ポリペプチド精製のための方法およびシステム
本発明は、精製後のポリペプチドを含む水溶液の、直後に行うろ過を含む、ポリペプチド精製のための方法および自動化システムを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド精製のための方法および自動化システムに関する。特に、本発明は、複合混合物からのポリペプチド精製に有用な、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に基づく方法および自動化システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）は、液体クロマトグラフィーの一種であり、複合混合物からタンパク質やＤＮＡなどの多量の多様な生体分子を分離および／又は精製するために、産業的にも学術的にも広く用いられている。ＦＰＬＣでは、液体の流れを利用して、対象の生体分子を含む可溶性成分の入った混合物を固定相に通過させることにより混合物を分離させ、これにより混合物の個々の成分が分離される。使用する溶出法により、混合物に含まれる複数の成分が互いに異なる速度で固定相を移動するか、または、固定相との特定のリガンド相互作用により保持され、これにより互いに分離する。
【０００３】
設計が単純であることから、ＦＰＬＣを自動化するシステムが開発された。ＦＰＬＣに基づく自動化システムは、特に、英国のＣｈａｌｆｏｎｔ Ｓｔ．ＧｉｌｅｓのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社により製造され、ＡＫＴＡ（一字目のＡは¨が付いた文字、以下同じ）（商標）という商品名で販売されている。
【０００４】
生体分子の精製は簡素化されるとはいえ、精製サイクルは現存のＦＰＬＣに基づくシステム上で実行されるようにのみ設定することができ、このシステムでは、対象の生体分子を含む生成されたフロースルーや溶出液は、一度システムを離れると短時間で回収することができる。生成されたフロースルーまたは溶出液が迅速に回収されず、それにより長期間露出されてしまう場合、それらが変質する危険性は高くなる。一度フロースルーや溶出液に変質が生じると、それらは使用できなくなり廃棄または大々的に浄化しなければならなくなり、時間もかかる上に費用もかかる。よって、フロースルーや溶出液の変質は回避しなければならない。フロースルーまたは溶出液の変質を回避するには、フロースルーや溶出液がシステムを離れる際にオペレータが必要となり、これにより、特に長い運転サイクルで、生産性を高めることのない余分な工数が増える。この結果、精製サイクルの実行を、フロースルーまたは溶出液がシステムを離れる時間がオペレータの通常の勤務時間内に収まるように設定され、これによりタイミングと実行させる精製サイクル数とが制限される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
こうしたことから、本発明の目的は、現存のＦＰＬＣに基づくシステムの所定の欠点を解消する手段を提供することであり、特に、その目的は、融通性および／または生産性が向上した方法およびシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によると、この目的は以下の項目１〜２３の主題により達成される。
項目１．ポリペプチドを精製するための高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に基づく方法であり、ａ）ポリペプチドを含む溶液を、固定相を含むクロマトグラフィー手段につけるステップと、ｂ）クロマトグラフィー手段である固定相に溶液を通過させることにより、溶液に含まれる他の分子からポリペプチドを分離するステップと、ｃ）クロマトグラフィー手段からフロースルーまたは溶出液中にポリペプチドを回収するステップと、ｄ）ろ過により再生したポリペプチドを含むフロースルーまたは溶出液を滅菌するステップと、を含む方法。
項目２．項目１のステップｂ）において、ポリペプチドは固定相と相互作用して固定相により保持され、ステップｃ）において、ポリペプチドは溶出により回収される項目１に記載の方法。
項目３．ステップｄ）において、ろ過は真空ろ過である項目１または２に記載の方法。
項目４．ステップａ）〜ｄ）のうち１つ以上のステップが自動的に制御される項目１〜３のいずれかに記載の方法。
項目５．固定相は、生体高分子、無機高分子、または合成高分子であり、これらの各々は任意で、それに結合する官能基を有してもよく、または、固定相はメンブレンまたはモノリスであることを特徴とする項目１〜４のいずれかに記載の方法。
項目６．項目１〜５のいずれかの方法によりポリペプチドを精製するために構成される高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）自動化システムであり、ｉ）クロマトグラフィーモジュールと、ｉｉ）クロマトグラフィーモジュールの次に配置されるろ過モジュールと、を備えるシステム。
項目７．ろ過モジュールは、クロマトグラフィーモジュールから回収したポリペプチドを含むフロースルーまたは溶出液を滅菌ろ過するための少なくとも１つのろ過手段と、少なくとも１つのろ過手段による滅菌ろ過を制御するための制御手段と、を備える項目６に記載のシステム。
項目８．ろ過モジュールは、クロマトグラフィーモジュールから回収したポリペプチドを含むフロースルーまたは溶出液を滅菌ろ過するための２つ以上のろ過手段と、各ろ過手段に対する、ろ過手段による滅菌ろ過を制御するための機能的に接続された制御手段と、を備える項目６または７に記載のシステム。
項目９．滅菌ろ過は真空をかけることにより行われる項目７または８に記載のシステム。
項目１０．制御手段は、演算手段による制御用の入力端子と出力端子とを任意で備える少なくとも１つの電動リレーと、少なくとも１つの電気機械バルブとを備え、電動リレーと電気機械バルブとは機能的に接続されている項目７〜９のいずれかに記載のシステム。
項目１１．各制御手段は、互いに機能的に接続されている電動リレーと電気機械バルブとを備える項目７〜１０のいずれかに記載のシステム。
項目１２．制御手段は、演算手段による制御用の入力端子と出力端子とを備える項目７〜１１のいずれかに記載のシステム。
項目１３．電気機械バルブは、真空供給の伝達を制御するために用いられる項目１０〜１２のいずれかに記載のシステム。
項目１４．電気機械バルブは前記電動リレーにより制御される項目１０〜１３のいずれかに記載のシステム。
項目１５．電気機械バルブはソレノイドバルブである項目１０〜１４のいずれかに記載のシステム。
項目１６．ろ過手段はフィルターカップである項目６〜１５のいずれかに記載のシステム。
項目１７．ろ過モジュールは、４つのろ過手段と４つの制御手段とを備える項目６〜１６のいずれかに記載のシステム。
項目１８．項目６〜７のいずれかに記載の自動クロマトグラフィーシステム用に構成されたろ過モジュールであって、ポリペプチドを含む水溶液を滅菌ろ過するための少なくとも１つのろ過手段と、少なくとも１つのろ過手段による前記滅菌ろ過を制御するための制御手段と、を備えるろ過モジュール。
項目１９．ポリペプチドを含む水溶液を滅菌ろ過するための２つ以上のろ過手段と、各ろ過手段に対する、ろ過手段による滅菌ろ過を制御するための機能的に接続された制御手段とを備える項目１８に記載のろ過モジュール。
項目２０．ろ過モジュールは、４つのろ過手段と４つの制御手段とを備えることで、常に１つのろ過手段が制御手段に機能的に接続されている項目１８または１９に記載のろ過モジュール。
項目２１．項目１８〜２０のいずれかのろ過モジュール用に構成された制御手段であって、演算手段による制御用の入力端子と出力端子とを任意で備える少なくとも１つの電動リレーと、少なくとも１つの電気機械バルブとを備え、電動リレーと電気機械バルブとは機能的に接続されている制御手段。
項目２２．演算手段による制御用の２つ以上の入力端子と２つ以上の出力端子とを任意で備える２つ以上の電動リレーと、２つ以上の電気機械バルブとを備え、電動リレーと電気機械バルブとは機能的に接続されている項目２１に記載の制御手段。
項目２３．制御手段は、４つのリレーと４つのバルブとを備えることで、常に１つのリレーが１つのバルブに機能的に接続されている項目２１または２２に記載の制御手段。
【０００７】
フロースルーまたは溶出液がクロマトグラフィー手段を離れると、フロースルーまたは溶出液をすぐに滅菌することにより、フロースルーまたは溶出液、または含まれる生体分子の変質の危険を伴うことなく長期に渡り確実に保存することができる（つまり、クロマトグラフィーの直後に実施されるインライン滅菌ろ過を用いる）。このように、本出願は、１つのクロマトグラフィーモジュールと多数の並列（つまり、２つ以上）のろ過手段を備える装置を対象とすることが好ましい。こうした装置の利点は、クロマトグラフィーモジュールの通過後に生成される溶出液が多数の並列のろ過手段を通過することにより（１つのクロマトグラフィー手段が１つのろ過手段にのみ接続されている装置と比較して）所定時間内に多量の液体をろ過できることである。このようにして得られたより高速のろ過により、精製されるタンパク質の変質の危険性が著しく低下する。
