本発明は、ポリペプチドによってＤＮＡ配列内の塩基対を選択的に認識する方法、ＤＮＡ配列内の１つ以上の塩基対を特異的に認識する修飾されたポリペプチド、およびポリペプチドによって特異的に認識され得るように修飾されるＤＮＡ、および特異的ＤＮＡ標的化におけるポリペプチドおよびＤＮＡの使用、ならびに細胞中の標的遺伝子の発現を調節する方法に言及する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドによって標的ＤＮＡ配列内の塩基対を選択的に認識する方法、標的ＤＮＡ配列内の１つ以上の塩基対を特異的に認識する修飾されたポリペプチド、およびポリペプチドによって特異的に認識され得るように修飾されるＤＮＡ、および特異的ＤＮＡ標的化におけるポリペプチドおよびＤＮＡの使用、ならびに細胞中の標的遺伝子の発現を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キサントモナス属の植物病原性細菌は、多くの重要な作物に重度の疾患を引き起こす。この細菌は、大型転写活性化因子様（ＴＡＬ）／ＡｖｒＢｓ３様エフェクターファミリーのメンバーを含むエフェクターの備蓄を、ＩＩＩ型分泌系を介して、植物細胞へと転座させる（Ｋａｙ＆Ｂｏｎａｓ（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：３７−４３、Ｗｈｉｔｅ＆Ｙａｎｇ（２００９）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．ｄｏｉ：１０．１１０４／ｐｐ．１１０９．１３９３６０、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６３：２５６−２７２）。キサントモナスの主要な病原性因子であるＴＡＬエフェクターは、縦列反復の中央ドメイン、核局在シグナル（ＮＬＳ）、および活性化ドメイン（ＡＤ）を含有し、植物細胞中の転写因子として作用する（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８：６４８−６５１、Ｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８：６４５−６４８、Ｇｕ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ４３５、１１２２−１１２５、図１ａ）。このエフェクターファミリーのタイプメンバーである、キサントモナス・カンペストリス・パソバー・ベシカトリアからのＡｖｒＢｓ３は、１７．５反復を含有し、トウガラシ植物内のＢｓ３抵抗性遺伝子を含むＵＰＡ（ＡｖｒＢｓ３によって上方制御された）遺伝子の発現を誘発する（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８：６４８−６５１、Ｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８：６４５−６４８、Ｍａｒｏｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１５：６３７−６４６）。ＴＡＬエフェクター内での反復の数および順序が、その比活性を決定する（Ｈｅｒｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３５６：１７２−１７４）。この反復がＡｖｒＢｓ３のＤＮＡ結合に必須であり、新規ＤＮＡ結合ドメインを構成することが示された（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８：６４８−６５１）。このドメインがどのようにＤＮＡに接触するか、および何が特異性を決定するかは依然として謎である。
【０００３】
選択的遺伝子発現は、タンパク質転写因子の、遺伝子の制御性領域内での特異的ヌクレオチド配列との相互作用を介して仲介される。ＤＮＡ結合タンパク質ドメインが、異なるＤＮＡ配列間を識別することができる様態は、分化および発生における遺伝子発現の制御等の、極めて重要なプロセスを理解するのに重要な議題である。
【０００４】
所望のＤＮＡ標的を認識するＤＮＡ結合ドメインを特異的に設計および生成する能力は、バイオテクノロジーにおいて非常に望ましい。かかる能力は、標的ＤＮＡ結合によって遺伝子発現を調節する能力を備えるカスタム転写因子の開発に有用であり得る。例としては、所望の標的ＤＮＡ配列に特異的な、カスタム亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質の設計を用いて行われる大規模な操作が挙げられる（Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７２：６４５、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：９３−９６、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：５５２５−５５３０（１９９７）、Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１３２９６−１３３０１、米国特許第７，２７３，９２３号、米国特許第７，２２０，７１９号）。さらに、デザイナーＤＮＡ結合ドメインを含有するポリペプチドは、ポリペプチド内のヌクレアーゼ触媒ドメイン等のドメインを修飾するＤＮＡの組み込みによって、実際の標的ＤＮＡ配列を修飾するために利用することができる。かかる例としては、非特異的ヌクレアーゼドメインと組み合わせた、メガヌクレアーゼ／ホーミングエンドヌクレアーゼＤＮＡ認識部位のＤＮＡ結合ドメイン（米国特許出願第２００７／０１４１０３８号を参照されたい）、修飾されたメガヌクレアーゼＤＮＡ認識部位および／または同一のまたは異なるメガヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメイン（米国特許出願公開第２００９０２７１８８１号を参照されたい）、および典型的にＦｏｋＩ等のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからの、ヌクレアーゼ活性を備えるドメインと組み合わせた亜鉛フィンガードメイン（Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３００：７６４、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ４３５，６４６、Ｓｋｕｋｌａ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ４５９，４３７−４４１、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ４５９：４４２４４５、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ９３：１１５６−１１６０、米国特許第７，１６３，８２４号）が挙げられる。カスタム亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを特定するために利用される現在の方法は、所望のＤＮＡ特異性を備えるマルチフィンガードメインを生成するために、大型無作為化ライブラリ（典型的に１０^８超のサイズ）を利用する、組み合わせ選択に基づく方法を採用する（Ｇｒｅｉｓｍａｎ＆Ｐａｂｏ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７５：６５７−６６１、Ｈｕｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１００：１２２７１−１２２７６、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１９：６５６−６６０。かかる方法は、時間がかかり、技術的に要求が厳しく、かつ潜在的に相当の費用がかかる。ＤＮＡ結合ポリペプチドの操作のための、単純な認識コードの特定は、所望のヌクレオチド標的を認識するＤＮＡ結合ドメインを設計するための現在の方法を上回る有意な前進を表すであろう。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ＤＮＡ配列内の塩基対を選択的に認識するポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、反復ドメインを含むポリペプチドを合成することを含み、ここで反復ドメインは、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、ここで反復単位は、ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する高度可変領域を含み、ここで反復単位は、ＤＮＡ配列内の１つの塩基対の認識に関与する。本発明のこれらのポリペプチドは、本発明の反復単位を含み、その後、最終目的ベクターへと組み立てることができる、標的ベクター内の反復単位を事前組み立てすることによるモジュラーアプローチによって構築することができる。本発明は、この方法で産生されるポリペプチド、ならびにポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、およびかかるＤＮＡ配列を含む宿主生物および細胞を提供する。
【０００６】
本発明は、ポリペプチドによって、標的ＤＮＡ配列内の塩基対を選択的に認識する方法を提供し、ここでポリペプチドは、反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含み、ここで反復単位は、各々、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する高度可変領域を含む。
【０００７】
より具体的には、本発明者らは、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の選択的認識に関与する、ＤＮＡ結合ポリペプチド内におけるアミノ酸を決定した。認識コードの解明と共に、ポリペプチド内で選択されたアミノ酸によって標的ＤＮＡ配列内の特異的塩基対を認識するための一般原則が決定された。本発明者らは、異なる長さの反復単位配列の部分である特定タイプの反復単位が、１つの規定／特異的塩基対を認識する能力を有することを見出している。反復ドメインを形成する各反復単位内で、高度可変領域は、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の特異的な認識に関与する。
【０００８】
したがって、本発明は、反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含むポリペプチドによって、標的ＤＮＡ配列内の塩基対を選択的に認識する方法だけでなく、ポリペプチド内の反復ドメインによって、選択的に認識される標的ＤＮＡ配列が生成され得る方法も提供する。
【０００９】
本発明はまた、特異的ＤＮＡ配列を認識するポリペプチドを構築する方法を提供する。本発明のこれらのポリペプチドは、本発明の反復単位を含み、その後、最終目的ベクターへと組み立てることができる、標的ベクター内の反復単位を事前組み立てすることによるモジュラーアプローチによって構築することができる。
【００１０】
本発明はまた、目的の標的ＤＮＡ配列に特異的なモジュラー反復単位を構築すること、ポリペプチドが今度は標的ＤＮＡを認識することを可能にするために、反復単位の付加によってポリペプチドを修飾すること、修飾されたポリペプチドが標的ＤＮＡ配列を認識することを可能にするために、修飾されたポリペプチドを原核または真核細胞中に導入または発現すること、およびかかる認識の結果として、細胞中の標的遺伝子の発現を調節することによる、遺伝子発現の標的調節のための方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、標的ＤＮＡ配列を認識する、本発明の少なくとも１つの反復ドメインを含むポリペプチドの構築による、標的ＤＮＡ配列の指向性修飾のための方法を提供し、ポリペプチドはまた、標的ＤＮＡを修飾することができる機能ドメインを含有し（部位特異的組み換え、ドナー標的配列の制限または統合を介して等）、それによって複合ゲノム内の標的ＤＮＡ修飾を可能にする。
【００１２】
本発明はさらに、反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含む修飾されたポリペプチドの産生を提供し、ここで反復単位の各々の内の高度可変領域は、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の選択的認識を決定する。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態では、上述の反復ドメインを含有するポリペプチドをコードするＤＮＡが提供される。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態では、標的ＤＮＡ配列内に位置する１つ以上の塩基対の各々が、対応する反復単位を有する反復ドメインを含むポリペプチドによって特異的に認識され得るように、標的ＤＮＡ配列内に位置する１つ以上の塩基対を含むように修飾されるＤＮＡが提供され、各反復単位は、ＤＮＡ内の対応する塩基対の認識を決定する高度可変領域を含む。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態では、ポリペプチドおよびＤＮＡの使用が提供される。さらに、本発明の単離された核酸分子、および本発明のコード配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドで形質転換された植物、植物部分、種子、植物細胞、および他の非ヒト宿主細胞が提供される。またさらに、本明細書に記載されるポリペプチドおよびＤＮＡは、動物およびヒト細胞、ならびに真菌または植物等の他の生物の細胞に導入することができる。
【００１６】
要約すると、本発明は、ポリペプチドによって、標的ＤＮＡ配列内の塩基対を選択的に認識する方法に焦点を合わせ、ここでポリペプチドは、反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含み、ここで各反復単位は、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する高度可変領域を含有し、ここで連続した反復単位は、標的ＤＮＡ配列内の連続した塩基対に相当する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ標的特異性のためのモデル。（Ａ）ＴＡＬエフェクターは、中央縦列反復単位（赤色）、核局在シグナル（ＮＬＳ）、および活性化ドメイン（ＡＤ）を含有する。ＡｖｒＢｓ３の第１反復のアミノ酸配列。高度可変アミノ酸１２および１３は、灰色で網掛けされている。（Ｂ）１７．５個のＡｖｒＢｓ３反復単位の１２位および１３位における高度可変アミノ酸は、ＵＰＡボックスコンセンサス（２１）に対して整列される。（Ｃ）誘発遺伝子のプロモーター内のＴＡＬエフェクターの反復単位および予測標的配列は、手動で整列された。各反復内の高度可変アミノ酸に相当する上部ＤＮＡ鎖内のヌクレオチドは、８つのエフェクターと、実験的に特定された標的遺伝子との次の組み合わせに基づいて数えられた：ＡｖｒＢｓ３／Ｂｓ３、ＵＰＡ１０、ＵＰＡ１２、ＵＰＡ１４、ＵＰＡ１９、ＵＰＡ２０、ＵＰＡ２１、ＵＰＡ２３、ＵＰＡ２５、ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６／Ｂｓ３−Ｅ、ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１０９／Ｂｓ３、ＡｖｒＨａｈ１／Ｂｓ３、ＡｖｒＸａ２７／Ｘａ２７、ＰｔｈＸｏ１／Ｘａ１３、ＰｔｈＸｏ６／ＯｓＴＦＸ１、ＰｔｈＸｏ７／ＯｓＴＦＩＩＡγ１（図５参照）。優性の組み合わせ（ｎ＞４）は、灰色で網掛けされている。アスタリスクは、この反復タイプでアミノ酸１３が欠損していることを示す。（Ｄ）高度可変アミノ酸１２および１３（この研究で実験的に証明された）に基づく反復タイプのＤＮＡ標的特異性コード（Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）。
【図２】Ｈａｘ２、Ｈａｘ３、およびＨａｘ４の標的ＤＮＡ配列。（Ａ）Ｈａｘ２、Ｈａｘ３、およびＨａｘ４反復単位、ならびに予測標的ＤＮＡ特異性（Ｈａｘボックス）のアミノ酸１２および１３。（Ｂ）Ｈａｘボックスは、ミニマルＢｓ４プロモーターの前で、ＧＵＳレポーターベクターへとクローン化された。（Ｃ）Ｈａｘエフェクターによる、Ｈａｘボックスの特異的誘発性。ＧＵＳレポーター構築物は、それぞれ３５Ｓ主導型ｈａｘ２、ｈａｘ３、ｈａｘ４、および空のＴ−ＤＮＡ（−）と共に、Ａ．ツメファシエンスを介してＮ．ベンサミアナに共送達された（エラーバーは標準偏差を示す、ｎ＝３試料、４−ＭＵ、４−メチルウンベリフェロン）。３５Ｓ：：ｕｉｄＡ（＋）は、対照として機能した。葉片は、Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド）で染色された。
【図３】反復タイプのＤＮＡ塩基対認識特異性。（Ａ）Ｈａｘ４誘導体およびＡｒｔＸボックス誘導体は、ミニマルＢｓ４プロモーターの前で、ＧＵＳレポーターベクターへとクローン化された。（Ｂ）ＮＧ、ＨＤ、ＮＩ、およびＮＳ反復単位の特異性。反復タイプ標的塩基中で置換された、Ｈａｘ４ボックス誘導体のＨａｘ４誘発性（灰色の背景）。（Ｃ）ＮＮ反復単位の特異性。人工エフェクターＡｒｔＸ１および予測標的ＤＮＡ配列。ＮＮ反復標的塩基中で置換された、ＡｒｔＸ１ボックス誘導体のＡｒｔＸ１誘発性（灰色の背景）。（Ｄ）人工エフェクターＡｒｔＸ２およびＡｒｔＸ３ならびに誘導ＤＮＡ標的配列。（Ｅ）人工エフェクターによる、ＡｒｔＸボックスの特異的誘発性。（Ａ）〜（Ｅ）ＧＵＳレポーター構築物は、それぞれ３５Ｓ主導型ｈａｘ４、ａｒｔＸ１、ａｒｔＸ２、またはａｒｔＸ３遺伝子、および空のＴ−ＤＮＡ（−）と共に、Ａ．ツメファシエンスを介してＮ．ベンサミアナへと共送達された。３５Ｓ：：ｕｉｄＡ（＋）は、対照として機能した。葉片は、Ｘ−Ｇｌｕｃで染色された。定量データについては、図１１を参照されたい。
【図４】最小数の反復単位が、転写活性化に必要とされる。（Ａ）異なる数（０．５〜１５．５個）のＨＤ反復単位（合計１．５〜１６．５個の反復単位）を備える、人工ＡｒｔＨＤエフェクター。（Ｂ）ＴＡおよび１７ＣからなるＡｒｔＨＤ標的ボックスは、ミニマルＢｓ４プロモーターの前で、ＧＵＳレポーターベクターへとクローン化された。（Ｃ）異なる数の反復単位を備えるＡｒｔＨＤエフェクターによるプロモーター活性化。３５Ｓ主導型エフェクター遺伝子または空のＴ−ＤＮＡ（−）は、ＧＵＳレポーター構築物と共に、Ａ．ツメファシエンスを介してＮ．ベンサミアナへと共送達された（エラーバーは標準偏差を示す、ｎ＝３試料、４−ＭＵ）。３５Ｓ：：ｕｉｄＡ（＋）は、対照として機能した。葉片は、Ｘ−Ｇｌｕｃで染色された。
【図５】誘発遺伝子のプロモーター内のＤＮＡ標的配列の、ＴＡＬエフェクター反復単位の高度可変アミノ酸１２および１３との整列。（Ａ）ＡｖｒＢｓ３、ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６、ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１０９、およびＡｖｒＨａｈ１の反復単位は、トウガラシＥＣＷ−３０Ｒ Ｂｓ３遺伝子のプロモーター内のＵＰＡボックスに対して整列された（受入番号：ＥＵ０７８６８４）。ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６およびＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１０９は、それぞれ、反復単位１１〜１４および反復単位１２〜１４が欠失した、ＡｖｒＢｓ３の欠失誘導体である。ＡｖｒＢｓ３、ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１０９、およびＡｖｒＨａｈ１は、ＥＣＷ−３０Ｒ植物中のＨＲを誘発するが、ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６は、誘発しない。（Ｂ）ＡｖｒＢｓ３、ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６、ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１０９、およびＡｖｒＨａｈ１の反復単位は、トウガラシＥＣＷ Ｂｓ３−Ｅ遺伝子のプロモーター内の非機能ＵＰＡボックスに対して整列された（受入番号：ＥＵ０７８６８３）。ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６は、トウガラシＥＣＷ植物中のＨＲを誘発するが、ＡｖｒＢｓ３、ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１０９、またはＡｖｒＨａｈ１は、誘発しない。（Ｃ）ＡｖｒＸａ２７の反復単位は、イネＸａ２７遺伝子のプロモーター内の推定標的配列に対して整列された。Ｘａ２７（受入番号：ＡＹ９８６４９２）は、イネ品種ＩＲＢＢ２７中のＡｖｒＸａ２７によって誘発され、ＨＲをもたらすが、イネ品種ＩＲ２４中のｘａ２７（受入番号：ＡＹ９８６４９１）は誘発されない。（Ｄ）ＰｔｈＸｏ１の反復単位は、イネＸａ１３／Ｏｓ８Ｎ３遺伝子のプロモーター内の推定標的配列に対して整列された。Ｘａ１３（受入番号：ＤＱ４２１３９６）は、イネ品種ＩＲ２４中のＰｔｈＸｏ１によって誘発され、感受性をもたらすが、イネ品種ＩＲＢＢ１３中のｘａ１３（受入番号：ＤＱ４２１３９４）は、誘発されない。（Ｅ）ＰｔｈＸｏ６の反復単位は、イネＯｓＴＦＸ１遺伝子のプロモーター内の推定標的配列に対して整列された（受入番号：ＡＫ１０８３１９）。ＯｓＴＦＸ１は、イネ品種ＩＲ２４中のＰｔｈＸｏ６によって誘発される。（Ｆ）ＰｔｈＸｏ７の反復単位は、イネＯｓＴＦＩＩＡγ１遺伝子のプロモーター内の推定標的配列に対して整列された（ＣＢ０９７１９２）。ＯｓＴＦＩＩＡγ１は、イネ品種ＩＲ２４中のＰｔｈＸｏ７によって誘発される。（Ａ）〜（Ｆ）ＤＮＡ配列の上部の数字は、コード領域内の第１ＡＴＧまでのヌクレオチド距離を示す。我々の予測標的特異性とマッチしていない反復／塩基の組み合わせ（アミノ酸１２／１３：ＮＩ＝Ａ、ＨＤ＝Ｃ、ＮＧ＝Ｔ、ＮＳ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、ＮＮ＝Ａ／Ｇ、ＩＧ＝Ｔ）は、赤色で色付けされる。未知の標的ＤＮＡ特異性を備える反復単位は、緑色で色付けされる。
