ペプチド系抗生物質
【課題】黄色ブドウ球菌の多剤耐性菌（ＭＲＳＡ）及びペニシリン耐性肺炎球菌（ＰＲＳＰ）に対して優れた有効性を有する、医薬の有効成分として有用な化合物を提供する。
【解決手段】ＭＲＳＡやＰＲＳＰに対して優れた有効性を有するポリペプチドを、Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ属に属する微生物が産成することを見いだした。この化合物及びその塩は、ＭＲＳＡ，ＰＲＳＰを含む各種病原菌に起因する感染症に有効である新規抗生物質を提供することができる。
【解決手段】ＭＲＳＡやＰＲＳＰに対して優れた有効性を有するポリペプチドを、Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ属に属する微生物が産成することを見いだした。この化合物及びその塩は、ＭＲＳＡ，ＰＲＳＰを含む各種病原菌に起因する感染症に有効である新規抗生物質を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な抗生物質及びその製造法と用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物の生産する抗生物質としては、これまでに数多く発見されており、医薬品、動物薬、農薬の分野においてすでに実用化されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
抗生物質の使用においては、耐性菌の発現や毒性が大きな問題となっており、これらの問題点を解決し得る新規な抗生物質の開発が強く望まれている。特に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は化膿性疾患の起因菌として知られているが、その多剤耐性菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：以降ＭＲＳＡとすることがある）が臨床上非常に大きな問題となっている（小栗ら、臨床と微生物、１５巻、７〜１５項、１９８８年）。抗ＭＲＳＡ抗生物質としてはバンコマイシン、テイコプラニン、ハベカシンが知られているが、それら薬剤に対してもバンコマイシン低感受性菌（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：以降ＶＩＳＡとすることがある）などの耐性菌が問題となっており（花木、日本臨床、５５巻、５号、２６９〜２７４項、１９９７年）、新規な抗ＭＲＳＡ抗生物質が求められている。また肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｉａｅ）は、肺炎・中耳炎・化膿性髄膜炎の起因菌として知られているが、従来使用されてきたペニシリン系およびセフェム系抗生物質に耐性を持つペニシリン耐性肺炎球菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：以降ＰＲＳＰとすることがある）が近年増加傾向にあり臨床上大きな問題となってきており（岩田、化学療法の領域、１６巻、５号、２９〜３７ページ、２０００年）、新規な抗ＰＲＳＰ抗生物質が求められている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、抗菌活性を有する新規な抗生物質を微生物代謝産物より見出すべく鋭意探索を行った。その結果、静岡県大井川町の落葉から分離したキネオスポリア（Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ）属に属する放線菌ＡＰ１７４４４株の培養液からＭＲＳＡ、ＰＲＳＰをはじめとする各種の病原性微生物に対して生育阻害活性を示す新規抗生物質が産生される事を見出し、本発明を完成させた。
【０００５】
即ち、本発明は、
（１） 下記の物理化学的性質を有するペプチド、
本発明の化合物の性状は以下の通りである。（尚、この化合物をＡＰ１７４４４化合物と略記することがある。）
ａ．アミノ酸分析により、Asn, Thr, Gly, Val, Ile, Leu, Phe, Pro,
Lanthionine, Methyllanthionineが検出できる。
ｂ．分子量：ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ ２１０７（Ｍ＋Ｈ）
ｃ．紫外部吸収スペクトル：メタノール中の主な吸収ピーク（ｎｍ）は次の通りである。
末端吸収、２６７−２７３
ｄ．赤外部吸収スペクトル：ＫＢｒ錠剤中の主な波数（ｃｍ-1）は次の通りである。
３２７０、３０５４、２９６６、１６６０、１５２７、１４２７、１２８６、１２４７、１２０１、１１３３
ｅ．Ｒｆ値：約０．５
薄層クロマトグラフィー条件は次の通りである。
固定層：シリカゲルＴＬＣ
展開溶媒：クロロホルム−メタノール（６：４）
（２）下記の物理化学的性状を有する（１）に記載のペプチド、
ｆ．アミノ酸配列のＮ末端が、Ileである。
ｇ．溶解性：ジメチルスルフォキシド、メタノールに可溶で、酢酸エチルに不溶である。
ｈ．呈色試験：ヨウ素蒸気との反応及び過マンガン酸カリウム脱色反応に陽性を示す。
（３） 上記（１）または（２）に記載の化合物を産生する能力を有するＫｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ属に属する微生物を培養し、その培養物より該化合物を採取する事を特徴とする該化合物またはその塩の製造方法、
（４） 上記（１）または（２）に記載の化合物を有効成分とする医薬、
（５） 感染症の予防及び／又は治療に用いる上記（４）に記載の医薬、
に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明について、以下具体的に説明する。
ＡＰ１７４４４化合物は赤外部吸収スペクトル測定の結果、１６６０および１５２７ｃｍ-1に強い吸収が観測され、ペプチド構造の化合物であることが示唆された。そこで、６Ｎ塩酸を用い（２４時間、１１０℃）完全加水分解したのち、イオン交換クロマトグラフィーによりアミノ酸の定量分析を行うと（日本電子 ＪＬＣ−５００／Ｖ型装置）、通常アミノ酸として、アスパラギン酸（又はアスパラギン）、スレオニン、グリシン（４分子）、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン（２分子）が検出され、ペプチド構造の化合物であることがわかった。アミノ酸分析では、通常アミノ酸以外に２種類のアミノ酸のピークが検出された。これらアミノ酸はＬＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＮＭＲ測定の結果、Ｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ及びＭｅｔｈｙｌｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ（Ｈａｎｓ−Ｇｅｏｒｇｅ ＳＡＨＬら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３０巻、８２７〜８５３ページ、１９９５年）であることが判明した。エドマン分解反応によるアミノ酸配列測定（島津製作所全自動タンパク質一次構造分析装置ＰＰＳＱ−２３Ａ型）を行ったが、１番目にＩｌｅが検出されるのみで２番目以後はアミノ酸ピークが検出されなかった。これは、２番目のアミノ酸が上記Ｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ構造であるか、ＤｅｈｙｄｒｏａｌａｎｉｎｅやＤｅｈｙｄｒｏｂｕｔｙｒｉｎｅであるためエドマン分解反応が進まないことが推定された。そこで、Ｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ構造を開裂させる反応、及びＤｅｈｙｄｒｏａｌａｎｉｎｅやＤｅｈｙｄｒｏｂｕｔｙｒｉｎｅをチオエーテル誘導体にする反応（（Ｈｅｌｍｕｔ Ｅ. Ｍｅｙｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２３巻、１８５−１９０ページ、１９９４年）を行ってからアミノ酸配列測定を２２番目まで行った結果、次の配列が得られた。ＩＸＸＶＸＬＸＸＰＧＸＴＸＰＧＧＧＸＮＸＸＦ（Ｘは、ＬａｎｔｈｉｏｎｉｎｅまたはＭｅｔｈｙｌｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅの開環構造物や、Ｄｅｈｙｄｒｏａｌａｎｉｎｅ、Ｄｅｈｙｄｒｏｂｕｔｙｒｉｎｅのチオエーテル誘導体等と推定される）。アミノ酸配列検索を行ったところ該当する化合物はなかった。したがって、ＡＰ１７４４４は新規化合物であると確認された。
