ループスアンチコアグラント検出試薬キット
【課題】ループスアンチコアグラント（LA）の検出感度を高め、LA弱陽性検体であっても特異的に検出できる試薬キットを提供することにある。
【解決手段】 第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬を備え、第１凝固時間測定試薬がリン脂質としてのホスファチジルセリンと、カルシウムイオンと、非ヒト由来物質とを含有し、第２凝固時間測定試薬がカルシウムイオンと、第１凝固時間測定試薬より低濃度のホスファチジルセリンとを含有することを特徴とするとするLA検出試薬キットを使用する。
【解決手段】 第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬を備え、第１凝固時間測定試薬がリン脂質としてのホスファチジルセリンと、カルシウムイオンと、非ヒト由来物質とを含有し、第２凝固時間測定試薬がカルシウムイオンと、第１凝固時間測定試薬より低濃度のホスファチジルセリンとを含有することを特徴とするとするLA検出試薬キットを使用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、in vitroでの血液検査でループスアンチコアグラント陽性疾患を特異的に検出できる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ループスアンチコアグラント（以下、LAと略記することがある）はSLE（Systemic Lupus Erythematosus）患者について初めて報告された抗凝血素である。SLE患者においてLAが検出される頻度は5％乃至10％である一方、他の自己免疫性疾患、腫瘍性疾患においても検出されることがある。LAは血栓症、流早産、血小板減少などの抗リン脂質抗体症候群(antiphospholipid syndrome；APS)において検出される頻度が高く、リン脂質依存性の凝固反応で凝固するまでの時間が延長されることから、リン脂質に対する自己抗体であると考えられている。
また、LAは不均一な抗体であり、陰性荷電リン脂質とβ２−グリコプロテインＩ（β２−ＧＰＩ）またはプロトロンビンとの複合体に対する抗体であることが、近年明らかになった。LAの抗凝固作用は、LAがこの複合体と結合することによりプロトロンビンがトロンビンに変化することを阻害するために起こると考えられる。
【０００３】
このような特徴を有するLAの検出試薬としては、 ホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第１凝固時間測定試薬とホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第２凝固時間測定試薬を備え、第１凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合が、第２凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合と異なっており、第１凝固時間測定試薬のホスファチジルセリン濃度が第２凝固時間測定試薬より高いことを特徴とするループスアンチコアグラント測定試薬が知られている(特許文献１)。この特許文献１にはヘパリン投与患者血漿やワーファリン投与患者血漿とは区別することができるLA測定試薬が開示されている。
一方、LAの検査ではLA弱陽性検体についても検出できる検出感度の高い試薬が望まれているが、特許文献１には、LA弱陽性検体に対する検出感度の向上については記載がない。
【０００４】
【特許文献１】特開2004-69697号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、LAの検出感度を高め、LA 弱陽性検体であっても特異的に検出できる試薬キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬とを備えたループスアンチコアグラント検出試薬キットにおいて、第１凝固時間測定試薬が、リン脂質としてのホスファチジルセリンと、カルシウムイオンと、ヒトを除く脊椎動物の抗体、血清、血漿及び免疫グロブリンから成る群より選ばれる少なくとも１種の非ヒト由来物質とを含有し、第２凝固時間測定試薬が、カルシウムイオンと、第１凝固時間測定試薬より低濃度のホスファチジルセリンとを含有することを特徴とするループスアンチコアグラント検出試薬キットに関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の試薬キットでは、LAに対して特異的に凝固時間の差異を認めることができ、LA陽性患者だけを高感度に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の実施形態の検出試薬キットは、血液又は血漿検体におけるループスアンチコアグラントが弱陽性検体であっても特異的に検出できる試薬キットである。
【０００９】
本発明の実施形態の検出試薬キットは、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬とを備えたループスアンチコアグラント検出試薬キットにおいて、第１凝固時間測定試薬が、リン脂質としてのホスファチジルセリンと、カルシウムイオンと、ヒトを除く脊椎動物の抗体、血清、血漿及び免疫グロブリンから成る群より選ばれる少なくとも１種の非ヒト由来物質とを含有し、第２凝固時間測定試薬が、カルシウムイオンと、第１凝固時間測定試薬より低濃度のホスファチジルセリンとを含有２種類の凝固時間測定試薬の組合せである。
【００１０】
上記第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬にリン脂質として含有されるホスファチジルセリン（以下、PSと略記することがある）は、合成ホスファチジルセリンであってもよいし、天然由来ホスファチジルセリンであってもよい。ホスファチジルセリンは合成ホスファチジルセリンであることが好ましい。天然由来のホスファチジルセリンを用いる場合には、純度99％以上に精製されたものを用いることが好ましい。
【００１１】
ホスファチジルセリン以外のリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン（以下、PEと略記することがある）及びホスファチジルコリン（以下、PCと略記することがある）を挙げることができる。
【００１２】
ループスアンチコアグラントを捕捉するために含有されるヒトを除く脊椎動物の抗体、血清、血漿又は免疫グロブリン（以下、これらを区別せず、総称して述べるときは「非ヒト由来物質」という）としては、好ましくはヒト及びブタを除くほ乳類の抗体、血清又は免疫グロブリンが用いられ、具体的には、マウスIgG、ウマIgG、ウシIgG、マウス血清、ウマ血清、ウシ血清、マウス、ウマ又はウシのα−グロブリンなどを用いることができる。市販品としては、Scantibodies社製のHBR(Heterophile Blocking Reagent) や、MAK33 (ロッシュ社製)、NM8などがある。HBRは、免疫測定方法における異好性抗体による干渉を抑制することを目的として検査系に添加される試薬であるが、本発明者により、LAに特異的に結合し、しかも、血液検体中に含まれるLA以外の血液凝固時間に関連する成分とは結合しないことが見出され、本発明の凝固時間測定試薬におけるLA抗体捕捉剤としての使用が可能となった。
【００１３】
LAを捕捉するために含有される非ヒト由来物質としては、１種類の動物由来の抗体等だけを用いてもよいし、異なる２種以上の動物由来の抗体等、例えばマウスIgGとウマIgGを混合して用いてもよい。
【００１４】
第２凝固時間測定試薬には、LA捕捉剤となる非ヒト由来物質が実質的に含まれず、また好ましくは非ヒト由来物質が含まれていないので、LA陽性の検体では、LAの存在により、凝固時間が延長される。一方、第１凝固時間測定試薬と検体を接触させた場合には、第１凝固時間測定試薬に含まれる非ヒト由来物質により、LAが捕捉されるので、LA陽性の検体であっても、LAの存在による凝固時間の延長が阻止される。従って、第１凝固時間測定試薬を用いたときの凝固時間（第１凝固時間）と第２凝固時間測定試薬を用いたときの凝固時間（第２凝固時間）との間で有意な差異が認められればLA陽性であり、有意な差異が認められなければ、LA陰性と判定できる。
【００１５】
第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬には、さらに、in vitroで血液凝固を起こすのに必要な他の成分を含んでもよい。他の成分としては、例えば、活性化剤、蛇毒、カルシウム、組織因子などが挙げられる。活性化剤としては、エラグ酸、カオリン、セライト及コロイドシリカからなる群より選択される１種以上を用いることが好ましい。蛇毒としては、ラッセル蛇毒、テキスタリン蛇毒及びエカリン蛇毒からなる群より選択される１種以上を用いることが好ましい。組織因子としては、ウサギ脳、ヒト胎盤由来のもの、これらの組換え体を用いることが好ましい。
これらの他の成分は、凝固時間測定試薬の種類に応じて適宜選択される。例えば、第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬がカルシウム及び活性化剤を含む場合には活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づいて凝固時間を測定する。第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬がカルシウム及び蛇毒を含む場合には、蛇毒測定時間の原理に基づいて凝固時間を測定する。また、第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬がカルシウム及び組織因子を含む場合には、プロトロンビン時間測定の原理に基づいて凝固時間を測定する。
