マーカーレス欠失のための直鎖状ＤＮＡ断片、生物膜の抑制形成を有する新規な株およびその調製方法
本発明は、抗生物質感受性、拡散効率、および形質転換効率が増加した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）変異株に関する。該変異株は、抗生物質に対する抵抗の増加、溶質拡散効率の低下、形質転換効率の低下などの、生物膜形成に起因する問題を最小限にする。本発明によると、遺伝子組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を選択する際、望ましい変異株を選択するのに必要とされる抗生物質の量がより少なくてすむだけでなく、選択される変異株以外の株による生物膜形成により生じる、選択効率の低下、つまり抗生物質に対する耐性の発現の低下が避けられる。また、物質産生プロセスにおいて、溶質拡散効率の増加により分泌物の量が増加する可能性がある。さらに、形質転換効率の増加により、有用な物質を容易に量産することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質感受性、拡散効率、形質転換効率を増大させた大腸菌変異株に関する。前記変異株は、抗生物質に対して増大された耐性、減少された溶質拡散効率、および低下された形質転換効率などの生物膜の形成により引き起こされる問題を最小限に留めることができる。
【背景技術】
【０００２】
生物膜は生物または非生物表面に付着する微生物のクラスタにより形成される。生物膜形成は、環境中への溶質の拡散を阻止する。溶質の一つのタイプである抗生物質の拡散もまた阻止されるので、生物膜の内側の微生物は、抗生物質に対する耐性を示す。従って、株は抗生物質に対する好ましくない耐性を示すことができる。すなわち、殺すか、その成長を抑制することにより取り除かれるべき株は、引き続き生き残るか、成長できる。結果として、異なるタイプの変異株を調整する場合は、好ましい変異株よりはむしろ親細胞が生き残ることができ、その結果選択効率性を低減する。
【０００３】
さらに、物質産生の過程で、分泌物の量は、生物膜形成により低減される可能性もある。外来遺伝子を取り込む形質転換体を調整する場合は、外来遺伝子の移入または取り込みは生物膜により抑制でき、従って、形質転換効率は増大する。特に、高密度細胞培養およびバイオ産業の過程での長時間の培養により増大した生物膜形成は、有益な物質の産生には深刻な問題を引き起こす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
バイオ産業では生物膜形成の抑制により利用されてきた二つの主要な取り組みがあり、一つの取り組みは生物膜抑制剤を増殖培地に付加することであり、もう一つは細菌が付着できない新しい物質の開発である。しかし、環境汚染問題および高費用などの制限のために、成功例は未だに報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、本発明の目的は、生物膜形成を抑制することにより、抗生物質感受性、および溶質拡散効率、形質転換効率を向上できる大腸菌変異株を提供することである。これらの生物膜欠損大腸菌変異株は、生物膜の形成に関連する遺伝子を欠失することにより得られる。
【０００６】
本発明のその他の目的は、増大した抗生物質感受性、溶質拡散効率、および形質転換効率を示す大腸菌変異株を作る方法であって、遺伝子に関連する生物膜を欠失した後、選択可能なマーカーが残らないマーカーレス欠失を含む方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、大腸菌内にある三つの生物膜に関連する遺伝子のうち少なくとも一つを欠失することにより、増大した抗生物質感受性、増大した溶質拡散効率、およびより高い形質転換効率を有する大腸菌変異株に関する。
【０００８】
大腸菌の場合、カーリ（curli）、１型線毛、およびコラン酸（colonic acid）は生物膜形成に必要となる。カーリおよび１型線毛は、微生物を結合するため、または表面に付着するために必要となり、コラン酸は生物膜構造に貢献する。すなわち、二つの大腸菌はカーリおよび１型線毛を利用してお互い結合されていて、コラン酸（colanic acid）は生物膜を形成するために、前記二つの大腸菌間の空間を埋める。
【０００９】
増大した抗生物質感受性、溶質拡散効率、および形質転換効率を有する生物膜欠損大腸菌変異株は、カーリ、１型線毛、およびコラン酸の産生にそれぞれ関連するｃｓｇオペロンおよび／またはｆｉｍオペロンおよび／またはｗｃａ遺伝子クラスタを欠失することにより作られた。
【００１０】
本明細書では、「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株」は生物膜形成を抑制する大腸菌の遺伝子変異株と定義する。例えば、増大した抗生物質感受性、溶質拡散効率、および形質転換効率を有する大腸菌変異株を含む上述した変異株は、ｗｃａ遺伝子クラスタ、ｆｉｍオペロンおよびｃｓｇオペロンのうち少なくとも一つを欠失することにより作ることができる。
【００１１】
さらに、「生物膜」は、生物または非生物物質表面に住む微生物のクラスタである。生物膜形成の抑制は、後に詳細に説明する付着性試験により検出できる。
【００１２】
また、「増大した抗生物質感受性」は、少量の抗生物質でより多くの微生物を殺すことができる能力のことである。例えば、抗生物質感受性は、後に詳細に説明するアンピシリン、ストレプトマイシン、リファンピシンを使用して測定できる。
【００１３】
さらに、「増大した溶質拡散効率」は、一定時間内により多い量の溶質を拡散できる能力のことである。例えば、溶質拡散効率は、後に詳細に説明する培地内のリパーゼに関連する活性量を検出する方法より測定できる。
【００１４】
また、「より高い形質転換効率」は、後に詳細に説明する塩化カルシウム熱衝撃形質転換方法により測定できる。
【００１５】
Ｃｓｇオペロン（ｃｓｇＤＥＦＧＢＡ、ｂ１０３７〜ｂ１０４３、Ｂｌａｔｔｎｅｒ、Ｆ．Ｒ．、Ｐｌｕｎｋｅｔｔ、Ｇ．ＩＩＩ、Ｂｌｏｃｈ、Ｃ．Ａ．、Ｐｅｒｎａ、Ｎ．Ｔ．、Ｂｕｒｌａｎｄ、Ｖ．、Ｒｉｌｅｙ、Ｍ．、Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ、Ｊ．、Ｇｌａｓｎｅｒ、Ｊ．Ｄ．、Ｒｏｄｅ、Ｃ．Ｋ．、Ｍａｙｈｅｗ、Ｇ．Ｆ．、Ｇｒｅｇｏｒ、Ｊ．、Ｄａｖｉｓ、Ｎ．Ｗ．、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ、Ｈ．Ａ．、Ｇｏｅｄｅｎ、Ｍ．Ａ．、Ｒｏｓｅ、Ｄ．Ｊ．、Ｍａｕ、Ｂ．ａｎｄ Ｓｈａｏ、Ｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７、１４５３、１９９７）は、カーリ生合成および合成されたカーリの細胞の外側への移動に関連し、ｆｉｍオペロン（ｆｉｍＢＥＡＩＣＤＥＦ、 ｂ４３１２〜ｂ４３２０、 Ｂｌａｔｔｎｅｒ、Ｆ．Ｒ．、Ｐｌｕｎｋｅｔｔ、Ｇ．ＩＩＩ、Ｂｌｏｃｈ、Ｃ．Ａ．、Ｐｅｒｎａ、Ｎ．Ｔ．、Ｂｕｒｌａｎｄ、Ｖ．、Ｒｉｌｅｙ、Ｍ．、Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ、Ｊ．、Ｇｌａｓｎｅｒ、Ｊ．Ｄ．、Ｒｏｄｅ、Ｃ．Ｋ．、Ｍａｙｈｅｗ、Ｇ．Ｆ．、Ｇｒｅｇｏｒ、Ｊ．、Ｄａｖｉｓ、Ｎ．Ｗ．、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ、Ｈ．Ａ．、Ｇｏｅｄｅｎ、Ｍ．Ａ．、Ｒｏｓｅ、Ｄ．Ｊ．、Ｍａｕ、Ｂ．ａｎｄ Ｓｈａｏ、Ｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７、１４５３、１９９７）は、１型線毛生合成および合成された１型線毛の細胞の外側への移動に関連し、ｗｃａ遺伝子クラスタ（ｗｚａ ｗｚｂ ｗｚｃ ｗｃａＡＢＣＤＥＦ ｇｍｄ ｗｃａＧＨＩ ｍａｎＣ ｍａｎＢ ｗｃａＪ ｗｚｘ ｗｃａＫＬ、ｂ２０４４〜ｂ２０６２、Ｂｌａｔｔｎｅｒ、Ｆ．Ｒ．、Ｐｌｕｎｋｅｔｔ、Ｇ．ＩＩＩ、Ｂｌｏｃｈ、Ｃ．Ａ．、Ｐｅｒｎａ、Ｎ．Ｔ．、Ｂｕｒｌａｎｄ、Ｖ．、Ｒｉｌｅｙ、Ｍ．、Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ、Ｊ．、Ｇｌａｓｎｅｒ、Ｊ．Ｄ．、Ｒｏｄｅ、Ｃ．Ｋ．、Ｍａｙｈｅｗ、Ｇ．Ｆ．、Ｇｒｅｇｏｒ、Ｊ．、Ｄａｖｉｓ、Ｎ．Ｗ．、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ、Ｈ．Ａ．、Ｇｏｅｄｅｎ、Ｍ．Ａ．、 Ｒｏｓｅ、Ｄ．Ｊ．、Ｍａｕ、Ｂ．ａｎｄ Ｓｈａｏ、Ｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７、１４５３、１９９７）は、コラン酸生合成および合成されたコラン酸の細胞の外側への移動に関連する。
【００１６】
本発明の例として、三つの遺伝子のすべてを欠失された大腸菌ＤＥＢ３１の抗生物質感受性は、アンピシリンに対しては約２５倍、ストレプトマイシンに対しては約４倍、リファンピシンに対しては約５倍増大された。リパーゼの分泌に関しては、拡散効率は約１１％増大し、ｐＵＣ１９プラスミドベクターを使用した形質転換に関しては、形質転換効率は２０倍を超えて増大したと示された。
【００１７】
以下は、本発明を得るのに使用される実験方法である。
【００１８】
第一に、上述した遺伝子により除去された大腸菌変異株は、以下のステップにより得られる。
（１）選択可能なマーカー、ｓａｃＢ遺伝子（配列番号 ３１）、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位（配列番号 ３２）、および微生物のゲノム領域と相同的ホモロジーアームを含む直鎖状ＤＮＡ断片を調整するステップ
（２）ステップ１）で調整された直鎖状ＤＮＡ断片と微生物の染色体の特定部位と置換するステップ
（３）Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素発現ベクターを導入して、選択可能なマーカーを除去するステップと、その次にショ糖を含む選択的培養培地で培養するステップ、と任意で、
（４）上記のステップ２）および３）を繰り返して、変異株の特定のゲノム領域を継続して欠失するステップ
直鎖状ＤＮＡ断片は、選択可能なマーカー、λ−Ｒｅｄ組換えに必要な５００塩基対（ｂｐ）のホモロジーアームＡおよびＣ、ホモロジーアームＢおよび選択可能なマーカーを欠失するのに必要なＩ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位、および標的領域のマーカーレス欠失を確認するためのsacＢ遺伝子を含む（図１を参照）。
【００１９】
選択可能なマーカーとして、抗生物質耐性遺伝子を使用でき、染色体の中に挿入された抗生物質耐性遺伝子を含む大腸菌変異株は適切な抗生物質に対する耐性を示すので、かかる抵抗は、その他のタイプの変異株から望ましい変異株を選択するために使用される。
【００２０】
ホモロジーアームは、欠失されるべき遺伝子領域に対する相同的領域を指し示し、遺伝子配列と図に従い、かかる領域はホモロジーアームＡ、ＢおよびＣとして表される。ホモロジーアームＡおよびＣの約５００ｂｐはＰＣＲにより生成され、従って、直鎖状ＤＮＡ断片の両端に位置する。それらは、直鎖状ＤＮＡ断片を微生物の中へ挿入するλ−Ｒｅｄ組換えに関与する。ホモロジーアームＡおよびＣのどちらかに接続されるホモロジーアームＢの約５００ｂｐはＰＣＲにより得られる。それは、選択可能なマーカーを欠失するための相同的組換えに関与する（図２を参照）。遺伝子領域Ｂが染色体上の遺伝子領域Ｃの近傍にある場合、ホモロジーアームＢは直鎖状ＤＮＡ断片上のホモロジーアームＡに結合される。この場合は、ホモロジーアームＡ、ＢおよびＣは、欠失されるべき微生物の遺伝子領域に依存していてもよい。
【００２１】
