ヘモグロビン類分離用カラム充填剤、ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法、並びに、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法
【課題】ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン分離用カラム充填剤を提供する。また、該ヘモグロビン分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、該ヘモグロビン分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供する。更に、該ヘモグロビン分離用カラム充填剤の製造方法を提供する。
【解決手段】非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して得られる架橋重合体粒子と、前記架橋重合体粒子の表面に形成したカチオン交換基を有するアクリル系重合体層とからなるヘモグロビン分離用カラム充填剤。
【解決手段】非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して得られる架橋重合体粒子と、前記架橋重合体粒子の表面に形成したカチオン交換基を有するアクリル系重合体層とからなるヘモグロビン分離用カラム充填剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤及び該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法に関する。また、本発明は、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野においては、糖尿病診断の指標としてヘモグロビンＡ１ｃの測定が汎用的に行なわれている。ヘモグロビンＡ１ｃは、液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣともいう）、免疫法、酵素法等により測定されているが、なかでもＨＰＬＣは精度が良く、短時間に測定できるため、特に糖尿病患者のヘモグロビンＡ１ｃ値の管理に用いられている。
【０００３】
ＨＰＬＣでヘモグロビンＡ１ｃを測定する際、ヘモグロビンＡ１ｃを短時間かつ高精度に測定でき、しかもカラム耐久性を高くする（カラム寿命を長くする）ために、カラム充填剤に必要な要件の１つは、測定対象試料中の成分の非特異吸着が生じ難いことである。カラム充填剤に試料中の成分が非特異吸着すると、得られるクロマトグラムが変形してヘモグロビンＡ１ｃ値の測定精度が低下する。その結果、カラム耐久性が低くなり、カラム寿命が短くなる。
【０００４】
このような非特異吸着を抑制する方法としては、カラム充填剤に用いられる重合体粒子を親水性材料により調製する方法が考えられる。しかしながら、重合体粒子を親水性にするほど、カラム充填剤の耐圧性、耐膨潤性が低下するため、迅速な分析がし難くなる。
カラム充填剤の耐圧性等を低下させずにカラム充填剤を親水化させる手段として、耐圧性に優れた重合体粒子の表面を親水性高分子で被覆し、カラム充填剤を二層構造とする方法が公知である。例えば、特許文献１には、重合体粒子の表面を親水性高分子であるポリビニルアルコールで被覆し、重合体粒子表面にイオン交換基を導入したカラム充填剤が開示されている。しかしながら、このような親水性高分子の被覆は、高分子鎖の疎水性に依存した物理的な吸着によるものであるため、多数の試料を測定する場合には、測定を繰り返すことで被覆した親水性高分子が剥離し、測定精度が低下する可能性が大きい。
【０００５】
また、より強固に親水性高分子を架橋重合体粒子の表面に被覆して二層構造とする方法としては、架橋重合体粒子の表面で親水性単量体を重合させることにより、架橋重合体粒子の表面を親水性高分子で被覆する方法が挙げられる。特許文献２には、架橋重合体粒子の表面に親水性重合体の層を形成する方法が開示されており、親水性重合体として、カチオン交換性重合体を用いることにより、ヘモグロビンＡ１ｃを高精度に分離することができるカラム充填剤が得られるとしている。しかしながら、測定のより高速化、高精度化が要望される最近では、特許文献２のカラム充填剤でも分離性能が不充分なことが多い。また、特許文献２では、架橋重合体粒子を調製する際に、架橋性単量体を多く含む単量体混合物を重合して調製するため、未反応の不飽和二重結合が多く残存する。この二重結合は疎水性が強いため、非特異吸着を起こしやすいという問題がある。
【０００６】
臨床検査の現場においては、ヘモグロビンＡ１ｃ等のヘモグロビン類を、短時間で高精度に測定したいという強い要望があり、ＨＰＬＣに用いられるカラム充填剤に対しては、より高い分離性能が要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１１−１８３４６０号公報
【特許文献２】特開平０３−７３８４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類分離用カラム充填剤を提供することを目的とする。また、本発明は、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。更に、本発明は、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して得られる架橋重合体粒子と、上記架橋重合体粒子の表面において重合されてなる、カチオン交換基を有するアクリル系重合体層とからなるヘモグロビン類分離用カラム充填剤である。
また、上記ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、又は、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法も本発明の１つである。
更に、非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して架橋重合体粒子を形成する工程１、及び、上記架橋重合体粒子と、カチオン交換基を有するアクリル系単量体を重合開始剤の存在下で重合し、上記架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基を有するアクリル系重合体層を形成する工程２を有するヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法も本発明の１つである。
加えて、非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して架橋重合体粒子を形成する工程１、及び、上記架橋重合体粒子と、カチオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体とを重合開始剤の存在下で重合し、上記架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系重合体層を形成させ、上記カチオン交換基に変換可能な官能基をカチオン交換基に変換する工程２を有するヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法も本発明の１つである。
以下に本発明を詳述する。
【００１０】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤は、非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して得られる架橋重合体粒子を基材とする。
なお、本明細書において「アクリル系」とは、アクリル基又はメタクリル基を有することを意味する。また、本明細書において「（メタ）アクリル酸」とは、「アクリル酸又はメタクリル酸」であることを示す。
【００１１】
上記非架橋性の親水性アクリル系単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸アルキル類、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、水酸基又はグリシジル基を有する（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸アルキル類としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル等が挙げられる。
上記ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記水酸基又はグリシジル基を有する（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの非架橋性の親水性アクリル系単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用して用いてもよい。
また、上記非架橋性の親水性アクリル系単量体は、イオン交換基を有さない構造であることが好ましい。
【００１２】
上記単量体混合物を１００重量％とした場合の上記非架橋性の親水性アクリル系単量体の含有量は特に限定されないが、好ましい下限は２０重量％、好ましい上限は８０重量％である。非架橋性の親水性アクリル系単量体の含有量が２０重量％未満であると、後述するカチオン交換基を有するアクリル系重合体の重合率が低下し、ヘモグロビン類の正確な測定ができなくなることがある。非架橋性の親水性アクリル系単量体の含有量が８０重量％を超えると、後述するポリグリシジルエーテル類の架橋剤としての効果が充分に発揮されないことがある。上記非架橋性の親水性アクリル系単量体の含有量のより好ましい下限は２５重量％、より好ましい上限は７５重量％である。
【００１３】
上記ポリグリシジルエーテル類は、架橋剤としての役割を有する。上記非架橋性の親水性アクリル系単量体と上記ポリグリシジルエーテル類とを用いて、基材となる架橋重合体粒子を作製することにより、未反応の不飽和二重結合が残存することによる非特異吸着を抑制することができ、長期間に亘って高い精度の分離性能を維持できる。
上記ポリグリシジルエーテル類は、１分子内にグリシジル基を複数有するものであり、具体的には例えば、ジグリシジルエーテル類、トリグリシジルエーテル類等が挙げられる。また、上記ポリグリシジルエーテル類としては、親水性が大きく、かつ、イオン交換基を有さないことが好ましい。
上記ジグリシジルエーテル類としては、例えば、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセリンジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンジグリシジルエーテル、グリセリン−エピクロルヒドリンジグリシジルエーテル、エチレングリコール−エピクロルヒドリンジグリシジルエーテル等が挙げられる。
上記トリグリシジルエーテル類としては、例えば、トリメチロールプロパントリグリシジルエーテル、グリセリントリグリシジルエーテル、グリセリン−エピクロルヒドリントリグリシジルエーテル、エチレングリコール−エピクロルヒドリントリグリシジルエーテル等が挙げられる。
【００１４】
上記単量体混合物を１００重量％とした場合の上記ポリグリシジルエーテル類の含有量は特に限定されないが、好ましい下限は２０重量％、好ましい上限は８０重量％である。ポリグリシジルエーテル類の含有量が２０重量％未満であると、ポリグリシジルエーテル類の架橋剤としての効果が充分に発揮されないことがある。ポリグリシジルエーテル類の含有量が８０重量％を超えると、上記非架橋性の親水性アクリル系単量体の含有量が低下することにより、後述するカチオン交換基を有するアクリル系重合体の重合率が低下し、ヘモグロビン類の正確な測定ができなくなることがある。上記ポリグリシジルエーテル類の含有量のより好ましい下限は２５重量％、より好ましい上限は７５重量％である。
【００１５】
上記単量体混合物は、上記非架橋性の親水性アクリル系単量体及び上記ポリグリシジルエーテル類に加えて、必要に応じて、架橋性のアクリル系単量体を少量添加することもできる。上記架橋性のアクリル系単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリテトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール−テトラメチレングリコール）−ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１−（メタ）アクリロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン（メタ）ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリ（メタ）アクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガン−２，６，１０−トリオール等が挙げられる。
