ペプチド輸送酵素遺伝子による酵母の形質転換法と当該遺伝子のプロモーター領域を用いたタンパク質の発現法
【課題】 短期間で簡易な酵母の形質転換系及び高発現ベクターの開発。
【解決手段】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのペブチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）を含むベクターを用いて、ペブチド輸送能が喪失した酵母を宿主とする形質転換系が可能となる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのペプチド輸送酵素遺伝子のプロモーターを利用した発現ベクターを用いて、ＹＰＤ培地、清酒もろみ、麦汁、ブドウ果汁などでプロモーター下流の遺伝子を発現させることができる。その結果、酵母への遺伝子導入のためのマーカーが更に一つ加わることで、酵母の遺伝子操作がより容易となった。醸造環境下でも発現可能なプロモーターの入手により、酒類の研究開発がより容易になった。
【解決手段】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのペブチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）を含むベクターを用いて、ペブチド輸送能が喪失した酵母を宿主とする形質転換系が可能となる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのペプチド輸送酵素遺伝子のプロモーターを利用した発現ベクターを用いて、ＹＰＤ培地、清酒もろみ、麦汁、ブドウ果汁などでプロモーター下流の遺伝子を発現させることができる。その結果、酵母への遺伝子導入のためのマーカーが更に一つ加わることで、酵母の遺伝子操作がより容易となった。醸造環境下でも発現可能なプロモーターの入手により、酒類の研究開発がより容易になった。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母のペプチド輸送酵素遺伝子の利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
酵母は遺伝子解析が進んだ微生物であり、遺伝子操作によるタンパク質の発現系の宿主としても用いられている。
酵母に遺伝子導入するためのマーカーの付与に、フルオロオロチン酸耐性によるウラシル要求性、α−アミノアジピン酸耐性によるリジン要求性等が利用されている。また、マーカーを有さない醸造用酵母には、薬剤耐性遺伝子を利用した形質転換系が報告されている。
【０００３】
しかしながら、酵母への遺伝子導入のためのマーカーの種類は多くないため、更に多くの手法が望まれるところである。
【０００４】
また、酵母でのタンパク質発現系のプロモーターとしては、主に解糖系遺伝子のものが使用されている。しかし、従来のプロモーターを利用した場合、清酒醸造などの醸造環境下では発現量が少なくなる場合があるなどの問題点を有している。
【０００５】
本発明は、酵母のペプチド輸送酵素遺伝子を利用してこれらの問題点を解決するのにはじめて成功したものであるが、先に本発明者らは、多酸・低アミノ酸酒類製造用酵母の育種に成功したものの、育種された酵母はペプチド輸送能を欠如していること、ましてや、ペプチド輸送酵素遺伝子の作用の解明には至らなかった（特許文献１参照）。
【特許文献１】特許第３３２１５９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
酒類製造業、研究機関その他遺伝子組換え技術に関連する業界において、短期間で簡易な酵母の形質転換系の開発と醸造環境下等で高発現するプロモーターの取得は、従来より重要な課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、各方面から検討の結果、本発明者らが先に開発するのにはじめて成功した多酸・低アミノ酸酒類製造用酵母（特許第３３２１５９７号公報）に着目し、その解析を進めたところ、その過程において、育種された酵母は、ペプチド輸送能を喪失していること、喪失したペプチド輸送能は、酵母のペプチド輸送酵素ＰＴＲ２遺伝子の導入により回復することが判明した。
【０００８】
また、ＰＴＲ２遺伝子のプロモーター領域を醸造環境下において酵素の誘導・発現に用いたところ、一般的に用いられている解糖系遺伝子のものより効率的にタンパク質を発現させることが判明した。
【０００９】
更に、通常のタンパク質発現系では、ＹＰＤ培地を用いて３０℃での振とう培養が一般的であることから、当該条件下における解糖系遺伝子とＰＴＲ２遺伝子のプロモーターについて検討を加えたところ、ＰＴＲ２遺伝子のプロモーターは、解糖系のものと比較して遜色のない結果も得られた。
【００１０】
本発明は、これらの有用新知見に基づいてなされたものであり、更にＰＴＲ２遺伝子の塩基配列の決定にも成功し、そしてプロモーター領域もつきとめ、各種ベクターの構築、ＰＴＲ２遺伝子の発現も確認し、遂に本発明の完成に至ったものである。
【００１１】
本発明は、ＰＴＲ２遺伝子の利用に係り、その実施態様は以下に例示される。
【００１２】
（態様１）
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）を含むベクター及び／又はＰＴＲ２をプラスミドに導入することを特徴とする該ベクターの製造方法。
【００１３】
（態様２）
ペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）が配列番号１の塩基配列で示されるＤＮＡからなるかあるいはそれを含むものであること、を特徴とする態様１に記載のベクター及び／又はその製造方法。
【００１４】
（態様３）
プラスミドｐＲＳ３１６（その塩基配列を配列番号２に示す）にペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）のＤＮＡを導入してなること、を特徴とする態様１又は２に記載のベクター及び／又はその製造方法。
【００１５】
（態様４）
態様１〜３のいずれか１項にしたがってベクターｐＲＳ３１６−Ｐｔｒ２を製造する方法及び／又は得られた該ベクター。
【００１６】
（態様５）
サッカロマイセス・セレビシエのＰＴＲ２遺伝子のプロモーターを導入すること、を特徴とする発現ベクターの製造方法及び／又は得られた発現ベクター。
【００１７】
（態様６）
プロモーターが、配列番号１の塩基配列において、塩基番号５１〜１４９９の領域からなるかあるいはそれを含むもの（例えば、塩基番号１〜１４９９の領域、また、その上流域及び／又は下流域を含む領域、更にＰＴＲ２遺伝子自体も使用可能であり、その場合は該遺伝子が有するプロモーターを利用することとなるし、ペプチド輸送酵素遺伝子としての作用も奏される。）であること、を特徴とする態様５に記載の発現ベクターの製造方法、及び／又は得られた発現ベクター。
【００１８】
（態様７）
プラスミド（例えば、ＹＥｐＦＬＡＧといったＹＥｐ型プラスミド）にＰＴＲ２遺伝子のプロモーター領域を導入すること、を特徴とする態様５又は６に記載の発現ベクター及び／又はその製造方法。
【００１９】
（態様８）
更にタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡを導入してなること、を特徴とする態様５又は態様６に記載の発現ベクター及び／又はその製造方法。
