ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用されるビーズ、該ビーズを製造する装置及び方法
ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な複数のビーズを製造する方法が提供され、該方法は、(i)ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する物質とを供給すること；(ii)試料導管と、不混和液体(immiscible liquid)が流れる第１キャリア流体導管とを備え、前記試料導管と前記第１キャリア流体導管とは接合部で合流している反応装置を供給すること；(iii)ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、前記１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する前記物質とを密な混合物(intimate admixture)で含有する液体を形成するために、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、前記１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する前記物質とを加熱すること；(iv)前記試料導管内に前記液体を、前記第１キャリア流体導管にキャリア流体を、それぞれ通過させて、前記接合部で又は前記接合部の下流で、小滴の形成をもたらすこと；(v)前記小滴を冷却することにより、固形ビーズの形成をもたらすことを含む。このような方法に使用される装置も提供され、このような方法で複数のビーズが作られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応、例えば（これのみではないが）ポリメラーゼ連鎖反応(PCR, polymerase chain reaction)に使用されるビーズ、該ビーズを製造する装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチド増幅反応は、増幅を開始する１または複数のプライマーと連動して、問題となるポリヌクレオチドシーケンスの増幅を促進させる酵素(ポリメラーゼ)を一般的に使用する。従来の増幅反応では、最初のＤＮＡ変性の前を含む、反応プロセスの全体にわたって試薬は互いに接触している。これらの反応条件は、望ましくない増幅生成物の生成をもたらし得る。少なくともいくつかの試薬を互いに分離するために、融解可能なビーズ(meltable beads)はＰＣＲ反応に使用されてきた。従来のビーズを製造するために使用される技術では、均一でないサイズのビーズが製造され、そのためユーザーはビーズの中に含有する試薬の正確な分量を知らず、ある種の用途では問題を引き起こす可能性がある。更に、従来のビーズの使用期限は限定される可能性がある。また、一般的に、従来のビーズを製造するために使用される各技術は、小さいサイズの範囲のビーズの製造にのみ適している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、これらの問題のうちの１又は複数を解決するために提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１の側面によれば、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な複数の球形ビーズが提供され、該ビーズは５０から２５００ミクロンまでの平均直径を有し、複数のビーズの直径の標準偏差は、該複数のビーズの平均直径の５％を超えない。該ビーズの各々は、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬を含有している。
【０００５】
これらのビーズは、ポリヌクレオチドの増幅反応での使用に特に有益であると判明した。
【０００６】
１又は複数の試薬は、標識されていない(unlabelled)オリゴヌクレオチド、標識されている(labelled)オリゴヌクレオチド、標識されているデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されているオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないオキシヌクレオシド三リン酸、ポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成のための酵素、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、ポリヌクレオチド、使用時に緩衝効果(buffering effect)をもたらす染料(stain)又は色素(dye)及び組成物(compound)のうちの１又は複数を含有してもよい。
【０００７】
標識されていないオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応に使用されるプリマーとしてよい。標識されているオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応に使用されるプローブとしてよい。ポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成のための酵素の例は当業者によく知られ、例えばTaq(登録商標)ポリメラーゼ又はリバーストランスクリプターゼである。ポリヌクレオチドは、増幅反応中に増幅されるポリヌクレオチドでもよい。もし試薬組成物が例えば陽性標準試料(positive control sample)を形成するならば、このようなポリヌクレオチドは有利に試薬組成物に組み込まれ得る。ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応での使用時に緩衝効果をもたらす組成物は、例えばＴＲＩＳ−ＨＣｌ(２−アミノ−２−(ヒドロキシメチル)−１，３−プロパンジオール，塩酸)でよい。
【０００８】
染料又は色素は、ポリヌクレオチドの増幅反応の進展を追跡するのに一般的に使用される染料又は色素のうちの１つであればよい。このような色素又は染料は、一般的に蛍光色素(fluorophores)でよい。色素又は染料は、インターカレーター(intercalator)(すなわち、二重らせん構造内の境界となる分子)でよい。SYBR Green I及び臭化エチジウムは、このようなインターカレーターの例である。あるいは、色素又は染料は、Hoechst 33258のような非インターカレーティング(non-intercalating)であってもよい。
【０００９】
各ビーズは、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応のための酵素、例えばTaqポリメラーゼを含有していることが好ましい。各ビーズは、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応のための酵素と、使用時に緩衝効果をもたらす組成物とを含有してもよい。各ビーズは、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応のための酵素と、使用時に緩衝効果をもたらす組成物と、デオキシヌクレオシド三リン酸(標識されている、又は標識されていない)とを含有してもよい。
【００１０】
ビーズは、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する物質を含有していることが好ましい。一般的に、このような物質は、このような固形ビーズを製造するのには都合がよい、液滴(liquid droplet)から、固形で融解可能なビーズの形成を容易にする。
【００１１】
固形ビーズの形成を促進する物質は、１又は複数のワックス又はゲル化剤、例えば多糖類を含有してよい。多糖類は、カードランガム、カラギーナン、β−グルカン、グアーガム、ジェランガム、ゼラチン、ローカストビーンガム、ペクチン及びキサンタンガムのうちの１又は複数を含有してよい。多糖類は、ローカストビーンガム、ペクチン、カラギーナン、グアーガム、アガロースなどのガラクタンを含有してよい。
【００１２】
ビーズは、０．１から１０重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、好ましくは０．３から３重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、より好ましくは０．３から１．５重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、更に好ましくは０．４から１．２重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を含有してよい。固形ビーズの形成を促進する物質がゲル化剤、特に多糖類、より格別にガラクタン、特別にアガロースである場合、百分率組成(percentage composition)が特に効果的であることが判明した。
【００１３】
ビーズの平均直径は、５００から２５００ミクロンまで、より好ましくは８００から１５００ミクロンまで、更に好ましくは９００から１２００ミクロンまでとすることができる。
【００１４】
ビーズの直径の標準偏差は小さいことが好ましい。複数のビーズの直径の標準偏差は、ビーズの平均直径の３％を超えない、より好ましくは平均直径の２％を超えないとすることができる。
【００１５】
ビーズの融点は、使用する酵素に適した所定の温度とすることが好ましい。酵素の包括(entrapment)は、酵素がポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成を補助することを阻害する。そのため、所望の動作温度に達したときのみに酵素が放出されるようにビーズの融点を選択する。もし酵素が包括されていないなら、酵素はポリヌクレオチドの増幅又は合成を自由に補助するため、所望のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを生成する可能性がある。例えば、Taqポリメラーゼを包括しているビーズは、酵素の通常動作温度の数度以下で融解するように準備してよい。この場合、酵素の通常動作温度は約９４℃なので、ビーズの融解は９０℃としてよい。
【００１６】
ビーズの融解温度は１００℃を超えないことが好ましい。ビーズの融解温度は３０℃未満でないことが好ましい。ビーズの融解温度は８０℃から９５℃までが好ましい。
【００１７】
複数のビーズは、少なくとも１０個のビーズを、好ましくは少なくとも３０個のビーズを、より好ましくは少なくとも１００個のビーズを含有していることがよい。
【００１８】
本発明は、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な球形ビーズであり、本発明の第１の側面に従う複数のビーズから選択された融解可能な球形ビーズを更に提供する。
【００１９】
本発明の第２の側面によれば、複数の反応管(reaction vessels)が提供され、各反応管は、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の融解可能な球形ビーズを収納している。複数の反応管の中のビーズは５０ミクロンから２５００ミクロンまでの平均直径を有し、複数の反応管の中のビーズの直径の標準偏差は平均直径の５％を超えない。該ビーズの各々は、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬を含有している。
【００２０】
提供された融解可能な球形ビーズは、本発明の第１の側面について既に述べた特徴を示す。例えば、ビーズは、固形ビーズの形成を促進する物質、例えばガラクタンを含有してよい。
【００２１】
本発明の第３の側面によれば、融解可能なビーズを製造する反応装置が提供される。反応装置は、
(i) 冷却時に融解可能なビーズを形成する第１液体が流れる試料導管(sample conduit)と、
(ii) 前記試料導管と第１キャリア流体導管とは接合部で合流している、キャリア流体が流れる第１キャリア流体導管(carrier fluid conduit)と、
(iii) 前記接合部から遠ざかる分割流れ導管(segmented flow conduit)であって、
前記接合部に結合された近位部(proximal portion)と、前記接合部から下流にある遠位部(distal portion)とを備え、前記接合部で又は前記接合部の近傍で、前記反応装置は使用時に前記キャリア流体内の前記第１液体のセグメントの形成をもたらす、流れの狭窄(constriction)又は不連続(discontinuity)を備える、分割流れ導管と、
(iv) 前記試料導管と前記第１キャリア流体導管と、前記接合部と、選択的に前記分割流れ導管の近位部とを加熱するヒーターと、
(v) 前記第１液体のセグメントの固形化を促進するために、前記分割流れ導管の遠位部を冷却するクーラーとを備える。
【００２２】
本発明の装置は、固形ビーズを形成する、第１液体のセグメントを冷却することにより本発明の第１の側面のビーズを製造する、効果的な装置である。
【００２３】
反応装置は、接合部で試料導管と合流する第２キャリア流体導管を更に備えてもよい。
【００２４】
反応装置は、好ましくはマイクロ流体装置(microfluidic device)である。「マイクロ流体(microfluidic)」という語は、当業者に概してよく理解されている。このようなマイクロ流体装置の導管は、一般的に２ｍｍ以下の幅、好ましくは０．５から２．０ｍｍまでの幅を有する。導管の深さは、一般的に２ｍｍ未満、好ましくは０．５から２．０ｍｍまでである。流体の流量は、特に導管の断面積に依存し、ここで与えられた好ましい値は、
１ｍｍから及び２ｍｍの深さ、１ｍｍから２ｍｍまでの幅を有する導管に関連する。例えば、試料導管を流れる第１液体の流量は、有利には毎時約０．０２から約５ｍｌ、より好ましくは毎時約０．１から約２ｍｌとすることができる。キャリア流体の流量は、毎時約０．２から約６０ｍｌ、好ましくは毎時約０．２から約１５ｍｌ、より好ましくは毎時約１から約３ｍｌとすることができる。
【００２５】
試料導管、第１及び第２キャリア流体導管、分割流れ導管のうち、１又は複数(好ましくはすべて)は、ブロックなどの基体の表面に備えてよい。このことは都合がよい反応装置を提供し、基体内の機械加工導管(machining conduit)により一般的に形成される。基体は、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、例えばテフロンなどの低エネルギー材料を含んでよい。代替的には、比較的高い表面エネルギーの基体を機械加工し、低エネルギーの表面を有する通路を提供する低エネルギー材料で機械加工された基体を被覆することにより、導管を形成することができる。