【００１６】
尚、第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬には、さらに必要に応じて、ヘペスおよびトリス緩衝液などの緩衝液を含んでもよい。緩衝液の濃度は、一般的に臨床化学の分野で用いられている濃度であればよく、簡単な繰り返し実験により決定することができる。
【００１７】
第１凝固時間測定試薬に含まれる凝固系組成物と、第２凝固時間測定試薬に含まれる凝固系組成物とは同種でなければならない。つまり、第１凝固時間測定試薬に含まれる凝固系組成物が活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づいて凝固時間を測定する場合には、第２凝固時間測定試薬に含まれる凝固系組成物も活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づいて凝固時間を測定する。
【００１８】
また、検出試薬キットを第１部分試薬と第２部分試薬からなる第１凝固時間測定試薬と、第３部分試薬と第４部分試薬からなる第２凝固時間測定試薬とで構成するようにしてもよい。
このとき、活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づいて凝固時間を測定する場合には第１部分試薬および第３部分試薬にはリン脂質及び活性化剤が含有され、２部分試薬および第４部分試薬にはカルシウムイオンが含まれる。
また、蛇毒測定時間の原理に基づいて凝固時間を測定する場合には第１部分試薬および第３部分試薬にはリン脂質及び蛇毒が含有され、２部分試薬および第４部分試薬には、カルシウムイオンが含まれる。
さらに、プロトロンビン時間測定の原理に基づいて凝固時間を測定する場合には第１部分試薬および第３部分試薬にはリン脂質及び組織因子が含有され、２部分試薬および第４部分試薬には、カルシウムイオンが含まれる。
なお、上記第１部分試薬には非ヒト由来物質を含有してもよい。
【００１９】
さらに、検出試薬キットを第１部分試薬、第２部分試薬及び第３部分試薬からなる第１凝固時間測定試薬と、第４部分試薬と第５部分試薬及び第６部分試薬からなる第２凝固時間測定試薬とで構成するようにしてもよい。
このとき、活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づいて凝固時間を測定する場合には第１部分試薬および第４部分試薬にはリン脂質が含有され、第２部分試薬及び第５部分試薬には活性化剤が含有され、第３部分試薬および第６部分試薬にはカルシウムイオンが含まれる。
また、蛇毒測定時間の原理に基づいて凝固時間を測定する場合には第１部分試薬および第４部分試薬にはリン脂質が含有され、第２部分試薬及び第５部分試薬には蛇毒が含有され、第３部分試薬および第６部分試薬にはカルシウムイオンが含まれる。
さらに、プロトロンビン時間測定の原理に基づいて凝固時間を測定する場合には第１部分試薬および第４部分試薬にはリン脂質が含有され、第２部分試薬及び第５部分試薬には組織因子が含有され、第３部分試薬および第６部分試薬にはカルシウムイオンが含まれる。
なお、上記第１部分試薬には非ヒト由来物質を含有してもよい。
【００２０】
第１凝固時間測定試薬および第２凝固時間測定試薬のリン脂質の含有量は、検体と第１凝固時間測定試薬または第２凝固時間測定試薬を等量混合して（検体50μＬと第１凝固時間測定試薬または第２凝固時間測定試薬を50μＬ混合する場合）、凝固時間測定する測定方法においては、第１凝固時間測定試薬中のホスファチジルセリン含有量は35〜370μM、好ましくは60〜250μMであり、ホスファチジルエタノールアミン含有量は40〜410μM、好ましくは65〜270μMであり、ホスファチジルコリン含有量は35〜385μM、好ましくは60〜255μMである。さらに、非ヒト由来物質の含有量は、被検体 1mL当たり0.1〜50mg、好ましくは0.2〜10mg、より好ましくは0.5〜6mgとなる量を含有させることが好ましい。測定試料1mLあたり、0.1mg以下では、LA陽性の検体の場合に、LAの捕捉が不十分となり、捕捉されなかったLAにより凝固時間の延長が認められるからである。
また、第２凝固時間測定試薬中のホスファチジルセリン含有量は1〜25μM、好ましくは5〜20μMであり、ホスファチジルエタノールアミン含有量は1〜30μM、好ましくは5〜20μMであり、ホスファチジルコリン含有量は10〜150μM、好ましくは25〜65μMである。
【００２１】
ホスファチジルセリンは上記記載の濃度の範囲内で使用することができ、第１凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合が、第２凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合と異なるものが好ましく、第１凝固時間測定試薬のホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合が第２凝固時間測定試薬のホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合より大きいことが好ましい。
【００２２】
上記リン脂質の濃度は検体50μＬと第１凝固時間測定試薬または第２凝固時間測定試薬を50μＬ混合する場合の濃度を記載したが、検体と凝固時間測定試薬との混合割合が異なる場合、検体と第１凝固時間測定試薬または第２凝固時間測定試薬とを混合した後のリン脂質の終濃度が上記の場合と同様の範囲となるようにすれればよい。
【００２３】
また、前記第１凝固時間測定試薬が第１部分試薬と第２部分試薬との組合せからなり、前記第２凝固時間測定試薬も第３部分試薬と第４部分試薬との組合せからなる場合、第１部分試薬および第３部分試薬のリン脂質の含有量は、検体と第１部分試薬または第３部分試薬を等量混合して、凝固時間測定する測定方法においては、第１部分試薬中のホスファチジルセリン含有量はホスファチジルセリン含有量は35〜370μM、好ましくは60〜250μMであり、ホスファチジルエタノールアミン含有量は40〜410μM、好ましくは65〜270μMであり、ホスファチジルコリン含有量は35〜385μM、好ましくは60〜255μMである。さらに、非ヒト由来物質の含有量は、被検体 1mL当たり0.1〜50mg、好ましくは0.2〜10mg、より好ましくは0.5〜6mgとなる量を含有させることが好ましい。測定試料1mLあたり、0.1mg以下では、LAの検体の場合に、LAの捕捉が不十分となり、捕捉されなかったLAにより凝固時間の延長が認められるからである。
また、第３部分試薬のホスファチジルセリン含有量は1〜25μM、好ましくは5〜20μMであり、ホスファチジルエタノールアミン含有量は1〜30μM、好ましくは5〜20μMであり、ホスファチジルコリン含有量は10〜150μM、好ましくは25〜65μMである。
【００２４】
前記第１凝固時間測定試薬が第１部分試薬、第２部分試薬及び第３部分試薬との組合せからなり、前記第２凝固時間測定試薬も第４部分試薬、第５部分試薬及び第６部分試薬との組合せからなる場合、第１部分試薬および第４部分試薬のリン脂質の含有量は、検体と第１部分試薬または第４部分試薬を等量混合して、凝固時間測定する測定方法においては、第１部分試薬中のホスファチジルセリン含有量は35〜370μM、好ましくは60〜250μMであり、ホスファチジルエタノールアミン含有量は40〜410μM、好ましくは65〜270μMであり、ホスファチジルコリン含有量は35〜385μM、好ましくは60〜255μMである。さらに、非ヒト由来物質の含有量は、被検体 1mL当たり0.1〜50mg、好ましくは0.2〜10mg、より好ましくは0.5〜6mgとなる量を含有させることが好ましい。測定試料1mLあたり、0.1mg以下では、LA陽性の検体の場合に、LAの捕捉が不十分となり、捕捉されなかったLAにより凝固時間の延長が認められるからである。
また、第４部分試薬のホスファチジルセリン含有量は1〜25μM、好ましくは5〜20μMであり、ホスファチジルエタノールアミン含有量は1〜30μM、好ましくは5〜20μMであり、ホスファチジルコリン含有量は10〜150μM、好ましくは25〜65μMである。
【００２５】
次に、上記構成を有する本発明の試薬キットを用いて、LAを検出する方法について説明する。
まず検体試料を２つに分け、一方には高濃度のPSを含む第１凝固時間測定試薬を添加し、もう一方の検体試料には、低濃度のPSを含む第２凝固時間測定試薬を添加する。
また、第１凝固時間測定試薬がそれぞれ第１部分試薬と第２部分試薬とに分かれている場合には、検体と第１部分試薬とを混合してから第２部分試薬を添加する。
さらに、第１凝固時間測定試薬が第１部分試薬、第２部分試薬および第３部分試薬に分かれている場合には、検体と第１部分試薬とを混合し、第２部分試薬、第３部分試薬の順に試薬を添加する。
検体に各試薬を添加した後、試料の凝固時間を測定する。凝固時間の測定は、当業者に公知の方法で行えばよく、公知の自動測定装置を用いて測定してもよい。
【００２６】
