ポリアミノ酸及びペプチドの製造方法
【課題】ポリα−グルタミン酸の大量合成技術を提供する。
【解決手段】ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端アミノ酸がグルタミン酸であるペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有する組成物と、該組成物を用いるポリα−グルタミン酸の製造方法と、アミノ酸又はその誘導体がＣ末端に連結したペプチドの製造方法。前記タンパク質を発現する組換えベクター。
【解決手段】ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端アミノ酸がグルタミン酸であるペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有する組成物と、該組成物を用いるポリα−グルタミン酸の製造方法と、アミノ酸又はその誘導体がＣ末端に連結したペプチドの製造方法。前記タンパク質を発現する組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端アミノ酸がグルタミン酸であるペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有する組成物と、該組成物を用いるポリα−グルタミン酸の製造方法と、アミノ酸又はその誘導体がＣ末端に連結したペプチドの製造方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌ＲｉｍＫ遺伝子産物は、リボソームＳ６タンパク質（ＲｐｓＦ遺伝子産物）のＣ末端に複数個のグルタミン酸を付加する修飾酵素として知られている（非特許文献１）。本発明の発明者らは、遊離のグルタミン酸単体を基質としてポリα−グルタミン酸を合成するポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性と、ジグルタミン酸か、Ｃ末端アミノ酸がグルタミン酸であるペプチドかに広範な特異性でアミノ酸を連結するアミノ酸リガーゼ活性とがＲｉｍＫ遺伝子産物にはあることを発見した。本発明は、かかる発見に基づいて想到された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｋａｎｇら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１７：２８１−２８８（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ポリグルタミン酸には、グルタミン酸がγ位のカルボキシル基でペプチド結合により連結して重合したホモポリペプチド（ポリγ−グルタミン酸）と、グルタミン酸がα位のカルボキシル基でペプチド結合により連結して重合したホモポリペプチド（ポリα−グルタミン酸）とがある。前者のポリγ−グルタミン酸は納豆の粘りけの主成分であり、増粘剤、保湿剤、生体適合性材料等として知られている。これに対し、後者のポリα−グルタミン酸については、その性状が詳しく知られていない。これは、ポリα−グルタミン酸を大量合成することが困難なことが原因の１つである。そこで、工業的なポリα−グルタミン酸の大量合成技術を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性及び／又はアミノ酸リガーゼ活性を有する組成物を提供する。本発明のポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性及び／又はアミノ酸リガーゼ活性を有する組成物は、（１）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列によってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む。
【０００６】
本発明の組成物は、前記（１）ないし（６）のタンパク質からなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を発現する組換えベクターを含む形質転換体を含む場合がある。
【０００７】
本発明は、（１）本発明の組成物を用意するステップと、（２）前記組成物と、グルタミン酸とを接触させて、ポリα−グルタミン酸を合成させるステップとを含む、ポリα−グルタミン酸の製造方法を提供する。
【０００８】
本発明のポリα−グルタミン酸の製造方法は、ポリα−グルタミン酸の粘性を消失させる温度条件で実施される場合がある。
【０００９】
本発明はアミノ酸又はその誘導体がＣ末端に連結したペプチドの製造方法を提供する。本発明のペプチドの製造方法は、（１）本発明の組成物を用意するステップと、（２）グリシン、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなるグループから選択される少なくとも１種類のアミノ酸又はその誘導体と、ジグルタミン酸か、Ｃ末端アミノ酸がグルタミン酸であるペプチドかと、前記組成物とを接触させて、前記少なくとも１種類のアミノ酸かその誘導体かがＣ末端に連結したペプチドを合成させるステップとを含む。
【００１０】
本明細書において「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。また、「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、金属イオン、補酵素、アロステリックリガンドその他の原子、イオン、原子団か、他の「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かを共有結合又は非共有結合により結合又は会合している場合がある。
【００１１】
本明細書において「ポリアミノ酸」とは、１種類のアミノ酸がペプチド結合でつながったペプチドをいう。
【００１２】
本明細書でアミノ酸を表す場合、アスパラギン、グルタミン等の化合物名で表す場合と、Ａｓｎ、Ｇｌｎ等の慣用の３文字表記で表す場合とがある。化合物名で表す場合には、アミノ酸のα炭素に関する立体配置を示す接頭辞（又はＤ−）を用いて表す。慣用の３文字表記で表す場合には、該３文字表記は特に断りのない限りＬ体のアミノ酸を表す。本明細書において、アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基とが少なくとも１個の炭素原子を介して結合した化合物であって、ペプチド結合により重合することが可能ないずれかの化合物を指す。本明細書におけるアミノ酸は、グリシン、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる２０種類のアミノ酸（以下、「リボソームタンパク質合成反応の基質となる２０種類のアミノ酸の単体」という。）とこれらの立体異性体であるＤ−アミノ酸とを含むが、これらに限定されない、いずれかの天然又は非天然のアミノ酸を含む場合がある。
【００１３】
本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。本発明の酵素タンパク質は、活性を有することを条件として、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で、本発明のポリα−グルタミン酸や、アミノ酸又はその誘導体がＣ末端に連結したペプチドの製造方法に使用される場合がある。本発明の酵素タンパク質を前記宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系で発現させる場合には、前記タンパク質を発現する宿主生物、例えば本発明の形質転換体が生きた状態で本発明の製造に用いられる場合がある。このとき、本発明のポリグルタミン酸の製造は、休止菌体反応系や発酵法によって行うことができる。あるいは、前記タンパク質は、精製された状態で本発明のポリα−グルタミン酸や、アミノ酸又はその誘導体がＣ末端に連結したペプチドの製造方法に使用されてもよい。
【００１４】
配列番号１のヌクレオチド酸配列と、配列番号２のアミノ酸配列とは、それぞれ、大腸菌Ｋ１２株のＲｉｍＫ遺伝子のヌクレオチド配列と、大腸菌Ｋ１２株のＲｉｍＫ遺伝子産物のアミノ酸配列とである。配列番号２のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０００９６として登録されている。配列番号３及び４に列挙されるヌクレオチド配列は、それぞれ大腸菌ＲｉｍＫ遺伝子をＰＣＲ法で増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーである。
【００１５】
本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、本発明のヌクレオチド配列と、比較対象のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を本発明のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。同様に、本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、本発明のアミノ酸配列と、比較対象のアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、配列が一致するアミノ酸残基の数の合計を本発明のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。本発明のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。
【００１６】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドはアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化される。６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液で前洗浄される。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応は６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行われる。その後前記固相は１× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄され、０．２× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄される。最後に前記固相に残存するプローブの量が前記標識物質の定量により決定される。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。
【００１７】
本発明のタンパク質は、大腸菌ＲｉｍＫ遺伝子産物であって、（１）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列によってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質である。
【００１８】
本発明の融合タンパク質は、特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質のＮ末端又はＣ末端に連結したものである。
【００１９】
本発明の特異的結合タグペプチドは、前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質を調製する際に、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドである。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、本発明の融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。本発明の特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明の特異的結合タグは、融合タンパク質がポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を保持することを条件としていかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。