【００２６】
反応装置は、固形ビーズを出す装置出口(device outlet)を好ましくは備えている。
【００２７】
反応装置は、固形ビーズによる出口の遮断を阻止するため、噴出液(flushing liquid)を装置出口に供給する、１又は複数の噴出導管(flushing conduit)を備えてもよい。
【００２８】
１又は複数の噴出導管は、装置出口の上流で分割流れ導管に合流していることが好ましい。１又は複数の噴出導管は、装置出口の近傍で分割流れ導管に合流していてよい。例えば、１又は複数の噴出導管は、装置出口の上流の、分割流れ導管の幅の２０倍未満の距離で分割流れ導管に合流している（ここで分割流れ導管の幅は、分割流れ導管が１又は複数の噴出導管に合流している位置での幅である）。反応装置は、噴出接合部(flushing junction)で分割流れ導管に合流する、２つの噴出導管を備えていることが好ましい。
【００２９】
１又は複数の噴出導管は、液体を１又は複数の噴出導管に導入する、噴出注入口(flush
inlet)と流体的に連通(in fluid communication)していることが好ましい。１つのみの噴出注入口があることが好ましい。
【００３０】
噴出液は、ビーズの形成に使用されるキャリア流体と同じでよい。
【００３１】
装置は、試料導管、第１キャリア流体導管、接合部、第２キャリア流体導管（もしあれば）及び選択的に分割流れ導管の近位部を加熱する、加熱プレートを備えてよい。
【００３２】
装置は、分割流れ導管の遠位部を冷却する、冷却プレートを備えてよい。特に導管が基体又はブロックに形成されている場合、冷却プレートは、装置の他の部位との良好な熱的接触を形成する好都合な方法である。
【００３３】
装置は、加熱プレートと冷却プレートを備えることが好ましい。この場合、加熱プレートと冷却プレートとの間に断熱間隙(insulating gap)があることが好ましい。断熱間隙は、空気などの断熱ガスを含んでいる。断熱間隙は０．１から１０ｍｍまでが好ましい。加熱プレートと冷却プレートとの間隔を０．１から１０ｍｍまでとしてよい。
【００３４】
冷却プレートと熱的に連通している分割流れ導管の長さは、加熱プレートと熱的に連通している分割流れ導管の長さの２から５倍までとすることができる。
【００３５】
分割流れ導管は、接合部から下流に、段差(step)を備えることができる。段差は、球形ビーズの形成を補助する。
【００３６】
段差は、分割流れ導管が接合部に合流する点から０．５ａから５ａまでの距離だけ下流に位置する。”ａ”は、段差よりすぐ上流での分割流れ導管の深さである。段差は、分割流れ導管が接合部に合流する点から０．５ａから２．０ａまで（より好ましくは０．５ａから１．５ａまで）の距離だけ下流に位置することが好ましい。”ａ”は、段差よりすぐ上流での分割流れ導管の深さである。これらの装置の幾何学的配置(geometries)は、球形ビーズの製造において効果的であることが判明した。
【００３７】
分割流れ導管は、分割流れ導管が接合部に合流する点から下流に、断面拡大部(enlargement in cross-section)を備えてもよい。このような断面拡大部は、拡大部において段差を作る。
【００３８】
断面拡大部は、分割流れ導管が接合部に合流する点から０．２５ｄから２．５ｄまでの距離だけ下流に位置する。”ｄ”は、拡大部よりすぐ下流での分割流れ導管の深さである。断面拡大部は、分割流れ導管が接合部に合流する点から０．２５ｄからｄまで（より好ましくは０．２５ｄから０．７５ｄまで）の距離だけ下流に位置することが好ましい。
【００３９】
拡大部よりすぐ下流での分割流れ導管の断面積は、拡大部よりすぐ上流での分割流れ導管の断面積の１．５から６倍まで（より好ましくは２から５倍まで）とすることができる。
【００４０】
本発明の第４の側面によれば、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な球形ビーズを製造する方法が提供され、該方法は、
(i) ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する物質とを供給すること；
(ii) 試料導管と、不混和液体(immiscible liquid)が流れる第１キャリア流体導管とを備え、前記試料導管と前記第１キャリア流体導管とは接合部で合流している反応装置を供給すること；
(iii) ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、前記１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する前記物質とを密な混合物(intimate admixture)で含有する液体を形成するために、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、前記１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する前記物質とを加熱すること；
(iv) 前記試料導管内に前記液体を、前記第１キャリア流体導管にキャリア流体を、それぞれ通過させて、前記接合部で又は前記接合部の下流で、小滴の形成をもたらすこと；
(v) 前記小滴を冷却することにより、固形ビーズの形成をもたらすこと；
を含む。
【００４１】
この方法は、ビーズ、特に球形のビーズを形成する効果的な方法を提供する。この方法は、低い多分散性、つまりサイズにおける小さい偏差を有するビーズを製造する効果的な方法であり、更に所望のサイズが広い範囲にわたるビーズの製造において効果的であることが判明した。
【００４２】
反応装置は、本発明の第３の側面に従う反応装置が好ましく、したがって本発明の第３の側面の反応装置に関して上述した特徴が組み込まれてもよい。
【００４３】
この方法は、本発明の第１の側面のビーズを形成するために使用してよい。したがって、本発明の第１の側面のビーズに関連するビーズ組成物に関連した記述もまた本発明の第４の側面の方法に関係する。
【００４４】
ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬は、本発明の第１の側面のビーズに関連して上述した試薬が好ましい。例えば、１又は複数の試薬は、標識されていない(unlabelled)オリゴヌクレオチド、標識されている(labelled)オリゴヌクレオチド、標識されているデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されているオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないオキシヌクレオシド三リン酸、ポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成のための酵素、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、ポリヌクレオチド、使用時に緩衝効果(buffering effect)をもたらす染料(stain)又は色素(dye)及び組成物(compound)のうちの１又は複数を含有してもよい。
【００４５】
標識されていないオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応に使用されるプリマーとしてよい。標識されているオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応に使用されるプローブとしてよい。ポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成のための酵素の例は当業者によく知られ、例えばTaq(登録商標)ポリメラーゼ又はリバーストランスクリプターゼである。ポリヌクレオチドは、増幅反応中に増幅されるポリヌクレオチドでもよい。もし試薬組成物が例えば陽性標準試料(positive control sample)を形成するならば、このようなポリヌクレオチドは有利に試薬組成物に組み込まれ得る。ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応での使用時に緩衝効果をもたらす組成物は、例えばＴＲＩＳ−ＨＣｌ(２−アミノ−２−(ヒドロキシメチル)−１，３−プロパンジオール，塩酸)でよい。
【００４６】
染料又は色素は、ポリヌクレオチドの増幅反応の進展を追跡するのに一般的に使用される染料又は色素のうちの１つであればよい。このような色素又は染料は、一般的に蛍光色素(fluorophores)でよい。色素又は染料は、インターカレーター(intercalator)(すなわち、二重らせん構造内に結合される分子)でよい。SYBR Green I及び臭化エチジウムは、このようなインターカレーターの例である。あるいは、色素又は染料は、Hoechst 33258のような非インターカレーティング(non-intercalating)であってもよい。
【００４７】
ステップ(iii)で形成される液体は、好ましくは水溶性である。したがって、キャリア流体は、水性混合物(aqueous mixture)、溶液(solution)又は懸濁液(suspension)と不混和(fluid immiscible)であることが好ましい。
【００４８】
更に、固形ビーズの形成を促進する物質は、１又は複数のワックス又はゲル化剤、例えば多糖類を含有してよい。多糖類は、カードランガム、カラギーナン、β−グルカン、グアーガム、ジェランガム、ゼラチン、ローカストビーンガム、ペクチン及びキサンタンガムのうちの１又は複数を含有してよい。多糖類は、ローカストビーンガム、ペクチン、カラギーナン、グアーガム、アガロースなどのガラクタンを含有してよい。
【００４９】
ステップ(iii)で形成される液体は、０．１から１０重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、好ましくは０．３から３重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、より好ましくは０．３から１．５重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、更に好ましくは０．４から１．２重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を含有してよい。固形ビーズの形成を促進する物質がガラクタンなどのゲル化剤である場合、これらの範囲は特に有益である。
【００５０】
ビーズの融点は、使用する酵素に適した所定の温度とすることが好ましい。酵素の包括(entrapment)は、酵素がポリヌクレオチドの増幅又は合成を補助することを阻害する。そのため、所望の動作温度に達したときのみに酵素が放出されるようにビーズの融点を選択する。もし酵素が包括されていないなら、酵素はポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成を自由に補助し、そして、所望のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを生成する可能性がある。
【００５１】
装置は、接合部から遠ざかる分割流れ導管を備えていることが好ましく、液体ビーズ(liquid beads)が分割流れ導管の中で冷却される。分割流れ導管は、接合部に結びつく近位部と、接合部から下流にある遠位部とを備えることが好ましい。
【００５２】
本発明の第５の側面によれば、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能なビーズの形成のための水性組成物が提供され、組成物は、固形ビーズの形成を促進する物質と、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬とを含有し、組成物は０．１から１０重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を含有する。
【００５３】
組成物は、好ましくは０．３から３重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、より好ましくは０．３から１．５重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、更に好ましくは０．４から１．２重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を含有してよい。固形ビーズの形成を促進する物質が多糖類などのゲル化剤である場合、これらの範囲は特に有益である。
【００５４】
装置は、マイクロ流体装置としてよい。
【００５５】
装置は、好ましくは接合部で試料導管と合流する第２キャリア流体導管を備えてもよい。
【００５６】
本発明の第５の側面に従う組成物は、例えば、本発明の第４の側面の方法を用いて、本発明の第１の側面のビーズを形成するために使用される。本発明の第５の側面の組成物は、本発明の第４の側面で使用される液体としてよい。本発明の第１の側面のビーズの組成物に関連した記述は、本発明の第５の側面の混合物にも適用される。
【００５７】
例えば、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬は、以下の１又は複数を含有してよい：標識されていないオリゴヌクレオチド、標識されているオリゴヌクレオチド、標識されているデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されているオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないオキシヌクレオシド三リン酸、ポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成のための酵素、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、ポリヌクレオチド、使用時に緩衝効果をもたらす染料又は色素及び組成物。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
次の図面を例示のためのみに参照して、本発明を以下に説明する。
【図１】図１は、本発明に従う反応装置の平面図である。図１Ｂは、装置出口(device outlet)の周囲である、図１の装置の一部の平面図で、噴出配置(flushing arrangement)を示す。
