リン酸アルミニウムおよび３Ｄ−ＭＰＬを含むアジュバント組成物
（ｉ）抗原；（ｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含む免疫原性組成物。成分（ｉｉ）および（ｉｉｉ）はまた、別個のアジュバント系として用いられ得る。これら組成物の種々の特徴が開示され、少なくとも５０％の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントは、リン酸アジュバントに吸着される。このアジュバント混合物は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原にともなって特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用されるすべての書類は、それらの全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ワクチンアジュバントの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
一般に「ミョウバン（ａｌｕｍ）」としばしば称されるアルミニウム塩は、古典的なワクチンアジュバントである。種々のさらなるアジュバントが記載され、そして詳細は、参考文献１および２のようなテキストに見出され得る。これらのアジュバントの１つは、３’脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（または「３Ｄ−ＭＰＬ」）である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
参考文献３〜１０は、「ＡＳ０４」と称されるアジュバント系を用いる非反応体肝炎患者における成功を報告し、３Ｄ−ＭＰＬおよびミョウバンの両方を含むといわれている（１１〜１４）。このアジュバント系に対する改変および改良を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントおよび３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを含む。この二重のアジュバントの組み合わせは、参考文献１２〜１４に一般的な意味で既に記載されているが、本発明は、この組成物の多くの改変を開示している：
（ａ）この組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間の浸透圧重量モル濃度を有する。
（ｂ）この組成物は、５〜７．５の間のｐＨを有する。
（ｃ）この組成物は、緩衝化されている。
（ｄ）このワクチン中の３Ｄ−ＭＰＬの少なくとも５０％は、リン酸アルミニウムに吸着されている。
（ｅ）このワクチン中の３Ｄ−ＭＰＬは、１５０ｎｍより小さい直径をもつミセル構造の形態をとる。
（ｆ）このワクチン中の３Ｄ−ＭＰＬは、好ましくは少なくとも１０％の６−アシル−鎖形態を含む、異なるアシル化形態の混合物である。
（ｇ）この組成物は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；ソルビトール；トリエタノールアミン；トリエチルアンモニウムイオン；ラクトース；シュークロース；トレハロース；マンニトールの１つ以上を含み得る。
【０００６】
これらの改変は、独立して、または組み合わせて用いられ得る。
【０００７】
それ故、本発明は：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、この組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間の浸透圧重量モル濃度を有することが特徴である。
【０００８】
本発明はまた：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、この組成物は、５〜７．５のｐＨを有することが特徴である。
【０００９】
本発明はまた：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、この組成物は、例えば、５〜７．５のｐＨに緩衝化されていることが特徴である。
【００１０】
本発明はまた：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、すくなとも５０％の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡがリン酸アルミニウムに吸着されていることが特徴である。
【００１１】
本発明はまた：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、この組成物は、５０μｇ／ｍｌより少ない非吸着３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡを有することが特徴である。
【００１２】
本発明はまた：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントが、１５０ｎｍより小さい直径を有する粒子の形態であることが特徴である。
【００１３】
本発明はまた：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）アシル化二糖類の混合物を含む３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、ここで、各二糖類は：（ａ）２つのβ−１’，６−連結２−デオキシ−２−アミノグルコース単糖ユニットを有し；（ｂ）４’位置でリン酸化され；（ｃ）１、３および６’位置で置換されておらず、（ｄ）３’位置でＯ−アシル化され、そして（ｅ）２および２’位置でＮ−アシル化され、そしてここで、アシル化二糖類の混合物が、少なくとも１０重量％の、２、２’および３’位置のアシル基の各々がそれ自体が脂肪族炭素原子においてＯ−アシル基で置換される成分を含む。
【００１４】
本発明はまた：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバント；およびソルビトール；トリエタノールアミン；トリエチルアンモニウムイオン；ラクトース；シュークロース；トレハロース；およびマンニトールからなる群から選択される少なくとも１つの物質を含むアジュバント組成物を提供する。
【００１５】
これらの種々の特徴は、組み合わせて用いられ得る。それ故、本発明は；（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、この組成物は、以下の性質の１つ以上を有することで特徴付けられる：
（１）２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間の浸透圧重量モル濃度；
（２）５〜７．５のｐＨ；
（３）それは、緩衝液を含む；
（４）少なくとも５０％の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが上記リン酸アルミニウムに吸収されている；
（５）それは、５０μg/ｍｌより少ない非吸着３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡを有する；
（６）上記３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントは、１５０ｎｍより小さい直径を有する粒子の形態である；
（７）上記３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントは、アシル化二糖類の混合物を含み、ここで各二糖類は：（ａ）２つのβ−１’，６−連結２−デオキシ−２−アミノグルコース単糖サブユニットを有し；（ｂ）４’位置でリン酸化され；（ｃ）１、３および６’位置で置換されておらず、（ｄ）３’位置でＯ−アシル化され、そして（ｅ）２および２’位置でＮ−アシル化され、そしてここで、アシル化二糖類の混合物が、少なくとも１０重量％の、２、２’および３’位置のアシル基の各々がそれ自体が脂肪族炭素原子においてＯ−アシル基で置換される成分を含む；そして／または
（８）それは、ソルビトール；トリエタノールアミン；トリエチルアンモニウムイオン；ラクトース；シュークロース；トレハロース；およびマンニトールからなる群から選択される少なくとも１つの物質を含む。
【００１６】
本発明はまた、本発明のアジュバント組成物を含む免疫原性組成物を提供し、そして（ｉｉｉ）抗原をさらに含む。
【００１７】
（リン酸アルミニウムアジュバント）
本発明の組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントおよび３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを含む。用語「リン酸アルミニウム」は、当該技術分野で一般的であるが、存在している実際の化学的化合物の正確な描写ではない［例えば、参考文献２の第９章を参照のこと］。本発明は、アジュバントとして一般的に用いられる任意の「リン酸アルミニウム」を用い得、これらは、代表的には、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、しばしば、少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム）をまた含む。それらは沈殿によって得られ得、そして沈殿の間の反応条件および濃度は、この塩中のヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に影響する。ヒドロキシアパタイトは、一般に、０．３〜１．２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシアパタイトは、厳密なＡｌＰＯ４からヒドロキシル基の存在によって区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲバンド（例えば、２００℃に加熱したとき）は、構造的ヒドロキシルの存在を示す［参考文献２の第９章］。
【００１８】
このアルミニウム塩は、任意の適切な物理的形態をとり得るが、代表的にはアモルファスである。リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般に０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、そしてより好ましくは０．９５±０．１である。このリン酸アルミニウムは、一般に、特にヒドロキシリン酸塩についてはアモルファスである。代表的なアジュバントは、０．６ｍｇＡｌ３＋／ｍｌで含められる、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａｌ３＋モル比のアモモファスヒドロキシリン酸アルミニウムである。このリン酸アルミニウムは、一般に、粒子状である。この粒子の代表的な直径は、任意の抗原および／または３Ｄ−ＭＰＬ吸着の後、０．５〜２０μｍの範囲（例えば、約５〜１０μｍ）てある。リン酸アルミニウムのＰＺＣは、ビトロキシルに対するリン酸の置換の程度に逆に相関し、そしてこの置換の程度は、沈殿によって塩を調製するために用いられる反応条件および反応体の濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離のリン酸イオンの濃度を変化することによるか（より多くのリン酸＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝液（ＰＺＣをより塩基性にする）。本発明に従って用いられるリン酸アルミニウムは、一般に、４．０〜７．０の間、より好ましくは５．０〜６．５の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。
【００１９】
このリン酸アルミニウムは、好ましくは、３Ｄ−ＭＰＬ（そして、必要に応じて抗原）が添加される水溶液の形態で用いられる（ＮＢ：水性リン酸アルミニウムを「溶液」と称することが標準的であるが、厳密な物理化学的観点から、この塩は不溶性であり、そして懸濁物を形成する）。このリン酸アルミニウムを必要な濃度まで希釈し、そして３Ｄ−ＭＰＬおよび／または抗原の添加の前に均一な溶液を確実にすることが好ましい。
【００２０】
３Ｄ−ＭＰＬおよび／または抗原の添加の前のＡｌ３＋の濃度は、一般に０と１０ｍｇ／ｍｌの間である。好ましい濃度は０．５と３ｍｇ／ｍｌの間である。
【００２１】
本発明の組成物を調製するために用いられるリン酸アルミニウムは、緩衝液を含み得るが（例えば、リン酸またはヒスチジンまたはＴｒｉｓ緩衝液）、常に必要なわけではない。このリン酸アルミニウム溶液は、好ましくは、滅菌され、そして発熱物質を含まない。このリン酸アルミニウムは、例えば、１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、そしてより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離の水性リン酸イオンを含み得る。このリン酸アルミニウムはまた、塩化ナトリウムを含み得る。塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲であり（例えば、０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、２〜１０ｍｇ／ｍｌ）、そしてより好ましくは約３±１ｍｇ／ｍｌである。ＮａＣｌの存在は、その他の成分の吸着前のｐＨの正確な測定を容易にし、そしてまた浸透圧重量モル濃度に影響する。
【００２２】
（３Ｄ−ＭＰＬアジュバント）
本発明の組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントおよび３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを含む。３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）はまた、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル−４’−ホスホリルリピドＡと称される。この名前は、モノホスホリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの位置３が脱アシル化されることを示す。それは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトースのない改変体から調製され、そして化学的にリピドＡに類似しているが、酸で壊れ易いホスホリル基および塩基で壊れ易いアシル基を欠いている。それは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、そしてＩＬ−１、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含むいくつかのサイトカインの放出を刺激する。３Ｄ−ＭＰＬの調製は、元は参考文献１５に記載され、そしてその産物は、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって、商標名ＭＰＬＴＭの下で製造および販売されている。さらなる詳細は参考文献１６〜１９に見出され得る。
【００２３】
代表的な組成物は、３Ｄ−ＭＰＬを、２５μｇ／ｍｌと２００μｇ／ｍｌとの間の濃度、例えば、５０〜１５０μｇ／ｍｌ、７５〜１２５μｇ／ｍｌ、９０〜１１０μｇ／ｍｌの範囲で、または約１００μｇ／ｍｌで含む。用量あたり２５〜７５μｇ／ｍｌの３Ｄ−ＭＰＬ、例えば、用量あたり、４５〜５５μｇの間、または約５０μｇの３Ｄ−ＭＰＬを投与することが通常である。
【００２４】
