ワクチン投与の方法、新たなネコカリシウイルス、ならびにネコパルボウイルスおよびネコヘルペスウイルスに対して動物を免疫感作する治療
【課題】ネコウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンの提供。
【解決手段】ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質がＦＣＶ−４９株由来のタンパク質配列を含むワクチン。ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、前記キャプシドタンパク質が、特定のタンパク質配列または少なくとも約９２．７％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、免疫応答を生じさせるのに有効な量提供されるワクチン。
【解決手段】ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質がＦＣＶ−４９株由来のタンパク質配列を含むワクチン。ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、前記キャプシドタンパク質が、特定のタンパク質配列または少なくとも約９２．７％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、免疫応答を生じさせるのに有効な量提供されるワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々のワクチンを種々の動物に投与する新たな方法の提供に関する。本発明は、いくつかの単離ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）を開示する。本発明は、ＦＣＶワクチンをネコに与える新たな方法を開示する。本発明はまた、ネコカリシウイルスをコードする核酸クローンにも関する。本発明は、ＦＣＶキャプシドタンパク質、生または死滅ワクチン、キャプシドタンパク質を含むサブユニットワクチン、核酸ワクチン、および単離ネコカリシウイルスのキャプシドタンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスベクターワクチンに関する。本発明はまた、ワクチン組成物の作製に有用なネコカリシウイルスを同定する方法、およびネコカリシウイルスに感染したネコを診断するアッセイにも関する。本発明はまた、新たなＦＣＶワクチンおよび古いＦＣＶワクチンをネコ科動物に投与する新たな方法をも提供する。
【背景技術】
【０００２】
カリシウイルスは、ネコにおける疾患の重要な原因であることが報告されている。発熱、鼻炎、くしゃみ、軽度の結膜炎、眼漏、外鼻孔、口腔粘膜中または舌上の小疱、肺炎、気管気管支炎（ｔｒａｃｈｅａｌ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、下痢、筋肉痛、こわばった口（ｓｔｉｆｆ ｇａｔｅ）や知覚過敏などの多様な症状が観察される。日和見細菌感染はしばしばＦＣＶ感染を伴い、それによって治療および回復が複雑となる。重度のＦＣＶ感染により、特に幼若なネコで死に至る可能性がある。そのような徴候は、報告によれば自然の場合では一般的であるが、実験的感染ではいつも顕著であるというわけではないことに留意されたい。ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）の種々の野外株が疾患を引き起こすその潜在性において異なり、または他の作用物質との同時感染が疾患の症状に影響を及ぼすように思われる。
【０００３】
ネコカリシウイルスに対するワクチンは、２０年を超える期間利用可能であった。多数のＦＣＶ血清型が存在するが、Ｆ９などの特定の株は、広範囲のＦＣＶ株に対して抗体を誘導することが分かった。Ｊ．Ｌ．ＢｉｔｔｌｅおよびＷ．Ｊ．Ｒｕｂｉｃ、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．、３７：２７５〜７８（１９７６）を参照されたい。結果的に、ネコカリシウイルスに対する最も初期のワクチンでは、改変型または弱毒化型のＦＣＶ−Ｆ９株が使用された。参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＪ．Ｌ．ＢｉｔｔｌｅおよびＷ．Ｊ．Ｒｕｂｉｃの米国特許第３，９３７，８１２号を参照されたい。
【０００４】
