マンノシルエリスリトールリピッドの生産方法
【課題】マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を効率よく生産することができる方法の提供。
【解決手段】植物油脂等の油脂類を主成分とするマンノシルエリスリトールリピッド生産用培地においてマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｒｕｇｕｌｏｓａなどの微生物を培養するに際し、該培地中に、エリスリトール及び／又はマンノースを添加して培養を行うことにより、マンノシルエリスリトールリピッドを効率よく生産する。
【解決手段】植物油脂等の油脂類を主成分とするマンノシルエリスリトールリピッド生産用培地においてマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｒｕｇｕｌｏｓａなどの微生物を培養するに際し、該培地中に、エリスリトール及び／又はマンノースを添加して培養を行うことにより、マンノシルエリスリトールリピッドを効率よく生産する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオサーファクタントの一種であるマンノシルエリスリトールリピッドの生産効率（生産量、生産速度、及び収率）を大幅に向上させることができるマンノシルエリスリトールリピッドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、脂質に１〜数十個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系及び免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていることなどが明らかにされつつある。また、糖脂質は，糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する両親媒性物質は界面活性物質と呼ばれている。石油化学工業が隆盛となるまでは、レシチン、サポニン等の生体成分由来の界面活性剤（バイオサーファクタント）が利用されていた。近年、石油化学工業の発展により合成界面活性剤が開発され、その生産量が飛躍的に増加し、日常生活には無くてはならない物質となったが、この合成界面活性剤の使用量の拡大に伴って環境汚染が広がり、社会問題が生じている。このため、安全性が高く、環境に対する負荷を低減できる生分解性の高い界面活性物質の開発が望まれている。
従来より、微生物が生産する界面活性物質としては、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子系の界面活性物質の５つに分類されている。これらの中でも、糖脂質系の界面活性剤が最もよく研究されており、細菌及び酵母による多くの種類の界面活性物質が報告されている。
前記細菌としては、Pseudomonas属によるラムノリピッド（非特許文献１及び２参照）とユスチラジン酸（非特許文献３参照）、Rhodococcus属によるトレハロースリピッド（非特許文献４参照）などが知られている。しかし、いずれも生産量は１５ｇ／Ｌ以下である。
前記酵母としては、Candida属によるソホロースリピッドとマンノシルエリスリトールリピッド（特許文献１参照）などが知られている。
前記ソホロースリピッドについては、Candida bombicolaを用いてグルコースとオレイン酸の流加培養法により２００時間で１８０ｇ／Ｌの効率的なソホロースリピッドの生産が可能であることが報告されている（非特許文献５参照）。
【０００３】
前記マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）については、Candida sp.B-7株を用いて５質量％の大豆油から５日間で３５ｇ／Ｌ（生産速度：０．３ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：７０質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献６及び７参照）。また、Candida antarctica T-34株を用いて８質量％の大豆油から８日間で３８ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４８質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献８及び９参照）。同じく、Candida antarctica T-34株を用いて６日間隔で計３回の逐次流加により２４日後に２５質量％のピーナッツ油から１１０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４４質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１０参照）。
Candida sp. SY-16株を用いて１０質量％の植物油脂から回分培養法により２００時間で５０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２５ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：５０質量％）のＭＥＬの生産が可能であると共に、流加培養法により２０質量％の植物油から２００時間で１２０ｇ／Ｌ（生産速度：０．６ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：５０質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１１参照）。
【０００４】
Pseudozyma aphidis株を用いて８０質量％の植物油脂から流加培養法により２４時間で１３．９ｇ／Ｌ
（生産速度：０．５７ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：９２質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１２参照）。
また、醤油醸造工程において副産物として生産されるしょうゆ油（あぶら）を原料としてCandida antarctica T-34株を用いて７日間で８質量％のしょうゆ油から１７ｇ／Ｌ（生産速度：０．１ｇ／Ｌ／ ｈ、原料収率：２１質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが提案されている（特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】特公昭６０−２４７９７号公報
【特許文献２】特開２００２−１０１８４７号公報
【非特許文献１】Ｓ．Ｉｔｏｈ， Ｈ．Ｈｏｎｄａ， Ｆｔｏｎａｍｉ ａｎｄ Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ：Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２３，８８５（１９７１）．
【非特許文献２】Ｍ．Ｙａｍａｇｕｔｉ， Ａ．Ｓａｔｏ ａｎｄ Ｒ．Ｙｕｋｕｙａｍａ：Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．，１７，７４１（１９７６）．
【非特許文献３】Ｓ．Ｓ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｉｊｅｅ， Ｒ．Ｈ．Ｈａｓｋｉｎｓａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｇｏｌｉｎ： Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，１３，２３５（１９７０）．
【非特許文献４】Ｐ．Ｒａｐｐ， Ｈ．Ｂｏｃｈ， Ｖ．Ｗａｒｙ ａｎｄ Ｆ．Ｗａｇｎｅｒ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１５，４９１（１９７９）．
【非特許文献５】Ｕ．Ｒａｕ， Ｃ．Ｍａｎｚｋｅ ａｎｄ Ｆ．Ｗａｇｎｅｒ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．， １８， １４９（１９９６）．
【非特許文献６】Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ， Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｔ．Ｓｕｇｉｓａｗａ，Ｙ．Ｔａｋａｍｏｒｉ ａｎｄ Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ： Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．， ６１， １９（１９８３）．
【非特許文献７】Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ， Ｍ．Ｏｏｇａｋｉａｎｄ Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ： Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．， ６１， １４３（１９８３）．
【非特許文献８】Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ， Ｓ．Ａｋｉｂａ， Ｃ．Ｈｉｏｋｉ ａｎｄＴ．Ｔａｂｕｃｈｉ： Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ５４， ３１（１９９０）．
