合、上記溶離液中において負電荷を有する蛋白質（等電点が上記溶離液のｐＨより低い蛋白質）の溶出速度が遅く、律速となる。この蛋白質の溶出速度を選択的に速くする場合、上記イオン対試薬として溶離液中において負の電荷を有するイオン対試薬を用いる。
【００２１】
本発明の分析方法は、溶血させた血液試料中の等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類の分析、又は、試料中の等電点の異なる少なくとも２種類のその他の蛋白質の分析に用いられる。
上記ヘモグロビン類又は上記その他の蛋白質の等電点の好ましい下限は３、好ましい上限は１１である。上記ヘモグロビン類又は上記その他の蛋白質の等電点は、高すぎても低すぎても、上記イオン対試薬を含有させた溶離液を流した際に疎水性相互作用とイオン交換作用とのつり合いが取りにくくなり、特定の成分の溶出速度を選択的に調整するのが難しくなることがある。上記ヘモグロビン類又は上記その他の蛋白質の等電点のより好ましい下限は５、より好ましい上限は１０である。
上記ヘモグロビン類としては、安定型ヘモグロビンＡ１ｃや不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ等のヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＦ、ヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＥ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ等が挙げられ、なかでも、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣが好ましい。
即ち、試料としては、ヘモグロビン類を含有する溶血した血液試料が好ましく、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有する溶血した血液試料がより好ましい。本発明の分析方法では、分離性能を低下させることなく、より迅速に分析が行えるので、ヘモグロビン類を含有する血液試料のように、検出だけではなく、特定成分の定量も必要となる試料の分析に用いることが好ましい。
また、上記その他の蛋白質としては、アルブミン類、フィブリノーゲン、グロブリン類、インシュリン、ハプトグロビン等が挙げられる。
【００２２】
本発明の分析方法に使用される液体クロマトグラフとしては、公知の装置が用いられる。液体クロマトグラフは、一般的には、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、分離カラム、検出器等から構成される。また、他の付属装置（カラムオーブンやデガッサー等）が適宜付属されてもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の分析方法によれば、等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類を含有する血液試料からヘモグロビン類を分析する際、保持時間の長いヘモグロビン類の溶出速度を選択的に速くするので、分離性能を低下させることなく、より迅速にヘモグロビン類が分析される。
本発明の分析方法は、ヘモグロビン類だけではなく、等電点の異なる少なくとも２種類の蛋白質を含有する試料にも用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明のヘモグロビン類の分析方法を用いてヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分析したときのクロマトグラムを示した模式図である。
【図２】カオトロピック塩を含有する溶離液を用いてヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分析したときのクロマトグラムを示した模式図である。
【図３】評価基準及び実施例２、５、７で得られたクロマトグラムを示した図である。
【図４】溶離液中の臭化テトラブチルアンモニウムの濃度に対するヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの保持時間を示した図である。
【図５】評価基準及び比較例１〜３で得られたクロマトグラムを示した図である。
【図６】溶離液中の過塩素酸ナトリウムの濃度に対するヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの保持時間を示した図である。
【図７】評価基準及び比較例４〜６で得られたクロマトグラムを示した図である。
【図８】評価基準及び比較例７〜９で得られたクロマトグラムを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。
【００２６】
（評価基準）
ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有するＡＦＳＣコントロール（ヘレナ研究所社製）１ｍＬを、希釈液（ｐＨ７．０、０．１重量％のトリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液）で５０倍に希釈したものを測定試料とした。
表面にスルホン酸基を有する架橋性アクリル酸エステルと非架橋性アクリル酸エステルとの共重合により合成した粒子表面をスルホン酸基で置換した充填剤粒子が充填された分離カラム、検出器（商品名「ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ」、島津製作所社製）、送液ポンプ（商品名「ＬＣ−２０ＡＤ」、島津製作所社製）、デガッサー（商品名「ＤＧＵ−２０Ａ５」、島津製作所社製）、カラムオーブン（商品名「ＣＴＯ−２０ＡＣ」、島津製作所社製）、オートサンプラ（商品名「ＳＩＬ−２０ＡＣ」、島津製作所社製）を備えた液体クロマトグラフを用い、以下の条件で上記測定試料の分析を行った。
溶離液の流速：１．７ｍＬ／ｍｉｎ
検出器の検出波長：４１５ｎｍ
オートサンプラによる試料注入量：１０μＬ
溶離条件：