【０００７】
本発明の化合物の分子量は、ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚが２１０７（Ｍ＋Ｈ）であることから、２１０６と判断した。
従って、アミノ酸分析、アミノ酸配列及び分子量から、構成アミノ酸の個数は２２個または２３個と考えられた（lanthionineやMethyllanthionine構造は、２アミノ酸として数えた）。
また、本発明の化合物の紫外部吸収スペクトルは、メタノール溶液で測定した結果、λｍａｘｎｍ（Ｅ１ｃｍ1%）が、末端吸収、２６７−２７３（４５）であり、アルカリ性メタノール溶液で測定した結果、λｍａｘｎｍ（Ｅ１ｃｍ1%）が、末端吸収、２５１−２５５（１９５）であった。
【０００８】
また本発明によれば、ＡＰ１７４４４化合物を産生する能力を有するキネオスポリア属に属する放線菌を培養し、その培養物よりＡＰ１７４４４化合物を採取する事を特徴とするＡＰ１７４４４化合物またはその塩の製造方法が提供される。
本発明のＡＰ１７４４４化合物を産生する能力を有するキネオスポリア属に属する微生物としては、本発明の化合物を産生する能力があれば特に限定されないが、例えば、下記のキネオスポリア・エスピー（Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ ｓｐ．）ＡＰ１７４４４株が例示される。
【０００９】
上記ＡＰ１７４４４株の菌学的性状は次の通りである。
１．形態的性質
イーストエキス・麦芽エキス寒天培地で２８℃、２０日間培養し、光学顕微鏡、実体顕微鏡にて観察を実施した。本菌は糸状を形成し、良く分岐した基底菌糸が発達する。通常、菌糸の断裂は認められない。成熟した基底菌糸の直径は約０．７〜１．２μｍである。基底菌糸の一部の先端に隔壁が形成され、胞子もしくは胞子嚢様の形態を形成する。胞子は球形、亜球形、楕円形、卵型で、その大きさは約０．８〜１．６μｍ×０．８〜１．６μｍである。また、胞子は運動性を有する。胞子表面は光学顕微鏡（×１５００）では平滑と観察される。気菌糸は確認できない。
【００１０】
２．培養的性質
各種培地で２８℃、２０日間培養し、観察した。色の記載はコンティナ・コーポレーション・オブ・アメリカ(Container Corporation of America)のカラー・ハーモニー・マニュアル(Color harmony manual)第４版 １９５８年に従った。
（１）イーストエキス・麦芽エキス寒天培地
生育は非常に良好。コロニーの色はLight Apricot(4ea)〜Apricot(4ga)。コロニー表面の状態は湿潤。気菌糸は形成しない。色素生産は認められない。
（２）オートミール寒天培地
生育良好。コロニーの色はPearl Pink(4ca)〜Shell Pink(5ba)。コロニー表面の状態は湿潤であるが、イーストエキス・麦芽エキス寒天培地程ではない。気菌糸は形成しない。色素生産は認められない。
【００１１】
（３）スターチ・無機塩寒天培地
生育微弱。コロニーの色はShell Tint(2ba)〜Shell Tint(3ba)。コロニー表面は湿潤ではない。気菌糸は形成しない。色素生産は認められない。
（４）グリセロール・アスパラギン寒天培地
生育は微弱でエーゼで塗布した跡を薄くトレースするように生育。コロニーの色はwhite(a)。コロニー表面は湿潤ではない。気菌糸は形成しない。色素生産は認められない。
【００１２】
３．生理学的性質
（１）温度（イーストエキス・麦芽エキス寒天培地で１４日間培養）
５℃ 生育せず
７、１１℃ 若干の生育確認
１７℃ 生育
２０、２３，２６，２９℃ 旺盛な生育
３３℃ 微弱な生育
３７℃ 若干の生育確認
３９℃、４２℃ 生育せず
（２）メラニン色素生産性
ペプトン・イースト・鉄寒天培地：色素生産 なし（生育微弱）
チロシン寒天培地：色素生産 なし（生育微弱）
【００１３】
（３）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地を基礎培地とする）
Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、イノシトール及びＬ−ラムノースを利用する。ラフィノースは利用しない。
以上の形態的性質、培養的性質及び生理学的性質で示された特徴により、本菌株をキネオスポリア（Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ）属の放線菌であると同定し、キネオスポリア・エスピー（Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ ｓｐ．）ＡＰ１７４４４と命名した。尚、本菌株を工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１９２１２として寄託した。
【００１４】
本発明に係わるＡＰ１７４４４化合物の典型的で好ましい製造方法は、キネオスポリア属に属する該化合物生産菌（例えばＫｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ ｓｐ．ＡＰ１７４４４）を好適な培地で培養し、その培養物から分離する方法が例示される。
本発明物質を製造するのに使用される培地は、液体培地による振盪培養または通気攪拌培養が最も適しているが、これに限定されない。培地はＡＰ１７４４４化合物生産菌が生育して培地中に該化合物を蓄積するものであれば特に限定されず、例えば、炭素源としてはグルコース、シュークロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜、有機酸等が使用できる。また窒素源としては、例えばイーストエキス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、グルテンミール、小麦胚芽、コーンスティープリカー、アミノ酸類、アンモニウム塩、硝酸塩、その他各種有機あるいは無機窒素化合物が用いられる。無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、各種リン酸塩、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩などを添加しても良い。また菌の生育及びＡＰ１７４４４化合物生産を促進するようなビタミン類、補酵素などを添加しても良い。特に、培地が強く発泡するのであれば、必要ある時に液体パラフィン、動物油、鉱物油、シリコン等を添加しても良い。
【００１５】