ここで、LA検出に用いる試料としては、血液をそのまま用いるよりも血漿を用いることが好ましく、より好ましくは血小板除去血漿を用いることが好ましい。また、試料に、正常血漿または正常血小板除去正常血漿を混合したものを用いてもよい。正常血漿を混合しておくことにより、凝固因子欠損に基づく凝固時間の延長を防止するが可能となり、LAの感度が高まるからである。試料と正常血漿の混合する場合の混合比は、一般的に４：１乃至１：４であり、好ましくは１：１である。
【００２７】
本発明の試薬キットを用いた凝固検査では、LA陽性患者、血液凝固因子欠損患者、ワーファリン投与患者、ヘパリン投与患者などの抗凝血疾患由来の試料の凝固時間は、正常血漿の凝固時間よりも長くなる。さらに、LA陽性患者検体については、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬による凝固時間の差異も認められる。すなわち、LA陽性患者由来の試料では、高濃度のPSを含む第１凝固時間測定試薬を用いたときの凝固時間よりも、低濃度のPSを含む第２凝固時間測定試薬を用いたときの凝固時間の方が長くなる。一方、血液凝固因子欠損患者、ワーファリン投与患者、ヘパリン投与患者由来の試料では、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬との間で、凝固時間の顕著な差異は認められない。従って、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬との凝固時間の差異に基づいて、LAを特異的に検出することができる。
【００２８】
LAの検出は、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬の差異によって判定することができるが、より精度よく判定するためには、正常血漿の凝固時間に対する患者由来の試料の凝固時間の比、例えばRosner Index(E.Rosner,et al.,Thromb.Haemast.1987,57:144-149）またはLupus Ratio(LR)（R.Schjetlein,et al.,Thromb.Res.1993,69:239-250）、LRと同じ原理ではあるが、検体と正常血漿の混合しない凝固時間比により、判定を行うことが好ましい。
正常血漿の場合、PS含有率は凝固時間に影響を及ぼさないので、第１凝固時間試薬と第２凝固時間試薬の比に該当するLR値は１程度である。また、血液凝固因子欠損患者、ワーファリン投与患者、またはヘパリン投与患者由来の場合であっても、正常血漿と比べて凝固時間は延長されるものの、PS濃度差による凝固時間の差はほとんど認められないため、LR値は１程度となる。これに対して、LA陽性の場合には、第１凝固時間測定試薬、第２凝固時間測定試薬の各濃度、組合わせにもよるが、第２凝固時間測定試薬の方が第１凝固時間測定試薬よりも凝固時間が延びるために、LR値を比較することによりLA陽性患者由来の試料を自動的に検出することができる。
【実施例】
【００２９】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
（比較例１）
【００３０】
活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づくループスアンチコアグラント測定試薬（２試薬系）を下記に示す方法により調製した。
つまり、LA-Hは第１部分試薬と第２部分試薬とからなり、LA-Lは第３部分試薬と第４部分試薬とからなり、第１部分試薬の各成分の濃度はヘペスが50mM、エラグ酸が0.1mM、トリスが25mM、ＰＳが123μM、ＰＥが134μM、ＰＣが127μMであり、各成分添加後のpHは7.35ある。また、第３部分試薬の各成分の濃度はヘペスが50mM、エラグ酸が0.1mM、トリスが25mM、ＰＳが12.3μM、ＰＥが13.4μM、ＰＣが38.2μMであり、各成分添加後のpHは7.35である。
また、塩化カルシウム濃度が25mMになるように精製水で調製したものを、第２部分試薬、第４部分試薬とした。
【００３１】
正常血漿及び測定試料をそれぞれ50μLづつ２セット準備し、一方のセットの各試料に、第１部分試薬（又は第３部分試薬）50μLを添加し、37℃に5分間加温した後、各試料に第２部分試薬（又は第４部分試薬）を50μL添加し、凝固時間を測定した。 凝固時間の測定は全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所株式会社）を用いて、凝固時間を測定した。測定は２回行い、平均値を求めた。
【００３２】
正常血漿としてはコアグトロールN(シスメックス社製)を使用し、測定試料としては表１に示すLA陽性患者血漿(検体番号1〜21)、また、表２に示す健常人血漿（検体番号22〜29）、ワーファリン投与患者血漿（検体番号30〜39）、第ＶＩＩＩ因子欠乏患者血漿（検体番号40〜49）およびヘパリン投与患者血漿（検体番号50〜53）を用いた。
【００３３】
また、健常人血漿はジョージキングバイオメディカル社（USA）、アルファセラピューティック社(USA)から購入した。ＬＡ陽性患者血漿、ワーファリン投与患者血漿、ヘパリン投与患者血漿、凝固因子欠乏患者血漿は、ジョージキングバイオメディカル社（USA）、医学生物学研究所、American Diagnostic Inc (USA)、サンフコ社から購入した。
【００３４】
各試料について測定した凝固時間から、下式１で示す凝固時間比を算出した。
〔式１〕
凝固時間比 ＝（ｂ／ａ）／（ｄ／ｃ）＝ｂｃ／ａｄ
ここで、式１中のａ、ｂ、ｃ、およびｄは、下記に示す組み合わせで得られた測定値を表す。つまり、ａ：LA-Hの測定試料の秒数、ｂ；LA-Lの測定試料の秒数、ｃ；LA-Hの正常血漿の秒数、ｄ；LA-Lの正常血漿の秒数
各測定試料の凝固時間比を表１及び表２のHBR(-)として示した。また、凝固時間比が1.6以上のものをLA陽性(LA+)と判定した。
（比較例２）
【００３５】
市販のＬＡ測定試薬である希釈ラッセル蛇毒試薬（医学生物学研究所社製）およびSTACLOT-LA試薬（ロシュ社製）を用いて、LA陽性患者血漿(表1に示す検体番号1〜21)凝固時間の測定を行った。
希釈ラッセル蛇毒試薬を用た各LA陽性患者血漿の測定は、用法容量に従い凝固時間を測定し「凝固時間の比率」を算出することにより行った。その結果をdRVVTとして表1に示した。
また、STACLOT-LA試薬を用いた各LA陽性患者血漿の測定は、用法用量に従い凝固時間を測定し、「凝固時間の差」を算出することにより行った。
【００３６】
その結果をSTACLOTとして表1に示した。希釈ラッセル蛇毒試薬を用いて算出した凝固時間の比率が1.3以上のものをLA陽性と判定し、STACLOT-LA試薬を用いて算出した凝固時間の差が8秒以上のものを陽性と判定した
【００３７】
（実施例１）
上記比較例１の第１部分試薬に1mg/mLになるようにHBR(Scantibodies社製)を添加した以外は比較例１と同様に測定及び判定を行った。その結果を表１及び表２のHBR(+)として示した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
表1に示すようにdRVVT試薬およびSTACLOT試薬とも陽性である検体（検体番号1〜13）はHBR(-)、HBR(+)とも陽性であったが、dRVVTおよびSTACLOTのいずれか一方が陽性である弱陽性検体（検体番号14〜21）につてはHBR(-)の試薬では2検体のみ陽性であったが、HBR(+)の試薬は全て陽性であり、LAが弱陽性であっても検出することが明らかとなった。また、表２に示す健常人血漿（検体番号22〜29）、ワーファリン投与患者血漿（検体番号30〜39）、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿（検体番号40〜49）およびヘパリン投与患者血漿（検体番号50〜53）につてはHBR(-)、HBR(+)とも陰性と判定され特異的にLAを検出することが判明した。
【００４０】
（実施例２）
活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づく凝固時間測定試薬（３試薬系）を下記に示す方法により調製し、実施例１で作成した活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づく２試薬系の試薬との相関性を検討した。
【００４１】
つまり、LA-Hは第１部分試薬、第２部分試薬及び第３部分試薬からなり、LA-Lは第４部分試薬、第５部分試薬及び第６部分試薬からなる。第１部分試薬の各成分の濃度はヘペスが50mM、トリスが25mM、ＰＳが123μM、ＰＥが134μM、ＰＣが127μM、HBR(Scantibodies社製) が1mg/mLであり、各成分添加後のpHは7.35である。また、第４部分試薬の各成分の濃度はヘペスが50mM、トリスが25mM、ＰＳが12.3μM、ＰＥが13.4μM、ＰＣが38.2μMであり、各成分添加後のpHは7.35である。
また、エラグ酸濃度が0.1mMになるように精製水で調製したものを、第２部分試薬、第５部分試薬とした。
また、塩化カルシウム濃度が25mMになるように精製水で調製したものを、第３部分試薬、第６部分試薬とした。
【００４２】
測定試料をそれぞれ50μLづつ２セット準備し、一方のセットの各試料に、第１部分試薬（又は第４部分試薬）50μLを添加し37℃で1分間加温した後、第２部分試薬（又は第５部分試薬）を50μL添加し37℃で5分間加温、さらに、第３部分試薬（又は第６部分試薬）を50μL添加し、上記と同様に全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所株式会社）を用いて凝固時間を測定し、凝固時間比を算出した。
