リボザイムを用いたＲＮＡ転写機能を有するベクターとそれを用いたＲＮＡ製造法
【目的】 余分な塩基配列が付加していない１種または２種以上のＲＮＡ転写産物を、優れた転写効率で製造すること。
【構成】 ＤＮＡ配列の5'末端と3'末端とに各々、セルフプロセッシングにより当該5'末端と3'末端を各々切断するリボザイムを有するＲＮＡを１単位として、当該ＲＮＡ単位を１個又は２個以上連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む加してなるリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
【構成】 ＤＮＡ配列の5'末端と3'末端とに各々、セルフプロセッシングにより当該5'末端と3'末端を各々切断するリボザイムを有するＲＮＡを１単位として、当該ＲＮＡ単位を１個又は２個以上連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む加してなるリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リボザイムを用いたＲＮＡ転写機能を有するベクターとそれを用いたＲＮＡ製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、すべての酵素はタンパク質から構成されていると確信されていたが、1981年に酵素活性を有するＲＮＡ分子、すなわちリボザイムが発見され、従来の酵素に関する概念は打ち破られた。この画期的発見はコロラド大学のチェック（T.Cech）らによってもたらされた。すなわち、原生動物のテトラヒメナのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）前駆体においては、機能上不必要なイントロン（ＩＶＳ）がタンパク質酵素の力を借りずに、セルフスプライシングにより取り除かれることが証明された(Cell,Vol.31,p.147-157(1982);Nature Vol.308, p.820-825 (1984))。
【０００３】その後、例えばホスホジエステル結合をセルフスプライシングする触媒機能を有するＲＮＡ分子が次々と発見された。また、他のＲＮＡ分子を切断するＲＮＡ分子（リボザイム）も見出されている。最近このような中で、ハセロフ（J.Haseloff）と ジャーラック（W.L. Gerlach）は、数種の植物病原性ウイルスのサテライトウイルスのリボザイムの間で共通に保持されている塩基配列に着目し、わずか24塩基で構成された短鎖リボザイムを遺伝子操作技術を用いて構築し、人工リボザイムの作出に成功した（NatureVol.334, p.585-591 (1988)；特願平3-502638号) 。
【０００４】また、大塚らは非自己のＲＮＡ分子の切断を触媒する短鎖リボザイムを化学合成で調製した（特願平2-195883号）。図１はこの短鎖リボザイムの構造と作用部位を示すもので、当該人工リボザイムは、基質となるＲＮＡ分子の塩基配列を認識して塩基対を形成する結合部位Ｃと、24個の特定の塩基配列を有するＢ（触媒活性部位を含む）から構成されており、基質として示された標的ＲＮＡはＡ（ＧＵＣ）部分に隣接する位置で切断を受ける（図中、矢印で示す）。
【０００５】なお、このＡ部分のＲＮＡ配列は、ＧＵＣのみに限定されるものではなく、他の配列に変更することも可能である。そして、このハセロフ（J.Haseloff）らの人工リボザイムの構築において用いられた手法は、上記のリボザイムの設計に基づいてリボザイムＲＮＡと相補塩基配列を有し、リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡを合成してプラスミドに挿入し、さらにこの組み換えプラスミドを形質転換して得られたクローンを適当な制限酵素で切断して、リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を得、これを鋳型としてインビトロ（in vitro）で転写することにより人工リボザイムを得るものであった。かかる手法の実施においては標的ＲＮＡの結合部位の塩基配列が異なる３種のリボザイムを合成し、この３種のリボザイムがクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼに対応するｍＲＮＡを各々異なる位置で切断することを明らかにしている。
【０００６】リボザイムは基質特異性が高く、標的部位の数塩基の違いも認識することができる。ベネット（M.J.Bennett）らは、リボザイムを用いて４つのアイソザイム遺伝子より構成されるマメのグルタミンシンセテースｍＲＮＡの切断実験を行い、４つのうち１つの遺伝子由来のｍＲＮＡを標的とするよう設計したリボザイムが、塩基配列がよく似た他のアイソザイム遺伝子由来のｍＲＮＡは切断しないことを報告している（Nucleic Acids Research,Vol.20,p.831-837(1992)）。
【０００７】リボザイムのこれらの性質を利用して、リボザイムを薬剤、特に、抗ＲＮＡウイルス剤として応用しようという試みがなされている。ロッシー（J.J.Rossi）らは、リボザイムを用いてヒト免疫不全症ウイルス(HIV-1)を切断をすることに成功した（Science Vol.247, p.1222-1224(1990)) 。彼らはHIV-1のgag遺伝子中のＧＵＣの3'側を切断するリボザイムを設計し、これをコードするＤＮＡをヒトβ−アクチンプロモーターの下流に連結し、CD４を有するヒーラ細胞に形質転換した。この形質転換体にHIV-1を感染させ、ポリメラーゼ伸長反応により正常なgagＲＮＡが顕著に減少していることを確認した。
【０００８】ところが、リボザイムの基質特異性が高いということは、逆の見方をすると、リボザイムの認識部位に塩基置換や欠損等の変異が生じると、もはや当該リボザイムはこれを基質とすることができずに、切断できないことになってしまう。そのため、塩基配列が頻繁に変化する微生物由来のＲＮＡ、例えば、前述の塩基配列の変化速度が早いことが知られているHIV-1では、永続的に作用するリボザイムを設計することは困難である。
【０００９】これを解決する方法の一つとして、標的ＲＮＡの多数の作用部位に多種類のリボザイムを同時に作用させることが考えられ得る。一ヵ所の標的部位が変異を起こしたとしても、他の標的部位が同時に変異を起こす確率はかなり低いであろうし、標的部位として、そのＲＮＡが機能するのに重要な部位を選択しておけば、変異を起こした場合そのＲＮＡは、もはや機能することができなくなってしまう。
【００１０】一方、リボザイムと同様のものにアンチセンスＲＮＡがある。これは、標的ＲＮＡを相補する塩基配列を有するＲＮＡで、標的ＲＮＡあるいは標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ鎖と２本鎖を形成することで標的ＲＮＡの転写あるいは、標的ＲＮＡが機能することを阻止するものである。その作用機構は、非常に複雑で、標的ＲＮＡの転写阻害、スプライシング阻害、翻訳阻害、あるいは標的ＲＮＡと２本鎖を形成することにより、ＲＮase による分解を誘導する等が報告されている（Antisense Nucleic Acids and Proteins(Eds. J.N.M.Hol and A.R.van der Krol)Marcel Dekker,New York(1991))。
【００１１】アンチセンスＲＮＡもリボザイム同様、抗ＲＮＡウイルス剤等の薬剤としての応用が試みられている。ハン（L.Han）らは、マウス白血病ウイルスのパッケージングに必須なウイルス遺伝子の配列に相補的なアンチセンスＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスを作成し、これが白血病ウイルスに曝されても全く発病しないことを示した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.88 ,p.4313-4317(1992)）。
【００１２】アンチセンスＲＮＡの場合も、リボザイム同様基質特異性が高い。そのため、前述のリボザイムと同様に、標的ＲＮＡにかかわる問題をはらんでいることが当該分野で知られている。リボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを生体内に供給する方法として、化学的方法；酵素法；また、あるいは遺伝子組み換え法で合成したものを生体外部から入れる方法；遺伝子組み換え法、すなわちリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを適当なプロモーターの下流につないだものを、適当なベクターに挿入し、これを生体内に導入することにより、生体内でリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを産生する方法が知られている。前者の化学的方法は、リボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡの効果を持続させるためには、頻繁にリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを生体内に注入し、十分な濃度を維持する必要がある。
【００１３】これに対して、後者の遺伝子組み換え法は生体内で絶えずリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを産生し続けることができるため、リボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを注入し続ける等の問題点を解決することができる。ところで、多種類のリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを生体内に供給する場合、それぞれのリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを生体外で前述のように合成し、生体外から供給することは可能であるが、組み換え遺伝子法によりこれを行うことは、多種の遺伝子を生体内に導入するのと同じことであり、この技術は非常に困難であることが当該分野で知られている。
【００１４】リボザイムに関しては、唯一、チェン（Chen) らは多種のリボザイムを一度に作用させるものとして、一つのプロモーターの下流に多種のリボザイムを幾つも連結し、一分子中に多種のリボザイム活性部位をもつものとして考案した(Nucleic Acids Res.Vol.20,p4581-4589(1992)) 。しかし、このような構築物は一分子中に相補的な配列を多く含み、それらの干渉作用により必ずしもリボザイム活性が高いとはいえない。このことは、連結するリボザイム活性部位が多くなるほど顕著であると考えられる。
【００１５】さらに、リボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡの様な特定のＲＮＡ転写物をインビトロ（in vitro) で得ようとする場合、従来法においては、目的とするＲＮＡをコードするＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡに転写する際に、当該ＤＮＡにより組み換えられたプラスミドを制限酵素で切断してから転写するという余分の手間を要するものであった（ラン・オフ法と呼ばれている）。
【００１６】この理由は、当該プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡを転写する場合に必然的に生ずる、5'末端側と3'末端側における余分な塩基配列を可能な限り転写させないようにするためである。すなわち、5'末端側は、プロモータのすぐ下流に上記ＤＮＡを連結させることによって処理されていたが、3'末端側の処理は、ＲＮＡの転写において未だユニバーサルなターミネータが見い出されておらず、当該3'末端側の処理に際して制限酵素を使用するいわゆるランオフ法を採らざるを得なかった（図２）。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】上記の制限酵素を使用する従来の方法は、制限酵素を使用するという余分の手間に加えて、転写において切断された線状のＤＮＡを使用する必要があるため、インビトロ（in vitro）では、ＲＮＡを合成することが可能であるが、生体内において、ＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を含む組み換えベクターを保持、増殖せしめつつＲＮＡ転写物を産生させることができないという欠点を有していた。さらに、5'末端側の処理においてプロモーターのすぐ下流に目的とするＲＮＡに対応するＤＮＡを連結したとしても、転写開始点から目的とするＲＮＡに対応するＤＮＡまでの間の余分な塩基配列が付加してしまうということを避けることができなかった。まして、余分な塩基配列が付加されていない複数個のＲＮＡを同時に産生させるベクターは、存在しなかった。
【００１８】本発明の課題は、上記のin vitroでの制限酵素による切断を行わずに、目的とするＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡにより組み換えられた環状のベクターをそのまま鋳型として用いることができるとともに余分な塩基配列を有しないＲＮＡ、あるいは、余分な塩基配列を有しない多種類のＲＮＡを同時に転写することが可能であり、かつ生体内においても当該組み換えベクターを保持増殖させながら目的とするＲＮＡ転写物を高い転写効率で産生することが可能な、リボザイムを用いたＲＮＡの新規な転写システムを提供しようとするものである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究の結果、ベクターの構築において、目的とするＲＮＡ転写物の5'末端と3'末端とを各々セルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡを一単位とし、当該１単位又は２単位以上を直列に連結し、特定の配列のプロモーターの下流に、あるいは特定の配列のプロモーター及びターミネーターの間に配置することにより、上記の課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【００２０】すなわち、本発明は次の(1)から(4)を要旨とするものである。
(1) ＤＮＡ配列の5'末端と3'末端とに各々、セルフプロセッシングにより当該5'末端と3'末端を各々切断するリボザイムを有するＲＮＡを１単位として、当該ＲＮＡ単位を１個又は２個以上連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
【００２１】(2) 前記(1)に記載したＲＮＡ単位を、１乃至10単位連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
(3) 前記(1)に記載したＲＮＡ単位をｎ個（ｎは１以上の整数）連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクターにおいて、5'末端側から１番目の上記ＲＮＡ単位の5'末端の近傍にプロモーターが付加されており、かつ当該プロモーターに対応するターミネーターが、5'末端側からｎ番目の上記ＲＮＡ単位の3'末端の近傍に付加されていることを特徴とする、ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
【００２２】(4) 前記(1)〜(3)に記載されたベクターを鋳型として、当該ベクターＤＮＡをＲＮＡに転写することを特徴とする、5'末端側と3'末端側がセルフプロセッシングされたＲＮＡ転写物の製造方法。
(5) 前記(1)〜(3)に記載されたベクターにより形質転換された、微生物、又は動物細胞若しくは植物細胞。
