ポリエチレングリコールおよび尿素による免疫反応増強方法
【課題】抗原と抗体との反応を増強し、これを適用した免疫測定等では測定感度を向上できる、抗原抗体反応の増強方法を提供する。
【解決手段】抗原と抗体とをポリエチレングリコール及び尿素の共存下で反応させる方法と、当該方法を実施するための、抗原又は抗体のいずれか、ポリエチレングリコール及び尿素を含む試薬により前記課題を解決する。
【解決手段】抗原と抗体とをポリエチレングリコール及び尿素の共存下で反応させる方法と、当該方法を実施するための、抗原又は抗体のいずれか、ポリエチレングリコール及び尿素を含む試薬により前記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原と抗体との反応を増強する方法に関するものである。本発明よれば、臨床診断の分野において常用されている抗体と抗原（当該抗体によって認識される物質）との反応を利用する免疫測定において、抗体と抗原との免疫反応を増強することで、高感度に検体（免疫測定の対象となる患者由来の血清、血漿等の血液由来成分や、尿等の、生体試料）中の抗原を検出する方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
低濃度のポリエチレングリコールを共存させることにより、免疫反応を促進する技術は公知である（例えば特許文献１）。一方、尿素に関しては、難水溶性蛋白質の処理剤としての利用例や、感染症に関する自己抗体を検出するための免疫反応における非特異抗体結合低減剤としての利用例が報告されている（例えば非特許文献１から３）。
【０００３】
【特許文献１】特開平７−１８１１８２号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５２、９５−１０４、１９９５年
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．８、１６−２１、１９９４年
【非特許文献３】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３３、１００−１０５、１９９１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前述の通り、特許文献１では、ポリエチレングリコールを共存させることにより、免疫反応を促進することが開示されている。しかし、特許文献１に開示されているのは、１％（重量／重量）に満たない、極めて低濃度のポリエチレングリコールを共存させる技術である。これは、高濃度のポリエチレングリコールの共存は蛋白質の沈殿を引き起こし、結果的に免疫反応を生じさせることが困難になり、測定結果の再現性が失われる可能性があり、また、高濃度のポリエチレングリコールの共存は抗原特異的反応と同時に非特異的反応の反応性をも上昇させるため、Ｓ／Ｎ比（抗原特異的反応によるシグナル／非特異的シグナルの比）で考えると、大きな性能（測定精度）向上は期待できない。
【０００５】
一方、尿素については、非特許文献はいずれも尿素を非特異抗体結合低減剤として利用することしか開示していない。
【０００６】
抗原と抗体との免疫反応を利用する免疫測定等では、測定感度は非常に重要な因子である。従って本発明は、抗原と抗体との反応を増強し、これを適用した免疫測定等では測定感度を向上できる、抗原抗体反応の増強方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
免疫測定等により、検体中に含まれる微量成分を定量することによる病気の診断がなされているが、検体中の微量成分をより高感度に検出するために様々な手法が行われている。本発明者は、かかる免疫測定における高感度化ついて鋭意研究を重ねた結果、免疫反応促進剤であるポリエチレングリコールを、単独ではなく、尿素と共に使用することで、抗原と抗体との免疫反応を増強し、免疫測定等における測定感度を向上し得ることを知見し、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、抗原抗体反応を増強する方法であって、抗原と抗体とをポリエチレングリコール及び尿素の共存下で反応させる方法である。また本発明は、抗原抗体反応を増強する試薬であって、抗原又は抗体のいずれか、ポリエチレングリコール及び尿素を含む試薬である。免疫測定に適用した場合を例として、以下、本発明の方法及び試薬を詳細に説明する。
【０００８】
本発明では、抗原と抗体との反応を利用した免疫測定において、抗原と抗体とをポリエチレングリコール及び尿素の共存下で反応させる。いかなる順序により抗原、抗体、ポリエチレングリコール及び尿素を混合して共存せしめるかについて、本発明では特に制限はない。例えば、抗原と抗体とを混合して免疫反応を開始し、速やかにポリエチレングリコールと尿素を順次、又は予め混合しておくことで同時に、添加しても良い。抗原と抗体との反応は迅速に生じることから、本発明による免疫反応の増強効果（免疫測定に適用した場合の測定感度の向上）という効果を最大限引き出すためには、抗原と抗体との免疫反応が開始される瞬間からポリエチレングリコール及び尿素の両者を共存させておくことが好ましい。このためには、例えば、抗原又は抗体のいずれか一方に、ポリエチレングリコール及び尿素の両方を予め混合しておき、これを抗原又は抗体の他方と混合することが例示できる。この好ましい例では、ポリエチレングリコールと尿素の共存が、前記混合液の一定量を添加するという単一の操作によって実施できるという意味においても、特に好ましい。
【０００９】
例えば免疫測定が、（１）対象サンプルと担体に固定した抗体との反応、（２）いわゆるＢ／Ｆ分離、（３）分離された担体と標識を結合した抗体の反応、の順で実施されるいわゆる２ステップサンドイッチ法である場合、ポリエチレングリコールと尿素は、（１）又は（３）のいずれかの反応の際に共存させれば一定の効果を得ることができるが、測定感度の向上等、本発明の効果を最大限引き出すためには（１）と（３）の両方の反応の際に共存させることが好ましい。そのような意味においては、対象サンプル、担体に固定した抗体及び標識を結合した抗体を１段階で反応させる１段階サンドイッチ法又はこれに類する測定法であれば、その反応の際にポリエチレングリコールと尿素を共存させるのみで発明の効果を最大限引き出すことができ、また操作に要するステップ数も減少できることから、特に好ましい。
【００１０】
本発明は、従来から実施されている免疫測定に、特別の制限なしに適用することができる。本発明を適用し得る免疫測定として、例えば、酵素標識、アイソトープ標識、蛍光標識又は発光標識等を利用する、競合法、サンドイッチ法又は蛍光偏光法等による測定を例示することができる。またホモジニアス測定法や表面プラズモン共鳴分析法を利用した結合測定等に適用することも可能である。
【００１１】
本発明における抗体とは、抗原性物質に対してヒト、マウス、ウサギ、ヤギその他が産生するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでも良い。抗原は、当該抗体が特異的に識別し結合する相手方であり、特定の疾病に関連する生体蛋白、ホルモン等の他、環境ホルモン等であっても良い。また場合によっては抗体そのものも「抗原」として本発明の対象とすることができる。
【００１２】
ポリエチレングリコールとしては平均分子量が種々のものが市販されているが、本発明では分子量に特別の制限はない。使用するポリエチレングリコールの量（共存させるポリエチレングリコールの濃度）についても特に制限はなく、抗原と抗体との反応を生じさせる溶液中における濃度（最終濃度）で１〜１０％（重量／重量）とすれば良い。ポリエチレングリコールの終濃度については、その分子量により最適な範囲があるため、本発明の実施に先立って具体的な条件を設定して予備的実験を行って決定することが特に好ましい。一例を説明すると、本発明者の知見によれば、平均分子量が６０００のポリエチレングリコールを使用する場合、最終濃度を３〜７％とすることにより、本発明の効果を最大限引き出すことが可能である。
【００１３】
尿素については、抗原と抗体との反応を生じさせる溶液中における濃度（最終濃度）で１〜４モル／リットルとすれば良いが、使用するポリエチレングリコールの使用濃度等を考慮して決定することが好ましい。例えば、本発明者の知見によれば、分子量６０００のポリエチレングリコールを最終濃度５％で使用する場合、最終濃度を２〜４モル／リットル、特に好ましくは３モル／リットルとすることにより、本発明の効果を最大限引き出すことが可能である。
【００１４】