【図２】図２は、図１の反応装置の概略斜視図である。
【図３ａ】図３ａは、反応装置の接合部の周囲の領域の平面図である。
【図３ｂ】図３ｂは、反応装置の接合部の周囲の領域の断面図である。
【図４】図４は、液体内に格納された１又は複数の試薬と比較した、固形ビーズ内の１又は複数の試薬の包括の効果を示す、ＰＣＲ生成物のゲルプレートの電気泳動像である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
図１は本発明に従う反応装置を示し、反応装置は符号１で概して示される。反応装置１は、冷却時に融解可能なビーズを形成する第１液体が流れる試料導管２と、キャリア流体が流れる第１キャリア流体導管４とを含み、試料導管２と第１キャリア流体導管４とは接合部１４で合流する。分割流れ導管７は接合部から遠ざかり、分割流れ導管７は接合部１４に結合された近位部１８と、接合部から下流にある遠位部１９とを有する。反応装置は、キャリア流体が流れる第２キャリア流体導管３を更に備える。第２キャリア流体導管３は接合部１４で試料導管２に合流する。接合部で、又は、接合部の近傍で、反応装置は使用時にキャリア流体内の第１液体のセグメントの形成をもたらす、流れの狭窄又は不連続を備える。この場合、接合部位自身が流れの狭窄をもたらしている。図３ａ及び３ｂを参照すれば、接合部１４のすぐ下流にある、分割流れ導管７の部分３４の断面は、試料導管２と第１及び第２キャリア流体導管のそれぞれと同じである。このことは流れの狭窄をもたらし、該狭窄はキャリア流体内の第１液体のセグメントの形成をもたらす。反応装置１は、試料導管と第１キャリア流体導管と、接合部と、分割流れ導管の近位部１８とを加熱するヒーター（図示しない）を更に備える。反応装置１は、第１液体のセグメントの固形化を促進するために、分割流れ導管の遠位部１９を冷却するクーラー（図示しない）を更に備える。
【００６０】
図２を参照すれば、ヒーター（図示しない）は、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)の基体の底面に対して当接して固定された、加熱プレート１６と熱的に連通し、該基体には、試料導管２、第１及び第２キャリア流体導管及び分割流れ導管７が形成されている。同様に、クーラー（この場合、水冷ポンプシステム）は、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)の基体の底面に対して当接して固定された、冷却プレート１７と熱的に連通している。の場合、加熱プレート１６と冷却プレート１７とは、小さい断熱間隙(insulating gap)１５（この場合５ｍｍの空気が提供される）により分割されている。断熱間隙１５は、加熱プレート１６と冷却プレート１７との間の熱的な連通を減少させる。この分離は、接合領域１４と分割流れ導管７の領域１８が冷却プレート１７により著しく冷却されないこと、逆に分割流れ導管７の領域１９が加熱プレート１６により著しく加熱されないことを保証する。
【００６１】
接合部１４の幾何学的配置は、図３ａ及び３ｂに詳細に示される。接合部１４にて第１及び第２キャリア流体導管は試料導管２に合流する。分割流れ導管７は接合部１４から遠ざかる。分割流れ導管７は、接合部１４から下流に、断面における拡大部(enlargement)３３を備える。分割流れ導管７の拡大部３３から上流の部分３４の深さは、分割流れ導管７の拡大部３３からすぐ下流の部分３５の深さの約０．７倍である。更に、分割流れ導管７の拡大部３３から上流の部分３４の幅は、１．２５ｍｍであり、分割流れ導管７の拡大部３３からすぐ下流の部分３５の幅（１．７ｍｍ）の約０．７倍である。分割流れ導管７が接合部１４に合流する点３６から拡大部３３までの距離は、部分３４の深さとほぼ同じである。更に、分割流れ導管７の拡大部３３からすぐ下流の深さは、１．７ｍｍであり、分割流れ導管７の拡大部３３からすぐ上流の部分の深さ（１．２５ｍｍ）の約１．４倍である。この拡大部３３と、拡大部の接合部１４に対する相対的な位置は、球形ビーズの形成を補助することにおいて有益であることが判明した。試料導管２及びキャリア流体導管３、４はそれぞれ１．２５ｍｍの幅及び深さを有する。導管のサイズは、製造されるビーズのサイズの決定の助けとなり、異なる幅や深さの導管は、異なるサイズのビーズの製造に使用することができる。
【実施例１】
【００６２】
図１、２、３ａ、３ｂを参照して、本発明に従う、融解可能なビーズの製造方法の例を説明する。
【００６３】
Taq(登録商標)ポリメラーゼとアガロース(シグマ−アルドリッチ社、ギリンガム、ドーセット、英国)との水溶液を以下のように準備した。既知量のアガロースを既知量の水に、すなわち水１０００μｌあたり１１ｍｇのアガロースが加えられた。電子レンジ内で、ファルコン管内の水及びアガロースを加熱することにより、アガロースの溶解が促進された。そして、ファルコン管は７０℃の水槽に入れられた。１００μｌのTaq(登録商標)ポリメラーゼ（ヘレナ バイオサイエンシズ、ゲートシード、英国）を測ってエッペンドルフ管内に入れられ、エッペンドルフ管は７０℃の水槽に入れられた。
【００６４】
エッペンドルフ管とファルコン管と７０℃の水槽から取り除かれた。９４８μｌのアガロース溶液は、Taq(登録商標)ポリメラーゼが入っているエッペンドルフ管にピペットで移され、エッペンドルフ管の内容物は、２７００ｒｐｍで２〜４秒撹拌混合(vortex-mix)された。次に、エッペンドルフ管はスペクトラフュージ遠心分離機に挿入され、エッペンドルフ管の内容物は約５から１０秒遠心分離された。
【００６５】
そして、エッペンドルフ管は７０℃の水槽に戻される。３０秒未満の持続時間の間、エッペンドルフ管は水槽から出さなければならない。
【００６６】
予熱された１ｍｌの注射器にTaq(登録商標)／アガロース溶液が注入される。注射器は、注射器とその内容物を約６５℃に維持する注射器ヒーター（図示しない）に挿入される。注射器は注入口(inlet)５に接続される。３本の１０ｍｌの注射器に鉱物油(シグマ−アルドリッチ社、ギリンガム、ドーセット、英国)が注入される。３本の注射器の各々が、キャリア流体注入口６の１つ及び噴出注入口１０に接続される。自動注射器駆動(automated syringe driver)により各注射器から液体が放出される。キャリア流体３２はキャリア流体注入口６へ、第１及び第２キャリア流体導管３、４へ、毎時１０ｍｌの流量で押し流される。アガロース及びTaq(登録商標)の水溶液３１は試料導管２へ毎時１．３ｍｌの流量で押し流される。噴出流体(flushing fluid)は噴出導管(flushing conduit)８へ毎時１５ｍｌの流量で押し流される。
【００６７】
図３ａ、３ｂを参照すると、キャリア流体３２と水溶液３１とが接合部１４で合流すると、水溶液の首のある小滴形状(necked-droplet shape)の形成が見られる。首のある小滴形状が下流に移動するにつれて、首が狭くなり、分裂して分離された水滴となるのが見られる。接合部より下流で分離された小滴の形成が見られる。拡大部３３が球形小滴の形成を促進しているようである。
【００６８】
図１を参照すると、球形小滴の形成を促進するために分割流れ導管７の領域１８が加熱される。金属プレート１７の底面全体に氷で冷やされた水を流すことにより、分割流れ導管７の領域１９は冷却される。
【００６９】
小滴は冷却された領域１９を通過し、冷やされ、固形ビーズを形成する。キャリア流体３２により、固形ビーズは装置出口９内を通って装置１の外に運ばれる。
【００７０】
装置１は、固形ビーズによる装置出口９の遮断を阻止する噴出配置(flushing arrangement)を備えている。図１Ｂは、装置１の装置出口９の周囲領域の平面図である。図１及び図１Ｂを参照すれば、固形ビーズは分割流れ導管７に沿って装置出口９に向かって通過する。噴出流体（この場合、キャリア流体３２と同じである）は、噴出注入口１０を介して注射器（図示しない）から導管８へ流れる。導管８は、噴出導管８ａ、８ｂに噴出流体を供給する。噴出導管８ａ、８ｂは、装置出口９の近傍にある噴出接合部１１で分割流れ導管７に合流する。比較的高い流量で、分割流れ導管７の装置出口９のすぐ上流において、噴出流体を導入することは、固形ビーズを装置出口９の外に押し流し、装置出口９の遮断を阻止する。
【００７１】
そして、固形ビーズは適切に保管された。
【実施例２】
【００７２】
実施例１の方法が繰り返され、０．１単位のTaq(登録商標)ポリメラーゼをそれぞれ含有するビーズが製造された。１つのビーズが、ＰＣＲ”ストリップ(strip)”のウェル(well)の各々に置かれ、各々のウェルに５μｌのＰＣＲ”マスターミックス(master mix)”を加えた。マスターミックスは、キアゲン緩衝(Qiagen buffer)、ＭｇＣｌ２溶液、dNTPミックス(dNTP mix)、水、PBR322プラスミド(plasmid)、Sal1及びBamH1プライマーを含有していた。この処理は、５つのウェルすべてに反復された。陽性標準試料(positive control sample)は、ビーズを含む試料と同時に投入された。陽性標準は、ＰＣＲマスターミックスにTaq(登録商標)ポリメラーゼ溶液（Taq(登録商標)ポリメラーゼを含有するビーズと対照に）を加えることにより作られた。ウェルはキャップで密閉されてＭＪリサーチ(MJ Research)社のサーマルサイクラー(thermal cycler)に置かれ、サーマルサイクリングシーケンス(thermal cycling sequence)が実行された。使用されたサーマルサイクリングシーケンスは、
(i) 初期変性 − ９４℃ ５分
(ii) ３０サイクルの３ステップサイクリング。各サイクルは次のステップを含む：
変性 − ９４℃ − ３０秒
アニーリング − ５５℃ − ３０秒
伸長 − ７２℃ − １分
(iii) 最終伸長 − ７２℃ − １０分
【００７３】
電気泳動槽内のアガロースゲル上で、サーモＥＣ(Thermo EC)社の電源を用いて、ＰＣＲ生成物の電気泳動を行なった。紫外線透過照射器を用いて、生成物はゲル上に視覚化された。
【００７４】
電気泳動は、ＰＣＲウェルから摘出された５つの試料のそれぞれが陽性標準と同じ電気泳動バンドを示し、効果的な増幅が起こったことを示した。
【００７５】
この実施例は、本発明のビーズを使用して、非常に小さい反応容積が使用できることを明らかにしている。
【実施例３】
【００７６】
実施例１及び２に述べた方法で融解可能なビーズが製造され、上述した陽性標準試料と並行して上述したＰＣＲ反応が行なわれた。図４を参照すると、”Ｌ”は陽性標準試料を示し、”ＬＡＤ”は２−ｌｏｇ ＤＮＡラダー参照試料(2-log DNA ladder reference sample)を示し、”Ｂ１”及び”Ｂ２”は本発明に従う融解可能ビーズを使用して作られた２つの試料を示す。ビーズは１つの電気泳動バンドのみを与えるＰＣＲ生成物を作り、１つだけの増幅生成物が生成されたことを示していることは明らかである。陽性標準試料は少なくとも３つの電気泳動バンドを示し、ＰＣＲ反応により少なくとも３つの増幅生成物が生成されたことを示している。本発明のビーズを使用して得られた、増大した増幅の特異性は、ビーズが９０℃以上で溶解してTaq(登録商標)ポリメラーゼが放出されるまで、TaqがＰＣＲマスターミックス内の試薬から分離されていたことによると考えられる。
【実施例４】
【００７７】
実施例１〜３は、どのようにしてポリメラーゼがビーズ内に包括(entrap)されたかを示す。また、本発明のビーズ内に１又は複数のプライマーを取り込むこともできる。
【００７８】
１５０μｌのSal1プライマー溶液（ストック濃度＝１０ピコモル／μｌ）と１５０μｌのBAMH1プライマー溶液（ストック濃度＝１０ピコモル／μｌ）を、３００μｌの溶融(molten)アガロース溶液の２重量％溶液に加えた。これで１重量％のアガロースと各プライマー１５００ｐｍｏｌとを含有する溶液が生成された。
【００７９】
図１、１Ｂ、２、３Ａ、３Ｂを参照して説明された装置を用いて、プライマーを含有するビーズが製造された。試料導管２に供給されるアガロース／プライマー溶液の流量は、毎時１．８６ｍｌであった。第１及び第２キャリア流体導管３、４に供給されるキャリア流体の流量は、毎時２０ｍｌであった。噴出導管８ａ、８ｂに供給される噴出流体の流量は、毎時１５ｍｌであった。
【００８０】
固形ビーズは集められ、Motic Images Plus 2.0ソフトウェアと組み合わたMotic社の顕微鏡を用いて、ビーズのサイズが測定された。製造された球形ビーズは、１２３０±３０μｍの直径を有すると判明した。各ビーズは３．０８ｐｍｏｌの各プライマーを含有していることが計算できる。
【００８１】
プライマーを含有するビーズは、上記実施例２で説明した反応と同様なＰＣＲ反応に使用される。所望の増幅生成物が生成され、電気泳動像により確認された。
【実施例５】
【００８２】
Qiagen SYBR Green ＰＣＲマスターミックスをビーズに取り込むために、実施例１及び２の方法が修正された。形成されたビーズは公称１０００μｍの直径を有する。したがって、約５２６ｎｌのマスターミックスを含有する。２２マスターミックスを含有するビーズからなる試料及びｐＢＲ３２２２テンプレートに対して、上記実施例２で説明したサーマルサイクリングが実行された。マスターミックス溶液を含有する陽性標準試料に対して、同様のサーマルサイクリングの体制が実行された。電気泳動は、ビーズが陽性標準試料と等価な増幅を起こしたことを示した。
【実施例６】
【００８３】
実施例２で説明したようにTaq(登録商標)ポリメラーゼを含有するビーズが形成された。ドナーからのｃＤＮＡの試料、ベータ−アクチン遺伝子の増幅のためにプライマーを含有する、ヒトのベータ−アクチン遺伝子(beta-actin gene)の増幅に必要なすべての試薬を含有するＰＣＲマスターミックスに、３個のビーズ（合計０．５単位のTaq(登録商標)ポリメラーゼ）が加えられた。サーマルサイクリングの後、電気泳動は、ＰＣＲ反応が成功したことを示した。このことは、本発明のビーズはｃＤＮＡからヒト遺伝子を増幅するために使用できることを示す。
【実施例７】
【００８４】
