ポリヌクレオチドの自動合成のための装置
本発明はａ）複数の防湿性試薬容器、ｂ）自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、ｃ）乾燥ボックスに試薬容器を接続する防湿性チューブ、ｄ）そこでガスが試薬容器を加圧する、試薬容器をガスに接続する試薬ガス供給装置及びｅ）そこでガス調整装置が試薬容器内の定圧を維持する、試薬ガスフィードに接続されたデジタルガス調整装置、を有する、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための装置を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概括的に生重合体合成、そしてより特別には無水状態を使用する高品質ポリヌクレオチドの自動合成装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代分子生物学における多数の技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡ解読、部位特異的突然変異誘発、全遺伝子アッセンブリー及び単一ヌクレオチドの多形性（ＳＮＰ）分析を含む合成ポリヌクレオチドを使用する。ポリヌクレオチドは概括的に、分子生物学に使用される多数の他の試薬と異なり、ストック製品として入手できず、各使用者の指定に対して注文作製される。例えば、ポリヌクレオチドの配列、規模、純度及び修飾物は使用者により指定されることができる。
【０００３】
ポリヌクレオチド合成化学及び処理技術の改善は、より低価格で、より早急な合成をもたらした。しかし、ポリヌクレオチド合成は一連の高い効率の化学反応を必要とする複雑な多段階工程のままである。理想的には、最終的ポリヌクレオチド生成物中の各ヌクレオチドの逐次（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）付加又はカップリングは、１００％収率をもたらす１００％効率を伴って起ると考えらえる。収率は各段階で又は完全な合成法の最後に回収される最終生成物の量を意味する。しかし、カップリング効率の効果は付加的であろうため、カップリング効率は１００％より小さく、各段階における僅かな減少が最終的ポリヌクレオチド生成物の収率に実質的な減少をもたらす可能性がある。例えば９９％〜９８．５％又は９８％の、カップリング効率の僅かな低下ですら、最終的ポリヌクレオチドの収率には重大な不利な影響をもつであろう。
【０００４】
ポリヌクレオチドの合成における各段階の収率はまた、生成することができるポリヌクレオチドの長さを決定する。ポリヌクレオチドの収量は各段階で減少するので、合成反応を継続するのに十分な材料がない時点が存在する。例えば、カップリング効率が９９％である場合は、合成後に存在する全長のポリヌクレオチド生成物の収率は２０個のヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対して約８３％、５０個のヌクレオチド含有のポリヌクレオチドに対して６１％、７５個のヌクレオチド含有のポリヌクレオチドに対して４８％そして１００個のヌクレオチド含有のポリヌクレオチドに対して３７％であろう。例えば、カップリング効率が９８％である場合は、１００個のヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの収率は１３％に低下する。従って、１００個を超えるヌクレオチドを含有する高品質のポリヌクレオチドを経済的に合成することは困難であった。
【０００５】
ポリヌクレオチドの合成におけるもう１つの課題は最終ポリヌクレオチド生成物中の不純物の存在である。不純物は合成反応からの前駆体試薬及び溶媒のみならずまた、所望のポリヌクレオチド生成物の全長に満たない、部分的ポリヌクレオチドが含まれることができる。これらの部分的ポリヌクレオチドは合成法期間のヌクレオチドの効率の悪いカップリングの結果であり、それらはしばしば、その後の適用における最終ポリヌクレオチド生成物の使用前の精製段階により除去される。部分的ポリヌクレオチド又は他の不純物からの最終ポリヌクレオチド生成物の精製は時間がかかり、最終ポリヌクレオチド生成物の収率減少をもたらす。
【０００６】
特定の適用のためには高品質のそして長さの長いポリヌクレオチドをもつことは望ましい。例えば、完全な遺伝子が生成されるように合成ポリヌクレオチドを重複させることにより、完全遺伝子をアッセンブルすることができる。このような遺伝子アッセンブリーの適用には、完全遺伝子をアッセンブルするために要する段階数及び従って、時間量を減少するためには、より長いポリヌクレオチドが望ましい。減少したアニーリング効率のような逐次（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）アッセンブリー反応における不純物の効果は付加的であろうために、このような方法のためには高品質のポリヌクレオチドが必要とされる。更に、アッセンブルされた遺伝子配列中への望ましくない突然変異体の導入を防止するために高品質のポリヌクレオチドが必要とされる。
【０００７】
従って、例えば、合成的遺伝子産生に適する原料として高品質のポリヌクレオチドの早急な合成を許す装置の需要が存在する。本発明はこの需要を充たし、同様に、関連した利点を提供する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明はａ）複数の防湿性試薬容器、ｂ）自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、ｃ）乾燥ボックスに試薬容器を接続する防湿性チューブ、ｄ）ガスが試薬容器を加圧する、試薬容器をガスに接続される試薬ガスフィード及びｅ）試薬ガスフィードに接続されており、かつ、試薬容器内の定圧を維持するデジタルガス調整装置、を有する、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための装置を提供する。本発明は更に、ａ）複数の防湿性試薬容器、ｂ）自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、ｃ）乾燥ボックスに試薬容器を接続する防湿性チューブ、ｄ）ガスが試薬容器を加圧する、試薬容器をガスに接続する試薬ガスフィード、ｅ）試薬ガスフィードに接続されており、かつ、試薬容器内の定圧を維持するデジタルガス調整装置及びｆ）ポリヌクレオチド合成装置、を有する、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための装置を提供する。
【０００９】
本発明はポリヌクレオチドのような生重合体の自動化合成の装置を提供する。装置は合成環境を制御して、効率のより良い合成反応を許し、より高品質の合成生成物をもたらす。例えば、装置は自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続系を維持することができ、そして試薬容器、自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、チューブ及び試薬ガスフィードに接続された少なくとも１基のデジタルガス調整装置を含む。本発明の装置は湿気の侵入を排除するために封止されている接続体を含むことができる。更に、本発明の装置は少なくとも１基のフロースルーガス乾燥機を含むことができる。本発明の装置は、生成される合成生成物に、より高い品質をもたらす、合成反応の効率を高めるためにポリヌクレオチド合成装置又は他の自動生重合体合成装置と併せて使用することができる。
【００１０】
１態様において、本発明は試薬容器、自動ポリヌクレオチド合成装置の合成反応室又は合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、防湿性チューブ、試薬ガスフィードに接続された少なくとも１基のデジタルガス調整装置及びポリヌクレオチド合成装置を含む装置を提供する。
【００１１】
本発明の装置は合成環境を制御して、著しく効率の良い合成の状態を最適にする。本発明の装置は例えば、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持することができる。このような装置の利点はポリヌクレオチド合成反応中の湿度が減少されることである。自動ポリヌクレオチド合成系内の湿度又は湿気の減少はカップリング効率の増加をもたらす。増加したカップリング効率は各段階における、より高い収率及び、より長いポリヌクレオチドを合成する能力をもたらす。増加したカップリング効率はまた、部分的ポリヌクレオチド生成物の量を減じ、それが最終的ポリヌクレオチド生成物の量を増加する。
【００１２】
本発明の装置のもう１つの利点は、装置が圧力の安定性を制御することができることである。安定な圧力は合成反応における化学薬品の送達における変動を減ずることができる。例えば、合成反応が継続するに従って、試薬容器の容量及び高純度ガスの高圧ガスシリンダー中のガス圧が低下し、それが圧力の随伴する低下をもたらす。圧力のこの低下は、カップリング効率を減ずる可能性がある、合成反応中に送達される試薬の量の変化をもたらす可能性がある。デジタルガス調整装置のような本発明の装置の構成部品は現在時のガス圧をモニターし、反応して、より一定なレベルへの圧力の均等化をもたらすことができる。定圧の維持は合成反応における正確な量の試薬の、より恒常的な送達をもたらし、それがより良いカップリング効率をもたらす。系中に定圧を維持することはまた、系中の相対湿度を減少する補助になる。
【００１３】
本発明の装置は例えば、低い水分含量及び化学試薬の恒常的送達のための安定した圧力レベルによりホメオスタティック状態を調整又は制御することができる。湿度の低下及び化学薬品送達の変動の減少双方が、より長くかつ、より高品質のポリヌクレオチドの生成を許す、より高いカップリング効率をもたらすことができる。高品質のポリヌクレオチドは精製段階なしで使用することができる。精製段階は時間がかかり、労力を要し、そして最終生成物のより低い収率をもたらす。長さの長い又は高品質のポリヌクレオチドは例えば、遺伝子アッセンブリー及び部位特異的突然変異誘発を含む幾つかの適用に有用である。
【００１４】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」は、共有結合により一緒に結合される２以上のヌクレオチドを意味することが意図される。例えば、ヌクレオチドはホスホジエステル結合により一緒に結合されることができる。ポリヌクレオチドは４種のヌクレオチド、アデニン、グアニン、シトシン及びチミン又はヌクレオチド類似体及び、イノシン、ジデオキシヌクレオチド又はヌクレオチドのチオール誘導体のような誘導体を含むことができる。ポリヌクレオチドを生成するためにはヌクレオチド又はホスホロアミダイトのような、ヌクレオチドの異なる化学的形態を使用することができる。更に、ヌクレオチドは放射性ラベル、蛍光色素、強磁性物質、発光タグ又は、ビオチンのような検出可能な部分のような検出可能な部分を更に取り入れることができる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、ＲＮＡ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
【００１５】
本明細書で使用される用語「閉鎖された連続的系」は、最適化された合成環境のためのホメオスタシスを維持するような方法で、経時的に系中の可変物（ｖａｒｉａｂｌｅ）をモニターし、調整することができる系を意味することが意図される。経時的に可変物をモニターし、調整することは、可変物が同時に又は「リアルタイム」でモニターされ、調整されることを意味することが意図される。所望されるホメオスタティック状態は例えば、系中の湿気のパーセントに関して又は系中の圧力量のような他の指標により、使用者により設定されることができる。例えば、閉鎖された連続的系は、系中に調整された圧力量を維持するように、圧力量が定常的にモニターされ、調整される、閉鎖された領域であることができる。
【００１６】
本明細書で使用される用語「閉鎖された連続的無水系」は、ホメオスタシスを維持するような方法で、同時に系中の湿気の量をモニターし、それに反応することができる系を意味することが意図される。所望されるホメオスタティック状態は、系中の湿気又は湿度のパーセントに対して使用者により設定することができる。例えば、閉鎖された連続的無水系は、湿気の量が、系からできるだけ多い湿気を排除するように定常的にモニターし調整される閉鎖された領域であることができる。更に、例えば、他の可変物を、圧力レベルのような閉鎖された連続的無水系中で調整することができる。
【００１７】
用語の無水は低い水分含量を意味することが意図される。水分含量は幾つかの方法で、例えば、湿度計を使用して湿度のパーセントとして測定することができる。無水系は低レベルの湿度又は湿気を有することができる。無水系は例えば、５％以下の相対湿度（ＲＨ）、４％以下の相対湿度、３％以下の相対湿度、２％以下の相対湿度、１％以下の相対湿度、０．５％以下の相対湿度又は検出できる相対湿度なしであることができる。水分含量はまた、百万分の一部（ｐｐｍ）単位で測定することができる。例えば、有機溶媒中の水分含量は無水有機溶媒に対して１０ｐｐｍ以下であることができる。
【００１８】
本明細書で使用される「試薬」は他の物質を検出、検査、測定又は生成するための化学反応中に使用される物質を意味することが意図される。試薬がポリヌクレオチドのような所望の物質の製造に使用される時は、試薬は所望の物質の製造の任意の段階で使用することができる。例えば、試薬はポリヌクレオチドの製造の開始時に使用されるヌクレオチド溶液のような前駆体であることができる。更に、試薬は、未結合ヌクレオチドを洗い落とすために使用される洗浄溶液のような、ポリヌクレオチドの製造中の、後になって使用される溶液であることができる。例えば、アセトニトリル洗浄溶液はポリヌクレオチドの製造において使用することができる試薬である。試薬には例えば、アミダイト、脱ブロック剤、酸化剤、活性剤、キャッピング試薬及びアセトニトリル洗浄溶液が含まれる。
【００１９】
本明細書で使用される用語「防湿性」は湿気に非透過性である物質を意味することが意図される。湿気は大気中の蒸気として又は物体の表面上に凝集した液体として感じることができる拡散した湿り気である。幾つかの防湿性物質は当業者に知られており、天然及び合成物質双方を含む。例えば、ステンレス鋼、ポリプロピレン、ポリスチレン及びテフロンは防湿性物質である。
【００２０】
本明細書で使用される用語「乾燥ボックス」は自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上に室を形成することができるフードを意味することが意図される。乾燥ボックスは、乾燥ボックスが十分なサイズの表面に封止されると、閉鎖された室を形成するような、１枚の開放された水平表面をもつフードである。乾燥ボックスはプラスチック、ガラス、重合体、エラストマー又はステンレス鋼のような防湿性物質から作製することができる。
【００２１】
本明細書で使用される用語「試薬ガスフィード」はガス源から試薬容器にガスを運搬することができるチューブを意味することが意図される。試薬ガスフィードは所望の圧力レベルに耐えることができる物質から作製される。例えば、試薬ガスフィードは、ガスシリンダーを洗浄溶液容器に接続する、プラスチック、ステンレス鋼又はテフロンチューブであることができる。様々なタイプのチューブを試薬ガスフィードのために使用することができ、例えば、チューブは、チューブがガス源から試薬容器にガスを運搬することができる限り、異なるレベルの柔軟性又は異なる直径をもつことができる。
【００２２】
本明細書で使用される用語「デジタルガス調整装置」は経時的にガス圧を正確にモニターし、ガス圧力を所望のレベルに調整するように機能する装置に出力信号を送達することができる装置を意味することが意図される。デジタルガス調整装置は系中のガス圧をモニターし、そして一定レベルのガス圧力を維持するように設定することができる。例えば、容器内の試薬レベルが変化するか又はガスシリンダー内の圧力が変化する時に、容器内にもたらされる圧力の変化がデジタルガス調整装置により正確にモニターされ、デジタル表示装置上に示されるように、デジタルガス調整装置は、加圧された試薬容器、高圧ガスシリンダー又は閉鎖系中のガス圧レベルをモニターすることができる。次にデジタルガス調整装置は、試薬容器に侵入するガスの量を制御する弁に信号を送り、容器内のガス圧力を均等化するように容器に侵入するガスの量を調整することができる。このように、連続的ホメオスタティック系が維持される。デジタル信号はアナログ信号の使用より、ガス圧のより正確な調整を許す。従ってデジタル信号はガス圧の同時の調整を許す。デジタルガス調整装置は例えば、０．１ｐｓｉの圧力、０．０５ｐｓｉの圧力又は０．０１ｐｓｉの圧力の区切りでガス圧を維持するために使用することができる。ガス調整装置が正確なほど、系内の圧力の制御がより正確である。デジタルガス調整装置は例えば、Ａｌｉｃａｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。
【００２３】
自動ポリヌクレオチド合成装置の、本明細書で使用される用語「合成プラットホーム」は、ポリヌクレオチド合成が起る１又は複数の反応容器又は反応室を含む又は保持することができる自動ポリヌクレオチド合成装置の表面を意味することが意図される。例えば、合成プラットホームはポリヌクレオチド合成反応が起ることができる１又は複数のウェル又はカラム又はプレートを含むことができる。幾つかの自動ポリヌクレオチド合成装置が市販されている。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ３８１Ａ及びＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ８９０５は市販されている標準ポリヌクレオチド合成装置である。更にポリヌクレオチド合成装置は、例えばＭｅｒＭａｄｅポリヌクレオチド合成装置のような注文製造された合成装置であることもできる（引用により本明細書に取り入れられているＲａｙｎｅｒ等、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：７４１−７４７（１９９８）を参照されたい）。
【００２４】
本明細書で使用される用語「フロースルーガス乾燥機」は、接合具中の物質が乾燥機中をフロースルーすることができるチューブのような接合具と一線に配置されている乾燥装置を意味することが意図される。乾燥装置は接合具中の物質から湿気を除去する任意の装置であることができる。例えば、乾燥装置は接合具中の物質を乾燥する乾燥物質を含むことができる。幾つかの乾燥物質、例えば、５Ａ分子ふるい及びＤＲＩＥＲＩＴＥを使用することができ、それらは当該技術分野で知られている。ＤＲＩＥＲＩＴＥのような乾燥物質は空気１ｌ当り０．００５ｍｇの乾燥までガスを乾燥することができる。ＤＲＩＥＲＩＴＥ中のインジケーターの色は枯渇する時に青からピンクに変化する。
【００２５】
本発明は自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的系を維持するための装置を提供する。本発明の装置は幾つかの試薬容器、自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、試薬容器を乾燥ボックスに接続する防湿性チューブ、試薬容器をガスに接続する試薬ガスフィード及び試薬ガスフィードに接続されたデジタルガス調整装置をもつことができる。チューブが溶媒と接している装置内の場所にある時、選択される防湿性チューブはまた溶媒抵抗性である。異なる溶媒に抵抗性である幾つかの物質が当該技術分野で知られている。
【００２６】
本発明の装置はオリゴヌクレオチドのような生重合体の合成を最適化するための制御された環境の室を形成する。閉鎖された連続的系は圧力のような、系内の可変物を調整することができる。１態様において、装置はシリコーンコーキング材で封止される接合具を含む。もう１つの態様において、封止された接合具は１平方インチ当り１００ポンド（ｐｓｉ）を超える圧力を維持することができる。
【００２７】
ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドとしても知られる）を合成する方法は当該技術分野で知られており、例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｔｅ，刊行，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）；Ｗｅｉｌｅｒ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４３：２１８（１９９６）；Ｍａｓｋｏｓ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（７）：１６７９（１９９２）；Ａｔｋｉｎｓｏｎ等、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈｉｔｅｔｒｉｅｓｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ，ｉｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ３５（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，１９８４）；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ及びＧａｉｔ（ｅｄｓ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）並びにＡｎｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）中に記載されていることを認めることができる。
【００２８】
ポリヌクレオチド及び他の重合体配列のアレーを生成するための固相合成法は例えば、Ｐｉｒｒｕｎｇ等、米国特許第５，１４３，８５４号明細書（ＰＣＴ出願書国際公開第９０／１５０７０号パンフレットも参照されたい）、Ｆｏｄｏｒ等、ＰＣＴ出願書国際公開第９２／１００９２号パンフレット、Ｆｏｄｏｒｌ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：７６７−７７７及びＷｉｎｋｌｅｒ等，米国特許第６，１３６，２６９号明細書，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等、ＰＣＴ出願書国際公開第８９／１０９９７号パンフレット及びＢｌａｎｃｈａｒｄ，ＰＣＴ出願書国際公開第９８／４１５３１号パンフレット中に記載されていることを見いだすことができる。これらの方法にはミクロピンを使用するアレーの合成及び印刷、写真平板及びオリゴヌクレオチドアレーのインクジェット合成が含まれる。
【００２９】
ポリヌクレオチドの逐次アニーリングによる大きい核酸重合体を合成する方法は例えば、Ｅｖａｎｓに対するＰＣＴ出願書国際公開第９９／１４３１８号パンフレット及びＥｖａｎｓに対する米国特許第６，５２１，４２７号明細書中に記載されていることを見いだすことができる。前記の引用物はすべてそれら全体を引用により本明細書中に取り入れられている。
【００３０】
ポリヌクレオチドはホスホロアミダイト化学反応を使用して市販の核酸合成装置上で生成することができる。Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈシリーズはホスホロアミダイト及び代わりの合成法を概説した（Ｂｒｏｗｎ，Ｔ．，及びＤｏｒｋａｓ，Ｊ．Ｓ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄ．Ｆ．Ｅｃｋｓｔｉｅｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ（１９９５））。
【００３１】
ポリヌクレオチドの化学的合成は４種の構成ブロック（塩基ホスホロアミダイト）が直線状重合体として結合される工程である。成分の塩基に加えて、ヌクレオチド間の結合の形成、酸化、キャッピング、脱トリチル化及び脱保護を補助するために、多数の試薬が必要とされる。自動化合成は逐次（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）化学反応、マトリックスに試薬を送達するための一連の弁及びタイマー並びに最後に精製、定量、生成物のＱＣ及び凍結乾燥を含むことができる合成後の処理の流れ、のための骨格として働く固形支持マトリックス上で実施することができる。
【００３２】
幾つかの標準ＤＮＡ塩基（Ｇ、Ｃ及びＡ）は、反応性の第一級アミンを含有し、従って第一級環外アミンを合成中に望ましくない反応に参加しないように、保護基で修飾することができる。更に、４種のホスホロアミダイトは同様に保護される必要があるリン結合を含む。これらの感受性サイトを保護するために使用される化学基は、ＤＮＡ合成サイクル中はそのままで留まることができるが、正常な未修飾ＤＮＡがもたらされるように、合成後に容易に除去されることができる。多数の異なる保護法が開発されてきた。例えば、ｂ−シアノエチル保護リンをもつホスホロアミダイトを使用することができる。複素環式塩基には第一級アミンの保護はしばしば、アデニン及びチトシンに対してはベンゾイル基によりそしてグアニンに対してはジメチルホルムアミジン又はイソブチル基のいずれかにより提供される。第一級アミンをもたないチミンは塩基の保護を必要としない。これらの保護基は合成中に使用される条件下で安定であるが、アンモニアによる処理により急速に、そして有効に除去される。
【００３３】
活性化モノマーがそれら自体と反応せずに、固形支持体に繋留された生長しているポリヌクレオチド鎖上の５’−ＯＨとのみ反応することができるように、塩基−ホスホロアミダイトの５’−ＯＨをブロックすることも望ましい。今日の化学は例えば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を使用する。縮合後、ＤＭＴ基は酸との処置により新規に添加された塩基から開裂される。放出されたＤＭＴカチオンは橙色であり、ＤＮＡのカップリング効率の進行を４９０ｎｍの分光測定値によりモニターすることができる。
【００３４】
デオキシリポース糖の３’ヒドロキシ基は著しく反応性のホスフィチル化剤で誘導される。この基上のホスフェートの酸素は通常、高温で、水酸化アンモニア処理を使用するβ−脱離により除去することができるβ−シアノエチル部分によりマスクされる。
【００３５】
自動化合成は固形支持体、通常、制御された多孔質ガラス（ＣＰＧ）又はポリスチレン上で実施することができる。ＣＰＧは反応室として働く小カラム中に充填される。充填されたカラムをＤＮＡ合成装置上の試薬送達ラインに結合し、化学反応はコンピューターの制御下で進行する。塩基は３’から５’方向（ＤＮＡポリメラーゼによる酵素合成と逆方向）に生長している鎖に付加される。「普遍的（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」支持体は存在するが合成はよりしばしば、３’ヒドロキシルにエステル結合により結合されている第１の塩基ですでに誘導されているＣＰＧを使用して開始される。合成はＣＰＧ固形支持体に結合された第１の塩基で開始し、３’ｙ５’方向に伸長する。ＣＰＧ粒子は比較的大きく、多孔質で、容量に対する表面の比率を著しく増加するチャンネルを含み、それにより、反応を、少容量の試薬を使用して小さい反応室内で実施させる。ＣＰＧは、片方の末端に試薬の入り口、そして他方に出口（廃棄物）を伴う、２種のフィルターフリット間の「カラム」内に配置される。
【００３６】
ポリヌクレオチド合成サイクルは以下に説明されるように４段階：（１）脱ブロック、（２）活性化／カップリング、（３）キャッピング及び（４）酸化、において進行することができる。
【００３７】
脱ブロック：合成サイクルはジクロロメタン（ＤＣＭ）中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）又はトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）に短時間暴露することにより５’−末端塩基の５’ヒドロキシルからのＤＭＴ基の除去により開始する。生成されるトリチルカチオンの収率を合成反応の効率をモニターする補助にするために測定することができる。ヌクレオシド構成ブロック上の反応性物質（第一級アミン及び遊離ヒドロキシル）保護は、暴露された５’ヒドロキシルがカップリング反応（次の段階）に参加することができる唯一の反応性求核原子であることを確実にする。
【００３８】
活性化／カップリング：ＤＮＡホスホロアミダイトはカップリング時にテトラゾール又はテトラゾール誘導体中での処理により、より反応性形態に転化される。これらの工程は、ホスホロアミダイトの急速な脱プロトン化、その後の、ホスホロテトラゾリド中間体の可逆的な、そして比較的遅い形成により起る。活性化デオキシリボヌクレオシド−ホスホロアミダイト試薬とのカップリング反応は早急で、効率がよい。ホスホロアミダイトに対するテトラゾールの過剰が完全な活性化及びＣＰＧに結合される反応性ポリヌクレオチドに対するホスホロアミダイトの過剰を確実にするために使用することができる。これらのタイプの条件下で、＞９９％のカップリング効率を達成することができる。
【００３９】
キャッピング：塩基カップリング反応は１００％の効率をもたないので、ＣＰＧ支持体上の少量の生長ポリヌクレオチドは結合せず、望ましくない先端を切り取られた物質をもたらすであろう。ブロックされない限り、これらの先端を切り取られ又は部分的なポリヌクレオチド生成物は後のサイクルにおいて基剤として働き続け、延長し、そして内部欠損をもつほとんど全長のポリヌクレオチドをもたらすことができる。これらの先端を切り取られた又は部分的なポリヌクレオチド生成物は（ｎ−１）−量体物質と呼ばれる。これらの「反応の失敗物」は大部分、無水酢酸による遊離５’−ＯＨのアセチル化を伴う「キャッピング」により次の合成サイクルに参加することを妨げられることができる。
【００４０】
酸化：この時点で、ＤＮＡ塩基は電位の不安定な３価のホスファイトトリエステルにより結合される。この物質は酸化により安定な５価ホスホトリエステル結合に転化される。水／ピリジン／テトラヒドロフラン中での希ヨウ素との反応生成物の処理は、加水分解されて、５価のリンを生ずるヨウ素−リン付加物を形成する。酸化段階はポリヌクレオチド合成の１サイクルを完結し、その後のサイクルは新規付加５’−塩基からの５’−ＤＭＴの除去で開始する。
【００４１】
開裂及び脱保護：合成完了後、ポリヌクレオチドを室温で濃水酸化アンモニウムで固形支持体から開裂することができる。高温におけるアンモニア中での連続培養はシアノエチル基のβ−脱離によりリンを脱保護し、そして更に複素環式塩基から保護基を除去する。
【００４２】
合成後の処理：合成中は、全長のポリヌクレオチド及び先端切り取り生成物又は部分的ポリヌクレオチド生成物の双方がＣＰＧ支持体に結合されたままである。合成後、その物質を同様に開裂して回収すると、最終反応生成物は所望の物質及び非所望の物質の不均一混合物である。ポリヌクレオチドの長さが増加するに従って、不純物がより大量に蓄積する。更に、開裂した保護基もまた存在する。この時点で、ポリヌクレオチドは伝統的に「脱塩され」、その工程では僅かな分子不純物（保護基及び短い先端切り取り生成物）をゲル濾過又は有機固相抽出（ＳＰＥ）法を使用して除去される。
【００４３】
定常のＰＣＲ又はＤＮＡ解読のような簡単な適用において短いプライマーを使用する時は、更なる精製を伴わない脱塩ポリヌクレオチドの使用が適当であることができる。しかし、クローン形成、部位特異的突然変異誘発又は遺伝子アッセンブリー適用中に使用される場合、ｎ−１及び他の先端切り取り又は部分的ポリヌクレオチド物質は、欠失変異体をもたらすことができる。先端切り取り又は部分的ポリヌクレオチド物質を除去するためには、ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣによる精製を使用することができる。
【００４４】
ポリヌクレオチドの合成効率は典型的には、化学反応の各サイクルに対して約９８〜９９％であり、従って各サイクルに対し約１〜２％の反応生成物は期待されるより１塩基短いであろう。幾つかの先端切り取り物質は「キャッピング」しないので、ＤＮＡ合成の更なるサイクル中に寄与し続ける。６０−量体のポリヌクレオチドに対して、最終生成物の５０％未満が所望の全長分子であろう。最終合成生成物は、配列の不均一集合物、有効には各可能な位置の欠失変異体のプールを表わす（ｎ−１）−量体及び（ｎ−２）−量体（等）の分子の混合集団を含むであろう。