前述したように、ポリエチレングリコールと尿素を予め混合しておき、これを検体等と混合する場合、当該混合液は、上述した最終濃度の２倍の濃度で調製しておき、検体と１：１で混合する等することが例示できる。ポリエチレングリコールと尿素の混合液は、１０ｍＭ程度のＴｒｉｓ−ＨＣｌ等を添加して、抗原と抗体との反応に支障のないｐＨ８程度のｐＨ領域とし、更には非特異的反応を回避するため０．１％（重量／重量）程度の界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ２０等）を加えておくことが好ましい。
【００１５】
本発明の方法を、例えば免疫測定に適用する際には、通常の免疫測定を実施するための各種試薬に加え、ポリエチレングリコールと尿素を含む試薬セットを用いる。ポリエチレングリコールと尿素は、それぞれ別個の容器に保持して前記試薬セットの構成物としても良いが、両者を共存させることによって変質等が生じることもないため、両者を混合した状態とすることが好ましい。具体的には、抗原抗体反応に関わる抗原又は抗体の一方、ポリエチレングリコール及び尿素を含む試薬が例示できる。また例えば、測定されるべき抗原以外の成分（例えば担体と結合した抗体及び酵素標識した抗体等）とともに、ポリエチレングリコールと尿素を単一の容器に凍結乾燥した状態にしておき、対象サンプルを添加するのみで本発明の実施を可能としておくことも例示できる。このような容器であれば、対象サンプルの当該容器への添加によって本発明を実施可能であるから、操作の容易性・簡便性を向上できるとともに、操作の再現性をも向上することができる。
【発明の効果】
【００１６】
ポリエチレングリコールと尿素の両者を共存させることにより、抗原と抗体との免疫反応を増強することが可能である。そして免疫反応を増強することによって、免疫測定における測定感度を飛躍的に向上させることが可能となる。
【実施例】
【００１７】
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
実施例１
免疫測定における対象抗原として、ヒト Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １（以下「ＳＮＤ１」とする）を選択し、その測定のための試薬を準備した。
【００１８】
まず、ＲＴ−ＰＣＲを用い、常法に従ってＳＮＤ１（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿０１４３９０．２）のｃＤＮＡをヒト前立腺癌細胞ＬｎＣａｐからクローニングした。クローニングしたｃＤＮＡから終止コドンを除去した後、ヒスチジン６残基をコードするコドンを追加して調製したポリヒスチジン−タッグＳＮＤ１をバキュロウイルス用トランスファーベクターｐＦＡＳＴＢａｃ−１（インビトロジェン社製）に導入し、Bac−to−Bacシステム（インビトロジェン社製）を用いてプロトコールに従いバキュロウイルスを調製した。
【００１９】
上記のように調製したバキュロウイルスを用い、常法に従って Sｆ２１に感染させて培養を行い、ポリヒスチジン−タッグＳＮＤ１含む発現培養上清を調製した。この培養上清をＴＢＳ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で透析後、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ金属キレートカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）製、Ｃａｔ．ＮＯ．１７−５２４８−０１）を用いてプロトコールに従い精製操作を行った。
【００２０】
図１は、精製操作により調整されたポリヒスチジン−タッグＳＮＤ１精製品のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示すものである。精製ＳＮＤ１をＢＣＡ蛋白定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．２３２２５）により濃度測定し、ＳＮＤ１濃度とした。
【００２１】
モノクローナル抗体は常法に従い調製した。まず、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（７週令のメス）に対し、ＳＮＤ１（５０μｇ）をフロイントの完全アジュバントと共に腹腔に免疫した。次に、当該マウスから得たB細胞とマウスミエローマ細胞株ＰＡＩとを常法に従って融合し、モノクローナル抗体産生株を取得した。取得した細胞が産生するモノクローナル抗体の中から、ＳＮＤ１をサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）測定可能な２種のモノクローナル抗体を選択した。選択したモノクローナル抗体の、精製ＳＮＤ１又はヒト前立腺癌細胞ＬｎＣａｐとの反応性を図２に示す。
実施例２
水不溶性の球状担体（内部にフェライトを練り込んだ粒子径約１．５ｍｍのＥＶＡ製）に、実施例１で選択したモノクローナル抗体の一方を１００ｎｇ／担体となるよう物理的に吸着させた後、ＢＳＡでブロッキング処理を行った。
【００２２】
磁力透過性の容器（容量１．２ｍｌ）に１２個の担体を入れた後、０．２μｇ／ｍＬのアルカリ性フォスファターゼ標識を施した、実施例１で選択したモノクローナル抗体の他方を含む緩衝液（３％ ＢＳＡ、５％水溶性ゼラチン、１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０）を加え、凍結乾燥した。
実施例３
実施例２で作製した試薬を用い、精製ＳＮＤ１を子牛血清（ＦＢＳ）に添加したものを対象サンプルとして、尿素の測定値に及ぼす影響を検証した。尿素を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ８）を対象サンプルと１：１の割合で混合し、混合液１５０μＬを容器に添加した。３７℃で１０分は４０分間、免疫反応を生じさせた後、Ｂ／Ｆ分離操作を行って遊離の標識抗体を担体から分離除去し、アルカリ性フォスファターゼの基質である４メチルウンベリフェリルリン酸を加え、４メチルウンベリフェロンの生成速度Ｒａｔｅ（ｎＭ／秒）を測定した。なお測定は、市販の免疫測定装置（東ソー（株）製、商品名ＡＩＡ−６００ＩＩ）を用いて自動的に実施した。この装置では、磁力透過性の容器に対して対象サンプルを１５０μＬ加え、３７℃で１０分又は４０分間、担体を磁石によって攪拌し、その状態で免疫反応させるものである。またこの装置は、アルカリ性フォスファターゼの基質である４メチルウンベリフェリルリン酸を加えた後２０から２９５秒までの酵素反応分解物（４メチルウンベリフェロン）の単位時間あたりの生成速度（ｎＭ／秒）を測定するものである。
結果を図３に示す。
【００２３】
図３に示した通り、尿素濃度１モル／リットル（Ｍ）共存の場合に、４０分の免疫反応においてわずかな反応性上昇が見られた以外は、共存尿素濃度上昇により、非特異的結合とＳＮＤ１特異的結合のいずれも低下した。４０分の免疫反応における共存尿素濃度１Ｍでの反応性上昇も、非共存時に比較すると３３％の上昇とわずかなものであり、反応性向上による高感度化は尿素のみでは達成できないことが分かる。
実施例４
実施例３同様の方法で、ポリエチレングリコールの測定値に及ぼす影響を検証した。ポリエチレングリコールはＰＥＧ６０００（ナイアライテスク社製、平均分子量７４００〜１２０００）を用いた。結果を図４に示す。
【００２４】
図４に示した通り、１０分又は４０分いずれの免疫反応時間においても共存ポリエチレングリコール濃度上昇により、非特異的結合とＳＮＤ１特異的結合いずれも上昇した。その上昇率は、ＳＮＤ１特異的結合において最大Ｒａｔe値を示す１０分反応での共存ポリエチレングリコール濃度５％時、４０分反応での４％時において、ポリエチレングリコール非共存時に比較してそれぞれ、１１．０倍、４．１倍であった。しかし、ＳＮＤ１を含まないゼロサンプルについてもそれぞれ、１９．９倍、３３．２倍と上昇してしまうため、抗原特異的シグナル／非特異的ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）は向上せず、ポリエチレングリコールのみでは、反応性は向上できても高感度化は達成できないことが分かる。
実施例５
平均分子量の異なるポリエチレングリコール、ＰＥＧ４０００（ナイアライテスク社製、平均分子量３０００〜３７００）、ＰＥＧ６０００（ナイアライテスク社製、平均分子量７４００〜１２０００）、ＰＥＧ２００００（ナイアライテスク社製、平均分子量１５０００〜２５０００）を用い、実施例３同様の方法で、ＳＮＤ１を含まないゼロサンプル及び１μｇ／ｍＬ含む対象サンプルの測定を行った。結果を図５に示す。