上記分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類としては、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの架橋性のアクリル系単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用して用いてもよい。
また、上記架橋性のアクリル系単量体は、イオン交換基を有さない構造であることが好ましい。
【００１６】
上記単量体混合物を１００重量％とした場合の上記架橋性のアクリル系単量体の含有量の好ましい上限は３０重量％である。架橋性のアクリル系単量体の含有量が３０重量％を超えると、得られる架橋重合体粒子に上記架橋性のアクリル系単量体の有する二重結合が残存し、この二重結合が有する疎水性により非特異吸着が誘発される。上記架橋性のアクリル系単量体の含有量のより好ましい上限は２０重量％である。
【００１７】
上記架橋重合体粒子の形状は特に限定されないが、球状であることが好ましく、真球状であることがより好ましい。
上記架橋重合体粒子の粒子径は特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は５０μｍである。架橋重合体粒子の粒子径が０．１μｍ未満であると、溶離液をカラムに流すために必要となる圧力が増大し、ＨＰＬＣの装置に耐圧性付与のための特殊な部品等が必要となる。架橋重合体粒子の粒子径が５０μｍを超えると、カラム内の空隙率が増大し、試料が拡散しやすくなり、ピークのブロード化等により測定精度が低下する場合がある。上記架橋重合体粒子の粒子径のより好ましい下限は０．５μｍ、より好ましい上限は３０μｍである。
【００１８】
本発明のヘモグロビン分離用カラム充填剤は、上記単量体混合物より調製された架橋重合体粒子と、上記架橋重合体粒子の表面に形成した、カチオン交換基を有するアクリル系重合体（以下、単にカチオン交換性重合体ともいう）層により構成される。
上記カチオン交換性重合体の有する「カチオン交換基」とは、公知のカチオン交換性を有する官能基を指し、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられ、特にスルホン酸基が好ましい。
なお、本発明でいうカチオン交換基は、カチオン交換基に付随する構造は問わず、上記カチオン交換基を末端に有する全ての官能基を含む。例えば、本発明でいう「カルボキシル基」とは、カルボキシルエチル基、カルボキシルプロピル基等、カルボキシル基が結合する官能基類全てを含む。
また、上記カチオン交換性重合体は、複数種のイオン交換基を有していてもよい。
【００１９】
上記カチオン交換性重合体は、（１）カチオン交換基を有するアクリル系単量体を重合して得られた重合体、又は、（２）カチオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体を重合し、後に当該官能基をカチオン交換基に変換して得られる重合体である。
【００２０】
上記（１）のカチオン交換性重合体を構成する「カチオン交換基を有するアクリル系単量体」としては、カチオン交換基、即ち、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等の上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体類が挙げられる。
【００２１】
上記カルボキシル基を有するアクリル系単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルサクシネート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルフタル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類が挙げられる。
【００２２】
上記リン酸基を有するアクリル系単量体としては、例えば、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート等の（メタ）アクリル酸誘導体類等が挙げられる。
【００２３】
上記スルホン酸基を有するアクリル系単量体としては、例えば、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−スルホエチル（メタ）アクリレート、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類等が挙げられる。
【００２４】
一方、上記（２）のカチオン交換性重合体を構成する、「カチオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体」とは、化学反応等によりカチオン交換基に変換可能な官能基、又は、後述するカチオン交換基を有する化合物と反応可能な官能基（以下、反応性官能基ともいう）を有するアクリル系単量体である。
ここでいう反応性官能基とは、非イオン交換性であり、かつ、後述するカチオン交換基を有する化合物と反応することができる官能基であり、例えば、水酸基、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられ、好ましくは水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基であり、より好ましくは、水酸基、エポキシ基、グリシジル基である。
【００２５】
上記反応性官能基を有するアクリル系単量体としては、（メタ）アクリル酸エステル類が好ましく、例えば、エポキシ化（メタ）アクリレート類、ヒドロキシル化（メタ）アクリレート類、アミノ化（メタ）アクリレート類、アルデヒド化（メタ）アクリレート類、シアノ化（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記エポキシ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ヒドロキシル化（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アミノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノエチル（メタ）アクリレート、２−アミノプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノプロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
上記アルデヒド化（メタ）アクリレート類としては、例えば、（メタ）アクロレイン等が挙げられる。
上記シアノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、シアノ（メタ）アクリレート、エチル−２−シアノアクリレート等が挙げられる。
これらの反応性官能基を有する単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用して用いてもよい。
【００２６】
上記（２）のカチオン交換性重合体を調製するためのカチオン交換基への変換は、上記反応性官能基を有するアクリル系単量体を重合して得られた、反応性官能基を有するアクリル系重合体の当該反応性官能基に、カチオン交換基を有する化合物を反応させることにより行われる。
【００２７】
上記反応性官能基を有するアクリル系重合体に、カチオン交換基を導入する方法としては、公知の化学反応による技術を用いることができる。下記に例示する方法は全て公知の化学反応であり、上記架橋重合体粒子や上記反応性官能基を有するアクリル系重合体層の分解等の反応を伴わない条件であれば、公知の反応を限定なく用いることができる。
【００２８】
上記反応性官能基を有するアクリル系重合体が有する水酸基を介して、カチオン交換基を導入する場合、例えば、ブロムエタンスルホン酸ナトリウム等のハロゲン化エタンスルホン酸類やクロロ酢酸ナトリウム等のハロゲン化酢酸類を、カチオン交換基を有する化合物として用い、これらの化合物を水酸化アルカリ水溶液中で反応させることにより、上記アクリル系重合体にカチオン交換基を導入することができる。
また、カチオン交換基を有するアルデヒド化合物を、酸触媒下にてアセタール反応により水酸基と反応させることにより、同様にカチオン交換基を導入することができる。
更に、例えば、トリカルバニル酸、ブタンテトラカルボン酸等の多官能カルボン酸化合物と水酸基の脱水反応によるエステル化により、カルボキシル基を導入することができる。
加えて、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させることによってもスルホン酸基を導入することができる。
【００２９】
また、エポキシ基、グリシジル基、又は、アミノ基を介してカチオン交換基を導入する場合、例えば、反応性官能基を有するアクリル系重合体に、エピクロルヒドリンやトリグリシジルエーテルのようなエポキシ化合物を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させてエポキシ化した後、硫酸ナトリウムやタウリン、グリコール酸等のカチオン交換基含有化合物を反応させる方法、三フッ化ホウ素エーテラートを結合した後、亜硫酸ナトリウム水溶液中で加熱処理する方法等が挙げられる。上記反応性官能基がエポキシ基やグリシジル基の場合には、そのまま上記処理に供してもよい。
【００３０】
本発明のヘモグロビン分離用カラム充填剤は、上記非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して得られた架橋重合体粒子、及び、重合開始剤の存在下において、上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体を重合し、上記架橋重合体粒子の表面にカチオン交換性重合体層を形成させることにより得ることができる。このような製造方法もまた、本発明の一つである。
【００３１】
本発明のヘモグロビン分離用カラム充填剤の製造方法においては、まず、架橋重合体粒子を調製する。この架橋重合体粒子は、上記非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を用いて、重合開始剤の存在下で重合反応を行うことにより調製される。上記重合反応の方法としては、例えば、乳化重合法、ソープフリー重合法、分散重合法、懸濁重合法、シード重合法等の公知の重合反応を適用することができる。なかでも、分散重合法、懸濁重合法、シード重合法等を用いることが好適である。
具体的には例えば、懸濁重合法の場合、上記単量体混合物に重合開始剤を溶解し、適当な分散媒中に分散させた後、必要に応じて窒素ガス等の不活性ガス雰囲気下にて攪拌しながら加温することにより、カラム充填剤として適当な、真球状の架橋重合体粒子を得ることができる。
【００３２】
上記重合開始剤としては、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤を用いることができ、例えば、過硫酸塩、有機過酸化物、アゾ化合物等が挙げられる。
上記過硫酸塩としては、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等が挙げられる。
上記有機過酸化物としては、例えば、クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド等が挙げられる。
上記アゾ化合物としては、例えば、２，２−アゾビスイソブチロニトリル、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル等が挙げられる。
【００３３】
上記単量体混合物１００重量部に対する上記重合開始剤の配合量の好ましい下限は０．０５重量部、好ましい上限は５重量部である。重合開始剤の配合量が０．０５重量部未満であると、重合反応が不充分となったり、重合反応に長時間要したりすることがある。重合開始剤の配合量が５重量部を超えると、急激な反応の進行により凝集物が発生することがある。
なお、上記重合開始剤は、上記単量体混合物に溶解させて用いることが好ましい。
【００３４】
また、重合に際しては、公知の重合方法において用いられる各種の添加剤等を添加してもよい。
上記添加剤としては、例えば、架橋重合体粒子にマクロポアを形成するための多孔質化剤、重合反応を制御するための各種連鎖移動剤、懸濁粒子を安定化されるための分散剤等が挙げられる。
【００３５】
具体的には例えば、多孔質化剤として上記単量体混合物を溶解するが重合体を溶解しない有機溶媒を上記単量体混合物に添加して重合反応を行い、重合反応後に上記多孔質剤を除去することにより、得られる架橋重合体粒子にマクロポアを形成することができる。このような有機溶媒としては、例えば、芳香族炭化水素類、飽和炭化水素類、アルコール類等が挙げられる。
上記芳香族炭化水素類としては、例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等が挙げられる。
上記飽和炭化水素類としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン等が挙げられる。