相関性の検討に用いた測定試料はLA陽性患者血漿18検体、健常人血漿32検体の合計50検体を用いた。
【００４３】
上記と同じ検体を実施例1で調製した２試薬系の試薬を用いて測定した、２試薬系の試薬と３試薬系の試薬のとの相関性を図1に示す。
図1に示すように２試薬系の試薬と３試薬系の試薬の相関性が認められ、３試薬系の試薬も２試薬系の試薬と同様に使用できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
以上説明したように、LA が弱陽性検体であっても特異的に検出できる試薬キットを提供することが可能となり、臨床検査の分野に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例２の活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づく３試薬系の凝固時間測定試薬と２試薬系の凝固時間測定試薬の相関性を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、in vitroでの血液検査でループスアンチコアグラント陽性疾患を特異的に検出できる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ループスアンチコアグラント（以下、LAと略記することがある）はSLE（Systemic Lupus Erythematosus）患者について初めて報告された抗凝血素である。SLE患者においてLAが検出される頻度は5％乃至10％である一方、他の自己免疫性疾患、腫瘍性疾患においても検出されることがある。LAは血栓症、流早産、血小板減少などの抗リン脂質抗体症候群(antiphospholipid syndrome；APS)において検出される頻度が高く、リン脂質依存性の凝固反応で凝固するまでの時間が延長されることから、リン脂質に対する自己抗体であると考えられている。
また、LAは不均一な抗体であり、陰性荷電リン脂質とβ２−グリコプロテインＩ（β２−ＧＰＩ）またはプロトロンビンとの複合体に対する抗体であることが、近年明らかになった。LAの抗凝固作用は、LAがこの複合体と結合することによりプロトロンビンがトロンビンに変化することを阻害するために起こると考えられる。
【０００３】
このような特徴を有するLAの検出試薬としては、 ホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第１凝固時間測定試薬とホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第２凝固時間測定試薬を備え、第１凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合が、第２凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合と異なっており、第１凝固時間測定試薬のホスファチジルセリン濃度が第２凝固時間測定試薬より高いことを特徴とするループスアンチコアグラント測定試薬が知られている(特許文献１)。この特許文献１にはヘパリン投与患者血漿やワーファリン投与患者血漿とは区別することができるLA測定試薬が開示されている。
一方、LAの検査ではLA弱陽性検体についても検出できる検出感度の高い試薬が望まれているが、特許文献１には、LA弱陽性検体に対する検出感度の向上については記載がない。
【０００４】
【特許文献１】特開2004-69697号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、LAの検出感度を高め、LA 弱陽性検体であっても特異的に検出できる試薬キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬とを備えたループスアンチコアグラント検出試薬キットにおいて、第１凝固時間測定試薬が、リン脂質としてのホスファチジルセリンと、カルシウムイオンと、ヒトを除く脊椎動物の抗体、血清、血漿及び免疫グロブリンから成る群より選ばれる少なくとも１種の非ヒト由来物質とを含有し、第２凝固時間測定試薬が、カルシウムイオンと、第１凝固時間測定試薬より低濃度のホスファチジルセリンとを含有することを特徴とするループスアンチコアグラント検出試薬キットに関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の試薬キットでは、LAに対して特異的に凝固時間の差異を認めることができ、LA陽性患者だけを高感度に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の実施形態の検出試薬キットは、血液又は血漿検体におけるループスアンチコアグラントが弱陽性検体であっても特異的に検出できる試薬キットである。
【０００９】
本発明の実施形態の検出試薬キットは、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬とを備えたループスアンチコアグラント検出試薬キットにおいて、第１凝固時間測定試薬が、リン脂質としてのホスファチジルセリンと、カルシウムイオンと、ヒトを除く脊椎動物の抗体、血清、血漿及び免疫グロブリンから成る群より選ばれる少なくとも１種の非ヒト由来物質とを含有し、第２凝固時間測定試薬が、カルシウムイオンと、第１凝固時間測定試薬より低濃度のホスファチジルセリンとを含有２種類の凝固時間測定試薬の組合せである。
【００１０】
上記第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬にリン脂質として含有されるホスファチジルセリン（以下、PSと略記することがある）は、合成ホスファチジルセリンであってもよいし、天然由来ホスファチジルセリンであってもよい。ホスファチジルセリンは合成ホスファチジルセリンであることが好ましい。天然由来のホスファチジルセリンを用いる場合には、純度99％以上に精製されたものを用いることが好ましい。
【００１１】
ホスファチジルセリン以外のリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン（以下、PEと略記することがある）及びホスファチジルコリン（以下、PCと略記することがある）を挙げることができる。
【００１２】
ループスアンチコアグラントを捕捉するために含有されるヒトを除く脊椎動物の抗体、血清、血漿又は免疫グロブリン（以下、これらを区別せず、総称して述べるときは「非ヒト由来物質」という）としては、好ましくはヒト及びブタを除くほ乳類の抗体、血清又は免疫グロブリンが用いられ、具体的には、マウスIgG、ウマIgG、ウシIgG、マウス血清、ウマ血清、ウシ血清、マウス、ウマ又はウシのα−グロブリンなどを用いることができる。市販品としては、Scantibodies社製のHBR(Heterophile Blocking Reagent) や、MAK33 (ロッシュ社製)、NM8などがある。HBRは、免疫測定方法における異好性抗体による干渉を抑制することを目的として検査系に添加される試薬であるが、本発明者により、LAに特異的に結合し、しかも、血液検体中に含まれるLA以外の血液凝固時間に関連する成分とは結合しないことが見出され、本発明の凝固時間測定試薬におけるLA抗体捕捉剤としての使用が可能となった。
【００１３】
LAを捕捉するために含有される非ヒト由来物質としては、１種類の動物由来の抗体等だけを用いてもよいし、異なる２種以上の動物由来の抗体等、例えばマウスIgGとウマIgGを混合して用いてもよい。
【００１４】
第２凝固時間測定試薬には、LA捕捉剤となる非ヒト由来物質が実質的に含まれず、また好ましくは非ヒト由来物質が含まれていないので、LA陽性の検体では、LAの存在により、凝固時間が延長される。一方、第１凝固時間測定試薬と検体を接触させた場合には、第１凝固時間測定試薬に含まれる非ヒト由来物質により、LAが捕捉されるので、LA陽性の検体であっても、LAの存在による凝固時間の延長が阻止される。従って、第１凝固時間測定試薬を用いたときの凝固時間（第１凝固時間）と第２凝固時間測定試薬を用いたときの凝固時間（第２凝固時間）との間で有意な差異が認められればLA陽性であり、有意な差異が認められなければ、LA陰性と判定できる。
【００１５】
第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬には、さらに、in vitroで血液凝固を起こすのに必要な他の成分を含んでもよい。他の成分としては、例えば、活性化剤、蛇毒、カルシウム、組織因子などが挙げられる。活性化剤としては、エラグ酸、カオリン、セライト及コロイドシリカからなる群より選択される１種以上を用いることが好ましい。蛇毒としては、ラッセル蛇毒、テキスタリン蛇毒及びエカリン蛇毒からなる群より選択される１種以上を用いることが好ましい。組織因子としては、ウサギ脳、ヒト胎盤由来のもの、これらの組換え体を用いることが好ましい。
これらの他の成分は、凝固時間測定試薬の種類に応じて適宜選択される。例えば、第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬がカルシウム及び活性化剤を含む場合には活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づいて凝固時間を測定する。第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬がカルシウム及び蛇毒を含む場合には、蛇毒測定時間の原理に基づいて凝固時間を測定する。また、第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬がカルシウム及び組織因子を含む場合には、プロトロンビン時間測定の原理に基づいて凝固時間を測定する。