【００２５】
図５Ａ及びＢに示した通り、いずれのポリエチレングリコールにおいても反応性の向上が認められるが、ポリエチレングリコールの分子量によりその効果は異なることが明らかとなった。また、図Ｃに示す通りポリエチレングリコールのみの添加ではＳ／Ｎ比の向上は認められないことが分かる。
実施例６
実施例３において、１０分間の免疫反応において最大のＳ／Ｎ比を示した共存尿素濃度２Ｍにおいて、更にポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）を共存させた場合の反応性を検証した。測定方法は実施例３と同様である。結果を図６、図７に示す。
【００２６】
図６Ａ及びＢに示した通り、ポリエチレングリコールの共存により、ＳＮＤ１特異的反応性及び非特異的反応性のいずれも上昇していることが分かる。しかし、図６Ｃに示した通り、ポリエチレングリコール２．５％の共存によりＳ／Ｎ比の向上は飛躍的となる。また図７に示した通り、尿素とポリエチレングリコールが非共存時の反応性と比較すると、尿素２Ｍのみの共存ではＳＮＤ１を含まないゼロサンプル測定値がわずかに低減（０．６倍）するものの、ＳＮＤ１含有サンプル測定値は変動しない（０．９倍）。結果として若干のＳ／Ｎ比の上昇（１．６倍）が認められるだけであり、尿素の共存のみでの高感度化は達成できない。一方、尿素に加えポリエチレングリコールを共存させた場合には、ＳＮＤ１を含まないゼロサンプル測定値の低減は認められない（０．９倍）ものの、ＳＮＤ１含有サンプル測定値の上昇は大きく（４．０倍）、結果として４．２倍のＳ／Ｎ比上昇が認められ、高感度化が達成されていることが分かる。
実施例７
実施例４の１０分間の免疫反応において抗原特異的反応性が最大値を示した共存ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）濃度５％において、更に尿素を共存させた場合の反応性を検証した。結果を図８、図９に示す。
【００２７】
図８Ａ、Ｂに示した通り、尿素共存により非特異的反応性は減少し、ＳＮＤ１特異的反応性は共存尿素濃度が２Ｍとなるまで上昇が認められる。そして図８Ｃから明らかなように、共存尿素濃度３Ｍの時にＳ／Ｎ比は飛躍的に向上する。また図９に示した通り、尿素及びポリエチレングリコール非共存時の反応性と比較して、ポリエチレングリコールのみの共存ではＳＮＤ１含有サンプル測定値は飛躍的に向上する（１０．７倍）ものの、ＳＮＤ１を含まないゼロサンプル測定値も上昇してしまい（２０．９倍）、結果としてＳ／Ｎ比（０．５倍）の向上は認められない。これに対し、更に３Ｍ尿素を共存させた場合には、ＳＮＤ１含有サンプル測定値は飛躍的に向上し（８．４倍）、かつゼロサンプルの測定値の上昇を抑えられる（１．６倍）。ポリエチレングリコール及び尿素の共存により、結果として５．２倍のＳ／Ｎ比上昇が認められ、高感度化が達成されていることが分かる。
実施例８
実施例３の４０分間の免疫反応においてＳ／Ｎ比が最大値を示した共存尿素濃度２Ｍにおいて、更にポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）を共存させた場合の反応性を検証した。結果を図１０、図１１に示す。
【００２８】
図１０Ａ、Ｂに示した通り、ポリエチレングリコール共存により非特異的反応性は４％ポリエチレングリコール共存時より急激に上昇し、ＳＮＤ１特異的反応性は５％共存時をピークに反応性向上が認められる。しかし、図１０Ｃから明らかなように、ポリエチレングリコール１％共存によりＳ／Ｎ比は最大を示すものの、１０分の免疫反応時に比較しその上昇率は低い。また図１１に示した通り、尿素及びポリエチレングリコール非共存時の反応性に比較して、尿素２Ｍとポリエチレングリコール１％の共存時には、ゼロサンプル測定値の低減が大きく（０．１３倍）、ＳＮＤ１含有サンプル測定値の上昇（１．５７倍）とあいまって、結果として１１．４倍のＳ／Ｎ比上昇が認められ、高感度化が達成されていることが分かる。
実施例９
実施例３の４０分間の免疫反応において抗原特異的反応性が最大値を示した共存ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）濃度４％において、更に尿素を共存させた場合の反応性を検証した。結果を図１２、１３に示す。
【００２９】
図１２Ａ、Ｂに示した通り、尿素共存により非特異的反応性は急激に減少し、ＳＮＤ１特異的反応性は１．５％共存時をピークに反応性向上が認められる。図１２Ｃから明らかなように、３Ｍの尿素を共存させることによりＳ／Ｎ比は飛躍的に上昇した。図１３に示した通り、尿素及びポリエチレングリコール非共存時の反応性と比較して、３Ｍ尿素及び４％ポリエチレングリコールを共存させた場合には、ゼロサンプル測定値を低減し（０．３４倍）、ＳＮＤ１含有サンプル測定値の上昇（２．２７倍）とあいまって、結果として６．６倍のＳ／Ｎ比上昇が認められ、高感度化が達成されていることが分かる。
実施例１０
ＳＮＤ１の１０００ｎｇ／ｍＬ溶液をベースとして１／２倍希釈系列サンプルを調製し、実施例３の方法に従って１０分及び４０分の免疫反応を実施した。免疫反応を増強するため、（１）ポリエチレングリコール及び尿素非共存、（２）２Ｍ尿素のみ共存、又は（３）４％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）及び３Ｍ尿素共存、の各条件下で免疫測定を実施した。結果を図１４に示す。
【００３０】
図１４Ａ、Ｂに示した通り、１０分、４０分いずれの免疫反応時間においても、ポリエチレングリコール４％と尿素３Ｍを共存させると、グラフの傾きが大きくなる（反応性が高くなる）ことが分かる。尿素２Ｍのみを共存させた場合は、非共存の場合と比較してグラフの傾きが大きくなることはなく、むしろグラフは低値側へシフトし、反応性が全体的に低下していることが分かる。
実施例１１
実施例１０と同様に、ＳＮＤ１の５０ｎｇ／ｍＬ溶液をベースとして１／２倍希釈系列サンプルを調製し、４０分の免疫反応を実施した。免疫反応を増強するため、（１）ポリエチレングリコール及び尿素非共存、（２）２Ｍ尿素のみ共存、又は（３）４％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）及び３Ｍ尿素共存、の各条件下で免疫測定を実施した。結果を図１５、１６に示す。
【００３１】
図１５に示した通り、ポリエチレングリコール４％と尿素３Ｍを共存させると、グラフの傾きが大きくなり（反応性が高くなり）、非共存の場合に比較して非特異的反応が低減されることが分かる。尿素２Ｍのみを共存させた場合は、非特異的反応の低減は認められるものの、非共存の場合と比較してグラフの傾きが大きくなることはなく、むしろグラフは低値側へシフトし、反応性が全体的に低下していることが分かる。
【００３２】
図１６Ａ、Ｂ、Ｃは検出感度算出のための（測定値平均＋２×標準偏差）が隣り合う測定値の（測定値平均−２×標準偏差）と重なり合わない最少測定点の（測定値平均＋２×標準偏差）を破線で示したものである。そして表１は、測定値より算出した検出感度、測定値のＣＶ（ｃｏｅｆｆｉｃｉｎｔ ｖａｒａｅｔｙ）２０％に相当する濃度を、測定値の累乗近似により作成したグラフから算出した実行感度、ゼロサンプル測定値平均＋２×標準偏差の値に相当する濃度を１０ｎｇ／ｍＬ以下の測定値を１次回帰式した際の相関式より算出した検出限界、の３種類の感度評価をまとめたものである。図１６又は表１のいずれの感度評価方法においても、ポリエチレングリコールと尿素を共存させる免疫反応増強法により、１０倍以上の感度向上が認められることが分かる。
【００３３】
【表１】
実施例１２
水不溶性の球状担体（内部にフェライトを練り込んだ粒子径約１．５ｍｍのＥＶＡ製）に、実施例１で選択したモノクローナル抗体の一方を１００ｎｇ／担体となるよう物理的に吸着させた後、ＢＳＡでブロッキング処理を行った。磁力透過性の容器（容量１．２ｍｌ）に１２個の担体を入れた後、緩衝液（３％ ＢＳＡ、５％水溶性ゼラチン、１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０）を加え、凍結乾燥した。
【００３４】