遊離には、この３Ｄ−ＭＰＬはリン酸アルミニウム上に吸収される。好ましくは、少なくとも５０（重量）％、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上またはそれより多くの３Ｄ−ＭＰＬが吸着される。吸着される％は、抗原に対するのと同じ方法で測定され得る。１００μｇ／ｍｌの総３Ｄ−ＭＰＬ濃度を有する組成物では、そのときは、非吸着３Ｄ−ＭＰＬの濃度は、５０μｇ／ｍｌ以下、例えば、４０μｇ／ｍｌ以下、３５μｇ／ｍｌ以下、３０μｇ／ｍｌ以下、２５μｇ／ｍｌ以下、２０μｇ／ｍｌ以下、１５μｇ／ｍｌ以下、１０μｇ／ｍｌ以下、５μｇ／ｍｌ以下、２μｇ／ｍｌ以下、１μｇ／ｍｌ以下などであるべきである。
【００２５】
３Ｄ−ＭＰＬは、それらのアシル化によって変動する（例えば、異なる長さであり得る３、４、５または６のアシル鎖を有する）関連分子の混合物の形態をとり得る。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしてもまた知られる）単糖は、２−位置炭素（すなわち、２および２’位置）でＮ−アシル化されており、そしてまた３’位置でＯ−アシル化されている。炭素２に結合する基は、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に結合する基は、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に結合する基は、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は以下の通りである：
【００２６】
【化１】
基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立して−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましく８〜１６の間であり、より好ましくは９〜１２の間であり、そして最も好ましくは１０である。
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は各々独立して：（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４であり得、ここでＲ４は−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずれかであり、ここでｍの値は好ましくは８〜１６の間であり、そしてより好ましくは１０、１２または１４である。２の位置ではｍは好ましくは１４である。２’位置ではｍは好ましくは１０である。３’位置ではｍは好ましくは１２である。基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’はそれ故好ましくはドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸から選択される−Ｏ−アシル基である。
【００２７】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のすべてが−Ｈであるとき、上記３Ｄ−ＭＰＬは３つのアシル鎖を有する（位置２、２’および３’の各々に１つ）。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’の２つのみが−Ｈであるとき、上記３Ｄ−ＭＰＬは４つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’の１つのみが−Ｈであるとき、上記３Ｄ−ＭＰＬは５つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のいずれもが−Ｈでないとき、上記３Ｄ−ＭＰＬは、６つのアシル基を有し得る。本発明に従って用いられる３Ｄ−ＭＰＬは、３〜６のアシル鎖を備えたこれらの形態の混合物であり得るが、この混合物中に６つのアシル鎖をもつ３Ｄ−ＭＰＬを含むことが好ましく、そして特に６つのアシル鎖形態が総３Ｄ−ＭＰＬの少なくとも１０重量％、例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上またはより多くを占めることが好ましい。６つのアシル鎖を備えた３Ｄ−ＭＰＬはが最もアジュバント活性な形態であることが見出された。
【００２８】
その故、本発明の組成物に含めるために３Ｄ−ＭＰＬの最も好ましい形態は：
【００２９】
【化２】
である。
【００３０】
３Ｄ−ＭＰＬが混合物の形態で用いられるとき、本発明の組成物中の３Ｄ−ＭＰＬの量または濃度への参照は、この混合物中の合わせた３Ｄ−ＭＰＬ種をいう。
【００３１】
水性条件では、３Ｄ−ＭＰＬは、異なるサイズを備えた、例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを備えたミセル凝集体または粒子を形成し得る。これらのいずれか、または両方が本発明とともに用いられ得、そしてより良好な粒子が慣用のアッセイによって選択され得る。より小さな粒子（例えば、３Ｄ−ＭＰＬの透明な懸濁物を与えるに十分小さい）が、それらの優れた活性［２０］のために、本発明に従う使用に好ましい。好ましい粒子は、１５０ｎｍより小さい、より好ましくは１２０ｎｍより小さい平均直径を有し、そして１００ｎｍより小さい平均直径を有しさえし得る。大部分の事例では、しかし、この平均直径は５０ｎｍより小さくはない。
【００３２】
３Ｄ−ＭＰＬがリン酸アルミニウムに吸着されるとき、３Ｄ−ＭＰＬ粒子サイズを直接測定することは可能でないかも知れないが、粒子サイズは、吸着が起こる前に測定され得る。
【００３３】
粒子直径は、動的光散乱の慣用の技法によって評価され得、これは、平均粒子直径を示す。粒子がｘｎｍの直径を有するといわれる場合、ほぼこの平均の粒子の分布を有するが、数の少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、またはそれより多く）の粒子が範囲ｘ±２５％内の直径を有する。
【００３４】
（最適抗原）
本発明のアジュバントシステムは、好ましくは、抗原の投与から得られる免疫応答を増大するために抗原と組み合わせて用いられる。
【００３５】
本発明のアジュバントシステムとの使用のための好ましい抗原は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）からのようなウイルス抗原である。このアジュバントシステムはまた、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍからのような寄生虫抗原との使用に適切である。
【００３６】
５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの間の抗原濃度、代表的には、例えば、１０〜３０μｇ／ｍｌ、１５〜２５μｇ／ｍｌ、または約２０μｇ／ｍｌが代表的である。５μｇ／用量〜５０μｇ／用量の間の用量あたりの抗原量がまた代表的であり、例えば、１０〜３０μｇ／用量の間、１５〜２５μｇ／用量の間、または約２０μｇ／用量である。
【００３７】
この抗原は、好ましくは、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着される。吸着される組成物中の特定の抗原の％は、好ましくは、少なくとも５０％（重量）、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上またはより高く、例えば、１００％までである。吸着される組成物中の抗原の％は、簡便には、例えば、遠心分離によって、非吸着物質から吸着された物質を分離することによって測定され得、ここではアルミニウム吸着抗原は容易にペレットを形成し、その一方、非吸着抗原は、上清液中に残る。上清液中の抗原の量（例えば、ＥＬＩＳＡによって測定される）が、組成物中の抗原の総量から引かれ得、そして次に吸着された％が算出され得る。抗原が完全に吸着されること、すなわち、上清液に検出可能なものはないことが好ましい。
【００３８】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ウイルス肝炎を引き起こす公知の作用因子の１つである。ＨＢＶビリオンは、外側タンパク質コートまたはキャプシッドによって取り囲まれた内側コアからなり、そしてこのウイルスコアは、ウイルスＤＮＡゲノムを含む。キャプシッドの主要成分は、ＨＢＶ表面抗原、またはより一般的には「ＨＢｓＡｇ」として知られるタンパク質であり、これは、約２４ｋＤａの分子量をもつ２２６アミノ酸のポリペプチドである。すべての現存するＢ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇを含み、そして、この抗原が通常のワクチン接種を受けるヒトに投与されるとき、それは、ＨＢＶ感染に対して保護する抗ＨＢｓＡｇ抗体の産生を刺激する。それ故、好ましいＨＢＶ抗原は、ＨＢｓＡｇである。ＨＢｓＡｇは、参考文献２１に記載される方法を用いてリン酸アルミニウム上に吸収され得る。リン酸アルミニウムへの吸着は、周知のＥＮＧＥＲＩＸ−ＢＴＭ産物（ＨＢｓＡｇが水酸化アルミニウムに吸着される）とは対照的であるが、ＨＥＰＡＣＣＩＮＥＴＭおよびＲＥＣＯＭＢＩＶＡＸＴＭ産物におけるのと同じである。参考文献２２に陳述されているように、リン酸アルミニウムは、水酸化アルミニウムよりＨＢｓＡｇに対するより良好なアジュバントであり得る。
【００３９】
ワクチン製造のために、ＨＢｓＡｇは、２つの様式で作製され得る。最初の方法は、慢性Ｂ型肝炎キャリヤーの血漿から粒子中の抗原を精製することを含む。なぜなら、大量のＨＢｓＡｇが肝臓中で合成され、そしてＨＢＶ感染の間に血流中に放出されるからである。第２の方法は、組換えＤＮＡ方法によってタンパク質を発現することを含む。本発明との使用のためのＨＢｓＡｇは、いずれかの方法によって調製され得るが、組換えによって発現されたＨＢｓＡｇを用いることが好ましい。特に、このＨＢｓＡｇが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母における発現によって調製されることが好ましい。ネイティブなＨＢｓＡｇ（すなわち、血漿精製産物におけるような）とは異なり、酵母で発現されたＨＢｓＡｇは、一般にグリコシル化されておらず、そしてこれは、本発明との使用のためのＨＢｓＡｇの最も好ましい形態である。なぜなら、それは、高度に免疫原性であり、そして血液産物汚染のリスクなくして調製され得るからである。この酵母発現されたＨＢｓＡｇは、有利には、ホスホリピドを含む脂質マトリックスを含む、実質的に球形の粒子（約２０ｎｍの平均直径）の形態である。
【００４０】
精製の後、ＨＢｓＡｇは、（例えば、システインとともに）透析に供され得、これは、ＨＢｓＡｇ調製の間で用いられ得るチメロサール［２３］のような任意の水銀を含んだ保存剤を除去するために用いられ得る。
【００４１】
「Ｓ」配列に加え、表面抗原は、プレ−Ｓ１および／またはプレ−Ｓ２配列のすべてまたは一部のような、プレ−Ｓ配列のすべてまたは一部を含み得る。
【００４２】
本発明との使用のための好ましいＨＰＶ抗原は、Ｌ１キャプシッドタンパク質であり、これは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として公知の構造物を形成するようにアセンブルし得る。このＶＬＰは、酵母細胞中（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中）または昆虫細胞中（例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのようなＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ細胞中、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞中）のＬ１の組換え発現によって産生され得る。酵母細胞には、プラスミドベクターがＬ１遺伝子（単数または複数）を保持し得；昆虫細胞には、バキュロウイルスベクターがＬ１遺伝子（単数または複数）を保持し得る。より好ましくは、上記組成物は、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８株両方からのＬ１ ＶＬＳを含む。この二価の組み合わせは、高度に有効であることが示されている［２４］。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８株に加え、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１からのＬ１ ＶＬＰを含むこともまた可能である。発癌ＨＰＶ株の使用もまた可能である。ワクチンは、ＨＰＶ株あたりＬ１の２０〜６０μｇ／ｍｌ（例えば、約４０μｇ／ｍｌ）を含み得る。
【００４３】
本発明との使用のために好ましいＨＳＶ抗原は、膜糖タンパク質ｇＤである。ＨＳＶ−２株からのｇＤ（「ｇＤ２」抗原）を用いることが好ましい。上記組成物は、Ｃ末端膜アンカー領域が欠失したｇＤ［２５］の形態を用い得、例えば、先欠けｇＤは、Ｃ末端にアスパラギン酸とグルタミンとが付加された天然タンパク質のアミノ酸１〜３０６を含む。このタンパク質のこの形態は、切断されて成熟２８３アミノ酸タンパク質を生じるシグナルペプチドを含む。アンカーの欠失は、このタンパク質が可溶性形態で調製されるることを可能にする。
【００４４】
本発明との使用のために好ましいＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ抗原は、スポロゾイド周囲タンパク質（ＣＳ）に基づく。これは、「ＲＴＳ，Ｓ」または「ＴＲＡＰ」として知られる、このＣＳタンパク質の一部をＨＢｓＡｇと融合する組換えタンパク質の形態をとり得る。ＲＴＳは、ＨＢＶ表面抗原のプレＳ２タンパク質の４つのアミノ酸を経由してＨＢｓＡｇに連結されるＣＳの実質的にすべてのＣ末端部分を含むハイブリッドタンパク質である［２６］。酵母中（特に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中）で発現されるとき、ＲＴＳは、リポタンパク質粒子（特にホスホリピドを含む）として産生され、そしてそれがＨＢＶからのＳ抗原とともに同時発現されるとき、それは、ＲＴＳ，Ｓとして知られる混合粒子を産生する。約１：４のＲＴＳ：Ｓ比が有用である。ＴＲＡＰ抗原は、参考文献２７に記載されている。
【００４５】
（薬学的組成物）
アジュバントおよび抗原成分に加え、本発明の組成物はさらなる成分を含み得る。これらの成分は、種々の供給源を有し得る。例えば、それらは、製造の間に用いられる抗原またはアジュバント成分の１つ中に存在し得るか、または上記抗原成分とは別個に添加され得る。
【００４６】
本発明の好ましい組成物は、１つ以上の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含む。
【００４７】
浸透圧を制御するために、ミネラル塩、例えば、ナトリウム塩のような生理学的塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。これは、アジュバントの混合の間、および抗原とアジュバント（単数または複数）の混合の間に存在し得る。
【００４８】
組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、好ましくは、２４０ｍＯｓｍ／ｋｇと３６０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、そしてより好ましくは、２９０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に入る浸透圧重量モル濃度を有する。浸透圧重量モル濃度は、先に、ワクチン接種によって引き起こされる痛みに対し衝撃を有することはないことが報告されている［２８］が、それにもかかわらず、浸透圧重量モル濃度をこの範囲に保つことが好ましい。
【００４９】
本発明の組成物は、１つ以上の緩衝液を含み得る。代表的な緩衝液は：リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝液を含む。緩衝液中および３Ｄ−ＭＰＬ中のリン酸基間の競争を避けるために、そのときは、リン酸緩衝液以外の緩衝液が好適であり得る。緩衝液は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲で含まれる。