ＦＣＶ−Ｆ９由来のワクチンおよび他の市販されているワクチンは多数の野外単離物からの防御をもたらすが、これらのワクチンがすべての株の感染を防止することは真実ではない。さらに、ＦＣＶが進化し続けるにつれて、ＦＣＶ−Ｆ９に基づくワクチンは、ますます少数の野外単離物に対してしか防御をもたらさなくなる（Ｌａｕｒｉｔｚｅｎら、１９９７、Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５６：５５〜６３）。さらに、獣医は、単一の血清型に基づくワクチンの効果に対して懸念を示している。実際、野外研究から、ＦＣＶ−Ｆ９株に由来するワクチンがネコカリシウイルスの多数の株に対して不十分な免疫しかもたらさないことが示唆される。例えば、Ｎ．Ｃ．Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、Ｆｅｌｉｎｅ Ｐｒａｃｔ．、１３（１）：２６〜３５（１９８３）；Ｓ．Ｄａｗｓｏｎら、Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１３２：３４６〜５０（１９９３）を参照されたい。獣医にはまた、ある状況では、そうでなければ健康な動物に疾患を引き起こす可能性がある改変型生ウイルスの投与についての懸念も起こっている。研究者は、皮下投与するＦＣＶワクチンの不注意な経口投与により急性疾患が生じることを報告している。Ｒ．Ｃ．Ｐｏｖｅｙ、Ｆｅｌｉｎｅ Ｐｒａｃｔ．、７（５）：１２〜１６（１９７７）を参照されたい。したがって、それ自体でまたは他のワクチンと組み合わせるとネコへのワクチン接種後に所望の防御をもたらすワクチンの開発には引き続き関心がある。ネコから単離されたいくつかの単離物を本明細書に記載し、免疫感作したネコにおいて広い防御をもたらす手段を提供する。
【０００５】
情報の開示
米国特許文献
３９３７８１２ １９７６年２月 Ｂｉｔｔｌｅら、３９４４４６９ １９７６年３月 Ｂｉｔｔｌｅら
４４８６５３０ １９８４年１２月 Ｄａｖｉｄら、４７８６５８９ １９８８年１１月 Ｒｏｕｎｄｓら、
５１６９７８９ １９９２年１２月 Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、５２２９２９３ １９９３年７月 Ｍａｔｓｕｕｒａら
５２６６３１３ １９９３年１１月 Ｅｓｐｏｓｉｔｏら、５３３８６８３ １９９４年８月 Ｐａｏｌｅｔｔｉら
５４９４８０７ １９９６年２月 Ｐａｏｌｅｔｔｉら、５５５９０４１ １９９６年９月 Ｋａｎｇら
５５６１０６４ １９９６年１０月 Ｍａｒｑｕｅｔら、５５８０８５９ １９９６年１２月 Ｆｅｌｇｎｅｒ
５５８５１００ １９９６年１２月 Ｍｏｎｄら、５５８９３８４ １９９６年１２月 Ｌｉｓｃｏｍｂｅ
５５８９４６６ １９９６年１２月 Ｆｅｌｇｎｅｒ、５６２０８４５ １９９７年４月 Ｇｏｕｌｄら
５６５６４４８ １９９７年８月 Ｋａｎｇら、５６９３７６１ １９９７年１２月 Ｑｕｅｅｎら
５６９３７６２ １９９７年１２月 Ｑｕｅｅｎら、５６９５９２８ １９９７年１２月 Ｓｔｅｗａｒｔら
５７０３０５５ １９９７年１２月 Ｆｅｌｇｎｅｒ、５７１６７８４ １９９８年２月 ＤｉＣｅｓａｒｅ
５７１６８２２ １９９８年２月 Ｗａｒｄｌｅｙ、５７１８９０１ １９９８年２月 Ｗａｒｄｌｅｙ
５７２５８６３ １９９８年３月 Ｄａｎｉｅｌｓら、５７２８５８７ １９９８年３月 Ｋａｎｇら
５８００８２１ １９９８年９月 Ａｃｈｅｓｏｎら、５９７７３２２ １９９９年１１月 Ｍａｒｋｓら
６０１０７０３ ２０００年１月 Ｍａｅｓら、６３５５２４６ ２００２年３月 Ｋｒｕｇｅｒら
６，５３４，０６６Ｂ１ ２００３年３月 Ｐｏｕｌｅｔら
外国特許文献
０４８４３８２ １９９５年３月 ＥＰ、ＷＯ２００４／０８３３９０
他の刊行物
Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ，Ｊ．ＮおよびＢｒｏｗｎ，Ｆ．，Ｊ．、Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、２２、ｐｐ．２８１〜２８５（１９７４）
ＣｌａｒｋｅおよびＬａｍｂｄｅｎ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７８：２９１〜３０１（１９９７）
Ｇｒｉｅｓｔ，Ｎ．Ｒ．、１９７９、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第３版）、ｐｐ．８４〜８５、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ
Ｊ．Ｌ．ＢｉｔｔｌｅおよびＷ．Ｊ．Ｒｕｂｉｃ、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３７：２７５〜７８（１９７６）
Ｌａｕｒｉｔｚｅｎら、Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５６：５５〜６３（１９９７）
Ｍａｋｙ，Ｂｒｉａｎ Ｗ．Ｊ．およびＫａｎｇｒｏ，Ｈｉｌｌａｒ Ｏ．、１９９６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ、ｐｐ．３５〜３７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
Ｍｏｔｉｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６４：４３１３〜４３１８（１９９６）
