ヘモグロビン類測定用カラム充填剤、ヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法、及び、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法
【課題】高耐久性で、高精度測定を行うことができる、液体クロマトグラフィー法ヘモグロビン類測定用カラム充填剤。
【解決手段】少なくとも非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を、前記単量体混合物は溶解するが前記単量体混合物を重合して得られた非イオン性の親水性架橋重合体は溶解しない溶媒中において、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、前記非イオン性の親水性架橋重合体に、前記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とにより製造する。
【解決手段】少なくとも非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を、前記単量体混合物は溶解するが前記単量体混合物を重合して得られた非イオン性の親水性架橋重合体は溶解しない溶媒中において、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、前記非イオン性の親水性架橋重合体に、前記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とにより製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐久性が高く、ヘモグロビン類の測定を高精度に行うことができるヘモグロビン類測定用カラム充填剤に関する。また、本発明は、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法、及び、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いるヘモグロビン類の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビン類、なかでも糖化ヘモグロビン類の一種であるヘモグロビンＡ１ｃは、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法として、精度が良く、短時間に測定できることから、特にＨＰＬＣ法が用いられている。
【０００３】
臨床検査の分野においては、短時間にかつ高精度に測定できることが要求される。例えば、糖尿病患者のヘモグロビンＡ１ｃ値の管理に用いられるためには、１試料当たり１〜２分での測定が可能であり、かつ、同時再現性試験のＣＶ値が１．０％以下程度であることが必要とされる。
更に、低コストでの測定を可能とするためには、カラム耐久性が高い（カラム寿命が長い）ことも要求される。
【０００４】
ヘモグロビンＡ１ｃを短時間かつ高精度に測定でき、低コストでの測定が可能でカラム耐久性の高いカラム充填剤には、測定対象となるヘモグロビン類の分離ピークがシャープであり、その状態を長期間にわたり維持することが必要とされる。分離ピークがブロード化すると、クロマトグラムが変形し、ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定精度を低下させ、カラム耐久性が短縮化する。
【０００５】
ヘモグロビンＡ１ｃを測定するためのカラム充填剤として、特許文献１及び特許文献２には、懸濁重合法により得られる、イオン交換基を有する架橋重合体が開示されている。しかしながら、特許文献１及び特許文献２に開示されているカラム充填剤は、懸濁重合法により得られる架橋重合体であるため、粒度分布が不均一であるという問題があった。
粒度分布を均一にするためには、分級操作等を行う方法が一般的である。しかし、分級操作は煩雑であるうえにロスが非常に大きく、現行の分級操作では粒度分布幅の調整に限界がある。分級操作では、粒度分布の不均一さに由来する試料の拡散によるピークのブロード化を充分に抑制できない。
【０００６】
粒度分布を均一にするためには、分散重合やシード重合等を用いて架橋重合体を得る方法も考えられる。しかし、ヘモグロビン類の測定に適した架橋重合体を分散重合やシード重合を用いて得ることは困難であった。
【特許文献１】特開平０３−２５５３６０号公報
【特許文献２】特開平０３−７３８４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、耐久性が高く、ヘモグロビン類の測定を高精度に行うことができるヘモグロビン類測定用カラム充填剤を提供することを目的とする。また、本発明は、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法、及び、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いるヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明１は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定に用いられるカラム充填剤であって、少なくとも、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を、上記単量体混合物は溶解するが上記単量体混合物を重合して得られた非イオン性の親水性架橋重合体は溶解しない溶媒中において、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、上記非イオン性の親水性架橋重合体に、上記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とにより製造されたものであり、上記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、上記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルであるヘモグロビン類測定用カラム充填剤である。
【０００９】
本発明２は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定に用いられるカラム充填剤であって、少なくとも、非架橋性高分子粒子に、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を吸収させた後、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、上記非イオン性の親水性架橋重合体に、上記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とにより製造されたものであり、上記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、上記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルであるヘモグロビン類測定用カラム充填剤である。
以下に本発明を詳述する。
【００１０】
本発明者は、特定の構造を有する単量体を含有する単量体混合物を重合して得られる、粒子径の均一な非イオン性の架橋性重合体を、イオン交換基を有する化合物と反応させることにより、粒度分布が均一化したヘモグロビン類測定用カラム充填剤を得ることができ、得られたカラム充填剤を用いることで、ヘモグロビン類の測定において高い測定精度及び高いカラム耐久性を発揮できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤は、非イオン性の親水性架橋重合体とイオン交換基とを有する化合物とを反応させて得られる。
上記非イオン性の親水性架橋重合体は、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を重合反応させて得られる。
【００１２】
上記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルである。
なお、本明細書において（メタ）アクリルとは、アクリル又はメタクリルを意味する。
【００１３】
上記アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
その他の本発明に用いられるアルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリテトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール−テトラメチレングリコール）−ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００１４】
上記ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１−（メタ）アクリロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン（メタ）ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリ（メタ）アクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガン−２，６，１０−トリオール等が挙げられる。
【００１５】
上記分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００１６】
上記非イオン性の架橋性単量体としては、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、アルキロールアルカン（メタ）アクリレート類が好適であり、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、及び、アルキロールアルカン（メタ）アクリレート類がより好適である。
【００１７】
上記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルである。なかでも、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、及び、２級アミノ基を有する（メタ）アクリル酸エステルであることが好適であり、水酸基、エポキシ基、及び、グリシジル基を有する（メタ）アクリル酸エステルであることがより好適である。
【００１８】
上記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としては、具体的には例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノエチル（メタ）アクリレート、２−アミノプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノプロピル（メタ）アクリレート、シアノ（メタ）アクリレート、エチルアクリレート等が挙げられる。
【００１９】
上記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体の配合量は特に限定されないが、上記非イオン性の架橋性単量体１００重量部に対して、好ましい下限は１０重量部、好ましい上限は１００重量部である。上記非イオン性の親水性単量体の配合量が１０重量部未満であると、反応性官能基量が少なくなるため、後述のイオン交換基の導入量が減少し、充分なイオン交換反応が行われない場合がある。上記非イオン性の親水性単量体の配合量が１００重量部を超えると、重合反応の途中で凝集することがある。
【００２０】
上記単量体混合物は、更に、非イオン性の非架橋性単量体を含有してもよい。
上記単量体混合物が上記非イオン性の非架橋性単量体を含有することにより、本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤の化学的性能を変化させて、ピークの分離状態を適宜変えることができる。
【００２１】
上記非イオン性の非架橋性単量体は特に限定されないが、（メタ）アクリル酸エステルであることが好適であり、例えば、（メタ）アクリル酸アルキル類、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸アルキル類は特に限定されず、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル等が挙げられる。
上記ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの非イオン性の非架橋性単量体は、単独で用いてもよいし、複数を併用して用いてもよい。
【００２２】
上記非イオン性の非架橋性単量体の配合量は特に限定されないが、上記非イオン性の架橋性単量体１００重量部に対して、好ましい上限は３０重量部である。上記非架橋性単量体の配合量が３０重量部を超えると、得られるカラム充填剤の耐圧性や耐膨潤性が低下することがある。上記非架橋性単量体の配合量のより好ましい上限は２０重量部である。
【００２３】
本発明１のヘモグロビン類測定用カラム充填剤における上記非イオン性の親水性架橋重合体を得る重合反応は、上記単量体混合物は溶解するが得られる非イオン性の親水性架橋重合体は溶解しない溶媒に、上記単量体混合物を溶解し、重合開始剤の存在下で重合を行う分散重合反応である。
上記溶媒は、上記単量体混合物が溶解し、得られる非イオン性の親水性架橋重合体が溶解しない液体であれば特に限定されず、上記単量体混合物の種類により適宜選択される。なかでも、アルコール類、アセトン、アセトニトリル、芳香族炭化水素類等の有機溶媒類が好適である。
上記アルコール類は特に限定されず、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、オクチルアルコール等が挙げられる。
上記芳香族炭化水素類は特に限定されず、例えば、トルエン、キシレン等が挙げられる。
【００２４】
加温、放射線照射等によって上記重合開始剤がラジカルを発生する条件にすることにより、上記重合反応を行うことができる。
上記重合開始剤は特に限定されず、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤を用いることができ、例えば、過硫酸塩、有機過酸化物、アゾ化合物等が挙げられる。
上記過硫酸塩は特に限定されず、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等が挙げられる。
上記有機過酸化物は特に限定されず、例えば、クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド等が挙げられる。
上記アゾ化合物は特に限定されず、例えば、２，２−アゾビスイソブヒロニトリル、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル等が挙げられる
