マイクロ液滴の作製方法
【課題】安定かつ物理的ストレスに耐え得る微細なスケールのラフトドメイン構造を備えたマイクロ液滴の作製方法を安価にかつ高い作製効率で提供する。
【解決手段】マイクロ液滴の作製方法は、少なくとも三種類の成分を含んだ脂質混合物を容器内で有機溶媒に溶解させる工程と、有機溶媒を揮発させ、容器内に脂質フィルムを形成する工程と、容器内にさらに油を加え、超音波処理を施し脂質フィルムを油に溶解させる工程と、容器内に水を加え、油と水とを攪拌する工程と、を含む。少なくとも三種類の成分は、飽和脂質と不飽和脂質とコレステロールとを含み、油は、オリーブオイル又は／及びドデカンであることを特徴とする。
【解決手段】マイクロ液滴の作製方法は、少なくとも三種類の成分を含んだ脂質混合物を容器内で有機溶媒に溶解させる工程と、有機溶媒を揮発させ、容器内に脂質フィルムを形成する工程と、容器内にさらに油を加え、超音波処理を施し脂質フィルムを油に溶解させる工程と、容器内に水を加え、油と水とを攪拌する工程と、を含む。少なくとも三種類の成分は、飽和脂質と不飽和脂質とコレステロールとを含み、油は、オリーブオイル又は／及びドデカンであることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラフトドメイン構造（脂質ラフト）を備えたマイクロ液滴の作製方法に関し、特に、安定かつ物理的ストレスに耐えうる微細なスケールのラフトドメイン構造（脂質ラフト）を備えたマイクロ液滴の作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内の様々な膜構造を総称して呼ばれる「生体膜」は、従来、静的構造体と考えられていたが、現在では膜構造が脂質とタンパク質からなる流動的な特徴をもつことが認められている。しかしながら、この生体膜を構成する脂質の構造的特徴が動的性質にどれ程関与しているかは十分に解明されていない。
【０００３】
ところで、生体膜の主成分であるリン脂質は親水基の頭部と疏水基の尾部をもつ両親媒性分子であり、水溶液中で自己集合してミセルや二分子膜構造（リポソーム）を自発的に形成する。ここで、リポソームはリン脂質等の脂質二分子膜によって形成され、その内部に水相を閉じ込めたカプセル構造を有する。このようにリポソームは、生体膜に近似した組成・構造を備えていることから、種々の生体物質や毒素との相互作用を検討するために、生体モデル膜として研究に用いられてきた。
【０００４】
生体膜モデルにリポソームを用いた研究報告として、例えば、非特許文献１には、ラフトドメイン構造を備えたリポソームの作製方法や刺激物質に対する変形応答が開示されている。また、非特許文献２には、生体膜におけるリン脂質の非対称分布に着目し、非対称ラフトドメイン構造を有するリポソームの作製方法が開示されている。
【０００５】
しかしながら、生体膜モデルとしてリポソームを用いる場合には、以下のような問題が挙げられる。
（１）生理的塩濃度でのリポソーム作製率が低い。
脂質分子同士が強く結合しているため、脂質の塊を形成し易い。そのため、脂質分子は水にうまく分散できず、生理的塩濃度ではリポソームが作製しにくい。
（２）浸透圧等の物理的ストレスにより、リポソームが変形・崩壊し易い。
また、リポソームは５ｎｍ程度の非常に薄い膜構造をしているため、弾性率が十分高くない。従って、浸透圧等の物理的ストレスにより、リポソームが容易に変形・崩壊してしまう。
（３）リポソーム膜面上のラフトドメイン構造は不安定でサイズが大きくなってしまう。一方、実際の細胞膜上のラフトドメイン構造のサイズは小さいまま安定である。
リポソーム膜は、後述するマイクロ液滴膜面に観察されるような裏打ち補強構造（タンパク質のモノマー分子が集合してフィラメント化し、膜に吸着したもの）がないため、非常に流動性が高い。また、脂質分子はブラウン運動により膜面内を拡散しており、脂質分子の会合体であるラフトドメイン構造も２次元膜面内をランダムに動き回り、衝突や融合を繰り返すため、ラフトドメイン構造のサイズが大きくなる。
（４）リポソームを用いた研究・解析手法は、解析目的の試薬を多量に要し、コストが掛る。
リポソームと検出物質（例えば毒性物質）との相互作用を解析実験する際には、リポソームを分散させるために多量の水溶液を必要とし、かつ、この水溶液全体に毒性物質を溶かす必要があるため、実際の解析で検出される量以上の毒性物質（サンプル）量が必要となってしまう。
【０００６】
このように課題の多いリポソームを用いずに生体膜モデルを作製しようとするアプローチもある。例えば、非特許文献３に示すように、油相中におけるマイクロ液滴により生体膜モデルを作製する方法が提案されている。
【０００７】
ここで、マイクロ液滴とは、大きさがマイクロメートル以下の水／油（Ｗ／Ｏ）エマルション（分散質・分散媒が共に液体である分散系溶液であり、乳濁液とも呼ばれる）を意味し、リポソームと比較し、目的の水溶液を油に乳化させる手法により生理的縁濃度の溶液を容易に含むことができる。また、水・油界面に単分子膜を形成することにより表面張力が強く、安定し、物理的ストレスに耐え得る構造となる。
【０００８】
非特許文献３において、マイクロ液滴は、一種類の不飽和脂質（例えば、ジオレオイルフォスフォコリン）を溶かしたミネラルオイルに水溶液を分散させることで形成されている。
【０００９】
しかしながら、非特許文献３に記載のマイクロ液滴を含め従来のマイクロ液滴では、生体膜の重要な構造的特徴であるラフトドメイン構造を再現することが出来なかった。従って、従来のマイクロ液滴は、それ自体で、リポソームに並び又は勝る生体膜モデルとして利用し得るものではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔｓｕｔｏｍｕ Ｈａｍａｄａ 他６名，“Ｄｙｎａｍｉｃ−Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒａｆｔ−Ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｇｉａｎｔ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ”，ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＹＳＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｂ，第１１１巻，１０８５３−１０８５７，２００７年
【非特許文献２】Ｔｓｕｔｏｍｕ Ｈａｍａｄａ 他５名，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｃｅｌｌ−Ｓｉｚｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ Ｌｉｐｉｄ−Ｃｏａｔｅｄ Ｗａｔｅｒ−ｉｎ−Ｏｉｌ Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔｓ”，ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＹＳＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｂ，第１１２巻，１４６７８−１４６８１，２００８年
【非特許文献３】Ｍ．Ｈａｓｅ 他４名，“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ−Ｓｉｚｅｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−Ｃｏａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ａｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｏｒｓ”，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第２３巻、３４８−３５２，２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、従来のリポソームが有する欠点を排除した生体膜モデルの作製方法を提供することを目的とする。すなわち、安定かつ物理的ストレスに耐え得る微細なスケールのラフトドメイン構造を備えたマイクロ液滴の作製方法を安価にかつ高い作製効率で提供することを目的とする。