さらに、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位（配列番号 ３２）は１８塩基対から成り、ホモロジーアームＢの近傍にあり、これは選択可能なマーカーを除去する場合、相同的組換えに関与する。Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位は大腸菌染色体内には存在しないので、遺伝子欠失に使用された直鎖状ＤＮＡ断片は、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位を含むべきである。
【００２２】
約５００ｂｐのホモロジーアームが上記のステップで使用されたので、より多くの種の組換えが発生でき、従ってより正確な欠失についての利点がある。
【００２３】
直鎖状ＤＮＡ断片は、標準電気穿孔法を使用して、微生物株に移されてもよい。染色体上の標的領域は、標的領域および直鎖状ＤＮＡ断片の両端に位置するホモロジーアームＡおよびＣ間でのλ−Ｒｅｄ組換えを介して直鎖状ＤＮＡ断片と置換された。直鎖状ＤＮＡ断片と置換された大腸菌変異株は、直鎖状ＤＮＡ断片上の抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質のタイプを含む培地内で選択された。
【００２４】
Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素の発現のためのベクターを選択変異株に形質転換した。その後、発現したＩ−ＳｃｅＩは、変異株から選択可能なマーカーを除去するために、染色体上にあるホモロジーアームＢの複製間の相同的組換えを誘発した。本発明の実施例では、Ｉ−ＳｃｅＩの発現に、プラスミドｐＳＴ９８ＡＳ（配列番号３３、 ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＡＦ１７０４８３、 Ｐｏｓｆａｉ Ｇ． Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏ Ｖ、 Ｂｅｒｅｃｓｋｉ Ｚ． Ｂｌａｔｔｎｅｒ ＦＲ． １９９９． Ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７ （２２）、 ４４０９−１５）を使用する。その後、微生物変異株はショ糖を含む培地上で選択された。一般に、ｓａｃＢ遺伝子はレバンスクラーゼ（levansucrase）をコード化する。レバンスクラーゼはショ糖をブドウ糖および果糖に加水分解し、果糖重合体、レバンを合成する。レバンは細胞に対して有毒であるから、ｓａｃＢ遺伝子を有する微生物は、ショ糖を含む培地内では生き残ることができない。従って、相同的組換えにより選択可能なマーカーおよびｓａｃＢ遺伝子を欠失した変異株は、ショ糖を含む培地内で選択されてもよい。
【００２５】
さらに、特定の遺伝子領域は、ステップ２）および３）を繰り返すことにより欠失される。
【００２６】
染色体領域を除去する方法を図２に示す。図２では、ａは選択可能なマーカー、ｓａｃＢ遺伝子、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位およびホモロジーアームＡ、ＢおよびＣを含む直鎖状ＤＮＡ断片を表し、ｂは欠失されるよう望まれる親染色体の一部を表し、ｃはλ−Ｒｅｄ組換えにより欠失標的領域で直鎖状ＤＮＡ断片と置換される染色体を表し、ｄはＩ−ＳｃｅＩ制限酵素を使用して染色体上の複製領域Ｂ間の相同的組換えを表し、ｅはどのような外来マーカーの残留もなく、特定の標的領域を欠失した染色体を表す。
【００２７】
上記の方法を使用してｗｃａ遺伝子クラスタ、ｆｉｍオペロンおよびｃｓｇオペロンのうち少なくとも一つを欠失した変異株の付着は、Ｄｏｒｅｌ（Ｄｏｒｅｌ Ｃ． ｅｔ ａｌ．、 ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、 １７８、 １６９、 １９９９）により開発された方法を使用して測定された。すなわち、２ｍｌのＬＢ培地を含む２４ウェルポリスチレンプレートに変異株を播種し、生物膜形成を可能にするために４８時間培養した。それぞれのウェルの上層は取り除かれ、ＬＢで二度洗浄されたものと混合され、プランクトン細胞と見なされた。ウェルに付着した生物膜細胞は、ピペット操作により１ｍｌのＬＢを使用して得られた。プランクトン細胞の濃度と生物膜細胞の濃度は、プレートカウント法により測定された。数の上で結果を比較するために、ウェルの表面で成長している生物膜細胞の付着率は、生物膜細胞の濃度を、プランクトン細胞および生物膜細胞の濃度の合計で割ることにより計算した。
【００２８】
変異株の抗生物質感受性は、Ｗｈｉｔｅｌｅｙ（Ｗｈｉｔｅｌｅｙ Ｍ．、 Ｎａｔｕｒｅ、 ４１３、 ８６０、 ２００１）により開発された手法を改良したものを使用して測定された。すなわち、０．２ｍｌのＬＢを含む９６ウェルポリスチレンプレートに変異株を播種し、２４時間培養し、生物膜形成を可能とした。それぞれのウェルは、０．２５μgから６４μgまでの範囲の様々な濃度抗生物質を添加し、１０時間培養した。生きている細胞の数はプレートカウント法により測定された。
【００２９】
変異株のリパーゼの拡散効率は、Ａｈｎ（Ａｈｎ Ｊ．Ｈ．、 Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １８１、 １８４７、 １９９９）により開発された手法を使用して測定した。本発明の実施例に従い、リパーゼの産生に必要な遺伝子を含むｐＨＯＰＥ（Ａｈｎ Ｊ． Ｈ．、 Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １８１、 １８４７、 １９９９）発現ベクターおよびｐＡＢＣ−ＡＣＹＣ（Ａｈｎ Ｊ．Ｈ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８１、１８４７、１９９９）発現ベクターを使用した。一般的に使用される電気穿孔法を使用して、発現ベクターを細胞に送った。５０ｍｌのＬＢ培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコに播種して、培養した。次に、一定期間を経て、１ｍｌの培養液を所定の時間帯ごとに採取して、１０分間１３、０００ｒｐｍで遠心分離し、４０５ｎｍの発光波長でリパーゼの活性を測定した。リパーゼの活性については、１分間で１μモルのｐ−ニトロフェニルヒドラジンパルミテートを分解できるリパーゼの量を一単位と定義する。
【００３０】
変異株の形質転換効率は、Ｍｏｌｃｈａｎｏｖａ（Ｍｏｌｃｈａｎｏｖａ、 Ｅ．Ｓ．、Ｇｅｎｅｔｉｋａ、１９、３７５、１９８３）により開発された塩化カルシウム熱衝撃形質転換方法を改良したものを使用して測定した。プラスミドベクター、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を野生型大腸菌および本発明の生物膜形成―抑制大腸菌ＤＥＢ３１に形質転換した。氷の上に置いた変異株のコンピテント細胞に１ｎｇから１００ｎｇまでの様々な濃度のプラスミドベクターを付加した。３０分後、８００ｍｌのＬＢプレートを付加する前に、９０分間４２℃で熱衝撃を加え、その後細胞を一時間３７℃で静置した。アンピシリンを含むＬＢプレートの上に細胞を播き、１６時間３７℃で培養した後、生きている変異株の数を確認した。
【００３１】
実施例
本発明は、下記の例によってさらに詳しく解説される。これらの例が挙げられている分野における標準的知識を持つ者にとっては、本発明をより明確に説明しているにすぎないことがはっきり分かるであろうが、発明は挙げられた例には限定されない。
【実施例１】
【００３２】
生物膜欠失大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＢ１１、ＤＥＢ１２およびＤＥＢ１３はｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロン、およびｗｃａ遺伝子クラスタを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２ ＭＧ１６５５（ソウル国立大学微生物学部Ｊｕｎｇ−Ｈｙｅ Ｒｏｅ教授）からそれぞれ欠失させることによって得られ、ＤＥＢ２１、ＤＥＢ２２、およびＤＥＢ２３のそれぞれは、ｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロン、およびｗｃａ遺伝子クラスタのうち少なくとも２つの遺伝子を欠失させることによって得られ、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株ＤＥＢ３１は全てのｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロン、およびｗｃａ遺伝子クラスタを欠失させることによって得られる。
【００３３】
１−１． ｃｓｇ遺伝子（ｃｓｇＤＥＦＧＢＡ）欠失大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＢ１１の調製
まず、ｐＳＧ７６Ｃベクター（Ｐｏｓｆａｉ Ｇ．、Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏ Ｖ．、Ｂｅｒｅｃｚｋｉ Ｚ．、Ｂｌａｔｔｎｅｒ ＦＲ １９９９年 染色体内の二重鎖切断で促進された大腸菌におけるマーカーレス遺伝子置換 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７（２２）、４４０９−１５）のＣｍR遺伝子（配列番号 ３４）を、２つの制限酵素ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州べバリー）で消化し、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位（配列番号 ３２）を含むｐＳＴ７６Ｋベクター（Ｐｏｓｆａｉ Ｇ、Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏ Ｖ．、Ｂｅｒｅｃｚｋｉ Ｚ．、Ｂｌａｔｔｎｅｒ ＦＲ １９９９年 染色体内の二重鎖切断で促進された大腸菌におけるマーカーレス遺伝子置換 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７（２２）、４４０９−１５）のＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ部位の中へ複製した。そして、ｐＤＥＬＴＡベクター（ＧＩＢＣＯＢＲＬ−ＤＥＬＥＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲＹ ＳＹＳＴＥＭ ＶＥＲＳＩＯＮ ２）からのｓａｃＢ遺伝子（配列番号３１）を制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州べバリー）で消化し、ＣｍR遺伝子およびＩ−ＳｃｅＩ認識部位を持つプラスミドの中へ複製した。構成されたプラスミドはｐＳＣＩと呼ぶ。
【００３４】
その後、標的領域（ｃｓｇＤＥＦＧＢＡ）の両端の領域と相同であるホモロジーアームＡ（配列番号 ７）およびＣ（配列番号 ９）を組換えＰＣＲで生成した。ホモロジーアームＡおよびＣはベクターの両端で結合し、λ−Ｒｅｄ組換えに関与する。さらに、相同的組換えによる選択可能なマーカーの除去に関与するホモロジーアームＢ（配列番号 ８）を生成し、組換えＰＣＲによって直鎖状ＤＮＡのホモロジーアームの一つに結合した。ホモロジーアームＡおよびＣをベクターの両端に位置付け、ホモロジーアームＢを一方の端に位置付けた後、直鎖状ＤＮＡ断片（配列番号 １０）を組換えＰＣＲによって生成した。図３（ａ）はＰＣＲの過程を表し、下記はその過程で使用されたプライマーである。
プライマーＡＡ： ５’−ｇｇｔｇａｃｔｇｇａａａｃｔｇｇｔｇｔｔａ−３’（配列番号 １）
プライマーＡＢ： ５’−ａｔｔａｔｃｇｇｔｔａｔｇａａａｇｃａａｃ−３’（配列番号 ２）
プライマーＢＡ： ５’−ｇｔｔｇｃｔｔｔｃａｔａａｃｃｆａｔａａｔａｃｃａｔｔａｔｔｃｃｔｇａａｇｔｃａｃｔｃｔ−３’（配列番号 ３）
プライマーＢＢ： ５’−ａｔｔａａｔｔｔｃｇａｔａａｇｃｃａｇａｔｃａｇｔｔｃａｔｔｔｃｔａｃｇｇｇｔｇａｔｇａ−３’（配列番号 ４）
プライマーＣＡ： ５’−ｇａｇｔｃｇａｃｃｔｇｃａｇｇｃａｔｇｃａｔｔｇｃａｇｃａａｔｃｇｔａｔｔｃｔ−３’（配列番号 ５）