０．２μｇ／ｍＬのアルカリ性フォスファターゼ標識抗ＳＮＤ１抗体（実施例１で選択したモノクローナル抗体の一方）を含む１％ＢＳＡ、１０ｍＭトリス緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．０を準備し、実施例３と同様の免疫測定装置を用いて測定を実施した。まず容器に対象サンプルを１５０μＬ添加して３７℃で２０分間反応させた後、未反応物質をＢ／Ｆ分離し、上述した標識抗ＳＮＤ１抗体の溶液１００μＬ加えた。３７℃で２０分間反応させた後、Ｂ／Ｆ分離操作を行って遊離の標識抗ＳＮＤ１抗体を担体から分離除去し、４メチルウンベリフェリルリン酸を加え、基質添加後２０から２９５秒までの酵素反応分解物（４メチルウンベリフェロン）の単位時間あたりの生成速度（ｎＭ／秒）を測定した。
【００３５】
対象サンプルは、ＳＮＤ１の１０００ｎｇ／ｍＬ溶液をベースとし調製した１／２倍希釈系列サンプルであり、（１）ポリエチレングリコール及び尿素を含む溶液、（２）２Ｍ尿素のみ含む溶液、又は（３）４％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）及び３Ｍ尿素を含む溶液、のいずれかの溶液と対象サンプルを１：１で混合後、その１５０μＬを容器に加えて測定を実施した。結果を図１７に示す。
【００３６】
図１７Ａ、Ｂに示した通り、ポリエチレングリコールと尿素が非共存の場合又は尿素のみ共存の場合は前述した実施例で述べたいわゆる「１ステップ測定」に比較して感度が大きく劣っていることが分かる。一方、図１７Ｃに示した通り、ポリエチレングリコールと尿素が共存した場合、高感度化（検出感度 １５．６ｎｇ／ｍｌ）が達成されているものの、いわゆる「１ステップ測定」における検出感度（１．５６ｎｇ／ｍｌ）に比較して１０倍ほど低い値となった。実施例１１と同様に各感度の一覧を表２に示したが、検出感度はＣＶ２０％となる濃度がなく算出できなかった。
【００３７】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、実施例で調製したＳＮＤ１の電気泳動の結果を示す図である。蛋白質はクマシーブリリアントブルーで染色している。
【図２】図２は、実施例で調製したＳＮＤ１（３ｎｇ／レーン）及びＬｎＣａｐ細胞（7０００ｃｅｌｌｓ／レーン）を電気泳動し、ポリフッ化ビニリデン膜に転写後、アルカリ性フォスファターゼ標識抗ＳＮＤ１抗体（実施例にて選択したもの２種類）でウエスタンブロッティングを行った際の結果を示す図である。検出は、ＣＤＰ−ＳＴＡＲ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で行った。ＣＢＢはクマシ−ブリリアントブルーにて電気泳動した全蛋白質を染色した染色像を示す。
【図３】図３Ａ、Ｂは免疫反応１０分、Ｃ、Ｄは４０分の各種尿素（Ｕｒｅａ）濃度で測定した結果を示すものである。Ａ、ＣはＳＮＤ１を含まないＦＢＳ（ｚｅｒｏ ｓａｍｐｌｅ）を、ＢはＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むＦＢＳを測定したものであり、ＤはＳＮＤ１を１μｇ/ｍＬ含むＦＢＳを測定したものである。なお各点は測定値平均±２×標準偏差を示す。
【図４】図４Ａ、Ｂは免疫反応１０分、Ｃ、Ｄは４０分の各種ポリエチレングリコール濃度で測定した際の結果を示すものである。Ａ、ＣはＳＮＤ１を含まないＦＢＳ（ｚｅｒｏ ｓａｍｐｌｅ）を、ＢはＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むＦＢＳを測定したものであり、ＤはＳＮＤ１を１μｇ/ｍＬ含むＦＢＳを測定したものである。なお各点は測定値平均±２×標準偏差を示す。
【図５】図５は、平均分子量の異なるポリエチレングリコール３種による反応性の違いを示す図である。Aはゼロサンプル、Ｂは１μｇ／ｍＬ ＳＮＤ１を含むサンプル、そしてＣは１μｇ／ｍＬ ＳＮＤ１を含むサンプルの測定結果をゼロサンプル測定結果で除したＳ／Ｎ比を示す。
【図６】図６は、２Ｍ尿素とポリエチレングリコールが共存した場合の、免疫反応１０分での反応性を検証した結果を示す図である。Ａはゼロサンプルの測定結果、ＢはＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むＦＢＳの測定結果、そしてＣはＳ／Ｎ比を示し、各点は測定値平均±２×標準偏差を示す。
【図７】図７は、尿素２Ｍの共存、尿素２Ｍ及びポリエチレングリコール２．５％の共存、尿素及びポリエチレングリコール非共存の場合の、ゼロサンプルの測定結果、ＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むサンプルの測定結果、そしてＳ／Ｎ比を示す。
【図８】図８は、５％ポリエチレングリコールと尿素が共存した場合の、免疫反応１０分での反応性を検証した結果を示す図である。Ａはゼロサンプルの測定結果、ＢはＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むＦＢＳの測定結果、そしてＣはＳ／Ｎ比を示し、各点は測定値平均±２×標準偏差を示す。
【図９】図９は、ポリエチレングリコール５％の共存、ポリエチレングリコール５％及び尿素３Ｍの共存、尿素及びポリエチレングリコール非共存の場合の、ゼロサンプルの測定結果、ＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むサンプルの測定結果、そしてＳ／Ｎ比を示す。
【図１０】図１０は、２Ｍ尿素とポリエチレングリコールが共存した場合の、免疫反応４０分での反応性を検証した結果を示す図である。Ａはゼロサンプルの測定結果、ＢはＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むＦＢＳの測定結果、そしてＣはＳ／Ｎ比を示し、各点は測定値平均±２×標準偏差を示す。
【図１１】図１１は、尿素２Ｍ及びポリエチレングリコール１％の共存、尿素及びポリエチレングリコール非共存の場合の、ゼロサンプルの測定結果、ＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むサンプルの測定結果、そしてＳ／Ｎ比を示す。
【図１２】４％ポリエチレングリコールと尿素が共存した場合の、免疫反応４０分での反応性を検証した結果を示す図である。Ａはゼロサンプルの測定結果，はＳＮＤ１を１μｇ/ｍＬ含むＦＢＳの測定結果、そしてＣはＳ／Ｎ比示し、各点は測定値平均±２×標準偏差を示す。
【図１３】図１３は、ポリエチレングリコール４％及び尿素３Ｍの共存、尿素及びポリエチレングリコール非共存の場合の、ゼロサンプルの測定結果、ＳＮＤ１を１μｇ/ｍＬ含むサンプルの測定結果、そしてＳ／Ｎ比を示す。
【図１４】図１４は、１０００ｎｇ／ｍＬをベースとして１／２希釈系列にて調製したＳＮＤ１サンプルを、Ａ；１０分の免疫反応、Ｂ；４０分の免疫反応で測定した場合の反応性を示す図である。測定は３重測定で行い、平均値±２×標準偏差値を示した。
【図１５】図１５は、５０ｎｇ／ｍＬをベースとして１／２希釈系列にて調製したＳＮＤ１サンプルを４０分の免疫反応で測定した際の反応性を示す図である。測定は５重測定で行い、平均値±２×標準偏差値を示した。
【図１６】図１６は、Ａ；尿素及びポリエチレングリコール非共存、Ｂ；２Ｍ尿素共存、Ｃ；４％ポリエチレングリコール及び３Ｍ尿素共存の場合の測定結果において、測定値平均＋２×標準偏差が、次のサンプルの測定値平均−２×標準偏差を超えない点の測定値平均＋２×標準偏差値を破線で示したものである。
【図１７】図１７は、Ａ；尿素及びポリエチレングリコール非共存、Ｂ；２Ｍ尿素共存、Ｃ；４％ポリエチレングリコール及び３Ｍ尿素共存を用いた、いわゆる２ステップ測定の結果において、測定値平均＋２×標準偏差が、次のサンプルの測定値平均−２×標準偏差を超えない点の測定値平均＋２×標準偏差値を破線で示したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原と抗体との反応を増強する方法に関するものである。本発明よれば、臨床診断の分野において常用されている抗体と抗原（当該抗体によって認識される物質）との反応を利用する免疫測定において、抗体と抗原との免疫反応を増強することで、高感度に検体（免疫測定の対象となる患者由来の血清、血漿等の血液由来成分や、尿等の、生体試料）中の抗原を検出する方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
低濃度のポリエチレングリコールを共存させることにより、免疫反応を促進する技術は公知である（例えば特許文献１）。一方、尿素に関しては、難水溶性蛋白質の処理剤としての利用例や、感染症に関する自己抗体を検出するための免疫反応における非特異抗体結合低減剤としての利用例が報告されている（例えば非特許文献１から３）。
