モロコシ属およびサトウキビ属の属間雑種植物およびその生産方法
属間雑種植物の生産方法およびそれにより生産された植物。ある特定の態様において、属間雑種植物は、変異ソルガムｉａｐ対立遺伝子を含むソルガム親植物を第２の単子葉植物と交雑させることによって生産される。かかる植物の使用方法およびそれから得られる生産物もまた、提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本願は、米国仮出願第６１／１０３，０８５号（２００８年１０月６日出願）、および第６１／０８３，４３６号（２００８年７月２４日出願）に対する優先権を主張する。上記出願は、出典明示により、全体として本願明細書の一部とされる。
本発明は、合衆国農務省（ＵＳＤＡ）によって授与されたＣＳＲＥＥＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ登録番号第２００４−３５３００−１４６８６号の下で政府の支援で完成した。合衆国政府は、本願においてある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、概して、植物遺伝学の分野に関する。より詳細には、属間雑種植物ならびにその生産および使用方法に関する。
【０００３】
２．関連分野の記載
２０２５年までに、世界のエネルギー消費は、２００２年のレベルから５７％増加すると予測される。該要求に応えるために多くの異なる代替エネルギー源が用いられるが、２０２２年までに年間少なくとも３６０億ガロンの代替燃料の使用を燃料生産者に要求する２００７年のＥｎｅｒｇｙ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ Ａｃｔにおいて記載された目標を満たすためには、バイオマス由来のエネルギー生産が必要とされることは明らかである。デンプン由来の代替燃料の生産のみでは、これらの目標を達成できないであろう。これらの生産目標を達成するためには、研究におけるかなりの投資および工業的責任を必要とするであろう。この新規なバイオ燃料産業の開発は、一貫した安定なバイオマス供給を保証し、それにより、バイオマス変換プラントを建築するのに必要な莫大な投資を正当付ける専用のバイオエネルギー供給原料の生産を基礎としなければならない。現在栽培される飼料用および食料用作物由来の作物残渣を用いることができるが、それらは、おそらく、必要に応じて専用のエネルギー作物からバイオマス生産を補うために役立つだけである。
【０００４】
これまでに、バイオ燃料生産専用の作物の開発および改良について、比較的ほとんど重要視されていなかった。専用のバイオ燃料供給原料として最も一般的に提案された種のいくつかは、スイッチグラス［パニカム・ヴァーガタム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）］、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｓｐ．）、サトウキビ／エネルギーケイン（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．）、ミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｐ．）およびソルガム［ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）］を包含する。現在、これらの植物種のセルロース性バイオエネルギーの可能性の強化に焦点を当てた農業経済学、育種およびゲノム的計画がある。しかしながら、目下、専用のバイオ燃料供給原料の望ましい特徴を全て具体化する所定の作物種はない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
第一の態様において、本発明は、ソルガム親植物を異なる属由来の単子葉植物と交雑させて子孫を得ることによって生産された属間植物を提供する。ソルガム親植物は、ソルガムの劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性であってもよい。ある特定の態様において、例えば、単子葉親植物は、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）植物などの草である。例えば、第２の単子葉親植物は、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、サトウキビ属とススキ属の交雑種、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）、ソルガネトラム属（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）またはトウモロコシ属（Ｚｅａ）植物であることができる。ある特定の具体例において、第２の単子葉植物は、ペニセタム・パーパレウム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）、パニカム・ヴァーガタム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、ペニセタム・シリアレ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｃｉｌｉａｒｅ）、ペニセタム・グラウカム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、アンドロポゴン・ゲラルディイ（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇｅｒａｒｄｉｉ）、アンドロポゴン・ハリイ（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｈａｌｌｉｉ）、シザキリウム・スコパリウム（Ｓｃｈｉｚａｃｈｙｒｉｕｍ ｓｃｏｐａｒｉｕｍ）、ソルガストラム・ヌタンス（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ ｎｕｔａｎｓ）、アルンド・ドナックス（Ａｒｕｎｄｏ ｄｏｎａｘ）、トリプシカム・ダクチロイデス（Ｔｒｉｐｓｉｃｕｍ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ）、スポロボルス・エイリオデス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ ａｉｒｉｏｄｅｓ）、ミスカンサス・フロリデュルス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｆｌｏｒｉｄｕｌｕｓ）、ミスカンサス・シネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ゼア・メイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ゼア・ニカラグエンシス（Ｚｅａ ｎｉｃａｒａｇｕｅｎｓｉｓ）、ゼア・ペレニス（Ｚｅａ ｐｅｒｅｎｎｉｓ）、またはゼア・ジプロペレニス（Ｚｅａ ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ）植物である。特定の態様において、ソルガム植物および／または第２の親植物は、１以上のトランス遺伝子を含む。
【０００６】
かくして、一の具体例において、本発明は、ソルガム親植物から生産した属間雑種植物を提供する。ある特定の態様において、ソルガム親植物は、ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）植物またはソルガム・ビカラーと野生のソルガム品種との雑種であり、ここに該植物物は、ソルガムの劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性である。さらなる具体例において、ソルガム親植物は、雄性不稔形質、例えば、細胞質または遺伝子性雄性不稔性対立遺伝子（例えば、ソルガムのｍｓ３）を含む。ある特定の具体例において、ソルガム親植物は、農学的にえり抜きのソルガム植物として定義されうる。当業者は、「農学的にえり抜きの」なる語が、生産者が商業的に意味のある産物を収穫することが可能になる有益な表現型に寄与する区別可能な形質の頂点を示すことを理解する。かかる形質は、収穫量、活力、病害耐性、環境ストレス耐性、および害虫耐性を含みうる。さらに特定の具体例において、ソルガム植物は、バイオ燃料生産に適応した農学的にえり抜きのソルガム植物であってもよい。またさらなる具体例において、ソルガム親植物は、ソルガム系統Ｔｘ３３６１の植物であってもよい。
【０００７】
別の態様において、本発明は、本明細書中に開示される属間雑種植物の部位を提供する。属間雑種植物の部位は、限定するものではないが、プロトプラスト、細胞、配偶子、分裂組織、根、雌しべ、葯、花、種子、胚、茎、または葉柄を包含する。ある特定の態様において、属間植物種子が提供される。いくつかの場合、属間植物種子は、機能的内胚乳を含むものとして定義されうる。さらなる態様において、植物種子は、殺害虫剤、殺真菌剤（例えば、Ｕ．Ｓ．特許第３，８４９，９３４号参照）、養分または水もしくは温度感受性ポリマーを含む人工種子コートを含んでいてもよい。ある特定の態様において、種子コーティングは、種子の機械的取扱性、種子発芽、幼植物確立または生育を改善するための剤を含む。種子のコーティングに使用されうるプロセスは、例えば、Ｕ．Ｓ．特許第２，７９９，２４１号、第３，０８９，８２４号、第３，１７７，０２７号、第３，１９６，８２７号、第３，２０７，８２４号、第３，２４１，５２０号、および第３，２５３，９９４号（出典明示により、本明細書の一部とされる）に開示される。当業者は、種子コートが、例えば、生存能力（例えば、発芽する種子のパーセント）または植物種子の貯蔵能力を増加させるために用いてもよいことを認識するであろう。またさらなる態様において、属間植物部位は、ソルガム染色体の倍加数を含む植物、例えば、２ｎソルガム染色体を含む植物配偶子の部位が提供される。当業者は、かかる配偶子が、ある特定の態様において、属間植物を微小管阻害剤または染色体倍加剤、例えば、化学的染色体倍加剤（例えば、コロチシン（colchicine））で処理することによって生産されうることを理解するであろう。
【０００８】
また別の態様において、本明細書中に提供される属間植物は、１以上のトランス遺伝子を含むものとして定義されうる。例えば、属間植物は、病害耐性、昆虫耐性、除草剤耐性、乾燥耐性、耐塩性、雄性不稔性、バイオマス増加または糖含量増加を与えるトランス遺伝子を含むことができる。特定の具体例において、トランス遺伝子は、属間雑種植物中に直接導入することができる。またさらなる態様において、トランス遺伝子は、親植物から受け継いでいてもよい。該親植物は、直接形質転換されていてもよく、またはその祖先由来のトランス遺伝子を受け継いでいてもよい。いくつかの態様において、本発明は、ソルガム親植物を第２の植物と交雑させ、ここに、該ソルガム親植物および／または第２の植物がトランス遺伝子を含み、次いで、該トランス遺伝子を含む子孫植物を選択することを含む方法を提供する。ある特定の態様において、本発明のトランスジェニック植物を交配させることを含む方法は、マーカーによって補助された選択によって（例えば、トランス遺伝子またはその産物の検出によって）、子孫植物を選択することを含んでいてもよい。
【０００９】
さらなる具体例において、本明細書中に記載の属間雑種植物の子孫植物が提供される。特定の具体例において、該子孫植物は、栄養繁殖または接ぎ木によって生産される。いくつかのさらなる態様において、子孫植物は、種子から生長しうる。
【００１０】
またさらなる具体例において、本明細書中に記載される属間植物の再生可能な細胞の組織培養が提供される。再生可能な細胞は、ある特定の態様において、属間植物の胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、葯、雌しべ、花、種子、ボールまたは茎由来であることができる。かくして、いくつかの態様において、組織培養再生可能細胞から再生された属間植物が提供される。
【００１１】
また別の具体例において、属間雑種植物またはその部位を得、そこから商業的製品を製造することを含む商業的製品の製造方法が提供される。ある特定の態様において、商業的製品は、発酵性（例えば、バイオ燃料）原料、シュークロース汁、バガス、エタノール、バイオジーゼル、糖類、サイレージ、穀物粉または動物飼料として定義される。いくつかの態様において、属間雑種植物はソルケイン（Ｓｏｒｃａｎｅ）植物であり、商業的製品は発酵性（例えば、バイオ燃料）原料、ソルケイン汁、糖蜜、バガス、エタノール、バイオジーゼル、バイオプラスチックまたは糖類である。例えば、発酵性原料は、エタノール（例えば、出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第５，０５３，２３１号および第６，９２７，０４８号参照）、バイオジーゼル、化学物質（例えば、酢酸およびアンモニア）などのバイオ燃料を生産するために使用してもよく、またはガス化のために使用してもよい。ある特定の態様において、属間雑種植物またはその部位は、セルロース性供給原料として使用されうる。例えば、属間雑種由来のセルロース性原料は、酵素的に、および／または化学的に、エタノール発酵のための遊離炭水化物に消化されてもよい（例えば、出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第４，３５５，１０８号参照）。したがって、いずれかのかかる商業的製品は、本願発明の一部を構成する。
【００１２】
ある特定の態様において、本発明は、部分的または実質的に精製したソルケイン汁、ソルケイン植物由来の糖液を提供する。ある特定の態様において、ソルケイン汁は、ソルガムポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を含むものとして定義されうる。例えば、ソルケイン汁は、ソルガムの劣性ｉａｐ対立遺伝子をコードしているソルガムのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を含むものとして定義されうる。さらなる態様において、該汁は、ソルガムおよびサトウキビＤＮＡを含むものとして定義されうる。
【００１３】
さらなる具体例において、「ソルケイン（Ｓｏｒｃａｎｅ）」属間雑種植物は、ソルガム親植物をサトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）（またはサトウキビ属雑種、例えば、サトウキビ属とススキ属（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）の雑種植物）と交雑することによって生産され、ここに、ソルガム親植物は、ソルガムの劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性である。例えば、ソルガム親植物は、ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）植物であってもよく、またはソルガム・ビカラーと野生ソルガム種との雑種であってもよい。サトウキビ属親植物のいくつかの例には、限定するものではないが、サッカラム・スポンタネウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）、サッカラム・オフィシナラム（Ｓ． ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、またはサッカラム・オフィシナラム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）とサッカラム・スポンタネウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）との雑種植物がある。ある特定の態様において、ソルケイン植物は、ソルガム親植物とサトウキビ属植物のＬ０６−０２４、ＨｏＣＰ０５−９０４またはＨｏ０６−５６２品種との間の交雑として生産されうる。
【００１４】
またさらなる態様において、本発明は、雄性不稔性形質を含むソルガム植物であって、ソルガムの劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性の植物またはその部位を提供する。例えば、ソルガム植物は、細胞質性または遺伝的雄性不稔性であってもよい。いくつかの態様において、ソルガム植物は、ソルガムのｍｓ３遺伝的不稔性性質を含んでいる。ある特定の態様において、該植物は、Ｔｘ３３６１系統の植物であってもよい。
【００１５】
またさらなる態様において、本発明は、（ａ）ソルガム植物と、ソルガムとは異なる種の第２の単子葉植物とを交雑させ、ここに、該第１のソルガム植物はソルガムのｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性であり、雌性親植物として使用され、次いで（ｂ）該交雑から得られる属間雑種胚を得る工程を含む、属間胚の生産方法を提供する。ある特定の場合、該方法は、さらに、（ｃ）該雑種胚を生育させて属間雑種植物を生産する工程を含みうる。ある特定の態様において、本明細書に提供される方法は、属間雑種植物を生産するための方法として定義されうる。さらなる態様において、本明細書に記載の方法において使用するためのソルガム親植物は、雄性不稔性であり、例えば、遺伝的雄性不稔性であるか、または細胞質性雄性不稔性である。
【００１６】
またさらなる態様において、本発明の方法は、複数の属間雑種植物を生産し、いずれかの親と異なる特徴を有する属間雑種を選択することを含みうる。ある具体例において、該方法は、さらに、（ｄ）属間雑種植物を戻し交配して単子葉植物を得る工程を含む。さらなる具体例において、該方法は、さらに、該植物を戻し交配して、遺伝子移入による少なくとも１つの形質または遺伝子についてホモ接合性の遺伝子移入子孫植物を生産することを含む。
【００１７】
ある特定の態様において、本発明にしたがってソルガム植物に交雑される第２の親植物は、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）の植物である。例えば、第２の親植物は、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、サトウキビ属とススキ属の雑種、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）、ソルガネトラム属（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）またはトウモロコシ属（Ｚｅａ）植物であってもよい。ある特定の具体例において、第２の単子葉植物は、ペニセタム・パーパレウム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）、パニカム・ヴァーガタム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、ペニセタム・シリアレ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｃｉｌｉａｒｅ）、ペニセタム・グラウカム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、アンドロポゴン・ゲラルディイ（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇｅｒａｒｄｉｉ）、アンドロポゴン・ハリイ（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｈａｌｌｉｉ）、シザキリウム・スコパリウム（Ｓｃｈｉｚａｃｈｙｒｉｕｍ ｓｃｏｐａｒｉｕｍ）、ソルガストラム・ヌタンス（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ ｎｕｔａｎｓ）、アルンド・ドナックス（Ａｒｕｎｄｏ ｄｏｎａｘ）、トリプシカム・ダクチロイデス（Ｔｒｉｐｓｉｃｕｍ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ）、スポロボルス・エイリオデス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ ａｉｒｉｏｄｅｓ）、ミスカンサス・フロリデュルス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｆｌｏｒｉｄｕｌｕｓ）、ミスカンサス・シネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ゼア・メイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ゼア・ニカラグエンシス（Ｚｅａ ｎｉｃａｒａｇｕｅｎｓｉｓ）、ゼア・ペレニス（Ｚｅａ ｐｅｒｅｎｎｉｓ）、またはゼア・ジプロペレニス（Ｚｅａ ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ）植物である。ある特定の態様において、第２の単子葉植物は、サトウキビ属、例えば、サッカラム・オフィシナラム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、サッカラム・スポンタネウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）、またはサッカラム・オフィシナラムとサッカラム・スポンタネウムとの雑種であってもよい。いくつかの他の態様において、第２の単子葉植物は、ススキ属植物、例えば、ミスカンサス・シネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）であってもよい。
【００１８】
いくつかの態様において、戻し交配は、属間雑種またはその子孫と、非ソルガム親植物［例えば、アンドロポゴン類（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｅａｅ）親植物］、そのクローンまたは同じ種からのバイオエネルギー収率に関して少なくとも９０％同一の植物との間で実施されうる。ある特定の他の態様において、戻し交配は、属間雑種またはその子孫と、ソルガム親植物との間で実施されうる。戻し交配は、例えば少なくとも２〜１０回戻し交配するような、連続的な戻し交配であることができる。
【００１９】
ある特定の具体例において、該方法は、（ｉ）第２の単子葉植物から花粉を収集し、次いで、（ｉｉ）ソルガム親植物の花に該花粉を受粉することを含みうる。
【００２０】
ある特定の態様において、本明細書に記載の属間胚を生産する方法は、さらに、胚および機能的内胚乳を含む雑種種子を生産するものとして定義されうる。ある特定の他の具体例において、雑種種子は、胚および非機能的内胚乳を含みうる。本発明の一の態様において、胚（例えば、非機能的内胚乳に関連した胚）は、属間雑種植物を生産するための組織培養方法を用いてレスキューされうる。例えば、ある態様において、工程（ｂ）はさらに、交雑から得られた胚を胚レスキューによって単離することを含んでいてもよい。
【００２１】
またさらなる態様において、属間雑種植物における発現に関する特徴は、バイオマス収率、改善された生長形質またはある種の望ましい形質を包含しうる。かかる特徴は、ハイブリダイゼーションのために選択された特定の親系統の結果として、雑種強勢から得られうる。該特徴には、例えば、バイオマス含量、稔性、栄養繁殖、光周期無感覚、背丈、茎直径、乾燥耐性、種子サイズ、発芽、保存後の種子生存率、またはいずれか他の目的の特徴を包含しうる。例えば、バイオマス含量は、シュークロース含量またはセルロース含量を改変することによって改善されうる。バイオマス収量を比較または定量するために、当業者によく知られた標準的なバイオマス分析手法を用いてもよい。また、標準的なバイオマス分析手法の詳細なプロトコールは、合衆国ナショナル・リニューアル・エネルギー・ラボラトリー（U.S. National Renewable Energy Laboratory）から自由に入手可能である。例えば、シュークロースまたはセルロース含量は、ＨＰＬＣまたは近赤外線反射スペクトロスコープによって測定されうる。
【００２２】
ある特定の態様において、属間雑種植物または種子またはＦ１子孫は、稔性を増加するための染色体倍加剤、例えば、化学染色体倍加剤（例えば、コルチシンまたは機能的等価物）で処理してもよい。属間雑種植物の染色体倍加剤での処理は、自殖可能な稔性または部分的稔性異質倍数性植物を生成するために使用されうる。処理後、属間雑種植物または種子またはＦ１子孫は、雄性および／または雌性親植物としての稔性について評価および選択されうる。
【００２３】
さらなる態様において、上記方法から生産された属間雑種は、種子または植物の形態であってもよい。
【００２４】
ある特定の具体例において、上記方法によって生産された属間雑種種子、植物またはその部位も提供される。他の態様において、上記方法によって属間雑種植物または種子からクローン的に繁殖した子孫属間雑種植物またはその部位も提供される。さらなる態様において、上記方法によって調製された遺伝子移入による形質または遺伝子を有する単子葉子孫も提供される。
【００２５】
本発明の方法および／または組成物との関連で考察される具体例は、本明細書に記載されるいずれか他の方法または組成物に関して用いられうる。かくして、一の方法または組成物に関連する具体例は、本発明の他の方法および組成物にも同様に応用してもよい。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「ソルケイン（Ｓｏｒｃａｎｅ）」なる語は、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）植物とサトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）植物（またはその雑種）との間の属間雑種をいう。ある特定の態様において、ソルケイン植物またはその植物部位は、モロコシ属由来の少なくとも１つの染色体または染色体セグメントおよびサトウキビ属由来の少なくとも１つの染色体または染色体セグメントを含むものとして定義されうる。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、核酸に関して「コードする」または「コードしている」なる語は、当業者により本願発明が容易に理解出来るようにするために使用されるが、これらの語は、各々、「含む」または「含んでいる」と交換可能に使用されうる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は１以上を意味しうる。特許請求の範囲で使用される場合、「含む」なる語と共に使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」なる語は、１または１よりも大きい数を意味しうる。
【００２９】
特許請求の範囲で使用される「または」なる語は、選択肢のみを示すことまたは選択肢が互いに排除することを明示的に示されないかぎり、「および／または」を意味するが、該開示は選択肢のみおよび「および／または」を示す定義を支持する。
【００３０】
本願を通して、「約」なる語は、ある値は、該値を決定するために使用されている装置、方法の誤差の先天的な変動、または研究対象に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００３１】
本発明の他の目的、特徴および利点は、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内の種々の変化および修飾は、詳細な説明から当業者に明らかなので、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい具体例を示しているが、説明目的でのみ与えられていることを理解すべきである。
【００３２】
図面の簡単な説明
下記の図面は、本明細書の一部を校正紙、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、１以上の図面と本明細書に提供される特定の具体例についての詳細な説明とを組み合わせて参照にして、よりよく理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１Ａ−Ｂ： ソルガム雌しべ上／中における花粉生長におけるｉａｐ遺伝子の影響。図１Ａ： トウモロコシ花粉管生長を示しているＴｘ３３６１（ｉａｐ ｉａｐ）雌しべ。矢印は、花柱の基部から子房へと生長しているトウモロコシ花粉管を示す。図１Ｂ： トウモロコシ花粉管生長を示さないＢＴｘ６２３モロコシ属雌しべ。矢印は、柱頭軸に侵入しないトウモロコシ花粉管を示す。
【図２】植えられた種子から発芽したモロコシ属とサトウキビ属との雑種植物。
【図３】属間雑種の直接的使用を示す概略図。ＡＡなる名称はソルガムを示し、ＭＭはポリネーター属、例えば、ススキ属、サトウキビを示す。
【図４】属間雑種の間接的（遺伝子移入）使用を示す概略図。ＡＡなる名称はソルガムを示し、ＭＭはポリネーター属、例えば、ススキ属、サトウキビを示す。
【図５】図５Ａ−Ｃ： テキサス州のカレッジ・ステーション（College Station）で育てられたソルガムとサトウキビとの属間雑種の写真。図５Ａ： ２つの７月齢ソルガムｘサトウキビ雑種。図５Ｂ： ソルガムｘサトウキビ雑種の花部。図５Ｃ： ソルガムｘサトウキビ雑種から広がった有糸分裂染色体。
【図６】植物上の節間の位置に基づいたＢｒｉｘ測定（屈折計によって測定された場合、汁柱の全可溶物質）。節間１は、植物の基部に位置し、最大数は植物の頂上にある。これらの植物における糖類プロフィールは、植物がほぼ８月齢で、まだ生殖生長に入らない８月に測定した。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
説明的具体例の記載
栽培したソルガム［ソルガム・ビカラー（Ｓ． ｂｉｃｏｌｏｒ）］は、伝統的な植物育種に不応性であり、野生のＥｕソルガム（Ｅｕ−Ｓｏｒｇｈｕｍ）品種とさえも交雑することができなかった。本発明は、ソルガムと他の単子葉植物との属間雑種を生産するのに有効な方法を提供することによって、初めて当該分野の欠如を克服する。本明細書に提供される属間雑種植物は、種々の農学的応用に有用な独特の形質を含み、バイオ燃料の生産に有益な特定の形質を有する。ある特定の態様において、本明細書に記載の方法により、ソルガムおよび豊富な他の単子葉植物属由来の農業経済学的に重要な形質を属間雑種植物中に組み込むことが可能である。本明細書に記載の方法を用いて、各親由来の農業経済学的に有益な形質を雑種植物に発現することができ、それにより、生産性、耐寒性、乾燥耐性、病害耐性などの実質的に改善された形質を生じることができる。
【００３５】
本明細書に提供される研究は、劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性のソルガム植物がサトウキビ種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．）およびミスカンサス（miscanthus）を包含する単子葉植物と首尾良くハイブリダイズできることを明らかにする。生産された雑種植物は、親植物品種と別個の形質を含む。例えば、モロコシ属とサトウキビ属との雑種「ソルケイン」は、茎柱の糖含量増加を包含する新規な表現型特徴を含むことが明らかにされた。
【００３６】
ある特定の態様において、本明細書中で提供される属間植物および方法は、バイオ燃料生産のための進化した供給原料を操作するために使用されうる。例えば、サトウキビは、その高い糖含量および太陽エネルギーのバイオマスへの変換における比類無き効率のおかげで、非常に好ましいバイオ燃料供給原料である。しかしながら、サトウキビ生産は、地理学的に、高い降雨量を有する赤道付近の地域に限られている。ソルガムは、温帯乾燥気候において生育し、バイオ燃料としての使用が意図されるが、ソルガムは、サトウキビよりも遙かに低い糖含量しか示さない。本明細書に提供される方法は、初めて、雑種植物において、ソルガム由来の乾燥耐性およびサトウキビ属由来の糖産生を包含する複数の属由来の所望の形質を組み合わせてえり抜きのバイオ燃料植物を生産することのできる育種計画を可能にする。
【００３７】
Ｉ．属間雑種を生産するための親植物
本発明のある特定の具体例は、第１の単子葉植物および第１の単子葉植物とは異なる種の第２の単子葉植物の交雑から、例えばサトウキビ植物とソルガム植物との交雑から、由来する属間雑種を生産する方法を提供する。かかる雑種交雑において、親として花粉レシピエント雌性植物、ならびに別の親として花粉ドナー雄性植物が存在するが、各親は雄性および雌性の花を有しうることが認識される。
【００３８】
ある特定の態様において、親植物は単子葉植物である。単子葉植物は、伝統的に認識される顕花植物（被子植物）の２つの主要な群のうちの１つであり、他方は双子葉植物である。さらなる態様において、親植物は、アンドロポゴン類（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｅａｅ）の植物であってもよい。アンドロポゴン類は、熱帯および温帯地域に広がった草の連［イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）］である。それらはＣ４炭素固定機能を使用する。該連は、一般に、ソルガム連と呼ばれる。該連に属する属には、アンドロポゴン（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、ボスリオクロア（Ｂｏｔｈｒｉｏｃｈｌｏａ）、クリソポゴン（Ｃｈｒｙｓｏｐｏｇｏｎ）、コイックス（Ｃｏｉｘ）、ジカンチウム（Ｄｉｃａｎｔｈｉｕｍ）およびセメダ（Ｔｈｅｍｅｄａ）がある。該草の出現は、インド、オーストラリア、アフリカおよび南アフリカの熱帯サバンナにおいて豊富である。
【００３９】
専用のバイオ燃料供給原料としてのソルガム、サトウキビおよびミスカンサスは関連しており、アンドロポゴン類の代表例である。これらの種の各々は、バイオマス供給原料としての相対的長所および潜在的弱点を有し、これらの作物間で形質を移動させる能力は、作物改良計画にとって非常に価値を有するであろう。これらの２または３種由来の好ましい形質を組み合わせることは、２、３またはそれ以上の種由来の栄養的雑種強勢雑種の合成および／またはドナー種から別の種への遺伝子および形質のハイブリダイゼーションに基づく有性移動によって達成されうる。遺伝的形質転換はまた、１個または非常に少数の遺伝子を属を横切って移動させるために使用されうる方法でもあるが、現行の方法は、バイオ燃料供給原料においておそらく価値がある多重遺伝子的農学的および組成的形質の移動の役に立たない。また、トランスジェニック作物の規制認可のコストが高いので、伝統的な（有性）移動方法が奨励される。
遺伝的形質転換ではなく有性移動方法による該目標の達成には、これらの草種における種間および／または属間繁殖障壁を克服する必要がある。本発明のある特定の態様において、このような繁殖障壁は、ソルガムの変異ｉａｐ遺伝子の利用により回避することができ、それにより、ソルガム、サトウキビおよび／またはススキ属由来の最も望ましい形質を新規な専用のバイオエネルギー供給原料中に組み込む可能性を提供して、２００７年の「Ｅｎｅｒｇｙ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ Ａｃｔ」に概説された目標を満たすのを助ける。
【００４０】
Ａ．モロコシ属（ソルガム）
ソルガムは、幅広く適用され、乾燥耐性であり、かつ、種子を解して容易に繁殖する。歴史的に、飼料穀物、食物用穀物、および飼草として世界中で栽培されているが、穀物生産に使用されるものとは明確に異なるエネルギーソルガムの品種および雑種が開発中である。全ての草の中でもソルガムは、高収量のデンプン（穀物雑種）、糖（スイートソルガム栽培種および雑種）、および／またはセルロース性バイオマス（飼草およびエネルギーソルガム雑種）を提供するその雑種が入手可能であるか、または開発可能であるので、バイオエネルギー穀物として独特である（Ｒｏｏｎｅｙら、２００７）。それは、すでに種子から作物として生育されているので、米国の多くの地域の生産者は、その栽培を熟知しており、該作物を栽培および収穫するのに必要な農業インフラを有する。それは、典型的に一年生作物として栽培されるが、多重収穫のために刈り株から新芽を出させることができ、最も乾燥耐性でかつ水利用効率のよい栽培作物の１つである（Ｒｏｏｎｅｙら、２００７）。
【００４１】