プライマーＣＢ： ５’−ｔａａａｇｇｔｔａｔｃｔｇａｃｔｇｇａａａ−３’（配列番号 ６）
増幅ＤＮＡはＮｕｃｌｅｏｇｅｎｅ Ｇｅｌ−Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＫＩＴ（Ｎｕｃｌｅｏｎｇｅｎ、 Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ、 Ｋｏｒｅａ）を使用して分離した。
【００３５】
調製した直鎖状ＤＮＡ断片は、標準電気穿孔法［バイオ・ラッド社、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｌｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ Ｃａｔ Ｎｏ １６５−２０９８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、 ＪＲ、他 電気穿孔法による形質転換のための酵母細胞の調整に対する改善プロトコル Ｙｅａｓｔ １４、５６５−５７１（１９９８年）；Ｇｒａｎｔ、 ＳＧ他 トランスジェニックマウスＤＮＡから大腸菌メチル化制限性変異体への分化プラスミド救済 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７、４６４５−４６４９（１９９０年）］を使用することによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５株（ソウル国立大学微生物学部Ｊｕｎｇ−Ｈｙｅ Ｒｏｅ教授）へと移した。直鎖状ＤＮＡ断片は、染色体領域と同相である２つのホモロジーアームＡおよびＣを含むため、２つのホモロジーアーム間の遺伝子領域は直鎖状ＤＮＡ断片に置換される。置換された直鎖状ＤＮＡ断片を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株は、直鎖状ＤＮＡ断片中にＣｍR遺伝子が存在するためにクロラムフェニコールに対する耐性を示すので、クロラムフェニコールを含むＬＢプレート上で選択した。
【００３６】
Ｉ−ＳｃｅＩ発現ベクターｐＳＴ９８ＡＳ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＡＦ１７０４８３ Ｐｏｓｆａｉ Ｇ．Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏ Ｖ、Ｂｅｒｅｃｚｋｉ Ｚ、Ｂｌａｔｔｎｅｒ ＦＲ １９９９年 染色体内の二重鎖切断で促進された大腸菌におけるマーカーレス遺伝子置換 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７（２２）、４４０９−１５）は、選択可能なマーカーで置換されたｃｓｇオペロンを持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の中へ導入した。
【００３７】
ｐＳＴ９８ＡＳにおけるＩ−ＳｃｅＩ制限酵素の転写はテトラサイクリンプロモーターによって制御することができるため、制限酵素Ｉ−ＳｃｅＩはクロルテトラサイクリンを含むプレート上で培養することによって発現させた。この過程中、プレートにショ糖を付加することによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の染色体上のｓａｃＢ遺伝子の欠如を試験した。選択可能なマーカーおよびｓａｃＢ遺伝子を含む染色体の特定領域は、発現したＩ−ＳｃｅＩに誘発されたホモロジーアームＢ複製間の相同的組換えによって欠失された。よって、変異株はショ糖を含む培地にて選択することができる（図２参照）。選択された変異株からのｃｓｇＤＥＦＧＢＡ遺伝子の欠失は、ＰＣＲによって確認された。その変異株はＤＥＢ１１と名付けられた。
【００３８】
１−２．ｆｉｍオペロン（ｆｉｍＢＥＡＩＣＤＦＧＨ）を欠失させたＤＥＢ１２大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の調製
実施例１．１にて説明した同じ方法を使用し、ホモロジーアームＡ（配列番号 １７）、Ｂ（配列番号 １８）、Ｃ（配列番号 １９）および直鎖状ＤＮＡ断片（配列番号 ２０）を下記のプライマーを使用することによって調製し、そしてｆｉｍＢＥＡＩＣＤＦＧＨ遺伝子を欠失させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を調製してＤＥＢ１２と名付けた。
プライマーＡＡ： ５’−ｃａａｔｃｔｃａｔｇｇｃｇｔａａｇｃｔ−３’（配列番号 １１）
プライマーＡＢ： ５’−ｇａｔｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｔｃａｇｇａ−３’（配列番号 １２）
プライマーＢＡ： ５’−ｃｃｔｇａｃｃｃａｔａｇｔｇａａａｔｃｇｔｃｔｇｇｇａｔｔａａｃｇｇｃａａ−３’（配列番号 １３）
プライマーＢＢ： ５’−ａｔｔａａｔｔｔｃｇａｔａａｇｃｃａｇａｔｃｔａｇａｔｃｃａｇｃａａｃｔｇｇｔｃａ−３’（配列番号 １４）
プライマーＣＡ： ５’−ｇａｇｔｃｇａｃｃｔｇｃａｇｇｃａｔｇｃｃｃｇｇａａａｃｃａｔｔａｃａｇａｃｔ−３’（配列番号 １５）
プライマーＣＢ： ５’−ｃｃｇｔｇｔｔａｔｔｃｇｃｔｇｇａａ−３’（配列番号 １６）
【００３９】
１−３．ｗｃａ遺伝子クラスタ（ｗｚａ ｗｚｂ ｗｚｃ ｗｃａＡＢＣＤＥＦ ｇｍｄ ｗｃａＧＨＩ ｍａｎＣ ｍａｎＢ ｗｃａＪ ｗｚｘ ｗｃａＫＬ）を欠失させたＤＥＢ１３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の調製
実施例１−１にて説明した同じ方法を使用し、ホモロジーアームＡ（配列番号 ２７）、Ｂ（配列番号 ２８）、Ｃ（配列番号 ２９）および直鎖状ＤＮＡ断片（配列番号 ３０）を下記のプライマーによって調製し、ｗｚａ、ｗｚｂ、ｗｚｃ、ｗｃａＡＢＣＤＥＦ、ｇｍｄ、ｗｃａＧＨＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ、ｗｃａＪ、ｗｚｘおよびｗｃａＫＬ遺伝子を欠失させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を調製してＤＥＢ１３と名付けた。
プライマーＡＡ： ５’−ｇｔｔａｔｇａａａｔｃｃｃｔｇｇｃｇｔ−３’（配列番号 ２１）
プライマーＡＢ： ５’−ｇｇｃｔｔｔａｔａｇａｇｇａｇａａｃｇｃａｔ−３’（配列番号 ２２）
プライマーＢＡ： ５’−ａｔｇｃｇｔｔｃｔｃｃｔｃｔａｔａａａｇｃｃｃｃｇｃｔｔａｔｃａａｇｇｔｔａｃｔｇａｃ−３’（配列番号 ２３）
プライマーＢＢ： ５’−ａｔｔａａｔｔｔｃｇａｔａａｇｃｃａｇａｔｃｇｔｃａａｃｃｔａａａｇａａａｃｔｃｃｔａａ−３’（配列番号 ２４）
プライマーＣＡ： ５’−ｇａｇｔｃｇａｃｃｔｇｃａｇｇｃａｔｇｃｃｃａｔｔｇｔｇｔｇｔｔａｇｃａｃｃａ−３’（配列番号 ２５）
プライマーＣＢ： ５’−ｇｃｔｇａｔｔｔｃｇａｔｃｔｃｇａｃａ−３’（配列番号 ２６）
【００４０】
１−４．ｃｓｇオペロンおよびｆｉｍオペロンが欠失したＤＥＢ２１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の調製
ｃｓｇオペロンおよびｆｉｍオペロンを欠失させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を、実施例１−１および１−２の方法を連続して使用することによって調製し、ＤＥＢ２１と名付けた。
【００４１】
１−５．ｃｓｇオペロンおよびｗｃａ遺伝子クラスタが欠失したＤＥＢ２２大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の調製
ｃｓｇオペロンおよびｗｃａ遺伝子クラスタが欠失した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を、実施例１−１および１−３の方法を連続して使用することによって調製し、ＤＥＢ２２と名付けた。
【００４２】
１−６．ｆｉｍオペロンおよびｗｃａ遺伝子クラスタが欠失したＤＥＢ２３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の調製
ｆｉｍオペロンおよびｗｃａ遺伝子クラスタが欠失した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を、実施例１−２および１−３の方法を連続して使用することによって調製し、ＤＥＢ２３と名付けた。
【００４３】
１−７．ｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロン、およびｗｃａ遺伝子クラスタを全て欠失させたＤＥＢ３１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の調製
ｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロン、およびｗｃａ遺伝子クラスタが欠失した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を、実施例１−１、１−２、および１−３の方法を連続して使用することによって調製した。その変異株はＤＥＢ３１と名付け、２００２年１１月１３日に韓国生命工学研究所遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託した（寄託番号ＫＣＴＣ １０３７４ＢＰ）。
【実施例２】
【００４４】
生物膜形成の抑制の確認
野生型細胞ＭＧ１６５５と比較して、実施例１−１から１−７より得られた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の抑制効果を判定するため、Ｄｏｒｅｌが開発した上記の方法を使用して変異株および親細胞の付着率を測定した。結果を図４に示した。
付着率（％）＝（付着した細胞の数）／（合計細胞数）×１００
結果として、一つの遺伝子が欠失した変異株でさえも、ＤＥＢ１１、ＤＥＢ１２、およびＤＥＢ１３は壁に付着した微生物の数の有意な減少を示した。特に、カーリ関連遺伝子が欠失したＤＥＢ１１の付着の約１５％が減少した。
【００４５】
さらに、標的領域がより欠失すると、付着した細胞の数はさらに著しく減少した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムからすべての標的領域が欠失すると、約６％の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＢ３１しか壁に付着していなかった（図４）。
【実施例３】
【００４６】
変異株の抗生物質感受性の測定
実施例２で確認された、生物膜関連遺伝子を欠失させた後の生物膜形成の著しい抑制効果を持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を、生物膜形成の減少が抗生物質感受性を大幅に増加させるかどうか判定するために試験した。
【００４７】
２００μｌのＬＢ培地を含む９６ウェルプレートにて変異株を２４時間培養した後、連続希釈した抗生物質を以下の濃度で各ウェルに添加した；アンピシリン０〜１２８μg／ｍｌ、ストレプトマイシン０〜６４μg／ｍｌ、およびリファンピシン０〜２５６μg／ｍｌ。抗生物質付加後、細胞をさらに３０℃で１０時間培養した。そして、標準プレートカウント法を使用して生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の数を数えた。結果を図５、６および７に示した。
【００４８】
図５に示されるように、アンピシリンの場合、５０μg／ｍｌの標準濃度で選択された生存している野生型ＭＧ１６５５の数は、２μg／ｍｌの濃度で選択された生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＢ３１と同じであった。つまり、生物膜欠失大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株のアンピシリンに対する感受性は２５倍に増加し、そして同じ選択効果が２５分の１に減少したアンピシリンの量で得ることができた。