【非特許文献９】Ｄ．ＫＩｔａｍｏｔｏ， Ｋ．Ｈａｎｅｉｓｈｉ， Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａａｎｄ Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ： Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ５４， ３７（１９９０）．
【非特許文献１０】Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ， Ｋ．Ｆｉｊｉｓｈｉｒｏ， Ｈ．Ｙａｎａｇｉｓｈｉｔａ，Ｔ．Ｎａｋａｎｅ ａｎｄ Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ： Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．， １４， ３０５（１９９２）．
【非特許文献１１】金，伊炳大，桂樹徹，谷吉樹：平成１０年日本生物工学会大会要旨，ｐ１９５．
【非特許文献１２】U．Rau， L．A．Naguyen， Ｈ．Roeper，H．Koch ａｎｄ S．Lang： Appl．Microbiol．Biotechnol．，（２００５）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一方、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれるマンノシルエリスリトールリピッドなどのバイオサーファクタントを食品工業、医薬品工業、化学工業などで広く普及させていくためには、マンノシルエリスリトールリピッドの生産効率を高め、生産コストの低減を図ることが必要である。 本発明は、このような要望に応え、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を用い、その培地組成及び培養条件を最適化することによって、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を効率よく生産することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、植物油脂等の油脂類を主成分とするマンノシルエリスリトールリピッド生産用培地においてマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養するに際し、該培地中に、エリスリトール及び／又はマンノースを添加して培養を行うことにより、マンノシルエリスリトールリピッドの生産効率が大幅に上昇することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００８】
（１）油脂類含有培地でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法において、培地中にエリスリトール及び／又はマンノースを添加することを特徴とするマンノシルエリスリトールリピッドの生産方法。
（２）上記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物であることを特徴とする上記（１）に記載の生産方法。
（３）シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物がシュードザイマ・ルギュローサ（Pseudozyma rugulosa）に属する微生物であることを特徴とする、上記（２）に記載の生産方法。
（４）初発油脂類濃度が５〜２０重量％、エリスリトール濃度が１〜８重量％及び／又はマンノース濃度が１〜８重量％含有する培地で培養を行うことを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の生産方法。
（５）初発油脂類濃度が５〜２０質量％、エリスリトール濃度が１〜８重量％及び／又はマンノース濃度が１〜８重量％含有する培地で範囲で培養を開始し、該培養開始後５〜７日目より油脂類、エリスリトール及び／又はマンノースを培地中に供給することを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの生産方法。
（６）培地組成及び培養条件が、以下に示されるものであることを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれか に記載の生産方法。
酵母エキス：０．１〜２ｇ／Ｌ
硝酸ナトリウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
リン酸２水素カリウム：０．１〜２ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
マンノース：５〜８０ｇ／Ｌ
エリスリトール：５〜８０ｇ／Ｌ
植物油脂：２０〜３００ｇ／Ｌ
培養温度：２６〜３２℃
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、マンノシルエリスリトールリピッドを生成する能力を有する微生物を植物油脂等の油脂類含有培地で培養するに際し、培地中にマンノース及び／又はエリスリトールを添加することにより、マンノシルエリスリトールリピッドを極めて効率良く生産できる。特に、シュードザイマ属に属する微生物であるシュードザイマ・ルギュローサ（Pseudozyma rugulosa NBRC 10877）を使用する場合には生産量が約２倍に上昇する。このシュードザイマ・ルギュローサ（Pseudozyma rugulosa NBRC 10877）は、従来、マンノシルエリスリトールリピッドを生成する能力を有する微生物としては、知られていなかったものである。しかも、このシュードザイマ・ルギュローサに属する微生物は、マンノース及び／又はエリスリトール添加による生産性向上効果が特に高く、これらを主原料に対し微量添加するだけで、マンノシルエリスリトールリピッドの生産量は約２倍に達する。
また、本発明においては、植物油等の油脂類の消費速度も向上し、結果としてこれら由来の油分の生成物への混入を低減し、マンノシルエリスリトールリピッドの分離精製においても効果が期待できる。
したがって、本発明は、医薬等種々用途への使用が期待されるバイオサーファクタントの生産技術の発展に大いに貢献するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（目的生産物）
本発明の目的生産物であるマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）は、下記構造式（１）で表される化合物である。
【化１】
前記構造式（１）において、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよく、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数１〜１４、好ましくは３〜１２の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。
前記マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）は、高い界面活性作用を有し、界面活性剤又はファインケミカルの種々の触媒として用いられる。ヒト急性前骨髄性白血病細胞性ＨＬ６０株にマンノシルエリスリトールリピッドを作用させると顆粒系を分化させる白血病細胞細胞分化誘導作用があり、 また、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞にマンノシルエリスリトールリピッドを作用させると神経突起の伸長が生ずる神経系細胞株分化誘導作用等の生理活性作用を有する。更に、微生物産生の糖脂質として初めて、メラノーマ細胞のアポトーシスを誘導することが可能となり（Ｘ． Ｚｈａｏ ｅｔ． ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５９， ４８２−４８６（１９９９））、癌細胞増殖抑制作用がある。これらの生理作用から見て、マンノシルエリスリトールリピッドには抗ガン剤等の医薬としての用途が期待される。また、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）には生分解性があり、高い安全性を有すると考えられているものである。
【００１１】
（使用微生物）
本発明の使用微生物については、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有するものであれば特に制限はなく、例えばシュードザイマ属に属する微生物が挙げられ、このうち特に好ましい微生物としては、シュードザイマ・ルギュローサに属する微生物が挙げることができる。該微生物はマンノシルエリスリトール生産微生物として知られていなかったものであるが、本発明者等により、シュードザイマ・アンタクチカ等の既知のマンノシルエリスリトールリピッド生産菌と同等の生産性を有することが初めて確認されたものである。しかも、このシュードザイマ・ルギュローサに属する微生物は、マンノース及び／又はエリスリトール添加による生産性向上効果が特に高く、これらを主原料に対し微量添加するだけで、マンノシルエリスリトールリピッドの生産量は約２倍に達する点で特筆すべきものである。
【００１２】
（マンノシルエリスリトールリピッドの生産）
本発明における使用微生物の培養においては、培地に、脂肪酸、脂肪酸トリグリセリド等の脂肪酸エステル類、あるいは植物油等の油脂類を含有させ、さらにマンノース、エリスリトールを含有させるが、このほかの条件については、特に制限はなく、適宜選定することができる。例えば、酵母に対して一般に用いられる培地を使用でき、このような培地として、例えば、ＹＰＤ培地（イーストイクストラクト１０ｇ、 ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース１００ｇ）を挙げることができる。