【００２５】
上記重合開始剤の配合量は特に限定されないが、単量体混合物１００重量部に対して、好ましい下限は０．００１重量部、好ましい上限は５重量部である。上記重合開始剤の配合量が０．００１重量部未満であると、重合反応が不充分となる場合や、重合反応に長時間要することがある。上記重合開始剤の配合量が５重量部を超えると、急激な反応の進行により、凝集物が発生することがある。
なお、上記重合開始剤は、上記単量体混合物に溶解させて用いることが好ましい。
【００２６】
また、重合に際しては、必要に応じて、重合体にマクロポアを形成するための多孔質化剤、重合反応を制御するための各種連鎖移動剤、懸濁粒子を安定化されるための分散剤等の公知の各種添加剤を添加してもよい。
【００２７】
上記イオン交換基を有する化合物は、上記非イオン性の親水性架橋重合体と反応することで、上記非イオン性の親水性架橋重合体にイオン交換基を導入する役割を有する。
【００２８】
上記イオン交換基は、公知のイオン交換性を有する官能基を指し、カチオン交換基であってもよいし、アニオン交換基であってもよい。
上記カチオン交換基は特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。
上記アニオン交換基は特に限定されず、例えば、３級アミノ基、４級アンモニウム基等が挙げられる。
なかでも、ヘモグロビンＡ１ｃの分離については、カチオン交換基であることが好適であり、特にスルホン酸基であることが好適である。
なお、上記イオン交換基を末端に有していれば、上記イオン交換基に付随する構造は特に限定されない。例えば、本明細書における「カルボキシル基」とは、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基等、カルボキシル基が結合する全ての官能基類を指す。
【００２９】
本発明２のヘモグロビン類測定用カラム充填剤では、本発明１における上記重合反応によって得られる非イオン性の親水性架橋重合体の代わりに、上記重合反応と同様の単量体混合物及び重合開始剤を用い、以下の方法で行われる重合反応によって得られる非イオン性の親水性架橋重合体を用いる。すなわち、非架橋性高分子粒子に上記単量体混合物を吸収させ、重合開始剤の存在下にて重合することで、非イオン性の親水性架橋重合体が得られる。
【００３０】
上記非架橋性高分子は、下記単量体混合物を吸収できるものであれば、低架橋性高分子からなるものであってもよい（以下、上記非架橋性高分子及び低架橋性高分子の両者を、単に非架橋性高分子ともいう）。
上記非架橋性高分子は、非架橋性単量体を重合して得られる高分子を意味し、上記低架橋性高分子は、非架橋性単量体と少量の架橋性単量体とを共重合して得られる高分子を意味する。
なお、上記低架橋高分子において、原料となる架橋性単量体の含有量は特に限定されないが、上記非架橋性単量体１００重量部に対して、好ましい上限は１０重量部である。
【００３１】
上記の非架橋性高分子は、（メタ）アクリレート類の単独重合体又は共重合体であることが好ましい。これらの非架橋性高分子を構成する単量体は、（メタ）アクリレート類である上記非イオン性の非架橋性単量体又は上記非イオン性の架橋性単量体が用いられる。
【００３２】
上記非架橋性高分子粒子に上記単量体混合物を吸収させる方法は特に限定されず、例えば、上記非架橋性高分子粒子を単量体混合物溶液に浸漬する方法等が挙げられる。上記非架橋性高分子粒子に上記単量体混合物を吸収させる際に、有機溶媒等を添加すると、吸収効率が増大する場合がある。また、上記非架橋性高分子粒子に上記単量体混合物を吸収させる際に、上記単量体混合物と共に、本発明１と同様の重合開始剤を吸収させることもできる。
【００３３】
上記単量体混合物を吸収した非架橋性高分子粒子を、必要に応じて添加される分散剤等の各種の添加剤が添加された水、有機溶媒、又は、これらの混合物等の分散媒に分散させ、上記重合開始剤の存在下で加温等により重合反応を行うことにより、非イオン性の親水性架橋重合体が得られる。この際の添加剤としては、本発明１と同様の添加剤を用いることができる。
【００３４】
上記のいずれかの方法により得られた非イオン性の親水性架橋重合体に、該非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させることにより、本発明のカラム充填剤が得られる。
【００３５】
上記非イオン性の親水性架橋重合体にイオン交換基を有する化合物を反応させる方法は、公知の化学反応による技術を用いることができる。下記に例示する方法は全て公知の化学反応であり、上記非イオン性の親水性架橋重合体の分解等の反応を伴わない条件であれば、公知の反応を限定なく用いることができる。
【００３６】
上記非イオン性の親水性重合体の非イオン性の親水性基が水酸基である場合、例えば、ブロモエタンスルホン酸ナトリウム等のハロゲン化エタンスルホン酸や、クロロ酢酸ナトリウム等のハロゲン化酢酸等を、上記イオン交換基を有する化合物として用いれば、これらの化合物を水酸化アルカリ水溶液中で反応させることにより、上記非イオン性の親水性重合体に上記イオン交換基を導入することができる。
【００３７】
上記非イオン性の親水性重合体の非イオン性の親水性基が水酸基である場合、例えば、イオン交換基を有するアルデヒド化合物を上記イオン交換基を有する化合物として用いれば、酸触媒下にてアセタール反応をさせることにより、上記非イオン性の親水性重合体に上記イオン交換基を導入することができる。
【００３８】
上記非イオン性の親水性重合体の非イオン性の親水性基が水酸基である場合、例えば、トリカルバニル酸、ブタンテトラカルボン酸等の多官能カルボン化合物を上記イオン交換基を有する化合物として用いれば、水酸基の脱水反応によるエステル化反応をさせることにより、上記非イオン性の親水性重合体に上記イオン交換基を導入することができる。
【００３９】
上記非イオン性の親水性重合体の非イオン性の親水性基が水酸基である場合、例えば、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等を上記イオン交換基を有する化合物として用いれば、これらの化合物を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させることにより、上記非イオン性の親水性重合体にスルホン酸基を導入することができる。
【００４０】
上記非イオン性の親水性重合体の非イオン性の親水性基がエポキシ基、グリシジル基、又は、アミノ基である場合、例えば、非イオン性の親水性重合体に、エピクロルヒドリンやトリグリシジルエーテル等のエポキシ化合物を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させてエポキシ化した後、硫酸ナトリウムやタウリン、グリコール酸等のカチオン交換基を有する化合物を反応させる方法や、三フッ化ホウ素エーテラートを結合した後、亜硫酸ナトリウム水溶液中で加熱処理する方法等により上記非イオン性の親水性重合体に上記イオン交換基を導入することができる。同様に、水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中に塩酸２−クロロトリエチルアミン水溶液を添加することにより、３級アミノ基を導入することができる。
なお、上記非イオン性の親水性架橋重合体がエポキシ基やグリシジル基を有する場合には、そのままイオン交換基を有する化合物と反応させてもよい。
【００４１】
本発明のカラム充填剤の平均粒子径は特に限定されないが、好ましい下限は０．５μｍ、好ましい上限は５０μｍである。上記平均粒子径が上記範囲外であると、ヘモグロビン類のピークがブロードになり易くなり、特に長期間使用した場合のブロード化現象が顕著になって測定精度が低下することがある。上記非イオン性の親水性架橋重合体の平均粒子径のより好ましい下限は１μｍ、より好ましい上限は２０μｍである。
【００４２】
本発明のカラム充填剤の粒子径のＣＶ値は特に限定されないが、好ましい上限は１０％である。上記粒子径のＣＶ値が１０％を超えると、ヘモグロビン類のピークがブロードになり易くなり、特に長期間使用した場合のブロード化現象が顕著になって測定精度が低下することがある。上記粒子径のＣＶ値のより好ましい上限は５％である。
なお、本明細書において粒子径のＣＶ値とは、下記式（１）により求められる数値のことである。
粒子径のＣＶ値（％）＝（σ／Ｄｎ）×１００ （１）
上記式（１）中、σは粒子径の標準偏差を表し、Ｄｎは平均粒子径を表す。
【００４３】
ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を製造する方法であって、少なくとも、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を、上記単量体混合物は溶解するが上記単量体混合物を重合して得られた非イオン性の親水性架橋重合体は溶解しない溶媒中において、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、上記非イオン性の親水性架橋重合体に、上記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とを有するものであり、上記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、上記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルであるヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法もまた、本発明の１つである。
【００４４】
ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を製造する方法であって、少なくとも、非架橋性高分子粒子に非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を吸収させた後、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、上記非イオン性の親水性架橋重合体に、上記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とを有するものであり、上記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、上記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルであるヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法もまた、本発明の１つである。
【００４５】
本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いる液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法もまた、本発明の１つである。
本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を充填したカラムを、溶離液送液用のポンプ、サンプラ、検出器等を備えた公知のＨＰＬＣシステムに接続し、血液試料を用いることでヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なうことができる。
【００４６】
本発明のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に用いる溶離液は特に限定されないが、公知の緩衝液を用いることが好ましい。
上記緩衝液は特に限定されず、例えば、有機酸及び有機酸の塩類、アミノ酸類、無機酸及びその塩類、グッドの緩衝液類等が挙げられる。
上記有機酸は特に限定されず、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類は特に限定されず、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
上記無機酸は特に限定されず、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
また、上記緩衝液は、必要に応じて、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。
【００４７】
上記緩衝液の塩濃度は特に限定されないが、好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は１０００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記緩衝液の塩濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、イオン交換反応が行なわれず、ヘモグロビン類を分離することができなくなることがある。上記緩衝液の塩濃度が１０００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、塩が析出しシステムに悪影響を及ぼすことがある。
【００４８】
本発明のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法を用いれば、ヘモグロビンＡ１ｃに加えて、ヘモグロビンＡｏ、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）、ヘモグロビンＡ２等のヘモグロビン類を分離することができる。
また、上記のヘモグロビン類に加えて、異常ヘモグロビン類を測定することができる。
本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いる液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法もまた、本発明の１つである。
上記異常ヘモグロビン類としては、具体的には例えば、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ等が挙げられる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明によれば、耐久性が高く、ヘモグロビン類の測定を高精度に行うことができるヘモグロビン類測定用カラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法、及び、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いるヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００５１】
（実施例１）