【００４９】
図６に示されているように、ストレプトマイシンの場合、３０μg／ｍｌの標準濃度で選択された生存している野生型ＭＧ１６５５の数は、８μg／ｍｌの濃度で選択された生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＢ３１と同じであった。つまり、生物膜欠失大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株のストレプトマイシンに対する感受性は４倍に増加し、そして同じ選択効果が４分の１に減少したストレプトマイシンの量で得ることができた。
【００５０】
リファンピシンでは同様の結果が示された。図７に示されているように、１５０μg／ｍｌの標準濃度で選択された生存している野生型ＭＧ１６５５の数は、３２μg／ｍｌの濃度で選択された生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＢ３１と同じであった。つまり、本発明の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株は、リファンピシンに対する感受性が約５倍に増加したことが確認された。
【実施例４】
【００５１】
変異株の溶質拡散効率の測定
実施例２において、生物膜関連遺伝子を欠失させることによって生物膜形成を著しく減少させたことが確認された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を、生物膜形成の抑制が大幅に溶質拡散効率を増加させたかどうか確認するために試験した。
【００５２】
リパーゼ発現ベクターｐＨＯＰＥ（Ａｈｎ Ｊ．Ｈ．、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８１、１８４７、１９９９年）およびリパーゼＡＢＣトランスポーター発現ベクターｐＡＢＣ−ＡＣＹＣ（Ａｈｎ Ｊ．Ｈ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８１、１８４７、１９９９年）を、標準電気穿孔法を使用して細胞内へと移した。変異株は５０ｍｌのＬＢ培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ内で培養された。培養の一部（１ｍｌ）を時間間隔をもって採取し、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み（２００μｌ）は４５℃で１０分間培養する前に、３ｍＬの１００μＭ ｐ−ニトロフェニルパルミテートと混ぜ合わせた。そして４０５ｎｍでの吸光度を測定することによって、リパーゼの活性を検出した。リパーゼ活性の１単位は、１分間につき１μモルのｐ−ニトロフェニルパルミテートを分解させるのに必要な酵素の量として定義された。
【００５３】
結果は図８に示されている。図８に示されているように、培養の２４時間後、培地で分泌されたリパーゼの量は最大となり、リパーゼの活性が１１％増加したことを示した。
【実施例５】
【００５４】
変異株の形質転換効率の測定
実施例２において、生物膜関連遺伝子を欠失させることによって生物膜形成を著しく減少させたことが確認された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を、生物膜形成の減少が大幅に形質転換効率を増加させたかどうか判定するために試験した。
【００５５】
塩化カルシウム熱衝撃形質転換法（Ｍｏｌｃｈａｎｏｖａ Ｅ．Ｓ．、Ｇｅｎｅｔｉｋａ １９、３７５、１９８３年）を使用することによって、プラスミドベクターｐＵＣ１９を野生型ＭＧ１６５５および生物膜形成を抑制されたＤＥＢ３１に移した。形質転換体はアンピシリンを含むＬＢ上に播いた。そして、３７℃で１６時間培養し、生存している変異株の数を判定した。結果は表１に示されている。
【００５６】
表１に示されているように、生物膜形成を抑制された変異株の形質転換効率は野生型よりも２０倍高かった。
【００５７】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００５８】
上述したように、本発明は、生物膜関連遺伝子を欠失させることによって抗生物質感受性を大幅に増加させ、同じ選択効率を得るために必要な抗生物質の量がより少なくなり、望ましい変異株以外の株の生存率を減少させることができる、大腸菌変異株に関する。よって、本発明は生物学的製品産業において有用となり得る。また、生物膜形成の抑制により溶質拡散効率を増加させることができ、分泌物の量を増加させることができる。さらに、生物膜形成の抑制により形質転換効率の増加が有用物質の産生をより容易にする。加えて、生物膜形成による設備の老化の速度を落とすことによって、生物学的製品を生産する際に使用される設備の費用を削減する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体の領域を欠失させるために使われる直鎖状ＤＮＡ断片を表す。
【図２】直鎖状ＤＮＡ断片を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の特定遺伝子を欠失させるステップを示す。
【図３】直鎖状ＤＮＡ断片を構成するためのＰＣＲの過程を示す。
【図４】本発明の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の付着率を測定することによる、生物膜関連遺伝子の欠失の確認の結果を示す。
【図５】本発明による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株のアンピシリンに対する感受性を示す。
【図６】本発明による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株のストレプトマイシンに対する感受性を示す。
【図７】本発明による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株のリファンピシンに対する感受性を示す。
【図８】本発明による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の溶質拡散効率を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質感受性、拡散効率、形質転換効率を増大させた大腸菌変異株に関する。前記変異株は、抗生物質に対して増大された耐性、減少された溶質拡散効率、および低下された形質転換効率などの生物膜の形成により引き起こされる問題を最小限に留めることができる。
【背景技術】
【０００２】
生物膜は生物または非生物表面に付着する微生物のクラスタにより形成される。生物膜形成は、環境中への溶質の拡散を阻止する。溶質の一つのタイプである抗生物質の拡散もまた阻止されるので、生物膜の内側の微生物は、抗生物質に対する耐性を示す。従って、株は抗生物質に対する好ましくない耐性を示すことができる。すなわち、殺すか、その成長を抑制することにより取り除かれるべき株は、引き続き生き残るか、成長できる。結果として、異なるタイプの変異株を調整する場合は、好ましい変異株よりはむしろ親細胞が生き残ることができ、その結果選択効率性を低減する。
【０００３】
さらに、物質産生の過程で、分泌物の量は、生物膜形成により低減される可能性もある。外来遺伝子を取り込む形質転換体を調整する場合は、外来遺伝子の移入または取り込みは生物膜により抑制でき、従って、形質転換効率は増大する。特に、高密度細胞培養およびバイオ産業の過程での長時間の培養により増大した生物膜形成は、有益な物質の産生には深刻な問題を引き起こす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
バイオ産業では生物膜形成の抑制により利用されてきた二つの主要な取り組みがあり、一つの取り組みは生物膜抑制剤を増殖培地に付加することであり、もう一つは細菌が付着できない新しい物質の開発である。しかし、環境汚染問題および高費用などの制限のために、成功例は未だに報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、本発明の目的は、生物膜形成を抑制することにより、抗生物質感受性、および溶質拡散効率、形質転換効率を向上できる大腸菌変異株を提供することである。これらの生物膜欠損大腸菌変異株は、生物膜の形成に関連する遺伝子を欠失することにより得られる。
【０００６】
本発明のその他の目的は、増大した抗生物質感受性、溶質拡散効率、および形質転換効率を示す大腸菌変異株を作る方法であって、遺伝子に関連する生物膜を欠失した後、選択可能なマーカーが残らないマーカーレス欠失を含む方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、大腸菌内にある三つの生物膜に関連する遺伝子のうち少なくとも一つを欠失することにより、増大した抗生物質感受性、増大した溶質拡散効率、およびより高い形質転換効率を有する大腸菌変異株に関する。
【０００８】
大腸菌の場合、カーリ（curli）、１型線毛、およびコラン酸（colonic acid）は生物膜形成に必要となる。カーリおよび１型線毛は、微生物を結合するため、または表面に付着するために必要となり、コラン酸は生物膜構造に貢献する。すなわち、二つの大腸菌はカーリおよび１型線毛を利用してお互い結合されていて、コラン酸（colanic acid）は生物膜を形成するために、前記二つの大腸菌間の空間を埋める。
【０００９】
増大した抗生物質感受性、溶質拡散効率、および形質転換効率を有する生物膜欠損大腸菌変異株は、カーリ、１型線毛、およびコラン酸の産生にそれぞれ関連するｃｓｇオペロンおよび／またはｆｉｍオペロンおよび／またはｗｃａ遺伝子クラスタを欠失することにより作られた。
【００１０】
本明細書では、「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株」は生物膜形成を抑制する大腸菌の遺伝子変異株と定義する。例えば、増大した抗生物質感受性、溶質拡散効率、および形質転換効率を有する大腸菌変異株を含む上述した変異株は、ｗｃａ遺伝子クラスタ、ｆｉｍオペロンおよびｃｓｇオペロンのうち少なくとも一つを欠失することにより作ることができる。
【００１１】
さらに、「生物膜」は、生物または非生物物質表面に住む微生物のクラスタである。生物膜形成の抑制は、後に詳細に説明する付着性試験により検出できる。
【００１２】
また、「増大した抗生物質感受性」は、少量の抗生物質でより多くの微生物を殺すことができる能力のことである。例えば、抗生物質感受性は、後に詳細に説明するアンピシリン、ストレプトマイシン、リファンピシンを使用して測定できる。
【００１３】
さらに、「増大した溶質拡散効率」は、一定時間内により多い量の溶質を拡散できる能力のことである。例えば、溶質拡散効率は、後に詳細に説明する培地内のリパーゼに関連する活性量を検出する方法より測定できる。
【００１４】
また、「より高い形質転換効率」は、後に詳細に説明する塩化カルシウム熱衝撃形質転換方法により測定できる。
【００１５】