ＭＥＬの生産量を増加させるためには培地に添加するマンノース及び／又はエリスリトールの供給量を増加させることが好ましく、本発明者等は、培養開始時のマンノース、エリスリトール濃度（初発マンノース、エリスリトール濃度）を変化させて培養を行った結果、培養液中の初発マンノース、エリスリトー ル濃度が少なくとも１％以上、好ましくは４〜８重量％の濃度の場合に、良好なＭＥＬの生産速度、生産量、及び収率が得られるという知見を得ている。これは、生産物すなわちマンノシルエリスリトールリピッドの前駆体物質である原料であるマンノースとエリスリトールを、酵母が細胞内で新たに合成することなく、直接取り込んで炭素源として利用できるため、生産経路が潤滑に進行するためと考えられる。
【００１３】
本発明の使用微生物、特に前記Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用いてマンノシルエリスリトールリピッドを生産する場合の好適な培地組成及び培養条件は、以下のとおりである。
酵母エキスは、０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、１ｇ／Ｌが特に好ましい
硝酸ナトリウムは、０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．５ｇ／Ｌが特に好ましい。
リン酸２水素カリウムは、０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、０．４ｇ／Ｌが特に好ましい。
硫酸マグネシウムは、０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
マンノースは、１ｇ／Ｌ以上が好ましく、２０〜６０ｇ／Ｌが特に好ましい。
エリスリトールは、１ｇ／Ｌ以上が好ましく、２０〜８０ｇ／Ｌが特に好ましい。
植物性油脂は、４０ｇ／Ｌ以上が好ましく、１８０ｇ／Ｌが特に好ましい。
培養温度は、２６〜３２℃が好ましく、３０℃が特に好ましい
【００１４】
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、種培養、本培養及びマンノシルエリスリトールリピッド生産培養の順にスケールアップしていくことが望ましい。
これらの培養における、培地、培養条件を例示すると以下のとおりである。
ａ）種培養；グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行う。
ｂ）本培養；所定量の植物性油脂等の油脂類、マンノース及び／又はエリスリトールと、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間培養を行う。
ｃ） マンノシルエリスリトールリピッド生産培養；所定量の植物性油脂等の油脂類、マンノース及び／又はエリスリトールと酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム ０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で８００ｒｐｍの撹拌速度で培養を行う。この培養においては、培養途中から植物性油脂、マンノース及び／又はエリスリトールを培養容器中に流下させて、培地中の油脂類濃度を４０〜２００ｇ／Ｌに保持することが望ましい。
以下に、本発明について実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００１５】
（Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株の培養）
ａ）保存培地（麦芽エキス３ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌグルコース１０ｇ／Ｌ、寒天３０ｇ／Ｌ）に保存しておいたPseudozyma rugulosa NBRC 10877株を、 グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウムム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液 体培地４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し、３ ０℃で振とう培養を行い、次いで、
ｂ）得られた菌体培養液を所定量の植物性油脂、マンノース、エリスリトールと酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液 体培地２０ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で振とう培養を行い、さらに
ｃ）これを所定量の植物性油脂、マンノース、エリスリトールと酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で８００ｒｐｍの撹拌速度で培養を行った。
上記ａ）〜ｃ）の各培養により得られた菌体培養液を使用して、以下の（１）〜（５）に示される試験を行った。
【００１６】
（試験手法、結果）
（１）バイオサーファクタントの生産の確認
上記ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を、マンノース、エリスルトール無添加で１０日間行い、得られたPseudozyma rugulosa NBRC 10877株の菌体培養液を疎水性のフィルム上にスポットしてその表面張力の変化を観察した。また、コントロールとして培養前の培養液、及び比較例としてPseudozyma antarctica KM-34 (FERMP-20730) 株とPseudozyma aphidisATCC32657株を同様にして培養して得られた培養液をそれぞれスポットして比較した。これらの結果を図１に示す。
これによれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株の菌体培養液のスポットにおいては、培地の表面張力がコントロールと同程度低下しており、このことはPseudozyma rugulosa NBRC 10877株がPseudozyma antarctica KM-34(FERMP-20730)株とPseudozyma aphidis ATCC32657株と同様に、バイオサーファクタントが生産可能であることを示している。
【００１７】
（2）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）生産能の確認
a）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養をマンノース、エリスルトール無添加で１０日間行った後の培養液を採取し、これを用いてPseudozyma rugulosa NBRC 10877株のバイオサーファクタントの生産性を薄層クロマトグラフィーで確認した。一方、比較例としてPseudozyma antarctica KM-34(FERMP-20730) 株を上記と同じ条件で培養し、同様にして薄層クロマトグラフィーを行った。
結果を図２に示す。なお、図中、左端はマンノシルエリスリトールリピッドの標準であり、ＭＥＬ−Ａ，ＭＥＬ−Ｂ及びＭＥＬ−Ｃはそれぞれ順に一般式中（Ｒ１、２＝炭素原子数１〜１４の脂肪酸残基、Ｒ３、４=アセチル基）、同（Ｒ１、２＝炭素原子数１〜１４の脂肪酸残基、Ｒ３=水素原子、Ｒ４=アセチル基）及び同（Ｒ１、２＝炭素原子数１〜１４の脂肪酸残基、Ｒ３=アセチル基、Ｒ４=水素原子）で表される化合物を示す。
これによれば、両株とも大豆油含有培地でマンノシルエリスリトールリピッド（MEL）を生産している。また、マンノシルエリスリトールリピッドの標準と対比して、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株が生産しているバイオサーファクタントはマンノシルエリスリトールリピッドであることがわかる。
【００１８】
（３）マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）生産用培地で同リピッドの生産
Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養をマンノース、エリスルトール無添加で１０日間行った。培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。また、比較例としてPseudozyma antarctica KM-34(FERMP-20730)株を上記と同じ条件で培養し、同様にして高速液体クロマトグラフィーで検出した。結果を図３に示す。なお、図３は、培養液中の酢酸エチル可溶分を高速液体クロマトグラフィーで検出した結果であり、既知のマンノシルエリスリトールリピッドのものと一致する。図３によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株はPseudozyma antarcticaKM-34(FERMP-20730)株と同程度のMEL生産能力を有する。
【００１９】
（４）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株が生産するマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）の構造解析
Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養をマンノース、エリスルトー ル無添加で１０日間行った。培養液を採取し、培養液中のＭＥＬを酢酸エチルで抽出し、１H NMR で生産物の構造解析を行った（上段）。また、典型的なMELの構造解析結果の例としてPseudozyma antarctica KM-34(FERMP-20730)株が生産するMELの分析結果を下段に示す。図４によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株が生産する物質は典型的なMELの構造を有することが明らかである。