【０００８】
これにより、本発明の方法およびシステムにより、運転サイクルのタイミングの融通性を向上させることができる。無人で夜間のサイクルを行わせることにより経過時間および工数のいずれをも短縮することができ、それによって、システムの生産性を向上させられる。更に、真空ろ過を利用することは、圧力により駆動されるインラインフィルターを追加する場合のようにシステムの動的特性を変更することがない。これにより、システムの圧力上限が重要となるより高速のスループットが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、１つの電動ＥＵＬリレーと１つのガスソレノイドバルブとを備える本発明の制御手段を模式的に示す図である。
【図２】図２は、４つの電動ＥＵＬリレーからなるアレイと４つのガスソレノイドバルブとを備える本発明の別の制御手段を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
特記しない限り、「ポリペプチド」および「タンパク質」は少なくとも２つのアミノ酸からなる化合物を指す。「ポリペプチド」または「タンパク質」は、触媒活性または結合活性を有していてよい。「ポリペプチド」または「タンパク質」は、例えば、酵素またはドメインや単一ドメイン抗体などの抗体であってもよいが、これらに限定されない。本発明の目的では、両方の用語は置き換え可能に用いることができる。
【００１１】
特記しない限り、「アミノ酸」という用語は、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つの酸性基とを備えるいずれの有機化合物も含む。アミノ酸は、天然由来の化合物でもよく、合成物からなるものでもよい。アミノ酸は、少なくとも１つのアミノ基および／または少なくとも１つのカルボキシル基を含むことが好ましい。「アミノ酸」は、また、こうしたアミノ酸化合物に由来しペプチド結合または擬似ペプチド結合により隣接する残留物に結合される、ペプチドおよびタンパク質などの大きな分子に含まれる残留物を指す。
【００１２】
特記しない限り、「固定相」という用語は、溶液内の物質と相互作用する固体材料を指す。
【００１３】
特記しない限り、「溶出液」という用語は、クロマトグラフィー手段を離れ、固定相に保持される物質を固定相から除去または溶解した液体を指す。
【００１４】
特記しない限り、「フロースルー」は、固定相により保持される物質を固定相から除去または溶解せずに、クロマトグラフィー手段を通過して分離した液体を指す。
【００１５】
特記しない限り、「滅菌ろ過する」および「滅菌ろ過」とは、微生物（例えば、バクテリアや菌類など）の汚染物質をフロースルーや溶出液から排除することを指す。ろ過のプロセスでは、汚染物質がフィルターに保持されるので、汚染物質がフロースルーや溶出液に含まれる他の物質から分離される。
【００１６】
一態様において、本発明はポリペプチドを精製するためのＦＰＬＣに基づいた方法を提供する。この方法は、
ａ）ポリペプチドを含む溶液を、固定相を含むクロマトグラフィー手段につけるステップと、
ｂ）クロマトグラフィー手段である固定相に溶液を通過させることにより、溶液に含まれる他の分子からポリペプチドを分離するステップと、
ｃ）クロマトグラフィー手段からフロースルーまたは溶出液中にポリペプチドを回収するステップと、
ｄ）回収したポリペプチドを含むフロースルーまたは溶出液をろ過により滅菌するステップと、を含む。
【００１７】
本発明で使用されるクロマトグラフィー手段は、ポリペプチドおよびタンパク質を精製するためのカラムクロマトグラフィー、メンブレンクロマトグラフィーまたはモノリスクロマトグラフィーで通常用いられる手段である。こうした手段は、本技術分野では公知である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー手段は精製カラムが用いられる。本実施形態で使用される精製カラムは、固定相を含む多様な大きさおよび内径のチューブである。通常、チューブの大きさおよび内径はそれぞれ１ｃｍ〜３０ｃｍの範囲および０．１〜５ｃｍの範囲である。しかしながら、チューブの大きさは２ｍまで大きくしてもよい。チューブは、ガラスまたはステンレス鋼などの金属から作られてもよい。精製カラムは、Ｔｒｉｃｏｒｎ（商標）カラム、ＭｉｎｉＢｅａｄｓ（商標）カラム、ＲＥＳＯＵＲＣＥ（商標）カラム、ＨｉＴｒａｐ（商標）カラム、ＨｉＬｏａｄ（商標）カラム、ＨｉＰｒｅｐ（商標）カラム、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）カラム、およびＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標）カラムなど、市販の精製カラムから選択してもよいが、これらに限定されない。また、精製カラムは、最適な固定相を空のカラム本体へ詰めることにより実験装置内で製造されてもよい。市販のカラム本体の一例としては、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＸＫシリーズやＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｖａｎｔａｇｅシリーズがある。
【００１９】
固定相は、固体充填材であり、生体高分子、合成高分子、または無機高分子であってもよい。生体高分子は、セルロース、デキストラン、またはアガロースから選択されてもよい。合成高分子は、ポリアクリルアミド、メタクリレート、またはポリビニルベンゼン／ポリスチレンから選択されてもよい。無機高分子は、シリカ、ヒドロキシアパタイト、または多孔性ガラスビーズであってもよい。必要に応じ、充填材には、更に、ポリペプチドとの特定相互作用を可能にする官能基が結合していてもよい。こうした官能基は、第四ヒドロキシプロピルジエチルアミノエチル基（ＱＡＥ）、第四トリメチルアミノエチル基（Ｑ）、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）、カルボキシメチル基（ＣＭ）、スルホメチル基（Ｓ）、またはスルホプロピル基（ＳＰ）であってもよいが、これらに限定されない。官能基は、また、対象のポリペプチドの特定の結合パートナーなど、群特異的または単一特異的なリガンドであってもよく、例えば、抗体の場合は抗原であり、またはその逆であってもよい。
【００２０】
他の実施形態では、クロマトグラフィー手段は、固定相としてメンブレンを含む容器またはカラムを用いる。カラムは、上記のようにチューブ状であってもよい。
【００２１】
クロマトグラフィーに用いられるメンブレンは、当該技術分野では周知のものである。メンブレンは、１層以上、例えば２層、３層、または４層からなるものであっても良いが、これらに限定されない。メンブレンのマトリクス材は、セルロース、修正セルロース、架橋セルロース、ニトロセルロースや、ナイロン、ポリビニルクロライド（ＰＶＣ）またはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）などのポリアミドであってもよいが、これらに限定されない。
【００２２】
他の実施形態では、クロマトグラフィー手段は、固定相としてモノリスを含む容器またはカラムを用いる。カラムは、上記のようにチューブ状であってもよい。
【００２３】
クロマトグラフィーに用いられるモノリスは、当該技術分野では周知のものである。
【００２４】
所定の実施形態において、ステップｄ）のろ過は真空ろ過である。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ＦＰＬＣに基づいた方法のための自動化システムを提供する。特に、本発明は、上記に詳述した方法によりポリペプチドを精製するために構成された自動ＦＰＬＣシステムを提供する。本発明のシステムは、クロマトグラフィーモジュールとろ過モジュールとを備える。ろ過モジュールは、クロマトグラフィーモジュールの後に配置される。
【００２６】
本発明のシステムのクロマトグラフィーモジュールは、クロマトグラフィー手段と、ポンプと、検出システムと、制御部とを備える。また、本発明のクロマトグラフィーモジュールは、オートサンプラーおよび／またはフラクションコレクターを備えてもよい。本発明では、クロマトグラフィーモジュールとして、英国のＣｈａｌｆｒｏｎｔ Ｓｔ．ＧｉｌｅｓのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社が製造し提供するＡＫＴＡ（商標）ＦＰＬＣ装置を用いてもよい。