実施例２で説明したようにTaq(登録商標)ポリメラーゼを含有するビーズが形成された。１ステップ逆転写酵素(one-step reverse transcriptase)ＰＣＲ反応が以下に説明するように実行された。ｐｏｌｙＴプライマーが７０度に加熱してテンプレートＲＮＡにアニールされ、０℃に急速冷却(crash-cooling)された。そして、５μｌのプライムド(primed)ＲＮＡが、本発明に従うビーズを含有するＲＴ−ＰＣＲマスターミックスに加えられた。ビーズはTaq(登録商標)ポリメラーゼ）を含有する。反応混合物(reaction mixture)は２５℃で５分間維持され、４２℃に加熱された。反応混合物はこの温度で６０分間維持され、ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡの逆転写が容易となった。次に、試料が７０℃に加熱され、この温度で１５分間維持された。この温度で、ＲＮＡ−ｃＤＮＡ二重鎖(duplex)は溶解し、ｃＤＮＡの二重鎖が形成される。各サイクルが９４℃、３０秒の変性、６０℃、３０秒のアニーリング、７２℃、１分の伸長のステップを含有する、３０サイクルの３ステップサイクリングを行なうことにより、ｃＤＮＡが増幅される。７２℃、５分の最終伸長のステップが実行された。同時に陽性標準遺伝子(positive control gene)が陽性標準プライマー(positive control primer)を用いて増幅された。本発明に従うビーズを含有する試料は所望の増幅生成物を生成したことが電気泳動で確認された。ミスプライミング（mispriming)によると思われる、いくつかの大きい分子量のＤＮＡバンドが観測された。
【００８５】
低表面エネルギーのポリマーの、この場合ポリテトラフルオロエチレンのブロックから導管を機械加工することにより、図１、２、３ａ、３ｂの装置のすべての導管は製造された。
【００８６】
本発明のビーズの製造方法は、上述した装置以外の装置を用いて実行できることは、当業者にとって容易に理解できるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応、例えば（これのみではないが）ポリメラーゼ連鎖反応(PCR, polymerase chain reaction)に使用されるビーズ、該ビーズを製造する装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチド増幅反応は、増幅を開始する１または複数のプライマーと連動して、問題となるポリヌクレオチドシーケンスの増幅を促進させる酵素(ポリメラーゼ)を一般的に使用する。従来の増幅反応では、最初のＤＮＡ変性の前を含む、反応プロセスの全体にわたって試薬は互いに接触している。これらの反応条件は、望ましくない増幅生成物の生成をもたらし得る。少なくともいくつかの試薬を互いに分離するために、融解可能なビーズ(meltable beads)はＰＣＲ反応に使用されてきた。従来のビーズを製造するために使用される技術では、均一でないサイズのビーズが製造され、そのためユーザーはビーズの中に含有する試薬の正確な分量を知らず、ある種の用途では問題を引き起こす可能性がある。更に、従来のビーズの使用期限は限定される可能性がある。また、一般的に、従来のビーズを製造するために使用される各技術は、小さいサイズの範囲のビーズの製造にのみ適している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、これらの問題のうちの１又は複数を解決するために提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１の側面によれば、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な複数の球形ビーズが提供され、該ビーズは５０から２５００ミクロンまでの平均直径を有し、複数のビーズの直径の標準偏差は、該複数のビーズの平均直径の５％を超えない。該ビーズの各々は、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬を含有している。
【０００５】
これらのビーズは、ポリヌクレオチドの増幅反応での使用に特に有益であると判明した。
【０００６】
１又は複数の試薬は、標識されていない(unlabelled)オリゴヌクレオチド、標識されている(labelled)オリゴヌクレオチド、標識されているデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されているオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないオキシヌクレオシド三リン酸、ポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成のための酵素、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、ポリヌクレオチド、使用時に緩衝効果(buffering effect)をもたらす染料(stain)又は色素(dye)及び組成物(compound)のうちの１又は複数を含有してもよい。
【０００７】
標識されていないオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応に使用されるプリマーとしてよい。標識されているオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応に使用されるプローブとしてよい。ポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成のための酵素の例は当業者によく知られ、例えばTaq(登録商標)ポリメラーゼ又はリバーストランスクリプターゼである。ポリヌクレオチドは、増幅反応中に増幅されるポリヌクレオチドでもよい。もし試薬組成物が例えば陽性標準試料(positive control sample)を形成するならば、このようなポリヌクレオチドは有利に試薬組成物に組み込まれ得る。ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応での使用時に緩衝効果をもたらす組成物は、例えばＴＲＩＳ−ＨＣｌ(２−アミノ−２−(ヒドロキシメチル)−１，３−プロパンジオール，塩酸)でよい。
【０００８】
染料又は色素は、ポリヌクレオチドの増幅反応の進展を追跡するのに一般的に使用される染料又は色素のうちの１つであればよい。このような色素又は染料は、一般的に蛍光色素(fluorophores)でよい。色素又は染料は、インターカレーター(intercalator)(すなわち、二重らせん構造内の境界となる分子)でよい。SYBR Green I及び臭化エチジウムは、このようなインターカレーターの例である。あるいは、色素又は染料は、Hoechst 33258のような非インターカレーティング(non-intercalating)であってもよい。
【０００９】
各ビーズは、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応のための酵素、例えばTaqポリメラーゼを含有していることが好ましい。各ビーズは、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応のための酵素と、使用時に緩衝効果をもたらす組成物とを含有してもよい。各ビーズは、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応のための酵素と、使用時に緩衝効果をもたらす組成物と、デオキシヌクレオシド三リン酸(標識されている、又は標識されていない)とを含有してもよい。
【００１０】
ビーズは、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する物質を含有していることが好ましい。一般的に、このような物質は、このような固形ビーズを製造するのには都合がよい、液滴(liquid droplet)から、固形で融解可能なビーズの形成を容易にする。
【００１１】
固形ビーズの形成を促進する物質は、１又は複数のワックス又はゲル化剤、例えば多糖類を含有してよい。多糖類は、カードランガム、カラギーナン、β−グルカン、グアーガム、ジェランガム、ゼラチン、ローカストビーンガム、ペクチン及びキサンタンガムのうちの１又は複数を含有してよい。多糖類は、ローカストビーンガム、ペクチン、カラギーナン、グアーガム、アガロースなどのガラクタンを含有してよい。
【００１２】
ビーズは、０．１から１０重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、好ましくは０．３から３重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、より好ましくは０．３から１．５重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、更に好ましくは０．４から１．２重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を含有してよい。固形ビーズの形成を促進する物質がゲル化剤、特に多糖類、より格別にガラクタン、特別にアガロースである場合、百分率組成(percentage composition)が特に効果的であることが判明した。
【００１３】
ビーズの平均直径は、５００から２５００ミクロンまで、より好ましくは８００から１５００ミクロンまで、更に好ましくは９００から１２００ミクロンまでとすることができる。
【００１４】
ビーズの直径の標準偏差は小さいことが好ましい。複数のビーズの直径の標準偏差は、ビーズの平均直径の３％を超えない、より好ましくは平均直径の２％を超えないとすることができる。
【００１５】
ビーズの融点は、使用する酵素に適した所定の温度とすることが好ましい。酵素の包括(entrapment)は、酵素がポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成を補助することを阻害する。そのため、所望の動作温度に達したときのみに酵素が放出されるようにビーズの融点を選択する。もし酵素が包括されていないなら、酵素はポリヌクレオチドの増幅又は合成を自由に補助するため、所望のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを生成する可能性がある。例えば、Taqポリメラーゼを包括しているビーズは、酵素の通常動作温度の数度以下で融解するように準備してよい。この場合、酵素の通常動作温度は約９４℃なので、ビーズの融解は９０℃としてよい。
【００１６】
ビーズの融解温度は１００℃を超えないことが好ましい。ビーズの融解温度は３０℃未満でないことが好ましい。ビーズの融解温度は８０℃から９５℃までが好ましい。
【００１７】
複数のビーズは、少なくとも１０個のビーズを、好ましくは少なくとも３０個のビーズを、より好ましくは少なくとも１００個のビーズを含有していることがよい。
【００１８】
本発明は、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な球形ビーズであり、本発明の第１の側面に従う複数のビーズから選択された融解可能な球形ビーズを更に提供する。
【００１９】
本発明の第２の側面によれば、複数の反応管(reaction vessels)が提供され、各反応管は、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の融解可能な球形ビーズを収納している。複数の反応管の中のビーズは５０ミクロンから２５００ミクロンまでの平均直径を有し、複数の反応管の中のビーズの直径の標準偏差は平均直径の５％を超えない。該ビーズの各々は、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬を含有している。
【００２０】
提供された融解可能な球形ビーズは、本発明の第１の側面について既に述べた特徴を示す。例えば、ビーズは、固形ビーズの形成を促進する物質、例えばガラクタンを含有してよい。
【００２１】
本発明の第３の側面によれば、融解可能なビーズを製造する反応装置が提供される。反応装置は、
(i) 冷却時に融解可能なビーズを形成する第１液体が流れる試料導管(sample conduit)と、
(ii) 前記試料導管と第１キャリア流体導管とは接合部で合流している、キャリア流体が流れる第１キャリア流体導管(carrier fluid conduit)と、
(iii) 前記接合部から遠ざかる分割流れ導管(segmented flow conduit)であって、
前記接合部に結合された近位部(proximal portion)と、前記接合部から下流にある遠位部(distal portion)とを備え、前記接合部で又は前記接合部の近傍で、前記反応装置は使用時に前記キャリア流体内の前記第１液体のセグメントの形成をもたらす、流れの狭窄(constriction)又は不連続(discontinuity)を備える、分割流れ導管と、
(iv) 前記試料導管と前記第１キャリア流体導管と、前記接合部と、選択的に前記分割流れ導管の近位部とを加熱するヒーターと、
(v) 前記第１液体のセグメントの固形化を促進するために、前記分割流れ導管の遠位部を冷却するクーラーとを備える。
【００２２】
本発明の装置は、固形ビーズを形成する、第１液体のセグメントを冷却することにより本発明の第１の側面のビーズを製造する、効果的な装置である。
【００２３】
反応装置は、接合部で試料導管と合流する第２キャリア流体導管を更に備えてもよい。
【００２４】
反応装置は、好ましくはマイクロ流体装置(microfluidic device)である。「マイクロ流体(microfluidic)」という語は、当業者に概してよく理解されている。このようなマイクロ流体装置の導管は、一般的に２ｍｍ以下の幅、好ましくは０．５から２．０ｍｍまでの幅を有する。導管の深さは、一般的に２ｍｍ未満、好ましくは０．５から２．０ｍｍまでである。流体の流量は、特に導管の断面積に依存し、ここで与えられた好ましい値は、
１ｍｍから及び２ｍｍの深さ、１ｍｍから２ｍｍまでの幅を有する導管に関連する。例えば、試料導管を流れる第１液体の流量は、有利には毎時約０．０２から約５ｍｌ、より好ましくは毎時約０．１から約２ｍｌとすることができる。キャリア流体の流量は、毎時約０．２から約６０ｍｌ、好ましくは毎時約０．２から約１５ｍｌ、より好ましくは毎時約１から約３ｍｌとすることができる。
【００２５】
試料導管、第１及び第２キャリア流体導管、分割流れ導管のうち、１又は複数(好ましくはすべて)は、ブロックなどの基体の表面に備えてよい。このことは都合がよい反応装置を提供し、基体内の機械加工導管(machining conduit)により一般的に形成される。基体は、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、例えばテフロンなどの低エネルギー材料を含んでよい。代替的には、比較的高い表面エネルギーの基体を機械加工し、低エネルギーの表面を有する通路を提供する低エネルギー材料で機械加工された基体を被覆することにより、導管を形成することができる。