Ｎ．Ｃ．Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、Ｆｅｌｉｎｅ Ｐｒａｃｔ．１３（１）：２６〜３５（１９８３）
Ｏｇｌｅｓｂｙ，Ａ．Ｓ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４、ｐｐ．３２９〜３４１（１９７１）
Ｐｏｕｌｅｔら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １０６：１７〜３１（２００５）
Ｐｏｕｌｅｔら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４５：２４３〜２６１（２０００）
Ｒ．Ｃ．Ｐｏｖｅｙ、Ｆｅｌｉｎｅ Ｐｒａｃｔ．、７（５）：１２〜１６（１９７７）
Ｓ．Ｄａｗｓｏｎら、Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．、１３２：３４６〜５０（１９９３）
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、英国Ｏｘｆｏｒｄ
Ｓｏｅｒｇｅｌ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、５、ｐｐ２３９〜２４４（１９７５）
Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｎ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、第１４巻、第１７／１８号、ｐｐ．１６５７〜１６６３（１９９６）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、いくつかの単離ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）の新たな株を提供し、そのウイルスに関する。本発明はまた、ワクチンを動物に、具体的にはＦＣＶワクチンをネコに与える新たな方法をも開示する。本発明はまた、ネコカリシウイルスをコードする核酸クローンにも関する。本発明は、ＦＣＶキャプシドタンパク質、生または死滅ワクチン、キャプシドタンパク質を含むサブユニットワクチン、核酸ワクチン、および単離ネコカリシウイルスのキャプシドタンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスベクターワクチンに関する。本発明はまた、ワクチン組成物の作製に有用なネコカリシウイルスを同定する方法、およびネコカリシウイルスに感染したネコを診断するアッセイにも関する。本発明はまた、新たなＦＣＶワクチンおよび古いＦＣＶワクチンをネコ科動物に投与する新たな方法をも提供する。汎白血球減少またはＦＰＬとも呼ばれているＦＰＶまたはネコパルボウイルスと、ネコ鼻気管支炎ウイルスとも呼ばれている他の疾患のＦＨＶまたはネコヘルペスウイルスの両方に対するワクチンで動物を、具体的にはネコを治療し免疫感作するための方法および材料も本明細書に記載する。記載するようにネコ科動物に与えたときＦＰＶおよび／またはＦＨＶワクチンの両方の有効な経口／経口および皮下／経口送達が可能となるワクチンの新規の組合せを下記に記載する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
具体的には、本発明は、ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作する下記のワクチンを開示する。ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質（配列番号１３）、または少なくとも約９１．２％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列。ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１２）または少なくとも約７８．７％もしくは７９．２％の配列同一性を有し、保存的置換を許容する配列を含むＤＮＡワクチン。
【０００８】
ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質が、ＦＣＶ−４９株由来のタンパク質配列（配列番号１５）または少なくとも約９２．７％、９５％もしくは９９％の同一性を有し、有効量提供されるワクチン。ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１４）または少なくとも約７８．９％、すなわち７９．４％（７８．９＋０．５）の配列同一性を有し、保存的置換を許容する配列を含むＤＮＡワクチン。
【０００９】
ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質がＦＣＶ−２６３９１−４株由来のタンパク質配列を含むワクチン。ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質がタンパク質配列（配列番号１７）または少なくとも約９１．８％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含むワクチン。ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１６）または少なくとも約７８．４％、すなわち７８．９％（７８．４＋０．５）の配列同一性を有する配列を含むＤＮＡワクチン。
【００１０】
ポリヌクレオチドが本質的に配列番号１２、１４、１６からなる群から選択されるワクチン。そのワクチンは、アジュバントを含有するワクチン、ＦＣＶ構成成分が生であるワクチン、ＦＣＶ構成成分を弱毒化したワクチン、ＦＣＶ構成成分を不活性化したワクチンのうち単独でもよく、またはいずれかの組合せでもよく、それはＦＣＶ−Ｆ９、ＦＣＶ−ＬＬＫ、ＦＣＶ−Ｍ８、ＦＣＶ−２５５、およびＦＣＶ−２２８０からなる群から選択される少なくとも１つの他のネコカリシウイルス株を含んでよい。
【００１１】
免疫応答を生じさせるのに有効な量の、配列番号１３、１５、または１７と９３％以上の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるＦＣＶキャプシドタンパク質のヌクレオチド配列であって、ＦＣＶ単離物が株２１３−９５でなく、核酸配列が異種プロモーター配列と作動的に連結しているヌクレオチド配列と、薬学的に許容できる担体とを含む、ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチン。本質的に配列番号１２、１４、１６からなる群から選択される群から選択されるＦＣＶキャプシドタンパク質のヌクレオチド配列を含む、ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチン。ヌクレオチド配列が、プラスミド、組換えウイルスベクター、または任意の他のヌクレオチドベクターのいずれかの中にあるワクチン。
【００１２】
組換えウイルスベクターが、ネコヘルペスウイルス、アライグマポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、アデノウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群から選択されるワクチン。
【００１３】
獣医学的に許容できる賦形剤の媒体と、本明細書において２３、２６、４１、４４および５６と呼ばれるモノクローナル抗体から選択されるモノクローナル抗体と結合するＦＣＶの単離株とを含む免疫原性組成物についても記載する。本発明の一部の型では、免疫原性組成物は、獣医学的に許容できる賦形剤の媒体と、本明細書において２３、２６、４１、４４および５６と呼ばれるモノクローナル抗体から選択されるモノクローナル抗体と選択的に結合するＦＣＶの単離株とを含む。これらの免疫原性組成物は、ＦＣＶ株が不活性化され、前記ＦＣＶ株がワクチンであり、アジュバントを含む組成物が含まれる。
【００１４】
本明細書に記載のワクチンは、ネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｓｉｔｔａｃｉ）、およびネコパルボウイルス、狂犬病ウイルスおよび気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）からなる群から選択される少なくとも１つの他のネコ病原体を含んでよい。ワクチンはまた、アジュバントをさらに含んでもよく、それとともに投与してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）と関係する死亡率を有意に低下させ、ＦＣＶワクチンの安全性を高めるワクチン接種法を提供する。さらに、特許請求に係るワクチン接種法は、既存のＦＣＶ−Ｆ９ワクチンプロトコールより幅広い血清交差中和特性を誘導し、それはネコカリシウイルスの異なる株全体に対してより良好な免疫をもたらすはずである。
【００１６】
本発明の一態様は、ワクチンで動物を、具体的にはネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作する方法を提供する。２つの他のネコ疾患であるＦＰＶおよびＦＨＶも、本明細書に記載する新規の治療を有する。その方法は、ネコに治療有効量の第１のワクチン、第２のワクチンを投与するステップを含み、年１回の追加免疫として約１年後、上記のように１２０日以内、またはより頻繁に第３のワクチンの投与を行ってもよい。第１のワクチンを非経口（例えば、皮下、筋内など）投与する。第１のワクチンの投与後約Ｎ日目に第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１または第２のワクチンの投与後約Ｍ日目に第３のワクチンを非経口、経口または口鼻投与する。ここで、ＮおよびＭは、それぞれ独立に、３〜１２０（両端を含む）の整数である。Ｎが約３週間および約２〜４週間である場合も好ましい。さらに、同定された特定のワクチンを２回の経口投与として投与することができ、最初に非経口投与する必要がない本発明の一態様を提供する。年１回の追加免疫についても助言する。