ＡＰ１７４４４化合物生産菌の培養における培養温度、培養時間、攪拌速度、通気量、培養液のｐＨなどの条件は、ＡＰ１７４４４化合物の蓄積量が最大となるように適当に選択、調節される。例えば、通常の通気攪拌培養の場合、培養温度は通常２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃で行うのが良い。培養時間は通常２〜１０日間、好ましくは３〜８日間の培養を行うのが良い。また培養液のｐＨ通常ｐＨ５．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０に調節するのが良い。
【００１６】
培養の経過に伴って培養液中に蓄積されるＡＰ１７４４４化合物の量の経時変化は以下に記載の分離、精製の際、確認可能な液体クロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィーにより測定する事ができる。
培養液からのＡＰ１７４４４化合物の分離、精製には、その物理化学的特性に基づく種々の方法を用いる事ができる。その場合に例えば下記の条件の液体クロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィーにより確認することで追跡可能である。
【００１７】
液体クロマトグラフィー条件
分離カラム：昭和電工Ｓｈｏｄｅｘ Ｃ１８ ４．６ｘ１５０ｍｍ
溶媒：アセトニトリル−０．０５％ＴＦＡ水溶液（３：７）
流速：１．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ ２２０ｎｍ
保持時間：１３．３分
薄層クロマトグラフィー条件
固定層：東京化成シリカゲルｆＳ２０１
展開溶媒：クロロホルム−メタノール（６：４）
検出：ＵＶ ２５４ｎｍ
Ｒｆ値：約０．５
【００１８】
分離、精製の方法として、例えば、培養液中に存在するＡＰ１７４４４化合物は、水と混和しない有機溶媒、例えばブタノールにより抽出精製する事ができる。あるいは吸着剤として例えばダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化成社製）などが使用される。ＡＰ１７４４４化合物を含む画分を上記の吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、又は、ＡＰ１７４４４化合物を吸着させた後、メタノール水、アセトン水などを用いて溶出させる事により該化合物を得る事ができる。更にシリカゲル、アルミナ、フロリジルの様な担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）、トヨパールＨＷ−４０（東ソー社製）などを用いた分配カラムクロマトグラフィー、及び順相、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーなどでＡＰ１７４４４化合物をそれぞれ分離、精製する事ができる。
【００１９】
ＡＰ１７４４４化合物の抗菌活性を各種の病原性微生物に対して測定し、その最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求めた。その結果を表１に示す。表１に示したごとく、ＡＰ１７４４４化合物はＭＲＳＡ（ＫＵ１６株：北里大学より分与）、ＶＩＳＡ（ＭＵ５０株：順天堂大学より分与）、ＰＲＳＰ（ＡＳＰ９６５株：東北労災病院より分与）、および病原性嫌気性菌を含む各種の病原性微生物に対して、抗菌活性を示す。
【００２０】
また、ＡＰ１７４４４化合物でＭＲＳＡ感染治療試験を行った。その結果を表２に示す。表２に示したごとく、ＡＰ１７４４４化合物はＭＲＳＡ感染治療試験において従来最も有効とされているバンコマイシンに比較して優れた治療効果を示す。
また、ＡＰ１７４４４化合物でＰＲＳＰ感染治療試験を行った。その結果を表３に示す。表３に示したごとく、ＡＰ１７４４４化合物は、ＰＲＳＰ感染治療試験において有効とされているバンコマイシンよりも優れた治療効果を示す。
【００２１】
従って、ＡＰ１７４４４化合物は、これらの病原性微生物に起因する感染症に対する治療又は予防剤として有用である。
以上の結果から、ＡＰ１７４４４は、上記の病原性微生物を起因とする感染症に対する治療及び／又は予防剤として有用である。なお、検定に用いる微生物は、本願で用いた微生物に限られることなく、各種の寄託機関の標準菌株や各施設での臨床分離株を利用する事ができ、容易に本願の抗菌活性の効果が確認されるであろう。
【００２２】
本発明のＡＰ１７４４４化合物を医薬として使用する際、ＡＰ１７４４４化合物の他に、薬学的に許容される担体とからなる事ができる。担体としては、公知のものが使用でき、その性質によっては賦型剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等と分類されることもあるが、例えば、ラクトース、コーンスターチ、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。医薬の典型例としてはＡＰ１７４４４化合物の５％グルコース水溶液が例示される。
【００２３】
本発明の医薬は、例えば抗生物質であり、さらに詳しくは、抗ＭＲＳＡ剤及び／又は抗ＰＲＳＰ剤である。本発明の医薬は、種々の形態で投与され得るが、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与または注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点眼剤、座薬、軟膏、スプレー、ローション等による非経口投与を挙げることができる。
これらの医薬は、症状、年齢、体重、投与方法及び剤形等によって異なるが通常は成人に対して１日１ｍｇ乃至３０００ｍｇを投与することができる。
【００２４】
【実施例】
次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【００２５】
［実施例１］
（１）ＡＰ１７４４４化合物の発酵生産
グルコース１％、デキストリン１％、イーストエキス０．５％、カゼイン水解物０．５％、ＣａＣＯ3０．１％の組成の培地（滅菌前ｐＨ７．０）を５００ｍｌ容三角フラスコ４本に各１００ｍｌずつ分注し、１１５℃で１５分間滅菌した。これらにＫｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ ｓｐ．ＡＰ１７４４４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１２）の斜面培養物を一白金耳接種し、ロータリーシェーカー（毎分２００回転）で２９℃、７２時間培養し、種培養液とした。グルコース２％、スターチ２％、脱脂大豆粉２％、イーストエキス０．５％、ＮａＣｌ０．２５％、ＣａＣＯ3０．３５％、ＺｎＳＯ4・７水塩０．００５％、ＭｎＣｌ2・７水塩０．０００５％、ＣｕＳＯ4・５水塩０．０００５％の組成培地（滅菌前ｐＨ７．０）を５００ｍｌ容三角フラスコ１本に各１００ｍｌずつ分注し、１１５℃で１５分間滅菌した培地１００本に、上記の種培養液を４ｍｌずつ接種し、２９℃で１４４時間ロータリーシェーカー（毎分２００回転）上で培養を行った。
【００２６】
（２）ＡＰ１７４４４化合物の精製
上記の培養方法で得られたブロス１０ｌを遠心分離器（毎分３０００回転、１０分間）で菌体（８００ｇ）とろ液（８ｌ） に分離した。
得られたろ液を、予め水洗したスチレンジビニルベンゼン系ポリマー樹脂ＨＰ−２０（三菱ダイヤイオン製品）カラム（８００ｍｌ）に付し、ＡＰ１７４４４物質を吸着させた。カラムを、４ｌの水で水洗し、４ｌの３０％アセトン水で洗浄したのち、５０％アセトン水で溶出し、４００ｍｌずつ分画を行うと、ＡＰ１７４４４化合物はフラクションＮｏ.２〜５に溶出されていた。上述のＡＰ１７４４４を含むフラクション（Ｎｏ.２〜５）を集め減圧下で濃縮を行い、得られた濃縮乾固物を２５０ｍｌの混合溶媒（クロロホルム：メタノール＝３：２）に懸濁し、遠心分離（毎分３０００回転、１０分間）を行い、上清を得た。得られた上清を減圧下で濃縮を行い、少量の混合溶媒（クロロホルム：メタノール＝７：３）に溶解し、予めクロロホルム−メタノール（７：３）にて作成したシリカゲルカラムクロマト（３００ｍｌ）に付し上記溶媒で溶出し、２０ｍｌずつ分画を行うと、ＡＰ１７４４４化合物はフラクションＮｏ．４２〜９５に溶出されていた。
