ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の凝集方法
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸粒子を凝集させ、その粒度を高める方法を提供する。本発明は、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸粒子を、親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁し、該懸濁液の沸点以下の温度で攪拌することからなる、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の凝集方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明はポリ−３−ヒドロキシアルカン酸粒子を凝集させる方法に関する。
【背景技術】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（以後ＰＨＡと称す）は多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在プラスチック廃棄物は、焼却、埋立などにより処理されているが、これらの処理方法には地球の温暖化や埋立地の地盤弛緩等の問題点がある。そのためプラスチックリサイクルへの社会意識の高まりとともに、リサイクルシステム化が進みつつある。しかし、リサイクル可能な用途には限りがあり、実際には、プラスチック廃棄処理方法としては、焼却、埋立、リサイクルだけでは対応しきれず、自然界に放置されたままになるものも多いのが現状である。そこで、廃棄後は自然界の物質循環に取り込まれ、分解生成物が有害とならないＰＨＡの様な生分解性プラスチックが注目されており、その実用化が切望されている。特に、微生物が菌体内で生成蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響がほとんどないと予想されている。また、医療分野においても、回収不要のインプラント材料や薬物担体としての利用が可能と考えられる。
微生物が生成するＰＨＡは、通常直径１μｍ以下の顆粒体で菌体内に蓄積されるため、このＰＨＡをプラスチックとして利用するためには、菌体内からＰＨＡを分離して取り出すという工程が必要である。ＰＨＡを微生物菌体から分離精製する既知の方法として、大別すると、ＰＨＡが可溶である有機溶媒を用いて菌体からＰＨＡを抽出する方法と、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を破砕もしくは可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法に分けられる。
有機溶媒による抽出を利用したＰＨＡの分離精製方法では、ＰＨＡが可溶である溶媒として、例えば１，２−ジクロロエタンやクロロホルムといったハロゲン化炭化水素を用いて抽出する方法（特開昭５５−１１８３９４号公報、特開昭５７−６５１９３号公報参照）、ジオキサン（特開昭６３−１９８９９１号公報参照）またはプロパンジオール（特開平０２−６９１８７号公報参照）またはテトラヒドロフラン（特開平０７−７９７８８号公報参照）のような親水性溶媒を用いた抽出方法も提案されている。しかしこれらの方法でＰＨＡを抽出した溶媒層は極めて粘稠性が高く、溶解しなかった菌体残渣とＰＨＡを含む溶媒層との分離が非常に困難である。また溶媒の使用量が膨大なため、コストがかさむといった欠点がある。
一方ＰＨＡ以外の菌体構成成分を、機械的処理、化学的処理、酵素的処理で可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法として、例えばＪ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９５８年，第１９巻，ｐ．１９８−２０９には、菌体懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムで処理してＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化しＰＨＡを得る方法が記載されている。
特公平０４−６１６３８号公報には、ＰＨＡを含有する微生物菌体懸濁液を１００℃以上で熱処理することで菌体構造を破壊し、次いでタンパク質分解酵素処理と、リン脂質分解酵素処理あるいは過酸化水素処理とを組み合わせてＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化してＰＨＡを得る方法が記載されている。
ＰＨＡ含有菌体を界面活性化剤で処理した後に、菌体から放出された核酸を過酸化水素で処理して分解し、ＰＨＡを分離する方法も提案されている（特表平０８−５０２４１５号公報参照）。
物理的処理方法としてＰＨＡ含有微生物菌体を高圧ホモジナイザーで破砕してＰＨＡを分離する方法が提案されている（特開平０７−１７７８９４号公報、特開平０７−３１４８８号公報参照）。
また、ＰＨＡ含有微生物懸濁液にアルカリを添加して加熱し、細胞を破砕してＰＨＡを分離する方法も提案されている（特開平０７−３１４８７号公報参照）。さらにアルカリ添加後に物理的破砕を行う方法がいくつか提案されている（Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，１９９１年，第２巻，ｐ．９５−１０５、特開平０７−３１４８９号公報参照）。
またＰＨＡ含有微生物懸濁液をｐＨ２未満の酸性に調整し、５０℃以上でＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化してＰＨＡを得る方法も提案されている（特開平１１−２６６８９１号公報参照）。
このようにして製造されるＰＨＡは、微生物菌体内で作られた直径１μｍ以下の微細な粒子そのままの形で得られる。これらのような微細な粒子を液体媒質から分離することは、より粒子が大きい場合に比べてしばしば困難である。
さらに、微粒子は爆発に必要なエネルギーが低いために粉塵爆発を起こす危険性、吸引した場合の肺での蓄積などが考えられ、取扱に注意が必要である。
このためＰＨＡを凝集させる技術が検討されており、加熱、アルカリ金属塩による凝集、浮上・凝集させる方法などが開発されている。
加熱させて凝集させる方法としては、ポリ−３−ヒドロキシブチレート（以下ＰＨＢ）含有懸濁液をＰＨＢの融点付近まで加熱して凝集させる方法がある（Ｂａｉｌｅｙ，Ｎｅｉｌ Ａ．；Ｇｅｏｒｇｅ，Ｎｅｉｌ；Ｎｉｒａｎｊａｎ，Ｋ．；Ｖａｒｌｅｙ，Ｊｕｌｉｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅａｄｉｎｇ，「ＩＣｈｅｍＥ Ｒｅｓ．Ｅｖｅｎｔ，Ｅｕｒ．Ｃｏｎｆ．Ｙｏｕｎｇ Ｒｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．」，（英国），第２版，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，１９９６年，第１巻，ｐ．１９６−１９８参照）。また、特表平０７−５０９１３１号公報では、水に懸濁したＰＨＢとＤ−３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）の共重合体（以下ＰＨＢＶ）に、適切な温度と圧力の蒸気を直接注入し、１２０〜１６０℃で加熱攪拌することによりＰＨＢＶの粒度を高める方法を提案している。これらの方法は加熱・加圧された蒸気を注入して、非常に高い温度まで加熱する必要がある。このため、高温の加熱・保温が可能であり、さらに耐圧性を持った特別な装置を設置する必要がある。またかなりの高温で処理するために、分子量の低下が起こる可能性がある。
また特開平０４−２６４１２５号公報では、ＰＨＢ含有菌体からＰＨＢを塩化メチレンやクロロホルム、トリクロロエチレンのように水と混和しないかつ沸点が１００℃未満であるような有機溶媒で、含水下、加熱攪拌を行いながら抽出し、抽出されたＰＨＢを含む該有機相を熱水中に注入することで、ＰＨＢをフロック状態で析出させて回収する方法が提案されている。この方法はＰＨＢの晶析方法の一つであって、実質的にはＰＨＢを凝集させているわけではない。また、この方法は操作が非常に複雑であり、工業化は困難である。さらには乾燥菌体重量当たり、１０〜３０倍の有機溶剤が必要であり、加えて近年、環境保護の観点から有機ハロゲン化合物の使用は制限される方向にあるので、これらの使用は望ましくない。