【００１２】
本願発明者は、ラフトドメイン構造を形成するために脂質を少なくとも３種類用いること、及び、該脂質を溶解させる油を適切な油に選択することで、効率よく安定したラフトドメイン構造がマイクロ液滴膜面に形成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
すなわち、本発明に係るマイクロ液滴の作製方法は、
少なくとも三種類の成分を含んだ脂質混合物を容器内で有機溶媒に溶解させる工程と、
前記有機溶媒を揮発させ、前記容器内に脂質フィルムを形成する工程と、
前記容器内にさらに油を加え、超音波処理を施し前記脂質フィルムを前記油に溶解させる工程と、
前記容器内に水を加え、前記油と前記水とを攪拌する工程と、
を含み、かつ、
前記少なくとも三種類の成分は、飽和脂質と不飽和脂質とコレステロールとを含み、
前記油は、オリーブオイル又は／及びドデカンであることを特徴とする。
【００１４】
これにより、安定で物理的ストレスに耐え得るラフトドメイン構造を備えたマイクロ液滴を作製することが可能となる。ここで、飽和脂質とは構成脂肪酸の炭素鎖が飽和結合をなす脂質のことを意味し、通常、相転移温度が高い性質を有する。一方、不飽和脂質とは構成脂肪酸の炭素鎖が不飽和結合を含む脂質のことを意味し、通常、相転移温度が低い性質を有する。
【００１５】
さらに、本発明に係るマイクロ液滴の作製方法においては、前記飽和脂質が飽和リン脂質であり、前記不飽和脂質が不飽和リン脂質であることが好ましい。
【００１６】
これにより、より人体の生体膜モデルに近いラフトドメイン構造を備えたマイクロ液滴を作製することが可能となる。
【００１７】
さらに、前記容器内に水を加え、攪拌する工程において、さらに毒性タンパク質又は金属微粒子を加え、前記油と水溶液とを攪拌することが好ましい。
【００１８】
これにより、毒性タンパク質や化粧品等に使用され得る金属微粒子が生体膜へ与える影響を評価可能なマイクロ液滴を作製することが可能となる。
【００１９】
さらに、前記脂質混合物がさらに糖脂質を含むことが好ましい。
【００２０】
これにより、毒性タンパク質や化粧品等に使用され得る金属微粒子とラフトドメイン構造に内在する糖脂質との関連性を評価可能なマイクロ液滴を作製することが可能となる。
【００２１】
さらに、前記容器内に水を加え、攪拌する工程において、前記油と前記水または前記水溶液との体積比が、８５：１５〜９９：１の割合となるように前記水又は前記水溶液を加えることが好ましい。
【００２２】
これにより、より安定し、所望のサイズ（マイクロメートル及びナノメートルのサイズ）および数に調整されたラフトドメイン構造を備えた脂質とのマイクロ液滴を作製することが可能となる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のマイクロ液滴の作製方法によれば、脂質成分に飽和脂質、不飽和脂質、コレステロールの少なくとも三種類用意した脂質混合物からなる脂質フィルムを投与し、Ｗ／Ｏ（Ｗａｔｅｒ／Ｏｉｌ）エマルションを構成する油にオリーブオイル又は／及びドデカンを利用するため、マイクロ液滴膜面上に脂質ラフト（すなわち実際の生体膜と略同等な微細スケールのラフトドメイン構造）が効率よく形成される。なお、本発明においては三種類の脂質を投与していれば、その成分比をコントロールしなくとも、高い割合でラフトドメイン構造を膜面上に形成することができる。
【００２４】
また、本発明では、二分子膜構造である従来のリポソームではなく、単分子膜のマイクロ液滴が作製されるため、リポソームが有していた従来の問題を回避することができる。すなわち、本発明の作製方法によれば、生理的塩濃度におけるマイクロ液滴の作製率が高い。また、浸透圧等の物理的ストレスにより、マイクロ液滴が変形・崩壊しにくい。さらに、高粘性の油により膜面が補強されるため、膜面上に形成されるラフトドメイン構造のサイズは数時間経過しても小さいまま、動かず、壊れず安定に存在する。
【００２５】
さらに、リポソームを使用した場合に比べて、油相に対する水相の量（試験物質、例えば毒性タンパク質、を含んだ水溶液の量）を二十分の一程度まで低減することが可能となるため、細胞膜モデルを使用した試験コスト（例えば、毒素等の試薬サンプルのコスト）を大幅に低減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明により作製されたマイクロ液滴の概略を示した図である。
【図２】脂質成分比とラフトドメイン構造占有領域との関係を示したグラフである。
【図３】本発明のマイクロ液滴を利用した毒性物質結合性評価結果を示した図である（コレラ毒素の場合）。
【図４】本発明のマイクロ液滴を利用した毒性物質結合性評価結果を示した図である（アミロイドペプチドの場合）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を図面に示す実施の形態に基づき説明するが、本発明は、下記の具体的な実施形態に何等限定されるものではない。
【００２８】
まず、本発明に係るマイクロ液滴の作製方法について工程毎に説明する。
（工程１）少なくとも三種類の成分を含んだ脂質混合物を容器（例えば、ガラス容器）内で有機溶媒に溶解させる。
【００２９】
ここで、少なくとも三種類の成分は、飽和脂質、不飽和脂質、及びコレステロールを含む。不飽和脂質には、例えばジオレオイルフォスフォコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルフォスフォグリセロール（ＤＯＰＧ）、パルミトイルオレオイルフォスフォコリン（ＰＯＰＣ）等の不飽和リン脂質（一般的に相転移温度の低い脂質）が挙げられる。不飽和リン脂質以外には、不飽和糖脂質が挙げられる。
【００３０】
一方、飽和脂質には、例えばジパルミトイルフォスフォコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルフォスフォエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、スフィンゴミエリン等の飽和リン脂質（一般に相転移温度が高い脂質）が挙げられる。飽和リン脂質以外には、飽和糖脂質が挙げられる。
【００３１】
このコレステロールも、生体膜モデル（マイクロ液滴）におけるラフトドメイン構造の形成に必須である。なぜならば、実際の細胞膜における脂質ラフトは、「無秩序・液体」状態の膜に浮かんでいる「秩序・液体」状態のラフトドメイン構造と定義される。この「秩序・液体」状態は、脂質だけでは作れず、脂質とコレステロールが混合することで実現される。なお、コレステロールを含まない２成分脂質のみでは、「秩序・固体」状態のラフトドメイン構造が形成されることになる。
【００３２】
なお、コレステロールはステロールの１種であり、エルゴステロール等の他のステロール分子も存在する。実際の生体膜構造の模擬を前提にするとコレステロールが好ましいが、コレステロールに代えてエルゴステロール等の他のステロール分子を用いてもよい。
【００３３】
なお、本発明のマイクロ液滴は、上述の各種類の脂質成分が一つずつ含まれていれば足りるが、例えば、２種類以上の飽和脂質や不飽和脂質を含んでいてもよい。これにより、実際の細胞膜の構造により近似したマイクロ液滴を作製することができる。
【００３４】
また、有機溶媒は特に限定されないが、上記脂質混合物の溶解が容易な点からクロロホルム又はメタノールが好ましい。
【００３５】
（工程２）この有機溶媒を揮発させ、容器内に脂質フィルムを形成する。なお、脂質フィルムとは、脂質混合物が乾燥して通常、容器底にフィルム状に形成されたものである。
【００３６】
（工程３）この容器にさらに所定のオイル（油）を加え、超音波処理を施し脂質フィルムを油に溶解させる。ここで使用する油として、膜面の脂質分子疎水基との親和性が高いオリーブオイル又はドデカンが好ましい。
【００３７】