【００４５】
合成の規模は出発物質の量を表わし、他方、合成収率は合成及び精製段階が完了した後に回収される最終生成物の量を表わす。ポリヌクレオチド合成において、３’末端塩基は注文者により注文された規模で固形支持体に結合される。塩基は３’から５’の方向に一度に１個ずつ付加される。理想的には各付加塩基は１００％の効率でカップリングして、１００％収率をもたらすと考えられる。実際には、カップリング効率は１００％より幾分小さく、この僅かな減少が最終オリゴヌクレオチド収率の実質的な減少をもたらすことができる（カップリング効率は付加的であろうため）。更に、カップリング効率は付加される各塩基に対して変動することができ、従って配列自体が収率の広範なばらつきの原因であることができる。２５０−ｎモル規模の反応に対して、脱保護及び精製後の最終収量は１０〜１００ｎモルにわたることができる。ある配列は他の配列より高い収量をもたらす傾向をもち、この傾向は通常再生可能である。１種の２０−塩基配列の合成に対する収量は２種の配列が同一日に、同一機械上で、同一試薬を使用して実施されるとしても、異なる２０−塩基配列に対して得られるものの２倍であることができる。収量の幾らかのばらつき性はまた、使用される個々の機械から由来することができる。
【００４６】
与えられる合成に対する理論的な収量は（Ｅｆｆ）ｎ−１であり、ここでＥｆｆはカップリング効率を表わし、そして「ｎ」はポリヌクレオチド中の塩基数を表わす。カップリング効率が９９％（Ｅｆｆ＝０．９９）である場合、合成後に存在する全長生成物の割合は２０−量体に対して、約（０．９９）１９又は８３％、５０−量体に対して（０．９９）４９又は６１％、そして７５−量体に対して（０．９９）７４又は４８％であろう。カップリング効率の僅かな減少は期待収量に実質的な減少をもたらすであろう。例えば、カップリング効率が９９％である場合、１００−量体に対する収率は（０．９９）９９又は３７％であるが、カップリング効率が９８％に低下する場合は、収率は（０．９８）９９又は１３％に低下する。
【００４７】
しかし、カップリング効率は付加される各塩基によりばらつく。恐らく、固形支持体の表面の近位の立体妨害のために、カップリング効率は最初の５〜６個の塩基に対して、より低い。次に、２０番目の塩基の付加に特徴的であるように、カップリング効率は約９９％の最適値まで増加し、そして次に長さが延長されるに従って、最適値より低いレベルに、再度低下する。カップリング効率は実際ポリヌクレオチドが非常に長くなるにつれて減少するので、１００−量体上の収率はしばしば１０％未満であることができる。生成物はまた、実施される場合に任意の精製過程中でも喪失され、それは更に収率を減少する。
【００４８】
本発明はａ）複数の防湿性試薬の容器、ｂ）自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、ｃ）試薬容器を乾燥ボックスに接続する防湿性チューブ、ｄ）ガスが試薬容器を加圧する、試薬容器をガスに接続する試薬ガスフィード及びｅ）ガス調整装置が試薬容器内に定圧を維持する、試薬ガスフィードに接続されたデジタルガス調整装置、を有する自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための装置を提供する。閉鎖された連続的無水系は系中の湿気含量を調整することができる。本発明の装置の１例は図２〜８に示される装置の様々な図及び拡大図を伴って、図１に示される。
【００４９】
本明細書に記載され、図に示される本発明の装置の様々な態様の外に、当業者は、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための本発明の装置の構造又は機能から逸脱せずに、僅かな修飾物及び並べ換え物を本明細書に記載され、例示される本発明の装置中に取り入れることができることを理解するであろう。例えば、系の一部又はすべての湿気含量に対して、より大掛かりのレベルの調整的制御を与えることができる修飾物は、閉鎖された連続的無水系を維持するための本発明の装置の一構成部品として含まれることができる。湿気含量の調整的制御は他の構成部品から隔離できる系の一部に対して及ぼすことができるか、又は制御は自動化系の非隔離可能な部分に対して及ぼすことができる。隔離可能な部分には例えば、試薬の容器、溶液の容器、廃棄物の容器、乾燥ボックス及び、弁又はソレノイドで終結するチューブが含まれる。系の非隔離可能な部分には例えば、隔離可能な部分の補完部分が含まれることができる。更に、湿気含量の調整的制御は全系に対して全体的に及ぼすことができる。
【００５０】
閉鎖された連続的無水系を維持するための調整的制御には、ディメンション、容量、封止剤、チューブの長さ、弁、ソレノイド、使用者のアクセス及びデジタル又は他の機械的又は電気的調整装置に対する僅かな修飾物が含まれることができる。例えば、容器、室又はチューブのより小さい容量は系中に導入される湿気量を減少し、そして／又は系から除去されることが必要な湿気量を減少するか又はそれら双方である。侵入又は排出湿気のいずれか又は双方の減少は無水状態のホメオスタシスを維持するために調整することが必要な定格荷重（ｎｅｔ ｌｏａｄ）を減少する。当業者は、サイズ又はディメンション、容量、封止剤、使用者のアクセスあるいはデジタル又は機械的圧力、容量又は真空調整装置の様々な組み合わせ及び入れ替えを組み合わせて、本明細書に記載される態様と同様な又はそれらより良い性能の特徴を有する閉鎖された連続的無水系を構成することができることを理解するであろう。
【００５１】
本明細書に記載される態様に対する他の修飾物には例えば、本明細書に例示される物質よりも大きい防湿性を示す物質の置き換え物が含まれることができる。例えば、本発明は閉鎖された連続的無水系を維持する装置を提供する。従って有益な防湿性を示す又は湿気不透過性を示す当業者に知られた物質を、本発明の装置から逸脱することなく、本明細書に記載される例示的物質に置き換えることができる。従って、当業者は、本明細書に提供される教示及び指導を与えられて、閉鎖された連続的無水系を維持する装置には、系の無水状態のホメオスタシスを維持又は補強する、本明細書に記載される装置に対する修飾物及びその構成部品の組み合わせ物が含まれ得ることを理解するであろう。
【００５２】
図１に示すように、本発明の装置は複数の試薬容器を含む。図１において、ヌクレオチド試薬を保持する試薬容器は１〜６と標識されている。脱保護剤、酸化剤、活性剤及びキャッピング試薬のような合成溶液を含む試薬容器は７〜１１と標識されている。装置はまた、自動ポリヌクレオチド合成装置（乾燥ボックス内、図に表れない）の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス（１２）を含む。チューブ（図示されない）は個々のソレノイド弁（１１８、１１９）を介して試薬容器を乾燥ボックス（１２）に接続する。試薬ガスフィードと集合的に呼ばれる更なるチューブ（例えば、６０、６３、６５、６７、６８、７３、７６、７８）は試薬容器をガスシリンダー（図６及び７に示されている）に接続する。デジタルガス調整装置（２２、２３、図６及び７参照）は試薬ガスフィードに接続される。更に、２本のフロースルーガス乾燥機（１６、１７、図５参照）は乾燥ボックス（１２）に接続される。更に２基のフロースルーガス乾燥機はヌクレオチド試薬容器（１５、図６参照）を加圧するために使用される試薬ガスフィード及び洗浄溶液の容器（１４、図７参照）を加圧するために使用されるガスフィード内に配置されている。
【００５３】
図１に示すように本発明の装置は複数の試薬容器を含む。試薬容器は合成反応中の任意の地点で使用される任意の試薬を保持することができる。例えば、試薬容器はヌクレオチド試薬（１〜６）、もう１種の合成溶液（例えば、脱保護剤、酸化剤、活性剤もしくはキャッピング試薬（７〜１１））又は、アセトニトリルのような洗浄溶液を保持することができる。ヌクレオチド試薬を保持する４個の試薬容器は、アデニン、チミン、シトシン及びグアニンのようなヌクレオチド塩基の試薬を保持するために使用することができる。第５の容器は最後のホスフェート・ホスホロアミダイト塩基を維持することができ、そして第６の容器は、必要な場合に混合ヌクレオチド塩基試薬として使用することができる。１態様において、試薬容器はヌクレオチド溶液容器又は洗浄溶液容器である。もう１つの態様において、装置は１個の洗浄溶液容器及び１又は複数のヌクレオチド溶液容器を含む。
【００５４】
試薬容器は液体試薬を保持することができる。１態様において、試薬容器は防湿性である。防湿性容器は外部環境からの湿気を容器の内部に侵入させない。防湿性容器はステンレス鋼、ガラス又はプラスチックのような防湿性物質からできているか又はそれらでコートされている。試薬容器はまた、それらが保持する物質にも抵抗性である、例えば、アセトニトリルのような溶媒を保持する試薬容器は溶媒抵抗性容器である。
【００５５】
使用されている試薬が湿気を含まないことを確保するために、試薬を混合する前に、試薬容器、例えばガラスびんを洗浄し、オーブンで乾燥することができる。びんは乾燥ボックス内で充填され、分子ふるいを添加され、試薬を使用する前に２４時間静置される。更に、試薬容器中に挿入される取り込みラインにテフロンフィルターを付加される（ａｄｄｅｄ）。これは取り込みライン中に導入され、そして合成プレート中に導入されるふるいからの微細物又は他の小粒子の量を減少する。
【００５６】
自動化合成のための閉鎖された連続的無水系を確実にするために本発明の装置中に他の構成部品を含むことができる。例えば、系は合成に送達される幾らか又はすべての化学試薬を貯蔵するための乾燥キャビネットを含むことができる。代表的乾燥キャビネットは防湿性物質から製造され、真空を維持するのに十分な接合部で封止されることができる。このような閉鎖された系のキャビネットは、乾燥剤の注入用圧力ポンプ及び圧力の維持のための真空ポンプ又は双方のような調整用構成部品との接続のために取り付けられる入り口及び出口をもつことができる。乾燥キャビネットは更に、任意の弁、デジタル調整装置あるいは、閉鎖された連続的無水系の調整又は維持のための、装置の他の構成部品又は部分に対して本明細書に記載される他の構成部品を含む又はそれらに取り付けることができる。更に、乾燥キャビネットは例えば、試薬を充填させる１、２又は３又はそれを超える正面のアクセスドアを含むことができる。系の乾燥キャビネット内の閉鎖された連続的無水環境の維持及び調整は例えば、操作前、その間又はその後にキャビネットをとおる乾燥窒素、アルゴン又はヘリウム又は他の無水ガスの一定の流れを発生することにより達成することができる。このような乾燥キャビネットは系操作のこれらの各相の期間中、試薬又は他の合成物質を連続的乾燥環境中に維持させる。乾燥キャビネットはまた、例えば、他の補助的構成部分を含むか又は他の補助的機能を実施することができる。例えば、乾燥キャビネットは二次的流出封じ込め物又は火災防御物を含むことができる。連続的無水状態を更に維持するためにキャビネット中に固形乾燥剤を導入することもできる。
【００５７】
ガラス容器は例えば、以下のプロトコールを使用して洗浄することができる。液体及びアミダイトを保持するための任意のサイズ、例えば、４Ｌ、９５０ｍｌ及び４５０ｍｌのアンバーコートびんは以下のように洗浄することができる。びんを、ＡＣＳ試薬等級のアセトニトリルで４回、ＡＣＳ試薬等級のアセトンで２回、次にＡＣＳ試薬等級のメタノールで２回すすぐ。すじが見えなくなるまで、びんの外側をふき取る。２〜３分間びんを逆さにして空にする。２４時間、６５℃以上のオーブン中に逆さに置く（ペーパータオル上に置く）。
【００５８】
ホスフェートホスホロアミダイト又は特製アミダイトを保持するための試験管又は注文ガラス容器は例えば以下のように洗浄することができる：熱水中で試験管ブラシをすすぐ。Ｍｉｃｒｏｎ−９０で試験管をこする。Ｍｉｃｒｏｎ−９０溶液中に再度入れ換える前に試験管ブラシをすすぐ。次に脱イオン（ｄＩ）水の熱水中でガラス容器をすすぐ。ガラス容器をＡＣＳ試薬等級のアセトニトリルで４回、ＡＣＳ試薬等級のアセトンで２回そして次にＡＣＳ試薬等級のメタノールで２回すすぐ。外側をふき取る。２４時間、６５℃以上のオーブン中に逆さに置く（ペーパータオル上に置く）。
【００５９】
合成反応に使用される試薬は例えば、Ｃｒｕａｃｈｅｍ（Ｄｕｌｌｅｓ，ＶＡ），Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ），ＡＢＩ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及びＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）から購入可能である。ホスホロアミダイトは典型的には５０グラムの量の粉末形態で配達され、乾燥アルゴン又は窒素を充填された別々のグローブ・ボックス中の例えば、９５０ｍｌの試薬びん中に無水アセトニトリル（０．０００２％Ｈ２Ｏ；＞１０ｐｐｍＨ２Ｏ）で直接希釈することができる。これは２０−量体の１０回の２プレート実施に十分量の試薬を提供する。
【００６０】
アミダイト塩基は以下のように調製することができる：作業はフード内に配置された無水グローブ・ボックス内で実施することができる。第１に、必要な試薬：例えば、Ａｎｎｏｖｉｓ（９５０ｍｌびん）からのアミダイト（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ）及び例えば、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅからの無水アセトニトリル（９５０ｍｌびん）を集める。これらの品物を乾燥ボックス中に入れ、閉鎖する。湿度モニターが０〜２％相対湿度に達するまで窒素ガス及び「急速パージ」のスイッチを入れる。次に上部の弁を閉鎖し、無水グローブ・ボックス内で１０ｐｓｉで、より低い流速で窒素パージを継続する。
【００６１】
作業濃度は１ｇの無水ホスホロアミダイト／１６〜１９ｍｌの無水アセトニトリル溶媒である−無水アセトニトリルを５０〜６０グラムの無水Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴホスホロアミダイト粉末を含有する９５０ｍｌびんの首に注入する。びんを激しく震盪して、ホスホロアミダイト粉末を溶液中に懸濁させる。アミダイトが完全に溶解するまで待ち、次に各びんに約５０グラムのゼオライトを添加し、蓋をする。びんに日付を付け、ロット番号を記す。無水グローブ・ボックスから取り出し、合成装置上に無水アミダイト溶液の試薬びんを置く。Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣは無水アセトニトリル溶媒中への無水Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃアミダイト粉末の懸濁後約２週間、使用することができる。
【００６２】
ホスフェート・ホスホロアミダイトは以下のように調製することができる。作業はフード内に配置された無水グローブ・ボックス中で実施することができる。このアミダイトは実施が完了後に調製することができる。第１に、−８０℃の冷凍庫から５’−ＣＥホスホリル化ホスホロアミダイト（Ｃｒｕａｃｈｅｍからの０．５ｇ又は１．０ｇいずれかのびん，ＤＭＴ非含有）を取り出し、無水グローブ・ボックス内に入れる。グローブ・ボックス内に更に無水アセトニトリル、化学的に抵抗性のシリンジ、２１ゲージの針、清浄な乾燥したアンバーコートされた注文ガラス容器（５０又は１５ｍＬ）及び蓋を入れる。湿度モニターが０〜２％相対湿度に達するまでアルゴン又は窒素及び「急速パージ」のスイッチを入れる。弁を閉鎖し、無水ガスのパージを減少する。包装を開封する。正確な濃度は０．５ｇ無水ホスホロアミダイト／８ｍｌ無水アセトニトリル溶媒である。カップリングを２倍にするために−ウェル当り１００μｌの２倍には、どのくらいの量のこの溶液が必要か、を計算する。９６ウェルのプレートに対して、これは１９．２ｍｌ（安全のために２２ｍｌを加える）である。シリンジ（１０〜２０ｃｃ及び２１ゲージの針）を使用して、無水アセトニトリル溶媒をそれら自体の包装物内でアミダイトに移す。アミダイトを室温で１０分間溶解させる。注文の円錐形の５０ｍｌのアンバーガラスを無水窒素でパージする。各液滴を得るために、５’−溶液からの隔壁蓋を外すことにより、清浄な、乾燥ガラス容器に溶液を移す。蓋をする。ｄ５位置のアセトニトリル洗浄びん又はオーブン乾燥した空のびんを取り出す。ｄ５位置に注文ガラス容器を置く。びんの蓋は必要な、できるだけ短時間だけ開ける。無水ホスフェート・ホスホロアミダイト１〜２ｍｌでラインをプライムする（ｐｒｉｍｅ）。古いホスホリル化試薬と混合しない。５’−ホスフェート・ホスホロアミダイト試薬は１時間以内、合成装置上にある。
【００６３】
図１に示すように、本発明の装置は乾燥ボックス（１２）を含む。乾燥ボックスは自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上に配置することができるフードである。次に合成プラットホームが乾燥ボックスの底部になる。乾燥ボックスが合成プラットホーム上に封止されると、それは合成プラットホームの周囲の閉鎖された連続的系の一部になることができる。乾燥ボックスは幾つかの物質、例えば、湿気及び溶媒抵抗性物質（例えば、Ｐｙｒｅｘガラス、ステンレス鋼、ポリプロピレン）から構成するか又はテフロンを使用することができる。１態様において、乾燥ボックスは防湿性物質から製造され、ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を提供するように合成プラットホーム上に封止される。図１に示される乾燥ボックスは、合成プラットホームを含む乾燥ボックスの内部を見るために使用することができる、ガラスの観察窓（図１に示される１０９、１１０、１１１、図２Ｄ中の１２０及び図４Ａ中の１２１）を含む。
【００６４】
乾燥ボックスはまた、図１に例示されたもの以外の様々なディメンション及びサイズをもつようにデザインされ、構成されることができる。例えば、乾燥ボックスは合成機械、構成部品、試薬及び溶液のために十分な空間を許しながら、その容量を最小にするように構成することができる。乾燥ボックス容量の最小化は合成環境内の湿気の量を減少し、従って無水条件に対する調整的管理を増強する。乾燥ボックスの容量及びディメンションは自動化合成装置のスタンド又は他の部品のディメンションに適合するように修飾することができる。閉鎖された連続的無水系を維持するための本発明の装置に有用な乾燥ボックス容量の特別な例は１０２ｌ、７０ｌ又はそれより小さい。
【００６５】
本発明の装置の乾燥ボックス中に取り入れることができる他の構成部品には、操作中に閉鎖された連続的無水系の完全性を維持する特徴物が含まれる。例えば、気密及びグローブによるアクセスは、閉鎖された連続的無水環境と妥協することなしに、オペレーターに操作中に系に伴うどんな問題でも対処させ、並びに系中へそして系から合成プレートを出し入れさせる。このような特徴物は、それがどんな特定の操作中でもすべての試料又はマルチウェルプレートを妨害したり又は台なしにすることなしに、同時に、操作、完成した合成物の取り出し又は新規合成物の導入を許すので、多数のマルチウェルプレートの同時合成期間中に有益である。
【００６６】
本発明の装置は幾つかのシール、例えば、乾燥ボックスと合成プラットホーム間のシール及び接合具と容器間のシールを含む。シールは気密接続体を形成するクロージャー（ｃｏｎｎｅｃｔｏｒｓ）を意味することが意図される。シールは例えば、ガラス、プラスチック又は金属との気密な接続体を形成することができる任意の物質から作製することができる。更に、シールは溶媒低構成物質から作製することができる。封止物質には例えば、ゴム、ＴＹＧＯＮ又はシリコーンが含まれる。１態様において、本発明の装置中の接続体は湿気の侵入を排除するために封止されている。もう１つの態様において、接続体はシリコーンのコーキングで封止されている。更なる態様において、接続体は二重封止されている。
【００６７】
装置中で使用されるシールは気密接続体を維持するのに十分に強力でなければならない。シールの強度は例えば、真空又は特定強度の圧力を維持するその能力により測定することができる。本発明の装置の封止された接続体は１００ｐｓｉを超える、７５ｐｓｉを超える、５０ｐｓｉを超える又は２５ｐｓｉを超える圧力を維持することができる。１態様において、本発明の装置の封止された接続体は２５ｐｓｉを超える圧力を維持することができる。
【００６８】
乾燥ボックスの継ぎ目は内側及び外側に二重封止され、そしてアクセスドア上のガスケットはシリコーンシーラーで補強されている。更に、ケーブルの結合具（ｃｏｕｐｌｉｎｇｓ）は封止され、注入ラインに供給するために使用される開放チューブ結合具はシリコーンゴムの封止物を使用して封止される。
【００６９】
本発明の装置は乾燥ボックス内に湿度計を含む。湿度計は例えば、デジタル湿度計であることができる。湿度計は内部の乾燥ボックス湿度を現在時で系により連続的にモニターさせることができる。次にこのデータを手動又は自動的にコンピューター中に供給して、合成を開始する前の前以て決められた期間待機するように妨げられる時に、いつ合成を開始するべきか決定するために使用することができる。例えば、乾燥ボックス内の湿度が１％以下の湿度である時には合成を開始するようにプログラムすることができる。更に系は、湿度が特定量を超える場合にオペレーターに警告し、必要なら合成反応を中断させることができる。
【００７０】
合成乾燥ボックスの湿度含量が高すぎると、反応が開始できない又は進行することができないので、合成反応の効率は湿度計の追加により改善することができる。更に、設定された期間の代わりに、湿度レベルに基づいて合成反応を開始することは、許容レベルへの湿度の低下に要する時間が設定時間より短い場合には、合成反応を速めることができる。例えば、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｏｄｅｌ ＴＰ１２０ ＳＮ ０２２２１３４７のような湿度計をＤｉｃｋｉｎｓｏｎから購入可能である。
【００７１】
図１に示されるように、本発明の装置は試薬容器（１〜１１）、乾燥ボックス（１２）及び化学薬品注入ライン装置（１３、１１８、１１９）を含む。装置の様々な構成部品を接続するチューブは図５〜８に示される。チューブは例えば、湿気及び溶媒抵抗性チューブであることができる。プラスチック及びＴＹＧＯＮ、テフロン及びポリプロピレンチューブのような幾つかのタイプの防湿性及び溶媒抵抗性チューブが当該技術分野で知られており、市販されている。例えば、該装置に使用されるチューブはテフロンチューブであることができる。
【００７２】
チューブは様々な方法で試薬容器に接続することができる。例えば、チューブは試薬容器のような、装置の他の構成部品に取り外し可能に接続することができる。これはチューブの早急で便利な調整又は取り替え及び容器の変更を許す。１態様において、取り外し可能な接続体は容器の入り口又は出口のような開口部の外側表面上にチューブを延伸することにより達成することができる。入り口又は出口の外側表面上に延伸されたチューブは弾性のリング又は金属の留め具のような留め具により定位置に保持することができる。更に、例えば、チューブは、片方の端の入り口又は出口のような開口部の外側表面及び他方の端の入り口又は出口の外側表面の周囲を包む外側の覆い（ｓｈｅａｔｈ）により定位置に保持されて気密クロージャーを形成することができる。便利な外側の覆いは例えば、ＴＹＧＯＮチューブを含むチューブの短い部分であることができる。更に例えば、チューブを様々な容器に接続するためにＳｗａｇｌｏｋ Ｐａｒｋｅｒ圧力パイプ接合金具（ｆｉｔｔｉｎｇｓ）、ポリプロピレン及びステンレス鋼接合金具を使用することができる。
【００７３】
図６に示されるように、本発明の装置は試薬ガスフィード又は、試薬容器を、試薬容器を加圧するガス（５８）に接続するライン（例えば、６０、６３、６５、６７、６８）を含む。１態様において、試薬ガスフィードは湿気及び溶媒抵抗性チューブから作製される。ガスフィードは加圧ガスを運搬するので、適当な強度及び組成のチューブ及びシールが使用される。例えば、ガスフィードは片方の端でＳｗａｇｌｏｋ圧力パイプ接合金具を使用してガスシリンダーに、そして他方の端でＳｗａｇｌｏｋ圧力パイプ接合金具を使用して１又は複数の試薬容器に接続されるテフロンチューブであることができる。試薬ガスフィードはヌクレオチド溶液のような試薬をガスシリンダー、例えば、ヘリウムガスシリンダーに接続することができる。ヘリウムは、送達ライン中の気泡を防止することができる、試薬ボトルを加圧するために使用することができる。更に、試薬ガスフィード（例えば、７３、７６、７８）は洗浄溶液、例えば、アセトニトリルのような試薬をガスシリンダー（７１）に接続することができる（図７参照）。
【００７４】
幾つかのタイプのガスを本発明の装置に使用することができる。本発明の装置に使用されるガスは安定であるか又はそれら自体に対してほとんど反応性を含まない不活性ガスであることができる。例えば、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノン及びラドンのような希ガスは装置内に使用することができる不活性ガスである。更に、窒素のようなガスは不活性ガスとして本発明の装置内に使用することができる。１態様において本発明の装置に使用されるガスは窒素、アルゴン又はヘリウムである。もう１つの態様において、ヘリウムは試薬容器を加圧するために使用され、そして窒素は乾燥ボックス内に使用されている。窒素ガスは例えば、液体窒素（Ｎ２）の沸騰ジュワーから誘導することができる。窒素を使用することに対する利点はそれが安価なガスであることである。
【００７５】
図１で示されるように、本発明の装置は、ガス調整装置が試薬容器内に定圧を維持するデジタルガス調整装置（２２、２３参照）を含む。１態様において、ガス調整装置はデジタルガス調整装置である。ガス調整装置はリアルタイムで正確にガス圧のレベルをモニターすることができ、ガス圧を一定に維持するためにガスのレベルを調整することができる。一定レベルのガス圧は、所望の値の近位で僅かに変動することができる圧力レベルである。例えば、試薬の容量が低下するに従って、試薬容器内の圧力は変動する。この変化はガス調整装置により早急に検出され、信号が送られ、それが所望のレベルへのガス圧の復帰調整をもたらす。ガス調整装置はガス圧の僅かな変化に早急に反応することができるので、ガス圧の僅かな変化は短時間、経験され得るが、ガス圧のレベルは本質的に一定である。何かの理由で、系内の圧力が特定量より下に低下すると、系はオペレーターに警告し、必要な場合は合成反応を中断させることができる。
【００７６】
１態様において、本発明の装置は試薬容器（１〜１１）をガス供給材料（ｓｕｐｐｌｙ）（例えば、５８、７１）に接続するチューブに接続されたフロースルーガス乾燥機（例えば、１４、１５）を含む。例えば、本発明の装置は試薬ガスフィード（例えば、６０、６３、６５、６７、６８、７３、７６、７８）に接続されたフロースルーガス乾燥機（１４、１５）を含むことができる。更なる態様において、本発明の装置はガスシリンダー（３８）を乾燥ボックス（１２）に接続するチューブ（例えば、４０、４１）に接続された少なくとも１基のフロースルーガス乾燥機（１６）を含む（図５参照）。図５に示されるように、乾燥ボックス（１２）の出口にチューブをとおって接続されたフロースルーガス乾燥機（１７）を大気に換気することができる。また更なる態様において、本発明の装置は乾燥ボックスガスの出口に接続されたフロースルーガス乾燥機、ヌクレオチド溶液の容器を加圧するために使用される試薬ガスフィードに接続されたフロースルーガス乾燥機、及びアセトニトリル洗浄溶液の容器（ジュワーとしても知られる）を加圧するために使用される試薬ガスフィードに接続されるフロースルーガス乾燥機を含む。
【００７７】
乾燥ボックスのガスの入り口及び出口に接続されたフロースルーガス乾燥機は、液体窒素ジュワーから乾燥ボックス中に導入されているガスが前以て乾燥されること及び乾燥ボックス廃棄物から逆流により、ほとんどから全く湿気が導入されないことを確実にすることを補助するために使用することができる。試薬ガスフィードに接続されたフロースルーガス乾燥機は、湿気が確実に試薬又は洗浄化学薬品中に導入されないように補助する。
【００７８】
フロースルーガス乾燥機は乾燥物質を含むことができる。更に、乾燥性物質は湿気含量を減少するために、乾燥ボックス内又は他の任意の場所に配置することができる。乾燥剤は湿気吸収物質である。多数の乾燥剤が当該技術分野で知られており、市販の、例えば粘土基材物質及びゼオライトである。市販の乾燥剤には、例えば、Ｄｒｉｅｒｉｔｅ及びＳｉｌｉｐｏｒｉｔｅ ＮＫ１０Ｆが含まれる。１態様において、本発明の装置に使用される乾燥物質は五酸化リン及び水酸化ナトリウムである。もう１つの態様において、本発明の装置に使用される乾燥物質はＤＲＩＥＲＩＴＥ及び５Ａの分子ふるいである。
【００７９】
フロースルーガス乾燥機は、ガスラインから湿気、不純物及び粒状物を除去するための表示するＤＲＩＥＲＩＴＥ及び５Ａ分子ふるいを充填された、例えば、ＤＲＩＥＲＩＴＥ Ｇａｓ Ｐｕｒｉｆｉｅｒである。このようなガス精製装置は圧縮タイプのチューブの留め具を使用して取り付けることができる。青からピンクへのＤＲＩＥＲＩＴＥの色彩変化が乾燥能の枯渇を示す。ＤＲＩＥＲＩＴＥは既知の方法により取り替える又は再生することができる。５Ａ分子ふるいは５オングストローム未満の有効分子直径をもつ不純物を除去する。ＤＲＩＥＲＩＴＥ Ｇａｓ Ｐｕｒｉｆｉｅｒは市販されている。それは成形ポリカーボネートから作製されたカラム及びｏ−リングガスケットを付けたポリカーボネートキャップを有する。ＤＲＩＥＲＩＴＥ及び分子ふるいはフェルトのフィルター間の定位置に固定されている。床支持体及びコイルのばねはステンレス鋼であり、出口フリットは４０ミクロンである。カラムのディメンションは２ ５／８インチ（６．６７ｃｍ）×１１ ３／８インチ（２８．９ｃｍ）である。接続体は１／８インチ（０．３２ｃｍ）のステンレス鋼の雄型チューブ留め具である。推奨最大作業圧力は１００ｐｓｉｇであり、水タンク容量は２５グラムである。推奨流量は最大効率に対して３００リッター／時間までである。
【００８０】
本発明の装置は合成プレート真空チャックと廃棄物容器間に少なくとも１個のインラインソレノイド弁（２４、２５）を含むことができる。これらの通常は閉鎖されたソレノイドは主真空系により活性化され、プレートが空にされた後に、合成フィルタープレートから廃棄物容器を隔離するために働くことができる（図８を参照されたい）。これは廃棄物容器を均等化から防止し、容器を連続的陰圧（真空）下に維持させることができる。もたらされる効果は、系が最初に廃棄物容器をポンプで真空にする必要なしに、合成プレートを即座に真空にすることができることである。もう１つの態様において、本発明の装置は、均等化を防止するために経路変更しそして、迂回される三方真空入り口ソレノイド弁（２６、２７）をもつことができる。Ｗｅｌｃｈの自動洗浄テフロンｄｒｇ Ｖａｃｕｕｍ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｏｄｅｌ ２０２５のような高強度真空系を本発明の装置に使用することができる。
【００８１】
合成プレートを固定するために使用されるチャックは標準の合成装置におけるより深い回収ボールをもつように修飾することができる。例えば、チャックは８ｍｍ、より深い回収ボールをもつように修飾することができる。この修飾物は、試薬が反応段階中にフィルタープレートをとおって漏洩する場合に、試薬がボールを充填しないで、フィルター合成プレート中の異なる合成ミクロウェルを交差汚染させないので、有用である。
【００８２】
本発明の装置は、生成されるポリヌクレオチド生成物の品質を高めるために、ポリヌクレオチド合成装置と連動して使用することができる。従って、本発明はまた、ａ）複数の防湿性試薬容器、ｂ）自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、ｃ）乾燥ボックスに試薬容器を接続する防湿性チューブ、ｄ）そこでガスが試薬容器を加圧する、試薬容器をガスに接続する試薬ガスフィード、ｅ）そこでガス調整装置が試薬容器内の定圧を維持する、試薬ガスフィードに接続されたデジタルガス調整装置及びｆ）ポリヌクレオチド合成装置、を含む、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための装置を提供する。
【００８３】