Ｃｓｇオペロン（ｃｓｇＤＥＦＧＢＡ、ｂ１０３７〜ｂ１０４３、Ｂｌａｔｔｎｅｒ、Ｆ．Ｒ．、Ｐｌｕｎｋｅｔｔ、Ｇ．ＩＩＩ、Ｂｌｏｃｈ、Ｃ．Ａ．、Ｐｅｒｎａ、Ｎ．Ｔ．、Ｂｕｒｌａｎｄ、Ｖ．、Ｒｉｌｅｙ、Ｍ．、Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ、Ｊ．、Ｇｌａｓｎｅｒ、Ｊ．Ｄ．、Ｒｏｄｅ、Ｃ．Ｋ．、Ｍａｙｈｅｗ、Ｇ．Ｆ．、Ｇｒｅｇｏｒ、Ｊ．、Ｄａｖｉｓ、Ｎ．Ｗ．、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ、Ｈ．Ａ．、Ｇｏｅｄｅｎ、Ｍ．Ａ．、Ｒｏｓｅ、Ｄ．Ｊ．、Ｍａｕ、Ｂ．ａｎｄ Ｓｈａｏ、Ｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７、１４５３、１９９７）は、カーリ生合成および合成されたカーリの細胞の外側への移動に関連し、ｆｉｍオペロン（ｆｉｍＢＥＡＩＣＤＥＦ、 ｂ４３１２〜ｂ４３２０、 Ｂｌａｔｔｎｅｒ、Ｆ．Ｒ．、Ｐｌｕｎｋｅｔｔ、Ｇ．ＩＩＩ、Ｂｌｏｃｈ、Ｃ．Ａ．、Ｐｅｒｎａ、Ｎ．Ｔ．、Ｂｕｒｌａｎｄ、Ｖ．、Ｒｉｌｅｙ、Ｍ．、Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ、Ｊ．、Ｇｌａｓｎｅｒ、Ｊ．Ｄ．、Ｒｏｄｅ、Ｃ．Ｋ．、Ｍａｙｈｅｗ、Ｇ．Ｆ．、Ｇｒｅｇｏｒ、Ｊ．、Ｄａｖｉｓ、Ｎ．Ｗ．、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ、Ｈ．Ａ．、Ｇｏｅｄｅｎ、Ｍ．Ａ．、Ｒｏｓｅ、Ｄ．Ｊ．、Ｍａｕ、Ｂ．ａｎｄ Ｓｈａｏ、Ｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７、１４５３、１９９７）は、１型線毛生合成および合成された１型線毛の細胞の外側への移動に関連し、ｗｃａ遺伝子クラスタ（ｗｚａ ｗｚｂ ｗｚｃ ｗｃａＡＢＣＤＥＦ ｇｍｄ ｗｃａＧＨＩ ｍａｎＣ ｍａｎＢ ｗｃａＪ ｗｚｘ ｗｃａＫＬ、ｂ２０４４〜ｂ２０６２、Ｂｌａｔｔｎｅｒ、Ｆ．Ｒ．、Ｐｌｕｎｋｅｔｔ、Ｇ．ＩＩＩ、Ｂｌｏｃｈ、Ｃ．Ａ．、Ｐｅｒｎａ、Ｎ．Ｔ．、Ｂｕｒｌａｎｄ、Ｖ．、Ｒｉｌｅｙ、Ｍ．、Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ、Ｊ．、Ｇｌａｓｎｅｒ、Ｊ．Ｄ．、Ｒｏｄｅ、Ｃ．Ｋ．、Ｍａｙｈｅｗ、Ｇ．Ｆ．、Ｇｒｅｇｏｒ、Ｊ．、Ｄａｖｉｓ、Ｎ．Ｗ．、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ、Ｈ．Ａ．、Ｇｏｅｄｅｎ、Ｍ．Ａ．、 Ｒｏｓｅ、Ｄ．Ｊ．、Ｍａｕ、Ｂ．ａｎｄ Ｓｈａｏ、Ｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７、１４５３、１９９７）は、コラン酸生合成および合成されたコラン酸の細胞の外側への移動に関連する。
【００１６】
本発明の例として、三つの遺伝子のすべてを欠失された大腸菌ＤＥＢ３１の抗生物質感受性は、アンピシリンに対しては約２５倍、ストレプトマイシンに対しては約４倍、リファンピシンに対しては約５倍増大された。リパーゼの分泌に関しては、拡散効率は約１１％増大し、ｐＵＣ１９プラスミドベクターを使用した形質転換に関しては、形質転換効率は２０倍を超えて増大したと示された。
【００１７】
以下は、本発明を得るのに使用される実験方法である。
【００１８】
第一に、上述した遺伝子により除去された大腸菌変異株は、以下のステップにより得られる。
（１）選択可能なマーカー、ｓａｃＢ遺伝子（配列番号 ３１）、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位（配列番号 ３２）、および微生物のゲノム領域と相同的ホモロジーアームを含む直鎖状ＤＮＡ断片を調整するステップ
（２）ステップ１）で調整された直鎖状ＤＮＡ断片と微生物の染色体の特定部位と置換するステップ
（３）Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素発現ベクターを導入して、選択可能なマーカーを除去するステップと、その次にショ糖を含む選択的培養培地で培養するステップ、と任意で、
（４）上記のステップ２）および３）を繰り返して、変異株の特定のゲノム領域を継続して欠失するステップ
直鎖状ＤＮＡ断片は、選択可能なマーカー、λ−Ｒｅｄ組換えに必要な５００塩基対（ｂｐ）のホモロジーアームＡおよびＣ、ホモロジーアームＢおよび選択可能なマーカーを欠失するのに必要なＩ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位、および標的領域のマーカーレス欠失を確認するためのsacＢ遺伝子を含む（図１を参照）。
【００１９】
選択可能なマーカーとして、抗生物質耐性遺伝子を使用でき、染色体の中に挿入された抗生物質耐性遺伝子を含む大腸菌変異株は適切な抗生物質に対する耐性を示すので、かかる抵抗は、その他のタイプの変異株から望ましい変異株を選択するために使用される。
【００２０】
ホモロジーアームは、欠失されるべき遺伝子領域に対する相同的領域を指し示し、遺伝子配列と図に従い、かかる領域はホモロジーアームＡ、ＢおよびＣとして表される。ホモロジーアームＡおよびＣの約５００ｂｐはＰＣＲにより生成され、従って、直鎖状ＤＮＡ断片の両端に位置する。それらは、直鎖状ＤＮＡ断片を微生物の中へ挿入するλ−Ｒｅｄ組換えに関与する。ホモロジーアームＡおよびＣのどちらかに接続されるホモロジーアームＢの約５００ｂｐはＰＣＲにより得られる。それは、選択可能なマーカーを欠失するための相同的組換えに関与する（図２を参照）。遺伝子領域Ｂが染色体上の遺伝子領域Ｃの近傍にある場合、ホモロジーアームＢは直鎖状ＤＮＡ断片上のホモロジーアームＡに結合される。この場合は、ホモロジーアームＡ、ＢおよびＣは、欠失されるべき微生物の遺伝子領域に依存していてもよい。
【００２１】
さらに、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位（配列番号 ３２）は１８塩基対から成り、ホモロジーアームＢの近傍にあり、これは選択可能なマーカーを除去する場合、相同的組換えに関与する。Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位は大腸菌染色体内には存在しないので、遺伝子欠失に使用された直鎖状ＤＮＡ断片は、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位を含むべきである。
【００２２】
約５００ｂｐのホモロジーアームが上記のステップで使用されたので、より多くの種の組換えが発生でき、従ってより正確な欠失についての利点がある。
【００２３】
直鎖状ＤＮＡ断片は、標準電気穿孔法を使用して、微生物株に移されてもよい。染色体上の標的領域は、標的領域および直鎖状ＤＮＡ断片の両端に位置するホモロジーアームＡおよびＣ間でのλ−Ｒｅｄ組換えを介して直鎖状ＤＮＡ断片と置換された。直鎖状ＤＮＡ断片と置換された大腸菌変異株は、直鎖状ＤＮＡ断片上の抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質のタイプを含む培地内で選択された。
【００２４】
Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素の発現のためのベクターを選択変異株に形質転換した。その後、発現したＩ−ＳｃｅＩは、変異株から選択可能なマーカーを除去するために、染色体上にあるホモロジーアームＢの複製間の相同的組換えを誘発した。本発明の実施例では、Ｉ−ＳｃｅＩの発現に、プラスミドｐＳＴ９８ＡＳ（配列番号３３、 ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＡＦ１７０４８３、 Ｐｏｓｆａｉ Ｇ． Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏ Ｖ、 Ｂｅｒｅｃｓｋｉ Ｚ． Ｂｌａｔｔｎｅｒ ＦＲ． １９９９． Ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７ （２２）、 ４４０９−１５）を使用する。その後、微生物変異株はショ糖を含む培地上で選択された。一般に、ｓａｃＢ遺伝子はレバンスクラーゼ（levansucrase）をコード化する。レバンスクラーゼはショ糖をブドウ糖および果糖に加水分解し、果糖重合体、レバンを合成する。レバンは細胞に対して有毒であるから、ｓａｃＢ遺伝子を有する微生物は、ショ糖を含む培地内では生き残ることができない。従って、相同的組換えにより選択可能なマーカーおよびｓａｃＢ遺伝子を欠失した変異株は、ショ糖を含む培地内で選択されてもよい。
【００２５】
さらに、特定の遺伝子領域は、ステップ２）および３）を繰り返すことにより欠失される。
【００２６】
染色体領域を除去する方法を図２に示す。図２では、ａは選択可能なマーカー、ｓａｃＢ遺伝子、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位およびホモロジーアームＡ、ＢおよびＣを含む直鎖状ＤＮＡ断片を表し、ｂは欠失されるよう望まれる親染色体の一部を表し、ｃはλ−Ｒｅｄ組換えにより欠失標的領域で直鎖状ＤＮＡ断片と置換される染色体を表し、ｄはＩ−ＳｃｅＩ制限酵素を使用して染色体上の複製領域Ｂ間の相同的組換えを表し、ｅはどのような外来マーカーの残留もなく、特定の標的領域を欠失した染色体を表す。
【００２７】
上記の方法を使用してｗｃａ遺伝子クラスタ、ｆｉｍオペロンおよびｃｓｇオペロンのうち少なくとも一つを欠失した変異株の付着は、Ｄｏｒｅｌ（Ｄｏｒｅｌ Ｃ． ｅｔ ａｌ．、 ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、 １７８、 １６９、 １９９９）により開発された方法を使用して測定された。すなわち、２ｍｌのＬＢ培地を含む２４ウェルポリスチレンプレートに変異株を播種し、生物膜形成を可能にするために４８時間培養した。それぞれのウェルの上層は取り除かれ、ＬＢで二度洗浄されたものと混合され、プランクトン細胞と見なされた。ウェルに付着した生物膜細胞は、ピペット操作により１ｍｌのＬＢを使用して得られた。プランクトン細胞の濃度と生物膜細胞の濃度は、プレートカウント法により測定された。数の上で結果を比較するために、ウェルの表面で成長している生物膜細胞の付着率は、生物膜細胞の濃度を、プランクトン細胞および生物膜細胞の濃度の合計で割ることにより計算した。
【００２８】
変異株の抗生物質感受性は、Ｗｈｉｔｅｌｅｙ（Ｗｈｉｔｅｌｅｙ Ｍ．、 Ｎａｔｕｒｅ、 ４１３、 ８６０、 ２００１）により開発された手法を改良したものを使用して測定された。すなわち、０．２ｍｌのＬＢを含む９６ウェルポリスチレンプレートに変異株を播種し、２４時間培養し、生物膜形成を可能とした。それぞれのウェルは、０．２５μgから６４μgまでの範囲の様々な濃度抗生物質を添加し、１０時間培養した。生きている細胞の数はプレートカウント法により測定された。
【００２９】
変異株のリパーゼの拡散効率は、Ａｈｎ（Ａｈｎ Ｊ．Ｈ．、 Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １８１、 １８４７、 １９９９）により開発された手法を使用して測定した。本発明の実施例に従い、リパーゼの産生に必要な遺伝子を含むｐＨＯＰＥ（Ａｈｎ Ｊ． Ｈ．、 Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １８１、 １８４７、 １９９９）発現ベクターおよびｐＡＢＣ−ＡＣＹＣ（Ａｈｎ Ｊ．Ｈ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８１、１８４７、１９９９）発現ベクターを使用した。一般的に使用される電気穿孔法を使用して、発現ベクターを細胞に送った。５０ｍｌのＬＢ培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコに播種して、培養した。次に、一定期間を経て、１ｍｌの培養液を所定の時間帯ごとに採取して、１０分間１３、０００ｒｐｍで遠心分離し、４０５ｎｍの発光波長でリパーゼの活性を測定した。リパーゼの活性については、１分間で１μモルのｐ−ニトロフェニルヒドラジンパルミテートを分解できるリパーゼの量を一単位と定義する。
【００３０】
変異株の形質転換効率は、Ｍｏｌｃｈａｎｏｖａ（Ｍｏｌｃｈａｎｏｖａ、 Ｅ．Ｓ．、Ｇｅｎｅｔｉｋａ、１９、３７５、１９８３）により開発された塩化カルシウム熱衝撃形質転換方法を改良したものを使用して測定した。プラスミドベクター、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を野生型大腸菌および本発明の生物膜形成―抑制大腸菌ＤＥＢ３１に形質転換した。氷の上に置いた変異株のコンピテント細胞に１ｎｇから１００ｎｇまでの様々な濃度のプラスミドベクターを付加した。３０分後、８００ｍｌのＬＢプレートを付加する前に、９０分間４２℃で熱衝撃を加え、その後細胞を一時間３７℃で静置した。アンピシリンを含むＬＢプレートの上に細胞を播き、１６時間３７℃で培養した後、生きている変異株の数を確認した。