【００５０】
本発明の組成物のｐＨは、一般に、最適安定性のために５．０〜７．５の間、そしてより代表的には５．０〜６．０の間、または６．０〜７．０の間である。
【００５１】
抗原の吸収される性質に起因して、最終のワクチン産物は、濁った外観をもつ懸濁液であり得る。この外観は、微生物汚染が容易に見えず、そしてそうなのでこのワクチンは、好ましは抗微生物薬剤を含むことを意味する。これは、このワクチンが複数用量コンテナにパッケージされるとき特に重要である。含めるための好ましい抗微生物剤は、２−フェノキシエタノールおよびチメロサールである。しかし、本発明のプロセスの間に水銀の保存剤（例えば、チメロサール）を用いないことが好ましい。しかし、本発明の組成物を調製するために用いられる前に、抗原が、このような保存剤で処理される場合、痕跡量の存在がは避けられないかも知れない。しかし、安全性のために、最終組成物が２５ｎｇ／ｍｌより少ない水銀を含むことが好ましい。より好ましくは、この最終ワクチン産物は、検出可能なチメロサールを含まない。これは、一般に、組成物を作製するために用いられる成分の調製の間にチメロサールの使用を避けることによって、本発明のプロセスにおいてその添加の前に抗原調製物から水銀保存剤を除去することにより避けられる。
【００５２】
製造の間に、所望の最終濃度を与えるための成分の希釈は、通常、ＷＦＩ（注射用の水）で実施され得る。
【００５３】
本発明の組成物中のリン酸アルミニウムの濃度は、Ａｌ３＋の項目で表され、好ましくは、５ｍｇ／ｍｌより少なく、例えば、４ｍｇ／ｍｌ以下、３ｍｇ／ｍｌ以下、２ｍｇ／ｍｌ以下、１ｍｇ／ｍｌ以下などである。
【００５４】
本発明の組成物中の３Ｄ−ＭＰＬの濃度は、好ましくは、２００μｇ／ｍｌより少なく、例えば、１５０μｇ／ｍｌ以下、１２５μｇ／ｍｌ以下、１１０μｇ／ｍｌ以下、１００μｇ／ｍｌ以下などである。
【００５５】
本発明の組成物中の個々の抗原の濃度は、好ましくは、６０μｇ／ｍｌより少なく、例えば、５５μｇ／ｍｌ以下、５０μｇ／ｍｌ以下、４５μｇ／ｍｌ以下、４０μｇ／ｍｌ以下などである。
【００５６】
本発明の組成物は、好ましは、患者に０．５ｍｌ用量で投与される。０．５ｍｌ用量への参照は、通常の変動、例えば、０．５ｍｌ±０．１ｍｌ、０．５ｍｌ±０．０５ｍｌなどを含むことが理解される。
【００５７】
好ましい組成物は、用量あたり、約５０μｇの３Ｄ−ＭＰＬおよび約０．５ｍｇのアルミニウムアジュバントを有する。
【００５８】
本発明は、患者への投与のために次いで分与され得る個々の用量へのパッケージングのために適切であるバルク材料を提供し得る。上記で述べた濃度は、最終のパッケージされた用量における代表的な濃度であり、そしてバルクワクチン中のそのような濃度はより高くても良い（例えば、希釈によって最終濃度まで減少され得る）。
【００５９】
本発明の組成物は、一般に、水溶液形態である。
【００６０】
本発明の組成物中に存在し得るさらなる成分は：３Ｄ−ＭＰＬ凝集を防ぐために用いられているかも知れない［２０］ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（「Ｔｗｅｅｎ８０」）；これもまた３Ｄ−ＭＰＬ凝集を防ぐために用いられているかも知れないソルビトール；３Ｄ−ＭＰＬを可溶化するために用いられいるかも知れないトリエタノールアミン；これもまた３Ｄ−ＭＰＬを可溶化するために用いられいるかも知れないトリエチルアンモニウムイオン；ラクトース；シュークロース；トレハロース；および／またはマンニトールを含む。
【００６１】
（本発明のプロセス）
本発明は、本発明のアジュバント組成物を製造するためのプロセスを提供し、（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを組み合わせる工程を包含する。
【００６２】
本発明はまた、本発明の組成物を製造するプロセスを提供し、（ｉ）抗原；（ｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを組み合わせる工程を包含する。これら成分（ｉ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、任意の順序で組み合わせられ得るが、好ましは、抗原とリン酸アルミニウムが最初に混合され、そして次に３Ｄ−ＭＰＬがこの抗原／リン酸アルミニウム混合物に添加される。代替として、３Ｄ−ＭＰＬとリン酸アルミニウムが最初に混合され、そして次に抗原がこのアジュバント混合物に添加される。
【００６３】
本発明は、本発明の組成物を製造するためのプロセスを提供し；（ａ）組換え宿主中で抗原を発現する工程；（ｂ）この抗原を精製する工程；および（ｃ）この精製された抗原を、（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントと組み合わせる工程を包含する。この工程（ｃ）で組み合わせられる３つの成分は、上記に記載のように、任意の順序で組み合わせられ得る。好ましい組換え宿主は、上記のような酵母および昆虫細胞である。
【００６４】
本発明は、本発明の組成物を製造するためのプロセスを提供し、（ａ）抗原、リン酸アルミニウムアジュバントおよび３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを組み合わせる工程；（ｂ）この組成物の浸透圧を測定する工程；そしてこの浸透圧重量モル濃度が２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の外側である場合、（ｃ）この浸透圧重量モル濃度を２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に調整する工程を包含する。この調整は、ナトリウム塩、例えば、塩化ナトリウムのような生理学的塩の添加を含み得る。
【００６５】
本発明は、本発明の組成物を製造するためのプロセスを提供し、（ａ）抗原、リン酸アルミニウムアジュバントおよび３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを組み合わせる工程；（ｂ）この組成物のｐＨを測定する工程；そしてこのｐＨが５．０〜７．５の範囲の外側である場合、（ｃ）ｐＨを５．０〜７．５の範囲内に入るように調整する工程を包含する。この調整は、酸または塩基の添加を含み得る。
【００６６】
本発明は、本発明の組成物を製造するためのプロセスを提供し、（ｉ）抗原、（ｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバントおよび（ｉｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを組み合わせる工程を包含し、ここで、成分（ｉｉｉ）中の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡは、１５０ｎｍより小さい直径を有する粒子の形態にある。成分（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、任意の順序で混合され得る。成分（ｉｉｉ）は、さらに、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートおよび／またはソルビトールを含み得る。
【００６７】
上記抗原およびアジュバントを組み合わせた後、本発明のプロセスは、上記混合物の０．５ｍｌサンプルをコンテナ中に抽出し、そしてパッケージする工程を包含し得る。複数用量の状況のために、複数用量の量が、単一のコンテナに一緒に抽出され、そしてパッケージされる。
【００６８】
本発明のプロセスは、上記ワクチンの使用のためのコンテナ中にパッケージするさらなる工程を包含し得る。適切なコンテナは、バイアルおよび使い捨てシリンジ（好ましくは滅菌されたもの）を含む。
【００６９】
（本発明のパッケージング組成物）
本発明の組成物が、バイアルにパッケージされる場合、これらは、好ましくは、ガラスまたはプラスチック材料から作製される。このバイアルは、好ましくは、上記組成物がそれに添加される前に滅菌され得る。ラテックス感受性患者にともなう問題を避けるために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーでシールされる。このバイアルは、単回用量のワクチンを含み得るか、またはそれは、１つ以上の用量（「複数用量」バイアル）例えば、１０の用量を含み得る。複数用量バイアルを用いるとき、各用量は、厳密な無菌状態下で滅菌ニードルおよびシリンジで引き抜かれるべきであり、バイアル内容物を汚染することを避けるよう注意をする。好ましいバイアルは、色のないガラスから作製される。
【００７０】
上記組成物が、シリンジ中にパッケージされる場合、このシリンジは、通常、それに取り付けられたニードルを有さないが、別個のニードルがアセンブリおよび使用のためにシリンジととも提供され得る。安全ニードルが好ましい。１−インチ２３−ゲージ、１−インチ２５−ゲージおよび５／８−インチ２５−ゲージのニードルが代表的である。シリンジには、その上に内容物のロット番号および使用期限日時がプリントされ得る剥ぎ取りラベルが提供され得、記録維持を容易にする。このシリンジ中のプランジャーは、好ましくは、ストッパーを有し、プランジャーが吸引の間に偶発的に除去されることを防ぐ。これらのシリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単回用量のワクチンを含む。このシリンジは、一般に、先端部キャップを有し、この先端部をニードルの取り付けの前にシールし、そしてこの先端部キャップは、好ましくはブチルゴムから作製される。このシリンジとニードルとが別個にパッケージされる場合、そのときは、このニードルは、好ましくは、ブチルゴムシールドが取り付けられる。Ｇｒｅｙブチルゴムが好ましい。好ましいシリンジは、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭの下で販売されるものである。
【００７１】
医師または患者が予備充填されたシリンジを受けるように、シリンジ中へのパッケージングが好ましい。ガラスコンテナ（例えば、シリンジまたはバイアル）が用いられる場合、ソーダ石灰ガラスからのよりむしろホウケイ酸ガラスから作製されたコンテナを用いることが好ましい。
【００７２】
組成物がコンテナ中にパッケージされた後、このコンテナは、次いで、配給のための箱内、例えば、厚紙の箱の内側に囲われ得、そしてこの箱は、ワクチンの詳細、例えば、その商標名、ワクチン中の抗原のリスト（例えば、「Ｂ型肝炎組換え」など）、説明コンテナ（例えば、「使い捨て予備充填Ｔｉｐ−Ｌｏｋシリンジ」または「１０×０．５ｍｌ単回用量バイアル」）、その用量（例えば、「各々１回の０．５ｍｌ用量を含む」）、警告（例えば、「成人使用のみのため」）、使用期限日時、適応症などがラベルされる。各箱は、１つ以上のパッケージされたワクチン、例えば、５または１０のパッケージされたワクチン（特にバイアルについて）を含み得る。このワクチンがシリンジ中に含まれる場合、このパッケージは、シリンジの絵を示し得る。
【００７３】
ワクチンは、ワクチンの詳細、例えば、投与のための指示書、ワクチン内の抗原の詳細などを含む印刷物とともに一緒に（例えば、同じ箱中に）パッケージされ得る。これらの指示書はまた、警告、例えば、ワクチン接種の後のアナフィラキシー反応の事例で利用可能なアドレナリンの溶液を準備しておくことなどを含み得る。
【００７４】
このパッケージされたワクチン材料は、好ましくは、滅菌されている。
【００７５】
このパッケージされたワクチン材料は、好ましくは、発熱物質を含まず、例えば、用量あたり、＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準測定）、そして好ましは＜０．１ＥＵを含む。
【００７６】
このパッケージされたワクチン材料は、好ましくは、グルテンを含まない。
【００７７】
任意の水性のパッケージされたワクチン材料のｐＨは、５〜８の間、例えば、５．５〜６．５の間である。本発明のプロセスは、それ故、パッケージングの前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を包含し得る。
【００７８】
このパッケージされたワクチンは、好ましは、２℃と８℃との間で貯蔵される。それは、凍結されるべきではない。
【００７９】
（処置およびワクチンの投与の方法）
本発明の組成物は、ヒト患者への投与のために適切であり、そして本発明は、患者における免疫応答を高める方法を提供し、本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
【００８０】
本発明はまた、薬剤における使用のための本発明の組成物を提供する。
【００８１】
本発明はまた、患者への投与のための医薬の製造における、（ｉ）抗原；（ｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントの使用を提供する。
【００８２】
本発明の方法および使用は、ＨＢＶ感染；ＨＳＶ感染；ＨＳＶによって引き起こされる生殖器ヘルペス；ＨＰＶ感染；ＨＰＶによって引き起こされる生殖器疣贅；ＨＰＶによって引き起こされる頸部癌；および／またはマラリアに対して保護するため、および／または処置するために患者に投与された後に免疫応答を惹起するために特に適切である。
【００８３】
本発明の免疫原生組成物は、好ましくは、感染の保護および／または処置における使用のためのワクチンである。
【００８４】
十分な効き目を有するために、代表的な免疫化スケジュールは、１つ以上の用量を投与することを含み得る。例えば、用量は：０および６月（時間０が最初の用量である）；０、１、２および６月；０日、２１日そして次に６〜１２月の間の第３の用量；または０、１、２、６および１２月であり得る。本発明の組成物は、筋肉内注入により、例えば、腕または脚中に投与され得る。本発明の組成物は、アルミニウムを基礎にしたアジュバントを含むので、成分の沈降が貯蔵の間に生じ得る。この組成物は、それ故、患者への投与の前に振とうされるべきである。この振とうされた組成物は、濁った白色の懸濁物であり得る。
【００８５】
（さらなる抗原性成分）
ＨＢｓＡｇ、ＨＰＶ Ｌ１、ＨＳＶ ｇＤおよび／マラリア抗原を含むことと同様に、本発明の組成物は、１つ以上のさらなる抗原を含み得る。例えば、それらは、以下の１つ以上を含み得る：Ａ型肝炎ウイルス抗原；ジフテリアトキソイド；破傷風トキソイド；不活性化ポリオウイルス抗原；細胞百日咳抗原；無毒化百日咳トキシン、線維状血球凝集素、および、必要に応じて６９ｋＤａ抗原を含む、無細胞百日咳抗原；代表的には、キャリヤタンパク質として破傷風トキソイドとの複合体化Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプＢ皮膜糖類；複合体化血清群Ａ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ皮膜糖類；複合体化血清群Ｃ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ皮膜糖類；複合体化血清群Ｙ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ皮膜糖類；複合体化血清群Ｗ１３５ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ皮膜糖類；複合体化Ｓ．ｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ皮膜糖類。
【００８６】
（リン酸アルミニウムの代替物）