【００２０】
本発明のタンパク質のポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性は、本発明のタンパク質と、グルタミン酸単体と、ＡＴＰと適当な緩衝液とを含む反応混合液か、本発明のタンパク質と、アミノ酸単体と、ジグルタミン酸か、Ｃ末端アミノ酸がグルタミン酸であるペプチドかと、ＡＴＰと適当な緩衝液とを含む反応混合液かをインキュベーションすることにより生成した遊離リン酸を定量することにより評価される場合がある。前記ペプチドが、Ｃ末端アミノ酸はグルタミン酸であるが、そのアミノ基が連結するアミノ酸はグルタミン酸以外の場合であっても、前記反応混合液は遊離リン酸を生成する。したがって、本発明のタンパク質のアミノ酸リガーゼは、Ｃ末端がグルタミン酸のペプチドと特異的に反応するが、Ｃ末端から２個目のアミノ酸はグルタミン酸である必要はない。したがって、前記Ｃ末端がグルタミン酸のペプチドのＣ末端から２個目よりＮ末端側のアミノ酸は、メトキシ基のような官能基、ビオチンその他の特異的結合パートナーや、蛍光その他の発色団、Ｘ線その他の電磁放射線の透過特性に特徴のある原子団、ＥＳＲ等の生物物理学的な測定用のプローブ原子団等によって修飾されていてもかまわないし、ガラス、ラテックス、シリコン、プラスチック等の固体や、糖鎖その他のポリマーに共有結合によって連結されていてもかまわない。メトキシ基のような官能基、ビオチンその他の特異的結合パートナーや、蛍光その他の発色団、Ｘ線その他の電磁放射線の透過特性に特徴のある原子団、ＥＳＲ等の生物物理学的な測定用のプローブ原子団等による修飾は、本発明のタンパク質のポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を完全に阻害しないことを条件として、アミノ酸のいずれの原子に結合するものであってもかまわない。前記修飾は前記アミノ酸のＮ末端アミノ基を修飾することが好ましい。
【００２１】
本発明のタンパク質のポリα−グルタミン酸シンテターゼ反応では、単体のグルタミン酸のＣ末端カルボキシル基にグルタミン酸が連結される。すると、本発明のタンパク質のアミノ酸リガーゼ反応においても、Ｃ末端がグルタミン酸であるペプチドだけでなく、単体のグルタミン酸にもアミノ酸が連結されうると考えられる。ここで、本発明のタンパク質のポリα−グルタミン酸シンテターゼ及び／又はアミノ酸リガーゼ反応によりアミノ酸と連結されるグルタミン酸は、前記酵素反応を完全に阻害しないことを条件として、メトキシ基のような官能基、ビオチンその他の特異的結合パートナーや、蛍光その他の発色団、Ｘ線その他の電磁放射線の透過特性に特徴のある原子団、ＥＳＲ等の生物物理学的な測定用のプローブ原子団等により修飾されていてもかまわないし、ガラス、ラテックス、シリコン、プラスチック等の固体や、糖鎖その他のポリマーに共有結合によって連結されていてもかまわない。前記修飾は前記グルタミン酸のＮ末端アミノ基を修飾することが好ましい。
【００２２】
本発明の組成物において、前記アミノ酸リガーゼ活性は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端アミノ酸がグルタミン酸であるペプチドかのＣ末端にアミノ酸を連結する活性の場合がある。前記ジグルタミン酸か、Ｃ末端アミノ酸がグルタミン酸であるペプチドかのＣ末端に連結されるアミノ酸は、リボソームタンパク質合成反応の基質となる２０種類のアミノ酸のうち、アルギニン、リジン、ヒスチジン及びプロリンを除くいずれかのアミノ酸か、その誘導体かの場合がある。前記誘導体は、メトキシ基のような官能基、ビオチンその他の特異的結合パートナーや、蛍光その他の発色団、Ｘ線その他の電磁放射線の透過特性に特徴のある原子団、ＥＳＲ等の生物物理学的な測定用のプローブ原子団等が、リボソームタンパク質合成反応の基質となる２０種類のアミノ酸のうち、アルギニン、リジン、ヒスチジン及びプロリンを除くいずれかのアミノ酸に共有結合で連結された化合物の場合がある。前記アミノ酸の誘導体は、該アミノ酸のＣ末端のカルボキシル基が修飾されることが好ましい。
【００２３】
本発明のポリα−グルタミン酸や、ペプチドの解析は、ＨＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＲＯＦ−ＭＳ等のような当業者に周知の分析機器の使用により実施される場合がある。
【００２４】
本発明の製造方法のステップ（２）では、本発明の組成物に加えて、ｐＨ調整のための緩衝液成分を含む反応液を用いて実施される場合がある。好ましくは前記緩衝液成分としてＴｒｉｓＨＣｌが使用され、ｐＨは９．０〜１０．０に調整される場合がある。
【００２５】
本発明の製造方法のステップ（２）において反応混合液が所定の反応時間及び反応温度でインキュベーションされる。本発明の製造方法において、本発明の組成物、基質及び／又はＡＴＰの反応液中における濃度、反応液量、反応時間、反応温度、ｐＨその他の反応条件は、ポリα−グルタミン酸又はペプチドの目標とする製造量、平均分子量、多分散度及び収率と、製造に要する時間、費用、設備等と、その他の条件との関係で当業者により決定される場合がある。
【００２６】
本発明の製造方法で取得されるポリα−グルタミン酸及びペプチドは、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、凍結乾燥等のような当業者に周知の操作の組合せにより回収される場合がある。また、本発明の製造方法で取得されるポリα−グルタミン酸及びトリペプチドは、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＲＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲ等のような当業者に周知の分析技術を使用して重合度、構造等を評価される場合がある。
【００２７】
本明細書において「組換えベクター」とは、本発明のタンパク質を宿主生物において発現させるために使用される、前記タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターである。
【００２８】
本明細書において「ベクター」とは、本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、本発明のタンパク質を該宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子であり、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等を含むがこれらに限定されない。好ましくは、前記ベクターはプラスミドの場合がある。さらに好ましくは、前記ベクターは、ｐＥＴ−２１ａ（＋）プラスミドの場合がある。
【００２９】
本発明の組換えベクターは、制限酵素、ＤＮＡ連結酵素等を使用する当業者に周知の遺伝子工学手法を用いて本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドといずれかのベクターとを連結することにより作製される場合がある。
【００３０】
本明細書において「形質転換体」とは、本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターが導入され、該所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった生物である。
【００３１】
本明細書において「宿主生物」とは、形質転換体の作製において、本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターが導入される生物である。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。前記宿主生物は大腸菌の場合がある。
【００３２】
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターをいずれかの適切な宿主生物に導入することにより作製される。組換えベクターの導入は、電気刺激で細胞膜に空隙を作るエレクトロポレーション法、カルシウムイオン処理と併せて行うヒートショック法等を含む当業者に周知のさまざまな手法により実施される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図。
【図２】ＲｉｍＫ反応産物精製標品と、合成ポリα−グルタミン酸と、合成ポリγ−グルタミン酸とを前記酸加水分解処理に供する前後のサンプルと、グルタミン酸単体とをＴＬＣ分析した結果図。
【図３Ａ】ＲｉｍＫ反応産物精製標品のＭＡＬＤＩ−ＲＯＦ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図。
【図３Ｂ】図３Ａのスペクトル図のｍ／ｚ値が４，０００ないし４，５００の範囲の縦軸を拡大したスペクトル図。
【図４Ａ】ＲｉｍＫ反応産物のＮＭＲスペクトルのケミカルシフト１．７−２．５の範囲の拡大したスペクトル図。
【図４Ｂ】合成ポリα−グルタミン酸（Ｐｏｌｙ−α−Ｇｌｕ）のＮＭＲスペクトルのケミカルシフト１．７−２．５の範囲の拡大したスペクトル図。
【図４Ｃ】合成ポリγ−グルタミン酸Ｐｏｌｙ−γ−Ｇｌｕ）のＮＭＲスペクトルのケミカルシフト１．７−２．５の範囲の拡大したスペクトル図。
【図４Ｄ】γ−ジグルタミン酸（γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のＮＭＲスペクトルのケミカルシフト１．７−２．５の範囲の拡大したスペクトル図。
【図５】ＲｉｍＫ遺伝子産物を発現する大腸菌の無細胞抽出液のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図。
【図６】ＲｉｍＫ精製タンパク質によるアルギニルグルタミン酸（ＲＥ）からの反応産物のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図。
【図７】加熱処理の温度（横軸）と、各温度で加熱処理された酵素を含む反応混合液の遊離リン酸濃度を陽性対照の遊離リン酸濃度で除算した比活性（縦軸）との関係を示すグラフ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
大腸菌ＲｉｍＫタンパク質をエンコードする遺伝子のクローニング、導入及び発現
（ＲｉｍＫ遺伝子の増幅）
大腸菌Ｋ１２株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び４に列挙されるヌクレオチド配列からなるそれぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、大腸菌ＲｉｍＫ遺伝子が増幅された。得られた増幅産物は、配列番号３のヌクレオチド配列と、配列番号１のヌクレオチド配列のうち第２４番目から第８８３番目のヌクレオチド配列と、配列番号４のヌクレオチド配列の逆相補体配列とがこの順に５’末端から３’末端まで連結されたヌクレオチド配列からなる２本鎖ＤＮＡであった。
【００３６】
（組換えプラスミドの取得）
前記ＰＣＲ反応の増幅産物をインサート用ＤＮＡと、ベクターであるｐＥＴ−２１ａ（＋）とが、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩにより切断された。切断産物は、精製後、連結されて、発現ベクターｐＥＴＲｉｍＫが得られた。ｐＥＴＲｉｍＫは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入された。発現ベクターｐＥＴＲｉｍＫは、ＲｉｍＫ遺伝子産物のＣ末端にＨｉｓタグが連結した融合タンパク質を発現する。
【００３７】
（目的の遺伝子の発現）