【００３１】
実施例
本発明は、下記の例によってさらに詳しく解説される。これらの例が挙げられている分野における標準的知識を持つ者にとっては、本発明をより明確に説明しているにすぎないことがはっきり分かるであろうが、発明は挙げられた例には限定されない。
【実施例１】
【００３２】
生物膜欠失大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＢ１１、ＤＥＢ１２およびＤＥＢ１３はｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロン、およびｗｃａ遺伝子クラスタを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２ ＭＧ１６５５（ソウル国立大学微生物学部Ｊｕｎｇ−Ｈｙｅ Ｒｏｅ教授）からそれぞれ欠失させることによって得られ、ＤＥＢ２１、ＤＥＢ２２、およびＤＥＢ２３のそれぞれは、ｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロン、およびｗｃａ遺伝子クラスタのうち少なくとも２つの遺伝子を欠失させることによって得られ、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株ＤＥＢ３１は全てのｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロン、およびｗｃａ遺伝子クラスタを欠失させることによって得られる。
【００３３】
１−１． ｃｓｇ遺伝子（ｃｓｇＤＥＦＧＢＡ）欠失大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＢ１１の調製
まず、ｐＳＧ７６Ｃベクター（Ｐｏｓｆａｉ Ｇ．、Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏ Ｖ．、Ｂｅｒｅｃｚｋｉ Ｚ．、Ｂｌａｔｔｎｅｒ ＦＲ １９９９年 染色体内の二重鎖切断で促進された大腸菌におけるマーカーレス遺伝子置換 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７（２２）、４４０９−１５）のＣｍR遺伝子（配列番号 ３４）を、２つの制限酵素ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州べバリー）で消化し、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位（配列番号 ３２）を含むｐＳＴ７６Ｋベクター（Ｐｏｓｆａｉ Ｇ、Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏ Ｖ．、Ｂｅｒｅｃｚｋｉ Ｚ．、Ｂｌａｔｔｎｅｒ ＦＲ １９９９年 染色体内の二重鎖切断で促進された大腸菌におけるマーカーレス遺伝子置換 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７（２２）、４４０９−１５）のＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ部位の中へ複製した。そして、ｐＤＥＬＴＡベクター（ＧＩＢＣＯＢＲＬ−ＤＥＬＥＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲＹ ＳＹＳＴＥＭ ＶＥＲＳＩＯＮ ２）からのｓａｃＢ遺伝子（配列番号３１）を制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州べバリー）で消化し、ＣｍR遺伝子およびＩ−ＳｃｅＩ認識部位を持つプラスミドの中へ複製した。構成されたプラスミドはｐＳＣＩと呼ぶ。
【００３４】
その後、標的領域（ｃｓｇＤＥＦＧＢＡ）の両端の領域と相同であるホモロジーアームＡ（配列番号 ７）およびＣ（配列番号 ９）を組換えＰＣＲで生成した。ホモロジーアームＡおよびＣはベクターの両端で結合し、λ−Ｒｅｄ組換えに関与する。さらに、相同的組換えによる選択可能なマーカーの除去に関与するホモロジーアームＢ（配列番号 ８）を生成し、組換えＰＣＲによって直鎖状ＤＮＡのホモロジーアームの一つに結合した。ホモロジーアームＡおよびＣをベクターの両端に位置付け、ホモロジーアームＢを一方の端に位置付けた後、直鎖状ＤＮＡ断片（配列番号 １０）を組換えＰＣＲによって生成した。図３（ａ）はＰＣＲの過程を表し、下記はその過程で使用されたプライマーである。
プライマーＡＡ： ５’−ｇｇｔｇａｃｔｇｇａａａｃｔｇｇｔｇｔｔａ−３’（配列番号 １）
プライマーＡＢ： ５’−ａｔｔａｔｃｇｇｔｔａｔｇａａａｇｃａａｃ−３’（配列番号 ２）
プライマーＢＡ： ５’−ｇｔｔｇｃｔｔｔｃａｔａａｃｃｆａｔａａｔａｃｃａｔｔａｔｔｃｃｔｇａａｇｔｃａｃｔｃｔ−３’（配列番号 ３）
プライマーＢＢ： ５’−ａｔｔａａｔｔｔｃｇａｔａａｇｃｃａｇａｔｃａｇｔｔｃａｔｔｔｃｔａｃｇｇｇｔｇａｔｇａ−３’（配列番号 ４）
プライマーＣＡ： ５’−ｇａｇｔｃｇａｃｃｔｇｃａｇｇｃａｔｇｃａｔｔｇｃａｇｃａａｔｃｇｔａｔｔｃｔ−３’（配列番号 ５）
プライマーＣＢ： ５’−ｔａａａｇｇｔｔａｔｃｔｇａｃｔｇｇａａａ−３’（配列番号 ６）
増幅ＤＮＡはＮｕｃｌｅｏｇｅｎｅ Ｇｅｌ−Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＫＩＴ（Ｎｕｃｌｅｏｎｇｅｎ、 Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ、 Ｋｏｒｅａ）を使用して分離した。
【００３５】
調製した直鎖状ＤＮＡ断片は、標準電気穿孔法［バイオ・ラッド社、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｌｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ Ｃａｔ Ｎｏ １６５−２０９８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、 ＪＲ、他 電気穿孔法による形質転換のための酵母細胞の調整に対する改善プロトコル Ｙｅａｓｔ １４、５６５−５７１（１９９８年）；Ｇｒａｎｔ、 ＳＧ他 トランスジェニックマウスＤＮＡから大腸菌メチル化制限性変異体への分化プラスミド救済 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７、４６４５−４６４９（１９９０年）］を使用することによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５株（ソウル国立大学微生物学部Ｊｕｎｇ−Ｈｙｅ Ｒｏｅ教授）へと移した。直鎖状ＤＮＡ断片は、染色体領域と同相である２つのホモロジーアームＡおよびＣを含むため、２つのホモロジーアーム間の遺伝子領域は直鎖状ＤＮＡ断片に置換される。置換された直鎖状ＤＮＡ断片を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株は、直鎖状ＤＮＡ断片中にＣｍR遺伝子が存在するためにクロラムフェニコールに対する耐性を示すので、クロラムフェニコールを含むＬＢプレート上で選択した。
【００３６】
Ｉ−ＳｃｅＩ発現ベクターｐＳＴ９８ＡＳ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＡＦ１７０４８３ Ｐｏｓｆａｉ Ｇ．Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏ Ｖ、Ｂｅｒｅｃｚｋｉ Ｚ、Ｂｌａｔｔｎｅｒ ＦＲ １９９９年 染色体内の二重鎖切断で促進された大腸菌におけるマーカーレス遺伝子置換 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７（２２）、４４０９−１５）は、選択可能なマーカーで置換されたｃｓｇオペロンを持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の中へ導入した。
【００３７】
ｐＳＴ９８ＡＳにおけるＩ−ＳｃｅＩ制限酵素の転写はテトラサイクリンプロモーターによって制御することができるため、制限酵素Ｉ−ＳｃｅＩはクロルテトラサイクリンを含むプレート上で培養することによって発現させた。この過程中、プレートにショ糖を付加することによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の染色体上のｓａｃＢ遺伝子の欠如を試験した。選択可能なマーカーおよびｓａｃＢ遺伝子を含む染色体の特定領域は、発現したＩ−ＳｃｅＩに誘発されたホモロジーアームＢ複製間の相同的組換えによって欠失された。よって、変異株はショ糖を含む培地にて選択することができる（図２参照）。選択された変異株からのｃｓｇＤＥＦＧＢＡ遺伝子の欠失は、ＰＣＲによって確認された。その変異株はＤＥＢ１１と名付けられた。
【００３８】
１−２．ｆｉｍオペロン（ｆｉｍＢＥＡＩＣＤＦＧＨ）を欠失させたＤＥＢ１２大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の調製
実施例１．１にて説明した同じ方法を使用し、ホモロジーアームＡ（配列番号 １７）、Ｂ（配列番号 １８）、Ｃ（配列番号 １９）および直鎖状ＤＮＡ断片（配列番号 ２０）を下記のプライマーを使用することによって調製し、そしてｆｉｍＢＥＡＩＣＤＦＧＨ遺伝子を欠失させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を調製してＤＥＢ１２と名付けた。
プライマーＡＡ： ５’−ｃａａｔｃｔｃａｔｇｇｃｇｔａａｇｃｔ−３’（配列番号 １１）
プライマーＡＢ： ５’−ｇａｔｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｔｃａｇｇａ−３’（配列番号 １２）
プライマーＢＡ： ５’−ｃｃｔｇａｃｃｃａｔａｇｔｇａａａｔｃｇｔｃｔｇｇｇａｔｔａａｃｇｇｃａａ−３’（配列番号 １３）
プライマーＢＢ： ５’−ａｔｔａａｔｔｔｃｇａｔａａｇｃｃａｇａｔｃｔａｇａｔｃｃａｇｃａａｃｔｇｇｔｃａ−３’（配列番号 １４）
プライマーＣＡ： ５’−ｇａｇｔｃｇａｃｃｔｇｃａｇｇｃａｔｇｃｃｃｇｇａａａｃｃａｔｔａｃａｇａｃｔ−３’（配列番号 １５）
プライマーＣＢ： ５’−ｃｃｇｔｇｔｔａｔｔｃｇｃｔｇｇａａ−３’（配列番号 １６）
【００３９】
１−３．ｗｃａ遺伝子クラスタ（ｗｚａ ｗｚｂ ｗｚｃ ｗｃａＡＢＣＤＥＦ ｇｍｄ ｗｃａＧＨＩ ｍａｎＣ ｍａｎＢ ｗｃａＪ ｗｚｘ ｗｃａＫＬ）を欠失させたＤＥＢ１３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の調製
実施例１−１にて説明した同じ方法を使用し、ホモロジーアームＡ（配列番号 ２７）、Ｂ（配列番号 ２８）、Ｃ（配列番号 ２９）および直鎖状ＤＮＡ断片（配列番号 ３０）を下記のプライマーによって調製し、ｗｚａ、ｗｚｂ、ｗｚｃ、ｗｃａＡＢＣＤＥＦ、ｇｍｄ、ｗｃａＧＨＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ、ｗｃａＪ、ｗｚｘおよびｗｃａＫＬ遺伝子を欠失させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を調製してＤＥＢ１３と名付けた。
プライマーＡＡ： ５’−ｇｔｔａｔｇａａａｔｃｃｃｔｇｇｃｇｔ−３’（配列番号 ２１）
プライマーＡＢ： ５’−ｇｇｃｔｔｔａｔａｇａｇｇａｇａａｃｇｃａｔ−３’（配列番号 ２２）
プライマーＢＡ： ５’−ａｔｇｃｇｔｔｃｔｃｃｔｃｔａｔａａａｇｃｃｃｃｇｃｔｔａｔｃａａｇｇｔｔａｃｔｇａｃ−３’（配列番号 ２３）
プライマーＢＢ： ５’−ａｔｔａａｔｔｔｃｇａｔａａｇｃｃａｇａｔｃｇｔｃａａｃｃｔａａａｇａａａｃｔｃｃｔａａ−３’（配列番号 ２４）