いくつかの適用には、リン酸アルミニウムアジュバントを水酸化アルミニウムアジュバントで置換すること、または水酸化アルミニウムとリン酸アジュバントを組み合わせることが有用であり得る。ＨＰＶおよびＨＳＶワクチンでは、例えば、水酸化アルミニウムは、リン酸アルミニウムより好ましくあり得る。従って、本発明の上記の定義は、補正され得る。
【００８７】
用語「水酸化アルミニウム」は、当該分野では一般的であるが、存在している実際の化学的化合物の正確な説明はない［例えば、参考文献２の第９章を参照のこと］。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される任意の「水酸化アルミニウム」アジュバントを用い得、これらは、代表的には、アルミニウムのオキシヒドロキシド塩であり、これらは、通常、少なくとも部分的に結晶である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表され得るオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光学によって、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のようなその他のアルミニウム化合物から、特に、１０７０ｃｍ−１における吸着バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１における強力なショルダーの存在によって区別され得る［参考文献２の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化の程度は、半分高さ（ＷＨＨ）における回折バンドの幅によって反映され、乏しい結晶の粒子は、より小さな結晶サイズに起因するより大きなライン広範化を示す。表面積は、ＷＨＨが増加するとき増加し、そしてより高いＷＨＨ値をもつアジュバントは、抗原吸収についてより大きな能力を有することが観察されている。線維状形態（例えば、透過型電子顕微鏡写真に見られるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントのついて代表的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは代表的には約１１であり、すなわち、このアジュバント自体は、生理学的ｐＨで正の表面荷電を有する。ｐＨ７．４でｍｇＡ＋＋＋あたり１．８〜２．６ｍｇタンパク質吸着能力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて方向されている。
【００８８】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えば、Ｘを含む組成物は、専らＸからなり得るか、またはさらなる何かを含有し得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。用語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくても良い。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【００８９】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００９０】
詳細に述べられていなければ、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、混合の任意の特定の順序を要求しない。それ故、成分は任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在するとき、そのときは、２つの成分が互いと組み合わされ得、そして次にこの組み合わせが、第３の成分と組み合わされ得るなどである。
【００９１】
イオン化可能基が、本明細書中の式で示される中性形態で存在し得るか、または例えば、ｐＨに依存して荷電された形態で存在し得ることが認識される。それ故、リン酸基は、−Ｐ−Ｏ−（ＯＨ）２として示され得、この式は、中性リン酸基の単なる代表であり、そしてその他の荷電形態が本発明によって包含される。同様に、糖のリングは、開いた形態および閉じた形態で存在し得、そして、閉じた形態は、本明細書中では構造式で示されているが、開いた形態もまた、本発明によって包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９２】
（発明を実施するための様式）
組換えＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現されたＨＢｓＡｇは、細胞回収、沈殿、限外濾過、ゲル透過、イオン交換、超遠心分離および脱塩を含むプロセスによって精製される。精製された抗原は、グリコシル化されておらず、そして実質的に球形の粒子の形態で観察され得る（平均直径約２０ｎｍ）。
【００９３】
抗原は、リン酸緩衝液溶液中に維持され、そして撹拌下、室温で１時間の間アモルファスリン酸アルミニウムアジュバントに吸着される（３〜６ｍｇ／ｍｌＡｌ＋＋＋）。
【００９４】
この混合物は室温で２週間の間貯蔵され、そして次に冷蔵庫で維持される。Ｃｏｒｉｘａからの３Ｄ−ＭＰＬアジュバントが次いで添加され、リン酸アルミニウムアジュバント上に吸着され、そして収入のための水および滅菌生理食塩水を用いて、所望の最終抗原濃度までの任意の必要な希釈が達成される。このバルクワクチンは、次いで、使い捨てシリンジ中の個々の用量にパッケージされる。
【００９５】
このようにして製造されたワクチンは、最初、健常青年および成人中で試験される。このワクチンは、すべての年齢グループの間でＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭ産物より強力な免疫応答（１００％までの血清保護率、より高いＧＭＴ値）を惹起する。
【００９６】
リン酸アルミニウム／３ｄＭＰＬアジュバント混合物で、このワクチンが２−用量のスケジュール（０および６月）として投与されるとき、９８．６％の血清保護率が観察され、これは、０、１および６月でＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭを用いて観察される９６．８％より良好である。ＧＭＴは、ほぼ７８００（ＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭの３７００に対して）である。初期試験の後、試験は、１５歳およびより年配である（平均年齢５８）、血液透析前患者および既に血液透析を受けている患者に移行する。これらの患者は、生まれつきＨＢＶである。このワクチンの単回用量（２０μｇのＨＢｓＡｇ）は、０、１、２および６月で投与された２倍用量のＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭと比較される。血清保護および抗ＨＢｓＡｇ ＧＴＭは以下のようである：
【００９７】
【表１】
それ故、これらのワクチンは、市場で主役のＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭワクチンより血液透析成人におけるより良好な免疫応答を一貫して惹起した。さらに、保護の発生は、より迅速であり（例えば、３月で血清保護された７５％の患者に対して、ＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭでは５２％、ｐ＜０．００５）そしてより長く持続する。
【００９８】
肝臓移植を待つ生まれつきＨＢＶである患者におけるさらなる試行は、類似の結果を示す。ワクチンは、０日および２１日で（ＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭについてはプララス７日の用量）、そして次に６〜１２月の間の最終用量投与される。
【００９９】
【表２】
血清保護率は、リン酸アルミニウム／３ｄＭＰＬを用いてより高い（６０％対３２％、ｐ＜０．０３５）。
【０１００】
満足できる安全性および反応発生能力がすべての患者で観察される。一時的な局所的不快さが本発明のワクチンでより高いが、これは、迅速に解決し、そして上記治療利益に比較されるとき、受容可能な副作用である。
【０１０１】
本発明が例示のみによって説明されており、そして本発明の範囲および思想内である改変がなされ得ることが理解される。
【０１０２】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用されるすべての書類は、それらの全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ワクチンアジュバントの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
一般に「ミョウバン（ａｌｕｍ）」としばしば称されるアルミニウム塩は、古典的なワクチンアジュバントである。種々のさらなるアジュバントが記載され、そして詳細は、参考文献１および２のようなテキストに見出され得る。これらのアジュバントの１つは、３’脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（または「３Ｄ−ＭＰＬ」）である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
参考文献３〜１０は、「ＡＳ０４」と称されるアジュバント系を用いる非反応体肝炎患者における成功を報告し、３Ｄ−ＭＰＬおよびミョウバンの両方を含むといわれている（１１〜１４）。このアジュバント系に対する改変および改良を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントおよび３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを含む。この二重のアジュバントの組み合わせは、参考文献１２〜１４に一般的な意味で既に記載されているが、本発明は、この組成物の多くの改変を開示している：
（ａ）この組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間の浸透圧重量モル濃度を有する。
（ｂ）この組成物は、５〜７．５の間のｐＨを有する。
（ｃ）この組成物は、緩衝化されている。
（ｄ）このワクチン中の３Ｄ−ＭＰＬの少なくとも５０％は、リン酸アルミニウムに吸着されている。
（ｅ）このワクチン中の３Ｄ−ＭＰＬは、１５０ｎｍより小さい直径をもつミセル構造の形態をとる。
（ｆ）このワクチン中の３Ｄ−ＭＰＬは、好ましくは少なくとも１０％の６−アシル−鎖形態を含む、異なるアシル化形態の混合物である。
（ｇ）この組成物は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；ソルビトール；トリエタノールアミン；トリエチルアンモニウムイオン；ラクトース；シュークロース；トレハロース；マンニトールの１つ以上を含み得る。
【０００６】
これらの改変は、独立して、または組み合わせて用いられ得る。
【０００７】
それ故、本発明は：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、この組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間の浸透圧重量モル濃度を有することが特徴である。
【０００８】
本発明はまた：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、この組成物は、５〜７．５のｐＨを有することが特徴である。
【０００９】
本発明はまた：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、この組成物は、例えば、５〜７．５のｐＨに緩衝化されていることが特徴である。
【００１０】
本発明はまた：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、すくなとも５０％の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡがリン酸アルミニウムに吸着されていることが特徴である。
【００１１】
本発明はまた：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、この組成物は、５０μｇ／ｍｌより少ない非吸着３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡを有することが特徴である。
【００１２】
本発明はまた：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントが、１５０ｎｍより小さい直径を有する粒子の形態であることが特徴である。
【００１３】
本発明はまた：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）アシル化二糖類の混合物を含む３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、ここで、各二糖類は：（ａ）２つのβ−１’，６−連結２−デオキシ−２−アミノグルコース単糖ユニットを有し；（ｂ）４’位置でリン酸化され；（ｃ）１、３および６’位置で置換されておらず、（ｄ）３’位置でＯ−アシル化され、そして（ｅ）２および２’位置でＮ−アシル化され、そしてここで、アシル化二糖類の混合物が、少なくとも１０重量％の、２、２’および３’位置のアシル基の各々がそれ自体が脂肪族炭素原子においてＯ−アシル基で置換される成分を含む。
【００１４】
本発明はまた：（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバント；およびソルビトール；トリエタノールアミン；トリエチルアンモニウムイオン；ラクトース；シュークロース；トレハロース；およびマンニトールからなる群から選択される少なくとも１つの物質を含むアジュバント組成物を提供する。
【００１５】
これらの種々の特徴は、組み合わせて用いられ得る。それ故、本発明は；（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物を提供し、この組成物は、以下の性質の１つ以上を有することで特徴付けられる：
（１）２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間の浸透圧重量モル濃度；
（２）５〜７．５のｐＨ；
（３）それは、緩衝液を含む；
（４）少なくとも５０％の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが上記リン酸アルミニウムに吸収されている；
（５）それは、５０μg/ｍｌより少ない非吸着３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡを有する；
（６）上記３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントは、１５０ｎｍより小さい直径を有する粒子の形態である；
（７）上記３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントは、アシル化二糖類の混合物を含み、ここで各二糖類は：（ａ）２つのβ−１’，６−連結２−デオキシ−２−アミノグルコース単糖サブユニットを有し；（ｂ）４’位置でリン酸化され；（ｃ）１、３および６’位置で置換されておらず、（ｄ）３’位置でＯ−アシル化され、そして（ｅ）２および２’位置でＮ−アシル化され、そしてここで、アシル化二糖類の混合物が、少なくとも１０重量％の、２、２’および３’位置のアシル基の各々がそれ自体が脂肪族炭素原子においてＯ−アシル基で置換される成分を含む；そして／または
（８）それは、ソルビトール；トリエタノールアミン；トリエチルアンモニウムイオン；ラクトース；シュークロース；トレハロース；およびマンニトールからなる群から選択される少なくとも１つの物質を含む。
【００１６】
本発明はまた、本発明のアジュバント組成物を含む免疫原性組成物を提供し、そして（ｉｉｉ）抗原をさらに含む。
【００１７】