【００２６】
反応装置は、固形ビーズを出す装置出口(device outlet)を好ましくは備えている。
【００２７】
反応装置は、固形ビーズによる出口の遮断を阻止するため、噴出液(flushing liquid)を装置出口に供給する、１又は複数の噴出導管(flushing conduit)を備えてもよい。
【００２８】
１又は複数の噴出導管は、装置出口の上流で分割流れ導管に合流していることが好ましい。１又は複数の噴出導管は、装置出口の近傍で分割流れ導管に合流していてよい。例えば、１又は複数の噴出導管は、装置出口の上流の、分割流れ導管の幅の２０倍未満の距離で分割流れ導管に合流している（ここで分割流れ導管の幅は、分割流れ導管が１又は複数の噴出導管に合流している位置での幅である）。反応装置は、噴出接合部(flushing junction)で分割流れ導管に合流する、２つの噴出導管を備えていることが好ましい。
【００２９】
１又は複数の噴出導管は、液体を１又は複数の噴出導管に導入する、噴出注入口(flush
inlet)と流体的に連通(in fluid communication)していることが好ましい。１つのみの噴出注入口があることが好ましい。
【００３０】
噴出液は、ビーズの形成に使用されるキャリア流体と同じでよい。
【００３１】
装置は、試料導管、第１キャリア流体導管、接合部、第２キャリア流体導管（もしあれば）及び選択的に分割流れ導管の近位部を加熱する、加熱プレートを備えてよい。
【００３２】
装置は、分割流れ導管の遠位部を冷却する、冷却プレートを備えてよい。特に導管が基体又はブロックに形成されている場合、冷却プレートは、装置の他の部位との良好な熱的接触を形成する好都合な方法である。
【００３３】
装置は、加熱プレートと冷却プレートを備えることが好ましい。この場合、加熱プレートと冷却プレートとの間に断熱間隙(insulating gap)があることが好ましい。断熱間隙は、空気などの断熱ガスを含んでいる。断熱間隙は０．１から１０ｍｍまでが好ましい。加熱プレートと冷却プレートとの間隔を０．１から１０ｍｍまでとしてよい。
【００３４】
冷却プレートと熱的に連通している分割流れ導管の長さは、加熱プレートと熱的に連通している分割流れ導管の長さの２から５倍までとすることができる。
【００３５】
分割流れ導管は、接合部から下流に、段差(step)を備えることができる。段差は、球形ビーズの形成を補助する。
【００３６】
段差は、分割流れ導管が接合部に合流する点から０．５ａから５ａまでの距離だけ下流に位置する。”ａ”は、段差よりすぐ上流での分割流れ導管の深さである。段差は、分割流れ導管が接合部に合流する点から０．５ａから２．０ａまで（より好ましくは０．５ａから１．５ａまで）の距離だけ下流に位置することが好ましい。”ａ”は、段差よりすぐ上流での分割流れ導管の深さである。これらの装置の幾何学的配置(geometries)は、球形ビーズの製造において効果的であることが判明した。
【００３７】
分割流れ導管は、分割流れ導管が接合部に合流する点から下流に、断面拡大部(enlargement in cross-section)を備えてもよい。このような断面拡大部は、拡大部において段差を作る。
【００３８】
断面拡大部は、分割流れ導管が接合部に合流する点から０．２５ｄから２．５ｄまでの距離だけ下流に位置する。”ｄ”は、拡大部よりすぐ下流での分割流れ導管の深さである。断面拡大部は、分割流れ導管が接合部に合流する点から０．２５ｄからｄまで（より好ましくは０．２５ｄから０．７５ｄまで）の距離だけ下流に位置することが好ましい。
【００３９】
拡大部よりすぐ下流での分割流れ導管の断面積は、拡大部よりすぐ上流での分割流れ導管の断面積の１．５から６倍まで（より好ましくは２から５倍まで）とすることができる。
【００４０】
本発明の第４の側面によれば、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な球形ビーズを製造する方法が提供され、該方法は、
(i) ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する物質とを供給すること；
(ii) 試料導管と、不混和液体(immiscible liquid)が流れる第１キャリア流体導管とを備え、前記試料導管と前記第１キャリア流体導管とは接合部で合流している反応装置を供給すること；
(iii) ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、前記１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する前記物質とを密な混合物(intimate admixture)で含有する液体を形成するために、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、前記１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する前記物質とを加熱すること；
(iv) 前記試料導管内に前記液体を、前記第１キャリア流体導管にキャリア流体を、それぞれ通過させて、前記接合部で又は前記接合部の下流で、小滴の形成をもたらすこと；
(v) 前記小滴を冷却することにより、固形ビーズの形成をもたらすこと；
を含む。
【００４１】
この方法は、ビーズ、特に球形のビーズを形成する効果的な方法を提供する。この方法は、低い多分散性、つまりサイズにおける小さい偏差を有するビーズを製造する効果的な方法であり、更に所望のサイズが広い範囲にわたるビーズの製造において効果的であることが判明した。
【００４２】
反応装置は、本発明の第３の側面に従う反応装置が好ましく、したがって本発明の第３の側面の反応装置に関して上述した特徴が組み込まれてもよい。
【００４３】
この方法は、本発明の第１の側面のビーズを形成するために使用してよい。したがって、本発明の第１の側面のビーズに関連するビーズ組成物に関連した記述もまた本発明の第４の側面の方法に関係する。
【００４４】
ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬は、本発明の第１の側面のビーズに関連して上述した試薬が好ましい。例えば、１又は複数の試薬は、標識されていない(unlabelled)オリゴヌクレオチド、標識されている(labelled)オリゴヌクレオチド、標識されているデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されているオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないオキシヌクレオシド三リン酸、ポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成のための酵素、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、ポリヌクレオチド、使用時に緩衝効果(buffering effect)をもたらす染料(stain)又は色素(dye)及び組成物(compound)のうちの１又は複数を含有してもよい。
【００４５】
標識されていないオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応に使用されるプリマーとしてよい。標識されているオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応に使用されるプローブとしてよい。ポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成のための酵素の例は当業者によく知られ、例えばTaq(登録商標)ポリメラーゼ又はリバーストランスクリプターゼである。ポリヌクレオチドは、増幅反応中に増幅されるポリヌクレオチドでもよい。もし試薬組成物が例えば陽性標準試料(positive control sample)を形成するならば、このようなポリヌクレオチドは有利に試薬組成物に組み込まれ得る。ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応での使用時に緩衝効果をもたらす組成物は、例えばＴＲＩＳ−ＨＣｌ(２−アミノ−２−(ヒドロキシメチル)−１，３−プロパンジオール，塩酸)でよい。
【００４６】
染料又は色素は、ポリヌクレオチドの増幅反応の進展を追跡するのに一般的に使用される染料又は色素のうちの１つであればよい。このような色素又は染料は、一般的に蛍光色素(fluorophores)でよい。色素又は染料は、インターカレーター(intercalator)(すなわち、二重らせん構造内に結合される分子)でよい。SYBR Green I及び臭化エチジウムは、このようなインターカレーターの例である。あるいは、色素又は染料は、Hoechst 33258のような非インターカレーティング(non-intercalating)であってもよい。
【００４７】
ステップ(iii)で形成される液体は、好ましくは水溶性である。したがって、キャリア流体は、水性混合物(aqueous mixture)、溶液(solution)又は懸濁液(suspension)と不混和(fluid immiscible)であることが好ましい。
【００４８】
更に、固形ビーズの形成を促進する物質は、１又は複数のワックス又はゲル化剤、例えば多糖類を含有してよい。多糖類は、カードランガム、カラギーナン、β−グルカン、グアーガム、ジェランガム、ゼラチン、ローカストビーンガム、ペクチン及びキサンタンガムのうちの１又は複数を含有してよい。多糖類は、ローカストビーンガム、ペクチン、カラギーナン、グアーガム、アガロースなどのガラクタンを含有してよい。
【００４９】
ステップ(iii)で形成される液体は、０．１から１０重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、好ましくは０．３から３重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、より好ましくは０．３から１．５重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、更に好ましくは０．４から１．２重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を含有してよい。固形ビーズの形成を促進する物質がガラクタンなどのゲル化剤である場合、これらの範囲は特に有益である。
【００５０】
ビーズの融点は、使用する酵素に適した所定の温度とすることが好ましい。酵素の包括(entrapment)は、酵素がポリヌクレオチドの増幅又は合成を補助することを阻害する。そのため、所望の動作温度に達したときのみに酵素が放出されるようにビーズの融点を選択する。もし酵素が包括されていないなら、酵素はポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成を自由に補助し、そして、所望のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを生成する可能性がある。
【００５１】
装置は、接合部から遠ざかる分割流れ導管を備えていることが好ましく、液体ビーズ(liquid beads)が分割流れ導管の中で冷却される。分割流れ導管は、接合部に結びつく近位部と、接合部から下流にある遠位部とを備えることが好ましい。
【００５２】
本発明の第５の側面によれば、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能なビーズの形成のための水性組成物が提供され、組成物は、固形ビーズの形成を促進する物質と、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬とを含有し、組成物は０．１から１０重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を含有する。
【００５３】
組成物は、好ましくは０．３から３重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、より好ましくは０．３から１．５重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を、更に好ましくは０．４から１．２重量％までの固形ビーズの形成を促進する物質を含有してよい。固形ビーズの形成を促進する物質が多糖類などのゲル化剤である場合、これらの範囲は特に有益である。
【００５４】
装置は、マイクロ流体装置としてよい。
【００５５】
装置は、好ましくは接合部で試料導管と合流する第２キャリア流体導管を備えてもよい。
【００５６】
本発明の第５の側面に従う組成物は、例えば、本発明の第４の側面の方法を用いて、本発明の第１の側面のビーズを形成するために使用される。本発明の第５の側面の組成物は、本発明の第４の側面で使用される液体としてよい。本発明の第１の側面のビーズの組成物に関連した記述は、本発明の第５の側面の混合物にも適用される。
【００５７】
例えば、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬は、以下の１又は複数を含有してよい：標識されていないオリゴヌクレオチド、標識されているオリゴヌクレオチド、標識されているデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されているオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないオキシヌクレオシド三リン酸、ポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成のための酵素、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、ポリヌクレオチド、使用時に緩衝効果をもたらす染料又は色素及び組成物。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
次の図面を例示のためのみに参照して、本発明を以下に説明する。
【図１】図１は、本発明に従う反応装置の平面図である。図１Ｂは、装置出口(device outlet)の周囲である、図１の装置の一部の平面図で、噴出配置(flushing arrangement)を示す。
【図２】図２は、図１の反応装置の概略斜視図である。
【図３ａ】図３ａは、反応装置の接合部の周囲の領域の平面図である。