【００１６】
尚、第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬には、さらに必要に応じて、ヘペスおよびトリス緩衝液などの緩衝液を含んでもよい。緩衝液の濃度は、一般的に臨床化学の分野で用いられている濃度であればよく、簡単な繰り返し実験により決定することができる。
【００１７】
第１凝固時間測定試薬に含まれる凝固系組成物と、第２凝固時間測定試薬に含まれる凝固系組成物とは同種でなければならない。つまり、第１凝固時間測定試薬に含まれる凝固系組成物が活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づいて凝固時間を測定する場合には、第２凝固時間測定試薬に含まれる凝固系組成物も活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づいて凝固時間を測定する。
【００１８】
また、検出試薬キットを第１部分試薬と第２部分試薬からなる第１凝固時間測定試薬と、第３部分試薬と第４部分試薬からなる第２凝固時間測定試薬とで構成するようにしてもよい。
このとき、活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づいて凝固時間を測定する場合には第１部分試薬および第３部分試薬にはリン脂質及び活性化剤が含有され、２部分試薬および第４部分試薬にはカルシウムイオンが含まれる。
また、蛇毒測定時間の原理に基づいて凝固時間を測定する場合には第１部分試薬および第３部分試薬にはリン脂質及び蛇毒が含有され、２部分試薬および第４部分試薬には、カルシウムイオンが含まれる。
さらに、プロトロンビン時間測定の原理に基づいて凝固時間を測定する場合には第１部分試薬および第３部分試薬にはリン脂質及び組織因子が含有され、２部分試薬および第４部分試薬には、カルシウムイオンが含まれる。
なお、上記第１部分試薬には非ヒト由来物質を含有してもよい。
【００１９】
さらに、検出試薬キットを第１部分試薬、第２部分試薬及び第３部分試薬からなる第１凝固時間測定試薬と、第４部分試薬と第５部分試薬及び第６部分試薬からなる第２凝固時間測定試薬とで構成するようにしてもよい。
このとき、活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づいて凝固時間を測定する場合には第１部分試薬および第４部分試薬にはリン脂質が含有され、第２部分試薬及び第５部分試薬には活性化剤が含有され、第３部分試薬および第６部分試薬にはカルシウムイオンが含まれる。
また、蛇毒測定時間の原理に基づいて凝固時間を測定する場合には第１部分試薬および第４部分試薬にはリン脂質が含有され、第２部分試薬及び第５部分試薬には蛇毒が含有され、第３部分試薬および第６部分試薬にはカルシウムイオンが含まれる。
さらに、プロトロンビン時間測定の原理に基づいて凝固時間を測定する場合には第１部分試薬および第４部分試薬にはリン脂質が含有され、第２部分試薬及び第５部分試薬には組織因子が含有され、第３部分試薬および第６部分試薬にはカルシウムイオンが含まれる。
なお、上記第１部分試薬には非ヒト由来物質を含有してもよい。
【００２０】
第１凝固時間測定試薬および第２凝固時間測定試薬のリン脂質の含有量は、検体と第１凝固時間測定試薬または第２凝固時間測定試薬を等量混合して（検体50μＬと第１凝固時間測定試薬または第２凝固時間測定試薬を50μＬ混合する場合）、凝固時間測定する測定方法においては、第１凝固時間測定試薬中のホスファチジルセリン含有量は35〜370μM、好ましくは60〜250μMであり、ホスファチジルエタノールアミン含有量は40〜410μM、好ましくは65〜270μMであり、ホスファチジルコリン含有量は35〜385μM、好ましくは60〜255μMである。さらに、非ヒト由来物質の含有量は、被検体 1mL当たり0.1〜50mg、好ましくは0.2〜10mg、より好ましくは0.5〜6mgとなる量を含有させることが好ましい。測定試料1mLあたり、0.1mg以下では、LA陽性の検体の場合に、LAの捕捉が不十分となり、捕捉されなかったLAにより凝固時間の延長が認められるからである。
また、第２凝固時間測定試薬中のホスファチジルセリン含有量は1〜25μM、好ましくは5〜20μMであり、ホスファチジルエタノールアミン含有量は1〜30μM、好ましくは5〜20μMであり、ホスファチジルコリン含有量は10〜150μM、好ましくは25〜65μMである。
【００２１】
ホスファチジルセリンは上記記載の濃度の範囲内で使用することができ、第１凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合が、第２凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合と異なるものが好ましく、第１凝固時間測定試薬のホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合が第２凝固時間測定試薬のホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合より大きいことが好ましい。
【００２２】
上記リン脂質の濃度は検体50μＬと第１凝固時間測定試薬または第２凝固時間測定試薬を50μＬ混合する場合の濃度を記載したが、検体と凝固時間測定試薬との混合割合が異なる場合、検体と第１凝固時間測定試薬または第２凝固時間測定試薬とを混合した後のリン脂質の終濃度が上記の場合と同様の範囲となるようにすれればよい。
【００２３】
また、前記第１凝固時間測定試薬が第１部分試薬と第２部分試薬との組合せからなり、前記第２凝固時間測定試薬も第３部分試薬と第４部分試薬との組合せからなる場合、第１部分試薬および第３部分試薬のリン脂質の含有量は、検体と第１部分試薬または第３部分試薬を等量混合して、凝固時間測定する測定方法においては、第１部分試薬中のホスファチジルセリン含有量はホスファチジルセリン含有量は35〜370μM、好ましくは60〜250μMであり、ホスファチジルエタノールアミン含有量は40〜410μM、好ましくは65〜270μMであり、ホスファチジルコリン含有量は35〜385μM、好ましくは60〜255μMである。さらに、非ヒト由来物質の含有量は、被検体 1mL当たり0.1〜50mg、好ましくは0.2〜10mg、より好ましくは0.5〜6mgとなる量を含有させることが好ましい。測定試料1mLあたり、0.1mg以下では、LAの検体の場合に、LAの捕捉が不十分となり、捕捉されなかったLAにより凝固時間の延長が認められるからである。
また、第３部分試薬のホスファチジルセリン含有量は1〜25μM、好ましくは5〜20μMであり、ホスファチジルエタノールアミン含有量は1〜30μM、好ましくは5〜20μMであり、ホスファチジルコリン含有量は10〜150μM、好ましくは25〜65μMである。
【００２４】
前記第１凝固時間測定試薬が第１部分試薬、第２部分試薬及び第３部分試薬との組合せからなり、前記第２凝固時間測定試薬も第４部分試薬、第５部分試薬及び第６部分試薬との組合せからなる場合、第１部分試薬および第４部分試薬のリン脂質の含有量は、検体と第１部分試薬または第４部分試薬を等量混合して、凝固時間測定する測定方法においては、第１部分試薬中のホスファチジルセリン含有量は35〜370μM、好ましくは60〜250μMであり、ホスファチジルエタノールアミン含有量は40〜410μM、好ましくは65〜270μMであり、ホスファチジルコリン含有量は35〜385μM、好ましくは60〜255μMである。さらに、非ヒト由来物質の含有量は、被検体 1mL当たり0.1〜50mg、好ましくは0.2〜10mg、より好ましくは0.5〜6mgとなる量を含有させることが好ましい。測定試料1mLあたり、0.1mg以下では、LA陽性の検体の場合に、LAの捕捉が不十分となり、捕捉されなかったLAにより凝固時間の延長が認められるからである。
また、第４部分試薬のホスファチジルセリン含有量は1〜25μM、好ましくは5〜20μMであり、ホスファチジルエタノールアミン含有量は1〜30μM、好ましくは5〜20μMであり、ホスファチジルコリン含有量は10〜150μM、好ましくは25〜65μMである。
【００２５】
次に、上記構成を有する本発明の試薬キットを用いて、LAを検出する方法について説明する。
まず検体試料を２つに分け、一方には高濃度のPSを含む第１凝固時間測定試薬を添加し、もう一方の検体試料には、低濃度のPSを含む第２凝固時間測定試薬を添加する。
また、第１凝固時間測定試薬がそれぞれ第１部分試薬と第２部分試薬とに分かれている場合には、検体と第１部分試薬とを混合してから第２部分試薬を添加する。
さらに、第１凝固時間測定試薬が第１部分試薬、第２部分試薬および第３部分試薬に分かれている場合には、検体と第１部分試薬とを混合し、第２部分試薬、第３部分試薬の順に試薬を添加する。
検体に各試薬を添加した後、試料の凝固時間を測定する。凝固時間の測定は、当業者に公知の方法で行えばよく、公知の自動測定装置を用いて測定してもよい。
【００２６】
ここで、LA検出に用いる試料としては、血液をそのまま用いるよりも血漿を用いることが好ましく、より好ましくは血小板除去血漿を用いることが好ましい。また、試料に、正常血漿または正常血小板除去正常血漿を混合したものを用いてもよい。正常血漿を混合しておくことにより、凝固因子欠損に基づく凝固時間の延長を防止するが可能となり、LAの感度が高まるからである。試料と正常血漿の混合する場合の混合比は、一般的に４：１乃至１：４であり、好ましくは１：１である。