【００２７】
クロマトグラフィー手段は上記の通りである。
【００２８】
ポンプはシステム内の液体を一定の流量にすることを可能にする。カラムクロマトグラフィーモジュールは、２つ以上のポンプ、例えば、２つ、３つ、または４つのポンプを備えても良いが、これらに限定されない。ポンプは、蠕動ポンプであってもよい。ポンプは、また、ダイヤフラムポンプ、チェックピストンポンプ、またはローブポンプであってもよい。ポンプの流速は、０．００１〜１００ｍｌ／ｍｉｎの範囲であってもよい。
【００２９】
検出システムは、クロマトグラフィー手段を離れる分子を検出することができる。検出システムは、ＵＶ分光光度計であってもよい。または、検出システムは、伝導性フローセルまたはｐＨ電極であってもよい。
【００３０】
制御部は、各システムコンポーネントの自動制御を可能とする。制御部は、各システムコンポーネントを制御するコンピュータプログラムを実行する演算手段であってもよい。演算手段は、コンピュータのプロセッサにより実行されるコンピュータプログラムをロードしたパーソナルコンピュータであってもよい。演算手段は、また、ネットワークシンクライアントであってもよい。このコンピュータプログラムは、英国ＣｈａｌｆｒｏｎｔのＳｔ．ＧｉｌｅｓのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手可能なＵＮＩＣＯＲＮ（商標）コントロールソフトウェアであってもよい。本発明ではＵＮＩＣＯＲＮ（商標）コントロールソフトウェアであることが好ましい。
【００３１】
本発明のシステムにおけるろ過モジュールは、クロマトグラフィーモジュールから回収されるフロースルーや溶出液を滅菌ろ過するための少なくとも１つのろ過手段と、少なくとも１つのろ過手段による滅菌ろ過を制御するための制御手段とを備える。ろ過モジュールは、２つ以上のろ過手段および／または２つ以上の制御手段を備えても良く、例えば、２つ、３つ、または４つのろ過手段および／または２つ、３つ、または４つの制御手段を備えてもよいが、これらに限定されない。
【００３２】
ろ過手段により、フロースルーや溶出液を滅菌ろ過することができる。つまり、微生物などの汚染物質がフロースルーや溶出液から除去される。ろ過手段は、フィルターを含む装置である。本発明の一実施形態では、ろ過手段がフィルターカップであり、真空駆動ボトルトップフィルターとも呼ばれる。フィルターカップは、当該技術分野では公知である。フィルターカップを用いることにより、移動を必要とすることなくフロースルーや溶出液をすぐに回収することができ、これにより、滅菌ろ過することができる。フィルターの細孔のサイズは、０．４５〜０．１μｍの範囲であって、例えば、０．４５μｍ、０．２２μｍ、または０．１μｍであってもよいが、これらに限定されない。通常、０．４５〜０．１μｍの範囲のサイズの細孔によってバクテリアなどの微生物が留められることが期待される。特定の実施形態では、フィルター細孔のサイズは０．２２μｍである。
【００３３】
詳述したように、滅菌ろ過は、真空によって駆動されてもよい。この場合、ろ過手段を減圧させ、負圧をかけることにより液体および空気をフィルターに通過させる。これは、フィルターの、ろ過される液体を保持する側と反対側に位置する、ろ過手段上の真空入口を介して真空を供給することにより達成される。真空は真空供給源により生成され、真空供給源はオンデマンド真空ポンプまたはパイプ式真空ポンプであってもよい。ろ過手段および真空供給源は、ガス管および／またはシリコン実験管で接続されている。
【００３４】
本発明の制御手段は、ろ過手段による滅菌ろ過の制御を可能にする。制御手段は、少なくとも１つの電動リレーまたは半導体リレーまたはソリッドステートの同等物、および少なくとも１つの電気機械バルブを備え、両者は機能的に接続されている。電動リレーと電気機械バルブとは、電気回路を介して機能的に接続されている。電気回路は、ヒステリシス設定を用いる高入力インピーダンス電圧検知リレーからなるものでもよい。
【００３５】
制御手段は、更に２つ以上の電動リレーおよび／または２つ以上の電気機械バルブ、例えば、２つ、３つ、または４つの電動リレーおよび／または２つ、３つ、または４つの電気機械バルブを備えてもよいが、これらに限定されない。所定の実施形態では、本発明の制御手段は、４つのリレーからなるアレイを備える。
【００３６】
電動リレーは、低出力リレーであってもよい。電動リレーは、リレーとして同じ筐体内に設置される専用の２４Ｖ−ＤＣ電源により駆動されてもよい。所定の実施形態では、リレーは２４Ｖ−ＤＣ電源により駆動される。
【００３７】
電動リレーは、制御部により制御される。制御部は、リレーの切替えを制御するコンピュータプログラムを実行する演算手段であってもよい。演算手段による制御を行うために、電動リレーは、リレーを演算手段に接続することができるようにする入力端子と出力端子とを備える。所定の実施形態では、電動リレーは上記のクロマトグラフィーモジュールの制御部により制御される。
【００３８】
所定の実施形態では、１つ以上の電気機械バルブにはソレノイドバルブを用いることができる。ソレノイドバルブは液体または気体と共に用いる電気機械バルブであり、ソレノイドに電流を流したり止めたりすることによりバルブを開閉させる。ソレノイドはコイルまたはワイヤであってもよい。特定の実施形態では、ソレノイドバルブにはガスソレノイドバルブを用いている。
【００３９】
真空ろ過が行われる特定の実施形態では、ろ過手段への真空供給の伝達を制御するためにガスソレノイドバルブが用いられる。ここでの実施形態では、ガスソレノイドは、ろ過手段と真空供給源との間に配置される。
【００４０】
例
制御手段の構成の一例を図１に表す。図１に示す制御手段は、単一の筐体内にある２４Ｖ−ＤＣ電源と、ＥＵＬリレーと、ガスソレノイドバルブとからなる。これらの構成要素は電気配線により接続されている。リレーは、端子Ｅ２およびＭを介して、ＡＫＴＡ（商標）精製装置のＰＩＮ６およびＰＩＮ５のそれぞれに接続されている。ガスソレノイドバルブは、ＥＵＬリレーの端子１１および１２に接続されている。
【００４１】
制御手段の構成の他の例を図２に表す。図２に示す制御手段は、単一の筐体内の２４Ｖ−ＤＣ電源と、４つのＥＵＬリレーと、４つのガスソレノイドバルブとからなる。これら構成要素は電気配線により接続されている。各リレーは、端子Ｍを介してＡＫＴＡ（商標）精製装置のＰＩＮ５に接続され、一方、端子Ｅ２を介してＡＫＴＡ（商標）精製装置のＰＩＮ６、ＰＩＮ７、ＰＩＮ８、またはＰＩＮ９に接続されている。各ガスソレノイドバルブは、ＥＵＬリレーのうちの１つのＥＵＬリレーの端子１１および１２に接続されており、したがって、ＡＫＴＡ（商標）精製装置により独立して制御される。
【００４２】
上記の構成により、ＵＮＩＣＯＲＮ（商標）コントロールソフトウェアがソレノイドバルブを制御することができるので、真空供給の伝達も制御できる。
【００４３】
上記のろ過モジュールおよびそれに含まれる制御手段について、本発明の別の態様を説明する。これらの態様によれば、ろ過モジュールおよび制御手段は本発明により提供され、ＦＰＬＣを基本としたシステム用に、また、ＦＰＬＣを基本としたシステムで用いられるように構成される。
【００４４】
ＡＫＴＡ真空制御ガジェット
ＡＫＴＡ真空制御ガジェットは、製品の品質および完全性を維持するようにシステム流動特性に影響することなく、ＡＫＴＡシステムからのカラム溶出液を滅菌できる方法を提供するものである。これにより、手作業を介入させる必要性が低下するので、ＡＫＴＡシステムを１日のうちより多くの時間にわたって利用することが可能となる。その効果を立証するため、ガジェットありでの運転とガジェットなしでの運転を比較する。
【００４５】
ガジェットなしでの運転
ガジェットなしの運転では、基本作業時間の開始時に、科学者によりシステムがセットアップされる。この場合、１サイクルは約８時間である。約７時間後に、科学者は分析または別の処理に供するための溶出液サンプルを取り出し、システムはサイクルを終了できる。この時点から翌朝まで、ＡＫＴＡシステムは稼動しない。
【００４６】
管理することなしにＡＫＴＡを夜通し運転させると、３サイクルが完了する。しかしながら、１回目のサイクルからの溶出液は常（室）温で１６時間保持され、２回目のサイクルからの溶出液は常温で８時間保持される。ＡＫＴＡは滅菌システムではないため、システムまたは実験室雰囲気からの汚染生物が取り込まれてしまう。高タンパク質水溶液は微生物の成長を促し、回収サンプルの変質に影響し、後の分析や他の処理に悪影響を及ぼす。
【００４７】
ガジェットありの運転