上記アルコール類としては、例えば、イソアミルアルコール、オクチルアルコール等のアルコール等が挙げられる。
上記単量体混合物１００重量部に対する上記多孔質化剤の配合量の好ましい上限は１００重量部である。
【００３６】
本発明のヘモグロビン分離用カラム充填剤の製造方法における次の工程は、得られた上記架橋重合体粒子の表面において上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体を重合する工程である。本工程は、上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体を、上記架橋重合体粒子、及び、上記重合開始剤の存在下で重合反応を行うことにより、上記架橋重合体粒子表面での重合反応が行われる。上記架橋重合体粒子の表面以外の部分で行われた反応、即ち、上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体のみからなる重合体粒子は、重合反応後に洗浄することで除去される。
【００３７】
上記架橋重合体粒子の表面で効率よく上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体を重合させるには、上記架橋重合体粒子内に上記重合開始剤を含有させた状態で、上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体を重合する方法を用いることが好ましい。上記架橋重合体粒子に上記重合開始剤を含有させる方法としては、例えば、上記架橋重合体粒子を膨潤させることができ、かつ、上記重合開始剤を溶解できる有機溶媒に上記重合開始剤を溶解し、更に、上記架橋重合体粒子をこの有機溶媒に含浸させる方法が挙げられる。この方法により上記重合開始剤を上記架橋重合体粒子の内部に含有させることができる。上記重合開始剤を含有する架橋重合体粒子を、上述した適当な分散媒中に分散し、上記カチオン交換基を有する単量体を添加して重合反応を行う。
【００３８】
また、上記架橋重合体粒子を調製する際の重合反応において、この重合反応が完了する前、即ち、上記重合開始剤が完全に消費される前に、上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体を反応系に添加することで、最初に添加した重合開始剤を利用して、上記架橋重合体粒子の表面に効率よくカチオン交換基を有する単量体を重合させることができる。
【００３９】
また、本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤は、上記非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して得られた架橋重合体粒子、及び、上記重合開始剤の存在下において、上記反応性官能基を有するアクリル系単量体を重合し、上記架橋重合体粒子の表面に、反応性官能基を有するアクリル系重合体層を形成させ、更にこの反応性官能基に上記カチオン交換基を有する化合物を反応させて、上記反応性官能基を有するアクリル系重合体をカチオン交換性重合体に変換することにより得ることができる。このような製造方法もまた、本発明の一つである。
【００４０】
反応性官能基を有する単量体を用いた場合の本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法も、上述したカチオン交換基を有する単量体を用いた場合と同様に行うことができる。即ち、上記反応性官能基を有するアクリル系重合体層を、上記架橋重合体粒子の表面に形成させた後、上述した方法によりカチオン交換性重合体に変換する。
【００４１】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、ヘモグロビンＡ１ｃ等の種々の蛋白質等の試料を測定することができる。本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたＨＰＬＣによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法もまた、本発明の一つである。
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いてＨＰＬＣによりヘモグロビンＡ１ｃ等のヘモグロビン類の測定を行なう場合には、溶離液送液用のポンプ、サンプラ、検出器等を備えた公知のＨＰＬＣシステムに、本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を充填したカラムを接続し、血液試料中のヘモグロビン類の測定を行なうことができる。
【００４２】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたＨＰＬＣに用いられる溶離液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましく、具体的には例えば、有機酸、無機酸、及び、これらの塩類、アミノ酸類、グッドの緩衝液等が挙げられる。
上記有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記無機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類としては、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
また、上記緩衝液には、他に一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。
ヘモグロビンＡ１ｃの測定を行う際の上記緩衝液の塩濃度の好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は１０００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記緩衝液の塩濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、イオン交換反応が行なわれず、ヘモグロビンを分離することができなくなることがある。上記緩衝液の塩濃度が１０００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、塩が析出しシステムに悪影響を及ぼすことがある。
【００４３】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用い、ＨＰＬＣにより、上記ヘモグロビンＡ１ｃに加えて、異常ヘモグロビン類を測定することができる。
このような測定方法もまた、本発明の一つである。
本発明の測定方法により測定できる異常ヘモグロビン類としては、例えば、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ等が挙げられる。また、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）やヘモグロビンＡ２を測定することもできる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤は、非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を素材とした架橋重合体粒子と、その表面に形成したカチオン交換性アクリル系重合体層により構成される。架橋重合体粒子内にポリグリシジルエーテル類を有することにより、非特異吸着が抑制され、従来のカラム充填剤を用いた測定よりも短時間での高分離性能が得られ、その結果、高精度な測定及びカラム耐久性能の向上が図られる。特にヘモグロビンＡ１ｃの測定において、高精度測定及びカラム耐久性の向上が達成される。
つまり、本発明によれば、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類分離用カラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。更に、本発明によれば、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図２】比較例２のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図３】実施例１のカラム充填剤を用いて異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図４】実施例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ２の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図５】実施例１、２、及び、比較例１のカラム充填剤の耐久性評価の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
（実施例１）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールモノメタクリレート（日油社製）２００ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（日油社製）２００ｇを混合した単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、カチオン交換基を有するアクリル系単量体として２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成社製）１００ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた架橋重合体粒子をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、スルホン酸基が導入された架橋重合体粒子（ヘモグロビン分離用カラム充填剤）を得た。
得られたヘモグロビン分離用カラム充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
【００４７】
上記ヘモグロビン分離用カラムを、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社製、「ＬＣ−１０Ａ」）に接続した。測定試料として、フッ化ナトリウム採血したヒト健常人血液を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により２００倍に溶血希釈したものを用いた。溶離液Ａとして２００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）、及び、溶離液Ｂとして４００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の２種の溶離液を用い、流速１．０ｍＬで送液して溶離液Ａから溶離液Ｂへのステップワイズグラジエント法により分離し、４１５ｎｍの吸光度を測定した結果、図１のクロマトグラムを得た。図１中、ピーク１がヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡ０である。ヘモグロビンＡ１ｃと他のヘモグロビン分画とが短時間内に良好に分離された。
【００４８】
（実施例２）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールモノメタクリレート１６０ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてグリセリンジグリシジルエーテル（日油社製）２４０ｇを用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００４９】
（実施例３）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてトリエチレングリコールモノメタクリレート（日油社製）１２０ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてトリメチロールプロパンジグリシジルエーテル（日油社製）２８０ｇを用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５０】
（実施例４）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてトリエチレングリコールモノメタクリレート２４０ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてグリセリントリグリシジルエーテル（日油社製）１６０ｇを用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５１】
（実施例５）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてトリエチレングリコールモノメタクリレート２８０ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてトリメチロールプロパントリグリシジルエーテル（日油社製）１２０ｇを用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５２】