【００２０】
（態様９）
タンパク質をコードする遺伝子がキシラナーゼ遺伝子ＸｙｎＦ３（その塩基配列を配列番号３に示す）であること、を特徴とする態様８に記載の発現ベクター及び／又はその製造方法。
【００２１】
（態様１０）
態様１〜４のいずれか１項に記載のベクターを用いること、を特徴とするペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）による酵母の形質転換方法。
【００２２】
（態様１１）
態様５〜９のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いること、を特徴とするペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）のプロモーター領域を利用するタンパク質の発現方法。
【００２３】
（態様１２）
態様９にしたがって発現ベクター（ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３）を構築し、この発現ベクターを用いて酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）を形質転換し、得られた形質転換体を清酒もろみ、麦汁、ブドウ果汁に添加し、キシラナーゼ遺伝子を発現させて、キシラナーゼを分泌せしめること、を特徴とするキシラナーゼの製造方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、ペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）を微生物、特に酵母への遺伝子導入のためのマーカーとして利用することができ、短期間で簡易な酵母の新しい形質転換系を開発した点で本発明はきわめて卓越している。
【００２５】
また、本発明は、ＰＴＲ２のプロモーターが醸造環境下で高発現するプロモーターであることも新規に発見し、実際に各種醸造もろみ中でのキシラナーゼ遺伝子の発現も確認しており、ＰＴＲ２のプロモーターを利用して高発現ベクターを構築し、醸造業界において、例えば、清酒、ビール、ブドウ酒等の効率的生産に寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明者らは、先に、多酸・低アミノ酸酒類製造用酵母の育種にはじめて成功したが（特許第３３２１５９７号）、その後の解析において、それにはペプチド輸送酵素をコードする遺伝子が関係することをはじめて見出した。そして更に研究の結果、ペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２遺伝子）がマーカー遺伝子として利用できることをはじめて見出し、本発明の完成に至ったものである。
【００２７】
ペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）の塩基配列は、配列番号１（図１〜３）に示される。ＰＴＲ２は、その塩基配列が明らかにされたので、先の特許公報（特許第３２１５９７号広報）にも記載されている清酒酵母協会９号、同協会７号、同協会１０号等の各種市販されている実用酵母あるいは実験室酵母等の酵母の遺伝子から切り出してもよいし、酵母ゲノムＤＮＡを鋳型にしてプライマーを用いてＰＣＲ法等によって合成してもよく、その入手に格別の困難性はない。
【００２８】
本発明に係るＰＴＲ２含有ベクターを作成するには、遺伝子導入の常法によればよく、プラスミドの制限酵素切断部位にＰＴＲ２を挿入すればよい。使用するプラスミドに格別の制限はなく、市販品等公知のものも適宜使用可能である。好適なプラスミドの１例としては、ｐＲＳ３１６が例示される。このプラスミドｐＲＳ３１６は、文献公知であるだけでなく、インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｓｅｑ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｖｅｃｔｏｒｄｂ／ｖｅｃｔｏｒ＿ｄｅｓｃｒｉｐ／ＣＯＭＰＬＥＴＥ／ＰＲＳ３１６．ＳＥＱ．ｈｔｍｌ）にて公開されており、入手に格別の困難性はない。プラスミドｐＲＳ３１６の塩基配列は配列番号２（図４〜６）に示される。
【００２９】
本発明は、上記のほかに、発現ベクターも提供するものである。発現ベクターを作成するには、遺伝子導入の常法によればよく、プラスミドの制限酵素切断部位にプロモーター遺伝子のＤＮＡを挿入すればよい。
【００３０】
発現ベクターのプロモーターとしては、配列番号１の塩基配列の内、塩基番号５１〜１４９９の領域（図中、下線を付し且つ太字にて示す領域）が使用される。この領域は、ＰＴＲ２のプロモーター領域に包含されるものであって、本発明に係る発現ベクターは、そのプロモーターとしてＰＴＲ２のプロモーターをそのままあるいはその一部をあるいはそのプロモーターを含む領域を利用することができ、きわめて特徴的である。
【００３１】
したがって、例えば、配列番号１の塩基配列の内、塩基番号１〜１４９９の領域（図中、下線を付した領域）もプロモーターとして使用することができ、また、ＰＴＲ２全体をベクターに導入してもよく、その場合はＰＴＲ２の構造遺伝子の作用も同時に利用できる。プロモーターは、ＰＴＲ２から切り出してもよいし、酵母のゲノムＤＮＡを鋳型にしてプライマーを用いてＰＣＲ法等によって合成してもよく、その入手に格別の困難性はない。
【００３２】
本発明に係る発現ベクターを作成するには、遺伝子導入の常法によればよく、プラスミドの制限酵素切断部位にプロモーター遺伝子のＤＮＡを挿入すればよい。使用するプラスミドに格別の制限はなく、市販品等も適宜使用可能である。好適なプラスミドとしては、ＹＥｐ型プラスミド、例えば、市販されているプラスミドＹＥｐＦＬＡＧ（シグマ社）を使用してもよい。
【００３３】
このようにして作成した発現ベクターは、そのプロモーターの下流に分泌させたいタンパク質をコードする遺伝子を挿入することにより、目的とするタンパク質発現ベクターとすることができる。目的とするタンパク質をコードする遺伝子としては、例えばキシラナーゼ遺伝子を挙げることができる。その１例としてＸｙｎＦ３遺伝子（その塩基配列を配列番号３（図７）に示す）が例示されるが、本遺伝子は公知であり、入手に困難性はない。
【００３４】
このようにして作成したベクター、発現ベクター、タンパク質発現ベクターは、それぞれ常法にしたがって酵母に形質転換し、形質転換体を作成し、それぞれの用途に使用する。
【００３５】
本発明の実施にあたり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）を含むベクターの宿主としては、先願の発明、特許第３３２１５９７号の多酸・低アミノ酸酒類製造用酵母の育種において利用したＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓに対して耐性となった酵母より、ペプチド輸送能を喪失していることを確認した株を宿主として利用できる。
【００３６】