以前に説明されたように、前記の装置中の接続体は例えばシリコーンコーキングを使用して湿気の侵入を排除するように封止することができる。更に封止された接続体は１００ｐｓｉ強度を超える圧力を維持することができる。更に前記のように、試薬容器はヌクレオチド溶液の容器又は廃棄物溶液の容器であることができ、そして１態様において、試薬容器は洗浄溶液の容器であり、そして１又は複数のヌクレオチド溶液の容器である。装置は更に、乾燥ボックスに乾燥試薬を配達する試薬容器を加圧するチューブに接続され又は試薬ガスフィードに接続された少なくとも１基のフロースルーガス乾燥機を含むことができる。更に、装置は湿度計を含むことができる。
【００８４】
当該技術分野で知られた幾つかのポリヌクレオチド合成装置は注文製造及び市販品双方が本発明の装置中に取り込まれることができる。１態様において、本発明の装置は本発明の装置に取り付ける又はその部品であることができる、Ｒａｙｎｅｒ等、（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅｚｒｃｈ ８：７４１−７４７（１９９８）に記載されたようなヌクレオチド合成装置を含む。
【００８５】
ポリヌクレオチド合成装置は標準のホスホロアミダイト化学反応を使用して１回の実施でポリヌクレオチドの２枚の標準の９６−ウェルのプレートを合成することができる。機械は１枚のプレート中で標準の、変質した（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）又は修飾されたポリヌクレオチドの組み合わせ物を生成することができる。実施時間は２０−量体の２枚のプレート及び４０ｎＭの反応規模に対し約１７時間以下であることができる。反応容器は各ウェルの底部に穴を開けた、標準のポリプロピレンの９６−ウェルのプレートであることができる。本発明の装置に使用することができる他のサイズの反応容器には例えば、当該技術分野で周知のマルチウェルフォーマットをもつプレートが含まれる。例えば、ｘｙテーブルはプレート１枚当り例えば、９６，１９２，３８４，１１５２又は１５３６ウェルをもつマルチウェルプレートを収納するように拡大又は縮小することができる。更に、単一の又は複数のマルチウェルプレートを本発明の装置に使用することができる。有用な数のマルチウェルプレートは例えば、１、２、３、４、５又は６又はそれより多いマルチウェルプレートであることができる。本明細書に提供される教示及び指導を与えられると、当業者は、１〜多数のマルチウェルプレートを収納するために、ｘｙテーブル、ソフトウエア制御系又は注入系をどのように調整するかを知るであろう。
【００８６】
９６−ウェル反応容器を例示する前記の特定の例において、２枚のプレートを別の真空チャック中に入れ、ｘｙテーブル上に固定する。各ウェルを順次、適当な試薬注入ライン下に配置して、専用弁を切り替えることにより試薬を注入する。例えば、本発明の装置は合成実施のために例えば、９６−ピン注入系を使用することができる。９６−ピン注入系は、各合成段階において注入されるすべての「満杯のプレート」の試薬を
単一の注入系を連続的にとおさずに、１２注入装置のバンクを介して送達させる。試薬のこのような平行した分配は連続的分配に比較して、系に、より短時間で合成段階を実施させる。更に、注入ヘッド上の利用可能な洗浄ラインを増加することができる。例えば、洗浄ラインの数を例えば、１２から２４に増加することは複数の機能に対するラインの使用を減少するので、それにより合成時間を減少する。更に注入装置は宝石を備えた先端をもつミクロ注入装置であることができ、更に注入物の流れの精度を高め、送達容量を低下させる。機械操作は、始動及び停止方法について使用者を指導するコンピューターにより制御され、走行の状態に対する連続的アップデートを提供し、そして定期的に実行することができる多数のサービス手順を容易にさせる。
【００８７】
Ｒａｙｎｅｒ等（上記）により記載されたポリヌクレオチド合成装置の外に、多数のポリヌクレオチドの早急な合成に利用可能な他の高処理量ポリヌクレオチド合成装置が存在する。例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂのＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒにより設計され、構築されたポリヌクレオチド合成装置は多チャンネルフォーマットを使用する（Ｓｉｎｄｅｌａｒ ａｎｄ Ｊａｋｌｅｖｉｃ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：９８２−９８７（１９９５））。この系もまたホスホロアミダイト化学反応を使用するが、各実施に対し、１２個のポリヌクレオチドに限定される。Ｓｔａｎｆｏｒｄ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＧｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒで設計され、構築されたポリヌクレオチド合成装置のＡＭＯＳは同様な化学反応を使用し、ＭｅｒＭａｄｅ合成装置（Ｌａｓｈｋａｒｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７９１２−７９１５（１９９５））と同様な反応規模で９６−ウェルのフォーマット中に直接合成する。
【００８８】
ポリヌクレオチド合成装置は約３×３フィート（９１×９１ｃｍ）の面積及び６ｆｔ（１８２．９ｃｍ）の高さのスタンドをもつことができる。合成試薬は標準の加圧溶媒びん中に、機械の上部に貯蔵することができ、機械の中心部分に配置された合成室にテフロンラインにより運搬される。機械を制御している電子機器及びコンピューターは都合に応じて、主要枠組みの内側又は外側のいずれかに配置することができる別のカート中に配置することができる。２個のアルゴンタンク（びんの圧力及び不活性合成環境を提供するための）を枠組みの側部に固定することができる。機械はＬａｂＶｉｅｗ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）中に書かれた制御プログラムを走行するＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｑｕａｄｒａ ９５０により操作することができる。プログラムはオペレーターに始動及び停止法を指導し、使用者に連続的にアップデートした系状態を提供しながら、合成工程を制御する。更に、合成のソフトウエアは本明細書に記載されたあらゆる様々な態様を収容するか又は、試料合成の機能又は速度を促進するように修飾又は開発することができる。例えば、合成試料の平行した又は同時の処理を本発明の装置に使用することができる。同時の処理はそれが各プレートに必要な合成時間の量を短縮するために、有益である。
【００８９】
合成室は３成分：内側の室、外側の室及びｘｙテーブルからなることができる。２枚の９６−ウェルプレートは２個の別の真空チャック内に配置され、それは次に内側の室内に配置され、内側の室は封止され、そしてｘｙテーブル上に固定される。これを順次、ｘｙテーブルの完全な運動を収容するのに十分なサイズの、より大きな外側の室内に含む。注入ヘッドを外側の室の上部に固定し、コンピューターの制御下にあるｘｙテーブルが化学薬品注入ヘッドの下方にあちこちプレートを移動させる。化学薬品は水蒸気及び空気の存在に対して特に感受性である（Ｇａｉｔ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９８４）。２室の組み合わせ物は反応物からこれらの不純物を排除するようになっている。更に、脱ブロック及び酸化ラインからの蒸気によるホスホロアミダイト及びテトラゾールラインのあらゆる汚染を最少にするために、アルゴンの一定流のために、アルゴンを内側の室及び、内側の室の壁の上部と、外側の室の屋根との間の小さな空隙中に連続的にポンプで送る。反応物からの水蒸気及び空気を減少させるために２室の組み合わせ物を使用するオリゴヌクレオチド合成装置と異なり、本請求の装置は１個の連続的な無水の乾燥ボックスの反応室を含む。
【００９０】
２枚の合成プレートは各段階後に試薬の化学薬品の排水を許すために２個の真空チャック内に個々に固定することができる。真空チャックはプレートの周囲に一緒にボルトで留められる２個の部品からなる。チャックの下半分はプレートとチャックの間にシールを提供するためのガスケット及び真空に接続される排水ラインを含む。プレートは外側の室の上部の封止可能なアクセスドアをとおって充填する前に真空チャック中に固定することができる。
【００９１】
試薬を例えば、化学薬品注入ヘッドを経てウェル中に導入することができる。化学薬品注入ヘッドはアクセスドア（これはまた、各走行の前のヘッドの洗浄を容易にする）の中心に配置することができる。化学薬品注入ヘッドは室内で試薬を担持するための１５個のリードスルー（ｌｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈｓ）からなる。６個の注入ヘッドは対である。これらの対の４個はこの段階のテーブルの移動を最少にするためにホスホロアミダイト及びアクチベーターの同時注入のためである。第５のものはキャッピング段階のための２種の化学薬品の注入のためのものである。最後の注入対は修飾又は縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）塩基のいずれかに対するものである。試薬はびんからｄｃソレノイド弁に、そして弁から１／１６−インチ（０．１６ｍｍ）の直径のテフロンチューブによりリードスルーに送達することができる。チューブがそれをとおってリードスルーに侵入するシールを形成するためにシリコーン封止剤を使用することができる。弁はソフトウエアによりスイッチ切り替えされるソリッドステートの継電器により個々に制御することができる。これらの弁により得ることができる最少の注入容量は＜２０μｌである。しかし、ウェル中の試薬の適当な混合を確実にするために、注入容量は少なくとも６０μｌでなければならない。
【００９２】
合成装置の電子機器は３種の主要な構成装置：モーター増幅ボックス、継電バー及び電力供給ボックス、をもつことができる。ｘｙテーブルのモーターはソフトウエアからモーター増幅ボックスに制御信号を送信する、ＮｕＬｏｇｉｃ０Ｌコントローラーカード（ＮｕＬｏｇｉｃ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）により制御することができる。モーター増幅ボックスは順次、モーターに必要な電圧を送り、モーションリミット及びホーム信号を、カードをとおって制御ソフトウエアに戻す。弁はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｕｍｅｎｔｓ ＮＢ−ＤＩＯ−９６カードにより制御することができる。信号はカードから３バンクの継電器カードに送られる（各カードは８継電器を含む）。２カードは試薬注入のためのＤＣ弁を制御し、第３のカードはアルゴン及び真空系に使用されるＡＣ弁を制御する。モーター及び弁のためのＡＣ及びＤＣ電圧源は電圧供給ボックスにより提供される。
【００９３】
合成装置はＬａｂＶｉｅｗ３．１．１．（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を走行するＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｑｕａｄｒａ ９５０コンピューターにより制御することができる。ソフトウエアは機械の操作を制御する。起動手順は必要な段階をとおってオペレーターをプロンプトする一連のダイアログボックスに従うことにより実行される。機械が一旦走行設定され、合成手順が開始された後には、更なる使用者の介入は必要でない。ソフトウエアがテーブルの動き及び弁操作を処理し、合成工程の状態の連続的アップデートを提供し、そして合成が完了したら、必要な停止段階を実施する。更に、使用者に、様々なサービス及び保守手順（注入容量の目盛合わせ及びプレートの補正及びウェルの位置の再設定のような）を実施されるための一連のオプションが存在する。
【００９４】
本発明の装置の一部としての合成装置上のソレノイド弁は以下の方法を使用して目盛補正することができる。
【００９５】
コンピューターソフトウエアにおいて、”Ｃａｌｉｂｒａｔｅ Ｖａｌｖｅｓ（弁を目盛補正）”を選択し、次に”Ｌｏａｄ Ｒｕｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ（ラン・プロファイルをロード）”を選択する。主室のドアは垂直でなければならない。左側上で出発し、補正したいライン上でクリックする。設定は（１）これは現在の注入時間である、そして（２）これは現在の注入容量／塩基である、とでるであろう。それぞれ、（３）ここに新規の注入時間を入力せよ、そして（４）ここで新規の注入容量を入力せよ、中に設定をタイプする。（５）何回の注入実施を望むか、に対しては次の設定を使用することができる、例えば：１２０ｍＬに対して５、１００ｍＬに対して６、６００ｍＬに２、等。ラインをクリアするためには”Ｉｎｊｅｃｔ（注入）”を選択する。ラインがクリーンで直線になると、選択されたラインの下方に透明なエッピンドルフチューブを配置して、”Ｉｎｊｅｃｔ（注入）”を再度クリックする。与えらえた注入時間に実際に送達される量を決定するために、次の式：
（エッピンドルフチューブ中の容量）／（注入の＃）
を使用する。
【００９６】
容量が次のよう：例えば、ｄｔ、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄ５、ａｃｔＴ、ａｃｔＡ、ａｃｔＧ、ａｃｔＣ、ａｃｔ５、ｃａｐＢ、ｄｅｂｌｏｃｋ（脱ブロック）：１００ｍＬ；Ｗａｓｈ（洗浄）：６５０ｍＬ；Ｏｘｉｄａｉｚｅｒ（酸化剤）：８０ｍＬ；ｃａｐ（キャッピング） Ａ：１２０ｍＬであるように必要に応じて注入時間を変更する。維持することが望ましい変更を実施後に、「Ｓａｖｅ Ｒｅｐｌａｃｅ（置き換えを保存）」を選択する。最後に脱ブロックを実施する。「Ｅｘｉｔ（終了）」、そして次に「Ｅｄｉｔ Ｒｕｎ Ｐｒｏｆｉｅ（実行プロファイルを編集）」を選択する。以下の待機時間、例えば、Ｄｅｂｌｏｃｋ Ｓｔｅｐ（脱ブロック段階）：５０秒；Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｓｔｅｐｓ（カップリング段階）−Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ及び５：２７０秒；Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｔｅｐｓ（キャッピング段階）：１００秒；Ｏｘｉｄｉｚｅ Ｓｔｅｐｓ（酸化段階）：７０秒をを使用することができる。以下のパージ時間、例えば、Ｐｕｒｇｅ（パージ）１：１８００秒；Ｄｒａｉｎ（排水）：２秒；Ｐｕｒｇｅ（パージ）２：１８００秒；（１及び２は各室のパージを意味する）を使用することができる。以下の真空時間（ｖａｃｕｕｍ ｔｉｍｅ）、例えば、Ｄｒａｉｎ（排水）１：１５秒；Ｅｑｕａｌｉｚａｔｉｏｎ（均等化）１：２秒；Ｄａｒｉｎ（排水）２：１５秒；均等化（Ｅｑｕａｌｉｚｅ）２：２秒（１及び２はプレートを表わす）を使用することができる。
【００９７】
合成の実行に必要なパラメーターはコントロールソフトウエアによりアクセスされる１群の簡単なテキストファイル中に保存することができる。これらのファイルは各ポリヌクレオチドの配列並びに注入容量、合成サイクル中の各段階の待機時間、各段階後の洗浄サイクル数についての情報、並びにプレート及びウェルの補正及びｘｙテーブルのモーター速度／加速度を含む。これらはプレートに対する異なる濃度及び収率を許すために各プレートにつき編集することができる。
【００９８】
合成工程は３’から５’末端に向かって実施される。反応は既に結合された第１の塩基を伴って、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ ｓｕｐｐｏｒｔ（制御された多孔質ガラス支持体）（ＣＰＧ）（Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ又はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用することにより開始される。次に、次の塩基をこの支持体に結合させる。反応プレートには２種のオプションが利用可能である。安価な方法は各ウェルの底部に１／６４−インチ（０．４ｍｍ）の穴を空ける、標準の９６−ウェルのプレート（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂ Ｎｅｔ，Ｗｏｏｄｂｒｉｄｇｅ，ＮＪ）を修飾することである。ＣＰＧのための支持体は円形のガラス繊維フリットを（Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ，Ｐｅｑｕａｎｎｏｑ，ＮＪ）〜３ｍｍの直径に切断し、それを各ウェルの底部に置くことにより提供される。あるいはまた、フリットですでにウェル中に充填されたフィルタープレート（Ｏｒｏｃｈｅｍ ＤＮＡ合成フィルタープレート）を使用することである。この装置は僅かにより高価であるが、その価格はプレートの準備における時間の節約により相殺される。両装置において、支持体と穴サイズの組み合わせ物は真空がプレートの下側に適用されるまで、試薬がウェル中に確実に留まるのに十分である。
【００９９】
反応パラメーターは、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び質量分析法の組み合わせを使用してポリヌクレオチドの品質を評価することにより満足な操作条件に合わせることができる。ＣＥ及びＨＰＬＣ曲線はＮの純度％についての情報を提供するが、他方、ＨＰＬＣ曲線は合成工程完了後に、残された残留化学薬品の量を定量するために使用することができる。配列データを読み取った後に、窒素で反応室を充填し、空気を追い出すための第１の３０分間のパージ段階が存在する。次にコンピューターは、各ウェルを合成工程中の現段階に適した化学薬品注入ラインと順次整列させるためにｘｙテーブルを移動させて、対応する１又は複数の弁を操作する。その段階に対する注入が終結すると、反応を完了させるための５０〜２７０秒間の待機時間がある。チャックに対する真空の適用によりプレートから試薬を除去する。各段階後、ウェルをアセトニトリル〜６００ｍｌで１又は２回（合成段階に応じて）洗浄して、合成の次の段階の前に、確実に未使用試薬が除去されるようにする。
【０１００】
フィルタープレートを充填するためのプロトコールは以下である：
各タイプのＣＰＧに対して、フィルターから２０ｍｌのＡｅｒｏｓｏｌ ＰＥ ｂａｒｒｉｅｒ Ｔｉｐの１〜３ｍｍを切断する。ＣＰＧをＯｒｏｃｈｅｍ合成フィルタープレートの各ウェルに移動するために、移動ピペット（各塩基に対して１本）及び電気ピペットエードを連動して使用する。標準ＣＰＧに対しては、使用されている各ウェルにＣＰＧを０．００３ｇ（４０ｎモル規模、乾燥充填法）を添加することによりフィルタープレートを準備する。ポリヌクレオチドの３’末端で塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）に対応するＣＰＧ−塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）を確実に使用する。真空チャック中にＯｒｏｃｈｅｍ合成フィルタープレートを置き、ドリル及び六角ビットを使用してボルトで固定する。廃棄物チューブが上部にあり、ウェルＡ１は左下の角にあるように真空チャックを配置する。ドリル上の把握は最小のトルク設定でなければならない。ボルトを直角に締める。シリンジを使用して、各ウェルの側部のＣＰＧをアセトニトリルで洗い落とす。汚染を回避するために針でＣＰＧに接触しないように注意する。プレートをフォイルのシールで覆う。ＣＰＧを含むウェルのフォイル上にマークする。
【０１０１】
コンピューター上の実行を設定するためのプロトコールは以下である。
【０１０２】
最初に、Ｗｅｌｃｈのテフロンの乾燥真空ポンプのスイッチを入れる。ソフトウエアプログラムを使用して、「Ｈｏｍｅ Ｔｅｂｌｅ（ホームテーブル）」、次に「Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｈｅａｄ Ｔｅｓｔ（注入ヘッドテスト）」を選択する。２ｌゲージの針及びシリンジに無水アセトニトリルを充填する。注入ラインの末端をクリーンにし、末端を均等（ｅｖｅｎ）にする。「Ｉｎｊｅｃｔ ａｌｌ Ｌｅｆｔ（左側すべてを注入）」、「Ｉｎｊｅｃｔ Ｗａｓｈ（洗浄物を注入）」及び「Ｉｎｊｅｃｔ ａｌｌ Ｒｉｇｈｔ（右側すべてを注入）」を選択することにより、主要なデブリー及び気泡のラインをクリアにする。以前に説明されたように弁を目盛補正する。乾燥ボックスに、ポリプロピレン（ｐｐ）トレーに新鮮な五酸化リン（Ｐ２Ｏ５）を添加する。ソフトウエアのＡｌｉｇｎ Ｐａｇｅ（整列ページ）上で、ｄ６位に行く。古いＰ２Ｏ５及び水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を除去する。
【０１０３】
以下の設定及び実行コンポーネントを設定することができる。「Ｃｙｃｌｅｓ（サイクル）」上で、以下のパラメーター、例えば、ＷＡＳＨ：Ｐｒｅｗａｓｈ（前洗浄）、Ｄｅｂｌｏｃｋ（脱ブロック）、Ｃｏｕｐｌｉｎｇ（カップリング）、Ｃａｐｐｉｎｇ（キャッピング）＝１，Ｉｎｔｅｒｉｍ Ｄｅｂｌｏｃｋ（中間脱ブロック）＝０；Ｏｘｉｄｉｚｅ（酸化），Ｆｉｎａｌ（最終）＝２、ｂ）＃Ｄｅｂｌｏｃｋ Ｓｔｅｐｓ（＃脱ブロック段階）＝２、ｃ）＃Ｆｉｎａｌ Ｄｅｂｌｏｃｋ Ｓｔｅｐｓ（＃最終脱ブロック段階）＝２、ｄ）＃２ｎｄ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｔｅｐｓ（＃第２回最終キャッピング段階）＝１、を設定することができる。実行で使用されるであろうプレートを選択する。ＣＰＧのタイプが適切に設定されていることを確認する、例えば、標準のＣＰＧを使用している時は、「標準」（標準のＣＰＧは第１塩基を含む）を選択する。Ｅｘｔｒａ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｏｐｔｉｏｎｓ（追加のカップリングオプション）に対してはｄＡ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ及びｄ５に対するカップリングサイクル数が２である。ｄＡ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ及びｄ５に対するアクチベーターと塩基注入間の遅れは１０ミリ秒であることができる。ｄ６〜ｄ１０を使用しない限り、これらは０に設定しなければならない。カップリングの待機時間は２７０秒に設定することができる。５’ホスホリル化されているポリヌクレオチドに対しては、これらのウェルに対しＤＭＴ ＯＮを選択する。これを必要としないプライマー又はポリヌクレオチドに対しては、ＤＭＴ ＯＦＦを選択する。窒素が流れていること及び、実行を完了するのに十分存在することを確認する。
【０１０４】
Ａｌｉｃａｔ弁は例えば、アセトニトリルジュワーが２．５０ｐｓｉに加圧され、そして試薬びんが４．０ｐｓｉに加圧されるように設定することができる。あらゆる結晶を洗い落とすために、必要な場合はシリンジを使用してアセトニトリルで注入ヘッドをすすぎ、乾燥する。アセトニトリルジュワーから誘導しているライン中に気泡がないことを確実にするために、各注入ライン上で個々にクリックすることによりラインをパージする。視覚観察により、弁、試薬びん，真空びん及びラインにおける漏洩を確認する。プライムする時は（ｐｒｉｍｉｎｇ）一度に１本のラインをプライムする（廃棄物排水ラインを含む）。各注入ラインにパルス数を入力する。３０ミリ秒間に、アクチベーターラインに対して２、そしてアミダイト及びホスホリル化試薬に対して１のデフォルト設定を使用することができる。機械上の所定位置にＯｒｏｃｈｅｍ合成フィルタープレートを含む真空チャックを配置し、良好なシールを得るために手動で締める。ＣＰＧ含有ウェルからフォイルを外し、洗浄を実施する。残留ＣＰＧを洗い落とすために２〜３回反復する。合成装置を走行する前に、相対湿度（ＲＨ）が１．０％ＲＨ以下になるまで待機する。走行が完了すると、プログラムを終了して、最起動する。「Ｓｅｔ Ｕｐ Ｒｕｎ（実行設定）」に戻る。混合し、５’ホスホリル化するアミダイト試薬を添加する。５’ホスホリル化されないポリヌクレオチドが存在する場合は、それらは最初の実行時にＤＭＴをオフにしていたにちがいないことに注意されたい。５’ライン、キャップライン、脱ブロックライン、関連アクチベーターライン、酸化剤ライン及びアセトニトリルラインをプライムする。Ｒｕｎ（実行）ボタンをクリックする。
【０１０５】
ヌクレオチドの開裂及び脱保護のプロトコールは以下である：
合成が完了後、合成装置から真空チャックを取り出し、チャックからポリヌクレオチド含有フィルタープレートを取り出す。合成完了後に真空チャック中に残された有機廃棄物があるかも知れないので、フィルタープレートを外す前に廃棄物を空ける。廃棄物を除くためにペーパータオル上にＯｒｏｃｈｅｍの合成フィルタープレートの先端をブロットする。進行する前にそれが完全に乾燥していることを確認する。Ｏｒｏｃｈｅｍの合成フィルタープレートを深いウェル、例えば、２ｍｌの、深いウェルの丸底Ｎｕｎｃ回収プレート中に入れる。深いウェルの回収プレートに日付、ポリヌクレオチドのバッチＩＤ、合成装置及びウェル番号を標識する。各ウェルにアンモニアメチルアミン（ＡＭＡ）（水酸化アンモニウム：メチルアミン（１：１），４℃で保存、１週間有効）２００ｍｌを添加し、室温で５分間インキュベートする。水酸化アンモニウムＡＣＳ試薬を例えば、Ｓｉｇｍａ（Ａ−６８９９）から得ることができ、水中メチルアミン４０重量％溶液を例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ（４２，６４６−６）から得ることができる。フィルタープレート中のミクロウェル中のＣＰＧが乾燥するように窒素を通気する。圧力をかけながらゆする運動は液体をフィルターに強制的にとおすことを容易にすることができる。反復する。２．０ｍｌの深さのウェルの回収プレートにＡＭＡ１００ｍｌを直接添加する。ＣＰＧ含有Ｏｒｏｃｈｅｍ合成フィルタープレートを廃棄する。回収プレートを例えば、注文のアルミニウム加熱ブロックのチャック中に、清浄な９６ウェルＮｕｎｃシリコーン封止剤で固く封止する。プレートの上部にもう１個のスペーサー（へこみをもたない）を配列し、チャック中に入れる。ねじを締める。オーブンを６５℃に前以て加熱する。６５℃で４５分間インキュベートする。４５分後、インキュベーターからアルミニウム加熱ブロックのチャックを取り出し、即座に−８０℃の冷凍庫中に約１時間入れる。
【０１０６】
ポリヌクレオチドの凍結乾燥及び再懸濁のプロトコールは以下である：
バランスプレートをもつＳｐｅｅｄ Ｖａｃ中に回収プレートを入れる。他のすべてのスチッチを入れる前に、両方の蒸気トラップを約２４時間冷却させる。高度真空のオイルポンプ［１０−４Ｔｏｒｒ］の油ボックスを、パージしている液体窒素ジュワーからの液体窒素ガス沸騰をスチッチオンにする（（少なくとも１０ｐｓｉ及び最小の設定）。Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ（急速真空化）のスチッチを入れる。底部の弁はオンの位置にあって、真空を引いていなければならない。Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃが最高速度にある時は、抽気（ｂｌｅｅｄ）の矢印が左側にあるように、弁を時計回りに回転することにより上部の弁をゆっくり開く。プレートが乾燥すると、空気を入れるために上部の弁をゆっくり抽気する。次にＳｐｅｅｄ Ｖａｃ及び底部の弁のスイッチを切る。ポリヌクレオチドはふわふわした白色−淡黄色のプラグ様に見える。多チャンネルピペットを使用し、１５０ｍｌの滅菌、濾過（０．２ミクロン）そしてオートクレーブ処理した１８メガオームの滅菌ＭｉｌｌｉＱ水を各ウェルに添加し、プレートをフォイルで封止する。ポリヌクレオチドのプレートを低速で３０分間、渦の上に置いて再懸濁させる。
【０１０７】
生成された各ポリヌクレオチドを、その品質を検査することができるか又は生成されたポリヌクレオチドの試料採取を選択し、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ９６−ウェルＣＥ、ＨＰＬＣ又は質量分析計上で品質を試験することができる。純度はポリヌクレオチドの主要ピークあるいはＣＥ又はＨＰＬＣ曲線のＮの面積の百分率を採ることにより計算される。
【０１０８】
ＢｉｏＴｅｋ ＰｏｗｅｒＷａｖｅ ＨＴを使用するオリゴヌクレオチドの定量は以下のように実施することができる。
【０１０９】
多チャンネルピペットを使用してプレート（未精製オリゴ糖）を「ストック」するために、目盛合わせしたＭｕｌｔｉＣｈａｎｎｅｌ Ｐｉｐｅｔｔｅ（多チャンネルピペット）でＵＶ ９６−ウェルプレート（例えば、Ｃｏｓｔａｒからの）中に各オリゴ３ｍｌを入れる。ＰＡＧＥ／Ｄｅｓａｌｔｅｄ（脱塩）プレートに対しては試料１０ｍｌを入れる。各ウェルに２９７ｍｌの１８ ＭＯＨＭ ＭｉｌｌｉＱ滅菌水（ＭＱＨ２Ｏ）を添加する（１／１００希釈）。ブランクのウェルが一列中に残る場合は、３００ｍｌのＭＱＨ２Ｏを各ウェル（少なくとも３ウェル）に添加する。そうでない場合は、３００ｍｌのＭＱＨ２Ｏを全体の次の空の列に添加する。ＰＡＧＥ／Ｄｅｓａｌｔｅｄ（脱塩）プレートに対して、１：１０希釈率で９０ｍｌの水を添加する。充填した９６ウェルのプレートに対して、試料及び水をプレート上のＡ１〜Ｇ１２中に、そしてＨ１〜Ｈ１２中にはブランクを充填する。もう１枚のプレートには試料及び水をＨ１〜Ｈ１２中に、そしてＧ１〜Ｇ１２中にはブランクを充填する。
【０１１０】
右上角にＡ１を伴って、プレートを分光光度計、例えば、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｐｅｃｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ中に配置する。ＤＮＡに対する２６０及び２８０の波長における光学密度を決定するために、分光光度計に関するソフトウエアを使用する。例えば、試料プロトコールは次のパラメーターをもつことができる：Ｒｅａｄｉｎｇ Ｔｙｐｅ（読み取りタイプ）：端点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）；Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ（波長）：１＝２６０，２＝２８０；ＲｅａｄＭｏｄｅ（読み取りモード）＝通常、Ｐｌａｔｅ（プレート）：Ｔｙｐｅ（タイプ）＝９６ウェル、Ｓｉｚｅ（サイズ）＝８×１２、Ｆｉｒｓｔ Ｗｅｌｌ（最初のウェル）＝Ａ１、Ｌａｓｔ Ｗｅｌｌ（最後のウェル）＝Ｈ１２；Ｓｈａｋｉｎｇ（振動）：強度＝０、期間＝０；温度調節；なし、遅延時間＝００：００：００；ＰｒｅＲｅａｄｉｎｇｓ（前読み取り）：経路長補正波長。Ｓａｍｐｌｅ＋Ｗａｔｅｒ（試料＋水）を含有のウェルに対しては、Ｔｙｐｅ（タイプ）の引き下ろしメニュー中のＳａｍｐｌｅ（試料）を選択する。Ｂｌａｎｃｓ（ブランク）を含有する列のものに対しては、Ｔｙｐｅ（タイプ）をＢｌｋに替える。プレートを読む。ソフトウエアは保存することができるＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（マイクロソフトのエクセル）のワークシートを作成することができる。
【０１１１】
ポリヌクレオチドの質量分析法のプロトコールは以下である。
【０１１２】
ＭＡＳＳ ＳＰＥＣ ＰＲＯＴＯＣＯＬ ｖ．１．１
Ｉ．試料の準備
凍結乾燥したストックの合成プレートに、濾過し、オートクレーブ処理した水１８ ＭＯＨＭ ｄＩ水１５０ｍｌを添加する。フォイルで封止し、再懸濁するまで３０分間震盪する。前記の方法を使用して、例えば、ＢｉｏＴｅｋ−ＰｏｗｅｒＷａｖｅＨＴを使用してオリゴヌクレオチドを定量する。ファイルのＯＤ２６０経路長補正カラムをコピーし、それをＥｘｃｅｌ（エクセル）ファイル及びＣＳＶファイル上のＯＤ２６０中に張り付ける。ｃｓｖファイルはＰａｃｋａｒｄ Ｍｕｌｔｉｐｒｏｂｅ ＩＩ ｅｘ液体処理装置を制御するために使用されるファイルである。Ｅｘｃｅｌ（エクセル）ファイルを印刷し、プロジェクトフォールダーをＭＡＬＤＩ下に入れる。Ｐａｃｋａｒｄを使用のために準備する（マニュアル参照）。
【０１１３】