ソルガム穀物は、合衆国外の地域では人の食物として等しく重要である。これらの地域において、該穀物は、パン、ポリッジ、菓子の形態で、およびアルコール飲料として消費される。ソルガム穀物は、粉に製粉してもよく、直接または小麦粉やトウモロコシ粉と混合して、食品の調製に使用してもよい。ソルガムは、該穀物の直接消費の他に、世界の多くの地域において、長い間、ビールの製造に使用されてきた。ソルガムの使用は、ヒトによる穀粒の消費の他に、乾式製粉および湿式製粉産業の生産物を包含する。ソルガムの乾式製粉の主生産物は、グリット（grit）、ミール（meal）およびフラワー（flour）である。食物使用のためのデンプンおよび他の抽出物は、湿式製粉工程によって提供される。
【００４２】
ソルガムは、工業的原料の供給源を提供する。工業的使用は、主に、湿式製粉工業由来のソルガムデンプンから、および乾式製粉工業由来のソルガム粉である。ソルガムデンプンおよび粉は、紙およびテキスタイル工業に適用する。他の工業的使用は、接着剤、建設材料における適用および石油泥としての適用を包含する。相当量のソルガム（穀粒および植物材料の両方）が工業的アルコール生産に使用されてきた。
【００４３】
本発明において意図されるモロコシ属の種は、限定するものではないが、ソルガム・アルマム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ａｌｍｕｍ）、ソルガム・アムプラム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ａｍｐｌｕｍ）、ソルガム・アングスタム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ａｎｇｕｓｔｕｍ）、ソルガム・アルンディナセウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍ）、ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）（主要な栽培種）、アオルガム・ブラキポドゥム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｒａｃｈｙｐｏｄｕｍ）、ソルガム・バルボサム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｕｌｂｏｓｕｍ）、ソルガム・バルヒカム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｕｒｍａｈｉｃｕｍ）、ソルガム・コントロヴェルム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｕｍ）、ソルガム・ドルモンディイ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ）、ソルガム・エカリナタム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｅｃａｒｉｎａｔｕｍ）、ソルガム・エクスタンス（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｅｘｓｔａｎｓ）、ソルガム・グランデ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｇｒａｎｄｅ）、ソルガム・ハレペンセ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｅ）、ソルガム・インテルジェクタム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｉｎｔｅｒｊｅｃｔｕｍ）、ソルガム・イントランス（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｉｎｔｒａｎｓ）、ソルガム・ラキシフロラム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｌａｘｉｆｌｏｒｕｍ）、ソルガム・レイオクラデュム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｌｅｉｏｃｌａｄｕｍ）、ソルガム・マクロスペルマム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｍａｃｒｏｓｐｅｒｍｕｍ）、ソルガム・マタランケンス（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｍａｔａｒａｎｋｅｎｓｅ）、ソルガム・ミリアセウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、ソルガム・ニグラム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）、ソルガム・ニチデュム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｎｉｔｉｄｕｍ）、ソルガム・プラモサム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｐｌｕｍｏｓｕｍ）、ソルガム・プロピンキウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｐｒｏｐｉｎｑｕｕｍ）、ソルガム・パープレオセリセウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｏｓｅｒｉｃｅｕｍ）、ソルガム・スチポイデウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｔｉｐｏｉｄｅｕｍ）、ソルガム・チモレンセ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｔｉｍｏｒｅｎｓｅ）、ソルガム・トリコクラデュム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｔｒｉｃｈｏｃｌａｄｕｍ）、ソルガム・ヴェルシカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ヴァーガタム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、およびソルガム・ヴルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）を包含する。
【００４４】
本発明で使用されるソルガムの一例は、ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）である。特定の具体例において、例えば下記のようなｉａｐ／ｉａｐ変異ソルガムを用いてもよい。実施例１に記載されるＴｘ３３６１系統を包含する雄性不稔性ｉａｐ／ｉａｐ変異体もまた、使用されうる。
【００４５】
ある特定の態様において、本明細書中に記載されるソルガム植物は、１以上の農業経済学的に有益な形質を含みうる。これらの形質は、親ソルガム系統中に導入され、次いで、属間雑種植物に伝達されるか、または属間雑種植物中に直接導入されてもよい。ある特定の態様において、農業経済的に有益な形質は、１以上のトランス遺伝子をソルガム植物または属間雑種植物中に導入することにより、導入されうる。一の態様において、トランス遺伝子は、Ｔｘ３３６１系統のようなｉａｐ／ｉａｐソルガム系統中に、かかるソルガム植物由来の細胞を直接形質転換することによって導入されてもよい。別の態様において、トランス遺伝子は、トランス遺伝子を含むソルガム植物をＴｘ３３６１のようなｉａｐ／ｉａｐソルガム系統と交雑することによって、ｉａｐ／ｉａｐソルガム植物中に導入してもよい。次いで、かかる交雑由来のＦ１子孫は、ｉａｐ／ｉａｐソルガムに戻し交配するか、または（他のＦ１子孫に）自家交配してもよく、該第２交配の生産物を、該トランス遺伝子の存在およびホモ接合性ｉａｐ対立遺伝子の継承についてスクリーンする。かくして、劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性のトランスジェニックソルガム植物は、本発明の一部として包含され、本明細書に記載の属間雑種植物を生産する方法において使用されうる。
【００４６】
ある特定の態様において、本明細書に記載のソルガム植物および属間雑種植物は、限定するものではないが、穀物収率増加、糖含量増加、倒伏減少、背丈減少、乾燥耐性、耐塩性、サビ病耐性、昆虫耐性、炭疽病耐性、黒穂病耐性、べと病耐性、灰斑病耐性、条斑病（zonate）耐性、葉枯れ耐性、ウイルス耐性（例えば、トウモロコシ矮性モザイクウイルス耐性）、小昆虫耐性、ナンキンムシ（chinch bug）耐性、またはアブラムシ（green bug）耐性を包含する１以上の農業経済学的に有益な形質を含む。例えば、本明細書に記載の植物は、生物型ＣおよびＥのアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ）に対する耐性または改善された耐性、炭疽病（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）耐性、病原型１および３のべと病（Ｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ ｓｏｒｇｈｉ）および／またはレース１、２、３および４の黒穂病（Ｓｐａｏｅｌｏｔｈｅｃａ ｒｅｉｌｉａｎａ）に対する耐性の形質を含んでいてもよい。
【００４７】
Ｂ．サトウキビ
サトウキビ［サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）］は、分類学的解釈に依存するが、６〜３７種からなる、旧世界の暖温帯地域〜熱帯地域に自生する背丈の高い多年生草（イネ科、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｅａｅ類）の属である。それらは、頑丈な節のある繊維質の、糖類が豊富で、一般に２〜６メートルの高さになる茎を有する。サトウキビ種の全ては同系交配し、主な商業的栽培種は、複雑な雑種である。
【００４８】
サトウキビは、氷砂糖の生産に用いられる熱帯地域の主要作物である。それはまた、世界の熱帯地域における糖由来エタノールの生産に幅広く用いられ、砂糖生産に好ましいものとしてではなく、さらに高いバイオマイス収率をもたらす多くの他のサトウキビが承認されている。高バイオマスサトウキビは、エネルギーケイン（energycane）と呼ばれ、セルロース性エタノール生産のためのバイオマス供給源として応用される。サトウキビは、潜在的なバイオマス収率が卓越しているが、熱帯種であり、米国内での適応は、その低温感受性によって制限される。さらに、サトウキビは、相当量の水を必要とし、ソルガムより乾燥の影響を受け易い。これらの因子は、さらに、その生産範囲を制限する。最終的に、該多年生作物の確立は、栄養繁殖に依存し、典型的に該作物の生産周期を通して最も費用のかかる唯一の作物である。
【００４９】
本発明で意図されるサトウキビ属（サトウキビ）の種は、限定するものではないが、サッカラム・アルンジナセウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍ）、サッカラム・ベンガレンス（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｂｅｎｇａｌｅｎｓｅ）、サッカラム・ブレヴィバルベ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｂｒｅｖｉｂａｒｂｅ）、サッカラム・エデュレ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｅｄｕｌｅ）、サッカラム・オフィシナラム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、サッカラム・プロセルム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｐｒｏｃｅｒｕｍ）、サッカラム・ラヴェナエ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｒａｖｅｎｎａｅ）、サッカラム・ロブスタム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｒｏｂｕｓｔｕｍ）、サッカラム・シネンセ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｉｎｅｎｓｅ）およびサッカラム・スポンタネウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）を包含する。本明細書の開示にしたがって使用するために意図されるいくつかのサトウキビ属の品種は、限定するものではないが、サトウキビ品種Ｈｏ０５−９６１、ＨＢ０３−４０３、Ｈｏ０１−５６４、Ｈｏ０５−９６１、Ｈｏ０６−５２５、Ｈｏ０６−５３０、Ｈｏ０６−５４３、Ｈｏ０６−５５２、Ｈｏ０６−５６２、Ｈｏ０６−５６３、Ｈｏ０６−５６５、Ｈｏ０７−６１３、Ｈｏ９５−９８８、ＨｏＣＰ０１−５１７、ＨｏＣＰ０４−８０３、ＨｏＣＰ０４−８１０、ＨｏＣＰ０４−８３８、ＨｏＣＰ０５−９０３、ＨｏＣＰ０５−９０４、ＨｏＣＰ０５−９２３、ＨｏＣＰ０６−５０２、ＨｏＣＰ９６−５４０、ＨｏＬ０５−９５３、Ｌ０１−２８３、Ｌ０６−００１、Ｌ０６−０２４、Ｌ０６−３８、ＬＣＰ８５−３８４、ＵＳ０２−８４０、ＴＣＰ００−４５２１、ＴＣＰ０１−４５３５、ＴＣＰ０２−４６２２、ＴＣＰ０３−４６３６、ＴＣＰ０３−４６４５、ＭＰＴＨ９７−２０９、ＵＳ０７−９０１４、ＵＳ０７９０２６、ＵＳ０７９０２５、Ｌ９７−１２８（米国植物特許第ＰＰ１７，６３６号）、Ｌ９９−２２６（米国植物特許第ＰＰ１８，８０７号）およびＬ９９−２３３（米国植物特許第ＰＰ１８，８２６号）を包含する。ある特定の態様において、親サトウキビ属植物は、１以上のトランス遺伝子を含んでいてもよい。例えば、親サトウキビ属植物は、先祖植物由来のトランス遺伝子を承継していてもよく、またはトランス遺伝子をコードするＤＮＡで直接形質転換されていてもよい。
【００５０】
ある特定の態様において、本明細書に記載のサトウキビ属植物は、１以上の農業経済学的に有益な形質を含んでいてもよい。例えば、本明細書で使用するためのサトウキビ属植物は、除草剤耐性（例えば、グリホサート耐性）または昆虫耐性（例えば、サトウキビ穿孔虫（Ｄｉａｔｒｅａｅ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）に対する耐性）を付与するトランス遺伝子を含むトランスジェニックサトウキビ属植物であってもよい。
【００５１】
Ｃ．ススキ属（ミスカンサス）
ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）は、栽培されるバイオエネルギー供給原料として可能性のあるいくつかの種を有する。ミスカンサスは、アフリカおよび南アジアの亜熱帯および熱帯地域に自生する約１５種の多年生草からなる属であり、１種（Ｍ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）は、北へ延びて温帯東アジアにまで及ぶ。種の例には、必ずしも限定するものではないが、ミスカンサス・フロリデュラス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｆｌｏｒｉｄｕｌｕｓ）、ミスカンサス・ギガンテウス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）、ミスカンサス・サッカリフロラス［（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｌｏｒｕｓ）（オギ（Amur silver-grass））］、ミスカンサス・シネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ミスカンサス・チンクトリウス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）およびミスカンサス・トランスモリソネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｔｒａｎｓｍｏｒｒｉｓｏｎｅｎｓｉｓ）が包含される。
【００５２】
ミスカンサスの迅速な生長、低ミネラル含量および高バイオマス収率は、バイオ燃料として好ましい。収穫後、燃焼させて、出力タービンのための熱および蒸気を生産することができる。その結果得られるＣＯ２放出は、植物が生長期の間に空気から収集したＣＯ２の量と等しく、かくして、該プロセスは、投入量（例えば、肥料）または使用場所へのバイオ燃料の輸送を考慮しなければ、グリーンハウスガス中性である。石炭との５０／５０混合物中に混合した場合、それは、現行の石炭を燃料とする発電所において改修することなしに使用することができる。
【００５３】
これらの型の最も多作なものは、ミスカンサス・シネンシス（Ｍ．ｓｉｎｅｓｉｓ）（二倍体）とミスカンサス・サッカリフロラス（Ｍ．ｓａｃｃｈａｒｉｆｌｏｒｕｓ）（４倍体）との天然種間３倍体不稔性雑種である「ジャイアント・ミスカンサス（Giant Miscanthus）」であり、これは、例えば、根茎切断またはイン・ビトロ培養で、栄養繁殖しなければならない。特定の型のミスカンサス（例えば、ジャイアント・ミスカンサス）は、高収量のバイオマスを生産し、多年生であり、温帯気候に適応する（Ｃｌｉｆｔｏｎ−Ｂｒｏｗｎら、２００１）。大規模な商業化の可能性は、未だ証明されていないか、または少なくとも発表されていない。
【００５４】
本明細書の開示にしたがって使用するためのさらなる植物種および品種は、中国、日本および韓国のほとんどを通じて東アジアに自生する草であるミスカンサス・シネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）［チャイニーズ・シルバー・グラス、ユーラリ・アグラス（Eulalia grass）、メイデン・グラス（Maiden grass）、ゼブラ・グラス、ポルクピン・グラス（Porcupine Grass）；類義語：Eulalia japonica Trin.、Miscanthus sinensis f. glaber Honda、Miscanthus sinensis var. gracillimus Hitchc., Miscanthus sinensis var. variegatus Beal、Miscanthus sinensis var. zebrinus Beal、Saccharum japonicum Thunb.］を包含する。それは、一般に０．８〜２ｍ（稀に４ｍ）の高さに生長する多年生草木植物であり、地下茎から密集した茂みを形成する。葉は、長さ１８〜７５ｃｍ、幅０．３〜２ｃｍである。花は、紫がかっており、葉の上に維持される。
【００５５】
Ｄ．さらなる単子葉植物
さらなる単子葉植物を用いて、本明細書に記載の属間交雑を生じることができる。例えば、ある特定の態様において、属間交雑は、ソルガムとイネ科（草）の第２の単子葉植物との間である。例えば、交雑は、ソルガム植物と、植物のＡｎｏｍｏｃｈｌｏｏｉｄｅａｅ、Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ（例えば、ＰｈａｒｕｓおよびＬｅｐｔａｓｐｉｓ）、Ｐｕｅｌｉｏｉｄｅａｅ、Ｐｏｏｉｄｅａｅ（例えば、コムギ、オオムギ、オートムギ、スズメノチャヒキ、アシ）、Ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅａｅ（例えば、竹）、Ｅｈｒｈａｒｔｏｉｄｅａｅ（例えば、コメ）、Ａｒｕｎｄｉｎｏｉｄｅａｅ、Ｃｅｎｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｉｄｏｉｄｅａｅ、Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ（例えば、トウモロコシ）、ＭｉｃｒａｉｒｏｉｄｅａｅまたはＤａｎｔｈｏｎｉｏｉｄｅａｅ亜科のメンバーとの間で生じる。ある特定の態様において、属間植物は、優勢なソルガムの遺伝的背景中に所望の形質を遺伝子移入させるために使用されうる。逆に言えば、ある特定の場合において、本明細書に記載される属間交雑は、ソルガムに望ましい形質を他の遠い関係の植物品種中に遺伝子移入するために使用することができる。いくつかの特定の属間交雑および属間植物は、限定するものではないが、ソルガムと、エリアンタス（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）種、ソルガストラム（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ）種、パニカム（Ｐａｎｉｃｕｍ）種、ペニセタム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）種、およびゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）の遺伝子型との交雑を包含する。
【００５６】
ある特定の態様において、本明細書に記載の交雑に使用される単子葉植物は、それ自体、属間雑種植物であってもよい。例えば、ソルガムは、ソルケイン（Ｓｏｒｃａｎｅ）植物またはミスケイン（ｍｉｓｃａｎｅ）植物（ススキ属とサトウキビ属の雑種）と交雑されてもよい。
【００５７】
ＩＩ．花粉不和合性系の使用
効率が良く、生産性の高いバイオ燃料供給原料を開発するという目標を達成するために、本発明のある特定の態様は、関連する種、例えば、ソルガム、サトウキビおよびミスカンサスに存在する所望の形質の多くを組み合わせる方法を提供する。ある特定の態様において、種間および属間不和合性においてｉａｐの役割を利用して、繁殖障壁を迂回するための雑種を作成する。
【００５８】
Ａ．自家不和合性
ある特定の態様において、自家不和合性を用いて、自家受精または同じ種由来の花粉との受粉を最小限にすることができる。受精は、雄性核および雌性核の融合の成功に終わる花粉と雌しべとの間の複雑な相互作用である（ｄｅ Ｎｅｔｔａｎｃｏｕｒｔ， １９９７； Ｓｗａｎｓｏｎら、２００４； Ｗｈｅｅｌｅｒら、２００１）。雌しべ組織は、いくつかの細胞環境を通じて花粉管生長を支持する明確な指示および必須の栄養を提供する（Ｓｗａｎｓｏｎら、２００４）。同時に、雌しべは、種間または同一種内受粉を包含する不適当な花粉への接触から胚珠を保護する精巧な障壁を提供する。
【００５９】
顕花植物における自家不合和性（ＳＩ）の研究は、Ｓ−遺伝子配列、遺伝子産物および遺伝子産物相互作用の詳細な理解まで進んでいる（ｄｅ Ｎｅｔｔａｎｃｏｕｒｔ， １９９７； Ｆｅｎｇら、２００６； ＭｃＣｌｕｒｅおよびＦｒａｎｋｌｉｎ−Ｔｏｎｇ， ２００６； Ｒａｈｍａｎら、２００７； Ｔａｂａｈら、２００４）。ＳＩは、通常、単一の複対立遺伝子座Ｓによって調節されており、それは、自己認識の花粉および雌しべ決定因子をコードしている少なくとも２つの密接に関連した遺伝子からなる。近年、ＳＩの雌性決定因子の同定において大きな進歩があった。ほとんどの配偶体ＳＩ系は、雌しべＳ成分として、Ｓ−ＲＮａｓｅを有するが、独特の配偶体系は、雌しべ成分として小型分泌ペプチドを有する（Ｆｅｎｇら、２００６； ＭｃＣｌｕｒｅおよびＦｒａｎｋｌｉｎ−Ｔｏｎｇ， ２００６）。ＳＩの胞子体形成において、雌しべ決定因子は、Ｓ−受容体キナーゼであり、保存的キナーゼドメイン、膜貫通型ドメインおよび可変細胞外受容体からなる（Ｎａｉｔｈａｎｉら、２００７； ＮａｓｒａｌｌａｈおよびＮａｓｒａｌｌａｈ， １９９３； Ｎａｓｒａｌｌａｈ， ２００２）。繁殖組織におけるこれらの遺伝子の時空間的な発現は、自家不合和性花粉の認識および拒絶に導く細胞的および分子的プロセスの詳細な説明を可能とする。
【００６０】
Ｂ．交雑不和合性
属間交雑のために、異なる種間の交雑不和合性の問題を解決しなければならない。種間交雑不和合性を理解するために、２つの主要なパラダイム、すなわち、不和合性および不調和（incongruity）が存在する。不和合性は、不和合遺伝子の阻害作用により、生殖関係が機能しないメカニズムである。不和合性は、「外来」と同定された花粉の活発な拒絶に依存し、上記のＳＩ系に類似する。あるいは、不調和は、花粉の活発な拒絶に依存しないが、本質的には、パートナーの１つについての遺伝的情報の欠落のために不機能が生じる受動的プロセスである。雄性パートナーが雌に存在するある特定の障壁を克服するための浸透メカニズムを欠く場合、調和しない関係が存在する。互いからの単離において進化する種は、進化的相違のため、調和しないパートナーである可能性が高い（Ｈｏｇｅｎｂｏｏｍ， １９７３）。関与メカニズムにもかかわらず、種間ハイブリダイゼーションに対する障壁は、作物種において共通し、それらを克服することは、生殖質改良計画において種間または属間交雑を利用するために必須である。
【００６１】
Ｃ．ソルガムにおけるＩａｐ遺伝子座
ハイブリダイゼーション障壁は、モロコシ属、およびソルガム・ビカラーと野生型ソルガム種ならびにより遠縁の植物との間の雑種を得るための多くの不成功に終わった試みにおいて存在する。雌性ソルガム植物において花粉管生長を調節する対立遺伝子が同定され、Ｉａｐと称される。該遺伝子（ｉａｐ対立遺伝子）の劣性変異体もまた、同定された。
【００６２】
ｉａｐの遺伝子座は、ソルガム連鎖群０２（ＳＢＩ−０２）の短腕に位置決定され、該遺伝子座には、いくつかのＡＦＬＰおよびマイクロサテライトマーカーが側面に位置する。ｉａｐ遺伝子座の側面に位置する２つの近接のマイクロサテライトマーカー（Ｘｔｘｐ５０およびＸｔｘｐ６３）は、配列に基づいた高密度ソルガムゲノム地図に対して相互参照された（例えば、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのウェブサイト上のｓｏｒｇｂｌａｓｔ３．ｔａｍｕ．ｅｄｕ、Ｍｅｎｚら、２００２公表を参照のこと）。該局所的組み換え頻度（ｃＭあたりのｋｂｐ、ｃＭあたりの遺伝子）は、ゲノムにわたって概算された。該ｉａｐ遺伝子座をまたがる領域は、〜１６５ｋｂ／ｃＭの局所的組み換え頻度を有すると予測される。かくして、該Ｉａｐ形質遺伝子座は、比較的小さいセグメント、〜８００ｋｂｐ−１Ｍｂｐに範囲が定められると推測される。
【００６３】
ＩＩＩ．ソルガムを含む属間雑種および遺伝子移入
本発明は、所望の形質を雑種または植物種に導入することを含む、属間ハイブリダイゼーションおよびバイオ燃料の生産の方法を提供する。
【００６４】
Ａ．属間雑種の生産
種間の複雑な形質の移入は、種間または属間雑種の生産の成功を必要とする。ソルガムとサトウキビ属との間およびサトウキビ属とススキ属との間の稀なハイブリダイゼーションについて、文献において多くの報告があるが、ススキ属とソルガムとの間のハイブリダイゼーションについての報告は今まで知られていない。これらの種が稀にしかハイブリダイズしないという能力は、おそらく、その遺伝的類似性（例えば、ソルガムおよびサトウキビはほんの５百万年前に分岐した）に関連する（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、２００４）。ソルガム、サトウキビ属およびススキ属のＤＮＡ配列は、今日にいたっても非常に類似している（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、２００２のＦＩＧ．１）。しかしながら、生存能力のある雑種は、滅多に観察されず（１，０００回の試みのうち＜１未満）、それらの分類学的および遺伝学的特徴を反映する。かかる極度の困難性が、これらの努力の実際的な有用性を排除している。
【００６５】
対照的に、本発明は、属間雑種の効率の良い生産を可能とする方法を提供する。一の態様において、かかる方法は、（ａ）劣性ｉａｐについてホモ接合性（外来花粉遺伝子の阻害）であるソルガム植物を得、（ｂ）該ソルガム植物を、ソルガム以外のアンドロポゴン類（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｅａｅ）植物と交雑し、Ｆ１子孫を得、ここに、該ソルガム植物を雌性親として用い、該非ソルガムアンドロポゴン類植物を雄性親として用い、（ｃ）Ｆ１子孫から属間雑種を選択し、ここに、該属間雑種はどちらの親よりも高いバイオ燃料収率を有する工程を含む。
【００６６】
本発明にしたがって行われる交雑において、ある特定の場合、該属間雑種交雑から得られる成熟種子は、いくつかの場合において、低い生存能力を有することが発明者により見出されたので、上記したように、生存能力のある属間雑種植物を得るために、受粉後に胚レスキューを用いることが望ましい。また、各親植物における生存能力のある花粉および花粉を受容する花の同時性を保証するために、親植物の光周期および／または他の生長条件を操作することも望ましい。有利には、該段階の間、植物を肥料および／または適当と考えられる他の農薬で処理してもよい。
【００６７】
いったん属間交雑が起これば、雑種として得られる子孫であって、単に自家受精または同じ種の別の植物由来の花粉での受粉の結果ではないことを同定することが重要である。一の同定方法は、本願発明の場合のように、属間雑種が十分に識別可能な特徴を有するならば、形態学的評価である。特に、本明細書に記載の特徴は、各親植物由来の植物の物理的特徴に基づいて、当業者が植物を属間雑種として同定することを可能とする。
【００６８】
しかしながら、他の技術も本発明に利用できることが分かっており、環境的変動によって引き起こされる誤差の可能性を回避しうる。全ての可能なＦ１子孫植物のために、植物の倍数性、染色体構成およびバリエーションを決定してもよく、また、多様なゲノム位置由来の親の多形分子マーカーのセットのために、親の遺伝子型構成および一致またはバリエーションを決定してもよい。例えば、ある特定の態様において、属間子孫をスクリーンして、高い割合の機能的２ｎ配偶体を生じる子孫を同定してもよい。これらの子孫は、特に、特異的形質の遺伝子移入のための交配および戻し交配に有用でありうる。
【００６９】
例えば、親がゲノムサイズで異なる場合、フローサイトメトリックまたは他のＤＮＡ含量測定法が初期発育段階で雑種を検出しうる。しかしながら、ＤＮＡ含量の相違は、雑種状態以外の理由に起因しうるため、付加的な分析方法も望まれうる。親の相補体がサイズ、数および／または多形において異なる場合、根端が発達するとすぐに、核型分析の実施が可能である。別法には、ゲノム・イン・サイトゥ・ハイブリダイゼーション（ＧＩＳＨ）（Ｓｃｈｗａｒｚａｃｈｅｒら、１９８９）または遺伝子マーカー分析の使用がある。
【００７０】
遺伝子マーカーは、種間雑種植物、特に、異なる単子葉親植物由来の遺伝的相補体の組み合わせの分析および同定のための効率の良い方法を代表する。本明細書中で使用される場合、「遺伝的相補体」なる語は、植物または植物由来の細胞の同一性を明らかにするヌクレオチド配列の集合物を意味する。例えば、本明細書中で提供される属間雑種は、例示的なソルガムおよびサトウキビ／ススキ属親植物に対して、継承されたマーカーの代表的なサンプルを決定するために、遺伝子型分類されることができる。
【００７１】
遺伝子マーカーは、単一遺伝子座にて対立遺伝子である。それらは、好ましくは、二倍体遺伝子座の両方の対立遺伝子の存在が容易に検出可能なように共優性な様式で継承されており、環境変動がなく、すなわち、それらの遺伝率は１である。単一遺伝子座遺伝子型のアレイは、各遺伝子座にて２つのマーカー対立遺伝子のプロファイルとして発現される。各遺伝子座のマーカー対立遺伝子組成は、ホモ接合性またはヘテロ接合性である。ホモ接合性は、ある遺伝子座の両方の対立遺伝子が同じヌクレオチド配列または繰り返し配列のサイズによって特徴付けられる状態である。ヘテロ接合性は、ある遺伝子座の遺伝子の異なる状態をいう。
【００７２】
有用な型の遺伝子マーカーは、単純配列リピート（ＳＳＲｓ）であり、それらは、一般に、高度多形であり、入手に費用がかからない。しかしながら、潜在的に、例えば、制限フラグメント長多形（ＲＦＬＰｓ）、増幅フラグメント長多形（ＡＦＬＰｓ）、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰｓ）、およびアイソザイムなどの他の型の遺伝子マーカーも、本発明の植物を同定するために使用可能である。
【００７３】
ある特定の態様において、稔性、栄養繁殖およびバイオ燃料特性を包含する子孫の形質をＦ１子孫のいくつかまたは全てについて決定することが望ましく、該決定の結果にもよるが、全てのＦ１植物が類似するようである場合、Ｆ１植物の代表的セットを分析し、Ｆ１植物が変化している場合、多くのＦ１植物をクローンとして個別に分析する。さらなる態様において、かかる子孫またはクローンは、所望の形質、例えば、いずれの親と比較しても改善したバイオ燃料収率について選択されうる。
【００７４】
Ｂ．遺伝子移入
遺伝子移入は、戻し勾配による、１の種由来の遺伝子の別の種の遺伝子プール中への移動（遺伝子の流れ）を含む。本発明の一の具体例において、種間雑種は、その親の１つと戻し交配してもよい。これは、１以上の形質を親に遺伝子移入することを可能とし、特に、新規な形質を該種に導入することができる。遺伝子移入は、長期のプロセスであり、戻し交配が起こる前に、多くの雑種生成を行ってもよい。遺伝子移入株（ＩＬと略する）は、類似の種、例えば、「野生型」種由来の遺伝的材料を含有する作物種の系統をいう。遺伝子移入系統は、定量的形質遺伝子座の研究を可能とするが、外来形質を導入することによる新規な品種の作成も可能とする。
【００７５】
本発明のある特定の具体例において、非ソルガムアンドロポゴン類植物のバイオ燃料収率を改善する方法であって、（ａ）劣性ｉａｐについてホモ接合性のソルガム植物を得、（ｂ）該ソルガム植物をソルガム以外のアンドロポゴン類植物と交雑し、Ｆ１子孫を得、ここに、該ソルガム植物を雌性親として用い、該非ソルガムアンドロポゴン類植物を雄性親として用い、（ｃ）該Ｆ１子孫から属間雑種を選択し、ここに、該属間雑種は、非ソルガムアンドロポゴン類植物と比べて高いバイオ燃料収率を有し、（ｄ）該属間雑種を非ソルガムアンドロポゴン類植物と戻し交配して、アンドロポゴン類子孫を得、ここに、該アンドロポゴン類子孫がより高いバイオ燃料収率を有する工程を含む方法も提供されうる。ある特定の具体例において、該方法は、さらに、（ｅ）該アンドロポゴン類子孫を同系交配させて、より高いバイオ燃料収率についてホモ接合性の第２の子孫を生産する工程を含んでいてもよい。
【００７６】
Ｃ．改善されたバイオ燃料収率の選択
いくつかの態様において、属間ハイブリダイゼーションまたは遺伝子移入を本発明において用いて、ある特定の植物のバイオ燃料収率を改善してもよい。より高いバイオ燃料収率の選択は、標準的なバイオマス分析手法、例えば、合衆国ナショナル・リニューアル・エネルギー・ラボラトリーによって提供される方法またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｌｐ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙによって採用された類似の手法を用いて行うことができる。
【００７７】
ある特定の態様において、バイオマス収率は、また、バイオマス含量、稔性、栄養繁殖、光周期不感受性、背丈、茎径、乾燥耐性、種子サイズ、発芽、貯蔵後の種子生存能力、または当該分野で一般に知られているいずれかの特徴を包含していてもよい。例えば、バイオマス含量は、シュークロース含量またはセルロース含量であってもよい。特に、シュークロース含量またはセルロース含量は、ＨＰＬＣまたは近赤外線反射スペクトロスコープによって測定さうる。
【００７８】
Ｄ．除草剤耐性
多くの除草剤耐性遺伝子が知られており、本願発明で利用されうる。例えば、生長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素に対する耐性を付与する遺伝子がある。該カテゴリーにおける例示的遺伝子は、例えば、Ｌｅｅら（１９８８）によって記載されるような変異体ＡＬＳおよびＡＨＡＳ酵素をコードする。
【００７９】