（実施例６）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてトリエチレングリコールモノメタクリレート１２０ｇ、架橋性のアクリル系単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）８０ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル２００ｇを用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５３】
（実施例７）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールモノメタクリレート２００ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル２００ｇを混合した単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、イオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体として２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート（和光純薬工業社製）１００ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた架橋重合体粒子をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基に変換可能な水酸基が導入された架橋重合体粒子を得た。
得られた架橋重合体粒子５０ｇを、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬに分散させ、室温で４０ｇのエピクロルヒドリンを添加し、５時間反応させた。得られたエポキシ化重合体粒子４０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入された架橋重合体粒子（ヘモグロビン分離用カラム充填剤）を得た。
得られたヘモグロビン分離用カラム充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン類分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５４】
（比較例１）
本比較例では、ポリグリシジルエーテル類を用いずに、架橋性のアクリル系単量体を用いて架橋重合体粒子を調製した例を示す。
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールモノメタクリレート２００ｇ、及び、架橋性のアクリル系単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇを混合した単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を、実施例１と同様に処理して、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５５】
（比較例２）
本比較例では、非架橋性の親水性アクリル系単量体を用いずに、架橋重合体粒子を調製した例を示す。
スチレン（キシダ化学社製）２００ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル２００ｇを混合した単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を、実施例１と同様に処理して、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図２のクロマトグラムを得た。図２中、ピーク１がヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡ０である。実施例１のカラム充填剤により得られたクロマトグラム（図１）よりも測定時間を延長したにも関わらず、ヘモグロビンＡ１ｃの分離が不良であった。
【００５６】
更に、実施例及び比較例で得られたヘモグロビン類分離用カラムを用いて、以下の評価を行った。
【００５７】
（１）回収率試験
実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離用カラムを用いて、回収率試験を実施した。回収率は、カラムの代わりに内径０．２５ｍｍ、長さ１０００ｍｍのＰＥＥＫ製配管をＨＰＬＣに取り付け、実施例及び比較例で用いた試料を測定したときのピーク総面積に対する調製したヘモグロビン類分離用カラムを取り付けて測定したときのピーク総面積の比率（％）により求めた。結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】
実施例で調製したヘモグロビン類分離用カラムにおいては、ほぼ１００％の回収率が得られた。
一方、比較例１で調製したヘモグロビン類分離用カラムでは回収率が約８５％、比較例２のカラムでは２５％と低かった。これは、測定対象であるヘモグロビンがカラム充填剤に非特異的に吸着して溶出してこなかったためであると考えられる。
【００６０】
（２）修飾ヘモグロビン類の分離性能評価
実施例に用いたヒト健常人血液の代わりに、修飾ヘモグロビン類を含む試料を人為的に調製して測定し、そのヘモグロビンＡ１ｃピークとの分離性能を評価した。
修飾ヘモグロビン類を含む試料としては、レイバイルヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、公知の方法により調製した。
即ち、試料Ｌは、ヒト健常人血液に、グルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、ヒト健常人血液に、アセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、ヒト健常人血液に、シアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。
得られた修飾ヘモグロビン類を含む試料（試料Ｌ、試料Ａ、試料Ｃ）と、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いたヒト健常人血液（非修飾品）とを、実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離用カラムを用いて測定し、ヘモグロビンＡ１ｃの測定値を比較した。分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料のヘモグロビンＡ１ｃ値から非修飾品のヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより評価した。結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】
表２に示した実施例のΔ値は０．２％以下であり、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確にヘモグロビンＡ１ｃが測定できることがわかる。一方、比較例１のヘモグロビン類分離用カラムを用いた場合では、修飾ヘモグロビンが存在すると、ヘモグロビンＡ１ｃ値が大きく変動し、ヘモグロビンＡ１ｃ値を正確に測定することができなかった。また、比較例２のヘモグロビン類分離用カラムでは、ヘモグロビン類のピークが検出されなかったため、Δ値は算出できなかった。
【００６３】
（３）異常ヘモグロビン類の分離性能評価
実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離用カラムを用いて、異常ヘモグロビンとしてヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含む試料（ヘレナ研究所社製、「ＡＦＳＣヘモコントロール」）の測定を行った。
実施例１のヘモグロビン類分離用カラムを用いて測定した結果、得られたクロマトグラムを図３に示す。図３中、ピーク１はヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡ０、ピーク３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク４はヘモグロビンＳ、ピーク５はヘモグロビンＣを示す。実施例１のヘモグロビン類分離用カラムにおいては、異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを良好に分離することができた。他の実施例のカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のヘモグロビン類分離用カラムを用いて測定した場合、異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分離することはできなかった。
【００６４】
（４）ヘモグロビンＡ２の分離性能評価
実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離用カラムを用いて、ヘモグロビンＡ２を含む試料として、Ａ２コントロール（レベル２）（バイオラッド社製）を測定した。
実施例１のカラム充填剤を用いて測定して得られたクロマトグラムを図４に示す。図４中、ピーク１はヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡ０、ピーク３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク６はヘモグロビンＡ２を示す。実施例１のヘモグロビン類分離用カラムにおいて、ヘモグロビンＡ２を良好に分離することができた。他の実施例のカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のカラム充填剤を用いて測定した場合、ヘモグロビンＡ２を分離することはできなかった。
【００６５】
（５）カラム耐久性の評価
実施例１、２及び比較例１で調製したヘモグロビン類分離用カラムを用いて、同一のヒト健常人血液試料を連続測定し、ヘモグロビンＡ１ｃ値の推移を確認した。結果を図５に示す。
実施例１、２で調製したヘモグロビン類分離用カラムでは、３０００回測定においても測定値が変化しなかったが、比較例１で調製したヘモグロビン類分離用カラムを用いた場合は、測定値が低下し、カラム寿命が短いことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類分離用カラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。更に、本発明によれば、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法を提供することができる。
【符号の説明】
【００６７】
１ ヘモグロビンＡ１ｃ
２ ヘモグロビンＡ０
３ ヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）
４ ヘモグロビンＳ
５ ヘモグロビンＣ
６ ヘモグロビンＡ２
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤及び該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法に関する。また、本発明は、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野においては、糖尿病診断の指標としてヘモグロビンＡ１ｃの測定が汎用的に行なわれている。ヘモグロビンＡ１ｃは、液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣともいう）、免疫法、酵素法等により測定されているが、なかでもＨＰＬＣは精度が良く、短時間に測定できるため、特に糖尿病患者のヘモグロビンＡ１ｃ値の管理に用いられている。
【０００３】
ＨＰＬＣでヘモグロビンＡ１ｃを測定する際、ヘモグロビンＡ１ｃを短時間かつ高精度に測定でき、しかもカラム耐久性を高くする（カラム寿命を長くする）ために、カラム充填剤に必要な要件の１つは、測定対象試料中の成分の非特異吸着が生じ難いことである。カラム充填剤に試料中の成分が非特異吸着すると、得られるクロマトグラムが変形してヘモグロビンＡ１ｃ値の測定精度が低下する。その結果、カラム耐久性が低くなり、カラム寿命が短くなる。
【０００４】
このような非特異吸着を抑制する方法としては、カラム充填剤に用いられる重合体粒子を親水性材料により調製する方法が考えられる。しかしながら、重合体粒子を親水性にするほど、カラム充填剤の耐圧性、耐膨潤性が低下するため、迅速な分析がし難くなる。