【００２３】以下、本発明を更に詳述する。本発明のベクターは、調製したＲＮＡ１単位をセルフプロセッシングにより切断する、又は２単位以上を直列に連結することにより構築することができる。本発明のベクターの構築は、まずＤＮＡ配列の5'末端と3'末端とに各々、セルフプロセッシングにより当該5'末端と3'末端を各々切断するリボザイムを有するＲＮＡ単位を調製することにより行うことができる。
【００２４】すなわち、目的とするＲＮＡ転写物の5'末端側と3'末端側を処理するため２つのリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を連結する。このうち、第１のＤＮＡ配列は、ＲＮＡ転写物の5'末端側を処理するためのもので、リボザイムＲＮＡの触媒活性部位をコードする部分と、その両端の基質となる転写されるＲＮＡの切断部位（5'末端側）を認識する結合部位をコードする部分を含む。このリボザイムＲＮＡとコードするＤＮＡは目的とするＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡの5'上流側に連結する。
【００２５】また、同じく挿入される第２のＤＮＡ配列は、転写されたＲＮＡの3'末端側を処理するためのもので前記目的とするＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡの3'下流側に連結され、リボザイムＲＮＡの触媒活性部位をコードする部分とその両端の基質となる転写されるＲＮＡの切断部位（3'末端側）を認識する結合部位をコードする部分より成る。
【００２６】そして、複数個のＲＮＡ単位を連結するベクターの構築においては、上記において調製したＲＮＡ単位の5'末端と3'末端とを各々、セルフプロセッシングにより切断するリボザイムを有するＲＮＡをコードするＤＮＡを１単位又は２単位以上を直列に連結することによりなる。次に、ＲＮＡ転写物の製造においては、上記のベクターを用いてＲＮＡ転写物を製造する。かかる場合は、当該組み換えベクターを試験管内あるいは微生物（細菌、酵母、カビを含む）、植物、動物等の生体中に保持せしめてＲＮＡの転写を行う。
【００２７】なお、上記ＲＮＡ単位を単数個コードするベクターに関しては、プロモーターの3'の下流側の転写開始点から開始され、目的とするＲＮＡ転写物の領域をすぎても終了せず、目的とするＲＮＡ転写物の3'側のプロセッシングリボザイムの領域をも通過し転写が続けられる。この時、生成したＲＮＡの5'末端及び3'端末は、すでにリボザイムによるセルフプロセッシングにより切断されて余分な塩基配列は付加されない。
【００２８】上記ＲＮＡ単位を複数個連結してコードするベクターに関しては、前記(1)のベクターと同じく、プロモーターの3'の下流側の転写開始点から開始され、目的のＲＮＡ転写物群の領域を過ぎても転写が続けられる。同時に、各目的ＲＮＡの5'末端及び3'端末のプロセッシングリボザイムの作用により、余分な塩基配列が付加されない各目的ＲＮＡが切り出される。
【００２９】なお、本発明において上記ＲＮＡ単位を連結可能な単位数は100単位程度までであるが、好ましくは１〜10単位程度である。以上の点を更に具体的に説明する。例えば、図３は酵母の凝集性に関する遺伝子由来ｍＲＮＡ（以下、SFL1ｍＲＮＡという。）を切断し得るリボザイムを産生する本発明の組み換えプラスミドpGENE 8459v3の構造を表すものである。すなわち、pGENE 8459（多比良ら、特願平1-329831及び、K.Taira et.al., Protein Engineering,3, 733-737(1990)) のEcoRI／SacI断片を取り除き、この代わりに、常法により化学合成した新たなオリゴヌクレオチドEcoRI／SacI断片を挿入することを示している。
【００３０】挿入する塩基配列は図３のpGENE 8459v3のEcoRIサイトからSacIサイトに相当し、両鎖とも化学合成した後、それぞれの5'末端をリン酸化してリガーゼを用いて連結する。当該プラスミドは、 T7 ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータの下流側にSFL1ｍＲＮＡの切断部位を認識する結合部位をコードする部分とループ状の触媒活性部位をコードする部分からなるリボザイムＲＮＡに対応するＤＮＡ部分を有しており、更にその5'上流側と3'下流側において転写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断される切断部位（Cleavage site)と、この切断を行うループ状の触媒活性部位、及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードする２つのＤＮＡ配列を有している。
【００３１】そして、上記結合部位をコードするＤＮＡ配列は、切断部位直前にある一つの塩基部分を除いてその両側の塩基配列と相補の関係にあり塩基対を形成する。当該プラスミドにおいては、転写は T7 プロモータの下流＋１から始まり、SFL1用のリボザイム部分、及びその下流側の塩基配列部分が順次ＲＮＡに転写される。そして、転写されたＲＮＡは前記した5'末端及び3'末端の切断部位において２つのリボザイムによりセルフプロセッシングされることにより、余分な塩基配列は得られるリボザイムには付加されない。
【００３２】従って、この図３の組み換えプラスミドを鋳型として転写することにより得られるリボザイムＲＮＡは図４の塩基配列を有するものとなる。このリボザイムＲＮＡは5'及び3'末端側に相補の塩基配列を有し、塩基対を形成してヘアピン構造となっており、このため生体内におけるエキソヌクレアーゼによる分解に対し、安定性を有するものである。
【００３３】また、例えば、図５及び図６は、HIV-1遺伝子あるいは、これに由来するｍＲＮＡの5'側Long terminal repeat配列（以下、LTRという。）と、HIV-1のtat遺伝子あるいは、これ由来のｍＲＮＡを切断し得るリボザイムをそれぞれ産生する本発明の組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatの構造を表すもので、以下にその構築の概要を述べる。
【００３４】前述のpGENE8459（多比良ら、特願平1-329831及び、K.Taira etal. Protein Engineering,3, 733-737(1990)) のEcoR／SacI断片を取り除き、常法により化学合成した新たなオリゴヌクレオチドEcoRI／SacI断片を代わりに挿入した。挿入した塩基配列は図７に示す、pV3TA-LTRのEcoRIサイトからSacIサイトに相当し、両鎖とも化学合成した後、それぞれの5'末端をリン酸化してリガーゼを用いて連結した。
【００３５】次に、得られたプラスミドのXhoI／SalI断片を取り除き、常法により化学合成した２種の合成リンカー（図９Ｂ，Ｃに塩基配列を示す。）の5'末端をリン酸化してリガーゼを用いて連結したものを代わりに挿入した。挿入後、リガーゼを用いて連結した。更に、得られたプラスミドのSalI／HindIII 断片を取り除き、常法により化学合成した新たなオリゴヌクレオチド（図９Ｄに塩基配列を示す。）を代わりに挿入し、リガーゼを用いて連結した。こうして得られた、図７の組み換えプラスミドpV3TA-LTRのApaI／EcoRV 断片を取り除き、常法により化学合成したオリゴヌクレオチドApaI／EcoRV 断片（図９Ｅに塩基配列を示す）を代わりに挿入し、リガーゼを用いて連結した。こうして得られた図８に示す、組み換えプラスミドpV3TA-tatを鋳型に、図10に示した２種の化学合成プライマーを用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェイン反応）法により増幅し、制限酵素KpnI及びHindIIIで処理後、図７のpV3TA-LTRのKpnI-HindIII間に挿入し、リガーゼを用いて連結し、図５及び図６の組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatを構築した。
【００３６】当該プラスミドは T7ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターの下流側に以下の構造体を有している。すなわち、生体内での安定性を計るため3'末端部分に少なくとも20個以上最大100個のアデニン残基よりなるポリＡテイルとそれに続くＧＵＣの塩基配列を付加したメチオニンｔＲＮＡのアンチコドン部位に挿入された状態（Cotten and Birnstiel,EMBO J.,8,3861-3866(1989)）で、LTRｍＲＮＡ結合部位およびループ状の触媒活性部位を有するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と、その5'上流側と3'下流側において転写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断される切断部分（Cleavage site）と、この切断を行うループ状の触媒活性部位及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードする２つのＤＮＡ配列、これらに続く形で上記構造体中のLTRｍＲＮＡ結合部位をtatｍＲＮＡ結合部位に変更したものである。
【００３７】これら結合部位をコードするＤＮＡ配列もまた、切断部位直前にある１つの塩基部分を除いてその両側の塩基配列と相補の関係にあり塩基対を形成する。該プラスミドは、転写を T7プロモータの下流＋１から始め、LTR用のリボザイム部分、その3'側セルフプロセッシングリボザイム部分、tat用のリボザイム部分の5'側セルフプロセッシングリボザイム部分に続いてtat用のリボザイム部分およびその下流側の塩基配列部分を順次ＲＮＡに転写していくが、転写されたＲＮＡは前記した４つのリボザイムによりセルフプロセッシングされることにより、余分な塩基配列が付加していないLTR用およびtat用リボザイムに切り分けられる。
【００３８】また、例えば図11は、図８のpV3TA-tat にT7プロモーターに対するターミネーターを付加した構造を表すもので、以下にかかる構築の概要を述べる。前述のpV3TA-tat のKpnI／HindIII 断片を取り除き、常法により化学合成したT7ターミネーター配列を含むKpnI／HindIII 断片を代わりに挿入した。このようにして、図11に示す組み換えプラスミドpV3TA-tat-Term1 を得た。
【００３９】当該プラスミドは、前述のpGENE8459v3 やpV3TA-LTR-tat と同様にプロセッシングリボザイムの作用によりtat 切断用のリボザイムが切り出される。この際、T7ターミネーターを付加することにより、tat 用リボザイムの転写量がT7ターミネーターを付加しないものの約２倍に増加することが判明した（図17) 。すなわち、特定のプロモーターにあったターミネーターを付加することにより、リボザイムの生産量を上げることが可能になる。
【００４０】かかる図５、図６、及び図11の組み換えプラスミドを鋳型として転写することにより得られる２種のリボザイムＲＮＡは、それぞれ図16に示す塩基配列を有するものとなる。当該リボザイムは、t-ＲＮＡ構造を形成するようになっており、さらに3'側には30個のアデニン残基によりなる、ポリＡテイルを有している。これらの構造は、生体内におけるエキソヌクレアーゼによる分解に際し、安定性を保持することが当該技術分野で知られている。
【００４１】この図３、図５、図６、及び図11の組み換えプラスミドは、リボザイムＲＮＡを製造するリボザイムとして、SFL1切断用のリボザイム、LTR 切断用のリボザイム、tat 切断用のリボザイム、プロモーターとして T7 ＲＮＡポリメラーゼのためのターミネーター及びベクターとしてpUC119を用いているが、本発明は特にこれらの要素に限定されるものではない。
【００４２】すなわち、上記の図３の組み換えプラスミドは、リボザイムＲＮＡを生産するものであるが、２種に限らず、5'末端と3'末端とを各々、セルフプロセッシングにより切断するリボザイムを有する異なるリボザイムをコードするＤＮＡ断片を連結することで、所望する種のリボザイムＲＮＡを生産させることが可能である。また、両プロセッシングリボザイムの間のリボザイムを全て同じものにすることにより、プラスミド当たりの同一種のリボザイムの生産量を上げることも可能となる。さらに、製造するＲＮＡはリボザイムに限らず、例えばＲＮＡウイルスのＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、種々のｍＲＮＡ等、広くＲＮＡ転写産物の製造に適用可能である。
【００４３】用いるプロモーターも、例えばSP6 ,GAL7,SV40,CaMV35S等、種々のものを使用することが可能であり、用いるターミネーターも上記プロモーターに対応するものを選択することが可能である。さらに本発明においては、組み換えベクターは、特に環状のままであっても、ＲＮＡを転写できるための種々の生体中においても機能を発揮するものであって、リボザイム機能を発揮させようとする生体、例えば植物、動物等の種類に応じて適切なベクターを選択することができる。
【００４４】
【実施例】以下に、実施例により本発明を詳細に説明する。ただし、これらの実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕 組み換えベクターpGENE 8459v3の構築先に述べた方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira, K., Oda, M., Shinshi, H., Maeda, H., and Furukawa, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990)）で図３のEcoR／SacI断片を化学合成し、これを含む溶液 3.3μl(100pmol)を制限酵素EcoRIとSacIで前もって切断しておいた組み換えプラスミドpGENE8459（多比良ら、特願平1-329831号；Taira K., Oda, M., Shinshi, H., Maeda, H., andFurukawa, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990)）に林等の方法（1)Hayasi,K.,Nakazawa,M.,Ishizaki,Y. and Obayashi,A.Nucleic Acids Res.,13,3261-3271(1985), 2)Hayashi,K.,Nakazawa,M.,Ishizaki,Y.,Hiraoka,N. and Obayashi,A.Nucleic Acids Res.,13,7979-7992(1985)) により連結した。
【００４５】この溶液を用いて大腸菌MV1184株を形質転換し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、挿入された断片中のXhoＩサイトを利用してポジティブなクローンを選択した。また、塩基配列はＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製370A）を用いて確認した。
〔実施例２〕 組み換えベクターpV3TA-LTRの構築先に述べた方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira K., Oda, M., Shinshi, H., Maeda, H., and Furukawa, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990)）で図８ＡのEcoRI／SacI断片を化学合成し、前述の林等の方法で、制限酵素EcoRIとSacIで前もって切断しておいた図３R>３の組み換えプラスミドpGENE 8459v3に連結し、大腸菌MV1184に形質転換した。コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、断片が挿入されたことによりKpnIサイトが消失したことを利用してポジティブなクローンを選択した。