試料を分離カラムに注入した後、０〜３０秒は溶離液１（ｐＨ５．４、１１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液）を分離カラムに流し、３０秒を超え９０秒までは溶離液２（ｐＨ７．２、２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液）を分離カラムに流し、９０秒を超え９６秒までは溶離液３（ｐＨ８．０、０．８重量％のトリトンＸ−１００及び３００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）を分離カラムに流し、９６秒を超え１２０秒までは、次の測定を行う前の平衡化のために溶離液１を分離カラムに流して、ヘモグロビン類を溶出させ、分析を行った。
【００２７】
（実施例１）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、５ｍｍｏｌ／Ｌの臭化テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００２８】
（実施例２）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、１０ｍｍｏｌ／Ｌの臭化テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００２９】
（実施例３）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、１５ｍｍｏｌ／Ｌの臭化テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３０】
（実施例４）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、２０ｍｍｏｌ／Ｌの臭化テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３１】
（実施例５）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、２５ｍｍｏｌ／Ｌの臭化テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３２】
（実施例６）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、３０ｍｍｏｌ／Ｌの臭化テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３３】
（実施例７）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、４０ｍｍｏｌ／Ｌの臭化テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３４】
評価基準及び実施例２、５、７で得られたクロマトグラムを図３に示した。図３において、（ｂ）は得られたクロマトグラムの拡大図である。
評価基準及び実施例１〜７におけるヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの溶出時間から、溶離液中の臭化テトラブチルアンモニウムの濃度に対するヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの保持時間を図４に示した。
【００３５】
（比較例１）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、５ｍｍｏｌ／Ｌの過塩素酸ナトリウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３６】
（比較例２）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、１０ｍｍｏｌ／Ｌの過塩素酸ナトリウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３７】
（比較例３）
溶離液２を、ｐＨ７．２で、１５ｍｍｏｌ／Ｌの過塩素酸ナトリウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００３８】
評価基準及び比較例１〜３で得られたクロマトグラムを図５に示した。図５において、（ｂ）は得られたクロマトグラムの拡大図である。
評価基準及び比較例１〜３におけるヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの溶出時間から、溶離液中の過塩素酸ナトリウムの濃度に対するヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの保持時間を図６に示した。
【００３９】
（比較例４）
溶離液２を、ｐＨ７．０で、５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。尚、ヘモグロビンＣは１２０秒経過後も溶出しなかった。
【００４０】
（比較例５）
溶離液２を、ｐＨ６．８で、１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。尚、ヘモグロビンＣは１２０秒経過後も溶出しなかった。
【００４１】
（比較例６）
溶離液２を、ｐＨ６．７で、１５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素テトラブチルアンモニウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。尚、ヘモグロビンＣは１２０秒経過後も溶出しなかった。
【００４２】
評価基準及び比較例４〜６で得られたクロマトグラムを図７に示した。図７において、（ｂ）は得られたクロマトグラムの拡大図である。
【００４３】
（比較例７）
溶離液２を、ｐＨ７．７で、３ｍｍｏｌ／Ｌのテトラブチルアンモニウムヒドロキシドを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００４４】
（比較例８）
溶離液２を、ｐＨ１１．０で、５ｍｍｏｌ／Ｌのテトラブチルアンモニウムヒドロキシドを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００４５】
（比較例９）
溶離液２を、ｐＨ１２．０で、１０ｍｍｏｌ／Ｌのテトラブチルアンモニウムヒドロキシドを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液に代えたこと以外は評価基準と同様にして、ヘモグロビン類の分析を行った。
【００４６】