また、超音波処理は、具体的には、油の入った容器を通常の超音波処理装置の水槽に部分的に浸漬してこの水槽を超音波振動させることで行われる。超音波処理を施す時間は、脂質フィルムが溶解した油量に依存するが、好ましくは１５〜１８０分であり、最も好ましく６０分である。加えて、この水槽の水温は、脂質分子を油に分散させるため、好ましくは２５〜６０℃であり、最も好ましく５０℃である。
【００３８】
（工程４）この容器に水を加え、前記油と水とを攪拌する。
ここで、水に毒性物質又は金属微粒子をさらに加え、水溶液にした状態で油と攪拌してもよい。これにより、病気の原因となる毒性物質又は化粧品等に含まれる金属微粒子とのマイクロ液滴膜面との反応を評価可能なマイクロ液滴を作製することが可能になる。さらに、工程１において、上述の脂質混合物にさらに糖脂質を含ませることも可能であり、これにより、毒性物質等とマイクロ液滴膜面との反応を評価するにあたって脂質成分の影響を検討することが可能になる。
【００３９】
また、水又は水溶液は、油に比較して少量加えることが好ましく、具体的には、油と水溶液の体積比が８５：１５〜９９：１になるように水又は水溶液の付与量を設定することが好ましい。水又は水溶液の体積割合が上限（つまり、１５）より大きすぎると、マイクロ液滴のサイズが大きくなりすぎてしまい（すなわち、μｍレベルのマイクロ液滴が形成されにくくなり）、一方、下限（つまり、１）より小さすぎると、形成されるマイクロ液滴の数が少なくなり過ぎることになる。
【００４０】
以上が本発明のマイクロ液滴の作製方法であり、これにより、図１（ａ）に示すような、ラフトドメイン構造２を備えたマイクロ液滴１を作製することができる。図１（ａ）に示すように、マイクロ液滴１は、ラフトドメイン構造２と無秩序相３とを含んだ単分子膜によって水相が油相から隔離されることによって形成されている。なお、図１（ｂ）及び（ｃ）は、オリーブオイル中に浮遊した実際のマイクロ液滴１を撮影した画像であり、図１（ｂ）はマイクロ液滴１の内部状態を示し、図１（ｃ）は膜表面状態を示した図である。ここで、黒色の各斑点がラフトドメイン構造２である。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明の具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する。
少なくとも三種類の脂質成分（飽和脂質、不飽和脂質、及びコレステロール）として、本実施例では、不飽和リン脂質であるＤＯＰＣ、飽和リン脂質であるＤＰＰＣ、及びコレステロールを使用し、各脂質成分を順に２０：６０：２０の分量で混ぜ合わせた。なお、実際に使用したＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、及びコレステロールの詳細は以下の通りである。
・供試ＤＯＰＣ（dioleoyl L‐α phosphatidylcholine、Avanti Polar Lipids社製）
・供試ＤＰＰＣ（dipalmitoyl L‐α phosphatidylcholine、Avanti Polar Lipids社製）
・供試コレステロール（cholesterol、Avanti Polar Lipids社製）
【００４２】
この脂質混合物をガラス容器内でクロロホルムに溶解させ、更にこのクロロホルムを揮発させ、ガラス容器内に脂質フィルムを形成した。このガラス容器にさらにオリーブオイル（実施例１）を加え、超音波処理（６０分、水温５０℃）を施し脂質フィルムをオリーブオイルに溶解させた。なお、オリーブオイルに替えて、ドデカン（実施例２）、菜種油（比較例１）、ミネラルオイル（比較例２）、スクアレン（比較例３）を使用してもマイクロ液滴を作製し、構造観察を行った。以下の表に上記各種の油を用いて作製されたマイクロ液滴におけるラフトドメイン構造の形成率を示す。ここで、Ｎとは、左欄の油条件において観察されたマイクロ液滴の総数であり、この総数に対するラフトドメイン構造の形成が確認されたマイクロ液滴の数の割合をラフトドメイン構造形成率とした。
【００４３】
【表１】
【００４４】
表１に示すように、オリーブオイル（実施例１）を用いた場合にはラフトドメイン構造形成率が３８．５％と最も高く、次いで、ドデカン（実施例２）を用いた場合には、ラフトドメイン構造形成率が１９．７％と十分に高かった。これに対し、菜種油（比較例１）、ミネラルオイル（比較例２）、及びスクアレン（比較例３）のいずれを用いた場合も、形成されたマイクロ液滴には、一つもラフトドメイン構造を確認することが出来なかった。
【００４５】
次に、脂質フィルム形成のための脂質三成分の各成分の分量がマイクロ液滴のラフトドメイン構造の形成に影響を与えるかどうかも評価した。この評価においては、表１において最もラフトドメイン構造形成率の高かったオリーブオイルを使用した。脂質成分比（ＤＯＰＣ：ＤＰＰＣ：コレステロール（Ｃｈｏｌ）の分量比）を、５０：５０：０、４０：４０：２０、３０：３０：４０、２０：２０：６０、２０：６０：２０に設定した５種類の試料を用いた。
【００４６】
図２に、脂質成分比とこの成分比の脂質混合物から作製されたマイクロ液滴の膜面に占めるラフトドメイン領域の割合（平均値）との関係を示す。この図より、ラフトドメイン構造は、脂質の成分比に依存することなく平均的に２０〜３０％の割合で液滴膜面上に形成されることがわかった。従って、本発明のマイクロ液滴作製方法において、脂質フィルムを用意する段階では、所定の種類の脂質を投与する必要があるが、投与量を厳密に管理しなくても、安定かつ丈夫なラフトドメイン構造を備えたマイクロ液滴を作製することができる。
【００４７】
なお、脂質成分比（ＤＯＰＣ：ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌの分量比）を５０：５０：０に設定したときに、マイクロ液滴膜面上にラフトドメイン構造が形成されるが、そのラフトドメイン構造は非常に固く（つまり「秩序・固体」状態となり）、生体膜モデルとして利用できる状態（つまり「秩序・液体」状態）のラフトドメイン構造にはならなかった。
【００４８】
また、本発明により作製されたマイクロ液滴の利用方法を以下に紹介する。例えば、試験物質（分子）がマイクロ液滴膜面上のラフトドメイン構造領域（つまり秩序相）とその周辺領域（つまり無秩序相）のどちらに結合しやすいかを調べることが可能となる。ここでは例示として、毒性タンパク質であるコレラ毒素とアルツハイマー病の原因物質であるアミロイドペプチドとを用いた結合性評価の結果を以下に示す。
【００４９】
（コレラ毒素の結合性評価）
脂質成分比ＤＯＰＣ：ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌは、３５：３５：３０のマイクロ液滴を使用した。このマイクロ液滴に直接コレラ毒素（ＣｔｘＢ−４８８）を２５μｇ／ｍＬを投与してマイクロ液滴膜面の観察を行った。さらに、このマイクロ液滴にさらに１ｍｏｌ％の糖脂質（ガングリオシドＧＭ１）を追加した上でコレラ毒素を投与してマイクロ液滴膜面上の観察も行った。観察を容易にするために、下記の蛍光物質を用いて、マイクロ液滴膜面の無秩序相とコレラ毒素とを夫々、蛍光させた。
・マイクロ液滴膜面の無秩序相の蛍光： Ｎ‐（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｒｅｄ‐Ｘ）‐１，２‐ｄｉｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ‐ｓｎ‐ｇｌｙｃｅｒｏ‐３‐ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製（図３及び明細書中では、Ｒｈｏ−ＰＥと呼ぶ。）
・コレラ毒素の蛍光： Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製
【００５０】