【００２７】
上述のＡＰ１７４４４を含むフラクション（Ｎｏ．４２〜９５）を集め減圧下で濃縮を行うと粗粉末３１０ｍｇが得られた。次いでこの粗粉末を６ｍｌのジメチルスルフォキシドに溶解し、その１２分の１量を予めアセト二トリル−０．０５％ＴＦＡ（３０：７０）にて作成した逆相分取カラム（昭和電工、Ｓｈｏｄｅｘ Ｃ１８Ｍ ２０ｍｍΦｘ２５０ｍｍ）に付し、同混合溶媒で展開し、５ｍｌずつ分画した。フラクションＮｏ．４６〜５４にＡＰ１７４４４化合物成分を得た。同様の操作を１２回行い、ＡＰ１７４４４化合物を含む各フラクションをそれぞれ集めアセト二トリルを減圧濃縮後、凍結乾燥すると、単一なＡＰ１７４４４化合物（１６４ｍｇ）の白色粉末が得られた。得られたＡＰ１７４４４化合物の各種性状を検定したところ以下の結果を示した。
【００２８】
ＡＰ１７４４４化合物の性状
１）概観：白色粉末
２）比旋光度：〔α〕D22＝＋４０．２±５（ｃ＝１．０、ＤＭＳＯ）
３）分子量：ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ ２１０７（Ｍ＋Ｈ）
４）紫外部吸収スペクトル：メタノール中の主な吸収ピーク（ｎｍ）は次の通りである。
λｍａｘｎｍ（Ｅ１ｃｍ1%）末端吸収、２６７−２７３（４５）
アルカリ性メタノール溶液中の主な吸収ピーク（ｎｍ）は次の通りである。
λｍａｘｎｍ（Ｅ１ｃｍ1%）末端吸収、２５１−２５５（１９５）
５）赤外部吸収スペクトル：ＫＢｒ錠剤中の主な波数（ｃｍ-1）は次の通りである。
３２７０、３０５４、２９６６、１６６０、１５２７、１４２７、１２８６、１２４７、１２０１、１１３３
６）少なくとも以下のアミノ酸を含む。Asn, Thr, Gly(4), Val, Ile, Leu, Phe, Pro(2), Lanthionine, Methyllanthionine
７）1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：図２に示す通りである。
８）13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：図３に示す通りである。
９）溶解性：ジメチルスルフォキシド、メタノールに可溶で、酢酸エチルに不溶である。
１０）呈色試験：ヨウ素蒸気との反応及び過マンガン酸カリウム脱色反応に陽性を示す。
【００２９】
［実施例２］
抗菌活性
実施例２で得られたＡＰ１７４４４化合物をＤＭＳＯに溶解した後、水で希釈し、各種濃度の水溶液を作成し、表１に示す各種の病原性微生物に対する抗菌活性を寒天希釈平板法（日本化学療法学会標準法）に準じて試験した。その結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
表１に示したごとく、ＡＰ１７４４４化合物は各種の病原性微生物に対して抗菌活性を示す。従ってＡＰ１７４４４化合物はこれら病原菌に起因する感染症に対する抗菌剤として有用である。
【００３２】
［実施例３］
ＭＲＳＡ動物感染治療効果
ＩＣＲ系マウス（４週齢 雄）に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＫＵ１６（ＭＲＳＡ）を、1匹あたり４ｘ１０7ＣＦＵ腹腔内感染させた。感染１時間後にＡＰ１７４４４化合物およびバンコマイシンを腹腔内投与した。感染３日後までの生存マウス数よりＶａｎ ｄｅｒ Ｗａｅｒｄｅｎ法によりＥＤ５０値を求めた。その結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
表２に示したごとく、ＡＰ１７４４４化合物は、ＭＲＳＡに対してバンコマイシンと比較して優れた感染治療効果を示す。
【００３５】
［実施例４］
ＰＲＳＰ動物感染治療効果
ＩＣＲ系マウス（４週齢 雄）に、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＳＰ９６５（ＰＲＳＰ）を、1匹あたり１．８ｘ１０7ＣＦＵ静脈内感染させた。感染１時間後にＡＰ１７４４４化合物およびバンコマイシンを腹腔内投与した。感染５日後までの生存マウス数よりＶａｎ ｄｅｒ Ｗａｅｒｄｅｎ法によりＥＤ５０値を求めた。その結果を表３に示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】
表３に示したごとく、ＡＰ１７４４４化合物は、ＰＲＳＰに対してバンコマイシンよりも優れた感染治療効果を示す。
【００３８】
［実施例５］
毒性試験
実施例２で得られたＡＰ１７４４４化合物をＤＭＳＯ溶解後水希釈して２０％ＤＭＳＯ水溶液を作製し、１００ｍｇ／ｋｇをＩＣＲ系マウス３匹に静脈内投与し、死亡状況を確認した。その結果いずれの個体においても死亡例はなく、本発明化合物は、安全性が高いことが確認された。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により、ＭＲＳＡ、ＰＲＳＰを含む各種病原菌に起因する感染症に有効である新規抗生物質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＡＰ１７４４４化合物のＫＢｒ錠剤中での赤外吸収スペクトルを示す。
【図２】図２はＡＰ１７４４４化合物のＤＭＳＯ−ｄ6中で測定した1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）スペクトルを示す。
【図３】図３はＡＰ１７４４４化合物のＤＭＳＯ−ｄ6中で測定した13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）スペクトルを示す。
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な抗生物質及びその製造法と用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物の生産する抗生物質としては、これまでに数多く発見されており、医薬品、動物薬、農薬の分野においてすでに実用化されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
抗生物質の使用においては、耐性菌の発現や毒性が大きな問題となっており、これらの問題点を解決し得る新規な抗生物質の開発が強く望まれている。特に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は化膿性疾患の起因菌として知られているが、その多剤耐性菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：以降ＭＲＳＡとすることがある）が臨床上非常に大きな問題となっている（小栗ら、臨床と微生物、１５巻、７〜１５項、１９８８年）。抗ＭＲＳＡ抗生物質としてはバンコマイシン、テイコプラニン、ハベカシンが知られているが、それら薬剤に対してもバンコマイシン低感受性菌（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：以降ＶＩＳＡとすることがある）などの耐性菌が問題となっており（花木、日本臨床、５５巻、５号、２６９〜２７４項、１９９７年）、新規な抗ＭＲＳＡ抗生物質が求められている。また肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｉａｅ）は、肺炎・中耳炎・化膿性髄膜炎の起因菌として知られているが、従来使用されてきたペニシリン系およびセフェム系抗生物質に耐性を持つペニシリン耐性肺炎球菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：以降ＰＲＳＰとすることがある）が近年増加傾向にあり臨床上大きな問題となってきており（岩田、化学療法の領域、１６巻、５号、２９〜３７ページ、２０００年）、新規な抗ＰＲＳＰ抗生物質が求められている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、抗菌活性を有する新規な抗生物質を微生物代謝産物より見出すべく鋭意探索を行った。その結果、静岡県大井川町の落葉から分離したキネオスポリア（Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ）属に属する放線菌ＡＰ１７４４４株の培養液からＭＲＳＡ、ＰＲＳＰをはじめとする各種の病原性微生物に対して生育阻害活性を示す新規抗生物質が産生される事を見出し、本発明を完成させた。