【００２７】
本発明の試薬キットを用いた凝固検査では、LA陽性患者、血液凝固因子欠損患者、ワーファリン投与患者、ヘパリン投与患者などの抗凝血疾患由来の試料の凝固時間は、正常血漿の凝固時間よりも長くなる。さらに、LA陽性患者検体については、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬による凝固時間の差異も認められる。すなわち、LA陽性患者由来の試料では、高濃度のPSを含む第１凝固時間測定試薬を用いたときの凝固時間よりも、低濃度のPSを含む第２凝固時間測定試薬を用いたときの凝固時間の方が長くなる。一方、血液凝固因子欠損患者、ワーファリン投与患者、ヘパリン投与患者由来の試料では、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬との間で、凝固時間の顕著な差異は認められない。従って、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬との凝固時間の差異に基づいて、LAを特異的に検出することができる。
【００２８】
LAの検出は、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬の差異によって判定することができるが、より精度よく判定するためには、正常血漿の凝固時間に対する患者由来の試料の凝固時間の比、例えばRosner Index(E.Rosner,et al.,Thromb.Haemast.1987,57:144-149）またはLupus Ratio(LR)（R.Schjetlein,et al.,Thromb.Res.1993,69:239-250）、LRと同じ原理ではあるが、検体と正常血漿の混合しない凝固時間比により、判定を行うことが好ましい。
正常血漿の場合、PS含有率は凝固時間に影響を及ぼさないので、第１凝固時間試薬と第２凝固時間試薬の比に該当するLR値は１程度である。また、血液凝固因子欠損患者、ワーファリン投与患者、またはヘパリン投与患者由来の場合であっても、正常血漿と比べて凝固時間は延長されるものの、PS濃度差による凝固時間の差はほとんど認められないため、LR値は１程度となる。これに対して、LA陽性の場合には、第１凝固時間測定試薬、第２凝固時間測定試薬の各濃度、組合わせにもよるが、第２凝固時間測定試薬の方が第１凝固時間測定試薬よりも凝固時間が延びるために、LR値を比較することによりLA陽性患者由来の試料を自動的に検出することができる。
【実施例】
【００２９】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
（比較例１）
【００３０】
活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づくループスアンチコアグラント測定試薬（２試薬系）を下記に示す方法により調製した。
つまり、LA-Hは第１部分試薬と第２部分試薬とからなり、LA-Lは第３部分試薬と第４部分試薬とからなり、第１部分試薬の各成分の濃度はヘペスが50mM、エラグ酸が0.1mM、トリスが25mM、ＰＳが123μM、ＰＥが134μM、ＰＣが127μMであり、各成分添加後のpHは7.35ある。また、第３部分試薬の各成分の濃度はヘペスが50mM、エラグ酸が0.1mM、トリスが25mM、ＰＳが12.3μM、ＰＥが13.4μM、ＰＣが38.2μMであり、各成分添加後のpHは7.35である。
また、塩化カルシウム濃度が25mMになるように精製水で調製したものを、第２部分試薬、第４部分試薬とした。
【００３１】
正常血漿及び測定試料をそれぞれ50μLづつ２セット準備し、一方のセットの各試料に、第１部分試薬（又は第３部分試薬）50μLを添加し、37℃に5分間加温した後、各試料に第２部分試薬（又は第４部分試薬）を50μL添加し、凝固時間を測定した。 凝固時間の測定は全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所株式会社）を用いて、凝固時間を測定した。測定は２回行い、平均値を求めた。
【００３２】
正常血漿としてはコアグトロールN(シスメックス社製)を使用し、測定試料としては表１に示すLA陽性患者血漿(検体番号1〜21)、また、表２に示す健常人血漿（検体番号22〜29）、ワーファリン投与患者血漿（検体番号30〜39）、第ＶＩＩＩ因子欠乏患者血漿（検体番号40〜49）およびヘパリン投与患者血漿（検体番号50〜53）を用いた。
【００３３】
また、健常人血漿はジョージキングバイオメディカル社（USA）、アルファセラピューティック社(USA)から購入した。ＬＡ陽性患者血漿、ワーファリン投与患者血漿、ヘパリン投与患者血漿、凝固因子欠乏患者血漿は、ジョージキングバイオメディカル社（USA）、医学生物学研究所、American Diagnostic Inc (USA)、サンフコ社から購入した。
【００３４】
各試料について測定した凝固時間から、下式１で示す凝固時間比を算出した。
〔式１〕
凝固時間比 ＝（ｂ／ａ）／（ｄ／ｃ）＝ｂｃ／ａｄ
ここで、式１中のａ、ｂ、ｃ、およびｄは、下記に示す組み合わせで得られた測定値を表す。つまり、ａ：LA-Hの測定試料の秒数、ｂ；LA-Lの測定試料の秒数、ｃ；LA-Hの正常血漿の秒数、ｄ；LA-Lの正常血漿の秒数
各測定試料の凝固時間比を表１及び表２のHBR(-)として示した。また、凝固時間比が1.6以上のものをLA陽性(LA+)と判定した。
（比較例２）
【００３５】
市販のＬＡ測定試薬である希釈ラッセル蛇毒試薬（医学生物学研究所社製）およびSTACLOT-LA試薬（ロシュ社製）を用いて、LA陽性患者血漿(表1に示す検体番号1〜21)凝固時間の測定を行った。
希釈ラッセル蛇毒試薬を用た各LA陽性患者血漿の測定は、用法容量に従い凝固時間を測定し「凝固時間の比率」を算出することにより行った。その結果をdRVVTとして表1に示した。
また、STACLOT-LA試薬を用いた各LA陽性患者血漿の測定は、用法用量に従い凝固時間を測定し、「凝固時間の差」を算出することにより行った。
【００３６】
その結果をSTACLOTとして表1に示した。希釈ラッセル蛇毒試薬を用いて算出した凝固時間の比率が1.3以上のものをLA陽性と判定し、STACLOT-LA試薬を用いて算出した凝固時間の差が8秒以上のものを陽性と判定した
【００３７】
（実施例１）
上記比較例１の第１部分試薬に1mg/mLになるようにHBR(Scantibodies社製)を添加した以外は比較例１と同様に測定及び判定を行った。その結果を表１及び表２のHBR(+)として示した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
表1に示すようにdRVVT試薬およびSTACLOT試薬とも陽性である検体（検体番号1〜13）はHBR(-)、HBR(+)とも陽性であったが、dRVVTおよびSTACLOTのいずれか一方が陽性である弱陽性検体（検体番号14〜21）につてはHBR(-)の試薬では2検体のみ陽性であったが、HBR(+)の試薬は全て陽性であり、LAが弱陽性であっても検出することが明らかとなった。また、表２に示す健常人血漿（検体番号22〜29）、ワーファリン投与患者血漿（検体番号30〜39）、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿（検体番号40〜49）およびヘパリン投与患者血漿（検体番号50〜53）につてはHBR(-)、HBR(+)とも陰性と判定され特異的にLAを検出することが判明した。
【００４０】
（実施例２）
活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づく凝固時間測定試薬（３試薬系）を下記に示す方法により調製し、実施例１で作成した活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づく２試薬系の試薬との相関性を検討した。
【００４１】
つまり、LA-Hは第１部分試薬、第２部分試薬及び第３部分試薬からなり、LA-Lは第４部分試薬、第５部分試薬及び第６部分試薬からなる。第１部分試薬の各成分の濃度はヘペスが50mM、トリスが25mM、ＰＳが123μM、ＰＥが134μM、ＰＣが127μM、HBR(Scantibodies社製) が1mg/mLであり、各成分添加後のpHは7.35である。また、第４部分試薬の各成分の濃度はヘペスが50mM、トリスが25mM、ＰＳが12.3μM、ＰＥが13.4μM、ＰＣが38.2μMであり、各成分添加後のpHは7.35である。
また、エラグ酸濃度が0.1mMになるように精製水で調製したものを、第２部分試薬、第５部分試薬とした。
また、塩化カルシウム濃度が25mMになるように精製水で調製したものを、第３部分試薬、第６部分試薬とした。
【００４２】
測定試料をそれぞれ50μLづつ２セット準備し、一方のセットの各試料に、第１部分試薬（又は第４部分試薬）50μLを添加し37℃で1分間加温した後、第２部分試薬（又は第５部分試薬）を50μL添加し37℃で5分間加温、さらに、第３部分試薬（又は第６部分試薬）を50μL添加し、上記と同様に全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所株式会社）を用いて凝固時間を測定し、凝固時間比を算出した。
相関性の検討に用いた測定試料はLA陽性患者血漿18検体、健常人血漿32検体の合計50検体を用いた。