【図６】ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６によって保護されるＤＮＡ領域は、ＡｖｒＢｓ３でのＤＮＡ領域よりも４ｂｐ短い。ＡｖｒＢｓ３およびＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６とのＤＮａｓｅＩフットプリント分析の要約（図７、８を参照されたい）。（Ａ）それぞれ、ＡｖｒＢｓ３およびＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６によって保護される、Ｂｓ３（上）およびＢｓ３−Ｅ（中央）プロモーター配列。ＤＮａｓｅＩフットプリントは、Ｂｓ３プロモーターの、ＡｖｒＢｓ３で保護されたセンス鎖の３７ヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の３６ヌクレオチド、ならびにＢｓ３−Ｅプロモーターの、ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６で保護されたセンス鎖の３０ヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の３２ヌクレオチドを示した。ＵＰＡボックスおよび予測ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６ボックスは、下線を引かれている。ＡｖｒＢｓ３およびＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６によって保護される、ＵＰＡ２０−ｕｂｍ−ｒ１６（下部）プロモーター配列。ＵＰＡ２０−ｕｂｍｒ１６プロモーターは、ＡｖｒＢｓ３およびＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６の両方による認識をもたらす、２ｂｐ置換（ＧＡ〜ＣＴ、太字イタリック体）を備えるＵＰＡ２０プロモーター誘導体である。ＤＮａｓｅＩフットプリントは、センス鎖の３５ヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の３４ヌクレオチドが、ＡｖｒＢｓ３によって保護され（ＵＰＡボックスは、下線を引かれている）、センス鎖の３１ヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の３２ヌクレオチドが、ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６によって保護されることを示した（ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６ボックスは、下線を引かれている）。緑色（ＡｖｒＢｓ３）または赤色（ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６）で網掛けされたＤＮＡ領域は、いずれの実験においても、低タンパク質量（等しいモル濃度のＤＮＡおよびタンパク質ダイマー）であっても、それぞれ、ＡｖｒＢｓ３およびＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６によって保護されたコアフットプリントを指す。灰色で網掛けされたＤＮＡ領域は、所定のタンパク質による全てのタンパク質濃度での、４つの実験全てにおいて、保護されなかったヌクレオチドを指す。ＡｖｒＢｓ３保護領域およびＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６保護領域の５’末端は、同一であることに注意されたい。垂直破線は、ＤＮＡ内で１つの反復が１つの塩基対に接触するという我々のモデルを確証する、ＡｖｒＢｓ３保護プロモーター領域およびＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６保護プロモーター領域の３’末端の間の差異を示す。（Ｂ）ＵＰＡ２０−ｕｂｍ−ｒ１６プロモーター内のＡｖｒＢｓ３およびＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６標的ＤＮＡ配列の、ＡｖｒＢｓ３およびＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６反復領域との整列（１２位および１３位における高度可変アミノ酸）。我々の予測標的特異性と、マッチしていない反復／塩基の組み合わせ（アミノ酸１２／１３：ＮＩ＝Ａ、ＨＤ＝Ｃ、ＮＧ＝Ｔ、ＮＳ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）は、赤で色付けされる。
【図７】ＡｖｒＢｓ３によって保護されるＢｓ３およびＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６によって保護されるＢｓ３−Ｅプロモーター配列。代表的なＤＮａｓｅＩフットプリント実験が示される。Ｂｓ３プロモーター配列上のＡｖｒＢｓ３ＤＮａｓｅＩフットプリント（Ａ、上部／センスＤＮＡ鎖；Ｂ、下部／アンチセンスＤＮＡ鎖）。Ｂｓ３−Ｅプロモーター配列上のＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６ＤＮａｓｅＩフットプリント（Ｃ、上部、センスＤＮＡ鎖；Ｄ、下部アンチセンスＤＮＡ鎖）。（Ａ）〜（Ｄ）（上）蛍光標識されたＰＣＲ産物は、それぞれ、Ｈｉｓ６：：ＡｖｒＢｓ３、Ｈｉｓ６：：ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６、およびＢＳＡの、５ｘモル過剰（タンパク質ダイマーに対して算出）でインキュベートされ、ＤＮａｓｅＩで処理され、キャピラリーシーケンサー上で分析された。電気泳動図のｙ軸は、任意スケール上の、ＰＣＲ産物の５’−６−ＦＡＭ標識化センス鎖（ａ、ｃ）または５’−ＨＥＸ標識化アンチセンス鎖（ｂ、ｄ）に相当する、相対的な蛍光強度を示す。それぞれ、Ｈｉｓ６：：ＡｖｒＢｓ３（緑色）またはＨｉｓ６：：ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６（赤色）との反応、およびＢＳＡ（黒色、陰性対照）についてのトレースが重ねられている。陰性対照と比較した、それぞれ、ＡｖｒＢｓ３またはＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６存在時のピーク高の低減は、保護に対応する。保護領域は、緑色（ＡｖｒＢｓ３）または赤色（ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６）垂直線によって示される。（中央）ＤＮＡ配列の電気泳動図。数字の付いたオレンジ色のピークは、ＤＮＡヌクレオチドサイズ標準に相当する。ＤＮＡ配列内のエフェクターの予測標的ボックスは、下線を引かれている。カバーされるヌクレオチドは、緑色（ＡｖｒＢｓ３）または赤色（ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６）ボックスによって印を付けられる。下部の数字は、それぞれ、ＡｖｒＢｓ３（ａ、ｂ）またはＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６（ｃ、ｄ）の存在時の、転写開始点（＋１）に相対的なヌクレオチド位置を指す。（下）それぞれ、Ｂｓ３（ａ、ｂ）またはＢｓ３−Ｅ（ｃ、ｄ）プロモーターから増幅された、ＤＮａｓｅＩフットプリントに使用されるＤＮＡＰＣＲ産物。１本ＤＮＡ鎖上の保護領域は、灰色のボックスによって示される。下部の数字は、それぞれ、ＡｖｒＢｓ３（ａ、ｂ）またはＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６（ｃ、ｄ）の存在時の、転写開始点（＋１）に相対的なヌクレオチド位置を指す。実験は、３回反復され、類似した結果となった。
【図８】ＡｖｒＢｓ３およびＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６によって保護される、ＵＰＡ２０−ｕｂｍ−ｒ１６プロモーター配列。代表的なＤＮａｓｅＩフットプリント実験。ＵＰＡ２０−ｕｂｍ−ｒ１６プロモーター配列上のＡｖｒＢｓ３およびＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６ＤＮａｓｅＩフットプリント（Ａ）、上部、センスＤＮＡ鎖；（Ｂ）下部、アンチセンスＤＮＡ鎖）。（上）蛍光標識されたＰＣＲ産物は、それぞれ、Ｈｉｓ６：：ＡｖｒＢｓ３、Ｈｉｓ６：：ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６、およびＢＳＡの、５ｘモル過剰（タンパク質ダイマーに対して算出）でインキュベートされ、ＤＮａｓｅＩで処理され、キャピラリーシーケンサー上で分析された。電気泳動図のｙ軸は、任意スケール上の、ＰＣＲ産物の５’−６−ＦＡＭ標識化センス鎖（ａ）または５’−ＨＥＸ標識化アンチセンス鎖（ｂ）に相当する、相対的な蛍光強度を示す。Ｈｉｓ６：：ＡｖｒＢｓ３（緑色）、Ｈｉｓ６：：ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６（赤色）、および陰性対照ＢＳＡ（黒色）との反応についてのトレースが重ねられている。陰性対照と比較した、ＡｖｒＢｓ３およびＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６存在時のピーク高の低減は、保護に対応する。保護領域は、緑色（ＡｖｒＢｓ３）および赤色（ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６）垂直線によって示される。（中央）ＤＮＡ配列の電気泳動図。数字の付いたオレンジ色のピークは、ＤＮＡヌクレオチドサイズ標準に相当する。ＡｖｒＢｓ３によってカバーされるヌクレオチドは、緑色線および緑色ボックスによって印を付けられ（ＵＰＡボックスは下線を引かれている）、ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６によってカバーされるヌクレオチドは、赤色線および赤色ボックスによって印を付けられる（ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６ボックスは下線を引かれている）。ＵＰＡ２０−ｕｂｍ−ｒ１６突然変異（ＧＡ〜ＣＴ）は、イタリック体で示される。（下）ＵＰＡ２０−ｕｂｍ−ｒ１６プロモーターから増幅された、ＤＮａｓｅＩフットプリントに使用されるＤＮＡＰＣＲ産物。１本ＤＮＡ鎖上の保護領域は、灰色のボックスによって示される。下部の数字は、ＡｖｒＢｓ３の存在時の、ＵＰＡ２０野生型プロモーターの転写開始点（＋１）に相対的なヌクレオチド位置を指す。実験は、３回反復され、類似した結果となった。
【図９】ＧＵＳレポーター構築物。標的ＤＮＡ配列（ＴＡＬエフェクターボックス）は、ミニトマトＢｓ４プロモーター（４１）（ｐＢｓ４、−５０〜＋２５）配列の５’に挿入され、ＧＡＴＥＷＡＹ組み換えによって、プロモーターレスｕｉｄＡ（β−グルクロニダーゼ、ＧＵＳ）遺伝子ａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２；ＧＡＴＥＷＡＹ組み換え部位への融合を構築する、Ａ．ツメファシエンスＴ−ＤＮＡベクターｐＧＷＢ３３０へと転移される。
【図１０】Ｈａｘ３内の推定反復０の認識特異性。（Ａ）Ｈａｘ３反復単位のアミノ酸１２および１３、ならびに反復０に相当する位置で置換を備える４つの潜在的標的Ｈａｘ３ボックス。（Ｂ）標的ボックスは、ミニトマトＢｓ４プロモーターの前で、ＧＵＳレポーターベクターへとクローン化された。（Ｃ）Ａ．ツメファシエンスを介して、ＧＵＳレポーター構築物と共にＮ．ベンサミアナ葉細胞へと共送達された、３５Ｓ主導型ｈａｘ３または空のＴ−ＤＮＡ（−）を備えるＧＵＳ活性（４−ＭＵ、４−メチルウンベリフェロン、ｎ＝３、エラーバーは標準偏差を示す）。定性検定のために、葉片は、Ｘ−Ｇｌｕｃで染色された。実験は、２回反復され、類似した結果となった。
【図１１】反復タイプのＤＮＡ塩基対認識特異性。Ｈａｘ４誘導体およびＡｒｔＸボックス誘導体は、ミニマルＢｓ４プロモーターの前で、ＧＵＳレポーターベクターへとクローン化された。図３に対する定量データ。（Ａ）ＮＧ、ＨＤ、ＮＩ、およびＮＳ反復単位の特異性。反復タイプ標的塩基中で置換された、Ｈａｘ４ボックス誘導体のＨａｘ４誘発性。（Ｂ）ＮＮ反復単位の特異性。ＮＮ反復標的塩基中で置換された、ＡｒｔＸ１ボックス誘導体のＡｒｔＸ１誘発性。（Ｃ）それぞれ、人工エフェクターＡｒｔＸ１、ＡｒｔＸ２、およびＡｒｔＸ３による、ＡｒｔＸボックスの特異的誘発性。（Ａ）〜（Ｃ）ＧＵＳレポーター構築物は、それぞれ、３５Ｓ主導型ｈａｘ４、ａｒｔＸ１、ａｒｔＸ２、ａｒｔＸ３遺伝子（灰色バー）、および空のＴ−ＤＮＡ（ａ、ｂ、白色バー、ｃ、−）と共に、Ａ．ツメファシエンスを介してＮ．ベンサミアナ葉細胞へと共送達された（ｎ＝３、エラーバーは標準偏差を示す）。３５Ｓ：：ｕｉｄＡ（＋）は、対照として機能した。実験は、３回行われ、類似した結果となった。
【図１２】ＡｖｒＸａ１０のための予測標的ＤＮＡ配列。（Ａ）ＡｖｒＸａ１０反復単位のアミノ酸１２および１３、ならびに予測ＮＮタイプ反復特異性ＡまたはＧを備える２つの潜在的標的ボックス。（Ｂ）ＡｖｒＸａ１０標的ボックスは、ミニマルＢｓ４プロモーターの前で、ＧＵＳレポーターベクターへとクローン化された。（Ｃ）Ａ．ツメファシエンスを介して、ＧＵＳレポーター構築物と共に、Ｎ．ベンサミアナ葉細胞へと共送達された、３５Ｓ主導型ａｖｒＸａ１０、ｈａｘ３（特異性対照）、または空のＴ−ＤＮＡ（−）のＧＵＳ検定。３５Ｓ：：ｕｉｄＡ（＋）は、構成的対照として機能した（ｎ＝３、エラーバーは標準偏差を示す）。定性検定のために、葉片は、Ｘ−Ｇｌｕｃで染色された。実験は、３回行われ、類似した結果となった。
【図１３】Ｈａｘ２内の反復タイプの認識特異性。（Ａ）Ｈａｘ２反復単位のアミノ酸１２および１３、ならびに反復タイプＩＧのための４つの潜在的標的Ｈａｘ２ボックス。（Ｂ）Ｈａｘ２標的ボックスは、ミニマルＢｓ４プロモーターの前で、ＧＵＳレポーターベクターへとクローン化された。（Ｃ）Ａ．ツメファシエンスを介して、ＧＵＳレポーター構築物と共に、Ｎ．ベンサミアナ葉細胞へと共送達された、３５Ｓプロモーター主導型ｈａｘ２または空のＴ−ＤＮＡ（−）のＧＵＳ検定。３５Ｓ：：ｕｉｄＡ（＋）は、構成的対照として機能した（ｎ＝３、エラーバーは標準偏差を示す。定性検定のために、葉片は、Ｘ−Ｇｌｕｃで染色された。実験は、３回行われ、類似した結果となった。
【図１４】Ｈａｘ２は、Ａ．タリアナにおけるＰＡＰ１の発現を誘発する。（Ａ）Ａ．タリアナの葉は、それぞれ、ｈａｘ２、ｈａｘ３、およびｈａｘ４の３５Ｓ主導型発現のためのＴ−ＤＮＡ構築物を送達する、Ａ．ツメファシエンス株で植菌された。ｈａｘ２の発現は、アントシアニン産生を示唆する紫色色素沈着を誘発するが、ｈａｘ３およびｈａｘ４の発現は、その限りではない。植菌７日後に写真が撮られた。（Ｂ）エタノール誘発性プロモーターの制御下でｈａｘ２を担持する、トランスジェニックＡ．タリアナ株。トランス遺伝子の発現を誘発するために、分離Ｔ２集団の植物は、１０％エタノールを噴霧された。ｈａｘ２−トランスジェニック植物のみが、アントシアニンを蓄積した。植菌６日後に写真が撮られた。（Ｃ）１０％エタノールで噴霧する前（−）およびその２４時間後（＋）の、３つの独立したＡ．タリアナ株のｈａｘ２−トランスジェニック植物からのｃＤＮＡでの、ｈａｘ２（２９サイクル）、ＰＡＰ１（３２サイクル）、および伸長因子Ｔｕ（ＥＦ−Ｔｕ、３２サイクル）の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。（Ｄ）Ｈａｘ２反復単位のアミノ酸１２および１３、ならびにＨａｘ２の標的ＤＮＡ配列。（Ｅ）Ａ．タリアナＣｏｌ−０からのＰＡＰ１のプロモーターは、不完全Ｈａｘ２ボックスを含有する。予測Ｈａｘ２ボックスとのミスマッチは、赤で色付けされる。推定ＴＡＴＡボックス、天然転写開始部位（＋１）、およびＰＡＰ１コード配列の第１コドンが示される。
【図１５】表１．ＴＡＬエフェクターの予測ＤＮＡ標的配列。表は、ＴＡＬエフェクターの反復配列および反復単位のアミノ酸１２および１３から使用される予測ＤＮＡ標的配列を示す。注釈は以下を示す。（Ａ）Ｘｃｖ、キサントモナス・カンペストリス・パソバー・ベシカトリア；Ｘｇ、キサントモナス・ガルドネリーＸｃａ、キサントモナス・カンペストリス・パソバー・アルモラシア；Ｘｏｏ、キサントモナス・オリゼ・パソバー・オリゼ；Ｘａｃ、キサントモナス・アクソノポディス・パソバー・シトリ；Ｘａｕ、キサントモナス・シトリ・パソバー・アウランティフォリ；Ｘｃｍ、キサントモナス・カンペストリス・パソバー・マルバセアラム；Ｘａｍ、キサントモナス・アクソノポディス・パソバー・マニホティス；Ｘｏｃ、キサントモナス・オリゼ・パソバー・オリジコラ。（Ｂ）星印（＊）は、アミノ酸１３の欠失を示す。（Ｃ）反復単位のアミノ酸１２および１３から推定される標的ＤＮＡ特異性。チミジンヌクレオチドは、推定反復０の特異性に起因して、５’末端に付加される。２本鎖ＤＮＡの上部（センス）鎖の配列は、不明瞭なコードで提供される（Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、?＝未知の特異性）。
【図１６】ＡｖｒＢｓ３、Ｈａｘ２、Ｈａｘ３、Ｈａｘ４のタンパク質配列。タンパク質配列の各々について、Ｎ末端、Ｃ末端、ならびに単一反復配列が示される。
【図１７】エフェクターＡＲＴＢｓ４は、ミニマルＢｓ４プロモーターの発現を誘発する。（Ａ）Ｈａｘ４反復単位のアミノ酸１２および１３および予測標的ＤＮＡ特異性（Ｈａｘ４ボックス）。Ｈａｘ４ボックスと比較して、Ｈａｘ４（ｍｕｔ）ボックスは、４つの塩基対置換を含有する。（Ｂ）人工エフェクターＡＲＴＢｓ４反復単位のアミノ酸１２および１３および予測標的ＤＮＡ特異性（ＡＲＴＢｓ４ボックス）。（Ｃ）Ｈａｘ４ボックスは、ミニマルＢｓ４プロモーターの前で、ＧＵＳレポーターベクターへとクローン化された。ＡＲＴＢｓ４ボックスは、ミニマルＢｓ４プロモーター内に天然に存在する。（Ｄ）それぞれ、Ｈａｘ４およびＡＲＴＢｓ４による、Ｈａｘ４およびＡＲＴＢｓ４ボックスの特異的誘発性。ＧＵＳレポーター構築物は、それぞれ、３５Ｓ主導型ｈａｘ４（灰色バー）、ＡＲＴＢｓ４（白色バー）、および空のＴ−ＤＮＡ（ｅｖ、黒色バー）と共に、アグロバクテリウムツメファシエンスを介してＮ．ベンサミアナへと共送達された（エラーバーは標準偏差を示す）。４−ＭＵ、４−メチルウンベリフェロン。３５Ｓ：：ｕｉｄＡ（ＧＵＳ、灰色バー）は、対照として機能した。葉片は、Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド）で染色された。
【図１８】反復ドメインおよびエフェクターの「ゴールデンゲート」クローン化についての図表。（Ａ）個々の反復単位（または他のタンパク質ドメイン）からなる形成ブロックは、特異的オーバーハングを生成する隣接するＩＩ型制限酵素標的部位（例えば、ＢｓａＩ）で、サブクローン化される。マッチングオーバーハングは、同一文字（Ａ〜Ｏ）で示される。異なる反復タイプは、各位置に対する形成ブロックとしてクローン化される（例えば、反復１、反復２等）。反復特異性は以下の通りである：ＮＩ＝Ａ、ＨＤ＝Ｃ、ＮＧ＝Ｔ、ＮＮ＝Ｇ、またはＡ。（Ｂ）形成ブロックは、「ゴールデンゲート」クローン化を用いて（制限連結）、マッチングオーバーハングの連結によって、標的ベクターへと組み立てられる。概して、得られた組立て産物は、クローン化に使用される標的部位のいずれも含有しない。
【図１９】ゴールデンゲートクローン化を介する、デザイナーエフェクターの生成のための代替的方法。図１９Ａ〜Ｄは、下の実施例３に開示される方法で説明される種々のベクターを示し、またこの方法の概略図を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜配列表＞
添付の図および配列表に列挙されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準文字略号およびアミノ酸の１文字コードを用いて示される。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端で始まり、３’末端へと前進する（すなわち、各ラインの左から右へ）、標準慣例に従う。各核酸配列の１本鎖のみが示されるが、表示される鎖の任意の参照によって、相補鎖が含まれることが理解される。アミノ酸配列は、アミノ末端で始まり、カルボキシ末端へと前進する（すなわち、各ラインの左から右へ）、標準慣例に従う。
【００１９】
次に本発明は、これ以降、添付の図面を参照してより完全に説明され、ここで、全てではないが幾つかの本発明の実施形態が示される。実際に、これらの発明は、多くの異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に示される実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要求事項を満たすように提供される。全体にわたって、同様の数字は、同様の要素を指す。
【００２０】
当業者には、前述の説明および関連する図面に提示される教示の利益を有する、本発明に付随する、本明細書に示される本発明の多くの修正および他の実施形態が想定されるであろう。したがって、本発明が開示される特定の実施形態に限定されてはならないこと、また、修正および他の実施形態が特許請求の範囲に含まれるように意図されることを理解されたい。本明細書には特定の用語が使用されているが、それらは包括的かつ記述的な意味合いで使用されたものにすぎず、制限を目的としたものではない。
【００２１】
本開示全体にわたって使用される幾つかの用語は、本明細書の下で定義される。
【００２２】
「反復ドメイン」という用語は、ポリペプチド内に存在するとき、標的ＤＮＡ特異性を付与するモジュラー反復単位からなる、ＴＡＬエフェクターからのＤＮＡ認識ドメインまたは開示される方法を用いて作製されるその人工版を説明するために使用される。反復単位からなる反復ドメインは、ＤＮＡ配列標的が所望され、それがＴＡＬエフェクターにおける使用に限定されない、任意のポリペプチドに付与することができる。
【００２３】
「反復単位」という用語は、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する１つのアミノ酸または２つの隣接アミノ酸を含有する、ＴＡＬエフェクターからの反復ドメインのモジュラー部分またはその人工版を説明するために使用される。反復単位は、一緒になって規定の標的ＤＮＡ配列を認識し、反復ドメインを構成する。反復単位は、ＤＮＡ配列標的が所望され、それがＴＡＬエフェクターにおける使用に限定されない、任意のポリペプチドに付加することができる。
【００２４】
「認識コード」という用語は、反復単位の１２位および１３位のアミノ酸と、かかるアミノ酸が次の通りの認識を付与する、標的ＤＮＡ配列内の対応するＤＮＡ塩基対との関係を説明するために使用される：Ｃ／Ｇの認識のためのＨＤ、Ａ／Ｔの認識のためのＮＩ、Ｔ／Ａの認識のためのＮＧ、Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃの認識のためのＮＳ、Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔの認識のためのＮＮ、Ｔ／Ａの認識のためのＩＧ、Ｃ／Ｇの認識のためのＮ、Ｃ／ＧまたはＴ／Ａの認識のためのＨＧ、Ｔ／Ａの認識のためのＨ、およびＧ／Ｃの認識のためのＮＫ。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、「エフェクター」（または「エフェクタータンパク質」もしくは「エフェクターポリペプチド」）は、ポリペプチドが標的ＤＮＡ配列を認識することができる、構築物またはそれらのコードされたポリペプチド産物に言及する。エフェクタータンパク質は、１．５個以上の反復単位からなる反復ドメイン含み、また制御性ドメイン等の１つ以上の機能ドメインを含んでもよい。本発明の好ましい実施形態では、「エフェクター」は、追加的に、遺伝子発現の制御等の効果を発揮することができる。本発明は、特に生物学的な機構には依存していないが、標的ＤＮＡ配列を認識する本発明のタンパク質またはポリペプチドは、標的ＤＮＡ配列に結合すると考えられる。
【００２６】
「天然産」という用語は、人間によって産生されることとは異なり、天然で見出すことのできる対象物を説明するために使用される。例えば、自然界の源から単離することができ、研究所の人間によって意図的に修飾されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然産とされる。概して、天然産という用語は、種に典型的であろうような個体等の、野生型個体中に存在する対象物を指す。
【００２７】
遺伝子の「発現を調節する」、「発現を阻害する」、および「発現を活性化する」という用語は、遺伝子の転写を活性化または阻害する、本発明のポリペプチドの能力を指す。活性化は、後に続く転写阻害の防止（すなわち、遺伝子発現の抑制の防止）を含み、阻害は、後に続く転写活性化の防止（すなわち、遺伝子活性化の防止）を含む。調節は、標的遺伝子の発現によって間接にまたは直接に影響を受ける、任意のパラメータを決定することによって検定することができる。かかるパラメータには、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質レベルの変化、タンパク質活性の変化、産物レベルの変化、下流遺伝子発現の変化、レポーター遺伝子転写の変化（ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰ（例えば、Ｍｉｓｔｉｌｉ＆Ｓｐｅｃｔｏｒ（１９９７）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５：９６１−９６４を参照されたい）；シグナル伝達の変化、リン酸化および脱リン酸化、受容体−リガンド相互作用、二次メッセンジャー濃度（例えば、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、およびＣａ２＋）、細胞増殖、血管新生、インビトロ、インビボ、ならびにエクスビボが含まれる。かかる機能効果は、例えば、化学発光、蛍光、熱量反応、抗体結合、誘発性マーカー、リガンド結合検定を介する、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質レベルの測定、ＲＮＡ安定性の測定、下流またはレポーター遺伝子発現の特定；ｃＧＭＰおよびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）等の細胞内二次メッセンジャーの変化；細胞内カルシウムレベルの変化；サイトカイン放出等、当業者に既知の任意の手段によって測定することができる。