図３の（ａ）〜（ｃ）は、レーザー共焦点顕微鏡（オリンパス社ＦＶ１０００）を用いて、蛍光物質付コレラ毒素（ＣｔｘＢ−４８８）を付与した後のマイクロ液滴膜面を撮影した蛍光顕微鏡画像であり、（ａ）はマイクロ液滴膜面の無秩序相を蛍光物質Ｒｈｏ−ＰＥで蛍光させた画像を示し、（ｂ）はマイクロ液滴膜面上で蛍光したコレラ毒素（ＣｔｘＢ−４８８）の画像を示し、（ｃ）は、（ａ）の画像と（ｃ）の画像とを人工的に結合させた画像を示す。また（ｄ）は、横軸は図３に示す破線ＡＢの一端Ａからの距離を示し、縦軸はその距離に対応した蛍光強度を示す。この図３（ｄ）の実線は、図３（ａ）におけるラフトドメイン領域以外の周辺部つまり無秩序相の蛍光強度（任意強度）を示し、一点破線は図３（ｂ）におけるコレラ毒素の蛍光強度を示す。この図３（ｄ）より、コレラ毒素の蛍光強度は周辺部つまり無秩序相の蛍光強度とよく一致していることが分かる。これにより、コレラ毒素は周辺部において検出されることがわかる。
【００５１】
一方、図３の（ｅ）〜（ｇ）は、上記実施例の脂質混合物にさらに糖脂質（ガングリオシドＧＭ１）を１ｍｏｌ％加えたマイクロ液滴膜面を撮影した蛍光顕微鏡画像であり、（ｅ）はマイクロ液滴膜面の無秩序相を蛍光物質Ｒｈｏ−ＰＥで蛍光させた画像を示し、（ｆ）はマイクロ液滴膜面上で蛍光したコレラ毒素（ＣｔｘＢ−４８８）の画像を示し、（ｇ）は、（ｅ）の画像と（ｆ）の画像とを人工的に結合させた画像を示す。また（ｈ）は、横軸は図３に示す破線ＡＢの一端Ａからの距離を示し、縦軸はその距離に対応した蛍光強度を示す。（ｈ）の実線は、図３（ｅ）におけるラフトドメイン領域以外の周辺部つまり無秩序相の蛍光強度（任意強度）を示し、一点破線は図３（ｆ）におけるコレラ毒素の蛍光強度を示す。この図３（ｈ）より、コレラ毒素の蛍光強度は周辺部つまり無秩序相の蛍光強度と一致せず、強弱の位置が逆転していることが分かる。これにより、コレラ毒素は糖脂質を含んだラフトドメイン部において検出されることがわかる。言い換えれば、コレラ毒素は糖脂質と特異的に結合することがわかる。
【００５２】
（アミロイドペプチドの結合性評価）
脂質成分比ＤＯＰＣ：ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌは、３５：３５：３０のマイクロ液滴を使用した。このマイクロ液滴に直接、５０μＭのアミロイドペプチド（Ａβ−４８８）を投与してマイクロ液滴膜面の観察を行った。さらに、マイクロ液滴にさらに１ｍｏｌ％の糖脂質（ガングリオシドＧＭ１）を追加した上でアミロイドペプチドを投与してマイクロ液滴膜面上の観察も行った。下記の蛍光物質を用いて、マイクロ液滴膜面の無秩序相とアミロイドペプチドとを夫々、蛍光させた。
・マイクロ液滴膜面の無秩序相の蛍光： Ｎ‐（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｒｅｄ‐Ｘ）‐１，２‐ｄｉｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ‐ｓｎ‐ｇｌｙｃｅｒｏ‐３‐ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製（図４及び明細書中では、Ｒｈｏ−ＰＥと呼ぶ。）
・アミロイドペプチドの蛍光： ＨｙＬｙｔｅ Ｆｌｏｕｒ ４８８ ｌａｂｅｌｅｄ Ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ（１−４０） Ａｎａｓｐｅｃ社製
【００５３】
図４の（ａ）〜（ｃ）は、レーザー共焦点顕微鏡（オリンパス社ＦＶ１０００）を用いて、蛍光させたアミロイドペプチドを付与した後のマイクロ液滴膜面を撮影した蛍光顕微鏡画像であり、（ａ）はマイクロ液滴膜面の無秩序相を蛍光物質Ｒｈｏ−ＰＥで蛍光させた画像を示し、（ｂ）はマイクロ液滴膜面上で蛍光したアミロイドペプチド（Ａβ−４８８）の画像を示し、（ｃ）は、（ａ）の画像と（ｃ）の画像とを人工的に結合させた画像を示す。また（ｄ）は、横軸は図４に示す破線ＡＢの一端Ａからの距離を示し、縦軸はその距離に対応した蛍光強度を示す。この図４（ｄ）の実線は、（ａ）におけるラフトドメイン領域以外の周辺部つまり無秩序相の蛍光強度（任意強度）を示し、一点破線は図４（ｂ）におけるアミロイドペプチドの蛍光強度を示す。この図４（ｄ）より、アミロイドペプチドの蛍光強度は周辺部つまり無秩序相の蛍光強度とよく一致していることが分かる。これにより、アミロイドペプチドは周辺部において検出されることがわかる。
【００５４】
一方、図４の（ｅ）〜（ｇ）は、上記実施例の脂質混合物にさらに糖脂質（ＧＭ１）を１ｍｏｌ％加えたマイクロ液滴膜面を撮影した蛍光顕微鏡画像であり、（ｅ）はマイクロ液滴膜面の無秩序相を蛍光物質Ｒｈｏ−ＰＥで蛍光させた画像を示し、（ｆ）はマイクロ液滴膜面上で蛍光したアミロイドペプチド（Ａβ−４８８）の画像を示し、（ｇ）は、（ｅ）の画像と（ｆ）の画像とを人工的に結合させた画像を示す。また（ｈ）は、横軸は図４に示す破線ＡＢの一端Ａからの距離を示し、縦軸はその距離に対応した蛍光強度を示す。（ｈ）の実線は、図４（ｅ）におけるラフトドメイン領域以外の周辺部つまり無秩序相の蛍光強度（任意強度）を示し、一点破線は図４（ｆ）におけるアミロイドペプチドの蛍光強度を示す。この図４（ｈ）では、図４（ｄ）の場合と同様に、アミロイドペプチドの蛍光強度は周辺部つまり無秩序相の蛍光強度とよく一致していることが分かる。これにより、アミロイドペプチドは周辺部において検出されることがわかる。従って、アミロイドペプチドは糖脂質（ＧＭ１）と特異的に結合せず、ラフトドメイン部を避けてマイクロ液滴膜面上に分布することがわかる。
【００５５】
以上、毒性タンパク質を数例用いて、毒性タンパク質とマイクロ液滴膜面（生体膜モデル）との局所的な干渉（結合性）の評価が可能であることを示した。なお、以上の実施例は例示に過ぎず、例えば、化粧品の成分である金属微粒子を脂質混合物に加えてマイクロ液滴を作製し、マイクロ液滴（生体膜モデル）と金属微粒子との局所的な干渉を評価し、ひいては生体膜への金属微粒子の影響を評価することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により作製されたマイクロ液滴は、安定かつ物理的ストレスに耐性のある生体膜モデルとして細胞膜研究に供することができ、特にマイクロメートルスケール以下での細胞モデル実験室（いわゆる、マイクロラボラトリー）として利用可能である。さらに、本発明のマイクロ液滴は、細胞毒性評価に利用できるだけでなく、化粧品分野における動物実験の代替評価方法としても利用できる等、産業上の利用可能性が高い。
【００５７】
さらに、リポソームを使用した場合に比べて、油相に対する水相の量（試験物質、例えば毒性タンパク質、を含んだ水溶液の量）を二十分の一程度まで低減することが可能となるため、細胞膜モデルを使用した試験コスト（例えば、毒素等の試薬サンプルのコスト）を大幅に低減することが可能となる。
【符号の説明】
【００５８】
１ マイクロ液滴
２ ラフトドメイン構造
３ 無秩序相
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラフトドメイン構造（脂質ラフト）を備えたマイクロ液滴の作製方法に関し、特に、安定かつ物理的ストレスに耐えうる微細なスケールのラフトドメイン構造（脂質ラフト）を備えたマイクロ液滴の作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内の様々な膜構造を総称して呼ばれる「生体膜」は、従来、静的構造体と考えられていたが、現在では膜構造が脂質とタンパク質からなる流動的な特徴をもつことが認められている。しかしながら、この生体膜を構成する脂質の構造的特徴が動的性質にどれ程関与しているかは十分に解明されていない。
【０００３】
ところで、生体膜の主成分であるリン脂質は親水基の頭部と疏水基の尾部をもつ両親媒性分子であり、水溶液中で自己集合してミセルや二分子膜構造（リポソーム）を自発的に形成する。ここで、リポソームはリン脂質等の脂質二分子膜によって形成され、その内部に水相を閉じ込めたカプセル構造を有する。このようにリポソームは、生体膜に近似した組成・構造を備えていることから、種々の生体物質や毒素との相互作用を検討するために、生体モデル膜として研究に用いられてきた。
【０００４】
生体膜モデルにリポソームを用いた研究報告として、例えば、非特許文献１には、ラフトドメイン構造を備えたリポソームの作製方法や刺激物質に対する変形応答が開示されている。また、非特許文献２には、生体膜におけるリン脂質の非対称分布に着目し、非対称ラフトドメイン構造を有するリポソームの作製方法が開示されている。