また、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのペプチド輸送酵素遺伝子の上流域約１５００ｂｐをプロモーターとするプラスミドの宿主としては、当該プラスミドにウラシル要求性等のマーカーを入れた場合には、ウラシル要求性を示す酵母株を用いることは当然である。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのペプチド輸送酵素遺伝子の上流域約１５００ｂｐをプロモーターの利用としては、当該プロモーターの下流にマルチクローニング部位を導入することが一般的であるが、タンパク質分泌のためのシグナルペプチド領域のＤＮＡ配列を下流におき、更にその下流に酵母菌体外に分泌させたいタンパク質をコードする遺伝子を挿入するためのマルチクローニング部位を導入してもよい。
【００３７】
本発明に係る形質転換体の内、キシラナーゼ遺伝子を挿入したタンパク発現ベクターを導入してなる形質転換酵母は、これを清酒もろみ、麦汁、ブドウ果汁等に添加して培養することにより、キシラナーゼ遺伝子を発現し、キシラナーゼを効率的に産生するため、原料の細胞壁が効率的に破壊され、その結果、清酒、ビール、ブドウ酒その他醸造製品の原料利用率を高めることができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）
（ペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）を含むベクターの作成）
ｐＲＳ３１６（Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｈｏｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ ａｎｄ Ｐｈｉｌｉｐ Ｈｉｅｔｅｒ.Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１２２，１９−２７，（１９８９）：その塩基配列を配列番号２（図４〜６）に示す）の制限酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａｌ部位に、酵母Ｘ２１８０ＡのゲノムＤＮＡよりプライマーＡ（配列番号４（図８）：ＰＴＲ２の上流域１５００−１４７９に相当する配列を含む）とプライマーＢ（配列番号５（図９）：ＰＴＲ２の下流域３７７−３４６に相当する配列を含む）を用いたＰＣＲ反応により増幅したＰＴＲ２遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入し、プラスミドｐＲＳ３１６−Ｐｔｒ２（図１４）を作成した。
【００４０】
（実施例２）
（ｐＲＳ３１６−Ｐｔｒ２による酵母の形質転換）
Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓに対して耐性となった清酒酵母協会９号に、ｐＲＳ３１６−Ｐｔｒ２による形質転換を行った。形質転換処理した酵母はＹＮＢ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｌａｔｅ（０．７％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ，２％ ｇｌｕｃｏｓｅ，０．１％ ｐｈｅ−ａｌａ ｐｅｐｔｉｄｅ，２％ ａｇａｒ）に塗布し、３０℃でコロニーを生育させた。その結果、ｐＲＳ３１６−Ｐｔｒ２、１マイクログラム当たり２０コロニーの形質転換株が得られた。
【００４１】
ブラスチシジンＳ耐性協会９号清酒酵母は、次のようにして作成した。すなわち、協会９号清酒酵母を、ＹＰＤ培地（イーストエキス１％ ペプトン２％ グルコース２％）に接種し、増殖させた後、無菌的に集菌洗浄し、その０．１ｍｌをブラスチシジンＳ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を含むＹＰＤ寒天培地に塗布し、３０℃で培養し、生育したコロニーをブラスチシジンＳ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を含むＹＰＤ寒天培地に更に植え次いで、作成した。
【００４２】
（実施例３）
（ペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）のプロモーターを含むベクターの作成）
酵母Ｓ２８８ＣのゲノムＤＮＡよりプライマーＣ（配列番号６（図１０）：ＰＴＲ２の上流域１４４７−１４２８に相当する配列を含む）とプライマーＤ（配列番号７（図１１）：ＰＴＲ２の上流域３２−１に相当する配列を含む）を用いたＰＣＲ反応によりＰＴＲ２遺伝子のプロモーターＤＮＡ（配列番号１において、塩基番号５１−１４９９の領域：図中、下線を付し且つ太字で示した領域）を調製した。
【００４３】
麹菌アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ４０のｃＤＮＡよりプライマーＥ（配列番号８：図１２）とプライマーＦ（配列番号９：図１３）を用いたＰＣＲ反応により増幅したキシラナーゼ遺伝子（ＸｙｎＦ３遺伝子のＤＮＡ断片を調製した（配列番号３：図７）
【００４４】
市販のプラスミドＹＥｐＦＬＡＧ（シグマ社より販売）のＡＤＨ２のプロモーター領域を調製したＰＴＲ２遺伝子のプロモーターＤＮＡに置き換え、ＦＬＡＧ及びマルチクローニング領域を、調製したＸｙｎＦ３遺伝子のＤＮＡ断片をＸｙｎＦ３タンパク質が酵母の菌体外に分泌されるように置き換え、ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３（図１５）を作成した。
【００４５】
（実施例４）
（ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３形質転換酵母による培地中へのキシラナーゼ分泌）
ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３(本ベクター）を酵母ＢＪ３５０５株に形質転換し、形質転換株をＹＰＤ培地（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，２％ ｐｅｐｔｏｎｅ，２％ ｇｌｕｃｏｓｅ）に植菌し３０℃で培養し、菌体外のキシラナーゼ活性を測定した。なお、対照としてＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３のプロモーター領域をＡＤＨ１（アルコールデヒドロゲナーゼ１）若しくはＡＤＨ２（アルコールデヒドロゲナーゼ２）のプロモーターに置き換えたもの（各々ＹＥｐＡｄｈ１Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３（対照１）、ＹＥｐＡｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３（対照２））を作成し、同様の実験を行った。培養液中のキシラナーゼ活性（Ｕ）測定結果を表１に示す。
【００４６】
（表１）
――――――――――――――――――――――――――――――――
培養時間（時間） 本ベクター 対照１ 対照２
――――――――――――――――――――――――――――――――
１６ ８．７ ７．６ １．４８
２４ １０．５ ９．２ １．４８
――――――――――――――――――――――――――――――――
但し、活性の表示は、（Ｕ／ｍｉｎ／ｍｌ）
【００４７】
この結果から、Ｐｔｒ２のプロモーターは、高発現系によく用いられるＡＤＨ１やＡＤＨ２のプロモーターと遜色のないことが判明した。
【００４８】
（実施例５）
（ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３形質転換酵母による清酒もろみ中へのキシラナーゼ分泌）
ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ１の２μ領域を除いたベクターを清酒酵母協会７０１号のトリプトファン要求性株Ｔ１に形質転換した株（Ｔ１−Ｐｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３）を造成した。また、ＹＥｐＡｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３も同様に酵母Ｔ１株に形質転換し、株（Ｔ１−Ａｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３）を造成した。なお、宿主酵母Ｔ１株は、上記Ｋ７０１１号のトリプトファン、ウラシル要求性株ＵＴ１株のウラシル要求性を相補した株である。
【００４９】
当該形質転換株を用いて清酒の仕込試験を行った。その結果、清酒もろみ中に、Ｔ１−Ｐｔｒ２ＰｒｏＸｙｎＦ３株の場合は、１０日目以降にはキシラナーゼ活性が１０Ｕを越え、もろみ末期まで高いレベルを維持したが、Ｔ１−Ａｄｈ２ＰｒｏＸｙｎＦ３株は全期間を通して活性が認められなかった。
【００５０】
（実施例６）
（ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３形質転換酵母による麦汁中へのキシラナーゼ分泌）
ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ１を清酒酵母協会７０１号のトリプトファン要求性株Ｔ１に形質転換した株（Ｔ１−ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３）を造成した。また、ＹＥｐＡｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３も同様に酵母Ｔ１株に形質転換し、株（Ｔ１−ＹＥｐＡｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３）を造成した。
【００５１】
二条大麦麦芽を用いて、糖度１１の麦汁を調製し、当該形質転換株添加による仕込試験を行った。６日間１５℃で培養した結果、麦汁発酵液中に、Ｔ１−ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３株の場合は、キシラナーゼ活性が３．６Ｕ／ｍｌ認められたが、Ｔ１−ＹＥｐＡｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３株は活性が認められなかった。
【００５２】
（実施例７）
（ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３形質転換酵母によるブドウ果汁中へのキシラナーゼ分泌）
ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ１を清酒酵母協会７０１号のトリプトファン要求性株Ｔ１に形質転換した株（Ｔ１−ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３）を造成した。また、ＹＥｐＡｄｈＰｒｏ−ＸｙｎＦ３も同様に酵母Ｔ１株に形質転換し、株（Ｔ１−ＹＥｐＡｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３）を造成した。
【００５３】
甲州ブドウを用いて、糖度２１のブドウ果汁を調製し、当該形質転換株添加によるブドウ果汁発酵試験を行った。６日間１５℃で培養した結果、ブドウ果汁発酵液中に、Ｔ１−ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３株の場合は、キシラナーゼ活性が５Ｕ／ｍｌ認められたが、Ｔ１−ＹＥｐＡｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３株は活性が認められなかった。
【００５４】
なお、実施例５、６及び７いずれの場合も、発酵終了時の酵母数、アルコール濃度に顕著な差は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】配列番号１で示されるペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）の塩基配列を示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】同上続きを示す。
【図４】配列番号２で示されるプラスミドｐＲＳ３１６の塩基配列を示す。
【図５】同上続きを示す。
【図６】同上続きを示す。
【図７】配列番号３で示されるキシラナーゼ遺伝子（ＸｙｎＦ３）の塩基配列を示す。
【図８】プライマーＡを示す。
【図９】プライマーＢを示す。
【図１０】プライマーＣを示す。
【図１１】プライマーＤを示す。
【図１２】プライマーＥを示す。
【図１３】プライマーＦを示す。
【図１４】ベクターｐＲＳ３１６−Ｐｔｒ２の構築図である。
【図１５】発現ベクターＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３の構築図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母のペプチド輸送酵素遺伝子の利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
酵母は遺伝子解析が進んだ微生物であり、遺伝子操作によるタンパク質の発現系の宿主としても用いられている。
酵母に遺伝子導入するためのマーカーの付与に、フルオロオロチン酸耐性によるウラシル要求性、α−アミノアジピン酸耐性によるリジン要求性等が利用されている。また、マーカーを有さない醸造用酵母には、薬剤耐性遺伝子を利用した形質転換系が報告されている。
【０００３】
しかしながら、酵母への遺伝子導入のためのマーカーの種類は多くないため、更に多くの手法が望まれるところである。
【０００４】
また、酵母でのタンパク質発現系のプロモーターとしては、主に解糖系遺伝子のものが使用されている。しかし、従来のプロモーターを利用した場合、清酒醸造などの醸造環境下では発現量が少なくなる場合があるなどの問題点を有している。
【０００５】
本発明は、酵母のペプチド輸送酵素遺伝子を利用してこれらの問題点を解決するのにはじめて成功したものであるが、先に本発明者らは、多酸・低アミノ酸酒類製造用酵母の育種に成功したものの、育種された酵母はペプチド輸送能を欠如していること、ましてや、ペプチド輸送酵素遺伝子の作用の解明には至らなかった（特許文献１参照）。
【特許文献１】特許第３３２１５９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
酒類製造業、研究機関その他遺伝子組換え技術に関連する業界において、短期間で簡易な酵母の形質転換系の開発と醸造環境下等で高発現するプロモーターの取得は、従来より重要な課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、各方面から検討の結果、本発明者らが先に開発するのにはじめて成功した多酸・低アミノ酸酒類製造用酵母（特許第３３２１５９７号公報）に着目し、その解析を進めたところ、その過程において、育種された酵母は、ペプチド輸送能を喪失していること、喪失したペプチド輸送能は、酵母のペプチド輸送酵素ＰＴＲ２遺伝子の導入により回復することが判明した。