アルカリ金属塩を添加してＰＨＡを凝集させる方法として、２価の陽イオンで凝集させる方法（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９８年，第６５（２，３）巻，ｐ．１７３−１８２）が知られており、特に塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムをＰＨＢ懸濁液に添加して凝集させ、ＰＨＢを分離する方法が報告されている（特表平０５−５０７４１０号公報）。しかし、この方法ではポリマーに金属塩が混入することになり、製品によっては望ましくない。
発明の要約
本発明の目的は、従来技術における上記の課題を解決し、ＰＨＡの分子量低下を抑制しながら、純度が高く、取扱が容易なＰＨＡ凝集体を得る方法を提供することにある。
本発明者らは、ＰＨＡ凝集体を工業的に有利に得る方法を鋭意検討した。その結果、微細なＰＨＡ粒子を、親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁させ、該懸濁液の沸点以下の温度で攪拌することでＰＨＡ粒子が凝集し、純度が高く、濾過性、取扱に優れたＰＨＡ凝集体が得られることを見いだし、本発明に達した。
本発明は、ＰＨＡ粒子を、親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁させ、攪拌することによって凝集させることからなる。親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁させたＰＨＡを凝集させる温度は該懸濁液の沸点以下であるが、より効率的に、十分に凝集したＰＨＡを得るために、好ましくは該懸濁液の沸点で保温、攪拌する。本発明の凝集方法によると、ＰＨＡに含まれる不純物（脂質など）を溶解させて除去することができるので、ＰＨＡの純度を高めることが可能となる。さらに本発明の方法では、実施するのに特別な装置が必要となる高温や高圧の条件はかならずしも必要ではない。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＰＨＢＨ凝集体の走査型電子顕微鏡写真（倍率２，０００倍）を示す。
図２は、１個のＰＨＢＨ凝集体の走査型電子顕微鏡写真（倍率５，０００倍）を示す。
図３は、ＰＨＢＨ凝集体の走査型電子顕微鏡写真（倍率５０，０００倍）を示す。
発明の詳細な開示
本発明におけるＰＨＡとは、ヒドロキシアルカン酸の重合体の総称である。ヒドロキシアルカン酸成分としては特に限定されないが、具体的には、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート（以下３ＨＢ）のホモポリマーや、３ＨＢと他の３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体、またはＤ−３−ヒドロキシヘキサノエート（以下３ＨＨ）と他のＤ−３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体などが挙げられる。さらに、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエートおよび３−ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される少なくとも２種のモノマーから構成される共重合体なども挙げられる。なかでもモノマー成分として３ＨＨを含む重合体、例えば、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体（ＰＨＢＨ）（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２８，４８２２−４８２８（１９９５））または、３ＨＢとＤ−３−ヒドロキシバレレート（以下３ＨＶ）と３ＨＨとの３成分共重合体（ＰＨＢＶＨ）（特許第２７７７５７号，特開平０８−２８９７９７号）が、得られるポリエステルの物性の面からより好ましい。ここで３ＨＢと３ＨＨの２成分共重合体ＰＨＢＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、３ＨＨユニットを１〜９９モル％といった組成比のものが好適である。また、３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨとの３成分共重合体ＰＨＢＶＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、例えば、３ＨＢユニットの含量は１〜９５モル％、３ＨＶユニットの含量は１〜９６モル％、３ＨＨユニットの含量は１〜３０モル％といった範囲のものが好適である。
本発明で使用する親水性溶媒としては特に限定されるものではないが、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノールなどのアルコール類、アセトンやメチルエチルケトンなどのケトン類、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類、アセトニトリルやプロピオニトリルなどのニトリル類、ジメチルホルムアミドやアセトアミドなどのアミド類、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ピペリジンなどが挙げられる。好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、プロピオニトリルなどが除去性の面などから好適である。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ブタノール、アセトンなどが入手が容易であることから好ましい。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、アセトンである。
懸濁液中のＰＨＡの濃度としては特に限定されないが、好ましくは１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは３０ｇ／Ｌ以上である。また、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、より好ましくは３００ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは２００ｇ／Ｌ以下である。ＰＨＡ濃度が極端に高い場合、懸濁液の粘度が増し、実質的に非流動性となる傾向がある。
懸濁液は、その媒質として、親水性溶媒のみからなるものであってもよいし、水と親水性溶媒との混合液体からなるものであってもよい。混合液体中の親水性溶媒の濃度としては、使用する親水性溶媒の水への溶解度以下であれば特に限定されないが、より十分な凝集効果を得るために、好ましくは１０％ｖ／ｖ以上、より好ましくは２０％ｖ／ｖ以上である。
本発明の凝集方法においては、ＰＨＡ粒子を、親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁させてなる懸濁液を、該懸濁液の沸点以下の温度で攪拌することによって、ＰＨＡ粒子を凝集させる。攪拌する手段としては、攪拌槽など、乱流を生じさせるものが挙げられるが、特に限定されるものではない。
攪拌時の温度は、室温以上が好ましく、４０℃以上がより好ましく、更には６０℃以上が好ましいが、凝集の効率性の観点から、懸濁液の沸点に近い温度ほど好ましく、懸濁液の沸点が最も好ましい。本願明細書において、懸濁液の沸点とは、懸濁液が沸騰を開始する温度のことをいう。本発明の方法では、一般的に１００℃以下でＰＨＡ粒子を凝集させることができる。さらに本発明の凝集方法は、加圧下で行ってもよいが、加圧する必要はなく、常圧下で行うことができる。
凝集に要する時間は温度や濃度などの条件によって異なるが、一般に数分〜数時間程度で十分に凝集を起こさせることができる。
本発明の凝集方法によって、ＰＨＡ凝集体の粒径を高めることが可能となる。例えば、体積平均直径が２０μｍ以上、好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは１００μｍ以上の凝集体を得ることができる。上限は特に限定されないが、体積平均直径が１０００μｍ以下、好ましくは５００μｍ以下の凝集体を得ることができる。粒径の増大に伴い濾過による回収が容易になり、工業生産において設備費が軽減できることになる。
本発明の凝集方法は、微生物によって産生されたＰＨＡを当該微生物菌体から分離精製してなるＰＨＡに対して、好適に適用することができる。この場合、少なくともＰＨＡ粒子がお互いに懸濁液中で接触しうるのに十分な程度に、粒子を取り巻く菌体構成物質が分解されている必要がある。
最初に回収されたＰＨＡ粒子が可溶性の菌体構成物質及び分解生成物その他ＰＨＡ以外の物質で汚染されている場合は、特にそれらを第２液体媒質に再懸濁させ、攪拌による洗浄、化学処理などの後続加工（たとえば漂白剤、たとえば過酸化水素、あるいは次亜塩素酸ソーダによる処理）を行い、粒子をこの新たな液体媒質から回収することも可能である。本発明の凝集方法は、このプロセスのいかなる時点で行うこともできる。