グリホサート（各々、変異型５−エノールピルビル−３ホスフィキメートシンターセ（ＥＰＳＰ）（5-enolpyruvl-3 phosphikimate synthase）およびａｒｏＡ遺伝子によって付与される耐性）および他のホスホノ化合物、例えば、グルホシネート（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）およびストレプトマイセスヒグロスコピカスホスフィノトリシン−アセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子）耐性遺伝子もまた、使用してもよい。例えば、グリホサート耐性を付与することのできるＥＰＳＰＳの形態のヌクレオチド配列を開示するＳｈａｈらの米国特許第４，９４０，８３５号参照のこと。変異型ａｒｏＡ遺伝子をコードしているＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号第３９２５６号の下で得ることができ、該変異型遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｃｏｍａｉの米国特許第４，７６９，０６１号に開示されている。Ｋｕｍａｄａらの欧州特許出願第０ ３３３ ０３３号およびＧｏｏｄｍａｎらの米国特許第４，９７５，３７４号は、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する耐性を付与するグルタミンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。ホスフィノトリシン−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓらの欧州特許出願第０ ２４２ ２４６号に提供され、ＤｅＧｒｅｅｆら（１９８９）は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生産を記載する。フェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン類（cycloshexones）、例えば、セトキシジム（sethoxydim）およびハロキシフォップ（haloxyfop）に対する耐性を付与する遺伝子の例は、Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９９２）によって記載されるＡｃｃｔ−Ｓ１、Ａｃｃｌ−Ｓ２およびＡｃｃｔ−Ｓ３遺伝子である。
【００８０】
また、光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジン（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）およびベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）に対する耐性を付与する遺伝子も知られている。Ｐｒｚｉｂｉｌｌａら（１９９１）は、変異型ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドでのクラミドモナスの形質転換を記載する。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｔａｌｋｅｒの米国特許第４，８１０，６４８号に開示され、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号第５３４３５号、第６７４４１号および第６７４４２号の下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現は、Ｈａｙｅｓら（１９９２）によって記載されている。
【００８１】
Ｅ．病害耐性
植物防御は、しばしば、植物中の病害耐性遺伝子（Ｒ）と病原体中の対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子の生産物との間の特異的相互作用によって活性化される。植物系統は、クローン化された耐性遺伝子で形質転換して、特異的病原体株に対して耐性の植物を作成することができる。例えば、Ｊｏｎｅｓら（１９９４）（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍに対する耐性のためのトマトＣｆ−９遺伝子のクローニング）、Ｍａｒｔｉｎら（１９９３）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｔｏｍａｔｏに対する耐性のためのトマトＰｔｏ遺伝子）、およびＭｉｎｄｒｉｎｏｓら（１９９４）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅに対する耐性のためのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＲＰＳ２遺伝子）を参照のこと。
【００８２】
ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素もまた、ウイルス病耐性に用いてもよい。例えば、形質転換植物細胞中のウイルス外被タンパク質の蓄積は、該外被タンパク質遺伝子が由来するウイルスならびに関連するウイルスによってもたらされるウイルス感染および／または病害発症に対する耐性を付与する。Ｂｅａｃｈｙら（１９９０）参照のこと。外被タンパク質媒介性耐性は、アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチウイルス、タバコ茎えそウイルス、およびタバコモザイクウイルスに対する形質転換植物に付与されている。Ｉｄ．
【００８３】
また、ウイルス特異的抗体を用いてもよい。例えば、組み換え抗体遺伝子を発現しているトランスジェニック植物がウイルス攻撃から保護されることを示すＴａｖｌａｄｏｒａｋｉら（１９９３）参照のこと。
【００８４】
例えば、Ｌｏｇｅｍａｎｎら（１９９２）は、真菌病害に対する耐性が増加したオオムギリボソーム不活化遺伝子を発現しているトランスジェニック植物を開示する。
【００８５】
Ｆ．昆虫耐性
昆虫耐性遺伝子の一例は、バシラス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質、その誘導体またはそれをモデル化した合成ポリペプチドを包含する。例えば、Ｂｔ δ−エンドトキシン遺伝子のクローニングおよびヌクレオチド配列を開示するＧｅｉｓｅｒら（１９８６）を参照のこと。さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードしているＤＮＡ分子は、例えば、ヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から、受託番号第４００９８号、第６７１３６号、第３１９９５号および第３１９９８号の下で入手可能である。別の例にはレクチンがある。例えば、いくつかのクリヴィア・ミニアータ（Ｃｌｉｖｉａ ｍｉｎｉａｔａ）のマンノース結合性レクチン遺伝子のヌクレオチド配列を開示するＶａｎ Ｄａｍｍｅら（１９９４）を参照のこと。ビタミン結合性タンパク質もまた使用してもよく、アビジンなどがある。ＰＣＴ出願第ＵＳ９３／０６４８７号（出典明示により、本明細書の一部とされる）を参照のこと。該出願は、昆虫害虫に対する殺幼虫剤としてのアビジンおよびアビジン相同物の使用を教示する。
【００８６】
また別の昆虫耐性遺伝子は、酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼまたはプロテイナーゼ阻害剤あるいはアミラーゼ阻害剤である。例えば、Ａｂｅら（１９８７）（米システインプロテイナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）、Ｈｕｕｂら（１９９３）（タバコプロテイナーゼ阻害剤ＩをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）、およびＳｕｍｉｔａｎｉら（１９９３）［ストレプトマイセス・ニトロスポレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）α−アミラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列］を参照のこと。昆虫特異的ホルモンまたはフェロモンもまた使用してもよい。例えば、Ｈａｍｍｏｃｋら（１９９０）による、クローン化された幼若ホルモンエステラーゼ、幼若ホルモンの不活性化剤のバキュロウイルス発現の開示を参照のこと。
【００８７】
また別の例は、昆虫特異的抗体、そこから誘導される抗毒素、発育遅滞（developmental-arrestive）タンパク質または酵素を包含する。単鎖抗体フラグメントの産生を介するトランスジェニックタバコにおける酵素的不活性化を記載するＴａｙｌｏｒら（１９９４）を参照のこと。さらなる例において、米キチナーゼ（ｃｈｉ ＩＩ）などのキチナーゼは、植物に発現されうる（例えば、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの調節下におけるソルガム中のｃｈｉ ＩＩの発現を開示するＺｈｕら、１９９８およびＫｒｉｓｈｎａｖｅｎｉら、２００１を参照のこと）。
【００８８】
Ｇ．修飾された脂肪酸、フィターゼおよびカルボヒドラーゼ代謝
修飾された脂肪酸代謝を付与する遺伝子を用いてもよい。例えば、ステリル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子を用いてもよい。Ｋｎｕｔｚｏｎら（１９９２）を参照のこと。また、Δ９脂肪酸デサチュラーゼ、パルミトイル（１６：０）またはステロイル（１８：０）ＣｏＡ由来のモノ不飽和パルミトレイン（１６：１）およびオレイン（１８：１）脂肪酸を形成する酵素をコードしているＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＬＥ１遺伝子（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、１９９２）；ヒマ（castor）由来のステロイル−アシルキャリヤータンパク質デルタ−９デサチュラーゼ（Ｆｏｘら、１９９３）；リノール酸（１８：２）からガンマリノレン酸（１８：３ガンマ）への変換に関与するシアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ由来のΔ６−およびΔ１２−デサチュラーゼ（Ｒｅｄｄｙら、１９９３）；オメガ−３デサチュラーゼをコードするＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来の遺伝子（Ａｒｏｎｄｅｌら、１９９２）；植物Δ９−デサチュラーゼ（ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９１／１３９７２号）ならびにダイズおよびアブラナ属Δ１５デサチュラーゼ（欧州特許出願第ＥＰ ０６１６６４４号）などの種々の脂肪酸デサチュラーゼが記載されている。
【００８９】
フィチン酸塩代謝は、また、フィターゼコード化遺伝子の導入によって、フィチン酸塩の分解を増強し、より多くの遊離リン酸塩を形質転換植物に加えるように修飾してもよい。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒフィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示するＶａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔら（１９９３）を参照のこと。例えば、これは、低レベルのフィチン酸によって特徴付けられる植物変異体の原因となる単一対立遺伝子に関連するＤＮＡをクローニング、次いで再導入することによって達成することができた。Ｒａｂｏｙら（１９９０）参照のこと。
【００９０】
カルボヒドラーゼ代謝を改変するために使用されうる多くの遺伝子が知られている。例えば、植物は、デンプンの分枝パターンを改変する酵素をコードする遺伝子で形質転換してもよい。Ｓｈｉｒｏｚａら（１９８８）（ストレプトコッカス変異体フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚら（１９８５）［バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列］、Ｐｅｎら（１９９２）［バシラス・リェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼを発現するトランスジェニック植物の生産］、Ｅｌｌｉｏｔら（１９９３）（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｅｒｇａａｒｄら（１９９３）（オオムギα−アミラーゼ遺伝子の部位特異的突然変異誘発）、およびＦｉｓｈｅｒら（１９９３）（トウモロコシ内胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）を参照のこと。トウモロコシ由来の１０ｋＤゼイン貯蔵タンパク質をコードするＺ１０遺伝子もまた、他の成分と相対的に細胞中の１０ｋＤゼインの量を改変するために使用してもよい（Ｋｉｒｉｈａｒａら、１９８８）。
【００９１】
Ｈ．さらなる農業経済学的形質
例えば、乾燥耐性または耐寒性を増加するために、さらなるトランス遺伝子を導入してもよい。例えば、雑種植物の表面ワックス含量および乾燥耐性を増加させるために、ワックス合成酵素を発現させてもよい。耐寒性を付与するのに有用なトランス遺伝子は、例えば、米国特許公報第２００８００９２２５５号（出典明示により本明細書の一部とされる）に開示される。非生物的ストレス耐性を改善するためにトランスジェニック植物中で発現または過剰発現されうるさらなる遺伝子は、マンニトール−１−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（例えば、ｍｔｌＤ）、ピロリン−５−カルボキシレートシンターゼ（例えば、ｐ５ＣＳｆ１２９Ａ）、および／またはコリンオキシダーゼ（例えば、ｃｏｄＡ）を包含する。
【００９２】
例えば、エタノール生産のためのデンプンを増加するか、またはタンパク質発現を提供することができる商業的形質もまた、遺伝子上にコード化することができる。形質転換植物の別の重要な商業的使用は、米国特許第５，６０２，３２１号（出典明示により本明細書の一部とされる）に記載されるようなポリマーおよびバイオプラスチックの生産である。Ｂ−ケトチオラーゼ、ＰＨＢアーゼ（ポリヒドロキシブチレートシンターゼ）およびアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素などの遺伝子は、ポリヒドキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）の発現を容易にする。
【００９３】
ＩＶ．雄性不稔性
ある特定の態様において、異なるが、密接に関連する種間のハイブリダイゼーションは、雌性親としてのソルガムのｉａｐ／ｉａｐ変異体の使用を含む。ソルガムは天然では低頻度で異系交配するので、所望の親間での交配を調節するには、一般に特別の操作が所望される（Ｒｏｏｎｅｙ、２００４）。本発明のある特定の具体例は、雄性不稔性ソルガム変異体、例えば、Ｔｘ ３３６１を用いて、手で除雄する必要性を回避する。雄性不稔性の例を下記する。
【００９４】
Ａ．手での除雄
主として調節された受粉および交配目的での植物の雄（花粉）部の除去または破壊は、除雄と呼ばれる。自家受粉の調節のための手での除雄および他の方法はよく知られている。
【００９５】
花は、開花前日に除雄されうる。かかる小花は、ソルガム円錐花序において開いた小花の約３ｃｍ以内に生じる。全て開いた小穂ははさみで除去する。特に、除雄を戸外で行う場合、円錐花序および器具を洗浄して、除雄前にいかなる花粉も除去すべきである。温室内でのかかる花粉移動の可能性はほとんどないが、円錐花序および器具のかかるリンスは、所望されない異系交配を回避するために実施すべきである。
【００９６】
除雄されるべき小花を除き、全ての小花を除去して、次の日に開花すると予想される小花のみを残す。シャープペンシルまたは同様の尖った器具を挿入することによって、３つの葯を囲んでいる外花穎および内花穎の外で操作する。葯を破壊しないように注意を払わなければならず、もし葯が破れたら、その花を除去して、器具をリンスして次の小花の汚染を回避すべきである。小花のセットが「完全に除雄される」前に、いずれの葯も除去しなければならない。１つの葯の存在は、ブリーダーによる花粉の移動前に、１以上の子房の受粉を引き起こすであろう。小花を除雄した後、小花を１−２日後に受粉させるまで、紙袋を除雄した円錐花序の上に被せる。屋外での除雄は、通常、他の植物から迷い出た生存能力のある花粉を避ける目的で、午後に行われる。
【００９７】
Ｂ．遺伝的雄性不稔性
ｍｓ１〜ｍｓ７と呼ばれる一連の核劣性雄性不稔性遺伝子がソルガムで特徴付けられている。劣性条件において、これらの変異は、ハイブリダイゼーションに用いることができる雄性不稔性植物をもたらす（Ｒｏｏｎｅｙ、２００１）。これらの植物は完全に雄性不稔性なので、除雄する必要はなく、非常の多数の種子をより容易に作成することができる。しかしながら、何世代にもわたって受け継がれる均一の遺伝的不稔性をもたらす能力がないことが、雑種種子生産のための遺伝的雄性不稔性の使用を面倒にする。結果的に、遺伝的雄性不稔性は、属間雑種植物およびその親の開発を容易にするための、本発明にしたがうソルガム育種計画に用いられうる。
【００９８】
遺伝的雄性不稔性の使用は、ハイブリダイゼーションを容易にするが、それはまた、開花中に該集団の綿密な管理を必要とする。いったん改良が完成したら、系統を誘導しなければならず、該劣性ｍｓ対立遺伝子は除去されるか、またはそれらは将来の世代に不稔性子孫を生じるであろう。遺伝的雄性不稔性のための系統分離は、無作為な円錐花序の自家受粉または不稔性円錐花序と同じ列にあるヘテロ接合性の雄性不稔性植物由来の花粉との大量受粉によって維持されることができる。該系を用いるために、雄性不稔性植物は、先端開花にて同定されなければならない。雄性不稔性植物の葯は、小さく、細く、生存能力のある花粉を落とさない。同定において、雄性不稔性円錐花序の先端を除去し、該円錐花序を袋に入れて解放受粉を回避すべきである。次いで、円錐花序を３−５日後に、所望の雄性親から収集した花粉で受粉することができる。これらの交雑由来の雑種は、個体数改善のために使用することができるか、または改善された純粋な系統を生産するための系統選択などの別の植物育種スキームを開始するために使用することができる。ブリーダーは、多くのえり抜きのソルガム生殖質および親系統において、遺伝的雄性不稔性ストックを開発している（ＰｅｄｅｒｓｅｎおよびＴｏｙ １９９７）。
【００９９】
Ｃ．殺配偶子剤
ある特定の具体例において、除雄は、所望により、花粉を不稔にするための殺配偶子剤を用いて達成することができる。かかる殺配偶子剤で処理した植物は、雄性不稔性になるが、典型的に、雌性稔性のままである。化学的殺配偶子剤の使用は、例えば、米国特許第４，９３６，９０４号（その開示は、特に、出典明示により全体として本明細書の一部とされる）に記載されている。
【０１００】
Ｖ．植物形質転換構築物
本発明にしたがって、遺伝的形質転換によって生産された１以上のトランス遺伝子を含む植物が提供される。植物形質転換に使用されるベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣｓ（酵母人工染色体）、ＢＡＣｓ（細菌人工染色体）または別の他の適当なクローニング系、ならびにそれら由来のＤＮＡフラグメントを包含しうる。かくして、「ベクター」または「発現ベクター」なる語が用いられる場合、上記型のベクターの全て、ならびにそれらから単離された核酸配列が包含される。大きな挿入能力を有するクローニング系の利用は、１以上の選択遺伝子を含む大型のＤＮＡ配列の導入を可能にすると考えられる。本発明によると、これは、全生合成経路に相当する遺伝子を植物中に導入するために使用することができた。かかる配列の導入は、細菌または酵母人工染色体（各々、ＢＡＣｓまたはＹＡＣｓ）の使用によって、または植物人工染色体の使用によってさえも、容易にされうる。例えば、アグロバクテリウム媒介性形質転換のためのＢＡＣｓの使用は、Ｈａｍｉｌｔｏｎら（１９９６）によって開示された。
【０１０１】
かかるベクターから単離された発現カセットは、形質転換に特に有用である。植物細胞を形質転換するために使用されるＤＮＡセグメントは、もちろん、一般に、宿主細胞中に導入し、発現させたいｃＤＮＡまたは遺伝子を含む。これらのＤＮＡセグメントは、さらに、プロモーター、エンハンサー、ポリリンカー、または所望により、調節遺伝子などの構造を含むことができる。細胞性導入のために選択されたＤＮＡセグメントまたは遺伝子は、しばしば、スクリーニング可能なまたは選択可能な形質をもたらす得られる組み換え細胞中で発現されるタンパク質、および／または得られるトランスジェニック植物に改善された表現型を付与するタンパク質をコードする。しかしながら、いつもこうであるとは限らず、本発明は、発現されないトランス遺伝子を組み込んだトランスジェニック植物も包含する。本発明において使用されるベクターと共に包含されうる成分の例は、下記の通りである。
【０１０２】
Ａ．調節エレメント
核酸配列の発現のための例示的プロモーターは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９８５）などの植物プロモーター、またはＣａＭＶ １９Ｓ（Ｌａｗｔｏｎら、１９８７）、ｎｏｓ（Ｅｂｅｒｔら、１９８７）、Ａｄｈ（Ｗａｌｋｅｒら、１９８７）、シュークロースシンターゼ（ＹａｎｇおよびＲｕｓｓｅｌｌ、１９９０）、チューブリン、アクチン（Ｗａｎｇら、１９９２）、ｃａｂ（Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９８９）、ＰＥＰＣアーゼ（ＨｕｄｓｐｅｔｈおよびＧｒｕｌａ、１９８９）またはＲ遺伝子複合体に関連するもの（Ｃｈａｎｄｌｅｒら、１９８９）等の他のプロモーターを包含する。根組織プロモーター（Ｃｏｎｋｌｉｎｇら、１９９０）などの組織特異的プロモーター、および組織特異的エンハンサー（Ｆｒｏｍｍら、１９８６）もまた、有用であると考えられ、ＡＢＡ−およびトルゴール−誘導可能プロモーターなどの誘導可能プロモーターである。ＰＡＬ２プロモーターもまた、本発明で有用でありうる（米国特許出願公開第２００４／００４９８０２号（特に、出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）。
【０１０３】
転写開始部位とコーディング配列の開始との間のＤＮＡ配列、すなわち、非翻訳リーダー配列もまた、遺伝子発現に影響を及ぼすことができる。かくして、本発明の形質転換構築物と共に、特定のリーダー配列を用いてみてもよい。リーダー配列は、付加配列の最適な発現を指示する、すなわち、ｍＲＮＡ安定性を増加または維持し、翻訳の不適当な開始を防ぎうる好ましいコンセンサスリーダー配列を含むと予測される配列を含むものを包含すると考えられる。かかる配列の選択は、本明細書の開示に照らして、当業者に既知であろう。植物において高度に発現する遺伝子由来の配列が典型的に好ましい。
【０１０４】
本発明にしたがって使用するためのベクターは、ｏｃｓエンハンサーエレメントを含むと考えられる。該エレメントは、最初、アグロバクテリウムのオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）遺伝子由来の１６ｂｐパリンドロームエンハンサーとして同定され（Ｅｌｌｉｓら、１９８７）、少なくとも１０個の他のプロモーターに存在する（Ｂｏｕｃｈｅｚら、１９８９）。ｏｃｓエレメントおよび該エレメントの特に多数のコピーなどのエンハンサーエレメントの使用は、植物形質転換との関連で適用した場合、隣接するプロモーターからの転写レベルを増加するように作用しうる。
【０１０５】
トランスジェニック植物における遺伝子の組織特異的標的化において使用するためのベクターは、典型的に、組織特異的プロモーターを含み、また、他の組織特異的調節エレメント、例えば、エンハンサー配列を含んでいてもよい。ある特定の植物組織における特異的または強化した発現を支持するプロモーターは、本明細書に照らして、当業者に既知であろう。これらは、例えば、緑色組織に特異的なｒｂｃＳプロモーター；根または損傷した葉組織において高い活性を有するｏｃｓ、ｎｏｓおよびｍａｓプロモーターを包含する。
【０１０６】
Ｂ．ターミネーター
本発明にしたがって調製される形質転換構築物は、典型的に、転写を停止させ、プロモーターに作動可能に連結したコーディング配列によって産生されるｍＲＮＡのポリアデニル化を可能にするシグナルとして作用する３’末端ＤＮＡ配列を包含するであろう。該文脈において有用であると考えられるターミネーターの例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ｎｏｓ ３’末端）のノパリンシンターゼ遺伝子由来のもの（Ｂｅｖａｎら、１９８３）、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピンシンターゼ遺伝子由来のＴ７転写産物のターミネーター、およびジャガイモまたはトマト由来のプロテアーゼ阻害剤ＩまたはＩＩ遺伝子の３’末端を包含する。Ａｄｈイントロン（Ｃａｌｌｉｓら、１９８７）、シュークロースシンターゼイントロン（Ｖａｓｉｌら、１９８９）またはＴＭＶオメガエレメント（Ｇａｌｌｉｅら、１９８９）等の調節エレメントは、所望により、さらに包含されうる。
【０１０７】
Ｃ．輸送またはシグナルペプチド
最初の翻訳産物から翻訳後に除去され、細胞内膜または細胞外膜中への、あるいは細胞内膜または細胞外膜を介するタンパク質輸送を容易にする、発現された遺伝子のコーディング配列に結合する配列は、輸送（通常、小腔、小胞、プラスチドおよび他の細胞内器官中への）およびシグナル配列（通常、小胞体、ゴルジ体および細胞膜の外側への）と呼ばれる。該タンパク質の細胞内外のコンパートメントへの輸送を容易にすることによって、これらの配列は、それらをタンパク質分解から保護する遺伝子産物の蓄積を増加しうる。これらの配列は、また、高度に発現した遺伝子由来の付加的なｍＲＮＡ配列が該遺伝子のコーディング配列に結合するのを可能にする。リボソームによって翻訳されているｍＲＮＡは裸の（naked）ｍＲＮＡよりも安定なので、該遺伝子の前にある翻訳可能なｍＲＮＡの存在は、該遺伝子由来のｍＲＮＡ転写産物の全安定性を増加し、それにより、遺伝子産物の合成を増加しうる。輸送およびシグナル配列は通常、最初の翻訳産物から翻訳後に除去されるので、これらの配列の使用は、最終ポリペプチド上に現れないかもしれない余分な翻訳配列の付加を可能にする。さらに、タンパク質の安定性を増加するために、ある特定のタンパク質の標的化が望ましいかもしれないと考えられる（米国特許第５，５４５，８１８号（出典明示により、全体として、本明細書の一部とされる））。
【０１０８】
さらに、ベクターは、トランスジェニック植物の細胞内での特異的遺伝子産物の細胞内標的化において、またはタンパク質を細胞外環境に指向するにおいて、構築および使用されうる。このことは、一般的に、輸送およびシグナルペプチド配列をコードしているＤＮＡ配列を特定の遺伝子のコーディング配列に結合することによって達成されるであろう。得られる輸送、またはシグナルペプチドは、該タンパク質を各々、特定の細胞内、または細胞外目的地に輸送し、次いで、翻訳後に除去されるであろう。
【０１０９】
Ｄ．マーカー遺伝子
選択可能またはスクリーニング可能なマーカータンパク質を用いることによって、形質転換体を同定する能力を提供または増強することができる。「マーカー遺伝子」は、該マーカータンパク質を発現している細胞に別個の表現型を付与し、かくして、かかる形質転換細胞を該マーカーを有しない細胞から識別可能にする遺伝子である。かかる遺伝子は、マーカーが化学的手段によって、すなわち、選択剤（例えば、除草剤、抗生物質など）の使用によって「選択」できる形質を付与するのか、または単純に観察または試験によって、すなわち、「スクリーニング」（例えば、緑色蛍光タンパク質）によって同定できる形質であるのかに依存するが、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーのいずれをコードしていてもよい。もちろん、適当なマーカータンパク質の多くの例が当該分野で知られており、本発明の実施において使用可能である。
【０１１０】
「選択可能」または「スクリーニング可能」なマーカーなる語には、形質転換細胞について同定または選択する手段としてその分泌が検出可能である「分泌可能マーカー」をコードする遺伝子も包含される。例えば、抗体相互作用によって同定されることができる選択可能抗原であるマーカー、または触媒活性によって検出可能な分泌可能酵素が包含される。分泌可能なタンパク質は、多くのクラスに分類され、例えば、ＥＬＩＳＡによって検出可能な小型拡散性タンパク質；細胞外溶液中で検出可能な小型活性酵素（例えば、α−アミラーゼ、β−ラクタマーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）；および細胞壁に挿入または閉じこめられるタンパク質（例えば、エクステンシンまたはタバコＰＲ−Ｓの発現単位において見出されるようなリーダー配列を含むタンパク質）を包含する。
【０１１１】
多くの選択可能マーカーコーディング領域が知られており、本発明において使用可能であり、限定するものではないが、カナマイシン耐性を提供し、カナマイシン、Ｇ４１８、パロモマイシンなどの使用について選択できるｎｅｏ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５）；ビアラホスまたはホスフィノトリシン耐性を付与するｂａｒ；グリホサート耐性を付与する変異型ＥＰＳＰシンターゼ５タンパク質（Ｈｉｎｃｈｅｅら、１９８８）；ブロモキシニルに対する耐性を付与するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅ由来のｂｘｎなどのニトリラーゼ（Ｓｔａｌｋｅｒら、１９８８）；イミダゾリノン、スルホニル尿素または他のＡＬＳ阻害性化学物質に対する耐性を付与する変異型アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）（欧州特許出願第１５４，２０４号、１９８５）；メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ（Ｔｈｉｌｌｅｔら、１９８８）、除草剤ダラポンに対する耐性を付与するダラポンデハロゲナーゼ；または５−メチルトリプトファンに対する耐性を付与する変異アントラニレートシンターゼを包含する。
【０１１２】
形質転換体を選択するための系において使用されることのできる選択可能マーカーの例示的具体例は、酵素ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来のｂａｒ遺伝子またはストレプトマイセス・ヴィリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のｐａｔ遺伝子である。酵素ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）は、除草剤ビアラホスにおける活性成分、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）を不活性化する。ＰＰＴは、グルタミンシンセターゼを阻害し（Ｍｕｒａｋａｍｉら、１９８６；Ｔｗｅｌｌら、１９８９）、アンモニアの迅速な蓄積および細胞死を引き起こす。
【０１１３】
使用してもよいスクリーニング可能なマーカーは、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはその種々の色素生産性基質が知られている酵素をコードするｕｉｄＡ遺伝子；植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の生産を調節する生産物をコードするＲ−座遺伝子（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら、１９８８）；その種々の色素生産性基質（例えば、ＰＡＤＡＣ、色素生産性セファロスポリン）が知られている酵素をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、１９７８）；色素生産性カテコール類を変換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Ｚｕｋｏｗｓｋｙら、１９８３）；α−アミラーゼ遺伝子（Ｉｋｕｔａら、１９９０）；チロシンのＤＯＰＡおよびドーパキノンへの酸化を可能にする酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Ｋａｔｚら、１９８３）（次いで、縮合して容易に検出可能な化合物メラニンを形成する）；その色素生産性基質が存在する酵素をコードするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子；バイオルミネセンス検出が可能なルシフェラーゼ（ｌｕｘ）遺伝子（Ｏｗら、１９８６）；カルシウム感受性バイオルミネセンス検出において使用されうるエクオリン遺伝子（Ｐｒａｓｈｅｒら、１９８５）；または緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子（Ｓｈｅｅｎら、１９９５；Ｈａｓｅｌｏｆｆら、１９９７；Ｒｅｉｃｈｅｌら、１９９６；Ｔｉａｎら、１９９７；ＷＯ９７／４１２２８）を包含する。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子は、また、特に有用なレポーター遺伝子と考えられる（Ｓｈｅｅｎら、１９９５；Ｈａｓｅｌｏｆｆら、１９９７；Ｒｅｉｃｈｅｌら、１９９６；Ｔｉａｎら、１９９７；ＷＯ ９７／４１２２８）。緑色蛍光タンパク質の発現は、特定の波長の光による照明後に蛍光として細胞または植物中で可視化されうる。
【０１１４】
Ｖ．寄託情報
本明細書中に開示されるソルガム系統Ｔｘ３３６１の寄託は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９になされた。寄託日は、２００９年６月２５日であり、ソルガム品種Ｔｘ３３６１の寄託された種子の受託番号は、ＡＴＣＣ受託番号第ＰＴＡ−１０１４９号である。寄託における全ての制限は除かれ、該寄託は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．８０１−１．８０９を満たすものである。該寄託は３０年間、または最後の請求後の５年間、または特許有効期間（いずれか長い方）、寄託所において維持され、必要ならば、該期間の間、取り替えられるであろう。出願人は、寄託物に対するいずれの特許権も放棄しない。
【実施例】
【０１１５】
ＶＩ．実施例
下記の実施例は、本発明の好ましい具体例を説明するために包含される。実施例に開示される技術が本発明の実施においてよく機能するように発明者によって見出された技術を示すものであり、かくして、その実施の好ましい形態を構成すると考えられることは、当業者に明らかであろう。しかしながら、当業者は、本願明細書の開示に照らして、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、開示される特定の具体例において多くの変更を行って、いまだ同様の結果を得ることができることを認めるはずである。
【０１１６】
実施例１
ｉａｐ ｉａｐ遺伝子型を有する改善されたソルガム系統の開発
繁殖障壁は、栽培されるソルガム種および他の野生型ソルガム種との間の雑種の生産に対して存在する（Ｈｏｄｎｅｔｔら、２００５）。該障壁は、野生型ソルガム種の花粉管が卵に到達し、受粉する前にソルガムの雌しべの生長を止めるので、接合前である（Ｐｒｉｃｅら、２００６）。
【０１１７】
ＩＡｐ［Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｉｅｎ Ｐｏｌｌｅｎ（外来花粉の阻害）］と称される単一遺伝子座は、栽培ソルガム種（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ Ｌ． Ｍｏｅｎｃｈ）とＥｕ−ソルガムセクション外の野生型ソルガム種との間の生殖的隔離の一原因である。ホモ接合性劣性条件において、ｉａｐ ｉａｐ遺伝子型は、該生殖的隔離を排除し、ソルガム・ビカラーおよび野生型ソルガム種間での雑種回収を可能にする（Ｈｏｄｎｅｔｔら、２００５；Ｐｒｉｃｅら、２００６）。遺伝子型は、最初、ソルガム・ビカラーにおいてアクセッション「ＮＲ４８１」として同定されたが（ＬａｕｒｉｅおよびＢｅｎｎｅｔｔ、１９８９）、該アクセッションは、背丈高、色素性種皮、および倒伏に対する極度の感受性などの農業経済学的に望ましくない特徴を有する。遺伝子移入子孫において回収されたいずれの野生種遺伝子変種も、遺伝的背景が乏しいので、遺伝子移入計画における使用の可能性は、制限される。
【０１１８】