【０００８】
また、ＰＴＲ２遺伝子のプロモーター領域を醸造環境下において酵素の誘導・発現に用いたところ、一般的に用いられている解糖系遺伝子のものより効率的にタンパク質を発現させることが判明した。
【０００９】
更に、通常のタンパク質発現系では、ＹＰＤ培地を用いて３０℃での振とう培養が一般的であることから、当該条件下における解糖系遺伝子とＰＴＲ２遺伝子のプロモーターについて検討を加えたところ、ＰＴＲ２遺伝子のプロモーターは、解糖系のものと比較して遜色のない結果も得られた。
【００１０】
本発明は、これらの有用新知見に基づいてなされたものであり、更にＰＴＲ２遺伝子の塩基配列の決定にも成功し、そしてプロモーター領域もつきとめ、各種ベクターの構築、ＰＴＲ２遺伝子の発現も確認し、遂に本発明の完成に至ったものである。
【００１１】
本発明は、ＰＴＲ２遺伝子の利用に係り、その実施態様は以下に例示される。
【００１２】
（態様１）
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）を含むベクター及び／又はＰＴＲ２をプラスミドに導入することを特徴とする該ベクターの製造方法。
【００１３】
（態様２）
ペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）が配列番号１の塩基配列で示されるＤＮＡからなるかあるいはそれを含むものであること、を特徴とする態様１に記載のベクター及び／又はその製造方法。
【００１４】
（態様３）
プラスミドｐＲＳ３１６（その塩基配列を配列番号２に示す）にペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）のＤＮＡを導入してなること、を特徴とする態様１又は２に記載のベクター及び／又はその製造方法。
【００１５】
（態様４）
態様１〜３のいずれか１項にしたがってベクターｐＲＳ３１６−Ｐｔｒ２を製造する方法及び／又は得られた該ベクター。
【００１６】
（態様５）
サッカロマイセス・セレビシエのＰＴＲ２遺伝子のプロモーターを導入すること、を特徴とする発現ベクターの製造方法及び／又は得られた発現ベクター。
【００１７】
（態様６）
プロモーターが、配列番号１の塩基配列において、塩基番号５１〜１４９９の領域からなるかあるいはそれを含むもの（例えば、塩基番号１〜１４９９の領域、また、その上流域及び／又は下流域を含む領域、更にＰＴＲ２遺伝子自体も使用可能であり、その場合は該遺伝子が有するプロモーターを利用することとなるし、ペプチド輸送酵素遺伝子としての作用も奏される。）であること、を特徴とする態様５に記載の発現ベクターの製造方法、及び／又は得られた発現ベクター。
【００１８】
（態様７）
プラスミド（例えば、ＹＥｐＦＬＡＧといったＹＥｐ型プラスミド）にＰＴＲ２遺伝子のプロモーター領域を導入すること、を特徴とする態様５又は６に記載の発現ベクター及び／又はその製造方法。
【００１９】
（態様８）
更にタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡを導入してなること、を特徴とする態様５又は態様６に記載の発現ベクター及び／又はその製造方法。
【００２０】
（態様９）
タンパク質をコードする遺伝子がキシラナーゼ遺伝子ＸｙｎＦ３（その塩基配列を配列番号３に示す）であること、を特徴とする態様８に記載の発現ベクター及び／又はその製造方法。
【００２１】
（態様１０）
態様１〜４のいずれか１項に記載のベクターを用いること、を特徴とするペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）による酵母の形質転換方法。
【００２２】
（態様１１）
態様５〜９のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いること、を特徴とするペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）のプロモーター領域を利用するタンパク質の発現方法。
【００２３】
（態様１２）
態様９にしたがって発現ベクター（ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３）を構築し、この発現ベクターを用いて酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）を形質転換し、得られた形質転換体を清酒もろみ、麦汁、ブドウ果汁に添加し、キシラナーゼ遺伝子を発現させて、キシラナーゼを分泌せしめること、を特徴とするキシラナーゼの製造方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、ペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）を微生物、特に酵母への遺伝子導入のためのマーカーとして利用することができ、短期間で簡易な酵母の新しい形質転換系を開発した点で本発明はきわめて卓越している。
【００２５】
また、本発明は、ＰＴＲ２のプロモーターが醸造環境下で高発現するプロモーターであることも新規に発見し、実際に各種醸造もろみ中でのキシラナーゼ遺伝子の発現も確認しており、ＰＴＲ２のプロモーターを利用して高発現ベクターを構築し、醸造業界において、例えば、清酒、ビール、ブドウ酒等の効率的生産に寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明者らは、先に、多酸・低アミノ酸酒類製造用酵母の育種にはじめて成功したが（特許第３３２１５９７号）、その後の解析において、それにはペプチド輸送酵素をコードする遺伝子が関係することをはじめて見出した。そして更に研究の結果、ペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２遺伝子）がマーカー遺伝子として利用できることをはじめて見出し、本発明の完成に至ったものである。
【００２７】
ペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）の塩基配列は、配列番号１（図１〜３）に示される。ＰＴＲ２は、その塩基配列が明らかにされたので、先の特許公報（特許第３２１５９７号広報）にも記載されている清酒酵母協会９号、同協会７号、同協会１０号等の各種市販されている実用酵母あるいは実験室酵母等の酵母の遺伝子から切り出してもよいし、酵母ゲノムＤＮＡを鋳型にしてプライマーを用いてＰＣＲ法等によって合成してもよく、その入手に格別の困難性はない。
【００２８】
本発明に係るＰＴＲ２含有ベクターを作成するには、遺伝子導入の常法によればよく、プラスミドの制限酵素切断部位にＰＴＲ２を挿入すればよい。使用するプラスミドに格別の制限はなく、市販品等公知のものも適宜使用可能である。好適なプラスミドの１例としては、ｐＲＳ３１６が例示される。このプラスミドｐＲＳ３１６は、文献公知であるだけでなく、インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｓｅｑ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｖｅｃｔｏｒｄｂ／ｖｅｃｔｏｒ＿ｄｅｓｃｒｉｐ／ＣＯＭＰＬＥＴＥ／ＰＲＳ３１６．ＳＥＱ．ｈｔｍｌ）にて公開されており、入手に格別の困難性はない。プラスミドｐＲＳ３１６の塩基配列は配列番号２（図４〜６）に示される。