発現ベクターｐＥＴＲｉｍＫが形質転換された大腸菌は、５０μｇ／ｍＬ アンピシリンを添加したＬＢ液体培地３ｍＬに接種され、３７°Ｃ、１５０ｒｐｍで５時間振とう培養された。その後、前記液体培地１ｍＬが５０μｇ／ｍＬ アンピシリンを添加した新鮮なＬＢ液体培地１００ｍＬに接種され、３７°Ｃ、１２０ｒｐｍで１ないし２時間振とう培養された。そして、終濃度が０．１ｍＭとなるようにイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が添加され、２５°Ｃ、１２０ｒｐｍで終夜培養され、遺伝子発現が誘導された。培養菌体は、遠心分離により集菌され、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁された。前記懸濁液は、超音波破砕後、遠心分離により残渣が除去され、上清が無細胞抽出液として回収された。ＲｉｍＫ遺伝子産物のＣ末端にＨｉｓタグが連結した融合タンパク質は、Ｎｉ−アフィニティーカラム（Ｈｉｓ−ｔｒａｐ、ＧＥヘルスケア）で精製後、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア）で脱塩され、酵素反応用精製タンパク質として用いられた（以下、「ＲｉｍＫ精製タンパク質」という）。
【実施例２】
【００３８】
ＲｉｍＫ精製タンパク質の酵素活性
材料及び方法
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と、２５ｍＭのアミノ酸基質と、１２．５ｍＭのＡＴＰと、１２．５ｍＭのＭｇＳＯ４と、０．５ｍｇ／ｍＬのＲｉｍＫ精製タンパク質とを含む反応混合液が調製された。前記アミノ酸基質として、リボソームタンパク質合成反応の基質となる２０種類のアミノ酸の単体のうちいずれか１種類が用いられた。したがって本実施例では、前記アミノ酸のそれぞれを含む反応混合液合計２０種類が調製された。それぞれの反応混合液は３０°Ｃで２０時間インキュベートされた。ペプチドが生成する際にはＡＴＰがＡＤＰとリン酸（Ｐｉ）に加水分解されることから、インキュベーション後の前記反応混合液中の遊離リン酸量がＤｅｔｅｒｍｉｎｅｒ Ｌ ＩＰ（協和メディックス）を用いて測定された。陰性対照として、アミノ酸基質を含まない反応混合液が用いられた。ＲｉｍＫタンパク質は大腸菌リボソームＳ６タンパク質（ＲｐｓＦ）のＣ末端にグルタミン酸を付加する活性を有することが知られている。そこで、ＲｐｓＦのＮ末端にＨｉｓタグが連結された融合タンパク質（以下、「ＲｐｓＦ精製タンパク質」という。）の精製標品を別途調製し、これを０．５ｍｇ／ｍＬ含む反応混合液が陽性対照として用いられた。
【００３９】
結果
ＲｉｍＫの生体内での基質であるＲｐｓＦ精製タンパク質は含まないで、アミノ酸基質のグルタミン酸だけを含む反応混合液において、３．１ｍＭの遊離リン酸が検出された。ＲｐｓＦにグルタミン酸を付加させる反応を行う陽性対照の反応混合液では、３．３ｍＭの遊離リン酸が検出された。ＲｐｓＦ精製タンパク質を含む反応混合液であっても、グルタミン酸のかわりにアスパラギン酸を含む反応混合液では１．５ｍＭの遊離リン酸しか検出されなかった。また、ＲｐｓＦ精製タンパク質は含むがアミノ酸基質を含まない反応混合液でも、１．６ｍＭの遊離リン酸が検出された。ＲｐｓＦ精製タンパク質は含まないが、プロリンを含む反応混合液では、０．１ｍＭしか遊離リン酸が検出されなかった。ＲｐｓＦ精製タンパク質は含まず、かつ、グルタミン酸及びプロリン以外の他のアミノ酸基質を含む反応混合液では、１．０ｍＭないし１．５ｍＭの遊離リン酸が検出された。アミノ酸基質を含まない陰性対照でも、１．５ｍＭ程度の遊離リン酸が検出された。そこでＲｉｍＫ精製タンパク質は、ＲｐｓＦ精製タンパク質が存在しなくても、遊離グルタミン酸特異的にＡＴＰを消費する反応を行うことが示された。ＲｉｍＫは大腸菌菌体内でＲｐｓＦにグルタミン酸を最大４個重合付加することが知られているが、本実施例の結果から、ＲｉｍＫは、タンパク質基質であるＲｐｓＦが存在しなくても単体のグルタミン酸を重合できる可能性が示唆された。
【実施例３】
【００４０】
ＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物の解析（１）
ＲｉｍＫによる反応産物の構造解析のために、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０−１０．０）中に、２０ｍＭのグルタミン酸と、２０ｍＭのＡＴＰと、２０ｍＭのＭｇＳＯ４と、０．５ｍｇ／ｍＬのＲｉｍＫ精製タンパク質とを含む反応混合液が調製され、３０°Ｃで２０時間インキュベーションされた。
【００４１】
ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， カリフォルニア州、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）のＨＰＬＣと、ＬＣＱ Ｄｅｃａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州、Ｗａｌｔｈａｍ）のＥＳＩ−ＭＳとから構成される。カラムは、Ｗａｔｅｒｓ社のＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８（５ｍｍ、４．６×１５０ｍｍ）が用いられた。溶離液にはＡ液として５０ｍＭのギ酸、Ｂ液としてアセトニトリルが用いられ、毎分１．０ｍＬの流速で、溶出開始後最初の２分はＡ液１００％が流され、その後７分間かけてＡ液にＢ液を混合させてＡ液１００％からＢ液１００％に移行しながら流され、その後６分間はＢ液１００％で流された。次に６秒間でＢ液からＡ液に切り替えられ、溶出開始後２０分までＡ液１００％が流された。
【００４２】
結果
図１はＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図である。太字のｎはグルタミン酸ポリマーの重合度を表し、各ポリマーにプロトン付加した分子量と一致するピークを黒矢印で表し、該ピークから水分子が抜けた分子量に相当するピークを灰色矢印で表す。図１から、黒矢印のピークは、グルタミン酸４ないし１２個がペプチド結合してプロトン付加したポリグルタミン酸と推察された。
【実施例４】
【００４３】
ＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物の解析（２）
ＲｉｍＫによる反応産物のさらなる構造解析用に多量の反応産物を得るために、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）中に、４０ｍＭのグルタミン酸と、４０ｍＭのＡＴＰと、４０ｍＭのＭｇＳＯ４と、１．０ｍｇ／ｍＬのＲｉｍＫ精製タンパク質とを含む反応混合液が調製され、３０°Ｃで２０時間インキュベーションされた。
【００４４】
実施例３からＲｉｍＫによるグルタミン酸の反応産物がポリグルタミン酸であることが推察されたので、エタノール沈殿法により前記反応産物が精製された。すなわち、前記反応混合液はインキュベーション後に煮沸され、遠心分離によりタンパク質が除去され、上清に５分の１量の５Ｍ ＮａＣｌが添加され、よく攪拌された。さらに２倍量のエタノールが添加され、攪拌された。得られた沈殿物が少ないときには、−８０°Ｃで２０分間冷却された。その後沈殿物（以下、「ＲｉｍＫ反応産物精製標品」という。）が遠心分離により回収された。典型的には、３ｍＬの反応混合液から約４０ｍｇの沈殿物が得られた。
【００４５】
酸加水分解処理によってポリマーを構成するモノマー成分を分析するために、ＲｉｍＫ反応産物精製標品と、合成ポリα−グルタミン酸（分子量７００−５，０００、和光純薬）と、合成ポリγ−グルタミン酸（分子量２００，０００−５００，０００、和光純薬）とが６Ｎ塩酸に懸濁され、９５°Ｃ、２４時間インキュベーションされた。その後ＮａＯＨで中和され、ＴＬＣ分析に供された。
【００４６】
結果
図２は、ＲｉｍＫ反応産物精製標品と、合成ポリα−グルタミン酸と、合成ポリγ−グルタミン酸とを前記酸加水分解処理に供する前後のサンプルと、グルタミン酸単体とをＴＬＣ分析した結果図である。図２に示されるとおり、ＲｉｍＫ反応産物精製標品は、合成ポリα−グルタミン酸及び合成ポリγ−グルタミン酸と同様に、酸加水分解処理によりグルタミン酸を遊離した。これにより、ＲｉｍＫ反応産物精製標品はポリグルタミン酸であることが示された。
【実施例５】
【００４７】
ＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物の解析（３）
実施例３のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ解析では、ｍ／ｚ値２，０００が測定限界であった。そこで、より測定限界のｍ／ｚ値が高いＭＡＬＤＩ−ＲＯＦ−ＭＳシステムによりＲｉｍＫ反応産物精製標品が解析された。ＭＡＬＤＩ−ＲＯＦ−ＭＳシステムはａｕｔｏｆｌｅｘＩＩＩ（ＢＲＵＫＥＲ）が用いられ、ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）がマトリックスとして用いられた。サンプルは前記マトリックスと混合され、プレートに滴下され、風乾後、測定に供された。
【００４８】
結果
図３Ａは、ＲｉｍＫ反応産物精製標品のＭＡＬＤＩ−ＲＯＦ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図である。各ピーク上の数字はグルタミン酸の重合度を示す。図３Ｂは、ｍ／ｚ値が４，０００ないし４，５００の範囲の縦軸を拡大したスペクトル図である。図３Ａ及びＢに示されるとおり、ＲｉｍＫ反応産物精製標品は分子量１，０００−４，３００のポリグルタミン酸として検出された。
【００４９】
図３Ａ及びＢのスペクトル図で観測されるＲｉｍＫ反応産物精製標品のピークの実測値は、重合度８ないし３３においてポリグルタミン酸のプロトン付加分子量の計算値と一致した。したがって、ＲｉｍＫによるグルタミン酸の反応産物はポリグルタミン酸であることが確認された。
【実施例６】
【００５０】
ＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物の解析（４）
グルタミン酸にはカルボキシル基がα−位とγ−位と２個存在する。そこで、ＲｉｍＫによるグルタミン酸の反応産物のポリグルタミン酸では、どちらのカルボキシル基が隣接するグルタミン酸のアミノ基とペプチド結合しているかという結合様式がＮＭＲ解析により決定された。
【００５１】
ＮＭＲ解析にはＡＶＡＮＣＥ５００（Ｂｒｕｋｅｒ社）が用いられ、エタノール沈殿により精製されたＲｉｍＫ反応産物精製標品がＤ２Ｏに溶解されて解析に供された。標準試薬として、合成ポリα−グルタミン酸（分子量７００−５，０００、和光純薬）と、合成ポリγ−グルタミン酸（分子量２００，０００−５００，０００、和光純薬）と、γ−ジグルタミン酸（ペプチド研究所）とが用いられた。
【００５２】
結果
図５ＡないしＤは、それぞれ、ＲｉｍＫ反応産物、合成ポリα−グルタミン酸（Ｐｏｌｙ−α−Ｇｌｕ）、合成ポリγ−グルタミン酸Ｐｏｌｙ−γ−Ｇｌｕ）及びγ−ジグルタミン酸（γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のＮＭＲスペクトルのケミカルシフト１．７−２．５の範囲の拡大したスペクトル図である。図５ＡないしＤから明かなとおり、ＲｉｍＫ反応産物のＮＭＲスペクトルのケミカルシフト１．７−２．５の範囲で検出される３本のピークの位置及び形状が、合成ポリα−グルタミン酸のものとよく一致した。したがって、ＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物は、グルタミン酸がα位のカルボキシル基でペプチド結合により連結して重合したホモポリペプチドであり、ＲｉｍＫ遺伝子産物にはポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性があるとの結論が得られた。
【実施例７】
【００５３】
ポリα−グルタミン酸の発酵生産