【０００３】
【特許文献１】特開平７−１８１１８２号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５２、９５−１０４、１９９５年
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．８、１６−２１、１９９４年
【非特許文献３】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３３、１００−１０５、１９９１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前述の通り、特許文献１では、ポリエチレングリコールを共存させることにより、免疫反応を促進することが開示されている。しかし、特許文献１に開示されているのは、１％（重量／重量）に満たない、極めて低濃度のポリエチレングリコールを共存させる技術である。これは、高濃度のポリエチレングリコールの共存は蛋白質の沈殿を引き起こし、結果的に免疫反応を生じさせることが困難になり、測定結果の再現性が失われる可能性があり、また、高濃度のポリエチレングリコールの共存は抗原特異的反応と同時に非特異的反応の反応性をも上昇させるため、Ｓ／Ｎ比（抗原特異的反応によるシグナル／非特異的シグナルの比）で考えると、大きな性能（測定精度）向上は期待できない。
【０００５】
一方、尿素については、非特許文献はいずれも尿素を非特異抗体結合低減剤として利用することしか開示していない。
【０００６】
抗原と抗体との免疫反応を利用する免疫測定等では、測定感度は非常に重要な因子である。従って本発明は、抗原と抗体との反応を増強し、これを適用した免疫測定等では測定感度を向上できる、抗原抗体反応の増強方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
免疫測定等により、検体中に含まれる微量成分を定量することによる病気の診断がなされているが、検体中の微量成分をより高感度に検出するために様々な手法が行われている。本発明者は、かかる免疫測定における高感度化ついて鋭意研究を重ねた結果、免疫反応促進剤であるポリエチレングリコールを、単独ではなく、尿素と共に使用することで、抗原と抗体との免疫反応を増強し、免疫測定等における測定感度を向上し得ることを知見し、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、抗原抗体反応を増強する方法であって、抗原と抗体とをポリエチレングリコール及び尿素の共存下で反応させる方法である。また本発明は、抗原抗体反応を増強する試薬であって、抗原又は抗体のいずれか、ポリエチレングリコール及び尿素を含む試薬である。免疫測定に適用した場合を例として、以下、本発明の方法及び試薬を詳細に説明する。
【０００８】
本発明では、抗原と抗体との反応を利用した免疫測定において、抗原と抗体とをポリエチレングリコール及び尿素の共存下で反応させる。いかなる順序により抗原、抗体、ポリエチレングリコール及び尿素を混合して共存せしめるかについて、本発明では特に制限はない。例えば、抗原と抗体とを混合して免疫反応を開始し、速やかにポリエチレングリコールと尿素を順次、又は予め混合しておくことで同時に、添加しても良い。抗原と抗体との反応は迅速に生じることから、本発明による免疫反応の増強効果（免疫測定に適用した場合の測定感度の向上）という効果を最大限引き出すためには、抗原と抗体との免疫反応が開始される瞬間からポリエチレングリコール及び尿素の両者を共存させておくことが好ましい。このためには、例えば、抗原又は抗体のいずれか一方に、ポリエチレングリコール及び尿素の両方を予め混合しておき、これを抗原又は抗体の他方と混合することが例示できる。この好ましい例では、ポリエチレングリコールと尿素の共存が、前記混合液の一定量を添加するという単一の操作によって実施できるという意味においても、特に好ましい。
【０００９】
例えば免疫測定が、（１）対象サンプルと担体に固定した抗体との反応、（２）いわゆるＢ／Ｆ分離、（３）分離された担体と標識を結合した抗体の反応、の順で実施されるいわゆる２ステップサンドイッチ法である場合、ポリエチレングリコールと尿素は、（１）又は（３）のいずれかの反応の際に共存させれば一定の効果を得ることができるが、測定感度の向上等、本発明の効果を最大限引き出すためには（１）と（３）の両方の反応の際に共存させることが好ましい。そのような意味においては、対象サンプル、担体に固定した抗体及び標識を結合した抗体を１段階で反応させる１段階サンドイッチ法又はこれに類する測定法であれば、その反応の際にポリエチレングリコールと尿素を共存させるのみで発明の効果を最大限引き出すことができ、また操作に要するステップ数も減少できることから、特に好ましい。
【００１０】
本発明は、従来から実施されている免疫測定に、特別の制限なしに適用することができる。本発明を適用し得る免疫測定として、例えば、酵素標識、アイソトープ標識、蛍光標識又は発光標識等を利用する、競合法、サンドイッチ法又は蛍光偏光法等による測定を例示することができる。またホモジニアス測定法や表面プラズモン共鳴分析法を利用した結合測定等に適用することも可能である。
【００１１】
本発明における抗体とは、抗原性物質に対してヒト、マウス、ウサギ、ヤギその他が産生するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでも良い。抗原は、当該抗体が特異的に識別し結合する相手方であり、特定の疾病に関連する生体蛋白、ホルモン等の他、環境ホルモン等であっても良い。また場合によっては抗体そのものも「抗原」として本発明の対象とすることができる。
【００１２】
ポリエチレングリコールとしては平均分子量が種々のものが市販されているが、本発明では分子量に特別の制限はない。使用するポリエチレングリコールの量（共存させるポリエチレングリコールの濃度）についても特に制限はなく、抗原と抗体との反応を生じさせる溶液中における濃度（最終濃度）で１〜１０％（重量／重量）とすれば良い。ポリエチレングリコールの終濃度については、その分子量により最適な範囲があるため、本発明の実施に先立って具体的な条件を設定して予備的実験を行って決定することが特に好ましい。一例を説明すると、本発明者の知見によれば、平均分子量が６０００のポリエチレングリコールを使用する場合、最終濃度を３〜７％とすることにより、本発明の効果を最大限引き出すことが可能である。
【００１３】
尿素については、抗原と抗体との反応を生じさせる溶液中における濃度（最終濃度）で１〜４モル／リットルとすれば良いが、使用するポリエチレングリコールの使用濃度等を考慮して決定することが好ましい。例えば、本発明者の知見によれば、分子量６０００のポリエチレングリコールを最終濃度５％で使用する場合、最終濃度を２〜４モル／リットル、特に好ましくは３モル／リットルとすることにより、本発明の効果を最大限引き出すことが可能である。
【００１４】
前述したように、ポリエチレングリコールと尿素を予め混合しておき、これを検体等と混合する場合、当該混合液は、上述した最終濃度の２倍の濃度で調製しておき、検体と１：１で混合する等することが例示できる。ポリエチレングリコールと尿素の混合液は、１０ｍＭ程度のＴｒｉｓ−ＨＣｌ等を添加して、抗原と抗体との反応に支障のないｐＨ８程度のｐＨ領域とし、更には非特異的反応を回避するため０．１％（重量／重量）程度の界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ２０等）を加えておくことが好ましい。
【００１５】
本発明の方法を、例えば免疫測定に適用する際には、通常の免疫測定を実施するための各種試薬に加え、ポリエチレングリコールと尿素を含む試薬セットを用いる。ポリエチレングリコールと尿素は、それぞれ別個の容器に保持して前記試薬セットの構成物としても良いが、両者を共存させることによって変質等が生じることもないため、両者を混合した状態とすることが好ましい。具体的には、抗原抗体反応に関わる抗原又は抗体の一方、ポリエチレングリコール及び尿素を含む試薬が例示できる。また例えば、測定されるべき抗原以外の成分（例えば担体と結合した抗体及び酵素標識した抗体等）とともに、ポリエチレングリコールと尿素を単一の容器に凍結乾燥した状態にしておき、対象サンプルを添加するのみで本発明の実施を可能としておくことも例示できる。このような容器であれば、対象サンプルの当該容器への添加によって本発明を実施可能であるから、操作の容易性・簡便性を向上できるとともに、操作の再現性をも向上することができる。