カラム充填剤の耐圧性等を低下させずにカラム充填剤を親水化させる手段として、耐圧性に優れた重合体粒子の表面を親水性高分子で被覆し、カラム充填剤を二層構造とする方法が公知である。例えば、特許文献１には、重合体粒子の表面を親水性高分子であるポリビニルアルコールで被覆し、重合体粒子表面にイオン交換基を導入したカラム充填剤が開示されている。しかしながら、このような親水性高分子の被覆は、高分子鎖の疎水性に依存した物理的な吸着によるものであるため、多数の試料を測定する場合には、測定を繰り返すことで被覆した親水性高分子が剥離し、測定精度が低下する可能性が大きい。
【０００５】
また、より強固に親水性高分子を架橋重合体粒子の表面に被覆して二層構造とする方法としては、架橋重合体粒子の表面で親水性単量体を重合させることにより、架橋重合体粒子の表面を親水性高分子で被覆する方法が挙げられる。特許文献２には、架橋重合体粒子の表面に親水性重合体の層を形成する方法が開示されており、親水性重合体として、カチオン交換性重合体を用いることにより、ヘモグロビンＡ１ｃを高精度に分離することができるカラム充填剤が得られるとしている。しかしながら、測定のより高速化、高精度化が要望される最近では、特許文献２のカラム充填剤でも分離性能が不充分なことが多い。また、特許文献２では、架橋重合体粒子を調製する際に、架橋性単量体を多く含む単量体混合物を重合して調製するため、未反応の不飽和二重結合が多く残存する。この二重結合は疎水性が強いため、非特異吸着を起こしやすいという問題がある。
【０００６】
臨床検査の現場においては、ヘモグロビンＡ１ｃ等のヘモグロビン類を、短時間で高精度に測定したいという強い要望があり、ＨＰＬＣに用いられるカラム充填剤に対しては、より高い分離性能が要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１１−１８３４６０号公報
【特許文献２】特開平０３−７３８４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類分離用カラム充填剤を提供することを目的とする。また、本発明は、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。更に、本発明は、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して得られる架橋重合体粒子と、上記架橋重合体粒子の表面において重合されてなる、カチオン交換基を有するアクリル系重合体層とからなるヘモグロビン類分離用カラム充填剤である。
また、上記ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、又は、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法も本発明の１つである。
更に、非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して架橋重合体粒子を形成する工程１、及び、上記架橋重合体粒子と、カチオン交換基を有するアクリル系単量体を重合開始剤の存在下で重合し、上記架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基を有するアクリル系重合体層を形成する工程２を有するヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法も本発明の１つである。
加えて、非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して架橋重合体粒子を形成する工程１、及び、上記架橋重合体粒子と、カチオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体とを重合開始剤の存在下で重合し、上記架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系重合体層を形成させ、上記カチオン交換基に変換可能な官能基をカチオン交換基に変換する工程２を有するヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法も本発明の１つである。
以下に本発明を詳述する。
【００１０】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤は、非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して得られる架橋重合体粒子を基材とする。
なお、本明細書において「アクリル系」とは、アクリル基又はメタクリル基を有することを意味する。また、本明細書において「（メタ）アクリル酸」とは、「アクリル酸又はメタクリル酸」であることを示す。
【００１１】
上記非架橋性の親水性アクリル系単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸アルキル類、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、水酸基又はグリシジル基を有する（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸アルキル類としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル等が挙げられる。
上記ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記水酸基又はグリシジル基を有する（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの非架橋性の親水性アクリル系単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用して用いてもよい。
また、上記非架橋性の親水性アクリル系単量体は、イオン交換基を有さない構造であることが好ましい。
【００１２】
上記単量体混合物を１００重量％とした場合の上記非架橋性の親水性アクリル系単量体の含有量は特に限定されないが、好ましい下限は２０重量％、好ましい上限は８０重量％である。非架橋性の親水性アクリル系単量体の含有量が２０重量％未満であると、後述するカチオン交換基を有するアクリル系重合体の重合率が低下し、ヘモグロビン類の正確な測定ができなくなることがある。非架橋性の親水性アクリル系単量体の含有量が８０重量％を超えると、後述するポリグリシジルエーテル類の架橋剤としての効果が充分に発揮されないことがある。上記非架橋性の親水性アクリル系単量体の含有量のより好ましい下限は２５重量％、より好ましい上限は７５重量％である。
【００１３】
上記ポリグリシジルエーテル類は、架橋剤としての役割を有する。上記非架橋性の親水性アクリル系単量体と上記ポリグリシジルエーテル類とを用いて、基材となる架橋重合体粒子を作製することにより、未反応の不飽和二重結合が残存することによる非特異吸着を抑制することができ、長期間に亘って高い精度の分離性能を維持できる。
上記ポリグリシジルエーテル類は、１分子内にグリシジル基を複数有するものであり、具体的には例えば、ジグリシジルエーテル類、トリグリシジルエーテル類等が挙げられる。また、上記ポリグリシジルエーテル類としては、親水性が大きく、かつ、イオン交換基を有さないことが好ましい。
上記ジグリシジルエーテル類としては、例えば、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセリンジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンジグリシジルエーテル、グリセリン−エピクロルヒドリンジグリシジルエーテル、エチレングリコール−エピクロルヒドリンジグリシジルエーテル等が挙げられる。
上記トリグリシジルエーテル類としては、例えば、トリメチロールプロパントリグリシジルエーテル、グリセリントリグリシジルエーテル、グリセリン−エピクロルヒドリントリグリシジルエーテル、エチレングリコール−エピクロルヒドリントリグリシジルエーテル等が挙げられる。
【００１４】
上記単量体混合物を１００重量％とした場合の上記ポリグリシジルエーテル類の含有量は特に限定されないが、好ましい下限は２０重量％、好ましい上限は８０重量％である。ポリグリシジルエーテル類の含有量が２０重量％未満であると、ポリグリシジルエーテル類の架橋剤としての効果が充分に発揮されないことがある。ポリグリシジルエーテル類の含有量が８０重量％を超えると、上記非架橋性の親水性アクリル系単量体の含有量が低下することにより、後述するカチオン交換基を有するアクリル系重合体の重合率が低下し、ヘモグロビン類の正確な測定ができなくなることがある。上記ポリグリシジルエーテル類の含有量のより好ましい下限は２５重量％、より好ましい上限は７５重量％である。
【００１５】
上記単量体混合物は、上記非架橋性の親水性アクリル系単量体及び上記ポリグリシジルエーテル類に加えて、必要に応じて、架橋性のアクリル系単量体を少量添加することもできる。上記架橋性のアクリル系単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリテトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール−テトラメチレングリコール）−ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１−（メタ）アクリロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン（メタ）ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリ（メタ）アクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガン−２，６，１０−トリオール等が挙げられる。
上記分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類としては、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの架橋性のアクリル系単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用して用いてもよい。
また、上記架橋性のアクリル系単量体は、イオン交換基を有さない構造であることが好ましい。
【００１６】
上記単量体混合物を１００重量％とした場合の上記架橋性のアクリル系単量体の含有量の好ましい上限は３０重量％である。架橋性のアクリル系単量体の含有量が３０重量％を超えると、得られる架橋重合体粒子に上記架橋性のアクリル系単量体の有する二重結合が残存し、この二重結合が有する疎水性により非特異吸着が誘発される。上記架橋性のアクリル系単量体の含有量のより好ましい上限は２０重量％である。
【００１７】
上記架橋重合体粒子の形状は特に限定されないが、球状であることが好ましく、真球状であることがより好ましい。
上記架橋重合体粒子の粒子径は特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は５０μｍである。架橋重合体粒子の粒子径が０．１μｍ未満であると、溶離液をカラムに流すために必要となる圧力が増大し、ＨＰＬＣの装置に耐圧性付与のための特殊な部品等が必要となる。架橋重合体粒子の粒子径が５０μｍを超えると、カラム内の空隙率が増大し、試料が拡散しやすくなり、ピークのブロード化等により測定精度が低下する場合がある。上記架橋重合体粒子の粒子径のより好ましい下限は０．５μｍ、より好ましい上限は３０μｍである。
【００１８】
本発明のヘモグロビン分離用カラム充填剤は、上記単量体混合物より調製された架橋重合体粒子と、上記架橋重合体粒子の表面に形成した、カチオン交換基を有するアクリル系重合体（以下、単にカチオン交換性重合体ともいう）層により構成される。
上記カチオン交換性重合体の有する「カチオン交換基」とは、公知のカチオン交換性を有する官能基を指し、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられ、特にスルホン酸基が好ましい。
なお、本発明でいうカチオン交換基は、カチオン交換基に付随する構造は問わず、上記カチオン交換基を末端に有する全ての官能基を含む。例えば、本発明でいう「カルボキシル基」とは、カルボキシルエチル基、カルボキシルプロピル基等、カルボキシル基が結合する官能基類全てを含む。
また、上記カチオン交換性重合体は、複数種のイオン交換基を有していてもよい。
【００１９】
上記カチオン交換性重合体は、（１）カチオン交換基を有するアクリル系単量体を重合して得られた重合体、又は、（２）カチオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体を重合し、後に当該官能基をカチオン交換基に変換して得られる重合体である。
【００２０】