実施例１で説明された手順にしたがって、ＲｉｍＫ遺伝子産物の融合タンパク質を発現するプラスミドベクターｐＥＴＲｉｍＫで形質転換された組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株が５０μｇ／ｍＬ アンピシリンを添加したＬＢ液体培地で培養され、ＩＰＴＧによってＲｉｍＫ遺伝子産物の発現が誘導された。培養菌体は、遠心分離により集菌され、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁された。前記懸濁液は、超音波破砕後、遠心分離により残渣が除去され、上清が無細胞抽出液として回収された。前記無細胞抽出液は１０分間煮沸され、遠心分離によって除タンパクされてから、実施例３で説明されたＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって解析された。
【００５４】
結果
図５は、ＲｉｍＫ遺伝子産物を発現する大腸菌の無細胞抽出液のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図である。実施例２でＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物としてポリα−グルタミン酸が検出された保持時間５．９ないし６．１分の範囲内で、グルタミン酸の５量体及び７量体のそれぞれにプロトン付加した分子量６６４及び９２２のピークが検出された。これにより、組換え大腸菌の菌体内でもポリα-グルタミン酸が蓄積していることが確認された。
【実施例８】
【００５５】
ＲｉｍＫ遺伝子産物によるペプチド合成反応の基質特異性（１）
ＲｉｍＫ遺伝子産物の生体内での生体内での基質であるＲｐｓＦのＣ末端には２個のグルタミン酸残基が連続している。そこで、ＲｉｍＫ遺伝子産物がアミノ酸又はペプチドの末端カルボキシル基と単体アミノ酸のアミノ基との間でペプチド結合を形成させる際に、カルボキシル基についてはグルタミン酸のα位のカルボキシル基に特異性があることは明かであるが、アミノ基については特定のアミノ酸だけしか利用できない基質特異性があるか否かは検討の余地がある。そこで、１２．５ｍＭのジグルタミン酸（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）と、リボソームタンパク質合成反応の基質となる２０種類のアミノ酸の単体いずれか１種類（Ｘａａ）１２．５ｍＭと、１２．５ｍＭのＡＴＰと、１２．５ｍＭのＭｇＳＯ４と、０．５ｍｇ／ｍＬのＲｉｍＫ精製タンパク質と、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）とを含む反応混合液が調製されて、３０°Ｃで２０時間のインキュベーションが行われた。反応後、各反応混合液中の遊離リン酸が実施例２と同様にして測定され、反応産物が実施例３と同様にしてＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって解析された。陰性対照（ＢＬＫ）として、前記アミノ酸の単体及びジグルタミン酸を両方とも含まない反応混合液での遊離リン酸濃度が測定された。
【００５６】
結果
以下の表１は、反応に供された単体アミノ酸ごとの遊離リン酸濃度と、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによるトリペプチド検出結果を示す。Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｘａａは、ジペプチドにアミノ酸単体又はその誘導体が連結した３個又は４個以上のアミノ酸からなるペプチドをさす。
【００５７】
【表１】
【００５８】
表１で「ＡＶＧ」は、それぞれのアミノ酸とジグルタミン酸とを含む反応混合液での遊離リン酸濃度を３回測定した平均値を表し、「−ＢＬＫ」は、ＡＶＧの遊離リン酸濃度から陰性対照（ＢＬＫ）の遊離リン酸濃度を減算した計算値を表す。塩基性アミノ酸であるアルギニン、リジン及びヒスチジンと、プロリンとを含む反応混合液ではトリペプチドは検出されなかったが、他のアミノ酸の単体を含む反応混合液ではトリペプチドが検出された。なお、システインを含む反応混合液では、合成されたトリペプチド分子２個がジスルフィド結合で連結された状態のトリペプチドの２量体のみが検出された。このＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳの解析結果は、遊離リン酸の測定結果とも一致していた。したがって、ＲｉｍＫ遺伝子産物には、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性があり、リボソームタンパク質合成反応の基質となる２０種類のアミノ酸の単体のうち、プロリン及び塩基性アミノ酸を除く他のアミノ酸を、ジグルタミン酸に連結できるので、基質特異性は広いことが明らかとなった。
【実施例９】
【００５９】
ＲｉｍＫ遺伝子産物によるペプチド合成反応の基質特異性（２）
本実施例では、ペプチドのＣ末端のグルタミン酸と単体アミノ酸との間でＲｉｍＫ遺伝子産物がペプチド結合を形成させる反応において、Ｃ末端から２番目のアミノ酸もグルタミン酸でなければならないかどうかが検討された。１２．５ｍＭのアルギニルグルタミン酸（Ａｒｇ−Ｇｌｕ、ＲＥ）と、グルタミン酸単体１２．５ｍＭと、１２．５ｍＭのＡＴＰと、１２．５ｍＭのＭｇＳＯ４と、０．５ｍｇ／ｍＬのＲｉｍＫ精製タンパク質と、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）とを含む反応混合液が調製され、３０°Ｃで２０時間のインキュベーションが行われた。反応後、前記反応混合液中の反応産物が実施例３と同様にしてＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって解析された。
【００６０】
結果
図６はＲｉｍＫ精製タンパク質によるアルギニルグルタミン酸（ＲＥ）からの反応産物のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図である。数字はグルタミン酸ポリマーの重合度を表し、ＲＥ７、ＲＥ８、・・・ＲＥ１４は、それぞれ、基質のアルギニルグルタミン酸にグルタミン酸が、６個、７個、・・・、１３個結合したペプチドにプロトン付加した分子量と一致するピークを表す。図６から、黒矢印のピークは、アルギニルグルタミン酸に６ないし１３個のポリグルタミン酸がペプチド結合してプロトン付加したアルギニルポリグルタミン酸と推察された。この結果から、ＲｉｍＫ遺伝子産物がペプチドのＣ末端にグルタミン酸を連結させる反応では、Ｃ末端から２番目のアミノ酸がグルタミン酸である必要はないことが明らかになった。
【００６１】
ポリグルタミン酸は、ハンチントン舞踏病その他のポリグルタミン酸病又はＣＡＧリピート病とよばれる遺伝性疾患の原因で、タンパク質内のグルタミン酸残基の繰り返し配列が異常に長くなるために、タンパク質の正常なフォールディングが阻害され、タンパク質の異常凝集を起こし、神経細胞死をもたらすと考えられている。ポリグルタミン酸によるタンパク質の異常凝集を軽減緩和する薬剤の開発のためには、ポリグルタミン酸に最小限の修飾を施したプローブが有用である。本発明のＲｉｍＫ遺伝子産物のジグルタミン酸へのアミノ酸リガーゼ活性は、かかるポリグルタミン酸プローブのようなポリグルタミン酸のＮ末端又はＣ末端にいずれかの修飾アミノ酸が連結した誘導体の調製に利用することができる。
【実施例１０】
【００６２】
ＲｉｍＫ遺伝子産物のポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性の熱安定性
ＲｉｍＫ遺伝子産物の酵素活性の熱安定性を検討するために、３０ないし６０°Ｃの範囲内で１５分間の加熱処理が施されたＲｉｍＫ精製タンパク質を０．５ｍｇ／ｍＬと、２５ｍＭのグルタミン酸と、１２．５ｍＭのＡＴＰと、１２．５ｍＭのＭｇＳＯ４と、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）とを含む反応混合液が調製され、３０°Ｃで２０時間インキュベーションされた。インキュベーション後の反応混合液中の遊離リン酸濃度が測定された。陽性対照として、未加熱のＲｉｍＫ精製タンパク質を含む反応混合液が用いられた。
【００６３】
結果
図７は、加熱処理の温度（横軸）と、各温度で加熱処理された酵素を含む反応混合液の遊離リン酸濃度を陽性対照の遊離リン酸濃度で除算した比活性（縦軸）との関係を示すグラフである。図６から明らかなとおり、ＲｉｍＫ精製タンパク質は６０°Ｃでは急激に失活したが、５５°Ｃ以下の温度での加熱処理に対しては非常に高い耐熱性を示した。したがって、ＲｉｍＫ遺伝子産物は工業的応用に適する。また、ポリグルタミン酸の粘性は温度上昇に伴って低下する。そこで、ポリグルタミン酸の粘度低下が起こる温度でも増殖可能な耐熱性微生物でＲｉｍＫ遺伝子産物を発現させることによって、より効率的にポリグルタミン酸を発酵生産することが可能になる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端アミノ酸がグルタミン酸であるペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有する組成物と、該組成物を用いるポリα−グルタミン酸の製造方法と、アミノ酸又はその誘導体がＣ末端に連結したペプチドの製造方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌ＲｉｍＫ遺伝子産物は、リボソームＳ６タンパク質（ＲｐｓＦ遺伝子産物）のＣ末端に複数個のグルタミン酸を付加する修飾酵素として知られている（非特許文献１）。本発明の発明者らは、遊離のグルタミン酸単体を基質としてポリα−グルタミン酸を合成するポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性と、ジグルタミン酸か、Ｃ末端アミノ酸がグルタミン酸であるペプチドかに広範な特異性でアミノ酸を連結するアミノ酸リガーゼ活性とがＲｉｍＫ遺伝子産物にはあることを発見した。本発明は、かかる発見に基づいて想到された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｋａｎｇら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１７：２８１−２８８（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ポリグルタミン酸には、グルタミン酸がγ位のカルボキシル基でペプチド結合により連結して重合したホモポリペプチド（ポリγ−グルタミン酸）と、グルタミン酸がα位のカルボキシル基でペプチド結合により連結して重合したホモポリペプチド（ポリα−グルタミン酸）とがある。前者のポリγ−グルタミン酸は納豆の粘りけの主成分であり、増粘剤、保湿剤、生体適合性材料等として知られている。これに対し、後者のポリα−グルタミン酸については、その性状が詳しく知られていない。これは、ポリα−グルタミン酸を大量合成することが困難なことが原因の１つである。そこで、工業的なポリα−グルタミン酸の大量合成技術を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性及び／又はアミノ酸リガーゼ活性を有する組成物を提供する。本発明のポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性及び／又はアミノ酸リガーゼ活性を有する組成物は、（１）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列によってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む。
【０００６】
本発明の組成物は、前記（１）ないし（６）のタンパク質からなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を発現する組換えベクターを含む形質転換体を含む場合がある。
【０００７】
本発明は、（１）本発明の組成物を用意するステップと、（２）前記組成物と、グルタミン酸とを接触させて、ポリα−グルタミン酸を合成させるステップとを含む、ポリα−グルタミン酸の製造方法を提供する。