次に、ガジェットありの運転を検証する。以下の例は、ＡＫＴＡ精製システムを用いて行われた。基本作業時間の開始時に、科学者によりシステムがセットアップされる。約８時間のサイクルを３サイクル実施できる十分な材料が機械に供給される。７時間後、システムは１回目のサイクルからの溶出液を回収して、ガジェットによる制御のもと滅菌される。１５時間後、２回目のサイクルからの溶出液も同様に滅菌され、２３時間後に３回目のサイクルへと移る。１回目のサイクルからの溶出液は、常温で１６時間保持されるが、取り込まれた微生物は滅菌フィルターにより除去されているので、微生物が増殖することはなく、これは２回目のサイクルについても同様である。
【００４８】
要約
ガジェットなしでの運転は、ＡＫＴＡによる材料の生成を基本作業時間内に限定する。基本運転時間外で機械を運転させようとすると、生成される製品サンプルを微生物の増殖による汚染や損傷といった危険にさらすことになる。
【００４９】
ガジェットを用いて運転することにより、微生物の増殖の危険を伴うことなく自動クロマトグラフィーシステムを最大限に利用することができる。
【００５０】
上記の本発明の態様により、本発明の趣旨と範囲は、上記実施形態の全ての可能な組み合わせをカバーすると考えられる。更に、当業者であれば、多様な変更、修正、および改良が容易になされることが理解できる。こうした変更、修正、および改良は本明細書に開示された内容の一部であり、本発明の趣旨と範囲内であるのものとする。よって、前述の記載および図は一例にしかすぎない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド精製のための方法および自動化システムに関する。特に、本発明は、複合混合物からのポリペプチド精製に有用な、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に基づく方法および自動化システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）は、液体クロマトグラフィーの一種であり、複合混合物からタンパク質やＤＮＡなどの多量の多様な生体分子を分離および／又は精製するために、産業的にも学術的にも広く用いられている。ＦＰＬＣでは、液体の流れを利用して、対象の生体分子を含む可溶性成分の入った混合物を固定相に通過させることにより混合物を分離させ、これにより混合物の個々の成分が分離される。使用する溶出法により、混合物に含まれる複数の成分が互いに異なる速度で固定相を移動するか、または、固定相との特定のリガンド相互作用により保持され、これにより互いに分離する。
【０００３】
設計が単純であることから、ＦＰＬＣを自動化するシステムが開発された。ＦＰＬＣに基づく自動化システムは、特に、英国のＣｈａｌｆｏｎｔ Ｓｔ．ＧｉｌｅｓのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社により製造され、ＡＫＴＡ（一字目のＡは¨が付いた文字、以下同じ）（商標）という商品名で販売されている。
【０００４】
生体分子の精製は簡素化されるとはいえ、精製サイクルは現存のＦＰＬＣに基づくシステム上で実行されるようにのみ設定することができ、このシステムでは、対象の生体分子を含む生成されたフロースルーや溶出液は、一度システムを離れると短時間で回収することができる。生成されたフロースルーまたは溶出液が迅速に回収されず、それにより長期間露出されてしまう場合、それらが変質する危険性は高くなる。一度フロースルーや溶出液に変質が生じると、それらは使用できなくなり廃棄または大々的に浄化しなければならなくなり、時間もかかる上に費用もかかる。よって、フロースルーや溶出液の変質は回避しなければならない。フロースルーまたは溶出液の変質を回避するには、フロースルーや溶出液がシステムを離れる際にオペレータが必要となり、これにより、特に長い運転サイクルで、生産性を高めることのない余分な工数が増える。この結果、精製サイクルの実行を、フロースルーまたは溶出液がシステムを離れる時間がオペレータの通常の勤務時間内に収まるように設定され、これによりタイミングと実行させる精製サイクル数とが制限される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
こうしたことから、本発明の目的は、現存のＦＰＬＣに基づくシステムの所定の欠点を解消する手段を提供することであり、特に、その目的は、融通性および／または生産性が向上した方法およびシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によると、この目的は以下の項目１〜２３の主題により達成される。
項目１．ポリペプチドを精製するための高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に基づく方法であり、ａ）ポリペプチドを含む溶液を、固定相を含むクロマトグラフィー手段につけるステップと、ｂ）クロマトグラフィー手段である固定相に溶液を通過させることにより、溶液に含まれる他の分子からポリペプチドを分離するステップと、ｃ）クロマトグラフィー手段からフロースルーまたは溶出液中にポリペプチドを回収するステップと、ｄ）ろ過により再生したポリペプチドを含むフロースルーまたは溶出液を滅菌するステップと、を含む方法。
項目２．項目１のステップｂ）において、ポリペプチドは固定相と相互作用して固定相により保持され、ステップｃ）において、ポリペプチドは溶出により回収される項目１に記載の方法。
項目３．ステップｄ）において、ろ過は真空ろ過である項目１または２に記載の方法。
項目４．ステップａ）〜ｄ）のうち１つ以上のステップが自動的に制御される項目１〜３のいずれかに記載の方法。
項目５．固定相は、生体高分子、無機高分子、または合成高分子であり、これらの各々は任意で、それに結合する官能基を有してもよく、または、固定相はメンブレンまたはモノリスであることを特徴とする項目１〜４のいずれかに記載の方法。
項目６．項目１〜５のいずれかの方法によりポリペプチドを精製するために構成される高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）自動化システムであり、ｉ）クロマトグラフィーモジュールと、ｉｉ）クロマトグラフィーモジュールの次に配置されるろ過モジュールと、を備えるシステム。
項目７．ろ過モジュールは、クロマトグラフィーモジュールから回収したポリペプチドを含むフロースルーまたは溶出液を滅菌ろ過するための少なくとも１つのろ過手段と、少なくとも１つのろ過手段による滅菌ろ過を制御するための制御手段と、を備える項目６に記載のシステム。
項目８．ろ過モジュールは、クロマトグラフィーモジュールから回収したポリペプチドを含むフロースルーまたは溶出液を滅菌ろ過するための２つ以上のろ過手段と、各ろ過手段に対する、ろ過手段による滅菌ろ過を制御するための機能的に接続された制御手段と、を備える項目６または７に記載のシステム。
項目９．滅菌ろ過は真空をかけることにより行われる項目７または８に記載のシステム。
項目１０．制御手段は、演算手段による制御用の入力端子と出力端子とを任意で備える少なくとも１つの電動リレーと、少なくとも１つの電気機械バルブとを備え、電動リレーと電気機械バルブとは機能的に接続されている項目７〜９のいずれかに記載のシステム。
項目１１．各制御手段は、互いに機能的に接続されている電動リレーと電気機械バルブとを備える項目７〜１０のいずれかに記載のシステム。
項目１２．制御手段は、演算手段による制御用の入力端子と出力端子とを備える項目７〜１１のいずれかに記載のシステム。
項目１３．電気機械バルブは、真空供給の伝達を制御するために用いられる項目１０〜１２のいずれかに記載のシステム。
項目１４．電気機械バルブは前記電動リレーにより制御される項目１０〜１３のいずれかに記載のシステム。
項目１５．電気機械バルブはソレノイドバルブである項目１０〜１４のいずれかに記載のシステム。
項目１６．ろ過手段はフィルターカップである項目６〜１５のいずれかに記載のシステム。
項目１７．ろ過モジュールは、４つのろ過手段と４つの制御手段とを備える項目６〜１６のいずれかに記載のシステム。
項目１８．項目６〜７のいずれかに記載の自動クロマトグラフィーシステム用に構成されたろ過モジュールであって、ポリペプチドを含む水溶液を滅菌ろ過するための少なくとも１つのろ過手段と、少なくとも１つのろ過手段による前記滅菌ろ過を制御するための制御手段と、を備えるろ過モジュール。
項目１９．ポリペプチドを含む水溶液を滅菌ろ過するための２つ以上のろ過手段と、各ろ過手段に対する、ろ過手段による滅菌ろ過を制御するための機能的に接続された制御手段とを備える項目１８に記載のろ過モジュール。