上記微生物は、細胞内にＰＨＡを蓄積している微生物であれば特に限定されない。例えばアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）の菌が挙げられる。特に、アルカリゲネス・リポリティカ（Ａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アルカリゲネス・ラトゥス（Ａ．ｌａｔｕｓ）、アエロモナス・キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）等の菌株、更には、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素群の遺伝子を導入したラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）（旧名Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ＡＣ３２）（ブダペスト条約に基づく国際寄託、国際寄託当局：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６）、寄託日１９９７年８月７日、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３８、原寄託ＦＥＲＭ Ｐ−１５７８６より移管）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４８２１−４８３０頁（１９９７））等がより好ましい。これら微生物を適切な条件で培養して菌体内にＰＨＡを蓄積させた微生物菌体が用いられる。その培養方法については特に限定されないが、例えば特開平０５−９３０４９号等に挙げられる方法が用いられる。
本発明の凝集方法において用いられるＰＨＡ粒子は、従来の技術の項で記載したような公知の方法によってＰＨＡ含有菌体から得られる任意のＰＨＡ粒子を用いることができる。また、ＰＨＡ含有菌体からＰＨＡ粒子を分離する好ましい方法として、ＰＨＡ含有菌体の懸濁液を攪拌しつつ、物理的破砕と同時にアルカリを添加することによりＰＨＡ以外の菌体構成物質を可溶化してＰＨＡを分離する方法が挙げられる。これによって、ＰＨＡ含有菌体からＰＨＡ粒子の凝集体を、非常に簡便な方法で、かつ効率よく得ることが可能となる。
菌体の懸濁液とは、培養終了後の培養懸濁液そのまま、又は、培養液から遠心分離等で分離した菌体を水に懸濁させた水性の懸濁液である。ここでの菌体の懸濁濃度は、乾燥菌体換算で５００ｇ／Ｌ以下が好ましく、より好ましくは３００ｇ／Ｌ以下である。
物理破砕処理としては、アルカリ処理により菌体内より溶出し、主に粘度の上昇の原因となる核酸を効率よく破砕し、かつ、菌体細胞壁や細胞膜や不溶性蛋白質などのポリマー以外の不溶性物質を十分に分散できるものであればこれらに限定されるものではない。具体的には、超音波による破砕、乳化分散機、高圧ホモジナイザーやミル等による破砕が挙げられる。
アルカリとしては特に限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウムなどのアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属の炭酸塩；酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなどの有機酸のアルカリ金属塩；ほう砂等のアルカリ金属のホウ酸塩；リン酸３ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸３カリウム、リン酸水素２カリウムなどのアルカリ金属のリン酸塩；あるいはアンモニア水などが挙げられる。この中でも、工業生産に適し、また価格の点で、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウムなどが好ましい。
アルカリを添加する際には、当該アルカリの添加によって懸濁液のｐＨをコントロールすることが好ましい。特に、ｐＨ８〜１３．５、更にはｐＨ１０〜１３、より好ましくはｐＨ１１〜１３の範囲でコントロールするのが好ましい。ｐＨをコントロールするために、アルカリは、懸濁液のｐＨを測定しつつ、連続的又は断続的に添加するのが好ましい。
物理的破砕とアルカリ処理を行う際の温度としては特に限定されないが、室温から５０℃の範囲が好ましく、３０℃から４０℃の範囲がより好ましい。
図１は本発明の一実施態様にかかるＰＨＡの凝集体の様子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮影したものである。当該凝集体は、１個の粒径が約０．１μｍから約１．５μｍのＰＨＢＨ微粒子が多数接着することにより１個の凝集体を形作っていることがわかる。ここで微粒子径の求め方は走査型電子顕微鏡写真を用いる当業者に周知の方法で行った。すなわち、微粒子径はＰＨＡ凝集塊の表面写真を５０００倍の解像度で撮影し、得られた写真から直接個々の微粒子の直径を読み取ることにより得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
本実施例ではＰＨＡとしてＰＨＢＨを用いた。本発明での実施はＰＨＢＨになんら限られるものではない。
ＰＨＢＨの懸濁液は、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素群遺伝子を導入したＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ（上述の寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３８）をＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４８２１−４８３０頁（１９９７）に記載の方法で培養し、ＰＨＢＨを約６７ｗｔ％含有した菌体を得た。遠心（５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）により培養液から分離したペースト状の菌体に水を加えて７５ｇ乾燥菌体／Ｌの水性懸濁液とし、アルカリとして水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ１１．７に保ちながら攪拌と物理的破砕とを行うことでＰＨＢＨ以外の菌体構成物質を可溶化し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行って沈殿物を得た。沈殿物はさらに水洗を行い、平均分子量約１４０万、３ＨＨモル分率７％、純度９７％のＰＨＢＨを分離した。得られたＰＨＢＨを２０％ｗ／ｖの水性懸濁液とし、以後の実験に使用した。
各実施例で使用したＰＨＢＨの純度は以下のようにして決定した（但し、実施例３と実施例４は後述するＨＰＬＣ法で純度を決定した）。ＰＨＢＨの粉体１０ｍｇを、クロロホルム１ｍｌに溶解したのち、メタノール０．８５ｍｌと濃硫酸０．１５ｍｌを加えて１００℃で１４０分間処理した。これを冷却後、硫酸アンモニア飽和水溶液０．５ｍｌを加えて激しく攪拌した後静置した。下層部をキャピラリーガスクロマトグラフィーにて分析して、分離物中のＰＨＢＨの純度およびＰＨＢＨ中の３ＨＢ、３ＨＨのモル分率を求めた。
菌体から分離して得られたＰＨＢＨの分子量は、菌体より分離して得られた沈殿物１０ｍｇを、クロロホルム１ｍｌに溶解したのち、不溶物を濾過により除いた。この溶液をＳｈｏｄｅｘ Ｋ８０５Ｌ（３００×８ｍｍ、２本連結）を装着したＳＨＩＭＡＤＺＵ社製ＧＰＣシステムを用いクロロホルムを移動相として分析した。
ＰＨＡ粒子の粒径は日機装社製マイクロトラック粒度計を用いて測定を行った。該装置によって測定した粒径値は体積平均粒径として得られる。体積平均粒径は、一般的に粒径を表すときに用いられ、粒子の体積によって重み付けられた平均粒径を意味している。
【実施例１】
ＰＨＢＨの２０％ｗ／ｖ水性懸濁液４０ｍｌとエタノール１６０ｍｌを混合し、バス温９０℃の攪拌槽内で、１０分間、加熱・攪拌した。その後、これを攪拌しながら室温まで冷却した。ポリマーを遠心分離（２４００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）にて回収し、水洗後粒径を測定した結果を表１に示す。
この結果から、水と親水性溶媒の混合液体からなる懸濁液を加熱・攪拌すると、ＰＨＡの分子量は大きく低下することなく、ＰＨＡ粒子が凝集し、粒径が増大することが分かった。
【実施例２】
実施例１で用いたものと同じＰＨＢＨ懸濁液２５ｍｌに各種親水性溶媒を加えてバス温８０℃で１５分間加熱攪拌を行った。そののち、攪拌しながら室温まで冷却し、遠心分離（２４００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）によりＰＨＡを回収した。これを水で洗浄後、水に再懸濁し粒径を測定した。