【０００５】
しかしながら、生体膜モデルとしてリポソームを用いる場合には、以下のような問題が挙げられる。
（１）生理的塩濃度でのリポソーム作製率が低い。
脂質分子同士が強く結合しているため、脂質の塊を形成し易い。そのため、脂質分子は水にうまく分散できず、生理的塩濃度ではリポソームが作製しにくい。
（２）浸透圧等の物理的ストレスにより、リポソームが変形・崩壊し易い。
また、リポソームは５ｎｍ程度の非常に薄い膜構造をしているため、弾性率が十分高くない。従って、浸透圧等の物理的ストレスにより、リポソームが容易に変形・崩壊してしまう。
（３）リポソーム膜面上のラフトドメイン構造は不安定でサイズが大きくなってしまう。一方、実際の細胞膜上のラフトドメイン構造のサイズは小さいまま安定である。
リポソーム膜は、後述するマイクロ液滴膜面に観察されるような裏打ち補強構造（タンパク質のモノマー分子が集合してフィラメント化し、膜に吸着したもの）がないため、非常に流動性が高い。また、脂質分子はブラウン運動により膜面内を拡散しており、脂質分子の会合体であるラフトドメイン構造も２次元膜面内をランダムに動き回り、衝突や融合を繰り返すため、ラフトドメイン構造のサイズが大きくなる。
（４）リポソームを用いた研究・解析手法は、解析目的の試薬を多量に要し、コストが掛る。
リポソームと検出物質（例えば毒性物質）との相互作用を解析実験する際には、リポソームを分散させるために多量の水溶液を必要とし、かつ、この水溶液全体に毒性物質を溶かす必要があるため、実際の解析で検出される量以上の毒性物質（サンプル）量が必要となってしまう。
【０００６】
このように課題の多いリポソームを用いずに生体膜モデルを作製しようとするアプローチもある。例えば、非特許文献３に示すように、油相中におけるマイクロ液滴により生体膜モデルを作製する方法が提案されている。
【０００７】
ここで、マイクロ液滴とは、大きさがマイクロメートル以下の水／油（Ｗ／Ｏ）エマルション（分散質・分散媒が共に液体である分散系溶液であり、乳濁液とも呼ばれる）を意味し、リポソームと比較し、目的の水溶液を油に乳化させる手法により生理的縁濃度の溶液を容易に含むことができる。また、水・油界面に単分子膜を形成することにより表面張力が強く、安定し、物理的ストレスに耐え得る構造となる。
【０００８】
非特許文献３において、マイクロ液滴は、一種類の不飽和脂質（例えば、ジオレオイルフォスフォコリン）を溶かしたミネラルオイルに水溶液を分散させることで形成されている。
【０００９】
しかしながら、非特許文献３に記載のマイクロ液滴を含め従来のマイクロ液滴では、生体膜の重要な構造的特徴であるラフトドメイン構造を再現することが出来なかった。従って、従来のマイクロ液滴は、それ自体で、リポソームに並び又は勝る生体膜モデルとして利用し得るものではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔｓｕｔｏｍｕ Ｈａｍａｄａ 他６名，“Ｄｙｎａｍｉｃ−Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒａｆｔ−Ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｇｉａｎｔ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ”，ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＹＳＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｂ，第１１１巻，１０８５３−１０８５７，２００７年
【非特許文献２】Ｔｓｕｔｏｍｕ Ｈａｍａｄａ 他５名，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｃｅｌｌ−Ｓｉｚｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ Ｌｉｐｉｄ−Ｃｏａｔｅｄ Ｗａｔｅｒ−ｉｎ−Ｏｉｌ Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔｓ”，ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＹＳＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｂ，第１１２巻，１４６７８−１４６８１，２００８年
【非特許文献３】Ｍ．Ｈａｓｅ 他４名，“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ−Ｓｉｚｅｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−Ｃｏａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ａｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｏｒｓ”，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第２３巻、３４８−３５２，２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、従来のリポソームが有する欠点を排除した生体膜モデルの作製方法を提供することを目的とする。すなわち、安定かつ物理的ストレスに耐え得る微細なスケールのラフトドメイン構造を備えたマイクロ液滴の作製方法を安価にかつ高い作製効率で提供することを目的とする。
【００１２】
本願発明者は、ラフトドメイン構造を形成するために脂質を少なくとも３種類用いること、及び、該脂質を溶解させる油を適切な油に選択することで、効率よく安定したラフトドメイン構造がマイクロ液滴膜面に形成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
すなわち、本発明に係るマイクロ液滴の作製方法は、
少なくとも三種類の成分を含んだ脂質混合物を容器内で有機溶媒に溶解させる工程と、
前記有機溶媒を揮発させ、前記容器内に脂質フィルムを形成する工程と、
前記容器内にさらに油を加え、超音波処理を施し前記脂質フィルムを前記油に溶解させる工程と、
前記容器内に水を加え、前記油と前記水とを攪拌する工程と、
を含み、かつ、
前記少なくとも三種類の成分は、飽和脂質と不飽和脂質とコレステロールとを含み、
前記油は、オリーブオイル又は／及びドデカンであることを特徴とする。
【００１４】
これにより、安定で物理的ストレスに耐え得るラフトドメイン構造を備えたマイクロ液滴を作製することが可能となる。ここで、飽和脂質とは構成脂肪酸の炭素鎖が飽和結合をなす脂質のことを意味し、通常、相転移温度が高い性質を有する。一方、不飽和脂質とは構成脂肪酸の炭素鎖が不飽和結合を含む脂質のことを意味し、通常、相転移温度が低い性質を有する。
【００１５】
さらに、本発明に係るマイクロ液滴の作製方法においては、前記飽和脂質が飽和リン脂質であり、前記不飽和脂質が不飽和リン脂質であることが好ましい。
【００１６】
これにより、より人体の生体膜モデルに近いラフトドメイン構造を備えたマイクロ液滴を作製することが可能となる。
【００１７】
さらに、前記容器内に水を加え、攪拌する工程において、さらに毒性タンパク質又は金属微粒子を加え、前記油と水溶液とを攪拌することが好ましい。
【００１８】
これにより、毒性タンパク質や化粧品等に使用され得る金属微粒子が生体膜へ与える影響を評価可能なマイクロ液滴を作製することが可能となる。
【００１９】
さらに、前記脂質混合物がさらに糖脂質を含むことが好ましい。
【００２０】
これにより、毒性タンパク質や化粧品等に使用され得る金属微粒子とラフトドメイン構造に内在する糖脂質との関連性を評価可能なマイクロ液滴を作製することが可能となる。
【００２１】
さらに、前記容器内に水を加え、攪拌する工程において、前記油と前記水または前記水溶液との体積比が、８５：１５〜９９：１の割合となるように前記水又は前記水溶液を加えることが好ましい。