【００２８】
「制御性ドメイン」は、転写調節活性を有する、タンパク質またはタンパク質部分配列を指す。典型的に、制御性ドメインは、転写を調節するために、本発明のポリペプチドに共有結合または非共有結合される。代替的に、本発明のポリペプチドは、制御性ドメインなしに単独で作用するか、または転写を調節するための多重制御性ドメインと共に作用することができる。そこから制御性ドメインを得ることができる転写因子ポリペプチドには、制御転写および基礎転写に関与するポリペプチドが含まれる。かかるポリペプチドには、転写因子、それらのエフェクタードメイン、共活性化因子、サイレンサー、核内ホルモン受容体が含まれる（例えば、核酸要素に関与するタンパク質および転写の概説については、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ８４：８２５ ３０を参照されたく、一般的な転写因子は、Ｂａｒｎｅｓ＆Ａｄｃｏｃｋ（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ２５ Ｓｕｐｐｌ．２：４６ ９およびＲｏｅｄｅｒ（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７３：１６５ ７１に概説される）。転写因子を専門とするデータベースは既知である（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２６９：６３０を参照されたい）。核内ホルモン受容体転写因子は、例えば、Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：４８５５ ７４に記載される。転写因子のＣ／ＥＢＰファミリーは、Ｗｅｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ１９３：１７１ ８５に概説される。核内ホルモン受容体によって転写制御を仲介する共活性化因子および共抑制因子は、例えば、Ｍｅｉｅｒ（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３４（２）：１５８ ９、Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：３４２ ５、およびＵｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９４：４９８ ５０２）に概説される。ＧＡＴＡ転写因子は、造血の制御に関与し、例えば、Ｓｉｍｏｎ（１９９５）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１：９ １１、Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２３：９９−１０７に記載される。ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）およびその関連するＴＡＦポリペプチド（ＴＡＦ３０、ＴＡＦ５５、ＴＡＦ８０、ＴＡＦ１１０、ＴＡＦ１５０、およびＴＡＦ２５０を含む）は、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ＆Ｔｊｉａｎ（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．６：４０３ ９およびＨｕｒｌｅｙ（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：６９ ７５に記載される。転写因子のＳＴＡＴファミリーは、例えば、ＢａｒａｈｍおよびＰｏｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１ ８に概説される。疾患に関与する転写因子は、Ａｓｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５６１ ９に概説される。遺伝子制御に関与するポリペプチドを修飾するキナーゼ、ホスファターゼ、および他のタンパク質はまた、本発明のポリペプチドのための制御性ドメインとしても有用である。かかる修飾因子は、例えば、ホルモンによって仲介される、転写のスイッチオンまたはオフにしばしば関与する。転写制御に関与するキナーゼは、Ｄａｖｉｓ（１９９５）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４２：４５９ ６７，Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｄｖ．Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２８：２７９ ８６、およびＢｏｕｌｉｋａｓ（１９９５）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．５：１ ７７に概説される一方で、ホスファターゼは、例えば、Ｓｃｈｏｎｔｈａｌ＆Ｓｅｍｉｎ（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．６：２３９ ４８に概説される。核内チロシンキナーゼは、Ｗａｎｇ（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：３７３ ６に記載される。有用なドメインは、発癌遺伝子の遺伝子産物（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー）ならびにそれらの関連する因子および修飾因子から得ることができる。発癌遺伝子は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｔｈｅ Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５に記載される。ｅｔｓ転写因子は、Ｗａｓｌｙｌｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：７ １８およびＣｒｅｐｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．５：６１５ ３８に概説される。Ｍｙｃ発癌遺伝子は、例えば、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：７１３ ２１に概説される。ｊｕｎおよびｆｏｓ転写因子は、例えば、Ｔｈｅ Ｆｏｓ ａｎｄ Ｊｕｎ Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ａｎｇｅｌ＆Ｈｅｒｒｌｉｃｈ，ｅｄｓ．（１９９４）に記載される。ｍａｘ発癌遺伝子は、Ｈｕｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５９：１０９ １６に概説される。ｍｙｂ遺伝子ファミリーは、Ｋａｎｅｉ−Ｉｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：８９ ９８に概説される。ｍｏｓファミリーは、Ｙｅｗ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：１９ ２５に概説される。本発明のポリペプチドは、ＤＮＡ修復酵素ならびにそれらの関連する因子および修飾因子から得られる、制御性ドメインを含み得る。ＤＮＡ修復システムは、例えば、Ｖｏｓ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．４：３８５ ９５、Ｓａｎｃａｒ（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２９：６９ １０５、Ｌｅｈｍａｎｎ（１９９５）Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．１７：１ １９、およびＷｏｏｄ（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１３５ ６７に概説される。ＤＮＡ再構成酵素ならびにそれらの関連する因子および修飾因子はまた、制御性ドメインとして使用することができる（例えば、Ｇａｎｇｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥｘｐｅｒｉｅｎｔｉＡ５０：２６１ ９、Ｓａｄｏｗｓｋｉ（１９９３）ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：７６０ ７を参照されたい）。
【００２９】
同様に、制御性ドメインは、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ）ならびにそれらの関連する因子および修飾因子に由来し得る。ヘリカーゼは、Ｍａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ６：１３ ２２に概説され、メチルトランスフェラーゼは、Ｃｈｅｎｇ（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：４ １０に記載される。ヒストンデアセチラーゼ（ＷｏｌｆｆｅＳｃｉｅｎｃｅ２７２：３７１ ２（１９９６））等の、クロマチン関連タンパク質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ）はまた、選択のエフェクターへの付加のためのドメインとしても有用である。好ましい一実施形態では、制御性ドメインは、転写抑制因子として作用するＤＮＡメチルトランスフェラーゼである（例えば、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｗｙｎｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２６：２８３ ２８９（１９９８）、Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７９：１０１ １１６（１９９８）、Ｏｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：２５３６ ２５４０（１９９８）、およびＺａｒｄｏ＆Ｃａｉａｆａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６５１７ １６５２０（１９９８）を参照されたい）。別の好ましい実施形態では、Ｆｏｋ１等のエンドヌクレアーゼは、転写抑制因子として使用され、それは遺伝子切断を介して作用する（例えば、国際公開第９５／０９２３３号、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２０１号を参照されたい）。クロマチンおよびＤＮＡ構造、移動および局在化ならびにそれらの関連する因子および修飾因子を制御する因子；微生物に由来する因子（例えば、原核生物、真核生物、およびウイルス）、ならびにそれらに関連するまたはそれらを修飾する因子はまた、キメラタンパク質を得るためにも使用することができる。一実施形態では、リコンビナーゼおよびインテグラーゼは、制御性ドメインとして使用される。一実施形態では、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、転写活性化因子として使用される（例えば、Ｊｉｎ＆Ｓｃｏｔｔｏ（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７７ ４３８４、Ｗｏｌｆｆｅ（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：３７１ ３７２、Ｔａｕｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：４０８ ４１１（１９９６）、およびＨａｓｓｉｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９５：３５１９ ３５２４（１９９８）を参照されたい）。別の実施形態では、ヒストンデアセチラーゼは、転写抑制因子として使用される（例えば、Ｊｉｎ＆Ｓｃｏｔｔｏ（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７７ ４３８４、Ｓｙｎｔｉｃｈａｋｉ＆Ｔｈｉｒｅｏｓ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４４１４ ２４４１９、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：２８３１ ２８４１；およびＭａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２３７８１ ２３７８５を参照されたい）。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子」は、任意にイントロンを含有するコード配列、ならびにコード配列の発現および転写物の非翻訳部分の転写を制御する制御領域を含む、核酸分子またはその部分を指す。したがって、「遺伝子」という用語は、コード配列の他に、プロモーター、エンハンサー、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、終結シグナル、ポリアデニル化領域等の制御配列を含む。遺伝子の制御配列は、コード領域の近位に、同領域内に、または同領域の遠位に位置してもよい。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「標的遺伝子」は、その発現が本発明のポリペプチドによって調節されようとしている遺伝子を指す。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「植物」は、特徴的に胚を産生し、葉緑体を含有し、セルロース細胞壁を有し、かつ移動力を欠く、植物界の種々の光合成、真核性多細胞生物のいずれをも指す。本明細書で使用されるとき、「植物」は、種子、懸濁培養、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、芽、配偶体、胞子体、花粉、小胞子、およびそれらの子孫を含む、任意の発生段階での、任意の植物または植物の部分を含む。挿し穂、および細胞または組織培養物もまた含まれる。本発明と任せて使用される「植物組織」という用語は、全植物、植物細胞、植物器官、例えば、葉、茎、根、分裂組織、植物種子、プロトプラスト、カルス、細胞培養物、ならびに構造および／または機能単位に組織化される植物細胞の任意の群を含むが、それらに限定されない。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「植物細胞中の標的遺伝子の発現を調節する」は、本発明のポリペプチドを用いて、単独でまたは他の転写および／または翻訳制御性因子、または植物細胞中のかかるポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて、植物細胞中の標的遺伝子の発現を増加させること（活性化）または減少させること（抑制）を指す。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「標的ＤＮＡ配列」は、それに対するタンパク質による認識が所望される、２本鎖ＤＮＡの一部を指す。一実施形態では、「標的ＤＮＡ配列」は、遺伝子に対してその発現の程度を変化させることによって、所望の表現型の結果が達成され得る、遺伝子に対する転写制御要素の全てまたは部分である。転写制御要素は、プロモーター、エンハンサー、例えば、ステロイド反応要素、熱ショック反応要素、金属反応要素等の他の反応要素、制御要素結合部位、オペレーター、および／またはサイレンサー等の陽性および陰性対照要素を含む。転写制御要素は、ウイルス性、真核性、または原核性であり得る。「標的ＤＮＡ配列」はまた、タンパク質に結合することができる下流または上流配列を含み、それによって転写を調節、典型的には防止する。
【００３５】
本明細書における「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ配列」という用語の使用は、本発明を、ＤＮＡを含むポリヌクレオチド分子に限定するようには意図されていない。当業者であれば、本発明の方法および組成物が、デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ）、またはリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの組み合わせからなるポリヌクレオチド分子を包含することを認識するであろう。かかるデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドには、合成、天然産、および非天然産であり、参照核酸と類似した結合特性を有し、かつ参照ヌクレオチドと類似した方法で代謝される、ヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは結合を含むが、それらに限定されない天然産分子および合成類似体の両方が含まれる。かかる類似体の例としては、制限なしに、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。本発明のポリヌクレオチド分子はまた、１本鎖形態、２本鎖形態、ヘアピン、ステム‐アンド‐ループ構造等を含むが、それらに限定されない、ポリヌクレオチド分子の全ての形態も包含する。さらに、当業者は、本明細書に開示されるＤＮＡ配列がまた、その例示的ヌクレオチド配列の補体も包含することを理解する。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「標的ＤＮＡ配列に特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドの、特異的標的ＤＮＡ配列への結合親和性が、同一のポリペプチドの、概して同等であるが非標的のＤＮＡ配列への結合親和性よりも統計的に高いことを意味する。それはまた、本発明の反復ドメインの、検出可能なほどに大規模な、例えば、非標的ＤＮＡ配列へのその結合よりも、少なくとも背景を１．５倍上回る、特異的標的ＤＮＡ配列への結合、および非標的ＤＮＡ配列の実質的な排除を指す。各ＤＮＡ配列に対する本発明のＫｄのポリペプチドは、ポリペプチド結合特異性を査定するために、特定の標的ＤＮＡ配列とすることができる。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「標的遺伝子内の標的ＤＮＡ配列」とは、標的ＤＮＡ配列に対する本発明のポリペプチドの認識が、標的遺伝子の発現を調節するであろう点で、標的ＤＮＡ配列と標的遺伝子との間の機能関係を指す。標的ＤＮＡ配列は、物理的に、標的遺伝子の境界の内側のどこにでも、例えば、５’末端、コード領域、３’末端、ｃＤＮＡでコードされた領域の外側の上流および下流領域、またはエンハンサーもしくは他の制御性領域の内側に位置してもよく、また標的遺伝子の近位または遠位であってもよい。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「内因性」とは、それがそこへ導入される標的遺伝子または宿主細胞に天然に関連する、核酸またはタンパク質配列を指す。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「外因性」とは、それがそこへ導入される標的遺伝子または宿主細胞に天然に関連しない、核酸またはタンパク質配列を指し、天然産核酸の非天然産複数コピー、例えば、ＤＮＡ配列、または非天然産ゲノム位置に位置する天然産核酸配列を含む。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子組み換え植物（またはトランスジェニック植物）」とは、そのゲノム内に外因性ポリヌクレオチドを含む植物を指す。概して、および好ましくは、外因性ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが連続する世代に伝えられるように、ゲノム内で安定的に統合される。外因性ポリヌクレオチドは、単独でまたは組み換え発現カセットの部分として、ゲノムに統合されてもよい。「トランスジェニック」は、任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部分または植物を含むように本明細書で使用され、その遺伝子型は、最初にそのように変化させられたトランスジェニック、ならびに最初のトランスジェニックからの性交雑または無性繁殖によって作り出されたトランスジェニックを含む外因性核酸の存在によって変化させられている。本明細書で使用されるとき、「トランスジェニック」という用語は、従来の植物育種法による、または無作為交配、非組み換えウイルス感染、非組み換え細菌形質転換、非組み換え転位、もしくは自然突然変異等の自然発生イベントによる、ゲノムの変化（染色体のまたは染色体外の）を包含しない。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、「ミニマルプロモーター」または実質的に類似した用語は、不活性であるか、または上流活性化の非存在時で大幅に低減されたプロモーター活性を有するプロモーター要素、特にＴＡＴＡ要素を指す。好適な転写因子の存在時で、ミニマルプロモーターは、転写を可能にするために機能する。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「抑制因子タンパク質」または「抑制因子」は、それぞれ、転写または翻訳を防止するために、ＤＮＡのオペレーターまたはＲＮＡに結合するタンパク質を指す。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「抑制」は、抑制因子タンパク質の、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ上の特異的部位への結合による、転写または翻訳の阻害を指す。好ましくは、抑制は、少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、およびさらにより好ましくは少なくとも５倍の、転写または翻訳レベルの有意な変化を含む。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「活性化因子タンパク質」または「活性化因子」は、それぞれ、転写または翻訳を亢進させるために、ＤＮＡのオペレーターまたはＲＮＡに結合するタンパク質を指す。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「活性化」は、活性化因子タンパク質の、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ上の特異的部位への結合による、転写または翻訳の亢進を指す。好ましくは、活性化は、少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、およびさらにより好ましくは少なくとも５倍の、転写または翻訳レベルの有意な変化を含む。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、、分子の「誘導体」または「類似体」は、分子に由来する部分またはその修飾版を指す。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、「転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターに由来する反復単位」は、ＴＡＬエフェクターからの反復単位、または本明細書に開示される方法のいずれかによって産生される１つ以上のＴＡＬエフェクターの修飾版もしくは人工版を指す。
【００４８】
以下で、ＩＩＩ型分泌系を介して植物細胞へと転座される、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターファミリーに関連して、本発明が具体的に説明される。このエフェクターファミリーのタイプメンバーは、ＡｖｒＢｓ３である。したがって、ＴＡＬエフェクターファミリーはまた、タンパク質のＡｖｒＢｓ３様ファミリーと名付けられる。双方の発現は、同義的に使用され、相互交換され得る。ＡｖｒＢｓ３様ファミリーの非限定的例は、次の通りである：ＡｖｒＢｓ４ならびにＨａｘサブファミリーＨａｘ２、Ｈａｘ３、およびＨａｘ４のメンバー、ならびにＢｒｇ１１。ＡｖｒＢｓ３およびそのファミリーの他のメンバーは、標的遺伝子のプロモーター域内のそれらの特異的ＤＮＡ配列への結合能力、およびこれらの遺伝子の発現の誘発に特徴付けられる。それらは、それらが植物遺伝子の転写活性化因子として作用することを可能にする、保存された構造特徴を有する。ＡｖｒＢｓ３様ファミリーおよび相同エフェクターは、典型的に、それらのＣ末端領域において、核局在化配列（ＮＬＳ）および転写活性化ドメイン（ＡＤ）を有する。中央領域は、典型的に３４〜３５個のアミノ酸の反復単位を含有する。反復単位は、ほぼ同一であるが、特定の位置で可変であり、これらの位置がどのようにタンパク質のヌクレオチド配列結合特異性を決定するかが、近年見出されている。
【００４９】
ＡｖｒＢｓ３について、反復単位がＤＮＡへの結合に関与することが示された。ＡｖｒＢｓ３およびおそらくＡｖｒＢｓ３−ファミリーの他のメンバーのＤＮＡ結合特異性は、タンパク質の中央反復ドメインによって仲介されるようである。この反復ドメインは、１７．５個の反復単位のＡｖｒＢｓ３にあり、相同タンパク質は、各々典型的に３４個のアミノ酸である１．５〜３３．５個の反復単位からなる。他の反復単位長もまた既知である（例えば、３０、３３、３５、３９、４０、４２個のアミノ酸）。反復ドメイン内の最後の反復は、通常、１９〜２０アミノ酸長の半反復のみである。個々の反復単位は、概して同一でない。それらは、特定の可変アミノ酸位置で異なり、これらのうち１２位および１３位は、高度可変である一方で、４位、１１位、２４位、および３２位は、高い頻度であるが、１２および１３よりは低い頻度で異なる（他の位置での変形も生じるが、より低い頻度である）。キサントモナスからの異なるＡｖｒＢｓ３様タンパク質の比較は、８０〜９７％の全体的配列同一性を示し、このうちほとんどの差異は、反復ドメインに限定される。例えば、ＡｖｒＢｓ３およびＡｖｒＢｓ３様ファミリーメンバーＡｖｒＢｓ４は、ＡｖｒＢｓ３に対するＡｖｒＢｓ４のＣ末端における４つのアミノ酸欠失を除いて、それらの反復ドメイン領域において排他的に異なる。
【００５０】
図１６では、ＡｖｒＢｓ３のアミノ酸配列、ならびにＨａｘ−サブファミリーのメンバーのアミノ酸配列が示される。反復単位は、本発明にとって特に重要であり、それは、１２位および１３位の高度可変アミノ酸ならびに４位および２４位の可変アミノ酸を除いて同一である。したがって、これらのタンパク質の各反復単位は、単独で提供される。
【００５１】
上述の通り、反復ドメイン内の反復単位が、ＡｖｒＢｓ３−ファミリーのＩＩＩ型エフェクタータンパク質の認識または結合能力および特異性を決定することはすでに説明されている。しかしながら、根底にある原則は、本発明まで知られていなかった。
【００５２】
本発明は、反復ドメイン内の１つの反復単位が、標的ＤＮＡ配列内の１つの特異的ＤＮＡ塩基対の認識に関与することを発見している。この知見は、しかしながら、本発明の１つの要素にすぎない。本発明は、反復ドメインの各反復単位内の高度可変領域が、標的ＤＮＡ配列内の１つの特異的ＤＮＡ塩基対の認識に関与することをさらに発見している。反復単位内で、高度可変領域（アミノ酸１２位および１３位に対応する）は、典型的にこの認識特異性に関与する。したがって、これらのアミノ酸における各変形は、標的ＤＮＡ認識、また好ましくは認識能力における、対応する変形を反映する。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「高度可変領域」は、本発明の反復単位の１２位および１３位または同等の位置を意味することが意図される。本発明の１２位および１３位は、ＡｖｒＢｓ３および本明細書に開示される他のＴＡＬエフェクターの完全長反復単位における１２位および１３位に相当することが認識される。「同等の位置」とは、本発明の反復単位における、それぞれ、１２位および１３位に対応する位置を意図する。任意の反復単位を、ＡｖｒＢｓ３の完全長反復単位と整列させることによって、かかる同等の位置を容易に決定することができる。
【００５４】
したがって、ＤＮＡ結合タンパク質の反復ドメイン内の１つの反復単位は、標的ＤＮＡ内の１つの塩基対を認識し、反復単位内、典型的に反復単位の高度可変領域内の１つのアミノ酸または２つの隣接アミノ酸残基は、標的ＤＮＡ内のどの塩基対が認識されるかを決定することが初めて示されている。この知見に基づいて、当業者は、反復ドメインのその反復単位内のポリペプチドを、所望の標的ＤＮＡ配列内の塩基対を特異的に標的とするように修飾することによって、目的の標的ＤＮＡ配列内の塩基対を特異的に標的とすることができるであろう。この知見に基づいて、本発明は、異なる反復タイプのＤＮＡ標的特異性のための認識コードを特定しており、実験的に裏付けられ得た複数のＴＡＬエフェクターの標的ＤＮＡ配列を予測することができた。これはさらに、ＴＡＬエフェクターによって制御される宿主遺伝子の特定を促進するであろう。標的ＤＮＡ内の塩基の線形配列を認識する反復単位の線形配列は、新規ＤＮＡ−タンパク質相互作用である。高い特異性でＤＮＡを標的とするために、本発明によって特定される、反復ドメインのモジュラー構造および認識コードは、種々の技術分野で使用するための特異的ＤＮＡ結合ドメインの効率的設計を可能にする。
【００５５】
本発明の一実施形態では、反復ドメインは、転写因子に、例えば、植物で活性な転写因子に、特に好ましくは、ＩＩＩ型エフェクタータンパク質に、例えば、ＡｖｒＢｓ３様ファミリーのエフェクターに含まれる。しかしながら、一方の反復ドメイン内の反復単位と、他方の標的ＤＮＡ内の塩基配列との間の相関を発見した後、反復ドメインのモジュラー構造は、特異的標的ＤＮＡ配列を標的とするために使用されよう任意のタンパク質で使用され得る。反復単位を含む反復ドメインを、反復単位が、１反復単位当たり１つの高度可変領域を含むために修飾され、高度可変領域が、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する、ポリペプチドに導入することによって、規定の標的ＤＮＡ配列に対する多種多様のタンパク質の認識が有効となるであろう。
【００５６】
反復ドメイン内の１つの反復単位は、ＤＮＡ内の１つの塩基対の特異的認識に関与することが見出されているため、複数の反復単位は、互いに組み合わされ得、ここで各反復単位は、標的ＤＮＡ配列内の特異的塩基対に対する各反復単位の認識に関与する高度可変領域を含む。
【００５７】
特異的アミノ酸のための特異的コドンを得るために、特異的にＤＮＡ配列を修飾する技術は、当該技術分野で既知である。
【００５８】
突然変異およびポリヌクレオチド変化のための方法は、広範に記載されている。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ１５４：３６７−３８２、米国特許第４，８７３，１９２号、ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、および引用される参考文献を参照されたい。これらの全ての公開物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
次の例は、新たな反復単位を構築し、標的ＤＮＡ配列内で塩基対を特異的に認識する人工的に構築された反復単位の特異的結合活性を試験する方法を提供する。
【００６０】
当業者は、反復ドメイン内で使用される反復単位の数を、所定の実験によって把握することができる。概して、少なくとも１．５個の反復単位が最小であると考えられるが、典型的に少なくとも約８つの反復単位が使用されるであろう。半分のサイズの反復単位を使用することができるため、反復単位は、完全な反復単位である必要はない。さらに、本明細書に開示される方法およびポリペプチドは、特定の数の反復単位を備える反復ドメインに確かに依存する。したがって、本発明のポリペプチドは、例えば、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５、５０、５０．５個またはそれを超える反復単位を含むことができる。典型的に、ＡｖｒＢｓ３は、１７．５個の反復単位を含有し、ＵＰＡ（ＡｖｒＢｓ３によって上方制御される）遺伝子の発現を誘発する。反復単位の数および順序は、対応する活性およびＤＮＡ認識特異性を決定するであろう。さらなる例として、ＡｖｒＢｓ３ファミリーメンバーＨａｘ２は、２１．５個の反復単位、Ｈａｘ３は、１１．５個の反復単位、Ｈａｘ４は、１４．５個の反復単位を含む。好ましくは、本発明のポリペプチドは、約８〜約３９個の反復単位を含む。より好ましくは、本発明のポリペプチドは、約１１．５〜約３３．５個の反復単位を含む。
【００６１】
３４個のアミノ酸（１文字コードで）を備える反復の典型的なコンセンサス配列が下に示される：
ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ
【００６２】
３５個のアミノ酸（１文字コードで）を備える反復単位についてのさらなるコンセンサス配列は、次の通りである：
ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＰＨＤ
【００６３】
本発明の一実施形態で使用され得る反復単位は、上述のコンセンサス配列との、少なくとも３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。好ましい実施形態では、ＡｖｒＢｓ３、Ｈａｘ２、Ｈａｘ３、およびＨａｘ４の反復配列、ならびにＡｖｒＢｓ３−ファミリーのさらなるメンバーが使用される。これらのメンバーの反復単位配列は、図１６に示される。これらの反復単位配列は、アミノ酸の１つ以上を置換することによって修飾され得る。修飾された反復単位配列は、ＡｖｒＢｓ３−ファミリー配列の原メンバーの原反復配列との、少なくとも３５％、４０％、５０％、６０％、７０％，７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。好ましい実施形態では、１２位および１３位のアミノ酸が変化させられる。さらなる実施形態では、４位、１１位、２４位、および３２位のアミノ酸が変化させられる。好ましくは、１反復当たりのアミノ酸の数は、１反復単位当たり２０〜４５個のアミノ酸、さらに３２〜４０個のアミノ酸、またさらに３２〜３９個のアミノ酸、およびさらに任意に３２、３４、３５、または３９個のアミノ酸の範囲にある。
【００６４】
具体的には、反復単位内の高度可変領域が、標的ＤＮＡ配列内の１つの塩基対の特異的認識を決定する。より具体的には、本発明は、反復単位内の１２位および１３位で見出されるアミノ酸と、標的ＤＮＡ配列内の塩基対との間の認識特異性の次の相関を見出している：
・Ｃ／Ｇの認識のためのＨＤ
・Ａ／Ｔの認識のためのＮＩ
・Ｔ／Ａの認識のためのＮＧ
・Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃの認識のためのＮＳ
・Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔの認識のためのＮＮ
・Ｔ／Ａの認識のためのＩＧ
・Ｃ／ＧまたはＴ／Ａの認識のためのＮ
・Ｔ／Ａの認識のためのＨＧ
・Ｔ／Ａの認識のためのＨ
・Ｇ／Ｃの認識のためのＮＫ。
【００６５】
アミノ酸は、１文字コードで表されることに留意しなければならない。ヌクレオチドは、塩基対として提供され、ここで第１の塩基は、上部鎖に位置し、第２の塩基は、下部鎖に位置する；例えば、Ｃ／Ｇとは、Ｃが上部鎖に位置し、Ｇが下部鎖に位置することを意味する。
【００６６】
単一アミノ酸ＮおよびＨそれぞれに関しては、ＡｖｒＢｓ３のアミノ酸１３は、他の反復単位を備える多重アミノ酸配列整列によって比較されたとき、反復単位から欠損していると思われる。