Ｐａｃｋａｒｄのファイル”Ｍａｌｄｉ ｗａｔｅｒ ｏｎｌｙ（Ｍａｌｄｉ水のみ）”を開く。プレート例えば、Ａｂｇｅｎｅプレートをデッキ上の適当な位置に配置し、水桶の蓋を外す。９６未満のウェルに対し、デッキ上のプレートの輪郭を修飾する。「（Ｅｘｅｃｕｔｅ）実行」を選択する。プロンプトされる時に正しいＣＳＶファイルを呼び出す。Ｐａｃｋａｒｄの水添加が完了すると、プレート中にストックのポリヌクレオチドの適当量をピペット添加するために多チャンネルピペット及びフィルターの先端（ｔｉｐｓ）を使用する。フォイルで封止し、穏やかに渦撹拌し、次に４００ｇで６０秒間、ＳｐｅｅｄＶａｃ（真空ではない）又はＢｅｃｋｍａｎ ｐｌａｔｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ中で短時間スピンする。次の段階まで４℃の冷蔵庫中に入れる。
ＩＩ．Ｓａｍｓｕｎｇスポッター
スポッター中の埃を回避する段階を採る。ＫｉｍＷｉｐｅ及び必要な場合はメタノールで払拭する。２枚の偵察プレートにチップがないことを確認する。ソフトウエアプログラムを開く。Ｒｉｎｓｅ Ｔａｎｋ（リンスタンク）、（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）Ｗａｓｈ Ｔａｎｋ（（音波処理装置）洗浄タンク）及びＷａｓｔｅ Ｔａｎｋ（廃棄物タンク）のボックスがすべてグリーンであることを確認する。そうでない時は、供給タンクに脱イオン水を充填することができる。（音波処理）洗浄タンクを脱イオン水とエタノール（又はメタノール又はイソプロパノール）の５０：５０溶液（容量）で充填することができる。廃棄物タンクを空にし、底部を覆うのに十分なだけの１００％ブリーチを添加する。
【０１１４】
主要ピンの状態調整：
「Ｈｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ（ホームマシーン）」、次に「Ｐｉｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ（ピン状態調整）」を選択する。Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｓｔａｔｕｓ（音波処理装置状態）下で、「Ｄｒａｉｎ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（音波処理装置排水）」を選択し、音波処理浴が空であることを確認する。ドアを開けてスポッターデッキにアクセスする。曲ったノズルのスクイーズボトルにより音波処理装置中の浴の上部に１００％エタノール（又はメタノール又はイソプロパノール）を注ぐ。ドアを閉める。Ｐｉｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｂｏｘ（ピンの状態調整ボックス）を閉め、エラーログを閉じる。「Ｐｉｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ（ピンの状態調整）」の主要ヘッド又は単一ヘッド及び「Ｓｔａｒｔ（開始）」を選択する。ピンはアルコール中に降下され、３０分間状態調整されるであろう。終結すると、「Ｄｒａｉｎ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（音波処理装置排水）」及び「Ｆｉｌｌ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（音波処理装置充填）」を選択する。ソフトウエアを使用して状態調整の期間を変えることができる。
【０１１５】
通常の実行−９６すべてのウェルがスポットされる−を開始するために：以下の実行設定を使用することができる、例えば：ａ）Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｆｉｔｉｏｎ Ｆｉｌｅ（定義ファイル移動）：９６から９６、ｂ）Ｃｙｃｌｅ Ｒｕｎ（サイクル実行）：Ａｕｔｏ Ｒｕｎ（自動実行）、ｃ）Ｓｐｏｔｔｉｎｇ（スポット実施）：Ｗｅｔ Ｒｕｎ（湿式実行）、ｄ）Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ（操作）：Ａｎａｌｙｔｅ Ｏｎｌｙ（被検体のみ）、ｅ）Ｄｉｓｐｌａｙ Ｗａｒｎｉｎｇ Ｍｅｓｓａｇｅ（警告メッセージ表示）：Ｔｉｍｅｄ Ｄｉｓｐｌａｙ ３０ｓｅｃ．（時限表示３０秒）、ｆ）Ｐｉｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｔｉｍｅ（ピン状態調整時間）：３０分。以下のＣｈｉｐ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ（チップ観察）設定を使用することができる、例えば、ａ）Ｃｈｅｃｋ Ａｕｔｏ Ｉｎｓｐｅｃｔ Ｃｈｉｐ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（チップの位置の自動観察を確認する、ｂ）Ｃｈｅｃｋ Ａｐｐｌｙ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ（補正適用を確認する）。以下のＣｌｅａｎ Ｓｅｔｔｉｎｇ（清浄化クリーン設定）オプションを使用することができ、例えば、ａ）Ｃｌｅａｎ Ｃｙｃｌｅｓ（サイクルを清浄化する）：１秒（ｓｅｃ．），ｂ）Ｒｉｎｓｅ Ｔｉｍｅ（リンス時間）：３秒、ｃ）Ｗａｓｈ Ｔｉｍｅ（洗浄時間）：５秒、ｄ）Ｄｒｙ Ｔｉｍｅ（乾燥時間）：０．２秒、ｅ）Ｗａｓｈ／Ｓｕｐｐｌｙ（洗浄／供給）：１００秒、ｅ）Ｃｌｅａｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｔｅｍｓ（配列製品を清浄化）−すすぎ、乾燥、洗浄、乾燥をオンにする（すべてを確認する）。以下のＬｏａｄ／Ｄｉｓｐｅｎｓｅ（充填／分配）オプションを使用することができる、例えば、ａ）Ｌｏａｄ Ｔｉｍｅ（充填時間）：３秒、ｂ）Ｌｏａｄ Ｏｆｆｓｅｔ（充填補正）：１秒、ｃ）Ｌｏａｄ Ｓｐｅｅｄ（充填速度）：４０ｍｍ／秒、ｄ）Ｄｉｓｐ．Ｔｉｍｅ（分配時間）：０、ｅ）Ｄｉｓｐ．Ｏｆｆｓｅｔ（分配補正）：１、ｆ）Ｄｉｓｐ．Ｓｐｅｅｄ（分配速度）：８０ｍｍ／秒。
【０１１６】
試料（少なくとも５０ｍｌ）含有ＭＰＴを適当な部分に置く。チップ位置＃１が右上にあるようにＳＣＯＵＴ（スカウト）プレートを配置する。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ ｌｏｇｏは左を指していなければならない。チップを選択されたスポットに配置し、Ｓｔａｒｔ（開始）ボタンを選択する。
【０１１７】
単一ピンによる１対１スポット添加に対して：
Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ（操作ツール）下で、ＭＴＰ Ｔｙｐｅ（ＭＴＰタイプ）及びＣＨＩＰ Ｔｙｐｅ（チップタイプ）を９６に替える。Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（移動定義）はＳｉｎｇｌｅ Ｐｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（単一ピン移動）でなければならない。Ｅｎａｂｌｅ Ｍｏｄｉｆｙ（修飾不可能）を選択し、ＭＴＰマップ上で、スポット添加されるウェルを選択する。ＭＴＰマップ上の適当なウェルがハイライトされたら、これらの試料がスポット添加されるチップ上のウェルをハイライトする。ＭＴＰがＣＨＩＰに作図されたら、Ｓａｖｅ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ Ｆｉｌｅ（定義ファイルを保存）を選択する。ＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＴＡＢ（操作タブ）、Ｒｕｎ Ｓｅｔｕｐ Ｔａｂ（実行設定タブ）上で、Ｌｏａｄ Ｍｅｔｈｏｄ（ロード方法）を選択する。以下の実行設定を使用することができる、例えば、ａ）Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｆｉｔｉｏｎ Ｆｉｌｅ（定義ファイルを移動）：Ｃｕｓｔｏｍ（顧客）、ｂ）Ｃｕｓｔｏｍ Ｆｏｌｄｅｒ（顧客フォルダー）からＳｉｎｇｌｅＰｉｎ．ｄｅｆ（単一ピン定義）をロードする。残りの設定は前記の９６から９６と同様である。
ＩＩＩ．Ｂｒｕｋｅｒ ＡｕｔｏＦｌｅｘ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＳｐｅｃｔｒｏＡｃｑｕｉｒｅ ＲＴ
Ａ．Ｂｒｕｋｅｒ ＡｕｔｏＦｌｅｘ／Ｏｌｉｇｏ Ｃｈｅｃｋ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．０．２０／ＳｐｅｃｔｒｏＡｃｑｕｉｒｅバージョン３．０．１．１４
ソフトウエア上のＦｌｅｘ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄウインドーから適当な方法を選択する、例えば、５０−量体に対して、ｂｅｓｔ ｔｅｓｔ ５５ｍｅｒ．ｐａｒを使用することができる。ｂｅｓｔ ｔｅｓｔ ５５ｍｅｒ．ｐａｒに対して、ＩＳ１＝２０．００ｋＶ、ＩＳ２＝１８．３０ｋＶ、Ｌｅｎｓ（レンズ）＝９．９０ｋＶ、Ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ（レフレクター）＝０．０ｋＶ、Ｐｏｌａｎｔｙ＝陽性、Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（検出装置）＝限定、ＰＩＥ＝６００ｎｓ、１５００Ｄａまでに抑制。質量分析法の図面上で、レーザーの上部にカーサーでポイントする。圧力は例えば、１５００〜１８００ｍｂａｒであることができる。Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（質量分析装置）タブ上で、高圧（ＨＶ）ＯＦＦを入れる。ＭＡＬＤＩ上で、側部のグリーンボタンを押してプローブする。チップ含有ＳＣＯＵＴプレートをトレー中に入れる。トレーの配置に注意し、トレーを閉める。
【０１１８】
ＲＴソフトウエアを選択し、コンピューターをオンにする。Ｍａｓｓ Ａｒｒａｙ Ｏｌｉｇｏ Ｃｈｅｃｋ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（大量アレーオリゴチェックソフトウエア）を開く。Ｏｌｉｇｏ Ｃｈｅｃｋ Ｃａｌｌｅｒ（オリゴチェックコーラー）、Ｏｌｉｇｏ Ｃｈｅｃｋ（オリゴチェック）及びＯｌｉｇｏ Ｃｈｅｃｋ Ａｃｑｕｉｒｅｒ（オリゴチェックアクワイアラー）を選択する。
【０１１９】
自動実行を実施するために：
Ｂｒｕｋｅｒ ＡｕｔｏＦｌｅｘ上で、以下の方法を使用することができる。Ｏｌｉｇｏ Ｃｈｅｃｋ（オリゴチェック）及び、Ｉｎｉｔｉａｌｉｚｅ Ｍａｌｄｉ Ｒｕｎ（Ｍａｌｄｉ実行開始）を選択する。Ｉｎｉｔｉａｌｉｚｅ Ａｕｔｏ Ｒｕｎ（自動実行開始）ウインドー中で、プレートの名称を入力し、チップ配置を可能にし、チップ位置を選択し、ブラウズし、そしてインプットファイル：ｑ：＼Ｍａｌｄｉ＼年＼プレート名 ｍｓを入力する。データベースからＬｏａｄ Ｍａｌｄｉ Ｒｕｎ（Ｍａｌｄｉ実行ロード）を選択する。Ｍｕｌｄｉ Ｒｕｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｅｒ（Ｍａｌｄｉ実行指定）ウインドー中でＡＬＬをクリックする。表われるツリーを開き、実行名を選択する。プレート名を選択し、実行をハイライトする。Ｓｕｂｍｉｔ Ｍａｌｄｉ Ｒｕｎ ｆｏｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（処理のためのＭａｌｄｉ実行服従）を選択し、スポッティングが１：１の場合はＳｐｅｃｔｒｏＪｅｔ、又はすべての６ピンが使用された場合はＳｐｅｃｔｒｏＰｏｉｎｔを選択する。Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍｏｄｅ（評価モード）（ＳＮＲ）に対しては、以下のパラメーターを使用することができる、例えば、ＳＮＲ Ｃｕｔｏｆｆ（中断）：１、Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ（信頼度）：０。ＳｐｅｃｔｒｏＡｃｑｕｉｒｅに戻り、Ｔｏｏｌｓ（ツール）、Ｃｏｎｄｉｆｕｒｅ（構成）、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｏｍｅｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ（質量分析法）を選択する。オートランを開始する時にはＬｏａｄ Ｍｅｔｈｏｄ（ロード方法）を選択する。Ｔｏｏｌｓ（ツール）メニューからＬｏａｄ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（ロードパラメーター）を選択し、正しいパラメーターファイルを開く。Ａｕｔｏ Ｒｕｎ Ｓｅｔｕｐ Ｔａｂ（自動実行設定タブ）上で、それがあるＣｈｉｐ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（チップ位置）の次に、実行のための正確な名称をタイプする。より完全な平均化のために、”Ｕｓｅ ａｌｌ Ｒａｓｔｅｒ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ（すべてのラスター位置を使用する）”を選択する。Ｒｕｎ（実行）を選択する。
【０１２０】
分析するために：
Ｏｌｉｇｏ Ｃｈｅｃｋ Ａｃｑｕｉｒｅｒ（オリゴチェックアクワイアラー）を選択する。データベースからＬｏａｄ Ｍａｌｄｉ Ｒｕｎ（Ｍａｌｄｉ実行をロード）を選択し、左側パネルのツリーを介してプレートに移動する。試料を再スポットし、再シュートする必要のあるトレース及び記録並びに失敗したものを調べる。試料を再シュートする必要がある場合は、再シュートされるもののみを映すようにｍｓファイルを修飾し、マッピングが正しいことを確認する。データを保存するためにＪＰＥＧファイルを作成することもできる。
【０１２１】
手動シュートを実施するために：
ＲＴソフトウエア上で、Ｔｏｏｌｓ（ツール）メニューからＬｏａｄ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（ロードパラメーター）を選択し、例えば、５０ｍｅｒ．ｐａｒを選択する。Ｍａｎｕａｌ（手動）コントロールタブに行く。ＡｕｔｏＦｌｅｘの側部のグリーンボタンを押し、チップを挿入する。グリーンボタンを押してクローズする。チップの配置及びプレートの配置については前記を参照する。Ｓｔａｇｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（位置確認）ボックス中の正しいチップ位置を入力する。ウェル表示（例えば、Ａ１、Ｆ３等）により最初にシュートされるスポットを選択する。このデータをＲａｗ Ｄａｔａ Ｆｉｌｅ（生のデータファイル）下に保存するために、Ｓａｖｅ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｔｏ ａ Ｆｉｌｅ（ファイルにスペクトルを保存）を選択する。ＪＯＧによる矢印を使用して、スポットにクロスヘアを整列させる。Ａｃｑｕｉｒｅ（アクワイア）を選択する。
【０１２２】
目盛補正するために：
興味対象の長さを括弧にいれて３点サンプルを準備する。例えば、５０−量体に対して、４５、５０及び５５を選択する。様々な濃度で混合されたストックオリゴをスポットに使用することができる。例えば、各１００ｍＭで開始し、次に希釈する。最大長さに対しては、より短い長さよりも大量を添加することができる。目標は大体同様な強度ですべての３ピークを見ることである。単一ピンを使用して９６チップをスポットする。Ｓａｍｓｕｎｇ Ｓｐｏｔｔｅｒ上で単一ピンのスポット実施の指示に従い、以前に説明されたように手動でシュートする。シュートを保存する。解析能に対し各スペクトルを概観し、例えば、少なくとも１０スペクトルを保持する。
【０１２３】
各スペクトルにつき、以下を実施する。スペクトルにカーサーをもってきて、マウスを使用して各ピーク上で拡大する。ピークの左側上を左クリックし、ピークの右側までドラッグしながら左ボタンを押し続ける。ボタンを放す。これはピーク上を拡大するであろう。位置決めハンドが表われるまでピークの頂点上にクロスヘアを向ける。ハンド上を左クリックする。頂点を通って垂直点線が下降し、スペクトル上に質量が表われるであろう。下方に「ピーク１」が適当な質量及び高さを伴って形成されるであろう。他のピークについて反復する。３点スペクトルにおいて各ピークにつきこれを実施後、期待される質量をタイプする。カーサーを主要３点頭部に配置し、右クリックする。Ｃａｌｉｂｒａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（スペクトル修正）を選択する。Ａ、Ｂ及びＣ値が与えられるであろう。すべてのファイルにつき反復する。Ａ、Ｂ及びＣすべての数値を収集し、平均する。
【０１２４】
この出願書全体に、様々な刊行物を括弧内に引用してきた。それらの全体のこれらの刊行物の開示は、本発明が関与する当該技術分野の状態をより完全に説明するために、本出願書中に引用によりここに取り入れられている。
【０１２５】
本発明は開示された態様に関して説明されたが、当業者は、詳説された特定の実験は本発明を具体的に示すだけであることを容易に認めるであろう。本発明の精神から逸脱せずに様々な修飾物を作製することができることが理解されなければならない。従って、本発明は以下の請求項によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】ポリヌクレオチドの自動合成のための装置を示す。図１の装置は、ヌクレオチドのための試薬容器（１〜６）、合成溶液のための試薬容器（７〜１１）、ガラスの観察窓（１０９、１１０、１１１）をもつ乾燥ボックス（１２）、試薬ビンを合成プレートに接続する個々のソレノイド弁（１１８、１１９）をもつ化学薬品注入装置のための枠組み（１３）、乾燥ボックスの入り口及び出口に接続された貫通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）ガス乾燥機（１４、１５）、ヌクレオチド試薬容器及び洗浄溶液の容器を加圧するために使用される試薬ガスフィード中に配置された貫通ガス乾燥機（１６、１７）、乾燥ボックスへのガスの入り口（１８、１９）、貫通ガス乾燥機（１７）への入り口（２０）及び貫通ガス乾燥機（１７）への出口（２１）、デジタルガス調整装置（２２、２３）、合成プレートから有機廃棄物容器へのインラインのソレノイド弁（２４）、装置の上部のための枠組み（１０５）、装置の底部のための枠組み（１１５）、合成溶液試薬の容器のための枠組み（１０６、１０７）及びヌクレオチド試薬の容器のための枠組み（１０８）、コンピューター（１１２）、弁を制御する管理装置ボックス（１１３）、管理装置を遮断するためのキルスイッチ（１１４）、テーブルの上面（１１６）並びにソレノイド弁を保持する板の一部（１１７、図３及び４に、より詳細に示される）を示す。
【図２】図１に示した装置の複数の図を示す。図２Ａは平面図であり、図２Ｂは斜めの角度の図であり、図２Ｃは正面図であり、図２Ｄは側面図である。装置の部分は図１と同様に標識を付けられている。図２Ｄにおいて、合成溶液のための試薬容器７及び８並びにヌクレオチドのための試薬容器１、２及び３は装置の右側上に配置されている合成溶液のための試薬容器９、１０及び１１並びにヌクレオチドのための試薬容器４、５及び６を示すために取り外されていることに注意されたい。
【図３】図１に示した装置の拡大図を示す。装置の部分は図１と同様に標識を付けられている。図３はソレノイド弁を保持する板（１１７）及びソレノイド弁（２６〜３１）の、より詳細な図を示す。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、合成プレートから有機廃棄物容器へのインラインのソレノイド弁（２４、２５）及び有機廃棄物容器への真空入り口ソレノイド弁（２６、２７）並びにその他のソレノイド弁（２８〜３１）の位置を示す、図１に示した装置の拡大図を示す。図４Ａはまた、ガラスの観察窓（１１１及び１２１）をもつ乾燥ボックス（１２）を示す。
【図５】乾燥ボックスの環境のガスの流れの拡大図を示す。液体窒素ジュワーからの吹きこぼれを乾燥ボックスのガス追い出しに使用することができる。図は液体窒素ジュワー（３８）及びガス調整装置（３９）、ガスの出口及び入り口（３２、３３）をもつ図１からのガス乾燥機（１６）、液体窒素ジュワー及びガス調整装置（３８、３９）を下方のガス乾燥機の入り口（３３）に接続するチューブ（４０）及び上部ガス乾燥機の出口（３２）を主ガス制御ソレノイド弁（２８）に接続するチューブ（４１）を示す。チューブ（４２）は主ガス制御装置（２８）を高流量制御ソレノイド弁（３０）に接続し、チューブ（４４）は高流量制御ソレノイド弁（３０）を高流量流量計（３７）に接続し、そしてチューブ（４６）は高流量流量計（３７）を三方接合具（４８）に接続する。チューブ（４３）は主ガス制御ソレノイド弁（２８）を低流量制御ソレノイド弁（３１）に接続し、そしてチューブ（４５）は低流量制御ソレノイド弁（３１）を低流量流量計（３６）に接続し、そしてチューブ（４７）は低流量流量計（３６）を三方接合具（４８）に接続する。チューブ（４９）は三方接合具（４８）を三方接合具（５０）に接続する。チューブ（５２）は三方接合具（５０）をガス入り口（１８）に接続し、そしてチューブ（５１）は三方接合具（５０）をガス入り口（１９）に接続する。チューブ（５４）はガス出口（３５）を三方接合具（５５）に接続し、そしてチューブ（５３）はガス出口（３４）を三方接合具（５５）に接続する。ガス入り口及び出口（１８、１９、３４及び３５）は乾燥ボックス（１２）に接続される。チューブ（５６）は三方接合具（５５）をガス乾燥機（１７）上のガス入り口（２０）に接続し、そしてチューブ（５７）はガス乾燥機（１７）上のガス出口（２１）を換気のために大気に接続する。
【図６】試薬ビン圧力系の拡大図を示す。図は制御されたヘリウムガス供給材料（５８）及びガス調整装置（５９）、制御されたヘリウムガス供給材料及びガス調整装置（５８、５９）及び、ガス乾燥機（１５）上のガス入り口（６１）を接続するチューブ（６０）を示す。チューブ（６２）はガス乾燥機（１５）上のガス出口（６２）をデジタルガス調整装置（２２）上の入り口（６４）と接続する。チューブ（６５）はデジタルガス調整装置（２２）を三方接合具（６６）と接続する。チューブ（６７）は三方接合具（６６）をガス供給マニホールド（６９）と接続し、そしてチューブ（６８）は三方接合具（６６）をガス供給マニホールド（７０）と接続する。ガス供給マニホールドは各試薬ビン（図１には示されない）に供給する。
【図７】アセトニトリル（ＡＣＮ）洗浄系の拡大図を示す。図は、制御されたヘリウムガス供給材料（７１）及びガス調整装置（７２）、制御されたヘリウムガス供給材料及びガス調整装置（７１、７２）及びガス乾燥機（１４）上のガス入り口（７４）を接続するチューブ（７３）を示す。チューブ（７６）はガス乾燥機（１４）上のガス出口（７５）をデジタルガス調整装置（２３）上の入り口（７７）と接続する。チューブ（７８）はデジタルガス調整装置（２３）をアセトニトリルジュワー（７９）と接続する。チューブ（８０）はアセトニトリルジュワー（７９）を三方接合具（８１）と接続する。チューブ（８２）は三方接合具（８１）をソレノイド弁洗浄ラインマニホールド（８３）と接続し、そしてチューブ（８４）は三方接合具（８１）をソレノイド弁洗浄ラインマニホールド（８５）と接続する。
【図８】真空系の拡大図を示す。図は、廃棄物容器（８６）をソレノイド弁（２５）と接続するチューブ（８７）及びソレノイド弁（２５）を合成プレート（プレート１）（８９）と接続するチューブ（８８）を示す。図はまた、廃棄物容器（９９）をソレノイド弁（２４）と接続するチューブ（１００）及びソレノイド弁（２４）を合成プレート（プレート２）（１０２）と接続するチューブ（１０１）を示す。チューブ（９０）は廃棄物容器（８６）を三方真空入り口ソレノイド弁（２６）と接続し、そしてチューブ（９１）は三方真空入り口ソレノイド弁（２６）を乾燥テフロン真空ポンプ（９３）及びトラップ（９２）と接続する。チューブ（１０３）は廃棄物容器（９９）を三方真空入り口ソレノイド弁（２７）と接続し、そしてチューブ（１０４）は三方真空入り口ソレノイド弁（２７）を乾燥テフロン真空ポンプ及びトラップ（９２、９３）と接続する。チューブ（９５）は排水廃棄物容器（９６）を排水管（ｄｒａｉｎ）（９４）と接続し、そしてチューブ（９７）は排水廃棄物容器（９６）を真空入り口ソレノイド弁（２９）と接続する。チューブ（９８）は真空入り口ソレノイド弁（２９）を乾燥テフロン真空ポンプ及びトラップ（９２、９３）と接続する。
【図９】図１で示された装置上で合成された、未精製５０−量体のＣＮＴ４−Ｆ−８ ５’ ＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧ ３’（配列確認番号：１）ポリヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．）のスペクトルを示す。
【図１０】図１で示された装置上で合成された、未精製５０量体のＣＮＴ４−Ｒ ５’ ＧＣＡＣＡＧＡＧＧＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＴＧＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧＡＴＣＡ ３’（配列確認番号：２）ポリヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．）のスペクトルを示す。
【図１１】Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．から購入して得た、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で精製され且つ脱塩された５０量体のポリＴ ５’ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列確認番号：３）ポリヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．）スペクトルを示す。
【図１２】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入して得た、ＰＡＧＥ精製され且つ脱塩された５０量体のＩＰＰ１ Ｆ４ ５’ ＡＧＴＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＣＧＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＡ ３’（配列確認番号：４）ポリヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．）スペクトルを示す。
【図１３】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入して得た、ＰＡＧＥ精製され且つ脱塩された５０−量体のＩＰＰ１ Ｆ６ ５’ ＣＣＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＧＧＡＡＡＴＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣＧＴＡＴＣＣＣＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＴＧＡ ３’（配列確認番号：５）ポリヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．）スペクトルを示す。
【図１４】市販のＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ ＭｅｒｍａｄｅＴＭオリゴヌクレオチド合成装置を使用してＥｇｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓで生成した、未精製のＥＰＯ ００１ Ｆ−７ ５’ＡＧＣＡＧＧＣＧＧＴＴＧＡＡＧＴＴＴＧＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＧＧＴＴ（配列確認番号：６）ポリヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．）スペクトルを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は概括的に生重合体合成、そしてより特別には無水状態を使用する高品質ポリヌクレオチドの自動合成装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代分子生物学における多数の技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡ解読、部位特異的突然変異誘発、全遺伝子アッセンブリー及び単一ヌクレオチドの多形性（ＳＮＰ）分析を含む合成ポリヌクレオチドを使用する。ポリヌクレオチドは概括的に、分子生物学に使用される多数の他の試薬と異なり、ストック製品として入手できず、各使用者の指定に対して注文作製される。例えば、ポリヌクレオチドの配列、規模、純度及び修飾物は使用者により指定されることができる。
【０００３】
ポリヌクレオチド合成化学及び処理技術の改善は、より低価格で、より早急な合成をもたらした。しかし、ポリヌクレオチド合成は一連の高い効率の化学反応を必要とする複雑な多段階工程のままである。理想的には、最終的ポリヌクレオチド生成物中の各ヌクレオチドの逐次（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）付加又はカップリングは、１００％収率をもたらす１００％効率を伴って起ると考えらえる。収率は各段階で又は完全な合成法の最後に回収される最終生成物の量を意味する。しかし、カップリング効率の効果は付加的であろうため、カップリング効率は１００％より小さく、各段階における僅かな減少が最終的ポリヌクレオチド生成物の収率に実質的な減少をもたらす可能性がある。例えば９９％〜９８．５％又は９８％の、カップリング効率の僅かな低下ですら、最終的ポリヌクレオチドの収率には重大な不利な影響をもつであろう。
【０００４】
ポリヌクレオチドの合成における各段階の収率はまた、生成することができるポリヌクレオチドの長さを決定する。ポリヌクレオチドの収量は各段階で減少するので、合成反応を継続するのに十分な材料がない時点が存在する。例えば、カップリング効率が９９％である場合は、合成後に存在する全長のポリヌクレオチド生成物の収率は２０個のヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対して約８３％、５０個のヌクレオチド含有のポリヌクレオチドに対して６１％、７５個のヌクレオチド含有のポリヌクレオチドに対して４８％そして１００個のヌクレオチド含有のポリヌクレオチドに対して３７％であろう。例えば、カップリング効率が９８％である場合は、１００個のヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの収率は１３％に低下する。従って、１００個を超えるヌクレオチドを含有する高品質のポリヌクレオチドを経済的に合成することは困難であった。
【０００５】
ポリヌクレオチドの合成におけるもう１つの課題は最終ポリヌクレオチド生成物中の不純物の存在である。不純物は合成反応からの前駆体試薬及び溶媒のみならずまた、所望のポリヌクレオチド生成物の全長に満たない、部分的ポリヌクレオチドが含まれることができる。これらの部分的ポリヌクレオチドは合成法期間のヌクレオチドの効率の悪いカップリングの結果であり、それらはしばしば、その後の適用における最終ポリヌクレオチド生成物の使用前の精製段階により除去される。部分的ポリヌクレオチド又は他の不純物からの最終ポリヌクレオチド生成物の精製は時間がかかり、最終ポリヌクレオチド生成物の収率減少をもたらす。
【０００６】
特定の適用のためには高品質のそして長さの長いポリヌクレオチドをもつことは望ましい。例えば、完全な遺伝子が生成されるように合成ポリヌクレオチドを重複させることにより、完全遺伝子をアッセンブルすることができる。このような遺伝子アッセンブリーの適用には、完全遺伝子をアッセンブルするために要する段階数及び従って、時間量を減少するためには、より長いポリヌクレオチドが望ましい。減少したアニーリング効率のような逐次（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）アッセンブリー反応における不純物の効果は付加的であろうために、このような方法のためには高品質のポリヌクレオチドが必要とされる。更に、アッセンブルされた遺伝子配列中への望ましくない突然変異体の導入を防止するために高品質のポリヌクレオチドが必要とされる。