ｉａｐ ｉａｐ遺伝子型を有する改善されたソルガム・ビカラー生殖質は、有意に改善した農業経済学的性能ならびにｍｓ３遺伝学的雄性不稔性系の分離と共に開発された。該系統は、遺伝的雄性不稔性ＢＴｘ６２３（遺伝的雄性不稔性についてのｍｓ３対立遺伝子を含有するＢＴｘ６２３の誘導体）とＮＲ４８１（ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性の系統）との間の交雑から開発された。該雑種をＢＴｘ６２３ｍｓ３親に対して一度戻し交配した。ＴＸ２００５のカレッジ・ステーションにおいて、不稔性ＢＣ１Ｆ１子孫を自家受粉し、３−矮性背丈、白色果皮、無芒、色素性種皮の不在、および倒伏減少について選択した。ＢＣ１Ｆ２子孫を温室中で生育させ、手で除雄し、トウモロコシ花粉管生長について試験した（ＬａｕｒｉｅおよびＢｅｎｎｅｔｔ、１９８９）。Ｉａｐ遺伝子座における遺伝子型は、受粉後２４時間のソルガム雌しべの花柱の基部に対するトウモロコシ花粉管生長を質的に測定することに基づいた。花柱の基部に対するトウモロコシ花粉管生長を示す個体は、ｉａｐ ｉａｐと見なされる（図１）。選択されたｉａｐ ｉａｐ個体を自家受粉させ、子孫列を次シーズンにテキサス州カレッジ・ステーションで生育させた。倒伏、背丈、芒およびｍｓ３対立遺伝子の分離について、系統を評価した。ｍｓ３分離列内の選択された雄性稔性および不稔性植物（ＢＣ１Ｆ３）を同種交配した。同種交配個体をテキサス州ウェスラコで生育させ、ｍｓ３の安定した戻し交配分離、倒伏、背丈、成熟について評価し、トウモロコシ花粉管生長を用いて、Ｉａｐ遺伝子座遺伝子型を確認した（表１および２）。選択された系統は、雄性不稔性および稔性植物間で大量に同種交配して、提案される遺伝的ストックのブリーダー用の種子を生産した。選択された系統は、Ａ１細胞質雄性不稔性系における不稔性の維持系統である。
【０１１９】
ｉａｐ ｉａｐ遺伝子型の観察された発現、花柱の基部に対するトウモロコシ花粉管生長は、以前に報告されたよりも低頻度であり（ＬａｕｒｉｅおよびＢｅｎｎｅｔｔ、１９８９）、恐らく環境的に影響を受けている。Ｔｘ３３６１は、全ての試験した環境において、ＮＲ４８１と類似の発現を有した。該遺伝的ストックは、雌性親として使用して、外来ソルガム種およびおそらく属を超える種との種間交配を得ることができる。いずれの回収された遺伝子移入も、さらなる評価および交配についてより好ましい遺伝的背景にあるであろう。
【０１２０】
【表１】
１Ｄｗａｒｆ遺伝子座：各矮性遺伝子座におけるホモ接合性対立遺伝子を示す。
†ＮＲ４８１は、ホモ接合性劣性である２つの遺伝子座を有するが、Ｄｗ２の遺伝子型のみが知られている。
２果皮の色：Ｒ＝赤、Ｗ＝白、
３芒、色素性種皮、およびｍｓ３戻し交配分離：Ｙ＝有り、Ｎ＝無し
４花柱基底に対するトウモロコシ花粉管生長を有するソルガム雌しべの頻度。値は平均であり、列内の異なる文字は、有意に異なる平均α＝．０５
５倒伏：０−９のスケール。０＝０−１０％、９＝９０−１００％倒伏
【０１２１】
テキサス州カレッジ・ステーションのテキサスＡＧＲＩＬＩＦＥＴＭ（登録商標）リサーチソルガム交配計画において、Ｔｘ３３６１系統が選択され、評価され、増幅された。ＡＧＲＩＬＩＦＥＴＭソルガム開発プログラムのナンバリングシステムを用いて、該遺伝的ストックをＴｘ３３６１と名付けた。Ｔｘ３３６１系統は、表現型評価の対象であり、その結果を下記の表２に示す。
【０１２２】
【表２−１】
【表２−２】
＊これらは、典型的な値である。値は、環境によって変化しうる。
【０１２３】
実施例２
モロコシ属親系統Ｔｘ３３６１ｍｓ３との属間雑種生産
２００７年の秋に、Ｔｘ３３６１ｍｓ３植物をサッカラム・スポンタネウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）、市販のサトウキビ［サッカラム・オフィシナラム（Ｓ． ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）ｘサッカラム・スポンタネウム（Ｓ． ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）］、およびミスケイン（miscane）（ススキ属 ｘ サトウキビ属）由来の花粉で受粉した。
【０１２４】
Ｔｘ３３６１ｍｓ３とサトウキビとの交配が成功し、１５００を超える推定Ｆ１種子が収穫された（受粉した全１７植物体において生産された）。２６個の推定Ｆ１雑種幼植物（７５個の種子から生産された）を植え、例示的植物を図２に示す。
【０１２５】
Ｔｘ３３６１ｍｓ３ ｘ サッカラム・スポンタネウムおよびＴｘ３３６１ｍｓ３ ｘ ミスカンサス・シネンシス（Ｍ． ｓｉｎｅｓｉｓ）の受粉は、受精が起こり、胚が形成したので、成功したが、発達は典型的に、内胚乳崩壊によって妨害された。Ｔｘ３３６１ｍｓ３とミスケインとの雑種において、胚レスキューが成功し、１６個の推定雑種が回収された。したがって、内胚乳崩壊が起こる場合、胚のイン・ビトロ培養がＦ１雑種を回収するのに有効であることが見出された。
【０１２６】
正常（ホモ接合性Ｉａｐ）Ｔｘ６２３ｍｓ３との受粉は、決して、受精、胚または内胚乳発達の証拠を示さなかったので、これらの雑種の全てにおいて、Ｔｘ３３６１ｍｓ３における変異体ｉａｐの利用は、非常に重要であった。
【０１２７】
２００８年に、ソルガム ｘ サトウキビおよびソルガム ｘ ミスケインの多くの雑種が生産され、温室で栽培された。また、多くのソルガム ｘ ミスカンサス・シネンシス胚が生産された。これらの植物は、その種子親であるＴｘ３３６１に似た表現型を示さなかった。該属間雑種は、種子またはクローン的に繁殖させたバイオ燃料作物として、または１の種から別の種へ遺伝子および形質を移入する手段として、直接使用される可能性がある。移入のための例示的プロトコールを図３および４に示す。
【０１２８】
実施例３
ソルガムとサトウキビとの雑種の生産および分析
開花時期がサトウキビの開花時期と一致するように、７月中旬から９月中旬まで、系統Ｔｘ３３６１の種子を温室内のポットに植えた。開花開始時、葯の表現型に基づいて、Ｔｘ３３６１の雄性不稔性植物を同定し、袋を被せた。ルイジアナ州ホーマにあるＵＳＤＡ−ＡＲＳシュガーケイン・リサーチ・ユニットで、２００７年および２００８年の９月下旬〜１１月上旬に、ソルガムとサトウキビとの受粉を行った。１月および２月にカレッジ・ステーションで、さらなる受粉を行った。全部で６７個の基本的な商業的サトウキビ育種系統を雄性親として用いた。
【０１２９】
ホーマで行った受粉は、ソルガムの円錐花序にサトウキビ花粉を振り掛け、ソルガムの円錐花序をサトウキビの穂でこすることによって完了した。次の年、１〜３個のソルガム円錐花序を単一のサトウキビ親と共に置き、サトウキビの穂を軽くたたき、次いで、ソルガムの円錐花序をサトウキビの穂の中に擦りつけることによって交雑を行った。該工程は、連続して３または４日繰り返した。これらの交雑完了後、受粉したソルガム植物を種子発生および成熟のために、カレッジ・ステーションに戻した。カレッジ・ステーションで行われるソルガムｘサトウキビ交雑の場合、各ソルガム円錐花序を一回受粉し、前年にホーマで実施された同じ方法を用いて受粉を行った。
【０１３０】
種子の準備
種子は、３年にわたって受粉後各々、平均４６、４１および２７日で母性親から取り出した。１年目に得られた種子は、発芽の３０〜９０日前に貯蔵されたが、次の年の種子は、収穫直後に発芽した。種子における高頻度の胎生のため、収穫および発芽のタイムラインが減少した。収穫後かつ発芽前に、まず、キャプタン（Captan）およびアプロン（Apron）の液体懸濁液で少なくとも１時間半、種子をコーティングし、次いで、３０％漂白溶液中で２０分間浸漬することによって、種子を表面滅菌した。表面滅菌後、種子を滅菌水でリンスし、１０ｍｇ Ｌ−１グリシン、１０ｍｇ Ｌ−１ Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ、１０ｍｇ Ｌ−１ Ｌ−チロシン、１００ｍｇ Ｌ−１イノシトール、および３０ｇ Ｌ−１シュークロースを補足し、０．７％寒天（植物組織培養グレード、Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ， ＫＳ）で固化させたムラシゲ−スクーグ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２）基礎塩およびビタミン培養培地を含有するペトリ皿中に胚を上にして置いた（Ｓｈａｒｍａ，１９９９）。全てのペトリ皿をパラフィルムで密閉し、１日１４時間に設定した育成用照明下、２７〜３０℃の一定温度に置いた。根およびシュートの両方において良好な発達を示した全ての種子を４’’ポットに植えた。いったん確立すると、それらを温室に移した。
【０１３１】
属間雑種植物の確認
属間雑種は、最初、形態学によって分類された。それらが発達するにつれて、全ての雑種は、父性親によって譲られない形質を有するほか、母性親が有しなかったサトウキビの多くの特徴（背丈、腋芽、成熟）を示した。これらの植物は、体細胞染色体数によって、属間雑種として確認された。染色体スプレッドは、ＪｅｗｅｌｌおよびＩｓｌａｍ−Ｆａｒｉｄｉ（１９９４）によって記載された方法に下記の変更を加えた方法を用いて、根端から調製された。若い活発に生長している根端を室温にて２．７５時間、α−ブロモナフタレンの飽和水溶液で前処理し、３：１ ９５％エタノール／氷酢酸（３：１ ｖ／ｖ）中で一晩固定した。次いで、根端を蒸留水で数回リンスし、０．２Ｍ ＨＣｌ中で１０分間加水分解し、蒸留水中で１０分リンスした。細胞壁を５％セルロース（Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０， Ｙａｋｕｌｔ Ｈｏｎｓｈａ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｔｏｋｙｏ）および１．０％ペクトラーゼＹ−２３（Ｓｅｉｓｈｉｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｔｏｋｙｏ）の水溶液で、ｐＨ４．５にて３７℃で３５〜６０分間消化し、蒸留水で３回リンスした。分裂組織をエタノール／氷酢酸（３：１）溶液中、透明ガラススライド上に置き、漬け込み、先の細い鉗子で広げ、室温で２日間風乾し、アズール・ブルー（Azure Blue）で染色した。根端スプレッドをツァイス・ユニバーサルＩＩ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．， Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、６３Ｘおよび１００Ｘアポクロマート対物レンズで調べた。オプトニクスＶＩ−４７０システム（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．， Ｇｏｌｅｔａ， ＣＡ）で画像を獲得し、デジタル保存し、オプティマス（ｖ．６．１）画像分析ソフトウェア（Ｏｐｔｉｍａｓ Ｃｏｒｐ．， Ｂｏｔｈｅｌｌ， ＷＡ）で加工した。
【０１３２】
雑種種子セットに対するサトウキビポリネーター（pollinator）の影響
２年目にホーマで行われた各交雑について、サトウキビ親植物、受粉日、受粉場所、花粉量、小花／円錐花序および生じた幼植物を記録した。サトウキビ花粉量は、解剖顕微鏡下で乾燥した柱頭を評価し、それらを軽い、中程度または重い（「軽い」は観察可能な花粉がほとんど無いか、または無いことを意味し、「中程度」ランクは、花粉がいくつかの柱頭で観察された場合に割り当て、「重い」ランクは、完全な被覆が観察された場合に割り当てられた）と格付けすることによって、雑種種子が収穫されたときに測定された主観的測定値であった。３年目にカレッジ・ステーションで行われた各交雑について、サトウキビ親植物、受粉日、種子／円錐花序および生じた幼植物を記録した。
【０１３３】
場所、受粉日およびサトウキビポリネーターの種子セットおよび花粉量に対する相対的影響を決定するために、ＳＡＳ ｖ９．１のＰＲＯＣ ＧＬＭを用いた。少なくとも３回の受粉に用いられたサトウキビ雄だけが該分析に含まれた。全ての影響を一定とみなし、ポリネーターを含む相互作用だけを分散分析に含めた。
【０１３４】
２００７年の雑種種子生産、確認および生長
２００７年（１年目）の秋に、１７種類の異なるポリネーターを用いて、全部で２４回の受粉を行った（表３）。柱頭反応に基づいて、受粉後に受精が起こったことは明らかであった。種子が発生し始めたが、サイズおよび生長速度は、正常なソルガムの自家受粉または他家受粉と比べて減少した。種子を発芽（収穫および貯蔵後）のために準備したとき、種子発生および発生後の胎生の間の胚喪失が一般的であることは明らかであり、さらなる分析は、３２％が胎生であり、３９％に胚がないことを示した。かなりの割合の残りの種子が発芽し、植物を生産した。これらの植物の全てが属間雑種であり、それらは、非常に生長が乏しいものから非常に生長力のあるものまで幅広い表現型を反映した。
【０１３５】
これらの受粉から、最も良好な雑種のうち２３個を温室内のポットに移植した。これらの植物の全てがサトウキビに類似した形態学的特徴を有していた（図５）。これらの雑種についての体細胞染色体数は、５６〜６４の範囲であり、１０個の染色体がソルガム由来であり、残りの染色体がサトウキビ属由来であった。該雑種は、短くて幅の広い少数の葉を有するＴｘ３３６１と比べて、長くて幅の狭い多数の葉を有する。発達において、２３個の雑種が幅広い範囲の生長力および生長性質を示し、これらの雑種のうち２つが優れた生長および発達を示した。これらの雑種は、生長力があり、サトウキビのようによく分けつしたが、各々、ソルガムに特有の形態学的形質、例えば、節のある支柱根および／または葉鞘における過剰なワックス粉を有した。７ヶ月で、雑種Ｌ０７−１１Ｓの茎は３．１ｍであったが、雑種Ｌ０７−９Ｓの茎は２．７ｍであった（図５Ａ）。これらの雑種のいずれも、サトウキビのように光周期感受性であり、カレッジ・ステーションにおいて１２月中旬から１月に開花したが、一方、Ｔｘ３３６１は、播種日にかかわらず、約６５日で開花する。これらの雑種の円錐花序は、サトウキビのものよりわずかに小型であり、検定交雑の試みにより、これら２つの特定の雑種の雄性および雌性不稔性の両方を確認した。８月に、両雑種の数本の茎を切断して、栄養繁殖および糖分布について試験した。栄養繁殖は成功し、これらの雑種中の糖濃度は、サトウキビにおいて見出されるパターンと類似し、より成熟した節間において糖濃度は増加した（図６）（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ａｎｄ Ｂｏｔｈａ， １９９７）。
【０１３６】
さらなる雑種種子生産およびプロセスの増強（２００８／２００９）
２００８年に、全部で１５５個のソルガム円錐花序（全部で７４，３００個の小花）を受粉した。これらの受粉から、１０，３４７個の種子を回収し、その結果、平均１４％の種子セットをもたらした。種子セットの割合は、２００９年の受粉において測定されなかったが、２００８年に観察されたのと同様なようであった。しかしながら、種子がより早期に収穫され、胎生による喪失が回避されたので、発芽は、２００８年と２００９年の受粉の間で実質的に改善された。２００９年に、種子がより早期に収穫されて（受粉後２８日 対 受粉後４０日）胎生による喪失を回避したので、発芽は２００８年から２００９年に増加した。さらに、２００８年の発芽は、胚が種子外被を通って生長できないことにより、さらに減少し、それゆえ、２００９年の種子の全てにおいて、培地に植える前に果皮が除去された。技術が改善されるにつれて、発芽率は、２００７年の２．５％から２００８年の５．７％に、２００９年では３３％に改善した。
【０１３７】
表３：ソルガムｘサトウキビ交雑において用いられたサトウキビ親
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【０１３８】
合わせた２００８／２００９受粉由来の全部で１３４８本の幼植物をポットに植え、温室に移動させた。これらの雑種に存在する表現型バリエーションは広範囲であったが、全て、形態学的に、ソルガムよりもサトウキビに似ていた。２００９年の春に、４８５個の雑種を選択し（生長力に基づいて）、カレッジ・ステーションの近くのスペース・プラントナーサリーに移植した（表３）。これらの雑種は、２００７年の交雑から評価された雑種の限定されたセットにおいて観察された生長および発達パターンに従うと予想される。
【０１３９】
種子セットおよび発芽に対するポリネーター親の影響
分散分析は、ポリネーター親に起因して種子セットに対する有意な影響を示した（表４）。ポリネーターに起因するバリエーションの範囲は、明らかに、ある特定のサトウキビ品種がＴｘ３３６１における属間雑種の生産のためのより良好なポリネーターであることを示す。Ｌ０６−０２４、ＨｏＣＰ０５−９０４およびＨｏ０６−５６２などのサトウキビポリネーターは、最も有効な雑種種子生産を実証する（表５）。
【０１４０】
【表４】
【０１４１】
【表５】
＊ 少なくとも３回の受粉で使用されたポリネーターのみを該分析に含めた。
＊＊ 花粉量評価は、１（軽い）、２（中程度）および３（重い）であった。
【０１４２】
サトウキビにおける花粉散布が遺伝子型および環境によって影響されることは知られており（ＭｏｏｒｅおよびＮｕｓｓ，１９８７）、分散分析は、花粉量がポリネーター親および受粉日によって影響されたことを確認した（表４）。低花粉量を有する系統は、一貫して、低い割合の種子セットを有する交雑をもたらしたが、必ずしも高花粉量が高い割合の種子セットを示したわけではない。上位７つのサトウキビポリネーターのうち６個（種子セットパーセンテージによって定義される）は、平均以上の花粉量を有したが、平均より低い割合の種子セットを有する雄花は、花粉量において変動した（表５）。これらの結果は、雄花が良好な花粉を生産するだけではなく、Ｔｘ３３６１との好ましい遺伝的および／またはゲノム的和合性を有さなければならないことを意味する。
【０１４３】
２００９年の分散分析データは、受粉環境およびサトウキビポリネーターのどちらも発芽割合に影響しないことを示した。種子生産および発芽を管理するための現在の技術に基づいて、使用されるポリネーターおよび受粉場所に拘わらず、該種子の２５−４０％が発芽し、植物を生産すると予想するのが妥当である。
【０１４４】
実施例４
ソルガムの広い雑種における花粉管生長
本明細書中で明らかにされた成功した雑種形成を考慮して、Ｔｘ３３６１ソルガム植物をさらに、付加的な属の植物由来の花粉を用いて受粉させた。受粉後、花粉管生長を観察し、記録した（表６）。花柱と表示したカラムの値は、花粉管生長量を示し、より高い値が大きな生長を示す。
【０１４５】
【表６−１】
【表６−２】
【表６−３】
【０１４６】
本明細書中に開示および主張される方法の全ては、本願の開示を踏まえて、過度の実験を行うことなく実施することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい具体例に関して記載されているが、発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載の方法および方法の工程または工程の順序に変更を加えてもよいことは、当業者に明らかであろう。より詳細には、化学的かつ生理学的に関連するある特定の剤を本明細書に記載の剤と置き換えてもよく、同一または類似の結果が達成されることが明らかであろう。当業者に明らかな全てのかかる類似置換物および修飾は、添付の特許請求の範囲によって規定される発明の精神、範囲および概念内にあると考えられる。
【０１４７】
参考文献
下記の参考文献は、それらが典型的な手順または本明細書に示されるものを補足する他の詳細を提供する程度まで、特に出典明示により本明細書の一部とされる。
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Ｒｅｉｃｈｅｌら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３ ： ５８８８−５８９３． １９９６．
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Ｔｈｉｌｌｅｔら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３：１２５００−１２５０８， １９８８．
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Ｔｗｅｌｌら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９１：１２７０−１２７４， １９８９
Ｖａｓｉｌら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ９１：１５７５−１５７９， １９８９．
Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：６６２４−６６２８， １９８７．
Ｗａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １２（８）：３３９９−３４０６， １９９２．
Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ， １５１：５６５−５８４， ２００１．
ＹａｎｇおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：４１４４−４１４８， １９９０．
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【図１Ａ−Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本願は、米国仮出願第６１／１０３，０８５号（２００８年１０月６日出願）、および第６１／０８３，４３６号（２００８年７月２４日出願）に対する優先権を主張する。上記出願は、出典明示により、全体として本願明細書の一部とされる。
本発明は、合衆国農務省（ＵＳＤＡ）によって授与されたＣＳＲＥＥＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ登録番号第２００４−３５３００−１４６８６号の下で政府の支援で完成した。合衆国政府は、本願においてある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、概して、植物遺伝学の分野に関する。より詳細には、属間雑種植物ならびにその生産および使用方法に関する。
【０００３】
２．関連分野の記載
２０２５年までに、世界のエネルギー消費は、２００２年のレベルから５７％増加すると予測される。該要求に応えるために多くの異なる代替エネルギー源が用いられるが、２０２２年までに年間少なくとも３６０億ガロンの代替燃料の使用を燃料生産者に要求する２００７年のＥｎｅｒｇｙ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ Ａｃｔにおいて記載された目標を満たすためには、バイオマス由来のエネルギー生産が必要とされることは明らかである。デンプン由来の代替燃料の生産のみでは、これらの目標を達成できないであろう。これらの生産目標を達成するためには、研究におけるかなりの投資および工業的責任を必要とするであろう。この新規なバイオ燃料産業の開発は、一貫した安定なバイオマス供給を保証し、それにより、バイオマス変換プラントを建築するのに必要な莫大な投資を正当付ける専用のバイオエネルギー供給原料の生産を基礎としなければならない。現在栽培される飼料用および食料用作物由来の作物残渣を用いることができるが、それらは、おそらく、必要に応じて専用のエネルギー作物からバイオマス生産を補うために役立つだけである。
【０００４】
これまでに、バイオ燃料生産専用の作物の開発および改良について、比較的ほとんど重要視されていなかった。専用のバイオ燃料供給原料として最も一般的に提案された種のいくつかは、スイッチグラス［パニカム・ヴァーガタム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）］、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｓｐ．）、サトウキビ／エネルギーケイン（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．）、ミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｐ．）およびソルガム［ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）］を包含する。現在、これらの植物種のセルロース性バイオエネルギーの可能性の強化に焦点を当てた農業経済学、育種およびゲノム的計画がある。しかしながら、目下、専用のバイオ燃料供給原料の望ましい特徴を全て具体化する所定の作物種はない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
第一の態様において、本発明は、ソルガム親植物を異なる属由来の単子葉植物と交雑させて子孫を得ることによって生産された属間植物を提供する。ソルガム親植物は、ソルガムの劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性であってもよい。ある特定の態様において、例えば、単子葉親植物は、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）植物などの草である。例えば、第２の単子葉親植物は、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、サトウキビ属とススキ属の交雑種、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）、ソルガネトラム属（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）またはトウモロコシ属（Ｚｅａ）植物であることができる。ある特定の具体例において、第２の単子葉植物は、ペニセタム・パーパレウム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）、パニカム・ヴァーガタム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、ペニセタム・シリアレ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｃｉｌｉａｒｅ）、ペニセタム・グラウカム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、アンドロポゴン・ゲラルディイ（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇｅｒａｒｄｉｉ）、アンドロポゴン・ハリイ（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｈａｌｌｉｉ）、シザキリウム・スコパリウム（Ｓｃｈｉｚａｃｈｙｒｉｕｍ ｓｃｏｐａｒｉｕｍ）、ソルガストラム・ヌタンス（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ ｎｕｔａｎｓ）、アルンド・ドナックス（Ａｒｕｎｄｏ ｄｏｎａｘ）、トリプシカム・ダクチロイデス（Ｔｒｉｐｓｉｃｕｍ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ）、スポロボルス・エイリオデス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ ａｉｒｉｏｄｅｓ）、ミスカンサス・フロリデュルス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｆｌｏｒｉｄｕｌｕｓ）、ミスカンサス・シネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ゼア・メイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ゼア・ニカラグエンシス（Ｚｅａ ｎｉｃａｒａｇｕｅｎｓｉｓ）、ゼア・ペレニス（Ｚｅａ ｐｅｒｅｎｎｉｓ）、またはゼア・ジプロペレニス（Ｚｅａ ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ）植物である。特定の態様において、ソルガム植物および／または第２の親植物は、１以上のトランス遺伝子を含む。
【０００６】
かくして、一の具体例において、本発明は、ソルガム親植物から生産した属間雑種植物を提供する。ある特定の態様において、ソルガム親植物は、ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）植物またはソルガム・ビカラーと野生のソルガム品種との雑種であり、ここに該植物物は、ソルガムの劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性である。さらなる具体例において、ソルガム親植物は、雄性不稔形質、例えば、細胞質または遺伝子性雄性不稔性対立遺伝子（例えば、ソルガムのｍｓ３）を含む。ある特定の具体例において、ソルガム親植物は、農学的にえり抜きのソルガム植物として定義されうる。当業者は、「農学的にえり抜きの」なる語が、生産者が商業的に意味のある産物を収穫することが可能になる有益な表現型に寄与する区別可能な形質の頂点を示すことを理解する。かかる形質は、収穫量、活力、病害耐性、環境ストレス耐性、および害虫耐性を含みうる。さらに特定の具体例において、ソルガム植物は、バイオ燃料生産に適応した農学的にえり抜きのソルガム植物であってもよい。またさらなる具体例において、ソルガム親植物は、ソルガム系統Ｔｘ３３６１の植物であってもよい。
【０００７】
別の態様において、本発明は、本明細書中に開示される属間雑種植物の部位を提供する。属間雑種植物の部位は、限定するものではないが、プロトプラスト、細胞、配偶子、分裂組織、根、雌しべ、葯、花、種子、胚、茎、または葉柄を包含する。ある特定の態様において、属間植物種子が提供される。いくつかの場合、属間植物種子は、機能的内胚乳を含むものとして定義されうる。さらなる態様において、植物種子は、殺害虫剤、殺真菌剤（例えば、Ｕ．Ｓ．特許第３，８４９，９３４号参照）、養分または水もしくは温度感受性ポリマーを含む人工種子コートを含んでいてもよい。ある特定の態様において、種子コーティングは、種子の機械的取扱性、種子発芽、幼植物確立または生育を改善するための剤を含む。種子のコーティングに使用されうるプロセスは、例えば、Ｕ．Ｓ．特許第２，７９９，２４１号、第３，０８９，８２４号、第３，１７７，０２７号、第３，１９６，８２７号、第３，２０７，８２４号、第３，２４１，５２０号、および第３，２５３，９９４号（出典明示により、本明細書の一部とされる）に開示される。当業者は、種子コートが、例えば、生存能力（例えば、発芽する種子のパーセント）または植物種子の貯蔵能力を増加させるために用いてもよいことを認識するであろう。またさらなる態様において、属間植物部位は、ソルガム染色体の倍加数を含む植物、例えば、２ｎソルガム染色体を含む植物配偶子の部位が提供される。当業者は、かかる配偶子が、ある特定の態様において、属間植物を微小管阻害剤または染色体倍加剤、例えば、化学的染色体倍加剤（例えば、コロチシン（colchicine））で処理することによって生産されうることを理解するであろう。
【０００８】
また別の態様において、本明細書中に提供される属間植物は、１以上のトランス遺伝子を含むものとして定義されうる。例えば、属間植物は、病害耐性、昆虫耐性、除草剤耐性、乾燥耐性、耐塩性、雄性不稔性、バイオマス増加または糖含量増加を与えるトランス遺伝子を含むことができる。特定の具体例において、トランス遺伝子は、属間雑種植物中に直接導入することができる。またさらなる態様において、トランス遺伝子は、親植物から受け継いでいてもよい。該親植物は、直接形質転換されていてもよく、またはその祖先由来のトランス遺伝子を受け継いでいてもよい。いくつかの態様において、本発明は、ソルガム親植物を第２の植物と交雑させ、ここに、該ソルガム親植物および／または第２の植物がトランス遺伝子を含み、次いで、該トランス遺伝子を含む子孫植物を選択することを含む方法を提供する。ある特定の態様において、本発明のトランスジェニック植物を交配させることを含む方法は、マーカーによって補助された選択によって（例えば、トランス遺伝子またはその産物の検出によって）、子孫植物を選択することを含んでいてもよい。
【０００９】
さらなる具体例において、本明細書中に記載の属間雑種植物の子孫植物が提供される。特定の具体例において、該子孫植物は、栄養繁殖または接ぎ木によって生産される。いくつかのさらなる態様において、子孫植物は、種子から生長しうる。
【００１０】
またさらなる具体例において、本明細書中に記載される属間植物の再生可能な細胞の組織培養が提供される。再生可能な細胞は、ある特定の態様において、属間植物の胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、葯、雌しべ、花、種子、ボールまたは茎由来であることができる。かくして、いくつかの態様において、組織培養再生可能細胞から再生された属間植物が提供される。
【００１１】
また別の具体例において、属間雑種植物またはその部位を得、そこから商業的製品を製造することを含む商業的製品の製造方法が提供される。ある特定の態様において、商業的製品は、発酵性（例えば、バイオ燃料）原料、シュークロース汁、バガス、エタノール、バイオジーゼル、糖類、サイレージ、穀物粉または動物飼料として定義される。いくつかの態様において、属間雑種植物はソルケイン（Ｓｏｒｃａｎｅ）植物であり、商業的製品は発酵性（例えば、バイオ燃料）原料、ソルケイン汁、糖蜜、バガス、エタノール、バイオジーゼル、バイオプラスチックまたは糖類である。例えば、発酵性原料は、エタノール（例えば、出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第５，０５３，２３１号および第６，９２７，０４８号参照）、バイオジーゼル、化学物質（例えば、酢酸およびアンモニア）などのバイオ燃料を生産するために使用してもよく、またはガス化のために使用してもよい。ある特定の態様において、属間雑種植物またはその部位は、セルロース性供給原料として使用されうる。例えば、属間雑種由来のセルロース性原料は、酵素的に、および／または化学的に、エタノール発酵のための遊離炭水化物に消化されてもよい（例えば、出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第４，３５５，１０８号参照）。したがって、いずれかのかかる商業的製品は、本願発明の一部を構成する。
【００１２】
ある特定の態様において、本発明は、部分的または実質的に精製したソルケイン汁、ソルケイン植物由来の糖液を提供する。ある特定の態様において、ソルケイン汁は、ソルガムポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を含むものとして定義されうる。例えば、ソルケイン汁は、ソルガムの劣性ｉａｐ対立遺伝子をコードしているソルガムのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を含むものとして定義されうる。さらなる態様において、該汁は、ソルガムおよびサトウキビＤＮＡを含むものとして定義されうる。
【００１３】
さらなる具体例において、「ソルケイン（Ｓｏｒｃａｎｅ）」属間雑種植物は、ソルガム親植物をサトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）（またはサトウキビ属雑種、例えば、サトウキビ属とススキ属（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）の雑種植物）と交雑することによって生産され、ここに、ソルガム親植物は、ソルガムの劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性である。例えば、ソルガム親植物は、ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）植物であってもよく、またはソルガム・ビカラーと野生ソルガム種との雑種であってもよい。サトウキビ属親植物のいくつかの例には、限定するものではないが、サッカラム・スポンタネウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）、サッカラム・オフィシナラム（Ｓ． ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、またはサッカラム・オフィシナラム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）とサッカラム・スポンタネウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）との雑種植物がある。ある特定の態様において、ソルケイン植物は、ソルガム親植物とサトウキビ属植物のＬ０６−０２４、ＨｏＣＰ０５−９０４またはＨｏ０６−５６２品種との間の交雑として生産されうる。