【００６７】
本発明の一実施形態では、ＡｖｒＢｓ３様タンパク質のＮ末端ドメインは、Ｔに対する認識特異性、反復の認識特異性の５’を付与する。
【００６８】
本発明の特に好ましい実施形態では、タンパク質ファミリーＡｖｒＢｓ３の反復単位が使用される。このタンパク質ファミリーのメンバーの例は、上で特定されている。特に、タンパク質ファミリーのメンバーは、ｖｒＢｓ３のアミノ酸配列に対して、特にＡｖｒＢｓ３の反復単位のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも３５％のアミノ酸相同性を有する。これを念頭に置くと、反復単位内の高度可変領域は、ＡｖｒＢｓ３ファミリーのメンバーの間のアミノ酸比較によって推定され得る。特に好ましい実施形態では、アミノ酸は、ＡｖｒＢｓ３の反復単位の１２位および１３位にある。しかしながら、可変領域はまた、異なるアミノ酸位置に位置してもよい。可変位置の例としては、アミノ酸番号４、１１、２４、および３２が挙げられる。本発明のさらなる実施形態では、ＤＮＡ配列内の塩基対の特異的認識に関与するアミノ酸は、典型的に、ＡｖｒＢｓ３ファミリーのメンバーの間で異ならない位置、または可変であるが、高度可変ではない位置に位置する。
【００６９】
要約すると、本発明者らは、反復単位が、ＤＮＡ配列上の１つの塩基対の認識を決定すること、および反復単位内の高度可変領域が、対応する反復単位の認識特異性を決定することを見出した。したがって、反復単位の配列は、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の特異的線形順序と相関する。本発明は、ＡｖｒＢｓ３に関するこの相関を見出しており、タンパク質のＡｖｒＢｓ３様ファミリーの代表的な数のメンバーに関してそれを検証している。ＡｖｒＢｓ３様ファミリーメンバーに関して、３４個または他のアミノ酸長の反復単位内の１２位および１３位のアミノ酸残基は、ＡｖｒＢｓ３様タンパク質の規定の結合特異性と相関する。この中核的原則の発見は、遺伝子発現の調節および標的ゲノム操作を含むが、それらに限定されない種々の用途のために、その同族標的ＤＮＡテンプレートでポリペプチドを特製する強力なツールを提供する。
【００７０】
本発明では、反復単位内に標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する高度可変領域が含まれる、反復単位を備える反復ドメインを含む、ポリペプチドが設計され得る。本発明の一実施形態では、各反復単位は、１つの標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する高度可変領域を含む。さらなる実施形態では、標的ＤＮＡ配列内の塩基対を特異的に認識しない、１または２つの反復単位が、反復ドメイン内に含まれる。本発明によって見出された認識コードを考慮すると、各反復単位が１つの標的ＤＮＡ配列内の塩基対の特異的認識に関与する、反復単位のモジュラー配列は、実行可能である。結果として、反復単位の配列は、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の配列に対応し、その結果１つの反復単位は、１つの塩基対にマッチする。
【００７１】
標的ＤＮＡ配列が既知であり、それに対するタンパク質による認識が所望されるのであれば、当業者は、特異的認識アミノ酸配列を含む、モジュラーの一連の反復単位を特異的に構築し、これらの反復単位を、所望の標的ＤＮＡ配列の認識および結合を可能にするために適切な順序で、ポリペプチドへと組み立てることができる。本発明のモジュラー反復単位ＤＮＡ結合ドメインと組み合わされることによって、任意のポリペプチドが修飾され得る。かかる例としては、転写活性化因子および抑制因子タンパク質であるポリペプチド、抵抗性仲介タンパク質、ヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リゾルバーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、デメチラーゼ、デアセチラーゼ、ならびにＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を修飾することができる任意の他のポリペプチドが含まれる。
【００７２】
本発明のモジュラー反復単位ＤＮＡ結合ドメインは、転写制御性領域および翻訳末端領域を含むが、それらに限定されない、任意の他の制御性領域で機能するために、核局在化シグナル等の細胞区画局在化シグナルと組み合わせることができる。
【００７３】
本発明のさらなる実施形態では、これらのモジュール設計された反復単位は、反復ドメインによる結合の結果、ＤＮＡの近位に配置されるとき、ＤＮＡを切断することができるエンドヌクレアーゼドメインと組み合わされる。かかるエンドヌクレアーゼ切断は、真菌、植物、および動物を含む真核生物中の相同組み換えの率を刺激することが知られる。部位特異的エンドヌクレアーゼ切断の結果として、特異的部位の相同組み換えを刺激する能力は、部位特異的切断を行わなかった場合に可能である頻度よりもはるかに高い頻度で、特異的部位の目的のＤＮＡ配列を統合した、形質転換された細胞の回復を可能にする。加えて、反復ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインから形成されるポリペプチドによって引き起こされる切断等のエンドヌクレアーゼ切断は、時に、切断の部位で配列を変化させる方法で細胞ＤＮＡ代謝機構によって、例えば、変化していない配列と比較して、切断の部位で短挿入または欠失を引き起こすことによって修復される。これらの配列変化は、例えば、タンパク質−コード配列を、非機能タンパク質を作製するために変化させること、スプライス部位を、遺伝子転写物が適切に切断されないように修飾すること、非機能転写物を作成すること、遺伝子のプロモーター配列を、それがもはや適切に転写されないように変化させること等による、遺伝子またはタンパク質の機能の不活性化を引き起こし得る。
【００７４】
部位特異的エンドヌクレアーゼを用いてＤＮＡを切断することは、切断の領域内の相同組み換えの率を増加させ得る。幾つかの実施形態では、Ｆｏｋ Ｉ（フラボバクテリウム・オケアノコイテス）エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断を誘発するために、エフェクター内で利用されてもよい。Ｆｏｋ Ｉエンドヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合ドメインから独立して機能し、典型的にダイマーとして、２本鎖ＤＮＡを切断する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ８９（１０）：４２７５−４２７９、およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ９３（３）：１１５６−１１６０、参考文献の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。１本鎖ＦｏｋＩダイマーもまた開発され、また利用することができる（Ｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４０：１５６−１６１）。所望の標的ＤＮＡ配列の認識のための反復ドメイン、ならびに亜鉛フィンガーヌクレアーゼを採用する、従来行われた作業に類似した、標的ＤＮＡ配列のまたはその近辺のＤＮＡ切断を誘発する、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含有するエフェクターを構築することができる（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ４５９：４４２−４４５、Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ４５９，４３７−４４１、これらの参考文献の全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。かかるエフェクターの比較は、Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３００，７６４、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ４３５，６４６、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＴｈｅＰｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４４：６９３−７０５、および米国特許第７，１６３，８２４号および同第７，００１，７６８号の通り、亜鉛フィンガーヌクレアーゼについて報告されるそれらの使用に類似する、付加、欠失、および他の修飾を含むゲノムの標的変化の生成を可能にし得、参考文献および特許の全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７５】
ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインは、ＰＣＲによって、標準方法で調製される海洋細菌フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ＡＴＣＣ）のゲノムＤＮＡからクローン化され得る。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの配列は、Ｐｕｂｍｅｄ（受入番号Ｍ２８８２８および受入番号Ｊ０４６２３、情報の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）上で入手可能である。
【００７６】
サッカロマイセス・セレビシエ酵母からのＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼは、相同組み換えの率を増加させるＤＮＡ切断を産生するために使用されている。Ｉ−ＳｃｅＩは、１８ｂｐ認識配列を有するミトコンドリアイントロンによってコードされるエンドヌクレアーゼであり、したがって所定のＤＮＡ内、さらには大型ゲノム内の非常に低い頻度の認識部位である（Ｔｈｉｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９（１）：１８９−１９０、参考文献の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｉ−ＳｃｅＩによって認識される切断部位の低頻度のために、それは相同組み換えを亢進するための使用に好適である。ＤＮＡ切断を誘発するための、Ｉ−ＳｃｅＩの使用に関するさらなる説明は、米国特許出願第２００９０３０５４０２号に見出され得、この特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７７】
Ｉ−ＳｃｅＩのための認識部位は、さまざまな異なるシステムに導入されている。後に続く、Ｉ−ＳｃｅＩでのこの部位の切断は、その部位が導入されている位置で、相同組み換えを増加させる。相同組み換えの亢進された頻度は、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞、マウスゲノム、およびタバコ植物ニコチアナ・プルムバギニフォリアのゲノムＤＮＡの染色体外ＤＮＡに導入されたＩ−ＳｃｅＩ部位を用いて得られている。例えば、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２（３）：８０６−８１０、Ｃｈｏｕｌｉｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５（４）：１９６８−１９７３、およびＰｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（２２）：５０３４−５０４０を参照されたく、参考文献の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非相同ＤＮＡ結合ドメインと共に作動する任意の他のエンドヌクレアーゼドメインは、エフェクター内で利用され得、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼは、１つのかかる非限定的例であることが理解されるであろう。ＤＮＡ認識およびＩ−ＳｃｅＩ等の結合ドメインを有する、エンドヌクレアーゼの使用の限定は、認識部位が所望の位置にまだ存在しない場合、かかる部位が、その部位で相同組み換えを亢進させるために、エンドヌクレアーゼの使用前に、所望の位置で相同組み換えの標準方法によって導入されなければならないことである。既知のエンドヌクレアーゼを修飾することによってまたは１つ以上のかかるエンドヌクレアーゼのキメラ版を作製することによって等の、新規標的ＤＮＡ配列を認識する、新規エンドヌクレアーゼの設計および合成を可能にする方法が報告されており、こうして目的の内因性標的ＤＮＡ配列を切断する、かかる操作されたエンドヌクレアーゼドメインの生成のための道が開かれている（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ１０：８９５−９０５、国際公開第２００７／０６０４９５号、国際公開第２００９／０９５７９３号、Ｆａｊａｒｄｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：２１６３−２１７３、公開および参考文献の双方は、参照によりそれらの全体が組み込まれる）。このため、ＤＮＡ結合活性を非機能にするが、ＤＮＡ切断機能は活性に保つために、および上のＦｏｋＩの使用に類似したＤＮＡ切断を誘発するように、エフェクター内で同様に操作されたエンドヌクレアーゼ切断ドメインを利用するために、かかるエンドヌクレアーゼドメインが同様に操作され得ることが構想され得る。かかる用途では、標的ＤＮＡ配列認識は、好ましくは、エフェクターの反復ドメインによって提供されるであろうが、ＤＮＡ切断は、操作されたエンドヌクレアーゼドメインによって遂行されるであろう。
【００７８】
上述の通り、エフェクターは、所望の特異的標的配列のための特異的認識を備える反復ドメインを含む。好ましい実施形態では、エフェクターは、内因性染色体ＤＮＡ配列に特異的に結合する。特異的核酸配列またはより好ましくは特異的内因性染色体配列は、相同組み換えを亢進させることが所望される核酸領域内の任意の配列であり得る。例えば、核酸領域は、その中で点突然変異もしくは欠失等の突然変異を導入することが所望される遺伝子を含有する領域、またはそこへ所望の表現型を付与する遺伝子を導入することが所望される領域であってもよい。
【００７９】
さらなる実施形態は、その中で所望の付加が導入されている、修飾された植物を生成する方法に関する。方法は、そこへ修飾を導入することが所望される、内因性標的ＤＮＡ配列を含む植物細胞を得ることと、内因性標的ＤＮＡ配列に結合する反復ドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインを含むエフェクターを用いて、内因性標的ＤＮＡ配列内で２本鎖切断を生成することと、内因性標的ＤＮＡの少なくとも一部と相同な配列を含む外因性核酸を、外因性核酸と内因性標的ＤＮＡ配列との間で相同組み換えが生じることを可能にする条件下で、植物細胞に導入することと、相同組み換えが生じている植物細胞から植物を生成することと、を含み得る。他の実施形態は、上述および本明細書の方法に従って作製される、遺伝子組み換え細胞および植物に関する。標的ＤＮＡ配列は、人工または天然産であり得ることに留意すべきである。かかる方法は、当該技術分野で既知であり、かかる目的で利用される技術および方法を用いて、任意の生物（動物、ヒト、真菌、卵菌細菌、およびウイルスを含むような非限定的生物）において使用され得ることは理解されるであろう。
【００８０】
本発明のさらなる実施形態では、これらのモジュール設計された反復ドメインは、遺伝子の、例えば、植物遺伝子、動物遺伝子、真菌遺伝子、卵菌遺伝子、ウイルス遺伝子、またはヒト遺伝子の発現の調節または制御に関与する１つ以上のドメインと組み合わされる。亜鉛フィンガードメインを含有するＤＮＡ結合ポリペプチドを生成することによって、遺伝子発現を調節する方法は、当該技術分野で既知である（米国特許第７，２８５，４１６号、同第７，５２１，２４１号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２７３，９２３号、同第７，２６２，０５４号、同第７，２２０，７１９号、同第７，０７０，９３４号、同第７，０１３，２１９号、同第６，９７９，５３９号、同第６，９３３，１１３号、同第６，８２４，９７８号、これらの特許の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、ＡｖｒＢｓ３様ファミリーのこれらのエフェクターは、特異的標的ＤＮＡ配列に結合するために修飾される。かかるポリペプチドは、例えば、遺伝子の転写を活性化、抑制、または他の方法で調節するために、目的の遺伝子のプロモーター内の遺伝的制御領域、または目的の遺伝子のための他の制御性領域に特異的に結合するように本発明の方法によって修飾される、転写活性化因子または転写の抑制因子タンパク質であり得る。
【００８１】
本発明のさらなる実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、天然産反復ドメインによってまたは修飾され反復ドメインによって、特異的に認識されるために修飾される。一例として、ＡｖｒＢｓ３様ファミリーのメンバーのための標的ＤＮＡ配列は、対応するＡｖｒＢｓ３エフェクターによって誘発され得る、新規の制御可能なプロモーターを生成するために、プロモーターに挿入することができる。二次的な誘発性システムは、トランス活性化因子および標的遺伝子を用いて構築することができ、ここでトランス活性化因子は、ポリペプチドであり、ここでポリペプチドは、標的遺伝子に結合し、発現を誘発する本発明の反復単位を含む、少なくとも１つの反復ドメインを含む。トランス活性化因子および標的遺伝子は、１つの細胞株に導入することができるが、また異なる細胞株に存在し、後に遺伝子移入されてもよい。さらなる実施形態では、疾患抵抗性植物は、本発明のポリペプチドを含有する反復ドメインの標的ＤＮＡ配列を、抵抗性仲介遺伝子を活性化させることによって発現後に植物の防御反応をもたらす遺伝子の前に挿入することによって、構築することができる。
【００８２】
さらなる実施形態では、カスタムＤＮＡ結合ポリペプチドは、反復単位タイプを再配列させることによって構築することができ、こうして新規標的ＤＮＡ結合特異性を備える反復ドメインの生成を可能にする。個々の反復単位は、典型的クローン化戦略を排除するＤＮＡレベルでほぼ同一である。本発明は、本発明の反復ドメインを備えるカスタムポリペプチドを組み立てるための、迅速で安価な戦略を提供する。かかるポリペプチドのクローン化汎用性を改善するために、２ステップの組み立て方法が設計された。この方法は、それらの標的ＤＮＡ認識および結合特異性を研究するために、新規反復タイプを備えるポリペプチドを組み立てるために使用された。
【００８３】
つまり、任意のＤＮＡ配列は、互いの特異的認識および結合を促進するために修飾されたＤＮＡ配列に結合するであろう反復単位からなる反復ドメインを有する、ポリペプチドを特異的に標的とするために、塩基対を、遺伝子または遺伝的制御要素の任意のＤＮＡ領域または特異的領域に導入することによって、本発明のポリペプチドを含有する反復ドメインによる結合を可能にするように修飾され得る。
【００８４】
本発明は、ポリペプチドを認識し、好ましくはそれに結合する真のモジュラーＤＮＡが、効率的に産生され得ることを示しており、ここでポリペプチドの結合モチーフは、特異的塩基対の組み合わせの、それらの認識能力に基づいて選択される反復単位からなる反復ドメインである。したがって、標的ＤＮＡ内に存在する塩基対の配列を単に考慮することによって、および反復単位を、そこに結合するために必要な特徴を有する結合モチーフとして、適切な順序で組み合わせることによって、任意の所望の標的ＤＮＡ配列に結合することができるポリペプチドを設計することは、十分に当業者の能力の範囲内であるはずである。標的ＤＮＡの既知の配列の長さが長いほど、ポリペプチドに含まれ得るモジュラー反復単位の数は多い。例えば、既知の配列が９塩基長にすぎない場合、上で定義される通り、９つの反復単位は、ポリペプチドに含まれ得る。既知の配列が２７塩基長である場合、最大２７個の反復単位がポリペプチドに含まれ得る。標的ＤＮＡ配列が長いほど、ゲノム内の他の場所のＤＮＡの、任意の他の所定の部分における、その発現の可能性は低い。
【００８５】
さらに、ポリペプチドへの組み込みのために選択されたそれらの反復単位は、それらの結合特徴を修飾するために人工的に修飾され得る。代替的に（または追加的に）、反復単位の長さおよびアミノ酸配列は、その結合特徴が影響を受けない限り、異なり得る。
【００８６】
概して、標的ＤＮＡ配列に対する高親和性および高特異性を有するような反復単位を選択することが好ましいであろう。
【００８７】
本明細書に記載される通り、エフェクターは、任意の選択の内因性遺伝子の発現の制御のために、任意の好適な標的部位を認識するように設計され得る。制御に好適な内因性遺伝子の例としては、ＶＥＧＦ、ＣＣＲ５、ＥＲアルファ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＨＢＶ Ｃ、Ｓ、Ｘ、およびＰ、ＬＤＬ−Ｒ、ＰＥＰＣＫ、ＣＹＰ７、フィブリノゲン、ＡｐｏＢ、Ａｐｏ Ｅ、Ａｐｏ（ａ）、レニン、ＮＦ−カッパＢ、Ｉ−カッパＢ、ＴＮＦ−アルファ、ＦＡＳリガンド、アミロイド前駆体タンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、ｏｂ−レプチン、ｕｃｐ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、ＰＤＧＦ、ＰＡＦ、ｐ５３、Ｒｂ、胎児ヘモグロビン、ジストロフィン、ウトロフィン、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ受容体ｆｌｔおよびｆｌｋ、トポイソメラーゼ、テロメラーゼ、ｂｃｌ−２、サイクリン、アンギオスタチン、ＩＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＳＴＡＴＳ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ＴＨ、ＰＴＩ−１、ポリガラクチュロナーゼ、ＥＰＳＰ合成酵素、ＦＡＤ２−１、デルタ−１２デサチュラーゼ、デルタ−９デサチュラーゼ、デルタ−１５デサチュラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、デンプン合成酵素、セルロース合成酵素、ショ糖合成酵素、細胞老化関連遺伝子、重金属キレート剤、脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ、ウイルス遺伝子、原虫遺伝子、真菌遺伝子、および細菌遺伝子が挙げられる。概して、制御される好適な遺伝子には、リンフォカイン、増殖因子、分裂促進因子、走化因子、癌活性因子、受容体、カリウムチャネル、Ｇ−タンパク質、シグナル伝達分子、疾患抵抗性遺伝子、および他の疾患関連遺伝が含まれる。
【００８８】
別の態様では、細胞中の標的遺伝子の発現を調節する方法が提供される。細胞は、好ましくは植物細胞、ヒト細胞、動物細胞、真菌細胞、または任意の他の生存細胞であってもよい。細胞は、ポリペプチドを含有し、ここでポリペプチドは、反復単位を含む、少なくとも１つの反復ドメインを含み、これらの反復単位は、高度可変領域を含有し、各反復単位は、標的ＤＮＡ配列内の１塩基対の認識に関与する。ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして導入されるか、またはポリペプチドは、当該技術分野で既知の方法によって、それ自体が細胞へ導入される。どのように導入されるかに関わらず、ポリペプチドは、塩基対の標的ＤＮＡを特異的に認識し、好ましくはそれに結合し、また標的遺伝子の発現を調節する、少なくとも１つの反復ドメインを含むはずである。好ましい実施形態では、全ての反復単位は、標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する高度可変領域を含有する。
【００８９】
エフェクターの、細胞への取り込みを促進するために、本発明のエフェクターに結合され得るペプチド配列の例としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＨＩＶのｔａｔタンパク質の１１アミノ酸ペプチド；ｐ１６タンパク質のアミノ酸８４ １０３に対応する２０残基ペプチド配列（Ｆａｈｒａｅｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ６：８４を参照されたい）；Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａのホメオドメインの６０−アミノ酸長の第３ヘリックス（Ｄｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４４）；カポジ線維芽細胞増殖因子（Ｋ−ＦＧＦ）ｈ領域等のシグナルペプチドのｈ領域；またはＨＳＶからのＶＰ２２転座ドメイン（Ｅｌｌｉｏｔ＆Ｏ’Ｈａｒｅ（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２２３ ２３３）。亢進された細胞取り込みを提供する、他の好適な化学的部分もまた、エフェクターに化学的に結合され得る。
【００９０】
毒素分子もまた、細胞膜を横切ってポリペプチドを輸送する能力を有する。しばしば、かかる分子は、少なくとも次の２つの部分からなる（「２要素毒素」と呼ばれる）：転座もしくは結合ドメインまたはポリペプチド、および別個の毒素ドメインまたはポリペプチド。典型的に、転座ドメインまたはポリペプチドは、細胞受容体に結合し、次いで毒素は、細胞中に輸送される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍパーフリンジェンス・イオータ毒素、ジフテリア毒素（ＤＴ）、緑膿菌外毒素Ａ（ＰＥ）、百日咳毒素（ＰＴ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓアンスラシス毒素、および百日咳アデニレートシクラーゼ（ＣＹＡ）を含む、複数の細菌毒素は、内部融合物またはアミノ末端融合物として細胞のサイトゾルにペプチドを送達する試みにおいて使用されている（Ａｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３３３４ ３３４１、Ｐｅｒｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：５１４７ ５１５６（１９９３）、Ｓｔｅｎｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１１３：１０２５ １０３２（１９９１）、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：３５３０ ３５３４、Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｂｓｔｒ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９５：２９５、Ｓｅｂｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：３８５１ ３８５７、Ｋｌｉｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０２７７ １０２８１、およびＮｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７１８６ １７１９３）。
【００９１】
エフェクターもまた、リポソームおよびイムノリポソーム等のリポソーム誘導体を介して、動物細胞中、好ましくは哺乳動物細胞中に導入することができる。「リポソーム」という用語は、水相を包み込む、１つ以上の同心性の状態の脂質二重層からなる小胞を指す。水相は、典型的に、細胞に送達されるべき化合物、この場合はエフェクターを含有する。リポソームは、形質膜と融合して、それによってサイトゾル中にエフェクターを放出する。代替的に、リポソームは、食細胞化されるかまたは輸送小胞の状態で細胞によって取り込まれる。リポソームは、いったんエンドソームまたは食胞において、輸送小胞の膜を分解するか、またはこれと融合するかのいずれかであり、そしてその内容物を放出する。
【００９２】
本発明は、特に、植物および農業技術の分野に関する。一態様では、本発明は、植物細胞中の標的遺伝子の発現を調節する方法に向けられ、この方法は、本発明に従って修飾されたポリペプチドを植物細胞に提供することを含み、ポリペプチドは、標的遺伝子内の標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を特異的に認識することができ、またポリペプチドが標的ヌクレオチド配列を認識すること、特にそれに結合することを可能にし、それによって植物細胞中の標的遺伝子の発現が調節される。
【００９３】
ポリペプチドは、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を介して植物細胞に提供され得る。例えば、タンパク質は、外因性で植物細胞に付加され得、植物細胞は、ポリペプチドが植物細胞に導入され、標的ヌクレオチド配列に結合し、植物細胞中の標的遺伝子の発現を制御するような条件下で維持される。代替的に、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡは、植物細胞中で発現され得、植物細胞は、発現されたポリペプチドが、標的ヌクレオチド配列に結合し、植物細胞中の標的遺伝子の発現を制御するような条件下で維持される。
【００９４】
植物細胞中の標的遺伝子の発現を調節するための好ましい方法は、次のステップを含む：ａ）本発明に従って修飾されたポリペプチドのための発現システムを植物細胞に提供すること（ポリペプチドは、標的遺伝子の発現制御因子、好ましくはプロモーター内の標的ヌクレオチド配列、またはその相補鎖を特異的に認識すること、および好ましくはそこに結合することができる）；およびｂ）ポリペプチドが産生され、標的ヌクレオチド配列に結合し、それによって植物細胞中の標的遺伝子の発現が調節されるような条件下で、植物細胞を培養すること。
【００９５】
本方法によって、任意の標的ヌクレオチド配列を調節することができる。例えば、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子に対して内因性または外因性であってもよい。本発明の実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、生存細胞中に存在し得るか、またはインビトロで存在してもよい。特定の実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、植物に対して内因性である。標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子に関連する任意の好適な場所に位置してもよい。例えば、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のコード領域の上流または下流であってもよい。代替的に、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のコード領域内にある。好ましくは、標的ヌクレオチド配列は、遺伝子のプロモーターである。
【００９６】
本方法によって、任意の標的遺伝子を調節することができる。例えば、標的遺伝子は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、オリゴ糖、炭水化物、脂質、または小分子の生合成、修飾、細胞輸送、代謝、および分解に影響を及ぼす産物をコードすることができる。さらに、エフェクターは、増加された疾患抵抗性、構造多糖類および貯蔵多糖類の修飾、風味、タンパク質、および脂肪酸、果実成熟、産出量、色、栄養的特性、改善された貯蔵能等の形質について、植物を操作するために使用することができる。
【００９７】
したがって、本発明は、標的細胞中の目的の遺伝子の発現を変化させる方法を提供し、それは以下を含む：目的の遺伝子の構造領域および／または制御性領域のＤＮＡ配列の少なくとも部分を決定すること（必要な場合）；本発明に従って修飾された反復単位を含むポリペプチドを、既知の配列のＤＮＡ上の特異的塩基対を認識するように設計すること、および修飾されたポリペプチドを標的細胞中（好ましくはその核内）に存在させること。（ＤＮＡ配列は、それが既知である場合、決定される必要がないことは明白であろう。）
【００９８】
制御性領域は、目的の遺伝子の構造領域からかなり遠隔であり得る（例えば、遠位エンハンサー配列または類似体）。
【００９９】
加えて、ポリペプチドは、有利に、他のタンパク質からの機能ドメイン（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、レプリカーゼ、インテグラーゼ等からの触媒ドメイン）またはさらに「合成」エフェクタードメインを含んでもよい。ポリペプチドはまた、核局在化シグナル等の活性化シグナルまたはプロセシングシグナルを含んでもよい。これらは、ポリペプチドの、核内標的（ゲノムＤＮＡ等の）への結合を亢進させるために、細胞の核に対するポリペプチドを標的とする際に特に有用である。
【０１００】
修飾されたポリペプチドは、ポリペプチドの発現を誘発するＤＮＡの細胞への送達の結果として、細胞中のインサイツで合成されてもよい。ＤＮＡの送達を促進する方法は、当業者に周知であり、例えば、組み換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム等を含む。代替的に、修飾されたポリペプチドは、細胞の外側で作製され、次いで細胞へ送達され得る。送達は、ポリペプチドをリポソーム等へ組み込むことによって、またはポリペプチドを標的部分（抗体もしくはホルモン分子の結合部分、または膜遷移ドメイン、または真菌もしくは卵菌エフェクターの転座ドメイン、または細菌毒素の典型的Ａ−Ｂファミリーの細胞結合Ｂドメイン等）に結合させることによって、促進され得る。実際に、遺伝子発現を制御する際の、本発明の修飾されたタンパク質の１つの有意な利点は、標的細胞のタンパク質の、ベクターを用いない送達であろう。
【０１０１】
本発明の知り得る限り、標的ＤＮＡ配列内の塩基対を特異的に認識することができる、修飾された反復単位を含有するポリペプチドの設計、および遺伝子発現の調節におけるその成功的使用（本明細書に記載される通り）は、かつて一度も示されていなかった。したがって、本明細書に開示される本発明の躍進は、植物中の使用を超えて拡大する、多数の可能性を提示する。本発明の一実施形態では、エフェクターポリペプチドは、疾患関連遺伝子の発現を制御する際の治療的使用および／または予防的使用のために設計される。例えば、ポリペプチドは、ヒト、他の動物、または植物における外来遺伝子（例えば、細菌またはウイルス病原体の遺伝子）の発現を阻害するため、または突然変異した宿主遺伝子（発癌遺伝子等）の発現を修飾するために使用することができる。
【０１０２】
したがって、本発明はまた、疾患関連遺伝子の発現を阻害することができるエフェクターポリペプチドを提供する。典型的にポリペプチドは、天然産ポリペプチドではなかろうが、疾患関連遺伝子の発現を阻害するように特異的に設計されるであろう。簡便に、エフェクターポリペプチドは、本発明の方法のいずれかによって設計されるであろう。
【０１０３】
本発明はまた、ゲノム操作の分野に関する。エフェクターポリペプチドは、ゲノム内の特異的ＤＮＡ配列を標的とするために、本発明に従って生成され得る。ポリペプチドは、標的ＤＮＡ配列の修飾を誘発する活性を含有するように修飾されてもよい（例えば、標的配列の部位特異的組み換えまたは統合）。この方法は、複合ゲノム内の標的ＤＮＡ修飾を可能にする。
【０１０４】
本発明のさらなる実施形態では、少なくとも１つの反復単位を含む反復ドメインを含むように修飾されたポリペプチドが提供され、反復単位は、ＤＮＡ配列内の塩基対の選択的認識を決定するための高度可変領域を有する。