非イオン性の架橋性単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ及びトリメチロールエタントリアクリレート（新中村化学工業社製）５０ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてグリセリンメタクリレート（日本油脂社製）５０ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、５Ｌのエチルアルコールに溶解させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で６０℃に加温し、２４時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、非イオン性の親水性架橋重合体を得た。
得られた非イオン性の親水性架橋重合体５０ｇを、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬに分散させ、室温において、エピクロルヒドリン４０ｇを添加し、５時間反応させた。得られたエポキシ化重合体４０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は３．５μｍ、粒子径のＣＶ値は１．３％であった。
得られた充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製した。
【００５２】
得られたヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社製、「ＬＣ−１０Ａ」）に接続した。測定試料として、フッ化ナトリウム採血した健常人血液を０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により２００倍に溶血希釈した試料を用いた。溶離液としては、２００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（溶離液Ａ、ｐＨ５．３）、及び、４００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（溶離液Ｂ、ｐＨ７．５）の２種を用い、流速１．０ｍＬで送液して溶離液Ａから溶離液Ｂへのステップワイズグラジエント法により分離し、４１５ｎｍの吸光度を測定して図１のクロマトグラムを得た。図１中、ピーク１がヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡｏである。ヘモグロビンＡ１ｃが他のヘモグロビン分画と短時間内で良好に分離された。
【００５３】
（実施例２）
非イオン性の架橋性単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３５０ｇと、非イオン性の非架橋性単量体としてエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂社製）５０ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてグリシジルメタクリレート（日本油脂社製）１００ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、５Ｌのエチルアルコールに溶解し、攪拌しながら窒素雰囲気下で６０℃に加温し、２４時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、非イオン性の親水性架橋重合体を得た。
得られた非イオン性の親水性架橋重合体５０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は３．０μｍ、粒子径のＣＶ値は１．１％であった。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５４】
（実施例３）
非イオン性の架橋性単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２０ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてグリシジルメタクリレート（日本油脂社製）５ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（ナカライテスク社製）０．２ｇを添加して溶解し、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液１Ｌに微分散させた。
この溶液に、非架橋性高分子粒子として平均粒子径０．３μｍのポリメチルメタクリレート粒子５０ｇを分散させた、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液２００ｍＬを添加した。更に４％ポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液３００ｍＬを添加し、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１０時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、非イオン性の親水性架橋重合体を得た。
得られた非イオン性の親水性架橋重合体５０ｇを、２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は４．２μｍ、粒子径のＣＶ値は２．６％であった。
得られた充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５５】
（実施例４）
非イオン性の架橋性単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２０ｇと、非イオン性の非架橋性単量体としてエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂社製）５ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてグリセリンメタクリレート（日本油脂社製）５ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（ナカライテスク社製）０．２ｇを添加して溶解し、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液１Ｌに微分散させた。
この溶液に、非架橋性高分子粒子として平均粒子径０．２７μｍのメチルメタクリレート−トリエチレングリコールジメタクリレート共重合体粒子（架橋度５％）５０ｇを分散させた、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液２００ｍＬを添加した。更に４％ポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液３００ｍＬを添加し、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１０時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、非イオン性の親水性架橋重合体を得た。
得られた非イオン性の親水性架橋重合体５０ｇを、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬに分散させ、室温において、エピクロルヒドリン４０ｇを添加し、５時間反応させた。得られたエポキシ化重合体４０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は４．０μｍ、粒子径のＣＶ値は２．１％であった。
得られた充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５６】
（比較例１）
本比較例では、実施例２の充填剤を構成する単量体を用いて、従来技術である懸濁重合法により、架橋重合体を調製した後、イオン交換基を導入する方法の例を示す。
非イオン性の架橋性単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇと、非イオン性の非架橋性単量体としてエチレングリコールモノメタクリレート（和光純薬工業社製）５０ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてグリシジルメタクリレート（和光純薬工業社製）５０ｇとを混合し、得られた混合物に、重合開始剤としてベンゾイルパーオキサイド（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、４％のポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液５Ｌに溶解し、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１２時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、架橋重合体を得た。
得られた架橋重合体５０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は６．５μｍ、粒子径のＣＶ値は１５．３％であった。懸濁重合法を用いたため、均一な粒子径の充填剤は得られなかった。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図２のクロマトグラムを得た。図２中、ピーク１がヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡｏである。実施例２のカラム充填剤を用いて得られたクロマトグラム（図１と同様）よりも測定時間を延長したにも関わらず、ヘモグロビンＡ１ｃの分離が不良であった。
【００５７】
（比較例２）
本比較例では、従来技術である懸濁重合法により、架橋性単量体とイオン交換基を有する単量体を共重合する方法、すなわち、実施例１における反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体の代わりに、イオン交換基を有する単量体を用いた懸濁重合法の例を示す。
非イオン性の架橋性単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇ及びトリメチロールエタントリアクリレート（新中村化学工業社製）５０ｇの混合物に、重合開始剤としてベンゾイルパーオキサイド（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液５Ｌに溶解し、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。３０℃に冷却した後、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成化学社製）１００ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、カラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は７．６μｍ、粒子径のＣＶ値は２１．３％であった。懸濁重合法を用いたため、均一な粒子径の充填剤は得られなかった。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図２と同様のクロマトグラムが得られ、ヘモグロビンＡ１ｃの分離は不良であった。
【００５８】
（比較例３）
本比較例では、実施例１における、非イオン性の親水性架橋重合体を構成する単量体を、本発明の範囲外のものに変更して得られた充填剤の例を示す。
非イオン性の架橋性単量体としてジビニルベンゼン（ナカライテスク社製）２００ｇと、非イオン性の非架橋性単量体としてスチレン（新中村化学工業社製）５０ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてグリセリンメタクリレート（日本油脂社製）５０ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、５Ｌのエチルアルコールに溶解させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で６０℃に加温し、２４時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、非イオン性の親水性架橋重合体を得た。
得られた非イオン性の親水性架橋重合体５０ｇを、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬに分散させ、室温において、エピクロルヒドリン４０ｇを添加し、５時間反応させた。得られたエポキシ化重合体４０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は３．２μｍ、粒子径のＣＶ値は２．０％であった。
得られた充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図２と同様のクロマトグラムが得られ、ヘモグロビンＡ１ｃの分離が不良であった。
【００５９】
（比較例４）
本比較例では、実施例１における反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体の代わりに、イオン交換基を有する単量体を用いた例を示す。
非イオン性の架橋性単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ及びトリメチロールエタントリアクリレート（新中村化学工業社製）５０ｇと、イオン交換基（スルホン酸基）を有する単量体として２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成化学社製）５０ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、５Ｌのエチルアルコールに溶解させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で６０℃に加温し、２４時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は４．５μｍ、粒子径のＣＶ値は１８．０％であった。
得られた充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図２と同様のクロマトグラムが得られ、ヘモグロビンＡ１ｃの分離が不良であった。
【００６０】
（比較例５）
本比較例では、実施例３における非イオン性の親水性単量体の代わりに、イオン交換基を有する単量体を、非架橋性高分子粒子に吸収させる単量体として用いた例を示す。
非イオン性の架橋性単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２０ｇと、イオン交換基を有する単量体として２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成化学社製）５ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（ナカライテスク社製）０．２ｇを添加して溶解し、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液１Ｌに微分散させた。