【００４６】得られた組み換えプラスミド0.5μgを制限酵素XhoIとSalIで処理したものに、先に述べた方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira K., Oda, M., Shinshi,H., Maeda, H., and Furukawa, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990)）で化学合成し、リン酸化し、連結した図８の合成リンカー（Ｂ，Ｃ）を２μg 加え、前述の林らの方法で連結した。これを大腸菌MV1184に形質転換し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、断片が挿入されたことによりば BamHIサイトが消失したことと、ApaIサイト、EcoRV サイトが生じたことを利用してポジティブなクローンを選択した。
【００４７】さらに、こうして得られた組み換えプラスミド 0.5μgを制限酵素SalIとHindIII で処理し、先に述べた方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira K., Oda,M., Shinshi, H., Maeda, H., and Furukawa, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990)）で化学合成した図９Ｄの合成リンカーを前述の林等の方法で連結した。これを大腸菌MV1184に形質転換し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、断片が挿入されたことによりSalIサイトが消失したことを利用してポジティブなクローンを選択した。この組み換えプラスミドの塩基配列をＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製370A）を用いて確認した。
〔実施例３〕 組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatの構築先に述べた方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira K., Oda, M., Shinshi,H., Maeda, H., and Furukawa, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990) ）で化学合成した図８ＥのApaI／EcoRV断片を、制限酵素ApaIとEcoRVで処理した図７の組み換えベクターpV3TA-LTRに前述の林らの方法で連結し、これを大腸菌MV1184に形質転換し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、断片が挿入されたことをＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製370A）を用いて塩基配列を確認することによりポジティブなクローンを選択した。
【００４８】こうして得られたプラスミド（以下、pV3TA-tat と呼ぶ）（図８）を鋳型に、図10に示した２種のプライマーを用い、ゲルファンド（D.H.Gelfand）等の方法（PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications. Academic Press, Inc., San Diego,CA, p.129-141(1990)）に従い、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェイン反応）法により増幅反応をおこなった。増幅反応は、92℃で１分30秒、50℃で２分、72℃で４分、これを１サイクルとして25サイクル行った。なお、この反応はパーキンエルマーシータスインストルメンツ社製ＤＮＡサーマルサイクラー480を用いた。得られたＤＮＡ断片を、常法に従いクロロホルム抽出、エタノール沈澱を行った後、制限酵素KpnIとHindIIIで処理し、制限酵素KpnIとHindIIIで処理した組み換えプラスミドpV3TA-LTRに連結し、大腸菌MV1184に形質転換し、コロニーを形成させた後、プラスミドを取り出し断片が挿入されたことを制限酵素EcoRIとHindIIIで切断することにより確認した。
〔実施例４〕組み換えプラスミドpV3TA-tat-term 1及びpV3TA-tat-term２の構築次に前記のようにして構築した組み換えプラスミドpV3TA-tatの３' 末端にT7ターミネーターを付加した。先に述べた方法によりT7ターミネーター配列（METHOD IN ENZYMOLOGY,VOL185,p.60-89(1990))を含むKpnＩ／HindIIIリンカー2.0μgを合成し、制限酵素KpnＩ／Hind IIIで切断しておいたpV3TA-tat0.5μgに前述の方法で連結し、大腸菌MV1184に形質転換した。コロニーを形成させた後、プラスミドを取り出し、制限酵素KpnＩ／Hind IIIで処理し、アガローズゲル電気泳動することにより、この合成リンカーが挿入されていることを確認した。このプラスミドをpV3TA-tat-term 1（図11）と称する。なお、このプラスミドpV3TA-tat-term1 は、Escherichia coli MV1184 に導入されて、E.coli TERM 1 として通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されており、その寄託番号は微工研菌寄第13143 号である。
【００４９】次に組み換えベクターpV3TA-tat-term1の改変を行った。先に述べた方法により、図11のXho1サイトからApa1サイトの配列を有するXhoＩ／ApaＩリンカー2.0μgを合成し、制限酵素XhoＩとApaＩ1 で理したpV3TA-tat-term10.5μgに前述の方法で連結し、大腸菌MV1184に形質転換した。コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、制限酵素XhoＩとApaＩとで処理し、アガロースゲル電気泳動法により、この合成リンカーがが挿入されていることを確認した。このプラスミドをpV3TA-tat-term 2( 図12）と称する。なお、このプラスミドpV3TA-tat-term 2は、Escherichia coliMV1184に導入されて、E.coli TERM 2 として通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されており、その寄託番号は微工研菌寄第13144 号である。
〔実施例５〕組み換えプラスミドpV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型の構築pV3TA-tat のSmaIサイトにBglII リンカー（5'-GGGAGATCTCCC-3') を、KpnIサイトにBamHI リンカー（5'-CGGATCCGGTAC-3') を挿入した。このようにして得たプラスミドを、制限酵素BglII とBamHI で処理し、tat 用リボザイム配列を含むBglII BamHI ＤＮＡ断片及びtat 用リボザイム配列を含まないBglII BamHI ＤＮＡ断片（以下、BglII BamHI ベクターと呼ぶ）をアガロースゲル電気泳動により分離回収した。回収したＤＮＡ断片をT4リガーゼを用いて連結後、再度、制限酵素BglII と BamHIで処理した。当該反応物をBglII-BamHIベクターに連結し、当該ベクターを用いてE.coli MV1184 を形質転換し、コロニーを形成させた後でプラスミドを取り出し、これを制限酵素BglII と BamHIで処理することにより、tat 用リボザイム配列を含むBglII- BamHI ＤＮＡ断片を１〜５個、及び10個含むものを選択した。以後、この種のプラスミドをpV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型と呼ぶ（図13−Ｂ）（ここでｎは、tat 用リボザイムを含むBglII-BamHI ＤＮＡ断片が何個入ったかを意味する。例えば、1 個ではpV3TA-(tat)1、2 個ではpV3TA-(tat)2。
〔実施例６〕直列連結型リボザイム発現プラスミドの構築pV3TA-tat を制限酵素XhoIで処理し、Klenow flagment で平滑化したのち、制限酵素HindIII で処理し、tat 用リボザイム配列を含むXhoI-HindIII ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離回収した。当該ＤＮＡ断片を、pV3TA-tat を制限酵素XbaIで処理し、Klenow flagment で平滑化した後、制限酵素HindIII で処理したものに連結した。さらにこれを制限酵素XbaIで処理し、Klenow flagment で平滑化したのち、制限酵素HindIII で処理し、先のＤＮＡ断片を連結した。以下、この操作を繰り返し、T7プロモーターの下流にtat 用リボザイム配列が直列に１個〜５個、及び10個含むものを構築した。ただし、この構築方法では、１個あるいはそれ以上連なったtat 用リボザイム配列の5'端と3'端に自分自身を切断するプロセッシングリボザイムが付加される。以下、この種のプラスミドを直列連結型リボザイム発現プラスミド(n-1〜5,10) と呼ぶ（図13−Ｂ）。
〔実施例７〕リボザイムの製造前述の方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira K., Oda, M., Shinshi, H., Maeda, H., and Furukawa, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990)）でＲＮＡの転写を行った。
【００５０】図14において、(A)から(D)は、鋳型ＤＮＡとして環状のpGENE 8459v3を用いた場合を、また、(E)から(H)は鋳型ＤＮＡとして制限酵素HindIIIにより切断した線状pGENE 8459v3を用いた場合をそれぞれ示している。転写反応時間は、(A)と(E)の場合30分；(B)と(F)の場合１時間；(C)と(G)の場合２時間30分；(D)と(H)の場合６時間であった。
【００５１】32Ｐでラベル化された上記(A)〜(H)の各転写産物は8.3％尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲルを用いて解析した。図16には約50塩基から130塩基までの領域を示す。図15において、(A)から(E)は、鋳型ＤＮＡとして環状のpV3TA-LTR-tatを用いた場合を示しており、(A)は０分；(B)は30分；(C)は１時間；(D)は２時間；(E)は４時間転写反応をさせた。
【００５２】32Ｐでラベル化された上記(A)〜(E)の各転写産物は8.3％尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲルを用いて解析した。図15には約50塩基から300 塩基までの領域を示す。更にpV3TA-tat、pV3TA-tat-term1及びpV3TA-tat-term2を鋳型として用いたInvitroにおける転写反応を行った。塩化セシュウム密度勾配遠心法で精製したプラスミドpV3TA-tat、pV3TA-tat-term1及びpV3TA-tat-term2の各々２μgを、40mMTris-HCl(pH7.5),6mM MgCl2,2mMスペルミジン、0.01％ bovine serum alubumin,0.375mM ATP,CTP,GTP,UTP, 0.74MBq α-32Ｐ〔CTP〕20unitsT7 ＲＮＡ ポリメラーゼを含む反応溶液50μl中37℃で反応させ、０、１、３、６、12、24時間ごとに７μlずつ回収した。これらに0.02％ブロモフェノールブルー、0.02％キシレンシアノール、50mM EDTA、９M尿素を含む水溶液を等容量加え、90℃で２分間加熱した後オートラジオグラフィーにかけた。なお、各々のオートラジオグラムの強度はフジ写真フイルム社製のバイオイメージアナライザーＢＡ100により測定した。
【００５３】オートラジオグラフィーの結果を図17に示す。(A)から(F)はpV3TA-tatを鋳型に用いた場合、(G)から(L)はpV3TAtat-term1を鋳型に用いた場合、(M)から(R)はpV3TA-tat-term2を鋳型に用いた場合の各々の結果を示す。反応時間は(A)、(G)、(M)が０時間；(B)、(H)、(N)が１時間；(C)、(I)、(O)が３時間；(D)、(J)、(P)が６時間；(E)、(K)、(Q)が12時間；(F)、(L)、(R)が24時間であった。また、これらのオートラジオグラムの内、tat 用リボザイムの部分の強度の相対値（レーン(B)の値を１とした場合）をグラフ化して表したのが図18である。
【００５４】図18の結果より転写されたtat用リボザイムの転写量はT7ターミネーターを３'末端に付加したpV3TA-tat-term1では付加しないpV3TA-tatの２倍であった。更にSac1サイトを除去したpV3TA-tat-term2はpV3TA-tat-term1の約２倍、pV3TA-tatの約４倍であった。また、図17の結果より、ターミネーターを３'末端に付加することにより高分子量域側の非特異的な転写物の生産が抑制されており、さらにSacＩサイトを除去したことにより、５'端処理用のリボザイムが付加したtat用リボザイム転写量が劇減していた。以上の結果をまとめると、pV3TA-tat-term2をリボザイムの転写、発現プラスミドとして用いれば、従来のリボザイム発現プラスミドであるpV3TA-tatに比較して目的とするリボザイムの生産量を少なくとも４倍にすることができ、さらに高分子領域側の非特異的な転写物の生産を抑制することか可能となり、リボザイムによるＲＮＡの生産方法の著しい進歩をもたらしたことになる。
【００５５】図19において、(A)はpV3TA-(tat)1、(B)はpV3TA-(tat)2、(C)はpV3TA-(tat)3、(D)はpV3TA-(tat)4、(E)はpV3TA-(tat)5、(F)はpV3TA-(tat)10をそれぞれ等量鋳型に用い、６時間転写反応させたものを、7M尿素を含む５％ポリアクリドアミノゲル電気泳動により解析した結果である。ここで5'CAR は、5'端にある5'端処理用リボザイム、5'CAR+3'CAR は各tat 用リボザイムの間に位置する5'端処理用リボザイムと3'端処理用リボザイムが連結したもの、5'CAR+3'CAR+tatRは、5'端処理用リボザイムと3'端処理用リボザイムとtat 用リボザイムが連結したものである。5'CAR 及び 5'CAR+3'CAR+tatR は、添加した鋳型の種類に関係なく一定であるが、その他のものは鋳型のｎ数に比例して増加した。すなわち、tat 用リボザイムとその5'側及び3'側に位置する端処理用リボザイムを一単位として、当該単位数に比例してtat 用リボザイムの生産量が増加した。
【００５６】図20は、tat 用リボザイムの生産量を経時的に調べたものである。ここで、pV3TA-(tat)1を鋳型とした場合の反応６時間後のtat 用リボザイム量を相対的に示したものである。これより明らかなように、tat 用リボザイム量は鋳型のｎ数に比例して増加しており、ｎ=10 の場合いずれの時間においてもｎ＝１の場合のほぼ10倍のtat 用リボザイム量が生産された。
【００５７】以上のことにより、両プロセッシングリボザイムの間のリボザイムを全て同じものにすることにより、プラスミド当りのリボザイムの生産量を上げることができることが判明した。