項目２０．ろ過モジュールは、４つのろ過手段と４つの制御手段とを備えることで、常に１つのろ過手段が制御手段に機能的に接続されている項目１８または１９に記載のろ過モジュール。
項目２１．項目１８〜２０のいずれかのろ過モジュール用に構成された制御手段であって、演算手段による制御用の入力端子と出力端子とを任意で備える少なくとも１つの電動リレーと、少なくとも１つの電気機械バルブとを備え、電動リレーと電気機械バルブとは機能的に接続されている制御手段。
項目２２．演算手段による制御用の２つ以上の入力端子と２つ以上の出力端子とを任意で備える２つ以上の電動リレーと、２つ以上の電気機械バルブとを備え、電動リレーと電気機械バルブとは機能的に接続されている項目２１に記載の制御手段。
項目２３．制御手段は、４つのリレーと４つのバルブとを備えることで、常に１つのリレーが１つのバルブに機能的に接続されている項目２１または２２に記載の制御手段。
【０００７】
フロースルーまたは溶出液がクロマトグラフィー手段を離れると、フロースルーまたは溶出液をすぐに滅菌することにより、フロースルーまたは溶出液、または含まれる生体分子の変質の危険を伴うことなく長期に渡り確実に保存することができる（つまり、クロマトグラフィーの直後に実施されるインライン滅菌ろ過を用いる）。このように、本出願は、１つのクロマトグラフィーモジュールと多数の並列（つまり、２つ以上）のろ過手段を備える装置を対象とすることが好ましい。こうした装置の利点は、クロマトグラフィーモジュールの通過後に生成される溶出液が多数の並列のろ過手段を通過することにより（１つのクロマトグラフィー手段が１つのろ過手段にのみ接続されている装置と比較して）所定時間内に多量の液体をろ過できることである。このようにして得られたより高速のろ過により、精製されるタンパク質の変質の危険性が著しく低下する。
【０００８】
これにより、本発明の方法およびシステムにより、運転サイクルのタイミングの融通性を向上させることができる。無人で夜間のサイクルを行わせることにより経過時間および工数のいずれをも短縮することができ、それによって、システムの生産性を向上させられる。更に、真空ろ過を利用することは、圧力により駆動されるインラインフィルターを追加する場合のようにシステムの動的特性を変更することがない。これにより、システムの圧力上限が重要となるより高速のスループットが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、１つの電動ＥＵＬリレーと１つのガスソレノイドバルブとを備える本発明の制御手段を模式的に示す図である。
【図２】図２は、４つの電動ＥＵＬリレーからなるアレイと４つのガスソレノイドバルブとを備える本発明の別の制御手段を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
特記しない限り、「ポリペプチド」および「タンパク質」は少なくとも２つのアミノ酸からなる化合物を指す。「ポリペプチド」または「タンパク質」は、触媒活性または結合活性を有していてよい。「ポリペプチド」または「タンパク質」は、例えば、酵素またはドメインや単一ドメイン抗体などの抗体であってもよいが、これらに限定されない。本発明の目的では、両方の用語は置き換え可能に用いることができる。
【００１１】
特記しない限り、「アミノ酸」という用語は、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つの酸性基とを備えるいずれの有機化合物も含む。アミノ酸は、天然由来の化合物でもよく、合成物からなるものでもよい。アミノ酸は、少なくとも１つのアミノ基および／または少なくとも１つのカルボキシル基を含むことが好ましい。「アミノ酸」は、また、こうしたアミノ酸化合物に由来しペプチド結合または擬似ペプチド結合により隣接する残留物に結合される、ペプチドおよびタンパク質などの大きな分子に含まれる残留物を指す。
【００１２】
特記しない限り、「固定相」という用語は、溶液内の物質と相互作用する固体材料を指す。
【００１３】
特記しない限り、「溶出液」という用語は、クロマトグラフィー手段を離れ、固定相に保持される物質を固定相から除去または溶解した液体を指す。
【００１４】
特記しない限り、「フロースルー」は、固定相により保持される物質を固定相から除去または溶解せずに、クロマトグラフィー手段を通過して分離した液体を指す。
【００１５】
特記しない限り、「滅菌ろ過する」および「滅菌ろ過」とは、微生物（例えば、バクテリアや菌類など）の汚染物質をフロースルーや溶出液から排除することを指す。ろ過のプロセスでは、汚染物質がフィルターに保持されるので、汚染物質がフロースルーや溶出液に含まれる他の物質から分離される。
【００１６】
一態様において、本発明はポリペプチドを精製するためのＦＰＬＣに基づいた方法を提供する。この方法は、
ａ）ポリペプチドを含む溶液を、固定相を含むクロマトグラフィー手段につけるステップと、
ｂ）クロマトグラフィー手段である固定相に溶液を通過させることにより、溶液に含まれる他の分子からポリペプチドを分離するステップと、
ｃ）クロマトグラフィー手段からフロースルーまたは溶出液中にポリペプチドを回収するステップと、
ｄ）回収したポリペプチドを含むフロースルーまたは溶出液をろ過により滅菌するステップと、を含む。
【００１７】
本発明で使用されるクロマトグラフィー手段は、ポリペプチドおよびタンパク質を精製するためのカラムクロマトグラフィー、メンブレンクロマトグラフィーまたはモノリスクロマトグラフィーで通常用いられる手段である。こうした手段は、本技術分野では公知である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー手段は精製カラムが用いられる。本実施形態で使用される精製カラムは、固定相を含む多様な大きさおよび内径のチューブである。通常、チューブの大きさおよび内径はそれぞれ１ｃｍ〜３０ｃｍの範囲および０．１〜５ｃｍの範囲である。しかしながら、チューブの大きさは２ｍまで大きくしてもよい。チューブは、ガラスまたはステンレス鋼などの金属から作られてもよい。精製カラムは、Ｔｒｉｃｏｒｎ（商標）カラム、ＭｉｎｉＢｅａｄｓ（商標）カラム、ＲＥＳＯＵＲＣＥ（商標）カラム、ＨｉＴｒａｐ（商標）カラム、ＨｉＬｏａｄ（商標）カラム、ＨｉＰｒｅｐ（商標）カラム、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）カラム、およびＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標）カラムなど、市販の精製カラムから選択してもよいが、これらに限定されない。また、精製カラムは、最適な固定相を空のカラム本体へ詰めることにより実験装置内で製造されてもよい。市販のカラム本体の一例としては、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＸＫシリーズやＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｖａｎｔａｇｅシリーズがある。
【００１９】
固定相は、固体充填材であり、生体高分子、合成高分子、または無機高分子であってもよい。生体高分子は、セルロース、デキストラン、またはアガロースから選択されてもよい。合成高分子は、ポリアクリルアミド、メタクリレート、またはポリビニルベンゼン／ポリスチレンから選択されてもよい。無機高分子は、シリカ、ヒドロキシアパタイト、または多孔性ガラスビーズであってもよい。必要に応じ、充填材には、更に、ポリペプチドとの特定相互作用を可能にする官能基が結合していてもよい。こうした官能基は、第四ヒドロキシプロピルジエチルアミノエチル基（ＱＡＥ）、第四トリメチルアミノエチル基（Ｑ）、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）、カルボキシメチル基（ＣＭ）、スルホメチル基（Ｓ）、またはスルホプロピル基（ＳＰ）であってもよいが、これらに限定されない。官能基は、また、対象のポリペプチドの特定の結合パートナーなど、群特異的または単一特異的なリガンドであってもよく、例えば、抗体の場合は抗原であり、またはその逆であってもよい。
【００２０】
他の実施形態では、クロマトグラフィー手段は、固定相としてメンブレンを含む容器またはカラムを用いる。カラムは、上記のようにチューブ状であってもよい。
【００２１】
クロマトグラフィーに用いられるメンブレンは、当該技術分野では周知のものである。メンブレンは、１層以上、例えば２層、３層、または４層からなるものであっても良いが、これらに限定されない。メンブレンのマトリクス材は、セルロース、修正セルロース、架橋セルロース、ニトロセルロースや、ナイロン、ポリビニルクロライド（ＰＶＣ）またはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）などのポリアミドであってもよいが、これらに限定されない。