【００２９】
本発明は、上記のほかに、発現ベクターも提供するものである。発現ベクターを作成するには、遺伝子導入の常法によればよく、プラスミドの制限酵素切断部位にプロモーター遺伝子のＤＮＡを挿入すればよい。
【００３０】
発現ベクターのプロモーターとしては、配列番号１の塩基配列の内、塩基番号５１〜１４９９の領域（図中、下線を付し且つ太字にて示す領域）が使用される。この領域は、ＰＴＲ２のプロモーター領域に包含されるものであって、本発明に係る発現ベクターは、そのプロモーターとしてＰＴＲ２のプロモーターをそのままあるいはその一部をあるいはそのプロモーターを含む領域を利用することができ、きわめて特徴的である。
【００３１】
したがって、例えば、配列番号１の塩基配列の内、塩基番号１〜１４９９の領域（図中、下線を付した領域）もプロモーターとして使用することができ、また、ＰＴＲ２全体をベクターに導入してもよく、その場合はＰＴＲ２の構造遺伝子の作用も同時に利用できる。プロモーターは、ＰＴＲ２から切り出してもよいし、酵母のゲノムＤＮＡを鋳型にしてプライマーを用いてＰＣＲ法等によって合成してもよく、その入手に格別の困難性はない。
【００３２】
本発明に係る発現ベクターを作成するには、遺伝子導入の常法によればよく、プラスミドの制限酵素切断部位にプロモーター遺伝子のＤＮＡを挿入すればよい。使用するプラスミドに格別の制限はなく、市販品等も適宜使用可能である。好適なプラスミドとしては、ＹＥｐ型プラスミド、例えば、市販されているプラスミドＹＥｐＦＬＡＧ（シグマ社）を使用してもよい。
【００３３】
このようにして作成した発現ベクターは、そのプロモーターの下流に分泌させたいタンパク質をコードする遺伝子を挿入することにより、目的とするタンパク質発現ベクターとすることができる。目的とするタンパク質をコードする遺伝子としては、例えばキシラナーゼ遺伝子を挙げることができる。その１例としてＸｙｎＦ３遺伝子（その塩基配列を配列番号３（図７）に示す）が例示されるが、本遺伝子は公知であり、入手に困難性はない。
【００３４】
このようにして作成したベクター、発現ベクター、タンパク質発現ベクターは、それぞれ常法にしたがって酵母に形質転換し、形質転換体を作成し、それぞれの用途に使用する。
【００３５】
本発明の実施にあたり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）を含むベクターの宿主としては、先願の発明、特許第３３２１５９７号の多酸・低アミノ酸酒類製造用酵母の育種において利用したＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓに対して耐性となった酵母より、ペプチド輸送能を喪失していることを確認した株を宿主として利用できる。
【００３６】
また、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのペプチド輸送酵素遺伝子の上流域約１５００ｂｐをプロモーターとするプラスミドの宿主としては、当該プラスミドにウラシル要求性等のマーカーを入れた場合には、ウラシル要求性を示す酵母株を用いることは当然である。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのペプチド輸送酵素遺伝子の上流域約１５００ｂｐをプロモーターの利用としては、当該プロモーターの下流にマルチクローニング部位を導入することが一般的であるが、タンパク質分泌のためのシグナルペプチド領域のＤＮＡ配列を下流におき、更にその下流に酵母菌体外に分泌させたいタンパク質をコードする遺伝子を挿入するためのマルチクローニング部位を導入してもよい。
【００３７】
本発明に係る形質転換体の内、キシラナーゼ遺伝子を挿入したタンパク発現ベクターを導入してなる形質転換酵母は、これを清酒もろみ、麦汁、ブドウ果汁等に添加して培養することにより、キシラナーゼ遺伝子を発現し、キシラナーゼを効率的に産生するため、原料の細胞壁が効率的に破壊され、その結果、清酒、ビール、ブドウ酒その他醸造製品の原料利用率を高めることができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）
（ペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）を含むベクターの作成）
ｐＲＳ３１６（Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｈｏｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ ａｎｄ Ｐｈｉｌｉｐ Ｈｉｅｔｅｒ.Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１２２，１９−２７，（１９８９）：その塩基配列を配列番号２（図４〜６）に示す）の制限酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａｌ部位に、酵母Ｘ２１８０ＡのゲノムＤＮＡよりプライマーＡ（配列番号４（図８）：ＰＴＲ２の上流域１５００−１４７９に相当する配列を含む）とプライマーＢ（配列番号５（図９）：ＰＴＲ２の下流域３７７−３４６に相当する配列を含む）を用いたＰＣＲ反応により増幅したＰＴＲ２遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入し、プラスミドｐＲＳ３１６−Ｐｔｒ２（図１４）を作成した。
【００４０】
（実施例２）
（ｐＲＳ３１６−Ｐｔｒ２による酵母の形質転換）
Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓに対して耐性となった清酒酵母協会９号に、ｐＲＳ３１６−Ｐｔｒ２による形質転換を行った。形質転換処理した酵母はＹＮＢ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｌａｔｅ（０．７％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ，２％ ｇｌｕｃｏｓｅ，０．１％ ｐｈｅ−ａｌａ ｐｅｐｔｉｄｅ，２％ ａｇａｒ）に塗布し、３０℃でコロニーを生育させた。その結果、ｐＲＳ３１６−Ｐｔｒ２、１マイクログラム当たり２０コロニーの形質転換株が得られた。
【００４１】
ブラスチシジンＳ耐性協会９号清酒酵母は、次のようにして作成した。すなわち、協会９号清酒酵母を、ＹＰＤ培地（イーストエキス１％ ペプトン２％ グルコース２％）に接種し、増殖させた後、無菌的に集菌洗浄し、その０．１ｍｌをブラスチシジンＳ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を含むＹＰＤ寒天培地に塗布し、３０℃で培養し、生育したコロニーをブラスチシジンＳ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を含むＹＰＤ寒天培地に更に植え次いで、作成した。
【００４２】
（実施例３）
（ペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）のプロモーターを含むベクターの作成）