【００１７】
配列表の簡単な説明
配列番号１：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＥＬ−６５３
配列番号２：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＥＬ−６５１
配列番号３：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｎ２
配列番号４：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｎ３
配列番号５：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｎ４
配列番号６：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｎ５
配列番号７：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｎ６
配列番号８：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｎ９
配列番号９：
オリゴヌクレオチドプライマー、プライマー２
配列番号１０：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｃ４
配列番号１１：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｃ８
配列番号１２：
ＦＣＶ−２１キャプシド遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号１３：
ＦＣＶ−２１キャプシド遺伝子のコードされたアミノ酸配列
配列番号１４：
ＦＣＶ−４９キャプシド遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号１５：
ＦＣＶ−４９キャプシド遺伝子のコードされたアミノ酸配列
配列番号１６：
ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシド遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号１７：
ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシド遺伝子のコードされたアミノ酸配列
【００１８】
定義および略語
測定可能な数値変数に関して使用するとき「約（ａｂｏｕｔ）」とは、「約３週間」が１７〜２５日間であり、約２〜４週間が１０〜４０日間である週単位の時間間隔に関して約（ａｂｏｕｔ）を使用する場合を除いて、変数の示された値、および示された値の実験誤差内（例えば平均の９５％信頼区間内）または示された値の１０パーセント以内のどちらか大きい方に入る変数のすべての値を指す。
【００１９】
「能動免疫」は、本発明のワクチンでのネコのワクチン接種によって誘導されるネコウイルスに対する液性免疫および／または細胞性免疫をどちらも含む。
【００２０】
「抗体」とは、特定の抗原との免疫応答の結果、その抗原と結合することができるイムノグロブリン分子を指す。イムノグロブリンは、「定常」領域および「可変」領域を有するポリペプチド「軽」鎖および「重」鎖から構成される血清タンパク質であり、定常領域の組成に基づいてクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）に分けられる。所与の抗原に「特異的」である抗体は、抗体の可変領域が特定の抗原を認識し排他的にそれと結合することを示し、例えば、抗体は、キャプシドタンパク質と他のポリペプチドの間に限局的な配列同一性、相同性、または類似性が存在するにも関わらず、結合親和性の測定可能な違いにより特定のキャプシドタンパク質を他の知られているタンパク質と区別することができる。特定の抗体はまた、抗体の可変領域の外側、具体的には分子の定常領域中にある配列との相互作用により、他のタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡ技術での黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡまたは他の抗体）と相互作用することもできる。抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイは周知である。そのようなアッセイの包括的な論述については、Ｈａｒｌｏｗら（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第６章（１９８８）を参照されたい。抗体はまた、抗体がＦＣＶキャプシドタンパク質に特異的であるという条件で、ＦＣＶキャプシドタンパク質の断片を認識しそれと結合することもできる。抗体は、当技術分野で知られている方法を使用して作製することができる。