【００２２】
他の実施形態では、クロマトグラフィー手段は、固定相としてモノリスを含む容器またはカラムを用いる。カラムは、上記のようにチューブ状であってもよい。
【００２３】
クロマトグラフィーに用いられるモノリスは、当該技術分野では周知のものである。
【００２４】
所定の実施形態において、ステップｄ）のろ過は真空ろ過である。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ＦＰＬＣに基づいた方法のための自動化システムを提供する。特に、本発明は、上記に詳述した方法によりポリペプチドを精製するために構成された自動ＦＰＬＣシステムを提供する。本発明のシステムは、クロマトグラフィーモジュールとろ過モジュールとを備える。ろ過モジュールは、クロマトグラフィーモジュールの後に配置される。
【００２６】
本発明のシステムのクロマトグラフィーモジュールは、クロマトグラフィー手段と、ポンプと、検出システムと、制御部とを備える。また、本発明のクロマトグラフィーモジュールは、オートサンプラーおよび／またはフラクションコレクターを備えてもよい。本発明では、クロマトグラフィーモジュールとして、英国のＣｈａｌｆｒｏｎｔ Ｓｔ．ＧｉｌｅｓのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社が製造し提供するＡＫＴＡ（商標）ＦＰＬＣ装置を用いてもよい。
【００２７】
クロマトグラフィー手段は上記の通りである。
【００２８】
ポンプはシステム内の液体を一定の流量にすることを可能にする。カラムクロマトグラフィーモジュールは、２つ以上のポンプ、例えば、２つ、３つ、または４つのポンプを備えても良いが、これらに限定されない。ポンプは、蠕動ポンプであってもよい。ポンプは、また、ダイヤフラムポンプ、チェックピストンポンプ、またはローブポンプであってもよい。ポンプの流速は、０．００１〜１００ｍｌ／ｍｉｎの範囲であってもよい。
【００２９】
検出システムは、クロマトグラフィー手段を離れる分子を検出することができる。検出システムは、ＵＶ分光光度計であってもよい。または、検出システムは、伝導性フローセルまたはｐＨ電極であってもよい。
【００３０】
制御部は、各システムコンポーネントの自動制御を可能とする。制御部は、各システムコンポーネントを制御するコンピュータプログラムを実行する演算手段であってもよい。演算手段は、コンピュータのプロセッサにより実行されるコンピュータプログラムをロードしたパーソナルコンピュータであってもよい。演算手段は、また、ネットワークシンクライアントであってもよい。このコンピュータプログラムは、英国ＣｈａｌｆｒｏｎｔのＳｔ．ＧｉｌｅｓのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手可能なＵＮＩＣＯＲＮ（商標）コントロールソフトウェアであってもよい。本発明ではＵＮＩＣＯＲＮ（商標）コントロールソフトウェアであることが好ましい。
【００３１】
本発明のシステムにおけるろ過モジュールは、クロマトグラフィーモジュールから回収されるフロースルーや溶出液を滅菌ろ過するための少なくとも１つのろ過手段と、少なくとも１つのろ過手段による滅菌ろ過を制御するための制御手段とを備える。ろ過モジュールは、２つ以上のろ過手段および／または２つ以上の制御手段を備えても良く、例えば、２つ、３つ、または４つのろ過手段および／または２つ、３つ、または４つの制御手段を備えてもよいが、これらに限定されない。
【００３２】
ろ過手段により、フロースルーや溶出液を滅菌ろ過することができる。つまり、微生物などの汚染物質がフロースルーや溶出液から除去される。ろ過手段は、フィルターを含む装置である。本発明の一実施形態では、ろ過手段がフィルターカップであり、真空駆動ボトルトップフィルターとも呼ばれる。フィルターカップは、当該技術分野では公知である。フィルターカップを用いることにより、移動を必要とすることなくフロースルーや溶出液をすぐに回収することができ、これにより、滅菌ろ過することができる。フィルターの細孔のサイズは、０．４５〜０．１μｍの範囲であって、例えば、０．４５μｍ、０．２２μｍ、または０．１μｍであってもよいが、これらに限定されない。通常、０．４５〜０．１μｍの範囲のサイズの細孔によってバクテリアなどの微生物が留められることが期待される。特定の実施形態では、フィルター細孔のサイズは０．２２μｍである。
【００３３】
詳述したように、滅菌ろ過は、真空によって駆動されてもよい。この場合、ろ過手段を減圧させ、負圧をかけることにより液体および空気をフィルターに通過させる。これは、フィルターの、ろ過される液体を保持する側と反対側に位置する、ろ過手段上の真空入口を介して真空を供給することにより達成される。真空は真空供給源により生成され、真空供給源はオンデマンド真空ポンプまたはパイプ式真空ポンプであってもよい。ろ過手段および真空供給源は、ガス管および／またはシリコン実験管で接続されている。
【００３４】
本発明の制御手段は、ろ過手段による滅菌ろ過の制御を可能にする。制御手段は、少なくとも１つの電動リレーまたは半導体リレーまたはソリッドステートの同等物、および少なくとも１つの電気機械バルブを備え、両者は機能的に接続されている。電動リレーと電気機械バルブとは、電気回路を介して機能的に接続されている。電気回路は、ヒステリシス設定を用いる高入力インピーダンス電圧検知リレーからなるものでもよい。
【００３５】
制御手段は、更に２つ以上の電動リレーおよび／または２つ以上の電気機械バルブ、例えば、２つ、３つ、または４つの電動リレーおよび／または２つ、３つ、または４つの電気機械バルブを備えてもよいが、これらに限定されない。所定の実施形態では、本発明の制御手段は、４つのリレーからなるアレイを備える。
【００３６】
電動リレーは、低出力リレーであってもよい。電動リレーは、リレーとして同じ筐体内に設置される専用の２４Ｖ−ＤＣ電源により駆動されてもよい。所定の実施形態では、リレーは２４Ｖ−ＤＣ電源により駆動される。
【００３７】
電動リレーは、制御部により制御される。制御部は、リレーの切替えを制御するコンピュータプログラムを実行する演算手段であってもよい。演算手段による制御を行うために、電動リレーは、リレーを演算手段に接続することができるようにする入力端子と出力端子とを備える。所定の実施形態では、電動リレーは上記のクロマトグラフィーモジュールの制御部により制御される。
【００３８】
所定の実施形態では、１つ以上の電気機械バルブにはソレノイドバルブを用いることができる。ソレノイドバルブは液体または気体と共に用いる電気機械バルブであり、ソレノイドに電流を流したり止めたりすることによりバルブを開閉させる。ソレノイドはコイルまたはワイヤであってもよい。特定の実施形態では、ソレノイドバルブにはガスソレノイドバルブを用いている。
【００３９】
真空ろ過が行われる特定の実施形態では、ろ過手段への真空供給の伝達を制御するためにガスソレノイドバルブが用いられる。ここでの実施形態では、ガスソレノイドは、ろ過手段と真空供給源との間に配置される。
【００４０】
例
制御手段の構成の一例を図１に表す。図１に示す制御手段は、単一の筐体内にある２４Ｖ−ＤＣ電源と、ＥＵＬリレーと、ガスソレノイドバルブとからなる。これらの構成要素は電気配線により接続されている。リレーは、端子Ｅ２およびＭを介して、ＡＫＴＡ（商標）精製装置のＰＩＮ６およびＰＩＮ５のそれぞれに接続されている。ガスソレノイドバルブは、ＥＵＬリレーの端子１１および１２に接続されている。
【００４１】
制御手段の構成の他の例を図２に表す。図２に示す制御手段は、単一の筐体内の２４Ｖ−ＤＣ電源と、４つのＥＵＬリレーと、４つのガスソレノイドバルブとからなる。これら構成要素は電気配線により接続されている。各リレーは、端子Ｍを介してＡＫＴＡ（商標）精製装置のＰＩＮ５に接続され、一方、端子Ｅ２を介してＡＫＴＡ（商標）精製装置のＰＩＮ６、ＰＩＮ７、ＰＩＮ８、またはＰＩＮ９に接続されている。各ガスソレノイドバルブは、ＥＵＬリレーのうちの１つのＥＵＬリレーの端子１１および１２に接続されており、したがって、ＡＫＴＡ（商標）精製装置により独立して制御される。
【００４２】
上記の構成により、ＵＮＩＣＯＲＮ（商標）コントロールソフトウェアがソレノイドバルブを制御することができるので、真空供給の伝達も制御できる。
【００４３】
上記のろ過モジュールおよびそれに含まれる制御手段について、本発明の別の態様を説明する。これらの態様によれば、ろ過モジュールおよび制御手段は本発明により提供され、ＦＰＬＣを基本としたシステム用に、また、ＦＰＬＣを基本としたシステムで用いられるように構成される。
【００４４】
ＡＫＴＡ真空制御ガジェット