〔実施例８〕リボザイム反応Ａ）pGENE 8459v3を用いて製造したリボザイム反応図16の「SFL1用リボザイム」及び線状pAM19SFL1ac(PstI)を鋳型として同様に転写及び電気泳動された「SFL1ｍＲＮＡ」をそれぞれポリアクリルアミドゲルより切り出し、400μlの0.3M酢酸ナトリウム／0.1mM EDTA／20mM Tris・HCl(pH8)を含む緩衝液を用いてそれぞれのＲＮＡを抽出した。常法によりエタノール沈澱を行い、単離した基質(SFL1ｍＲＮＡ）が酵素(SFL1用リボザイム）より過剰な条件で混合し、50mM Tris・HCl(pH8)／10mM MgCl2を含む緩衝液中37℃で切断反応を追った。
【００５８】図５及び図６と同じ組成のゲルで解析した結果を図21に示す。(A)、(B)、(C)、(D)、(E)の反応時間は、それぞれ0.1、2.5、5.5、9.5時間である。時間と共にSFL1ｍＲＮＡが図４のような複合体をリボザイムと形成し、SFL1ｍＲＮＡが二つに切断される。図14及び図21の結果より明らかなように、a. 環状のpGENE 8459v3を鋳型とした場合、61塩基で構成されるSFL1用リボザイムが放出された。これは5'端処理用及び3'端処理用のリボザイムが効率よく作用したためである。また、5'端処理用リボザイムとSFL1用リボザイムが連結した断片も徐々に切断を受け二つに別れる（図14、A〜D）。b. 3'端処理用リボザイムのすぐ下流にあるHindIIIサイトを切断した線状pGENE 8495v3を鋳型とした場合、まず5'端処理用リボザイム、SFL1用リボザイム、及び3'端処理用リボザイムが連結された状態で産生され、徐々に切断を受けるが、環状のpGENE 8459v3を鋳型とした場合と比べて転写効率が悪く、また副産物も多かった（図14、E〜H）。T7 ＲＮＡポリメラーゼを用いてSFL1遺伝子の転写産物を作成し、その後、単離したSFL1用リボザイムと混ぜた場合においては、SFL1用リボザイムがうまく作用すると76塩基のSFL1転写産物が切り出されるように結合部位を設計したものであり（図４）、実際予想どおり76塩基の断片が確認できた（図21) 。
【００５９】以上の結果をまとめると、5'端処理用リボザイムと3'端処理用リボザイムは分子内で設計どおりに切断反応を起こした。また、SFL1用リボザイムも設計どおりに分子間で切断反応を起こした。また環状ＤＮＡを鋳型とする方が転写効率および純度の面で優れており、またpGENE 8459v3の「SFL1用リボザイム」領域はカセット式になっており他の配列と置き換えることができるので、特に短いＲＮＡ転写産物を単離する場合、pGENE 8459v3の方が従来のラン・オフ法より優れている（制限酵素を用いて切断する手間もはぶける）ことが明らかになった。
Ｂ）pV3TA-tat、pV3TA-LTRおよびpV3TA-LTR-tat用いて製造したリボザイム反応pV3TA-tat、pV3TA-LTR、pV3TA-LTR-tatおよびT7-LTR（T7 プロモーターの下流にHIV-1のgag遺伝子のｃＤＮＡ（転写開始点から422塩基対下流を含む）を有するＤＮＡ断片）、T7-tat（T7 プロモーターの下流にHIV-1のtat遺伝子のｃＤＮＡ（翻訳開始点から149塩基対下流を含む）を有するＤＮＡ断片）を鋳型として同様に転写および電気泳動されたtat用リボザイム、LTR用リボザイム、tat用リボザイム＋LTR用リボザイムおよびLTRＲＮＡ、tatＲＮＡをそれぞれポリアクリルアミドゲルより切り出し、前述と同様にゲルからＲＮＡを抽出した。エタノール沈澱後、tat用リボザイムとtatＲＮＡ、LTR用リボザイムとLTRＲＮＡ、tat用リボザイム＋LTR用リボザイムとLTRＲＮＡとtatＲＮＡをそれぞれ前述の条件で切断反応を行った。
【００６０】図14と同じ組成のゲルで解析した結果を図22に示す。(A)〜(F)は、tat用リボザイムとtatＲＮＡ、(G)〜(L)は、tat用リボザイム＋LTR用リボザイムとLTRＲＮＡとtatＲＮＡ、(M)〜(R)はLTR用リボザイムとLTRＲＮＡの切断反応の結果である。反応時間は(A)、(G)、(M)が０時間；(B)、(H)、(N)が0.5時間、(C)、(I)、(O)が１時間；(D)、(J)、(P)が２時間；(E)、(K)、(Q)が４時間；(F)、(L)、(R)が６時間である。
【００６１】図15及び図22の結果より、pV3TA-LTR-tatを鋳型とした場合、163 塩基で構成されるtat用リボザイムおよびLTR用リボザイムの両方が産生されていることが明らかである。すなわち、pV3TA-tatより産生されたtat用リボザイムは、tat ＲＮＡ（149塩基）を、49塩基と100塩基のＲＮＡ断片に切断し、pv3TA-LTRより産生されたtat用リボザイムは、LTRＲＮＡ（422塩基）を、70塩基と352塩基のＲＮＡ断片に切断しているが、pV3TA-LTR-tatより産生されたリボザイムは、tatＲＮＡとLTRＲＮＡをそれぞれ同じパターンで切断している。
【００６２】これらのことからをまとめると、２個の5'端 処理用リボザイムと２個の3'端処理用リボザイムは分子内で設計通りに切断反応を起こし、２種のリボザイムすなわちLTR用リボザイム、tat用リボザイムが産生された。また、産生された両リボザイムは余分な塩基配列を含まず、さらに、それぞれの標的ＲＮＡを設計通りに切断した。両端にシスに作用するリボザイムを有するＲＮＡをコードするＤＮＡをつなげていくことで、複数種のリボザイムのようなＲＮＡを一度に産生することが可能である。
Ｃ）組み換えプラスミドpV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型を鋳型として用いたin vitro転写切断反応組み換えプラスミドpV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型を鋳型として用い、これにより転写されるリボザイムによるHIV-1tatＲＮＡの切断を、転写反応と切断反応を同時に行う転写切断反応を用いて検討した。
【００６３】反応は、以下の条件で行った。すなわち、40mM Tris-HCl(pH8.0),20mM MgCl2,2mM スペルミジン,1mM ジチオスレイトール,1mM NTP,2 units／μl ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター,20nM tat ＲＮＡ(32Pで放射ラベルしたもの),2nM 鋳型プラスミドの混合物を37℃で保温し、各時間ごとに採取した。
【００６４】採取した反応物を7M尿素を含む５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した結果を図23に示す。(A)はpV3TA-(tat)1、(B)はpV3TA-(tat)2、(C)はpV3TA-(tat)3、(D)はpV3TA-(tat)4、(E)はpV3TA-(tat)5、(F)はpV3TA-(tat)10を鋳型として用いたもので、反応時間は0,1,3,6,12時間で行った。これより明らかなように、切断効率は鋳型のｎ数に比例して増加していた。また、切断効率を直列連結型リボザイム発現プラスミドを鋳型として用いた場合と比較したのが図24である。これは、反応開始６時間後の添加したtat ＲＮＡの切断された割合を示したものである。
【００６５】ｎ数が３個までは両方ともにほぼ同じ切断効率を示したが、直列連結型ではそれ以上のｎ数においては飽和状態に達したのに対して、pV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型では直線的に増加していた。以上のことにより、pV3TA-(tat)n(n-1〜5,10)型を用いた場合のほうが、単にリボザイムを直列に連結したものに比べて、切断効率の点で有利であることが示された。
【００６６】
【発明の効果】本発明のリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を含むベクターは、環状のままでも制限酵素を用いることなく5'末端及び3'末端側において余分な塩基配列が付加されていないＲＮＡ転写物を製造することが可能なものであり、従来のように制限酵素を用いる場合に比べて簡便な操作でＲＮＡ転写物の製造を行うことができるほか、試験管内のみでなく、生体内においても該組み換えベクターを保持増殖せしめながら、ＲＮＡ転写物の産生を図ることができる。特に、3'末端にターミネーターを付加することにより、本発明のベクターは、それらを含まないリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を含むベクターに比して転写効率が飛躍的に高めることが可能になる。
【００６７】また、本発明のリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を複数個連結させたものを含むベクターは、5'末端及び3'末端側において余分な塩基配列が付加されていない複数種のＲＮＡ転写物を一度に製造することが可能なものであり、また、同一のＲＮＡ転写物の生産性を向上させることが可能となる。この場合も、試験管内のみでなく、生体内においても該組み換えベクターを保持増殖せしめながら、ＲＮＡ転写物の産生を図ることができる。
【００６８】これらのことは、例えば、余分な塩基配列を付加されていないリボザイムＲＮＡあるいはアンチセンスＲＮＡを生体内で一度に多種製造することが可能であることを意味し、特にこれらを塩基配列が変化しやすい、例えば前述のHIV-1に効果的に作用させることが可能となる。さらに、一度に多種のＲＮＡに、リボザイムＲＮＡあるいはアンチセンスＲＮＡを作用させることも可能となる。
【００６９】本発明のベクターは、医薬、動物薬、農薬或いは試薬等、又はそれらの製造に有効に利用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ハセロフ（J.Haseloff）等が示した短鎖人工リボザイムの構造を示す図である。
【図２】 従来の転写手段であるラン・オフ法を示す模式図である。
【図３】 組み換えプラスミドpGENE 8459v3の構造を示す図である。
【図４】 SFL1用リボザイムの塩基配列とその5'端および3'端におけるステム構造、さらにSFL1ｍＲＮＡとの複合体を示す図である。
【図５】 組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatの構造を示す図である。
【図６】 組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatの構造を示す図である。
【図７】 組み換えプラスミドpV3TA-LTRの構造を示す図である。
【図８】 組み換えプラスミドpV3TA-tatの構造を示す図である。
【図９】 組み換えプラスミドpV3TA-LTR、pV3TA-tatの構築に用いた合成リンカ−の塩基配列を示す図である。
【図10】 組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatの構築に用いたＰＣＲ反応用の合成オリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列を示す。
【図11】 組み換えプラスミドpV3TA-tat-term１の構造を示す図である。
【図12】 組み換えプラスミドpV3TA-tat-term２の構造を示す図である。
【図13】 pV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型プラスミドの概念図である。
【図14】 環状および線状のpGENE 8459v3を鋳型として転写して得られた各種転写産物の電気泳動図である。
【図15】 pV3TA-LTR-tatを鋳型として転写して得られた各種転写産物の電気泳動図である。
【図16】 LTR用及びtat用リボザイムの塩基配列とそのｔＲＮＡ構造およびポリＡテイル構造を示す図である。
【図17】 pV3TA-tat, pV3TA-tat-term１及び pV3TA-tat-term２を鋳型として転写して得られたそれぞれの転写産物の電気泳動図である。
【図18】 pV3TA-tat, pV3TA-tat-term１及び pV3TA-tat-term２を鋳型として転写して得られた転写産物-tatリボザイムＲＮＡの、pV3TA-tat で転写された生産物を１とした場合の転写効率の反応時間に対する変化を示した図である。
【図19】 pV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型プラスミドをそれぞれ等量鋳型に用い、転写反応させたものの電気泳動図である。
【図20】 pV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型プラスミドをそれぞれ鋳型として転写して得られた転写産物-tatリボザイムＲＮＡの、pV3TA-tat で転写された生産物を１とした場合の転写効率の反応時間に対する変化を示した図である。
【図21】 SFL1用リボザイムによるSFL1-ｍＲＮＡの切断を示す電気泳動図である。
【図22】 LTR用リボザイム及びtat用リボザイムによるLTRＲＮＡおよびtatＲＮＡの切断を示す電気泳動図である。
【図23】 プラスミドpV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型を鋳型として用いたin vitro転写切断反応の結果物の電気泳動図である。
【図24】 切断効率を連結するリボザイムの単位数との関連において検討を行った図である。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リボザイムを用いたＲＮＡ転写機能を有するベクターとそれを用いたＲＮＡ製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、すべての酵素はタンパク質から構成されていると確信されていたが、1981年に酵素活性を有するＲＮＡ分子、すなわちリボザイムが発見され、従来の酵素に関する概念は打ち破られた。この画期的発見はコロラド大学のチェック（T.Cech）らによってもたらされた。すなわち、原生動物のテトラヒメナのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）前駆体においては、機能上不必要なイントロン（ＩＶＳ）がタンパク質酵素の力を借りずに、セルフスプライシングにより取り除かれることが証明された(Cell,Vol.31,p.147-157(1982);Nature Vol.308, p.820-825 (1984))。
【０００３】その後、例えばホスホジエステル結合をセルフスプライシングする触媒機能を有するＲＮＡ分子が次々と発見された。また、他のＲＮＡ分子を切断するＲＮＡ分子（リボザイム）も見出されている。最近このような中で、ハセロフ（J.Haseloff）と ジャーラック（W.L. Gerlach）は、数種の植物病原性ウイルスのサテライトウイルスのリボザイムの間で共通に保持されている塩基配列に着目し、わずか24塩基で構成された短鎖リボザイムを遺伝子操作技術を用いて構築し、人工リボザイムの作出に成功した（NatureVol.334, p.585-591 (1988)；特願平3-502638号) 。
【０００４】また、大塚らは非自己のＲＮＡ分子の切断を触媒する短鎖リボザイムを化学合成で調製した（特願平2-195883号）。図１はこの短鎖リボザイムの構造と作用部位を示すもので、当該人工リボザイムは、基質となるＲＮＡ分子の塩基配列を認識して塩基対を形成する結合部位Ｃと、24個の特定の塩基配列を有するＢ（触媒活性部位を含む）から構成されており、基質として示された標的ＲＮＡはＡ（ＧＵＣ）部分に隣接する位置で切断を受ける（図中、矢印で示す）。