【０００７】
従って、例えば、合成的遺伝子産生に適する原料として高品質のポリヌクレオチドの早急な合成を許す装置の需要が存在する。本発明はこの需要を充たし、同様に、関連した利点を提供する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明はａ）複数の防湿性試薬容器、ｂ）自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、ｃ）乾燥ボックスに試薬容器を接続する防湿性チューブ、ｄ）ガスが試薬容器を加圧する、試薬容器をガスに接続される試薬ガスフィード及びｅ）試薬ガスフィードに接続されており、かつ、試薬容器内の定圧を維持するデジタルガス調整装置、を有する、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための装置を提供する。本発明は更に、ａ）複数の防湿性試薬容器、ｂ）自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、ｃ）乾燥ボックスに試薬容器を接続する防湿性チューブ、ｄ）ガスが試薬容器を加圧する、試薬容器をガスに接続する試薬ガスフィード、ｅ）試薬ガスフィードに接続されており、かつ、試薬容器内の定圧を維持するデジタルガス調整装置及びｆ）ポリヌクレオチド合成装置、を有する、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための装置を提供する。
【０００９】
本発明はポリヌクレオチドのような生重合体の自動化合成の装置を提供する。装置は合成環境を制御して、効率のより良い合成反応を許し、より高品質の合成生成物をもたらす。例えば、装置は自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続系を維持することができ、そして試薬容器、自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、チューブ及び試薬ガスフィードに接続された少なくとも１基のデジタルガス調整装置を含む。本発明の装置は湿気の侵入を排除するために封止されている接続体を含むことができる。更に、本発明の装置は少なくとも１基のフロースルーガス乾燥機を含むことができる。本発明の装置は、生成される合成生成物に、より高い品質をもたらす、合成反応の効率を高めるためにポリヌクレオチド合成装置又は他の自動生重合体合成装置と併せて使用することができる。
【００１０】
１態様において、本発明は試薬容器、自動ポリヌクレオチド合成装置の合成反応室又は合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、防湿性チューブ、試薬ガスフィードに接続された少なくとも１基のデジタルガス調整装置及びポリヌクレオチド合成装置を含む装置を提供する。
【００１１】
本発明の装置は合成環境を制御して、著しく効率の良い合成の状態を最適にする。本発明の装置は例えば、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持することができる。このような装置の利点はポリヌクレオチド合成反応中の湿度が減少されることである。自動ポリヌクレオチド合成系内の湿度又は湿気の減少はカップリング効率の増加をもたらす。増加したカップリング効率は各段階における、より高い収率及び、より長いポリヌクレオチドを合成する能力をもたらす。増加したカップリング効率はまた、部分的ポリヌクレオチド生成物の量を減じ、それが最終的ポリヌクレオチド生成物の量を増加する。
【００１２】
本発明の装置のもう１つの利点は、装置が圧力の安定性を制御することができることである。安定な圧力は合成反応における化学薬品の送達における変動を減ずることができる。例えば、合成反応が継続するに従って、試薬容器の容量及び高純度ガスの高圧ガスシリンダー中のガス圧が低下し、それが圧力の随伴する低下をもたらす。圧力のこの低下は、カップリング効率を減ずる可能性がある、合成反応中に送達される試薬の量の変化をもたらす可能性がある。デジタルガス調整装置のような本発明の装置の構成部品は現在時のガス圧をモニターし、反応して、より一定なレベルへの圧力の均等化をもたらすことができる。定圧の維持は合成反応における正確な量の試薬の、より恒常的な送達をもたらし、それがより良いカップリング効率をもたらす。系中に定圧を維持することはまた、系中の相対湿度を減少する補助になる。
【００１３】
本発明の装置は例えば、低い水分含量及び化学試薬の恒常的送達のための安定した圧力レベルによりホメオスタティック状態を調整又は制御することができる。湿度の低下及び化学薬品送達の変動の減少双方が、より長くかつ、より高品質のポリヌクレオチドの生成を許す、より高いカップリング効率をもたらすことができる。高品質のポリヌクレオチドは精製段階なしで使用することができる。精製段階は時間がかかり、労力を要し、そして最終生成物のより低い収率をもたらす。長さの長い又は高品質のポリヌクレオチドは例えば、遺伝子アッセンブリー及び部位特異的突然変異誘発を含む幾つかの適用に有用である。
【００１４】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」は、共有結合により一緒に結合される２以上のヌクレオチドを意味することが意図される。例えば、ヌクレオチドはホスホジエステル結合により一緒に結合されることができる。ポリヌクレオチドは４種のヌクレオチド、アデニン、グアニン、シトシン及びチミン又はヌクレオチド類似体及び、イノシン、ジデオキシヌクレオチド又はヌクレオチドのチオール誘導体のような誘導体を含むことができる。ポリヌクレオチドを生成するためにはヌクレオチド又はホスホロアミダイトのような、ヌクレオチドの異なる化学的形態を使用することができる。更に、ヌクレオチドは放射性ラベル、蛍光色素、強磁性物質、発光タグ又は、ビオチンのような検出可能な部分のような検出可能な部分を更に取り入れることができる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、ＲＮＡ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
【００１５】
本明細書で使用される用語「閉鎖された連続的系」は、最適化された合成環境のためのホメオスタシスを維持するような方法で、経時的に系中の可変物（ｖａｒｉａｂｌｅ）をモニターし、調整することができる系を意味することが意図される。経時的に可変物をモニターし、調整することは、可変物が同時に又は「リアルタイム」でモニターされ、調整されることを意味することが意図される。所望されるホメオスタティック状態は例えば、系中の湿気のパーセントに関して又は系中の圧力量のような他の指標により、使用者により設定されることができる。例えば、閉鎖された連続的系は、系中に調整された圧力量を維持するように、圧力量が定常的にモニターされ、調整される、閉鎖された領域であることができる。
【００１６】
本明細書で使用される用語「閉鎖された連続的無水系」は、ホメオスタシスを維持するような方法で、同時に系中の湿気の量をモニターし、それに反応することができる系を意味することが意図される。所望されるホメオスタティック状態は、系中の湿気又は湿度のパーセントに対して使用者により設定することができる。例えば、閉鎖された連続的無水系は、湿気の量が、系からできるだけ多い湿気を排除するように定常的にモニターし調整される閉鎖された領域であることができる。更に、例えば、他の可変物を、圧力レベルのような閉鎖された連続的無水系中で調整することができる。
【００１７】
用語の無水は低い水分含量を意味することが意図される。水分含量は幾つかの方法で、例えば、湿度計を使用して湿度のパーセントとして測定することができる。無水系は低レベルの湿度又は湿気を有することができる。無水系は例えば、５％以下の相対湿度（ＲＨ）、４％以下の相対湿度、３％以下の相対湿度、２％以下の相対湿度、１％以下の相対湿度、０．５％以下の相対湿度又は検出できる相対湿度なしであることができる。水分含量はまた、百万分の一部（ｐｐｍ）単位で測定することができる。例えば、有機溶媒中の水分含量は無水有機溶媒に対して１０ｐｐｍ以下であることができる。
【００１８】
本明細書で使用される「試薬」は他の物質を検出、検査、測定又は生成するための化学反応中に使用される物質を意味することが意図される。試薬がポリヌクレオチドのような所望の物質の製造に使用される時は、試薬は所望の物質の製造の任意の段階で使用することができる。例えば、試薬はポリヌクレオチドの製造の開始時に使用されるヌクレオチド溶液のような前駆体であることができる。更に、試薬は、未結合ヌクレオチドを洗い落とすために使用される洗浄溶液のような、ポリヌクレオチドの製造中の、後になって使用される溶液であることができる。例えば、アセトニトリル洗浄溶液はポリヌクレオチドの製造において使用することができる試薬である。試薬には例えば、アミダイト、脱ブロック剤、酸化剤、活性剤、キャッピング試薬及びアセトニトリル洗浄溶液が含まれる。
【００１９】
本明細書で使用される用語「防湿性」は湿気に非透過性である物質を意味することが意図される。湿気は大気中の蒸気として又は物体の表面上に凝集した液体として感じることができる拡散した湿り気である。幾つかの防湿性物質は当業者に知られており、天然及び合成物質双方を含む。例えば、ステンレス鋼、ポリプロピレン、ポリスチレン及びテフロンは防湿性物質である。
【００２０】
本明細書で使用される用語「乾燥ボックス」は自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上に室を形成することができるフードを意味することが意図される。乾燥ボックスは、乾燥ボックスが十分なサイズの表面に封止されると、閉鎖された室を形成するような、１枚の開放された水平表面をもつフードである。乾燥ボックスはプラスチック、ガラス、重合体、エラストマー又はステンレス鋼のような防湿性物質から作製することができる。
【００２１】
本明細書で使用される用語「試薬ガスフィード」はガス源から試薬容器にガスを運搬することができるチューブを意味することが意図される。試薬ガスフィードは所望の圧力レベルに耐えることができる物質から作製される。例えば、試薬ガスフィードは、ガスシリンダーを洗浄溶液容器に接続する、プラスチック、ステンレス鋼又はテフロンチューブであることができる。様々なタイプのチューブを試薬ガスフィードのために使用することができ、例えば、チューブは、チューブがガス源から試薬容器にガスを運搬することができる限り、異なるレベルの柔軟性又は異なる直径をもつことができる。
【００２２】
本明細書で使用される用語「デジタルガス調整装置」は経時的にガス圧を正確にモニターし、ガス圧力を所望のレベルに調整するように機能する装置に出力信号を送達することができる装置を意味することが意図される。デジタルガス調整装置は系中のガス圧をモニターし、そして一定レベルのガス圧力を維持するように設定することができる。例えば、容器内の試薬レベルが変化するか又はガスシリンダー内の圧力が変化する時に、容器内にもたらされる圧力の変化がデジタルガス調整装置により正確にモニターされ、デジタル表示装置上に示されるように、デジタルガス調整装置は、加圧された試薬容器、高圧ガスシリンダー又は閉鎖系中のガス圧レベルをモニターすることができる。次にデジタルガス調整装置は、試薬容器に侵入するガスの量を制御する弁に信号を送り、容器内のガス圧力を均等化するように容器に侵入するガスの量を調整することができる。このように、連続的ホメオスタティック系が維持される。デジタル信号はアナログ信号の使用より、ガス圧のより正確な調整を許す。従ってデジタル信号はガス圧の同時の調整を許す。デジタルガス調整装置は例えば、０．１ｐｓｉの圧力、０．０５ｐｓｉの圧力又は０．０１ｐｓｉの圧力の区切りでガス圧を維持するために使用することができる。ガス調整装置が正確なほど、系内の圧力の制御がより正確である。デジタルガス調整装置は例えば、Ａｌｉｃａｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。
【００２３】
自動ポリヌクレオチド合成装置の、本明細書で使用される用語「合成プラットホーム」は、ポリヌクレオチド合成が起る１又は複数の反応容器又は反応室を含む又は保持することができる自動ポリヌクレオチド合成装置の表面を意味することが意図される。例えば、合成プラットホームはポリヌクレオチド合成反応が起ることができる１又は複数のウェル又はカラム又はプレートを含むことができる。幾つかの自動ポリヌクレオチド合成装置が市販されている。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ３８１Ａ及びＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ８９０５は市販されている標準ポリヌクレオチド合成装置である。更にポリヌクレオチド合成装置は、例えばＭｅｒＭａｄｅポリヌクレオチド合成装置のような注文製造された合成装置であることもできる（引用により本明細書に取り入れられているＲａｙｎｅｒ等、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：７４１−７４７（１９９８）を参照されたい）。
【００２４】
本明細書で使用される用語「フロースルーガス乾燥機」は、接合具中の物質が乾燥機中をフロースルーすることができるチューブのような接合具と一線に配置されている乾燥装置を意味することが意図される。乾燥装置は接合具中の物質から湿気を除去する任意の装置であることができる。例えば、乾燥装置は接合具中の物質を乾燥する乾燥物質を含むことができる。幾つかの乾燥物質、例えば、５Ａ分子ふるい及びＤＲＩＥＲＩＴＥを使用することができ、それらは当該技術分野で知られている。ＤＲＩＥＲＩＴＥのような乾燥物質は空気１ｌ当り０．００５ｍｇの乾燥までガスを乾燥することができる。ＤＲＩＥＲＩＴＥ中のインジケーターの色は枯渇する時に青からピンクに変化する。
【００２５】
本発明は自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的系を維持するための装置を提供する。本発明の装置は幾つかの試薬容器、自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、試薬容器を乾燥ボックスに接続する防湿性チューブ、試薬容器をガスに接続する試薬ガスフィード及び試薬ガスフィードに接続されたデジタルガス調整装置をもつことができる。チューブが溶媒と接している装置内の場所にある時、選択される防湿性チューブはまた溶媒抵抗性である。異なる溶媒に抵抗性である幾つかの物質が当該技術分野で知られている。
【００２６】
本発明の装置はオリゴヌクレオチドのような生重合体の合成を最適化するための制御された環境の室を形成する。閉鎖された連続的系は圧力のような、系内の可変物を調整することができる。１態様において、装置はシリコーンコーキング材で封止される接合具を含む。もう１つの態様において、封止された接合具は１平方インチ当り１００ポンド（ｐｓｉ）を超える圧力を維持することができる。
【００２７】
ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドとしても知られる）を合成する方法は当該技術分野で知られており、例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｔｅ，刊行，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）；Ｗｅｉｌｅｒ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４３：２１８（１９９６）；Ｍａｓｋｏｓ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（７）：１６７９（１９９２）；Ａｔｋｉｎｓｏｎ等、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈｉｔｅｔｒｉｅｓｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ，ｉｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ３５（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，１９８４）；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ及びＧａｉｔ（ｅｄｓ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）並びにＡｎｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）中に記載されていることを認めることができる。
【００２８】
ポリヌクレオチド及び他の重合体配列のアレーを生成するための固相合成法は例えば、Ｐｉｒｒｕｎｇ等、米国特許第５，１４３，８５４号明細書（ＰＣＴ出願書国際公開第９０／１５０７０号パンフレットも参照されたい）、Ｆｏｄｏｒ等、ＰＣＴ出願書国際公開第９２／１００９２号パンフレット、Ｆｏｄｏｒｌ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：７６７−７７７及びＷｉｎｋｌｅｒ等，米国特許第６，１３６，２６９号明細書，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等、ＰＣＴ出願書国際公開第８９／１０９９７号パンフレット及びＢｌａｎｃｈａｒｄ，ＰＣＴ出願書国際公開第９８／４１５３１号パンフレット中に記載されていることを見いだすことができる。これらの方法にはミクロピンを使用するアレーの合成及び印刷、写真平板及びオリゴヌクレオチドアレーのインクジェット合成が含まれる。
【００２９】
ポリヌクレオチドの逐次アニーリングによる大きい核酸重合体を合成する方法は例えば、Ｅｖａｎｓに対するＰＣＴ出願書国際公開第９９／１４３１８号パンフレット及びＥｖａｎｓに対する米国特許第６，５２１，４２７号明細書中に記載されていることを見いだすことができる。前記の引用物はすべてそれら全体を引用により本明細書中に取り入れられている。
【００３０】
ポリヌクレオチドはホスホロアミダイト化学反応を使用して市販の核酸合成装置上で生成することができる。Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈシリーズはホスホロアミダイト及び代わりの合成法を概説した（Ｂｒｏｗｎ，Ｔ．，及びＤｏｒｋａｓ，Ｊ．Ｓ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄ．Ｆ．Ｅｃｋｓｔｉｅｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ（１９９５））。
【００３１】
ポリヌクレオチドの化学的合成は４種の構成ブロック（塩基ホスホロアミダイト）が直線状重合体として結合される工程である。成分の塩基に加えて、ヌクレオチド間の結合の形成、酸化、キャッピング、脱トリチル化及び脱保護を補助するために、多数の試薬が必要とされる。自動化合成は逐次（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）化学反応、マトリックスに試薬を送達するための一連の弁及びタイマー並びに最後に精製、定量、生成物のＱＣ及び凍結乾燥を含むことができる合成後の処理の流れ、のための骨格として働く固形支持マトリックス上で実施することができる。
【００３２】
幾つかの標準ＤＮＡ塩基（Ｇ、Ｃ及びＡ）は、反応性の第一級アミンを含有し、従って第一級環外アミンを合成中に望ましくない反応に参加しないように、保護基で修飾することができる。更に、４種のホスホロアミダイトは同様に保護される必要があるリン結合を含む。これらの感受性サイトを保護するために使用される化学基は、ＤＮＡ合成サイクル中はそのままで留まることができるが、正常な未修飾ＤＮＡがもたらされるように、合成後に容易に除去されることができる。多数の異なる保護法が開発されてきた。例えば、ｂ−シアノエチル保護リンをもつホスホロアミダイトを使用することができる。複素環式塩基には第一級アミンの保護はしばしば、アデニン及びチトシンに対してはベンゾイル基によりそしてグアニンに対してはジメチルホルムアミジン又はイソブチル基のいずれかにより提供される。第一級アミンをもたないチミンは塩基の保護を必要としない。これらの保護基は合成中に使用される条件下で安定であるが、アンモニアによる処理により急速に、そして有効に除去される。
【００３３】
活性化モノマーがそれら自体と反応せずに、固形支持体に繋留された生長しているポリヌクレオチド鎖上の５’−ＯＨとのみ反応することができるように、塩基−ホスホロアミダイトの５’−ＯＨをブロックすることも望ましい。今日の化学は例えば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を使用する。縮合後、ＤＭＴ基は酸との処置により新規に添加された塩基から開裂される。放出されたＤＭＴカチオンは橙色であり、ＤＮＡのカップリング効率の進行を４９０ｎｍの分光測定値によりモニターすることができる。
【００３４】
デオキシリポース糖の３’ヒドロキシ基は著しく反応性のホスフィチル化剤で誘導される。この基上のホスフェートの酸素は通常、高温で、水酸化アンモニア処理を使用するβ−脱離により除去することができるβ−シアノエチル部分によりマスクされる。
【００３５】
自動化合成は固形支持体、通常、制御された多孔質ガラス（ＣＰＧ）又はポリスチレン上で実施することができる。ＣＰＧは反応室として働く小カラム中に充填される。充填されたカラムをＤＮＡ合成装置上の試薬送達ラインに結合し、化学反応はコンピューターの制御下で進行する。塩基は３’から５’方向（ＤＮＡポリメラーゼによる酵素合成と逆方向）に生長している鎖に付加される。「普遍的（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」支持体は存在するが合成はよりしばしば、３’ヒドロキシルにエステル結合により結合されている第１の塩基ですでに誘導されているＣＰＧを使用して開始される。合成はＣＰＧ固形支持体に結合された第１の塩基で開始し、３’ｙ５’方向に伸長する。ＣＰＧ粒子は比較的大きく、多孔質で、容量に対する表面の比率を著しく増加するチャンネルを含み、それにより、反応を、少容量の試薬を使用して小さい反応室内で実施させる。ＣＰＧは、片方の末端に試薬の入り口、そして他方に出口（廃棄物）を伴う、２種のフィルターフリット間の「カラム」内に配置される。
【００３６】
ポリヌクレオチド合成サイクルは以下に説明されるように４段階：（１）脱ブロック、（２）活性化／カップリング、（３）キャッピング及び（４）酸化、において進行することができる。
【００３７】
脱ブロック：合成サイクルはジクロロメタン（ＤＣＭ）中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）又はトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）に短時間暴露することにより５’−末端塩基の５’ヒドロキシルからのＤＭＴ基の除去により開始する。生成されるトリチルカチオンの収率を合成反応の効率をモニターする補助にするために測定することができる。ヌクレオシド構成ブロック上の反応性物質（第一級アミン及び遊離ヒドロキシル）保護は、暴露された５’ヒドロキシルがカップリング反応（次の段階）に参加することができる唯一の反応性求核原子であることを確実にする。
【００３８】
活性化／カップリング：ＤＮＡホスホロアミダイトはカップリング時にテトラゾール又はテトラゾール誘導体中での処理により、より反応性形態に転化される。これらの工程は、ホスホロアミダイトの急速な脱プロトン化、その後の、ホスホロテトラゾリド中間体の可逆的な、そして比較的遅い形成により起る。活性化デオキシリボヌクレオシド−ホスホロアミダイト試薬とのカップリング反応は早急で、効率がよい。ホスホロアミダイトに対するテトラゾールの過剰が完全な活性化及びＣＰＧに結合される反応性ポリヌクレオチドに対するホスホロアミダイトの過剰を確実にするために使用することができる。これらのタイプの条件下で、＞９９％のカップリング効率を達成することができる。
【００３９】
キャッピング：塩基カップリング反応は１００％の効率をもたないので、ＣＰＧ支持体上の少量の生長ポリヌクレオチドは結合せず、望ましくない先端を切り取られた物質をもたらすであろう。ブロックされない限り、これらの先端を切り取られ又は部分的なポリヌクレオチド生成物は後のサイクルにおいて基剤として働き続け、延長し、そして内部欠損をもつほとんど全長のポリヌクレオチドをもたらすことができる。これらの先端を切り取られた又は部分的なポリヌクレオチド生成物は（ｎ−１）−量体物質と呼ばれる。これらの「反応の失敗物」は大部分、無水酢酸による遊離５’−ＯＨのアセチル化を伴う「キャッピング」により次の合成サイクルに参加することを妨げられることができる。
【００４０】
酸化：この時点で、ＤＮＡ塩基は電位の不安定な３価のホスファイトトリエステルにより結合される。この物質は酸化により安定な５価ホスホトリエステル結合に転化される。水／ピリジン／テトラヒドロフラン中での希ヨウ素との反応生成物の処理は、加水分解されて、５価のリンを生ずるヨウ素−リン付加物を形成する。酸化段階はポリヌクレオチド合成の１サイクルを完結し、その後のサイクルは新規付加５’−塩基からの５’−ＤＭＴの除去で開始する。
【００４１】
開裂及び脱保護：合成完了後、ポリヌクレオチドを室温で濃水酸化アンモニウムで固形支持体から開裂することができる。高温におけるアンモニア中での連続培養はシアノエチル基のβ−脱離によりリンを脱保護し、そして更に複素環式塩基から保護基を除去する。
【００４２】
合成後の処理：合成中は、全長のポリヌクレオチド及び先端切り取り生成物又は部分的ポリヌクレオチド生成物の双方がＣＰＧ支持体に結合されたままである。合成後、その物質を同様に開裂して回収すると、最終反応生成物は所望の物質及び非所望の物質の不均一混合物である。ポリヌクレオチドの長さが増加するに従って、不純物がより大量に蓄積する。更に、開裂した保護基もまた存在する。この時点で、ポリヌクレオチドは伝統的に「脱塩され」、その工程では僅かな分子不純物（保護基及び短い先端切り取り生成物）をゲル濾過又は有機固相抽出（ＳＰＥ）法を使用して除去される。
【００４３】
定常のＰＣＲ又はＤＮＡ解読のような簡単な適用において短いプライマーを使用する時は、更なる精製を伴わない脱塩ポリヌクレオチドの使用が適当であることができる。しかし、クローン形成、部位特異的突然変異誘発又は遺伝子アッセンブリー適用中に使用される場合、ｎ−１及び他の先端切り取り又は部分的ポリヌクレオチド物質は、欠失変異体をもたらすことができる。先端切り取り又は部分的ポリヌクレオチド物質を除去するためには、ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣによる精製を使用することができる。
【００４４】
ポリヌクレオチドの合成効率は典型的には、化学反応の各サイクルに対して約９８〜９９％であり、従って各サイクルに対し約１〜２％の反応生成物は期待されるより１塩基短いであろう。幾つかの先端切り取り物質は「キャッピング」しないので、ＤＮＡ合成の更なるサイクル中に寄与し続ける。６０−量体のポリヌクレオチドに対して、最終生成物の５０％未満が所望の全長分子であろう。最終合成生成物は、配列の不均一集合物、有効には各可能な位置の欠失変異体のプールを表わす（ｎ−１）−量体及び（ｎ−２）−量体（等）の分子の混合集団を含むであろう。
【００４５】
合成の規模は出発物質の量を表わし、他方、合成収率は合成及び精製段階が完了した後に回収される最終生成物の量を表わす。ポリヌクレオチド合成において、３’末端塩基は注文者により注文された規模で固形支持体に結合される。塩基は３’から５’の方向に一度に１個ずつ付加される。理想的には各付加塩基は１００％の効率でカップリングして、１００％収率をもたらすと考えられる。実際には、カップリング効率は１００％より幾分小さく、この僅かな減少が最終オリゴヌクレオチド収率の実質的な減少をもたらすことができる（カップリング効率は付加的であろうため）。更に、カップリング効率は付加される各塩基に対して変動することができ、従って配列自体が収率の広範なばらつきの原因であることができる。２５０−ｎモル規模の反応に対して、脱保護及び精製後の最終収量は１０〜１００ｎモルにわたることができる。ある配列は他の配列より高い収量をもたらす傾向をもち、この傾向は通常再生可能である。１種の２０−塩基配列の合成に対する収量は２種の配列が同一日に、同一機械上で、同一試薬を使用して実施されるとしても、異なる２０−塩基配列に対して得られるものの２倍であることができる。収量の幾らかのばらつき性はまた、使用される個々の機械から由来することができる。
【００４６】
与えられる合成に対する理論的な収量は（Ｅｆｆ）ｎ−１であり、ここでＥｆｆはカップリング効率を表わし、そして「ｎ」はポリヌクレオチド中の塩基数を表わす。カップリング効率が９９％（Ｅｆｆ＝０．９９）である場合、合成後に存在する全長生成物の割合は２０−量体に対して、約（０．９９）１９又は８３％、５０−量体に対して（０．９９）４９又は６１％、そして７５−量体に対して（０．９９）７４又は４８％であろう。カップリング効率の僅かな減少は期待収量に実質的な減少をもたらすであろう。例えば、カップリング効率が９９％である場合、１００−量体に対する収率は（０．９９）９９又は３７％であるが、カップリング効率が９８％に低下する場合は、収率は（０．９８）９９又は１３％に低下する。
【００４７】
しかし、カップリング効率は付加される各塩基によりばらつく。恐らく、固形支持体の表面の近位の立体妨害のために、カップリング効率は最初の５〜６個の塩基に対して、より低い。次に、２０番目の塩基の付加に特徴的であるように、カップリング効率は約９９％の最適値まで増加し、そして次に長さが延長されるに従って、最適値より低いレベルに、再度低下する。カップリング効率は実際ポリヌクレオチドが非常に長くなるにつれて減少するので、１００−量体上の収率はしばしば１０％未満であることができる。生成物はまた、実施される場合に任意の精製過程中でも喪失され、それは更に収率を減少する。
【００４８】
本発明はａ）複数の防湿性試薬の容器、ｂ）自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、ｃ）試薬容器を乾燥ボックスに接続する防湿性チューブ、ｄ）ガスが試薬容器を加圧する、試薬容器をガスに接続する試薬ガスフィード及びｅ）ガス調整装置が試薬容器内に定圧を維持する、試薬ガスフィードに接続されたデジタルガス調整装置、を有する自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための装置を提供する。閉鎖された連続的無水系は系中の湿気含量を調整することができる。本発明の装置の１例は図２〜８に示される装置の様々な図及び拡大図を伴って、図１に示される。
【００４９】
本明細書に記載され、図に示される本発明の装置の様々な態様の外に、当業者は、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための本発明の装置の構造又は機能から逸脱せずに、僅かな修飾物及び並べ換え物を本明細書に記載され、例示される本発明の装置中に取り入れることができることを理解するであろう。例えば、系の一部又はすべての湿気含量に対して、より大掛かりのレベルの調整的制御を与えることができる修飾物は、閉鎖された連続的無水系を維持するための本発明の装置の一構成部品として含まれることができる。湿気含量の調整的制御は他の構成部品から隔離できる系の一部に対して及ぼすことができるか、又は制御は自動化系の非隔離可能な部分に対して及ぼすことができる。隔離可能な部分には例えば、試薬の容器、溶液の容器、廃棄物の容器、乾燥ボックス及び、弁又はソレノイドで終結するチューブが含まれる。系の非隔離可能な部分には例えば、隔離可能な部分の補完部分が含まれることができる。更に、湿気含量の調整的制御は全系に対して全体的に及ぼすことができる。
【００５０】