【０１０５】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、反復単位内に、次の塩基対の１つの認識を決定するために、次の群から選択される高度可変領域を含む：
・Ｃ／Ｇの認識のためのＨＤ
・Ａ／Ｔの認識のためのＮＩ
・Ｔ／Ａの認識のためのＮＧ
・Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃの認識のためのＮＳ
・Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔの認識のためのＮＮ
・Ｔ／Ａの認識のためのＩＧ
・Ｃ／ＧまたはＴ／Ａの認識のためのＮ
・Ｔ／Ａの認識のためのＨＧ
・Ｔ／Ａの認識のためのＨ
・Ｇ／Ｃの認識のためのＮＫ。
【０１０６】
本発明はまた、前述のポリペプチドのいずれか１つをコードするＤＮＡを含む。
【０１０７】
さらなる実施形態では、塩基対が、反復単位を含む少なくとも１つの反復ドメインを含むポリペプチドによって特異的に認識され得るように、標的ＤＮＡ配列内に位置する塩基対を含むために修飾されるＤＮＡが提供され、この反復単位は、ＤＮＡ内の塩基対の認識を決定する高度可変領域を有する。任意の一実施形態では、塩基対は、遺伝子発現制御配列内に位置する。反復ドメインのモジュラー組立てに起因して、塩基対の配列は、反復ドメインによって特異的に標的とされ得る。
【０１０８】
本発明の代替的実施形態では、ＤＮＡは、次の高度可変領域の１つによって選択的認識および決定された認識を受容するために、次の群から選択される塩基対によって修飾される：
・ＨＤによる認識のためのＣ／Ｇ
・ＮＩによる認識のためのＡ／Ｔ
・ＮＧによる認識のためのＴ／Ａ
・ＮＳによる認識のためのＣＴまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃ
・ＮＮによる認識のためのＧ／ＣまたはＡ／Ｔ
・ＩＧによる認識のためのＴ／Ａ。
・Ｎによる認識のためのＣ／ＧまたはＴ／Ａ
・ＨＧによる認識のためのＴ／Ａ
・Ｈによる認識のためのＴ／Ａ
・ＮＫによる認識のためのＧ／Ｃ。
【０１０９】
さらに別の態様では、本発明は、本発明に記載のポリペプチドをそこに結合させることによって、試料混合物中に存在する目的の核酸配列を修飾する方法を提供し、それはポリペプチドが目的の配列を認識すること、および好ましくはそこに特異的に結合することを可能にするために、試料混合物を、目的の配列の少なくとも一部に対する親和性を有するポリペプチドと接触させることを含む。
【０１１０】
本明細書で使用されるとき、「修飾する」という用語は、配列が、単にポリペプチドの結合によって修飾されると考えられることを意味することが意図される。それは、ヌクレオチドの配列が変更されることを示唆することを意図されていないが、かかる変更（およびその他）は、ポリペプチドの、目的の核酸への結合に続いて起こり得る。簡便に、核酸配列は、ＤＮＡである。
【０１１１】
目的の核酸の修飾（モジュラー反復単位を含有するように修飾されたポリペプチドによる、そこへの結合という意味で）は、幾つかの方法のうちのいずれかで検出され得る（例えば、ゲル移動度シフト検定、標識化ポリペプチド標識の使用は、放射性、蛍光、酵素、またはビオチン／ストレプトアビジン標識を含み得る）。
【０１１２】
目的の核酸配列の修飾（およびその検出）が、必要とされる全てであってもよい（例えば、疾患の診断の際に）。しかしながら、望ましくは、さらなる試料のプロセシングが行われる。簡便に、ポリペプチド（およびそこに特異的に結合する核酸配列）は、試料の残りから分離される。有利に、ポリペプチド−ＤＮＡ複合体は、かかる分離を促進するために、固相支持体に結合される。例えば、ポリペプチドは、アクリルアミドもしくはアガロースゲルマトリックス中に存在してもよいか、またはより好ましくは、膜の表面上またはマイクロタイタープレートのウェル中で固定化される。
【０１１３】
本発明の一実施形態では、反復単位を含む前記反復ドメインは、標的認識および好ましくはＤＮＡ配列内の１つ以上の特異的塩基対の結合を達成するために、細菌、ウイルス、真菌、卵菌、ヒト、動物、または植物ポリペプチドに挿入され、任意に、ここでの前記反復単位は、ＤＮＡ配列内の１つ以上の塩基対に対する事前選択された特異的結合活性を得るために、さらに任意に修飾されるタンパク質のＡｖｒＢｓ３様ファミリーの反復ドメインに由来する。
【０１１４】
本発明は、単離されたまたは実質的に精製された、ポリヌクレオチドまたはタンパク質組成物を包含する。「単離された」または「精製された」、ポリヌクレオチドもしくはタンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、通常、その天然産環境で見出されるポリヌクレオチドまたはタンパク質に伴うか、またはそれらと相互作用する構成要素が実質的にまたは本質的にない。したがって、単離されたまたは精製された、ポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組み換え技術によって産生されるとき、他の細胞物質または培養媒体が実質的にないか、または化学的に合成されるとき、化学的前駆体または他の化学物質が実質的にない。任意に、「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがそこに由来する生物のゲノムＤＮＡ内のポリヌクレオチドに天然に隣接した（すなわち、ポリヌクレオチドの５’および３’末端に位置する配列）配列（任意にタンパク質コード配列）がない。例えば、種々の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがそこに由来する細胞のゲノムＤＮＡ内のポリヌクレオチドに天然に隣接した、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。実質的に細胞物質のないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％、または１％（乾燥重量で）未満の汚染タンパク質を有するタンパク質の調製を含む。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性な部分が、組み換えにより産生されるとき、任意に、培養媒体は、約３０％、２０％、１０％、５％、または１％（乾燥重量で）未満の化学的前駆体または目的の非タンパク質化学物質に相当する。
【０１１５】
開示されるＤＮＡ配列およびそれによってコードされたタンパク質の、フラグメントおよび変異体もまた、本発明によって包含される。「フラグメント」とは、ＤＮＡ配列の一部またはアミノ酸配列の一部、およびしたがってそれによってコードされたタンパク質を意図する。コード配列を含むＤＮＡ配列のフラグメントは、天然タンパク質の生物学的活性を保持するタンパク質フラグメント、およびしたがって本明細書に記載される標的ＤＮＡ配列に対するＤＮＡ認識または結合活性をコードしてもよい。代替的に、ＤＮＡ配列のフラグメントは、概して生物学的活性を保持するタンパク質をコードしないか、またはプロモーター活性を保持しない、ハイブリダイゼーションプローブとして有用である。したがって、ＤＮＡ配列のフラグメントは、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから、本発明の最大完全長ポリヌクレオチドの範囲に及んでもよい。
【０１１６】
「変異体」は、実質的に類似した配列を意味することが意図される。ＤＮＡ配列について、変異体は、５’および／または３’末端で欠失（すなわち、トランケーション）を有するＤＮＡ配列、天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の内部部位での１つ以上のヌクレオチドの欠失および／または付加、ならびに／または天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の部位での１つ以上のヌクレオチドの置換を含む。本明細書で使用されるとき、「天然」ＤＮＡ配列またはポリペプチドは、それぞれ、天然産ＤＮＡ配列またはアミノ酸配列を含む。ＤＮＡ配列について、保存的変異体は、遺伝的コードの縮重のために、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするそれらの配列を含む。変異体ＤＮＡ配列はまた、例えば、部位特異的突然変異を用いることによって生成されるが、本発明のタンパク質を依然としてコードするＤＮＡ配列等の、合成的に誘発されたＤＮＡ配列を含む。概して、本発明の特定のＤＮＡ配列の変異体は、本明細書の他の箇所に記載される配列整列プログラムおよびパラメータによって決定される、その特定のポリヌクレオチドに対して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するであろう。
【０１１７】
本発明の特定のＤＮＡ配列の変異体（すなわち、参照ＤＮＡ配列）はまた、変異体ＤＮＡ配列によってコードされたポリペプチドと、参照ＤＮＡ配列によってコードされたポリペプチドとの間の、配列同一性の百分率の比較によって評価され得る。任意の２つのポリペプチドの間の百分率配列同一性は、本明細書の他の箇所に記載される配列整列プログラムおよびパラメータを用いて算出され得る。本発明のポリヌクレオチドの任意の所定の対が、それらがコードする２つのポリペプチドによって共有される配列同一性の百分率の比較によって評価される場合、２つのコードされたポリペプチドの間の配列同一性の百分率は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性である。
【０１１８】
「変異体」タンパク質は、天然タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端での１つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆるトランケーション）によって、天然タンパク質に由来するタンパク質、天然タンパク質中の１つ以上の内部部位での１つ以上のアミノ酸の欠失および／または付加、または天然タンパク質中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換を意味することが意図される。本発明によって包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、つまり、それらは本明細書に記載される天然タンパク質の所望の生物学的活性をプロセスし続ける。かかる変異体は、例えば、遺伝的多型から、または人間による操作からもたらされてもよい。本発明のタンパク質の生物学的に活性な変異体は、本明細書の他の箇所に記載される配列整列プログラムおよびパラメータによって決定される、天然タンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するであろう。本発明のタンパク質の生物学的に活性な変異体は、わずか１〜１５個のアミノ酸残基、６〜１０、わずか５、わずか４、３、２、またはさらに１つのアミノ酸残基等のわずか１〜１０個の差で、そのタンパク質から異なってもよい。
【０１１９】
本発明のタンパク質は、アミノ酸置換、欠失、トランケーション、および挿入を含む種々の方法で変化させられ得る。かかる操作のための方法は、概して当該技術分野で既知である。例えば、タンパク質のアミノ酸配列変異体およびフラグメントは、ＤＮＡ内の突然変異によって調製され得る。突然変異およびポリヌクレオチド変化のための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２、米国特許第４，８７３，１９２号、ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、および引用される参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指導は、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルで見出され得、それは参照により本明細書に組み込まれる。１つのアミノ酸を、類似した特性を有する別の分子と置換する等の保存的置換が最適であってもよい。
【０１２０】
本明細書で包含される、タンパク質配列の欠失、挿入、および置換は、タンパク質の特徴の根本的な変化をもたらすことが予測されていない。しかしながら、それを行う前に置換、欠失、または挿入の正確な影響を予測することが困難な場合、当業者は、本明細書の他の箇所に記載される、または当該技術分野で既知の、所定のスクリーニング検定によってこの影響が評価されるであろうことを理解するであろう。
【０１２１】
変異体ＤＮＡ配列およびタンパク質はまた、ＤＮＡシャフリング等の突然変異誘発手順および組み替え誘導手順に由来する配列およびタンパク質を包含する。かかるＤＮＡシャフリングのための戦略は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１０７４７−１０７５１、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９−３９１、Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：４５０４−４５０９、Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９１：２８８−２９１、および米国特許第５，６０５，７９３号および同第５，８３７，４５８号を参照されたい。
【０１２２】
ＰＣＲアプローチでは、オリゴヌクレオチドプライマーは、目的の任意の生物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡからの対応するＤＮＡ配列を増幅するＰＣＲ反応で使用するために、設計することができる。ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲクローン化を設計する方法は、概して当該技術分野で既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示される。また、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９５）ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、およびＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９９）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）も参照されたい。ＰＣＲの既知の方法は、対形成されたプライマー、入れ子式プライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチのプライマー等を用いる方法を含むが、それらに限定されない。
【０１２３】
ハイブリダイゼーション技術では、既知のポリヌクレオチドの全てまたは部分は、選択された生物からクローン化されたゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメント（すなわち、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリ）の集団中に存在する他の対応するポリヌクレオチドと、選択的にハイブリッド形成するプローブとして使用される。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他のオリゴヌクレオチドであってもよく、^３２Ｐ等の検出可能な基、または任意の他の検出可能なマーカーでラベル化されてもよい。したがって、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本発明のＤＮＡ配列に基づいて、合成オリゴヌクレオチドを標識化することによって作製され得る。ハイブリダイゼーションのためのプローブの調製ならびにｃＤＮＡおよびゲノムライブラリの構築のための方法は、概して当該技術分野で既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示される。
【０１２４】
かかる配列のハイブリダイゼーションは、厳格な条件下で行われてもよい。「厳格な条件」または「厳格なハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列よりも、検出可能なほどに大規模に（例えば、少なくとも背景を２倍上回る）、その標的配列とハイブリッド形成するような条件が意図される。厳格な条件は、配列依存性であり、異なる状況において異なるであろう。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件の厳格度を制御することによって、プローブと１００％相補的な標的配列が特定され得る（相同プロービング）。代替的に、厳格度条件は、低い程度の類似性が検出されるように、配列内の一部のミスマッチを許容するように調節され得る（非相同プロービング）。概して、プローブは、約１０００ヌクレオチド長未満、任意に５００ヌクレオチド長未満である。
【０１２５】
典型的に、厳格な条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で約１．５Ｍ Ｎａイオン未満、典型的に約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合少なくとも約３０℃、および長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）の場合少なくとも約６０℃であるような条件であろう。厳格な条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤の付加によって達成されてもよい。例示的な低厳格度条件は、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液との３７℃でのハイブリダイゼーション、および１Ｘ〜２Ｘ ＳＳＣ（２０Ｘ ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中の５０〜５５℃での洗浄を含む。例示的な中程度の厳格度条件は、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．５Ｘ〜１Ｘ ＳＳＣ中の５５〜６０℃での洗浄を含む。例示的な高厳格度条件は、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．１Ｘ ＳＳＣ中の６０〜６５℃での洗浄を含む。任意に、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％ＳＤＳを含んでもよい。ハイブリダイゼーションの期間は、概して約２４時間未満、通常約４〜約１２時間である。洗浄時間の期間は、少なくとも平衡に到達するために十分な時間の長さであろう。
【０１２６】
特異性は、典型的にポストハイブリダイゼーション洗浄の関数であり、このうち重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔ_ｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４：Ｔ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６（対数Ｍ）＋０．４１（ＧＣ％）−０．６１（形成％）−５００／Ｌの方程式から概算され得、式中、Ｍは、一価陽イオンのモル濃度、ＧＣ％は、ＤＮＡ内のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率、形成％は、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率、かつＬは、塩基対のハイブリッドの長さである。Ｔ_ｍは、相補標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブとハイブリッド形成する温度（規定のイオン強度およびｐＨ下で）である。Ｔ_ｍは、各１％のミスマッチにつき約１℃減少させられ、したがって、Ｔ_ｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性を備える配列とハイブリッド形成するように調節され得る。例えば、９０％以上の同一性を備える配列が求められる場合、Ｔ_ｍは１０℃減少させられ得る。概して、厳格な条件は、規定のイオン強度およびｐＨで、特定の配列およびその補体についての熱融点（Ｔ_ｍ）よりも、約５℃低くなるように選択される。しかしながら、非常に厳格な条件は、熱融点（Ｔ_ｍ）よりも１、２、３、もしくは４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、中程度に厳格な条件は、熱融点（Ｔ_ｍ）よりも６、７、８、９、もしくは１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、低い厳格度条件は、熱融点（Ｔ_ｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、もしくは２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液の厳格度の変形が、方程式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望のＴ_ｍを用いて、本質的に説明されていることを理解するであろう。所望のミスマッチの程度が、４５℃未満（水溶液）または３２℃未満（ホルムアミド溶液）のＴ_ｍをもたらす場合、高い温度が使用され得るように、ＳＳＣ濃度を増加させることが最適である。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指導は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ-Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【０１２７】
本発明のＤＮＡ配列およびタンパク質は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含むポリヌクレオチド分子およびタンパク質を包含する、つまり、本明細書に開示されるＤＮＡ配列とまたはアミノ酸配列と十分に同一であることが理解される。本明細書で使用されるとき、「十分に同一」という用語は、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が、共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するように、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して、十分な数もしくは最小の数の、同一もしくは同等の（例えば、類似した側鎖を備える）アミノ酸残基またはヌクレオチドを含有する第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列を指す。例えば、少なくとも約７０％の同一性、好ましくは７５％の同一性、より好ましくは８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する共通の構造ドメインを含有するアミノ酸またはヌクレオチド配列は、本明細書で十分に同一であるとして定義される。
【０１２８】
２つのアミノ酸配列のまたは２つの核酸の百分率同一性を決定するために、配列は、最適な比較目的で整列される。２つの配列の間の百分率同一性は、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち、百分率同一性＝同一位置の数／位置の合計数（例えば、重複位置）×１００）である。一実施形態では、２つの配列は、同一の長さである。２つの配列の間の百分率同一性は、ギャップを許容しながら、または許容せずに、下記の技術に類似した技術を用いて決定され得る。百分率同一性を算出する際には、典型的に正確なマッチが数えられる。
【０１２９】
２つの配列の間の百分率同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの、好ましい、非限定的例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７にあるように修飾された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のポリヌクレオチド分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２で行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で行うことができる。比較目的のためのギャップ整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。代替的に、分子の間の距離関係を検出する反復検索を行うために、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用することができる。上掲のＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい、非限定的例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（２．０版）に組み込まれ、それは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの部分である。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用するとき、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用することができる。整列はまた、検査によって手動で行われてもよい。
【０１３０】
特に指示しない限り、本明細書で提供される配列同一性／類似性値は、本発明の完全長配列を用いておよびアルゴリズムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４）の平均による多重整列を用いて、ソフトウェアパッケージＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ＳｕｉｔｅＶｅｒｓｉｏｎ７に含まれるプログラムＡｌｉｇｎＸを用いて（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）デフォルトパラメータを用いて、またはそれらの任意の同等のプログラムを用いて、得られる値を指す。「同等のプログラム」とは、問題となる任意の２つの配列のために、デフォルトパラメータを用いて、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（１．８３版）によって生成される対応する整列と比較されたとき、同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチならびに配列同一性の同一の百分率を有する整列を生成する、任意の配列比較プログラムが意図される（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｗｅｂｓｉｔｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌにて入手可能）。
【０１３１】
本発明のＤＮＡ配列は、細菌、真菌、藻類、植物、および動物を含むが、それらに限定されない、任意の原核性細胞もしくは真核性細胞および／または目的の生物中の発現のための発現カセット中に提供され得る。カセットは、本発明のＤＮＡ配列に作動可能に結合された５’および３’制御配列を含むであろう。「作動可能に結合された」とは、２つ以上の要素の間の機能結合を意味することが意図される。例えば、目的のポリヌクレオチドまたは遺伝子と、制御配列（すなわち、プロモーター）との間の作動可能な結合は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能結合である。作動可能に結合された要素は、隣接または非隣接であってもよい。２つのタンパク質コード領域の結合を指すために使用されるとき、作動可能に結合されたとは、コード領域が、同一の読み枠内にあることが意図される。カセットは、生物に共形質転換される少なくとも１つのさらなる遺伝子をさらに含有してもよい。代替的に、さらなる遺伝子は、多重発現カセット上に提供され得る。かかる発現カセットには、ＤＮＡ配列の挿入を制御性領域の転写の調節下に置くための、複数の制限部位および／または組み換え部位が提供される。発現カセットは、選択可能なマーカー遺伝子をさらに含有してもよい。
【０１３２】
発現カセットは、転写の５’−３’方向に、植物もしくは他の生物または非ヒト宿主細胞中で機能的である、転写および翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、本発明のＤＮＡ配列、ならびに転写および翻訳末端領域（すなわち、末端領域）を含むであろう。制御性領域（すなわち、プロモーター、転写制御性領域、および翻訳末端領域）および／または本発明のＤＮＡ配列は、天然／宿主細胞にまたは互いに類似してもよい。代替的に、本発明の制御性領域および／またはＤＮＡ配列は、宿主細胞とまたは互いに非相同であってもよい。配列に関連して本明細書で使用されるとき、「非相同」は、外来種に由来する配列であるか、または、同一の種に由来する場合、人間の意図的な介入によって、組成および／またはゲノム遺伝子座においてその天然形態から実質的に修飾された配列である。例えば、非相同ポリヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーターは、ポリヌクレオチドが由来する種とは異なる種に由来するか、または、同一の／類似した種に由来する場合、１つまたは双方は、それらの原型および／またはゲノム遺伝子座から実質的に修飾されるか、またはプロモーターは、作動可能に結合されたポリヌクレオチドのための天然プロモーターでない。本明細書で使用されるとき、キメラ遺伝子は、コード配列と非相同な転写開始領域に作動可能に結合されたコード配列を含む。
【０１３３】
末端領域は、転写開始領域を備える天然であってもよく、作動可能に結合された目的のＤＮＡ配列を備える天然であってもよく、宿主を備える天然であってもよく、またはプロモーター、目的のＤＮＡ配列、植物宿主、またはそれらの任意の組み合わせに対して別の源に由来してもよい（すなわち、外来または非相同）。簡便な末端領域で使用するための植物は、オクトピン合成酵素およびノパリン合成酵素末端領域等の、Ａ．ツメファシエンスのＴｉ−プラスミドから入手可能である。また、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ６４：６７１−６７４、Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１−１４９、Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２：１２６１−１２７２、Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ９１：１５１−１５８、Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３、およびＪｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９も参照されたい。
【０１３４】
適切な場合、ポリヌクレオチドは、形質転換生物中の増加された発現のために最適化されてもよい。つまり、ポリヌクレオチドは、改善された発現のために、宿主から好まれるコドンを用いて、合成することができる。宿主優先コドン用途の考察については、例えば、ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＧｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照されたい。宿主優先遺伝子、特に植物優先遺伝子を合成する方法は、当該技術分野で入手可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号および同第５，４３６，３９１号、ならびにＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照されたく、それらは参照により本明細書に組みこまれる。
【０１３５】
さらなる配列修飾は、細胞宿主中の遺伝子発現を亢進させることが知られる。これらは、偽性ポリアデニル化シグナル、エクソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復、および遺伝子発現に有害であり得る他のかかる特徴のはっきりした配列をコードする配列の排除を含む。配列のＧ−Ｃ含量は、宿主細胞中で発現される既知の遺伝子を参照することによって算出される、所定の細胞宿主に平均的なレベルに調節されてもよい。可能な場合、配列は、予測ヘアピン二次性ｍＲＮＡ構造を回避するように修飾される。
【０１３６】
発現カセットは、５’リーダー配列をさらに含有してもよい。かかるリーダー配列は、翻訳を亢進させるように作用することができる。翻訳リーダーは、当該技術分野で既知であり、以下を含む：ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６１２６−６１３０）、ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈウイルス）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ１６５（２）：２３３−２３８）、ＭＤＭＶリーダー（ＭａｉｚｅＤｗａｒｆ Ｍｏｓａｉｃ ウイルス）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５４：９−２０）、およびヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５３：９０−９４）、アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡからの非翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２５：６２２−６２５）、タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ ＲＮＡ，ｅｄ．Ｃｅｃｈ（Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２３７−２５６）、およびメイズクロロティックモットルウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８１：３８２−３８５）。また、Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８も参照されたい。
【０１３７】
発現カセットを調製する際には、ＤＮＡ配列を正しい方向、また必要に応じて、正しい読み枠内に提供することができるように、種々のＤＮＡフラグメントを操作してもよい。この目的のために、ＤＮＡフラグメントを結合させるためにアダプターまたはリンカーを採用してもよいか、または簡便な制限部位を提供すること、過剰なＤＮＡを除去すること、制限部位を除去すること等の他の操作を伴ってもよい。この目的で、インビトロ突然変異、プライマー修復、制限、アニール、再置換、例えば、転移および塩基転換を伴ってもよい。
【０１３８】