【００２２】
これにより、より安定し、所望のサイズ（マイクロメートル及びナノメートルのサイズ）および数に調整されたラフトドメイン構造を備えた脂質とのマイクロ液滴を作製することが可能となる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のマイクロ液滴の作製方法によれば、脂質成分に飽和脂質、不飽和脂質、コレステロールの少なくとも三種類用意した脂質混合物からなる脂質フィルムを投与し、Ｗ／Ｏ（Ｗａｔｅｒ／Ｏｉｌ）エマルションを構成する油にオリーブオイル又は／及びドデカンを利用するため、マイクロ液滴膜面上に脂質ラフト（すなわち実際の生体膜と略同等な微細スケールのラフトドメイン構造）が効率よく形成される。なお、本発明においては三種類の脂質を投与していれば、その成分比をコントロールしなくとも、高い割合でラフトドメイン構造を膜面上に形成することができる。
【００２４】
また、本発明では、二分子膜構造である従来のリポソームではなく、単分子膜のマイクロ液滴が作製されるため、リポソームが有していた従来の問題を回避することができる。すなわち、本発明の作製方法によれば、生理的塩濃度におけるマイクロ液滴の作製率が高い。また、浸透圧等の物理的ストレスにより、マイクロ液滴が変形・崩壊しにくい。さらに、高粘性の油により膜面が補強されるため、膜面上に形成されるラフトドメイン構造のサイズは数時間経過しても小さいまま、動かず、壊れず安定に存在する。
【００２５】
さらに、リポソームを使用した場合に比べて、油相に対する水相の量（試験物質、例えば毒性タンパク質、を含んだ水溶液の量）を二十分の一程度まで低減することが可能となるため、細胞膜モデルを使用した試験コスト（例えば、毒素等の試薬サンプルのコスト）を大幅に低減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明により作製されたマイクロ液滴の概略を示した図である。
【図２】脂質成分比とラフトドメイン構造占有領域との関係を示したグラフである。
【図３】本発明のマイクロ液滴を利用した毒性物質結合性評価結果を示した図である（コレラ毒素の場合）。
【図４】本発明のマイクロ液滴を利用した毒性物質結合性評価結果を示した図である（アミロイドペプチドの場合）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を図面に示す実施の形態に基づき説明するが、本発明は、下記の具体的な実施形態に何等限定されるものではない。
【００２８】
まず、本発明に係るマイクロ液滴の作製方法について工程毎に説明する。
（工程１）少なくとも三種類の成分を含んだ脂質混合物を容器（例えば、ガラス容器）内で有機溶媒に溶解させる。
【００２９】
ここで、少なくとも三種類の成分は、飽和脂質、不飽和脂質、及びコレステロールを含む。不飽和脂質には、例えばジオレオイルフォスフォコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルフォスフォグリセロール（ＤＯＰＧ）、パルミトイルオレオイルフォスフォコリン（ＰＯＰＣ）等の不飽和リン脂質（一般的に相転移温度の低い脂質）が挙げられる。不飽和リン脂質以外には、不飽和糖脂質が挙げられる。
【００３０】
一方、飽和脂質には、例えばジパルミトイルフォスフォコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルフォスフォエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、スフィンゴミエリン等の飽和リン脂質（一般に相転移温度が高い脂質）が挙げられる。飽和リン脂質以外には、飽和糖脂質が挙げられる。
【００３１】
このコレステロールも、生体膜モデル（マイクロ液滴）におけるラフトドメイン構造の形成に必須である。なぜならば、実際の細胞膜における脂質ラフトは、「無秩序・液体」状態の膜に浮かんでいる「秩序・液体」状態のラフトドメイン構造と定義される。この「秩序・液体」状態は、脂質だけでは作れず、脂質とコレステロールが混合することで実現される。なお、コレステロールを含まない２成分脂質のみでは、「秩序・固体」状態のラフトドメイン構造が形成されることになる。
【００３２】
なお、コレステロールはステロールの１種であり、エルゴステロール等の他のステロール分子も存在する。実際の生体膜構造の模擬を前提にするとコレステロールが好ましいが、コレステロールに代えてエルゴステロール等の他のステロール分子を用いてもよい。
【００３３】
なお、本発明のマイクロ液滴は、上述の各種類の脂質成分が一つずつ含まれていれば足りるが、例えば、２種類以上の飽和脂質や不飽和脂質を含んでいてもよい。これにより、実際の細胞膜の構造により近似したマイクロ液滴を作製することができる。
【００３４】
また、有機溶媒は特に限定されないが、上記脂質混合物の溶解が容易な点からクロロホルム又はメタノールが好ましい。
【００３５】
（工程２）この有機溶媒を揮発させ、容器内に脂質フィルムを形成する。なお、脂質フィルムとは、脂質混合物が乾燥して通常、容器底にフィルム状に形成されたものである。
【００３６】
（工程３）この容器にさらに所定のオイル（油）を加え、超音波処理を施し脂質フィルムを油に溶解させる。ここで使用する油として、膜面の脂質分子疎水基との親和性が高いオリーブオイル又はドデカンが好ましい。
【００３７】
また、超音波処理は、具体的には、油の入った容器を通常の超音波処理装置の水槽に部分的に浸漬してこの水槽を超音波振動させることで行われる。超音波処理を施す時間は、脂質フィルムが溶解した油量に依存するが、好ましくは１５〜１８０分であり、最も好ましく６０分である。加えて、この水槽の水温は、脂質分子を油に分散させるため、好ましくは２５〜６０℃であり、最も好ましく５０℃である。
【００３８】
（工程４）この容器に水を加え、前記油と水とを攪拌する。
ここで、水に毒性物質又は金属微粒子をさらに加え、水溶液にした状態で油と攪拌してもよい。これにより、病気の原因となる毒性物質又は化粧品等に含まれる金属微粒子とのマイクロ液滴膜面との反応を評価可能なマイクロ液滴を作製することが可能になる。さらに、工程１において、上述の脂質混合物にさらに糖脂質を含ませることも可能であり、これにより、毒性物質等とマイクロ液滴膜面との反応を評価するにあたって脂質成分の影響を検討することが可能になる。
【００３９】
また、水又は水溶液は、油に比較して少量加えることが好ましく、具体的には、油と水溶液の体積比が８５：１５〜９９：１になるように水又は水溶液の付与量を設定することが好ましい。水又は水溶液の体積割合が上限（つまり、１５）より大きすぎると、マイクロ液滴のサイズが大きくなりすぎてしまい（すなわち、μｍレベルのマイクロ液滴が形成されにくくなり）、一方、下限（つまり、１）より小さすぎると、形成されるマイクロ液滴の数が少なくなり過ぎることになる。
【００４０】
以上が本発明のマイクロ液滴の作製方法であり、これにより、図１（ａ）に示すような、ラフトドメイン構造２を備えたマイクロ液滴１を作製することができる。図１（ａ）に示すように、マイクロ液滴１は、ラフトドメイン構造２と無秩序相３とを含んだ単分子膜によって水相が油相から隔離されることによって形成されている。なお、図１（ｂ）及び（ｃ）は、オリーブオイル中に浮遊した実際のマイクロ液滴１を撮影した画像であり、図１（ｂ）はマイクロ液滴１の内部状態を示し、図１（ｃ）は膜表面状態を示した図である。ここで、黒色の各斑点がラフトドメイン構造２である。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明の具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する。
少なくとも三種類の脂質成分（飽和脂質、不飽和脂質、及びコレステロール）として、本実施例では、不飽和リン脂質であるＤＯＰＣ、飽和リン脂質であるＤＰＰＣ、及びコレステロールを使用し、各脂質成分を順に２０：６０：２０の分量で混ぜ合わせた。なお、実際に使用したＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、及びコレステロールの詳細は以下の通りである。