【００４３】
上記と同じ検体を実施例1で調製した２試薬系の試薬を用いて測定した、２試薬系の試薬と３試薬系の試薬のとの相関性を図1に示す。
図1に示すように２試薬系の試薬と３試薬系の試薬の相関性が認められ、３試薬系の試薬も２試薬系の試薬と同様に使用できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
以上説明したように、LA が弱陽性検体であっても特異的に検出できる試薬キットを提供することが可能となり、臨床検査の分野に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例２の活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づく３試薬系の凝固時間測定試薬と２試薬系の凝固時間測定試薬の相関性を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬とを備えたループスアンチコアグラント検出試薬キットにおいて、
第１凝固時間測定試薬が、リン脂質としてのホスファチジルセリンと、カルシウムイオンと、ヒトを除く脊椎動物の抗体、血清、血漿及び免疫グロブリンから成る群より選ばれる少なくとも１種の非ヒト由来物質とを含有し、
第２凝固時間測定試薬が、カルシウムイオンと、第１凝固時間測定試薬より低濃度のホスファチジルセリンとを含有することを特徴とするループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項２】
第１および第２凝固時間測定試薬が、リン脂質として、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンを含有する請求項１記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項３】
第１凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合が、第２凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合と異なっている請求項１または請求項２に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項４】
前記第１凝固時間測定試薬および前記第２凝固時間測定試薬が活性化剤を含有する請求項１〜３の何れか１項に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項５】
前記第１凝固時間測定試薬および前記第２凝固時間測定試薬が蛇毒を含有する請求項１〜３の何れか１項に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項６】
前記第１凝固時間測定試薬および前記第２凝固時間測定試薬が組織因子を含有する請求項１〜３の何れか１項に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項７】
前記第１凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン及び非ヒト由来物質を含有する第１部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第２部分試薬とからなり、前記第２凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリンを含有する第３部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第４部分試薬とからなる請求項１〜３の何れか１項に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項８】
前記第１凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン、活性化剤及び非ヒト由来物質を含有する第１部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第２部分試薬とからなり、前記第２凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン及び活性化剤を含有する第３部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第４部分試薬とからなる請求項４に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項９】
前記第１凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン、蛇毒及び非ヒト由来物質を含有する第１部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第２部分試薬とからなり、前記第２凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン及び蛇毒を含有する第３部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第４部分試薬とからなる請求項５に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１０】
前記第１凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン、組織因子及び非ヒト由来物質を含有する第１部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第２部分試薬とからなり、前記第２凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン及び組織因子を含有する第３部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第４部分試薬とからなる請求項６に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１１】
前記第１部分試薬及び第３部分試薬が、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンを含有する請求項７〜１０の何れか１項に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１２】
前記第１凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン及び非ヒト由来物質を含有する第１部分試薬と、活性化剤を含有する第２部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第３部分試薬とからなり、前記第２凝固時間測定試薬がホスファチジルセリンを含有する第４部分試薬と、活性化剤を含有する第５部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第６部分試薬とからなる請求項４に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１３】
前記第１凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン及び非ヒト由来物質を含有する第１部分試薬と、蛇毒を含有する第２部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第３部分試薬とからなり、前記第２凝固時間測定試薬がホスファチジルセリンを含有する第４部分試薬と、蛇毒を含有する第５部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第６部分試薬とからなる請求項５に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１４】
前記第１凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン及び非ヒト由来物質を含有する第１部分試薬と、組織因子を含有する第２部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第３部分試薬とからなり、前記第２凝固時間測定試薬がホスファチジルセリンを含有する第４部分試薬と、組織因子を含有する第５部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第６部分試薬とからなる請求項６に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１５】
前記第１部分試薬及び第４部分試薬が、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンを含有する請求項１２〜１４の何れか１項に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１６】
前記活性化剤がエラグ酸、カオリン、セライト及びコロイドシリカからなる群より選択される１以上の活性化剤である請求項４、８または１２に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１７】
前記蛇毒がラッセル蛇毒、テキスタリン蛇毒及びエカリン蛇毒からなる群より選択される１以上の蛇毒である請求項５、９または１３に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１８】