【０００８】
本発明のポリα−グルタミン酸の製造方法は、ポリα−グルタミン酸の粘性を消失させる温度条件で実施される場合がある。
【０００９】
本発明はアミノ酸又はその誘導体がＣ末端に連結したペプチドの製造方法を提供する。本発明のペプチドの製造方法は、（１）本発明の組成物を用意するステップと、（２）グリシン、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなるグループから選択される少なくとも１種類のアミノ酸又はその誘導体と、ジグルタミン酸か、Ｃ末端アミノ酸がグルタミン酸であるペプチドかと、前記組成物とを接触させて、前記少なくとも１種類のアミノ酸かその誘導体かがＣ末端に連結したペプチドを合成させるステップとを含む。
【００１０】
本明細書において「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。また、「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、金属イオン、補酵素、アロステリックリガンドその他の原子、イオン、原子団か、他の「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かを共有結合又は非共有結合により結合又は会合している場合がある。
【００１１】
本明細書において「ポリアミノ酸」とは、１種類のアミノ酸がペプチド結合でつながったペプチドをいう。
【００１２】
本明細書でアミノ酸を表す場合、アスパラギン、グルタミン等の化合物名で表す場合と、Ａｓｎ、Ｇｌｎ等の慣用の３文字表記で表す場合とがある。化合物名で表す場合には、アミノ酸のα炭素に関する立体配置を示す接頭辞（又はＤ−）を用いて表す。慣用の３文字表記で表す場合には、該３文字表記は特に断りのない限りＬ体のアミノ酸を表す。本明細書において、アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基とが少なくとも１個の炭素原子を介して結合した化合物であって、ペプチド結合により重合することが可能ないずれかの化合物を指す。本明細書におけるアミノ酸は、グリシン、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる２０種類のアミノ酸（以下、「リボソームタンパク質合成反応の基質となる２０種類のアミノ酸の単体」という。）とこれらの立体異性体であるＤ−アミノ酸とを含むが、これらに限定されない、いずれかの天然又は非天然のアミノ酸を含む場合がある。
【００１３】
本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。本発明の酵素タンパク質は、活性を有することを条件として、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で、本発明のポリα−グルタミン酸や、アミノ酸又はその誘導体がＣ末端に連結したペプチドの製造方法に使用される場合がある。本発明の酵素タンパク質を前記宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系で発現させる場合には、前記タンパク質を発現する宿主生物、例えば本発明の形質転換体が生きた状態で本発明の製造に用いられる場合がある。このとき、本発明のポリグルタミン酸の製造は、休止菌体反応系や発酵法によって行うことができる。あるいは、前記タンパク質は、精製された状態で本発明のポリα−グルタミン酸や、アミノ酸又はその誘導体がＣ末端に連結したペプチドの製造方法に使用されてもよい。
【００１４】
配列番号１のヌクレオチド酸配列と、配列番号２のアミノ酸配列とは、それぞれ、大腸菌Ｋ１２株のＲｉｍＫ遺伝子のヌクレオチド配列と、大腸菌Ｋ１２株のＲｉｍＫ遺伝子産物のアミノ酸配列とである。配列番号２のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０００９６として登録されている。配列番号３及び４に列挙されるヌクレオチド配列は、それぞれ大腸菌ＲｉｍＫ遺伝子をＰＣＲ法で増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーである。
【００１５】
本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、本発明のヌクレオチド配列と、比較対象のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を本発明のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。同様に、本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、本発明のアミノ酸配列と、比較対象のアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、配列が一致するアミノ酸残基の数の合計を本発明のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。本発明のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。
【００１６】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドはアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化される。６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液で前洗浄される。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応は６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行われる。その後前記固相は１× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄され、０．２× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄される。最後に前記固相に残存するプローブの量が前記標識物質の定量により決定される。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。
【００１７】
本発明のタンパク質は、大腸菌ＲｉｍＫ遺伝子産物であって、（１）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列によってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質である。
【００１８】
本発明の融合タンパク質は、特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質のＮ末端又はＣ末端に連結したものである。
【００１９】
本発明の特異的結合タグペプチドは、前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質を調製する際に、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドである。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、本発明の融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。本発明の特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明の特異的結合タグは、融合タンパク質がポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を保持することを条件としていかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。
【００２０】
本発明のタンパク質のポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性は、本発明のタンパク質と、グルタミン酸単体と、ＡＴＰと適当な緩衝液とを含む反応混合液か、本発明のタンパク質と、アミノ酸単体と、ジグルタミン酸か、Ｃ末端アミノ酸がグルタミン酸であるペプチドかと、ＡＴＰと適当な緩衝液とを含む反応混合液かをインキュベーションすることにより生成した遊離リン酸を定量することにより評価される場合がある。前記ペプチドが、Ｃ末端アミノ酸はグルタミン酸であるが、そのアミノ基が連結するアミノ酸はグルタミン酸以外の場合であっても、前記反応混合液は遊離リン酸を生成する。したがって、本発明のタンパク質のアミノ酸リガーゼは、Ｃ末端がグルタミン酸のペプチドと特異的に反応するが、Ｃ末端から２個目のアミノ酸はグルタミン酸である必要はない。したがって、前記Ｃ末端がグルタミン酸のペプチドのＣ末端から２個目よりＮ末端側のアミノ酸は、メトキシ基のような官能基、ビオチンその他の特異的結合パートナーや、蛍光その他の発色団、Ｘ線その他の電磁放射線の透過特性に特徴のある原子団、ＥＳＲ等の生物物理学的な測定用のプローブ原子団等によって修飾されていてもかまわないし、ガラス、ラテックス、シリコン、プラスチック等の固体や、糖鎖その他のポリマーに共有結合によって連結されていてもかまわない。メトキシ基のような官能基、ビオチンその他の特異的結合パートナーや、蛍光その他の発色団、Ｘ線その他の電磁放射線の透過特性に特徴のある原子団、ＥＳＲ等の生物物理学的な測定用のプローブ原子団等による修飾は、本発明のタンパク質のポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を完全に阻害しないことを条件として、アミノ酸のいずれの原子に結合するものであってもかまわない。前記修飾は前記アミノ酸のＮ末端アミノ基を修飾することが好ましい。
【００２１】
本発明のタンパク質のポリα−グルタミン酸シンテターゼ反応では、単体のグルタミン酸のＣ末端カルボキシル基にグルタミン酸が連結される。すると、本発明のタンパク質のアミノ酸リガーゼ反応においても、Ｃ末端がグルタミン酸であるペプチドだけでなく、単体のグルタミン酸にもアミノ酸が連結されうると考えられる。ここで、本発明のタンパク質のポリα−グルタミン酸シンテターゼ及び／又はアミノ酸リガーゼ反応によりアミノ酸と連結されるグルタミン酸は、前記酵素反応を完全に阻害しないことを条件として、メトキシ基のような官能基、ビオチンその他の特異的結合パートナーや、蛍光その他の発色団、Ｘ線その他の電磁放射線の透過特性に特徴のある原子団、ＥＳＲ等の生物物理学的な測定用のプローブ原子団等により修飾されていてもかまわないし、ガラス、ラテックス、シリコン、プラスチック等の固体や、糖鎖その他のポリマーに共有結合によって連結されていてもかまわない。前記修飾は前記グルタミン酸のＮ末端アミノ基を修飾することが好ましい。
【００２２】
本発明の組成物において、前記アミノ酸リガーゼ活性は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端アミノ酸がグルタミン酸であるペプチドかのＣ末端にアミノ酸を連結する活性の場合がある。前記ジグルタミン酸か、Ｃ末端アミノ酸がグルタミン酸であるペプチドかのＣ末端に連結されるアミノ酸は、リボソームタンパク質合成反応の基質となる２０種類のアミノ酸のうち、アルギニン、リジン、ヒスチジン及びプロリンを除くいずれかのアミノ酸か、その誘導体かの場合がある。前記誘導体は、メトキシ基のような官能基、ビオチンその他の特異的結合パートナーや、蛍光その他の発色団、Ｘ線その他の電磁放射線の透過特性に特徴のある原子団、ＥＳＲ等の生物物理学的な測定用のプローブ原子団等が、リボソームタンパク質合成反応の基質となる２０種類のアミノ酸のうち、アルギニン、リジン、ヒスチジン及びプロリンを除くいずれかのアミノ酸に共有結合で連結された化合物の場合がある。前記アミノ酸の誘導体は、該アミノ酸のＣ末端のカルボキシル基が修飾されることが好ましい。