【０００５】
即ち、本発明は、
（１） 下記の物理化学的性質を有するペプチド、
本発明の化合物の性状は以下の通りである。（尚、この化合物をＡＰ１７４４４化合物と略記することがある。）
ａ．アミノ酸分析により、Asn, Thr, Gly, Val, Ile, Leu, Phe, Pro,
Lanthionine, Methyllanthionineが検出できる。
ｂ．分子量：ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ ２１０７（Ｍ＋Ｈ）
ｃ．紫外部吸収スペクトル：メタノール中の主な吸収ピーク（ｎｍ）は次の通りである。
末端吸収、２６７−２７３
ｄ．赤外部吸収スペクトル：ＫＢｒ錠剤中の主な波数（ｃｍ-1）は次の通りである。
３２７０、３０５４、２９６６、１６６０、１５２７、１４２７、１２８６、１２４７、１２０１、１１３３
ｅ．Ｒｆ値：約０．５
薄層クロマトグラフィー条件は次の通りである。
固定層：シリカゲルＴＬＣ
展開溶媒：クロロホルム−メタノール（６：４）
（２）下記の物理化学的性状を有する（１）に記載のペプチド、
ｆ．アミノ酸配列のＮ末端が、Ileである。
ｇ．溶解性：ジメチルスルフォキシド、メタノールに可溶で、酢酸エチルに不溶である。
ｈ．呈色試験：ヨウ素蒸気との反応及び過マンガン酸カリウム脱色反応に陽性を示す。
（３） 上記（１）または（２）に記載の化合物を産生する能力を有するＫｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ属に属する微生物を培養し、その培養物より該化合物を採取する事を特徴とする該化合物またはその塩の製造方法、
（４） 上記（１）または（２）に記載の化合物を有効成分とする医薬、
（５） 感染症の予防及び／又は治療に用いる上記（４）に記載の医薬、
に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明について、以下具体的に説明する。
ＡＰ１７４４４化合物は赤外部吸収スペクトル測定の結果、１６６０および１５２７ｃｍ-1に強い吸収が観測され、ペプチド構造の化合物であることが示唆された。そこで、６Ｎ塩酸を用い（２４時間、１１０℃）完全加水分解したのち、イオン交換クロマトグラフィーによりアミノ酸の定量分析を行うと（日本電子 ＪＬＣ−５００／Ｖ型装置）、通常アミノ酸として、アスパラギン酸（又はアスパラギン）、スレオニン、グリシン（４分子）、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン（２分子）が検出され、ペプチド構造の化合物であることがわかった。アミノ酸分析では、通常アミノ酸以外に２種類のアミノ酸のピークが検出された。これらアミノ酸はＬＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＮＭＲ測定の結果、Ｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ及びＭｅｔｈｙｌｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ（Ｈａｎｓ−Ｇｅｏｒｇｅ ＳＡＨＬら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３０巻、８２７〜８５３ページ、１９９５年）であることが判明した。エドマン分解反応によるアミノ酸配列測定（島津製作所全自動タンパク質一次構造分析装置ＰＰＳＱ−２３Ａ型）を行ったが、１番目にＩｌｅが検出されるのみで２番目以後はアミノ酸ピークが検出されなかった。これは、２番目のアミノ酸が上記Ｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ構造であるか、ＤｅｈｙｄｒｏａｌａｎｉｎｅやＤｅｈｙｄｒｏｂｕｔｙｒｉｎｅであるためエドマン分解反応が進まないことが推定された。そこで、Ｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ構造を開裂させる反応、及びＤｅｈｙｄｒｏａｌａｎｉｎｅやＤｅｈｙｄｒｏｂｕｔｙｒｉｎｅをチオエーテル誘導体にする反応（（Ｈｅｌｍｕｔ Ｅ. Ｍｅｙｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２３巻、１８５−１９０ページ、１９９４年）を行ってからアミノ酸配列測定を２２番目まで行った結果、次の配列が得られた。ＩＸＸＶＸＬＸＸＰＧＸＴＸＰＧＧＧＸＮＸＸＦ（Ｘは、ＬａｎｔｈｉｏｎｉｎｅまたはＭｅｔｈｙｌｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅの開環構造物や、Ｄｅｈｙｄｒｏａｌａｎｉｎｅ、Ｄｅｈｙｄｒｏｂｕｔｙｒｉｎｅのチオエーテル誘導体等と推定される）。アミノ酸配列検索を行ったところ該当する化合物はなかった。したがって、ＡＰ１７４４４は新規化合物であると確認された。
【０００７】
本発明の化合物の分子量は、ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚが２１０７（Ｍ＋Ｈ）であることから、２１０６と判断した。
従って、アミノ酸分析、アミノ酸配列及び分子量から、構成アミノ酸の個数は２２個または２３個と考えられた（lanthionineやMethyllanthionine構造は、２アミノ酸として数えた）。
また、本発明の化合物の紫外部吸収スペクトルは、メタノール溶液で測定した結果、λｍａｘｎｍ（Ｅ１ｃｍ1%）が、末端吸収、２６７−２７３（４５）であり、アルカリ性メタノール溶液で測定した結果、λｍａｘｎｍ（Ｅ１ｃｍ1%）が、末端吸収、２５１−２５５（１９５）であった。
【０００８】
また本発明によれば、ＡＰ１７４４４化合物を産生する能力を有するキネオスポリア属に属する放線菌を培養し、その培養物よりＡＰ１７４４４化合物を採取する事を特徴とするＡＰ１７４４４化合物またはその塩の製造方法が提供される。
本発明のＡＰ１７４４４化合物を産生する能力を有するキネオスポリア属に属する微生物としては、本発明の化合物を産生する能力があれば特に限定されないが、例えば、下記のキネオスポリア・エスピー（Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ ｓｐ．）ＡＰ１７４４４株が例示される。
【０００９】
上記ＡＰ１７４４４株の菌学的性状は次の通りである。
１．形態的性質