ＡＫＴＡ真空制御ガジェットは、製品の品質および完全性を維持するようにシステム流動特性に影響することなく、ＡＫＴＡシステムからのカラム溶出液を滅菌できる方法を提供するものである。これにより、手作業を介入させる必要性が低下するので、ＡＫＴＡシステムを１日のうちより多くの時間にわたって利用することが可能となる。その効果を立証するため、ガジェットありでの運転とガジェットなしでの運転を比較する。
【００４５】
ガジェットなしでの運転
ガジェットなしの運転では、基本作業時間の開始時に、科学者によりシステムがセットアップされる。この場合、１サイクルは約８時間である。約７時間後に、科学者は分析または別の処理に供するための溶出液サンプルを取り出し、システムはサイクルを終了できる。この時点から翌朝まで、ＡＫＴＡシステムは稼動しない。
【００４６】
管理することなしにＡＫＴＡを夜通し運転させると、３サイクルが完了する。しかしながら、１回目のサイクルからの溶出液は常（室）温で１６時間保持され、２回目のサイクルからの溶出液は常温で８時間保持される。ＡＫＴＡは滅菌システムではないため、システムまたは実験室雰囲気からの汚染生物が取り込まれてしまう。高タンパク質水溶液は微生物の成長を促し、回収サンプルの変質に影響し、後の分析や他の処理に悪影響を及ぼす。
【００４７】
ガジェットありの運転
次に、ガジェットありの運転を検証する。以下の例は、ＡＫＴＡ精製システムを用いて行われた。基本作業時間の開始時に、科学者によりシステムがセットアップされる。約８時間のサイクルを３サイクル実施できる十分な材料が機械に供給される。７時間後、システムは１回目のサイクルからの溶出液を回収して、ガジェットによる制御のもと滅菌される。１５時間後、２回目のサイクルからの溶出液も同様に滅菌され、２３時間後に３回目のサイクルへと移る。１回目のサイクルからの溶出液は、常温で１６時間保持されるが、取り込まれた微生物は滅菌フィルターにより除去されているので、微生物が増殖することはなく、これは２回目のサイクルについても同様である。
【００４８】
要約
ガジェットなしでの運転は、ＡＫＴＡによる材料の生成を基本作業時間内に限定する。基本運転時間外で機械を運転させようとすると、生成される製品サンプルを微生物の増殖による汚染や損傷といった危険にさらすことになる。
【００４９】
ガジェットを用いて運転することにより、微生物の増殖の危険を伴うことなく自動クロマトグラフィーシステムを最大限に利用することができる。
【００５０】
上記の本発明の態様により、本発明の趣旨と範囲は、上記実施形態の全ての可能な組み合わせをカバーすると考えられる。更に、当業者であれば、多様な変更、修正、および改良が容易になされることが理解できる。こうした変更、修正、および改良は本明細書に開示された内容の一部であり、本発明の趣旨と範囲内であるのものとする。よって、前述の記載および図は一例にしかすぎない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ポリペプチドを含む溶液を、固定相を含むクロマトグラフィー手段につけるステップと、
ｂ）前記クロマトグラフィー手段の前記固定相に前記溶液を通過させることにより、前記溶液に含まれる他の分子から前記ポリペプチドを分離するステップと、
ｃ）前記クロマトグラフィー手段からフロースルーまたは溶出液中に前記ポリペプチドを回収するステップと、
ｄ）回収した前記ポリペプチドを含む前記フロースルーまたは溶出液をろ過により滅菌するステップと、
を含むポリペプチドを精製するための高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に基づく方法。
【請求項２】
前記ステップｂ）において、前記ポリペプチドは前記固定相と相互作用して前記固定相に保持され、
前記ステップｃ）において、前記ポリペプチドは溶出により回収される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップｄ）で、前記ろ過は真空ろ過である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップａ）からｄ）のうち１つ以上のステップが自動的に制御される請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記固定相は、生体高分子、無機高分子、または合成高分子であり、該生体高分子、無機高分子、または合成高分子のそれぞれは、当該生体高分子、無機高分子、または合成高分子に結合する官能基を任意で有してもよく、または、前記固定相はメンブレンまたはモノリスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ｉ）クロマトグラフィーモジュールと、
ｉｉ）前記クロマトグラフィーモジュールの次に配置されるろ過モジュールと、
を備える請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によるポリペプチドを精製するために構成された高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）自動化システム。
【請求項７】
前記ろ過モジュールは、前記クロマトグラフィーモジュールから回収した前記ポリペプチドを含む前記フロースルーまたは溶出液を滅菌ろ過するための少なくとも１つのろ過手段と、前記少なくとも１つのろ過手段による前記滅菌ろ過を制御するための制御手段と、を備える請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記ろ過モジュールは、前記クロマトグラフィーモジュールから回収した前記ポリペプチドを含む前記フロースルーまたは溶出液を滅菌ろ過するための２つ以上のろ過手段と、各ろ過手段に対する、前記ろ過手段による前記滅菌ろ過を制御するための機能的に接続された制御手段と、を備える請求項６または７に記載のシステム。
【請求項９】
前記滅菌ろ過は真空をかけることにより行われる請求項７または８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記制御手段は、演算手段による制御用の入力端子と出力端子とを任意で備える少なくとも１つの電動リレーと、少なくとも１つの電気機械バルブとを備え、前記電動リレーと前記電気機械バルブとは機能的に接続されている請求項７〜９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１１】
各制御手段は、互いに機能的に接続されている電動リレーと電気機械バルブとを備える請求項７〜１０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記制御手段は、演算手段による制御用の入力端子と出力端子とを備える請求項７〜１１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１３】
前記電気機械バルブは、真空供給の伝達を制御するために用いられる請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記電気機械バルブは前記電動リレーにより制御される請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５】
前記電気機械バルブはソレノイドバルブである請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１６】
前記ろ過手段はフィルターカップである請求項６〜１５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記ろ過モジュールは、４つのろ過手段と４つの制御手段とを備える請求項６〜１６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１８】
ポリペプチドを含む水溶液を滅菌ろ過するための少なくとも１つのろ過手段と、前記少なくとも１つのろ過手段による前記滅菌ろ過を制御するための制御手段と、
を備える請求項６〜１７のいずれか一項に記載の自動クロマトグラフィーシステム用に構成されるろ過モジュール。
【請求項１９】
前記ポリペプチドを含む水溶液を滅菌ろ過するための２つ以上のろ過手段と、該各ろ過手段に対する、該ろ過手段による前記滅菌ろ過を制御するための機能的に接続された制御手段とを備える請求項１８に記載のろ過モジュール。
【請求項２０】
前記ろ過モジュールは、４つのろ過手段と４つの制御手段とを備えることで、常に１つのろ過手段が制御手段に機能的に接続されている請求項１８または１９に記載のろ過モジュール。
【請求項２１】
演算手段による制御用の入力端子と出力端子とを任意で備える少なくとも１つの電動リレーと、少なくとも１つの電気機械バルブとを備え、前記電動リレーと前記電気機械バルブとは機能的に接続される請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のろ過モジュール用に構成される制御手段。