この結果から、水と親水性溶媒の混合液体からなる懸濁液を加熱・攪拌すると、ＰＨＡの分子量は大きく低下することなく、ＰＨＡ粒子が凝集し、粒径が増大することが分かった。特に、アセトニトリルやテトラヒドロフランなどＰＨＡ溶解能の高い溶媒を用いると、粒径はより大きくなることが判明した。
【実施例３】
実施例１で用いたＰＨＢＨスラリーを、ＰＨＢＨ１０ｇを含む懸濁液１００ｍＬ中のエタノール量がそれぞれ８０ｍＬ、７０ｍＬとなるようにＰＨＢＨ水性懸濁液を調整し（それぞれの懸濁液のｐＨは、７．６２と７．３６）、バス温９０℃の攪拌槽内で、加熱攪拌を行った。懸濁液から適時サンプルを採取し、これを攪拌しながら室温まで冷却した。これを遠心分離（２４００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）にて回収し、再度水に懸濁させて粒径を測定した結果を表３に示す。
この結果から、水と親水性溶媒の混合液体からなる懸濁液を加熱・攪拌すると、ＰＨＡの分子量は大きく低下することなく、ＰＨＡ粒子が凝集し、粒径が増大することが分かった。またＰＨＡの純度が向上することも分かった。
【実施例４】
実施例１と同様な方法で菌体から分離されたＰＨＢＨ（分子量１５６万、純度９９％）を加熱・減圧乾燥した。得られた乾燥ＰＨＢＨ８ｇをエタノールに十分に懸濁させ、８０ｍＬのＰＨＢＨエタノール懸濁液（ｐＨ７．０５）を得た。これを実施例１と同様な方法で加熱・攪拌し、冷却後、水に懸濁させて粒径を測定した結果を表４に示す。
この結果から、親水性溶媒からなる懸濁液を加熱・攪拌すると、ＰＨＡの分子量は低下することなく、ＰＨＡ粒子が凝集し、粒径が増大することが分かった。またＰＨＡの純度が向上することも分かった。
なお実施例３及び実施例４において、処理後のＰＨＢＨの純度は以下のようにして測定した。
処理後のＰＨＢＨ懸濁液を遠心分離して上清を除去し、回収したＰＨＢＨに対し、上記ＰＨＢＨ懸濁液と同容量に達するまでエタノールを加えることで２回洗浄した。洗浄後、加熱（５０℃）減圧乾燥して得られたＰＨＢＨの純度を、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。
高速液体クロマトグラフィーの条件：
カラム：資生堂 カプセルパックＵＧ８０ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
移動相：２０ｍｍｏｌリン酸バッファー（ｐＨ３．０）：メタノール＝８０：２０（リン酸１カリウム＋リン酸で調整）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
なお、ポリマー約２５ｍｇ、メタノール４ｍＬ、メタンスルホン酸３００μＬを混合し１００℃で３時間加熱した後、室温まで冷却し、１０ｍＬにメタノールでメスアップしたもの１０μＬを、高速液体クロマトグラフィーに注入した。
【実施例５】
実施例２のメタノール凝集で得られた凝集体の走査型電子顕微鏡写真を撮影した（図１〜３）。凝集体を分散法によりサンプリングし、表面を日立Ｓ−４０００走査型電子顕微鏡にて加速電圧３ｋＶで観察した結果、凝集体はサブミクロンオーダーの丸みを帯びたＰＨＢＨ粒子が凝集し、不定形の２次凝集体を形成していることが判明した（図１、２）。さらに日立Ｓ−５０００走査型電子顕微鏡にて加速電圧１ｋＶで高倍率観察した結果、粒子と粒子が接合している部分が存在することが明らかとなった（図３）。
【産業上の利用の可能性】
本発明によるＰＨＡの凝集方法は、極めて簡便な方法によって、ＰＨＡの分子量低下を抑制しながら、純度の高いＰＨＡの凝集体を得ることが可能である。この方法によりＰＨＡは、濾過性や取扱に優れた粒径の粒子となる。
【図１】
【図２】
【図３】
【技術分野】
本発明はポリ−３−ヒドロキシアルカン酸粒子を凝集させる方法に関する。
【背景技術】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（以後ＰＨＡと称す）は多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在プラスチック廃棄物は、焼却、埋立などにより処理されているが、これらの処理方法には地球の温暖化や埋立地の地盤弛緩等の問題点がある。そのためプラスチックリサイクルへの社会意識の高まりとともに、リサイクルシステム化が進みつつある。しかし、リサイクル可能な用途には限りがあり、実際には、プラスチック廃棄処理方法としては、焼却、埋立、リサイクルだけでは対応しきれず、自然界に放置されたままになるものも多いのが現状である。そこで、廃棄後は自然界の物質循環に取り込まれ、分解生成物が有害とならないＰＨＡの様な生分解性プラスチックが注目されており、その実用化が切望されている。特に、微生物が菌体内で生成蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響がほとんどないと予想されている。また、医療分野においても、回収不要のインプラント材料や薬物担体としての利用が可能と考えられる。
微生物が生成するＰＨＡは、通常直径１μｍ以下の顆粒体で菌体内に蓄積されるため、このＰＨＡをプラスチックとして利用するためには、菌体内からＰＨＡを分離して取り出すという工程が必要である。ＰＨＡを微生物菌体から分離精製する既知の方法として、大別すると、ＰＨＡが可溶である有機溶媒を用いて菌体からＰＨＡを抽出する方法と、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を破砕もしくは可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法に分けられる。
有機溶媒による抽出を利用したＰＨＡの分離精製方法では、ＰＨＡが可溶である溶媒として、例えば１，２−ジクロロエタンやクロロホルムといったハロゲン化炭化水素を用いて抽出する方法（特開昭５５−１１８３９４号公報、特開昭５７−６５１９３号公報参照）、ジオキサン（特開昭６３−１９８９９１号公報参照）またはプロパンジオール（特開平０２−６９１８７号公報参照）またはテトラヒドロフラン（特開平０７−７９７８８号公報参照）のような親水性溶媒を用いた抽出方法も提案されている。しかしこれらの方法でＰＨＡを抽出した溶媒層は極めて粘稠性が高く、溶解しなかった菌体残渣とＰＨＡを含む溶媒層との分離が非常に困難である。また溶媒の使用量が膨大なため、コストがかさむといった欠点がある。
一方ＰＨＡ以外の菌体構成成分を、機械的処理、化学的処理、酵素的処理で可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法として、例えばＪ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９５８年，第１９巻，ｐ．１９８−２０９には、菌体懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムで処理してＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化しＰＨＡを得る方法が記載されている。
特公平０４−６１６３８号公報には、ＰＨＡを含有する微生物菌体懸濁液を１００℃以上で熱処理することで菌体構造を破壊し、次いでタンパク質分解酵素処理と、リン脂質分解酵素処理あるいは過酸化水素処理とを組み合わせてＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化してＰＨＡを得る方法が記載されている。
ＰＨＡ含有菌体を界面活性化剤で処理した後に、菌体から放出された核酸を過酸化水素で処理して分解し、ＰＨＡを分離する方法も提案されている（特表平０８−５０２４１５号公報参照）。
物理的処理方法としてＰＨＡ含有微生物菌体を高圧ホモジナイザーで破砕してＰＨＡを分離する方法が提案されている（特開平０７−１７７８９４号公報、特開平０７−３１４８８号公報参照）。
また、ＰＨＡ含有微生物懸濁液にアルカリを添加して加熱し、細胞を破砕してＰＨＡを分離する方法も提案されている（特開平０７−３１４８７号公報参照）。さらにアルカリ添加後に物理的破砕を行う方法がいくつか提案されている（Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，１９９１年，第２巻，ｐ．９５−１０５、特開平０７−３１４８９号公報参照）。
またＰＨＡ含有微生物懸濁液をｐＨ２未満の酸性に調整し、５０℃以上でＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化してＰＨＡを得る方法も提案されている（特開平１１−２６６８９１号公報参照）。