（リン酸アルミニウムアジュバント）
本発明の組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントおよび３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを含む。用語「リン酸アルミニウム」は、当該技術分野で一般的であるが、存在している実際の化学的化合物の正確な描写ではない［例えば、参考文献２の第９章を参照のこと］。本発明は、アジュバントとして一般的に用いられる任意の「リン酸アルミニウム」を用い得、これらは、代表的には、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、しばしば、少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム）をまた含む。それらは沈殿によって得られ得、そして沈殿の間の反応条件および濃度は、この塩中のヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に影響する。ヒドロキシアパタイトは、一般に、０．３〜１．２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシアパタイトは、厳密なＡｌＰＯ４からヒドロキシル基の存在によって区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲバンド（例えば、２００℃に加熱したとき）は、構造的ヒドロキシルの存在を示す［参考文献２の第９章］。
【００１８】
このアルミニウム塩は、任意の適切な物理的形態をとり得るが、代表的にはアモルファスである。リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般に０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、そしてより好ましくは０．９５±０．１である。このリン酸アルミニウムは、一般に、特にヒドロキシリン酸塩についてはアモルファスである。代表的なアジュバントは、０．６ｍｇＡｌ３＋／ｍｌで含められる、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａｌ３＋モル比のアモモファスヒドロキシリン酸アルミニウムである。このリン酸アルミニウムは、一般に、粒子状である。この粒子の代表的な直径は、任意の抗原および／または３Ｄ−ＭＰＬ吸着の後、０．５〜２０μｍの範囲（例えば、約５〜１０μｍ）てある。リン酸アルミニウムのＰＺＣは、ビトロキシルに対するリン酸の置換の程度に逆に相関し、そしてこの置換の程度は、沈殿によって塩を調製するために用いられる反応条件および反応体の濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離のリン酸イオンの濃度を変化することによるか（より多くのリン酸＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝液（ＰＺＣをより塩基性にする）。本発明に従って用いられるリン酸アルミニウムは、一般に、４．０〜７．０の間、より好ましくは５．０〜６．５の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。
【００１９】
このリン酸アルミニウムは、好ましくは、３Ｄ−ＭＰＬ（そして、必要に応じて抗原）が添加される水溶液の形態で用いられる（ＮＢ：水性リン酸アルミニウムを「溶液」と称することが標準的であるが、厳密な物理化学的観点から、この塩は不溶性であり、そして懸濁物を形成する）。このリン酸アルミニウムを必要な濃度まで希釈し、そして３Ｄ−ＭＰＬおよび／または抗原の添加の前に均一な溶液を確実にすることが好ましい。
【００２０】
３Ｄ−ＭＰＬおよび／または抗原の添加の前のＡｌ３＋の濃度は、一般に０と１０ｍｇ／ｍｌの間である。好ましい濃度は０．５と３ｍｇ／ｍｌの間である。
【００２１】
本発明の組成物を調製するために用いられるリン酸アルミニウムは、緩衝液を含み得るが（例えば、リン酸またはヒスチジンまたはＴｒｉｓ緩衝液）、常に必要なわけではない。このリン酸アルミニウム溶液は、好ましくは、滅菌され、そして発熱物質を含まない。このリン酸アルミニウムは、例えば、１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、そしてより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離の水性リン酸イオンを含み得る。このリン酸アルミニウムはまた、塩化ナトリウムを含み得る。塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲であり（例えば、０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、２〜１０ｍｇ／ｍｌ）、そしてより好ましくは約３±１ｍｇ／ｍｌである。ＮａＣｌの存在は、その他の成分の吸着前のｐＨの正確な測定を容易にし、そしてまた浸透圧重量モル濃度に影響する。
【００２２】
（３Ｄ−ＭＰＬアジュバント）
本発明の組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントおよび３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを含む。３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）はまた、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル−４’−ホスホリルリピドＡと称される。この名前は、モノホスホリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの位置３が脱アシル化されることを示す。それは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトースのない改変体から調製され、そして化学的にリピドＡに類似しているが、酸で壊れ易いホスホリル基および塩基で壊れ易いアシル基を欠いている。それは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、そしてＩＬ−１、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含むいくつかのサイトカインの放出を刺激する。３Ｄ−ＭＰＬの調製は、元は参考文献１５に記載され、そしてその産物は、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって、商標名ＭＰＬＴＭの下で製造および販売されている。さらなる詳細は参考文献１６〜１９に見出され得る。
【００２３】
代表的な組成物は、３Ｄ−ＭＰＬを、２５μｇ／ｍｌと２００μｇ／ｍｌとの間の濃度、例えば、５０〜１５０μｇ／ｍｌ、７５〜１２５μｇ／ｍｌ、９０〜１１０μｇ／ｍｌの範囲で、または約１００μｇ／ｍｌで含む。用量あたり２５〜７５μｇ／ｍｌの３Ｄ−ＭＰＬ、例えば、用量あたり、４５〜５５μｇの間、または約５０μｇの３Ｄ−ＭＰＬを投与することが通常である。
【００２４】
遊離には、この３Ｄ−ＭＰＬはリン酸アルミニウム上に吸収される。好ましくは、少なくとも５０（重量）％、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上またはそれより多くの３Ｄ−ＭＰＬが吸着される。吸着される％は、抗原に対するのと同じ方法で測定され得る。１００μｇ／ｍｌの総３Ｄ−ＭＰＬ濃度を有する組成物では、そのときは、非吸着３Ｄ−ＭＰＬの濃度は、５０μｇ／ｍｌ以下、例えば、４０μｇ／ｍｌ以下、３５μｇ／ｍｌ以下、３０μｇ／ｍｌ以下、２５μｇ／ｍｌ以下、２０μｇ／ｍｌ以下、１５μｇ／ｍｌ以下、１０μｇ／ｍｌ以下、５μｇ／ｍｌ以下、２μｇ／ｍｌ以下、１μｇ／ｍｌ以下などであるべきである。
【００２５】
３Ｄ−ＭＰＬは、それらのアシル化によって変動する（例えば、異なる長さであり得る３、４、５または６のアシル鎖を有する）関連分子の混合物の形態をとり得る。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしてもまた知られる）単糖は、２−位置炭素（すなわち、２および２’位置）でＮ−アシル化されており、そしてまた３’位置でＯ−アシル化されている。炭素２に結合する基は、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に結合する基は、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に結合する基は、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は以下の通りである：
【００２６】
【化１】
基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立して−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましく８〜１６の間であり、より好ましくは９〜１２の間であり、そして最も好ましくは１０である。
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は各々独立して：（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４であり得、ここでＲ４は−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずれかであり、ここでｍの値は好ましくは８〜１６の間であり、そしてより好ましくは１０、１２または１４である。２の位置ではｍは好ましくは１４である。２’位置ではｍは好ましくは１０である。３’位置ではｍは好ましくは１２である。基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’はそれ故好ましくはドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸から選択される−Ｏ−アシル基である。
【００２７】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のすべてが−Ｈであるとき、上記３Ｄ−ＭＰＬは３つのアシル鎖を有する（位置２、２’および３’の各々に１つ）。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’の２つのみが−Ｈであるとき、上記３Ｄ−ＭＰＬは４つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’の１つのみが−Ｈであるとき、上記３Ｄ−ＭＰＬは５つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のいずれもが−Ｈでないとき、上記３Ｄ−ＭＰＬは、６つのアシル基を有し得る。本発明に従って用いられる３Ｄ−ＭＰＬは、３〜６のアシル鎖を備えたこれらの形態の混合物であり得るが、この混合物中に６つのアシル鎖をもつ３Ｄ−ＭＰＬを含むことが好ましく、そして特に６つのアシル鎖形態が総３Ｄ−ＭＰＬの少なくとも１０重量％、例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上またはより多くを占めることが好ましい。６つのアシル鎖を備えた３Ｄ−ＭＰＬはが最もアジュバント活性な形態であることが見出された。
【００２８】
その故、本発明の組成物に含めるために３Ｄ−ＭＰＬの最も好ましい形態は：
【００２９】
【化２】
である。
【００３０】
３Ｄ−ＭＰＬが混合物の形態で用いられるとき、本発明の組成物中の３Ｄ−ＭＰＬの量または濃度への参照は、この混合物中の合わせた３Ｄ−ＭＰＬ種をいう。
【００３１】
水性条件では、３Ｄ−ＭＰＬは、異なるサイズを備えた、例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを備えたミセル凝集体または粒子を形成し得る。これらのいずれか、または両方が本発明とともに用いられ得、そしてより良好な粒子が慣用のアッセイによって選択され得る。より小さな粒子（例えば、３Ｄ−ＭＰＬの透明な懸濁物を与えるに十分小さい）が、それらの優れた活性［２０］のために、本発明に従う使用に好ましい。好ましい粒子は、１５０ｎｍより小さい、より好ましくは１２０ｎｍより小さい平均直径を有し、そして１００ｎｍより小さい平均直径を有しさえし得る。大部分の事例では、しかし、この平均直径は５０ｎｍより小さくはない。
【００３２】
３Ｄ−ＭＰＬがリン酸アルミニウムに吸着されるとき、３Ｄ−ＭＰＬ粒子サイズを直接測定することは可能でないかも知れないが、粒子サイズは、吸着が起こる前に測定され得る。
【００３３】
粒子直径は、動的光散乱の慣用の技法によって評価され得、これは、平均粒子直径を示す。粒子がｘｎｍの直径を有するといわれる場合、ほぼこの平均の粒子の分布を有するが、数の少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、またはそれより多く）の粒子が範囲ｘ±２５％内の直径を有する。
【００３４】
（最適抗原）
本発明のアジュバントシステムは、好ましくは、抗原の投与から得られる免疫応答を増大するために抗原と組み合わせて用いられる。
【００３５】
本発明のアジュバントシステムとの使用のための好ましい抗原は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）からのようなウイルス抗原である。このアジュバントシステムはまた、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍからのような寄生虫抗原との使用に適切である。
【００３６】
５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの間の抗原濃度、代表的には、例えば、１０〜３０μｇ／ｍｌ、１５〜２５μｇ／ｍｌ、または約２０μｇ／ｍｌが代表的である。５μｇ／用量〜５０μｇ／用量の間の用量あたりの抗原量がまた代表的であり、例えば、１０〜３０μｇ／用量の間、１５〜２５μｇ／用量の間、または約２０μｇ／用量である。
【００３７】
この抗原は、好ましくは、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着される。吸着される組成物中の特定の抗原の％は、好ましくは、少なくとも５０％（重量）、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上またはより高く、例えば、１００％までである。吸着される組成物中の抗原の％は、簡便には、例えば、遠心分離によって、非吸着物質から吸着された物質を分離することによって測定され得、ここではアルミニウム吸着抗原は容易にペレットを形成し、その一方、非吸着抗原は、上清液中に残る。上清液中の抗原の量（例えば、ＥＬＩＳＡによって測定される）が、組成物中の抗原の総量から引かれ得、そして次に吸着された％が算出され得る。抗原が完全に吸着されること、すなわち、上清液に検出可能なものはないことが好ましい。
【００３８】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ウイルス肝炎を引き起こす公知の作用因子の１つである。ＨＢＶビリオンは、外側タンパク質コートまたはキャプシッドによって取り囲まれた内側コアからなり、そしてこのウイルスコアは、ウイルスＤＮＡゲノムを含む。キャプシッドの主要成分は、ＨＢＶ表面抗原、またはより一般的には「ＨＢｓＡｇ」として知られるタンパク質であり、これは、約２４ｋＤａの分子量をもつ２２６アミノ酸のポリペプチドである。すべての現存するＢ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇを含み、そして、この抗原が通常のワクチン接種を受けるヒトに投与されるとき、それは、ＨＢＶ感染に対して保護する抗ＨＢｓＡｇ抗体の産生を刺激する。それ故、好ましいＨＢＶ抗原は、ＨＢｓＡｇである。ＨＢｓＡｇは、参考文献２１に記載される方法を用いてリン酸アルミニウム上に吸収され得る。リン酸アルミニウムへの吸着は、周知のＥＮＧＥＲＩＸ−ＢＴＭ産物（ＨＢｓＡｇが水酸化アルミニウムに吸着される）とは対照的であるが、ＨＥＰＡＣＣＩＮＥＴＭおよびＲＥＣＯＭＢＩＶＡＸＴＭ産物におけるのと同じである。参考文献２２に陳述されているように、リン酸アルミニウムは、水酸化アルミニウムよりＨＢｓＡｇに対するより良好なアジュバントであり得る。