・供試ＤＯＰＣ（dioleoyl L‐α phosphatidylcholine、Avanti Polar Lipids社製）
・供試ＤＰＰＣ（dipalmitoyl L‐α phosphatidylcholine、Avanti Polar Lipids社製）
・供試コレステロール（cholesterol、Avanti Polar Lipids社製）
【００４２】
この脂質混合物をガラス容器内でクロロホルムに溶解させ、更にこのクロロホルムを揮発させ、ガラス容器内に脂質フィルムを形成した。このガラス容器にさらにオリーブオイル（実施例１）を加え、超音波処理（６０分、水温５０℃）を施し脂質フィルムをオリーブオイルに溶解させた。なお、オリーブオイルに替えて、ドデカン（実施例２）、菜種油（比較例１）、ミネラルオイル（比較例２）、スクアレン（比較例３）を使用してもマイクロ液滴を作製し、構造観察を行った。以下の表に上記各種の油を用いて作製されたマイクロ液滴におけるラフトドメイン構造の形成率を示す。ここで、Ｎとは、左欄の油条件において観察されたマイクロ液滴の総数であり、この総数に対するラフトドメイン構造の形成が確認されたマイクロ液滴の数の割合をラフトドメイン構造形成率とした。
【００４３】
【表１】
【００４４】
表１に示すように、オリーブオイル（実施例１）を用いた場合にはラフトドメイン構造形成率が３８．５％と最も高く、次いで、ドデカン（実施例２）を用いた場合には、ラフトドメイン構造形成率が１９．７％と十分に高かった。これに対し、菜種油（比較例１）、ミネラルオイル（比較例２）、及びスクアレン（比較例３）のいずれを用いた場合も、形成されたマイクロ液滴には、一つもラフトドメイン構造を確認することが出来なかった。
【００４５】
次に、脂質フィルム形成のための脂質三成分の各成分の分量がマイクロ液滴のラフトドメイン構造の形成に影響を与えるかどうかも評価した。この評価においては、表１において最もラフトドメイン構造形成率の高かったオリーブオイルを使用した。脂質成分比（ＤＯＰＣ：ＤＰＰＣ：コレステロール（Ｃｈｏｌ）の分量比）を、５０：５０：０、４０：４０：２０、３０：３０：４０、２０：２０：６０、２０：６０：２０に設定した５種類の試料を用いた。
【００４６】
図２に、脂質成分比とこの成分比の脂質混合物から作製されたマイクロ液滴の膜面に占めるラフトドメイン領域の割合（平均値）との関係を示す。この図より、ラフトドメイン構造は、脂質の成分比に依存することなく平均的に２０〜３０％の割合で液滴膜面上に形成されることがわかった。従って、本発明のマイクロ液滴作製方法において、脂質フィルムを用意する段階では、所定の種類の脂質を投与する必要があるが、投与量を厳密に管理しなくても、安定かつ丈夫なラフトドメイン構造を備えたマイクロ液滴を作製することができる。
【００４７】
なお、脂質成分比（ＤＯＰＣ：ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌの分量比）を５０：５０：０に設定したときに、マイクロ液滴膜面上にラフトドメイン構造が形成されるが、そのラフトドメイン構造は非常に固く（つまり「秩序・固体」状態となり）、生体膜モデルとして利用できる状態（つまり「秩序・液体」状態）のラフトドメイン構造にはならなかった。
【００４８】
また、本発明により作製されたマイクロ液滴の利用方法を以下に紹介する。例えば、試験物質（分子）がマイクロ液滴膜面上のラフトドメイン構造領域（つまり秩序相）とその周辺領域（つまり無秩序相）のどちらに結合しやすいかを調べることが可能となる。ここでは例示として、毒性タンパク質であるコレラ毒素とアルツハイマー病の原因物質であるアミロイドペプチドとを用いた結合性評価の結果を以下に示す。
【００４９】
（コレラ毒素の結合性評価）
脂質成分比ＤＯＰＣ：ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌは、３５：３５：３０のマイクロ液滴を使用した。このマイクロ液滴に直接コレラ毒素（ＣｔｘＢ−４８８）を２５μｇ／ｍＬを投与してマイクロ液滴膜面の観察を行った。さらに、このマイクロ液滴にさらに１ｍｏｌ％の糖脂質（ガングリオシドＧＭ１）を追加した上でコレラ毒素を投与してマイクロ液滴膜面上の観察も行った。観察を容易にするために、下記の蛍光物質を用いて、マイクロ液滴膜面の無秩序相とコレラ毒素とを夫々、蛍光させた。
・マイクロ液滴膜面の無秩序相の蛍光： Ｎ‐（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｒｅｄ‐Ｘ）‐１，２‐ｄｉｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ‐ｓｎ‐ｇｌｙｃｅｒｏ‐３‐ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製（図３及び明細書中では、Ｒｈｏ−ＰＥと呼ぶ。）
・コレラ毒素の蛍光： Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製
【００５０】
図３の（ａ）〜（ｃ）は、レーザー共焦点顕微鏡（オリンパス社ＦＶ１０００）を用いて、蛍光物質付コレラ毒素（ＣｔｘＢ−４８８）を付与した後のマイクロ液滴膜面を撮影した蛍光顕微鏡画像であり、（ａ）はマイクロ液滴膜面の無秩序相を蛍光物質Ｒｈｏ−ＰＥで蛍光させた画像を示し、（ｂ）はマイクロ液滴膜面上で蛍光したコレラ毒素（ＣｔｘＢ−４８８）の画像を示し、（ｃ）は、（ａ）の画像と（ｃ）の画像とを人工的に結合させた画像を示す。また（ｄ）は、横軸は図３に示す破線ＡＢの一端Ａからの距離を示し、縦軸はその距離に対応した蛍光強度を示す。この図３（ｄ）の実線は、図３（ａ）におけるラフトドメイン領域以外の周辺部つまり無秩序相の蛍光強度（任意強度）を示し、一点破線は図３（ｂ）におけるコレラ毒素の蛍光強度を示す。この図３（ｄ）より、コレラ毒素の蛍光強度は周辺部つまり無秩序相の蛍光強度とよく一致していることが分かる。これにより、コレラ毒素は周辺部において検出されることがわかる。
【００５１】
一方、図３の（ｅ）〜（ｇ）は、上記実施例の脂質混合物にさらに糖脂質（ガングリオシドＧＭ１）を１ｍｏｌ％加えたマイクロ液滴膜面を撮影した蛍光顕微鏡画像であり、（ｅ）はマイクロ液滴膜面の無秩序相を蛍光物質Ｒｈｏ−ＰＥで蛍光させた画像を示し、（ｆ）はマイクロ液滴膜面上で蛍光したコレラ毒素（ＣｔｘＢ−４８８）の画像を示し、（ｇ）は、（ｅ）の画像と（ｆ）の画像とを人工的に結合させた画像を示す。また（ｈ）は、横軸は図３に示す破線ＡＢの一端Ａからの距離を示し、縦軸はその距離に対応した蛍光強度を示す。（ｈ）の実線は、図３（ｅ）におけるラフトドメイン領域以外の周辺部つまり無秩序相の蛍光強度（任意強度）を示し、一点破線は図３（ｆ）におけるコレラ毒素の蛍光強度を示す。この図３（ｈ）より、コレラ毒素の蛍光強度は周辺部つまり無秩序相の蛍光強度と一致せず、強弱の位置が逆転していることが分かる。これにより、コレラ毒素は糖脂質を含んだラフトドメイン部において検出されることがわかる。言い換えれば、コレラ毒素は糖脂質と特異的に結合することがわかる。
【００５２】
（アミロイドペプチドの結合性評価）
脂質成分比ＤＯＰＣ：ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌは、３５：３５：３０のマイクロ液滴を使用した。このマイクロ液滴に直接、５０μＭのアミロイドペプチド（Ａβ−４８８）を投与してマイクロ液滴膜面の観察を行った。さらに、マイクロ液滴にさらに１ｍｏｌ％の糖脂質（ガングリオシドＧＭ１）を追加した上でアミロイドペプチドを投与してマイクロ液滴膜面上の観察も行った。下記の蛍光物質を用いて、マイクロ液滴膜面の無秩序相とアミロイドペプチドとを夫々、蛍光させた。
・マイクロ液滴膜面の無秩序相の蛍光： Ｎ‐（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｒｅｄ‐Ｘ）‐１，２‐ｄｉｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ‐ｓｎ‐ｇｌｙｃｅｒｏ‐３‐ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製（図４及び明細書中では、Ｒｈｏ−ＰＥと呼ぶ。）