この溶液に、非架橋性高分子粒子として平均粒子径０．３μｍのポリメチルメタクリレート粒子５０ｇを分散させた、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液２００ｍＬを添加した。更に４％ポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液３００ｍＬを添加し、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、重合反応を行おうとしたが、重合反応中に凝集塊が発生し、重合体が粒子として得られなかった。
【００６１】
（比較例６）
本比較例では、実施例４におけるメチルメタクリレート−トリエチレングリコールジメタクリレート共重合体粒子の代わりにポリスチレンを非架橋性高分子粒子として用い、テトラエチレングリコールジメタクリレートの代わりにジビニルベンゼンを非イオン性の架橋性単量体としてとして用いた例を示す。
非イオン性の架橋性単量体としてジビニルベンゼン（新中村化学工業社製）２０ｇと、非イオン性の非架橋性単量体としてスチレン（日本油脂社製）５ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてグリセリンメタクリレート（日本油脂社製）５ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（ナカライテスク社製）０．２ｇを添加して溶解し、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液１Ｌに微分散させた。
この溶液に、非架橋性高分子粒子として平均粒子径０．２７μｍのポリスチレン粒子５０ｇを分散させた、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液２００ｍＬを添加した。更に４％ポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液３００ｍＬを添加し、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１０時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、非イオン性の架橋重合体を得た。
得られた非イオン性の架橋重合体５０ｇを、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬに分散させ、室温において、エピクロルヒドリン４０ｇを添加し、５時間反応させた。得られたエポキシ化重合体４０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は４．０μｍ、粒子径のＣＶ値は３．２％であった。
得られた充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図２と同様のクロマトグラムが得られ、ヘモグロビンＡ１ｃの分離が不良であった。
【００６２】
（比較例７）
本比較例では、実施例１における、非イオン性の親水性架橋重合体を構成する単量体を、本発明の範囲外のものに変更して得られた充填剤の例を示す。
非イオン性の架橋性単量体としてジエチレングリコールジビニルエーテル（和光純薬社製）３００ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてアリルグリシジルエーテル（日本油脂社製）５０ｇとを混合し、得られた混合物に、重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、５Ｌのエチルアルコールに溶解させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で６０℃に加温し、重合反応を行おうとしたが、重合反応中に凝集塊が発生し、重合体が粒子として得られなかった。
【００６３】
（修飾ヘモグロビン類の分離性能評価）
得られたカラム充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製し、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社製、ＬＣ−１０Ａ）に接続した。
修飾ヘモグロビン類としては、レイバイルヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、公知の方法により調製した。
すなわち、試料Ｌは、健常人血液にグルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、健常人血液にアセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、健常人血液にシアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。
上記修飾ヘモグロビン類を含む試料（試料Ｌ、試料Ａ、試料Ｃ）、及び、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いた健常人血液（非修飾品）を、実施例及び比較例で得られたカラム充填剤を用いて測定し、各カラム充填剤の分離性能を評価した。分離性能の評価は、修飾ヘモグロビン試料のヘモグロビンＡ１ｃ値から非修飾品のヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより行なった。得られたΔ値を表１に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
表１より、実施例で得られたカラム充填剤を用いた場合のΔ値はいずれも０．２％以下であり、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確にヘモグロビンＡ１ｃが測定できることが判った。一方、比較例のカラム充填剤を用いた場合では、修飾ヘモグロビンが存在すると、ヘモグロビンＡ１ｃ値が大きく変動し、ヘモグロビンＡ１ｃ値を正確に測定することができなかった。
【００６６】
（異常ヘモグロビン類の分離性能評価）
実施例及び比較例で得られたカラム充填剤を用いて、異常ヘモグロビンとしてヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含む試料（ヘレナ研究所社製、「ＡＦＳＣヘモコントロール」）の測定を行った。
実施例１で得られたカラム充填剤を用いて測定し、得られたクロマトグラムを図３に示す。図３中、ピーク１はヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡｏ、ピーク３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク４はヘモグロビンＳ、ピーク５はヘモグロビンＣを示す。図３より、実施例１で得られたカラム充填剤を用いて異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを良好に分離することができた。実施例２、３及び４で得られたカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のカラム充填剤を用いて測定した場合、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分離することはできなかった。
【００６７】
（ヘモグロビンＡ２の分離性能評価）
実施例及び比較例で得られたカラム充填剤を用いて、ヘモグロビンＡ２を含む試料としてＡ２コントロール（レベル２）（バイオラッド社製）を測定した。
実施例１で得られたカラム充填剤を用いて測定し、得られたクロマトグラムを図４に示す。図４中、ピーク１はヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡｏ、ピーク３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク６はヘモグロビンＡ２を示す。図４より、実施例１で得られたカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ２を良好に分離することができた。実施例２、３及び４で得られたカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のカラム充填剤を用いて測定した場合、ヘモグロビンＡ２を分離することはできなかった。
【００６８】
（カラム耐久性の評価）
実施例及び比較例で得られたカラム充填剤を用いて、同一の健常人血液試料を連続測定し、ヘモグロビンＡ１ｃ値の推移を確認した。結果を図５に示す。
実施例で得られたカラム充填剤では、３０００回測定においても測定値が変化しなかったが、比較例のカラム充填剤を用いた場合は、測定値が低下し、カラム寿命が短いことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、耐久性が高く、ヘモグロビン類の測定を高精度に行うことができるヘモグロビン類測定用カラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法、及び、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いるヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】実施例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図２】比較例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図３】実施例１のカラム充填剤を用いて異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図４】実施例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ２の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図５】実施例及び比較例のカラム充填剤の耐久性評価の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐久性が高く、ヘモグロビン類の測定を高精度に行うことができるヘモグロビン類測定用カラム充填剤に関する。また、本発明は、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法、及び、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いるヘモグロビン類の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビン類、なかでも糖化ヘモグロビン類の一種であるヘモグロビンＡ１ｃは、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法として、精度が良く、短時間に測定できることから、特にＨＰＬＣ法が用いられている。
【０００３】
臨床検査の分野においては、短時間にかつ高精度に測定できることが要求される。例えば、糖尿病患者のヘモグロビンＡ１ｃ値の管理に用いられるためには、１試料当たり１〜２分での測定が可能であり、かつ、同時再現性試験のＣＶ値が１．０％以下程度であることが必要とされる。
更に、低コストでの測定を可能とするためには、カラム耐久性が高い（カラム寿命が長い）ことも要求される。
【０００４】
ヘモグロビンＡ１ｃを短時間かつ高精度に測定でき、低コストでの測定が可能でカラム耐久性の高いカラム充填剤には、測定対象となるヘモグロビン類の分離ピークがシャープであり、その状態を長期間にわたり維持することが必要とされる。分離ピークがブロード化すると、クロマトグラムが変形し、ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定精度を低下させ、カラム耐久性が短縮化する。
【０００５】
ヘモグロビンＡ１ｃを測定するためのカラム充填剤として、特許文献１及び特許文献２には、懸濁重合法により得られる、イオン交換基を有する架橋重合体が開示されている。しかしながら、特許文献１及び特許文献２に開示されているカラム充填剤は、懸濁重合法により得られる架橋重合体であるため、粒度分布が不均一であるという問題があった。
粒度分布を均一にするためには、分級操作等を行う方法が一般的である。しかし、分級操作は煩雑であるうえにロスが非常に大きく、現行の分級操作では粒度分布幅の調整に限界がある。分級操作では、粒度分布の不均一さに由来する試料の拡散によるピークのブロード化を充分に抑制できない。
【０００６】
粒度分布を均一にするためには、分散重合やシード重合等を用いて架橋重合体を得る方法も考えられる。しかし、ヘモグロビン類の測定に適した架橋重合体を分散重合やシード重合を用いて得ることは困難であった。
【特許文献１】特開平０３−２５５３６０号公報
【特許文献２】特開平０３−７３８４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、耐久性が高く、ヘモグロビン類の測定を高精度に行うことができるヘモグロビン類測定用カラム充填剤を提供することを目的とする。また、本発明は、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法、及び、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いるヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明１は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定に用いられるカラム充填剤であって、少なくとも、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を、上記単量体混合物は溶解するが上記単量体混合物を重合して得られた非イオン性の親水性架橋重合体は溶解しない溶媒中において、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、上記非イオン性の親水性架橋重合体に、上記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とにより製造されたものであり、上記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、上記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルであるヘモグロビン類測定用カラム充填剤である。
【０００９】