【００２３】
本発明のポリα−グルタミン酸や、ペプチドの解析は、ＨＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＲＯＦ−ＭＳ等のような当業者に周知の分析機器の使用により実施される場合がある。
【００２４】
本発明の製造方法のステップ（２）では、本発明の組成物に加えて、ｐＨ調整のための緩衝液成分を含む反応液を用いて実施される場合がある。好ましくは前記緩衝液成分としてＴｒｉｓＨＣｌが使用され、ｐＨは９．０〜１０．０に調整される場合がある。
【００２５】
本発明の製造方法のステップ（２）において反応混合液が所定の反応時間及び反応温度でインキュベーションされる。本発明の製造方法において、本発明の組成物、基質及び／又はＡＴＰの反応液中における濃度、反応液量、反応時間、反応温度、ｐＨその他の反応条件は、ポリα−グルタミン酸又はペプチドの目標とする製造量、平均分子量、多分散度及び収率と、製造に要する時間、費用、設備等と、その他の条件との関係で当業者により決定される場合がある。
【００２６】
本発明の製造方法で取得されるポリα−グルタミン酸及びペプチドは、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、凍結乾燥等のような当業者に周知の操作の組合せにより回収される場合がある。また、本発明の製造方法で取得されるポリα−グルタミン酸及びトリペプチドは、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＲＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲ等のような当業者に周知の分析技術を使用して重合度、構造等を評価される場合がある。
【００２７】
本明細書において「組換えベクター」とは、本発明のタンパク質を宿主生物において発現させるために使用される、前記タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターである。
【００２８】
本明細書において「ベクター」とは、本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、本発明のタンパク質を該宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子であり、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等を含むがこれらに限定されない。好ましくは、前記ベクターはプラスミドの場合がある。さらに好ましくは、前記ベクターは、ｐＥＴ−２１ａ（＋）プラスミドの場合がある。
【００２９】
本発明の組換えベクターは、制限酵素、ＤＮＡ連結酵素等を使用する当業者に周知の遺伝子工学手法を用いて本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドといずれかのベクターとを連結することにより作製される場合がある。
【００３０】
本明細書において「形質転換体」とは、本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターが導入され、該所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった生物である。
【００３１】
本明細書において「宿主生物」とは、形質転換体の作製において、本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターが導入される生物である。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。前記宿主生物は大腸菌の場合がある。
【００３２】
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターをいずれかの適切な宿主生物に導入することにより作製される。組換えベクターの導入は、電気刺激で細胞膜に空隙を作るエレクトロポレーション法、カルシウムイオン処理と併せて行うヒートショック法等を含む当業者に周知のさまざまな手法により実施される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図。
【図２】ＲｉｍＫ反応産物精製標品と、合成ポリα−グルタミン酸と、合成ポリγ−グルタミン酸とを前記酸加水分解処理に供する前後のサンプルと、グルタミン酸単体とをＴＬＣ分析した結果図。
【図３Ａ】ＲｉｍＫ反応産物精製標品のＭＡＬＤＩ−ＲＯＦ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図。
【図３Ｂ】図３Ａのスペクトル図のｍ／ｚ値が４，０００ないし４，５００の範囲の縦軸を拡大したスペクトル図。
【図４Ａ】ＲｉｍＫ反応産物のＮＭＲスペクトルのケミカルシフト１．７−２．５の範囲の拡大したスペクトル図。
【図４Ｂ】合成ポリα−グルタミン酸（Ｐｏｌｙ−α−Ｇｌｕ）のＮＭＲスペクトルのケミカルシフト１．７−２．５の範囲の拡大したスペクトル図。
【図４Ｃ】合成ポリγ−グルタミン酸Ｐｏｌｙ−γ−Ｇｌｕ）のＮＭＲスペクトルのケミカルシフト１．７−２．５の範囲の拡大したスペクトル図。
【図４Ｄ】γ−ジグルタミン酸（γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のＮＭＲスペクトルのケミカルシフト１．７−２．５の範囲の拡大したスペクトル図。
【図５】ＲｉｍＫ遺伝子産物を発現する大腸菌の無細胞抽出液のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図。
【図６】ＲｉｍＫ精製タンパク質によるアルギニルグルタミン酸（ＲＥ）からの反応産物のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図。
【図７】加熱処理の温度（横軸）と、各温度で加熱処理された酵素を含む反応混合液の遊離リン酸濃度を陽性対照の遊離リン酸濃度で除算した比活性（縦軸）との関係を示すグラフ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
大腸菌ＲｉｍＫタンパク質をエンコードする遺伝子のクローニング、導入及び発現
（ＲｉｍＫ遺伝子の増幅）
大腸菌Ｋ１２株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び４に列挙されるヌクレオチド配列からなるそれぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、大腸菌ＲｉｍＫ遺伝子が増幅された。得られた増幅産物は、配列番号３のヌクレオチド配列と、配列番号１のヌクレオチド配列のうち第２４番目から第８８３番目のヌクレオチド配列と、配列番号４のヌクレオチド配列の逆相補体配列とがこの順に５’末端から３’末端まで連結されたヌクレオチド配列からなる２本鎖ＤＮＡであった。
【００３６】
（組換えプラスミドの取得）
前記ＰＣＲ反応の増幅産物をインサート用ＤＮＡと、ベクターであるｐＥＴ−２１ａ（＋）とが、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩにより切断された。切断産物は、精製後、連結されて、発現ベクターｐＥＴＲｉｍＫが得られた。ｐＥＴＲｉｍＫは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入された。発現ベクターｐＥＴＲｉｍＫは、ＲｉｍＫ遺伝子産物のＣ末端にＨｉｓタグが連結した融合タンパク質を発現する。
【００３７】
（目的の遺伝子の発現）
発現ベクターｐＥＴＲｉｍＫが形質転換された大腸菌は、５０μｇ／ｍＬ アンピシリンを添加したＬＢ液体培地３ｍＬに接種され、３７°Ｃ、１５０ｒｐｍで５時間振とう培養された。その後、前記液体培地１ｍＬが５０μｇ／ｍＬ アンピシリンを添加した新鮮なＬＢ液体培地１００ｍＬに接種され、３７°Ｃ、１２０ｒｐｍで１ないし２時間振とう培養された。そして、終濃度が０．１ｍＭとなるようにイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が添加され、２５°Ｃ、１２０ｒｐｍで終夜培養され、遺伝子発現が誘導された。培養菌体は、遠心分離により集菌され、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁された。前記懸濁液は、超音波破砕後、遠心分離により残渣が除去され、上清が無細胞抽出液として回収された。ＲｉｍＫ遺伝子産物のＣ末端にＨｉｓタグが連結した融合タンパク質は、Ｎｉ−アフィニティーカラム（Ｈｉｓ−ｔｒａｐ、ＧＥヘルスケア）で精製後、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア）で脱塩され、酵素反応用精製タンパク質として用いられた（以下、「ＲｉｍＫ精製タンパク質」という）。
【実施例２】
【００３８】
ＲｉｍＫ精製タンパク質の酵素活性
材料及び方法
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と、２５ｍＭのアミノ酸基質と、１２．５ｍＭのＡＴＰと、１２．５ｍＭのＭｇＳＯ４と、０．５ｍｇ／ｍＬのＲｉｍＫ精製タンパク質とを含む反応混合液が調製された。前記アミノ酸基質として、リボソームタンパク質合成反応の基質となる２０種類のアミノ酸の単体のうちいずれか１種類が用いられた。したがって本実施例では、前記アミノ酸のそれぞれを含む反応混合液合計２０種類が調製された。それぞれの反応混合液は３０°Ｃで２０時間インキュベートされた。ペプチドが生成する際にはＡＴＰがＡＤＰとリン酸（Ｐｉ）に加水分解されることから、インキュベーション後の前記反応混合液中の遊離リン酸量がＤｅｔｅｒｍｉｎｅｒ Ｌ ＩＰ（協和メディックス）を用いて測定された。陰性対照として、アミノ酸基質を含まない反応混合液が用いられた。ＲｉｍＫタンパク質は大腸菌リボソームＳ６タンパク質（ＲｐｓＦ）のＣ末端にグルタミン酸を付加する活性を有することが知られている。そこで、ＲｐｓＦのＮ末端にＨｉｓタグが連結された融合タンパク質（以下、「ＲｐｓＦ精製タンパク質」という。）の精製標品を別途調製し、これを０．５ｍｇ／ｍＬ含む反応混合液が陽性対照として用いられた。
【００３９】
結果
ＲｉｍＫの生体内での基質であるＲｐｓＦ精製タンパク質は含まないで、アミノ酸基質のグルタミン酸だけを含む反応混合液において、３．１ｍＭの遊離リン酸が検出された。ＲｐｓＦにグルタミン酸を付加させる反応を行う陽性対照の反応混合液では、３．３ｍＭの遊離リン酸が検出された。ＲｐｓＦ精製タンパク質を含む反応混合液であっても、グルタミン酸のかわりにアスパラギン酸を含む反応混合液では１．５ｍＭの遊離リン酸しか検出されなかった。また、ＲｐｓＦ精製タンパク質は含むがアミノ酸基質を含まない反応混合液でも、１．６ｍＭの遊離リン酸が検出された。ＲｐｓＦ精製タンパク質は含まないが、プロリンを含む反応混合液では、０．１ｍＭしか遊離リン酸が検出されなかった。ＲｐｓＦ精製タンパク質は含まず、かつ、グルタミン酸及びプロリン以外の他のアミノ酸基質を含む反応混合液では、１．０ｍＭないし１．５ｍＭの遊離リン酸が検出された。アミノ酸基質を含まない陰性対照でも、１．５ｍＭ程度の遊離リン酸が検出された。そこでＲｉｍＫ精製タンパク質は、ＲｐｓＦ精製タンパク質が存在しなくても、遊離グルタミン酸特異的にＡＴＰを消費する反応を行うことが示された。ＲｉｍＫは大腸菌菌体内でＲｐｓＦにグルタミン酸を最大４個重合付加することが知られているが、本実施例の結果から、ＲｉｍＫは、タンパク質基質であるＲｐｓＦが存在しなくても単体のグルタミン酸を重合できる可能性が示唆された。
【実施例３】
【００４０】
ＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物の解析（１）
ＲｉｍＫによる反応産物の構造解析のために、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０−１０．０）中に、２０ｍＭのグルタミン酸と、２０ｍＭのＡＴＰと、２０ｍＭのＭｇＳＯ４と、０．５ｍｇ／ｍＬのＲｉｍＫ精製タンパク質とを含む反応混合液が調製され、３０°Ｃで２０時間インキュベーションされた。