・アミロイドペプチドの蛍光： ＨｙＬｙｔｅ Ｆｌｏｕｒ ４８８ ｌａｂｅｌｅｄ Ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ（１−４０） Ａｎａｓｐｅｃ社製
【００５３】
図４の（ａ）〜（ｃ）は、レーザー共焦点顕微鏡（オリンパス社ＦＶ１０００）を用いて、蛍光させたアミロイドペプチドを付与した後のマイクロ液滴膜面を撮影した蛍光顕微鏡画像であり、（ａ）はマイクロ液滴膜面の無秩序相を蛍光物質Ｒｈｏ−ＰＥで蛍光させた画像を示し、（ｂ）はマイクロ液滴膜面上で蛍光したアミロイドペプチド（Ａβ−４８８）の画像を示し、（ｃ）は、（ａ）の画像と（ｃ）の画像とを人工的に結合させた画像を示す。また（ｄ）は、横軸は図４に示す破線ＡＢの一端Ａからの距離を示し、縦軸はその距離に対応した蛍光強度を示す。この図４（ｄ）の実線は、（ａ）におけるラフトドメイン領域以外の周辺部つまり無秩序相の蛍光強度（任意強度）を示し、一点破線は図４（ｂ）におけるアミロイドペプチドの蛍光強度を示す。この図４（ｄ）より、アミロイドペプチドの蛍光強度は周辺部つまり無秩序相の蛍光強度とよく一致していることが分かる。これにより、アミロイドペプチドは周辺部において検出されることがわかる。
【００５４】
一方、図４の（ｅ）〜（ｇ）は、上記実施例の脂質混合物にさらに糖脂質（ＧＭ１）を１ｍｏｌ％加えたマイクロ液滴膜面を撮影した蛍光顕微鏡画像であり、（ｅ）はマイクロ液滴膜面の無秩序相を蛍光物質Ｒｈｏ−ＰＥで蛍光させた画像を示し、（ｆ）はマイクロ液滴膜面上で蛍光したアミロイドペプチド（Ａβ−４８８）の画像を示し、（ｇ）は、（ｅ）の画像と（ｆ）の画像とを人工的に結合させた画像を示す。また（ｈ）は、横軸は図４に示す破線ＡＢの一端Ａからの距離を示し、縦軸はその距離に対応した蛍光強度を示す。（ｈ）の実線は、図４（ｅ）におけるラフトドメイン領域以外の周辺部つまり無秩序相の蛍光強度（任意強度）を示し、一点破線は図４（ｆ）におけるアミロイドペプチドの蛍光強度を示す。この図４（ｈ）では、図４（ｄ）の場合と同様に、アミロイドペプチドの蛍光強度は周辺部つまり無秩序相の蛍光強度とよく一致していることが分かる。これにより、アミロイドペプチドは周辺部において検出されることがわかる。従って、アミロイドペプチドは糖脂質（ＧＭ１）と特異的に結合せず、ラフトドメイン部を避けてマイクロ液滴膜面上に分布することがわかる。
【００５５】
以上、毒性タンパク質を数例用いて、毒性タンパク質とマイクロ液滴膜面（生体膜モデル）との局所的な干渉（結合性）の評価が可能であることを示した。なお、以上の実施例は例示に過ぎず、例えば、化粧品の成分である金属微粒子を脂質混合物に加えてマイクロ液滴を作製し、マイクロ液滴（生体膜モデル）と金属微粒子との局所的な干渉を評価し、ひいては生体膜への金属微粒子の影響を評価することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により作製されたマイクロ液滴は、安定かつ物理的ストレスに耐性のある生体膜モデルとして細胞膜研究に供することができ、特にマイクロメートルスケール以下での細胞モデル実験室（いわゆる、マイクロラボラトリー）として利用可能である。さらに、本発明のマイクロ液滴は、細胞毒性評価に利用できるだけでなく、化粧品分野における動物実験の代替評価方法としても利用できる等、産業上の利用可能性が高い。
【００５７】
さらに、リポソームを使用した場合に比べて、油相に対する水相の量（試験物質、例えば毒性タンパク質、を含んだ水溶液の量）を二十分の一程度まで低減することが可能となるため、細胞膜モデルを使用した試験コスト（例えば、毒素等の試薬サンプルのコスト）を大幅に低減することが可能となる。
【符号の説明】
【００５８】
１ マイクロ液滴
２ ラフトドメイン構造
３ 無秩序相
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも三種類の成分を含んだ脂質混合物を容器内で有機溶媒に溶解させる工程と、
前記有機溶媒を揮発させ、前記容器内に脂質フィルムを形成する工程と、
前記容器内にさらに油を加え、超音波処理を施し前記脂質フィルムを前記油に溶解させる工程と、
前記容器内に水を加え、前記油と前記水とを攪拌する工程と、
を含み、かつ、
前記少なくとも三種類の成分は、飽和脂質と不飽和脂質とコレステロールとを含み、
前記油は、オリーブオイル又は／及びドデカンであることを特徴とするマイクロ液滴の作製方法。
【請求項２】
前記飽和脂質が飽和リン脂質であり、前記不飽和脂質が不飽和リン脂質であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ液滴の作製方法。
【請求項３】
前記容器内に水を加え、攪拌する工程において、さらに毒性タンパク質又は金属微粒子を加え、前記油と水溶液とを攪拌することを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロ液滴の作製方法。
【請求項４】
前記脂質混合物がさらに糖脂質を含むことを特徴とする請求項２又は３に記載のマイクロ液滴の作製方法。
【請求項５】
前記容器内に水を加え、攪拌する工程において、前記油と前記水または前記水溶液との体積比が、８５：１５〜９９：１の割合となるように前記水又は前記水溶液を加えることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロ液滴の作製方法。
【請求項１】
少なくとも三種類の成分を含んだ脂質混合物を容器内で有機溶媒に溶解させる工程と、
前記有機溶媒を揮発させ、前記容器内に脂質フィルムを形成する工程と、
前記容器内にさらに油を加え、超音波処理を施し前記脂質フィルムを前記油に溶解させる工程と、
前記容器内に水を加え、前記油と前記水とを攪拌する工程と、
を含み、かつ、
前記少なくとも三種類の成分は、飽和脂質と不飽和脂質とコレステロールとを含み、
前記油は、オリーブオイル又は／及びドデカンであることを特徴とするマイクロ液滴の作製方法。
【請求項２】
前記飽和脂質が飽和リン脂質であり、前記不飽和脂質が不飽和リン脂質であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ液滴の作製方法。
【請求項３】
前記容器内に水を加え、攪拌する工程において、さらに毒性タンパク質又は金属微粒子を加え、前記油と水溶液とを攪拌することを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロ液滴の作製方法。
【請求項４】
前記脂質混合物がさらに糖脂質を含むことを特徴とする請求項２又は３に記載のマイクロ液滴の作製方法。
【請求項５】
前記容器内に水を加え、攪拌する工程において、前記油と前記水または前記水溶液との体積比が、８５：１５〜９９：１の割合となるように前記水又は前記水溶液を加えることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロ液滴の作製方法。
【図２】
【図１】
【図３】
【図４】
【図１】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−８０９１６（Ｐ２０１１−８０９１６Ａ）
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３４６４３（Ｐ２００９−２３４６４３）
【出願日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【出願人】（３０４０２４４３０）国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 (169)
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【出願人】（３０４０２４４３０）国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 (169)
[ Back to top ]