【００１４】
またさらなる態様において、本発明は、雄性不稔性形質を含むソルガム植物であって、ソルガムの劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性の植物またはその部位を提供する。例えば、ソルガム植物は、細胞質性または遺伝的雄性不稔性であってもよい。いくつかの態様において、ソルガム植物は、ソルガムのｍｓ３遺伝的不稔性性質を含んでいる。ある特定の態様において、該植物は、Ｔｘ３３６１系統の植物であってもよい。
【００１５】
またさらなる態様において、本発明は、（ａ）ソルガム植物と、ソルガムとは異なる種の第２の単子葉植物とを交雑させ、ここに、該第１のソルガム植物はソルガムのｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性であり、雌性親植物として使用され、次いで（ｂ）該交雑から得られる属間雑種胚を得る工程を含む、属間胚の生産方法を提供する。ある特定の場合、該方法は、さらに、（ｃ）該雑種胚を生育させて属間雑種植物を生産する工程を含みうる。ある特定の態様において、本明細書に提供される方法は、属間雑種植物を生産するための方法として定義されうる。さらなる態様において、本明細書に記載の方法において使用するためのソルガム親植物は、雄性不稔性であり、例えば、遺伝的雄性不稔性であるか、または細胞質性雄性不稔性である。
【００１６】
またさらなる態様において、本発明の方法は、複数の属間雑種植物を生産し、いずれかの親と異なる特徴を有する属間雑種を選択することを含みうる。ある具体例において、該方法は、さらに、（ｄ）属間雑種植物を戻し交配して単子葉植物を得る工程を含む。さらなる具体例において、該方法は、さらに、該植物を戻し交配して、遺伝子移入による少なくとも１つの形質または遺伝子についてホモ接合性の遺伝子移入子孫植物を生産することを含む。
【００１７】
ある特定の態様において、本発明にしたがってソルガム植物に交雑される第２の親植物は、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）の植物である。例えば、第２の親植物は、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、サトウキビ属とススキ属の雑種、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）、ソルガネトラム属（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）またはトウモロコシ属（Ｚｅａ）植物であってもよい。ある特定の具体例において、第２の単子葉植物は、ペニセタム・パーパレウム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）、パニカム・ヴァーガタム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、ペニセタム・シリアレ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｃｉｌｉａｒｅ）、ペニセタム・グラウカム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、アンドロポゴン・ゲラルディイ（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇｅｒａｒｄｉｉ）、アンドロポゴン・ハリイ（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｈａｌｌｉｉ）、シザキリウム・スコパリウム（Ｓｃｈｉｚａｃｈｙｒｉｕｍ ｓｃｏｐａｒｉｕｍ）、ソルガストラム・ヌタンス（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ ｎｕｔａｎｓ）、アルンド・ドナックス（Ａｒｕｎｄｏ ｄｏｎａｘ）、トリプシカム・ダクチロイデス（Ｔｒｉｐｓｉｃｕｍ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ）、スポロボルス・エイリオデス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ ａｉｒｉｏｄｅｓ）、ミスカンサス・フロリデュルス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｆｌｏｒｉｄｕｌｕｓ）、ミスカンサス・シネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ゼア・メイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ゼア・ニカラグエンシス（Ｚｅａ ｎｉｃａｒａｇｕｅｎｓｉｓ）、ゼア・ペレニス（Ｚｅａ ｐｅｒｅｎｎｉｓ）、またはゼア・ジプロペレニス（Ｚｅａ ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ）植物である。ある特定の態様において、第２の単子葉植物は、サトウキビ属、例えば、サッカラム・オフィシナラム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、サッカラム・スポンタネウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）、またはサッカラム・オフィシナラムとサッカラム・スポンタネウムとの雑種であってもよい。いくつかの他の態様において、第２の単子葉植物は、ススキ属植物、例えば、ミスカンサス・シネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）であってもよい。
【００１８】
いくつかの態様において、戻し交配は、属間雑種またはその子孫と、非ソルガム親植物［例えば、アンドロポゴン類（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｅａｅ）親植物］、そのクローンまたは同じ種からのバイオエネルギー収率に関して少なくとも９０％同一の植物との間で実施されうる。ある特定の他の態様において、戻し交配は、属間雑種またはその子孫と、ソルガム親植物との間で実施されうる。戻し交配は、例えば少なくとも２〜１０回戻し交配するような、連続的な戻し交配であることができる。
【００１９】
ある特定の具体例において、該方法は、（ｉ）第２の単子葉植物から花粉を収集し、次いで、（ｉｉ）ソルガム親植物の花に該花粉を受粉することを含みうる。
【００２０】
ある特定の態様において、本明細書に記載の属間胚を生産する方法は、さらに、胚および機能的内胚乳を含む雑種種子を生産するものとして定義されうる。ある特定の他の具体例において、雑種種子は、胚および非機能的内胚乳を含みうる。本発明の一の態様において、胚（例えば、非機能的内胚乳に関連した胚）は、属間雑種植物を生産するための組織培養方法を用いてレスキューされうる。例えば、ある態様において、工程（ｂ）はさらに、交雑から得られた胚を胚レスキューによって単離することを含んでいてもよい。
【００２１】
またさらなる態様において、属間雑種植物における発現に関する特徴は、バイオマス収率、改善された生長形質またはある種の望ましい形質を包含しうる。かかる特徴は、ハイブリダイゼーションのために選択された特定の親系統の結果として、雑種強勢から得られうる。該特徴には、例えば、バイオマス含量、稔性、栄養繁殖、光周期無感覚、背丈、茎直径、乾燥耐性、種子サイズ、発芽、保存後の種子生存率、またはいずれか他の目的の特徴を包含しうる。例えば、バイオマス含量は、シュークロース含量またはセルロース含量を改変することによって改善されうる。バイオマス収量を比較または定量するために、当業者によく知られた標準的なバイオマス分析手法を用いてもよい。また、標準的なバイオマス分析手法の詳細なプロトコールは、合衆国ナショナル・リニューアル・エネルギー・ラボラトリー（U.S. National Renewable Energy Laboratory）から自由に入手可能である。例えば、シュークロースまたはセルロース含量は、ＨＰＬＣまたは近赤外線反射スペクトロスコープによって測定されうる。
【００２２】
ある特定の態様において、属間雑種植物または種子またはＦ１子孫は、稔性を増加するための染色体倍加剤、例えば、化学染色体倍加剤（例えば、コルチシンまたは機能的等価物）で処理してもよい。属間雑種植物の染色体倍加剤での処理は、自殖可能な稔性または部分的稔性異質倍数性植物を生成するために使用されうる。処理後、属間雑種植物または種子またはＦ１子孫は、雄性および／または雌性親植物としての稔性について評価および選択されうる。
【００２３】
さらなる態様において、上記方法から生産された属間雑種は、種子または植物の形態であってもよい。
【００２４】
ある特定の具体例において、上記方法によって生産された属間雑種種子、植物またはその部位も提供される。他の態様において、上記方法によって属間雑種植物または種子からクローン的に繁殖した子孫属間雑種植物またはその部位も提供される。さらなる態様において、上記方法によって調製された遺伝子移入による形質または遺伝子を有する単子葉子孫も提供される。
【００２５】
本発明の方法および／または組成物との関連で考察される具体例は、本明細書に記載されるいずれか他の方法または組成物に関して用いられうる。かくして、一の方法または組成物に関連する具体例は、本発明の他の方法および組成物にも同様に応用してもよい。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「ソルケイン（Ｓｏｒｃａｎｅ）」なる語は、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）植物とサトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）植物（またはその雑種）との間の属間雑種をいう。ある特定の態様において、ソルケイン植物またはその植物部位は、モロコシ属由来の少なくとも１つの染色体または染色体セグメントおよびサトウキビ属由来の少なくとも１つの染色体または染色体セグメントを含むものとして定義されうる。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、核酸に関して「コードする」または「コードしている」なる語は、当業者により本願発明が容易に理解出来るようにするために使用されるが、これらの語は、各々、「含む」または「含んでいる」と交換可能に使用されうる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は１以上を意味しうる。特許請求の範囲で使用される場合、「含む」なる語と共に使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」なる語は、１または１よりも大きい数を意味しうる。
【００２９】
特許請求の範囲で使用される「または」なる語は、選択肢のみを示すことまたは選択肢が互いに排除することを明示的に示されないかぎり、「および／または」を意味するが、該開示は選択肢のみおよび「および／または」を示す定義を支持する。
【００３０】
本願を通して、「約」なる語は、ある値は、該値を決定するために使用されている装置、方法の誤差の先天的な変動、または研究対象に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００３１】
本発明の他の目的、特徴および利点は、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内の種々の変化および修飾は、詳細な説明から当業者に明らかなので、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい具体例を示しているが、説明目的でのみ与えられていることを理解すべきである。
【００３２】
図面の簡単な説明
下記の図面は、本明細書の一部を校正紙、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、１以上の図面と本明細書に提供される特定の具体例についての詳細な説明とを組み合わせて参照にして、よりよく理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１Ａ−Ｂ： ソルガム雌しべ上／中における花粉生長におけるｉａｐ遺伝子の影響。図１Ａ： トウモロコシ花粉管生長を示しているＴｘ３３６１（ｉａｐ ｉａｐ）雌しべ。矢印は、花柱の基部から子房へと生長しているトウモロコシ花粉管を示す。図１Ｂ： トウモロコシ花粉管生長を示さないＢＴｘ６２３モロコシ属雌しべ。矢印は、柱頭軸に侵入しないトウモロコシ花粉管を示す。
【図２】植えられた種子から発芽したモロコシ属とサトウキビ属との雑種植物。
【図３】属間雑種の直接的使用を示す概略図。ＡＡなる名称はソルガムを示し、ＭＭはポリネーター属、例えば、ススキ属、サトウキビを示す。
【図４】属間雑種の間接的（遺伝子移入）使用を示す概略図。ＡＡなる名称はソルガムを示し、ＭＭはポリネーター属、例えば、ススキ属、サトウキビを示す。
【図５】図５Ａ−Ｃ： テキサス州のカレッジ・ステーション（College Station）で育てられたソルガムとサトウキビとの属間雑種の写真。図５Ａ： ２つの７月齢ソルガムｘサトウキビ雑種。図５Ｂ： ソルガムｘサトウキビ雑種の花部。図５Ｃ： ソルガムｘサトウキビ雑種から広がった有糸分裂染色体。
【図６】植物上の節間の位置に基づいたＢｒｉｘ測定（屈折計によって測定された場合、汁柱の全可溶物質）。節間１は、植物の基部に位置し、最大数は植物の頂上にある。これらの植物における糖類プロフィールは、植物がほぼ８月齢で、まだ生殖生長に入らない８月に測定した。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
説明的具体例の記載
栽培したソルガム［ソルガム・ビカラー（Ｓ． ｂｉｃｏｌｏｒ）］は、伝統的な植物育種に不応性であり、野生のＥｕソルガム（Ｅｕ−Ｓｏｒｇｈｕｍ）品種とさえも交雑することができなかった。本発明は、ソルガムと他の単子葉植物との属間雑種を生産するのに有効な方法を提供することによって、初めて当該分野の欠如を克服する。本明細書に提供される属間雑種植物は、種々の農学的応用に有用な独特の形質を含み、バイオ燃料の生産に有益な特定の形質を有する。ある特定の態様において、本明細書に記載の方法により、ソルガムおよび豊富な他の単子葉植物属由来の農業経済学的に重要な形質を属間雑種植物中に組み込むことが可能である。本明細書に記載の方法を用いて、各親由来の農業経済学的に有益な形質を雑種植物に発現することができ、それにより、生産性、耐寒性、乾燥耐性、病害耐性などの実質的に改善された形質を生じることができる。
【００３５】
本明細書に提供される研究は、劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性のソルガム植物がサトウキビ種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．）およびミスカンサス（miscanthus）を包含する単子葉植物と首尾良くハイブリダイズできることを明らかにする。生産された雑種植物は、親植物品種と別個の形質を含む。例えば、モロコシ属とサトウキビ属との雑種「ソルケイン」は、茎柱の糖含量増加を包含する新規な表現型特徴を含むことが明らかにされた。
【００３６】
ある特定の態様において、本明細書中で提供される属間植物および方法は、バイオ燃料生産のための進化した供給原料を操作するために使用されうる。例えば、サトウキビは、その高い糖含量および太陽エネルギーのバイオマスへの変換における比類無き効率のおかげで、非常に好ましいバイオ燃料供給原料である。しかしながら、サトウキビ生産は、地理学的に、高い降雨量を有する赤道付近の地域に限られている。ソルガムは、温帯乾燥気候において生育し、バイオ燃料としての使用が意図されるが、ソルガムは、サトウキビよりも遙かに低い糖含量しか示さない。本明細書に提供される方法は、初めて、雑種植物において、ソルガム由来の乾燥耐性およびサトウキビ属由来の糖産生を包含する複数の属由来の所望の形質を組み合わせてえり抜きのバイオ燃料植物を生産することのできる育種計画を可能にする。
【００３７】
Ｉ．属間雑種を生産するための親植物
本発明のある特定の具体例は、第１の単子葉植物および第１の単子葉植物とは異なる種の第２の単子葉植物の交雑から、例えばサトウキビ植物とソルガム植物との交雑から、由来する属間雑種を生産する方法を提供する。かかる雑種交雑において、親として花粉レシピエント雌性植物、ならびに別の親として花粉ドナー雄性植物が存在するが、各親は雄性および雌性の花を有しうることが認識される。
【００３８】
ある特定の態様において、親植物は単子葉植物である。単子葉植物は、伝統的に認識される顕花植物（被子植物）の２つの主要な群のうちの１つであり、他方は双子葉植物である。さらなる態様において、親植物は、アンドロポゴン類（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｅａｅ）の植物であってもよい。アンドロポゴン類は、熱帯および温帯地域に広がった草の連［イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）］である。それらはＣ４炭素固定機能を使用する。該連は、一般に、ソルガム連と呼ばれる。該連に属する属には、アンドロポゴン（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、ボスリオクロア（Ｂｏｔｈｒｉｏｃｈｌｏａ）、クリソポゴン（Ｃｈｒｙｓｏｐｏｇｏｎ）、コイックス（Ｃｏｉｘ）、ジカンチウム（Ｄｉｃａｎｔｈｉｕｍ）およびセメダ（Ｔｈｅｍｅｄａ）がある。該草の出現は、インド、オーストラリア、アフリカおよび南アフリカの熱帯サバンナにおいて豊富である。
【００３９】
専用のバイオ燃料供給原料としてのソルガム、サトウキビおよびミスカンサスは関連しており、アンドロポゴン類の代表例である。これらの種の各々は、バイオマス供給原料としての相対的長所および潜在的弱点を有し、これらの作物間で形質を移動させる能力は、作物改良計画にとって非常に価値を有するであろう。これらの２または３種由来の好ましい形質を組み合わせることは、２、３またはそれ以上の種由来の栄養的雑種強勢雑種の合成および／またはドナー種から別の種への遺伝子および形質のハイブリダイゼーションに基づく有性移動によって達成されうる。遺伝的形質転換はまた、１個または非常に少数の遺伝子を属を横切って移動させるために使用されうる方法でもあるが、現行の方法は、バイオ燃料供給原料においておそらく価値がある多重遺伝子的農学的および組成的形質の移動の役に立たない。また、トランスジェニック作物の規制認可のコストが高いので、伝統的な（有性）移動方法が奨励される。
遺伝的形質転換ではなく有性移動方法による該目標の達成には、これらの草種における種間および／または属間繁殖障壁を克服する必要がある。本発明のある特定の態様において、このような繁殖障壁は、ソルガムの変異ｉａｐ遺伝子の利用により回避することができ、それにより、ソルガム、サトウキビおよび／またはススキ属由来の最も望ましい形質を新規な専用のバイオエネルギー供給原料中に組み込む可能性を提供して、２００７年の「Ｅｎｅｒｇｙ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ Ａｃｔ」に概説された目標を満たすのを助ける。
【００４０】
Ａ．モロコシ属（ソルガム）
ソルガムは、幅広く適用され、乾燥耐性であり、かつ、種子を解して容易に繁殖する。歴史的に、飼料穀物、食物用穀物、および飼草として世界中で栽培されているが、穀物生産に使用されるものとは明確に異なるエネルギーソルガムの品種および雑種が開発中である。全ての草の中でもソルガムは、高収量のデンプン（穀物雑種）、糖（スイートソルガム栽培種および雑種）、および／またはセルロース性バイオマス（飼草およびエネルギーソルガム雑種）を提供するその雑種が入手可能であるか、または開発可能であるので、バイオエネルギー穀物として独特である（Ｒｏｏｎｅｙら、２００７）。それは、すでに種子から作物として生育されているので、米国の多くの地域の生産者は、その栽培を熟知しており、該作物を栽培および収穫するのに必要な農業インフラを有する。それは、典型的に一年生作物として栽培されるが、多重収穫のために刈り株から新芽を出させることができ、最も乾燥耐性でかつ水利用効率のよい栽培作物の１つである（Ｒｏｏｎｅｙら、２００７）。
【００４１】
ソルガム穀物は、合衆国外の地域では人の食物として等しく重要である。これらの地域において、該穀物は、パン、ポリッジ、菓子の形態で、およびアルコール飲料として消費される。ソルガム穀物は、粉に製粉してもよく、直接または小麦粉やトウモロコシ粉と混合して、食品の調製に使用してもよい。ソルガムは、該穀物の直接消費の他に、世界の多くの地域において、長い間、ビールの製造に使用されてきた。ソルガムの使用は、ヒトによる穀粒の消費の他に、乾式製粉および湿式製粉産業の生産物を包含する。ソルガムの乾式製粉の主生産物は、グリット（grit）、ミール（meal）およびフラワー（flour）である。食物使用のためのデンプンおよび他の抽出物は、湿式製粉工程によって提供される。
【００４２】
ソルガムは、工業的原料の供給源を提供する。工業的使用は、主に、湿式製粉工業由来のソルガムデンプンから、および乾式製粉工業由来のソルガム粉である。ソルガムデンプンおよび粉は、紙およびテキスタイル工業に適用する。他の工業的使用は、接着剤、建設材料における適用および石油泥としての適用を包含する。相当量のソルガム（穀粒および植物材料の両方）が工業的アルコール生産に使用されてきた。
【００４３】
本発明において意図されるモロコシ属の種は、限定するものではないが、ソルガム・アルマム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ａｌｍｕｍ）、ソルガム・アムプラム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ａｍｐｌｕｍ）、ソルガム・アングスタム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ａｎｇｕｓｔｕｍ）、ソルガム・アルンディナセウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍ）、ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）（主要な栽培種）、アオルガム・ブラキポドゥム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｒａｃｈｙｐｏｄｕｍ）、ソルガム・バルボサム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｕｌｂｏｓｕｍ）、ソルガム・バルヒカム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｕｒｍａｈｉｃｕｍ）、ソルガム・コントロヴェルム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｕｍ）、ソルガム・ドルモンディイ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ）、ソルガム・エカリナタム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｅｃａｒｉｎａｔｕｍ）、ソルガム・エクスタンス（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｅｘｓｔａｎｓ）、ソルガム・グランデ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｇｒａｎｄｅ）、ソルガム・ハレペンセ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｅ）、ソルガム・インテルジェクタム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｉｎｔｅｒｊｅｃｔｕｍ）、ソルガム・イントランス（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｉｎｔｒａｎｓ）、ソルガム・ラキシフロラム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｌａｘｉｆｌｏｒｕｍ）、ソルガム・レイオクラデュム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｌｅｉｏｃｌａｄｕｍ）、ソルガム・マクロスペルマム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｍａｃｒｏｓｐｅｒｍｕｍ）、ソルガム・マタランケンス（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｍａｔａｒａｎｋｅｎｓｅ）、ソルガム・ミリアセウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、ソルガム・ニグラム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）、ソルガム・ニチデュム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｎｉｔｉｄｕｍ）、ソルガム・プラモサム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｐｌｕｍｏｓｕｍ）、ソルガム・プロピンキウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｐｒｏｐｉｎｑｕｕｍ）、ソルガム・パープレオセリセウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｏｓｅｒｉｃｅｕｍ）、ソルガム・スチポイデウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｔｉｐｏｉｄｅｕｍ）、ソルガム・チモレンセ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｔｉｍｏｒｅｎｓｅ）、ソルガム・トリコクラデュム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｔｒｉｃｈｏｃｌａｄｕｍ）、ソルガム・ヴェルシカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ヴァーガタム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、およびソルガム・ヴルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）を包含する。
【００４４】
本発明で使用されるソルガムの一例は、ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）である。特定の具体例において、例えば下記のようなｉａｐ／ｉａｐ変異ソルガムを用いてもよい。実施例１に記載されるＴｘ３３６１系統を包含する雄性不稔性ｉａｐ／ｉａｐ変異体もまた、使用されうる。
【００４５】
ある特定の態様において、本明細書中に記載されるソルガム植物は、１以上の農業経済学的に有益な形質を含みうる。これらの形質は、親ソルガム系統中に導入され、次いで、属間雑種植物に伝達されるか、または属間雑種植物中に直接導入されてもよい。ある特定の態様において、農業経済的に有益な形質は、１以上のトランス遺伝子をソルガム植物または属間雑種植物中に導入することにより、導入されうる。一の態様において、トランス遺伝子は、Ｔｘ３３６１系統のようなｉａｐ／ｉａｐソルガム系統中に、かかるソルガム植物由来の細胞を直接形質転換することによって導入されてもよい。別の態様において、トランス遺伝子は、トランス遺伝子を含むソルガム植物をＴｘ３３６１のようなｉａｐ／ｉａｐソルガム系統と交雑することによって、ｉａｐ／ｉａｐソルガム植物中に導入してもよい。次いで、かかる交雑由来のＦ１子孫は、ｉａｐ／ｉａｐソルガムに戻し交配するか、または（他のＦ１子孫に）自家交配してもよく、該第２交配の生産物を、該トランス遺伝子の存在およびホモ接合性ｉａｐ対立遺伝子の継承についてスクリーンする。かくして、劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性のトランスジェニックソルガム植物は、本発明の一部として包含され、本明細書に記載の属間雑種植物を生産する方法において使用されうる。
【００４６】
ある特定の態様において、本明細書に記載のソルガム植物および属間雑種植物は、限定するものではないが、穀物収率増加、糖含量増加、倒伏減少、背丈減少、乾燥耐性、耐塩性、サビ病耐性、昆虫耐性、炭疽病耐性、黒穂病耐性、べと病耐性、灰斑病耐性、条斑病（zonate）耐性、葉枯れ耐性、ウイルス耐性（例えば、トウモロコシ矮性モザイクウイルス耐性）、小昆虫耐性、ナンキンムシ（chinch bug）耐性、またはアブラムシ（green bug）耐性を包含する１以上の農業経済学的に有益な形質を含む。例えば、本明細書に記載の植物は、生物型ＣおよびＥのアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ）に対する耐性または改善された耐性、炭疽病（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）耐性、病原型１および３のべと病（Ｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ ｓｏｒｇｈｉ）および／またはレース１、２、３および４の黒穂病（Ｓｐａｏｅｌｏｔｈｅｃａ ｒｅｉｌｉａｎａ）に対する耐性の形質を含んでいてもよい。
【００４７】
Ｂ．サトウキビ
サトウキビ［サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）］は、分類学的解釈に依存するが、６〜３７種からなる、旧世界の暖温帯地域〜熱帯地域に自生する背丈の高い多年生草（イネ科、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｅａｅ類）の属である。それらは、頑丈な節のある繊維質の、糖類が豊富で、一般に２〜６メートルの高さになる茎を有する。サトウキビ種の全ては同系交配し、主な商業的栽培種は、複雑な雑種である。
【００４８】
サトウキビは、氷砂糖の生産に用いられる熱帯地域の主要作物である。それはまた、世界の熱帯地域における糖由来エタノールの生産に幅広く用いられ、砂糖生産に好ましいものとしてではなく、さらに高いバイオマイス収率をもたらす多くの他のサトウキビが承認されている。高バイオマスサトウキビは、エネルギーケイン（energycane）と呼ばれ、セルロース性エタノール生産のためのバイオマス供給源として応用される。サトウキビは、潜在的なバイオマス収率が卓越しているが、熱帯種であり、米国内での適応は、その低温感受性によって制限される。さらに、サトウキビは、相当量の水を必要とし、ソルガムより乾燥の影響を受け易い。これらの因子は、さらに、その生産範囲を制限する。最終的に、該多年生作物の確立は、栄養繁殖に依存し、典型的に該作物の生産周期を通して最も費用のかかる唯一の作物である。
【００４９】
本発明で意図されるサトウキビ属（サトウキビ）の種は、限定するものではないが、サッカラム・アルンジナセウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍ）、サッカラム・ベンガレンス（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｂｅｎｇａｌｅｎｓｅ）、サッカラム・ブレヴィバルベ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｂｒｅｖｉｂａｒｂｅ）、サッカラム・エデュレ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｅｄｕｌｅ）、サッカラム・オフィシナラム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、サッカラム・プロセルム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｐｒｏｃｅｒｕｍ）、サッカラム・ラヴェナエ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｒａｖｅｎｎａｅ）、サッカラム・ロブスタム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｒｏｂｕｓｔｕｍ）、サッカラム・シネンセ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｉｎｅｎｓｅ）およびサッカラム・スポンタネウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）を包含する。本明細書の開示にしたがって使用するために意図されるいくつかのサトウキビ属の品種は、限定するものではないが、サトウキビ品種Ｈｏ０５−９６１、ＨＢ０３−４０３、Ｈｏ０１−５６４、Ｈｏ０５−９６１、Ｈｏ０６−５２５、Ｈｏ０６−５３０、Ｈｏ０６−５４３、Ｈｏ０６−５５２、Ｈｏ０６−５６２、Ｈｏ０６−５６３、Ｈｏ０６−５６５、Ｈｏ０７−６１３、Ｈｏ９５−９８８、ＨｏＣＰ０１−５１７、ＨｏＣＰ０４−８０３、ＨｏＣＰ０４−８１０、ＨｏＣＰ０４−８３８、ＨｏＣＰ０５−９０３、ＨｏＣＰ０５−９０４、ＨｏＣＰ０５−９２３、ＨｏＣＰ０６−５０２、ＨｏＣＰ９６−５４０、ＨｏＬ０５−９５３、Ｌ０１−２８３、Ｌ０６−００１、Ｌ０６−０２４、Ｌ０６−３８、ＬＣＰ８５−３８４、ＵＳ０２−８４０、ＴＣＰ００−４５２１、ＴＣＰ０１−４５３５、ＴＣＰ０２−４６２２、ＴＣＰ０３−４６３６、ＴＣＰ０３−４６４５、ＭＰＴＨ９７−２０９、ＵＳ０７−９０１４、ＵＳ０７９０２６、ＵＳ０７９０２５、Ｌ９７−１２８（米国植物特許第ＰＰ１７，６３６号）、Ｌ９９−２２６（米国植物特許第ＰＰ１８，８０７号）およびＬ９９−２３３（米国植物特許第ＰＰ１８，８２６号）を包含する。ある特定の態様において、親サトウキビ属植物は、１以上のトランス遺伝子を含んでいてもよい。例えば、親サトウキビ属植物は、先祖植物由来のトランス遺伝子を承継していてもよく、またはトランス遺伝子をコードするＤＮＡで直接形質転換されていてもよい。
【００５０】
ある特定の態様において、本明細書に記載のサトウキビ属植物は、１以上の農業経済学的に有益な形質を含んでいてもよい。例えば、本明細書で使用するためのサトウキビ属植物は、除草剤耐性（例えば、グリホサート耐性）または昆虫耐性（例えば、サトウキビ穿孔虫（Ｄｉａｔｒｅａｅ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）に対する耐性）を付与するトランス遺伝子を含むトランスジェニックサトウキビ属植物であってもよい。
【００５１】
Ｃ．ススキ属（ミスカンサス）
ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）は、栽培されるバイオエネルギー供給原料として可能性のあるいくつかの種を有する。ミスカンサスは、アフリカおよび南アジアの亜熱帯および熱帯地域に自生する約１５種の多年生草からなる属であり、１種（Ｍ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）は、北へ延びて温帯東アジアにまで及ぶ。種の例には、必ずしも限定するものではないが、ミスカンサス・フロリデュラス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｆｌｏｒｉｄｕｌｕｓ）、ミスカンサス・ギガンテウス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）、ミスカンサス・サッカリフロラス［（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｌｏｒｕｓ）（オギ（Amur silver-grass））］、ミスカンサス・シネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ミスカンサス・チンクトリウス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）およびミスカンサス・トランスモリソネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｔｒａｎｓｍｏｒｒｉｓｏｎｅｎｓｉｓ）が包含される。