【０００５】なお、このＡ部分のＲＮＡ配列は、ＧＵＣのみに限定されるものではなく、他の配列に変更することも可能である。そして、このハセロフ（J.Haseloff）らの人工リボザイムの構築において用いられた手法は、上記のリボザイムの設計に基づいてリボザイムＲＮＡと相補塩基配列を有し、リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡを合成してプラスミドに挿入し、さらにこの組み換えプラスミドを形質転換して得られたクローンを適当な制限酵素で切断して、リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を得、これを鋳型としてインビトロ（in vitro）で転写することにより人工リボザイムを得るものであった。かかる手法の実施においては標的ＲＮＡの結合部位の塩基配列が異なる３種のリボザイムを合成し、この３種のリボザイムがクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼに対応するｍＲＮＡを各々異なる位置で切断することを明らかにしている。
【０００６】リボザイムは基質特異性が高く、標的部位の数塩基の違いも認識することができる。ベネット（M.J.Bennett）らは、リボザイムを用いて４つのアイソザイム遺伝子より構成されるマメのグルタミンシンセテースｍＲＮＡの切断実験を行い、４つのうち１つの遺伝子由来のｍＲＮＡを標的とするよう設計したリボザイムが、塩基配列がよく似た他のアイソザイム遺伝子由来のｍＲＮＡは切断しないことを報告している（Nucleic Acids Research,Vol.20,p.831-837(1992)）。
【０００７】リボザイムのこれらの性質を利用して、リボザイムを薬剤、特に、抗ＲＮＡウイルス剤として応用しようという試みがなされている。ロッシー（J.J.Rossi）らは、リボザイムを用いてヒト免疫不全症ウイルス(HIV-1)を切断をすることに成功した（Science Vol.247, p.1222-1224(1990)) 。彼らはHIV-1のgag遺伝子中のＧＵＣの3'側を切断するリボザイムを設計し、これをコードするＤＮＡをヒトβ−アクチンプロモーターの下流に連結し、CD４を有するヒーラ細胞に形質転換した。この形質転換体にHIV-1を感染させ、ポリメラーゼ伸長反応により正常なgagＲＮＡが顕著に減少していることを確認した。
【０００８】ところが、リボザイムの基質特異性が高いということは、逆の見方をすると、リボザイムの認識部位に塩基置換や欠損等の変異が生じると、もはや当該リボザイムはこれを基質とすることができずに、切断できないことになってしまう。そのため、塩基配列が頻繁に変化する微生物由来のＲＮＡ、例えば、前述の塩基配列の変化速度が早いことが知られているHIV-1では、永続的に作用するリボザイムを設計することは困難である。
【０００９】これを解決する方法の一つとして、標的ＲＮＡの多数の作用部位に多種類のリボザイムを同時に作用させることが考えられ得る。一ヵ所の標的部位が変異を起こしたとしても、他の標的部位が同時に変異を起こす確率はかなり低いであろうし、標的部位として、そのＲＮＡが機能するのに重要な部位を選択しておけば、変異を起こした場合そのＲＮＡは、もはや機能することができなくなってしまう。
【００１０】一方、リボザイムと同様のものにアンチセンスＲＮＡがある。これは、標的ＲＮＡを相補する塩基配列を有するＲＮＡで、標的ＲＮＡあるいは標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ鎖と２本鎖を形成することで標的ＲＮＡの転写あるいは、標的ＲＮＡが機能することを阻止するものである。その作用機構は、非常に複雑で、標的ＲＮＡの転写阻害、スプライシング阻害、翻訳阻害、あるいは標的ＲＮＡと２本鎖を形成することにより、ＲＮase による分解を誘導する等が報告されている（Antisense Nucleic Acids and Proteins(Eds. J.N.M.Hol and A.R.van der Krol)Marcel Dekker,New York(1991))。
【００１１】アンチセンスＲＮＡもリボザイム同様、抗ＲＮＡウイルス剤等の薬剤としての応用が試みられている。ハン（L.Han）らは、マウス白血病ウイルスのパッケージングに必須なウイルス遺伝子の配列に相補的なアンチセンスＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスを作成し、これが白血病ウイルスに曝されても全く発病しないことを示した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.88 ,p.4313-4317(1992)）。
【００１２】アンチセンスＲＮＡの場合も、リボザイム同様基質特異性が高い。そのため、前述のリボザイムと同様に、標的ＲＮＡにかかわる問題をはらんでいることが当該分野で知られている。リボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを生体内に供給する方法として、化学的方法；酵素法；また、あるいは遺伝子組み換え法で合成したものを生体外部から入れる方法；遺伝子組み換え法、すなわちリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを適当なプロモーターの下流につないだものを、適当なベクターに挿入し、これを生体内に導入することにより、生体内でリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを産生する方法が知られている。前者の化学的方法は、リボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡの効果を持続させるためには、頻繁にリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを生体内に注入し、十分な濃度を維持する必要がある。
【００１３】これに対して、後者の遺伝子組み換え法は生体内で絶えずリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを産生し続けることができるため、リボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを注入し続ける等の問題点を解決することができる。ところで、多種類のリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを生体内に供給する場合、それぞれのリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを生体外で前述のように合成し、生体外から供給することは可能であるが、組み換え遺伝子法によりこれを行うことは、多種の遺伝子を生体内に導入するのと同じことであり、この技術は非常に困難であることが当該分野で知られている。
【００１４】リボザイムに関しては、唯一、チェン（Chen) らは多種のリボザイムを一度に作用させるものとして、一つのプロモーターの下流に多種のリボザイムを幾つも連結し、一分子中に多種のリボザイム活性部位をもつものとして考案した(Nucleic Acids Res.Vol.20,p4581-4589(1992)) 。しかし、このような構築物は一分子中に相補的な配列を多く含み、それらの干渉作用により必ずしもリボザイム活性が高いとはいえない。このことは、連結するリボザイム活性部位が多くなるほど顕著であると考えられる。
【００１５】さらに、リボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡの様な特定のＲＮＡ転写物をインビトロ（in vitro) で得ようとする場合、従来法においては、目的とするＲＮＡをコードするＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡに転写する際に、当該ＤＮＡにより組み換えられたプラスミドを制限酵素で切断してから転写するという余分の手間を要するものであった（ラン・オフ法と呼ばれている）。
【００１６】この理由は、当該プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡを転写する場合に必然的に生ずる、5'末端側と3'末端側における余分な塩基配列を可能な限り転写させないようにするためである。すなわち、5'末端側は、プロモータのすぐ下流に上記ＤＮＡを連結させることによって処理されていたが、3'末端側の処理は、ＲＮＡの転写において未だユニバーサルなターミネータが見い出されておらず、当該3'末端側の処理に際して制限酵素を使用するいわゆるランオフ法を採らざるを得なかった（図２）。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】上記の制限酵素を使用する従来の方法は、制限酵素を使用するという余分の手間に加えて、転写において切断された線状のＤＮＡを使用する必要があるため、インビトロ（in vitro）では、ＲＮＡを合成することが可能であるが、生体内において、ＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を含む組み換えベクターを保持、増殖せしめつつＲＮＡ転写物を産生させることができないという欠点を有していた。さらに、5'末端側の処理においてプロモーターのすぐ下流に目的とするＲＮＡに対応するＤＮＡを連結したとしても、転写開始点から目的とするＲＮＡに対応するＤＮＡまでの間の余分な塩基配列が付加してしまうということを避けることができなかった。まして、余分な塩基配列が付加されていない複数個のＲＮＡを同時に産生させるベクターは、存在しなかった。
【００１８】本発明の課題は、上記のin vitroでの制限酵素による切断を行わずに、目的とするＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡにより組み換えられた環状のベクターをそのまま鋳型として用いることができるとともに余分な塩基配列を有しないＲＮＡ、あるいは、余分な塩基配列を有しない多種類のＲＮＡを同時に転写することが可能であり、かつ生体内においても当該組み換えベクターを保持増殖させながら目的とするＲＮＡ転写物を高い転写効率で産生することが可能な、リボザイムを用いたＲＮＡの新規な転写システムを提供しようとするものである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究の結果、ベクターの構築において、目的とするＲＮＡ転写物の5'末端と3'末端とを各々セルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡを一単位とし、当該１単位又は２単位以上を直列に連結し、特定の配列のプロモーターの下流に、あるいは特定の配列のプロモーター及びターミネーターの間に配置することにより、上記の課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【００２０】すなわち、本発明は次の(1)から(4)を要旨とするものである。
(1) ＤＮＡ配列の5'末端と3'末端とに各々、セルフプロセッシングにより当該5'末端と3'末端を各々切断するリボザイムを有するＲＮＡを１単位として、当該ＲＮＡ単位を１個又は２個以上連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
【００２１】(2) 前記(1)に記載したＲＮＡ単位を、１乃至10単位連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
(3) 前記(1)に記載したＲＮＡ単位をｎ個（ｎは１以上の整数）連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクターにおいて、5'末端側から１番目の上記ＲＮＡ単位の5'末端の近傍にプロモーターが付加されており、かつ当該プロモーターに対応するターミネーターが、5'末端側からｎ番目の上記ＲＮＡ単位の3'末端の近傍に付加されていることを特徴とする、ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
【００２２】(4) 前記(1)〜(3)に記載されたベクターを鋳型として、当該ベクターＤＮＡをＲＮＡに転写することを特徴とする、5'末端側と3'末端側がセルフプロセッシングされたＲＮＡ転写物の製造方法。
(5) 前記(1)〜(3)に記載されたベクターにより形質転換された、微生物、又は動物細胞若しくは植物細胞。
【００２３】以下、本発明を更に詳述する。本発明のベクターは、調製したＲＮＡ１単位をセルフプロセッシングにより切断する、又は２単位以上を直列に連結することにより構築することができる。本発明のベクターの構築は、まずＤＮＡ配列の5'末端と3'末端とに各々、セルフプロセッシングにより当該5'末端と3'末端を各々切断するリボザイムを有するＲＮＡ単位を調製することにより行うことができる。
【００２４】すなわち、目的とするＲＮＡ転写物の5'末端側と3'末端側を処理するため２つのリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を連結する。このうち、第１のＤＮＡ配列は、ＲＮＡ転写物の5'末端側を処理するためのもので、リボザイムＲＮＡの触媒活性部位をコードする部分と、その両端の基質となる転写されるＲＮＡの切断部位（5'末端側）を認識する結合部位をコードする部分を含む。このリボザイムＲＮＡとコードするＤＮＡは目的とするＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡの5'上流側に連結する。
【００２５】また、同じく挿入される第２のＤＮＡ配列は、転写されたＲＮＡの3'末端側を処理するためのもので前記目的とするＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡの3'下流側に連結され、リボザイムＲＮＡの触媒活性部位をコードする部分とその両端の基質となる転写されるＲＮＡの切断部位（3'末端側）を認識する結合部位をコードする部分より成る。
【００２６】そして、複数個のＲＮＡ単位を連結するベクターの構築においては、上記において調製したＲＮＡ単位の5'末端と3'末端とを各々、セルフプロセッシングにより切断するリボザイムを有するＲＮＡをコードするＤＮＡを１単位又は２単位以上を直列に連結することによりなる。次に、ＲＮＡ転写物の製造においては、上記のベクターを用いてＲＮＡ転写物を製造する。かかる場合は、当該組み換えベクターを試験管内あるいは微生物（細菌、酵母、カビを含む）、植物、動物等の生体中に保持せしめてＲＮＡの転写を行う。
【００２７】なお、上記ＲＮＡ単位を単数個コードするベクターに関しては、プロモーターの3'の下流側の転写開始点から開始され、目的とするＲＮＡ転写物の領域をすぎても終了せず、目的とするＲＮＡ転写物の3'側のプロセッシングリボザイムの領域をも通過し転写が続けられる。この時、生成したＲＮＡの5'末端及び3'端末は、すでにリボザイムによるセルフプロセッシングにより切断されて余分な塩基配列は付加されない。
【００２８】上記ＲＮＡ単位を複数個連結してコードするベクターに関しては、前記(1)のベクターと同じく、プロモーターの3'の下流側の転写開始点から開始され、目的のＲＮＡ転写物群の領域を過ぎても転写が続けられる。同時に、各目的ＲＮＡの5'末端及び3'端末のプロセッシングリボザイムの作用により、余分な塩基配列が付加されない各目的ＲＮＡが切り出される。