本発明２は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定に用いられるカラム充填剤であって、少なくとも、非架橋性高分子粒子に、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を吸収させた後、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、上記非イオン性の親水性架橋重合体に、上記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とにより製造されたものであり、上記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、上記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルであるヘモグロビン類測定用カラム充填剤である。
以下に本発明を詳述する。
【００１０】
本発明者は、特定の構造を有する単量体を含有する単量体混合物を重合して得られる、粒子径の均一な非イオン性の架橋性重合体を、イオン交換基を有する化合物と反応させることにより、粒度分布が均一化したヘモグロビン類測定用カラム充填剤を得ることができ、得られたカラム充填剤を用いることで、ヘモグロビン類の測定において高い測定精度及び高いカラム耐久性を発揮できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤は、非イオン性の親水性架橋重合体とイオン交換基とを有する化合物とを反応させて得られる。
上記非イオン性の親水性架橋重合体は、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を重合反応させて得られる。
【００１２】
上記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルである。
なお、本明細書において（メタ）アクリルとは、アクリル又はメタクリルを意味する。
【００１３】
上記アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
その他の本発明に用いられるアルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリテトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール−テトラメチレングリコール）−ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００１４】
上記ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１−（メタ）アクリロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン（メタ）ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリ（メタ）アクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガン−２，６，１０−トリオール等が挙げられる。
【００１５】
上記分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００１６】
上記非イオン性の架橋性単量体としては、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、アルキロールアルカン（メタ）アクリレート類が好適であり、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、及び、アルキロールアルカン（メタ）アクリレート類がより好適である。
【００１７】
上記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルである。なかでも、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、及び、２級アミノ基を有する（メタ）アクリル酸エステルであることが好適であり、水酸基、エポキシ基、及び、グリシジル基を有する（メタ）アクリル酸エステルであることがより好適である。
【００１８】
上記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としては、具体的には例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノエチル（メタ）アクリレート、２−アミノプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジアミノプロピル（メタ）アクリレート、シアノ（メタ）アクリレート、エチルアクリレート等が挙げられる。
【００１９】
上記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体の配合量は特に限定されないが、上記非イオン性の架橋性単量体１００重量部に対して、好ましい下限は１０重量部、好ましい上限は１００重量部である。上記非イオン性の親水性単量体の配合量が１０重量部未満であると、反応性官能基量が少なくなるため、後述のイオン交換基の導入量が減少し、充分なイオン交換反応が行われない場合がある。上記非イオン性の親水性単量体の配合量が１００重量部を超えると、重合反応の途中で凝集することがある。
【００２０】
上記単量体混合物は、更に、非イオン性の非架橋性単量体を含有してもよい。
上記単量体混合物が上記非イオン性の非架橋性単量体を含有することにより、本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤の化学的性能を変化させて、ピークの分離状態を適宜変えることができる。
【００２１】
上記非イオン性の非架橋性単量体は特に限定されないが、（メタ）アクリル酸エステルであることが好適であり、例えば、（メタ）アクリル酸アルキル類、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸アルキル類は特に限定されず、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル等が挙げられる。
上記ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類は特に限定されず、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの非イオン性の非架橋性単量体は、単独で用いてもよいし、複数を併用して用いてもよい。
【００２２】
上記非イオン性の非架橋性単量体の配合量は特に限定されないが、上記非イオン性の架橋性単量体１００重量部に対して、好ましい上限は３０重量部である。上記非架橋性単量体の配合量が３０重量部を超えると、得られるカラム充填剤の耐圧性や耐膨潤性が低下することがある。上記非架橋性単量体の配合量のより好ましい上限は２０重量部である。
【００２３】
本発明１のヘモグロビン類測定用カラム充填剤における上記非イオン性の親水性架橋重合体を得る重合反応は、上記単量体混合物は溶解するが得られる非イオン性の親水性架橋重合体は溶解しない溶媒に、上記単量体混合物を溶解し、重合開始剤の存在下で重合を行う分散重合反応である。
上記溶媒は、上記単量体混合物が溶解し、得られる非イオン性の親水性架橋重合体が溶解しない液体であれば特に限定されず、上記単量体混合物の種類により適宜選択される。なかでも、アルコール類、アセトン、アセトニトリル、芳香族炭化水素類等の有機溶媒類が好適である。
上記アルコール類は特に限定されず、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、オクチルアルコール等が挙げられる。
上記芳香族炭化水素類は特に限定されず、例えば、トルエン、キシレン等が挙げられる。
【００２４】
加温、放射線照射等によって上記重合開始剤がラジカルを発生する条件にすることにより、上記重合反応を行うことができる。
上記重合開始剤は特に限定されず、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤を用いることができ、例えば、過硫酸塩、有機過酸化物、アゾ化合物等が挙げられる。
上記過硫酸塩は特に限定されず、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等が挙げられる。
上記有機過酸化物は特に限定されず、例えば、クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド等が挙げられる。
上記アゾ化合物は特に限定されず、例えば、２，２−アゾビスイソブヒロニトリル、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル等が挙げられる
【００２５】
上記重合開始剤の配合量は特に限定されないが、単量体混合物１００重量部に対して、好ましい下限は０．００１重量部、好ましい上限は５重量部である。上記重合開始剤の配合量が０．００１重量部未満であると、重合反応が不充分となる場合や、重合反応に長時間要することがある。上記重合開始剤の配合量が５重量部を超えると、急激な反応の進行により、凝集物が発生することがある。
なお、上記重合開始剤は、上記単量体混合物に溶解させて用いることが好ましい。
【００２６】
また、重合に際しては、必要に応じて、重合体にマクロポアを形成するための多孔質化剤、重合反応を制御するための各種連鎖移動剤、懸濁粒子を安定化されるための分散剤等の公知の各種添加剤を添加してもよい。
【００２７】
上記イオン交換基を有する化合物は、上記非イオン性の親水性架橋重合体と反応することで、上記非イオン性の親水性架橋重合体にイオン交換基を導入する役割を有する。
【００２８】
上記イオン交換基は、公知のイオン交換性を有する官能基を指し、カチオン交換基であってもよいし、アニオン交換基であってもよい。
上記カチオン交換基は特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。
上記アニオン交換基は特に限定されず、例えば、３級アミノ基、４級アンモニウム基等が挙げられる。
なかでも、ヘモグロビンＡ１ｃの分離については、カチオン交換基であることが好適であり、特にスルホン酸基であることが好適である。
なお、上記イオン交換基を末端に有していれば、上記イオン交換基に付随する構造は特に限定されない。例えば、本明細書における「カルボキシル基」とは、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基等、カルボキシル基が結合する全ての官能基類を指す。
【００２９】
本発明２のヘモグロビン類測定用カラム充填剤では、本発明１における上記重合反応によって得られる非イオン性の親水性架橋重合体の代わりに、上記重合反応と同様の単量体混合物及び重合開始剤を用い、以下の方法で行われる重合反応によって得られる非イオン性の親水性架橋重合体を用いる。すなわち、非架橋性高分子粒子に上記単量体混合物を吸収させ、重合開始剤の存在下にて重合することで、非イオン性の親水性架橋重合体が得られる。
【００３０】
上記非架橋性高分子は、下記単量体混合物を吸収できるものであれば、低架橋性高分子からなるものであってもよい（以下、上記非架橋性高分子及び低架橋性高分子の両者を、単に非架橋性高分子ともいう）。
上記非架橋性高分子は、非架橋性単量体を重合して得られる高分子を意味し、上記低架橋性高分子は、非架橋性単量体と少量の架橋性単量体とを共重合して得られる高分子を意味する。
なお、上記低架橋高分子において、原料となる架橋性単量体の含有量は特に限定されないが、上記非架橋性単量体１００重量部に対して、好ましい上限は１０重量部である。
【００３１】
上記の非架橋性高分子は、（メタ）アクリレート類の単独重合体又は共重合体であることが好ましい。これらの非架橋性高分子を構成する単量体は、（メタ）アクリレート類である上記非イオン性の非架橋性単量体又は上記非イオン性の架橋性単量体が用いられる。
【００３２】
上記非架橋性高分子粒子に上記単量体混合物を吸収させる方法は特に限定されず、例えば、上記非架橋性高分子粒子を単量体混合物溶液に浸漬する方法等が挙げられる。上記非架橋性高分子粒子に上記単量体混合物を吸収させる際に、有機溶媒等を添加すると、吸収効率が増大する場合がある。また、上記非架橋性高分子粒子に上記単量体混合物を吸収させる際に、上記単量体混合物と共に、本発明１と同様の重合開始剤を吸収させることもできる。
【００３３】
上記単量体混合物を吸収した非架橋性高分子粒子を、必要に応じて添加される分散剤等の各種の添加剤が添加された水、有機溶媒、又は、これらの混合物等の分散媒に分散させ、上記重合開始剤の存在下で加温等により重合反応を行うことにより、非イオン性の親水性架橋重合体が得られる。この際の添加剤としては、本発明１と同様の添加剤を用いることができる。
【００３４】
上記のいずれかの方法により得られた非イオン性の親水性架橋重合体に、該非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させることにより、本発明のカラム充填剤が得られる。
【００３５】
上記非イオン性の親水性架橋重合体にイオン交換基を有する化合物を反応させる方法は、公知の化学反応による技術を用いることができる。下記に例示する方法は全て公知の化学反応であり、上記非イオン性の親水性架橋重合体の分解等の反応を伴わない条件であれば、公知の反応を限定なく用いることができる。
【００３６】
上記非イオン性の親水性重合体の非イオン性の親水性基が水酸基である場合、例えば、ブロモエタンスルホン酸ナトリウム等のハロゲン化エタンスルホン酸や、クロロ酢酸ナトリウム等のハロゲン化酢酸等を、上記イオン交換基を有する化合物として用いれば、これらの化合物を水酸化アルカリ水溶液中で反応させることにより、上記非イオン性の親水性重合体に上記イオン交換基を導入することができる。
【００３７】
上記非イオン性の親水性重合体の非イオン性の親水性基が水酸基である場合、例えば、イオン交換基を有するアルデヒド化合物を上記イオン交換基を有する化合物として用いれば、酸触媒下にてアセタール反応をさせることにより、上記非イオン性の親水性重合体に上記イオン交換基を導入することができる。
【００３８】
上記非イオン性の親水性重合体の非イオン性の親水性基が水酸基である場合、例えば、トリカルバニル酸、ブタンテトラカルボン酸等の多官能カルボン化合物を上記イオン交換基を有する化合物として用いれば、水酸基の脱水反応によるエステル化反応をさせることにより、上記非イオン性の親水性重合体に上記イオン交換基を導入することができる。
【００３９】