【請求項２２】
演算手段による制御用の２つ以上の入力端子と２つ以上の出力端子とを任意で備える２つ以上の電動リレーと、２つ以上の電気機械バルブとを備え、前記電動リレーと前記電気機械バルブとは機能的に接続されている請求項２１に記載の制御手段。
【請求項２３】
前記制御手段は、４つのリレーと４つのバルブとを備えることで、常に１つのリレーが１つのバルブに機能的に接続されている請求項２１または２２に記載の制御手段。
【請求項１】
ａ）ポリペプチドを含む溶液を、固定相を含むクロマトグラフィー手段につけるステップと、
ｂ）前記クロマトグラフィー手段の前記固定相に前記溶液を通過させることにより、前記溶液に含まれる他の分子から前記ポリペプチドを分離するステップと、
ｃ）前記クロマトグラフィー手段からフロースルーまたは溶出液中に前記ポリペプチドを回収するステップと、
ｄ）回収した前記ポリペプチドを含む前記フロースルーまたは溶出液をろ過により滅菌するステップと、
を含むポリペプチドを精製するための高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に基づく方法。
【請求項２】
前記ステップｂ）において、前記ポリペプチドは前記固定相と相互作用して前記固定相に保持され、
前記ステップｃ）において、前記ポリペプチドは溶出により回収される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップｄ）で、前記ろ過は真空ろ過である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップａ）からｄ）のうち１つ以上のステップが自動的に制御される請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記固定相は、生体高分子、無機高分子、または合成高分子であり、該生体高分子、無機高分子、または合成高分子のそれぞれは、当該生体高分子、無機高分子、または合成高分子に結合する官能基を任意で有してもよく、または、前記固定相はメンブレンまたはモノリスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ｉ）クロマトグラフィーモジュールと、
ｉｉ）前記クロマトグラフィーモジュールの次に配置されるろ過モジュールと、
を備える請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によるポリペプチドを精製するために構成された高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）自動化システム。
【請求項７】
前記ろ過モジュールは、前記クロマトグラフィーモジュールから回収した前記ポリペプチドを含む前記フロースルーまたは溶出液を滅菌ろ過するための少なくとも１つのろ過手段と、前記少なくとも１つのろ過手段による前記滅菌ろ過を制御するための制御手段と、を備える請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記ろ過モジュールは、前記クロマトグラフィーモジュールから回収した前記ポリペプチドを含む前記フロースルーまたは溶出液を滅菌ろ過するための２つ以上のろ過手段と、各ろ過手段に対する、前記ろ過手段による前記滅菌ろ過を制御するための機能的に接続された制御手段と、を備える請求項６または７に記載のシステム。
【請求項９】
前記滅菌ろ過は真空をかけることにより行われる請求項７または８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記制御手段は、演算手段による制御用の入力端子と出力端子とを任意で備える少なくとも１つの電動リレーと、少なくとも１つの電気機械バルブとを備え、前記電動リレーと前記電気機械バルブとは機能的に接続されている請求項７〜９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１１】
各制御手段は、互いに機能的に接続されている電動リレーと電気機械バルブとを備える請求項７〜１０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記制御手段は、演算手段による制御用の入力端子と出力端子とを備える請求項７〜１１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１３】
前記電気機械バルブは、真空供給の伝達を制御するために用いられる請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記電気機械バルブは前記電動リレーにより制御される請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５】
前記電気機械バルブはソレノイドバルブである請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１６】
前記ろ過手段はフィルターカップである請求項６〜１５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記ろ過モジュールは、４つのろ過手段と４つの制御手段とを備える請求項６〜１６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１８】
ポリペプチドを含む水溶液を滅菌ろ過するための少なくとも１つのろ過手段と、前記少なくとも１つのろ過手段による前記滅菌ろ過を制御するための制御手段と、
を備える請求項６〜１７のいずれか一項に記載の自動クロマトグラフィーシステム用に構成されるろ過モジュール。
【請求項１９】
前記ポリペプチドを含む水溶液を滅菌ろ過するための２つ以上のろ過手段と、該各ろ過手段に対する、該ろ過手段による前記滅菌ろ過を制御するための機能的に接続された制御手段とを備える請求項１８に記載のろ過モジュール。
【請求項２０】
前記ろ過モジュールは、４つのろ過手段と４つの制御手段とを備えることで、常に１つのろ過手段が制御手段に機能的に接続されている請求項１８または１９に記載のろ過モジュール。
【請求項２１】
演算手段による制御用の入力端子と出力端子とを任意で備える少なくとも１つの電動リレーと、少なくとも１つの電気機械バルブとを備え、前記電動リレーと前記電気機械バルブとは機能的に接続される請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のろ過モジュール用に構成される制御手段。
【請求項２２】
演算手段による制御用の２つ以上の入力端子と２つ以上の出力端子とを任意で備える２つ以上の電動リレーと、２つ以上の電気機械バルブとを備え、前記電動リレーと前記電気機械バルブとは機能的に接続されている請求項２１に記載の制御手段。
【請求項２３】
前記制御手段は、４つのリレーと４つのバルブとを備えることで、常に１つのリレーが１つのバルブに機能的に接続されている請求項２１または２２に記載の制御手段。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１３−５０４７５０（Ｐ２０１３−５０４７５０Ａ）
【公表日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２８３６８（Ｐ２０１２−５２８３６８）
【出願日】平成２２年９月１０日（２０１０．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６３２９５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２９８９８
【国際公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（５１１１９３３５２）ロンザ バイオロジクス ピーエルシー (3)
【公表日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１０日（２０１０．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６３２９５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２９８９８
【国際公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（５１１１９３３５２）ロンザ バイオロジクス ピーエルシー (3)
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