【００４１】
ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， カリフォルニア州、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）のＨＰＬＣと、ＬＣＱ Ｄｅｃａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州、Ｗａｌｔｈａｍ）のＥＳＩ−ＭＳとから構成される。カラムは、Ｗａｔｅｒｓ社のＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８（５ｍｍ、４．６×１５０ｍｍ）が用いられた。溶離液にはＡ液として５０ｍＭのギ酸、Ｂ液としてアセトニトリルが用いられ、毎分１．０ｍＬの流速で、溶出開始後最初の２分はＡ液１００％が流され、その後７分間かけてＡ液にＢ液を混合させてＡ液１００％からＢ液１００％に移行しながら流され、その後６分間はＢ液１００％で流された。次に６秒間でＢ液からＡ液に切り替えられ、溶出開始後２０分までＡ液１００％が流された。
【００４２】
結果
図１はＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図である。太字のｎはグルタミン酸ポリマーの重合度を表し、各ポリマーにプロトン付加した分子量と一致するピークを黒矢印で表し、該ピークから水分子が抜けた分子量に相当するピークを灰色矢印で表す。図１から、黒矢印のピークは、グルタミン酸４ないし１２個がペプチド結合してプロトン付加したポリグルタミン酸と推察された。
【実施例４】
【００４３】
ＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物の解析（２）
ＲｉｍＫによる反応産物のさらなる構造解析用に多量の反応産物を得るために、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）中に、４０ｍＭのグルタミン酸と、４０ｍＭのＡＴＰと、４０ｍＭのＭｇＳＯ４と、１．０ｍｇ／ｍＬのＲｉｍＫ精製タンパク質とを含む反応混合液が調製され、３０°Ｃで２０時間インキュベーションされた。
【００４４】
実施例３からＲｉｍＫによるグルタミン酸の反応産物がポリグルタミン酸であることが推察されたので、エタノール沈殿法により前記反応産物が精製された。すなわち、前記反応混合液はインキュベーション後に煮沸され、遠心分離によりタンパク質が除去され、上清に５分の１量の５Ｍ ＮａＣｌが添加され、よく攪拌された。さらに２倍量のエタノールが添加され、攪拌された。得られた沈殿物が少ないときには、−８０°Ｃで２０分間冷却された。その後沈殿物（以下、「ＲｉｍＫ反応産物精製標品」という。）が遠心分離により回収された。典型的には、３ｍＬの反応混合液から約４０ｍｇの沈殿物が得られた。
【００４５】
酸加水分解処理によってポリマーを構成するモノマー成分を分析するために、ＲｉｍＫ反応産物精製標品と、合成ポリα−グルタミン酸（分子量７００−５，０００、和光純薬）と、合成ポリγ−グルタミン酸（分子量２００，０００−５００，０００、和光純薬）とが６Ｎ塩酸に懸濁され、９５°Ｃ、２４時間インキュベーションされた。その後ＮａＯＨで中和され、ＴＬＣ分析に供された。
【００４６】
結果
図２は、ＲｉｍＫ反応産物精製標品と、合成ポリα−グルタミン酸と、合成ポリγ−グルタミン酸とを前記酸加水分解処理に供する前後のサンプルと、グルタミン酸単体とをＴＬＣ分析した結果図である。図２に示されるとおり、ＲｉｍＫ反応産物精製標品は、合成ポリα−グルタミン酸及び合成ポリγ−グルタミン酸と同様に、酸加水分解処理によりグルタミン酸を遊離した。これにより、ＲｉｍＫ反応産物精製標品はポリグルタミン酸であることが示された。
【実施例５】
【００４７】
ＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物の解析（３）
実施例３のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ解析では、ｍ／ｚ値２，０００が測定限界であった。そこで、より測定限界のｍ／ｚ値が高いＭＡＬＤＩ−ＲＯＦ−ＭＳシステムによりＲｉｍＫ反応産物精製標品が解析された。ＭＡＬＤＩ−ＲＯＦ−ＭＳシステムはａｕｔｏｆｌｅｘＩＩＩ（ＢＲＵＫＥＲ）が用いられ、ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）がマトリックスとして用いられた。サンプルは前記マトリックスと混合され、プレートに滴下され、風乾後、測定に供された。
【００４８】
結果
図３Ａは、ＲｉｍＫ反応産物精製標品のＭＡＬＤＩ−ＲＯＦ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図である。各ピーク上の数字はグルタミン酸の重合度を示す。図３Ｂは、ｍ／ｚ値が４，０００ないし４，５００の範囲の縦軸を拡大したスペクトル図である。図３Ａ及びＢに示されるとおり、ＲｉｍＫ反応産物精製標品は分子量１，０００−４，３００のポリグルタミン酸として検出された。
【００４９】
図３Ａ及びＢのスペクトル図で観測されるＲｉｍＫ反応産物精製標品のピークの実測値は、重合度８ないし３３においてポリグルタミン酸のプロトン付加分子量の計算値と一致した。したがって、ＲｉｍＫによるグルタミン酸の反応産物はポリグルタミン酸であることが確認された。
【実施例６】
【００５０】
ＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物の解析（４）
グルタミン酸にはカルボキシル基がα−位とγ−位と２個存在する。そこで、ＲｉｍＫによるグルタミン酸の反応産物のポリグルタミン酸では、どちらのカルボキシル基が隣接するグルタミン酸のアミノ基とペプチド結合しているかという結合様式がＮＭＲ解析により決定された。
【００５１】
ＮＭＲ解析にはＡＶＡＮＣＥ５００（Ｂｒｕｋｅｒ社）が用いられ、エタノール沈殿により精製されたＲｉｍＫ反応産物精製標品がＤ２Ｏに溶解されて解析に供された。標準試薬として、合成ポリα−グルタミン酸（分子量７００−５，０００、和光純薬）と、合成ポリγ−グルタミン酸（分子量２００，０００−５００，０００、和光純薬）と、γ−ジグルタミン酸（ペプチド研究所）とが用いられた。
【００５２】
結果
図５ＡないしＤは、それぞれ、ＲｉｍＫ反応産物、合成ポリα−グルタミン酸（Ｐｏｌｙ−α−Ｇｌｕ）、合成ポリγ−グルタミン酸Ｐｏｌｙ−γ−Ｇｌｕ）及びγ−ジグルタミン酸（γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のＮＭＲスペクトルのケミカルシフト１．７−２．５の範囲の拡大したスペクトル図である。図５ＡないしＤから明かなとおり、ＲｉｍＫ反応産物のＮＭＲスペクトルのケミカルシフト１．７−２．５の範囲で検出される３本のピークの位置及び形状が、合成ポリα−グルタミン酸のものとよく一致した。したがって、ＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物は、グルタミン酸がα位のカルボキシル基でペプチド結合により連結して重合したホモポリペプチドであり、ＲｉｍＫ遺伝子産物にはポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性があるとの結論が得られた。
【実施例７】
【００５３】
ポリα−グルタミン酸の発酵生産
実施例１で説明された手順にしたがって、ＲｉｍＫ遺伝子産物の融合タンパク質を発現するプラスミドベクターｐＥＴＲｉｍＫで形質転換された組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株が５０μｇ／ｍＬ アンピシリンを添加したＬＢ液体培地で培養され、ＩＰＴＧによってＲｉｍＫ遺伝子産物の発現が誘導された。培養菌体は、遠心分離により集菌され、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁された。前記懸濁液は、超音波破砕後、遠心分離により残渣が除去され、上清が無細胞抽出液として回収された。前記無細胞抽出液は１０分間煮沸され、遠心分離によって除タンパクされてから、実施例３で説明されたＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって解析された。
【００５４】
結果
図５は、ＲｉｍＫ遺伝子産物を発現する大腸菌の無細胞抽出液のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図である。実施例２でＲｉｍＫ精製タンパク質によるグルタミン酸からの反応産物としてポリα−グルタミン酸が検出された保持時間５．９ないし６．１分の範囲内で、グルタミン酸の５量体及び７量体のそれぞれにプロトン付加した分子量６６４及び９２２のピークが検出された。これにより、組換え大腸菌の菌体内でもポリα-グルタミン酸が蓄積していることが確認された。
【実施例８】
【００５５】
ＲｉｍＫ遺伝子産物によるペプチド合成反応の基質特異性（１）
ＲｉｍＫ遺伝子産物の生体内での生体内での基質であるＲｐｓＦのＣ末端には２個のグルタミン酸残基が連続している。そこで、ＲｉｍＫ遺伝子産物がアミノ酸又はペプチドの末端カルボキシル基と単体アミノ酸のアミノ基との間でペプチド結合を形成させる際に、カルボキシル基についてはグルタミン酸のα位のカルボキシル基に特異性があることは明かであるが、アミノ基については特定のアミノ酸だけしか利用できない基質特異性があるか否かは検討の余地がある。そこで、１２．５ｍＭのジグルタミン酸（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）と、リボソームタンパク質合成反応の基質となる２０種類のアミノ酸の単体いずれか１種類（Ｘａａ）１２．５ｍＭと、１２．５ｍＭのＡＴＰと、１２．５ｍＭのＭｇＳＯ４と、０．５ｍｇ／ｍＬのＲｉｍＫ精製タンパク質と、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）とを含む反応混合液が調製されて、３０°Ｃで２０時間のインキュベーションが行われた。反応後、各反応混合液中の遊離リン酸が実施例２と同様にして測定され、反応産物が実施例３と同様にしてＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって解析された。陰性対照（ＢＬＫ）として、前記アミノ酸の単体及びジグルタミン酸を両方とも含まない反応混合液での遊離リン酸濃度が測定された。
【００５６】
結果
以下の表１は、反応に供された単体アミノ酸ごとの遊離リン酸濃度と、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによるトリペプチド検出結果を示す。Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｘａａは、ジペプチドにアミノ酸単体又はその誘導体が連結した３個又は４個以上のアミノ酸からなるペプチドをさす。
【００５７】
【表１】
【００５８】
表１で「ＡＶＧ」は、それぞれのアミノ酸とジグルタミン酸とを含む反応混合液での遊離リン酸濃度を３回測定した平均値を表し、「−ＢＬＫ」は、ＡＶＧの遊離リン酸濃度から陰性対照（ＢＬＫ）の遊離リン酸濃度を減算した計算値を表す。塩基性アミノ酸であるアルギニン、リジン及びヒスチジンと、プロリンとを含む反応混合液ではトリペプチドは検出されなかったが、他のアミノ酸の単体を含む反応混合液ではトリペプチドが検出された。なお、システインを含む反応混合液では、合成されたトリペプチド分子２個がジスルフィド結合で連結された状態のトリペプチドの２量体のみが検出された。このＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳの解析結果は、遊離リン酸の測定結果とも一致していた。したがって、ＲｉｍＫ遺伝子産物には、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性があり、リボソームタンパク質合成反応の基質となる２０種類のアミノ酸の単体のうち、プロリン及び塩基性アミノ酸を除く他のアミノ酸を、ジグルタミン酸に連結できるので、基質特異性は広いことが明らかとなった。