【発明の効果】
【００１６】
ポリエチレングリコールと尿素の両者を共存させることにより、抗原と抗体との免疫反応を増強することが可能である。そして免疫反応を増強することによって、免疫測定における測定感度を飛躍的に向上させることが可能となる。
【実施例】
【００１７】
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
実施例１
免疫測定における対象抗原として、ヒト Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １（以下「ＳＮＤ１」とする）を選択し、その測定のための試薬を準備した。
【００１８】
まず、ＲＴ−ＰＣＲを用い、常法に従ってＳＮＤ１（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿０１４３９０．２）のｃＤＮＡをヒト前立腺癌細胞ＬｎＣａｐからクローニングした。クローニングしたｃＤＮＡから終止コドンを除去した後、ヒスチジン６残基をコードするコドンを追加して調製したポリヒスチジン−タッグＳＮＤ１をバキュロウイルス用トランスファーベクターｐＦＡＳＴＢａｃ−１（インビトロジェン社製）に導入し、Bac−to−Bacシステム（インビトロジェン社製）を用いてプロトコールに従いバキュロウイルスを調製した。
【００１９】
上記のように調製したバキュロウイルスを用い、常法に従って Sｆ２１に感染させて培養を行い、ポリヒスチジン−タッグＳＮＤ１含む発現培養上清を調製した。この培養上清をＴＢＳ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で透析後、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ金属キレートカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）製、Ｃａｔ．ＮＯ．１７−５２４８−０１）を用いてプロトコールに従い精製操作を行った。
【００２０】
図１は、精製操作により調整されたポリヒスチジン−タッグＳＮＤ１精製品のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示すものである。精製ＳＮＤ１をＢＣＡ蛋白定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．２３２２５）により濃度測定し、ＳＮＤ１濃度とした。
【００２１】
モノクローナル抗体は常法に従い調製した。まず、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（７週令のメス）に対し、ＳＮＤ１（５０μｇ）をフロイントの完全アジュバントと共に腹腔に免疫した。次に、当該マウスから得たB細胞とマウスミエローマ細胞株ＰＡＩとを常法に従って融合し、モノクローナル抗体産生株を取得した。取得した細胞が産生するモノクローナル抗体の中から、ＳＮＤ１をサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）測定可能な２種のモノクローナル抗体を選択した。選択したモノクローナル抗体の、精製ＳＮＤ１又はヒト前立腺癌細胞ＬｎＣａｐとの反応性を図２に示す。
実施例２
水不溶性の球状担体（内部にフェライトを練り込んだ粒子径約１．５ｍｍのＥＶＡ製）に、実施例１で選択したモノクローナル抗体の一方を１００ｎｇ／担体となるよう物理的に吸着させた後、ＢＳＡでブロッキング処理を行った。
【００２２】
磁力透過性の容器（容量１．２ｍｌ）に１２個の担体を入れた後、０．２μｇ／ｍＬのアルカリ性フォスファターゼ標識を施した、実施例１で選択したモノクローナル抗体の他方を含む緩衝液（３％ ＢＳＡ、５％水溶性ゼラチン、１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０）を加え、凍結乾燥した。
実施例３
実施例２で作製した試薬を用い、精製ＳＮＤ１を子牛血清（ＦＢＳ）に添加したものを対象サンプルとして、尿素の測定値に及ぼす影響を検証した。尿素を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ８）を対象サンプルと１：１の割合で混合し、混合液１５０μＬを容器に添加した。３７℃で１０分は４０分間、免疫反応を生じさせた後、Ｂ／Ｆ分離操作を行って遊離の標識抗体を担体から分離除去し、アルカリ性フォスファターゼの基質である４メチルウンベリフェリルリン酸を加え、４メチルウンベリフェロンの生成速度Ｒａｔｅ（ｎＭ／秒）を測定した。なお測定は、市販の免疫測定装置（東ソー（株）製、商品名ＡＩＡ−６００ＩＩ）を用いて自動的に実施した。この装置では、磁力透過性の容器に対して対象サンプルを１５０μＬ加え、３７℃で１０分又は４０分間、担体を磁石によって攪拌し、その状態で免疫反応させるものである。またこの装置は、アルカリ性フォスファターゼの基質である４メチルウンベリフェリルリン酸を加えた後２０から２９５秒までの酵素反応分解物（４メチルウンベリフェロン）の単位時間あたりの生成速度（ｎＭ／秒）を測定するものである。
結果を図３に示す。
【００２３】
図３に示した通り、尿素濃度１モル／リットル（Ｍ）共存の場合に、４０分の免疫反応においてわずかな反応性上昇が見られた以外は、共存尿素濃度上昇により、非特異的結合とＳＮＤ１特異的結合のいずれも低下した。４０分の免疫反応における共存尿素濃度１Ｍでの反応性上昇も、非共存時に比較すると３３％の上昇とわずかなものであり、反応性向上による高感度化は尿素のみでは達成できないことが分かる。
実施例４
実施例３同様の方法で、ポリエチレングリコールの測定値に及ぼす影響を検証した。ポリエチレングリコールはＰＥＧ６０００（ナイアライテスク社製、平均分子量７４００〜１２０００）を用いた。結果を図４に示す。
【００２４】
図４に示した通り、１０分又は４０分いずれの免疫反応時間においても共存ポリエチレングリコール濃度上昇により、非特異的結合とＳＮＤ１特異的結合いずれも上昇した。その上昇率は、ＳＮＤ１特異的結合において最大Ｒａｔe値を示す１０分反応での共存ポリエチレングリコール濃度５％時、４０分反応での４％時において、ポリエチレングリコール非共存時に比較してそれぞれ、１１．０倍、４．１倍であった。しかし、ＳＮＤ１を含まないゼロサンプルについてもそれぞれ、１９．９倍、３３．２倍と上昇してしまうため、抗原特異的シグナル／非特異的ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）は向上せず、ポリエチレングリコールのみでは、反応性は向上できても高感度化は達成できないことが分かる。
実施例５
平均分子量の異なるポリエチレングリコール、ＰＥＧ４０００（ナイアライテスク社製、平均分子量３０００〜３７００）、ＰＥＧ６０００（ナイアライテスク社製、平均分子量７４００〜１２０００）、ＰＥＧ２００００（ナイアライテスク社製、平均分子量１５０００〜２５０００）を用い、実施例３同様の方法で、ＳＮＤ１を含まないゼロサンプル及び１μｇ／ｍＬ含む対象サンプルの測定を行った。結果を図５に示す。
【００２５】
図５Ａ及びＢに示した通り、いずれのポリエチレングリコールにおいても反応性の向上が認められるが、ポリエチレングリコールの分子量によりその効果は異なることが明らかとなった。また、図Ｃに示す通りポリエチレングリコールのみの添加ではＳ／Ｎ比の向上は認められないことが分かる。
実施例６
実施例３において、１０分間の免疫反応において最大のＳ／Ｎ比を示した共存尿素濃度２Ｍにおいて、更にポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）を共存させた場合の反応性を検証した。測定方法は実施例３と同様である。結果を図６、図７に示す。
【００２６】
図６Ａ及びＢに示した通り、ポリエチレングリコールの共存により、ＳＮＤ１特異的反応性及び非特異的反応性のいずれも上昇していることが分かる。しかし、図６Ｃに示した通り、ポリエチレングリコール２．５％の共存によりＳ／Ｎ比の向上は飛躍的となる。また図７に示した通り、尿素とポリエチレングリコールが非共存時の反応性と比較すると、尿素２Ｍのみの共存ではＳＮＤ１を含まないゼロサンプル測定値がわずかに低減（０．６倍）するものの、ＳＮＤ１含有サンプル測定値は変動しない（０．９倍）。結果として若干のＳ／Ｎ比の上昇（１．６倍）が認められるだけであり、尿素の共存のみでの高感度化は達成できない。一方、尿素に加えポリエチレングリコールを共存させた場合には、ＳＮＤ１を含まないゼロサンプル測定値の低減は認められない（０．９倍）ものの、ＳＮＤ１含有サンプル測定値の上昇は大きく（４．０倍）、結果として４．２倍のＳ／Ｎ比上昇が認められ、高感度化が達成されていることが分かる。