プライマーＣＡ： ５’−ｇａｇｔｃｇａｃｃｔｇｃａｇｇｃａｔｇｃｃｃａｔｔｇｔｇｔｇｔｔａｇｃａｃｃａ−３’（配列番号 ２５）
プライマーＣＢ： ５’−ｇｃｔｇａｔｔｔｃｇａｔｃｔｃｇａｃａ−３’（配列番号 ２６）
【００４０】
１−４．ｃｓｇオペロンおよびｆｉｍオペロンが欠失したＤＥＢ２１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の調製
ｃｓｇオペロンおよびｆｉｍオペロンを欠失させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を、実施例１−１および１−２の方法を連続して使用することによって調製し、ＤＥＢ２１と名付けた。
【００４１】
１−５．ｃｓｇオペロンおよびｗｃａ遺伝子クラスタが欠失したＤＥＢ２２大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の調製
ｃｓｇオペロンおよびｗｃａ遺伝子クラスタが欠失した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を、実施例１−１および１−３の方法を連続して使用することによって調製し、ＤＥＢ２２と名付けた。
【００４２】
１−６．ｆｉｍオペロンおよびｗｃａ遺伝子クラスタが欠失したＤＥＢ２３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の調製
ｆｉｍオペロンおよびｗｃａ遺伝子クラスタが欠失した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を、実施例１−２および１−３の方法を連続して使用することによって調製し、ＤＥＢ２３と名付けた。
【００４３】
１−７．ｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロン、およびｗｃａ遺伝子クラスタを全て欠失させたＤＥＢ３１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の調製
ｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロン、およびｗｃａ遺伝子クラスタが欠失した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を、実施例１−１、１−２、および１−３の方法を連続して使用することによって調製した。その変異株はＤＥＢ３１と名付け、２００２年１１月１３日に韓国生命工学研究所遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託した（寄託番号ＫＣＴＣ １０３７４ＢＰ）。
【実施例２】
【００４４】
生物膜形成の抑制の確認
野生型細胞ＭＧ１６５５と比較して、実施例１−１から１−７より得られた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の抑制効果を判定するため、Ｄｏｒｅｌが開発した上記の方法を使用して変異株および親細胞の付着率を測定した。結果を図４に示した。
付着率（％）＝（付着した細胞の数）／（合計細胞数）×１００
結果として、一つの遺伝子が欠失した変異株でさえも、ＤＥＢ１１、ＤＥＢ１２、およびＤＥＢ１３は壁に付着した微生物の数の有意な減少を示した。特に、カーリ関連遺伝子が欠失したＤＥＢ１１の付着の約１５％が減少した。
【００４５】
さらに、標的領域がより欠失すると、付着した細胞の数はさらに著しく減少した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムからすべての標的領域が欠失すると、約６％の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＢ３１しか壁に付着していなかった（図４）。
【実施例３】
【００４６】
変異株の抗生物質感受性の測定
実施例２で確認された、生物膜関連遺伝子を欠失させた後の生物膜形成の著しい抑制効果を持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を、生物膜形成の減少が抗生物質感受性を大幅に増加させるかどうか判定するために試験した。
【００４７】
２００μｌのＬＢ培地を含む９６ウェルプレートにて変異株を２４時間培養した後、連続希釈した抗生物質を以下の濃度で各ウェルに添加した；アンピシリン０〜１２８μg／ｍｌ、ストレプトマイシン０〜６４μg／ｍｌ、およびリファンピシン０〜２５６μg／ｍｌ。抗生物質付加後、細胞をさらに３０℃で１０時間培養した。そして、標準プレートカウント法を使用して生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の数を数えた。結果を図５、６および７に示した。
【００４８】
図５に示されるように、アンピシリンの場合、５０μg／ｍｌの標準濃度で選択された生存している野生型ＭＧ１６５５の数は、２μg／ｍｌの濃度で選択された生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＢ３１と同じであった。つまり、生物膜欠失大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株のアンピシリンに対する感受性は２５倍に増加し、そして同じ選択効果が２５分の１に減少したアンピシリンの量で得ることができた。
【００４９】
図６に示されているように、ストレプトマイシンの場合、３０μg／ｍｌの標準濃度で選択された生存している野生型ＭＧ１６５５の数は、８μg／ｍｌの濃度で選択された生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＢ３１と同じであった。つまり、生物膜欠失大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株のストレプトマイシンに対する感受性は４倍に増加し、そして同じ選択効果が４分の１に減少したストレプトマイシンの量で得ることができた。
【００５０】
リファンピシンでは同様の結果が示された。図７に示されているように、１５０μg／ｍｌの標準濃度で選択された生存している野生型ＭＧ１６５５の数は、３２μg／ｍｌの濃度で選択された生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＢ３１と同じであった。つまり、本発明の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株は、リファンピシンに対する感受性が約５倍に増加したことが確認された。
【実施例４】
【００５１】
変異株の溶質拡散効率の測定
実施例２において、生物膜関連遺伝子を欠失させることによって生物膜形成を著しく減少させたことが確認された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を、生物膜形成の抑制が大幅に溶質拡散効率を増加させたかどうか確認するために試験した。
【００５２】
リパーゼ発現ベクターｐＨＯＰＥ（Ａｈｎ Ｊ．Ｈ．、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８１、１８４７、１９９９年）およびリパーゼＡＢＣトランスポーター発現ベクターｐＡＢＣ−ＡＣＹＣ（Ａｈｎ Ｊ．Ｈ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８１、１８４７、１９９９年）を、標準電気穿孔法を使用して細胞内へと移した。変異株は５０ｍｌのＬＢ培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ内で培養された。培養の一部（１ｍｌ）を時間間隔をもって採取し、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み（２００μｌ）は４５℃で１０分間培養する前に、３ｍＬの１００μＭ ｐ−ニトロフェニルパルミテートと混ぜ合わせた。そして４０５ｎｍでの吸光度を測定することによって、リパーゼの活性を検出した。リパーゼ活性の１単位は、１分間につき１μモルのｐ−ニトロフェニルパルミテートを分解させるのに必要な酵素の量として定義された。
【００５３】
結果は図８に示されている。図８に示されているように、培養の２４時間後、培地で分泌されたリパーゼの量は最大となり、リパーゼの活性が１１％増加したことを示した。
【実施例５】
【００５４】
変異株の形質転換効率の測定
実施例２において、生物膜関連遺伝子を欠失させることによって生物膜形成を著しく減少させたことが確認された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株を、生物膜形成の減少が大幅に形質転換効率を増加させたかどうか判定するために試験した。
【００５５】
塩化カルシウム熱衝撃形質転換法（Ｍｏｌｃｈａｎｏｖａ Ｅ．Ｓ．、Ｇｅｎｅｔｉｋａ １９、３７５、１９８３年）を使用することによって、プラスミドベクターｐＵＣ１９を野生型ＭＧ１６５５および生物膜形成を抑制されたＤＥＢ３１に移した。形質転換体はアンピシリンを含むＬＢ上に播いた。そして、３７℃で１６時間培養し、生存している変異株の数を判定した。結果は表１に示されている。
【００５６】
表１に示されているように、生物膜形成を抑制された変異株の形質転換効率は野生型よりも２０倍高かった。
【００５７】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００５８】
上述したように、本発明は、生物膜関連遺伝子を欠失させることによって抗生物質感受性を大幅に増加させ、同じ選択効率を得るために必要な抗生物質の量がより少なくなり、望ましい変異株以外の株の生存率を減少させることができる、大腸菌変異株に関する。よって、本発明は生物学的製品産業において有用となり得る。また、生物膜形成の抑制により溶質拡散効率を増加させることができ、分泌物の量を増加させることができる。さらに、生物膜形成の抑制により形質転換効率の増加が有用物質の産生をより容易にする。加えて、生物膜形成による設備の老化の速度を落とすことによって、生物学的製品を生産する際に使用される設備の費用を削減する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体の領域を欠失させるために使われる直鎖状ＤＮＡ断片を表す。
【図２】直鎖状ＤＮＡ断片を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の特定遺伝子を欠失させるステップを示す。
【図３】直鎖状ＤＮＡ断片を構成するためのＰＣＲの過程を示す。
【図４】本発明の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の付着率を測定することによる、生物膜関連遺伝子の欠失の確認の結果を示す。
【図５】本発明による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株のアンピシリンに対する感受性を示す。
【図６】本発明による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株のストレプトマイシンに対する感受性を示す。
【図７】本発明による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株のリファンピシンに対する感受性を示す。
【図８】本発明による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の溶質拡散効率を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物ゲノム領域を欠失させるための直鎖状ＤＮＡ断片であって、
λ−Ｒｅｄ組換えのための両端の約５００塩基対のホモロジーアームＡおよびＣと、
選択可能なマーカー、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位（配列番号 ３２）およびｓａｃＢ遺伝子（配列番号 ３１）と、