上記非イオン性の親水性重合体の非イオン性の親水性基が水酸基である場合、例えば、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等を上記イオン交換基を有する化合物として用いれば、これらの化合物を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させることにより、上記非イオン性の親水性重合体にスルホン酸基を導入することができる。
【００４０】
上記非イオン性の親水性重合体の非イオン性の親水性基がエポキシ基、グリシジル基、又は、アミノ基である場合、例えば、非イオン性の親水性重合体に、エピクロルヒドリンやトリグリシジルエーテル等のエポキシ化合物を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させてエポキシ化した後、硫酸ナトリウムやタウリン、グリコール酸等のカチオン交換基を有する化合物を反応させる方法や、三フッ化ホウ素エーテラートを結合した後、亜硫酸ナトリウム水溶液中で加熱処理する方法等により上記非イオン性の親水性重合体に上記イオン交換基を導入することができる。同様に、水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中に塩酸２−クロロトリエチルアミン水溶液を添加することにより、３級アミノ基を導入することができる。
なお、上記非イオン性の親水性架橋重合体がエポキシ基やグリシジル基を有する場合には、そのままイオン交換基を有する化合物と反応させてもよい。
【００４１】
本発明のカラム充填剤の平均粒子径は特に限定されないが、好ましい下限は０．５μｍ、好ましい上限は５０μｍである。上記平均粒子径が上記範囲外であると、ヘモグロビン類のピークがブロードになり易くなり、特に長期間使用した場合のブロード化現象が顕著になって測定精度が低下することがある。上記非イオン性の親水性架橋重合体の平均粒子径のより好ましい下限は１μｍ、より好ましい上限は２０μｍである。
【００４２】
本発明のカラム充填剤の粒子径のＣＶ値は特に限定されないが、好ましい上限は１０％である。上記粒子径のＣＶ値が１０％を超えると、ヘモグロビン類のピークがブロードになり易くなり、特に長期間使用した場合のブロード化現象が顕著になって測定精度が低下することがある。上記粒子径のＣＶ値のより好ましい上限は５％である。
なお、本明細書において粒子径のＣＶ値とは、下記式（１）により求められる数値のことである。
粒子径のＣＶ値（％）＝（σ／Ｄｎ）×１００ （１）
上記式（１）中、σは粒子径の標準偏差を表し、Ｄｎは平均粒子径を表す。
【００４３】
ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を製造する方法であって、少なくとも、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を、上記単量体混合物は溶解するが上記単量体混合物を重合して得られた非イオン性の親水性架橋重合体は溶解しない溶媒中において、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、上記非イオン性の親水性架橋重合体に、上記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とを有するものであり、上記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、上記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルであるヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法もまた、本発明の１つである。
【００４４】
ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を製造する方法であって、少なくとも、非架橋性高分子粒子に非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を吸収させた後、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、上記非イオン性の親水性架橋重合体に、上記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とを有するものであり、上記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、上記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルであるヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法もまた、本発明の１つである。
【００４５】
本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いる液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法もまた、本発明の１つである。
本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を充填したカラムを、溶離液送液用のポンプ、サンプラ、検出器等を備えた公知のＨＰＬＣシステムに接続し、血液試料を用いることでヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なうことができる。
【００４６】
本発明のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に用いる溶離液は特に限定されないが、公知の緩衝液を用いることが好ましい。
上記緩衝液は特に限定されず、例えば、有機酸及び有機酸の塩類、アミノ酸類、無機酸及びその塩類、グッドの緩衝液類等が挙げられる。
上記有機酸は特に限定されず、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類は特に限定されず、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
上記無機酸は特に限定されず、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
また、上記緩衝液は、必要に応じて、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。
【００４７】
上記緩衝液の塩濃度は特に限定されないが、好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は１０００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記緩衝液の塩濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、イオン交換反応が行なわれず、ヘモグロビン類を分離することができなくなることがある。上記緩衝液の塩濃度が１０００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、塩が析出しシステムに悪影響を及ぼすことがある。
【００４８】
本発明のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法を用いれば、ヘモグロビンＡ１ｃに加えて、ヘモグロビンＡｏ、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）、ヘモグロビンＡ２等のヘモグロビン類を分離することができる。
また、上記のヘモグロビン類に加えて、異常ヘモグロビン類を測定することができる。
本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いる液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法もまた、本発明の１つである。
上記異常ヘモグロビン類としては、具体的には例えば、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ等が挙げられる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明によれば、耐久性が高く、ヘモグロビン類の測定を高精度に行うことができるヘモグロビン類測定用カラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法、及び、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いるヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００５１】
（実施例１）
非イオン性の架橋性単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ及びトリメチロールエタントリアクリレート（新中村化学工業社製）５０ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてグリセリンメタクリレート（日本油脂社製）５０ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、５Ｌのエチルアルコールに溶解させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で６０℃に加温し、２４時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、非イオン性の親水性架橋重合体を得た。
得られた非イオン性の親水性架橋重合体５０ｇを、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬに分散させ、室温において、エピクロルヒドリン４０ｇを添加し、５時間反応させた。得られたエポキシ化重合体４０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は３．５μｍ、粒子径のＣＶ値は１．３％であった。
得られた充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製した。
【００５２】
得られたヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社製、「ＬＣ−１０Ａ」）に接続した。測定試料として、フッ化ナトリウム採血した健常人血液を０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により２００倍に溶血希釈した試料を用いた。溶離液としては、２００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（溶離液Ａ、ｐＨ５．３）、及び、４００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（溶離液Ｂ、ｐＨ７．５）の２種を用い、流速１．０ｍＬで送液して溶離液Ａから溶離液Ｂへのステップワイズグラジエント法により分離し、４１５ｎｍの吸光度を測定して図１のクロマトグラムを得た。図１中、ピーク１がヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡｏである。ヘモグロビンＡ１ｃが他のヘモグロビン分画と短時間内で良好に分離された。
【００５３】
（実施例２）
非イオン性の架橋性単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３５０ｇと、非イオン性の非架橋性単量体としてエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂社製）５０ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてグリシジルメタクリレート（日本油脂社製）１００ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、５Ｌのエチルアルコールに溶解し、攪拌しながら窒素雰囲気下で６０℃に加温し、２４時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、非イオン性の親水性架橋重合体を得た。
得られた非イオン性の親水性架橋重合体５０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は３．０μｍ、粒子径のＣＶ値は１．１％であった。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５４】
（実施例３）
非イオン性の架橋性単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２０ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてグリシジルメタクリレート（日本油脂社製）５ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（ナカライテスク社製）０．２ｇを添加して溶解し、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液１Ｌに微分散させた。
この溶液に、非架橋性高分子粒子として平均粒子径０．３μｍのポリメチルメタクリレート粒子５０ｇを分散させた、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液２００ｍＬを添加した。更に４％ポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液３００ｍＬを添加し、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１０時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、非イオン性の親水性架橋重合体を得た。
得られた非イオン性の親水性架橋重合体５０ｇを、２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は４．２μｍ、粒子径のＣＶ値は２．６％であった。
得られた充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５５】
（実施例４）
非イオン性の架橋性単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２０ｇと、非イオン性の非架橋性単量体としてエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂社製）５ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてグリセリンメタクリレート（日本油脂社製）５ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（ナカライテスク社製）０．２ｇを添加して溶解し、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液１Ｌに微分散させた。