酵母Ｓ２８８ＣのゲノムＤＮＡよりプライマーＣ（配列番号６（図１０）：ＰＴＲ２の上流域１４４７−１４２８に相当する配列を含む）とプライマーＤ（配列番号７（図１１）：ＰＴＲ２の上流域３２−１に相当する配列を含む）を用いたＰＣＲ反応によりＰＴＲ２遺伝子のプロモーターＤＮＡ（配列番号１において、塩基番号５１−１４９９の領域：図中、下線を付し且つ太字で示した領域）を調製した。
【００４３】
麹菌アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ４０のｃＤＮＡよりプライマーＥ（配列番号８：図１２）とプライマーＦ（配列番号９：図１３）を用いたＰＣＲ反応により増幅したキシラナーゼ遺伝子（ＸｙｎＦ３遺伝子のＤＮＡ断片を調製した（配列番号３：図７）
【００４４】
市販のプラスミドＹＥｐＦＬＡＧ（シグマ社より販売）のＡＤＨ２のプロモーター領域を調製したＰＴＲ２遺伝子のプロモーターＤＮＡに置き換え、ＦＬＡＧ及びマルチクローニング領域を、調製したＸｙｎＦ３遺伝子のＤＮＡ断片をＸｙｎＦ３タンパク質が酵母の菌体外に分泌されるように置き換え、ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３（図１５）を作成した。
【００４５】
（実施例４）
（ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３形質転換酵母による培地中へのキシラナーゼ分泌）
ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３(本ベクター）を酵母ＢＪ３５０５株に形質転換し、形質転換株をＹＰＤ培地（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，２％ ｐｅｐｔｏｎｅ，２％ ｇｌｕｃｏｓｅ）に植菌し３０℃で培養し、菌体外のキシラナーゼ活性を測定した。なお、対照としてＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３のプロモーター領域をＡＤＨ１（アルコールデヒドロゲナーゼ１）若しくはＡＤＨ２（アルコールデヒドロゲナーゼ２）のプロモーターに置き換えたもの（各々ＹＥｐＡｄｈ１Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３（対照１）、ＹＥｐＡｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３（対照２））を作成し、同様の実験を行った。培養液中のキシラナーゼ活性（Ｕ）測定結果を表１に示す。
【００４６】
（表１）
――――――――――――――――――――――――――――――――
培養時間（時間） 本ベクター 対照１ 対照２
――――――――――――――――――――――――――――――――
１６ ８．７ ７．６ １．４８
２４ １０．５ ９．２ １．４８
――――――――――――――――――――――――――――――――
但し、活性の表示は、（Ｕ／ｍｉｎ／ｍｌ）
【００４７】
この結果から、Ｐｔｒ２のプロモーターは、高発現系によく用いられるＡＤＨ１やＡＤＨ２のプロモーターと遜色のないことが判明した。
【００４８】
（実施例５）
（ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３形質転換酵母による清酒もろみ中へのキシラナーゼ分泌）
ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ１の２μ領域を除いたベクターを清酒酵母協会７０１号のトリプトファン要求性株Ｔ１に形質転換した株（Ｔ１−Ｐｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３）を造成した。また、ＹＥｐＡｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３も同様に酵母Ｔ１株に形質転換し、株（Ｔ１−Ａｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３）を造成した。なお、宿主酵母Ｔ１株は、上記Ｋ７０１１号のトリプトファン、ウラシル要求性株ＵＴ１株のウラシル要求性を相補した株である。
【００４９】
当該形質転換株を用いて清酒の仕込試験を行った。その結果、清酒もろみ中に、Ｔ１−Ｐｔｒ２ＰｒｏＸｙｎＦ３株の場合は、１０日目以降にはキシラナーゼ活性が１０Ｕを越え、もろみ末期まで高いレベルを維持したが、Ｔ１−Ａｄｈ２ＰｒｏＸｙｎＦ３株は全期間を通して活性が認められなかった。
【００５０】
（実施例６）
（ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３形質転換酵母による麦汁中へのキシラナーゼ分泌）
ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ１を清酒酵母協会７０１号のトリプトファン要求性株Ｔ１に形質転換した株（Ｔ１−ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３）を造成した。また、ＹＥｐＡｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３も同様に酵母Ｔ１株に形質転換し、株（Ｔ１−ＹＥｐＡｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３）を造成した。
【００５１】
二条大麦麦芽を用いて、糖度１１の麦汁を調製し、当該形質転換株添加による仕込試験を行った。６日間１５℃で培養した結果、麦汁発酵液中に、Ｔ１−ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３株の場合は、キシラナーゼ活性が３．６Ｕ／ｍｌ認められたが、Ｔ１−ＹＥｐＡｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３株は活性が認められなかった。
【００５２】
（実施例７）
（ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３形質転換酵母によるブドウ果汁中へのキシラナーゼ分泌）
ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ１を清酒酵母協会７０１号のトリプトファン要求性株Ｔ１に形質転換した株（Ｔ１−ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３）を造成した。また、ＹＥｐＡｄｈＰｒｏ−ＸｙｎＦ３も同様に酵母Ｔ１株に形質転換し、株（Ｔ１−ＹＥｐＡｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３）を造成した。
【００５３】
甲州ブドウを用いて、糖度２１のブドウ果汁を調製し、当該形質転換株添加によるブドウ果汁発酵試験を行った。６日間１５℃で培養した結果、ブドウ果汁発酵液中に、Ｔ１−ＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３株の場合は、キシラナーゼ活性が５Ｕ／ｍｌ認められたが、Ｔ１−ＹＥｐＡｄｈ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３株は活性が認められなかった。
【００５４】