閉鎖された連続的無水系を維持するための調整的制御には、ディメンション、容量、封止剤、チューブの長さ、弁、ソレノイド、使用者のアクセス及びデジタル又は他の機械的又は電気的調整装置に対する僅かな修飾物が含まれることができる。例えば、容器、室又はチューブのより小さい容量は系中に導入される湿気量を減少し、そして／又は系から除去されることが必要な湿気量を減少するか又はそれら双方である。侵入又は排出湿気のいずれか又は双方の減少は無水状態のホメオスタシスを維持するために調整することが必要な定格荷重（ｎｅｔ ｌｏａｄ）を減少する。当業者は、サイズ又はディメンション、容量、封止剤、使用者のアクセスあるいはデジタル又は機械的圧力、容量又は真空調整装置の様々な組み合わせ及び入れ替えを組み合わせて、本明細書に記載される態様と同様な又はそれらより良い性能の特徴を有する閉鎖された連続的無水系を構成することができることを理解するであろう。
【００５１】
本明細書に記載される態様に対する他の修飾物には例えば、本明細書に例示される物質よりも大きい防湿性を示す物質の置き換え物が含まれることができる。例えば、本発明は閉鎖された連続的無水系を維持する装置を提供する。従って有益な防湿性を示す又は湿気不透過性を示す当業者に知られた物質を、本発明の装置から逸脱することなく、本明細書に記載される例示的物質に置き換えることができる。従って、当業者は、本明細書に提供される教示及び指導を与えられて、閉鎖された連続的無水系を維持する装置には、系の無水状態のホメオスタシスを維持又は補強する、本明細書に記載される装置に対する修飾物及びその構成部品の組み合わせ物が含まれ得ることを理解するであろう。
【００５２】
図１に示すように、本発明の装置は複数の試薬容器を含む。図１において、ヌクレオチド試薬を保持する試薬容器は１〜６と標識されている。脱保護剤、酸化剤、活性剤及びキャッピング試薬のような合成溶液を含む試薬容器は７〜１１と標識されている。装置はまた、自動ポリヌクレオチド合成装置（乾燥ボックス内、図に表れない）の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス（１２）を含む。チューブ（図示されない）は個々のソレノイド弁（１１８、１１９）を介して試薬容器を乾燥ボックス（１２）に接続する。試薬ガスフィードと集合的に呼ばれる更なるチューブ（例えば、６０、６３、６５、６７、６８、７３、７６、７８）は試薬容器をガスシリンダー（図６及び７に示されている）に接続する。デジタルガス調整装置（２２、２３、図６及び７参照）は試薬ガスフィードに接続される。更に、２本のフロースルーガス乾燥機（１６、１７、図５参照）は乾燥ボックス（１２）に接続される。更に２基のフロースルーガス乾燥機はヌクレオチド試薬容器（１５、図６参照）を加圧するために使用される試薬ガスフィード及び洗浄溶液の容器（１４、図７参照）を加圧するために使用されるガスフィード内に配置されている。
【００５３】
図１に示すように本発明の装置は複数の試薬容器を含む。試薬容器は合成反応中の任意の地点で使用される任意の試薬を保持することができる。例えば、試薬容器はヌクレオチド試薬（１〜６）、もう１種の合成溶液（例えば、脱保護剤、酸化剤、活性剤もしくはキャッピング試薬（７〜１１））又は、アセトニトリルのような洗浄溶液を保持することができる。ヌクレオチド試薬を保持する４個の試薬容器は、アデニン、チミン、シトシン及びグアニンのようなヌクレオチド塩基の試薬を保持するために使用することができる。第５の容器は最後のホスフェート・ホスホロアミダイト塩基を維持することができ、そして第６の容器は、必要な場合に混合ヌクレオチド塩基試薬として使用することができる。１態様において、試薬容器はヌクレオチド溶液容器又は洗浄溶液容器である。もう１つの態様において、装置は１個の洗浄溶液容器及び１又は複数のヌクレオチド溶液容器を含む。
【００５４】
試薬容器は液体試薬を保持することができる。１態様において、試薬容器は防湿性である。防湿性容器は外部環境からの湿気を容器の内部に侵入させない。防湿性容器はステンレス鋼、ガラス又はプラスチックのような防湿性物質からできているか又はそれらでコートされている。試薬容器はまた、それらが保持する物質にも抵抗性である、例えば、アセトニトリルのような溶媒を保持する試薬容器は溶媒抵抗性容器である。
【００５５】
使用されている試薬が湿気を含まないことを確保するために、試薬を混合する前に、試薬容器、例えばガラスびんを洗浄し、オーブンで乾燥することができる。びんは乾燥ボックス内で充填され、分子ふるいを添加され、試薬を使用する前に２４時間静置される。更に、試薬容器中に挿入される取り込みラインにテフロンフィルターを付加される（ａｄｄｅｄ）。これは取り込みライン中に導入され、そして合成プレート中に導入されるふるいからの微細物又は他の小粒子の量を減少する。
【００５６】
自動化合成のための閉鎖された連続的無水系を確実にするために本発明の装置中に他の構成部品を含むことができる。例えば、系は合成に送達される幾らか又はすべての化学試薬を貯蔵するための乾燥キャビネットを含むことができる。代表的乾燥キャビネットは防湿性物質から製造され、真空を維持するのに十分な接合部で封止されることができる。このような閉鎖された系のキャビネットは、乾燥剤の注入用圧力ポンプ及び圧力の維持のための真空ポンプ又は双方のような調整用構成部品との接続のために取り付けられる入り口及び出口をもつことができる。乾燥キャビネットは更に、任意の弁、デジタル調整装置あるいは、閉鎖された連続的無水系の調整又は維持のための、装置の他の構成部品又は部分に対して本明細書に記載される他の構成部品を含む又はそれらに取り付けることができる。更に、乾燥キャビネットは例えば、試薬を充填させる１、２又は３又はそれを超える正面のアクセスドアを含むことができる。系の乾燥キャビネット内の閉鎖された連続的無水環境の維持及び調整は例えば、操作前、その間又はその後にキャビネットをとおる乾燥窒素、アルゴン又はヘリウム又は他の無水ガスの一定の流れを発生することにより達成することができる。このような乾燥キャビネットは系操作のこれらの各相の期間中、試薬又は他の合成物質を連続的乾燥環境中に維持させる。乾燥キャビネットはまた、例えば、他の補助的構成部分を含むか又は他の補助的機能を実施することができる。例えば、乾燥キャビネットは二次的流出封じ込め物又は火災防御物を含むことができる。連続的無水状態を更に維持するためにキャビネット中に固形乾燥剤を導入することもできる。
【００５７】
ガラス容器は例えば、以下のプロトコールを使用して洗浄することができる。液体及びアミダイトを保持するための任意のサイズ、例えば、４Ｌ、９５０ｍｌ及び４５０ｍｌのアンバーコートびんは以下のように洗浄することができる。びんを、ＡＣＳ試薬等級のアセトニトリルで４回、ＡＣＳ試薬等級のアセトンで２回、次にＡＣＳ試薬等級のメタノールで２回すすぐ。すじが見えなくなるまで、びんの外側をふき取る。２〜３分間びんを逆さにして空にする。２４時間、６５℃以上のオーブン中に逆さに置く（ペーパータオル上に置く）。
【００５８】
ホスフェートホスホロアミダイト又は特製アミダイトを保持するための試験管又は注文ガラス容器は例えば以下のように洗浄することができる：熱水中で試験管ブラシをすすぐ。Ｍｉｃｒｏｎ−９０で試験管をこする。Ｍｉｃｒｏｎ−９０溶液中に再度入れ換える前に試験管ブラシをすすぐ。次に脱イオン（ｄＩ）水の熱水中でガラス容器をすすぐ。ガラス容器をＡＣＳ試薬等級のアセトニトリルで４回、ＡＣＳ試薬等級のアセトンで２回そして次にＡＣＳ試薬等級のメタノールで２回すすぐ。外側をふき取る。２４時間、６５℃以上のオーブン中に逆さに置く（ペーパータオル上に置く）。
【００５９】
合成反応に使用される試薬は例えば、Ｃｒｕａｃｈｅｍ（Ｄｕｌｌｅｓ，ＶＡ），Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ），ＡＢＩ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及びＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）から購入可能である。ホスホロアミダイトは典型的には５０グラムの量の粉末形態で配達され、乾燥アルゴン又は窒素を充填された別々のグローブ・ボックス中の例えば、９５０ｍｌの試薬びん中に無水アセトニトリル（０．０００２％Ｈ２Ｏ；＞１０ｐｐｍＨ２Ｏ）で直接希釈することができる。これは２０−量体の１０回の２プレート実施に十分量の試薬を提供する。
【００６０】
アミダイト塩基は以下のように調製することができる：作業はフード内に配置された無水グローブ・ボックス内で実施することができる。第１に、必要な試薬：例えば、Ａｎｎｏｖｉｓ（９５０ｍｌびん）からのアミダイト（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ）及び例えば、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅからの無水アセトニトリル（９５０ｍｌびん）を集める。これらの品物を乾燥ボックス中に入れ、閉鎖する。湿度モニターが０〜２％相対湿度に達するまで窒素ガス及び「急速パージ」のスイッチを入れる。次に上部の弁を閉鎖し、無水グローブ・ボックス内で１０ｐｓｉで、より低い流速で窒素パージを継続する。
【００６１】
作業濃度は１ｇの無水ホスホロアミダイト／１６〜１９ｍｌの無水アセトニトリル溶媒である−無水アセトニトリルを５０〜６０グラムの無水Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴホスホロアミダイト粉末を含有する９５０ｍｌびんの首に注入する。びんを激しく震盪して、ホスホロアミダイト粉末を溶液中に懸濁させる。アミダイトが完全に溶解するまで待ち、次に各びんに約５０グラムのゼオライトを添加し、蓋をする。びんに日付を付け、ロット番号を記す。無水グローブ・ボックスから取り出し、合成装置上に無水アミダイト溶液の試薬びんを置く。Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣは無水アセトニトリル溶媒中への無水Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃアミダイト粉末の懸濁後約２週間、使用することができる。
【００６２】
ホスフェート・ホスホロアミダイトは以下のように調製することができる。作業はフード内に配置された無水グローブ・ボックス中で実施することができる。このアミダイトは実施が完了後に調製することができる。第１に、−８０℃の冷凍庫から５’−ＣＥホスホリル化ホスホロアミダイト（Ｃｒｕａｃｈｅｍからの０．５ｇ又は１．０ｇいずれかのびん，ＤＭＴ非含有）を取り出し、無水グローブ・ボックス内に入れる。グローブ・ボックス内に更に無水アセトニトリル、化学的に抵抗性のシリンジ、２１ゲージの針、清浄な乾燥したアンバーコートされた注文ガラス容器（５０又は１５ｍＬ）及び蓋を入れる。湿度モニターが０〜２％相対湿度に達するまでアルゴン又は窒素及び「急速パージ」のスイッチを入れる。弁を閉鎖し、無水ガスのパージを減少する。包装を開封する。正確な濃度は０．５ｇ無水ホスホロアミダイト／８ｍｌ無水アセトニトリル溶媒である。カップリングを２倍にするために−ウェル当り１００μｌの２倍には、どのくらいの量のこの溶液が必要か、を計算する。９６ウェルのプレートに対して、これは１９．２ｍｌ（安全のために２２ｍｌを加える）である。シリンジ（１０〜２０ｃｃ及び２１ゲージの針）を使用して、無水アセトニトリル溶媒をそれら自体の包装物内でアミダイトに移す。アミダイトを室温で１０分間溶解させる。注文の円錐形の５０ｍｌのアンバーガラスを無水窒素でパージする。各液滴を得るために、５’−溶液からの隔壁蓋を外すことにより、清浄な、乾燥ガラス容器に溶液を移す。蓋をする。ｄ５位置のアセトニトリル洗浄びん又はオーブン乾燥した空のびんを取り出す。ｄ５位置に注文ガラス容器を置く。びんの蓋は必要な、できるだけ短時間だけ開ける。無水ホスフェート・ホスホロアミダイト１〜２ｍｌでラインをプライムする（ｐｒｉｍｅ）。古いホスホリル化試薬と混合しない。５’−ホスフェート・ホスホロアミダイト試薬は１時間以内、合成装置上にある。
【００６３】
図１に示すように、本発明の装置は乾燥ボックス（１２）を含む。乾燥ボックスは自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上に配置することができるフードである。次に合成プラットホームが乾燥ボックスの底部になる。乾燥ボックスが合成プラットホーム上に封止されると、それは合成プラットホームの周囲の閉鎖された連続的系の一部になることができる。乾燥ボックスは幾つかの物質、例えば、湿気及び溶媒抵抗性物質（例えば、Ｐｙｒｅｘガラス、ステンレス鋼、ポリプロピレン）から構成するか又はテフロンを使用することができる。１態様において、乾燥ボックスは防湿性物質から製造され、ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を提供するように合成プラットホーム上に封止される。図１に示される乾燥ボックスは、合成プラットホームを含む乾燥ボックスの内部を見るために使用することができる、ガラスの観察窓（図１に示される１０９、１１０、１１１、図２Ｄ中の１２０及び図４Ａ中の１２１）を含む。
【００６４】
乾燥ボックスはまた、図１に例示されたもの以外の様々なディメンション及びサイズをもつようにデザインされ、構成されることができる。例えば、乾燥ボックスは合成機械、構成部品、試薬及び溶液のために十分な空間を許しながら、その容量を最小にするように構成することができる。乾燥ボックス容量の最小化は合成環境内の湿気の量を減少し、従って無水条件に対する調整的管理を増強する。乾燥ボックスの容量及びディメンションは自動化合成装置のスタンド又は他の部品のディメンションに適合するように修飾することができる。閉鎖された連続的無水系を維持するための本発明の装置に有用な乾燥ボックス容量の特別な例は１０２ｌ、７０ｌ又はそれより小さい。
【００６５】
本発明の装置の乾燥ボックス中に取り入れることができる他の構成部品には、操作中に閉鎖された連続的無水系の完全性を維持する特徴物が含まれる。例えば、気密及びグローブによるアクセスは、閉鎖された連続的無水環境と妥協することなしに、オペレーターに操作中に系に伴うどんな問題でも対処させ、並びに系中へそして系から合成プレートを出し入れさせる。このような特徴物は、それがどんな特定の操作中でもすべての試料又はマルチウェルプレートを妨害したり又は台なしにすることなしに、同時に、操作、完成した合成物の取り出し又は新規合成物の導入を許すので、多数のマルチウェルプレートの同時合成期間中に有益である。
【００６６】
本発明の装置は幾つかのシール、例えば、乾燥ボックスと合成プラットホーム間のシール及び接合具と容器間のシールを含む。シールは気密接続体を形成するクロージャー（ｃｏｎｎｅｃｔｏｒｓ）を意味することが意図される。シールは例えば、ガラス、プラスチック又は金属との気密な接続体を形成することができる任意の物質から作製することができる。更に、シールは溶媒低構成物質から作製することができる。封止物質には例えば、ゴム、ＴＹＧＯＮ又はシリコーンが含まれる。１態様において、本発明の装置中の接続体は湿気の侵入を排除するために封止されている。もう１つの態様において、接続体はシリコーンのコーキングで封止されている。更なる態様において、接続体は二重封止されている。
【００６７】
装置中で使用されるシールは気密接続体を維持するのに十分に強力でなければならない。シールの強度は例えば、真空又は特定強度の圧力を維持するその能力により測定することができる。本発明の装置の封止された接続体は１００ｐｓｉを超える、７５ｐｓｉを超える、５０ｐｓｉを超える又は２５ｐｓｉを超える圧力を維持することができる。１態様において、本発明の装置の封止された接続体は２５ｐｓｉを超える圧力を維持することができる。
【００６８】
乾燥ボックスの継ぎ目は内側及び外側に二重封止され、そしてアクセスドア上のガスケットはシリコーンシーラーで補強されている。更に、ケーブルの結合具（ｃｏｕｐｌｉｎｇｓ）は封止され、注入ラインに供給するために使用される開放チューブ結合具はシリコーンゴムの封止物を使用して封止される。
【００６９】
本発明の装置は乾燥ボックス内に湿度計を含む。湿度計は例えば、デジタル湿度計であることができる。湿度計は内部の乾燥ボックス湿度を現在時で系により連続的にモニターさせることができる。次にこのデータを手動又は自動的にコンピューター中に供給して、合成を開始する前の前以て決められた期間待機するように妨げられる時に、いつ合成を開始するべきか決定するために使用することができる。例えば、乾燥ボックス内の湿度が１％以下の湿度である時には合成を開始するようにプログラムすることができる。更に系は、湿度が特定量を超える場合にオペレーターに警告し、必要なら合成反応を中断させることができる。
【００７０】
合成乾燥ボックスの湿度含量が高すぎると、反応が開始できない又は進行することができないので、合成反応の効率は湿度計の追加により改善することができる。更に、設定された期間の代わりに、湿度レベルに基づいて合成反応を開始することは、許容レベルへの湿度の低下に要する時間が設定時間より短い場合には、合成反応を速めることができる。例えば、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｏｄｅｌ ＴＰ１２０ ＳＮ ０２２２１３４７のような湿度計をＤｉｃｋｉｎｓｏｎから購入可能である。
【００７１】
図１に示されるように、本発明の装置は試薬容器（１〜１１）、乾燥ボックス（１２）及び化学薬品注入ライン装置（１３、１１８、１１９）を含む。装置の様々な構成部品を接続するチューブは図５〜８に示される。チューブは例えば、湿気及び溶媒抵抗性チューブであることができる。プラスチック及びＴＹＧＯＮ、テフロン及びポリプロピレンチューブのような幾つかのタイプの防湿性及び溶媒抵抗性チューブが当該技術分野で知られており、市販されている。例えば、該装置に使用されるチューブはテフロンチューブであることができる。
【００７２】
チューブは様々な方法で試薬容器に接続することができる。例えば、チューブは試薬容器のような、装置の他の構成部品に取り外し可能に接続することができる。これはチューブの早急で便利な調整又は取り替え及び容器の変更を許す。１態様において、取り外し可能な接続体は容器の入り口又は出口のような開口部の外側表面上にチューブを延伸することにより達成することができる。入り口又は出口の外側表面上に延伸されたチューブは弾性のリング又は金属の留め具のような留め具により定位置に保持することができる。更に、例えば、チューブは、片方の端の入り口又は出口のような開口部の外側表面及び他方の端の入り口又は出口の外側表面の周囲を包む外側の覆い（ｓｈｅａｔｈ）により定位置に保持されて気密クロージャーを形成することができる。便利な外側の覆いは例えば、ＴＹＧＯＮチューブを含むチューブの短い部分であることができる。更に例えば、チューブを様々な容器に接続するためにＳｗａｇｌｏｋ Ｐａｒｋｅｒ圧力パイプ接合金具（ｆｉｔｔｉｎｇｓ）、ポリプロピレン及びステンレス鋼接合金具を使用することができる。
【００７３】
図６に示されるように、本発明の装置は試薬ガスフィード又は、試薬容器を、試薬容器を加圧するガス（５８）に接続するライン（例えば、６０、６３、６５、６７、６８）を含む。１態様において、試薬ガスフィードは湿気及び溶媒抵抗性チューブから作製される。ガスフィードは加圧ガスを運搬するので、適当な強度及び組成のチューブ及びシールが使用される。例えば、ガスフィードは片方の端でＳｗａｇｌｏｋ圧力パイプ接合金具を使用してガスシリンダーに、そして他方の端でＳｗａｇｌｏｋ圧力パイプ接合金具を使用して１又は複数の試薬容器に接続されるテフロンチューブであることができる。試薬ガスフィードはヌクレオチド溶液のような試薬をガスシリンダー、例えば、ヘリウムガスシリンダーに接続することができる。ヘリウムは、送達ライン中の気泡を防止することができる、試薬ボトルを加圧するために使用することができる。更に、試薬ガスフィード（例えば、７３、７６、７８）は洗浄溶液、例えば、アセトニトリルのような試薬をガスシリンダー（７１）に接続することができる（図７参照）。
【００７４】
幾つかのタイプのガスを本発明の装置に使用することができる。本発明の装置に使用されるガスは安定であるか又はそれら自体に対してほとんど反応性を含まない不活性ガスであることができる。例えば、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノン及びラドンのような希ガスは装置内に使用することができる不活性ガスである。更に、窒素のようなガスは不活性ガスとして本発明の装置内に使用することができる。１態様において本発明の装置に使用されるガスは窒素、アルゴン又はヘリウムである。もう１つの態様において、ヘリウムは試薬容器を加圧するために使用され、そして窒素は乾燥ボックス内に使用されている。窒素ガスは例えば、液体窒素（Ｎ２）の沸騰ジュワーから誘導することができる。窒素を使用することに対する利点はそれが安価なガスであることである。
【００７５】
図１で示されるように、本発明の装置は、ガス調整装置が試薬容器内に定圧を維持するデジタルガス調整装置（２２、２３参照）を含む。１態様において、ガス調整装置はデジタルガス調整装置である。ガス調整装置はリアルタイムで正確にガス圧のレベルをモニターすることができ、ガス圧を一定に維持するためにガスのレベルを調整することができる。一定レベルのガス圧は、所望の値の近位で僅かに変動することができる圧力レベルである。例えば、試薬の容量が低下するに従って、試薬容器内の圧力は変動する。この変化はガス調整装置により早急に検出され、信号が送られ、それが所望のレベルへのガス圧の復帰調整をもたらす。ガス調整装置はガス圧の僅かな変化に早急に反応することができるので、ガス圧の僅かな変化は短時間、経験され得るが、ガス圧のレベルは本質的に一定である。何かの理由で、系内の圧力が特定量より下に低下すると、系はオペレーターに警告し、必要な場合は合成反応を中断させることができる。
【００７６】
１態様において、本発明の装置は試薬容器（１〜１１）をガス供給材料（ｓｕｐｐｌｙ）（例えば、５８、７１）に接続するチューブに接続されたフロースルーガス乾燥機（例えば、１４、１５）を含む。例えば、本発明の装置は試薬ガスフィード（例えば、６０、６３、６５、６７、６８、７３、７６、７８）に接続されたフロースルーガス乾燥機（１４、１５）を含むことができる。更なる態様において、本発明の装置はガスシリンダー（３８）を乾燥ボックス（１２）に接続するチューブ（例えば、４０、４１）に接続された少なくとも１基のフロースルーガス乾燥機（１６）を含む（図５参照）。図５に示されるように、乾燥ボックス（１２）の出口にチューブをとおって接続されたフロースルーガス乾燥機（１７）を大気に換気することができる。また更なる態様において、本発明の装置は乾燥ボックスガスの出口に接続されたフロースルーガス乾燥機、ヌクレオチド溶液の容器を加圧するために使用される試薬ガスフィードに接続されたフロースルーガス乾燥機、及びアセトニトリル洗浄溶液の容器（ジュワーとしても知られる）を加圧するために使用される試薬ガスフィードに接続されるフロースルーガス乾燥機を含む。
【００７７】
乾燥ボックスのガスの入り口及び出口に接続されたフロースルーガス乾燥機は、液体窒素ジュワーから乾燥ボックス中に導入されているガスが前以て乾燥されること及び乾燥ボックス廃棄物から逆流により、ほとんどから全く湿気が導入されないことを確実にすることを補助するために使用することができる。試薬ガスフィードに接続されたフロースルーガス乾燥機は、湿気が確実に試薬又は洗浄化学薬品中に導入されないように補助する。
【００７８】
フロースルーガス乾燥機は乾燥物質を含むことができる。更に、乾燥性物質は湿気含量を減少するために、乾燥ボックス内又は他の任意の場所に配置することができる。乾燥剤は湿気吸収物質である。多数の乾燥剤が当該技術分野で知られており、市販の、例えば粘土基材物質及びゼオライトである。市販の乾燥剤には、例えば、Ｄｒｉｅｒｉｔｅ及びＳｉｌｉｐｏｒｉｔｅ ＮＫ１０Ｆが含まれる。１態様において、本発明の装置に使用される乾燥物質は五酸化リン及び水酸化ナトリウムである。もう１つの態様において、本発明の装置に使用される乾燥物質はＤＲＩＥＲＩＴＥ及び５Ａの分子ふるいである。
【００７９】
フロースルーガス乾燥機は、ガスラインから湿気、不純物及び粒状物を除去するための表示するＤＲＩＥＲＩＴＥ及び５Ａ分子ふるいを充填された、例えば、ＤＲＩＥＲＩＴＥ Ｇａｓ Ｐｕｒｉｆｉｅｒである。このようなガス精製装置は圧縮タイプのチューブの留め具を使用して取り付けることができる。青からピンクへのＤＲＩＥＲＩＴＥの色彩変化が乾燥能の枯渇を示す。ＤＲＩＥＲＩＴＥは既知の方法により取り替える又は再生することができる。５Ａ分子ふるいは５オングストローム未満の有効分子直径をもつ不純物を除去する。ＤＲＩＥＲＩＴＥ Ｇａｓ Ｐｕｒｉｆｉｅｒは市販されている。それは成形ポリカーボネートから作製されたカラム及びｏ−リングガスケットを付けたポリカーボネートキャップを有する。ＤＲＩＥＲＩＴＥ及び分子ふるいはフェルトのフィルター間の定位置に固定されている。床支持体及びコイルのばねはステンレス鋼であり、出口フリットは４０ミクロンである。カラムのディメンションは２ ５／８インチ（６．６７ｃｍ）×１１ ３／８インチ（２８．９ｃｍ）である。接続体は１／８インチ（０．３２ｃｍ）のステンレス鋼の雄型チューブ留め具である。推奨最大作業圧力は１００ｐｓｉｇであり、水タンク容量は２５グラムである。推奨流量は最大効率に対して３００リッター／時間までである。
【００８０】
本発明の装置は合成プレート真空チャックと廃棄物容器間に少なくとも１個のインラインソレノイド弁（２４、２５）を含むことができる。これらの通常は閉鎖されたソレノイドは主真空系により活性化され、プレートが空にされた後に、合成フィルタープレートから廃棄物容器を隔離するために働くことができる（図８を参照されたい）。これは廃棄物容器を均等化から防止し、容器を連続的陰圧（真空）下に維持させることができる。もたらされる効果は、系が最初に廃棄物容器をポンプで真空にする必要なしに、合成プレートを即座に真空にすることができることである。もう１つの態様において、本発明の装置は、均等化を防止するために経路変更しそして、迂回される三方真空入り口ソレノイド弁（２６、２７）をもつことができる。Ｗｅｌｃｈの自動洗浄テフロンｄｒｇ Ｖａｃｕｕｍ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｏｄｅｌ ２０２５のような高強度真空系を本発明の装置に使用することができる。
【００８１】
合成プレートを固定するために使用されるチャックは標準の合成装置におけるより深い回収ボールをもつように修飾することができる。例えば、チャックは８ｍｍ、より深い回収ボールをもつように修飾することができる。この修飾物は、試薬が反応段階中にフィルタープレートをとおって漏洩する場合に、試薬がボールを充填しないで、フィルター合成プレート中の異なる合成ミクロウェルを交差汚染させないので、有用である。
【００８２】
本発明の装置は、生成されるポリヌクレオチド生成物の品質を高めるために、ポリヌクレオチド合成装置と連動して使用することができる。従って、本発明はまた、ａ）複数の防湿性試薬容器、ｂ）自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、ｃ）乾燥ボックスに試薬容器を接続する防湿性チューブ、ｄ）そこでガスが試薬容器を加圧する、試薬容器をガスに接続する試薬ガスフィード、ｅ）そこでガス調整装置が試薬容器内の定圧を維持する、試薬ガスフィードに接続されたデジタルガス調整装置及びｆ）ポリヌクレオチド合成装置、を含む、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための装置を提供する。
【００８３】
以前に説明されたように、前記の装置中の接続体は例えばシリコーンコーキングを使用して湿気の侵入を排除するように封止することができる。更に封止された接続体は１００ｐｓｉ強度を超える圧力を維持することができる。更に前記のように、試薬容器はヌクレオチド溶液の容器又は廃棄物溶液の容器であることができ、そして１態様において、試薬容器は洗浄溶液の容器であり、そして１又は複数のヌクレオチド溶液の容器である。装置は更に、乾燥ボックスに乾燥試薬を配達する試薬容器を加圧するチューブに接続され又は試薬ガスフィードに接続された少なくとも１基のフロースルーガス乾燥機を含むことができる。更に、装置は湿度計を含むことができる。
【００８４】
当該技術分野で知られた幾つかのポリヌクレオチド合成装置は注文製造及び市販品双方が本発明の装置中に取り込まれることができる。１態様において、本発明の装置は本発明の装置に取り付ける又はその部品であることができる、Ｒａｙｎｅｒ等、（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅｚｒｃｈ ８：７４１−７４７（１９９８）に記載されたようなヌクレオチド合成装置を含む。
【００８５】
ポリヌクレオチド合成装置は標準のホスホロアミダイト化学反応を使用して１回の実施でポリヌクレオチドの２枚の標準の９６−ウェルのプレートを合成することができる。機械は１枚のプレート中で標準の、変質した（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）又は修飾されたポリヌクレオチドの組み合わせ物を生成することができる。実施時間は２０−量体の２枚のプレート及び４０ｎＭの反応規模に対し約１７時間以下であることができる。反応容器は各ウェルの底部に穴を開けた、標準のポリプロピレンの９６−ウェルのプレートであることができる。本発明の装置に使用することができる他のサイズの反応容器には例えば、当該技術分野で周知のマルチウェルフォーマットをもつプレートが含まれる。例えば、ｘｙテーブルはプレート１枚当り例えば、９６，１９２，３８４，１１５２又は１５３６ウェルをもつマルチウェルプレートを収納するように拡大又は縮小することができる。更に、単一の又は複数のマルチウェルプレートを本発明の装置に使用することができる。有用な数のマルチウェルプレートは例えば、１、２、３、４、５又は６又はそれより多いマルチウェルプレートであることができる。本明細書に提供される教示及び指導を与えられると、当業者は、１〜多数のマルチウェルプレートを収納するために、ｘｙテーブル、ソフトウエア制御系又は注入系をどのように調整するかを知るであろう。
【００８６】
９６−ウェル反応容器を例示する前記の特定の例において、２枚のプレートを別の真空チャック中に入れ、ｘｙテーブル上に固定する。各ウェルを順次、適当な試薬注入ライン下に配置して、専用弁を切り替えることにより試薬を注入する。例えば、本発明の装置は合成実施のために例えば、９６−ピン注入系を使用することができる。９６−ピン注入系は、各合成段階において注入されるすべての「満杯のプレート」の試薬を
単一の注入系を連続的にとおさずに、１２注入装置のバンクを介して送達させる。試薬のこのような平行した分配は連続的分配に比較して、系に、より短時間で合成段階を実施させる。更に、注入ヘッド上の利用可能な洗浄ラインを増加することができる。例えば、洗浄ラインの数を例えば、１２から２４に増加することは複数の機能に対するラインの使用を減少するので、それにより合成時間を減少する。更に注入装置は宝石を備えた先端をもつミクロ注入装置であることができ、更に注入物の流れの精度を高め、送達容量を低下させる。機械操作は、始動及び停止方法について使用者を指導するコンピューターにより制御され、走行の状態に対する連続的アップデートを提供し、そして定期的に実行することができる多数のサービス手順を容易にさせる。
【００８７】
Ｒａｙｎｅｒ等（上記）により記載されたポリヌクレオチド合成装置の外に、多数のポリヌクレオチドの早急な合成に利用可能な他の高処理量ポリヌクレオチド合成装置が存在する。例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂのＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒにより設計され、構築されたポリヌクレオチド合成装置は多チャンネルフォーマットを使用する（Ｓｉｎｄｅｌａｒ ａｎｄ Ｊａｋｌｅｖｉｃ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：９８２−９８７（１９９５））。この系もまたホスホロアミダイト化学反応を使用するが、各実施に対し、１２個のポリヌクレオチドに限定される。Ｓｔａｎｆｏｒｄ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＧｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒで設計され、構築されたポリヌクレオチド合成装置のＡＭＯＳは同様な化学反応を使用し、ＭｅｒＭａｄｅ合成装置（Ｌａｓｈｋａｒｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７９１２−７９１５（１９９５））と同様な反応規模で９６−ウェルのフォーマット中に直接合成する。