イーストエキス・麦芽エキス寒天培地で２８℃、２０日間培養し、光学顕微鏡、実体顕微鏡にて観察を実施した。本菌は糸状を形成し、良く分岐した基底菌糸が発達する。通常、菌糸の断裂は認められない。成熟した基底菌糸の直径は約０．７〜１．２μｍである。基底菌糸の一部の先端に隔壁が形成され、胞子もしくは胞子嚢様の形態を形成する。胞子は球形、亜球形、楕円形、卵型で、その大きさは約０．８〜１．６μｍ×０．８〜１．６μｍである。また、胞子は運動性を有する。胞子表面は光学顕微鏡（×１５００）では平滑と観察される。気菌糸は確認できない。
【００１０】
２．培養的性質
各種培地で２８℃、２０日間培養し、観察した。色の記載はコンティナ・コーポレーション・オブ・アメリカ(Container Corporation of America)のカラー・ハーモニー・マニュアル(Color harmony manual)第４版 １９５８年に従った。
（１）イーストエキス・麦芽エキス寒天培地
生育は非常に良好。コロニーの色はLight Apricot(4ea)〜Apricot(4ga)。コロニー表面の状態は湿潤。気菌糸は形成しない。色素生産は認められない。
（２）オートミール寒天培地
生育良好。コロニーの色はPearl Pink(4ca)〜Shell Pink(5ba)。コロニー表面の状態は湿潤であるが、イーストエキス・麦芽エキス寒天培地程ではない。気菌糸は形成しない。色素生産は認められない。
【００１１】
（３）スターチ・無機塩寒天培地
生育微弱。コロニーの色はShell Tint(2ba)〜Shell Tint(3ba)。コロニー表面は湿潤ではない。気菌糸は形成しない。色素生産は認められない。
（４）グリセロール・アスパラギン寒天培地
生育は微弱でエーゼで塗布した跡を薄くトレースするように生育。コロニーの色はwhite(a)。コロニー表面は湿潤ではない。気菌糸は形成しない。色素生産は認められない。
【００１２】
３．生理学的性質
（１）温度（イーストエキス・麦芽エキス寒天培地で１４日間培養）
５℃ 生育せず
７、１１℃ 若干の生育確認
１７℃ 生育
２０、２３，２６，２９℃ 旺盛な生育
３３℃ 微弱な生育
３７℃ 若干の生育確認
３９℃、４２℃ 生育せず
（２）メラニン色素生産性
ペプトン・イースト・鉄寒天培地：色素生産 なし（生育微弱）
チロシン寒天培地：色素生産 なし（生育微弱）
【００１３】
（３）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地を基礎培地とする）
Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、イノシトール及びＬ−ラムノースを利用する。ラフィノースは利用しない。
以上の形態的性質、培養的性質及び生理学的性質で示された特徴により、本菌株をキネオスポリア（Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ）属の放線菌であると同定し、キネオスポリア・エスピー（Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ ｓｐ．）ＡＰ１７４４４と命名した。尚、本菌株を工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１９２１２として寄託した。
【００１４】
本発明に係わるＡＰ１７４４４化合物の典型的で好ましい製造方法は、キネオスポリア属に属する該化合物生産菌（例えばＫｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ ｓｐ．ＡＰ１７４４４）を好適な培地で培養し、その培養物から分離する方法が例示される。
本発明物質を製造するのに使用される培地は、液体培地による振盪培養または通気攪拌培養が最も適しているが、これに限定されない。培地はＡＰ１７４４４化合物生産菌が生育して培地中に該化合物を蓄積するものであれば特に限定されず、例えば、炭素源としてはグルコース、シュークロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜、有機酸等が使用できる。また窒素源としては、例えばイーストエキス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、グルテンミール、小麦胚芽、コーンスティープリカー、アミノ酸類、アンモニウム塩、硝酸塩、その他各種有機あるいは無機窒素化合物が用いられる。無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、各種リン酸塩、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩などを添加しても良い。また菌の生育及びＡＰ１７４４４化合物生産を促進するようなビタミン類、補酵素などを添加しても良い。特に、培地が強く発泡するのであれば、必要ある時に液体パラフィン、動物油、鉱物油、シリコン等を添加しても良い。
【００１５】
ＡＰ１７４４４化合物生産菌の培養における培養温度、培養時間、攪拌速度、通気量、培養液のｐＨなどの条件は、ＡＰ１７４４４化合物の蓄積量が最大となるように適当に選択、調節される。例えば、通常の通気攪拌培養の場合、培養温度は通常２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃で行うのが良い。培養時間は通常２〜１０日間、好ましくは３〜８日間の培養を行うのが良い。また培養液のｐＨ通常ｐＨ５．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０に調節するのが良い。
【００１６】
培養の経過に伴って培養液中に蓄積されるＡＰ１７４４４化合物の量の経時変化は以下に記載の分離、精製の際、確認可能な液体クロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィーにより測定する事ができる。
培養液からのＡＰ１７４４４化合物の分離、精製には、その物理化学的特性に基づく種々の方法を用いる事ができる。その場合に例えば下記の条件の液体クロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィーにより確認することで追跡可能である。
【００１７】
液体クロマトグラフィー条件
分離カラム：昭和電工Ｓｈｏｄｅｘ Ｃ１８ ４．６ｘ１５０ｍｍ
溶媒：アセトニトリル−０．０５％ＴＦＡ水溶液（３：７）
流速：１．０ｍｌ／分
検出：ＵＶ ２２０ｎｍ
保持時間：１３．３分
薄層クロマトグラフィー条件
固定層：東京化成シリカゲルｆＳ２０１
展開溶媒：クロロホルム−メタノール（６：４）
検出：ＵＶ ２５４ｎｍ
Ｒｆ値：約０．５
【００１８】
分離、精製の方法として、例えば、培養液中に存在するＡＰ１７４４４化合物は、水と混和しない有機溶媒、例えばブタノールにより抽出精製する事ができる。あるいは吸着剤として例えばダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化成社製）などが使用される。ＡＰ１７４４４化合物を含む画分を上記の吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、又は、ＡＰ１７４４４化合物を吸着させた後、メタノール水、アセトン水などを用いて溶出させる事により該化合物を得る事ができる。更にシリカゲル、アルミナ、フロリジルの様な担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）、トヨパールＨＷ−４０（東ソー社製）などを用いた分配カラムクロマトグラフィー、及び順相、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーなどでＡＰ１７４４４化合物をそれぞれ分離、精製する事ができる。
【００１９】