【００２０】
（５）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のMEL生産に対する窒素源の影響
Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養をマンノース、エリスリトール無添加で１０日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中の窒素源はそれぞれ図中に記載した組成に調製したものを用いた。結果を図５に示す。この結果によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるMEL生産において、最適な窒素源は硝酸ナトリウムである。
【００２１】
（６）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のMEL生産に対する植物性油脂の影響
Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養をマンノース、エリスリトール無添加で１０日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中の植物性油脂はそれぞれ図中に記載した組成に調製したものを用いた。結果を図６に示す。この結果によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株は各種植物性油脂からMELを生産し、大豆油が最も良好な結果を示した。
【００２２】
（７）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のMEL生産に対する水溶性炭素源の影響
Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養をマンノース８０ｇ／Ｌ、エリスリトール８０ｇ／Ｌ、あるいはグルコース８０ｇ／Ｌをそれぞれ添加して各々１０日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中に植物性油脂として大豆油４０ｇ／Ｌを添加した。結果を図７に示す。この結果によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるMELの生産量はエリスリトールを添加したとき約２倍上昇した。
【００２３】
（８）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のMEL生産に対するエリスリトール濃度の影響
Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養を図８に記載の各濃度でエリスリトールを添加して１０日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中に植物性油脂として大豆油４０ｇ／Ｌを添加した。結果を図８に示す。なお、数値はエリスリトール無添加時の生産量を１００とした時の相対地として示している。この結果によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるMELの生産量はエリスリトール２０ｇ／Ｌ以上を添加したとき約２倍上昇した。
【００２４】
（９）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のMEL生産に対するエリスリトール濃度の影響
Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養を図８に記載の濃度でマンノースを添加して１０日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中に植物性油脂として大豆油４０ｇ／Ｌを添加した。結果を図８に示 す。なお、数値はマンノース無添加時の生産量を１００とした時の相対地として示している。この結果によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるMELの生産量はマンノース２０〜６０ｇ／Ｌを添加したとき約１．７倍上昇した。マンノース８０ｇ／Ｌの添加では生産量の上昇効果が低下した。
【００２５】
（１０）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のMEL生産培養
上記ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を、マンノース、エリスルトール無添加で１０日間行い、続いて、ｃ）の培養を行った。ｃ）の培養は８０ｇ/Lの植物性油脂と２０ｇ/Lあるいは８０ｇ/Lのエリスリトールを含む培地を用いて行った。培養途中から８０ｇ/Lの植物性油脂と所定量のエリスリトールを１週間毎に培養容器中に流下させた。図１０は、１週間毎に培養液を採取し、ＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで定量して作製したグラフである。矢印は炭素源を添加した時点を示している。比較の対象として、エリスリトールを含まない培地で生産培養した結果を用いた。図１０によると、２％あるいは８％のエリスリトールを培地中に加えた場合、２８日間で生産されたMELの量は１９０ｇ/L以上に達しており、エリスリトールを加えない条件の約３倍上昇した。このときの生産収率は約７９％であった。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】Pseudozyma rugulosa NBRC10877株、Pseudozyma antarctica KM-34(FERMP-27030)株及びPseudozyma aphidisATCC32657株を大豆油含有 培地で培養して得られた培養液の、疎水性フィルム上にスポットし、その表面張力を観察した結果を示す写真である。
【図２】Pseudozyma rugulosa NBRC10877株が、大豆油含有培地でマンノシルエリスリトールリピドを生産しうること を示す、該培養物についての薄層クロマトグラフィー写真である。
【図３】Pseudozyma rugulosa NBRC10877株が、大豆油含有培地でマンノシルエリスリトールリピドを生産しうること を示す、該培養物についての高速液体クロマトグラフィーの分析結果である。
【図４】Pseudozyma rugulosa NBRC10877株が、大豆油含有培地でマンノシルエリスリトールリピドを生産しうることを示す、該培養物についての１HNMR による構造解析の結果である。
【図５】Pseudozyma rugulosa NBRC10877株によるマンノシルエリスリトールリピドの生産に対する窒素源の影響を示すグラフである。
【図６】Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるマンノシルエリスリトールリピドの生産に対する植物性油脂の影響を示すグラフである。
【図７】Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるマンノシルエリスリトールリピドの生産に対する水溶性炭素源 の影響を示すグラフである。
【図８】Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるマンノシルエリスリトールリピドの生産に対するエリスルトール の添加効果を示すグラフである。
【図９】Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるマンノシルエリスリトールリピドの生産に対するマンノースの添加効果を示すグラフである。
【図１０】Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のマンノシルエリスリトールリピド生産培養の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオサーファクタントの一種であるマンノシルエリスリトールリピッドの生産効率（生産量、生産速度、及び収率）を大幅に向上させることができるマンノシルエリスリトールリピッドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、脂質に１〜数十個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系及び免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていることなどが明らかにされつつある。また、糖脂質は，糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する両親媒性物質は界面活性物質と呼ばれている。石油化学工業が隆盛となるまでは、レシチン、サポニン等の生体成分由来の界面活性剤（バイオサーファクタント）が利用されていた。近年、石油化学工業の発展により合成界面活性剤が開発され、その生産量が飛躍的に増加し、日常生活には無くてはならない物質となったが、この合成界面活性剤の使用量の拡大に伴って環境汚染が広がり、社会問題が生じている。このため、安全性が高く、環境に対する負荷を低減できる生分解性の高い界面活性物質の開発が望まれている。
従来より、微生物が生産する界面活性物質としては、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子系の界面活性物質の５つに分類されている。これらの中でも、糖脂質系の界面活性剤が最もよく研究されており、細菌及び酵母による多くの種類の界面活性物質が報告されている。
前記細菌としては、Pseudomonas属によるラムノリピッド（非特許文献１及び２参照）とユスチラジン酸（非特許文献３参照）、Rhodococcus属によるトレハロースリピッド（非特許文献４参照）などが知られている。しかし、いずれも生産量は１５ｇ／Ｌ以下である。