上記（１）のカチオン交換性重合体を構成する「カチオン交換基を有するアクリル系単量体」としては、カチオン交換基、即ち、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等の上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体類が挙げられる。
【００２１】
上記カルボキシル基を有するアクリル系単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルサクシネート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルフタル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類が挙げられる。
【００２２】
上記リン酸基を有するアクリル系単量体としては、例えば、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート等の（メタ）アクリル酸誘導体類等が挙げられる。
【００２３】
上記スルホン酸基を有するアクリル系単量体としては、例えば、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−スルホエチル（メタ）アクリレート、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類等が挙げられる。
【００２４】
一方、上記（２）のカチオン交換性重合体を構成する、「カチオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体」とは、化学反応等によりカチオン交換基に変換可能な官能基、又は、後述するカチオン交換基を有する化合物と反応可能な官能基（以下、反応性官能基ともいう）を有するアクリル系単量体である。
ここでいう反応性官能基とは、非イオン交換性であり、かつ、後述するカチオン交換基を有する化合物と反応することができる官能基であり、例えば、水酸基、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられ、好ましくは水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基であり、より好ましくは、水酸基、エポキシ基、グリシジル基である。
【００２５】
上記反応性官能基を有するアクリル系単量体としては、（メタ）アクリル酸エステル類が好ましく、例えば、エポキシ化（メタ）アクリレート類、ヒドロキシル化（メタ）アクリレート類、アミノ化（メタ）アクリレート類、アルデヒド化（メタ）アクリレート類、シアノ化（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記エポキシ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ヒドロキシル化（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アミノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノエチル（メタ）アクリレート、２−アミノプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノプロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
上記アルデヒド化（メタ）アクリレート類としては、例えば、（メタ）アクロレイン等が挙げられる。
上記シアノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、シアノ（メタ）アクリレート、エチル−２−シアノアクリレート等が挙げられる。
これらの反応性官能基を有する単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用して用いてもよい。
【００２６】
上記（２）のカチオン交換性重合体を調製するためのカチオン交換基への変換は、上記反応性官能基を有するアクリル系単量体を重合して得られた、反応性官能基を有するアクリル系重合体の当該反応性官能基に、カチオン交換基を有する化合物を反応させることにより行われる。
【００２７】
上記反応性官能基を有するアクリル系重合体に、カチオン交換基を導入する方法としては、公知の化学反応による技術を用いることができる。下記に例示する方法は全て公知の化学反応であり、上記架橋重合体粒子や上記反応性官能基を有するアクリル系重合体層の分解等の反応を伴わない条件であれば、公知の反応を限定なく用いることができる。
【００２８】
上記反応性官能基を有するアクリル系重合体が有する水酸基を介して、カチオン交換基を導入する場合、例えば、ブロムエタンスルホン酸ナトリウム等のハロゲン化エタンスルホン酸類やクロロ酢酸ナトリウム等のハロゲン化酢酸類を、カチオン交換基を有する化合物として用い、これらの化合物を水酸化アルカリ水溶液中で反応させることにより、上記アクリル系重合体にカチオン交換基を導入することができる。
また、カチオン交換基を有するアルデヒド化合物を、酸触媒下にてアセタール反応により水酸基と反応させることにより、同様にカチオン交換基を導入することができる。
更に、例えば、トリカルバニル酸、ブタンテトラカルボン酸等の多官能カルボン酸化合物と水酸基の脱水反応によるエステル化により、カルボキシル基を導入することができる。
加えて、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させることによってもスルホン酸基を導入することができる。
【００２９】
また、エポキシ基、グリシジル基、又は、アミノ基を介してカチオン交換基を導入する場合、例えば、反応性官能基を有するアクリル系重合体に、エピクロルヒドリンやトリグリシジルエーテルのようなエポキシ化合物を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させてエポキシ化した後、硫酸ナトリウムやタウリン、グリコール酸等のカチオン交換基含有化合物を反応させる方法、三フッ化ホウ素エーテラートを結合した後、亜硫酸ナトリウム水溶液中で加熱処理する方法等が挙げられる。上記反応性官能基がエポキシ基やグリシジル基の場合には、そのまま上記処理に供してもよい。
【００３０】
本発明のヘモグロビン分離用カラム充填剤は、上記非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して得られた架橋重合体粒子、及び、重合開始剤の存在下において、上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体を重合し、上記架橋重合体粒子の表面にカチオン交換性重合体層を形成させることにより得ることができる。このような製造方法もまた、本発明の一つである。
【００３１】
本発明のヘモグロビン分離用カラム充填剤の製造方法においては、まず、架橋重合体粒子を調製する。この架橋重合体粒子は、上記非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を用いて、重合開始剤の存在下で重合反応を行うことにより調製される。上記重合反応の方法としては、例えば、乳化重合法、ソープフリー重合法、分散重合法、懸濁重合法、シード重合法等の公知の重合反応を適用することができる。なかでも、分散重合法、懸濁重合法、シード重合法等を用いることが好適である。
具体的には例えば、懸濁重合法の場合、上記単量体混合物に重合開始剤を溶解し、適当な分散媒中に分散させた後、必要に応じて窒素ガス等の不活性ガス雰囲気下にて攪拌しながら加温することにより、カラム充填剤として適当な、真球状の架橋重合体粒子を得ることができる。
【００３２】
上記重合開始剤としては、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤を用いることができ、例えば、過硫酸塩、有機過酸化物、アゾ化合物等が挙げられる。
上記過硫酸塩としては、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等が挙げられる。
上記有機過酸化物としては、例えば、クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド等が挙げられる。
上記アゾ化合物としては、例えば、２，２−アゾビスイソブチロニトリル、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル等が挙げられる。
【００３３】
上記単量体混合物１００重量部に対する上記重合開始剤の配合量の好ましい下限は０．０５重量部、好ましい上限は５重量部である。重合開始剤の配合量が０．０５重量部未満であると、重合反応が不充分となったり、重合反応に長時間要したりすることがある。重合開始剤の配合量が５重量部を超えると、急激な反応の進行により凝集物が発生することがある。
なお、上記重合開始剤は、上記単量体混合物に溶解させて用いることが好ましい。
【００３４】
また、重合に際しては、公知の重合方法において用いられる各種の添加剤等を添加してもよい。
上記添加剤としては、例えば、架橋重合体粒子にマクロポアを形成するための多孔質化剤、重合反応を制御するための各種連鎖移動剤、懸濁粒子を安定化されるための分散剤等が挙げられる。
【００３５】
具体的には例えば、多孔質化剤として上記単量体混合物を溶解するが重合体を溶解しない有機溶媒を上記単量体混合物に添加して重合反応を行い、重合反応後に上記多孔質剤を除去することにより、得られる架橋重合体粒子にマクロポアを形成することができる。このような有機溶媒としては、例えば、芳香族炭化水素類、飽和炭化水素類、アルコール類等が挙げられる。
上記芳香族炭化水素類としては、例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等が挙げられる。
上記飽和炭化水素類としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン等が挙げられる。
上記アルコール類としては、例えば、イソアミルアルコール、オクチルアルコール等のアルコール等が挙げられる。
上記単量体混合物１００重量部に対する上記多孔質化剤の配合量の好ましい上限は１００重量部である。
【００３６】
本発明のヘモグロビン分離用カラム充填剤の製造方法における次の工程は、得られた上記架橋重合体粒子の表面において上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体を重合する工程である。本工程は、上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体を、上記架橋重合体粒子、及び、上記重合開始剤の存在下で重合反応を行うことにより、上記架橋重合体粒子表面での重合反応が行われる。上記架橋重合体粒子の表面以外の部分で行われた反応、即ち、上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体のみからなる重合体粒子は、重合反応後に洗浄することで除去される。
【００３７】
上記架橋重合体粒子の表面で効率よく上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体を重合させるには、上記架橋重合体粒子内に上記重合開始剤を含有させた状態で、上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体を重合する方法を用いることが好ましい。上記架橋重合体粒子に上記重合開始剤を含有させる方法としては、例えば、上記架橋重合体粒子を膨潤させることができ、かつ、上記重合開始剤を溶解できる有機溶媒に上記重合開始剤を溶解し、更に、上記架橋重合体粒子をこの有機溶媒に含浸させる方法が挙げられる。この方法により上記重合開始剤を上記架橋重合体粒子の内部に含有させることができる。上記重合開始剤を含有する架橋重合体粒子を、上述した適当な分散媒中に分散し、上記カチオン交換基を有する単量体を添加して重合反応を行う。
【００３８】
また、上記架橋重合体粒子を調製する際の重合反応において、この重合反応が完了する前、即ち、上記重合開始剤が完全に消費される前に、上記カチオン交換基を有するアクリル系単量体を反応系に添加することで、最初に添加した重合開始剤を利用して、上記架橋重合体粒子の表面に効率よくカチオン交換基を有する単量体を重合させることができる。
【００３９】
また、本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤は、上記非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して得られた架橋重合体粒子、及び、上記重合開始剤の存在下において、上記反応性官能基を有するアクリル系単量体を重合し、上記架橋重合体粒子の表面に、反応性官能基を有するアクリル系重合体層を形成させ、更にこの反応性官能基に上記カチオン交換基を有する化合物を反応させて、上記反応性官能基を有するアクリル系重合体をカチオン交換性重合体に変換することにより得ることができる。このような製造方法もまた、本発明の一つである。