【００３９】
ワクチン製造のために、ＨＢｓＡｇは、２つの様式で作製され得る。最初の方法は、慢性Ｂ型肝炎キャリヤーの血漿から粒子中の抗原を精製することを含む。なぜなら、大量のＨＢｓＡｇが肝臓中で合成され、そしてＨＢＶ感染の間に血流中に放出されるからである。第２の方法は、組換えＤＮＡ方法によってタンパク質を発現することを含む。本発明との使用のためのＨＢｓＡｇは、いずれかの方法によって調製され得るが、組換えによって発現されたＨＢｓＡｇを用いることが好ましい。特に、このＨＢｓＡｇが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母における発現によって調製されることが好ましい。ネイティブなＨＢｓＡｇ（すなわち、血漿精製産物におけるような）とは異なり、酵母で発現されたＨＢｓＡｇは、一般にグリコシル化されておらず、そしてこれは、本発明との使用のためのＨＢｓＡｇの最も好ましい形態である。なぜなら、それは、高度に免疫原性であり、そして血液産物汚染のリスクなくして調製され得るからである。この酵母発現されたＨＢｓＡｇは、有利には、ホスホリピドを含む脂質マトリックスを含む、実質的に球形の粒子（約２０ｎｍの平均直径）の形態である。
【００４０】
精製の後、ＨＢｓＡｇは、（例えば、システインとともに）透析に供され得、これは、ＨＢｓＡｇ調製の間で用いられ得るチメロサール［２３］のような任意の水銀を含んだ保存剤を除去するために用いられ得る。
【００４１】
「Ｓ」配列に加え、表面抗原は、プレ−Ｓ１および／またはプレ−Ｓ２配列のすべてまたは一部のような、プレ−Ｓ配列のすべてまたは一部を含み得る。
【００４２】
本発明との使用のための好ましいＨＰＶ抗原は、Ｌ１キャプシッドタンパク質であり、これは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として公知の構造物を形成するようにアセンブルし得る。このＶＬＰは、酵母細胞中（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中）または昆虫細胞中（例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのようなＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ細胞中、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞中）のＬ１の組換え発現によって産生され得る。酵母細胞には、プラスミドベクターがＬ１遺伝子（単数または複数）を保持し得；昆虫細胞には、バキュロウイルスベクターがＬ１遺伝子（単数または複数）を保持し得る。より好ましくは、上記組成物は、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８株両方からのＬ１ ＶＬＳを含む。この二価の組み合わせは、高度に有効であることが示されている［２４］。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８株に加え、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１からのＬ１ ＶＬＰを含むこともまた可能である。発癌ＨＰＶ株の使用もまた可能である。ワクチンは、ＨＰＶ株あたりＬ１の２０〜６０μｇ／ｍｌ（例えば、約４０μｇ／ｍｌ）を含み得る。
【００４３】
本発明との使用のために好ましいＨＳＶ抗原は、膜糖タンパク質ｇＤである。ＨＳＶ−２株からのｇＤ（「ｇＤ２」抗原）を用いることが好ましい。上記組成物は、Ｃ末端膜アンカー領域が欠失したｇＤ［２５］の形態を用い得、例えば、先欠けｇＤは、Ｃ末端にアスパラギン酸とグルタミンとが付加された天然タンパク質のアミノ酸１〜３０６を含む。このタンパク質のこの形態は、切断されて成熟２８３アミノ酸タンパク質を生じるシグナルペプチドを含む。アンカーの欠失は、このタンパク質が可溶性形態で調製されるることを可能にする。
【００４４】
本発明との使用のために好ましいＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ抗原は、スポロゾイド周囲タンパク質（ＣＳ）に基づく。これは、「ＲＴＳ，Ｓ」または「ＴＲＡＰ」として知られる、このＣＳタンパク質の一部をＨＢｓＡｇと融合する組換えタンパク質の形態をとり得る。ＲＴＳは、ＨＢＶ表面抗原のプレＳ２タンパク質の４つのアミノ酸を経由してＨＢｓＡｇに連結されるＣＳの実質的にすべてのＣ末端部分を含むハイブリッドタンパク質である［２６］。酵母中（特に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中）で発現されるとき、ＲＴＳは、リポタンパク質粒子（特にホスホリピドを含む）として産生され、そしてそれがＨＢＶからのＳ抗原とともに同時発現されるとき、それは、ＲＴＳ，Ｓとして知られる混合粒子を産生する。約１：４のＲＴＳ：Ｓ比が有用である。ＴＲＡＰ抗原は、参考文献２７に記載されている。
【００４５】
（薬学的組成物）
アジュバントおよび抗原成分に加え、本発明の組成物はさらなる成分を含み得る。これらの成分は、種々の供給源を有し得る。例えば、それらは、製造の間に用いられる抗原またはアジュバント成分の１つ中に存在し得るか、または上記抗原成分とは別個に添加され得る。
【００４６】
本発明の好ましい組成物は、１つ以上の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含む。
【００４７】
浸透圧を制御するために、ミネラル塩、例えば、ナトリウム塩のような生理学的塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。これは、アジュバントの混合の間、および抗原とアジュバント（単数または複数）の混合の間に存在し得る。
【００４８】
組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、好ましくは、２４０ｍＯｓｍ／ｋｇと３６０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、そしてより好ましくは、２９０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に入る浸透圧重量モル濃度を有する。浸透圧重量モル濃度は、先に、ワクチン接種によって引き起こされる痛みに対し衝撃を有することはないことが報告されている［２８］が、それにもかかわらず、浸透圧重量モル濃度をこの範囲に保つことが好ましい。
【００４９】
本発明の組成物は、１つ以上の緩衝液を含み得る。代表的な緩衝液は：リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝液を含む。緩衝液中および３Ｄ−ＭＰＬ中のリン酸基間の競争を避けるために、そのときは、リン酸緩衝液以外の緩衝液が好適であり得る。緩衝液は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲で含まれる。
【００５０】
本発明の組成物のｐＨは、一般に、最適安定性のために５．０〜７．５の間、そしてより代表的には５．０〜６．０の間、または６．０〜７．０の間である。
【００５１】
抗原の吸収される性質に起因して、最終のワクチン産物は、濁った外観をもつ懸濁液であり得る。この外観は、微生物汚染が容易に見えず、そしてそうなのでこのワクチンは、好ましは抗微生物薬剤を含むことを意味する。これは、このワクチンが複数用量コンテナにパッケージされるとき特に重要である。含めるための好ましい抗微生物剤は、２−フェノキシエタノールおよびチメロサールである。しかし、本発明のプロセスの間に水銀の保存剤（例えば、チメロサール）を用いないことが好ましい。しかし、本発明の組成物を調製するために用いられる前に、抗原が、このような保存剤で処理される場合、痕跡量の存在がは避けられないかも知れない。しかし、安全性のために、最終組成物が２５ｎｇ／ｍｌより少ない水銀を含むことが好ましい。より好ましくは、この最終ワクチン産物は、検出可能なチメロサールを含まない。これは、一般に、組成物を作製するために用いられる成分の調製の間にチメロサールの使用を避けることによって、本発明のプロセスにおいてその添加の前に抗原調製物から水銀保存剤を除去することにより避けられる。
【００５２】
製造の間に、所望の最終濃度を与えるための成分の希釈は、通常、ＷＦＩ（注射用の水）で実施され得る。
【００５３】
本発明の組成物中のリン酸アルミニウムの濃度は、Ａｌ３＋の項目で表され、好ましくは、５ｍｇ／ｍｌより少なく、例えば、４ｍｇ／ｍｌ以下、３ｍｇ／ｍｌ以下、２ｍｇ／ｍｌ以下、１ｍｇ／ｍｌ以下などである。
【００５４】
本発明の組成物中の３Ｄ−ＭＰＬの濃度は、好ましくは、２００μｇ／ｍｌより少なく、例えば、１５０μｇ／ｍｌ以下、１２５μｇ／ｍｌ以下、１１０μｇ／ｍｌ以下、１００μｇ／ｍｌ以下などである。
【００５５】
本発明の組成物中の個々の抗原の濃度は、好ましくは、６０μｇ／ｍｌより少なく、例えば、５５μｇ／ｍｌ以下、５０μｇ／ｍｌ以下、４５μｇ／ｍｌ以下、４０μｇ／ｍｌ以下などである。
【００５６】
本発明の組成物は、好ましは、患者に０．５ｍｌ用量で投与される。０．５ｍｌ用量への参照は、通常の変動、例えば、０．５ｍｌ±０．１ｍｌ、０．５ｍｌ±０．０５ｍｌなどを含むことが理解される。
【００５７】
好ましい組成物は、用量あたり、約５０μｇの３Ｄ−ＭＰＬおよび約０．５ｍｇのアルミニウムアジュバントを有する。
【００５８】
本発明は、患者への投与のために次いで分与され得る個々の用量へのパッケージングのために適切であるバルク材料を提供し得る。上記で述べた濃度は、最終のパッケージされた用量における代表的な濃度であり、そしてバルクワクチン中のそのような濃度はより高くても良い（例えば、希釈によって最終濃度まで減少され得る）。
【００５９】
本発明の組成物は、一般に、水溶液形態である。
【００６０】
本発明の組成物中に存在し得るさらなる成分は：３Ｄ−ＭＰＬ凝集を防ぐために用いられているかも知れない［２０］ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（「Ｔｗｅｅｎ８０」）；これもまた３Ｄ−ＭＰＬ凝集を防ぐために用いられているかも知れないソルビトール；３Ｄ−ＭＰＬを可溶化するために用いられいるかも知れないトリエタノールアミン；これもまた３Ｄ−ＭＰＬを可溶化するために用いられいるかも知れないトリエチルアンモニウムイオン；ラクトース；シュークロース；トレハロース；および／またはマンニトールを含む。
【００６１】
（本発明のプロセス）
本発明は、本発明のアジュバント組成物を製造するためのプロセスを提供し、（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを組み合わせる工程を包含する。
【００６２】
本発明はまた、本発明の組成物を製造するプロセスを提供し、（ｉ）抗原；（ｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを組み合わせる工程を包含する。これら成分（ｉ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、任意の順序で組み合わせられ得るが、好ましは、抗原とリン酸アルミニウムが最初に混合され、そして次に３Ｄ−ＭＰＬがこの抗原／リン酸アルミニウム混合物に添加される。代替として、３Ｄ−ＭＰＬとリン酸アルミニウムが最初に混合され、そして次に抗原がこのアジュバント混合物に添加される。
【００６３】
本発明は、本発明の組成物を製造するためのプロセスを提供し；（ａ）組換え宿主中で抗原を発現する工程；（ｂ）この抗原を精製する工程；および（ｃ）この精製された抗原を、（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントと組み合わせる工程を包含する。この工程（ｃ）で組み合わせられる３つの成分は、上記に記載のように、任意の順序で組み合わせられ得る。好ましい組換え宿主は、上記のような酵母および昆虫細胞である。
【００６４】
本発明は、本発明の組成物を製造するためのプロセスを提供し、（ａ）抗原、リン酸アルミニウムアジュバントおよび３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを組み合わせる工程；（ｂ）この組成物の浸透圧を測定する工程；そしてこの浸透圧重量モル濃度が２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の外側である場合、（ｃ）この浸透圧重量モル濃度を２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に調整する工程を包含する。この調整は、ナトリウム塩、例えば、塩化ナトリウムのような生理学的塩の添加を含み得る。
【００６５】
本発明は、本発明の組成物を製造するためのプロセスを提供し、（ａ）抗原、リン酸アルミニウムアジュバントおよび３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを組み合わせる工程；（ｂ）この組成物のｐＨを測定する工程；そしてこのｐＨが５．０〜７．５の範囲の外側である場合、（ｃ）ｐＨを５．０〜７．５の範囲内に入るように調整する工程を包含する。この調整は、酸または塩基の添加を含み得る。
【００６６】
本発明は、本発明の組成物を製造するためのプロセスを提供し、（ｉ）抗原、（ｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバントおよび（ｉｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを組み合わせる工程を包含し、ここで、成分（ｉｉｉ）中の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡは、１５０ｎｍより小さい直径を有する粒子の形態にある。成分（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、任意の順序で混合され得る。成分（ｉｉｉ）は、さらに、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートおよび／またはソルビトールを含み得る。
【００６７】
上記抗原およびアジュバントを組み合わせた後、本発明のプロセスは、上記混合物の０．５ｍｌサンプルをコンテナ中に抽出し、そしてパッケージする工程を包含し得る。複数用量の状況のために、複数用量の量が、単一のコンテナに一緒に抽出され、そしてパッケージされる。
【００６８】
本発明のプロセスは、上記ワクチンの使用のためのコンテナ中にパッケージするさらなる工程を包含し得る。適切なコンテナは、バイアルおよび使い捨てシリンジ（好ましくは滅菌されたもの）を含む。
【００６９】
（本発明のパッケージング組成物）
本発明の組成物が、バイアルにパッケージされる場合、これらは、好ましくは、ガラスまたはプラスチック材料から作製される。このバイアルは、好ましくは、上記組成物がそれに添加される前に滅菌され得る。ラテックス感受性患者にともなう問題を避けるために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーでシールされる。このバイアルは、単回用量のワクチンを含み得るか、またはそれは、１つ以上の用量（「複数用量」バイアル）例えば、１０の用量を含み得る。複数用量バイアルを用いるとき、各用量は、厳密な無菌状態下で滅菌ニードルおよびシリンジで引き抜かれるべきであり、バイアル内容物を汚染することを避けるよう注意をする。好ましいバイアルは、色のないガラスから作製される。