幾つかのプロモーターを、本発明の実践に使用することができる。プロモーターは、目的の宿主および所望の結果に基づいて選択することができる。核酸は、植物中の発現のために、構成的、組織優先、または他のプロモーターと組み合わせることができる。かかる構成的プロモーターには、例えば、コアＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０−８１２）、イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２：１６３−１７１）、ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２、およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）、ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）、ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７２３−２７３０）、ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）等が含まれる。他の構成的プロモーターには、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号、同第５，６０８，１４４号、同第５，６０４，１２１号、同第５，５６９，５９７号、同第５，４６６，７８５号、同第５，３９９，６８０号、同第５，２６８，４６３号、同第５，６０８，１４２号、および同第６，１７７，６１１号が含まれる。
【０１３９】
組織優先プロモーターは、特定の宿主組織内での亢進された発現を標的とするために利用することができる。植物に使用するためのかかる組織優先プロモーターは、葉優先プロモーター、根優先プロモーター、種優先プロモーター、および茎優先プロモーターを含むが、それらに限定されない。組織優先プロモーターは、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１２（２）：２５５−２６５、Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３、Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．６（２）：１５７−１６８、Ｒｉｎｅｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１３４１、Ｖａｎ Ｃａｍｐ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５−５３５、Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８、Ｌａｍ（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．ＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒ．２０：１８１−１９６、Ｏｒｏｚｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ ＭｏｌＢｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８、Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０（２０）：９５８６−９５９０、およびＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ．４（３）：４９５−５０５を含む。かかるプロモーターは、必要な場合、低発現のために修飾することができる。
【０１４０】
概して、誘発性プロモーターから、特に病原体誘発性プロモーターから、遺伝子を発現することが有益であろう。かかるプロモーターは、例えば、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、ベータ−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼ等の、病原関連タンパク質（ＰＲタンパク質）からのプロモーターを含み、それは、病原体による感染に続いて誘発される。例えば、Ｒｅｄｏｌｆｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．８９：２４５−２５４、Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ４：６４５−６５６、およびＶａｎ Ｌｏｏｎ（１９８５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｖｉｒｏｌ．４：１１１−１１６を参照されたい。また、国際公開第９９／４３８１９号も参照されたく、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
病原体感染の部位で、またはその付近で局在的に発現されるプロモーターが目的である。例えば、Ｍａｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：３３５−３４２、Ｍａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ−ＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ２：３２５−３３１、Ｓｏｍｓｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：２４２７−２４３０、Ｓｏｍｓｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２：９３−９８、およびＹａｎｇ（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１４９７２−１４９７７を参照されたい。また、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１０：９５５−９６６、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：２５０７−２５１１、Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ．３：１９１−２０１、Ｓｉｅｂｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１：９６１−９６８、米国特許第５，７５０，３８６号（線虫誘発性）、および引用される参考文献も参照されたい。トウモロコシＰＲｍｓ遺伝子のための誘発性プロモーターを特に目的とし、その発現は、病原体フザリウム・モニリフォルメによって誘発される（例えば、Ｃｏｒｄｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈ．４１：１８９−２００）を参照されたい。
【０１４２】
化学調節プロモーターは、外因性化学調節因子の適用を通じて、植物中の遺伝子の発現を調節するために使用することができる。目的に依存して、プロモーターは、化学の適用が遺伝子発現を誘発する場合、化学誘発性プロモーターであってもよく、化学の適用が遺伝子発現を抑制する場合、化学抑制性プロモーターであってもよい。化学誘発性プロモーターは、当該技術分野で既知であり、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤によって活性化される、トウモロコシＩｎ２−２プロモーター、出芽前除草剤として使用される疎水性求電子化合物によって活性化される、トウモロコシＧＳＴプロモーター、およびサリチル酸によって活性化される、タバコＰＲ−１ａプロモーターを含むが、それらに限定されない。目的の他の化学制御性プロモーターは、ステロイド反応性プロモーター（例えば、Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０４２１−１０４２５およびＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１４（２）：２４７−２５７の糖質コルチコイド誘発性プロモーターを参照されたい）ならびにテトラサイクリン誘発性およびテトラサイクリン抑制性プロモーターを含み（例えば、Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９−２３７、および米国特許第５，８１４，６１８号および同第５，７８９，１５６号を参照されたい）、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４３】
発現カセットはまた、形質転換された細胞の選択のために、選択可能なマーカー遺伝子も含む。選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換された細胞または組織の選択に利用される。マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子等の、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、ならびにグルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）等の除草化合物に対する抵抗性を付与する遺伝子を含む。さらなる選択可能なマーカーは、β−ガラクトシダーゼ等の表現型マーカーおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ ８５：６１０−９およびＦｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１６：２１５−２８）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＹＰ）（Ｂｏｌｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１１７：９４３−５４およびＫａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ１２９：９１３−４２）、および黄色蛍光タンパク質（ＥｖｒｏｇｅｎからのＰｈｉＹＦＰ（商標）、Ｂｏｌｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１１７：９４３−５４を参照されたい）等の蛍光タンパク質を含む。さらなる選択可能なマーカーについては、概して、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６−５１１、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６３１４−６３１８、Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ７１：６３−７２、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２４１９−２４２２、Ｂａｒｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８０）ｉｎ ＴｈｅＯｐｅｒｏｎ、ｐｐ．１７７−２２０、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ４８：５５５−５６６、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ４９：６０３−６１２、Ｆｉｇｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ５２：７１３−７２２、Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．ＵＳＡ８６：５４００−５４０４、Ｆｕｅｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２５４９−２５５３、Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４８：４８０−４８３、Ｇｏｓｓｅｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｒｅｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１９１７−１９２１、Ｌａｂｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６、Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：３９５２−３９５６、Ｂａｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：５０７２−５０７６、Ｗｙｂｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４６４７−４６５３、ＨｉｌｌｅｎおよびＷｉｓｓｍａｎ（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：１４３−１６２、Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１５９１−１５９５、Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７：１０９４−１１０４、Ｂｏｎｉｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５５４７−５５５１、Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：９１３−９１９、Ｈｌａｖｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３４：７２１−７２４を参照されたい。かかる開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
上の選択可能なマーカー遺伝子の一覧は、限定的するものとは意図されていない。本発明で、任意の選択可能なマーカー遺伝子を使用することができる。
【０１４５】
植物を形質転換するための、多数の植物形質転換ベクターおよび方法が入手可能である。例えば、Ａｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｐｙｓｉｏｌ．，８１：３０１−３０５、Ｆｒｙ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＲｅｐ．６：３２１−３２５、Ｂｌｏｃｋ，Ｍ．（１９８８）Ｔｈｅｏｒ．ＡｐｐｌＧｅｎｅｔ．７６：７６７−７７４、Ｈｉｎｃｈｅｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｔａｄｌｅｒ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｍｐ．２０３２１２．２０３−２１２、Ｃｏｕｓｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８：４８１−４９４、Ｃｈｅｅ，Ｐ．Ｐ．およびＳｌｉｇｈｔｏｍ，Ｊ．Ｌ．（１９９２）Ｇｅｎｅ．１１８：２５５−２６０、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２３９−２４６、Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：３０９−３１４、Ｄｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９：８１−８８、Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１２１２−１１２１６、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．（１９９３）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ｐｌａｎｔ；２９Ｐ：１１９−１２４、Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＲｅｐ．１２：１８０−１８３、Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ａ．およびＭｃｈｕｇｈｅｎ，Ａ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９１：１３９−１４８、Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｃ．Ｉ．およびＴｒｉｅｕ，Ｔ．Ｎ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１６７、Ｇｏｌｏｖｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９０：４１−５２、Ｇｕｏ Ｃｈｉｎ Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．３８：２０７２−２０７８、Ａｓａｎｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＲｅｐ．１３、Ａｙｅｒｅｓ Ｎ．Ｍ．およびＰａｒｋ，Ｗ．Ｄ．（１９９４）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｓｃｉ．１３：２１９−２３９、Ｂａｒｃｅｌｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：５８３−５９２、Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：２９９−３０７、Ｂｏｒｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｃｔａ．ＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔ．１６：２２５−２３０、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．（１９９４）Ａｇｒｏ．Ｆｏｏｄ．Ｉｎｄ．Ｈｉ Ｔｅｃｈ．５：１７−２７、Ｅａｐｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＲｅｐ．１３：５８２−５８６、Ｈａｒｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：９１９９２３；Ｒｉｔａｌａ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３１７−３２５；およびＷａｎ，Ｙ．Ｃ．およびＬｅｍａｕｘ，Ｐ．Ｇ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：３７４８を参照されたい。
【０１４６】
本発明の方法は、ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド構築物を、宿主細胞に導入することを含む。「導入する」とは、構築物が宿主細胞の内部へのアクセスを得るような様態で、ポリヌクレオチド構築物を植物に提示することが意図される。本発明の方法は、ポリヌクレオチド構築物が宿主の１つの細胞の内部へのアクセスを得る限り、ポリヌクレオチド構築物を宿主細胞へ導入するための特定の方法に依存しない。ポリヌクレオチド構築物を細菌、植物、真菌、および動物に導入する方法は、当該技術分野で既知であり、安定的形質転換方法、一過性形質転換方法、およびウイルス仲介方法を含むが、それらに限定されない。
【０１４７】
「安定的形質転換」とは、植物に導入されたポリヌクレオチド構築物が宿主のゲノムに統合し、それらの子孫によって受け継がれることができることが意図される。「一過性形質転換」とは、宿主に導入されたポリヌクレオチド構築物が宿主のゲノムに統合しないことが意図される。
【０１４８】
植物および植物細胞の形質転換について、本発明のＤＮＡ配列は、標準技術を用いて、目的の宿主細胞または生物中のＤＮＡ配列の発現に好適な、当該技術分野で既知の任意のベクターに挿入される。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換される標的宿主の種に依存する。
【０１４９】
植物発現カセットを構築し、外来核酸を植物に導入する手法は、概して当該技術分野で既知であり、すでに説明されている。例えば、外来ＤＮＡは、腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミドベクターを用いて、植物に導入することができる。外来ＤＮＡ送達に利用される他の方法は、ＰＥＧ仲介型プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、微量注入ウィスカ、および直接のＤＮＡ取り込みのための遺伝子銃または微粒子銃の使用を含む。かかる方法は、当該技術分野で既知である（Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，４０５，７６５号、Ｂｉｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ１００：２４７−２５０、Ｓｃｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．、（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２８：１０４−１１２、Ｇｕｅｒｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ５２：１１１−１１６、Ｎｅｕｈａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｔｈｅｏｒ．ＡｐｐｌＧｅｎｅｔ．７５：３０−３６、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２７：７０−７３、Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２０８：１２６５、Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１２２９−１２３１、ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ９１：６９４−７０１、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８８）、およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＳｃｈｕｌｅｒおよびＺｉｅｌｉｎｓｋｉ，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．（１９８９）。形質転換の方法は、形質転換される植物細胞、使用されるベクターの安定性、遺伝子産物の発現レベル、および他のパラメータに依存する。
【０１５０】
本発明のＤＮＡ配列は、植物をウイルスまたはウイルス性の核酸に接触させることによって、植物に導入されてもよい。概して、かかる方法は、本発明のポリヌクレオチド構築物をウイルス性のＤＮＡまたはＲＮＡ分子に組み込むことを含む。本発明のタンパク質がウイルス性のポリタンパク質の一部として最初に合成されてもよく、次いでインビボまたはインビトロでのタンパク質分解によってプロセスされて、所望の組み換えタンパク質を産生してもよいことが認識される。さらに、本発明のプロモーターが、ウイルス性のＲＮポリメラーゼによって転写に利用されるプロモーターも包含することが認識される。ウイルス性のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を用いて、ポリヌクレオチド構築物を植物に導入し、そこでコードされたタンパク質を発現させる方法は当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第５，８８９，１９１号、同第５，８８９，１９０号、同第５，８６６，７８５号、同第５，５８９，３６７号、および同第５，３１６，９３１号を参照されたく、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
特定の実施形態では、種々の一過性形質転換方法を用いて、本発明のＤＮＡ配列を、植物に提供することができる。かかる一過性形質転換方法は、タンパク質またはその変異体およびフラグメントの植物への直接導入、またはタンパク質をコードする転写物の植物への導入を含むが、それらに限定されない。かかる方法は、例えば、微量注入法または微粒子銃法を含む。例えば、Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＭｏｌＧｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：１７９−１８５、Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４４：５３−５８、Ｈｅｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：２１７６−２１８０、およびＨｕｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆ ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１０７：７７５−７８４を参照されたく、参考文献の全ては、参照により本明細書に組み込まれる。代替的に、ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の技術を用いて、一過性で植物に形質転換することができる。かかる技術は、下記のアグロバクテリウムツメファシエンス仲介型一過性発現を含む。
【０１５２】
形質転換された細胞は、従来の方法に従って、植物中で増殖されてもよい。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ５：８１−８４を参照されたい。次いでこれらの植物は増殖され、同一の形質転換株または異なる株のいずれかで受粉され、所望の表現型特徴の構成的発現を有する、得られたハイブリッドが特定されてもよい。所望の表現型特徴の発現が安定的に維持され、受け継がれることを確実にするために、２つ以上の世代が増殖されてもよく、次いで所望の表現型特徴の発現が達成されたことを確実にするために、種子が採取されてもよい。このようにして、本発明は、本発明のポリヌクレオチド構築物、例えば、それらのゲノムに安定的に組み込まれる、本発明の発現カセットを有する形質転換種子（「トランスジェニック種子」とも称される）を提供する。
【０１５３】
本発明は、単子葉類および双子葉類を含むが、それらに限定されない、任意の植物種子の形質転換に使用されてもよい。特に目的とする植物、および目的の種子を提供する穀物植物には、油糧種子植物、マメ科植物、およびアラビドプシス・タリアナが含まれるが、それらに限定されない。目的の種子には、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ソルガム、ライ等の穀物種子が含まれる。油糧種子植物には、ワタ、ダイズ、ベニバナ、ヒマワリ、アブラナ属、トウモロコシ、アルファルファ、ヤシ、ココナッツ等が含まれる。マメ科植物には、マメおよびエンドウマメが含まれる。マメには、グアー、イナゴマメ、コロハ、ダイズ、インゲンマメ、ササゲ、リョクトウ、ライマメ、ソラマメ、レンズマメ、ヒヨコマメ等が含まれる。
【０１５４】
本明細書で使用されるとき、植物という用語は、植物細胞、植物プロトプラスト、植物をそこから再生することができる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物群落、および植物中または胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、根、根端、葯等の植物部分中で無処置の植物細胞を含む。再生植物の子孫、変異体、および突然変異体もまた、これらの部分が、導入されたポリヌクレオチドを含むという条件で、本発明の範囲内に含まれる。
【０１５５】
本発明はさらに、本発明のＤＮＡ配列の、細菌細胞、酵母細胞、他の真菌細胞、ヒト細胞、および他の動物細胞を含むが、それらに限定されない非植物宿主細胞への導入を包含する。加えて、本発明は、安定的方法および一過性形質転換方法の両方による、ＤＮＡ配列の、動物および他の生物への導入を包含する。
【０１５６】
本明細書で説明される通り、本発明のＤＮＡ配列を、これらの真核性システムにおいて発現することができる。酵母中の非相同ポリヌクレオチドの合成は、周知である（Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。真核性タンパク質の産生のために、広範に利用される２つの酵母は、サッカロミセス・セルビシエおよびピキア・パストリスである。サッカロミセスおよびピキア中での発現のためのベクター、株、およびプロトコルは、当該技術分野で既知であり、商業供給者（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手可能である。好適なベクターは、通常、所望に応じて、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたはオキシダーゼを含むプロモーター、および複製の起点、末端配列等の発現制御配列を有する。
【０１５７】
本発明の配列はまた、哺乳類起源または昆虫起源の細胞培養物をトランスフェクトする際の使用のために、種々の発現ベクターに連結されることができる。ペプチドの産生に有用な例示的な細胞培養物は、哺乳類細胞である。無処置のタンパク質を発現することができる幾つかの好適な宿主細胞株は、当該技術分野で開発されており、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、およびＣＨＯ細胞株を含む。これらの細胞のための発現ベクターは、複製の起点、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、またはｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター）、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９）等の発現制御配列、およびリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０大型Ｔ ＡｇポリＡ付加部位）等の必要なプロセシング情報部位、および転写終結配列を含んでもよい。本発明のタンパク質の産生に有用な他の動物細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。
【０１５８】
昆虫細胞中で本発明のタンパク質を発現するための適切なベクターは、通常、ＳＦ９バキュロウイルスに由来する。好適な昆虫細胞株には、カ幼虫、カイコ、ヨトウムシ、ガ、およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞株等のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株が含まれる（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（１９８７）Ｊ．Ｅｍｂｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．２７：３５３−３６５を参照されたい）。
【０１５９】
酵母に関しては、高等動物または植物宿主細胞が採用されるとき、ポリアデニル化または転写終結配列は、典型的にベクターに組み込まれる。終結配列の例は、ウシ増殖ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列がまた含まれてもよい。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０からのＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３−７８１）。追加的に、宿主細胞中の複製を制御するための遺伝子配列は、ウシパピローマウイルス型ベクターで見出されるベクター等のベクターに組み込まれてもよい（Ｓａｖｅｒｉａ−Ｃａｍｐｏ（１９８５）ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌ．ＩＩ ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｖａ．，ｐｐ．２１３−２３８）。
【０１６０】
動物および下等真核性（例えば、酵母）宿主細胞は、種々の手段によるトランスフェクションに適格であるか、または適格にされる。ＤＮＡを動物細胞に導入する、周知の方法が複数存在する。これらには以下が含まれる：リン酸カルシウム沈殿、受容細胞の、ＤＮＡを含有する細菌プロトプラストとの融合、受容細胞の、ＤＮＡを含有するリポソームでの処置、ＤＥＡＥデキストリン、エレクトロポレーション、遺伝子銃、およびＤＮＡの、細胞への直接微量注入。トランスフェクトされた細胞は、当該技術分野で周知の手段によって培養される（Ｋｕｃｈｌｅｒ（１９９７）ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄｏｗｄｅｎ，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓ，Ｉｎｃ．）。
【０１６１】
最も頻繁には、原核生物は、大腸菌の種々の株に代表されるが、他の微生物菌株がまた本発明の方法で使用されてもよい。一般的に使用される原核対照配列は、本明細書で、リボソーム結合配列と共に、任意にオペレーターを供える、転写開始のためのプロモーターを含むように定義され、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）および乳糖（ｌａｃ）プロモーターシステム（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ１９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７）、ならびにラムダ誘導Ｐ ＬプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２９２：１２８）等の一般的に使用されるプロモーターを含む。選択マーカーの、大腸菌中にトランスフェクトされたＤＮＡベクターへの組み込みもまた有用である。かかるマーカーの例としては、アンピシリン、テトラサイクリン、またはクロラムフェニコールに対する抵抗性を特定する遺伝子が挙げられる。
【０１６２】
ベクターは、適切な宿主細胞の導入を可能にするために選択される。細菌ベクターは、典型的にプラスミドまたはファージに由来する。適切な細菌細胞は、ファージベクター粒子に感染するか、またはネイキッドファージベクターＤＮＡでトランスフェクトされる。プラスミドベクターが使用される場合、細菌細胞は、プラスミドベクターＤＮＡでトランスフェクトされる。本発明のタンパク質を発現するための発現システムは、バチルス属菌およびサルモネラ（Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｇｅｎｅ２２：２２９−２３５）、Ｍｏｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３０２：５４３−５４５）を用いて入手可能である。
【０１６３】
融合タンパク質に関して、「作動可能に結合された」は、２つ以上の要素またはドメインの間の機能結合を意味することが意図される。１つ以上のアミノ酸のリンカーは、２つ以上の要素の所望の機能を維持するために、２つ以上の要素の各々の間に挿入されてもよいことが認識される。
【０１６４】
本発明の一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのタンパク質またはその部分もしくはドメインに作動可能に結合された本発明の反復ドメインを含む。本発明の特定の実施形態では、タンパク質またはその部分もしくはドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡを修飾することができるタンパク質またはその機能部分もしくはドメインを含む。他の実施形態では、タンパク質またはその機能部分もしくはドメインは、転写活性化因子または転写抑制因子として機能することができる。好ましいタンパク質には、転写活性化因子、転写抑制因子、抵抗性仲介タンパク質、ヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リゾルバーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、デメチラーゼ、およびデアセチラーゼが含まれるが、それらに限定されない。