【実施例９】
【００５９】
ＲｉｍＫ遺伝子産物によるペプチド合成反応の基質特異性（２）
本実施例では、ペプチドのＣ末端のグルタミン酸と単体アミノ酸との間でＲｉｍＫ遺伝子産物がペプチド結合を形成させる反応において、Ｃ末端から２番目のアミノ酸もグルタミン酸でなければならないかどうかが検討された。１２．５ｍＭのアルギニルグルタミン酸（Ａｒｇ−Ｇｌｕ、ＲＥ）と、グルタミン酸単体１２．５ｍＭと、１２．５ｍＭのＡＴＰと、１２．５ｍＭのＭｇＳＯ４と、０．５ｍｇ／ｍＬのＲｉｍＫ精製タンパク質と、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）とを含む反応混合液が調製され、３０°Ｃで２０時間のインキュベーションが行われた。反応後、前記反応混合液中の反応産物が実施例３と同様にしてＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって解析された。
【００６０】
結果
図６はＲｉｍＫ精製タンパク質によるアルギニルグルタミン酸（ＲＥ）からの反応産物のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる解析結果を示すスペクトル図である。数字はグルタミン酸ポリマーの重合度を表し、ＲＥ７、ＲＥ８、・・・ＲＥ１４は、それぞれ、基質のアルギニルグルタミン酸にグルタミン酸が、６個、７個、・・・、１３個結合したペプチドにプロトン付加した分子量と一致するピークを表す。図６から、黒矢印のピークは、アルギニルグルタミン酸に６ないし１３個のポリグルタミン酸がペプチド結合してプロトン付加したアルギニルポリグルタミン酸と推察された。この結果から、ＲｉｍＫ遺伝子産物がペプチドのＣ末端にグルタミン酸を連結させる反応では、Ｃ末端から２番目のアミノ酸がグルタミン酸である必要はないことが明らかになった。
【００６１】
ポリグルタミン酸は、ハンチントン舞踏病その他のポリグルタミン酸病又はＣＡＧリピート病とよばれる遺伝性疾患の原因で、タンパク質内のグルタミン酸残基の繰り返し配列が異常に長くなるために、タンパク質の正常なフォールディングが阻害され、タンパク質の異常凝集を起こし、神経細胞死をもたらすと考えられている。ポリグルタミン酸によるタンパク質の異常凝集を軽減緩和する薬剤の開発のためには、ポリグルタミン酸に最小限の修飾を施したプローブが有用である。本発明のＲｉｍＫ遺伝子産物のジグルタミン酸へのアミノ酸リガーゼ活性は、かかるポリグルタミン酸プローブのようなポリグルタミン酸のＮ末端又はＣ末端にいずれかの修飾アミノ酸が連結した誘導体の調製に利用することができる。
【実施例１０】
【００６２】
ＲｉｍＫ遺伝子産物のポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性の熱安定性
ＲｉｍＫ遺伝子産物の酵素活性の熱安定性を検討するために、３０ないし６０°Ｃの範囲内で１５分間の加熱処理が施されたＲｉｍＫ精製タンパク質を０．５ｍｇ／ｍＬと、２５ｍＭのグルタミン酸と、１２．５ｍＭのＡＴＰと、１２．５ｍＭのＭｇＳＯ４と、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）とを含む反応混合液が調製され、３０°Ｃで２０時間インキュベーションされた。インキュベーション後の反応混合液中の遊離リン酸濃度が測定された。陽性対照として、未加熱のＲｉｍＫ精製タンパク質を含む反応混合液が用いられた。
【００６３】
結果
図７は、加熱処理の温度（横軸）と、各温度で加熱処理された酵素を含む反応混合液の遊離リン酸濃度を陽性対照の遊離リン酸濃度で除算した比活性（縦軸）との関係を示すグラフである。図６から明らかなとおり、ＲｉｍＫ精製タンパク質は６０°Ｃでは急激に失活したが、５５°Ｃ以下の温度での加熱処理に対しては非常に高い耐熱性を示した。したがって、ＲｉｍＫ遺伝子産物は工業的応用に適する。また、ポリグルタミン酸の粘性は温度上昇に伴って低下する。そこで、ポリグルタミン酸の粘度低下が起こる温度でも増殖可能な耐熱性微生物でＲｉｍＫ遺伝子産物を発現させることによって、より効率的にポリグルタミン酸を発酵生産することが可能になる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（２）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（３）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（４）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（５）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列によってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含むことを特徴とする、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性及び／又はアミノ酸リガーゼ活性を有する組成物。
【請求項２】
（１）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（２）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性及び／又はアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（３）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性及び／又はアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（４）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性及び／又はアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（５）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列によってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性及び／又はアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を発現する組換えベクターを含む形質転換体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
（１）請求項１又は２に記載の組成物を用意するステップと、
（２）前記組成物と、グルタミン酸とを接触させて、ポリα−グルタミン酸を合成させるステップとを含むことを特徴とする、ポリα−グルタミン酸の製造方法。
【請求項４】
（１）請求項１又は２に記載の組成物を用意するステップと、
（２）グリシン、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなるグループから選択される少なくとも１種類のアミノ酸又はその誘導体と、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかと、前記組成物とを接触させて、前記少なくとも１種類のアミノ酸かその誘導体かがＣ末端に連結したペプチドを合成させるステップとを含むことを特徴とする、アミノ酸又はその誘導体がＣ末端に連結したペプチドの製造方法。
【請求項１】
（１）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（２）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（３）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（４）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（５）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列によってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性、及び／又は、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかへのアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含むことを特徴とする、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性及び／又はアミノ酸リガーゼ活性を有する組成物。
【請求項２】
（１）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（２）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性及び／又はアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（３）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性及び／又はアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（４）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性及び／又はアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（５）配列番号２のアミノ酸配列のうち第２番目から第３００番目のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列によってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ポリα−グルタミン酸シンテターゼ活性及び／又はアミノ酸リガーゼ活性を有するタンパク質と、
（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を発現する組換えベクターを含む形質転換体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
（１）請求項１又は２に記載の組成物を用意するステップと、
（２）前記組成物と、グルタミン酸とを接触させて、ポリα−グルタミン酸を合成させるステップとを含むことを特徴とする、ポリα−グルタミン酸の製造方法。
【請求項４】
（１）請求項１又は２に記載の組成物を用意するステップと、
（２）グリシン、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなるグループから選択される少なくとも１種類のアミノ酸又はその誘導体と、ジグルタミン酸か、Ｃ末端にグルタミン酸残基が少なくとも１個存在するペプチドかと、前記組成物とを接触させて、前記少なくとも１種類のアミノ酸かその誘導体かがＣ末端に連結したペプチドを合成させるステップとを含むことを特徴とする、アミノ酸又はその誘導体がＣ末端に連結したペプチドの製造方法。
【図１】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−２２９４１６（Ｐ２０１１−２２９４１６Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１００２８８（Ｐ２０１０−１００２８８）
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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