【００５２】
ミスカンサスの迅速な生長、低ミネラル含量および高バイオマス収率は、バイオ燃料として好ましい。収穫後、燃焼させて、出力タービンのための熱および蒸気を生産することができる。その結果得られるＣＯ２放出は、植物が生長期の間に空気から収集したＣＯ２の量と等しく、かくして、該プロセスは、投入量（例えば、肥料）または使用場所へのバイオ燃料の輸送を考慮しなければ、グリーンハウスガス中性である。石炭との５０／５０混合物中に混合した場合、それは、現行の石炭を燃料とする発電所において改修することなしに使用することができる。
【００５３】
これらの型の最も多作なものは、ミスカンサス・シネンシス（Ｍ．ｓｉｎｅｓｉｓ）（二倍体）とミスカンサス・サッカリフロラス（Ｍ．ｓａｃｃｈａｒｉｆｌｏｒｕｓ）（４倍体）との天然種間３倍体不稔性雑種である「ジャイアント・ミスカンサス（Giant Miscanthus）」であり、これは、例えば、根茎切断またはイン・ビトロ培養で、栄養繁殖しなければならない。特定の型のミスカンサス（例えば、ジャイアント・ミスカンサス）は、高収量のバイオマスを生産し、多年生であり、温帯気候に適応する（Ｃｌｉｆｔｏｎ−Ｂｒｏｗｎら、２００１）。大規模な商業化の可能性は、未だ証明されていないか、または少なくとも発表されていない。
【００５４】
本明細書の開示にしたがって使用するためのさらなる植物種および品種は、中国、日本および韓国のほとんどを通じて東アジアに自生する草であるミスカンサス・シネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）［チャイニーズ・シルバー・グラス、ユーラリ・アグラス（Eulalia grass）、メイデン・グラス（Maiden grass）、ゼブラ・グラス、ポルクピン・グラス（Porcupine Grass）；類義語：Eulalia japonica Trin.、Miscanthus sinensis f. glaber Honda、Miscanthus sinensis var. gracillimus Hitchc., Miscanthus sinensis var. variegatus Beal、Miscanthus sinensis var. zebrinus Beal、Saccharum japonicum Thunb.］を包含する。それは、一般に０．８〜２ｍ（稀に４ｍ）の高さに生長する多年生草木植物であり、地下茎から密集した茂みを形成する。葉は、長さ１８〜７５ｃｍ、幅０．３〜２ｃｍである。花は、紫がかっており、葉の上に維持される。
【００５５】
Ｄ．さらなる単子葉植物
さらなる単子葉植物を用いて、本明細書に記載の属間交雑を生じることができる。例えば、ある特定の態様において、属間交雑は、ソルガムとイネ科（草）の第２の単子葉植物との間である。例えば、交雑は、ソルガム植物と、植物のＡｎｏｍｏｃｈｌｏｏｉｄｅａｅ、Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ（例えば、ＰｈａｒｕｓおよびＬｅｐｔａｓｐｉｓ）、Ｐｕｅｌｉｏｉｄｅａｅ、Ｐｏｏｉｄｅａｅ（例えば、コムギ、オオムギ、オートムギ、スズメノチャヒキ、アシ）、Ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅａｅ（例えば、竹）、Ｅｈｒｈａｒｔｏｉｄｅａｅ（例えば、コメ）、Ａｒｕｎｄｉｎｏｉｄｅａｅ、Ｃｅｎｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｉｄｏｉｄｅａｅ、Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ（例えば、トウモロコシ）、ＭｉｃｒａｉｒｏｉｄｅａｅまたはＤａｎｔｈｏｎｉｏｉｄｅａｅ亜科のメンバーとの間で生じる。ある特定の態様において、属間植物は、優勢なソルガムの遺伝的背景中に所望の形質を遺伝子移入させるために使用されうる。逆に言えば、ある特定の場合において、本明細書に記載される属間交雑は、ソルガムに望ましい形質を他の遠い関係の植物品種中に遺伝子移入するために使用することができる。いくつかの特定の属間交雑および属間植物は、限定するものではないが、ソルガムと、エリアンタス（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）種、ソルガストラム（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ）種、パニカム（Ｐａｎｉｃｕｍ）種、ペニセタム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）種、およびゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）の遺伝子型との交雑を包含する。
【００５６】
ある特定の態様において、本明細書に記載の交雑に使用される単子葉植物は、それ自体、属間雑種植物であってもよい。例えば、ソルガムは、ソルケイン（Ｓｏｒｃａｎｅ）植物またはミスケイン（ｍｉｓｃａｎｅ）植物（ススキ属とサトウキビ属の雑種）と交雑されてもよい。
【００５７】
ＩＩ．花粉不和合性系の使用
効率が良く、生産性の高いバイオ燃料供給原料を開発するという目標を達成するために、本発明のある特定の態様は、関連する種、例えば、ソルガム、サトウキビおよびミスカンサスに存在する所望の形質の多くを組み合わせる方法を提供する。ある特定の態様において、種間および属間不和合性においてｉａｐの役割を利用して、繁殖障壁を迂回するための雑種を作成する。
【００５８】
Ａ．自家不和合性
ある特定の態様において、自家不和合性を用いて、自家受精または同じ種由来の花粉との受粉を最小限にすることができる。受精は、雄性核および雌性核の融合の成功に終わる花粉と雌しべとの間の複雑な相互作用である（ｄｅ Ｎｅｔｔａｎｃｏｕｒｔ， １９９７； Ｓｗａｎｓｏｎら、２００４； Ｗｈｅｅｌｅｒら、２００１）。雌しべ組織は、いくつかの細胞環境を通じて花粉管生長を支持する明確な指示および必須の栄養を提供する（Ｓｗａｎｓｏｎら、２００４）。同時に、雌しべは、種間または同一種内受粉を包含する不適当な花粉への接触から胚珠を保護する精巧な障壁を提供する。
【００５９】
顕花植物における自家不合和性（ＳＩ）の研究は、Ｓ−遺伝子配列、遺伝子産物および遺伝子産物相互作用の詳細な理解まで進んでいる（ｄｅ Ｎｅｔｔａｎｃｏｕｒｔ， １９９７； Ｆｅｎｇら、２００６； ＭｃＣｌｕｒｅおよびＦｒａｎｋｌｉｎ−Ｔｏｎｇ， ２００６； Ｒａｈｍａｎら、２００７； Ｔａｂａｈら、２００４）。ＳＩは、通常、単一の複対立遺伝子座Ｓによって調節されており、それは、自己認識の花粉および雌しべ決定因子をコードしている少なくとも２つの密接に関連した遺伝子からなる。近年、ＳＩの雌性決定因子の同定において大きな進歩があった。ほとんどの配偶体ＳＩ系は、雌しべＳ成分として、Ｓ−ＲＮａｓｅを有するが、独特の配偶体系は、雌しべ成分として小型分泌ペプチドを有する（Ｆｅｎｇら、２００６； ＭｃＣｌｕｒｅおよびＦｒａｎｋｌｉｎ−Ｔｏｎｇ， ２００６）。ＳＩの胞子体形成において、雌しべ決定因子は、Ｓ−受容体キナーゼであり、保存的キナーゼドメイン、膜貫通型ドメインおよび可変細胞外受容体からなる（Ｎａｉｔｈａｎｉら、２００７； ＮａｓｒａｌｌａｈおよびＮａｓｒａｌｌａｈ， １９９３； Ｎａｓｒａｌｌａｈ， ２００２）。繁殖組織におけるこれらの遺伝子の時空間的な発現は、自家不合和性花粉の認識および拒絶に導く細胞的および分子的プロセスの詳細な説明を可能とする。
【００６０】
Ｂ．交雑不和合性
属間交雑のために、異なる種間の交雑不和合性の問題を解決しなければならない。種間交雑不和合性を理解するために、２つの主要なパラダイム、すなわち、不和合性および不調和（incongruity）が存在する。不和合性は、不和合遺伝子の阻害作用により、生殖関係が機能しないメカニズムである。不和合性は、「外来」と同定された花粉の活発な拒絶に依存し、上記のＳＩ系に類似する。あるいは、不調和は、花粉の活発な拒絶に依存しないが、本質的には、パートナーの１つについての遺伝的情報の欠落のために不機能が生じる受動的プロセスである。雄性パートナーが雌に存在するある特定の障壁を克服するための浸透メカニズムを欠く場合、調和しない関係が存在する。互いからの単離において進化する種は、進化的相違のため、調和しないパートナーである可能性が高い（Ｈｏｇｅｎｂｏｏｍ， １９７３）。関与メカニズムにもかかわらず、種間ハイブリダイゼーションに対する障壁は、作物種において共通し、それらを克服することは、生殖質改良計画において種間または属間交雑を利用するために必須である。
【００６１】
Ｃ．ソルガムにおけるＩａｐ遺伝子座
ハイブリダイゼーション障壁は、モロコシ属、およびソルガム・ビカラーと野生型ソルガム種ならびにより遠縁の植物との間の雑種を得るための多くの不成功に終わった試みにおいて存在する。雌性ソルガム植物において花粉管生長を調節する対立遺伝子が同定され、Ｉａｐと称される。該遺伝子（ｉａｐ対立遺伝子）の劣性変異体もまた、同定された。
【００６２】
ｉａｐの遺伝子座は、ソルガム連鎖群０２（ＳＢＩ−０２）の短腕に位置決定され、該遺伝子座には、いくつかのＡＦＬＰおよびマイクロサテライトマーカーが側面に位置する。ｉａｐ遺伝子座の側面に位置する２つの近接のマイクロサテライトマーカー（Ｘｔｘｐ５０およびＸｔｘｐ６３）は、配列に基づいた高密度ソルガムゲノム地図に対して相互参照された（例えば、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのウェブサイト上のｓｏｒｇｂｌａｓｔ３．ｔａｍｕ．ｅｄｕ、Ｍｅｎｚら、２００２公表を参照のこと）。該局所的組み換え頻度（ｃＭあたりのｋｂｐ、ｃＭあたりの遺伝子）は、ゲノムにわたって概算された。該ｉａｐ遺伝子座をまたがる領域は、〜１６５ｋｂ／ｃＭの局所的組み換え頻度を有すると予測される。かくして、該Ｉａｐ形質遺伝子座は、比較的小さいセグメント、〜８００ｋｂｐ−１Ｍｂｐに範囲が定められると推測される。
【００６３】
ＩＩＩ．ソルガムを含む属間雑種および遺伝子移入
本発明は、所望の形質を雑種または植物種に導入することを含む、属間ハイブリダイゼーションおよびバイオ燃料の生産の方法を提供する。
【００６４】
Ａ．属間雑種の生産
種間の複雑な形質の移入は、種間または属間雑種の生産の成功を必要とする。ソルガムとサトウキビ属との間およびサトウキビ属とススキ属との間の稀なハイブリダイゼーションについて、文献において多くの報告があるが、ススキ属とソルガムとの間のハイブリダイゼーションについての報告は今まで知られていない。これらの種が稀にしかハイブリダイズしないという能力は、おそらく、その遺伝的類似性（例えば、ソルガムおよびサトウキビはほんの５百万年前に分岐した）に関連する（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、２００４）。ソルガム、サトウキビ属およびススキ属のＤＮＡ配列は、今日にいたっても非常に類似している（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、２００２のＦＩＧ．１）。しかしながら、生存能力のある雑種は、滅多に観察されず（１，０００回の試みのうち＜１未満）、それらの分類学的および遺伝学的特徴を反映する。かかる極度の困難性が、これらの努力の実際的な有用性を排除している。
【００６５】
対照的に、本発明は、属間雑種の効率の良い生産を可能とする方法を提供する。一の態様において、かかる方法は、（ａ）劣性ｉａｐについてホモ接合性（外来花粉遺伝子の阻害）であるソルガム植物を得、（ｂ）該ソルガム植物を、ソルガム以外のアンドロポゴン類（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｅａｅ）植物と交雑し、Ｆ１子孫を得、ここに、該ソルガム植物を雌性親として用い、該非ソルガムアンドロポゴン類植物を雄性親として用い、（ｃ）Ｆ１子孫から属間雑種を選択し、ここに、該属間雑種はどちらの親よりも高いバイオ燃料収率を有する工程を含む。
【００６６】
本発明にしたがって行われる交雑において、ある特定の場合、該属間雑種交雑から得られる成熟種子は、いくつかの場合において、低い生存能力を有することが発明者により見出されたので、上記したように、生存能力のある属間雑種植物を得るために、受粉後に胚レスキューを用いることが望ましい。また、各親植物における生存能力のある花粉および花粉を受容する花の同時性を保証するために、親植物の光周期および／または他の生長条件を操作することも望ましい。有利には、該段階の間、植物を肥料および／または適当と考えられる他の農薬で処理してもよい。
【００６７】
いったん属間交雑が起これば、雑種として得られる子孫であって、単に自家受精または同じ種の別の植物由来の花粉での受粉の結果ではないことを同定することが重要である。一の同定方法は、本願発明の場合のように、属間雑種が十分に識別可能な特徴を有するならば、形態学的評価である。特に、本明細書に記載の特徴は、各親植物由来の植物の物理的特徴に基づいて、当業者が植物を属間雑種として同定することを可能とする。
【００６８】
しかしながら、他の技術も本発明に利用できることが分かっており、環境的変動によって引き起こされる誤差の可能性を回避しうる。全ての可能なＦ１子孫植物のために、植物の倍数性、染色体構成およびバリエーションを決定してもよく、また、多様なゲノム位置由来の親の多形分子マーカーのセットのために、親の遺伝子型構成および一致またはバリエーションを決定してもよい。例えば、ある特定の態様において、属間子孫をスクリーンして、高い割合の機能的２ｎ配偶体を生じる子孫を同定してもよい。これらの子孫は、特に、特異的形質の遺伝子移入のための交配および戻し交配に有用でありうる。
【００６９】
例えば、親がゲノムサイズで異なる場合、フローサイトメトリックまたは他のＤＮＡ含量測定法が初期発育段階で雑種を検出しうる。しかしながら、ＤＮＡ含量の相違は、雑種状態以外の理由に起因しうるため、付加的な分析方法も望まれうる。親の相補体がサイズ、数および／または多形において異なる場合、根端が発達するとすぐに、核型分析の実施が可能である。別法には、ゲノム・イン・サイトゥ・ハイブリダイゼーション（ＧＩＳＨ）（Ｓｃｈｗａｒｚａｃｈｅｒら、１９８９）または遺伝子マーカー分析の使用がある。
【００７０】
遺伝子マーカーは、種間雑種植物、特に、異なる単子葉親植物由来の遺伝的相補体の組み合わせの分析および同定のための効率の良い方法を代表する。本明細書中で使用される場合、「遺伝的相補体」なる語は、植物または植物由来の細胞の同一性を明らかにするヌクレオチド配列の集合物を意味する。例えば、本明細書中で提供される属間雑種は、例示的なソルガムおよびサトウキビ／ススキ属親植物に対して、継承されたマーカーの代表的なサンプルを決定するために、遺伝子型分類されることができる。
【００７１】
遺伝子マーカーは、単一遺伝子座にて対立遺伝子である。それらは、好ましくは、二倍体遺伝子座の両方の対立遺伝子の存在が容易に検出可能なように共優性な様式で継承されており、環境変動がなく、すなわち、それらの遺伝率は１である。単一遺伝子座遺伝子型のアレイは、各遺伝子座にて２つのマーカー対立遺伝子のプロファイルとして発現される。各遺伝子座のマーカー対立遺伝子組成は、ホモ接合性またはヘテロ接合性である。ホモ接合性は、ある遺伝子座の両方の対立遺伝子が同じヌクレオチド配列または繰り返し配列のサイズによって特徴付けられる状態である。ヘテロ接合性は、ある遺伝子座の遺伝子の異なる状態をいう。
【００７２】
有用な型の遺伝子マーカーは、単純配列リピート（ＳＳＲｓ）であり、それらは、一般に、高度多形であり、入手に費用がかからない。しかしながら、潜在的に、例えば、制限フラグメント長多形（ＲＦＬＰｓ）、増幅フラグメント長多形（ＡＦＬＰｓ）、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰｓ）、およびアイソザイムなどの他の型の遺伝子マーカーも、本発明の植物を同定するために使用可能である。
【００７３】
ある特定の態様において、稔性、栄養繁殖およびバイオ燃料特性を包含する子孫の形質をＦ１子孫のいくつかまたは全てについて決定することが望ましく、該決定の結果にもよるが、全てのＦ１植物が類似するようである場合、Ｆ１植物の代表的セットを分析し、Ｆ１植物が変化している場合、多くのＦ１植物をクローンとして個別に分析する。さらなる態様において、かかる子孫またはクローンは、所望の形質、例えば、いずれの親と比較しても改善したバイオ燃料収率について選択されうる。
【００７４】
Ｂ．遺伝子移入
遺伝子移入は、戻し勾配による、１の種由来の遺伝子の別の種の遺伝子プール中への移動（遺伝子の流れ）を含む。本発明の一の具体例において、種間雑種は、その親の１つと戻し交配してもよい。これは、１以上の形質を親に遺伝子移入することを可能とし、特に、新規な形質を該種に導入することができる。遺伝子移入は、長期のプロセスであり、戻し交配が起こる前に、多くの雑種生成を行ってもよい。遺伝子移入株（ＩＬと略する）は、類似の種、例えば、「野生型」種由来の遺伝的材料を含有する作物種の系統をいう。遺伝子移入系統は、定量的形質遺伝子座の研究を可能とするが、外来形質を導入することによる新規な品種の作成も可能とする。
【００７５】
本発明のある特定の具体例において、非ソルガムアンドロポゴン類植物のバイオ燃料収率を改善する方法であって、（ａ）劣性ｉａｐについてホモ接合性のソルガム植物を得、（ｂ）該ソルガム植物をソルガム以外のアンドロポゴン類植物と交雑し、Ｆ１子孫を得、ここに、該ソルガム植物を雌性親として用い、該非ソルガムアンドロポゴン類植物を雄性親として用い、（ｃ）該Ｆ１子孫から属間雑種を選択し、ここに、該属間雑種は、非ソルガムアンドロポゴン類植物と比べて高いバイオ燃料収率を有し、（ｄ）該属間雑種を非ソルガムアンドロポゴン類植物と戻し交配して、アンドロポゴン類子孫を得、ここに、該アンドロポゴン類子孫がより高いバイオ燃料収率を有する工程を含む方法も提供されうる。ある特定の具体例において、該方法は、さらに、（ｅ）該アンドロポゴン類子孫を同系交配させて、より高いバイオ燃料収率についてホモ接合性の第２の子孫を生産する工程を含んでいてもよい。
【００７６】
Ｃ．改善されたバイオ燃料収率の選択
いくつかの態様において、属間ハイブリダイゼーションまたは遺伝子移入を本発明において用いて、ある特定の植物のバイオ燃料収率を改善してもよい。より高いバイオ燃料収率の選択は、標準的なバイオマス分析手法、例えば、合衆国ナショナル・リニューアル・エネルギー・ラボラトリーによって提供される方法またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｌｐ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙによって採用された類似の手法を用いて行うことができる。
【００７７】
ある特定の態様において、バイオマス収率は、また、バイオマス含量、稔性、栄養繁殖、光周期不感受性、背丈、茎径、乾燥耐性、種子サイズ、発芽、貯蔵後の種子生存能力、または当該分野で一般に知られているいずれかの特徴を包含していてもよい。例えば、バイオマス含量は、シュークロース含量またはセルロース含量であってもよい。特に、シュークロース含量またはセルロース含量は、ＨＰＬＣまたは近赤外線反射スペクトロスコープによって測定さうる。
【００７８】
Ｄ．除草剤耐性
多くの除草剤耐性遺伝子が知られており、本願発明で利用されうる。例えば、生長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素に対する耐性を付与する遺伝子がある。該カテゴリーにおける例示的遺伝子は、例えば、Ｌｅｅら（１９８８）によって記載されるような変異体ＡＬＳおよびＡＨＡＳ酵素をコードする。
【００７９】
グリホサート（各々、変異型５−エノールピルビル−３ホスフィキメートシンターセ（ＥＰＳＰ）（5-enolpyruvl-3 phosphikimate synthase）およびａｒｏＡ遺伝子によって付与される耐性）および他のホスホノ化合物、例えば、グルホシネート（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）およびストレプトマイセスヒグロスコピカスホスフィノトリシン−アセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子）耐性遺伝子もまた、使用してもよい。例えば、グリホサート耐性を付与することのできるＥＰＳＰＳの形態のヌクレオチド配列を開示するＳｈａｈらの米国特許第４，９４０，８３５号参照のこと。変異型ａｒｏＡ遺伝子をコードしているＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号第３９２５６号の下で得ることができ、該変異型遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｃｏｍａｉの米国特許第４，７６９，０６１号に開示されている。Ｋｕｍａｄａらの欧州特許出願第０ ３３３ ０３３号およびＧｏｏｄｍａｎらの米国特許第４，９７５，３７４号は、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する耐性を付与するグルタミンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。ホスフィノトリシン−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓらの欧州特許出願第０ ２４２ ２４６号に提供され、ＤｅＧｒｅｅｆら（１９８９）は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生産を記載する。フェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン類（cycloshexones）、例えば、セトキシジム（sethoxydim）およびハロキシフォップ（haloxyfop）に対する耐性を付与する遺伝子の例は、Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９９２）によって記載されるＡｃｃｔ−Ｓ１、Ａｃｃｌ−Ｓ２およびＡｃｃｔ−Ｓ３遺伝子である。
【００８０】
また、光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジン（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）およびベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）に対する耐性を付与する遺伝子も知られている。Ｐｒｚｉｂｉｌｌａら（１９９１）は、変異型ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドでのクラミドモナスの形質転換を記載する。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｔａｌｋｅｒの米国特許第４，８１０，６４８号に開示され、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号第５３４３５号、第６７４４１号および第６７４４２号の下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現は、Ｈａｙｅｓら（１９９２）によって記載されている。
【００８１】
Ｅ．病害耐性
植物防御は、しばしば、植物中の病害耐性遺伝子（Ｒ）と病原体中の対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子の生産物との間の特異的相互作用によって活性化される。植物系統は、クローン化された耐性遺伝子で形質転換して、特異的病原体株に対して耐性の植物を作成することができる。例えば、Ｊｏｎｅｓら（１９９４）（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍに対する耐性のためのトマトＣｆ−９遺伝子のクローニング）、Ｍａｒｔｉｎら（１９９３）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｔｏｍａｔｏに対する耐性のためのトマトＰｔｏ遺伝子）、およびＭｉｎｄｒｉｎｏｓら（１９９４）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅに対する耐性のためのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＲＰＳ２遺伝子）を参照のこと。
【００８２】
ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素もまた、ウイルス病耐性に用いてもよい。例えば、形質転換植物細胞中のウイルス外被タンパク質の蓄積は、該外被タンパク質遺伝子が由来するウイルスならびに関連するウイルスによってもたらされるウイルス感染および／または病害発症に対する耐性を付与する。Ｂｅａｃｈｙら（１９９０）参照のこと。外被タンパク質媒介性耐性は、アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチウイルス、タバコ茎えそウイルス、およびタバコモザイクウイルスに対する形質転換植物に付与されている。Ｉｄ．
【００８３】
また、ウイルス特異的抗体を用いてもよい。例えば、組み換え抗体遺伝子を発現しているトランスジェニック植物がウイルス攻撃から保護されることを示すＴａｖｌａｄｏｒａｋｉら（１９９３）参照のこと。
【００８４】
例えば、Ｌｏｇｅｍａｎｎら（１９９２）は、真菌病害に対する耐性が増加したオオムギリボソーム不活化遺伝子を発現しているトランスジェニック植物を開示する。
【００８５】
Ｆ．昆虫耐性
昆虫耐性遺伝子の一例は、バシラス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質、その誘導体またはそれをモデル化した合成ポリペプチドを包含する。例えば、Ｂｔ δ−エンドトキシン遺伝子のクローニングおよびヌクレオチド配列を開示するＧｅｉｓｅｒら（１９８６）を参照のこと。さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードしているＤＮＡ分子は、例えば、ヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から、受託番号第４００９８号、第６７１３６号、第３１９９５号および第３１９９８号の下で入手可能である。別の例にはレクチンがある。例えば、いくつかのクリヴィア・ミニアータ（Ｃｌｉｖｉａ ｍｉｎｉａｔａ）のマンノース結合性レクチン遺伝子のヌクレオチド配列を開示するＶａｎ Ｄａｍｍｅら（１９９４）を参照のこと。ビタミン結合性タンパク質もまた使用してもよく、アビジンなどがある。ＰＣＴ出願第ＵＳ９３／０６４８７号（出典明示により、本明細書の一部とされる）を参照のこと。該出願は、昆虫害虫に対する殺幼虫剤としてのアビジンおよびアビジン相同物の使用を教示する。
【００８６】
また別の昆虫耐性遺伝子は、酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼまたはプロテイナーゼ阻害剤あるいはアミラーゼ阻害剤である。例えば、Ａｂｅら（１９８７）（米システインプロテイナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）、Ｈｕｕｂら（１９９３）（タバコプロテイナーゼ阻害剤ＩをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）、およびＳｕｍｉｔａｎｉら（１９９３）［ストレプトマイセス・ニトロスポレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｉｔｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）α−アミラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列］を参照のこと。昆虫特異的ホルモンまたはフェロモンもまた使用してもよい。例えば、Ｈａｍｍｏｃｋら（１９９０）による、クローン化された幼若ホルモンエステラーゼ、幼若ホルモンの不活性化剤のバキュロウイルス発現の開示を参照のこと。
【００８７】
また別の例は、昆虫特異的抗体、そこから誘導される抗毒素、発育遅滞（developmental-arrestive）タンパク質または酵素を包含する。単鎖抗体フラグメントの産生を介するトランスジェニックタバコにおける酵素的不活性化を記載するＴａｙｌｏｒら（１９９４）を参照のこと。さらなる例において、米キチナーゼ（ｃｈｉ ＩＩ）などのキチナーゼは、植物に発現されうる（例えば、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの調節下におけるソルガム中のｃｈｉ ＩＩの発現を開示するＺｈｕら、１９９８およびＫｒｉｓｈｎａｖｅｎｉら、２００１を参照のこと）。
【００８８】
Ｇ．修飾された脂肪酸、フィターゼおよびカルボヒドラーゼ代謝
修飾された脂肪酸代謝を付与する遺伝子を用いてもよい。例えば、ステリル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子を用いてもよい。Ｋｎｕｔｚｏｎら（１９９２）を参照のこと。また、Δ９脂肪酸デサチュラーゼ、パルミトイル（１６：０）またはステロイル（１８：０）ＣｏＡ由来のモノ不飽和パルミトレイン（１６：１）およびオレイン（１８：１）脂肪酸を形成する酵素をコードしているＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＬＥ１遺伝子（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、１９９２）；ヒマ（castor）由来のステロイル−アシルキャリヤータンパク質デルタ−９デサチュラーゼ（Ｆｏｘら、１９９３）；リノール酸（１８：２）からガンマリノレン酸（１８：３ガンマ）への変換に関与するシアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ由来のΔ６−およびΔ１２−デサチュラーゼ（Ｒｅｄｄｙら、１９９３）；オメガ−３デサチュラーゼをコードするＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来の遺伝子（Ａｒｏｎｄｅｌら、１９９２）；植物Δ９−デサチュラーゼ（ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９１／１３９７２号）ならびにダイズおよびアブラナ属Δ１５デサチュラーゼ（欧州特許出願第ＥＰ ０６１６６４４号）などの種々の脂肪酸デサチュラーゼが記載されている。
【００８９】
フィチン酸塩代謝は、また、フィターゼコード化遺伝子の導入によって、フィチン酸塩の分解を増強し、より多くの遊離リン酸塩を形質転換植物に加えるように修飾してもよい。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒフィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示するＶａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔら（１９９３）を参照のこと。例えば、これは、低レベルのフィチン酸によって特徴付けられる植物変異体の原因となる単一対立遺伝子に関連するＤＮＡをクローニング、次いで再導入することによって達成することができた。Ｒａｂｏｙら（１９９０）参照のこと。
【００９０】
カルボヒドラーゼ代謝を改変するために使用されうる多くの遺伝子が知られている。例えば、植物は、デンプンの分枝パターンを改変する酵素をコードする遺伝子で形質転換してもよい。Ｓｈｉｒｏｚａら（１９８８）（ストレプトコッカス変異体フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚら（１９８５）［バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列］、Ｐｅｎら（１９９２）［バシラス・リェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼを発現するトランスジェニック植物の生産］、Ｅｌｌｉｏｔら（１９９３）（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｅｒｇａａｒｄら（１９９３）（オオムギα−アミラーゼ遺伝子の部位特異的突然変異誘発）、およびＦｉｓｈｅｒら（１９９３）（トウモロコシ内胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）を参照のこと。トウモロコシ由来の１０ｋＤゼイン貯蔵タンパク質をコードするＺ１０遺伝子もまた、他の成分と相対的に細胞中の１０ｋＤゼインの量を改変するために使用してもよい（Ｋｉｒｉｈａｒａら、１９８８）。
【００９１】
Ｈ．さらなる農業経済学的形質
例えば、乾燥耐性または耐寒性を増加するために、さらなるトランス遺伝子を導入してもよい。例えば、雑種植物の表面ワックス含量および乾燥耐性を増加させるために、ワックス合成酵素を発現させてもよい。耐寒性を付与するのに有用なトランス遺伝子は、例えば、米国特許公報第２００８００９２２５５号（出典明示により本明細書の一部とされる）に開示される。非生物的ストレス耐性を改善するためにトランスジェニック植物中で発現または過剰発現されうるさらなる遺伝子は、マンニトール−１−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（例えば、ｍｔｌＤ）、ピロリン−５−カルボキシレートシンターゼ（例えば、ｐ５ＣＳｆ１２９Ａ）、および／またはコリンオキシダーゼ（例えば、ｃｏｄＡ）を包含する。
【００９２】
例えば、エタノール生産のためのデンプンを増加するか、またはタンパク質発現を提供することができる商業的形質もまた、遺伝子上にコード化することができる。形質転換植物の別の重要な商業的使用は、米国特許第５，６０２，３２１号（出典明示により本明細書の一部とされる）に記載されるようなポリマーおよびバイオプラスチックの生産である。Ｂ−ケトチオラーゼ、ＰＨＢアーゼ（ポリヒドロキシブチレートシンターゼ）およびアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素などの遺伝子は、ポリヒドキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）の発現を容易にする。
【００９３】
ＩＶ．雄性不稔性
ある特定の態様において、異なるが、密接に関連する種間のハイブリダイゼーションは、雌性親としてのソルガムのｉａｐ／ｉａｐ変異体の使用を含む。ソルガムは天然では低頻度で異系交配するので、所望の親間での交配を調節するには、一般に特別の操作が所望される（Ｒｏｏｎｅｙ、２００４）。本発明のある特定の具体例は、雄性不稔性ソルガム変異体、例えば、Ｔｘ ３３６１を用いて、手で除雄する必要性を回避する。雄性不稔性の例を下記する。
【００９４】
Ａ．手での除雄
主として調節された受粉および交配目的での植物の雄（花粉）部の除去または破壊は、除雄と呼ばれる。自家受粉の調節のための手での除雄および他の方法はよく知られている。
【００９５】
花は、開花前日に除雄されうる。かかる小花は、ソルガム円錐花序において開いた小花の約３ｃｍ以内に生じる。全て開いた小穂ははさみで除去する。特に、除雄を戸外で行う場合、円錐花序および器具を洗浄して、除雄前にいかなる花粉も除去すべきである。温室内でのかかる花粉移動の可能性はほとんどないが、円錐花序および器具のかかるリンスは、所望されない異系交配を回避するために実施すべきである。
【００９６】