実施例７
実施例４の１０分間の免疫反応において抗原特異的反応性が最大値を示した共存ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）濃度５％において、更に尿素を共存させた場合の反応性を検証した。結果を図８、図９に示す。
【００２７】
図８Ａ、Ｂに示した通り、尿素共存により非特異的反応性は減少し、ＳＮＤ１特異的反応性は共存尿素濃度が２Ｍとなるまで上昇が認められる。そして図８Ｃから明らかなように、共存尿素濃度３Ｍの時にＳ／Ｎ比は飛躍的に向上する。また図９に示した通り、尿素及びポリエチレングリコール非共存時の反応性と比較して、ポリエチレングリコールのみの共存ではＳＮＤ１含有サンプル測定値は飛躍的に向上する（１０．７倍）ものの、ＳＮＤ１を含まないゼロサンプル測定値も上昇してしまい（２０．９倍）、結果としてＳ／Ｎ比（０．５倍）の向上は認められない。これに対し、更に３Ｍ尿素を共存させた場合には、ＳＮＤ１含有サンプル測定値は飛躍的に向上し（８．４倍）、かつゼロサンプルの測定値の上昇を抑えられる（１．６倍）。ポリエチレングリコール及び尿素の共存により、結果として５．２倍のＳ／Ｎ比上昇が認められ、高感度化が達成されていることが分かる。
実施例８
実施例３の４０分間の免疫反応においてＳ／Ｎ比が最大値を示した共存尿素濃度２Ｍにおいて、更にポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）を共存させた場合の反応性を検証した。結果を図１０、図１１に示す。
【００２８】
図１０Ａ、Ｂに示した通り、ポリエチレングリコール共存により非特異的反応性は４％ポリエチレングリコール共存時より急激に上昇し、ＳＮＤ１特異的反応性は５％共存時をピークに反応性向上が認められる。しかし、図１０Ｃから明らかなように、ポリエチレングリコール１％共存によりＳ／Ｎ比は最大を示すものの、１０分の免疫反応時に比較しその上昇率は低い。また図１１に示した通り、尿素及びポリエチレングリコール非共存時の反応性に比較して、尿素２Ｍとポリエチレングリコール１％の共存時には、ゼロサンプル測定値の低減が大きく（０．１３倍）、ＳＮＤ１含有サンプル測定値の上昇（１．５７倍）とあいまって、結果として１１．４倍のＳ／Ｎ比上昇が認められ、高感度化が達成されていることが分かる。
実施例９
実施例３の４０分間の免疫反応において抗原特異的反応性が最大値を示した共存ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）濃度４％において、更に尿素を共存させた場合の反応性を検証した。結果を図１２、１３に示す。
【００２９】
図１２Ａ、Ｂに示した通り、尿素共存により非特異的反応性は急激に減少し、ＳＮＤ１特異的反応性は１．５％共存時をピークに反応性向上が認められる。図１２Ｃから明らかなように、３Ｍの尿素を共存させることによりＳ／Ｎ比は飛躍的に上昇した。図１３に示した通り、尿素及びポリエチレングリコール非共存時の反応性と比較して、３Ｍ尿素及び４％ポリエチレングリコールを共存させた場合には、ゼロサンプル測定値を低減し（０．３４倍）、ＳＮＤ１含有サンプル測定値の上昇（２．２７倍）とあいまって、結果として６．６倍のＳ／Ｎ比上昇が認められ、高感度化が達成されていることが分かる。
実施例１０
ＳＮＤ１の１０００ｎｇ／ｍＬ溶液をベースとして１／２倍希釈系列サンプルを調製し、実施例３の方法に従って１０分及び４０分の免疫反応を実施した。免疫反応を増強するため、（１）ポリエチレングリコール及び尿素非共存、（２）２Ｍ尿素のみ共存、又は（３）４％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）及び３Ｍ尿素共存、の各条件下で免疫測定を実施した。結果を図１４に示す。
【００３０】
図１４Ａ、Ｂに示した通り、１０分、４０分いずれの免疫反応時間においても、ポリエチレングリコール４％と尿素３Ｍを共存させると、グラフの傾きが大きくなる（反応性が高くなる）ことが分かる。尿素２Ｍのみを共存させた場合は、非共存の場合と比較してグラフの傾きが大きくなることはなく、むしろグラフは低値側へシフトし、反応性が全体的に低下していることが分かる。
実施例１１
実施例１０と同様に、ＳＮＤ１の５０ｎｇ／ｍＬ溶液をベースとして１／２倍希釈系列サンプルを調製し、４０分の免疫反応を実施した。免疫反応を増強するため、（１）ポリエチレングリコール及び尿素非共存、（２）２Ｍ尿素のみ共存、又は（３）４％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）及び３Ｍ尿素共存、の各条件下で免疫測定を実施した。結果を図１５、１６に示す。
【００３１】
図１５に示した通り、ポリエチレングリコール４％と尿素３Ｍを共存させると、グラフの傾きが大きくなり（反応性が高くなり）、非共存の場合に比較して非特異的反応が低減されることが分かる。尿素２Ｍのみを共存させた場合は、非特異的反応の低減は認められるものの、非共存の場合と比較してグラフの傾きが大きくなることはなく、むしろグラフは低値側へシフトし、反応性が全体的に低下していることが分かる。
【００３２】
図１６Ａ、Ｂ、Ｃは検出感度算出のための（測定値平均＋２×標準偏差）が隣り合う測定値の（測定値平均−２×標準偏差）と重なり合わない最少測定点の（測定値平均＋２×標準偏差）を破線で示したものである。そして表１は、測定値より算出した検出感度、測定値のＣＶ（ｃｏｅｆｆｉｃｉｎｔ ｖａｒａｅｔｙ）２０％に相当する濃度を、測定値の累乗近似により作成したグラフから算出した実行感度、ゼロサンプル測定値平均＋２×標準偏差の値に相当する濃度を１０ｎｇ／ｍＬ以下の測定値を１次回帰式した際の相関式より算出した検出限界、の３種類の感度評価をまとめたものである。図１６又は表１のいずれの感度評価方法においても、ポリエチレングリコールと尿素を共存させる免疫反応増強法により、１０倍以上の感度向上が認められることが分かる。
【００３３】
【表１】
実施例１２
水不溶性の球状担体（内部にフェライトを練り込んだ粒子径約１．５ｍｍのＥＶＡ製）に、実施例１で選択したモノクローナル抗体の一方を１００ｎｇ／担体となるよう物理的に吸着させた後、ＢＳＡでブロッキング処理を行った。磁力透過性の容器（容量１．２ｍｌ）に１２個の担体を入れた後、緩衝液（３％ ＢＳＡ、５％水溶性ゼラチン、１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０）を加え、凍結乾燥した。
【００３４】
０．２μｇ／ｍＬのアルカリ性フォスファターゼ標識抗ＳＮＤ１抗体（実施例１で選択したモノクローナル抗体の一方）を含む１％ＢＳＡ、１０ｍＭトリス緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．０を準備し、実施例３と同様の免疫測定装置を用いて測定を実施した。まず容器に対象サンプルを１５０μＬ添加して３７℃で２０分間反応させた後、未反応物質をＢ／Ｆ分離し、上述した標識抗ＳＮＤ１抗体の溶液１００μＬ加えた。３７℃で２０分間反応させた後、Ｂ／Ｆ分離操作を行って遊離の標識抗ＳＮＤ１抗体を担体から分離除去し、４メチルウンベリフェリルリン酸を加え、基質添加後２０から２９５秒までの酵素反応分解物（４メチルウンベリフェロン）の単位時間あたりの生成速度（ｎＭ／秒）を測定した。
【００３５】
対象サンプルは、ＳＮＤ１の１０００ｎｇ／ｍＬ溶液をベースとし調製した１／２倍希釈系列サンプルであり、（１）ポリエチレングリコール及び尿素を含む溶液、（２）２Ｍ尿素のみ含む溶液、又は（３）４％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）及び３Ｍ尿素を含む溶液、のいずれかの溶液と対象サンプルを１：１で混合後、その１５０μＬを容器に加えて測定を実施した。結果を図１７に示す。
【００３６】
図１７Ａ、Ｂに示した通り、ポリエチレングリコールと尿素が非共存の場合又は尿素のみ共存の場合は前述した実施例で述べたいわゆる「１ステップ測定」に比較して感度が大きく劣っていることが分かる。一方、図１７Ｃに示した通り、ポリエチレングリコールと尿素が共存した場合、高感度化（検出感度 １５．６ｎｇ／ｍｌ）が達成されているものの、いわゆる「１ステップ測定」における検出感度（１．５６ｎｇ／ｍｌ）に比較して１０倍ほど低い値となった。実施例１１と同様に各感度の一覧を表２に示したが、検出感度はＣＶ２０％となる濃度がなく算出できなかった。