【０１６５】
次の実施例は、例示の目的で提供され、限定を目的としない。
【実施例】
【０１６６】
実施例１：ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ特異性のための塩基の特定
ＡｖｒＢｓ３が、誘発標的遺伝子内のプロモーター要素であるＵＰＡボックスに直接に結合するという事実に促され（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８，６４８−６５１、Ｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８：６４５−６４８）、我々は、ＤＮＡ配列特異性のための塩基を調査した。各反復領域は、概して３４個のアミノ酸からなり、反復単位は、ほぼ同一であるが、アミノ酸１２および１３は、高度可変である（Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６３：２５６−２７２、図１Ａ）。ＡｖｒＢｓ３のＣ最末端の反復は、その最初の２０個のアミノ酸においてのみ他の反復単位との配列類似性を示し、したがって半反復と称される。反復単位は、それらの高度可変な第１２および第１３アミノ酸に基づいて、異なる反復タイプに分類することができる（図１Ｂ）。ＵＰＡボックス（１８（２０）／１９（２１）ｂｐ）のサイズは、ＡｖｒＢｓ３中の反復単位の数（１７．５個）にほぼ対応するため、我々は、ＡｖｒＢｓ３の１つの反復単位が、１つの特異的ＤＮＡ塩基対に接触するという可能性を考えた。ＡｖｒＢｓ３の反復タイプ（各反復のアミノ酸１２および１３）がＵＰＡボックスに投影されるとき、特定の反復タイプが、標的ＤＮＡ内の特異的塩基対と相関することが明白となる。例えば、ＨＤおよびＮＩ反復単位は、それぞれ、ＣおよびＡへの強い選好を有する（図１Ｂ）。簡潔にするために、上部（センス）ＤＮＡ鎖の塩基のみを指定する。我々の認識特異性のモデルは、４つの反復単位（Δ１１〜１４、図５Ａ、Ｂ）を欠く、ＡｖｒＢｓ３反復欠失誘導体ＡｖｒＢｓ３Δｒｅｐ１６が、より短いおよび異なる標的ＤＮＡ配列を認識するという事実によって支持される（図５〜８）。ＡｖｒＢｓ３誘発性トウガラシ遺伝子のＵＰＡボックスの配列比較、および突然変異分析に基づいて、ＡｖｒＢｓ３の標的ＤＮＡボックスは、ＡｖｒＢｓ３の反復単位の数よりも１ｂｐ長いようである。加えて、Ｔは、第１反復の予測認識特異性の直前に、ＵＰＡボックスの５’末端で保存される（図１）。興味深いことに、アミノ酸配列保存の欠如にもかかわらず、第１反復および反復領域に先行するタンパク質領域の二次構造予測は、類似性を示す。これは、反復０と名付けられる、さらなる反復を示唆する（図１Ｂ）。
【０１６７】
我々のモデル（図１Ｂ）をさらに立証および拡大するために、それらの反復単位の配列に基づいて、キサントモナスＴＡＬエフェクターの未知の標的ＤＮＡ配列を予測し、また推定結合部位の存在について、既知のＴＡＬ標的遺伝子のプロモーターおよびそれらの対立遺伝子を検査した。我々は、対応するＴＡＬエフェクターに応答して誘発される、対立遺伝子のプロモーター内の予測された特異性にマッチする配列を特定したが、非誘発性対立遺伝子内ではそれを特定しなかった（図５Ｃ〜Ｆ）。これらのボックスの存在は、誘発遺伝子が、対応するＴＡＬエフェクターの直接標的であることを示唆する。標的ＤＮＡ配列内の異なる反復タイプについてのＤＮＡ塩基の頻度に基づいて、８つのＴＡＬエフェクターを用いて、特定の反復タイプのＤＮＡ標的特異性のためのコードを推定した（図１Ｃ、Ｄ、図５）。
【０１６８】
我々のモデルを実験的に検証するために、アブラナ科病原体Ｘ．カンペストリス・パソバーアルモラシア（２２）からのＴＡＬエフェクターＨａｘ２（２１．５個の反復単位）、Ｈａｘ３（１１．５個の反復単位）、およびＨａｘ４（１４．５個の反復単位）についての標的ＤＮＡ配列を予測した。Ｈａｘ３およびＨａｘ４は、ＤＮＡ結合および遺伝子活性化が実験的に示されているＡｖｒＢｓ３に存在する反復タイプを排他的に含有するため、第１に、Ｈａｘ３およびＨａｘ４についての標的ＤＮＡボックスを誘導した（アミノ酸１２／１３：ＮＩ、ＨＤ、ＮＧ、ＮＳ、図１Ａ、図２Ａ）。Ｈａｘ３およびＨａｘ４標的ボックスを、非常に弱い基礎活性を有する、ミニ（−５５〜＋２５）トマトＢｓ４プロモーターの前に配置し（Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−ＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔ．１８：１２１５−１２２５、図２Ｂ、図９）、プロモーターレスｕｉｄＡ（β−グルクロニダーゼ、ＧＵＳ）レポーター遺伝子を誘導した。一過性発現研究のために、レポーター構築物を、アグロバクテリウム仲介型Ｔ−ＤＮＡ送達を用いて、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−プロモーター誘導性エフェクター遺伝子ｈａｘ３およびｈａｘ４と共に、ニコチアナ・ベンサミアナ葉にトランスフェクトした。定性および定量ＧＵＳ検定により、Ｈａｘ３ボックスまたはＨａｘ４ボックスを含有するプロモーターが、対応するエフェクターの存在時に、強力におよび特異的に誘発されることが示された（図２Ｃ）。同様に、Ｈａｘ３の予測標的ＤＮＡ配列内の第１のヌクレオチド（Ｔ）の重要性に対処し、５’末端にＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかを備える４つの異なるＨａｘ３ボックスを生成した（図１０Ａ、Ｂ）。Ｎ．ベンサミアナにおけるｈａｘ３とレポーター構築物との共発現は、５’Ｔを備えるＨａｘ３ボックスを含有するプロモーターのみが、Ｈａｘ３の存在時に強力に誘発される一方で、他がより弱い活性化をもたらすことが示された（図１０Ｃ）。これは、０位がＨａｘ３および同様の他のＴＡＬエフェクターのプロモーター活性化特異性に寄与することを示す。幾つかの反復タイプがより広範な特異性を付与する、すなわち、１つを超える塩基を認識する可能性に対処するために、Ｈａｘ４ボックスを置換した（図３Ａ、Ｂ）。一過性ＧＵＳ検定により、Ｈａｘ４中のＮＩ反復単位、ＨＤ反復単位、およびＮＧ反復単位が、それぞれ、塩基Ａ、Ｃ、およびＴの認識を強力に選好する一方で、ＮＳ反復単位が、４つの塩基全てを認識することが示された（図３Ｂ、図１１）。複数のＴＡＬエフェクターが、ＮＮ反復単位を含有するため（図５および図１５、表１）、ＮＮ反復単位を備える人工ＴＡＬエフェクターである、ＡｒｔＸ１を生成し、我々のコードを用いて、対応するＤＮＡ認識配列を推定した（図３Ｃ）。ＡｒｔＸ１ボックス誘導体の分析により、ＮＮ反復単位が、ＡおよびＧの両方を認識し、中でもＧを選好することが示された（図３Ｃ）。この結果は、ＮＮ反復単位に相当する位置でＡまたはＧのいずれかを含有するイネにおける、天然ＡｖｒＸａ２７ボックスの我々の予測を裏付ける（図５Ｃ）。加えて、ＡｖｒＸａ１０のＮＮ反復単位に相当する位置でＡまたはＧのいずれかを備える、２つの潜在的なＡｖｒＸａ１０ボックスを誘導した。双方のレポーター構築物は、ＡｖｒＸａ１０によって効率的に誘発された（図１２）。まとめると、これらのデータは、幾つかの反復タイプが、特異的塩基対を認識する一方で、他がより柔軟であることを強力に示唆する。
【０１６９】
Ｈａｘ２は、典型的な３４個のアミノ酸の反復単位の代わりに、１反復当たり３５個のアミノ酸を含有するため、例外的ＴＡＬエフェクターである（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−ＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔ．１８：８３８−８４８）。加えて、Ｈａｘ２は、その第２反復内で希有なアミノ酸の組み合わせを含有する（アミノ酸１２／１３：ＩＧ、図２Ａ）。Ｈａｘ２ボックスの対応する第３塩基を置換し、一過性検定を用いて、エフェクターＨａｘ２を備えるレポーター遺伝子活性化を分析した。これにより、ＩＧ反復が、Ｔに対する特異性を付与することが示された（図１３）。Ｈａｘ２ボックスは、Ｈａｘ２によるプロモーター活性化をもたらすのみであるが、Ｈａｘ３またはＨａｘ４によるプロモーター活性化をもたらさない（図２Ｃ）。これは、３５個のアミノ酸の反復単位が、３４個のアミノ酸の反復単位と同様に機能することを示す。これは、３５個のアミノ酸反復単位を含有するＴＡＬエフェクターＡｖｒＨａｈ１が、Ｂｓ３仲介型抵抗性を誘発するという事実によって支持される（Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌ．１７９：５４６−５５６）。ＡｖｒＨａｈ１の反復タイプは、Ｂｓ３プロモーター内のＵＰＡボックスとマッチする（図５Ａ、Ｂ）。
【０１７０】
興味深いことに、アラビドプシス・タリアナにおけるｈａｘ２の発現は、紫色の葉をもたらし、それはアントシアニンの蓄積を示す（図１４Ａ、Ｂ）。Ｈａｘ２標的遺伝子を特定するために、縮重Ｈａｘ２ボックス配列でのパターン検索（Ｐａｔｍａｔｃｈ，ＴＡＩＲ；ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）を用いて、Ａ．タリアナゲノムのプロモーター領域を分析した。推定Ｈａｘ２標的遺伝子の１つは、アントシアニン生合成を制御するＭＹＢ転写因子ＰＡＰ１（Ａｔ１Ｇ５６６５０）をコードする（Ｂｏｒｅｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌl１２：２３８３−２３９４）。ＰＡＰ１転写物レベルの半定量的分析により、ＰＡＰ１の発現が、Ｈａｘ２によって強力に誘発されることが示された（図１４Ｃ）。ＰＡＰ１プロモーター領域の目視検査により、最適以下のＨａｘ２ボックスの存在が示された（図１４Ｄ、Ｅ）。ＴＡＬエフェクター反復タイプのためのコード（図１Ｄ）および上述のデータに基づいて、その幾つかは重要な病原性因子であるさらなるＴＡＬエフェクターのための推定標的ＤＮＡ配列を予測した（図１５、表１）。
【０１７１】
ＴＡＬエフェクター内の反復数は、１．５〜２８．５個の範囲に及ぶため、少ない反復単位を備えるエフェクターが遺伝子発現を活性化し得るかどうかは、主要な議題である。したがって、反復単位の数が、標的遺伝子発現にどのように影響を及ぼすかを試験した。このために、Ｈａｘ３のＮ末端領域およびＣ末端領域ならびに０．５〜１５．５個のＨＤ反復単位を備える反復ドメインを含有する人工エフェクターを構築した（Ｃに対する特異性）。技術的理由により、全てのケースで第１反復は、ＮＩであった（Ａに対する特異性）。対応する標的ＤＮＡボックスは、ＴＡに続く１７個のＣ残基からなる（図４Ａ、Ｂ）。一過性Ｂｓ４−プロモーターＧＵＳ検定を用いて、Ｎ．ベンサミアナにおける人工エフェクターによるプロモーター活性化を測定した。遺伝子誘発のために少なくとも６．５個の反復単位が必要とされた一方で、１０．５個以上の反復単位が、強力なレポーター遺伝子活性化をもたらした（図４Ｃ）。これらのデータは、反復単位の最小数が、人工標的ＤＮＡボックスを認識し、遺伝子発現を活性化させる必要があることを示す。この結果はまた、より少ない反復数を備えるエフェクターが、主に非活性であることを示唆する。ＴＡＬエフェクターの反復領域が、連続した標的ＤＮＡ配列に対応する連続的性質を有することが示されている。したがって、新規ＤＮＡ結合特異性を備えるエフェクターを生成することは、実行可能であるはずである。各々無作為に組み立てられた１２．５個の反復単位（図３Ｃ、Ｄ）を備える、３つの人工エフェクターを生成し（ＡｒｔＸ１、ＡｒｔＸ２、ＡｒｔＸ３）、予測標的ＤＮＡ配列を含有するＢｓ４プロモーター−レポーター融合の誘発について試験した。３つの人工エフェクター全ては、対応する標的ＤＮＡボックスの存在時に、ＧＵＳレポーターのみを強力におよび特異的に誘発した（図３Ｅ、図１１）。１つの反復単位が、各反復のアミノ酸１２および１３を介してＤＮＡ内の１つの塩基対に接触するという、ＴＡＬエフェクターの認識特異性についての我々のモデルは、ＴＡＬエフェクターの結合特異性およびの植物標的遺伝子の特定を予測することを可能にする。多くのＴＡＬエフェクターは、主な病原性因子であるため、植物標的遺伝子の知識は、キサントモナズ（ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄｓ）によって引き起こされる植物疾患発生の我々の理解を大幅に高めるであろう。加えて、我々は、特異的ＤＮＡ結合ドメインを備える転写因子として作用する、人工エフェクターの設計に成功した。従来、亜鉛フィンガー単位の縦列配列を含有する亜鉛フィンガー転写因子は、特異的標的ＤＮＡ配列に結合するように操作されている。
【０１７２】
同様に、ＴＡＬエフェクターは、容易に再配列することができる線形ＤＮＡ結合特異性を有する。ＴＡＬエフェクター内の反復領域の仮定右手型高次へリックス構造が、遺伝物質の右手型ヘリックスとの相互作用に対する潜在的機構を直接に示唆することは、我々の注意を免れなかった。標的ＤＮＡと複合体を形成するＴＡＬエフェクターの、新規ＤＮＡ結合ドメインの構造を決定することは重要であろう。
【０１７３】
次の段落は、本発明のさらなる実施形態を説明する。
【０１７４】
１）天然産ＡｖｒＢｓ３相同タンパク質のＤＮＡ結合特異性の予測および抵抗性植物の生成。
ＡｖｒＢｓ３ファミリーの天然産エフェクターの反復ドメインの反復単位は、対応するＤＮＡ結合特異性をコードする。これらの認識配列は、認識コードで予測することができる。
【０１７５】
予測認識配列の、トランスジェニック植物における遺伝子の前の人工挿入は、対応するＡｖｒＢｓ３様エフェクターが植物細胞に転座される場合（例えば、細菌感染の間に）、遺伝子の発現をもたらす。
【０１７６】
認識配列が、その発現が植物の防御反応（抵抗性仲介遺伝子）をもたらす遺伝子の前に挿入される場合、かかる構築されたトランスジェニック植物は、対応するエフェクターを転座させる植物病原体細菌の感染に対して抵抗性である。
【０１７７】
２）その発現がＡｖｒＢｓ３−ファミリーの特異的エフェクターによって誘発される植物遺伝子の特定
植物遺伝子のプロモーター領域内のＡｖｒＢｓ３ファミリーの、対応するエフェクターのＤＮＡ標的配列の予測は、エフェクターによるこれらの遺伝子の誘発性発現のための指標である。本発明に従う方法を用いて、誘発性植物遺伝子を予測することが可能である。予測は、特に、配列されたゲノム内で明快である。
【０１７８】
３）発現システムにおける転写活性化因子としての、他のエフェクターの使用
Ｈａｘ３およびＨａｘ４の使用に類似して、ＡｖｒＢｓ３ファミリーの他のメンバーの予測ＤＮＡ結合配列は、対応するＡｖｒＢｓ３エフェクターによって誘導することができる新規制御可能なプロモーターを生成するために、プロモーターに挿入することができる。
【０１７９】
４）二次的な誘発性システムの構築
２つの構築物を植物に導入する。第１に、その発現が誘発性プロモーターの制御下にあるｈａｘ３遺伝子である。第２に、プロモーター内にＨａｘ３ボックスを含有する標的遺伝子である。ｈａｘ３の発現の誘発は、次いで標的遺伝子の発現を誘発するＨａｘ３タンパク質の産生をもたらす。説明される２成分性構築物は、標的遺伝子の可変の発現を可能にする、２倍の発現スイッチをもたらす。トランス活性化因子および標的遺伝子もまた、最初に異なる植物株に存在してもよく、自由に遺伝子移入されてもよい。これに類似して、Ｈａｘ４および対応するＨａｘ４ボックスを使用することができる。このシステムはまた、ＡｖｒＢｓ３ファミリーの他のメンバーまたは人工誘導体および予測ＤＮＡ標的配列と共に使用することもできる。このシステムの機能は、すでに検証することができた。その天然プロモーターの制御下で誘発性ａｖｒＢｓ３遺伝子ならびにＢｓ３遺伝子を含有し、その発現がＡｖｒＢｓ３によって誘発され得る、トランスジェニックアラビドプシス・タリアナ植物を構築した。ａｖｒＢｓ３の発現の誘発は、Ｂｓ３の発現、したがって細胞死をもたらす。国際公開第２００９／０４２７５３号を参照されたく、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８０】
５）疾患抵抗性植物の構築
ＡｖｒＢｓ３類似エフェクターのＤＮＡ標的配列が、その発現が植物の防御反応（抵抗性仲介遺伝子）をもたらす遺伝子の前に挿入される場合、対応するように構築されたトランスジェニック植物は、植物病原体生物の感染に対して抵抗性となり、このエフェクターを有効にするであろう。かかる抵抗性仲介遺伝子は、例えば、生物／病原体の分散を防止する局在細胞死をもたらすことができるか、または植物細胞の基礎抵抗性もしくは全身抵抗性を誘発することができる。
【０１８１】
６）特異的ＤＮＡ配列の検出のための反復ドメインの生成、およびそれに続く遺伝子の転写の誘発
中央反復ドメインのモジュラー構造は、明確なＤＮＡ結合特異性の標的構築、およびこれと共に、選択された植物遺伝子の転写の誘発を可能にする。ＤＮＡ結合特異性は、新規エフェクター−ＤＮＡボックス変異体が標的遺伝子の発現の誘発性のために生成されるように、標的遺伝子の前に人工的に挿入することができる。さらに、生物中の天然産ＤＮＡ配列を認識する反復ドメインを構築することができる。このアプローチの利点は、本発明の対応するエフェクターが、この生物の細胞中に存在する場合、非トランスジェニック生物中の任意の遺伝子の発現が、誘発され得るということである。
【０１８２】
エフェクターの導入は、異なる方法で行うことができる：
（１）タンパク質輸送システムで細菌を介して転移する（例えば、ＩＩＩ型分泌系）；
（２）人工ＡｖｒＢｓ３タンパク質での細胞衝撃；
（３）遺伝子移入、アグロバクテリウム、ウイルスベクター、もしくは細胞衝撃を介する、エフェクターの産生をもたらすＤＮＡセグメントの転移；または
（４）標的細胞によってエフェクタータンパク質の取り込みをもたらす他の方法。
【０１８３】
ＡｖｒＢｓ３ファミリーのエフェクターの中央反復ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインの新規タイプである（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，２００７）。単一の反復単位の特異性の解読は、現在、この領域のＤＮＡ結合特異性の標的適合を可能にしている。ＤＮＡ結合領域は、配列特異的効果を生成するために、他の機能ドメインと翻訳的に融合することができる。かかるタンパク質融合の４つの例を下に提供する。
【０１８４】
７）生存生物の細胞中の遺伝子の誘発性発現のための転写活性化因子の構築
ＡｖｒＢｓ３様ファミリーのエフェクターは、植物細胞中の遺伝子の発現を誘発する。このために、タンパク質のＣ末端は、必須であり、それはタンパク質の植物核への移入を仲介する、転写活性化ドメインおよび核局在配列を含有する。ＡｖｒＢｓ３相同タンパク質のＣ末端は、それが真菌、動物、またはヒト系における遺伝子の発現を仲介するような方法で、修飾することができる。それによって、ヒト、他の動物、または真菌において転写活性化因子として機能するエフェクターを構築することができる。したがって、本発明に従う方法は、植物だけでなく、他の生存生物にも適用することができる。
【０１８５】
８）転写抑制因子としてのエフェクターの使用
反復ドメインのＤＮＡ結合特異性は、特異的抑制因子として作用するエフェクターを構築するために、タンパク質融合体内の他のドメイン共に使用することができる。これらのエフェクターは、それらが標的遺伝子のプロモーターに結合するような方法で生成されている、ＤＮＡ結合特異性を示す。転写活性化因子であるＴＡＬエフェクターと対照的に、これらのエフェクターは、標的遺伝子の発現をブロックするために構築される。典型的抑制因子と同様に、これらのエフェクターは、それらの標的ＤＮＡ配列の認識またはそこへの結合によってプロモーター配列をカバーし、さもなければ標的遺伝子の発現を制御する因子に対して、それらをアクセス不可能にすることが予測される。代替的に、または加えて、反復ドメインは、ＥＡＲモチーフ等の転写抑制ドメインに融合することができる（Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１３：１９５９−１９６８（２００１））。
【０１８６】
９）特異的配列の標識化および単離のための反復ドメインの使用
反復ドメインの、特異的標的ＤＮＡ配列を認識する能力は、特異的ＤＮＡ配列を標識化するために、他のドメインと共に使用することができる。Ｃ末端側ＧＦＰ（「緑色蛍光タンパク質」）は、例えば、所望のＤＮＡ配列を検出する人工反復ドメインに融合することができる。この融合タンパク質は、インビボおよびインビトロで、対応するＤＮＡ配列に結合する。この配列の染色体上の位置を、融合ＧＦＰタンパク質を用いて局在化することができる。類似した方法では、タンパク質の細胞局在（例えば、ＦＩＳＨによって）を可能にする他のタンパク質ドメインを、細胞のゲノム内の対応するＤＮＡ配列に対するタンパク質を標的とする、特異的人工反復ドメインに融合することができる。加えて、本発明の反復ドメインのＤＮＡ認識特異性は、特異的ＤＮＡ配列を単離するために使用することができる。このために、ＡｖｒＢｓ３様タンパク質をマトリックスに固定化することができ、マッチング配列を含有する対応するＤＮＡ分子と相互作用する。したがって、特異的ＤＮＡ配列を、ＤＮＡ分子の混合物から単離することができる。
【０１８７】
１０）ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ切断のための反復ドメインの使用
反復ドメインのＤＮＡ認識特異性は、ＤＮＡを特異的に切断するために、好適な制限エンドヌクレアーゼと融合することができる。したがって、反復ドメインの列特異的結合は、エンドヌクレアーゼが、所望の位置でＤＮＡを特異的に切断するように、少数の特異的配列に対する融合タンパク質の局在をもたらす。亜鉛フィンガーヌクレアーゼを用いて行われた作業に類似して、標的ＤＮＡ配列の認識を用いて、ＦｏｋＩ等の非特異的ヌクレアーゼを、特異的エンドヌクレアーゼに変化させることができる。例えば、２つのエフェクターＤＮＡ標的部位の間の最適距離は、２つのＦｏｋＩドメインの二量体化を支持するのに必要であろう距離に決定されるであろう。これは、２つのＤＮＡ結合部位が、異なるサイズのスペーサー配列によって分離される構築物の収集を分析することによって達成されるであろう。このアプローチを用いることにより、ヌクレアーゼ仲介型ＤＮＡ切断が生じることを可能にする距離、および異なるＤＮＡ配列を標的とするさらなるエフェクターヌクレアーゼの機能分析を決定することが可能となる。代替的アプローチでは、新規に開発された１本鎖ＦｏｋＩダイマー（Ｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１４０：１５６−１６１）が採用される。このアプローチでは、２つのＦｏｋＩ触媒ドメインは、本発明の単反復ドメインに転写的に融合される。したがって、対応するヌクレアーゼの機能性は、２つの異なるタンパク質上に位置する、２つのＦｏｋＩドメインの分子内二量体化にもはや依存しない。このタイプの構築は、亜鉛フィンガーベースのＤＮＡ結合モチーフの背景において首尾よく使用されている。さらに、これらの方法は、複合ＤＮＡ−分子内の少数の位置のみでの非常に特異的な切断を可能にする。これらの方法は、とりわけ、インビボで２本鎖切断を導入するために、およびこれらの位置でドナーＤＮＡを選択的に組み込むために使用することができる。これらの方法はまた、トランス遺伝子を特異的に挿入するためにも使用することができる。
【０１８８】
１１）カスタム設計された反復順序を備える反復ドメインの構築
反復ドメインの個々の反復単位の間の高い類似性に起因して、上述のカスタムＤＮＡ結合ポリペプチドの構築は、従来のクローン化方法を用いる方法を通じては実行できない可能性がある。この実施例に詳述される通り、Ｂｓ４プロモーター（図１７Ｂ、Ｃ）等の、目的のプロモーター内の所望のＤＮＡ配列にマッチする反復単位順序を備える反復ドメインは、本発明の認識コードに基づいて決定される。「ゴールデンゲート」クローン化を用いて、特異的１１．５個の反復単位順序の生成を達成した（Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＰＬｏＳ ＯＮＥ３：ｅ３６４７）。形成ブロックとして、Ｈａｘ３のＮ末端およびＣ末端、ならびに１１．５個の反復単位に類似した１２個の個々の反復単位をサブクローン化した。各形成ブロックは、フラグメントの、カスタムエフェクターポリペプチドへの秩序組立てを可能にする、個々の隣接ＢｓａＩ部位（図１８）を含有した。エフェクター（ＡＲＴＢｓ４）を、合計１４個のフラグメントから、カスタムエフェクターポリペプチドの、植物細胞中のＮ末端側標識ＧＦＰ融合（図１８）としてのアグロバクテリウム仲介型の発現を可能にするＢｓａＩ適合性バイナリーベクターへと正確に組み立てた。
【０１８９】
１２）ウイルス抑制因子としてのエフェクターの使用
反復ドメインのヌクレオチド結合特異性は、細胞中のウイルス複製を妨害するエフェクターを設計するために使用することができる。これらのエフェクターは、ウイルスの複製起点におけるヌクレオチド配列およびウイルス機能に重要な他の配列に対して標的化された、ヌクレオチド結合特異性を示すであろう。ウイルス機能をブロックするために、さらなるタンパク質ドメインがこれらの反復ドメインに融合される必要はない。それらは、プロモーター、エンハンサー、長末端反復単位、および内部リボソーム進入部位を含む、複製の起点または他の主要な配列を、それらに結合し、かつウイルスによりコードされたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオキャプシドタンパク質、およびインテグラーゼを含む、ウイルス複製およびウイルス機能に関与する、宿主もしくはウイルス因子に対してそれらをアクセス不可能にすることによりカバーすることによって、典型的抑制因子と同様に作用する、このタイプの戦略は、亜鉛フィンガータンパク質で首尾よく使用されている（Ｓｅｒａ（２００５）Ｊ．Ｖｉｒ．７９：２６１４−２６１９、Ｔａｋｅｎａｋａ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＮｕｃｌＡｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５１：４２９−４３０）。
【０１９０】
約すると、本発明は、本発明の方法のいずれかで使用されるであろう単離された核酸分子、ならびにそれらのゲノムに安定的に組み込まれた非相同ポリヌクレオチドおよび上述のヌクレオチド分子を含む形質転換植物をさらに含み、それらは好ましくはプロモーター要素に作動可能に結合され、かつ／または目的の遺伝子に作動可能に結合される。形質転換植物は、好ましくは単子葉類または双子葉類である。本発明はまた、形質転換植物の種子を含む。本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のポリペプチドのいずれかで形質転換されたヒトおよび非ヒト宿主細胞を含む。本発明のヌクレオチドおよびポリペプチドのいずれかと組み合わせて使用されるプロモーターは、好ましくは組織特異的プロモーター、化学誘発性プロモーター、および病原体誘発性プロモーターである。
【０１９１】
本発明を、動物および植物システムにおいて使用することができる一方で、１つの好ましい任意の実施形態は、植物中のシステムにおける使用に言及する。植物という用語は、植物細胞、植物プロトプラスト、植物をそこから再生することができる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物群落、および植物中または胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、根、根端、葯等の植物部分中で無処置の植物細胞を含む。これらの部分が、導入されたポリヌクレオチドを含むという条件で、再生植物の子孫、変異体、および突然変異体もまた、本発明の範囲内である。
【０１９２】
物質および方法
細菌株および増殖条件。エスケリキア・コリを溶原培養液（ＬＢ）中で３７℃で、アグロバクテリウムツメファシエンスＧＶ３１０１を酵母エキス培養液（ＹＥＢ）中で３０℃で培養し、適切な抗生物質を補充した。
【０１９３】
植物物質および植菌。ニコチアナベンサミアナ植物を、１６時間の光および４０〜６０％の湿度を保ちながら、グリーンハウスで栽培した（日中および夜間温度は、それぞれ２３℃および１９℃）。５〜７週間目の植物の成熟葉を、前述の通り、無針注射器を用いてアグロバクテリウムで植菌した（Ｓ１）。植菌された植物を、１６時間の光、２２℃および１８℃の夜間温度を保ちながら、グロースチャンバ（ＰｅｒｃｉｖａｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。
【０１９４】
人工エフェクターの構築。修飾された反復領域を備えるエフェクターの構築は、Ｅｓｐ３Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）制限フラグメントの連結に基づいた。Ｅｓｐ３Ｉは、その認識配列の外側を切断し、典型的に１反復当たり１回である。本発明のエフェクターの生成のためのＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）適合性ＥＮＴＲＹベクターを構築するために、ｈａｘ３のＮ末端およびＣ末端を、校正ポリメラーゼ（ＨｏｔＳｔａｒ ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＫｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲによって増幅し、ＳＯＥ（重複伸長によるスプライシング）−ＰＣＲによって組み合わせ、ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯに挿入し、１．５個の反復単位を備えるｈａｘ３誘導体を得た（ｐＣ３ＳＥ２６、第１反復＝ＮＩ、最後の半反復＝ＮＧ）。開始コドンに先行する１ｂｐフレームシフトを、ＧＡＴＥＷＡＹ組み換え（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、フレーム内Ｎ末端融合を可能にするために部位特異的突然変異によって挿入し、ｐＣ３ＳＥＩＦを得た。単一の反復単位を、ほとんどの反復単位および反復特異的逆方向プライマーへの順方向プライマー結合を用いて、ＴＡＬエフェクターから増幅した。双方のプライマーは、天然に存在するＥｓｐ３Ｉ部位を含んだ。１つを超える反復の増幅を回避するために、テンプレートＤＮＡを、ＰＣＲ反応前にＥｓｐ３Ｉで分解した。ＰＣＲ産物を、Ｅｓｐ３Ｉで分解し、Ｅｓｐ３Ｉ分解ｐＣ３ＳＥ２６へとクローン化し、単一の反復がＥｓｐ３Ｉで切除され得る２．５個の反復単位を備えるＨａｘ３誘導体を得た（ＨＤ反復＝Ｈａｘ３の反復５、ＮＩ反復＝Ｈａｘ３の反復１１、ＮＧ反復＝Ｈａｘ４の反復４、ＮＮ反復＝Ｈａｘ４の反復４のＧ_１３Ｎ突然変異体）。ＡｒｔＨＤエフェクター骨格構築物は、最後の半反復がＨＤ反復に突然変異した、Ｈａｘ３のＮ末端およびＣ末端らなる。得られた構築物を、Ｅｓｐ３Ｉによって制限し、脱リン酸化した。反復単位をコードするＤＮＡフラグメントを、単一のＨＤ反復を含有するｐＣ３ＳＥ２６誘導体から、Ｅｓｐ３Ｉで切除し、アガロースゲルを介して精製した。コンカテマー連結を促進するために、ベクターへのモル過剰の挿入を用いて、連結を行い、大腸菌へ形質転換した。反復単位の数を、ＳｔｕＩおよびＨｉｎｃＩＩを用いて、組み換えプラスミド中で決定した。上述の反復単位をコードするＤＮＡフラグメントを、クローン化された単一のＮＩ、ＨＤ、ＮＮ、およびＮＧ反復単位（それぞれ、Ａ、Ｃ、Ｇ／Ａ、およびＴに対する特異性）から単離することによって、反復タイプの無作為の組み合わせを備えるＡｒｔＸ１−３エフェクターを生成した。フラグメントを、ベクターｐＣ３ＳＥＩＦを備えるコンカテマー連結反応物に、各々等しいモル濃度で付加した。１２．５個の反復単位を備える本発明のエフェクターを含有するプラスミドを、後に続く分析のために選択した。Ｎ末端ＧＦＰエフェクター融合の発現のために、エフェクターを、ＧＡＴＥＷＡＹ組み換え（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｐＧＷＢ６（Ｓ２）へとクローン化した。オリゴヌクレオチド配列は、要望に応じて入手可能である。全ての構築物を配列した。
【０１９５】
ＧＵＳレポーター構築物。ミニマルＢｓ４プロモーターをＰＣＲによって増幅し、５’末端（Ｓ３、図Ｓ５）に標的ＤＮＡボックスを備えるｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。プロモーター誘導体を、プロモーターレスｕｉｄＡ遺伝子を含有するｐＧＷＢ３（Ｓ２）へとクローン化した。
【０１９６】
ｈａｘ２トランスジェニックＡ．タリアナの構築。ｈａｘ２を、誘発性ａｌｃＡプロモーターの制御下で、アスペルギルス・ニデュランスから、３５Ｓ主導型ａｌｃＲエタノール依存性調節因子遺伝子およびｎｐｔＩＩ選択マーカーを含有する、バイナリーＴ−ＤＮＡベクターｂｉｎＳＲＮＡＣａｔＮ（Ｚｅｎｅｃａ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のＧＡＴＥＷＡＹ適合性誘導体へとクローン化した。ＡｌｃＲは、ａｌｃＡプロモーターのエタノール依存性誘発を誘導する（Ｓ４）。これらの遺伝子を含有するＴ−ＤＮＡを、フローラルディップ植菌を用いて、Ａ．ツメファシエンスを介して、Ａ．タリアナＣｏｌ−０に形質転換した（Ｓ５）。形質転換体を、滅菌培地上のカナマイシン抵抗性植物として選択した。
【０１９７】
人工エフェクター、ＡＲＴＢｓ４の構築。１１．５個の特異的秩序の反復単位を備えるエフェクターを組み立てるために、「ゴールデンゲート」クローン化（Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＰＬｏＳ ＯＮＥ３：ｅ３６４７）を使用した。Ｈａｘ３のＮ末端およびＣ末端、ならびに１１．５個の反復単位に類似した１２個の個々の反復単位をサブクローン化した。各形成ブロックは、フラグメントの、人工エフェクターへの秩序組立てを可能にする、個々の隣接ＢｓａＩ部位を含有した。任意の所望の反復組成物を備えるエフェクターの標的組立てのために、反復単位の形成ブロックレパートリーを伸長した。ＤＮＡ内の４つの天然塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ）のいずれかに対する標的特異性を可能にするために、１反復単位当たりアミノ酸１２および１３に基づいて、４つの異なる反復タイプを選択した。４つの反復タイプおよびそれらの特異性は以下の通りである：ＮＩ＝Ａ、ＨＤ＝Ｃ、ＮＧ＝Ｔ、ＮＮ＝ＧまたはＡ。普遍的に適用可能な組立てキットを生成するために、４つの反復単位タイプの各々に相当する４つの単位を、１２個の反復位置の各々に対する隣接ＢｓａＩ部位を用いてクローン化した。合計４８個の形成ブロックは、４つの反復単位タイプの任意の組成で、１１．５個の反復単位を備えるエフェクターを組み立てるために使用することができるライブラリに類似する。
【０１９８】
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）検定。一過性ＧＵＳ検定のために、エフェクター構築物およびＧＵＳレポーター構築物を送達するアグロバクテリウム株を、１：１で混合し、０．８のＯＤ_６００でニコチアナベンサミアナ葉に植菌した。前述の通り、２つの葉片（直径０．９ｃｍ）を、浸透２日後に試料採取し（ｄｐｉ）、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）を用いて、定量ＧＵＳ活性を決定した（Ｓ１）。Ｂｒａｄｆｏｒｄ検定（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、タンパク質を定量化した。データは、異なる植物からの３回分の試料に相当する。定性ＧＵＳ検定のために、葉片を２ｄｐｉで試料採取し、Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド）染色溶液（Ｓ３）中でインキュベートし、エタノール中で脱染し、乾燥させた。実験を少なくとも２回行い、類似した結果となった。
【０１９９】
ｈａｘ２、ｈａｘ３、およびｈａｘ４の発現。ｈａｘ２、ｈａｘ３、およびｈａｘ４を、ｐＡＧＨ２、ｐＡＧＨ３、およびｐＡＧＨ４を用いて、構成的カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下で、植物中で発現させた（Ｓ６）。