なお、実施例５、６及び７いずれの場合も、発酵終了時の酵母数、アルコール濃度に顕著な差は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】配列番号１で示されるペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）の塩基配列を示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】同上続きを示す。
【図４】配列番号２で示されるプラスミドｐＲＳ３１６の塩基配列を示す。
【図５】同上続きを示す。
【図６】同上続きを示す。
【図７】配列番号３で示されるキシラナーゼ遺伝子（ＸｙｎＦ３）の塩基配列を示す。
【図８】プライマーＡを示す。
【図９】プライマーＢを示す。
【図１０】プライマーＣを示す。
【図１１】プライマーＤを示す。
【図１２】プライマーＥを示す。
【図１３】プライマーＦを示す。
【図１４】ベクターｐＲＳ３１６−Ｐｔｒ２の構築図である。
【図１５】発現ベクターＹＥｐＰｔｒ２Ｐｒｏ−ＸｙｎＦ３の構築図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）を含むベクター。
【請求項２】
ペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）が配列番号１に示す塩基配列からなるものであること、を特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
プラスミドｐＲＳ３１６（その塩基配列を配列番号２に示す）にペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）のＤＮＡを導入してなること、を特徴とする請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）のプロモーターを含有してなる発現ベクター。
【請求項５】
プロモーターが、配列番号１において、塩基番号５１〜１４９９の領域からなるものであること、を特徴とする請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
ＹＥｐ型プラスミドにペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）のプロモーター領域を導入してなること、を特徴とする請求項４又は５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
更にタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡを導入してなること、を特徴とする請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
タンパク質をコードする遺伝子がキシラナーゼ遺伝子ＸｙｎＦ３（その塩基配列を配列番号３に示す）であること、を特徴とする請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか1項に記載のベクターを用いること、を特徴とするペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）による酵母の形質転換方法。
【請求項１０】
請求項４〜８のいずれか1項に記載の発現ベクターを用いること、を特徴とするペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）のプロモーター領域を利用するタンパク質の発現方法。
【請求項１】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）を含むベクター。
【請求項２】
ペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）が配列番号１に示す塩基配列からなるものであること、を特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
プラスミドｐＲＳ３１６（その塩基配列を配列番号２に示す）にペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）のＤＮＡを導入してなること、を特徴とする請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）のプロモーターを含有してなる発現ベクター。
【請求項５】
プロモーターが、配列番号１において、塩基番号５１〜１４９９の領域からなるものであること、を特徴とする請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
ＹＥｐ型プラスミドにペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）のプロモーター領域を導入してなること、を特徴とする請求項４又は５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
更にタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡを導入してなること、を特徴とする請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
タンパク質をコードする遺伝子がキシラナーゼ遺伝子ＸｙｎＦ３（その塩基配列を配列番号３に示す）であること、を特徴とする請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか1項に記載のベクターを用いること、を特徴とするペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）による酵母の形質転換方法。
【請求項１０】
請求項４〜８のいずれか1項に記載の発現ベクターを用いること、を特徴とするペプチド輸送酵素遺伝子（ＰＴＲ２）のプロモーター領域を利用するタンパク質の発現方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００６−２３８８５２（Ｐ２００６−２３８８５２Ａ）
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−６２９１９（Ｐ２００５−６２９１９）
【出願日】平成１７年３月７日（２００５．３．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年９月８日 日本醸造学会主催の「平成１６年度 日本醸造学会大会」において文書をもって発表
【出願人】（３０１０２５６３４）独立行政法人酒類総合研究所 (55)
【出願人】（５０５０８４２７３）アサヒビール株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月７日（２００５．３．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年９月８日 日本醸造学会主催の「平成１６年度 日本醸造学会大会」において文書をもって発表
【出願人】（３０１０２５６３４）独立行政法人酒類総合研究所 (55)
【出願人】（５０５０８４２７３）アサヒビール株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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