【００２９】なお、本発明において上記ＲＮＡ単位を連結可能な単位数は100単位程度までであるが、好ましくは１〜10単位程度である。以上の点を更に具体的に説明する。例えば、図３は酵母の凝集性に関する遺伝子由来ｍＲＮＡ（以下、SFL1ｍＲＮＡという。）を切断し得るリボザイムを産生する本発明の組み換えプラスミドpGENE 8459v3の構造を表すものである。すなわち、pGENE 8459（多比良ら、特願平1-329831及び、K.Taira et.al., Protein Engineering,3, 733-737(1990)) のEcoRI／SacI断片を取り除き、この代わりに、常法により化学合成した新たなオリゴヌクレオチドEcoRI／SacI断片を挿入することを示している。
【００３０】挿入する塩基配列は図３のpGENE 8459v3のEcoRIサイトからSacIサイトに相当し、両鎖とも化学合成した後、それぞれの5'末端をリン酸化してリガーゼを用いて連結する。当該プラスミドは、 T7 ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータの下流側にSFL1ｍＲＮＡの切断部位を認識する結合部位をコードする部分とループ状の触媒活性部位をコードする部分からなるリボザイムＲＮＡに対応するＤＮＡ部分を有しており、更にその5'上流側と3'下流側において転写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断される切断部位（Cleavage site)と、この切断を行うループ状の触媒活性部位、及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードする２つのＤＮＡ配列を有している。
【００３１】そして、上記結合部位をコードするＤＮＡ配列は、切断部位直前にある一つの塩基部分を除いてその両側の塩基配列と相補の関係にあり塩基対を形成する。当該プラスミドにおいては、転写は T7 プロモータの下流＋１から始まり、SFL1用のリボザイム部分、及びその下流側の塩基配列部分が順次ＲＮＡに転写される。そして、転写されたＲＮＡは前記した5'末端及び3'末端の切断部位において２つのリボザイムによりセルフプロセッシングされることにより、余分な塩基配列は得られるリボザイムには付加されない。
【００３２】従って、この図３の組み換えプラスミドを鋳型として転写することにより得られるリボザイムＲＮＡは図４の塩基配列を有するものとなる。このリボザイムＲＮＡは5'及び3'末端側に相補の塩基配列を有し、塩基対を形成してヘアピン構造となっており、このため生体内におけるエキソヌクレアーゼによる分解に対し、安定性を有するものである。
【００３３】また、例えば、図５及び図６は、HIV-1遺伝子あるいは、これに由来するｍＲＮＡの5'側Long terminal repeat配列（以下、LTRという。）と、HIV-1のtat遺伝子あるいは、これ由来のｍＲＮＡを切断し得るリボザイムをそれぞれ産生する本発明の組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatの構造を表すもので、以下にその構築の概要を述べる。
【００３４】前述のpGENE8459（多比良ら、特願平1-329831及び、K.Taira etal. Protein Engineering,3, 733-737(1990)) のEcoR／SacI断片を取り除き、常法により化学合成した新たなオリゴヌクレオチドEcoRI／SacI断片を代わりに挿入した。挿入した塩基配列は図７に示す、pV3TA-LTRのEcoRIサイトからSacIサイトに相当し、両鎖とも化学合成した後、それぞれの5'末端をリン酸化してリガーゼを用いて連結した。
【００３５】次に、得られたプラスミドのXhoI／SalI断片を取り除き、常法により化学合成した２種の合成リンカー（図９Ｂ，Ｃに塩基配列を示す。）の5'末端をリン酸化してリガーゼを用いて連結したものを代わりに挿入した。挿入後、リガーゼを用いて連結した。更に、得られたプラスミドのSalI／HindIII 断片を取り除き、常法により化学合成した新たなオリゴヌクレオチド（図９Ｄに塩基配列を示す。）を代わりに挿入し、リガーゼを用いて連結した。こうして得られた、図７の組み換えプラスミドpV3TA-LTRのApaI／EcoRV 断片を取り除き、常法により化学合成したオリゴヌクレオチドApaI／EcoRV 断片（図９Ｅに塩基配列を示す）を代わりに挿入し、リガーゼを用いて連結した。こうして得られた図８に示す、組み換えプラスミドpV3TA-tatを鋳型に、図10に示した２種の化学合成プライマーを用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェイン反応）法により増幅し、制限酵素KpnI及びHindIIIで処理後、図７のpV3TA-LTRのKpnI-HindIII間に挿入し、リガーゼを用いて連結し、図５及び図６の組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatを構築した。
【００３６】当該プラスミドは T7ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターの下流側に以下の構造体を有している。すなわち、生体内での安定性を計るため3'末端部分に少なくとも20個以上最大100個のアデニン残基よりなるポリＡテイルとそれに続くＧＵＣの塩基配列を付加したメチオニンｔＲＮＡのアンチコドン部位に挿入された状態（Cotten and Birnstiel,EMBO J.,8,3861-3866(1989)）で、LTRｍＲＮＡ結合部位およびループ状の触媒活性部位を有するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と、その5'上流側と3'下流側において転写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断される切断部分（Cleavage site）と、この切断を行うループ状の触媒活性部位及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードする２つのＤＮＡ配列、これらに続く形で上記構造体中のLTRｍＲＮＡ結合部位をtatｍＲＮＡ結合部位に変更したものである。
【００３７】これら結合部位をコードするＤＮＡ配列もまた、切断部位直前にある１つの塩基部分を除いてその両側の塩基配列と相補の関係にあり塩基対を形成する。該プラスミドは、転写を T7プロモータの下流＋１から始め、LTR用のリボザイム部分、その3'側セルフプロセッシングリボザイム部分、tat用のリボザイム部分の5'側セルフプロセッシングリボザイム部分に続いてtat用のリボザイム部分およびその下流側の塩基配列部分を順次ＲＮＡに転写していくが、転写されたＲＮＡは前記した４つのリボザイムによりセルフプロセッシングされることにより、余分な塩基配列が付加していないLTR用およびtat用リボザイムに切り分けられる。
【００３８】また、例えば図11は、図８のpV3TA-tat にT7プロモーターに対するターミネーターを付加した構造を表すもので、以下にかかる構築の概要を述べる。前述のpV3TA-tat のKpnI／HindIII 断片を取り除き、常法により化学合成したT7ターミネーター配列を含むKpnI／HindIII 断片を代わりに挿入した。このようにして、図11に示す組み換えプラスミドpV3TA-tat-Term1 を得た。
【００３９】当該プラスミドは、前述のpGENE8459v3 やpV3TA-LTR-tat と同様にプロセッシングリボザイムの作用によりtat 切断用のリボザイムが切り出される。この際、T7ターミネーターを付加することにより、tat 用リボザイムの転写量がT7ターミネーターを付加しないものの約２倍に増加することが判明した（図17) 。すなわち、特定のプロモーターにあったターミネーターを付加することにより、リボザイムの生産量を上げることが可能になる。
【００４０】かかる図５、図６、及び図11の組み換えプラスミドを鋳型として転写することにより得られる２種のリボザイムＲＮＡは、それぞれ図16に示す塩基配列を有するものとなる。当該リボザイムは、t-ＲＮＡ構造を形成するようになっており、さらに3'側には30個のアデニン残基によりなる、ポリＡテイルを有している。これらの構造は、生体内におけるエキソヌクレアーゼによる分解に際し、安定性を保持することが当該技術分野で知られている。
【００４１】この図３、図５、図６、及び図11の組み換えプラスミドは、リボザイムＲＮＡを製造するリボザイムとして、SFL1切断用のリボザイム、LTR 切断用のリボザイム、tat 切断用のリボザイム、プロモーターとして T7 ＲＮＡポリメラーゼのためのターミネーター及びベクターとしてpUC119を用いているが、本発明は特にこれらの要素に限定されるものではない。
【００４２】すなわち、上記の図３の組み換えプラスミドは、リボザイムＲＮＡを生産するものであるが、２種に限らず、5'末端と3'末端とを各々、セルフプロセッシングにより切断するリボザイムを有する異なるリボザイムをコードするＤＮＡ断片を連結することで、所望する種のリボザイムＲＮＡを生産させることが可能である。また、両プロセッシングリボザイムの間のリボザイムを全て同じものにすることにより、プラスミド当たりの同一種のリボザイムの生産量を上げることも可能となる。さらに、製造するＲＮＡはリボザイムに限らず、例えばＲＮＡウイルスのＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、種々のｍＲＮＡ等、広くＲＮＡ転写産物の製造に適用可能である。
【００４３】用いるプロモーターも、例えばSP6 ,GAL7,SV40,CaMV35S等、種々のものを使用することが可能であり、用いるターミネーターも上記プロモーターに対応するものを選択することが可能である。さらに本発明においては、組み換えベクターは、特に環状のままであっても、ＲＮＡを転写できるための種々の生体中においても機能を発揮するものであって、リボザイム機能を発揮させようとする生体、例えば植物、動物等の種類に応じて適切なベクターを選択することができる。
【００４４】
【実施例】以下に、実施例により本発明を詳細に説明する。ただし、これらの実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕 組み換えベクターpGENE 8459v3の構築先に述べた方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira, K., Oda, M., Shinshi, H., Maeda, H., and Furukawa, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990)）で図３のEcoR／SacI断片を化学合成し、これを含む溶液 3.3μl(100pmol)を制限酵素EcoRIとSacIで前もって切断しておいた組み換えプラスミドpGENE8459（多比良ら、特願平1-329831号；Taira K., Oda, M., Shinshi, H., Maeda, H., andFurukawa, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990)）に林等の方法（1)Hayasi,K.,Nakazawa,M.,Ishizaki,Y. and Obayashi,A.Nucleic Acids Res.,13,3261-3271(1985), 2)Hayashi,K.,Nakazawa,M.,Ishizaki,Y.,Hiraoka,N. and Obayashi,A.Nucleic Acids Res.,13,7979-7992(1985)) により連結した。
【００４５】この溶液を用いて大腸菌MV1184株を形質転換し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、挿入された断片中のXhoＩサイトを利用してポジティブなクローンを選択した。また、塩基配列はＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製370A）を用いて確認した。
〔実施例２〕 組み換えベクターpV3TA-LTRの構築先に述べた方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira K., Oda, M., Shinshi, H., Maeda, H., and Furukawa, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990)）で図８ＡのEcoRI／SacI断片を化学合成し、前述の林等の方法で、制限酵素EcoRIとSacIで前もって切断しておいた図３R>３の組み換えプラスミドpGENE 8459v3に連結し、大腸菌MV1184に形質転換した。コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、断片が挿入されたことによりKpnIサイトが消失したことを利用してポジティブなクローンを選択した。
【００４６】得られた組み換えプラスミド0.5μgを制限酵素XhoIとSalIで処理したものに、先に述べた方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira K., Oda, M., Shinshi,H., Maeda, H., and Furukawa, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990)）で化学合成し、リン酸化し、連結した図８の合成リンカー（Ｂ，Ｃ）を２μg 加え、前述の林らの方法で連結した。これを大腸菌MV1184に形質転換し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、断片が挿入されたことによりば BamHIサイトが消失したことと、ApaIサイト、EcoRV サイトが生じたことを利用してポジティブなクローンを選択した。
【００４７】さらに、こうして得られた組み換えプラスミド 0.5μgを制限酵素SalIとHindIII で処理し、先に述べた方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira K., Oda,M., Shinshi, H., Maeda, H., and Furukawa, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990)）で化学合成した図９Ｄの合成リンカーを前述の林等の方法で連結した。これを大腸菌MV1184に形質転換し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、断片が挿入されたことによりSalIサイトが消失したことを利用してポジティブなクローンを選択した。この組み換えプラスミドの塩基配列をＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製370A）を用いて確認した。
〔実施例３〕 組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatの構築先に述べた方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira K., Oda, M., Shinshi,H., Maeda, H., and Furukawa, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990) ）で化学合成した図８ＥのApaI／EcoRV断片を、制限酵素ApaIとEcoRVで処理した図７の組み換えベクターpV3TA-LTRに前述の林らの方法で連結し、これを大腸菌MV1184に形質転換し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、断片が挿入されたことをＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製370A）を用いて塩基配列を確認することによりポジティブなクローンを選択した。