【００７０】
上記組成物が、シリンジ中にパッケージされる場合、このシリンジは、通常、それに取り付けられたニードルを有さないが、別個のニードルがアセンブリおよび使用のためにシリンジととも提供され得る。安全ニードルが好ましい。１−インチ２３−ゲージ、１−インチ２５−ゲージおよび５／８−インチ２５−ゲージのニードルが代表的である。シリンジには、その上に内容物のロット番号および使用期限日時がプリントされ得る剥ぎ取りラベルが提供され得、記録維持を容易にする。このシリンジ中のプランジャーは、好ましくは、ストッパーを有し、プランジャーが吸引の間に偶発的に除去されることを防ぐ。これらのシリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単回用量のワクチンを含む。このシリンジは、一般に、先端部キャップを有し、この先端部をニードルの取り付けの前にシールし、そしてこの先端部キャップは、好ましくはブチルゴムから作製される。このシリンジとニードルとが別個にパッケージされる場合、そのときは、このニードルは、好ましくは、ブチルゴムシールドが取り付けられる。Ｇｒｅｙブチルゴムが好ましい。好ましいシリンジは、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭの下で販売されるものである。
【００７１】
医師または患者が予備充填されたシリンジを受けるように、シリンジ中へのパッケージングが好ましい。ガラスコンテナ（例えば、シリンジまたはバイアル）が用いられる場合、ソーダ石灰ガラスからのよりむしろホウケイ酸ガラスから作製されたコンテナを用いることが好ましい。
【００７２】
組成物がコンテナ中にパッケージされた後、このコンテナは、次いで、配給のための箱内、例えば、厚紙の箱の内側に囲われ得、そしてこの箱は、ワクチンの詳細、例えば、その商標名、ワクチン中の抗原のリスト（例えば、「Ｂ型肝炎組換え」など）、説明コンテナ（例えば、「使い捨て予備充填Ｔｉｐ−Ｌｏｋシリンジ」または「１０×０．５ｍｌ単回用量バイアル」）、その用量（例えば、「各々１回の０．５ｍｌ用量を含む」）、警告（例えば、「成人使用のみのため」）、使用期限日時、適応症などがラベルされる。各箱は、１つ以上のパッケージされたワクチン、例えば、５または１０のパッケージされたワクチン（特にバイアルについて）を含み得る。このワクチンがシリンジ中に含まれる場合、このパッケージは、シリンジの絵を示し得る。
【００７３】
ワクチンは、ワクチンの詳細、例えば、投与のための指示書、ワクチン内の抗原の詳細などを含む印刷物とともに一緒に（例えば、同じ箱中に）パッケージされ得る。これらの指示書はまた、警告、例えば、ワクチン接種の後のアナフィラキシー反応の事例で利用可能なアドレナリンの溶液を準備しておくことなどを含み得る。
【００７４】
このパッケージされたワクチン材料は、好ましくは、滅菌されている。
【００７５】
このパッケージされたワクチン材料は、好ましくは、発熱物質を含まず、例えば、用量あたり、＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準測定）、そして好ましは＜０．１ＥＵを含む。
【００７６】
このパッケージされたワクチン材料は、好ましくは、グルテンを含まない。
【００７７】
任意の水性のパッケージされたワクチン材料のｐＨは、５〜８の間、例えば、５．５〜６．５の間である。本発明のプロセスは、それ故、パッケージングの前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を包含し得る。
【００７８】
このパッケージされたワクチンは、好ましは、２℃と８℃との間で貯蔵される。それは、凍結されるべきではない。
【００７９】
（処置およびワクチンの投与の方法）
本発明の組成物は、ヒト患者への投与のために適切であり、そして本発明は、患者における免疫応答を高める方法を提供し、本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
【００８０】
本発明はまた、薬剤における使用のための本発明の組成物を提供する。
【００８１】
本発明はまた、患者への投与のための医薬の製造における、（ｉ）抗原；（ｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントの使用を提供する。
【００８２】
本発明の方法および使用は、ＨＢＶ感染；ＨＳＶ感染；ＨＳＶによって引き起こされる生殖器ヘルペス；ＨＰＶ感染；ＨＰＶによって引き起こされる生殖器疣贅；ＨＰＶによって引き起こされる頸部癌；および／またはマラリアに対して保護するため、および／または処置するために患者に投与された後に免疫応答を惹起するために特に適切である。
【００８３】
本発明の免疫原生組成物は、好ましくは、感染の保護および／または処置における使用のためのワクチンである。
【００８４】
十分な効き目を有するために、代表的な免疫化スケジュールは、１つ以上の用量を投与することを含み得る。例えば、用量は：０および６月（時間０が最初の用量である）；０、１、２および６月；０日、２１日そして次に６〜１２月の間の第３の用量；または０、１、２、６および１２月であり得る。本発明の組成物は、筋肉内注入により、例えば、腕または脚中に投与され得る。本発明の組成物は、アルミニウムを基礎にしたアジュバントを含むので、成分の沈降が貯蔵の間に生じ得る。この組成物は、それ故、患者への投与の前に振とうされるべきである。この振とうされた組成物は、濁った白色の懸濁物であり得る。
【００８５】
（さらなる抗原性成分）
ＨＢｓＡｇ、ＨＰＶ Ｌ１、ＨＳＶ ｇＤおよび／マラリア抗原を含むことと同様に、本発明の組成物は、１つ以上のさらなる抗原を含み得る。例えば、それらは、以下の１つ以上を含み得る：Ａ型肝炎ウイルス抗原；ジフテリアトキソイド；破傷風トキソイド；不活性化ポリオウイルス抗原；細胞百日咳抗原；無毒化百日咳トキシン、線維状血球凝集素、および、必要に応じて６９ｋＤａ抗原を含む、無細胞百日咳抗原；代表的には、キャリヤタンパク質として破傷風トキソイドとの複合体化Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプＢ皮膜糖類；複合体化血清群Ａ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ皮膜糖類；複合体化血清群Ｃ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ皮膜糖類；複合体化血清群Ｙ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ皮膜糖類；複合体化血清群Ｗ１３５ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ皮膜糖類；複合体化Ｓ．ｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ皮膜糖類。
【００８６】
（リン酸アルミニウムの代替物）
いくつかの適用には、リン酸アルミニウムアジュバントを水酸化アルミニウムアジュバントで置換すること、または水酸化アルミニウムとリン酸アジュバントを組み合わせることが有用であり得る。ＨＰＶおよびＨＳＶワクチンでは、例えば、水酸化アルミニウムは、リン酸アルミニウムより好ましくあり得る。従って、本発明の上記の定義は、補正され得る。
【００８７】
用語「水酸化アルミニウム」は、当該分野では一般的であるが、存在している実際の化学的化合物の正確な説明はない［例えば、参考文献２の第９章を参照のこと］。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される任意の「水酸化アルミニウム」アジュバントを用い得、これらは、代表的には、アルミニウムのオキシヒドロキシド塩であり、これらは、通常、少なくとも部分的に結晶である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表され得るオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光学によって、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のようなその他のアルミニウム化合物から、特に、１０７０ｃｍ−１における吸着バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１における強力なショルダーの存在によって区別され得る［参考文献２の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化の程度は、半分高さ（ＷＨＨ）における回折バンドの幅によって反映され、乏しい結晶の粒子は、より小さな結晶サイズに起因するより大きなライン広範化を示す。表面積は、ＷＨＨが増加するとき増加し、そしてより高いＷＨＨ値をもつアジュバントは、抗原吸収についてより大きな能力を有することが観察されている。線維状形態（例えば、透過型電子顕微鏡写真に見られるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントのついて代表的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは代表的には約１１であり、すなわち、このアジュバント自体は、生理学的ｐＨで正の表面荷電を有する。ｐＨ７．４でｍｇＡ＋＋＋あたり１．８〜２．６ｍｇタンパク質吸着能力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて方向されている。
【００８８】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えば、Ｘを含む組成物は、専らＸからなり得るか、またはさらなる何かを含有し得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。用語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくても良い。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【００８９】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００９０】
詳細に述べられていなければ、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、混合の任意の特定の順序を要求しない。それ故、成分は任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在するとき、そのときは、２つの成分が互いと組み合わされ得、そして次にこの組み合わせが、第３の成分と組み合わされ得るなどである。
【００９１】
イオン化可能基が、本明細書中の式で示される中性形態で存在し得るか、または例えば、ｐＨに依存して荷電された形態で存在し得ることが認識される。それ故、リン酸基は、−Ｐ−Ｏ−（ＯＨ）２として示され得、この式は、中性リン酸基の単なる代表であり、そしてその他の荷電形態が本発明によって包含される。同様に、糖のリングは、開いた形態および閉じた形態で存在し得、そして、閉じた形態は、本明細書中では構造式で示されているが、開いた形態もまた、本発明によって包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９２】
（発明を実施するための様式）
組換えＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現されたＨＢｓＡｇは、細胞回収、沈殿、限外濾過、ゲル透過、イオン交換、超遠心分離および脱塩を含むプロセスによって精製される。精製された抗原は、グリコシル化されておらず、そして実質的に球形の粒子の形態で観察され得る（平均直径約２０ｎｍ）。
【００９３】
抗原は、リン酸緩衝液溶液中に維持され、そして撹拌下、室温で１時間の間アモルファスリン酸アルミニウムアジュバントに吸着される（３〜６ｍｇ／ｍｌＡｌ＋＋＋）。
【００９４】
この混合物は室温で２週間の間貯蔵され、そして次に冷蔵庫で維持される。Ｃｏｒｉｘａからの３Ｄ−ＭＰＬアジュバントが次いで添加され、リン酸アルミニウムアジュバント上に吸着され、そして収入のための水および滅菌生理食塩水を用いて、所望の最終抗原濃度までの任意の必要な希釈が達成される。このバルクワクチンは、次いで、使い捨てシリンジ中の個々の用量にパッケージされる。
【００９５】
このようにして製造されたワクチンは、最初、健常青年および成人中で試験される。このワクチンは、すべての年齢グループの間でＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭ産物より強力な免疫応答（１００％までの血清保護率、より高いＧＭＴ値）を惹起する。
【００９６】
リン酸アルミニウム／３ｄＭＰＬアジュバント混合物で、このワクチンが２−用量のスケジュール（０および６月）として投与されるとき、９８．６％の血清保護率が観察され、これは、０、１および６月でＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭを用いて観察される９６．８％より良好である。ＧＭＴは、ほぼ７８００（ＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭの３７００に対して）である。初期試験の後、試験は、１５歳およびより年配である（平均年齢５８）、血液透析前患者および既に血液透析を受けている患者に移行する。これらの患者は、生まれつきＨＢＶである。このワクチンの単回用量（２０μｇのＨＢｓＡｇ）は、０、１、２および６月で投与された２倍用量のＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭと比較される。血清保護および抗ＨＢｓＡｇ ＧＴＭは以下のようである：
【００９７】
【表１】
それ故、これらのワクチンは、市場で主役のＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭワクチンより血液透析成人におけるより良好な免疫応答を一貫して惹起した。さらに、保護の発生は、より迅速であり（例えば、３月で血清保護された７５％の患者に対して、ＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭでは５２％、ｐ＜０．００５）そしてより長く持続する。
【００９８】
肝臓移植を待つ生まれつきＨＢＶである患者におけるさらなる試行は、類似の結果を示す。ワクチンは、０日および２１日で（ＥＮＧＥＲＩＸ ＢＴＭについてはプララス７日の用量）、そして次に６〜１２月の間の最終用量投与される。
【００９９】
【表２】
血清保護率は、リン酸アルミニウム／３ｄＭＰＬを用いてより高い（６０％対３２％、ｐ＜０．０３５）。
【０１００】
満足できる安全性および反応発生能力がすべての患者で観察される。一時的な局所的不快さが本発明のワクチンでより高いが、これは、迅速に解決し、そして上記治療利益に比較されるとき、受容可能な副作用である。
【０１０１】
本発明が例示のみによって説明されており、そして本発明の範囲および思想内である改変がなされ得ることが理解される。
【０１０２】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物であって、少なくとも５０％の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが該リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されている、アジュバント組成物。