【図３ｂ】図３ｂは、反応装置の接合部の周囲の領域の断面図である。
【図４】図４は、液体内に格納された１又は複数の試薬と比較した、固形ビーズ内の１又は複数の試薬の包括の効果を示す、ＰＣＲ生成物のゲルプレートの電気泳動像である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
図１は本発明に従う反応装置を示し、反応装置は符号１で概して示される。反応装置１は、冷却時に融解可能なビーズを形成する第１液体が流れる試料導管２と、キャリア流体が流れる第１キャリア流体導管４とを含み、試料導管２と第１キャリア流体導管４とは接合部１４で合流する。分割流れ導管７は接合部から遠ざかり、分割流れ導管７は接合部１４に結合された近位部１８と、接合部から下流にある遠位部１９とを有する。反応装置は、キャリア流体が流れる第２キャリア流体導管３を更に備える。第２キャリア流体導管３は接合部１４で試料導管２に合流する。接合部で、又は、接合部の近傍で、反応装置は使用時にキャリア流体内の第１液体のセグメントの形成をもたらす、流れの狭窄又は不連続を備える。この場合、接合部位自身が流れの狭窄をもたらしている。図３ａ及び３ｂを参照すれば、接合部１４のすぐ下流にある、分割流れ導管７の部分３４の断面は、試料導管２と第１及び第２キャリア流体導管のそれぞれと同じである。このことは流れの狭窄をもたらし、該狭窄はキャリア流体内の第１液体のセグメントの形成をもたらす。反応装置１は、試料導管と第１キャリア流体導管と、接合部と、分割流れ導管の近位部１８とを加熱するヒーター（図示しない）を更に備える。反応装置１は、第１液体のセグメントの固形化を促進するために、分割流れ導管の遠位部１９を冷却するクーラー（図示しない）を更に備える。
【００６０】
図２を参照すれば、ヒーター（図示しない）は、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)の基体の底面に対して当接して固定された、加熱プレート１６と熱的に連通し、該基体には、試料導管２、第１及び第２キャリア流体導管及び分割流れ導管７が形成されている。同様に、クーラー（この場合、水冷ポンプシステム）は、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)の基体の底面に対して当接して固定された、冷却プレート１７と熱的に連通している。の場合、加熱プレート１６と冷却プレート１７とは、小さい断熱間隙(insulating gap)１５（この場合５ｍｍの空気が提供される）により分割されている。断熱間隙１５は、加熱プレート１６と冷却プレート１７との間の熱的な連通を減少させる。この分離は、接合領域１４と分割流れ導管７の領域１８が冷却プレート１７により著しく冷却されないこと、逆に分割流れ導管７の領域１９が加熱プレート１６により著しく加熱されないことを保証する。
【００６１】
接合部１４の幾何学的配置は、図３ａ及び３ｂに詳細に示される。接合部１４にて第１及び第２キャリア流体導管は試料導管２に合流する。分割流れ導管７は接合部１４から遠ざかる。分割流れ導管７は、接合部１４から下流に、断面における拡大部(enlargement)３３を備える。分割流れ導管７の拡大部３３から上流の部分３４の深さは、分割流れ導管７の拡大部３３からすぐ下流の部分３５の深さの約０．７倍である。更に、分割流れ導管７の拡大部３３から上流の部分３４の幅は、１．２５ｍｍであり、分割流れ導管７の拡大部３３からすぐ下流の部分３５の幅（１．７ｍｍ）の約０．７倍である。分割流れ導管７が接合部１４に合流する点３６から拡大部３３までの距離は、部分３４の深さとほぼ同じである。更に、分割流れ導管７の拡大部３３からすぐ下流の深さは、１．７ｍｍであり、分割流れ導管７の拡大部３３からすぐ上流の部分の深さ（１．２５ｍｍ）の約１．４倍である。この拡大部３３と、拡大部の接合部１４に対する相対的な位置は、球形ビーズの形成を補助することにおいて有益であることが判明した。試料導管２及びキャリア流体導管３、４はそれぞれ１．２５ｍｍの幅及び深さを有する。導管のサイズは、製造されるビーズのサイズの決定の助けとなり、異なる幅や深さの導管は、異なるサイズのビーズの製造に使用することができる。
【実施例１】
【００６２】
図１、２、３ａ、３ｂを参照して、本発明に従う、融解可能なビーズの製造方法の例を説明する。
【００６３】
Taq(登録商標)ポリメラーゼとアガロース(シグマ−アルドリッチ社、ギリンガム、ドーセット、英国)との水溶液を以下のように準備した。既知量のアガロースを既知量の水に、すなわち水１０００μｌあたり１１ｍｇのアガロースが加えられた。電子レンジ内で、ファルコン管内の水及びアガロースを加熱することにより、アガロースの溶解が促進された。そして、ファルコン管は７０℃の水槽に入れられた。１００μｌのTaq(登録商標)ポリメラーゼ（ヘレナ バイオサイエンシズ、ゲートシード、英国）を測ってエッペンドルフ管内に入れられ、エッペンドルフ管は７０℃の水槽に入れられた。
【００６４】
エッペンドルフ管とファルコン管と７０℃の水槽から取り除かれた。９４８μｌのアガロース溶液は、Taq(登録商標)ポリメラーゼが入っているエッペンドルフ管にピペットで移され、エッペンドルフ管の内容物は、２７００ｒｐｍで２〜４秒撹拌混合(vortex-mix)された。次に、エッペンドルフ管はスペクトラフュージ遠心分離機に挿入され、エッペンドルフ管の内容物は約５から１０秒遠心分離された。
【００６５】
そして、エッペンドルフ管は７０℃の水槽に戻される。３０秒未満の持続時間の間、エッペンドルフ管は水槽から出さなければならない。
【００６６】
予熱された１ｍｌの注射器にTaq(登録商標)／アガロース溶液が注入される。注射器は、注射器とその内容物を約６５℃に維持する注射器ヒーター（図示しない）に挿入される。注射器は注入口(inlet)５に接続される。３本の１０ｍｌの注射器に鉱物油(シグマ−アルドリッチ社、ギリンガム、ドーセット、英国)が注入される。３本の注射器の各々が、キャリア流体注入口６の１つ及び噴出注入口１０に接続される。自動注射器駆動(automated syringe driver)により各注射器から液体が放出される。キャリア流体３２はキャリア流体注入口６へ、第１及び第２キャリア流体導管３、４へ、毎時１０ｍｌの流量で押し流される。アガロース及びTaq(登録商標)の水溶液３１は試料導管２へ毎時１．３ｍｌの流量で押し流される。噴出流体(flushing fluid)は噴出導管(flushing conduit)８へ毎時１５ｍｌの流量で押し流される。
【００６７】
図３ａ、３ｂを参照すると、キャリア流体３２と水溶液３１とが接合部１４で合流すると、水溶液の首のある小滴形状(necked-droplet shape)の形成が見られる。首のある小滴形状が下流に移動するにつれて、首が狭くなり、分裂して分離された水滴となるのが見られる。接合部より下流で分離された小滴の形成が見られる。拡大部３３が球形小滴の形成を促進しているようである。
【００６８】
図１を参照すると、球形小滴の形成を促進するために分割流れ導管７の領域１８が加熱される。金属プレート１７の底面全体に氷で冷やされた水を流すことにより、分割流れ導管７の領域１９は冷却される。
【００６９】
小滴は冷却された領域１９を通過し、冷やされ、固形ビーズを形成する。キャリア流体３２により、固形ビーズは装置出口９内を通って装置１の外に運ばれる。
【００７０】
装置１は、固形ビーズによる装置出口９の遮断を阻止する噴出配置(flushing arrangement)を備えている。図１Ｂは、装置１の装置出口９の周囲領域の平面図である。図１及び図１Ｂを参照すれば、固形ビーズは分割流れ導管７に沿って装置出口９に向かって通過する。噴出流体（この場合、キャリア流体３２と同じである）は、噴出注入口１０を介して注射器（図示しない）から導管８へ流れる。導管８は、噴出導管８ａ、８ｂに噴出流体を供給する。噴出導管８ａ、８ｂは、装置出口９の近傍にある噴出接合部１１で分割流れ導管７に合流する。比較的高い流量で、分割流れ導管７の装置出口９のすぐ上流において、噴出流体を導入することは、固形ビーズを装置出口９の外に押し流し、装置出口９の遮断を阻止する。
【００７１】
そして、固形ビーズは適切に保管された。
【実施例２】
【００７２】
実施例１の方法が繰り返され、０．１単位のTaq(登録商標)ポリメラーゼをそれぞれ含有するビーズが製造された。１つのビーズが、ＰＣＲ”ストリップ(strip)”のウェル(well)の各々に置かれ、各々のウェルに５μｌのＰＣＲ”マスターミックス(master mix)”を加えた。マスターミックスは、キアゲン緩衝(Qiagen buffer)、ＭｇＣｌ２溶液、dNTPミックス(dNTP mix)、水、PBR322プラスミド(plasmid)、Sal1及びBamH1プライマーを含有していた。この処理は、５つのウェルすべてに反復された。陽性標準試料(positive control sample)は、ビーズを含む試料と同時に投入された。陽性標準は、ＰＣＲマスターミックスにTaq(登録商標)ポリメラーゼ溶液（Taq(登録商標)ポリメラーゼを含有するビーズと対照に）を加えることにより作られた。ウェルはキャップで密閉されてＭＪリサーチ(MJ Research)社のサーマルサイクラー(thermal cycler)に置かれ、サーマルサイクリングシーケンス(thermal cycling sequence)が実行された。使用されたサーマルサイクリングシーケンスは、
(i) 初期変性 − ９４℃ ５分
(ii) ３０サイクルの３ステップサイクリング。各サイクルは次のステップを含む：
変性 − ９４℃ − ３０秒
アニーリング − ５５℃ − ３０秒
伸長 − ７２℃ − １分
(iii) 最終伸長 − ７２℃ − １０分
【００７３】
電気泳動槽内のアガロースゲル上で、サーモＥＣ(Thermo EC)社の電源を用いて、ＰＣＲ生成物の電気泳動を行なった。紫外線透過照射器を用いて、生成物はゲル上に視覚化された。
【００７４】
電気泳動は、ＰＣＲウェルから摘出された５つの試料のそれぞれが陽性標準と同じ電気泳動バンドを示し、効果的な増幅が起こったことを示した。
【００７５】
この実施例は、本発明のビーズを使用して、非常に小さい反応容積が使用できることを明らかにしている。
【実施例３】
【００７６】
実施例１及び２に述べた方法で融解可能なビーズが製造され、上述した陽性標準試料と並行して上述したＰＣＲ反応が行なわれた。図４を参照すると、”Ｌ”は陽性標準試料を示し、”ＬＡＤ”は２−ｌｏｇ ＤＮＡラダー参照試料(2-log DNA ladder reference sample)を示し、”Ｂ１”及び”Ｂ２”は本発明に従う融解可能ビーズを使用して作られた２つの試料を示す。ビーズは１つの電気泳動バンドのみを与えるＰＣＲ生成物を作り、１つだけの増幅生成物が生成されたことを示していることは明らかである。陽性標準試料は少なくとも３つの電気泳動バンドを示し、ＰＣＲ反応により少なくとも３つの増幅生成物が生成されたことを示している。本発明のビーズを使用して得られた、増大した増幅の特異性は、ビーズが９０℃以上で溶解してTaq(登録商標)ポリメラーゼが放出されるまで、TaqがＰＣＲマスターミックス内の試薬から分離されていたことによると考えられる。
【実施例４】
【００７７】
実施例１〜３は、どのようにしてポリメラーゼがビーズ内に包括(entrap)されたかを示す。また、本発明のビーズ内に１又は複数のプライマーを取り込むこともできる。
【００７８】
１５０μｌのSal1プライマー溶液（ストック濃度＝１０ピコモル／μｌ）と１５０μｌのBAMH1プライマー溶液（ストック濃度＝１０ピコモル／μｌ）を、３００μｌの溶融(molten)アガロース溶液の２重量％溶液に加えた。これで１重量％のアガロースと各プライマー１５００ｐｍｏｌとを含有する溶液が生成された。
【００７９】
図１、１Ｂ、２、３Ａ、３Ｂを参照して説明された装置を用いて、プライマーを含有するビーズが製造された。試料導管２に供給されるアガロース／プライマー溶液の流量は、毎時１．８６ｍｌであった。第１及び第２キャリア流体導管３、４に供給されるキャリア流体の流量は、毎時２０ｍｌであった。噴出導管８ａ、８ｂに供給される噴出流体の流量は、毎時１５ｍｌであった。
【００８０】
固形ビーズは集められ、Motic Images Plus 2.0ソフトウェアと組み合わたMotic社の顕微鏡を用いて、ビーズのサイズが測定された。製造された球形ビーズは、１２３０±３０μｍの直径を有すると判明した。各ビーズは３．０８ｐｍｏｌの各プライマーを含有していることが計算できる。
【００８１】
プライマーを含有するビーズは、上記実施例２で説明した反応と同様なＰＣＲ反応に使用される。所望の増幅生成物が生成され、電気泳動像により確認された。
【実施例５】
【００８２】
Qiagen SYBR Green ＰＣＲマスターミックスをビーズに取り込むために、実施例１及び２の方法が修正された。形成されたビーズは公称１０００μｍの直径を有する。したがって、約５２６ｎｌのマスターミックスを含有する。２２マスターミックスを含有するビーズからなる試料及びｐＢＲ３２２２テンプレートに対して、上記実施例２で説明したサーマルサイクリングが実行された。マスターミックス溶液を含有する陽性標準試料に対して、同様のサーマルサイクリングの体制が実行された。電気泳動は、ビーズが陽性標準試料と等価な増幅を起こしたことを示した。
【実施例６】
【００８３】
実施例２で説明したようにTaq(登録商標)ポリメラーゼを含有するビーズが形成された。ドナーからのｃＤＮＡの試料、ベータ−アクチン遺伝子の増幅のためにプライマーを含有する、ヒトのベータ−アクチン遺伝子(beta-actin gene)の増幅に必要なすべての試薬を含有するＰＣＲマスターミックスに、３個のビーズ（合計０．５単位のTaq(登録商標)ポリメラーゼ）が加えられた。サーマルサイクリングの後、電気泳動は、ＰＣＲ反応が成功したことを示した。このことは、本発明のビーズはｃＤＮＡからヒト遺伝子を増幅するために使用できることを示す。
【実施例７】
【００８４】