前記酵母としては、Candida属によるソホロースリピッドとマンノシルエリスリトールリピッド（特許文献１参照）などが知られている。
前記ソホロースリピッドについては、Candida bombicolaを用いてグルコースとオレイン酸の流加培養法により２００時間で１８０ｇ／Ｌの効率的なソホロースリピッドの生産が可能であることが報告されている（非特許文献５参照）。
【０００３】
前記マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）については、Candida sp.B-7株を用いて５質量％の大豆油から５日間で３５ｇ／Ｌ（生産速度：０．３ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：７０質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献６及び７参照）。また、Candida antarctica T-34株を用いて８質量％の大豆油から８日間で３８ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４８質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献８及び９参照）。同じく、Candida antarctica T-34株を用いて６日間隔で計３回の逐次流加により２４日後に２５質量％のピーナッツ油から１１０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４４質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１０参照）。
Candida sp. SY-16株を用いて１０質量％の植物油脂から回分培養法により２００時間で５０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２５ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：５０質量％）のＭＥＬの生産が可能であると共に、流加培養法により２０質量％の植物油から２００時間で１２０ｇ／Ｌ（生産速度：０．６ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：５０質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１１参照）。
【０００４】
Pseudozyma aphidis株を用いて８０質量％の植物油脂から流加培養法により２４時間で１３．９ｇ／Ｌ
（生産速度：０．５７ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：９２質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１２参照）。
また、醤油醸造工程において副産物として生産されるしょうゆ油（あぶら）を原料としてCandida antarctica T-34株を用いて７日間で８質量％のしょうゆ油から１７ｇ／Ｌ（生産速度：０．１ｇ／Ｌ／ ｈ、原料収率：２１質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが提案されている（特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】特公昭６０−２４７９７号公報
【特許文献２】特開２００２−１０１８４７号公報
【非特許文献１】Ｓ．Ｉｔｏｈ， Ｈ．Ｈｏｎｄａ， Ｆｔｏｎａｍｉ ａｎｄ Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ：Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２３，８８５（１９７１）．
【非特許文献２】Ｍ．Ｙａｍａｇｕｔｉ， Ａ．Ｓａｔｏ ａｎｄ Ｒ．Ｙｕｋｕｙａｍａ：Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．，１７，７４１（１９７６）．
【非特許文献３】Ｓ．Ｓ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｉｊｅｅ， Ｒ．Ｈ．Ｈａｓｋｉｎｓａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｇｏｌｉｎ： Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，１３，２３５（１９７０）．
【非特許文献４】Ｐ．Ｒａｐｐ， Ｈ．Ｂｏｃｈ， Ｖ．Ｗａｒｙ ａｎｄ Ｆ．Ｗａｇｎｅｒ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１５，４９１（１９７９）．
【非特許文献５】Ｕ．Ｒａｕ， Ｃ．Ｍａｎｚｋｅ ａｎｄ Ｆ．Ｗａｇｎｅｒ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．， １８， １４９（１９９６）．
【非特許文献６】Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ， Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｔ．Ｓｕｇｉｓａｗａ，Ｙ．Ｔａｋａｍｏｒｉ ａｎｄ Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ： Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．， ６１， １９（１９８３）．
【非特許文献７】Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ， Ｍ．Ｏｏｇａｋｉａｎｄ Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ： Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．， ６１， １４３（１９８３）．
【非特許文献８】Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ， Ｓ．Ａｋｉｂａ， Ｃ．Ｈｉｏｋｉ ａｎｄＴ．Ｔａｂｕｃｈｉ： Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ５４， ３１（１９９０）．
【非特許文献９】Ｄ．ＫＩｔａｍｏｔｏ， Ｋ．Ｈａｎｅｉｓｈｉ， Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａａｎｄ Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ： Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ５４， ３７（１９９０）．
【非特許文献１０】Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ， Ｋ．Ｆｉｊｉｓｈｉｒｏ， Ｈ．Ｙａｎａｇｉｓｈｉｔａ，Ｔ．Ｎａｋａｎｅ ａｎｄ Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ： Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．， １４， ３０５（１９９２）．
【非特許文献１１】金，伊炳大，桂樹徹，谷吉樹：平成１０年日本生物工学会大会要旨，ｐ１９５．
【非特許文献１２】U．Rau， L．A．Naguyen， Ｈ．Roeper，H．Koch ａｎｄ S．Lang： Appl．Microbiol．Biotechnol．，（２００５）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一方、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれるマンノシルエリスリトールリピッドなどのバイオサーファクタントを食品工業、医薬品工業、化学工業などで広く普及させていくためには、マンノシルエリスリトールリピッドの生産効率を高め、生産コストの低減を図ることが必要である。 本発明は、このような要望に応え、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を用い、その培地組成及び培養条件を最適化することによって、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を効率よく生産することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、植物油脂等の油脂類を主成分とするマンノシルエリスリトールリピッド生産用培地においてマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養するに際し、該培地中に、エリスリトール及び／又はマンノースを添加して培養を行うことにより、マンノシルエリスリトールリピッドの生産効率が大幅に上昇することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００８】
（１）油脂類含有培地でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法において、培地中にエリスリトール及び／又はマンノースを添加することを特徴とするマンノシルエリスリトールリピッドの生産方法。
（２）上記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物であることを特徴とする上記（１）に記載の生産方法。