【０２００】
ＤＮａｓｅＩフットプリント。記載される通り（Ｓ７）、次の修飾を用いてＤＮａｓｅＩフットプリントを行った：テンプレートおよびＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）として、それぞれ、プラスミドｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ：：ＦＰＢｓ３（−２１１〜＋１０８のＢｓ３プロモーターフラグメント）およびｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ：：ＦＰＢｓ３−Ｅ（−２２４〜＋１０８のＢｓ３−Ｅプロモーターフラグメント）を用いて、Ｂｓ３およびＢｓ３−ＥプロモーターＤＮＡの蛍光標識されたＰＣＲ産物を生成した。テンプレートおよびＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）として、プラスミドｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ：：ＦＰＵ２０−ｕｂｍ−ｒ１６（ｕｂｍ−ｒ１６突然変異を含有する、−２１３〜＋８６のＵＰＡ２０プロモーターフラグメント（Ｓ７）を用いて、ＵＰＡ２０−ｕｂｍ−ｒ１６プロモーターＤＮＡの蛍光標識されたＰＣＲ産物を生成した。製造業者の指示に従って、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｅｑｕｅｎａｓｅＤｙｅＰｒｉｍｅｒ ＭａｎｕａｌＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＵＳＢ）を用いて、プラスミドｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ：：ＦＰＢｓ３、ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ：：ＦＰＢｓ３−Ｅ、およびｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ：：ＦＰＵ２０−ｕｂｍ−ｒ１６を配列した。内部遺伝子ＧｅｎｅＳｃａｎ−５００ＬＩＺ ＳｉｚｅＳｔａｎｄａｒｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＤＮＡフラグメントサイズを決定するために使用した。
【０２０１】
実施例２：Ｇヌクレオチドに結合するＴＡＬ反復単位の特定
ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合ドメインは、縦列配列された３４アミノ酸反復単位からなる。反復単位のアミノ酸配列は、ＤＮＡ標的特異性を定める１２位および１３位の２つの隣接した高度可変残基（ＨＶＲ）を除いて、主に保存されている（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０９−１５１２、Ｍｏｓｃｏｕ＆Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０１）。機能分析は、Ａ（ＮＩ）、Ｃ（ＨＤ）、Ｔ（ＮＧ、ＩＧ）に優先的に結合するか、またはＧおよびＡ（ＮＮ）に同等によく結合するＨＶＲモチーフを特定した（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０９−１５１２）。バイオインフォマティクス分析により、所定のプロモーター−ＴＡＬエフェクター相互作用におけるＨＶＲが、Ｇに特異的にマッチすることが示された（Ｍｏｓｃｏｕ＆Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０１）。しかしながら、この分析は、単一の（ＨＮ＆ＮＡ）または２つの（ＮＫ）相互作用部位に基づいていた。我々の見解では、相互作用部位の数は、ＨＶＲ特異性についての信頼できる結論に達するには少なすぎる。それにもかかわらず、これらのＨＶＲは、Ｇへの特異的結合を仲介し得る好適な候補であると考えることができる。
【０２０２】
未知の特異性を備えるＨＶＲの標的特異性を明確にするために、ｓ３プロモーター内のＡｖｒＢｓ３とＵＰＡボックスとの間の、よく特徴付けられた相互作用を利用した。部位特異的突然変異を用いて、第５および第６反復単位内のＨＶＲ ＮＩをＮＫによって置換し、ＡｖｒＢｓ３−ＮＫ_５／６を得た。野生型Ｂｓ３プロモーター内の第５および第６反復のＮＩ残基は双方ともＡヌクレオチドにマッチした。部位特異的突然変異を用いて、Ｂｓ３プロモーター内の２つのＡヌクレオチドを、２つのＣ、Ｇ、およびＴヌクレオチドによって置換した。野生型Ｂｓ３プロモーターおよび３つのプロモーター突然変異体をｕｉｄＡレポーター遺伝子に融合し、ニコチアナベンサミアナ葉における野生型ＡｖｒＢｓ３またはＡｖｒＢｓ３−ＮＫ_５／６のいずれかと組み合わせて、アグロバクテリウムツメファシエンス一過性発現を介して試験した。ＧＵＳ検定により、ＡｖｒＢｓ３−ＮＫ_５／６が、「ＧＧ」Ｂｓ３プロモーター突然変異体との組み合わせにおいてのみＧＵＳレポーターを活性化させる一方で、ＡｖｒＢｓ３が、Ｂｓ３野生型プロモーター構築物との組み合わせにおいてのみそれを活性化させることが示された。
【０２０３】
我々の分析は、ＮＫがＧと特異的に対形成し、したがって、より多くの特異的反復配列を生成する選択肢、またＧリッチ標的配列を特異的に標的とする選択肢を提供することを示唆する。
【０２０４】
実施例３：ゴールデンゲートクローン化を介する、デザイナーエフェクターの生成のための方法
ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合ドメインは、縦列配列された３４アミノ酸反復単位（ＲＥＦ）からなる。反復単位のアミノ酸配列は、ＤＮＡ標的特異性を定める１２位および１３位の２つの隣接した高度可変残基（ＨＶＲ）を除いて、主に保存されている（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０９−１５１２、Ｍｏｓｃｏｕ＆Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０１）。異なるＨＶＲモチーフは、異なるレベルの特異性で、個々のＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴヌクレオチドに結合する。重要なことに、統計的分析は、縦列配列された反復単位が、隣接単位の特異性を干渉しないことを示唆する（Ｍｏｓｃｏｕ＆Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０１）。したがって、事前に特徴付けられた特異性を備える反復単位のモジュラー組立ては、所望のＤＮＡ特異性を備えるＤＮＡ−認識モジュールの生成のための効率的な方法を提供する可能性が高い。
【０２０５】
しかしながら、所望の反復ドメインをコードするＤＮＡ構築物の生成は、反復単位がほぼ同一であるという事実に起因して難易度が高い。過去に、我々は、所望のＨＶＲ組成を備える１７．５個の反復単位をコードするエフェクター遺伝子を生成するために、化学合成を使用していた。ＤＮＡレベルで反復単位の間の差異を最大化するために、遺伝的コードの縮重を利用した。ＤＮＡ配列をコードする１７．５個の反復単位のコドン最適化配列は、対応するＴＡＬエフェクター野生型遺伝子と対照的に、ＰＣＲ増幅可能であり、ＰＣＲベースの突然変異に従う。我々の知見はまた、エフェクター反復ドメインの化学合成が、概して実行可能であることも示す。しかしながら、化学合成では、所望のＨＶＲ組成を備える、多数のエフェクターの迅速でコスト効率の高い生成が可能でない。さらに、このアプローチでは、２０個以上の反復単位を備える反復ドメインの生成が可能でない可能性が最も高いであろう。
【０２０６】
近年開発された「ゴールデンゲートクローン化」は、所望の組成物の反復単位配列の生成ための代替的アプローチを提供する。この戦略は、それらの認識配列の外側を切断する、ＩＩＳ型制限酵素の使用に基づく。４ｂｐ粘着末端を作り出す、ＩＩＳ型酵素ＢｓａＩを用いて作業を行う。ＩＩＳ型酵素において、認識および切断部位は分離しているという事実に起因して、ＢｓａＩ制限によって、原則として、マルチフラグメント連結のための塩基を提供する２５６（４^４）個の異なる粘着末端を生成することができる。切断部位の適切な設計によって、ＩＩＳ型制限酵素によって切断される２つ以上のフラグメントは、原制限部位を欠く産物に連結することができる（Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＰＬｏＳ ＯＮＥ３：ｅ３６４７、Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ ＯＮＥ４：ｅ５５５３）。
【０２０７】
しかしながら実際には、この方法に対して２つの限界が存在する。幾つかの反応におけるエキソヌクレアーゼ活性に起因して、１本鎖オーバーハングＤＮＡ粘着末端は、４塩基から３塩基に減少し、事実上、適合する粘着末端の数を１６（２^４）個のみにする。第２に、連結反応の効率は、多数の挿入に伴い急激に減少するため、天然産の機能ＴＡＬエフェクターで典型的に見出されるような、１７．５個の反復単位を備えるエフェクターを作り出すことが必要となるほどである。これらの限界を回避するために、２０、３０、４０、またはそれを超える反復単位のエフェクターの効率的産生を可能にする、２段階連結プロセスを設計した。
【０２０８】
我々の「反復−配列形成キット」の基盤は、個々の反復単位（１プラスミド当たり１つの反復単位）を含有する一連の「挿入プラスミド」、一連の１０個の反復単位からなる反復ドメインを含有する「中間体ベクター」、ならびにＴＡＬエフェクターのＮ末端およびＣ末端非反復領域を含有する１つの「受容体ベクター」である。全ての反復単位は、ＢｓａＩ認識部位が挿入プラスミドにおける挿入に隣接するような方法で設計される。
【０２０９】
マルチフラグメント連結の説明を簡略化するために、本明細書では、反復単位遺伝子の異なる末端を大文字で定義し（粘着末端の配列オーバーハングの代わりに）、それらの配向（反復単位のＮ末端またはＣ末端）を角括弧内のＮまたはＣ（例えば、Ａ［Ｃ］）で示す。第１反復単位遺伝子を含有する挿入プラスミドは、ＢｓａＩ処置がＡ［Ｎ］およびＢ［Ｃ］末端を作り出すような方法で設計される。第２反復単位遺伝子は、ＢｓａＩ切断後にＢ［Ｎ］およびＣ［Ｃ］末端を有する一方で、第３反復単位遺伝子を備える挿入プラスミドのＢｓａＩ切断は、Ｃ［Ｎ］およびＤ［Ｃ］末端等をもたらす。適合する末端のみが融合され得るため、第１反復単位遺伝子のＢ［Ｃ］末端は、第２反復単位遺伝子のＢ［Ｎ］末端に特異的に融合するであろう。同様に、第２反復単位遺伝子のＣ［Ｃ］末端は、第３反復単位遺伝子のＣ［Ｎ］末端に特異的に連結し、他も同様であろう。
【０２１０】
ＢｓａＩ分解は、設計された隣接反復単位のみと適合する、４ｂｐ粘着オーバーハングを備える反復単位を放出する。ＢｓａＩ認識部位自体は、切断された挿入プラスミドベクター内に残り、放出された挿入部分は、ＢｓａＩ認識部位を有さない。反復単位は、切断−連結反応（切断および連結が同時に起こる）において、オーバーハング末端によって特定される順序で共に結合される。ＢｓａＩおよびリガーゼの同時作用に起因して、反復単位の挿入ドナーベクターへの再連結は、これがＢｓａＩ認識部位を回復させるため、回避される。対照的に、所望の連結産物は、ＢｓａＩ認識部位を欠いている。この実験的設計は、このクローン化手順を高効率にする。
【０２１１】
特異的塩基配列を認識するように設計されるエフェクターを生成するために、各反復単位位置のための４つの変異体を作製する。これらの変異体は、特異的ヌクレオチド認識特異性を備える個々の反復単位である（例えば、Ｃ塩基の認識のための１２位および１３位におけるＨＤ残基、ＡのためのＮＩ等）。各位置のための変異体を、各反復単位のために適切な粘着末端を用いて作製し、例えば、所望のＤＮＡ認識に基づいて選択し、反復単位１のために４つの潜在的な挿入プラスミドが存在するように、反復単位１のためにＡ［Ｎ］およびＢ［Ｃ］末端を作製する。異なるヌクレオチド認識特異性ならびにＢ［Ｎ］およびＣ［Ｃ］末端を備える、反復単位２のための４つの変異体が存在し、各反復位置についても同様である。
【０２１２】
連結を２段階で行う。第１段階では、１０個の反復単位を中間体ベクターに組み合わせる。異なる一連の１０個の反復単位を、中間体ベクター中に組み合わせることができる。中間体ベクター１は、反復単位１〜１０を含有し、中間体ベクター２は、反復単位１１〜２０を含有し、他も同様である。第２段階では、単独で組み立てられた１０個の反復単位を、受容体ベクターに組み合わせる。受容体ベクターはまた、最終構築物において１０、２０、３０、４０個、または他の１０の倍数の反復単位からなる完全なエフェクターが組み立てられるように、エフェクターのＮ末端およびＣ末端非反復領域を含有する。中間体ベクターは、１０個の反復単位フラグメントを導入するための挿入部分においてＢｓａＩ部位を有し、また隣接ベクター配列において隣接ＢｐｉＩ部位も有する。ＢｐｉＩは、ＢｓａＩとは異なる認識部位を備える、別のＩＩＳ型酵素である。ＢｓａＩを用いて、１０個の反復単位を最初に「中間体ベクター」に組み立て、ＢｐｉＩを用いて、組み立てられた１０ｍｅｒｓを１つのフラグメントとして放出する。このフラグメントを、ＴＡＬエフェクターのＮ末端およびＣ末端非反復領域の間でＢｐｉＩ部位を含有する受容体ベクターとの、ＢｐｉＩ切断−リガーゼ反応において連結する。この場合、２〜４つの挿入のみを受容体ベクターへと連結する。これは、各連結を高特異的にし、４０個以上の反復単位を容易に組み立てることを可能にする。
【０２１３】
反復単位配列がその中で最終的にクローン化される受容体ベクターは、ＧＡＴＥＷＡＹＥｎｔｒｙクローンを代表し、したがってエフェクターの、任意の所望の発現構築物への組み換えベースの転移を可能にする。現在、受容体ベクターは、ＴＡＬ−タイプ転写因子を生成するように設計される。しかしながら、わずかな修飾により、受容体ベクターは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼまたは他の所望の機能ドメインへの、反復配列の融合も可能にする。
【０２１４】
この方法の概略図を、図１９Ａ〜Ｄに提供する。
【０２１５】
実施例４：標的ＤＮＡ−特異的ヌクレアーゼの産生および試験
標的ＤＮＡ配列およびＦｏｋＩヌクレアーゼ（「ＴＡＬ−ｔｙｐｅ−ヌクレアーゼ」）を認識する、本発明の反復ドメインを含む融合タンパク質を、本明細書に開示される方法または当該技術分野で既知の方法のいずれかによって説明される通りに産生する。対応する標的ＤＮＡでのインキュベーションによって、融合タンパク質を、ヌクレアーゼ活性について試験する。反復ドメインＤＮＡ標的部位を、プラスミドベクターの多重クローン化部位へとクローン化する（例えば、ブルースクリプト）。陰性対照として、ＴＡＬヌクレアーゼ標的部位を含有しない「空のベクター」または突然変異でクローン化された標的部位のいずれかを使用する。ＤＮＡ基質のＴＡＬタイプヌクレアーゼでの処置の前に、ベクターを、ベクター骨格内で切断する好適な標準エンドヌクレアーゼでの処置によって直線化する。この直線化されたベクターを、インビトロで生成された反復ドメイン−ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合タンパク質でインキュベートし、産物をアガロースゲル電気泳動によって分析する。ゲル電気泳動における２つのＤＮＡフラグメントの検出は、特異的ヌクレアーゼ仲介型切断のための指標である。対照的に、反復ドメインによって認識される標的部位を含有しない陰性対照は、反復ドメイン−ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合タンパク質での処置による影響を受けない。反復ドメイン−ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合タンパク質を生成するために、インビトロ遺伝子発現およびタンパク質合成のための、ＤＮＡ主導型、無細胞システムを使用する（例えば、Ｔ７Ｈｉｇｈ−Ｙｉｅｌｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ）。かかるシステムを使用するために、反復ドメイン−ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合タンパク質ヌクレオチド配列を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの前にクローン化する。インビトロ転写および翻訳を介して産生されるかかる融合タンパク質を、さらなる精製を行わずにＤＮＡ切断検定で使用する。
【０２１６】
本明細書で、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法的対象物の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つ以上の要素を示す。
【０２１７】
本明細書全体にわたって、単語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、指定の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を含むことを意味することが理解されるであろうが、任意の他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を除外するものではない。
【０２１８】
本明細書で言及される全ての公開物および特許出願は、本発明がそれに付随している当業者のレベルの指標である。全ての公開物および特許出願は、各個々の公開物または特許出願が、参照により組み込まれることを具体的に個々に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。追加的に、次の特許出願の各々は、これにより参照されてその全体が本明細書に組み込まれる：２００９年１月１２日に出願されたＤＥ第１０ ２００９ ００４ ６５９．３号、２００９年７月１３日に出願されたＥＰ第０９１６５３２８号、および２００９年７月１３日に出願されたＵＳ第６１／２２５，０４３号。
【０２１９】
前述の発明は、明確な理解の目的で、例示および実施例として幾らか詳細に説明されたが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および修正が行われてもよいことは、明白であろう。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡ配列内の少なくとも１つの塩基対を選択的に認識するポリペプチドを産生する方法であって、前記方法は、反復ドメインを含むポリペプチドを合成することを含み、前記反復ドメインは、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、前記反復単位は、前記標的ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する高度可変領域を含み、前記反復単位は、前記ＤＮＡ配列内の１つの塩基対の前記認識に関与し、かつ前記高度可変領域は、
（ａ） Ｃ／Ｇの認識のためのＨＤ、
（ｂ） Ａ／Ｔの認識のためのＮＩ、
（ｃ） Ｔ／Ａの認識のためのＮＧ、
（ｄ） Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃの認識のためのＮＳ、
（ｅ） Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔの認識のためのＮＮ、
（ｆ） Ｔ／Ａの認識のためのＩＧ、
（ｇ） Ｃ／Ｇの認識のためのＮ、
（ｈ） Ｃ／ＧまたはＴ／Ａの認識のためのＨＧ、
（ｉ） Ｔ／Ａの認識のためのＨ、および
（ｊ） Ｇ／Ｃの認識のためのＮＫからなる群から選択されるメンバーを含む、方法。
【請求項２】
前記高度可変領域は、前記反復単位内のアミノ酸１２および１３に対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反復ドメインは、１．５〜４０．５個の反復単位を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記反復ドメインは、１１．５〜３３．５個の反復単位を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、前記反復ドメインに作動可能に結合された少なくとも１つの追加ドメインをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記追加ドメインは、細菌、ウイルス、真菌、卵菌、ヒト、動物、植物、もしくは人工タンパク質、またはそれらの一部を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記追加ドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡを修飾することができる、タンパク質またはその機能部分もしくはドメインを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記追加ドメインは、転写活性化因子、転写抑制因子、抵抗性仲介タンパク質、ヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リゾルバーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、デメチラーゼ、およびデアセチラーゼからなる群から選択されるタンパク質またはその機能部分もしくはドメインを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドの前記反復ドメインは、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現することによって合成され、前記ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡ配列は、その後、前記ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡ配列を含む最終ベクターへと組み立てられる１つ以上の標的ベクター内で、前記反復単位を事前組み立てすることによって組み立てられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記反復単位は、３０〜４０個のアミノ酸を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記反復単位は、３３、３４、３５、または３９個のアミノ酸を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリペプチドは、前記標的ＤＮＡ配列内の、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の塩基対を認識する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリペプチドは、前記標的ＤＮＡ配列内の全ての塩基対を認識する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドは、前記標的ＤＮＡ配列に結合することができる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法によって産生される、ポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドは、天然産でない、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法によって産生される前記ポリペプチドのためのコード配列を含む、ＤＮＡ。
【請求項１８】
前記ＤＮＡは、天然産でない、請求項１７に記載のＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１７に記載のＤＮＡに作動可能に結合されたプロモーターを含む、発現カセット。
【請求項２０】
請求項１９に記載の発現カセットを含む、非ヒト宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、動物細胞、または植物細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１９に記載の発現カセットを含む、形質転換された、非ヒト生物。
【請求項２３】
前記生物は、真菌、動物、または植物である、請求項２２に記載の形質転換生物。
【請求項２４】
ポリペプチドによって、ＤＮＡ配列内の塩基対を選択的に認識する方法であって、前記方法は、反復ドメインを含むポリペプチドを構築することを含み、前記反復ドメインは、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、前記反復単位は、前記ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する高度可変領域を含み、前記反復単位は、前記ＤＮＡ配列内の１つの塩基対の前記認識に関与し、かつ前記高度可変領域は、
（ａ） Ｃ／Ｇの認識のためのＨＤ、
（ｂ） Ａ／Ｔの認識のためのＮＩ、
（ｃ） Ｔ／Ａの認識のためのＮＧ、
（ｄ） Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃの認識のためのＮＳ、
（ｅ） Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔの認識のためのＮＮ、
（ｆ） Ｔ／Ａの認識のためのＩＧ、
（ｇ） Ｃ／Ｇの認識のためのＮ、
（ｈ） Ｃ／ＧまたはＴ／Ａの認識のためのＨＧ、
（ｉ） Ｔ／Ａの認識のためのＨ、および
（ｊ） Ｇ／Ｃの認識のためのＮＫからなる群から選択されるメンバーを含む、方法。
【請求項２５】
前記高度可変領域は、前記反復単位内のアミノ酸１２および１３に対応する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記反復ドメインは、１．５〜４０．５個の反復単位を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記反復ドメインは、１１．５〜３３．５個の反復単位を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドは、前記反復ドメインに作動可能に結合された少なくとも１つの追加ドメインをさらに含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記反復単位は、３０〜４０個のアミノ酸を含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記反復単位は、３３、３４、３５、または３９個のアミノ酸を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
反復単位を含む前記反復ドメインは、標的認識および好ましくはＤＮＡ配列内の１つ以上の特異的塩基対の結合を達成するために、細菌、ウイルス、真菌、卵菌、ヒト、動物、または植物ポリペプチドに挿入され、任意に、前記反復単位は、ＤＮＡ配列内の１つ以上の塩基対に対する事前選択された比活性を得るために、さらに任意に修飾されるＡｖｒＢｓ３様エフェクターの前記反復ドメインに由来する、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記反復単位を含む前記反復ドメインは、遺伝子の転写を制御するポリペプチド内、任意に転写活性化因子または抑制因子タンパク質内、任意にＡｖｒＢｓ３様タンパク質内、例えば、ＡｖｒＢｓ３またはＨａｘエフェクタータンパク質内に含有される、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
反復ドメインの前記Ｎ末端領域は、前記反復単位の認識特異性のＴ／Ａ５’に対する認識特異性を付与する、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＤＮＡ配列内の前記塩基対は、遺伝子と組み合わされた発現制御要素に挿入され、前記発現制御要素は、前記遺伝子の前記発現を特異的に制御するために、前記発現制御要素に位置する前記塩基対を認識する前記反復単位内の、前記高度可変領域を含む転写制御タンパク質によって標的化され、前記発現制御要素は、好ましくはプロモーターである、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記遺伝子は、疾患抵抗性生物を得るための抵抗性仲介遺伝子であって、前記発現制御要素は、任意にＡｖｒＢｓ３様エフェクタータンパク質のための前記標的配列である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
細胞中の標的遺伝子の発現を調節する方法であって、ポリペプチドを含有する細胞が提供され、前記ポリペプチドは、反復ドメインを含み、前記反復ドメインは、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、前記反復単位は、ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する高度可変領域を含み、前記反復単位は、前記ＤＮＡ配列内の１つの塩基対の前記認識に関与し、かつ前記高度可変領域は、
（ａ） Ｃ／Ｇの認識のためのＨＤ、
（ｂ） Ａ／Ｔの認識のためのＮＩ、
（ｃ） Ｔ／Ａの認識のためのＮＧ、
（ｄ） Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃの認識のためのＮＳ、
（ｅ） Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔの認識のためのＮＮ、
（ｆ） Ｔ／Ａの認識のためのＩＧ、
（ｇ） Ｃ／Ｇの認識のためのＮ、
（ｈ） Ｃ／ＧまたはＴ／Ａの認識のためのＨＧ、
（ｉ） Ｔ／Ａの認識のためのＨ、および
（ｊ） Ｇ／Ｃの認識のためのＮＫからなる群から選択されるメンバーを含む、方法。
【請求項３７】
反復ドメインを含むポリペプチドであって、前記反復ドメインは、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、前記反復単位は、ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する高度可変領域を含み、前記反復単位は、前記ＤＮＡ配列内の１つの塩基対の前記認識に関与し、かつ前記高度可変領域は、
（ａ） Ｃ／Ｇの認識のためのＨＤ、
（ｂ） Ａ／Ｔの認識のためのＮＩ、
（ｃ） Ｔ／Ａの認識のためのＮＧ、
（ｄ） Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃの認識のためのＮＳ、
（ｅ） Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔの認識のためのＮＮ、
（ｆ） Ｔ／Ａの認識のためのＩＧ、
（ｇ） Ｃ／Ｇの認識のためのＮ、
（ｈ） Ｃ／ＧまたはＴ／Ａの認識のためのＨＧ、
（ｉ） Ｔ／Ａの認識のためのＨ、および
（ｊ） Ｇ／Ｃの認識のためのＮＫからなる群から選択されるメンバーを含む、ポリペプチド。
【請求項３８】
請求項３７に記載のポリペプチドのためのコード配列を含む、ＤＮＡ。
【請求項３９】
標的ＤＮＡ配列内に位置する塩基対が、反復ドメインを含むポリペプチドによって特異的に認識され得るように、前記塩基対を含むように修飾されるＤＮＡであって、前記反復ドメインは、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、前記反復単位は、前記ＤＮＡ配列内の塩基対の認識を決定する高度可変領域を含み、前記反復単位は、前記ＤＮＡ配列内の１つの塩基対の前記認識に関与し、前記高度可変領域による選択的および決定された認識を受容するために、前記塩基対は、
（ａ） ＨＤによる認識のためのＣ／Ｇ、
（ｂ） ＮＩによる認識のためのＡ／Ｔ、
（ｃ） ＮＧによる認識のためのＴ／Ａ、
（ｄ） ＮＳによる認識のためのＣＴまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃ、
（ｅ） ＮＮによる認識のためのＧ／ＣまたはＡ／Ｔ、
（ｆ） ＩＧによる認識のためのＴ／Ａ、
（ｇ） Ｎによる認識のためのＣ／ＧまたはＴ／Ａ、
（ｈ） ＨＧによる認識のためのＴ／Ａ、
（ｉ） Ｈによる認識のためのＴ／Ａ、および
（ｊ） ＮＫによる認識のためのＧ／Ｃからなる群から選択される、ＤＮＡ。
【請求項４０】
前記塩基対は、プロモーターまたは他の遺伝子制御配列内に位置する、請求項３９に記載のＤＮＡ。
【請求項４１】
前記ＤＮＡは、天然産でない、請求項３９に記載のＤＮＡ。
【請求項４２】
請求項３９に記載のＤＮＡを含む、ベクター。
【請求項４３】
請求項３９に記載のＤＮＡを含む、非ヒト宿主細胞。
【請求項４４】
前記宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、動物細胞、または植物細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
請求項３９に記載のＤＮＡを含む、形質転換された、非ヒト生物。
【請求項４６】
前記生物は、真菌、動物、または植物である、請求項４５に記載の形質転換生物。
【請求項４７】
反復ドメインを含むポリペプチドによって選択的に認識される、標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡを産生する方法であって、前記反復ドメインは、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、前記反復単位は、前記標的ＤＮＡ配列内で塩基対の認識を決定する高度可変領域を含み、前記反復単位は、前記標的ＤＮＡ配列内で１つの塩基対の前記認識に関与し、前記方法は、前記反復単位によって認識されることができる塩基対を含む、ＤＮＡを合成することを含み、前記塩基対は、
（ａ） ＨＤによる認識のためのＣ／Ｇ、
（ｂ） ＮＩによる認識のためのＡ／Ｔ、
（ｃ） ＮＧによる認識のためのＴ／Ａ、
（ｄ） ＮＳによる認識のためのＣＴまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃ、
（ｅ） ＮＮによる認識のためのＧ／ＣまたはＡ／Ｔ、
（ｆ） ＩＧによる認識のためのＴ／Ａ、
（ｇ） Ｎによる認識のためのＣ／ＧまたはＴ／Ａ、
（ｈ） ＨＧによる認識のためのＴ／Ａ、
（ｉ） Ｈによる認識のためのＴ／Ａ、および
（ｊ） ＮＫによる認識のためのＧ／Ｃからなる群から選択される、方法。

【図１】

【図２】

【図３−１】

【図３−２】

【図４】

【図５−１】

【図５−２】

【図６】

【図７−１】

【図７−２】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５−１】

【図１５−２】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１６Ｃ】

【図１６Ｄ】

【図１６Ｅ】

【図１６Ｆ】

【図１７】

【図１８】

【図１９Ａ−１】

【図１９Ａ−２】

【図１９Ａ−３】

【図１９Ｂ】

【図１９Ｃ−１】

【図１９Ｃ−２】

【図１９Ｃ−３】

【図１９Ｄ−１】

【図１９Ｄ−２】

【公表番号】特表２０１２−５１４９７６（Ｐ２０１２−５１４９７６Ａ）
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４４９４５（Ｐ２０１１−５４４９４５）
【出願日】平成２２年１月１２日（２０１０．１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００１５４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７９４３０
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５１１１６９７５９）
【出願人】（５１１１６９７６０）
【出願人】（５１１１６９７７１）
【出願人】（５１１１６９７８２）
【Ｆターム（参考）】