このようにして製造されるＰＨＡは、微生物菌体内で作られた直径１μｍ以下の微細な粒子そのままの形で得られる。これらのような微細な粒子を液体媒質から分離することは、より粒子が大きい場合に比べてしばしば困難である。
さらに、微粒子は爆発に必要なエネルギーが低いために粉塵爆発を起こす危険性、吸引した場合の肺での蓄積などが考えられ、取扱に注意が必要である。
このためＰＨＡを凝集させる技術が検討されており、加熱、アルカリ金属塩による凝集、浮上・凝集させる方法などが開発されている。
加熱させて凝集させる方法としては、ポリ−３−ヒドロキシブチレート（以下ＰＨＢ）含有懸濁液をＰＨＢの融点付近まで加熱して凝集させる方法がある（Ｂａｉｌｅｙ，Ｎｅｉｌ Ａ．；Ｇｅｏｒｇｅ，Ｎｅｉｌ；Ｎｉｒａｎｊａｎ，Ｋ．；Ｖａｒｌｅｙ，Ｊｕｌｉｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅａｄｉｎｇ，「ＩＣｈｅｍＥ Ｒｅｓ．Ｅｖｅｎｔ，Ｅｕｒ．Ｃｏｎｆ．Ｙｏｕｎｇ Ｒｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．」，（英国），第２版，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，１９９６年，第１巻，ｐ．１９６−１９８参照）。また、特表平０７−５０９１３１号公報では、水に懸濁したＰＨＢとＤ−３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）の共重合体（以下ＰＨＢＶ）に、適切な温度と圧力の蒸気を直接注入し、１２０〜１６０℃で加熱攪拌することによりＰＨＢＶの粒度を高める方法を提案している。これらの方法は加熱・加圧された蒸気を注入して、非常に高い温度まで加熱する必要がある。このため、高温の加熱・保温が可能であり、さらに耐圧性を持った特別な装置を設置する必要がある。またかなりの高温で処理するために、分子量の低下が起こる可能性がある。
また特開平０４−２６４１２５号公報では、ＰＨＢ含有菌体からＰＨＢを塩化メチレンやクロロホルム、トリクロロエチレンのように水と混和しないかつ沸点が１００℃未満であるような有機溶媒で、含水下、加熱攪拌を行いながら抽出し、抽出されたＰＨＢを含む該有機相を熱水中に注入することで、ＰＨＢをフロック状態で析出させて回収する方法が提案されている。この方法はＰＨＢの晶析方法の一つであって、実質的にはＰＨＢを凝集させているわけではない。また、この方法は操作が非常に複雑であり、工業化は困難である。さらには乾燥菌体重量当たり、１０〜３０倍の有機溶剤が必要であり、加えて近年、環境保護の観点から有機ハロゲン化合物の使用は制限される方向にあるので、これらの使用は望ましくない。
アルカリ金属塩を添加してＰＨＡを凝集させる方法として、２価の陽イオンで凝集させる方法（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９８年，第６５（２，３）巻，ｐ．１７３−１８２）が知られており、特に塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムをＰＨＢ懸濁液に添加して凝集させ、ＰＨＢを分離する方法が報告されている（特表平０５−５０７４１０号公報）。しかし、この方法ではポリマーに金属塩が混入することになり、製品によっては望ましくない。
発明の要約
本発明の目的は、従来技術における上記の課題を解決し、ＰＨＡの分子量低下を抑制しながら、純度が高く、取扱が容易なＰＨＡ凝集体を得る方法を提供することにある。
本発明者らは、ＰＨＡ凝集体を工業的に有利に得る方法を鋭意検討した。その結果、微細なＰＨＡ粒子を、親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁させ、該懸濁液の沸点以下の温度で攪拌することでＰＨＡ粒子が凝集し、純度が高く、濾過性、取扱に優れたＰＨＡ凝集体が得られることを見いだし、本発明に達した。
本発明は、ＰＨＡ粒子を、親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁させ、攪拌することによって凝集させることからなる。親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁させたＰＨＡを凝集させる温度は該懸濁液の沸点以下であるが、より効率的に、十分に凝集したＰＨＡを得るために、好ましくは該懸濁液の沸点で保温、攪拌する。本発明の凝集方法によると、ＰＨＡに含まれる不純物（脂質など）を溶解させて除去することができるので、ＰＨＡの純度を高めることが可能となる。さらに本発明の方法では、実施するのに特別な装置が必要となる高温や高圧の条件はかならずしも必要ではない。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＰＨＢＨ凝集体の走査型電子顕微鏡写真（倍率２，０００倍）を示す。
図２は、１個のＰＨＢＨ凝集体の走査型電子顕微鏡写真（倍率５，０００倍）を示す。
図３は、ＰＨＢＨ凝集体の走査型電子顕微鏡写真（倍率５０，０００倍）を示す。
発明の詳細な開示
本発明におけるＰＨＡとは、ヒドロキシアルカン酸の重合体の総称である。ヒドロキシアルカン酸成分としては特に限定されないが、具体的には、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート（以下３ＨＢ）のホモポリマーや、３ＨＢと他の３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体、またはＤ−３−ヒドロキシヘキサノエート（以下３ＨＨ）と他のＤ−３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体などが挙げられる。さらに、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエートおよび３−ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される少なくとも２種のモノマーから構成される共重合体なども挙げられる。なかでもモノマー成分として３ＨＨを含む重合体、例えば、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体（ＰＨＢＨ）（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２８，４８２２−４８２８（１９９５））または、３ＨＢとＤ−３−ヒドロキシバレレート（以下３ＨＶ）と３ＨＨとの３成分共重合体（ＰＨＢＶＨ）（特許第２７７７５７号，特開平０８−２８９７９７号）が、得られるポリエステルの物性の面からより好ましい。ここで３ＨＢと３ＨＨの２成分共重合体ＰＨＢＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、３ＨＨユニットを１〜９９モル％といった組成比のものが好適である。また、３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨとの３成分共重合体ＰＨＢＶＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、例えば、３ＨＢユニットの含量は１〜９５モル％、３ＨＶユニットの含量は１〜９６モル％、３ＨＨユニットの含量は１〜３０モル％といった範囲のものが好適である。
本発明で使用する親水性溶媒としては特に限定されるものではないが、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノールなどのアルコール類、アセトンやメチルエチルケトンなどのケトン類、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類、アセトニトリルやプロピオニトリルなどのニトリル類、ジメチルホルムアミドやアセトアミドなどのアミド類、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ピペリジンなどが挙げられる。好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、プロピオニトリルなどが除去性の面などから好適である。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ブタノール、アセトンなどが入手が容易であることから好ましい。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、アセトンである。