ＡＰ１７４４４化合物の抗菌活性を各種の病原性微生物に対して測定し、その最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求めた。その結果を表１に示す。表１に示したごとく、ＡＰ１７４４４化合物はＭＲＳＡ（ＫＵ１６株：北里大学より分与）、ＶＩＳＡ（ＭＵ５０株：順天堂大学より分与）、ＰＲＳＰ（ＡＳＰ９６５株：東北労災病院より分与）、および病原性嫌気性菌を含む各種の病原性微生物に対して、抗菌活性を示す。
【００２０】
また、ＡＰ１７４４４化合物でＭＲＳＡ感染治療試験を行った。その結果を表２に示す。表２に示したごとく、ＡＰ１７４４４化合物はＭＲＳＡ感染治療試験において従来最も有効とされているバンコマイシンに比較して優れた治療効果を示す。
また、ＡＰ１７４４４化合物でＰＲＳＰ感染治療試験を行った。その結果を表３に示す。表３に示したごとく、ＡＰ１７４４４化合物は、ＰＲＳＰ感染治療試験において有効とされているバンコマイシンよりも優れた治療効果を示す。
【００２１】
従って、ＡＰ１７４４４化合物は、これらの病原性微生物に起因する感染症に対する治療又は予防剤として有用である。
以上の結果から、ＡＰ１７４４４は、上記の病原性微生物を起因とする感染症に対する治療及び／又は予防剤として有用である。なお、検定に用いる微生物は、本願で用いた微生物に限られることなく、各種の寄託機関の標準菌株や各施設での臨床分離株を利用する事ができ、容易に本願の抗菌活性の効果が確認されるであろう。
【００２２】
本発明のＡＰ１７４４４化合物を医薬として使用する際、ＡＰ１７４４４化合物の他に、薬学的に許容される担体とからなる事ができる。担体としては、公知のものが使用でき、その性質によっては賦型剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等と分類されることもあるが、例えば、ラクトース、コーンスターチ、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。医薬の典型例としてはＡＰ１７４４４化合物の５％グルコース水溶液が例示される。
【００２３】
本発明の医薬は、例えば抗生物質であり、さらに詳しくは、抗ＭＲＳＡ剤及び／又は抗ＰＲＳＰ剤である。本発明の医薬は、種々の形態で投与され得るが、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与または注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点眼剤、座薬、軟膏、スプレー、ローション等による非経口投与を挙げることができる。
これらの医薬は、症状、年齢、体重、投与方法及び剤形等によって異なるが通常は成人に対して１日１ｍｇ乃至３０００ｍｇを投与することができる。
【００２４】
【実施例】
次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【００２５】
［実施例１］
（１）ＡＰ１７４４４化合物の発酵生産
グルコース１％、デキストリン１％、イーストエキス０．５％、カゼイン水解物０．５％、ＣａＣＯ3０．１％の組成の培地（滅菌前ｐＨ７．０）を５００ｍｌ容三角フラスコ４本に各１００ｍｌずつ分注し、１１５℃で１５分間滅菌した。これらにＫｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ ｓｐ．ＡＰ１７４４４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１２）の斜面培養物を一白金耳接種し、ロータリーシェーカー（毎分２００回転）で２９℃、７２時間培養し、種培養液とした。グルコース２％、スターチ２％、脱脂大豆粉２％、イーストエキス０．５％、ＮａＣｌ０．２５％、ＣａＣＯ3０．３５％、ＺｎＳＯ4・７水塩０．００５％、ＭｎＣｌ2・７水塩０．０００５％、ＣｕＳＯ4・５水塩０．０００５％の組成培地（滅菌前ｐＨ７．０）を５００ｍｌ容三角フラスコ１本に各１００ｍｌずつ分注し、１１５℃で１５分間滅菌した培地１００本に、上記の種培養液を４ｍｌずつ接種し、２９℃で１４４時間ロータリーシェーカー（毎分２００回転）上で培養を行った。
【００２６】
（２）ＡＰ１７４４４化合物の精製
上記の培養方法で得られたブロス１０ｌを遠心分離器（毎分３０００回転、１０分間）で菌体（８００ｇ）とろ液（８ｌ） に分離した。
得られたろ液を、予め水洗したスチレンジビニルベンゼン系ポリマー樹脂ＨＰ−２０（三菱ダイヤイオン製品）カラム（８００ｍｌ）に付し、ＡＰ１７４４４物質を吸着させた。カラムを、４ｌの水で水洗し、４ｌの３０％アセトン水で洗浄したのち、５０％アセトン水で溶出し、４００ｍｌずつ分画を行うと、ＡＰ１７４４４化合物はフラクションＮｏ.２〜５に溶出されていた。上述のＡＰ１７４４４を含むフラクション（Ｎｏ.２〜５）を集め減圧下で濃縮を行い、得られた濃縮乾固物を２５０ｍｌの混合溶媒（クロロホルム：メタノール＝３：２）に懸濁し、遠心分離（毎分３０００回転、１０分間）を行い、上清を得た。得られた上清を減圧下で濃縮を行い、少量の混合溶媒（クロロホルム：メタノール＝７：３）に溶解し、予めクロロホルム−メタノール（７：３）にて作成したシリカゲルカラムクロマト（３００ｍｌ）に付し上記溶媒で溶出し、２０ｍｌずつ分画を行うと、ＡＰ１７４４４化合物はフラクションＮｏ．４２〜９５に溶出されていた。
【００２７】
上述のＡＰ１７４４４を含むフラクション（Ｎｏ．４２〜９５）を集め減圧下で濃縮を行うと粗粉末３１０ｍｇが得られた。次いでこの粗粉末を６ｍｌのジメチルスルフォキシドに溶解し、その１２分の１量を予めアセト二トリル−０．０５％ＴＦＡ（３０：７０）にて作成した逆相分取カラム（昭和電工、Ｓｈｏｄｅｘ Ｃ１８Ｍ ２０ｍｍΦｘ２５０ｍｍ）に付し、同混合溶媒で展開し、５ｍｌずつ分画した。フラクションＮｏ．４６〜５４にＡＰ１７４４４化合物成分を得た。同様の操作を１２回行い、ＡＰ１７４４４化合物を含む各フラクションをそれぞれ集めアセト二トリルを減圧濃縮後、凍結乾燥すると、単一なＡＰ１７４４４化合物（１６４ｍｇ）の白色粉末が得られた。得られたＡＰ１７４４４化合物の各種性状を検定したところ以下の結果を示した。
【００２８】
ＡＰ１７４４４化合物の性状
１）概観：白色粉末
２）比旋光度：〔α〕D22＝＋４０．２±５（ｃ＝１．０、ＤＭＳＯ）
３）分子量：ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ ２１０７（Ｍ＋Ｈ）
４）紫外部吸収スペクトル：メタノール中の主な吸収ピーク（ｎｍ）は次の通りである。
λｍａｘｎｍ（Ｅ１ｃｍ1%）末端吸収、２６７−２７３（４５）
アルカリ性メタノール溶液中の主な吸収ピーク（ｎｍ）は次の通りである。
λｍａｘｎｍ（Ｅ１ｃｍ1%）末端吸収、２５１−２５５（１９５）
５）赤外部吸収スペクトル：ＫＢｒ錠剤中の主な波数（ｃｍ-1）は次の通りである。
３２７０、３０５４、２９６６、１６６０、１５２７、１４２７、１２８６、１２４７、１２０１、１１３３
６）少なくとも以下のアミノ酸を含む。Asn, Thr, Gly(4), Val, Ile, Leu, Phe, Pro(2), Lanthionine, Methyllanthionine
７）1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：図２に示す通りである。
８）13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）：図３に示す通りである。
９）溶解性：ジメチルスルフォキシド、メタノールに可溶で、酢酸エチルに不溶である。
１０）呈色試験：ヨウ素蒸気との反応及び過マンガン酸カリウム脱色反応に陽性を示す。
【００２９】
［実施例２］