【００８８】
ポリヌクレオチド合成装置は約３×３フィート（９１×９１ｃｍ）の面積及び６ｆｔ（１８２．９ｃｍ）の高さのスタンドをもつことができる。合成試薬は標準の加圧溶媒びん中に、機械の上部に貯蔵することができ、機械の中心部分に配置された合成室にテフロンラインにより運搬される。機械を制御している電子機器及びコンピューターは都合に応じて、主要枠組みの内側又は外側のいずれかに配置することができる別のカート中に配置することができる。２個のアルゴンタンク（びんの圧力及び不活性合成環境を提供するための）を枠組みの側部に固定することができる。機械はＬａｂＶｉｅｗ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）中に書かれた制御プログラムを走行するＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｑｕａｄｒａ ９５０により操作することができる。プログラムはオペレーターに始動及び停止法を指導し、使用者に連続的にアップデートした系状態を提供しながら、合成工程を制御する。更に、合成のソフトウエアは本明細書に記載されたあらゆる様々な態様を収容するか又は、試料合成の機能又は速度を促進するように修飾又は開発することができる。例えば、合成試料の平行した又は同時の処理を本発明の装置に使用することができる。同時の処理はそれが各プレートに必要な合成時間の量を短縮するために、有益である。
【００８９】
合成室は３成分：内側の室、外側の室及びｘｙテーブルからなることができる。２枚の９６−ウェルプレートは２個の別の真空チャック内に配置され、それは次に内側の室内に配置され、内側の室は封止され、そしてｘｙテーブル上に固定される。これを順次、ｘｙテーブルの完全な運動を収容するのに十分なサイズの、より大きな外側の室内に含む。注入ヘッドを外側の室の上部に固定し、コンピューターの制御下にあるｘｙテーブルが化学薬品注入ヘッドの下方にあちこちプレートを移動させる。化学薬品は水蒸気及び空気の存在に対して特に感受性である（Ｇａｉｔ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９８４）。２室の組み合わせ物は反応物からこれらの不純物を排除するようになっている。更に、脱ブロック及び酸化ラインからの蒸気によるホスホロアミダイト及びテトラゾールラインのあらゆる汚染を最少にするために、アルゴンの一定流のために、アルゴンを内側の室及び、内側の室の壁の上部と、外側の室の屋根との間の小さな空隙中に連続的にポンプで送る。反応物からの水蒸気及び空気を減少させるために２室の組み合わせ物を使用するオリゴヌクレオチド合成装置と異なり、本請求の装置は１個の連続的な無水の乾燥ボックスの反応室を含む。
【００９０】
２枚の合成プレートは各段階後に試薬の化学薬品の排水を許すために２個の真空チャック内に個々に固定することができる。真空チャックはプレートの周囲に一緒にボルトで留められる２個の部品からなる。チャックの下半分はプレートとチャックの間にシールを提供するためのガスケット及び真空に接続される排水ラインを含む。プレートは外側の室の上部の封止可能なアクセスドアをとおって充填する前に真空チャック中に固定することができる。
【００９１】
試薬を例えば、化学薬品注入ヘッドを経てウェル中に導入することができる。化学薬品注入ヘッドはアクセスドア（これはまた、各走行の前のヘッドの洗浄を容易にする）の中心に配置することができる。化学薬品注入ヘッドは室内で試薬を担持するための１５個のリードスルー（ｌｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈｓ）からなる。６個の注入ヘッドは対である。これらの対の４個はこの段階のテーブルの移動を最少にするためにホスホロアミダイト及びアクチベーターの同時注入のためである。第５のものはキャッピング段階のための２種の化学薬品の注入のためのものである。最後の注入対は修飾又は縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）塩基のいずれかに対するものである。試薬はびんからｄｃソレノイド弁に、そして弁から１／１６−インチ（０．１６ｍｍ）の直径のテフロンチューブによりリードスルーに送達することができる。チューブがそれをとおってリードスルーに侵入するシールを形成するためにシリコーン封止剤を使用することができる。弁はソフトウエアによりスイッチ切り替えされるソリッドステートの継電器により個々に制御することができる。これらの弁により得ることができる最少の注入容量は＜２０μｌである。しかし、ウェル中の試薬の適当な混合を確実にするために、注入容量は少なくとも６０μｌでなければならない。
【００９２】
合成装置の電子機器は３種の主要な構成装置：モーター増幅ボックス、継電バー及び電力供給ボックス、をもつことができる。ｘｙテーブルのモーターはソフトウエアからモーター増幅ボックスに制御信号を送信する、ＮｕＬｏｇｉｃ０Ｌコントローラーカード（ＮｕＬｏｇｉｃ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）により制御することができる。モーター増幅ボックスは順次、モーターに必要な電圧を送り、モーションリミット及びホーム信号を、カードをとおって制御ソフトウエアに戻す。弁はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｕｍｅｎｔｓ ＮＢ−ＤＩＯ−９６カードにより制御することができる。信号はカードから３バンクの継電器カードに送られる（各カードは８継電器を含む）。２カードは試薬注入のためのＤＣ弁を制御し、第３のカードはアルゴン及び真空系に使用されるＡＣ弁を制御する。モーター及び弁のためのＡＣ及びＤＣ電圧源は電圧供給ボックスにより提供される。
【００９３】
合成装置はＬａｂＶｉｅｗ３．１．１．（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を走行するＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｑｕａｄｒａ ９５０コンピューターにより制御することができる。ソフトウエアは機械の操作を制御する。起動手順は必要な段階をとおってオペレーターをプロンプトする一連のダイアログボックスに従うことにより実行される。機械が一旦走行設定され、合成手順が開始された後には、更なる使用者の介入は必要でない。ソフトウエアがテーブルの動き及び弁操作を処理し、合成工程の状態の連続的アップデートを提供し、そして合成が完了したら、必要な停止段階を実施する。更に、使用者に、様々なサービス及び保守手順（注入容量の目盛合わせ及びプレートの補正及びウェルの位置の再設定のような）を実施されるための一連のオプションが存在する。
【００９４】
本発明の装置の一部としての合成装置上のソレノイド弁は以下の方法を使用して目盛補正することができる。
【００９５】
コンピューターソフトウエアにおいて、”Ｃａｌｉｂｒａｔｅ Ｖａｌｖｅｓ（弁を目盛補正）”を選択し、次に”Ｌｏａｄ Ｒｕｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ（ラン・プロファイルをロード）”を選択する。主室のドアは垂直でなければならない。左側上で出発し、補正したいライン上でクリックする。設定は（１）これは現在の注入時間である、そして（２）これは現在の注入容量／塩基である、とでるであろう。それぞれ、（３）ここに新規の注入時間を入力せよ、そして（４）ここで新規の注入容量を入力せよ、中に設定をタイプする。（５）何回の注入実施を望むか、に対しては次の設定を使用することができる、例えば：１２０ｍＬに対して５、１００ｍＬに対して６、６００ｍＬに２、等。ラインをクリアするためには”Ｉｎｊｅｃｔ（注入）”を選択する。ラインがクリーンで直線になると、選択されたラインの下方に透明なエッピンドルフチューブを配置して、”Ｉｎｊｅｃｔ（注入）”を再度クリックする。与えらえた注入時間に実際に送達される量を決定するために、次の式：
（エッピンドルフチューブ中の容量）／（注入の＃）
を使用する。
【００９６】
容量が次のよう：例えば、ｄｔ、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄ５、ａｃｔＴ、ａｃｔＡ、ａｃｔＧ、ａｃｔＣ、ａｃｔ５、ｃａｐＢ、ｄｅｂｌｏｃｋ（脱ブロック）：１００ｍＬ；Ｗａｓｈ（洗浄）：６５０ｍＬ；Ｏｘｉｄａｉｚｅｒ（酸化剤）：８０ｍＬ；ｃａｐ（キャッピング） Ａ：１２０ｍＬであるように必要に応じて注入時間を変更する。維持することが望ましい変更を実施後に、「Ｓａｖｅ Ｒｅｐｌａｃｅ（置き換えを保存）」を選択する。最後に脱ブロックを実施する。「Ｅｘｉｔ（終了）」、そして次に「Ｅｄｉｔ Ｒｕｎ Ｐｒｏｆｉｅ（実行プロファイルを編集）」を選択する。以下の待機時間、例えば、Ｄｅｂｌｏｃｋ Ｓｔｅｐ（脱ブロック段階）：５０秒；Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｓｔｅｐｓ（カップリング段階）−Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ及び５：２７０秒；Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｔｅｐｓ（キャッピング段階）：１００秒；Ｏｘｉｄｉｚｅ Ｓｔｅｐｓ（酸化段階）：７０秒をを使用することができる。以下のパージ時間、例えば、Ｐｕｒｇｅ（パージ）１：１８００秒；Ｄｒａｉｎ（排水）：２秒；Ｐｕｒｇｅ（パージ）２：１８００秒；（１及び２は各室のパージを意味する）を使用することができる。以下の真空時間（ｖａｃｕｕｍ ｔｉｍｅ）、例えば、Ｄｒａｉｎ（排水）１：１５秒；Ｅｑｕａｌｉｚａｔｉｏｎ（均等化）１：２秒；Ｄａｒｉｎ（排水）２：１５秒；均等化（Ｅｑｕａｌｉｚｅ）２：２秒（１及び２はプレートを表わす）を使用することができる。
【００９７】
合成の実行に必要なパラメーターはコントロールソフトウエアによりアクセスされる１群の簡単なテキストファイル中に保存することができる。これらのファイルは各ポリヌクレオチドの配列並びに注入容量、合成サイクル中の各段階の待機時間、各段階後の洗浄サイクル数についての情報、並びにプレート及びウェルの補正及びｘｙテーブルのモーター速度／加速度を含む。これらはプレートに対する異なる濃度及び収率を許すために各プレートにつき編集することができる。
【００９８】
合成工程は３’から５’末端に向かって実施される。反応は既に結合された第１の塩基を伴って、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ ｓｕｐｐｏｒｔ（制御された多孔質ガラス支持体）（ＣＰＧ）（Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ又はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用することにより開始される。次に、次の塩基をこの支持体に結合させる。反応プレートには２種のオプションが利用可能である。安価な方法は各ウェルの底部に１／６４−インチ（０．４ｍｍ）の穴を空ける、標準の９６−ウェルのプレート（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂ Ｎｅｔ，Ｗｏｏｄｂｒｉｄｇｅ，ＮＪ）を修飾することである。ＣＰＧのための支持体は円形のガラス繊維フリットを（Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ，Ｐｅｑｕａｎｎｏｑ，ＮＪ）〜３ｍｍの直径に切断し、それを各ウェルの底部に置くことにより提供される。あるいはまた、フリットですでにウェル中に充填されたフィルタープレート（Ｏｒｏｃｈｅｍ ＤＮＡ合成フィルタープレート）を使用することである。この装置は僅かにより高価であるが、その価格はプレートの準備における時間の節約により相殺される。両装置において、支持体と穴サイズの組み合わせ物は真空がプレートの下側に適用されるまで、試薬がウェル中に確実に留まるのに十分である。
【００９９】
反応パラメーターは、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び質量分析法の組み合わせを使用してポリヌクレオチドの品質を評価することにより満足な操作条件に合わせることができる。ＣＥ及びＨＰＬＣ曲線はＮの純度％についての情報を提供するが、他方、ＨＰＬＣ曲線は合成工程完了後に、残された残留化学薬品の量を定量するために使用することができる。配列データを読み取った後に、窒素で反応室を充填し、空気を追い出すための第１の３０分間のパージ段階が存在する。次にコンピューターは、各ウェルを合成工程中の現段階に適した化学薬品注入ラインと順次整列させるためにｘｙテーブルを移動させて、対応する１又は複数の弁を操作する。その段階に対する注入が終結すると、反応を完了させるための５０〜２７０秒間の待機時間がある。チャックに対する真空の適用によりプレートから試薬を除去する。各段階後、ウェルをアセトニトリル〜６００ｍｌで１又は２回（合成段階に応じて）洗浄して、合成の次の段階の前に、確実に未使用試薬が除去されるようにする。
【０１００】
フィルタープレートを充填するためのプロトコールは以下である：
各タイプのＣＰＧに対して、フィルターから２０ｍｌのＡｅｒｏｓｏｌ ＰＥ ｂａｒｒｉｅｒ Ｔｉｐの１〜３ｍｍを切断する。ＣＰＧをＯｒｏｃｈｅｍ合成フィルタープレートの各ウェルに移動するために、移動ピペット（各塩基に対して１本）及び電気ピペットエードを連動して使用する。標準ＣＰＧに対しては、使用されている各ウェルにＣＰＧを０．００３ｇ（４０ｎモル規模、乾燥充填法）を添加することによりフィルタープレートを準備する。ポリヌクレオチドの３’末端で塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）に対応するＣＰＧ−塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）を確実に使用する。真空チャック中にＯｒｏｃｈｅｍ合成フィルタープレートを置き、ドリル及び六角ビットを使用してボルトで固定する。廃棄物チューブが上部にあり、ウェルＡ１は左下の角にあるように真空チャックを配置する。ドリル上の把握は最小のトルク設定でなければならない。ボルトを直角に締める。シリンジを使用して、各ウェルの側部のＣＰＧをアセトニトリルで洗い落とす。汚染を回避するために針でＣＰＧに接触しないように注意する。プレートをフォイルのシールで覆う。ＣＰＧを含むウェルのフォイル上にマークする。
【０１０１】
コンピューター上の実行を設定するためのプロトコールは以下である。
【０１０２】
最初に、Ｗｅｌｃｈのテフロンの乾燥真空ポンプのスイッチを入れる。ソフトウエアプログラムを使用して、「Ｈｏｍｅ Ｔｅｂｌｅ（ホームテーブル）」、次に「Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｈｅａｄ Ｔｅｓｔ（注入ヘッドテスト）」を選択する。２ｌゲージの針及びシリンジに無水アセトニトリルを充填する。注入ラインの末端をクリーンにし、末端を均等（ｅｖｅｎ）にする。「Ｉｎｊｅｃｔ ａｌｌ Ｌｅｆｔ（左側すべてを注入）」、「Ｉｎｊｅｃｔ Ｗａｓｈ（洗浄物を注入）」及び「Ｉｎｊｅｃｔ ａｌｌ Ｒｉｇｈｔ（右側すべてを注入）」を選択することにより、主要なデブリー及び気泡のラインをクリアにする。以前に説明されたように弁を目盛補正する。乾燥ボックスに、ポリプロピレン（ｐｐ）トレーに新鮮な五酸化リン（Ｐ２Ｏ５）を添加する。ソフトウエアのＡｌｉｇｎ Ｐａｇｅ（整列ページ）上で、ｄ６位に行く。古いＰ２Ｏ５及び水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を除去する。
【０１０３】
以下の設定及び実行コンポーネントを設定することができる。「Ｃｙｃｌｅｓ（サイクル）」上で、以下のパラメーター、例えば、ＷＡＳＨ：Ｐｒｅｗａｓｈ（前洗浄）、Ｄｅｂｌｏｃｋ（脱ブロック）、Ｃｏｕｐｌｉｎｇ（カップリング）、Ｃａｐｐｉｎｇ（キャッピング）＝１，Ｉｎｔｅｒｉｍ Ｄｅｂｌｏｃｋ（中間脱ブロック）＝０；Ｏｘｉｄｉｚｅ（酸化），Ｆｉｎａｌ（最終）＝２、ｂ）＃Ｄｅｂｌｏｃｋ Ｓｔｅｐｓ（＃脱ブロック段階）＝２、ｃ）＃Ｆｉｎａｌ Ｄｅｂｌｏｃｋ Ｓｔｅｐｓ（＃最終脱ブロック段階）＝２、ｄ）＃２ｎｄ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｔｅｐｓ（＃第２回最終キャッピング段階）＝１、を設定することができる。実行で使用されるであろうプレートを選択する。ＣＰＧのタイプが適切に設定されていることを確認する、例えば、標準のＣＰＧを使用している時は、「標準」（標準のＣＰＧは第１塩基を含む）を選択する。Ｅｘｔｒａ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｏｐｔｉｏｎｓ（追加のカップリングオプション）に対してはｄＡ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ及びｄ５に対するカップリングサイクル数が２である。ｄＡ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ及びｄ５に対するアクチベーターと塩基注入間の遅れは１０ミリ秒であることができる。ｄ６〜ｄ１０を使用しない限り、これらは０に設定しなければならない。カップリングの待機時間は２７０秒に設定することができる。５’ホスホリル化されているポリヌクレオチドに対しては、これらのウェルに対しＤＭＴ ＯＮを選択する。これを必要としないプライマー又はポリヌクレオチドに対しては、ＤＭＴ ＯＦＦを選択する。窒素が流れていること及び、実行を完了するのに十分存在することを確認する。
【０１０４】
Ａｌｉｃａｔ弁は例えば、アセトニトリルジュワーが２．５０ｐｓｉに加圧され、そして試薬びんが４．０ｐｓｉに加圧されるように設定することができる。あらゆる結晶を洗い落とすために、必要な場合はシリンジを使用してアセトニトリルで注入ヘッドをすすぎ、乾燥する。アセトニトリルジュワーから誘導しているライン中に気泡がないことを確実にするために、各注入ライン上で個々にクリックすることによりラインをパージする。視覚観察により、弁、試薬びん，真空びん及びラインにおける漏洩を確認する。プライムする時は（ｐｒｉｍｉｎｇ）一度に１本のラインをプライムする（廃棄物排水ラインを含む）。各注入ラインにパルス数を入力する。３０ミリ秒間に、アクチベーターラインに対して２、そしてアミダイト及びホスホリル化試薬に対して１のデフォルト設定を使用することができる。機械上の所定位置にＯｒｏｃｈｅｍ合成フィルタープレートを含む真空チャックを配置し、良好なシールを得るために手動で締める。ＣＰＧ含有ウェルからフォイルを外し、洗浄を実施する。残留ＣＰＧを洗い落とすために２〜３回反復する。合成装置を走行する前に、相対湿度（ＲＨ）が１．０％ＲＨ以下になるまで待機する。走行が完了すると、プログラムを終了して、最起動する。「Ｓｅｔ Ｕｐ Ｒｕｎ（実行設定）」に戻る。混合し、５’ホスホリル化するアミダイト試薬を添加する。５’ホスホリル化されないポリヌクレオチドが存在する場合は、それらは最初の実行時にＤＭＴをオフにしていたにちがいないことに注意されたい。５’ライン、キャップライン、脱ブロックライン、関連アクチベーターライン、酸化剤ライン及びアセトニトリルラインをプライムする。Ｒｕｎ（実行）ボタンをクリックする。
【０１０５】
ヌクレオチドの開裂及び脱保護のプロトコールは以下である：
合成が完了後、合成装置から真空チャックを取り出し、チャックからポリヌクレオチド含有フィルタープレートを取り出す。合成完了後に真空チャック中に残された有機廃棄物があるかも知れないので、フィルタープレートを外す前に廃棄物を空ける。廃棄物を除くためにペーパータオル上にＯｒｏｃｈｅｍの合成フィルタープレートの先端をブロットする。進行する前にそれが完全に乾燥していることを確認する。Ｏｒｏｃｈｅｍの合成フィルタープレートを深いウェル、例えば、２ｍｌの、深いウェルの丸底Ｎｕｎｃ回収プレート中に入れる。深いウェルの回収プレートに日付、ポリヌクレオチドのバッチＩＤ、合成装置及びウェル番号を標識する。各ウェルにアンモニアメチルアミン（ＡＭＡ）（水酸化アンモニウム：メチルアミン（１：１），４℃で保存、１週間有効）２００ｍｌを添加し、室温で５分間インキュベートする。水酸化アンモニウムＡＣＳ試薬を例えば、Ｓｉｇｍａ（Ａ−６８９９）から得ることができ、水中メチルアミン４０重量％溶液を例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ（４２，６４６−６）から得ることができる。フィルタープレート中のミクロウェル中のＣＰＧが乾燥するように窒素を通気する。圧力をかけながらゆする運動は液体をフィルターに強制的にとおすことを容易にすることができる。反復する。２．０ｍｌの深さのウェルの回収プレートにＡＭＡ１００ｍｌを直接添加する。ＣＰＧ含有Ｏｒｏｃｈｅｍ合成フィルタープレートを廃棄する。回収プレートを例えば、注文のアルミニウム加熱ブロックのチャック中に、清浄な９６ウェルＮｕｎｃシリコーン封止剤で固く封止する。プレートの上部にもう１個のスペーサー（へこみをもたない）を配列し、チャック中に入れる。ねじを締める。オーブンを６５℃に前以て加熱する。６５℃で４５分間インキュベートする。４５分後、インキュベーターからアルミニウム加熱ブロックのチャックを取り出し、即座に−８０℃の冷凍庫中に約１時間入れる。
【０１０６】
ポリヌクレオチドの凍結乾燥及び再懸濁のプロトコールは以下である：
バランスプレートをもつＳｐｅｅｄ Ｖａｃ中に回収プレートを入れる。他のすべてのスチッチを入れる前に、両方の蒸気トラップを約２４時間冷却させる。高度真空のオイルポンプ［１０−４Ｔｏｒｒ］の油ボックスを、パージしている液体窒素ジュワーからの液体窒素ガス沸騰をスチッチオンにする（（少なくとも１０ｐｓｉ及び最小の設定）。Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ（急速真空化）のスチッチを入れる。底部の弁はオンの位置にあって、真空を引いていなければならない。Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃが最高速度にある時は、抽気（ｂｌｅｅｄ）の矢印が左側にあるように、弁を時計回りに回転することにより上部の弁をゆっくり開く。プレートが乾燥すると、空気を入れるために上部の弁をゆっくり抽気する。次にＳｐｅｅｄ Ｖａｃ及び底部の弁のスイッチを切る。ポリヌクレオチドはふわふわした白色−淡黄色のプラグ様に見える。多チャンネルピペットを使用し、１５０ｍｌの滅菌、濾過（０．２ミクロン）そしてオートクレーブ処理した１８メガオームの滅菌ＭｉｌｌｉＱ水を各ウェルに添加し、プレートをフォイルで封止する。ポリヌクレオチドのプレートを低速で３０分間、渦の上に置いて再懸濁させる。
【０１０７】
生成された各ポリヌクレオチドを、その品質を検査することができるか又は生成されたポリヌクレオチドの試料採取を選択し、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ９６−ウェルＣＥ、ＨＰＬＣ又は質量分析計上で品質を試験することができる。純度はポリヌクレオチドの主要ピークあるいはＣＥ又はＨＰＬＣ曲線のＮの面積の百分率を採ることにより計算される。
【０１０８】
ＢｉｏＴｅｋ ＰｏｗｅｒＷａｖｅ ＨＴを使用するオリゴヌクレオチドの定量は以下のように実施することができる。
【０１０９】
多チャンネルピペットを使用してプレート（未精製オリゴ糖）を「ストック」するために、目盛合わせしたＭｕｌｔｉＣｈａｎｎｅｌ Ｐｉｐｅｔｔｅ（多チャンネルピペット）でＵＶ ９６−ウェルプレート（例えば、Ｃｏｓｔａｒからの）中に各オリゴ３ｍｌを入れる。ＰＡＧＥ／Ｄｅｓａｌｔｅｄ（脱塩）プレートに対しては試料１０ｍｌを入れる。各ウェルに２９７ｍｌの１８ ＭＯＨＭ ＭｉｌｌｉＱ滅菌水（ＭＱＨ２Ｏ）を添加する（１／１００希釈）。ブランクのウェルが一列中に残る場合は、３００ｍｌのＭＱＨ２Ｏを各ウェル（少なくとも３ウェル）に添加する。そうでない場合は、３００ｍｌのＭＱＨ２Ｏを全体の次の空の列に添加する。ＰＡＧＥ／Ｄｅｓａｌｔｅｄ（脱塩）プレートに対して、１：１０希釈率で９０ｍｌの水を添加する。充填した９６ウェルのプレートに対して、試料及び水をプレート上のＡ１〜Ｇ１２中に、そしてＨ１〜Ｈ１２中にはブランクを充填する。もう１枚のプレートには試料及び水をＨ１〜Ｈ１２中に、そしてＧ１〜Ｇ１２中にはブランクを充填する。
【０１１０】
右上角にＡ１を伴って、プレートを分光光度計、例えば、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｐｅｃｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ中に配置する。ＤＮＡに対する２６０及び２８０の波長における光学密度を決定するために、分光光度計に関するソフトウエアを使用する。例えば、試料プロトコールは次のパラメーターをもつことができる：Ｒｅａｄｉｎｇ Ｔｙｐｅ（読み取りタイプ）：端点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）；Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ（波長）：１＝２６０，２＝２８０；ＲｅａｄＭｏｄｅ（読み取りモード）＝通常、Ｐｌａｔｅ（プレート）：Ｔｙｐｅ（タイプ）＝９６ウェル、Ｓｉｚｅ（サイズ）＝８×１２、Ｆｉｒｓｔ Ｗｅｌｌ（最初のウェル）＝Ａ１、Ｌａｓｔ Ｗｅｌｌ（最後のウェル）＝Ｈ１２；Ｓｈａｋｉｎｇ（振動）：強度＝０、期間＝０；温度調節；なし、遅延時間＝００：００：００；ＰｒｅＲｅａｄｉｎｇｓ（前読み取り）：経路長補正波長。Ｓａｍｐｌｅ＋Ｗａｔｅｒ（試料＋水）を含有のウェルに対しては、Ｔｙｐｅ（タイプ）の引き下ろしメニュー中のＳａｍｐｌｅ（試料）を選択する。Ｂｌａｎｃｓ（ブランク）を含有する列のものに対しては、Ｔｙｐｅ（タイプ）をＢｌｋに替える。プレートを読む。ソフトウエアは保存することができるＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（マイクロソフトのエクセル）のワークシートを作成することができる。
【０１１１】
ポリヌクレオチドの質量分析法のプロトコールは以下である。
【０１１２】
ＭＡＳＳ ＳＰＥＣ ＰＲＯＴＯＣＯＬ ｖ．１．１
Ｉ．試料の準備
凍結乾燥したストックの合成プレートに、濾過し、オートクレーブ処理した水１８ ＭＯＨＭ ｄＩ水１５０ｍｌを添加する。フォイルで封止し、再懸濁するまで３０分間震盪する。前記の方法を使用して、例えば、ＢｉｏＴｅｋ−ＰｏｗｅｒＷａｖｅＨＴを使用してオリゴヌクレオチドを定量する。ファイルのＯＤ２６０経路長補正カラムをコピーし、それをＥｘｃｅｌ（エクセル）ファイル及びＣＳＶファイル上のＯＤ２６０中に張り付ける。ｃｓｖファイルはＰａｃｋａｒｄ Ｍｕｌｔｉｐｒｏｂｅ ＩＩ ｅｘ液体処理装置を制御するために使用されるファイルである。Ｅｘｃｅｌ（エクセル）ファイルを印刷し、プロジェクトフォールダーをＭＡＬＤＩ下に入れる。Ｐａｃｋａｒｄを使用のために準備する（マニュアル参照）。
【０１１３】
Ｐａｃｋａｒｄのファイル”Ｍａｌｄｉ ｗａｔｅｒ ｏｎｌｙ（Ｍａｌｄｉ水のみ）”を開く。プレート例えば、Ａｂｇｅｎｅプレートをデッキ上の適当な位置に配置し、水桶の蓋を外す。９６未満のウェルに対し、デッキ上のプレートの輪郭を修飾する。「（Ｅｘｅｃｕｔｅ）実行」を選択する。プロンプトされる時に正しいＣＳＶファイルを呼び出す。Ｐａｃｋａｒｄの水添加が完了すると、プレート中にストックのポリヌクレオチドの適当量をピペット添加するために多チャンネルピペット及びフィルターの先端（ｔｉｐｓ）を使用する。フォイルで封止し、穏やかに渦撹拌し、次に４００ｇで６０秒間、ＳｐｅｅｄＶａｃ（真空ではない）又はＢｅｃｋｍａｎ ｐｌａｔｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ中で短時間スピンする。次の段階まで４℃の冷蔵庫中に入れる。
ＩＩ．Ｓａｍｓｕｎｇスポッター
スポッター中の埃を回避する段階を採る。ＫｉｍＷｉｐｅ及び必要な場合はメタノールで払拭する。２枚の偵察プレートにチップがないことを確認する。ソフトウエアプログラムを開く。Ｒｉｎｓｅ Ｔａｎｋ（リンスタンク）、（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）Ｗａｓｈ Ｔａｎｋ（（音波処理装置）洗浄タンク）及びＷａｓｔｅ Ｔａｎｋ（廃棄物タンク）のボックスがすべてグリーンであることを確認する。そうでない時は、供給タンクに脱イオン水を充填することができる。（音波処理）洗浄タンクを脱イオン水とエタノール（又はメタノール又はイソプロパノール）の５０：５０溶液（容量）で充填することができる。廃棄物タンクを空にし、底部を覆うのに十分なだけの１００％ブリーチを添加する。
【０１１４】
主要ピンの状態調整：
「Ｈｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ（ホームマシーン）」、次に「Ｐｉｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ（ピン状態調整）」を選択する。Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｓｔａｔｕｓ（音波処理装置状態）下で、「Ｄｒａｉｎ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（音波処理装置排水）」を選択し、音波処理浴が空であることを確認する。ドアを開けてスポッターデッキにアクセスする。曲ったノズルのスクイーズボトルにより音波処理装置中の浴の上部に１００％エタノール（又はメタノール又はイソプロパノール）を注ぐ。ドアを閉める。Ｐｉｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｂｏｘ（ピンの状態調整ボックス）を閉め、エラーログを閉じる。「Ｐｉｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ（ピンの状態調整）」の主要ヘッド又は単一ヘッド及び「Ｓｔａｒｔ（開始）」を選択する。ピンはアルコール中に降下され、３０分間状態調整されるであろう。終結すると、「Ｄｒａｉｎ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（音波処理装置排水）」及び「Ｆｉｌｌ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（音波処理装置充填）」を選択する。ソフトウエアを使用して状態調整の期間を変えることができる。
【０１１５】
通常の実行−９６すべてのウェルがスポットされる−を開始するために：以下の実行設定を使用することができる、例えば：ａ）Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｆｉｔｉｏｎ Ｆｉｌｅ（定義ファイル移動）：９６から９６、ｂ）Ｃｙｃｌｅ Ｒｕｎ（サイクル実行）：Ａｕｔｏ Ｒｕｎ（自動実行）、ｃ）Ｓｐｏｔｔｉｎｇ（スポット実施）：Ｗｅｔ Ｒｕｎ（湿式実行）、ｄ）Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ（操作）：Ａｎａｌｙｔｅ Ｏｎｌｙ（被検体のみ）、ｅ）Ｄｉｓｐｌａｙ Ｗａｒｎｉｎｇ Ｍｅｓｓａｇｅ（警告メッセージ表示）：Ｔｉｍｅｄ Ｄｉｓｐｌａｙ ３０ｓｅｃ．（時限表示３０秒）、ｆ）Ｐｉｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｔｉｍｅ（ピン状態調整時間）：３０分。以下のＣｈｉｐ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ（チップ観察）設定を使用することができる、例えば、ａ）Ｃｈｅｃｋ Ａｕｔｏ Ｉｎｓｐｅｃｔ Ｃｈｉｐ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（チップの位置の自動観察を確認する、ｂ）Ｃｈｅｃｋ Ａｐｐｌｙ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ（補正適用を確認する）。以下のＣｌｅａｎ Ｓｅｔｔｉｎｇ（清浄化クリーン設定）オプションを使用することができ、例えば、ａ）Ｃｌｅａｎ Ｃｙｃｌｅｓ（サイクルを清浄化する）：１秒（ｓｅｃ．），ｂ）Ｒｉｎｓｅ Ｔｉｍｅ（リンス時間）：３秒、ｃ）Ｗａｓｈ Ｔｉｍｅ（洗浄時間）：５秒、ｄ）Ｄｒｙ Ｔｉｍｅ（乾燥時間）：０．２秒、ｅ）Ｗａｓｈ／Ｓｕｐｐｌｙ（洗浄／供給）：１００秒、ｅ）Ｃｌｅａｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｔｅｍｓ（配列製品を清浄化）−すすぎ、乾燥、洗浄、乾燥をオンにする（すべてを確認する）。以下のＬｏａｄ／Ｄｉｓｐｅｎｓｅ（充填／分配）オプションを使用することができる、例えば、ａ）Ｌｏａｄ Ｔｉｍｅ（充填時間）：３秒、ｂ）Ｌｏａｄ Ｏｆｆｓｅｔ（充填補正）：１秒、ｃ）Ｌｏａｄ Ｓｐｅｅｄ（充填速度）：４０ｍｍ／秒、ｄ）Ｄｉｓｐ．Ｔｉｍｅ（分配時間）：０、ｅ）Ｄｉｓｐ．Ｏｆｆｓｅｔ（分配補正）：１、ｆ）Ｄｉｓｐ．Ｓｐｅｅｄ（分配速度）：８０ｍｍ／秒。