（３）シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物がシュードザイマ・ルギュローサ（Pseudozyma rugulosa）に属する微生物であることを特徴とする、上記（２）に記載の生産方法。
（４）初発油脂類濃度が５〜２０重量％、エリスリトール濃度が１〜８重量％及び／又はマンノース濃度が１〜８重量％含有する培地で培養を行うことを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の生産方法。
（５）初発油脂類濃度が５〜２０質量％、エリスリトール濃度が１〜８重量％及び／又はマンノース濃度が１〜８重量％含有する培地で範囲で培養を開始し、該培養開始後５〜７日目より油脂類、エリスリトール及び／又はマンノースを培地中に供給することを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの生産方法。
（６）培地組成及び培養条件が、以下に示されるものであることを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれか に記載の生産方法。
酵母エキス：０．１〜２ｇ／Ｌ
硝酸ナトリウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
リン酸２水素カリウム：０．１〜２ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
マンノース：５〜８０ｇ／Ｌ
エリスリトール：５〜８０ｇ／Ｌ
植物油脂：２０〜３００ｇ／Ｌ
培養温度：２６〜３２℃
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、マンノシルエリスリトールリピッドを生成する能力を有する微生物を植物油脂等の油脂類含有培地で培養するに際し、培地中にマンノース及び／又はエリスリトールを添加することにより、マンノシルエリスリトールリピッドを極めて効率良く生産できる。特に、シュードザイマ属に属する微生物であるシュードザイマ・ルギュローサ（Pseudozyma rugulosa NBRC 10877）を使用する場合には生産量が約２倍に上昇する。このシュードザイマ・ルギュローサ（Pseudozyma rugulosa NBRC 10877）は、従来、マンノシルエリスリトールリピッドを生成する能力を有する微生物としては、知られていなかったものである。しかも、このシュードザイマ・ルギュローサに属する微生物は、マンノース及び／又はエリスリトール添加による生産性向上効果が特に高く、これらを主原料に対し微量添加するだけで、マンノシルエリスリトールリピッドの生産量は約２倍に達する。
また、本発明においては、植物油等の油脂類の消費速度も向上し、結果としてこれら由来の油分の生成物への混入を低減し、マンノシルエリスリトールリピッドの分離精製においても効果が期待できる。
したがって、本発明は、医薬等種々用途への使用が期待されるバイオサーファクタントの生産技術の発展に大いに貢献するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（目的生産物）
本発明の目的生産物であるマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）は、下記構造式（１）で表される化合物である。
【化１】
前記構造式（１）において、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよく、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数１〜１４、好ましくは３〜１２の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。
前記マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）は、高い界面活性作用を有し、界面活性剤又はファインケミカルの種々の触媒として用いられる。ヒト急性前骨髄性白血病細胞性ＨＬ６０株にマンノシルエリスリトールリピッドを作用させると顆粒系を分化させる白血病細胞細胞分化誘導作用があり、 また、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞にマンノシルエリスリトールリピッドを作用させると神経突起の伸長が生ずる神経系細胞株分化誘導作用等の生理活性作用を有する。更に、微生物産生の糖脂質として初めて、メラノーマ細胞のアポトーシスを誘導することが可能となり（Ｘ． Ｚｈａｏ ｅｔ． ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５９， ４８２−４８６（１９９９））、癌細胞増殖抑制作用がある。これらの生理作用から見て、マンノシルエリスリトールリピッドには抗ガン剤等の医薬としての用途が期待される。また、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）には生分解性があり、高い安全性を有すると考えられているものである。
【００１１】
（使用微生物）
本発明の使用微生物については、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有するものであれば特に制限はなく、例えばシュードザイマ属に属する微生物が挙げられ、このうち特に好ましい微生物としては、シュードザイマ・ルギュローサに属する微生物が挙げることができる。該微生物はマンノシルエリスリトール生産微生物として知られていなかったものであるが、本発明者等により、シュードザイマ・アンタクチカ等の既知のマンノシルエリスリトールリピッド生産菌と同等の生産性を有することが初めて確認されたものである。しかも、このシュードザイマ・ルギュローサに属する微生物は、マンノース及び／又はエリスリトール添加による生産性向上効果が特に高く、これらを主原料に対し微量添加するだけで、マンノシルエリスリトールリピッドの生産量は約２倍に達する点で特筆すべきものである。
【００１２】
（マンノシルエリスリトールリピッドの生産）
本発明における使用微生物の培養においては、培地に、脂肪酸、脂肪酸トリグリセリド等の脂肪酸エステル類、あるいは植物油等の油脂類を含有させ、さらにマンノース、エリスリトールを含有させるが、このほかの条件については、特に制限はなく、適宜選定することができる。例えば、酵母に対して一般に用いられる培地を使用でき、このような培地として、例えば、ＹＰＤ培地（イーストイクストラクト１０ｇ、 ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース１００ｇ）を挙げることができる。
ＭＥＬの生産量を増加させるためには培地に添加するマンノース及び／又はエリスリトールの供給量を増加させることが好ましく、本発明者等は、培養開始時のマンノース、エリスリトール濃度（初発マンノース、エリスリトール濃度）を変化させて培養を行った結果、培養液中の初発マンノース、エリスリトー ル濃度が少なくとも１％以上、好ましくは４〜８重量％の濃度の場合に、良好なＭＥＬの生産速度、生産量、及び収率が得られるという知見を得ている。これは、生産物すなわちマンノシルエリスリトールリピッドの前駆体物質である原料であるマンノースとエリスリトールを、酵母が細胞内で新たに合成することなく、直接取り込んで炭素源として利用できるため、生産経路が潤滑に進行するためと考えられる。
【００１３】
本発明の使用微生物、特に前記Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用いてマンノシルエリスリトールリピッドを生産する場合の好適な培地組成及び培養条件は、以下のとおりである。
酵母エキスは、０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、１ｇ／Ｌが特に好ましい
硝酸ナトリウムは、０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．５ｇ／Ｌが特に好ましい。
リン酸２水素カリウムは、０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、０．４ｇ／Ｌが特に好ましい。
硫酸マグネシウムは、０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
マンノースは、１ｇ／Ｌ以上が好ましく、２０〜６０ｇ／Ｌが特に好ましい。
エリスリトールは、１ｇ／Ｌ以上が好ましく、２０〜８０ｇ／Ｌが特に好ましい。
植物性油脂は、４０ｇ／Ｌ以上が好ましく、１８０ｇ／Ｌが特に好ましい。
培養温度は、２６〜３２℃が好ましく、３０℃が特に好ましい
【００１４】
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、種培養、本培養及びマンノシルエリスリトールリピッド生産培養の順にスケールアップしていくことが望ましい。
これらの培養における、培地、培養条件を例示すると以下のとおりである。
ａ）種培養；グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行う。
ｂ）本培養；所定量の植物性油脂等の油脂類、マンノース及び／又はエリスリトールと、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で２日間培養を行う。
ｃ） マンノシルエリスリトールリピッド生産培養；所定量の植物性油脂等の油脂類、マンノース及び／又はエリスリトールと酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム ０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で８００ｒｐｍの撹拌速度で培養を行う。この培養においては、培養途中から植物性油脂、マンノース及び／又はエリスリトールを培養容器中に流下させて、培地中の油脂類濃度を４０〜２００ｇ／Ｌに保持することが望ましい。