【００４８】こうして得られたプラスミド（以下、pV3TA-tat と呼ぶ）（図８）を鋳型に、図10に示した２種のプライマーを用い、ゲルファンド（D.H.Gelfand）等の方法（PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications. Academic Press, Inc., San Diego,CA, p.129-141(1990)）に従い、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェイン反応）法により増幅反応をおこなった。増幅反応は、92℃で１分30秒、50℃で２分、72℃で４分、これを１サイクルとして25サイクル行った。なお、この反応はパーキンエルマーシータスインストルメンツ社製ＤＮＡサーマルサイクラー480を用いた。得られたＤＮＡ断片を、常法に従いクロロホルム抽出、エタノール沈澱を行った後、制限酵素KpnIとHindIIIで処理し、制限酵素KpnIとHindIIIで処理した組み換えプラスミドpV3TA-LTRに連結し、大腸菌MV1184に形質転換し、コロニーを形成させた後、プラスミドを取り出し断片が挿入されたことを制限酵素EcoRIとHindIIIで切断することにより確認した。
〔実施例４〕組み換えプラスミドpV3TA-tat-term 1及びpV3TA-tat-term２の構築次に前記のようにして構築した組み換えプラスミドpV3TA-tatの３' 末端にT7ターミネーターを付加した。先に述べた方法によりT7ターミネーター配列（METHOD IN ENZYMOLOGY,VOL185,p.60-89(1990))を含むKpnＩ／HindIIIリンカー2.0μgを合成し、制限酵素KpnＩ／Hind IIIで切断しておいたpV3TA-tat0.5μgに前述の方法で連結し、大腸菌MV1184に形質転換した。コロニーを形成させた後、プラスミドを取り出し、制限酵素KpnＩ／Hind IIIで処理し、アガローズゲル電気泳動することにより、この合成リンカーが挿入されていることを確認した。このプラスミドをpV3TA-tat-term 1（図11）と称する。なお、このプラスミドpV3TA-tat-term1 は、Escherichia coli MV1184 に導入されて、E.coli TERM 1 として通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されており、その寄託番号は微工研菌寄第13143 号である。
【００４９】次に組み換えベクターpV3TA-tat-term1の改変を行った。先に述べた方法により、図11のXho1サイトからApa1サイトの配列を有するXhoＩ／ApaＩリンカー2.0μgを合成し、制限酵素XhoＩとApaＩ1 で理したpV3TA-tat-term10.5μgに前述の方法で連結し、大腸菌MV1184に形質転換した。コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、制限酵素XhoＩとApaＩとで処理し、アガロースゲル電気泳動法により、この合成リンカーがが挿入されていることを確認した。このプラスミドをpV3TA-tat-term 2( 図12）と称する。なお、このプラスミドpV3TA-tat-term 2は、Escherichia coliMV1184に導入されて、E.coli TERM 2 として通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されており、その寄託番号は微工研菌寄第13144 号である。
〔実施例５〕組み換えプラスミドpV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型の構築pV3TA-tat のSmaIサイトにBglII リンカー（5'-GGGAGATCTCCC-3') を、KpnIサイトにBamHI リンカー（5'-CGGATCCGGTAC-3') を挿入した。このようにして得たプラスミドを、制限酵素BglII とBamHI で処理し、tat 用リボザイム配列を含むBglII BamHI ＤＮＡ断片及びtat 用リボザイム配列を含まないBglII BamHI ＤＮＡ断片（以下、BglII BamHI ベクターと呼ぶ）をアガロースゲル電気泳動により分離回収した。回収したＤＮＡ断片をT4リガーゼを用いて連結後、再度、制限酵素BglII と BamHIで処理した。当該反応物をBglII-BamHIベクターに連結し、当該ベクターを用いてE.coli MV1184 を形質転換し、コロニーを形成させた後でプラスミドを取り出し、これを制限酵素BglII と BamHIで処理することにより、tat 用リボザイム配列を含むBglII- BamHI ＤＮＡ断片を１〜５個、及び10個含むものを選択した。以後、この種のプラスミドをpV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型と呼ぶ（図13−Ｂ）（ここでｎは、tat 用リボザイムを含むBglII-BamHI ＤＮＡ断片が何個入ったかを意味する。例えば、1 個ではpV3TA-(tat)1、2 個ではpV3TA-(tat)2。
〔実施例６〕直列連結型リボザイム発現プラスミドの構築pV3TA-tat を制限酵素XhoIで処理し、Klenow flagment で平滑化したのち、制限酵素HindIII で処理し、tat 用リボザイム配列を含むXhoI-HindIII ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離回収した。当該ＤＮＡ断片を、pV3TA-tat を制限酵素XbaIで処理し、Klenow flagment で平滑化した後、制限酵素HindIII で処理したものに連結した。さらにこれを制限酵素XbaIで処理し、Klenow flagment で平滑化したのち、制限酵素HindIII で処理し、先のＤＮＡ断片を連結した。以下、この操作を繰り返し、T7プロモーターの下流にtat 用リボザイム配列が直列に１個〜５個、及び10個含むものを構築した。ただし、この構築方法では、１個あるいはそれ以上連なったtat 用リボザイム配列の5'端と3'端に自分自身を切断するプロセッシングリボザイムが付加される。以下、この種のプラスミドを直列連結型リボザイム発現プラスミド(n-1〜5,10) と呼ぶ（図13−Ｂ）。
〔実施例７〕リボザイムの製造前述の方法（多比良ら、特願平1-329831号；Taira K., Oda, M., Shinshi, H., Maeda, H., and Furukawa, K. Protein Engineering,3, 733-737(1990)）でＲＮＡの転写を行った。
【００５０】図14において、(A)から(D)は、鋳型ＤＮＡとして環状のpGENE 8459v3を用いた場合を、また、(E)から(H)は鋳型ＤＮＡとして制限酵素HindIIIにより切断した線状pGENE 8459v3を用いた場合をそれぞれ示している。転写反応時間は、(A)と(E)の場合30分；(B)と(F)の場合１時間；(C)と(G)の場合２時間30分；(D)と(H)の場合６時間であった。
【００５１】32Ｐでラベル化された上記(A)〜(H)の各転写産物は8.3％尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲルを用いて解析した。図16には約50塩基から130塩基までの領域を示す。図15において、(A)から(E)は、鋳型ＤＮＡとして環状のpV3TA-LTR-tatを用いた場合を示しており、(A)は０分；(B)は30分；(C)は１時間；(D)は２時間；(E)は４時間転写反応をさせた。
【００５２】32Ｐでラベル化された上記(A)〜(E)の各転写産物は8.3％尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲルを用いて解析した。図15には約50塩基から300 塩基までの領域を示す。更にpV3TA-tat、pV3TA-tat-term1及びpV3TA-tat-term2を鋳型として用いたInvitroにおける転写反応を行った。塩化セシュウム密度勾配遠心法で精製したプラスミドpV3TA-tat、pV3TA-tat-term1及びpV3TA-tat-term2の各々２μgを、40mMTris-HCl(pH7.5),6mM MgCl2,2mMスペルミジン、0.01％ bovine serum alubumin,0.375mM ATP,CTP,GTP,UTP, 0.74MBq α-32Ｐ〔CTP〕20unitsT7 ＲＮＡ ポリメラーゼを含む反応溶液50μl中37℃で反応させ、０、１、３、６、12、24時間ごとに７μlずつ回収した。これらに0.02％ブロモフェノールブルー、0.02％キシレンシアノール、50mM EDTA、９M尿素を含む水溶液を等容量加え、90℃で２分間加熱した後オートラジオグラフィーにかけた。なお、各々のオートラジオグラムの強度はフジ写真フイルム社製のバイオイメージアナライザーＢＡ100により測定した。
【００５３】オートラジオグラフィーの結果を図17に示す。(A)から(F)はpV3TA-tatを鋳型に用いた場合、(G)から(L)はpV3TAtat-term1を鋳型に用いた場合、(M)から(R)はpV3TA-tat-term2を鋳型に用いた場合の各々の結果を示す。反応時間は(A)、(G)、(M)が０時間；(B)、(H)、(N)が１時間；(C)、(I)、(O)が３時間；(D)、(J)、(P)が６時間；(E)、(K)、(Q)が12時間；(F)、(L)、(R)が24時間であった。また、これらのオートラジオグラムの内、tat 用リボザイムの部分の強度の相対値（レーン(B)の値を１とした場合）をグラフ化して表したのが図18である。
【００５４】図18の結果より転写されたtat用リボザイムの転写量はT7ターミネーターを３'末端に付加したpV3TA-tat-term1では付加しないpV3TA-tatの２倍であった。更にSac1サイトを除去したpV3TA-tat-term2はpV3TA-tat-term1の約２倍、pV3TA-tatの約４倍であった。また、図17の結果より、ターミネーターを３'末端に付加することにより高分子量域側の非特異的な転写物の生産が抑制されており、さらにSacＩサイトを除去したことにより、５'端処理用のリボザイムが付加したtat用リボザイム転写量が劇減していた。以上の結果をまとめると、pV3TA-tat-term2をリボザイムの転写、発現プラスミドとして用いれば、従来のリボザイム発現プラスミドであるpV3TA-tatに比較して目的とするリボザイムの生産量を少なくとも４倍にすることができ、さらに高分子領域側の非特異的な転写物の生産を抑制することか可能となり、リボザイムによるＲＮＡの生産方法の著しい進歩をもたらしたことになる。
【００５５】図19において、(A)はpV3TA-(tat)1、(B)はpV3TA-(tat)2、(C)はpV3TA-(tat)3、(D)はpV3TA-(tat)4、(E)はpV3TA-(tat)5、(F)はpV3TA-(tat)10をそれぞれ等量鋳型に用い、６時間転写反応させたものを、7M尿素を含む５％ポリアクリドアミノゲル電気泳動により解析した結果である。ここで5'CAR は、5'端にある5'端処理用リボザイム、5'CAR+3'CAR は各tat 用リボザイムの間に位置する5'端処理用リボザイムと3'端処理用リボザイムが連結したもの、5'CAR+3'CAR+tatRは、5'端処理用リボザイムと3'端処理用リボザイムとtat 用リボザイムが連結したものである。5'CAR 及び 5'CAR+3'CAR+tatR は、添加した鋳型の種類に関係なく一定であるが、その他のものは鋳型のｎ数に比例して増加した。すなわち、tat 用リボザイムとその5'側及び3'側に位置する端処理用リボザイムを一単位として、当該単位数に比例してtat 用リボザイムの生産量が増加した。
【００５６】図20は、tat 用リボザイムの生産量を経時的に調べたものである。ここで、pV3TA-(tat)1を鋳型とした場合の反応６時間後のtat 用リボザイム量を相対的に示したものである。これより明らかなように、tat 用リボザイム量は鋳型のｎ数に比例して増加しており、ｎ=10 の場合いずれの時間においてもｎ＝１の場合のほぼ10倍のtat 用リボザイム量が生産された。
【００５７】以上のことにより、両プロセッシングリボザイムの間のリボザイムを全て同じものにすることにより、プラスミド当りのリボザイムの生産量を上げることができることが判明した。
〔実施例８〕リボザイム反応Ａ）pGENE 8459v3を用いて製造したリボザイム反応図16の「SFL1用リボザイム」及び線状pAM19SFL1ac(PstI)を鋳型として同様に転写及び電気泳動された「SFL1ｍＲＮＡ」をそれぞれポリアクリルアミドゲルより切り出し、400μlの0.3M酢酸ナトリウム／0.1mM EDTA／20mM Tris・HCl(pH8)を含む緩衝液を用いてそれぞれのＲＮＡを抽出した。常法によりエタノール沈澱を行い、単離した基質(SFL1ｍＲＮＡ）が酵素(SFL1用リボザイム）より過剰な条件で混合し、50mM Tris・HCl(pH8)／10mM MgCl2を含む緩衝液中37℃で切断反応を追った。
【００５８】図５及び図６と同じ組成のゲルで解析した結果を図21に示す。(A)、(B)、(C)、(D)、(E)の反応時間は、それぞれ0.1、2.5、5.5、9.5時間である。時間と共にSFL1ｍＲＮＡが図４のような複合体をリボザイムと形成し、SFL1ｍＲＮＡが二つに切断される。図14及び図21の結果より明らかなように、a. 環状のpGENE 8459v3を鋳型とした場合、61塩基で構成されるSFL1用リボザイムが放出された。これは5'端処理用及び3'端処理用のリボザイムが効率よく作用したためである。また、5'端処理用リボザイムとSFL1用リボザイムが連結した断片も徐々に切断を受け二つに別れる（図14、A〜D）。b. 3'端処理用リボザイムのすぐ下流にあるHindIIIサイトを切断した線状pGENE 8495v3を鋳型とした場合、まず5'端処理用リボザイム、SFL1用リボザイム、及び3'端処理用リボザイムが連結された状態で産生され、徐々に切断を受けるが、環状のpGENE 8459v3を鋳型とした場合と比べて転写効率が悪く、また副産物も多かった（図14、E〜H）。T7 ＲＮＡポリメラーゼを用いてSFL1遺伝子の転写産物を作成し、その後、単離したSFL1用リボザイムと混ぜた場合においては、SFL1用リボザイムがうまく作用すると76塩基のSFL1転写産物が切り出されるように結合部位を設計したものであり（図４）、実際予想どおり76塩基の断片が確認できた（図21) 。
【００５９】以上の結果をまとめると、5'端処理用リボザイムと3'端処理用リボザイムは分子内で設計どおりに切断反応を起こした。また、SFL1用リボザイムも設計どおりに分子間で切断反応を起こした。また環状ＤＮＡを鋳型とする方が転写効率および純度の面で優れており、またpGENE 8459v3の「SFL1用リボザイム」領域はカセット式になっており他の配列と置き換えることができるので、特に短いＲＮＡ転写産物を単離する場合、pGENE 8459v3の方が従来のラン・オフ法より優れている（制限酵素を用いて切断する手間もはぶける）ことが明らかになった。
Ｂ）pV3TA-tat、pV3TA-LTRおよびpV3TA-LTR-tat用いて製造したリボザイム反応pV3TA-tat、pV3TA-LTR、pV3TA-LTR-tatおよびT7-LTR（T7 プロモーターの下流にHIV-1のgag遺伝子のｃＤＮＡ（転写開始点から422塩基対下流を含む）を有するＤＮＡ断片）、T7-tat（T7 プロモーターの下流にHIV-1のtat遺伝子のｃＤＮＡ（翻訳開始点から149塩基対下流を含む）を有するＤＮＡ断片）を鋳型として同様に転写および電気泳動されたtat用リボザイム、LTR用リボザイム、tat用リボザイム＋LTR用リボザイムおよびLTRＲＮＡ、tatＲＮＡをそれぞれポリアクリルアミドゲルより切り出し、前述と同様にゲルからＲＮＡを抽出した。エタノール沈澱後、tat用リボザイムとtatＲＮＡ、LTR用リボザイムとLTRＲＮＡ、tat用リボザイム＋LTR用リボザイムとLTRＲＮＡとtatＲＮＡをそれぞれ前述の条件で切断反応を行った。