懸濁液中のＰＨＡの濃度としては特に限定されないが、好ましくは１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは３０ｇ／Ｌ以上である。また、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、より好ましくは３００ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは２００ｇ／Ｌ以下である。ＰＨＡ濃度が極端に高い場合、懸濁液の粘度が増し、実質的に非流動性となる傾向がある。
懸濁液は、その媒質として、親水性溶媒のみからなるものであってもよいし、水と親水性溶媒との混合液体からなるものであってもよい。混合液体中の親水性溶媒の濃度としては、使用する親水性溶媒の水への溶解度以下であれば特に限定されないが、より十分な凝集効果を得るために、好ましくは１０％ｖ／ｖ以上、より好ましくは２０％ｖ／ｖ以上である。
本発明の凝集方法においては、ＰＨＡ粒子を、親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁させてなる懸濁液を、該懸濁液の沸点以下の温度で攪拌することによって、ＰＨＡ粒子を凝集させる。攪拌する手段としては、攪拌槽など、乱流を生じさせるものが挙げられるが、特に限定されるものではない。
攪拌時の温度は、室温以上が好ましく、４０℃以上がより好ましく、更には６０℃以上が好ましいが、凝集の効率性の観点から、懸濁液の沸点に近い温度ほど好ましく、懸濁液の沸点が最も好ましい。本願明細書において、懸濁液の沸点とは、懸濁液が沸騰を開始する温度のことをいう。本発明の方法では、一般的に１００℃以下でＰＨＡ粒子を凝集させることができる。さらに本発明の凝集方法は、加圧下で行ってもよいが、加圧する必要はなく、常圧下で行うことができる。
凝集に要する時間は温度や濃度などの条件によって異なるが、一般に数分〜数時間程度で十分に凝集を起こさせることができる。
本発明の凝集方法によって、ＰＨＡ凝集体の粒径を高めることが可能となる。例えば、体積平均直径が２０μｍ以上、好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは１００μｍ以上の凝集体を得ることができる。上限は特に限定されないが、体積平均直径が１０００μｍ以下、好ましくは５００μｍ以下の凝集体を得ることができる。粒径の増大に伴い濾過による回収が容易になり、工業生産において設備費が軽減できることになる。
本発明の凝集方法は、微生物によって産生されたＰＨＡを当該微生物菌体から分離精製してなるＰＨＡに対して、好適に適用することができる。この場合、少なくともＰＨＡ粒子がお互いに懸濁液中で接触しうるのに十分な程度に、粒子を取り巻く菌体構成物質が分解されている必要がある。
最初に回収されたＰＨＡ粒子が可溶性の菌体構成物質及び分解生成物その他ＰＨＡ以外の物質で汚染されている場合は、特にそれらを第２液体媒質に再懸濁させ、攪拌による洗浄、化学処理などの後続加工（たとえば漂白剤、たとえば過酸化水素、あるいは次亜塩素酸ソーダによる処理）を行い、粒子をこの新たな液体媒質から回収することも可能である。本発明の凝集方法は、このプロセスのいかなる時点で行うこともできる。
上記微生物は、細胞内にＰＨＡを蓄積している微生物であれば特に限定されない。例えばアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）の菌が挙げられる。特に、アルカリゲネス・リポリティカ（Ａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アルカリゲネス・ラトゥス（Ａ．ｌａｔｕｓ）、アエロモナス・キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）等の菌株、更には、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素群の遺伝子を導入したラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）（旧名Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ＡＣ３２）（ブダペスト条約に基づく国際寄託、国際寄託当局：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６）、寄託日１９９７年８月７日、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３８、原寄託ＦＥＲＭ Ｐ−１５７８６より移管）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４８２１−４８３０頁（１９９７））等がより好ましい。これら微生物を適切な条件で培養して菌体内にＰＨＡを蓄積させた微生物菌体が用いられる。その培養方法については特に限定されないが、例えば特開平０５−９３０４９号等に挙げられる方法が用いられる。
本発明の凝集方法において用いられるＰＨＡ粒子は、従来の技術の項で記載したような公知の方法によってＰＨＡ含有菌体から得られる任意のＰＨＡ粒子を用いることができる。また、ＰＨＡ含有菌体からＰＨＡ粒子を分離する好ましい方法として、ＰＨＡ含有菌体の懸濁液を攪拌しつつ、物理的破砕と同時にアルカリを添加することによりＰＨＡ以外の菌体構成物質を可溶化してＰＨＡを分離する方法が挙げられる。これによって、ＰＨＡ含有菌体からＰＨＡ粒子の凝集体を、非常に簡便な方法で、かつ効率よく得ることが可能となる。
菌体の懸濁液とは、培養終了後の培養懸濁液そのまま、又は、培養液から遠心分離等で分離した菌体を水に懸濁させた水性の懸濁液である。ここでの菌体の懸濁濃度は、乾燥菌体換算で５００ｇ／Ｌ以下が好ましく、より好ましくは３００ｇ／Ｌ以下である。
物理破砕処理としては、アルカリ処理により菌体内より溶出し、主に粘度の上昇の原因となる核酸を効率よく破砕し、かつ、菌体細胞壁や細胞膜や不溶性蛋白質などのポリマー以外の不溶性物質を十分に分散できるものであればこれらに限定されるものではない。具体的には、超音波による破砕、乳化分散機、高圧ホモジナイザーやミル等による破砕が挙げられる。
アルカリとしては特に限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウムなどのアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属の炭酸塩；酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなどの有機酸のアルカリ金属塩；ほう砂等のアルカリ金属のホウ酸塩；リン酸３ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸３カリウム、リン酸水素２カリウムなどのアルカリ金属のリン酸塩；あるいはアンモニア水などが挙げられる。この中でも、工業生産に適し、また価格の点で、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウムなどが好ましい。
アルカリを添加する際には、当該アルカリの添加によって懸濁液のｐＨをコントロールすることが好ましい。特に、ｐＨ８〜１３．５、更にはｐＨ１０〜１３、より好ましくはｐＨ１１〜１３の範囲でコントロールするのが好ましい。ｐＨをコントロールするために、アルカリは、懸濁液のｐＨを測定しつつ、連続的又は断続的に添加するのが好ましい。
物理的破砕とアルカリ処理を行う際の温度としては特に限定されないが、室温から５０℃の範囲が好ましく、３０℃から４０℃の範囲がより好ましい。
図１は本発明の一実施態様にかかるＰＨＡの凝集体の様子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮影したものである。当該凝集体は、１個の粒径が約０．１μｍから約１．５μｍのＰＨＢＨ微粒子が多数接着することにより１個の凝集体を形作っていることがわかる。ここで微粒子径の求め方は走査型電子顕微鏡写真を用いる当業者に周知の方法で行った。すなわち、微粒子径はＰＨＡ凝集塊の表面写真を５０００倍の解像度で撮影し、得られた写真から直接個々の微粒子の直径を読み取ることにより得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
本実施例ではＰＨＡとしてＰＨＢＨを用いた。本発明での実施はＰＨＢＨになんら限られるものではない。