除雄されるべき小花を除き、全ての小花を除去して、次の日に開花すると予想される小花のみを残す。シャープペンシルまたは同様の尖った器具を挿入することによって、３つの葯を囲んでいる外花穎および内花穎の外で操作する。葯を破壊しないように注意を払わなければならず、もし葯が破れたら、その花を除去して、器具をリンスして次の小花の汚染を回避すべきである。小花のセットが「完全に除雄される」前に、いずれの葯も除去しなければならない。１つの葯の存在は、ブリーダーによる花粉の移動前に、１以上の子房の受粉を引き起こすであろう。小花を除雄した後、小花を１−２日後に受粉させるまで、紙袋を除雄した円錐花序の上に被せる。屋外での除雄は、通常、他の植物から迷い出た生存能力のある花粉を避ける目的で、午後に行われる。
【００９７】
Ｂ．遺伝的雄性不稔性
ｍｓ１〜ｍｓ７と呼ばれる一連の核劣性雄性不稔性遺伝子がソルガムで特徴付けられている。劣性条件において、これらの変異は、ハイブリダイゼーションに用いることができる雄性不稔性植物をもたらす（Ｒｏｏｎｅｙ、２００１）。これらの植物は完全に雄性不稔性なので、除雄する必要はなく、非常の多数の種子をより容易に作成することができる。しかしながら、何世代にもわたって受け継がれる均一の遺伝的不稔性をもたらす能力がないことが、雑種種子生産のための遺伝的雄性不稔性の使用を面倒にする。結果的に、遺伝的雄性不稔性は、属間雑種植物およびその親の開発を容易にするための、本発明にしたがうソルガム育種計画に用いられうる。
【００９８】
遺伝的雄性不稔性の使用は、ハイブリダイゼーションを容易にするが、それはまた、開花中に該集団の綿密な管理を必要とする。いったん改良が完成したら、系統を誘導しなければならず、該劣性ｍｓ対立遺伝子は除去されるか、またはそれらは将来の世代に不稔性子孫を生じるであろう。遺伝的雄性不稔性のための系統分離は、無作為な円錐花序の自家受粉または不稔性円錐花序と同じ列にあるヘテロ接合性の雄性不稔性植物由来の花粉との大量受粉によって維持されることができる。該系を用いるために、雄性不稔性植物は、先端開花にて同定されなければならない。雄性不稔性植物の葯は、小さく、細く、生存能力のある花粉を落とさない。同定において、雄性不稔性円錐花序の先端を除去し、該円錐花序を袋に入れて解放受粉を回避すべきである。次いで、円錐花序を３−５日後に、所望の雄性親から収集した花粉で受粉することができる。これらの交雑由来の雑種は、個体数改善のために使用することができるか、または改善された純粋な系統を生産するための系統選択などの別の植物育種スキームを開始するために使用することができる。ブリーダーは、多くのえり抜きのソルガム生殖質および親系統において、遺伝的雄性不稔性ストックを開発している（ＰｅｄｅｒｓｅｎおよびＴｏｙ １９９７）。
【００９９】
Ｃ．殺配偶子剤
ある特定の具体例において、除雄は、所望により、花粉を不稔にするための殺配偶子剤を用いて達成することができる。かかる殺配偶子剤で処理した植物は、雄性不稔性になるが、典型的に、雌性稔性のままである。化学的殺配偶子剤の使用は、例えば、米国特許第４，９３６，９０４号（その開示は、特に、出典明示により全体として本明細書の一部とされる）に記載されている。
【０１００】
Ｖ．植物形質転換構築物
本発明にしたがって、遺伝的形質転換によって生産された１以上のトランス遺伝子を含む植物が提供される。植物形質転換に使用されるベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣｓ（酵母人工染色体）、ＢＡＣｓ（細菌人工染色体）または別の他の適当なクローニング系、ならびにそれら由来のＤＮＡフラグメントを包含しうる。かくして、「ベクター」または「発現ベクター」なる語が用いられる場合、上記型のベクターの全て、ならびにそれらから単離された核酸配列が包含される。大きな挿入能力を有するクローニング系の利用は、１以上の選択遺伝子を含む大型のＤＮＡ配列の導入を可能にすると考えられる。本発明によると、これは、全生合成経路に相当する遺伝子を植物中に導入するために使用することができた。かかる配列の導入は、細菌または酵母人工染色体（各々、ＢＡＣｓまたはＹＡＣｓ）の使用によって、または植物人工染色体の使用によってさえも、容易にされうる。例えば、アグロバクテリウム媒介性形質転換のためのＢＡＣｓの使用は、Ｈａｍｉｌｔｏｎら（１９９６）によって開示された。
【０１０１】
かかるベクターから単離された発現カセットは、形質転換に特に有用である。植物細胞を形質転換するために使用されるＤＮＡセグメントは、もちろん、一般に、宿主細胞中に導入し、発現させたいｃＤＮＡまたは遺伝子を含む。これらのＤＮＡセグメントは、さらに、プロモーター、エンハンサー、ポリリンカー、または所望により、調節遺伝子などの構造を含むことができる。細胞性導入のために選択されたＤＮＡセグメントまたは遺伝子は、しばしば、スクリーニング可能なまたは選択可能な形質をもたらす得られる組み換え細胞中で発現されるタンパク質、および／または得られるトランスジェニック植物に改善された表現型を付与するタンパク質をコードする。しかしながら、いつもこうであるとは限らず、本発明は、発現されないトランス遺伝子を組み込んだトランスジェニック植物も包含する。本発明において使用されるベクターと共に包含されうる成分の例は、下記の通りである。
【０１０２】
Ａ．調節エレメント
核酸配列の発現のための例示的プロモーターは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９８５）などの植物プロモーター、またはＣａＭＶ １９Ｓ（Ｌａｗｔｏｎら、１９８７）、ｎｏｓ（Ｅｂｅｒｔら、１９８７）、Ａｄｈ（Ｗａｌｋｅｒら、１９８７）、シュークロースシンターゼ（ＹａｎｇおよびＲｕｓｓｅｌｌ、１９９０）、チューブリン、アクチン（Ｗａｎｇら、１９９２）、ｃａｂ（Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９８９）、ＰＥＰＣアーゼ（ＨｕｄｓｐｅｔｈおよびＧｒｕｌａ、１９８９）またはＲ遺伝子複合体に関連するもの（Ｃｈａｎｄｌｅｒら、１９８９）等の他のプロモーターを包含する。根組織プロモーター（Ｃｏｎｋｌｉｎｇら、１９９０）などの組織特異的プロモーター、および組織特異的エンハンサー（Ｆｒｏｍｍら、１９８６）もまた、有用であると考えられ、ＡＢＡ−およびトルゴール−誘導可能プロモーターなどの誘導可能プロモーターである。ＰＡＬ２プロモーターもまた、本発明で有用でありうる（米国特許出願公開第２００４／００４９８０２号（特に、出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）。
【０１０３】
転写開始部位とコーディング配列の開始との間のＤＮＡ配列、すなわち、非翻訳リーダー配列もまた、遺伝子発現に影響を及ぼすことができる。かくして、本発明の形質転換構築物と共に、特定のリーダー配列を用いてみてもよい。リーダー配列は、付加配列の最適な発現を指示する、すなわち、ｍＲＮＡ安定性を増加または維持し、翻訳の不適当な開始を防ぎうる好ましいコンセンサスリーダー配列を含むと予測される配列を含むものを包含すると考えられる。かかる配列の選択は、本明細書の開示に照らして、当業者に既知であろう。植物において高度に発現する遺伝子由来の配列が典型的に好ましい。
【０１０４】
本発明にしたがって使用するためのベクターは、ｏｃｓエンハンサーエレメントを含むと考えられる。該エレメントは、最初、アグロバクテリウムのオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）遺伝子由来の１６ｂｐパリンドロームエンハンサーとして同定され（Ｅｌｌｉｓら、１９８７）、少なくとも１０個の他のプロモーターに存在する（Ｂｏｕｃｈｅｚら、１９８９）。ｏｃｓエレメントおよび該エレメントの特に多数のコピーなどのエンハンサーエレメントの使用は、植物形質転換との関連で適用した場合、隣接するプロモーターからの転写レベルを増加するように作用しうる。
【０１０５】
トランスジェニック植物における遺伝子の組織特異的標的化において使用するためのベクターは、典型的に、組織特異的プロモーターを含み、また、他の組織特異的調節エレメント、例えば、エンハンサー配列を含んでいてもよい。ある特定の植物組織における特異的または強化した発現を支持するプロモーターは、本明細書に照らして、当業者に既知であろう。これらは、例えば、緑色組織に特異的なｒｂｃＳプロモーター；根または損傷した葉組織において高い活性を有するｏｃｓ、ｎｏｓおよびｍａｓプロモーターを包含する。
【０１０６】
Ｂ．ターミネーター
本発明にしたがって調製される形質転換構築物は、典型的に、転写を停止させ、プロモーターに作動可能に連結したコーディング配列によって産生されるｍＲＮＡのポリアデニル化を可能にするシグナルとして作用する３’末端ＤＮＡ配列を包含するであろう。該文脈において有用であると考えられるターミネーターの例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ｎｏｓ ３’末端）のノパリンシンターゼ遺伝子由来のもの（Ｂｅｖａｎら、１９８３）、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピンシンターゼ遺伝子由来のＴ７転写産物のターミネーター、およびジャガイモまたはトマト由来のプロテアーゼ阻害剤ＩまたはＩＩ遺伝子の３’末端を包含する。Ａｄｈイントロン（Ｃａｌｌｉｓら、１９８７）、シュークロースシンターゼイントロン（Ｖａｓｉｌら、１９８９）またはＴＭＶオメガエレメント（Ｇａｌｌｉｅら、１９８９）等の調節エレメントは、所望により、さらに包含されうる。
【０１０７】
Ｃ．輸送またはシグナルペプチド
最初の翻訳産物から翻訳後に除去され、細胞内膜または細胞外膜中への、あるいは細胞内膜または細胞外膜を介するタンパク質輸送を容易にする、発現された遺伝子のコーディング配列に結合する配列は、輸送（通常、小腔、小胞、プラスチドおよび他の細胞内器官中への）およびシグナル配列（通常、小胞体、ゴルジ体および細胞膜の外側への）と呼ばれる。該タンパク質の細胞内外のコンパートメントへの輸送を容易にすることによって、これらの配列は、それらをタンパク質分解から保護する遺伝子産物の蓄積を増加しうる。これらの配列は、また、高度に発現した遺伝子由来の付加的なｍＲＮＡ配列が該遺伝子のコーディング配列に結合するのを可能にする。リボソームによって翻訳されているｍＲＮＡは裸の（naked）ｍＲＮＡよりも安定なので、該遺伝子の前にある翻訳可能なｍＲＮＡの存在は、該遺伝子由来のｍＲＮＡ転写産物の全安定性を増加し、それにより、遺伝子産物の合成を増加しうる。輸送およびシグナル配列は通常、最初の翻訳産物から翻訳後に除去されるので、これらの配列の使用は、最終ポリペプチド上に現れないかもしれない余分な翻訳配列の付加を可能にする。さらに、タンパク質の安定性を増加するために、ある特定のタンパク質の標的化が望ましいかもしれないと考えられる（米国特許第５，５４５，８１８号（出典明示により、全体として、本明細書の一部とされる））。
【０１０８】
さらに、ベクターは、トランスジェニック植物の細胞内での特異的遺伝子産物の細胞内標的化において、またはタンパク質を細胞外環境に指向するにおいて、構築および使用されうる。このことは、一般的に、輸送およびシグナルペプチド配列をコードしているＤＮＡ配列を特定の遺伝子のコーディング配列に結合することによって達成されるであろう。得られる輸送、またはシグナルペプチドは、該タンパク質を各々、特定の細胞内、または細胞外目的地に輸送し、次いで、翻訳後に除去されるであろう。
【０１０９】
Ｄ．マーカー遺伝子
選択可能またはスクリーニング可能なマーカータンパク質を用いることによって、形質転換体を同定する能力を提供または増強することができる。「マーカー遺伝子」は、該マーカータンパク質を発現している細胞に別個の表現型を付与し、かくして、かかる形質転換細胞を該マーカーを有しない細胞から識別可能にする遺伝子である。かかる遺伝子は、マーカーが化学的手段によって、すなわち、選択剤（例えば、除草剤、抗生物質など）の使用によって「選択」できる形質を付与するのか、または単純に観察または試験によって、すなわち、「スクリーニング」（例えば、緑色蛍光タンパク質）によって同定できる形質であるのかに依存するが、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーのいずれをコードしていてもよい。もちろん、適当なマーカータンパク質の多くの例が当該分野で知られており、本発明の実施において使用可能である。
【０１１０】
「選択可能」または「スクリーニング可能」なマーカーなる語には、形質転換細胞について同定または選択する手段としてその分泌が検出可能である「分泌可能マーカー」をコードする遺伝子も包含される。例えば、抗体相互作用によって同定されることができる選択可能抗原であるマーカー、または触媒活性によって検出可能な分泌可能酵素が包含される。分泌可能なタンパク質は、多くのクラスに分類され、例えば、ＥＬＩＳＡによって検出可能な小型拡散性タンパク質；細胞外溶液中で検出可能な小型活性酵素（例えば、α−アミラーゼ、β−ラクタマーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）；および細胞壁に挿入または閉じこめられるタンパク質（例えば、エクステンシンまたはタバコＰＲ−Ｓの発現単位において見出されるようなリーダー配列を含むタンパク質）を包含する。
【０１１１】
多くの選択可能マーカーコーディング領域が知られており、本発明において使用可能であり、限定するものではないが、カナマイシン耐性を提供し、カナマイシン、Ｇ４１８、パロモマイシンなどの使用について選択できるｎｅｏ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５）；ビアラホスまたはホスフィノトリシン耐性を付与するｂａｒ；グリホサート耐性を付与する変異型ＥＰＳＰシンターゼ５タンパク質（Ｈｉｎｃｈｅｅら、１９８８）；ブロモキシニルに対する耐性を付与するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅ由来のｂｘｎなどのニトリラーゼ（Ｓｔａｌｋｅｒら、１９８８）；イミダゾリノン、スルホニル尿素または他のＡＬＳ阻害性化学物質に対する耐性を付与する変異型アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）（欧州特許出願第１５４，２０４号、１９８５）；メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ（Ｔｈｉｌｌｅｔら、１９８８）、除草剤ダラポンに対する耐性を付与するダラポンデハロゲナーゼ；または５−メチルトリプトファンに対する耐性を付与する変異アントラニレートシンターゼを包含する。
【０１１２】
形質転換体を選択するための系において使用されることのできる選択可能マーカーの例示的具体例は、酵素ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来のｂａｒ遺伝子またはストレプトマイセス・ヴィリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のｐａｔ遺伝子である。酵素ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）は、除草剤ビアラホスにおける活性成分、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）を不活性化する。ＰＰＴは、グルタミンシンセターゼを阻害し（Ｍｕｒａｋａｍｉら、１９８６；Ｔｗｅｌｌら、１９８９）、アンモニアの迅速な蓄積および細胞死を引き起こす。
【０１１３】
使用してもよいスクリーニング可能なマーカーは、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはその種々の色素生産性基質が知られている酵素をコードするｕｉｄＡ遺伝子；植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の生産を調節する生産物をコードするＲ−座遺伝子（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら、１９８８）；その種々の色素生産性基質（例えば、ＰＡＤＡＣ、色素生産性セファロスポリン）が知られている酵素をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、１９７８）；色素生産性カテコール類を変換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Ｚｕｋｏｗｓｋｙら、１９８３）；α−アミラーゼ遺伝子（Ｉｋｕｔａら、１９９０）；チロシンのＤＯＰＡおよびドーパキノンへの酸化を可能にする酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Ｋａｔｚら、１９８３）（次いで、縮合して容易に検出可能な化合物メラニンを形成する）；その色素生産性基質が存在する酵素をコードするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子；バイオルミネセンス検出が可能なルシフェラーゼ（ｌｕｘ）遺伝子（Ｏｗら、１９８６）；カルシウム感受性バイオルミネセンス検出において使用されうるエクオリン遺伝子（Ｐｒａｓｈｅｒら、１９８５）；または緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子（Ｓｈｅｅｎら、１９９５；Ｈａｓｅｌｏｆｆら、１９９７；Ｒｅｉｃｈｅｌら、１９９６；Ｔｉａｎら、１９９７；ＷＯ９７／４１２２８）を包含する。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子は、また、特に有用なレポーター遺伝子と考えられる（Ｓｈｅｅｎら、１９９５；Ｈａｓｅｌｏｆｆら、１９９７；Ｒｅｉｃｈｅｌら、１９９６；Ｔｉａｎら、１９９７；ＷＯ ９７／４１２２８）。緑色蛍光タンパク質の発現は、特定の波長の光による照明後に蛍光として細胞または植物中で可視化されうる。
【０１１４】
Ｖ．寄託情報
本明細書中に開示されるソルガム系統Ｔｘ３３６１の寄託は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９になされた。寄託日は、２００９年６月２５日であり、ソルガム品種Ｔｘ３３６１の寄託された種子の受託番号は、ＡＴＣＣ受託番号第ＰＴＡ−１０１４９号である。寄託における全ての制限は除かれ、該寄託は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．８０１−１．８０９を満たすものである。該寄託は３０年間、または最後の請求後の５年間、または特許有効期間（いずれか長い方）、寄託所において維持され、必要ならば、該期間の間、取り替えられるであろう。出願人は、寄託物に対するいずれの特許権も放棄しない。
【実施例】
【０１１５】
ＶＩ．実施例
下記の実施例は、本発明の好ましい具体例を説明するために包含される。実施例に開示される技術が本発明の実施においてよく機能するように発明者によって見出された技術を示すものであり、かくして、その実施の好ましい形態を構成すると考えられることは、当業者に明らかであろう。しかしながら、当業者は、本願明細書の開示に照らして、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、開示される特定の具体例において多くの変更を行って、いまだ同様の結果を得ることができることを認めるはずである。
【０１１６】
実施例１
ｉａｐ ｉａｐ遺伝子型を有する改善されたソルガム系統の開発
繁殖障壁は、栽培されるソルガム種および他の野生型ソルガム種との間の雑種の生産に対して存在する（Ｈｏｄｎｅｔｔら、２００５）。該障壁は、野生型ソルガム種の花粉管が卵に到達し、受粉する前にソルガムの雌しべの生長を止めるので、接合前である（Ｐｒｉｃｅら、２００６）。
【０１１７】
ＩＡｐ［Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｉｅｎ Ｐｏｌｌｅｎ（外来花粉の阻害）］と称される単一遺伝子座は、栽培ソルガム種（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ Ｌ． Ｍｏｅｎｃｈ）とＥｕ−ソルガムセクション外の野生型ソルガム種との間の生殖的隔離の一原因である。ホモ接合性劣性条件において、ｉａｐ ｉａｐ遺伝子型は、該生殖的隔離を排除し、ソルガム・ビカラーおよび野生型ソルガム種間での雑種回収を可能にする（Ｈｏｄｎｅｔｔら、２００５；Ｐｒｉｃｅら、２００６）。遺伝子型は、最初、ソルガム・ビカラーにおいてアクセッション「ＮＲ４８１」として同定されたが（ＬａｕｒｉｅおよびＢｅｎｎｅｔｔ、１９８９）、該アクセッションは、背丈高、色素性種皮、および倒伏に対する極度の感受性などの農業経済学的に望ましくない特徴を有する。遺伝子移入子孫において回収されたいずれの野生種遺伝子変種も、遺伝的背景が乏しいので、遺伝子移入計画における使用の可能性は、制限される。
【０１１８】
ｉａｐ ｉａｐ遺伝子型を有する改善されたソルガム・ビカラー生殖質は、有意に改善した農業経済学的性能ならびにｍｓ３遺伝学的雄性不稔性系の分離と共に開発された。該系統は、遺伝的雄性不稔性ＢＴｘ６２３（遺伝的雄性不稔性についてのｍｓ３対立遺伝子を含有するＢＴｘ６２３の誘導体）とＮＲ４８１（ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性の系統）との間の交雑から開発された。該雑種をＢＴｘ６２３ｍｓ３親に対して一度戻し交配した。ＴＸ２００５のカレッジ・ステーションにおいて、不稔性ＢＣ１Ｆ１子孫を自家受粉し、３−矮性背丈、白色果皮、無芒、色素性種皮の不在、および倒伏減少について選択した。ＢＣ１Ｆ２子孫を温室中で生育させ、手で除雄し、トウモロコシ花粉管生長について試験した（ＬａｕｒｉｅおよびＢｅｎｎｅｔｔ、１９８９）。Ｉａｐ遺伝子座における遺伝子型は、受粉後２４時間のソルガム雌しべの花柱の基部に対するトウモロコシ花粉管生長を質的に測定することに基づいた。花柱の基部に対するトウモロコシ花粉管生長を示す個体は、ｉａｐ ｉａｐと見なされる（図１）。選択されたｉａｐ ｉａｐ個体を自家受粉させ、子孫列を次シーズンにテキサス州カレッジ・ステーションで生育させた。倒伏、背丈、芒およびｍｓ３対立遺伝子の分離について、系統を評価した。ｍｓ３分離列内の選択された雄性稔性および不稔性植物（ＢＣ１Ｆ３）を同種交配した。同種交配個体をテキサス州ウェスラコで生育させ、ｍｓ３の安定した戻し交配分離、倒伏、背丈、成熟について評価し、トウモロコシ花粉管生長を用いて、Ｉａｐ遺伝子座遺伝子型を確認した（表１および２）。選択された系統は、雄性不稔性および稔性植物間で大量に同種交配して、提案される遺伝的ストックのブリーダー用の種子を生産した。選択された系統は、Ａ１細胞質雄性不稔性系における不稔性の維持系統である。
【０１１９】
ｉａｐ ｉａｐ遺伝子型の観察された発現、花柱の基部に対するトウモロコシ花粉管生長は、以前に報告されたよりも低頻度であり（ＬａｕｒｉｅおよびＢｅｎｎｅｔｔ、１９８９）、恐らく環境的に影響を受けている。Ｔｘ３３６１は、全ての試験した環境において、ＮＲ４８１と類似の発現を有した。該遺伝的ストックは、雌性親として使用して、外来ソルガム種およびおそらく属を超える種との種間交配を得ることができる。いずれの回収された遺伝子移入も、さらなる評価および交配についてより好ましい遺伝的背景にあるであろう。
【０１２０】
【表１】
１Ｄｗａｒｆ遺伝子座：各矮性遺伝子座におけるホモ接合性対立遺伝子を示す。
†ＮＲ４８１は、ホモ接合性劣性である２つの遺伝子座を有するが、Ｄｗ２の遺伝子型のみが知られている。
２果皮の色：Ｒ＝赤、Ｗ＝白、
３芒、色素性種皮、およびｍｓ３戻し交配分離：Ｙ＝有り、Ｎ＝無し
４花柱基底に対するトウモロコシ花粉管生長を有するソルガム雌しべの頻度。値は平均であり、列内の異なる文字は、有意に異なる平均α＝．０５
５倒伏：０−９のスケール。０＝０−１０％、９＝９０−１００％倒伏
【０１２１】
テキサス州カレッジ・ステーションのテキサスＡＧＲＩＬＩＦＥＴＭ（登録商標）リサーチソルガム交配計画において、Ｔｘ３３６１系統が選択され、評価され、増幅された。ＡＧＲＩＬＩＦＥＴＭソルガム開発プログラムのナンバリングシステムを用いて、該遺伝的ストックをＴｘ３３６１と名付けた。Ｔｘ３３６１系統は、表現型評価の対象であり、その結果を下記の表２に示す。
【０１２２】
【表２−１】
【表２−２】
＊これらは、典型的な値である。値は、環境によって変化しうる。
【０１２３】
実施例２
モロコシ属親系統Ｔｘ３３６１ｍｓ３との属間雑種生産
２００７年の秋に、Ｔｘ３３６１ｍｓ３植物をサッカラム・スポンタネウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）、市販のサトウキビ［サッカラム・オフィシナラム（Ｓ． ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）ｘサッカラム・スポンタネウム（Ｓ． ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）］、およびミスケイン（miscane）（ススキ属 ｘ サトウキビ属）由来の花粉で受粉した。
【０１２４】
Ｔｘ３３６１ｍｓ３とサトウキビとの交配が成功し、１５００を超える推定Ｆ１種子が収穫された（受粉した全１７植物体において生産された）。２６個の推定Ｆ１雑種幼植物（７５個の種子から生産された）を植え、例示的植物を図２に示す。
【０１２５】
Ｔｘ３３６１ｍｓ３ ｘ サッカラム・スポンタネウムおよびＴｘ３３６１ｍｓ３ ｘ ミスカンサス・シネンシス（Ｍ． ｓｉｎｅｓｉｓ）の受粉は、受精が起こり、胚が形成したので、成功したが、発達は典型的に、内胚乳崩壊によって妨害された。Ｔｘ３３６１ｍｓ３とミスケインとの雑種において、胚レスキューが成功し、１６個の推定雑種が回収された。したがって、内胚乳崩壊が起こる場合、胚のイン・ビトロ培養がＦ１雑種を回収するのに有効であることが見出された。
【０１２６】
正常（ホモ接合性Ｉａｐ）Ｔｘ６２３ｍｓ３との受粉は、決して、受精、胚または内胚乳発達の証拠を示さなかったので、これらの雑種の全てにおいて、Ｔｘ３３６１ｍｓ３における変異体ｉａｐの利用は、非常に重要であった。
【０１２７】
２００８年に、ソルガム ｘ サトウキビおよびソルガム ｘ ミスケインの多くの雑種が生産され、温室で栽培された。また、多くのソルガム ｘ ミスカンサス・シネンシス胚が生産された。これらの植物は、その種子親であるＴｘ３３６１に似た表現型を示さなかった。該属間雑種は、種子またはクローン的に繁殖させたバイオ燃料作物として、または１の種から別の種へ遺伝子および形質を移入する手段として、直接使用される可能性がある。移入のための例示的プロトコールを図３および４に示す。
【０１２８】
実施例３
ソルガムとサトウキビとの雑種の生産および分析
開花時期がサトウキビの開花時期と一致するように、７月中旬から９月中旬まで、系統Ｔｘ３３６１の種子を温室内のポットに植えた。開花開始時、葯の表現型に基づいて、Ｔｘ３３６１の雄性不稔性植物を同定し、袋を被せた。ルイジアナ州ホーマにあるＵＳＤＡ−ＡＲＳシュガーケイン・リサーチ・ユニットで、２００７年および２００８年の９月下旬〜１１月上旬に、ソルガムとサトウキビとの受粉を行った。１月および２月にカレッジ・ステーションで、さらなる受粉を行った。全部で６７個の基本的な商業的サトウキビ育種系統を雄性親として用いた。
【０１２９】
ホーマで行った受粉は、ソルガムの円錐花序にサトウキビ花粉を振り掛け、ソルガムの円錐花序をサトウキビの穂でこすることによって完了した。次の年、１〜３個のソルガム円錐花序を単一のサトウキビ親と共に置き、サトウキビの穂を軽くたたき、次いで、ソルガムの円錐花序をサトウキビの穂の中に擦りつけることによって交雑を行った。該工程は、連続して３または４日繰り返した。これらの交雑完了後、受粉したソルガム植物を種子発生および成熟のために、カレッジ・ステーションに戻した。カレッジ・ステーションで行われるソルガムｘサトウキビ交雑の場合、各ソルガム円錐花序を一回受粉し、前年にホーマで実施された同じ方法を用いて受粉を行った。
【０１３０】
種子の準備
種子は、３年にわたって受粉後各々、平均４６、４１および２７日で母性親から取り出した。１年目に得られた種子は、発芽の３０〜９０日前に貯蔵されたが、次の年の種子は、収穫直後に発芽した。種子における高頻度の胎生のため、収穫および発芽のタイムラインが減少した。収穫後かつ発芽前に、まず、キャプタン（Captan）およびアプロン（Apron）の液体懸濁液で少なくとも１時間半、種子をコーティングし、次いで、３０％漂白溶液中で２０分間浸漬することによって、種子を表面滅菌した。表面滅菌後、種子を滅菌水でリンスし、１０ｍｇ Ｌ−１グリシン、１０ｍｇ Ｌ−１ Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ、１０ｍｇ Ｌ−１ Ｌ−チロシン、１００ｍｇ Ｌ−１イノシトール、および３０ｇ Ｌ−１シュークロースを補足し、０．７％寒天（植物組織培養グレード、Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ， ＫＳ）で固化させたムラシゲ−スクーグ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２）基礎塩およびビタミン培養培地を含有するペトリ皿中に胚を上にして置いた（Ｓｈａｒｍａ，１９９９）。全てのペトリ皿をパラフィルムで密閉し、１日１４時間に設定した育成用照明下、２７〜３０℃の一定温度に置いた。根およびシュートの両方において良好な発達を示した全ての種子を４’’ポットに植えた。いったん確立すると、それらを温室に移した。
【０１３１】
属間雑種植物の確認
属間雑種は、最初、形態学によって分類された。それらが発達するにつれて、全ての雑種は、父性親によって譲られない形質を有するほか、母性親が有しなかったサトウキビの多くの特徴（背丈、腋芽、成熟）を示した。これらの植物は、体細胞染色体数によって、属間雑種として確認された。染色体スプレッドは、ＪｅｗｅｌｌおよびＩｓｌａｍ−Ｆａｒｉｄｉ（１９９４）によって記載された方法に下記の変更を加えた方法を用いて、根端から調製された。若い活発に生長している根端を室温にて２．７５時間、α−ブロモナフタレンの飽和水溶液で前処理し、３：１ ９５％エタノール／氷酢酸（３：１ ｖ／ｖ）中で一晩固定した。次いで、根端を蒸留水で数回リンスし、０．２Ｍ ＨＣｌ中で１０分間加水分解し、蒸留水中で１０分リンスした。細胞壁を５％セルロース（Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０， Ｙａｋｕｌｔ Ｈｏｎｓｈａ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｔｏｋｙｏ）および１．０％ペクトラーゼＹ−２３（Ｓｅｉｓｈｉｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｔｏｋｙｏ）の水溶液で、ｐＨ４．５にて３７℃で３５〜６０分間消化し、蒸留水で３回リンスした。分裂組織をエタノール／氷酢酸（３：１）溶液中、透明ガラススライド上に置き、漬け込み、先の細い鉗子で広げ、室温で２日間風乾し、アズール・ブルー（Azure Blue）で染色した。根端スプレッドをツァイス・ユニバーサルＩＩ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．， Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、６３Ｘおよび１００Ｘアポクロマート対物レンズで調べた。オプトニクスＶＩ−４７０システム（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．， Ｇｏｌｅｔａ， ＣＡ）で画像を獲得し、デジタル保存し、オプティマス（ｖ．６．１）画像分析ソフトウェア（Ｏｐｔｉｍａｓ Ｃｏｒｐ．， Ｂｏｔｈｅｌｌ， ＷＡ）で加工した。
【０１３２】
雑種種子セットに対するサトウキビポリネーター（pollinator）の影響
２年目にホーマで行われた各交雑について、サトウキビ親植物、受粉日、受粉場所、花粉量、小花／円錐花序および生じた幼植物を記録した。サトウキビ花粉量は、解剖顕微鏡下で乾燥した柱頭を評価し、それらを軽い、中程度または重い（「軽い」は観察可能な花粉がほとんど無いか、または無いことを意味し、「中程度」ランクは、花粉がいくつかの柱頭で観察された場合に割り当て、「重い」ランクは、完全な被覆が観察された場合に割り当てられた）と格付けすることによって、雑種種子が収穫されたときに測定された主観的測定値であった。３年目にカレッジ・ステーションで行われた各交雑について、サトウキビ親植物、受粉日、種子／円錐花序および生じた幼植物を記録した。
【０１３３】
場所、受粉日およびサトウキビポリネーターの種子セットおよび花粉量に対する相対的影響を決定するために、ＳＡＳ ｖ９．１のＰＲＯＣ ＧＬＭを用いた。少なくとも３回の受粉に用いられたサトウキビ雄だけが該分析に含まれた。全ての影響を一定とみなし、ポリネーターを含む相互作用だけを分散分析に含めた。
【０１３４】
２００７年の雑種種子生産、確認および生長
２００７年（１年目）の秋に、１７種類の異なるポリネーターを用いて、全部で２４回の受粉を行った（表３）。柱頭反応に基づいて、受粉後に受精が起こったことは明らかであった。種子が発生し始めたが、サイズおよび生長速度は、正常なソルガムの自家受粉または他家受粉と比べて減少した。種子を発芽（収穫および貯蔵後）のために準備したとき、種子発生および発生後の胎生の間の胚喪失が一般的であることは明らかであり、さらなる分析は、３２％が胎生であり、３９％に胚がないことを示した。かなりの割合の残りの種子が発芽し、植物を生産した。これらの植物の全てが属間雑種であり、それらは、非常に生長が乏しいものから非常に生長力のあるものまで幅広い表現型を反映した。
【０１３５】
これらの受粉から、最も良好な雑種のうち２３個を温室内のポットに移植した。これらの植物の全てがサトウキビに類似した形態学的特徴を有していた（図５）。これらの雑種についての体細胞染色体数は、５６〜６４の範囲であり、１０個の染色体がソルガム由来であり、残りの染色体がサトウキビ属由来であった。該雑種は、短くて幅の広い少数の葉を有するＴｘ３３６１と比べて、長くて幅の狭い多数の葉を有する。発達において、２３個の雑種が幅広い範囲の生長力および生長性質を示し、これらの雑種のうち２つが優れた生長および発達を示した。これらの雑種は、生長力があり、サトウキビのようによく分けつしたが、各々、ソルガムに特有の形態学的形質、例えば、節のある支柱根および／または葉鞘における過剰なワックス粉を有した。７ヶ月で、雑種Ｌ０７−１１Ｓの茎は３．１ｍであったが、雑種Ｌ０７−９Ｓの茎は２．７ｍであった（図５Ａ）。これらの雑種のいずれも、サトウキビのように光周期感受性であり、カレッジ・ステーションにおいて１２月中旬から１月に開花したが、一方、Ｔｘ３３６１は、播種日にかかわらず、約６５日で開花する。これらの雑種の円錐花序は、サトウキビのものよりわずかに小型であり、検定交雑の試みにより、これら２つの特定の雑種の雄性および雌性不稔性の両方を確認した。８月に、両雑種の数本の茎を切断して、栄養繁殖および糖分布について試験した。栄養繁殖は成功し、これらの雑種中の糖濃度は、サトウキビにおいて見出されるパターンと類似し、より成熟した節間において糖濃度は増加した（図６）（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ａｎｄ Ｂｏｔｈａ， １９９７）。
【０１３６】
さらなる雑種種子生産およびプロセスの増強（２００８／２００９）
２００８年に、全部で１５５個のソルガム円錐花序（全部で７４，３００個の小花）を受粉した。これらの受粉から、１０，３４７個の種子を回収し、その結果、平均１４％の種子セットをもたらした。種子セットの割合は、２００９年の受粉において測定されなかったが、２００８年に観察されたのと同様なようであった。しかしながら、種子がより早期に収穫され、胎生による喪失が回避されたので、発芽は、２００８年と２００９年の受粉の間で実質的に改善された。２００９年に、種子がより早期に収穫されて（受粉後２８日 対 受粉後４０日）胎生による喪失を回避したので、発芽は２００８年から２００９年に増加した。さらに、２００８年の発芽は、胚が種子外被を通って生長できないことにより、さらに減少し、それゆえ、２００９年の種子の全てにおいて、培地に植える前に果皮が除去された。技術が改善されるにつれて、発芽率は、２００７年の２．５％から２００８年の５．７％に、２００９年では３３％に改善した。
【０１３７】
表３：ソルガムｘサトウキビ交雑において用いられたサトウキビ親
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【０１３８】