以下に、本発明について実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００１５】
（Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株の培養）
ａ）保存培地（麦芽エキス３ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌグルコース１０ｇ／Ｌ、寒天３０ｇ／Ｌ）に保存しておいたPseudozyma rugulosa NBRC 10877株を、 グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウムム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液 体培地４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し、３ ０℃で振とう培養を行い、次いで、
ｂ）得られた菌体培養液を所定量の植物性油脂、マンノース、エリスリトールと酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液 体培地２０ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３０℃で振とう培養を行い、さらに
ｃ）これを所定量の植物性油脂、マンノース、エリスリトールと酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３０℃で８００ｒｐｍの撹拌速度で培養を行った。
上記ａ）〜ｃ）の各培養により得られた菌体培養液を使用して、以下の（１）〜（５）に示される試験を行った。
【００１６】
（試験手法、結果）
（１）バイオサーファクタントの生産の確認
上記ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を、マンノース、エリスルトール無添加で１０日間行い、得られたPseudozyma rugulosa NBRC 10877株の菌体培養液を疎水性のフィルム上にスポットしてその表面張力の変化を観察した。また、コントロールとして培養前の培養液、及び比較例としてPseudozyma antarctica KM-34 (FERMP-20730) 株とPseudozyma aphidisATCC32657株を同様にして培養して得られた培養液をそれぞれスポットして比較した。これらの結果を図１に示す。
これによれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株の菌体培養液のスポットにおいては、培地の表面張力がコントロールと同程度低下しており、このことはPseudozyma rugulosa NBRC 10877株がPseudozyma antarctica KM-34(FERMP-20730)株とPseudozyma aphidis ATCC32657株と同様に、バイオサーファクタントが生産可能であることを示している。
【００１７】
（2）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）生産能の確認
a）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養をマンノース、エリスルトール無添加で１０日間行った後の培養液を採取し、これを用いてPseudozyma rugulosa NBRC 10877株のバイオサーファクタントの生産性を薄層クロマトグラフィーで確認した。一方、比較例としてPseudozyma antarctica KM-34(FERMP-20730) 株を上記と同じ条件で培養し、同様にして薄層クロマトグラフィーを行った。
結果を図２に示す。なお、図中、左端はマンノシルエリスリトールリピッドの標準であり、ＭＥＬ−Ａ，ＭＥＬ−Ｂ及びＭＥＬ−Ｃはそれぞれ順に一般式中（Ｒ１、２＝炭素原子数１〜１４の脂肪酸残基、Ｒ３、４=アセチル基）、同（Ｒ１、２＝炭素原子数１〜１４の脂肪酸残基、Ｒ３=水素原子、Ｒ４=アセチル基）及び同（Ｒ１、２＝炭素原子数１〜１４の脂肪酸残基、Ｒ３=アセチル基、Ｒ４=水素原子）で表される化合物を示す。
これによれば、両株とも大豆油含有培地でマンノシルエリスリトールリピッド（MEL）を生産している。また、マンノシルエリスリトールリピッドの標準と対比して、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株が生産しているバイオサーファクタントはマンノシルエリスリトールリピッドであることがわかる。
【００１８】
（３）マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）生産用培地で同リピッドの生産
Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養をマンノース、エリスルトール無添加で１０日間行った。培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。また、比較例としてPseudozyma antarctica KM-34(FERMP-20730)株を上記と同じ条件で培養し、同様にして高速液体クロマトグラフィーで検出した。結果を図３に示す。なお、図３は、培養液中の酢酸エチル可溶分を高速液体クロマトグラフィーで検出した結果であり、既知のマンノシルエリスリトールリピッドのものと一致する。図３によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株はPseudozyma antarcticaKM-34(FERMP-20730)株と同程度のMEL生産能力を有する。
【００１９】
（４）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株が生産するマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）の構造解析
Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養をマンノース、エリスルトー ル無添加で１０日間行った。培養液を採取し、培養液中のＭＥＬを酢酸エチルで抽出し、１H NMR で生産物の構造解析を行った（上段）。また、典型的なMELの構造解析結果の例としてPseudozyma antarctica KM-34(FERMP-20730)株が生産するMELの分析結果を下段に示す。図４によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株が生産する物質は典型的なMELの構造を有することが明らかである。
【００２０】
（５）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のMEL生産に対する窒素源の影響
Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養をマンノース、エリスリトール無添加で１０日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中の窒素源はそれぞれ図中に記載した組成に調製したものを用いた。結果を図５に示す。この結果によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるMEL生産において、最適な窒素源は硝酸ナトリウムである。
【００２１】
（６）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のMEL生産に対する植物性油脂の影響
Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養をマンノース、エリスリトール無添加で１０日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中の植物性油脂はそれぞれ図中に記載した組成に調製したものを用いた。結果を図６に示す。この結果によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株は各種植物性油脂からMELを生産し、大豆油が最も良好な結果を示した。
【００２２】
（７）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のMEL生産に対する水溶性炭素源の影響
Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養をマンノース８０ｇ／Ｌ、エリスリトール８０ｇ／Ｌ、あるいはグルコース８０ｇ／Ｌをそれぞれ添加して各々１０日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中に植物性油脂として大豆油４０ｇ／Ｌを添加した。結果を図７に示す。この結果によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるMELの生産量はエリスリトールを添加したとき約２倍上昇した。
【００２３】
（８）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のMEL生産に対するエリスリトール濃度の影響
Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養を図８に記載の各濃度でエリスリトールを添加して１０日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中に植物性油脂として大豆油４０ｇ／Ｌを添加した。結果を図８に示す。なお、数値はエリスリトール無添加時の生産量を１００とした時の相対地として示している。この結果によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるMELの生産量はエリスリトール２０ｇ／Ｌ以上を添加したとき約２倍上昇した。