評価基準及び比較例７〜９で得られたクロマトグラムを図８に示した。図８において、（ｂ）は得られたクロマトグラムの拡大図である。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によれば、等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類を含有する血液試料のヘモグロビン類の分析方法、特に、保持時間の長いヘモグロビン類の溶出速度を選択的に速くすることができるヘモグロビン類の分析方法を提供することができる。また、本発明によれば、等電点の異なる少なくとも２種類の蛋白質を含有する試料の蛋白質の分析方法を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類を含有する血液試料を、イオン交換基を有する固定相が充填された分離カラムに通して前記ヘモグロビン類を固定相に保持させ、分離カラムに溶離液を流すことで前記ヘモグロビン類を溶出させて分析する、イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の分析方法であって、
前記溶離液は、イオン対試薬を含有し、かつ、前記少なくとも２種類のヘモグロビン類の等電点の間のｐＨを有するものである
ことを特徴とするヘモグロビン類の分析方法。
【請求項２】
イオン交換基は陽イオン交換基であり、かつ、イオン対試薬は正の電荷を有することを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項３】
溶離液は、分離して分析を行う少なくとも２種類のヘモグロビン類の、最も高い等電点と最も低い等電点との間のｐＨを有することを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項４】
イオン対試薬がテトラブチルアンモニウム塩であることを特徴とする請求項１、２又は３記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項５】
イオン対試薬の溶離液中の濃度が５〜２５ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項６】
血液試料は、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有することを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項７】
溶離液のｐＨが、７．１〜７．３であることを特徴とする請求項６に記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項８】
等電点の異なる少なくとも２種類の蛋白質を含有する試料を、イオン交換基を有する固定相が充填された分離カラムに通して前記蛋白質を固定相に保持させ、前記分離カラムに溶離液を流すことで前記蛋白質を溶出させて分析する、イオン交換液体クロマトグラフィーによる蛋白質の分析方法であって、
前記溶離液は、イオン対試薬を含有し、かつ、前記少なくとも２種類の蛋白質の等電点の間のｐＨを有するものである
ことを特徴とする蛋白質の分析方法。
【請求項９】
溶離液は、分離して分析を行う少なくとも２種類の蛋白質の、最も高い等電点と最も低い等電点との間のｐＨを有することを特徴とする請求項８記載の蛋白質の分析方法。
【請求項１】
等電点の異なる少なくとも２種類のヘモグロビン類を含有する血液試料を、イオン交換基を有する固定相が充填された分離カラムに通して前記ヘモグロビン類を固定相に保持させ、分離カラムに溶離液を流すことで前記ヘモグロビン類を溶出させて分析する、イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の分析方法であって、
前記溶離液は、イオン対試薬を含有し、かつ、前記少なくとも２種類のヘモグロビン類の等電点の間のｐＨを有するものである
ことを特徴とするヘモグロビン類の分析方法。
【請求項２】
イオン交換基は陽イオン交換基であり、かつ、イオン対試薬は正の電荷を有することを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項３】
溶離液は、分離して分析を行う少なくとも２種類のヘモグロビン類の、最も高い等電点と最も低い等電点との間のｐＨを有することを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項４】
イオン対試薬がテトラブチルアンモニウム塩であることを特徴とする請求項１、２又は３記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項５】
イオン対試薬の溶離液中の濃度が５〜２５ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項６】
血液試料は、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有することを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項７】
溶離液のｐＨが、７．１〜７．３であることを特徴とする請求項６に記載のヘモグロビン類の分析方法。
【請求項８】
等電点の異なる少なくとも２種類の蛋白質を含有する試料を、イオン交換基を有する固定相が充填された分離カラムに通して前記蛋白質を固定相に保持させ、前記分離カラムに溶離液を流すことで前記蛋白質を溶出させて分析する、イオン交換液体クロマトグラフィーによる蛋白質の分析方法であって、
前記溶離液は、イオン対試薬を含有し、かつ、前記少なくとも２種類の蛋白質の等電点の間のｐＨを有するものである
ことを特徴とする蛋白質の分析方法。
【請求項９】
溶離液は、分離して分析を行う少なくとも２種類の蛋白質の、最も高い等電点と最も低い等電点との間のｐＨを有することを特徴とする請求項８記載の蛋白質の分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−２３７１１０（Ｐ２０１０−２３７１１０Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８６９１３（Ｐ２００９−８６９１３）
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
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