【００４０】
反応性官能基を有する単量体を用いた場合の本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法も、上述したカチオン交換基を有する単量体を用いた場合と同様に行うことができる。即ち、上記反応性官能基を有するアクリル系重合体層を、上記架橋重合体粒子の表面に形成させた後、上述した方法によりカチオン交換性重合体に変換する。
【００４１】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、ヘモグロビンＡ１ｃ等の種々の蛋白質等の試料を測定することができる。本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたＨＰＬＣによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法もまた、本発明の一つである。
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いてＨＰＬＣによりヘモグロビンＡ１ｃ等のヘモグロビン類の測定を行なう場合には、溶離液送液用のポンプ、サンプラ、検出器等を備えた公知のＨＰＬＣシステムに、本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を充填したカラムを接続し、血液試料中のヘモグロビン類の測定を行なうことができる。
【００４２】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたＨＰＬＣに用いられる溶離液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましく、具体的には例えば、有機酸、無機酸、及び、これらの塩類、アミノ酸類、グッドの緩衝液等が挙げられる。
上記有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記無機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類としては、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
また、上記緩衝液には、他に一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。
ヘモグロビンＡ１ｃの測定を行う際の上記緩衝液の塩濃度の好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は１０００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記緩衝液の塩濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、イオン交換反応が行なわれず、ヘモグロビンを分離することができなくなることがある。上記緩衝液の塩濃度が１０００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、塩が析出しシステムに悪影響を及ぼすことがある。
【００４３】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用い、ＨＰＬＣにより、上記ヘモグロビンＡ１ｃに加えて、異常ヘモグロビン類を測定することができる。
このような測定方法もまた、本発明の一つである。
本発明の測定方法により測定できる異常ヘモグロビン類としては、例えば、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ等が挙げられる。また、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）やヘモグロビンＡ２を測定することもできる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤は、非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を素材とした架橋重合体粒子と、その表面に形成したカチオン交換性アクリル系重合体層により構成される。架橋重合体粒子内にポリグリシジルエーテル類を有することにより、非特異吸着が抑制され、従来のカラム充填剤を用いた測定よりも短時間での高分離性能が得られ、その結果、高精度な測定及びカラム耐久性能の向上が図られる。特にヘモグロビンＡ１ｃの測定において、高精度測定及びカラム耐久性の向上が達成される。
つまり、本発明によれば、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類分離用カラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。更に、本発明によれば、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図２】比較例２のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図３】実施例１のカラム充填剤を用いて異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図４】実施例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ２の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図５】実施例１、２、及び、比較例１のカラム充填剤の耐久性評価の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
（実施例１）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールモノメタクリレート（日油社製）２００ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（日油社製）２００ｇを混合した単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、カチオン交換基を有するアクリル系単量体として２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成社製）１００ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた架橋重合体粒子をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、スルホン酸基が導入された架橋重合体粒子（ヘモグロビン分離用カラム充填剤）を得た。
得られたヘモグロビン分離用カラム充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
【００４７】
上記ヘモグロビン分離用カラムを、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社製、「ＬＣ−１０Ａ」）に接続した。測定試料として、フッ化ナトリウム採血したヒト健常人血液を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により２００倍に溶血希釈したものを用いた。溶離液Ａとして２００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）、及び、溶離液Ｂとして４００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の２種の溶離液を用い、流速１．０ｍＬで送液して溶離液Ａから溶離液Ｂへのステップワイズグラジエント法により分離し、４１５ｎｍの吸光度を測定した結果、図１のクロマトグラムを得た。図１中、ピーク１がヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡ０である。ヘモグロビンＡ１ｃと他のヘモグロビン分画とが短時間内に良好に分離された。
【００４８】
（実施例２）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールモノメタクリレート１６０ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてグリセリンジグリシジルエーテル（日油社製）２４０ｇを用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００４９】
（実施例３）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてトリエチレングリコールモノメタクリレート（日油社製）１２０ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてトリメチロールプロパンジグリシジルエーテル（日油社製）２８０ｇを用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５０】
（実施例４）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてトリエチレングリコールモノメタクリレート２４０ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてグリセリントリグリシジルエーテル（日油社製）１６０ｇを用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５１】
（実施例５）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてトリエチレングリコールモノメタクリレート２８０ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてトリメチロールプロパントリグリシジルエーテル（日油社製）１２０ｇを用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５２】
（実施例６）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてトリエチレングリコールモノメタクリレート１２０ｇ、架橋性のアクリル系単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）８０ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル２００ｇを用いた以外は、実施例１と同様に操作を行い、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５３】
（実施例７）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールモノメタクリレート２００ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル２００ｇを混合した単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、イオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体として２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート（和光純薬工業社製）１００ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた架橋重合体粒子をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基に変換可能な水酸基が導入された架橋重合体粒子を得た。
得られた架橋重合体粒子５０ｇを、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬに分散させ、室温で４０ｇのエピクロルヒドリンを添加し、５時間反応させた。得られたエポキシ化重合体粒子４０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入された架橋重合体粒子（ヘモグロビン分離用カラム充填剤）を得た。
得られたヘモグロビン分離用カラム充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン類分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５４】
（比較例１）
本比較例では、ポリグリシジルエーテル類を用いずに、架橋性のアクリル系単量体を用いて架橋重合体粒子を調製した例を示す。
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールモノメタクリレート２００ｇ、及び、架橋性のアクリル系単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇを混合した単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を、実施例１と同様に処理して、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５５】