抗菌活性
実施例２で得られたＡＰ１７４４４化合物をＤＭＳＯに溶解した後、水で希釈し、各種濃度の水溶液を作成し、表１に示す各種の病原性微生物に対する抗菌活性を寒天希釈平板法（日本化学療法学会標準法）に準じて試験した。その結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
表１に示したごとく、ＡＰ１７４４４化合物は各種の病原性微生物に対して抗菌活性を示す。従ってＡＰ１７４４４化合物はこれら病原菌に起因する感染症に対する抗菌剤として有用である。
【００３２】
［実施例３］
ＭＲＳＡ動物感染治療効果
ＩＣＲ系マウス（４週齢 雄）に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＫＵ１６（ＭＲＳＡ）を、1匹あたり４ｘ１０7ＣＦＵ腹腔内感染させた。感染１時間後にＡＰ１７４４４化合物およびバンコマイシンを腹腔内投与した。感染３日後までの生存マウス数よりＶａｎ ｄｅｒ Ｗａｅｒｄｅｎ法によりＥＤ５０値を求めた。その結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
表２に示したごとく、ＡＰ１７４４４化合物は、ＭＲＳＡに対してバンコマイシンと比較して優れた感染治療効果を示す。
【００３５】
［実施例４］
ＰＲＳＰ動物感染治療効果
ＩＣＲ系マウス（４週齢 雄）に、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＳＰ９６５（ＰＲＳＰ）を、1匹あたり１．８ｘ１０7ＣＦＵ静脈内感染させた。感染１時間後にＡＰ１７４４４化合物およびバンコマイシンを腹腔内投与した。感染５日後までの生存マウス数よりＶａｎ ｄｅｒ Ｗａｅｒｄｅｎ法によりＥＤ５０値を求めた。その結果を表３に示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】
表３に示したごとく、ＡＰ１７４４４化合物は、ＰＲＳＰに対してバンコマイシンよりも優れた感染治療効果を示す。
【００３８】
［実施例５］
毒性試験
実施例２で得られたＡＰ１７４４４化合物をＤＭＳＯ溶解後水希釈して２０％ＤＭＳＯ水溶液を作製し、１００ｍｇ／ｋｇをＩＣＲ系マウス３匹に静脈内投与し、死亡状況を確認した。その結果いずれの個体においても死亡例はなく、本発明化合物は、安全性が高いことが確認された。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により、ＭＲＳＡ、ＰＲＳＰを含む各種病原菌に起因する感染症に有効である新規抗生物質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＡＰ１７４４４化合物のＫＢｒ錠剤中での赤外吸収スペクトルを示す。
【図２】図２はＡＰ１７４４４化合物のＤＭＳＯ−ｄ6中で測定した1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）スペクトルを示す。
【図３】図３はＡＰ１７４４４化合物のＤＭＳＯ−ｄ6中で測定した13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）スペクトルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の物理化学的性状を有するペプチド。
ａ．アミノ酸分析により、Asn, Thr, Gly, Val, Ile, Leu, Phe, Pro, Lanthionine, Methyllanthionineが検出できる。
ｂ．分子量：ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ ２１０７（Ｍ＋Ｈ）
ｃ．紫外部吸収スペクトル：メタノール中の主な吸収ピーク（ｎｍ）は次の通りである。
末端吸収、２６７−２７３
ｄ．赤外部吸収スペクトル：ＫＢｒ錠剤中の主な波数（ｃｍ-1）は次の通りである。
３２７０、３０５４、２９６６、１６６０、１５２７、１４２７、１２８６、１２４７、１２０１、１１３３
ｅ．Ｒｆ値：約０．５
薄層クロマトグラフィー条件は次の通りである。
固定層：シリカゲルＴＬＣ
展開溶媒：クロロホルム−メタノール（６：４）
【請求項２】
次の物理化学的性状を有する請求項１に記載のペプチド。
ｆ．アミノ酸配列のＮ末端が、Ileである。
ｇ．溶解性：ジメチルスルフォキシド、メタノールに可溶で、酢酸エチルに不溶である。
ｈ．呈色試験：ヨウ素蒸気との反応及び過マンガン酸カリウム脱色反応に陽性を示す。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物を産生する能力を有するＫｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ属に属する微生物を培養し、その培養物より該化合物を採取する事を特徴とする該化合物またはその塩の製造方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載された化合物を有効成分とする医薬。
【請求項５】
感染症の予防及び／又は治療に用いるための請求項４に記載の医薬。
【請求項１】
次の物理化学的性状を有するペプチド。
ａ．アミノ酸分析により、Asn, Thr, Gly, Val, Ile, Leu, Phe, Pro, Lanthionine, Methyllanthionineが検出できる。
ｂ．分子量：ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ ２１０７（Ｍ＋Ｈ）
ｃ．紫外部吸収スペクトル：メタノール中の主な吸収ピーク（ｎｍ）は次の通りである。
末端吸収、２６７−２７３
ｄ．赤外部吸収スペクトル：ＫＢｒ錠剤中の主な波数（ｃｍ-1）は次の通りである。
３２７０、３０５４、２９６６、１６６０、１５２７、１４２７、１２８６、１２４７、１２０１、１１３３
ｅ．Ｒｆ値：約０．５
薄層クロマトグラフィー条件は次の通りである。
固定層：シリカゲルＴＬＣ
展開溶媒：クロロホルム−メタノール（６：４）
【請求項２】
次の物理化学的性状を有する請求項１に記載のペプチド。
ｆ．アミノ酸配列のＮ末端が、Ileである。
ｇ．溶解性：ジメチルスルフォキシド、メタノールに可溶で、酢酸エチルに不溶である。
ｈ．呈色試験：ヨウ素蒸気との反応及び過マンガン酸カリウム脱色反応に陽性を示す。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物を産生する能力を有するＫｉｎｅｏｓｐｏｒｉａ属に属する微生物を培養し、その培養物より該化合物を採取する事を特徴とする該化合物またはその塩の製造方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載された化合物を有効成分とする医薬。
【請求項５】
感染症の予防及び／又は治療に用いるための請求項４に記載の医薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−１７６４０６（Ｐ２００６−１７６４０６Ａ）
【公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−６４８４５（Ｐ２００３−６４８４５）
【出願日】平成１５年３月１１日（２００３．３．１１）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年３月１１日（２００３．３．１１）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
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