実施例２で説明したようにTaq(登録商標)ポリメラーゼを含有するビーズが形成された。１ステップ逆転写酵素(one-step reverse transcriptase)ＰＣＲ反応が以下に説明するように実行された。ｐｏｌｙＴプライマーが７０度に加熱してテンプレートＲＮＡにアニールされ、０℃に急速冷却(crash-cooling)された。そして、５μｌのプライムド(primed)ＲＮＡが、本発明に従うビーズを含有するＲＴ−ＰＣＲマスターミックスに加えられた。ビーズはTaq(登録商標)ポリメラーゼ）を含有する。反応混合物(reaction mixture)は２５℃で５分間維持され、４２℃に加熱された。反応混合物はこの温度で６０分間維持され、ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡの逆転写が容易となった。次に、試料が７０℃に加熱され、この温度で１５分間維持された。この温度で、ＲＮＡ−ｃＤＮＡ二重鎖(duplex)は溶解し、ｃＤＮＡの二重鎖が形成される。各サイクルが９４℃、３０秒の変性、６０℃、３０秒のアニーリング、７２℃、１分の伸長のステップを含有する、３０サイクルの３ステップサイクリングを行なうことにより、ｃＤＮＡが増幅される。７２℃、５分の最終伸長のステップが実行された。同時に陽性標準遺伝子(positive control gene)が陽性標準プライマー(positive control primer)を用いて増幅された。本発明に従うビーズを含有する試料は所望の増幅生成物を生成したことが電気泳動で確認された。ミスプライミング（mispriming)によると思われる、いくつかの大きい分子量のＤＮＡバンドが観測された。
【００８５】
低表面エネルギーのポリマーの、この場合ポリテトラフルオロエチレンのブロックから導管を機械加工することにより、図１、２、３ａ、３ｂの装置のすべての導管は製造された。
【００８６】
本発明のビーズの製造方法は、上述した装置以外の装置を用いて実行できることは、当業者にとって容易に理解できるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な複数の球形ビーズを製造する方法であって、該方法は、
(i) ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する物質とを供給すること；
(ii) 試料導管と、不混和液体(immiscible liquid)が流れる第１キャリア流体導管とを備え、前記試料導管と前記第１キャリア流体導管とは接合部で合流している反応装置を供給すること；
(iii) ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、前記１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する前記物質とを密な混合物(intimate admixture)で含有する液体を形成するために、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、前記１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する前記物質とを加熱すること；
(iv) 前記試料導管内に前記液体を、前記第１キャリア流体導管にキャリア流体を、それぞれ通過させて、前記接合部で又は前記接合部の下流で、小滴の形成をもたらすこと；
(v) 前記小滴を冷却することにより、固形ビーズの形成をもたらすこと；
を含有する。
【請求項２】
前記装置は、前記接合部から遠ざかる分割流れ導管(segmented flow conduit)を備え、液体ビーズ(liquid beads)が前記分割流れ導管の中で冷却される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記装置は、マイクロ流体装置(microfluidic device)である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記装置は、前記接合部で前記試料導管と合流する第２キャリア流体導管を備える、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記分割流れ導管は、前記接合部に結合された近位部(proximal portion)と、前記接合部から下流にある遠位部(distal portion)とを備える、請求項２又は、請求項２に従属する請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記反応装置は、
(a) 冷却時に融解可能なビーズを形成する第１液体が流れる試料導管(sample conduit)と、
(b) 前記試料導管と第１キャリア流体導管とは接合部で合流している、キャリア流体が流れる第１キャリア流体導管(carrier fluid conduit)と、
(c) 前記接合部から遠ざかる分割流れ導管(segmented flow conduit)であって、
前記接合部に結合された近位部(proximal portion)と、前記接合部から下流にある遠位部(distal portion)とを備え、前記接合部で又は前記接合部の近傍で、前記反応装置は使用時に前記キャリア流体内の前記第１液体のセグメントの形成をもたらす、流れの狭窄(constriction)又は不連続(discontinuity)を備える、分割流れ導管と、
(d) 前記試料導管と前記第１キャリア流体導管と、前記接合部と、選択的に前記分割流れ導管の近位部とを加熱するヒーターと、
(e) 前記第１液体のセグメントの固形化を促進するために、前記分割流れ導管の遠位部を冷却するクーラーとを含む、マイクロ流体装置である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、前記１又は複数の試薬は、標識されていない(unlabelled)オリゴヌクレオチド、標識されている(labelled)オリゴヌクレオチド、標識されているデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されているオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないオキシヌクレオシド三リン酸、ポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成のための酵素、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、ポリヌクレオチド、使用時に緩衝効果(buffering effect)をもたらす染料(stain)又は色素(dye)及び組成物(compound)のうちの１又は複数を含有している、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ステップ(iii)で形成される液体は水溶性である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記キャリア流体は、水性混合物(aqueous mixture)、溶液(solution)又は懸濁液(suspension)と不混和(fluid immiscible)である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
固形ビーズの形成を促進する前記物質は、１又は複数のワックス又はゲル化剤を含有している前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ステップ(iii)で形成される液体は、０．１から１０重量％までの固形ビーズの形成を促進する前記物質を含有している、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な複数の球形ビーズを製造する方法であって、
前記ビーズは５０から２５００ミクロンまでの平均直径を有し、前記複数のビーズの直径の標準偏差は前記複数のビーズの平均直径の５％を超えず、前記ビーズの各々はポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬を含有している、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
融解可能な球形ビーズを製造するマイクロ流体反応装置であって、前記反応装置は
(i) 冷却時に融解可能なビーズを形成する第１液体が流れる試料導管(sample conduit)と、
(ii) 前記試料導管と第１キャリア流体導管とは接合部で合流している、キャリア流体が流れる第１キャリア流体導管(carrier fluid conduit)と、
(iii) 前記接合部から遠ざかる分割流れ導管(segmented flow conduit)であって、
前記接合部に結合された近位部(proximal portion)と、前記接合部から下流にある遠位部(distal portion)とを備え、前記接合部で又は前記接合部の近傍で、前記反応装置は使用時に前記キャリア流体内の前記第１液体のセグメントの形成をもたらす、流れの狭窄(constriction)又は不連続(discontinuity)を備える、分割流れ導管と、
(iv) 前記試料導管と前記第１キャリア流体導管と、前記接合部と、選択的に前記試料導管の近位部とを加熱するヒーターと、
(v) 前記第１液体のセグメントの固形化を促進するために、前記分割流れ導管の遠位部を冷却するクーラーとを含む。
【請求項１４】
固形ビーズによる出口の遮断を阻止するため、噴出液(flushing liquid)を装置出口に供給する、１又は複数の噴出導管(flushing conduit)を備える請求項１３に記載の反応装置。
【請求項１５】
１又は複数の前記噴出導管は、前記装置出口の上流で前記分割流れ導管に合流している請求項１４に記載の反応装置。
【請求項１６】
１又は複数の前記噴出導管は、前記装置出口の近傍で前記分割流れ導管に合流している請求項１５に記載の反応装置。
【請求項１７】
前記反応装置は、噴出接合部(flushing junction)で前記分割流れ導管に合流する、２つの噴出導管を備える請求項１４乃至１６のいずれかに記載の反応装置。
【請求項１８】
噴出導管は、液体を１又は複数の噴出導管に導入する、噴出注入口(flush inlet)と流体的に連通(in fluid communication)しており、前記装置は１つのみの噴出注入口を備える請求項１７記載の反応装置。
【請求項１９】
前記接合部で、前記試料導管と第１キャリア流体導管とに合流する第２キャリア流体導管を更に備える請求項１３乃至１８のいずれかに記載の反応装置。
【請求項２０】
前記装置は、前記試料導管と前記第１キャリア流体導管と前記接合部と選択的に前記分割流れ導管の近位部を加熱する、加熱プレートを備える請求項１３乃至１９のいずれかに記載の反応装置。
【請求項２１】
前記装置は、前記分割流れ導管の遠位部を冷却する、冷却プレートを備える請求項１３乃至２０のいずれかに記載の反応装置。
【請求項２２】
前記装置は、前記試料導管と前記第１キャリア流体導管と前記接合部と選択的に前記分割流れ導管の近位部を加熱する、加熱プレートと、前記分割流れ導管の遠位部を冷却する、冷却プレートと備え、前記加熱プレートと前記冷却プレートとの間に断熱間隙(insulating gap)がある、請求項１３乃至２１のいずれかに記載の反応装置。
【請求項２３】
前記クーラーと熱的に連通している前記分割流れ導管の長さは、前記加熱プレートと熱的に連通している前記分割流れ導管の長さの２から５倍まである、請求項１３乃至２２のいずれかに記載の反応装置。
【請求項２４】
前記分割流れ導管は、前記接合部から下流に段差(step)を備え、前記段差は、前記分割流れ導管が前記接合部に合流する点から１ａから５ａまでの距離だけ下流に位置し、”ａ”は、前記段差よりすぐ上流での前記分割流れ導管の深さである請求項１３乃至２３のいずれかに記載の反応装置。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な複数の球形ビーズであって、前記ビーズは５０から２５００ミクロンまでの平均直径を有し、前記複数のビーズの直径の標準偏差は前記複数のビーズの平均直径の５％を超えず、前記ビーズの各々はポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬を含有している。
【請求項２６】
ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、前記１又は複数の試薬は、標識されていない(unlabelled)オリゴヌクレオチド、標識されている(labelled)オリゴヌクレオチド、標識されているデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されているオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないオキシヌクレオシド三リン酸、ポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成のための酵素、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、ポリヌクレオチド、使用時に緩衝効果(buffering effect)をもたらす染料(stain)又は色素(dye)及び組成物(compound)のうちの１又は複数を含有している請求項２５に記載の融解可能な複数の球形ビーズ。
【請求項２７】
前記ビーズは固形ビーズの形成を促進する物質を含有し、固形ビーズの形成を促進する前記物質は、１又は複数のワックス又はゲル化剤を含有している請求項２５又は２６に記載の融解可能な複数の球形ビーズ。
【請求項２８】
前記ビーズは、０．１から１０重量％までの固形ビーズの形成を促進する前記物質を含有している請求項２５乃至２７のいずれかに記載の融解可能な複数の球形ビーズ。
【請求項２９】
前記ビーズの平均直径は、８００から１５００ミクロンまでである請求項２５乃至２８のいずれかに記載の複数のビーズ。
【請求項３０】
前記複数のビーズの直径の標準偏差は、前記複数のビーズの平均直径の３％を超えない請求項２５乃至２９のいずれかに記載の複数のビーズ。
【請求項３１】
複数の反応管(reaction vessels)であって、各反応管は、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な１又は複数の球形ビーズを収納しており、前記複数の反応管内の前記ビーズは５０から２５００ミクロンまでの平均直径を有し、前記複数の反応管内の前記ビーズの直径の標準偏差は前記平均直径の５％を超えず、前記ビーズの各々はポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬を含有している。
【請求項３２】
融解可能なビーズの形成のための水性組成物で、前記組成物は、固形ビーズの形成を促進する物質と、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬とを含有し、前記組成物は０．１から１０重量％までの固形ビーズの形成を促進する前記物質を含有する。
【請求項１】
ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な複数の球形ビーズを製造する方法であって、該方法は、
(i) ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する物質とを供給すること；
(ii) 試料導管と、不混和液体(immiscible liquid)が流れる第１キャリア流体導管とを備え、前記試料導管と前記第１キャリア流体導管とは接合部で合流している反応装置を供給すること；
(iii) ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、前記１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する前記物質とを密な混合物(intimate admixture)で含有する液体を形成するために、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、前記１又は複数の試薬と、固形ビーズ(solid beads)の形成を促進する前記物質とを加熱すること；
(iv) 前記試料導管内に前記液体を、前記第１キャリア流体導管にキャリア流体を、それぞれ通過させて、前記接合部で又は前記接合部の下流で、小滴の形成をもたらすこと；
(v) 前記小滴を冷却することにより、固形ビーズの形成をもたらすこと；
を含有する。
【請求項２】
前記装置は、前記接合部から遠ざかる分割流れ導管(segmented flow conduit)を備え、液体ビーズ(liquid beads)が前記分割流れ導管の中で冷却される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記装置は、マイクロ流体装置(microfluidic device)である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記装置は、前記接合部で前記試料導管と合流する第２キャリア流体導管を備える、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記分割流れ導管は、前記接合部に結合された近位部(proximal portion)と、前記接合部から下流にある遠位部(distal portion)とを備える、請求項２又は、請求項２に従属する請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記反応装置は、
(a) 冷却時に融解可能なビーズを形成する第１液体が流れる試料導管(sample conduit)と、
(b) 前記試料導管と第１キャリア流体導管とは接合部で合流している、キャリア流体が流れる第１キャリア流体導管(carrier fluid conduit)と、
(c) 前記接合部から遠ざかる分割流れ導管(segmented flow conduit)であって、
前記接合部に結合された近位部(proximal portion)と、前記接合部から下流にある遠位部(distal portion)とを備え、前記接合部で又は前記接合部の近傍で、前記反応装置は使用時に前記キャリア流体内の前記第１液体のセグメントの形成をもたらす、流れの狭窄(constriction)又は不連続(discontinuity)を備える、分割流れ導管と、
(d) 前記試料導管と前記第１キャリア流体導管と、前記接合部と、選択的に前記分割流れ導管の近位部とを加熱するヒーターと、
(e) 前記第１液体のセグメントの固形化を促進するために、前記分割流れ導管の遠位部を冷却するクーラーとを含む、マイクロ流体装置である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、前記１又は複数の試薬は、標識されていない(unlabelled)オリゴヌクレオチド、標識されている(labelled)オリゴヌクレオチド、標識されているデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されているオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないオキシヌクレオシド三リン酸、ポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成のための酵素、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、ポリヌクレオチド、使用時に緩衝効果(buffering effect)をもたらす染料(stain)又は色素(dye)及び組成物(compound)のうちの１又は複数を含有している、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ステップ(iii)で形成される液体は水溶性である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記キャリア流体は、水性混合物(aqueous mixture)、溶液(solution)又は懸濁液(suspension)と不混和(fluid immiscible)である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
固形ビーズの形成を促進する前記物質は、１又は複数のワックス又はゲル化剤を含有している前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ステップ(iii)で形成される液体は、０．１から１０重量％までの固形ビーズの形成を促進する前記物質を含有している、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な複数の球形ビーズを製造する方法であって、
前記ビーズは５０から２５００ミクロンまでの平均直径を有し、前記複数のビーズの直径の標準偏差は前記複数のビーズの平均直径の５％を超えず、前記ビーズの各々はポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬を含有している、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
融解可能な球形ビーズを製造するマイクロ流体反応装置であって、前記反応装置は
(i) 冷却時に融解可能なビーズを形成する第１液体が流れる試料導管(sample conduit)と、
(ii) 前記試料導管と第１キャリア流体導管とは接合部で合流している、キャリア流体が流れる第１キャリア流体導管(carrier fluid conduit)と、
(iii) 前記接合部から遠ざかる分割流れ導管(segmented flow conduit)であって、
前記接合部に結合された近位部(proximal portion)と、前記接合部から下流にある遠位部(distal portion)とを備え、前記接合部で又は前記接合部の近傍で、前記反応装置は使用時に前記キャリア流体内の前記第１液体のセグメントの形成をもたらす、流れの狭窄(constriction)又は不連続(discontinuity)を備える、分割流れ導管と、
(iv) 前記試料導管と前記第１キャリア流体導管と、前記接合部と、選択的に前記試料導管の近位部とを加熱するヒーターと、
(v) 前記第１液体のセグメントの固形化を促進するために、前記分割流れ導管の遠位部を冷却するクーラーとを含む。
【請求項１４】
固形ビーズによる出口の遮断を阻止するため、噴出液(flushing liquid)を装置出口に供給する、１又は複数の噴出導管(flushing conduit)を備える請求項１３に記載の反応装置。
【請求項１５】
１又は複数の前記噴出導管は、前記装置出口の上流で前記分割流れ導管に合流している請求項１４に記載の反応装置。
【請求項１６】
１又は複数の前記噴出導管は、前記装置出口の近傍で前記分割流れ導管に合流している請求項１５に記載の反応装置。
【請求項１７】
前記反応装置は、噴出接合部(flushing junction)で前記分割流れ導管に合流する、２つの噴出導管を備える請求項１４乃至１６のいずれかに記載の反応装置。
【請求項１８】
噴出導管は、液体を１又は複数の噴出導管に導入する、噴出注入口(flush inlet)と流体的に連通(in fluid communication)しており、前記装置は１つのみの噴出注入口を備える請求項１７記載の反応装置。
【請求項１９】
前記接合部で、前記試料導管と第１キャリア流体導管とに合流する第２キャリア流体導管を更に備える請求項１３乃至１８のいずれかに記載の反応装置。
【請求項２０】
前記装置は、前記試料導管と前記第１キャリア流体導管と前記接合部と選択的に前記分割流れ導管の近位部を加熱する、加熱プレートを備える請求項１３乃至１９のいずれかに記載の反応装置。
【請求項２１】
前記装置は、前記分割流れ導管の遠位部を冷却する、冷却プレートを備える請求項１３乃至２０のいずれかに記載の反応装置。
【請求項２２】
前記装置は、前記試料導管と前記第１キャリア流体導管と前記接合部と選択的に前記分割流れ導管の近位部を加熱する、加熱プレートと、前記分割流れ導管の遠位部を冷却する、冷却プレートと備え、前記加熱プレートと前記冷却プレートとの間に断熱間隙(insulating gap)がある、請求項１３乃至２１のいずれかに記載の反応装置。
【請求項２３】
前記クーラーと熱的に連通している前記分割流れ導管の長さは、前記加熱プレートと熱的に連通している前記分割流れ導管の長さの２から５倍まである、請求項１３乃至２２のいずれかに記載の反応装置。
【請求項２４】
前記分割流れ導管は、前記接合部から下流に段差(step)を備え、前記段差は、前記分割流れ導管が前記接合部に合流する点から１ａから５ａまでの距離だけ下流に位置し、”ａ”は、前記段差よりすぐ上流での前記分割流れ導管の深さである請求項１３乃至２３のいずれかに記載の反応装置。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な複数の球形ビーズであって、前記ビーズは５０から２５００ミクロンまでの平均直径を有し、前記複数のビーズの直径の標準偏差は前記複数のビーズの平均直径の５％を超えず、前記ビーズの各々はポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬を含有している。
【請求項２６】
ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、前記１又は複数の試薬は、標識されていない(unlabelled)オリゴヌクレオチド、標識されている(labelled)オリゴヌクレオチド、標識されているデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されているオキシヌクレオシド三リン酸、標識されていないオキシヌクレオシド三リン酸、ポリヌクレオチドの増幅及び／又は合成のための酵素、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、ポリヌクレオチド、使用時に緩衝効果(buffering effect)をもたらす染料(stain)又は色素(dye)及び組成物(compound)のうちの１又は複数を含有している請求項２５に記載の融解可能な複数の球形ビーズ。
【請求項２７】
前記ビーズは固形ビーズの形成を促進する物質を含有し、固形ビーズの形成を促進する前記物質は、１又は複数のワックス又はゲル化剤を含有している請求項２５又は２６に記載の融解可能な複数の球形ビーズ。
【請求項２８】
前記ビーズは、０．１から１０重量％までの固形ビーズの形成を促進する前記物質を含有している請求項２５乃至２７のいずれかに記載の融解可能な複数の球形ビーズ。
【請求項２９】
前記ビーズの平均直径は、８００から１５００ミクロンまでである請求項２５乃至２８のいずれかに記載の複数のビーズ。
【請求項３０】
前記複数のビーズの直径の標準偏差は、前記複数のビーズの平均直径の３％を超えない請求項２５乃至２９のいずれかに記載の複数のビーズ。
【請求項３１】
複数の反応管(reaction vessels)であって、各反応管は、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、融解可能な１又は複数の球形ビーズを収納しており、前記複数の反応管内の前記ビーズは５０から２５００ミクロンまでの平均直径を有し、前記複数の反応管内の前記ビーズの直径の標準偏差は前記平均直径の５％を超えず、前記ビーズの各々はポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬を含有している。
【請求項３２】
融解可能なビーズの形成のための水性組成物で、前記組成物は、固形ビーズの形成を促進する物質と、ポリヌクレオチドの増幅反応及び／又は合成反応に使用される、１又は複数の試薬とを含有し、前記組成物は０．１から１０重量％までの固形ビーズの形成を促進する前記物質を含有する。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【公表番号】特表２０１０−５０５３９１（Ｐ２０１０−５０５３９１Ａ）
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２９７７５（Ｐ２００９−５２９７７５）
【出願日】平成１９年１０月２日（２００７．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００３７３４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４０９５９
【国際公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５０９０７１５５２）キュー チップ リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２日（２００７．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００３７３４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４０９５９
【国際公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５０９０７１５５２）キュー チップ リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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