合わせた２００８／２００９受粉由来の全部で１３４８本の幼植物をポットに植え、温室に移動させた。これらの雑種に存在する表現型バリエーションは広範囲であったが、全て、形態学的に、ソルガムよりもサトウキビに似ていた。２００９年の春に、４８５個の雑種を選択し（生長力に基づいて）、カレッジ・ステーションの近くのスペース・プラントナーサリーに移植した（表３）。これらの雑種は、２００７年の交雑から評価された雑種の限定されたセットにおいて観察された生長および発達パターンに従うと予想される。
【０１３９】
種子セットおよび発芽に対するポリネーター親の影響
分散分析は、ポリネーター親に起因して種子セットに対する有意な影響を示した（表４）。ポリネーターに起因するバリエーションの範囲は、明らかに、ある特定のサトウキビ品種がＴｘ３３６１における属間雑種の生産のためのより良好なポリネーターであることを示す。Ｌ０６−０２４、ＨｏＣＰ０５−９０４およびＨｏ０６−５６２などのサトウキビポリネーターは、最も有効な雑種種子生産を実証する（表５）。
【０１４０】
【表４】
【０１４１】
【表５】
＊ 少なくとも３回の受粉で使用されたポリネーターのみを該分析に含めた。
＊＊ 花粉量評価は、１（軽い）、２（中程度）および３（重い）であった。
【０１４２】
サトウキビにおける花粉散布が遺伝子型および環境によって影響されることは知られており（ＭｏｏｒｅおよびＮｕｓｓ，１９８７）、分散分析は、花粉量がポリネーター親および受粉日によって影響されたことを確認した（表４）。低花粉量を有する系統は、一貫して、低い割合の種子セットを有する交雑をもたらしたが、必ずしも高花粉量が高い割合の種子セットを示したわけではない。上位７つのサトウキビポリネーターのうち６個（種子セットパーセンテージによって定義される）は、平均以上の花粉量を有したが、平均より低い割合の種子セットを有する雄花は、花粉量において変動した（表５）。これらの結果は、雄花が良好な花粉を生産するだけではなく、Ｔｘ３３６１との好ましい遺伝的および／またはゲノム的和合性を有さなければならないことを意味する。
【０１４３】
２００９年の分散分析データは、受粉環境およびサトウキビポリネーターのどちらも発芽割合に影響しないことを示した。種子生産および発芽を管理するための現在の技術に基づいて、使用されるポリネーターおよび受粉場所に拘わらず、該種子の２５−４０％が発芽し、植物を生産すると予想するのが妥当である。
【０１４４】
実施例４
ソルガムの広い雑種における花粉管生長
本明細書中で明らかにされた成功した雑種形成を考慮して、Ｔｘ３３６１ソルガム植物をさらに、付加的な属の植物由来の花粉を用いて受粉させた。受粉後、花粉管生長を観察し、記録した（表６）。花柱と表示したカラムの値は、花粉管生長量を示し、より高い値が大きな生長を示す。
【０１４５】
【表６−１】
【表６−２】
【表６−３】
【０１４６】
本明細書中に開示および主張される方法の全ては、本願の開示を踏まえて、過度の実験を行うことなく実施することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい具体例に関して記載されているが、発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載の方法および方法の工程または工程の順序に変更を加えてもよいことは、当業者に明らかであろう。より詳細には、化学的かつ生理学的に関連するある特定の剤を本明細書に記載の剤と置き換えてもよく、同一または類似の結果が達成されることが明らかであろう。当業者に明らかな全てのかかる類似置換物および修飾は、添付の特許請求の範囲によって規定される発明の精神、範囲および概念内にあると考えられる。
【０１４７】
参考文献
下記の参考文献は、それらが典型的な手順または本明細書に示されるものを補足する他の詳細を提供する程度まで、特に出典明示により本明細書の一部とされる。
米国特許第２，７９９，２４１号；米国特許第３，０８９，８２４号；米国特許第３，１７７，０２７号；米国特許第３，１９６，８２７号；米国特許第３，２０７，８２４号；米国特許第３，２４１，５２０号；米国特許第３，２５３，９９４号；米国特許第３，８４９，９３４号；米国特許第４，３５５，１０８号；米国特許第４，４６１，６４８号；米国特許第４，５３５，０６０号；米国特許第４，９３６，９０４号；米国特許第５，０５３，２３１号；米国特許第５，５４５，８１８号；米国特許第５，６０２，３２１号；米国特許第６，９２７，０４８号。
米国植物特許第ＰＰ１７，６３６号；米国植物特許第ＰＰ１８，８０７号；米国植物特許第ＰＰ１８，８２６号。
米国特許公報第２００４００４９８０２号；米国特許公報第２００８００９２２５５号。
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Ｌｅｅら、Ａｄｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｅｎｇｎｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ６５： ９３−１１５， １９９９
Ｌｅｅら、Ｋｏｒｅａｎ Ｊ． Ｇｅｎｅｔ．， １１（２）：６５−７２， １９８９．
Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．， １６３：４４１−４５０， ２００２．
ＭｃＣｌｕｒｅおよびＦｒａｎｋｌｉｎ−Ｔｏｎｇ、Ｐｌａｎｔａ， ２２４：２３３−２４５， ２００６．
Ｍｅｎｚら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．， Ｂｉｏｌ．， ４８：４８３−４９９， ２００２．
ＭｏｒｊａｎｏｆｆおよびＧｒａｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ２９：７３３−７４１， １９８７．
Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２０５：４２−５０， １９８６．
ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ．， １５：４７３−４９７， １９６２．
Ｎａｉｔｈａｎｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １０４：１２２１１−１２２１６， ２００７．
ＮａｓｒａｌｌａｈおよびＮａｓｒａｌｌａｈ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ５：１３２５−１３３５， １９９３．
Ｎａｓｒａｌｌａｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９６：３０５−３０８， ２００２．
Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ， ３１３：８１０−８１２， １９８５．
Ｏｗら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３４：８５６−８５９， １９８６．
Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １０１：９９０３−９９０８， ２００４．
ＰＣＴ出願 ＷＯ ９７／４１２２８
ＰｅｄｅｒｓｅｎおよびＴｏｙ、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３７（６）：１９７３−１９７５， １９９７．
Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， １９９：１８３−１８８， １９８５．
Ｐｒａｓｈｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １２６（３）：１２５９−１２６８， １９８５．
Ｐｒｉｃｅら、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ４６：２６１７−２６２２， ２００６．
Ｒａｈｍａｎら、Ｓｅｘｕａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ．， ２０：７３−８５， ２００７．
Ｒｅｉｃｈｅｌら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３ ： ５８８８−５８９３． １９９６．
Ｒｏｏｎｅｙら、Ｂｉｏｆｕｅｌｓ， Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｂｉｏｒｅｆｉｎｉｎｇ．， １：１４７−１５７， ２００７．
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｉｎ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９．
Ｓｃｈｗａｒｚａｃｈｅｒら、Ａｎｎ． Ｂｏｔａｎｙ， ６４：３１５-３２４， １９８９．
Ｓｈｅｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ８（５）：７７７−７８４， １９９５．
Ｓｔａｌｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２：４１９−４２２， １９８８．
Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２１５（３）：４３１−４４０， １９８９．
Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７５：３７３７−３７４１， １９７８．
Ｓｗａｎｓｏｎら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ３８：７９３−８１８， ２００４．
Ｔａｂａｈら、Ｓｅｘｕａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ．， １７：１３１−１４０， ２００４．
Ｔｈｉｌｌｅｔら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３：１２５００−１２５０８， １９８８．
Ｔｉａｎ， Ｓｅｑｕｉｎ， Ｃｈａｒｅｓｔ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．， １６：２６７-２７１， １９９７．
Ｔｗｅｌｌら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９１：１２７０−１２７４， １９８９
Ｖａｓｉｌら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ９１：１５７５−１５７９， １９８９．
Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：６６２４−６６２８， １９８７．
Ｗａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １２（８）：３３９９−３４０６， １９９２．
Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ， １５１：５６５−５８４， ２００１．
ＹａｎｇおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：４１４４−４１４８， １９９０．
Ｚｈｕら、Ｊ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， ５２， ２４３−２５２ １９９８．
Ｚｕｋｏｗｓｋｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０：１１０１−１１０５， １９８３．
【図１Ａ−Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソルガム親植物をサトウキビ属親植物と交雑することによって生産される属間雑種植物であって、該ソルガム親植物が劣性ｉａｐ対立遺伝子に関してホモ接合性である、植物。
【請求項２】
ソルガム親植物がソルガム・ビカラー植物である、請求項１記載の植物。
【請求項３】
ソルガム親植物が雄性不稔性である、請求項１記載の植物。
【請求項４】
ソルガム親植物がソルガム系統Ｔｘ３３６１である、請求項３記載の植物。
【請求項５】
サトウキビ属親植物がサッカラム・スポンタネウム、サッカラム・オフィシナラム、またはサッカラム・オフィシナラムとサッカラム・スポンタネウムとの雑種植物である、請求項１記載の植物。
【請求項６】
サトウキビ属親植物がサトウキビ品種Ｌ０６−０２４、ＨｏＣＰ０５−９０４、またはＨｏ０６−５６２である、請求項５記載の植物。
【請求項７】
トランス遺伝子をさらに含む、請求項１記載の植物。
【請求項８】
トランス遺伝子が病害耐性、昆虫耐性、除草剤耐性、乾燥耐性、耐塩性、雄性不稔性、または糖含量増加を付与する、請求項７記載の植物。
【請求項９】
請求項１記載の植物の植物部位。
【請求項１０】
プロトプラスト、細胞、配偶子、分裂組織、根、雌しべ、葯、花、種子、胚、茎、または葉柄としてさらに定義される、請求項９記載の植物部位。
【請求項１１】
２ｎ植物配偶子としてさらに定義される、請求項１０記載の植物部位。
【請求項１２】
請求項１記載の植物を生産する種子。
【請求項１３】
殺害虫剤、殺真菌剤、養分または水もしくは温度感受性ポリマー、あるいは種子の機械的取扱性、種子発芽、幼植物確立または生長を改善するための剤を含む剤でさらに被覆される、請求項１２記載の種子。
【請求項１４】
請求項１記載の植物から得られた商業的製品。
【請求項１５】
商業的製品が発酵性バイオ燃料供給原料、サトウキビ汁、糖蜜、バガス、エタノール、バイオジーゼルまたは糖類である、請求項１４記載の商業的製品。
【請求項１６】
ソルガム親植物由来の少なくとも１つの第１の染色体またはそのセグメントおよびサトウキビ属親植物由来の少なくとも１つの第１の染色体またはそのセグメントを含む、請求項１記載の植物の子孫植物。
【請求項１７】
請求項１記載の植物の再生可能な細胞の組織培養物。
【請求項１８】
再生可能な細胞が胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、葯、雌しべ、花、種子、ボール、または茎から由来する、請求項１７記載の組織培養物。
【請求項１９】
請求項１７記載の組織培養物から再生した植物。
【請求項２０】
請求項１記載の植物またはその部位を得、そこから商業的製品を製造することを含む、商業的製品の製造方法。
【請求項２１】
商業的製品が発酵性バイオ燃料供給原料、サトウキビ汁、糖蜜、バガス、エタノール、バイオジーゼルまたは糖類である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
雄性不稔性を付与する対立遺伝子を含むソルガム植物であって、劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性である植物。
【請求項２３】
対立遺伝子がｍｓ３である、請求項２２記載のソルガム植物。
【請求項２４】
請求項２２記載のソルガム植物を生産する種子。
【請求項２５】
ソルガム親植物とサトウキビ属親植物を交雑させることを含み、ここに、該ソルガム親植物がソルガムの劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性であり、雌性親として用いられる、属間雑種胚または種子の生産方法。
【請求項２６】
交雑から生じた胚をレスキューすることを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
交雑から生じた胚を生育させて属間雑種植物を生産することを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
胚が機能的内胚乳を有する種子に含まれる、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
ソルガム親植物と異なる属由来の第２の単子葉植物を交雑させることによって生産される属間雑種植物であって、ここに、該ソルガム親植物が劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性である、植物。
【請求項３０】
ソルガム親植物がソルガム・ビカラー植物である、請求項２９記載の植物。
【請求項３１】
ソルガム親植物が雄性不稔性を含む、請求項２９記載の植物。
【請求項３２】
ソルガム親植物がソルガム系統Ｔｘ３３６１の植物である、請求項３１記載の植物。
【請求項３３】
第２の単子葉植物がイネ科の植物である、請求項２９記載の植物。
【請求項３４】
第２の単子葉植物がサトウキビ属植物、ススキ属植物、トウキビ属とススキ属との雑種植物、エリアンサス属植物、ソルガストラム属植物、キビ属植物、チカラシバ属植物、またはトウモロコシ属植物である、請求項２９記載の植物。
【請求項３５】
第２の単子葉植物がパニカム・ヴァーガタム、ペニセタム・パーパレウム、ペニセタム・シリアレ、ペニセタム・グラウカム、アンドロポゴン・ゲラルディイ、アンドロポゴン・ハリイ、シザキリウム・スコパリウム、ソルガストラム・ヌタンス、アルンド・ドナックス、トリプシカム・ダクチロイデス、スポロボルス・エイリオデス、ミスカンサス・フロリデュルス、ミスカンサス・シネンシス、ゼア・メイス、ゼア・ニカラグエンシス、ゼア・ペレニス、またはゼア・ジプロペレニス植物である、請求項２９記載の植物。
【請求項３６】
トランス遺伝子をさらに含む、請求項２９記載の植物。
【請求項３７】
トランス遺伝子が病害耐性、昆虫耐性、除草剤耐性、乾燥耐性、耐塩性、雄性不稔性、または糖含量増加を付与する、請求項３６記載の植物。
【請求項３８】
請求項２９記載の植物の植物部位。
【請求項３９】
プロトプラスト、細胞、配偶子、分裂組織、根、雌しべ、葯、花、種子、胚、茎、または葉柄としてさらに定義される、請求項３８記載の植物部位。
【請求項４０】
２ｎ植物配偶子としてさらに定義される、請求項３９記載の植物部位。
【請求項４１】
請求項２９記載の植物を生産する種子。
【請求項４２】
殺害虫剤、殺真菌剤、養分もしくは水または温度感受性ポリマー、あるいは種子の機械的取扱性、種子発芽、幼植物確立または生長を改善するための剤を含む剤でさらに被覆される、請求項４１記載の種子。
【請求項４３】
請求項２９記載の植物から得られた商業的製品。
【請求項４４】
商業的製品が発酵性バイオ燃料供給原料、サトウキビ汁、糖蜜、バガス、エタノール、バイオジーゼルまたは糖類である、請求項４３記載の商業的製品。
【請求項４５】
ソルガム親植物由来の少なくとも１つの第１の染色体またはそのセグメントおよび第２の単子葉植物由来の少なくとも１つの第１の染色体またはそのセグメントを含む、請求項２９載の植物の子孫植物。
【請求項４６】
請求項２９記載の植物の再生可能な細胞の組織培養物。
【請求項４７】
再生可能な細胞が胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、葯、雌しべ、花、種子、ボール、または茎から由来する、請求項４６記載の組織培養物。
【請求項４８】
請求項４６記載の組織培養物から再生した植物。
【請求項４９】
請求項２９記載の植物またはその部位を得、それから商業的製品を製造することを含む、商業的製品の製造方法。
【請求項５０】
商業的製品が発酵性バイオ燃料供給原料、サトウキビ汁、糖蜜、バガス、エタノール、バイオジーゼルまたは糖類である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ソルガム親植物と第２の単子葉親植物を交雑させることを含み、ここに、該ソルガム植物がソルガムの劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性であり、雌性親として用いられる、属間雑種胚または種子の生産方法。
【請求項５２】
交雑から生じた胚をレスキューすることを含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
交雑から生じた胚を生育させて属間雑種植物を生産することを含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５４】
胚が機能的内胚乳を有する種子に含まれる、請求項５１記載の方法。
【請求項５５】
属間雑種植物を戻し交配させて第３の単子葉植物を得ることをさらに含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５６】
第３の単子葉植物を同系交配させて、少なくとも１つの遺伝子移入された形質または遺伝子についてホモ接合性である遺伝子移入された子孫を生産することをさらに含む、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
ソルガム植物が遺伝子的または細胞質性雄性不稔性を付与する遺伝子を含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５８】
ソルガム親植物がソルガム系統Ｔｘ３３６１の植物である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
単子葉植物がイネ科植物から選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項６０】
単子葉植物がサトウキビ属、ススキ属、エリアンサス属、トウモロコシ属、ソルガストラム属、キビ属およびチカラシバ属からなる群から選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項６１】
単子葉植物がサッカラム・オフィシナラム、サッカラム・スポンタネウム、またはサッカラム・オフィシナラムとサッカラム・スポンタネウムとの雑種植物である、請求項５１記載の方法。
【請求項６２】
単子葉植物がパニカム・ヴァーガタム、ペニセタム・パーパレウム、ペニセタム・シリアレ、ペニセタム・グラウカム、アンドロポゴン・ゲラルディイ、アンドロポゴン・ハリイ、シザキリウム・スコパリウム、ソルガストラム・ヌタンス、アルンド・ドナックス、トリプシカム・ダクチロイデス、スポロボルス・エイリオデス、ミスカンサス・フロリデュルス、ミスカンサス・シネンシス、ゼア・メイス、ゼア・ニカラグエンシス、ゼア・ペレニス、またはゼア・ジプロペレニス植物である、請求項５１記載の方法。
【請求項６３】
ソルガム親植物と第２の単子葉植物との交雑が、
（ｉ）単子葉親植物から花粉を収集し、
（ｉｉ）該花粉でソルガム親植物の花を受粉させる
ことを含む、請求項５１記載の方法。
【請求項６４】
属間雑種植物または種子を染色体倍加剤で処理する、請求項５１記載の方法。
【請求項６５】
染色体倍加剤が化学的染色体倍加剤である、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
請求項５１記載の方法によって生産された属間雑種種子、植物またはその部位。
【請求項６７】
ソルガム親植物由来の少なくとも１つの第１の染色体またはそのセグメントおよび第２の単子葉親植物由来の少なくとも１つの第１の染色体またはそのセグメントを含む、請求項５３載の植物の子孫属間雑種植物。
【請求項１】
ソルガム親植物をサトウキビ属親植物と交雑することによって生産される属間雑種植物であって、該ソルガム親植物が劣性ｉａｐ対立遺伝子に関してホモ接合性である、植物。
【請求項２】
ソルガム親植物がソルガム・ビカラー植物である、請求項１記載の植物。
【請求項３】
ソルガム親植物が雄性不稔性である、請求項１記載の植物。
【請求項４】
ソルガム親植物がソルガム系統Ｔｘ３３６１である、請求項３記載の植物。
【請求項５】
サトウキビ属親植物がサッカラム・スポンタネウム、サッカラム・オフィシナラム、またはサッカラム・オフィシナラムとサッカラム・スポンタネウムとの雑種植物である、請求項１記載の植物。
【請求項６】
サトウキビ属親植物がサトウキビ品種Ｌ０６−０２４、ＨｏＣＰ０５−９０４、またはＨｏ０６−５６２である、請求項５記載の植物。
【請求項７】
トランス遺伝子をさらに含む、請求項１記載の植物。
【請求項８】
トランス遺伝子が病害耐性、昆虫耐性、除草剤耐性、乾燥耐性、耐塩性、雄性不稔性、または糖含量増加を付与する、請求項７記載の植物。
【請求項９】
請求項１記載の植物の植物部位。
【請求項１０】
プロトプラスト、細胞、配偶子、分裂組織、根、雌しべ、葯、花、種子、胚、茎、または葉柄としてさらに定義される、請求項９記載の植物部位。
【請求項１１】
２ｎ植物配偶子としてさらに定義される、請求項１０記載の植物部位。
【請求項１２】
請求項１記載の植物を生産する種子。
【請求項１３】
殺害虫剤、殺真菌剤、養分または水もしくは温度感受性ポリマー、あるいは種子の機械的取扱性、種子発芽、幼植物確立または生長を改善するための剤を含む剤でさらに被覆される、請求項１２記載の種子。
【請求項１４】
請求項１記載の植物から得られた商業的製品。
【請求項１５】
商業的製品が発酵性バイオ燃料供給原料、サトウキビ汁、糖蜜、バガス、エタノール、バイオジーゼルまたは糖類である、請求項１４記載の商業的製品。
【請求項１６】
ソルガム親植物由来の少なくとも１つの第１の染色体またはそのセグメントおよびサトウキビ属親植物由来の少なくとも１つの第１の染色体またはそのセグメントを含む、請求項１記載の植物の子孫植物。
【請求項１７】
請求項１記載の植物の再生可能な細胞の組織培養物。
【請求項１８】
再生可能な細胞が胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、葯、雌しべ、花、種子、ボール、または茎から由来する、請求項１７記載の組織培養物。
【請求項１９】
請求項１７記載の組織培養物から再生した植物。
【請求項２０】
請求項１記載の植物またはその部位を得、そこから商業的製品を製造することを含む、商業的製品の製造方法。
【請求項２１】
商業的製品が発酵性バイオ燃料供給原料、サトウキビ汁、糖蜜、バガス、エタノール、バイオジーゼルまたは糖類である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
雄性不稔性を付与する対立遺伝子を含むソルガム植物であって、劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性である植物。
【請求項２３】
対立遺伝子がｍｓ３である、請求項２２記載のソルガム植物。
【請求項２４】
請求項２２記載のソルガム植物を生産する種子。
【請求項２５】
ソルガム親植物とサトウキビ属親植物を交雑させることを含み、ここに、該ソルガム親植物がソルガムの劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性であり、雌性親として用いられる、属間雑種胚または種子の生産方法。
【請求項２６】
交雑から生じた胚をレスキューすることを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
交雑から生じた胚を生育させて属間雑種植物を生産することを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
胚が機能的内胚乳を有する種子に含まれる、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
ソルガム親植物と異なる属由来の第２の単子葉植物を交雑させることによって生産される属間雑種植物であって、ここに、該ソルガム親植物が劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性である、植物。
【請求項３０】
ソルガム親植物がソルガム・ビカラー植物である、請求項２９記載の植物。
【請求項３１】
ソルガム親植物が雄性不稔性を含む、請求項２９記載の植物。
【請求項３２】
ソルガム親植物がソルガム系統Ｔｘ３３６１の植物である、請求項３１記載の植物。
【請求項３３】
第２の単子葉植物がイネ科の植物である、請求項２９記載の植物。
【請求項３４】
第２の単子葉植物がサトウキビ属植物、ススキ属植物、トウキビ属とススキ属との雑種植物、エリアンサス属植物、ソルガストラム属植物、キビ属植物、チカラシバ属植物、またはトウモロコシ属植物である、請求項２９記載の植物。
【請求項３５】
第２の単子葉植物がパニカム・ヴァーガタム、ペニセタム・パーパレウム、ペニセタム・シリアレ、ペニセタム・グラウカム、アンドロポゴン・ゲラルディイ、アンドロポゴン・ハリイ、シザキリウム・スコパリウム、ソルガストラム・ヌタンス、アルンド・ドナックス、トリプシカム・ダクチロイデス、スポロボルス・エイリオデス、ミスカンサス・フロリデュルス、ミスカンサス・シネンシス、ゼア・メイス、ゼア・ニカラグエンシス、ゼア・ペレニス、またはゼア・ジプロペレニス植物である、請求項２９記載の植物。
【請求項３６】
トランス遺伝子をさらに含む、請求項２９記載の植物。
【請求項３７】
トランス遺伝子が病害耐性、昆虫耐性、除草剤耐性、乾燥耐性、耐塩性、雄性不稔性、または糖含量増加を付与する、請求項３６記載の植物。
【請求項３８】
請求項２９記載の植物の植物部位。
【請求項３９】
プロトプラスト、細胞、配偶子、分裂組織、根、雌しべ、葯、花、種子、胚、茎、または葉柄としてさらに定義される、請求項３８記載の植物部位。
【請求項４０】
２ｎ植物配偶子としてさらに定義される、請求項３９記載の植物部位。
【請求項４１】
請求項２９記載の植物を生産する種子。
【請求項４２】
殺害虫剤、殺真菌剤、養分もしくは水または温度感受性ポリマー、あるいは種子の機械的取扱性、種子発芽、幼植物確立または生長を改善するための剤を含む剤でさらに被覆される、請求項４１記載の種子。
【請求項４３】
請求項２９記載の植物から得られた商業的製品。
【請求項４４】
商業的製品が発酵性バイオ燃料供給原料、サトウキビ汁、糖蜜、バガス、エタノール、バイオジーゼルまたは糖類である、請求項４３記載の商業的製品。
【請求項４５】
ソルガム親植物由来の少なくとも１つの第１の染色体またはそのセグメントおよび第２の単子葉植物由来の少なくとも１つの第１の染色体またはそのセグメントを含む、請求項２９載の植物の子孫植物。
【請求項４６】
請求項２９記載の植物の再生可能な細胞の組織培養物。
【請求項４７】
再生可能な細胞が胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、葯、雌しべ、花、種子、ボール、または茎から由来する、請求項４６記載の組織培養物。
【請求項４８】
請求項４６記載の組織培養物から再生した植物。
【請求項４９】
請求項２９記載の植物またはその部位を得、それから商業的製品を製造することを含む、商業的製品の製造方法。
【請求項５０】
商業的製品が発酵性バイオ燃料供給原料、サトウキビ汁、糖蜜、バガス、エタノール、バイオジーゼルまたは糖類である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ソルガム親植物と第２の単子葉親植物を交雑させることを含み、ここに、該ソルガム植物がソルガムの劣性ｉａｐ対立遺伝子についてホモ接合性であり、雌性親として用いられる、属間雑種胚または種子の生産方法。
【請求項５２】
交雑から生じた胚をレスキューすることを含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
交雑から生じた胚を生育させて属間雑種植物を生産することを含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５４】
胚が機能的内胚乳を有する種子に含まれる、請求項５１記載の方法。
【請求項５５】
属間雑種植物を戻し交配させて第３の単子葉植物を得ることをさらに含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５６】
第３の単子葉植物を同系交配させて、少なくとも１つの遺伝子移入された形質または遺伝子についてホモ接合性である遺伝子移入された子孫を生産することをさらに含む、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
ソルガム植物が遺伝子的または細胞質性雄性不稔性を付与する遺伝子を含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５８】
ソルガム親植物がソルガム系統Ｔｘ３３６１の植物である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
単子葉植物がイネ科植物から選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項６０】
単子葉植物がサトウキビ属、ススキ属、エリアンサス属、トウモロコシ属、ソルガストラム属、キビ属およびチカラシバ属からなる群から選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項６１】
単子葉植物がサッカラム・オフィシナラム、サッカラム・スポンタネウム、またはサッカラム・オフィシナラムとサッカラム・スポンタネウムとの雑種植物である、請求項５１記載の方法。
【請求項６２】
単子葉植物がパニカム・ヴァーガタム、ペニセタム・パーパレウム、ペニセタム・シリアレ、ペニセタム・グラウカム、アンドロポゴン・ゲラルディイ、アンドロポゴン・ハリイ、シザキリウム・スコパリウム、ソルガストラム・ヌタンス、アルンド・ドナックス、トリプシカム・ダクチロイデス、スポロボルス・エイリオデス、ミスカンサス・フロリデュルス、ミスカンサス・シネンシス、ゼア・メイス、ゼア・ニカラグエンシス、ゼア・ペレニス、またはゼア・ジプロペレニス植物である、請求項５１記載の方法。
【請求項６３】
ソルガム親植物と第２の単子葉植物との交雑が、
（ｉ）単子葉親植物から花粉を収集し、
（ｉｉ）該花粉でソルガム親植物の花を受粉させる
ことを含む、請求項５１記載の方法。
【請求項６４】
属間雑種植物または種子を染色体倍加剤で処理する、請求項５１記載の方法。
【請求項６５】
染色体倍加剤が化学的染色体倍加剤である、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
請求項５１記載の方法によって生産された属間雑種種子、植物またはその部位。
【請求項６７】
ソルガム親植物由来の少なくとも１つの第１の染色体またはそのセグメントおよび第２の単子葉親植物由来の少なくとも１つの第１の染色体またはそのセグメントを含む、請求項５３載の植物の子孫属間雑種植物。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ−Ｃ】
【図６】
【図３】
【図４】
【図５Ａ−Ｃ】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５２８９１１（Ｐ２０１１−５２８９１１Ａ）
【公表日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２０２２８（Ｐ２０１１−５２０２２８）
【出願日】平成２１年７月２４日（２００９．７．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５１７０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１１９３５
【国際公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【出願人】（５０１４９０４３８）ザ・テキサス・エイ・アンド・エム・ユニバーシティ・システム (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｔｅｘａｓ Ａ ＆ Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２４日（２００９．７．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５１７０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１１９３５
【国際公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【出願人】（５０１４９０４３８）ザ・テキサス・エイ・アンド・エム・ユニバーシティ・システム (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｔｅｘａｓ Ａ ＆ Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ
【Ｆターム（参考）】
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