前記ホモロジーアームＡまたはＣに結合可能な、相同的組換えのためのホモロジーアームＢと、
を備え、前記選択可能なマーカー、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位、ｓａｃＢ遺伝子、およびホモロジーアームＢは、ホモロジーアームＡおよびＣの間に配置され、
前記ホモロジーアームＡおよびＣはそれぞれ、欠失される微生物の遺伝子領域の両端のうち一方に結合される、約５００塩基対のゲノム領域と相同的であり、
前記ホモロジーアームＢは、欠失の標的となる微生物遺伝子領域の１つであって、前記ホモロジーアームＡおよびＣと相同的である領域、に結合されている微生物の約５００塩基対の遺伝子領域と相同的である、微生物ゲノム領域を欠失させるための直鎖状ＤＮＡ断片。
【請求項２】
配列番号 １０、２０または３０の塩基配列を有する、請求項１に記載の直鎖状ＤＮＡ断片。
【請求項３】
請求項１に記載の直鎖状ＤＮＡ断片を使用したλ−Ｒｅｄ組換えおよび相同的組換えにより、生物膜関連遺伝子であるｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロンおよびｗｃａ遺伝子クラスタのうちの少なくとも１つが欠失することで、生物膜形成が抑制されていることを特徴とする、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株。
【請求項４】
前記λ−Ｒｅｄ組換えおよび相同的組換えは、配列番号１０、２０および３０の塩基配列を有するＤＮＡ断片から成る群から選択される少なくとも１つの直鎖状ＤＮＡ断片を使用して起こる、請求項３に記載の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株。
【請求項５】
前記λ−Ｒｅｄ組換えおよび相同的組換えは、配列番号１０、２０および３０の塩基配列を有するＤＮＡ断片から成る群から選択される少なくとも２つの直鎖状ＤＮＡ断片を使用して繰り返される、請求項４に記載の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株。
【請求項６】
前記λ−Ｒｅｄ組換えおよび相同的組換えは、配列番号 １０、２０および３０の塩基配列を有する直鎖状ＤＮＡ断片のすべてを使用して繰り返される、請求項５に記載の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株。
【請求項７】
前記変異株がＤＥＢ ３１（寄託番号ＫＣＴＣ １０３７４ＢＰ）である、請求項６に記載の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株。
【請求項８】
特定のゲノム領域が欠失した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の調製方法であって、
１）請求項１に記載の直鎖状ＤＮＡ断片を調製するステップと、
２）前記直鎖状ＤＮＡ断片を微生物に挿入し、前記ホモロジーアームＡおよびＣと、染色体上のそれらの相同的ゲノム領域とのλ−Ｒｅｄ組換えによって、欠失されるべきゲノム領域を前記直鎖状ＤＮＡ断片と置換した後、選択可能なマーカーに対応する抗生物質を含む培地中で培養することにより形質転換した微生物を選択するステップと、
３）Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素発現ベクターを選択された微生物に導入し、２つのホモロジーアームＢの間の相同的組換えにより選択可能なマーカーおよびｓａｃＢ遺伝子を欠失させた後、ショ糖を含む培地中で培養して外来マーカーをもたないマーカーレス欠失変異株を選択するステップと、
を含む調製方法。
【請求項９】
少なくとも１つのゲノム領域を欠失させるために、ステップ２）およびステップ３）が繰り返される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロン、およびｗｃａ遺伝子クラスタのうちの少なくとも１つが欠失される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｃｓｇオペロンは、それぞれ配列番号 ７、８および９を有するホモロジーアームＡ、ＢおよびＣを使用して欠失され、前記ｆｉｍオペロンは、それぞれ配列番号 １７、１８および１９を有するホモロジーアームＡ、ＢおよびＣを使用して欠失され、あるいは前記ｗｃａ遺伝子クラスタは、それぞれ配列番号 ２７、２８および２９を有するホモロジーアームＡ、ＢおよびＣを使用して欠失される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロンおよびｗｃａ遺伝子クラスタから成る群から選択される少なくとも２つの遺伝子が欠失される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロンおよびｗｃａ遺伝子クラスタのすべてが欠失される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
微生物ゲノム領域を欠失させるための直鎖状ＤＮＡ断片であって、
λ−Ｒｅｄ組換えのための両端の約５００塩基対のホモロジーアームＡおよびＣと、
選択可能なマーカー、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位（配列番号 ３２）およびｓａｃＢ遺伝子（配列番号 ３１）と、
前記ホモロジーアームＡまたはＣに結合可能な、相同的組換えのためのホモロジーアームＢと、
を備え、前記選択可能なマーカー、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位、ｓａｃＢ遺伝子、およびホモロジーアームＢは、ホモロジーアームＡおよびＣの間に配置され、
前記ホモロジーアームＡおよびＣはそれぞれ、欠失される微生物の遺伝子領域の両端のうち一方に結合される、約５００塩基対のゲノム領域と相同的であり、
前記ホモロジーアームＢは、欠失の標的となる微生物遺伝子領域の１つであって、前記ホモロジーアームＡおよびＣと相同的である領域、に結合されている微生物の約５００塩基対の遺伝子領域と相同的である、微生物ゲノム領域を欠失させるための直鎖状ＤＮＡ断片。
【請求項２】
配列番号 １０、２０または３０の塩基配列を有する、請求項１に記載の直鎖状ＤＮＡ断片。
【請求項３】
請求項１に記載の直鎖状ＤＮＡ断片を使用したλ−Ｒｅｄ組換えおよび相同的組換えにより、生物膜関連遺伝子であるｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロンおよびｗｃａ遺伝子クラスタのうちの少なくとも１つが欠失することで、生物膜形成が抑制されていることを特徴とする、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株。
【請求項４】
前記λ−Ｒｅｄ組換えおよび相同的組換えは、配列番号１０、２０および３０の塩基配列を有するＤＮＡ断片から成る群から選択される少なくとも１つの直鎖状ＤＮＡ断片を使用して起こる、請求項３に記載の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株。
【請求項５】
前記λ−Ｒｅｄ組換えおよび相同的組換えは、配列番号１０、２０および３０の塩基配列を有するＤＮＡ断片から成る群から選択される少なくとも２つの直鎖状ＤＮＡ断片を使用して繰り返される、請求項４に記載の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株。
【請求項６】
前記λ−Ｒｅｄ組換えおよび相同的組換えは、配列番号 １０、２０および３０の塩基配列を有する直鎖状ＤＮＡ断片のすべてを使用して繰り返される、請求項５に記載の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株。
【請求項７】
前記変異株がＤＥＢ ３１（寄託番号ＫＣＴＣ １０３７４ＢＰ）である、請求項６に記載の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株。
【請求項８】
特定のゲノム領域が欠失した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株の調製方法であって、
１）請求項１に記載の直鎖状ＤＮＡ断片を調製するステップと、
２）前記直鎖状ＤＮＡ断片を微生物に挿入し、前記ホモロジーアームＡおよびＣと、染色体上のそれらの相同的ゲノム領域とのλ−Ｒｅｄ組換えによって、欠失されるべきゲノム領域を前記直鎖状ＤＮＡ断片と置換した後、選択可能なマーカーに対応する抗生物質を含む培地中で培養することにより形質転換した微生物を選択するステップと、
３）Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素発現ベクターを選択された微生物に導入し、２つのホモロジーアームＢの間の相同的組換えにより選択可能なマーカーおよびｓａｃＢ遺伝子を欠失させた後、ショ糖を含む培地中で培養して外来マーカーをもたないマーカーレス欠失変異株を選択するステップと、
を含む調製方法。
【請求項９】
少なくとも１つのゲノム領域を欠失させるために、ステップ２）およびステップ３）が繰り返される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロン、およびｗｃａ遺伝子クラスタのうちの少なくとも１つが欠失される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｃｓｇオペロンは、それぞれ配列番号 ７、８および９を有するホモロジーアームＡ、ＢおよびＣを使用して欠失され、前記ｆｉｍオペロンは、それぞれ配列番号 １７、１８および１９を有するホモロジーアームＡ、ＢおよびＣを使用して欠失され、あるいは前記ｗｃａ遺伝子クラスタは、それぞれ配列番号 ２７、２８および２９を有するホモロジーアームＡ、ＢおよびＣを使用して欠失される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロンおよびｗｃａ遺伝子クラスタから成る群から選択される少なくとも２つの遺伝子が欠失される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｃｓｇオペロン、ｆｉｍオペロンおよびｗｃａ遺伝子クラスタのすべてが欠失される、請求項１２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００８−５１１３１５（Ｐ２００８−５１１３１５Ａ）
【公表日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２９７０７（Ｐ２００７−５２９７０７）
【出願日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００２８９８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２５７０２
【国際公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【出願人】（５９６０７１７５２）コリア アドバンスト インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー (60)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００２８９８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２５７０２
【国際公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【出願人】（５９６０７１７５２）コリア アドバンスト インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー (60)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]