前記組織因子がウサギ脳由来またはヒト胎盤由来のものである請求項６、１０または１４に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１】
第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬とを備えたループスアンチコアグラント検出試薬キットにおいて、
第１凝固時間測定試薬が、リン脂質としてのホスファチジルセリンと、カルシウムイオンと、ヒトを除く脊椎動物の抗体、血清、血漿及び免疫グロブリンから成る群より選ばれる少なくとも１種の非ヒト由来物質とを含有し、
第２凝固時間測定試薬が、カルシウムイオンと、第１凝固時間測定試薬より低濃度のホスファチジルセリンとを含有することを特徴とするループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項２】
第１および第２凝固時間測定試薬が、リン脂質として、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンを含有する請求項１記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項３】
第１凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合が、第２凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合と異なっている請求項１または請求項２に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項４】
前記第１凝固時間測定試薬および前記第２凝固時間測定試薬が活性化剤を含有する請求項１〜３の何れか１項に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項５】
前記第１凝固時間測定試薬および前記第２凝固時間測定試薬が蛇毒を含有する請求項１〜３の何れか１項に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項６】
前記第１凝固時間測定試薬および前記第２凝固時間測定試薬が組織因子を含有する請求項１〜３の何れか１項に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項７】
前記第１凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン及び非ヒト由来物質を含有する第１部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第２部分試薬とからなり、前記第２凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリンを含有する第３部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第４部分試薬とからなる請求項１〜３の何れか１項に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項８】
前記第１凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン、活性化剤及び非ヒト由来物質を含有する第１部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第２部分試薬とからなり、前記第２凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン及び活性化剤を含有する第３部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第４部分試薬とからなる請求項４に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項９】
前記第１凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン、蛇毒及び非ヒト由来物質を含有する第１部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第２部分試薬とからなり、前記第２凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン及び蛇毒を含有する第３部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第４部分試薬とからなる請求項５に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１０】
前記第１凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン、組織因子及び非ヒト由来物質を含有する第１部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第２部分試薬とからなり、前記第２凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン及び組織因子を含有する第３部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第４部分試薬とからなる請求項６に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１１】
前記第１部分試薬及び第３部分試薬が、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンを含有する請求項７〜１０の何れか１項に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１２】
前記第１凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン及び非ヒト由来物質を含有する第１部分試薬と、活性化剤を含有する第２部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第３部分試薬とからなり、前記第２凝固時間測定試薬がホスファチジルセリンを含有する第４部分試薬と、活性化剤を含有する第５部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第６部分試薬とからなる請求項４に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１３】
前記第１凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン及び非ヒト由来物質を含有する第１部分試薬と、蛇毒を含有する第２部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第３部分試薬とからなり、前記第２凝固時間測定試薬がホスファチジルセリンを含有する第４部分試薬と、蛇毒を含有する第５部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第６部分試薬とからなる請求項５に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１４】
前記第１凝固時間測定試薬が、ホスファチジルセリン及び非ヒト由来物質を含有する第１部分試薬と、組織因子を含有する第２部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第３部分試薬とからなり、前記第２凝固時間測定試薬がホスファチジルセリンを含有する第４部分試薬と、組織因子を含有する第５部分試薬と、カルシウムイオンを含有する第６部分試薬とからなる請求項６に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１５】
前記第１部分試薬及び第４部分試薬が、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンを含有する請求項１２〜１４の何れか１項に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１６】
前記活性化剤がエラグ酸、カオリン、セライト及びコロイドシリカからなる群より選択される１以上の活性化剤である請求項４、８または１２に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１７】
前記蛇毒がラッセル蛇毒、テキスタリン蛇毒及びエカリン蛇毒からなる群より選択される１以上の蛇毒である請求項５、９または１３に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【請求項１８】
前記組織因子がウサギ脳由来またはヒト胎盤由来のものである請求項６、１０または１４に記載のループスアンチコアグラント検出試薬キット。
【図１】
【公開番号】特開２００６−１３３００２（Ｐ２００６−１３３００２Ａ）
【公開日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３２００８５（Ｐ２００４−３２００８５）
【出願日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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