この溶液に、非架橋性高分子粒子として平均粒子径０．２７μｍのメチルメタクリレート−トリエチレングリコールジメタクリレート共重合体粒子（架橋度５％）５０ｇを分散させた、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液２００ｍＬを添加した。更に４％ポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液３００ｍＬを添加し、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１０時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、非イオン性の親水性架橋重合体を得た。
得られた非イオン性の親水性架橋重合体５０ｇを、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬに分散させ、室温において、エピクロルヒドリン４０ｇを添加し、５時間反応させた。得られたエポキシ化重合体４０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は４．０μｍ、粒子径のＣＶ値は２．１％であった。
得られた充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。
【００５６】
（比較例１）
本比較例では、実施例２の充填剤を構成する単量体を用いて、従来技術である懸濁重合法により、架橋重合体を調製した後、イオン交換基を導入する方法の例を示す。
非イオン性の架橋性単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇと、非イオン性の非架橋性単量体としてエチレングリコールモノメタクリレート（和光純薬工業社製）５０ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてグリシジルメタクリレート（和光純薬工業社製）５０ｇとを混合し、得られた混合物に、重合開始剤としてベンゾイルパーオキサイド（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、４％のポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液５Ｌに溶解し、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１２時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、架橋重合体を得た。
得られた架橋重合体５０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は６．５μｍ、粒子径のＣＶ値は１５．３％であった。懸濁重合法を用いたため、均一な粒子径の充填剤は得られなかった。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図２のクロマトグラムを得た。図２中、ピーク１がヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡｏである。実施例２のカラム充填剤を用いて得られたクロマトグラム（図１と同様）よりも測定時間を延長したにも関わらず、ヘモグロビンＡ１ｃの分離が不良であった。
【００５７】
（比較例２）
本比較例では、従来技術である懸濁重合法により、架橋性単量体とイオン交換基を有する単量体を共重合する方法、すなわち、実施例１における反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体の代わりに、イオン交換基を有する単量体を用いた懸濁重合法の例を示す。
非イオン性の架橋性単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇ及びトリメチロールエタントリアクリレート（新中村化学工業社製）５０ｇの混合物に、重合開始剤としてベンゾイルパーオキサイド（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液５Ｌに溶解し、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。３０℃に冷却した後、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成化学社製）１００ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、カラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は７．６μｍ、粒子径のＣＶ値は２１．３％であった。懸濁重合法を用いたため、均一な粒子径の充填剤は得られなかった。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図２と同様のクロマトグラムが得られ、ヘモグロビンＡ１ｃの分離は不良であった。
【００５８】
（比較例３）
本比較例では、実施例１における、非イオン性の親水性架橋重合体を構成する単量体を、本発明の範囲外のものに変更して得られた充填剤の例を示す。
非イオン性の架橋性単量体としてジビニルベンゼン（ナカライテスク社製）２００ｇと、非イオン性の非架橋性単量体としてスチレン（新中村化学工業社製）５０ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてグリセリンメタクリレート（日本油脂社製）５０ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、５Ｌのエチルアルコールに溶解させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で６０℃に加温し、２４時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、非イオン性の親水性架橋重合体を得た。
得られた非イオン性の親水性架橋重合体５０ｇを、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬに分散させ、室温において、エピクロルヒドリン４０ｇを添加し、５時間反応させた。得られたエポキシ化重合体４０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は３．２μｍ、粒子径のＣＶ値は２．０％であった。
得られた充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図２と同様のクロマトグラムが得られ、ヘモグロビンＡ１ｃの分離が不良であった。
【００５９】
（比較例４）
本比較例では、実施例１における反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体の代わりに、イオン交換基を有する単量体を用いた例を示す。
非イオン性の架橋性単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ及びトリメチロールエタントリアクリレート（新中村化学工業社製）５０ｇと、イオン交換基（スルホン酸基）を有する単量体として２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成化学社製）５０ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、５Ｌのエチルアルコールに溶解させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で６０℃に加温し、２４時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は４．５μｍ、粒子径のＣＶ値は１８．０％であった。
得られた充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図２と同様のクロマトグラムが得られ、ヘモグロビンＡ１ｃの分離が不良であった。
【００６０】
（比較例５）
本比較例では、実施例３における非イオン性の親水性単量体の代わりに、イオン交換基を有する単量体を、非架橋性高分子粒子に吸収させる単量体として用いた例を示す。
非イオン性の架橋性単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）２０ｇと、イオン交換基を有する単量体として２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成化学社製）５ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（ナカライテスク社製）０．２ｇを添加して溶解し、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液１Ｌに微分散させた。
この溶液に、非架橋性高分子粒子として平均粒子径０．３μｍのポリメチルメタクリレート粒子５０ｇを分散させた、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液２００ｍＬを添加した。更に４％ポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液３００ｍＬを添加し、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、重合反応を行おうとしたが、重合反応中に凝集塊が発生し、重合体が粒子として得られなかった。
【００６１】
（比較例６）
本比較例では、実施例４におけるメチルメタクリレート−トリエチレングリコールジメタクリレート共重合体粒子の代わりにポリスチレンを非架橋性高分子粒子として用い、テトラエチレングリコールジメタクリレートの代わりにジビニルベンゼンを非イオン性の架橋性単量体としてとして用いた例を示す。
非イオン性の架橋性単量体としてジビニルベンゼン（新中村化学工業社製）２０ｇと、非イオン性の非架橋性単量体としてスチレン（日本油脂社製）５ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてグリセリンメタクリレート（日本油脂社製）５ｇとを混合し、得られた混合物に重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（ナカライテスク社製）０．２ｇを添加して溶解し、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液１Ｌに微分散させた。
この溶液に、非架橋性高分子粒子として平均粒子径０．２７μｍのポリスチレン粒子５０ｇを分散させた、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液２００ｍＬを添加した。更に４％ポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液３００ｍＬを添加し、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１０時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、非イオン性の架橋重合体を得た。
得られた非イオン性の架橋重合体５０ｇを、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬに分散させ、室温において、エピクロルヒドリン４０ｇを添加し、５時間反応させた。得られたエポキシ化重合体４０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、スルホン酸基が導入されたカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒子径は４．０μｍ、粒子径のＣＶ値は３．２％であった。
得られた充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製した。
実施例１と同様の方法により、健常人血液を測定したところ、図２と同様のクロマトグラムが得られ、ヘモグロビンＡ１ｃの分離が不良であった。
【００６２】
（比較例７）
本比較例では、実施例１における、非イオン性の親水性架橋重合体を構成する単量体を、本発明の範囲外のものに変更して得られた充填剤の例を示す。
非イオン性の架橋性単量体としてジエチレングリコールジビニルエーテル（和光純薬社製）３００ｇと、反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体としてアリルグリシジルエーテル（日本油脂社製）５０ｇとを混合し、得られた混合物に、重合開始剤として２，２−アゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、５Ｌのエチルアルコールに溶解させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で６０℃に加温し、重合反応を行おうとしたが、重合反応中に凝集塊が発生し、重合体が粒子として得られなかった。
【００６３】
（修飾ヘモグロビン類の分離性能評価）
得られたカラム充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビンＡ１ｃ分離カラムを調製し、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社製、ＬＣ−１０Ａ）に接続した。
修飾ヘモグロビン類としては、レイバイルヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、公知の方法により調製した。
すなわち、試料Ｌは、健常人血液にグルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、健常人血液にアセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、健常人血液にシアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。
上記修飾ヘモグロビン類を含む試料（試料Ｌ、試料Ａ、試料Ｃ）、及び、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いた健常人血液（非修飾品）を、実施例及び比較例で得られたカラム充填剤を用いて測定し、各カラム充填剤の分離性能を評価した。分離性能の評価は、修飾ヘモグロビン試料のヘモグロビンＡ１ｃ値から非修飾品のヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより行なった。得られたΔ値を表１に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