【請求項２】
前記組成物が、５μｇ／ｍｌより少ない非吸着３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡを有する、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項３】
少なくとも９５％の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されている、請求項１〜２のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項４】
前記３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントがアシル化二糖類の混合物を含み、ここで、各二糖類が：（ａ）２つのβ−１’，６−連結２−デオキシ−２−アミノグルコース単糖サブユニットを有し；（ｂ）４’位置でリン酸化され；（ｃ）１、３および６’位置で置換されておらず、（ｄ）３’位置でＯ−アシル化され、そして（ｅ）２および２’位置でＮ−アシル化され、そしてここで、アシル化二糖類の混合物が、少なくとも１０重量％の、２、２’および３’位置のアシル基の各々がそれ自体が脂肪族炭素原子においてＯ−アシル基で置換される成分を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項５】
トリメチルアンモニウムイオンをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項６】
前記組成物が、２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧重量モル濃度を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項７】
前記組成物が、５〜７．５のｐＨを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項８】
（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバント；および（ｉｉｉ）抗原を含む免疫原性組成物であって、少なくとも５０％の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが該リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されている、組成物。
【請求項９】
前記リン酸アルミニウムアジュバントが、アモルファスである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１０】
前記抗原が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
少なくとも５０％（好ましくは少なくとも９０％）のＨＢｓＡｇが、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗原が、ホスホリピドを含むリピドマトリックスを含む実質的に球形の粒子の形態にある酵母で発現されたＨＢｓＡｇである、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物の０．５ｍｌ用量が：約５０μｇの３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；（Ａｌ３＋の形態によって発現される）約０．５ｍｇのリン酸アルミニウム；および約２０μｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇを有する、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗原が、酵母で発現された混合粒子（ＲＴＳ、Ｓ）であり：（ａ）ＨＢＶ表面抗原のプレＳ２部分の４つのアミノ酸を経由してＨＢｓＡｇに連結されるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＣＳタンパク質の実質的にすべてのＣ末端部分を含むハイブリッドタンパク質であるＲＴＳ；および（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原であるＳを含む、請求項８または請求項９の組成物。
【請求項１６】
シリンジに梱包された、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記シリンジが、ホウケイ酸ガラスから作製され、そしてブチルゴムから作製される先端部キャップを有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項８〜１５のいずれか１項に記載の組成物を調製するプロセスであって：（ａ）前記抗原および前記リン酸アルミニウムアジュバントを混合する工程；および次いで（ｂ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを該抗原／リン酸アルミニウム混合物と組み合わせる工程、を包含する、プロセス。
【請求項１９】
前記抗原が、前記工程（ａ）で前記リン酸アルミニウムアジュバントに吸着する、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記工程（ｂ）の後に、前記混合物の０．５ｍｌのサンプルをコンテナ中に抽出および梱包する工程をさらに包含する、請求項１８または請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記コンテナが、ガラスシリンジである、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
（ｉ）抗原；（ｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントの、患者に投与するためのワクチンの製造における使用であって、ここで、少なくとも５０％の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが該リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されている、使用。
【請求項２３】
前記ワクチンが、筋肉内注入用である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記抗原が、ＨＢｓＡｇである、請求項２２または２３の使用。
【請求項２５】
前記組成物が、０、１、２および６月における用量であって、時間０が最初の用量である免疫化スケジュールによって投与される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記患者が、血液透析成人である、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項１】
（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを含むアジュバント組成物であって、少なくとも５０％の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが該リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されている、アジュバント組成物。
【請求項２】
前記組成物が、５μｇ／ｍｌより少ない非吸着３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡを有する、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項３】
少なくとも９５％の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されている、請求項１〜２のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項４】
前記３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントがアシル化二糖類の混合物を含み、ここで、各二糖類が：（ａ）２つのβ−１’，６−連結２−デオキシ−２−アミノグルコース単糖サブユニットを有し；（ｂ）４’位置でリン酸化され；（ｃ）１、３および６’位置で置換されておらず、（ｄ）３’位置でＯ−アシル化され、そして（ｅ）２および２’位置でＮ−アシル化され、そしてここで、アシル化二糖類の混合物が、少なくとも１０重量％の、２、２’および３’位置のアシル基の各々がそれ自体が脂肪族炭素原子においてＯ−アシル基で置換される成分を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項５】
トリメチルアンモニウムイオンをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項６】
前記組成物が、２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧重量モル濃度を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項７】
前記組成物が、５〜７．５のｐＨを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項８】
（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバント；および（ｉｉｉ）抗原を含む免疫原性組成物であって、少なくとも５０％の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが該リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されている、組成物。
【請求項９】
前記リン酸アルミニウムアジュバントが、アモルファスである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１０】
前記抗原が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
少なくとも５０％（好ましくは少なくとも９０％）のＨＢｓＡｇが、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗原が、ホスホリピドを含むリピドマトリックスを含む実質的に球形の粒子の形態にある酵母で発現されたＨＢｓＡｇである、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物の０．５ｍｌ用量が：約５０μｇの３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；（Ａｌ３＋の形態によって発現される）約０．５ｍｇのリン酸アルミニウム；および約２０μｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇを有する、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗原が、酵母で発現された混合粒子（ＲＴＳ、Ｓ）であり：（ａ）ＨＢＶ表面抗原のプレＳ２部分の４つのアミノ酸を経由してＨＢｓＡｇに連結されるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＣＳタンパク質の実質的にすべてのＣ末端部分を含むハイブリッドタンパク質であるＲＴＳ；および（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原であるＳを含む、請求項８または請求項９の組成物。
【請求項１６】
シリンジに梱包された、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記シリンジが、ホウケイ酸ガラスから作製され、そしてブチルゴムから作製される先端部キャップを有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項８〜１５のいずれか１項に記載の組成物を調製するプロセスであって：（ａ）前記抗原および前記リン酸アルミニウムアジュバントを混合する工程；および次いで（ｂ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントを該抗原／リン酸アルミニウム混合物と組み合わせる工程、を包含する、プロセス。
【請求項１９】
前記抗原が、前記工程（ａ）で前記リン酸アルミニウムアジュバントに吸着する、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記工程（ｂ）の後に、前記混合物の０．５ｍｌのサンプルをコンテナ中に抽出および梱包する工程をさらに包含する、請求項１８または請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記コンテナが、ガラスシリンジである、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
（ｉ）抗原；（ｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバント；および（ｉｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバントの、患者に投与するためのワクチンの製造における使用であって、ここで、少なくとも５０％の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが該リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されている、使用。
【請求項２３】
前記ワクチンが、筋肉内注入用である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記抗原が、ＨＢｓＡｇである、請求項２２または２３の使用。
【請求項２５】
前記組成物が、０、１、２および６月における用量であって、時間０が最初の用量である免疫化スケジュールによって投与される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記患者が、血液透析成人である、請求項２４または２５に記載の使用。
【公表番号】特表２００８−５３０１９５（Ｐ２００８−５３０１９５Ａ）
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５５７０１（Ｐ２００７−５５５７０１）
【出願日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／０００５５７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８７５６３
【国際公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【出願人】（５０６３６１１００）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド (44)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／０００５５７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８７５６３
【国際公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【出願人】（５０６３６１１００）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド (44)
【Ｆターム（参考）】
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