ＰＨＢＨの懸濁液は、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素群遺伝子を導入したＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ（上述の寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３８）をＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４８２１−４８３０頁（１９９７）に記載の方法で培養し、ＰＨＢＨを約６７ｗｔ％含有した菌体を得た。遠心（５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）により培養液から分離したペースト状の菌体に水を加えて７５ｇ乾燥菌体／Ｌの水性懸濁液とし、アルカリとして水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ１１．７に保ちながら攪拌と物理的破砕とを行うことでＰＨＢＨ以外の菌体構成物質を可溶化し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行って沈殿物を得た。沈殿物はさらに水洗を行い、平均分子量約１４０万、３ＨＨモル分率７％、純度９７％のＰＨＢＨを分離した。得られたＰＨＢＨを２０％ｗ／ｖの水性懸濁液とし、以後の実験に使用した。
各実施例で使用したＰＨＢＨの純度は以下のようにして決定した（但し、実施例３と実施例４は後述するＨＰＬＣ法で純度を決定した）。ＰＨＢＨの粉体１０ｍｇを、クロロホルム１ｍｌに溶解したのち、メタノール０．８５ｍｌと濃硫酸０．１５ｍｌを加えて１００℃で１４０分間処理した。これを冷却後、硫酸アンモニア飽和水溶液０．５ｍｌを加えて激しく攪拌した後静置した。下層部をキャピラリーガスクロマトグラフィーにて分析して、分離物中のＰＨＢＨの純度およびＰＨＢＨ中の３ＨＢ、３ＨＨのモル分率を求めた。
菌体から分離して得られたＰＨＢＨの分子量は、菌体より分離して得られた沈殿物１０ｍｇを、クロロホルム１ｍｌに溶解したのち、不溶物を濾過により除いた。この溶液をＳｈｏｄｅｘ Ｋ８０５Ｌ（３００×８ｍｍ、２本連結）を装着したＳＨＩＭＡＤＺＵ社製ＧＰＣシステムを用いクロロホルムを移動相として分析した。
ＰＨＡ粒子の粒径は日機装社製マイクロトラック粒度計を用いて測定を行った。該装置によって測定した粒径値は体積平均粒径として得られる。体積平均粒径は、一般的に粒径を表すときに用いられ、粒子の体積によって重み付けられた平均粒径を意味している。
【実施例１】
ＰＨＢＨの２０％ｗ／ｖ水性懸濁液４０ｍｌとエタノール１６０ｍｌを混合し、バス温９０℃の攪拌槽内で、１０分間、加熱・攪拌した。その後、これを攪拌しながら室温まで冷却した。ポリマーを遠心分離（２４００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）にて回収し、水洗後粒径を測定した結果を表１に示す。
この結果から、水と親水性溶媒の混合液体からなる懸濁液を加熱・攪拌すると、ＰＨＡの分子量は大きく低下することなく、ＰＨＡ粒子が凝集し、粒径が増大することが分かった。
【実施例２】
実施例１で用いたものと同じＰＨＢＨ懸濁液２５ｍｌに各種親水性溶媒を加えてバス温８０℃で１５分間加熱攪拌を行った。そののち、攪拌しながら室温まで冷却し、遠心分離（２４００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）によりＰＨＡを回収した。これを水で洗浄後、水に再懸濁し粒径を測定した。
この結果から、水と親水性溶媒の混合液体からなる懸濁液を加熱・攪拌すると、ＰＨＡの分子量は大きく低下することなく、ＰＨＡ粒子が凝集し、粒径が増大することが分かった。特に、アセトニトリルやテトラヒドロフランなどＰＨＡ溶解能の高い溶媒を用いると、粒径はより大きくなることが判明した。
【実施例３】
実施例１で用いたＰＨＢＨスラリーを、ＰＨＢＨ１０ｇを含む懸濁液１００ｍＬ中のエタノール量がそれぞれ８０ｍＬ、７０ｍＬとなるようにＰＨＢＨ水性懸濁液を調整し（それぞれの懸濁液のｐＨは、７．６２と７．３６）、バス温９０℃の攪拌槽内で、加熱攪拌を行った。懸濁液から適時サンプルを採取し、これを攪拌しながら室温まで冷却した。これを遠心分離（２４００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）にて回収し、再度水に懸濁させて粒径を測定した結果を表３に示す。
この結果から、水と親水性溶媒の混合液体からなる懸濁液を加熱・攪拌すると、ＰＨＡの分子量は大きく低下することなく、ＰＨＡ粒子が凝集し、粒径が増大することが分かった。またＰＨＡの純度が向上することも分かった。
【実施例４】
実施例１と同様な方法で菌体から分離されたＰＨＢＨ（分子量１５６万、純度９９％）を加熱・減圧乾燥した。得られた乾燥ＰＨＢＨ８ｇをエタノールに十分に懸濁させ、８０ｍＬのＰＨＢＨエタノール懸濁液（ｐＨ７．０５）を得た。これを実施例１と同様な方法で加熱・攪拌し、冷却後、水に懸濁させて粒径を測定した結果を表４に示す。
この結果から、親水性溶媒からなる懸濁液を加熱・攪拌すると、ＰＨＡの分子量は低下することなく、ＰＨＡ粒子が凝集し、粒径が増大することが分かった。またＰＨＡの純度が向上することも分かった。
なお実施例３及び実施例４において、処理後のＰＨＢＨの純度は以下のようにして測定した。
処理後のＰＨＢＨ懸濁液を遠心分離して上清を除去し、回収したＰＨＢＨに対し、上記ＰＨＢＨ懸濁液と同容量に達するまでエタノールを加えることで２回洗浄した。洗浄後、加熱（５０℃）減圧乾燥して得られたＰＨＢＨの純度を、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。
高速液体クロマトグラフィーの条件：
カラム：資生堂 カプセルパックＵＧ８０ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
移動相：２０ｍｍｏｌリン酸バッファー（ｐＨ３．０）：メタノール＝８０：２０（リン酸１カリウム＋リン酸で調整）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
なお、ポリマー約２５ｍｇ、メタノール４ｍＬ、メタンスルホン酸３００μＬを混合し１００℃で３時間加熱した後、室温まで冷却し、１０ｍＬにメタノールでメスアップしたもの１０μＬを、高速液体クロマトグラフィーに注入した。
【実施例５】
実施例２のメタノール凝集で得られた凝集体の走査型電子顕微鏡写真を撮影した（図１〜３）。凝集体を分散法によりサンプリングし、表面を日立Ｓ−４０００走査型電子顕微鏡にて加速電圧３ｋＶで観察した結果、凝集体はサブミクロンオーダーの丸みを帯びたＰＨＢＨ粒子が凝集し、不定形の２次凝集体を形成していることが判明した（図１、２）。さらに日立Ｓ−５０００走査型電子顕微鏡にて加速電圧１ｋＶで高倍率観察した結果、粒子と粒子が接合している部分が存在することが明らかとなった（図３）。
【産業上の利用の可能性】
本発明によるＰＨＡの凝集方法は、極めて簡便な方法によって、ＰＨＡの分子量低下を抑制しながら、純度の高いＰＨＡの凝集体を得ることが可能である。この方法によりＰＨＡは、濾過性や取扱に優れた粒径の粒子となる。
【図１】
【図２】
【図３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体に懸濁させたポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を凝集させる方法であって、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸粒子を、親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁し、該懸濁液の沸点以下の温度で攪拌することを特徴とする、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の凝集方法。
【請求項２】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエートおよび３−ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される少なくとも２種のモノマーから構成される共重合体である請求項１記載の凝集方法。
【請求項３】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、Ｄ−３−ヒドロキシヘキサノエートと他のＤ−３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体である請求項１記載の凝集方法。
【請求項４】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、Ｄ−３−ヒドロキシヘキサノエートとＤ−３−ヒドロキシブチレートとの２成分共重合体、または、Ｄ−３−ヒドロキシヘキサノエートとＤ−３−ヒドロキシブチレートとＤ−３−ヒドロキシバレレートとの３成分共重合体である請求項３記載の凝集方法。