表１より、実施例で得られたカラム充填剤を用いた場合のΔ値はいずれも０．２％以下であり、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確にヘモグロビンＡ１ｃが測定できることが判った。一方、比較例のカラム充填剤を用いた場合では、修飾ヘモグロビンが存在すると、ヘモグロビンＡ１ｃ値が大きく変動し、ヘモグロビンＡ１ｃ値を正確に測定することができなかった。
【００６６】
（異常ヘモグロビン類の分離性能評価）
実施例及び比較例で得られたカラム充填剤を用いて、異常ヘモグロビンとしてヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含む試料（ヘレナ研究所社製、「ＡＦＳＣヘモコントロール」）の測定を行った。
実施例１で得られたカラム充填剤を用いて測定し、得られたクロマトグラムを図３に示す。図３中、ピーク１はヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡｏ、ピーク３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク４はヘモグロビンＳ、ピーク５はヘモグロビンＣを示す。図３より、実施例１で得られたカラム充填剤を用いて異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを良好に分離することができた。実施例２、３及び４で得られたカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のカラム充填剤を用いて測定した場合、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分離することはできなかった。
【００６７】
（ヘモグロビンＡ２の分離性能評価）
実施例及び比較例で得られたカラム充填剤を用いて、ヘモグロビンＡ２を含む試料としてＡ２コントロール（レベル２）（バイオラッド社製）を測定した。
実施例１で得られたカラム充填剤を用いて測定し、得られたクロマトグラムを図４に示す。図４中、ピーク１はヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡｏ、ピーク３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク６はヘモグロビンＡ２を示す。図４より、実施例１で得られたカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ２を良好に分離することができた。実施例２、３及び４で得られたカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のカラム充填剤を用いて測定した場合、ヘモグロビンＡ２を分離することはできなかった。
【００６８】
（カラム耐久性の評価）
実施例及び比較例で得られたカラム充填剤を用いて、同一の健常人血液試料を連続測定し、ヘモグロビンＡ１ｃ値の推移を確認した。結果を図５に示す。
実施例で得られたカラム充填剤では、３０００回測定においても測定値が変化しなかったが、比較例のカラム充填剤を用いた場合は、測定値が低下し、カラム寿命が短いことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、耐久性が高く、ヘモグロビン類の測定を高精度に行うことができるヘモグロビン類測定用カラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法、及び、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いるヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】実施例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図２】比較例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図３】実施例１のカラム充填剤を用いて異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図４】実施例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ２の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図５】実施例及び比較例のカラム充填剤の耐久性評価の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定に用いられるカラム充填剤であって、
少なくとも、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を、前記単量体混合物は溶解するが前記単量体混合物を重合して得られた非イオン性の親水性架橋重合体は溶解しない溶媒中において、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、
前記非イオン性の親水性架橋重合体に、前記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とにより製造されたものであり、
前記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、前記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルである
ことを特徴とするヘモグロビン類測定用カラム充填剤。
【請求項２】
ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を製造する方法であって、
少なくとも、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を、前記単量体混合物は溶解するが前記単量体混合物を重合して得られた非イオン性の親水性架橋重合体は溶解しない溶媒中において、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、
前記非イオン性の親水性架橋重合体に、前記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とを有するものであり、
前記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、前記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルである
ことを特徴とするヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法。
【請求項３】
液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定に用いられるカラム充填剤であって、
少なくとも、非架橋性高分子粒子に、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を吸収させた後、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、
前記非イオン性の親水性架橋重合体に、前記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とにより製造されたものであり、
前記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、前記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルである
ことを特徴とするヘモグロビン類測定用カラム充填剤。
【請求項４】
ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を製造する方法であって、
少なくとも、非架橋性高分子粒子に、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を吸収させた後、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、
前記非イオン性の親水性架橋重合体に、前記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とを有するものであり、
前記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、前記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルである
ことを特徴とするヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１又は３記載のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項６】
請求項１又は３記載のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法。
【請求項１】
液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定に用いられるカラム充填剤であって、
少なくとも、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を、前記単量体混合物は溶解するが前記単量体混合物を重合して得られた非イオン性の親水性架橋重合体は溶解しない溶媒中において、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、
前記非イオン性の親水性架橋重合体に、前記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とにより製造されたものであり、
前記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、前記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルである
ことを特徴とするヘモグロビン類測定用カラム充填剤。
【請求項２】
ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を製造する方法であって、
少なくとも、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を、前記単量体混合物は溶解するが前記単量体混合物を重合して得られた非イオン性の親水性架橋重合体は溶解しない溶媒中において、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、
前記非イオン性の親水性架橋重合体に、前記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とを有するものであり、
前記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、前記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルである
ことを特徴とするヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法。
【請求項３】
液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定に用いられるカラム充填剤であって、
少なくとも、非架橋性高分子粒子に、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を吸収させた後、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、
前記非イオン性の親水性架橋重合体に、前記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とにより製造されたものであり、
前記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、前記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルである
ことを特徴とするヘモグロビン類測定用カラム充填剤。
【請求項４】
ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を製造する方法であって、
少なくとも、非架橋性高分子粒子に、非イオン性の架橋性単量体と反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体とを含有する単量体混合物を吸収させた後、重合開始剤の存在下で重合することにより非イオン性の親水性架橋重合体を得る工程と、
前記非イオン性の親水性架橋重合体に、前記非イオン性の親水性架橋重合体が有する反応性官能基と反応するイオン交換基を有する化合物を反応させてカラム充填剤を得る工程とを有するものであり、
前記非イオン性の架橋性単量体は、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、及び、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類からなる群より選択される少なくとも１種の（メタ）アクリル酸エステルであり、かつ、前記反応性官能基を有する非イオン性の親水性単量体は、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、及び、アルデヒド基からなる群より選択される少なくとも１種の反応性官能基を有する（メタ）アクリル酸エステルである
ことを特徴とするヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１又は３記載のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項６】
請求項１又は３記載のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１２２０６０（Ｐ２０１０−１２２０６０Ａ）
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９５８３７（Ｐ２００８−２９５８３７）
【出願日】平成２０年１１月１９日（２００８．１１．１９）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１９日（２００８．１１．１９）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
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