【００２４】
（９）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のMEL生産に対するエリスリトール濃度の影響
Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養を図８に記載の濃度でマンノースを添加して１０日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中に植物性油脂として大豆油４０ｇ／Ｌを添加した。結果を図８に示 す。なお、数値はマンノース無添加時の生産量を１００とした時の相対地として示している。この結果によれば、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるMELの生産量はマンノース２０〜６０ｇ／Ｌを添加したとき約１．７倍上昇した。マンノース８０ｇ／Ｌの添加では生産量の上昇効果が低下した。
【００２５】
（１０）Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のMEL生産培養
上記ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を、マンノース、エリスルトール無添加で１０日間行い、続いて、ｃ）の培養を行った。ｃ）の培養は８０ｇ/Lの植物性油脂と２０ｇ/Lあるいは８０ｇ/Lのエリスリトールを含む培地を用いて行った。培養途中から８０ｇ/Lの植物性油脂と所定量のエリスリトールを１週間毎に培養容器中に流下させた。図１０は、１週間毎に培養液を採取し、ＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで定量して作製したグラフである。矢印は炭素源を添加した時点を示している。比較の対象として、エリスリトールを含まない培地で生産培養した結果を用いた。図１０によると、２％あるいは８％のエリスリトールを培地中に加えた場合、２８日間で生産されたMELの量は１９０ｇ/L以上に達しており、エリスリトールを加えない条件の約３倍上昇した。このときの生産収率は約７９％であった。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】Pseudozyma rugulosa NBRC10877株、Pseudozyma antarctica KM-34(FERMP-27030)株及びPseudozyma aphidisATCC32657株を大豆油含有 培地で培養して得られた培養液の、疎水性フィルム上にスポットし、その表面張力を観察した結果を示す写真である。
【図２】Pseudozyma rugulosa NBRC10877株が、大豆油含有培地でマンノシルエリスリトールリピドを生産しうること を示す、該培養物についての薄層クロマトグラフィー写真である。
【図３】Pseudozyma rugulosa NBRC10877株が、大豆油含有培地でマンノシルエリスリトールリピドを生産しうること を示す、該培養物についての高速液体クロマトグラフィーの分析結果である。
【図４】Pseudozyma rugulosa NBRC10877株が、大豆油含有培地でマンノシルエリスリトールリピドを生産しうることを示す、該培養物についての１HNMR による構造解析の結果である。
【図５】Pseudozyma rugulosa NBRC10877株によるマンノシルエリスリトールリピドの生産に対する窒素源の影響を示すグラフである。
【図６】Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるマンノシルエリスリトールリピドの生産に対する植物性油脂の影響を示すグラフである。
【図７】Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるマンノシルエリスリトールリピドの生産に対する水溶性炭素源 の影響を示すグラフである。
【図８】Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるマンノシルエリスリトールリピドの生産に対するエリスルトール の添加効果を示すグラフである。
【図９】Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株によるマンノシルエリスリトールリピドの生産に対するマンノースの添加効果を示すグラフである。
【図１０】Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株のマンノシルエリスリトールリピド生産培養の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
油脂類含有培地でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法において、培地中にエリスリトール及び／又はマンノースを添加することを特徴とするマンノシルエリスリトールリピッドの生産方法。
【請求項２】
上記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物であることを特徴とする請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物がシュードザイマ・ルギュローサ（Pseudozyma rugulosa）に属する微生物であることを特徴とする、請求項２に記載の生産方法。
【請求項４】
初発油脂類濃度が５〜２０重量％、エリスリトール濃度が１〜８重量％及び／又はマンノース濃度が１〜８重量％含有する培地で培養を行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の生産方法。
【請求項５】
初発油脂類濃度が５〜２０質量％、エリスリトール濃度が１〜８重量％及び／又はマンノース濃度が１〜８重量％含有する培地で範囲で培養を開始し、該培養開始後５〜７日目より油脂類、エリスリトール及び／又はマンノースを培地中に供給することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの生産方法。
【請求項６】
培地組成及び培養条件が、以下に示されるものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか に記載の生産方法。
酵母エキス：０．１〜２ｇ／Ｌ
硝酸ナトリウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
リン酸２水素カリウム：０．１〜２ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
マンノース：５〜８０ｇ／Ｌ
エリスリトール：５〜８０ｇ／Ｌ
植物油脂：２０〜３００ｇ／Ｌ
培養温度：２６〜３２℃
【請求項１】
油脂類含有培地でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法において、培地中にエリスリトール及び／又はマンノースを添加することを特徴とするマンノシルエリスリトールリピッドの生産方法。
【請求項２】
上記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物であることを特徴とする請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物がシュードザイマ・ルギュローサ（Pseudozyma rugulosa）に属する微生物であることを特徴とする、請求項２に記載の生産方法。
【請求項４】
初発油脂類濃度が５〜２０重量％、エリスリトール濃度が１〜８重量％及び／又はマンノース濃度が１〜８重量％含有する培地で培養を行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の生産方法。
【請求項５】
初発油脂類濃度が５〜２０質量％、エリスリトール濃度が１〜８重量％及び／又はマンノース濃度が１〜８重量％含有する培地で範囲で培養を開始し、該培養開始後５〜７日目より油脂類、エリスリトール及び／又はマンノースを培地中に供給することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッドの生産方法。
【請求項６】
培地組成及び培養条件が、以下に示されるものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか に記載の生産方法。
酵母エキス：０．１〜２ｇ／Ｌ
硝酸ナトリウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
リン酸２水素カリウム：０．１〜２ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
マンノース：５〜８０ｇ／Ｌ
エリスリトール：５〜８０ｇ／Ｌ
植物油脂：２０〜３００ｇ／Ｌ
培養温度：２６〜３２℃
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【公開番号】特開２００７−１８５１４２（Ｐ２００７−１８５１４２Ａ）
【公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−６３０５（Ｐ２００６−６３０５）
【出願日】平成１８年１月１３日（２００６．１．１３）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月１３日（２００６．１．１３）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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