（比較例２）
本比較例では、非架橋性の親水性アクリル系単量体を用いずに、架橋重合体粒子を調製した例を示す。
スチレン（キシダ化学社製）２００ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル２００ｇを混合した単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を、実施例１と同様に処理して、ヘモグロビン分離用カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図２のクロマトグラムを得た。図２中、ピーク１がヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡ０である。実施例１のカラム充填剤により得られたクロマトグラム（図１）よりも測定時間を延長したにも関わらず、ヘモグロビンＡ１ｃの分離が不良であった。
【００５６】
更に、実施例及び比較例で得られたヘモグロビン類分離用カラムを用いて、以下の評価を行った。
【００５７】
（１）回収率試験
実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離用カラムを用いて、回収率試験を実施した。回収率は、カラムの代わりに内径０．２５ｍｍ、長さ１０００ｍｍのＰＥＥＫ製配管をＨＰＬＣに取り付け、実施例及び比較例で用いた試料を測定したときのピーク総面積に対する調製したヘモグロビン類分離用カラムを取り付けて測定したときのピーク総面積の比率（％）により求めた。結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】
実施例で調製したヘモグロビン類分離用カラムにおいては、ほぼ１００％の回収率が得られた。
一方、比較例１で調製したヘモグロビン類分離用カラムでは回収率が約８５％、比較例２のカラムでは２５％と低かった。これは、測定対象であるヘモグロビンがカラム充填剤に非特異的に吸着して溶出してこなかったためであると考えられる。
【００６０】
（２）修飾ヘモグロビン類の分離性能評価
実施例に用いたヒト健常人血液の代わりに、修飾ヘモグロビン類を含む試料を人為的に調製して測定し、そのヘモグロビンＡ１ｃピークとの分離性能を評価した。
修飾ヘモグロビン類を含む試料としては、レイバイルヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、公知の方法により調製した。
即ち、試料Ｌは、ヒト健常人血液に、グルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、ヒト健常人血液に、アセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、ヒト健常人血液に、シアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。
得られた修飾ヘモグロビン類を含む試料（試料Ｌ、試料Ａ、試料Ｃ）と、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いたヒト健常人血液（非修飾品）とを、実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離用カラムを用いて測定し、ヘモグロビンＡ１ｃの測定値を比較した。分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料のヘモグロビンＡ１ｃ値から非修飾品のヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより評価した。結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】
表２に示した実施例のΔ値は０．２％以下であり、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確にヘモグロビンＡ１ｃが測定できることがわかる。一方、比較例１のヘモグロビン類分離用カラムを用いた場合では、修飾ヘモグロビンが存在すると、ヘモグロビンＡ１ｃ値が大きく変動し、ヘモグロビンＡ１ｃ値を正確に測定することができなかった。また、比較例２のヘモグロビン類分離用カラムでは、ヘモグロビン類のピークが検出されなかったため、Δ値は算出できなかった。
【００６３】
（３）異常ヘモグロビン類の分離性能評価
実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離用カラムを用いて、異常ヘモグロビンとしてヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含む試料（ヘレナ研究所社製、「ＡＦＳＣヘモコントロール」）の測定を行った。
実施例１のヘモグロビン類分離用カラムを用いて測定した結果、得られたクロマトグラムを図３に示す。図３中、ピーク１はヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡ０、ピーク３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク４はヘモグロビンＳ、ピーク５はヘモグロビンＣを示す。実施例１のヘモグロビン類分離用カラムにおいては、異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを良好に分離することができた。他の実施例のカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のヘモグロビン類分離用カラムを用いて測定した場合、異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分離することはできなかった。
【００６４】
（４）ヘモグロビンＡ２の分離性能評価
実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離用カラムを用いて、ヘモグロビンＡ２を含む試料として、Ａ２コントロール（レベル２）（バイオラッド社製）を測定した。
実施例１のカラム充填剤を用いて測定して得られたクロマトグラムを図４に示す。図４中、ピーク１はヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡ０、ピーク３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク６はヘモグロビンＡ２を示す。実施例１のヘモグロビン類分離用カラムにおいて、ヘモグロビンＡ２を良好に分離することができた。他の実施例のカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のカラム充填剤を用いて測定した場合、ヘモグロビンＡ２を分離することはできなかった。
【００６５】
（５）カラム耐久性の評価
実施例１、２及び比較例１で調製したヘモグロビン類分離用カラムを用いて、同一のヒト健常人血液試料を連続測定し、ヘモグロビンＡ１ｃ値の推移を確認した。結果を図５に示す。
実施例１、２で調製したヘモグロビン類分離用カラムでは、３０００回測定においても測定値が変化しなかったが、比較例１で調製したヘモグロビン類分離用カラムを用いた場合は、測定値が低下し、カラム寿命が短いことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類分離用カラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。更に、本発明によれば、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法を提供することができる。
【符号の説明】
【００６７】
１ ヘモグロビンＡ１ｃ
２ ヘモグロビンＡ０
３ ヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）
４ ヘモグロビンＳ
５ ヘモグロビンＣ
６ ヘモグロビンＡ２
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して得られる架橋重合体粒子と、
前記架橋重合体粒子の表面において重合されてなる、カチオン交換基を有するアクリル系重合体層とからなる
ことを特徴とするヘモグロビン類分離用カラム充填剤。
【請求項２】
単量体混合物が、非架橋性の親水性アクリル系単量体を２０〜８０重量％、及び、ポリグリシジルエーテル類を８０〜２０重量％含有することを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を製造する方法であって、
非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して架橋重合体粒子を形成する工程１、及び、
前記架橋重合体粒子と、カチオン交換基を有するアクリル系単量体を重合開始剤の存在下で重合し、前記架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基を有するアクリル系重合体層を形成する工程２を有する
ことを特徴とするヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法。
【請求項６】
請求項１又は２記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を製造する方法であって、
非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して架橋重合体粒子を形成する工程１、及び、
前記架橋重合体粒子と、カチオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体とを重合開始剤の存在下で重合し、前記架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系重合体層を形成させ、前記カチオン交換基に変換可能な官能基をカチオン交換基に変換する工程２を有する
ことを特徴とするヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法。
【請求項１】
非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して得られる架橋重合体粒子と、
前記架橋重合体粒子の表面において重合されてなる、カチオン交換基を有するアクリル系重合体層とからなる
ことを特徴とするヘモグロビン類分離用カラム充填剤。
【請求項２】
単量体混合物が、非架橋性の親水性アクリル系単量体を２０〜８０重量％、及び、ポリグリシジルエーテル類を８０〜２０重量％含有することを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を製造する方法であって、
非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して架橋重合体粒子を形成する工程１、及び、
前記架橋重合体粒子と、カチオン交換基を有するアクリル系単量体を重合開始剤の存在下で重合し、前記架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基を有するアクリル系重合体層を形成する工程２を有する
ことを特徴とするヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法。
【請求項６】
請求項１又は２記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を製造する方法であって、
非架橋性の親水性アクリル系単量体及びポリグリシジルエーテル類を含有する単量体混合物を重合して架橋重合体粒子を形成する工程１、及び、
前記架橋重合体粒子と、カチオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体とを重合開始剤の存在下で重合し、前記架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系重合体層を形成させ、前記カチオン交換基に変換可能な官能基をカチオン交換基に変換する工程２を有する
ことを特徴とするヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−４７８５８（Ｐ２０１１−４７８５８Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９７９７２（Ｐ２００９−１９７９７２）
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
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