【請求項５】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、微生物によって産生され、当該微生物菌体から分離精製されたものである請求項１〜４のいずれかに記載の凝集方法。
【請求項６】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を産生する微生物がアエロモナス属である請求項５記載の凝集方法。
【請求項７】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を産生する微生物が、アエロモナス・キャビエ又はアエロモナス・ハイドロフィラである請求項６記載の凝集方法。
【請求項８】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を産生する微生物が、アエロモナス・キャビエ由来のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素群遺伝子を導入された菌株である請求項５記載の凝集方法。
【請求項９】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を含有する微生物が、アエロモナス・キャビエ由来のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素群遺伝子を導入されたラルストニア・ユートロファである請求項５記載の凝集方法。
【請求項１０】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸粒子が、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸含有菌体の懸濁液を攪拌しつつ、物理的破砕と同時にアルカリを添加することによりポリ−３−ヒドロキシアルカン酸以外の菌体構成物質を可溶化してポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を分離したものである請求項１〜９のいずれかに記載の凝集方法。
【請求項１１】
親水性溶媒が、アルコール類、ケトン類、ニトリル類、アミド類及びエーテル類からなる群より選択されたものである請求項１〜１０のいずれかに記載の凝集方法。
【請求項１２】
アルコール類が、メタノール又はエタノールであり、ケトン類がアセトンであり、ニトリル類がアセトニトリルであり、アミド類がジメチルホルムアミドであり、エーテル類がテトラヒドロフランである請求項１１記載の凝集方法。
【請求項１３】
粒径０．１μｍ以上、１．５μｍ以下のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸微粒子同士が接着してなることを特徴とする、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の凝集体。
【請求項１】
液体に懸濁させたポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を凝集させる方法であって、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸粒子を、親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁し、該懸濁液の沸点以下の温度で攪拌することを特徴とする、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の凝集方法。
【請求項２】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエートおよび３−ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される少なくとも２種のモノマーから構成される共重合体である請求項１記載の凝集方法。
【請求項３】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、Ｄ−３−ヒドロキシヘキサノエートと他のＤ−３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体である請求項１記載の凝集方法。
【請求項４】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、Ｄ−３−ヒドロキシヘキサノエートとＤ−３−ヒドロキシブチレートとの２成分共重合体、または、Ｄ−３−ヒドロキシヘキサノエートとＤ−３−ヒドロキシブチレートとＤ−３−ヒドロキシバレレートとの３成分共重合体である請求項３記載の凝集方法。
【請求項５】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、微生物によって産生され、当該微生物菌体から分離精製されたものである請求項１〜４のいずれかに記載の凝集方法。
【請求項６】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を産生する微生物がアエロモナス属である請求項５記載の凝集方法。
【請求項７】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を産生する微生物が、アエロモナス・キャビエ又はアエロモナス・ハイドロフィラである請求項６記載の凝集方法。
【請求項８】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を産生する微生物が、アエロモナス・キャビエ由来のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素群遺伝子を導入された菌株である請求項５記載の凝集方法。
【請求項９】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を含有する微生物が、アエロモナス・キャビエ由来のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素群遺伝子を導入されたラルストニア・ユートロファである請求項５記載の凝集方法。
【請求項１０】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸粒子が、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸含有菌体の懸濁液を攪拌しつつ、物理的破砕と同時にアルカリを添加することによりポリ−３−ヒドロキシアルカン酸以外の菌体構成物質を可溶化してポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を分離したものである請求項１〜９のいずれかに記載の凝集方法。
【請求項１１】
親水性溶媒が、アルコール類、ケトン類、ニトリル類、アミド類及びエーテル類からなる群より選択されたものである請求項１〜１０のいずれかに記載の凝集方法。
【請求項１２】
アルコール類が、メタノール又はエタノールであり、ケトン類がアセトンであり、ニトリル類がアセトニトリルであり、アミド類がジメチルホルムアミドであり、エーテル類がテトラヒドロフランである請求項１１記載の凝集方法。
【請求項１３】
粒径０．１μｍ以上、１．５μｍ以下のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸微粒子同士が接着してなることを特徴とする、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の凝集体。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３３７００
【国際公開日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【発行日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４２８１８（Ｐ２００４−５４２８１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１２４８５
【国際出願日】平成１５年９月３０日（２００３．９．３０）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【発行日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１２４８５
【国際出願日】平成１５年９月３０日（２００３．９．３０）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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