【００６０】図14と同じ組成のゲルで解析した結果を図22に示す。(A)〜(F)は、tat用リボザイムとtatＲＮＡ、(G)〜(L)は、tat用リボザイム＋LTR用リボザイムとLTRＲＮＡとtatＲＮＡ、(M)〜(R)はLTR用リボザイムとLTRＲＮＡの切断反応の結果である。反応時間は(A)、(G)、(M)が０時間；(B)、(H)、(N)が0.5時間、(C)、(I)、(O)が１時間；(D)、(J)、(P)が２時間；(E)、(K)、(Q)が４時間；(F)、(L)、(R)が６時間である。
【００６１】図15及び図22の結果より、pV3TA-LTR-tatを鋳型とした場合、163 塩基で構成されるtat用リボザイムおよびLTR用リボザイムの両方が産生されていることが明らかである。すなわち、pV3TA-tatより産生されたtat用リボザイムは、tat ＲＮＡ（149塩基）を、49塩基と100塩基のＲＮＡ断片に切断し、pv3TA-LTRより産生されたtat用リボザイムは、LTRＲＮＡ（422塩基）を、70塩基と352塩基のＲＮＡ断片に切断しているが、pV3TA-LTR-tatより産生されたリボザイムは、tatＲＮＡとLTRＲＮＡをそれぞれ同じパターンで切断している。
【００６２】これらのことからをまとめると、２個の5'端 処理用リボザイムと２個の3'端処理用リボザイムは分子内で設計通りに切断反応を起こし、２種のリボザイムすなわちLTR用リボザイム、tat用リボザイムが産生された。また、産生された両リボザイムは余分な塩基配列を含まず、さらに、それぞれの標的ＲＮＡを設計通りに切断した。両端にシスに作用するリボザイムを有するＲＮＡをコードするＤＮＡをつなげていくことで、複数種のリボザイムのようなＲＮＡを一度に産生することが可能である。
Ｃ）組み換えプラスミドpV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型を鋳型として用いたin vitro転写切断反応組み換えプラスミドpV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型を鋳型として用い、これにより転写されるリボザイムによるHIV-1tatＲＮＡの切断を、転写反応と切断反応を同時に行う転写切断反応を用いて検討した。
【００６３】反応は、以下の条件で行った。すなわち、40mM Tris-HCl(pH8.0),20mM MgCl2,2mM スペルミジン,1mM ジチオスレイトール,1mM NTP,2 units／μl ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター,20nM tat ＲＮＡ(32Pで放射ラベルしたもの),2nM 鋳型プラスミドの混合物を37℃で保温し、各時間ごとに採取した。
【００６４】採取した反応物を7M尿素を含む５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した結果を図23に示す。(A)はpV3TA-(tat)1、(B)はpV3TA-(tat)2、(C)はpV3TA-(tat)3、(D)はpV3TA-(tat)4、(E)はpV3TA-(tat)5、(F)はpV3TA-(tat)10を鋳型として用いたもので、反応時間は0,1,3,6,12時間で行った。これより明らかなように、切断効率は鋳型のｎ数に比例して増加していた。また、切断効率を直列連結型リボザイム発現プラスミドを鋳型として用いた場合と比較したのが図24である。これは、反応開始６時間後の添加したtat ＲＮＡの切断された割合を示したものである。
【００６５】ｎ数が３個までは両方ともにほぼ同じ切断効率を示したが、直列連結型ではそれ以上のｎ数においては飽和状態に達したのに対して、pV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型では直線的に増加していた。以上のことにより、pV3TA-(tat)n(n-1〜5,10)型を用いた場合のほうが、単にリボザイムを直列に連結したものに比べて、切断効率の点で有利であることが示された。
【００６６】
【発明の効果】本発明のリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を含むベクターは、環状のままでも制限酵素を用いることなく5'末端及び3'末端側において余分な塩基配列が付加されていないＲＮＡ転写物を製造することが可能なものであり、従来のように制限酵素を用いる場合に比べて簡便な操作でＲＮＡ転写物の製造を行うことができるほか、試験管内のみでなく、生体内においても該組み換えベクターを保持増殖せしめながら、ＲＮＡ転写物の産生を図ることができる。特に、3'末端にターミネーターを付加することにより、本発明のベクターは、それらを含まないリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を含むベクターに比して転写効率が飛躍的に高めることが可能になる。
【００６７】また、本発明のリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を複数個連結させたものを含むベクターは、5'末端及び3'末端側において余分な塩基配列が付加されていない複数種のＲＮＡ転写物を一度に製造することが可能なものであり、また、同一のＲＮＡ転写物の生産性を向上させることが可能となる。この場合も、試験管内のみでなく、生体内においても該組み換えベクターを保持増殖せしめながら、ＲＮＡ転写物の産生を図ることができる。
【００６８】これらのことは、例えば、余分な塩基配列を付加されていないリボザイムＲＮＡあるいはアンチセンスＲＮＡを生体内で一度に多種製造することが可能であることを意味し、特にこれらを塩基配列が変化しやすい、例えば前述のHIV-1に効果的に作用させることが可能となる。さらに、一度に多種のＲＮＡに、リボザイムＲＮＡあるいはアンチセンスＲＮＡを作用させることも可能となる。
【００６９】本発明のベクターは、医薬、動物薬、農薬或いは試薬等、又はそれらの製造に有効に利用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ハセロフ（J.Haseloff）等が示した短鎖人工リボザイムの構造を示す図である。
【図２】 従来の転写手段であるラン・オフ法を示す模式図である。
【図３】 組み換えプラスミドpGENE 8459v3の構造を示す図である。
【図４】 SFL1用リボザイムの塩基配列とその5'端および3'端におけるステム構造、さらにSFL1ｍＲＮＡとの複合体を示す図である。
【図５】 組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatの構造を示す図である。
【図６】 組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatの構造を示す図である。
【図７】 組み換えプラスミドpV3TA-LTRの構造を示す図である。
【図８】 組み換えプラスミドpV3TA-tatの構造を示す図である。
【図９】 組み換えプラスミドpV3TA-LTR、pV3TA-tatの構築に用いた合成リンカ−の塩基配列を示す図である。
【図10】 組み換えプラスミドpV3TA-LTR-tatの構築に用いたＰＣＲ反応用の合成オリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列を示す。
【図11】 組み換えプラスミドpV3TA-tat-term１の構造を示す図である。
【図12】 組み換えプラスミドpV3TA-tat-term２の構造を示す図である。
【図13】 pV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型プラスミドの概念図である。
【図14】 環状および線状のpGENE 8459v3を鋳型として転写して得られた各種転写産物の電気泳動図である。
【図15】 pV3TA-LTR-tatを鋳型として転写して得られた各種転写産物の電気泳動図である。
【図16】 LTR用及びtat用リボザイムの塩基配列とそのｔＲＮＡ構造およびポリＡテイル構造を示す図である。
【図17】 pV3TA-tat, pV3TA-tat-term１及び pV3TA-tat-term２を鋳型として転写して得られたそれぞれの転写産物の電気泳動図である。
【図18】 pV3TA-tat, pV3TA-tat-term１及び pV3TA-tat-term２を鋳型として転写して得られた転写産物-tatリボザイムＲＮＡの、pV3TA-tat で転写された生産物を１とした場合の転写効率の反応時間に対する変化を示した図である。
【図19】 pV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型プラスミドをそれぞれ等量鋳型に用い、転写反応させたものの電気泳動図である。
【図20】 pV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型プラスミドをそれぞれ鋳型として転写して得られた転写産物-tatリボザイムＲＮＡの、pV3TA-tat で転写された生産物を１とした場合の転写効率の反応時間に対する変化を示した図である。
【図21】 SFL1用リボザイムによるSFL1-ｍＲＮＡの切断を示す電気泳動図である。
【図22】 LTR用リボザイム及びtat用リボザイムによるLTRＲＮＡおよびtatＲＮＡの切断を示す電気泳動図である。
【図23】 プラスミドpV3TA-(tat)n(n-1〜5,10) 型を鋳型として用いたin vitro転写切断反応の結果物の電気泳動図である。
【図24】 切断効率を連結するリボザイムの単位数との関連において検討を行った図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ＤＮＡ配列の5'末端と3'末端とに各々、セルフプロセッシングにより当該5'末端と3'末端を各々切断するリボザイムを有するＲＮＡを１単位として、当該ＲＮＡ単位を１個又は２個以上連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項２】 請求項１に記載したＲＮＡ単位を、１乃至10単位連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項３】 請求項１に記載したＲＮＡ単位をｎ個（ｎは１以上の整数）連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクターにおいて、5'末端側から１番目の上記ＲＮＡ単位の5'末端の近傍にプロモーターが付加されており、かつ当該プロモーターに対応するターミネーターが、5'末端側からｎ番目の上記ＲＮＡ単位の3'末端の近傍に付加されていることを特徴とする、ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項４】 請求項１乃至請求項３に記載されたベクターを鋳型として、当該ベクターＤＮＡをＲＮＡに転写することを特徴とする、5'末端側と3'末端側がセルフプロセッシングされたＲＮＡ転写物の製造方法。
【請求項５】 請求項１乃至請求項３に記載されたベクターにより形質転換された、微生物、又は動物細胞若しくは植物細胞。
【請求項１】 ＤＮＡ配列の5'末端と3'末端とに各々、セルフプロセッシングにより当該5'末端と3'末端を各々切断するリボザイムを有するＲＮＡを１単位として、当該ＲＮＡ単位を１個又は２個以上連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項２】 請求項１に記載したＲＮＡ単位を、１乃至10単位連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項３】 請求項１に記載したＲＮＡ単位をｎ個（ｎは１以上の整数）連結したＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクターにおいて、5'末端側から１番目の上記ＲＮＡ単位の5'末端の近傍にプロモーターが付加されており、かつ当該プロモーターに対応するターミネーターが、5'末端側からｎ番目の上記ＲＮＡ単位の3'末端の近傍に付加されていることを特徴とする、ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項４】 請求項１乃至請求項３に記載されたベクターを鋳型として、当該ベクターＤＮＡをＲＮＡに転写することを特徴とする、5'末端側と3'末端側がセルフプロセッシングされたＲＮＡ転写物の製造方法。
【請求項５】 請求項１乃至請求項３に記載されたベクターにより形質転換された、微生物、又は動物細胞若しくは植物細胞。
【図１】
【図２】
【図１０】
【図３】
【図４】
【図１４】
【図１７】
【図１８】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図２１】
【図２４】
【図１６】
【図１９】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図１０】
【図３】
【図４】
【図１４】
【図１７】
【図１８】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図２１】
【図２４】
【図１６】
【図１９】
【図２２】
【図２３】
【公開番号】特開平６−１２５７７８
【公開日】平成６年（１９９４）５月１０日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平５−１０７０９７
【出願日】平成５年（１９９３）５月７日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １９９３年４月１日 財団法人バイオインダストリー協会発行の「バイオサイエンスとインダストリーＶｏｌ．５１ Ｎｏ．４」に発表
【出願人】（０００００１１４４）工業技術院長 (75)
【上記１名の復代理人】
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔 （外３名）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【出願人】（０００００４４５５）日立化成工業株式会社 (4,649)
【上記２名の代理人】
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔 （外２名）
【公開日】平成６年（１９９４）５月１０日
【国際特許分類】
【出願日】平成５年（１９９３）５月７日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １９９３年４月１日 財団法人バイオインダストリー協会発行の「バイオサイエンスとインダストリーＶｏｌ．５１ Ｎｏ．４」に発表
【出願人】（０００００１１４４）工業技術院長 (75)
【上記１名の復代理人】
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔 （外３名）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【出願人】（０００００４４５５）日立化成工業株式会社 (4,649)
【上記２名の代理人】
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔 （外２名）
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