【０１１６】
試料（少なくとも５０ｍｌ）含有ＭＰＴを適当な部分に置く。チップ位置＃１が右上にあるようにＳＣＯＵＴ（スカウト）プレートを配置する。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ ｌｏｇｏは左を指していなければならない。チップを選択されたスポットに配置し、Ｓｔａｒｔ（開始）ボタンを選択する。
【０１１７】
単一ピンによる１対１スポット添加に対して：
Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ（操作ツール）下で、ＭＴＰ Ｔｙｐｅ（ＭＴＰタイプ）及びＣＨＩＰ Ｔｙｐｅ（チップタイプ）を９６に替える。Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（移動定義）はＳｉｎｇｌｅ Ｐｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（単一ピン移動）でなければならない。Ｅｎａｂｌｅ Ｍｏｄｉｆｙ（修飾不可能）を選択し、ＭＴＰマップ上で、スポット添加されるウェルを選択する。ＭＴＰマップ上の適当なウェルがハイライトされたら、これらの試料がスポット添加されるチップ上のウェルをハイライトする。ＭＴＰがＣＨＩＰに作図されたら、Ｓａｖｅ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ Ｆｉｌｅ（定義ファイルを保存）を選択する。ＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＴＡＢ（操作タブ）、Ｒｕｎ Ｓｅｔｕｐ Ｔａｂ（実行設定タブ）上で、Ｌｏａｄ Ｍｅｔｈｏｄ（ロード方法）を選択する。以下の実行設定を使用することができる、例えば、ａ）Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｆｉｔｉｏｎ Ｆｉｌｅ（定義ファイルを移動）：Ｃｕｓｔｏｍ（顧客）、ｂ）Ｃｕｓｔｏｍ Ｆｏｌｄｅｒ（顧客フォルダー）からＳｉｎｇｌｅＰｉｎ．ｄｅｆ（単一ピン定義）をロードする。残りの設定は前記の９６から９６と同様である。
ＩＩＩ．Ｂｒｕｋｅｒ ＡｕｔｏＦｌｅｘ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＳｐｅｃｔｒｏＡｃｑｕｉｒｅ ＲＴ
Ａ．Ｂｒｕｋｅｒ ＡｕｔｏＦｌｅｘ／Ｏｌｉｇｏ Ｃｈｅｃｋ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．０．２０／ＳｐｅｃｔｒｏＡｃｑｕｉｒｅバージョン３．０．１．１４
ソフトウエア上のＦｌｅｘ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄウインドーから適当な方法を選択する、例えば、５０−量体に対して、ｂｅｓｔ ｔｅｓｔ ５５ｍｅｒ．ｐａｒを使用することができる。ｂｅｓｔ ｔｅｓｔ ５５ｍｅｒ．ｐａｒに対して、ＩＳ１＝２０．００ｋＶ、ＩＳ２＝１８．３０ｋＶ、Ｌｅｎｓ（レンズ）＝９．９０ｋＶ、Ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ（レフレクター）＝０．０ｋＶ、Ｐｏｌａｎｔｙ＝陽性、Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（検出装置）＝限定、ＰＩＥ＝６００ｎｓ、１５００Ｄａまでに抑制。質量分析法の図面上で、レーザーの上部にカーサーでポイントする。圧力は例えば、１５００〜１８００ｍｂａｒであることができる。Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（質量分析装置）タブ上で、高圧（ＨＶ）ＯＦＦを入れる。ＭＡＬＤＩ上で、側部のグリーンボタンを押してプローブする。チップ含有ＳＣＯＵＴプレートをトレー中に入れる。トレーの配置に注意し、トレーを閉める。
【０１１８】
ＲＴソフトウエアを選択し、コンピューターをオンにする。Ｍａｓｓ Ａｒｒａｙ Ｏｌｉｇｏ Ｃｈｅｃｋ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（大量アレーオリゴチェックソフトウエア）を開く。Ｏｌｉｇｏ Ｃｈｅｃｋ Ｃａｌｌｅｒ（オリゴチェックコーラー）、Ｏｌｉｇｏ Ｃｈｅｃｋ（オリゴチェック）及びＯｌｉｇｏ Ｃｈｅｃｋ Ａｃｑｕｉｒｅｒ（オリゴチェックアクワイアラー）を選択する。
【０１１９】
自動実行を実施するために：
Ｂｒｕｋｅｒ ＡｕｔｏＦｌｅｘ上で、以下の方法を使用することができる。Ｏｌｉｇｏ Ｃｈｅｃｋ（オリゴチェック）及び、Ｉｎｉｔｉａｌｉｚｅ Ｍａｌｄｉ Ｒｕｎ（Ｍａｌｄｉ実行開始）を選択する。Ｉｎｉｔｉａｌｉｚｅ Ａｕｔｏ Ｒｕｎ（自動実行開始）ウインドー中で、プレートの名称を入力し、チップ配置を可能にし、チップ位置を選択し、ブラウズし、そしてインプットファイル：ｑ：＼Ｍａｌｄｉ＼年＼プレート名 ｍｓを入力する。データベースからＬｏａｄ Ｍａｌｄｉ Ｒｕｎ（Ｍａｌｄｉ実行ロード）を選択する。Ｍｕｌｄｉ Ｒｕｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｅｒ（Ｍａｌｄｉ実行指定）ウインドー中でＡＬＬをクリックする。表われるツリーを開き、実行名を選択する。プレート名を選択し、実行をハイライトする。Ｓｕｂｍｉｔ Ｍａｌｄｉ Ｒｕｎ ｆｏｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（処理のためのＭａｌｄｉ実行服従）を選択し、スポッティングが１：１の場合はＳｐｅｃｔｒｏＪｅｔ、又はすべての６ピンが使用された場合はＳｐｅｃｔｒｏＰｏｉｎｔを選択する。Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍｏｄｅ（評価モード）（ＳＮＲ）に対しては、以下のパラメーターを使用することができる、例えば、ＳＮＲ Ｃｕｔｏｆｆ（中断）：１、Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ（信頼度）：０。ＳｐｅｃｔｒｏＡｃｑｕｉｒｅに戻り、Ｔｏｏｌｓ（ツール）、Ｃｏｎｄｉｆｕｒｅ（構成）、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｏｍｅｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ（質量分析法）を選択する。オートランを開始する時にはＬｏａｄ Ｍｅｔｈｏｄ（ロード方法）を選択する。Ｔｏｏｌｓ（ツール）メニューからＬｏａｄ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（ロードパラメーター）を選択し、正しいパラメーターファイルを開く。Ａｕｔｏ Ｒｕｎ Ｓｅｔｕｐ Ｔａｂ（自動実行設定タブ）上で、それがあるＣｈｉｐ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（チップ位置）の次に、実行のための正確な名称をタイプする。より完全な平均化のために、”Ｕｓｅ ａｌｌ Ｒａｓｔｅｒ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ（すべてのラスター位置を使用する）”を選択する。Ｒｕｎ（実行）を選択する。
【０１２０】
分析するために：
Ｏｌｉｇｏ Ｃｈｅｃｋ Ａｃｑｕｉｒｅｒ（オリゴチェックアクワイアラー）を選択する。データベースからＬｏａｄ Ｍａｌｄｉ Ｒｕｎ（Ｍａｌｄｉ実行をロード）を選択し、左側パネルのツリーを介してプレートに移動する。試料を再スポットし、再シュートする必要のあるトレース及び記録並びに失敗したものを調べる。試料を再シュートする必要がある場合は、再シュートされるもののみを映すようにｍｓファイルを修飾し、マッピングが正しいことを確認する。データを保存するためにＪＰＥＧファイルを作成することもできる。
【０１２１】
手動シュートを実施するために：
ＲＴソフトウエア上で、Ｔｏｏｌｓ（ツール）メニューからＬｏａｄ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（ロードパラメーター）を選択し、例えば、５０ｍｅｒ．ｐａｒを選択する。Ｍａｎｕａｌ（手動）コントロールタブに行く。ＡｕｔｏＦｌｅｘの側部のグリーンボタンを押し、チップを挿入する。グリーンボタンを押してクローズする。チップの配置及びプレートの配置については前記を参照する。Ｓｔａｇｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（位置確認）ボックス中の正しいチップ位置を入力する。ウェル表示（例えば、Ａ１、Ｆ３等）により最初にシュートされるスポットを選択する。このデータをＲａｗ Ｄａｔａ Ｆｉｌｅ（生のデータファイル）下に保存するために、Ｓａｖｅ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｔｏ ａ Ｆｉｌｅ（ファイルにスペクトルを保存）を選択する。ＪＯＧによる矢印を使用して、スポットにクロスヘアを整列させる。Ａｃｑｕｉｒｅ（アクワイア）を選択する。
【０１２２】
目盛補正するために：
興味対象の長さを括弧にいれて３点サンプルを準備する。例えば、５０−量体に対して、４５、５０及び５５を選択する。様々な濃度で混合されたストックオリゴをスポットに使用することができる。例えば、各１００ｍＭで開始し、次に希釈する。最大長さに対しては、より短い長さよりも大量を添加することができる。目標は大体同様な強度ですべての３ピークを見ることである。単一ピンを使用して９６チップをスポットする。Ｓａｍｓｕｎｇ Ｓｐｏｔｔｅｒ上で単一ピンのスポット実施の指示に従い、以前に説明されたように手動でシュートする。シュートを保存する。解析能に対し各スペクトルを概観し、例えば、少なくとも１０スペクトルを保持する。
【０１２３】
各スペクトルにつき、以下を実施する。スペクトルにカーサーをもってきて、マウスを使用して各ピーク上で拡大する。ピークの左側上を左クリックし、ピークの右側までドラッグしながら左ボタンを押し続ける。ボタンを放す。これはピーク上を拡大するであろう。位置決めハンドが表われるまでピークの頂点上にクロスヘアを向ける。ハンド上を左クリックする。頂点を通って垂直点線が下降し、スペクトル上に質量が表われるであろう。下方に「ピーク１」が適当な質量及び高さを伴って形成されるであろう。他のピークについて反復する。３点スペクトルにおいて各ピークにつきこれを実施後、期待される質量をタイプする。カーサーを主要３点頭部に配置し、右クリックする。Ｃａｌｉｂｒａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（スペクトル修正）を選択する。Ａ、Ｂ及びＣ値が与えられるであろう。すべてのファイルにつき反復する。Ａ、Ｂ及びＣすべての数値を収集し、平均する。
【０１２４】
この出願書全体に、様々な刊行物を括弧内に引用してきた。それらの全体のこれらの刊行物の開示は、本発明が関与する当該技術分野の状態をより完全に説明するために、本出願書中に引用によりここに取り入れられている。
【０１２５】
本発明は開示された態様に関して説明されたが、当業者は、詳説された特定の実験は本発明を具体的に示すだけであることを容易に認めるであろう。本発明の精神から逸脱せずに様々な修飾物を作製することができることが理解されなければならない。従って、本発明は以下の請求項によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】ポリヌクレオチドの自動合成のための装置を示す。図１の装置は、ヌクレオチドのための試薬容器（１〜６）、合成溶液のための試薬容器（７〜１１）、ガラスの観察窓（１０９、１１０、１１１）をもつ乾燥ボックス（１２）、試薬ビンを合成プレートに接続する個々のソレノイド弁（１１８、１１９）をもつ化学薬品注入装置のための枠組み（１３）、乾燥ボックスの入り口及び出口に接続された貫通（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）ガス乾燥機（１４、１５）、ヌクレオチド試薬容器及び洗浄溶液の容器を加圧するために使用される試薬ガスフィード中に配置された貫通ガス乾燥機（１６、１７）、乾燥ボックスへのガスの入り口（１８、１９）、貫通ガス乾燥機（１７）への入り口（２０）及び貫通ガス乾燥機（１７）への出口（２１）、デジタルガス調整装置（２２、２３）、合成プレートから有機廃棄物容器へのインラインのソレノイド弁（２４）、装置の上部のための枠組み（１０５）、装置の底部のための枠組み（１１５）、合成溶液試薬の容器のための枠組み（１０６、１０７）及びヌクレオチド試薬の容器のための枠組み（１０８）、コンピューター（１１２）、弁を制御する管理装置ボックス（１１３）、管理装置を遮断するためのキルスイッチ（１１４）、テーブルの上面（１１６）並びにソレノイド弁を保持する板の一部（１１７、図３及び４に、より詳細に示される）を示す。
【図２】図１に示した装置の複数の図を示す。図２Ａは平面図であり、図２Ｂは斜めの角度の図であり、図２Ｃは正面図であり、図２Ｄは側面図である。装置の部分は図１と同様に標識を付けられている。図２Ｄにおいて、合成溶液のための試薬容器７及び８並びにヌクレオチドのための試薬容器１、２及び３は装置の右側上に配置されている合成溶液のための試薬容器９、１０及び１１並びにヌクレオチドのための試薬容器４、５及び６を示すために取り外されていることに注意されたい。
【図３】図１に示した装置の拡大図を示す。装置の部分は図１と同様に標識を付けられている。図３はソレノイド弁を保持する板（１１７）及びソレノイド弁（２６〜３１）の、より詳細な図を示す。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、合成プレートから有機廃棄物容器へのインラインのソレノイド弁（２４、２５）及び有機廃棄物容器への真空入り口ソレノイド弁（２６、２７）並びにその他のソレノイド弁（２８〜３１）の位置を示す、図１に示した装置の拡大図を示す。図４Ａはまた、ガラスの観察窓（１１１及び１２１）をもつ乾燥ボックス（１２）を示す。
【図５】乾燥ボックスの環境のガスの流れの拡大図を示す。液体窒素ジュワーからの吹きこぼれを乾燥ボックスのガス追い出しに使用することができる。図は液体窒素ジュワー（３８）及びガス調整装置（３９）、ガスの出口及び入り口（３２、３３）をもつ図１からのガス乾燥機（１６）、液体窒素ジュワー及びガス調整装置（３８、３９）を下方のガス乾燥機の入り口（３３）に接続するチューブ（４０）及び上部ガス乾燥機の出口（３２）を主ガス制御ソレノイド弁（２８）に接続するチューブ（４１）を示す。チューブ（４２）は主ガス制御装置（２８）を高流量制御ソレノイド弁（３０）に接続し、チューブ（４４）は高流量制御ソレノイド弁（３０）を高流量流量計（３７）に接続し、そしてチューブ（４６）は高流量流量計（３７）を三方接合具（４８）に接続する。チューブ（４３）は主ガス制御ソレノイド弁（２８）を低流量制御ソレノイド弁（３１）に接続し、そしてチューブ（４５）は低流量制御ソレノイド弁（３１）を低流量流量計（３６）に接続し、そしてチューブ（４７）は低流量流量計（３６）を三方接合具（４８）に接続する。チューブ（４９）は三方接合具（４８）を三方接合具（５０）に接続する。チューブ（５２）は三方接合具（５０）をガス入り口（１８）に接続し、そしてチューブ（５１）は三方接合具（５０）をガス入り口（１９）に接続する。チューブ（５４）はガス出口（３５）を三方接合具（５５）に接続し、そしてチューブ（５３）はガス出口（３４）を三方接合具（５５）に接続する。ガス入り口及び出口（１８、１９、３４及び３５）は乾燥ボックス（１２）に接続される。チューブ（５６）は三方接合具（５５）をガス乾燥機（１７）上のガス入り口（２０）に接続し、そしてチューブ（５７）はガス乾燥機（１７）上のガス出口（２１）を換気のために大気に接続する。
【図６】試薬ビン圧力系の拡大図を示す。図は制御されたヘリウムガス供給材料（５８）及びガス調整装置（５９）、制御されたヘリウムガス供給材料及びガス調整装置（５８、５９）及び、ガス乾燥機（１５）上のガス入り口（６１）を接続するチューブ（６０）を示す。チューブ（６２）はガス乾燥機（１５）上のガス出口（６２）をデジタルガス調整装置（２２）上の入り口（６４）と接続する。チューブ（６５）はデジタルガス調整装置（２２）を三方接合具（６６）と接続する。チューブ（６７）は三方接合具（６６）をガス供給マニホールド（６９）と接続し、そしてチューブ（６８）は三方接合具（６６）をガス供給マニホールド（７０）と接続する。ガス供給マニホールドは各試薬ビン（図１には示されない）に供給する。
【図７】アセトニトリル（ＡＣＮ）洗浄系の拡大図を示す。図は、制御されたヘリウムガス供給材料（７１）及びガス調整装置（７２）、制御されたヘリウムガス供給材料及びガス調整装置（７１、７２）及びガス乾燥機（１４）上のガス入り口（７４）を接続するチューブ（７３）を示す。チューブ（７６）はガス乾燥機（１４）上のガス出口（７５）をデジタルガス調整装置（２３）上の入り口（７７）と接続する。チューブ（７８）はデジタルガス調整装置（２３）をアセトニトリルジュワー（７９）と接続する。チューブ（８０）はアセトニトリルジュワー（７９）を三方接合具（８１）と接続する。チューブ（８２）は三方接合具（８１）をソレノイド弁洗浄ラインマニホールド（８３）と接続し、そしてチューブ（８４）は三方接合具（８１）をソレノイド弁洗浄ラインマニホールド（８５）と接続する。
【図８】真空系の拡大図を示す。図は、廃棄物容器（８６）をソレノイド弁（２５）と接続するチューブ（８７）及びソレノイド弁（２５）を合成プレート（プレート１）（８９）と接続するチューブ（８８）を示す。図はまた、廃棄物容器（９９）をソレノイド弁（２４）と接続するチューブ（１００）及びソレノイド弁（２４）を合成プレート（プレート２）（１０２）と接続するチューブ（１０１）を示す。チューブ（９０）は廃棄物容器（８６）を三方真空入り口ソレノイド弁（２６）と接続し、そしてチューブ（９１）は三方真空入り口ソレノイド弁（２６）を乾燥テフロン真空ポンプ（９３）及びトラップ（９２）と接続する。チューブ（１０３）は廃棄物容器（９９）を三方真空入り口ソレノイド弁（２７）と接続し、そしてチューブ（１０４）は三方真空入り口ソレノイド弁（２７）を乾燥テフロン真空ポンプ及びトラップ（９２、９３）と接続する。チューブ（９５）は排水廃棄物容器（９６）を排水管（ｄｒａｉｎ）（９４）と接続し、そしてチューブ（９７）は排水廃棄物容器（９６）を真空入り口ソレノイド弁（２９）と接続する。チューブ（９８）は真空入り口ソレノイド弁（２９）を乾燥テフロン真空ポンプ及びトラップ（９２、９３）と接続する。
【図９】図１で示された装置上で合成された、未精製５０−量体のＣＮＴ４−Ｆ−８ ５’ ＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧ ３’（配列確認番号：１）ポリヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．）のスペクトルを示す。
【図１０】図１で示された装置上で合成された、未精製５０量体のＣＮＴ４−Ｒ ５’ ＧＣＡＣＡＧＡＧＧＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＴＧＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧＡＴＣＡ ３’（配列確認番号：２）ポリヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．）のスペクトルを示す。
【図１１】Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．から購入して得た、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で精製され且つ脱塩された５０量体のポリＴ ５’ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列確認番号：３）ポリヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．）スペクトルを示す。
【図１２】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入して得た、ＰＡＧＥ精製され且つ脱塩された５０量体のＩＰＰ１ Ｆ４ ５’ ＡＧＴＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＣＧＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＡ ３’（配列確認番号：４）ポリヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．）スペクトルを示す。
【図１３】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入して得た、ＰＡＧＥ精製され且つ脱塩された５０−量体のＩＰＰ１ Ｆ６ ５’ ＣＣＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＧＧＡＡＡＴＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣＧＴＡＴＣＣＣＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＴＧＡ ３’（配列確認番号：５）ポリヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．）スペクトルを示す。
【図１４】市販のＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ ＭｅｒｍａｄｅＴＭオリゴヌクレオチド合成装置を使用してＥｇｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓで生成した、未精製のＥＰＯ ００１ Ｆ−７ ５’ＡＧＣＡＧＧＣＧＧＴＴＧＡＡＧＴＴＴＧＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＧＧＴＴ（配列確認番号：６）ポリヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．）スペクトルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）複数の防湿性試薬容器、
ｂ）自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、
ｃ）該乾燥ボックスに該試薬容器を接続する防湿性チューブ、
ｄ）ガスが該試薬容器を加圧する、該試薬容器をガスに接続する試薬ガスフィード及び
ｅ）該試薬ガスフィードに接続されており、かつ、該試薬容器内の定圧を維持するデジタルガス調整装置、
を含んでなる、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための装置。
【請求項２】
該接続体（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ）が湿気の侵入を排除するために封止されている、請求項１の装置。
【請求項３】
該封止された接続体が１００ｐｓｉ強度より大きい圧力を維持することができる、請求項２の装置。
【請求項４】
該接続体がシリコーンコーキング材で封止されている、請求項２の装置。
【請求項５】
該試薬容器がヌクレオチド溶液の容器又は洗浄溶液の容器である、請求項１の装置。
【請求項６】
該ガスが窒素、アルゴン又はヘリウムである、請求項１の装置。
【請求項７】
該チューブに接続されたフロースルー（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）ガス乾燥機を更に含んでなる、請求項１の装置。
【請求項８】
該試薬ガスフィードに接続されたフロースルーガス乾燥機を更に含んでなる、請求項１又は７の装置。
【請求項９】
該乾燥ボックス内部にデジタル湿度計を更に含んでなる、請求項１又は７の装置。
【請求項１０】
該乾燥ボックス内部にデジタル湿度計を更に含んでなる、請求項８の装置。
【請求項１１】
ａ）複数の防湿性試薬容器、
ｂ）自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、
ｃ）該乾燥ボックスに該試薬容器を接続する防湿性チューブ、
ｄ）ガスが該試薬容器を加圧する、該試薬容器をガスに接続する試薬ガスフィード、
ｅ）該試薬ガスフィードに接続されており、かつ、該試薬容器内の定圧を維持するデジタルのガス調整装置及び
ｆ）ポリヌクレオチド合成装置、
を含んでなる、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための装置。
【請求項１２】
該接続体が湿気の侵入を排除するために封止されている、請求項１１の装置。
【請求項１３】
該封止された接続体が１００ｐｓｉ強度を超える圧力を維持することができる、請求項１２の装置。
【請求項１４】
該接続体がシリコーンコーキング材で封止されている、請求項１２の装置。
【請求項１５】
該試薬容器がヌクレオチド溶液の容器又は洗浄溶液の容器である、請求項１１の装置。
【請求項１６】
該ガスが窒素、アルゴン又はヘリウムである、請求項１１の装置。
【請求項１７】
該チューブに接続されたフロースルーガス乾燥機を更に含んでなる、請求項１１の装置。
【請求項１８】
該試薬ガスフィードに接続されたフロースルーガス乾燥機を更に含んでなる、請求項１１又は１７の装置。
【請求項１９】
該乾燥ボックス内部にデジタル湿度計を更に含んでなる、請求項１１又は１７の装置。
【請求項２０】
該乾燥ボックス内部にデジタル湿度計を更に含んでなる、請求項１８の装置。
【請求項１】
ａ）複数の防湿性試薬容器、
ｂ）自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、
ｃ）該乾燥ボックスに該試薬容器を接続する防湿性チューブ、
ｄ）ガスが該試薬容器を加圧する、該試薬容器をガスに接続する試薬ガスフィード及び
ｅ）該試薬ガスフィードに接続されており、かつ、該試薬容器内の定圧を維持するデジタルガス調整装置、
を含んでなる、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための装置。
【請求項２】
該接続体（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ）が湿気の侵入を排除するために封止されている、請求項１の装置。
【請求項３】
該封止された接続体が１００ｐｓｉ強度より大きい圧力を維持することができる、請求項２の装置。
【請求項４】
該接続体がシリコーンコーキング材で封止されている、請求項２の装置。
【請求項５】
該試薬容器がヌクレオチド溶液の容器又は洗浄溶液の容器である、請求項１の装置。
【請求項６】
該ガスが窒素、アルゴン又はヘリウムである、請求項１の装置。
【請求項７】
該チューブに接続されたフロースルー（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）ガス乾燥機を更に含んでなる、請求項１の装置。
【請求項８】
該試薬ガスフィードに接続されたフロースルーガス乾燥機を更に含んでなる、請求項１又は７の装置。
【請求項９】
該乾燥ボックス内部にデジタル湿度計を更に含んでなる、請求項１又は７の装置。
【請求項１０】
該乾燥ボックス内部にデジタル湿度計を更に含んでなる、請求項８の装置。
【請求項１１】
ａ）複数の防湿性試薬容器、
ｂ）自動ポリヌクレオチド合成装置の合成プラットホーム上にシールを形成することができる乾燥ボックス、
ｃ）該乾燥ボックスに該試薬容器を接続する防湿性チューブ、
ｄ）ガスが該試薬容器を加圧する、該試薬容器をガスに接続する試薬ガスフィード、
ｅ）該試薬ガスフィードに接続されており、かつ、該試薬容器内の定圧を維持するデジタルのガス調整装置及び
ｆ）ポリヌクレオチド合成装置、
を含んでなる、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖された連続的無水系を維持するための装置。
【請求項１２】
該接続体が湿気の侵入を排除するために封止されている、請求項１１の装置。
【請求項１３】
該封止された接続体が１００ｐｓｉ強度を超える圧力を維持することができる、請求項１２の装置。
【請求項１４】
該接続体がシリコーンコーキング材で封止されている、請求項１２の装置。
【請求項１５】
該試薬容器がヌクレオチド溶液の容器又は洗浄溶液の容器である、請求項１１の装置。
【請求項１６】
該ガスが窒素、アルゴン又はヘリウムである、請求項１１の装置。
【請求項１７】
該チューブに接続されたフロースルーガス乾燥機を更に含んでなる、請求項１１の装置。
【請求項１８】
該試薬ガスフィードに接続されたフロースルーガス乾燥機を更に含んでなる、請求項１１又は１７の装置。
【請求項１９】
該乾燥ボックス内部にデジタル湿度計を更に含んでなる、請求項１１又は１７の装置。
【請求項２０】
該乾燥ボックス内部にデジタル湿度計を更に含んでなる、請求項１８の装置。
【図１】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００７−５２５１８５（Ｐ２００７−５２５１８５Ａ）
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１４３１９（Ｐ２００６−５１４３１９）
【出願日】平成１６年５月６日（２００４．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４２７１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９９４３５
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
２．ＰＹＲＥＸ
３．Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ
【出願人】（５０５４１１５８３）イージア・バイオサイエンシズ・エルエルシー (1)
【出願人】（３０６０４０５０６）
【出願人】（３０６０４０５１７）
【出願人】（３０６０４０４９２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月６日（２００４．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４２７１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９９４３５
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
２．ＰＹＲＥＸ
３．Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ
【出願人】（５０５４１１５８３）イージア・バイオサイエンシズ・エルエルシー (1)
【出願人】（３０６０４０５０６）
【出願人】（３０６０４０５１７）
【出願人】（３０６０４０４９２）
【Ｆターム（参考）】
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