【００３７】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、実施例で調製したＳＮＤ１の電気泳動の結果を示す図である。蛋白質はクマシーブリリアントブルーで染色している。
【図２】図２は、実施例で調製したＳＮＤ１（３ｎｇ／レーン）及びＬｎＣａｐ細胞（7０００ｃｅｌｌｓ／レーン）を電気泳動し、ポリフッ化ビニリデン膜に転写後、アルカリ性フォスファターゼ標識抗ＳＮＤ１抗体（実施例にて選択したもの２種類）でウエスタンブロッティングを行った際の結果を示す図である。検出は、ＣＤＰ−ＳＴＡＲ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で行った。ＣＢＢはクマシ−ブリリアントブルーにて電気泳動した全蛋白質を染色した染色像を示す。
【図３】図３Ａ、Ｂは免疫反応１０分、Ｃ、Ｄは４０分の各種尿素（Ｕｒｅａ）濃度で測定した結果を示すものである。Ａ、ＣはＳＮＤ１を含まないＦＢＳ（ｚｅｒｏ ｓａｍｐｌｅ）を、ＢはＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むＦＢＳを測定したものであり、ＤはＳＮＤ１を１μｇ/ｍＬ含むＦＢＳを測定したものである。なお各点は測定値平均±２×標準偏差を示す。
【図４】図４Ａ、Ｂは免疫反応１０分、Ｃ、Ｄは４０分の各種ポリエチレングリコール濃度で測定した際の結果を示すものである。Ａ、ＣはＳＮＤ１を含まないＦＢＳ（ｚｅｒｏ ｓａｍｐｌｅ）を、ＢはＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むＦＢＳを測定したものであり、ＤはＳＮＤ１を１μｇ/ｍＬ含むＦＢＳを測定したものである。なお各点は測定値平均±２×標準偏差を示す。
【図５】図５は、平均分子量の異なるポリエチレングリコール３種による反応性の違いを示す図である。Aはゼロサンプル、Ｂは１μｇ／ｍＬ ＳＮＤ１を含むサンプル、そしてＣは１μｇ／ｍＬ ＳＮＤ１を含むサンプルの測定結果をゼロサンプル測定結果で除したＳ／Ｎ比を示す。
【図６】図６は、２Ｍ尿素とポリエチレングリコールが共存した場合の、免疫反応１０分での反応性を検証した結果を示す図である。Ａはゼロサンプルの測定結果、ＢはＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むＦＢＳの測定結果、そしてＣはＳ／Ｎ比を示し、各点は測定値平均±２×標準偏差を示す。
【図７】図７は、尿素２Ｍの共存、尿素２Ｍ及びポリエチレングリコール２．５％の共存、尿素及びポリエチレングリコール非共存の場合の、ゼロサンプルの測定結果、ＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むサンプルの測定結果、そしてＳ／Ｎ比を示す。
【図８】図８は、５％ポリエチレングリコールと尿素が共存した場合の、免疫反応１０分での反応性を検証した結果を示す図である。Ａはゼロサンプルの測定結果、ＢはＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むＦＢＳの測定結果、そしてＣはＳ／Ｎ比を示し、各点は測定値平均±２×標準偏差を示す。
【図９】図９は、ポリエチレングリコール５％の共存、ポリエチレングリコール５％及び尿素３Ｍの共存、尿素及びポリエチレングリコール非共存の場合の、ゼロサンプルの測定結果、ＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むサンプルの測定結果、そしてＳ／Ｎ比を示す。
【図１０】図１０は、２Ｍ尿素とポリエチレングリコールが共存した場合の、免疫反応４０分での反応性を検証した結果を示す図である。Ａはゼロサンプルの測定結果、ＢはＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むＦＢＳの測定結果、そしてＣはＳ／Ｎ比を示し、各点は測定値平均±２×標準偏差を示す。
【図１１】図１１は、尿素２Ｍ及びポリエチレングリコール１％の共存、尿素及びポリエチレングリコール非共存の場合の、ゼロサンプルの測定結果、ＳＮＤ１を２μｇ/ｍＬ含むサンプルの測定結果、そしてＳ／Ｎ比を示す。
【図１２】４％ポリエチレングリコールと尿素が共存した場合の、免疫反応４０分での反応性を検証した結果を示す図である。Ａはゼロサンプルの測定結果，はＳＮＤ１を１μｇ/ｍＬ含むＦＢＳの測定結果、そしてＣはＳ／Ｎ比示し、各点は測定値平均±２×標準偏差を示す。
【図１３】図１３は、ポリエチレングリコール４％及び尿素３Ｍの共存、尿素及びポリエチレングリコール非共存の場合の、ゼロサンプルの測定結果、ＳＮＤ１を１μｇ/ｍＬ含むサンプルの測定結果、そしてＳ／Ｎ比を示す。
【図１４】図１４は、１０００ｎｇ／ｍＬをベースとして１／２希釈系列にて調製したＳＮＤ１サンプルを、Ａ；１０分の免疫反応、Ｂ；４０分の免疫反応で測定した場合の反応性を示す図である。測定は３重測定で行い、平均値±２×標準偏差値を示した。
【図１５】図１５は、５０ｎｇ／ｍＬをベースとして１／２希釈系列にて調製したＳＮＤ１サンプルを４０分の免疫反応で測定した際の反応性を示す図である。測定は５重測定で行い、平均値±２×標準偏差値を示した。
【図１６】図１６は、Ａ；尿素及びポリエチレングリコール非共存、Ｂ；２Ｍ尿素共存、Ｃ；４％ポリエチレングリコール及び３Ｍ尿素共存の場合の測定結果において、測定値平均＋２×標準偏差が、次のサンプルの測定値平均−２×標準偏差を超えない点の測定値平均＋２×標準偏差値を破線で示したものである。
【図１７】図１７は、Ａ；尿素及びポリエチレングリコール非共存、Ｂ；２Ｍ尿素共存、Ｃ；４％ポリエチレングリコール及び３Ｍ尿素共存を用いた、いわゆる２ステップ測定の結果において、測定値平均＋２×標準偏差が、次のサンプルの測定値平均−２×標準偏差を超えない点の測定値平均＋２×標準偏差値を破線で示したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原抗体反応を増強する方法であって、抗原と抗体とをポリエチレングリコール及び尿素の共存下で反応させる方法。
【請求項２】
抗原又は抗体をポリエチレングリコール及び尿素と混合し、次いで抗体又は抗原と反応させることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】
抗原と抗体との反応を生じさせる溶液中におけるポリエチレングリコールの濃度が１〜１０％（重量／重量）であることを特徴とする、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
抗原と抗体との反応を生じさせる溶液中における尿素の濃度が１〜４モル／リットルであることを特徴とする、請求項１又は２の方法。
【請求項５】
抗原抗体反応を増強する試薬であって、抗原又は抗体のいずれか、ポリエチレングリコール及び尿素を含む試薬。
【請求項１】
抗原抗体反応を増強する方法であって、抗原と抗体とをポリエチレングリコール及び尿素の共存下で反応させる方法。
【請求項２】
抗原又は抗体をポリエチレングリコール及び尿素と混合し、次いで抗体又は抗原と反応させることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】
抗原と抗体との反応を生じさせる溶液中におけるポリエチレングリコールの濃度が１〜１０％（重量／重量）であることを特徴とする、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
抗原と抗体との反応を生じさせる溶液中における尿素の濃度が１〜４モル／リットルであることを特徴とする、請求項１又は２の方法。
【請求項５】
抗原抗体反応を増強する試薬であって、抗原又は抗体のいずれか、ポリエチレングリコール及び尿素を含む試薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２０１０−１４５２０２（Ｐ２０１０−１４５２０２Ａ）
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３２１９７７（Ｐ２００８−３２１９７７）
【出願日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
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