【００２１】
「抗原」または「免疫原」とは、対象にさらされた後その抗原に特異的な免疫応答を誘導する１つまたは複数の（直線的、高次構造的またはその両方の）エピトープを含有する分子を指す。エピトープとは、Ｔ細胞受容体または特定の抗体と結合する抗原の特定の部位であり、通常は約３アミノ酸残基〜約２０アミノ酸残基を含む。抗原という用語は、サブユニット抗原という、本来抗原が結合している生物全体、ならびに死滅し、弱毒化しまたは不活性化した細菌、ウイルス、真菌、寄生虫または他の微生物から離れそれと別々となった抗原を指す。抗原という用語はまた、抗イディオタイプ抗体やその断片などの抗体、および抗原または抗原決定基（エピトープ）を模倣することができる合成ペプチドミモトープをも指す。抗原という用語はまた、ＤＮＡ免疫感作の適用などで、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをも指す。
【００２２】
「賦形剤」とは、抗原でないワクチンの任意の構成成分を指す。
【００２３】
ＦＥＬＯＣＥＬＬ３とは、オウム病クラミジアを含まないＦＥＬＯＣＥＬＬ４である。
【００２４】
ＦＥＬＯＣＥＬＬ４は、改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス［ＦＨＶ］、カリシウイルス［ＦＣＶ−Ｆ９］、汎白血球減少ウイルス［ＦＰＶ］およびオウム病クラミジア［ＦＣｐ］を含有する。ＦＥＬＯＣＥＬＬ４Ａは、改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス［ＦＨＶ］、カリシウイルス［ＦＣＶ−２１］、汎白血球減少ウイルス［ＦＰＶ］およびオウム病クラミジア［ＦＣｐ］を含有する。ＦＥＬＯＣＥＬＬ４Ａは、ＦＣＶ−Ｆ９を含まないがＦＣＶ−２１を含むＦＥＬＯＣＥＬＬ４である。ＦＥＬＯＣＥＬＬ３Ａは、ＦＣＶ−Ｆ９を含まないがＦＣＶ−２１を含むＦＥＬＯＣＥＬＬ３である。Ｆｅｌｏｃｅｌｌ（登録商標）４、Ｆｅｌｏｃｅｌｌ４、もしくはＦＥＬＯＣＥＬＬ４またはこれらの語の後に「３」もしくは「４」の数が続くものはワクチンであり、名称Ｆｅｌｏｃｅｌｌの任意の変種は、Ｐｆｉｚｅｒによって所有されている。
【００２５】
「第１のワクチン」、「第２のワクチン」、「第３のワクチン」などは、別々に投与可能なワクチンを指し、それは同じものでもよくまたは異なるものでもよく、一般に任意の順番で投与することができる。したがって、第３のワクチンは、第２のワクチンの前後に対象に投与することができる。
【００２６】
ポリペプチドに関するパーセントアミノ酸配列「同一性」に関して「同一性」とは、両方の配列を整列し必要な場合にギャップを導入して最大のパーセント配列同一性にした後に、標的配列中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率と本明細書で定義する。パーセント配列同一性は、従来の方法によって決定される。簡潔に述べると、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら；Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０；１９９４）およびＰＡＭ２５０重み行列（Ｄａｙｈｏｆｆら、「Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．」、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、５：３４５〜３５８（１９７８））およびプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．；ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）によって提供される初期設定のパラメーターを使用して、２つのアミノ酸配列を整列してアラインメントスコアを最適化する。ＰＡＭ２５０重み行列表を、表１−１として示す（アミノ酸は標準的な１文字のコードで示す）。
【００２７】
【表１】
【００２８】
次いでパーセント同一性を下記のように計算する：
同一整合の合計数＿×１００
［長い配列の長さ＋２つの配列を整列するために長い配列中に導入したギャップの数］
【００２９】
対象中での「免疫応答」とは、抗原に対する液性免疫応答、細胞性免疫応答、または液性および細胞性免疫応答の発生を指す。「液性免疫応答」とは、抗体によって媒介されるものを指す。「細胞性免疫応答」とは、Ｔリンパ球または他の白血球またはその両方によって媒介されるものであり、活性化したＴ細胞、白血球、またはその両方によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、および同様の分子の産生を含む。免疫応答は、当技術分野で知られている標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを使用して決定することができる。
【００３０】
抗原の「免疫学的防御量」または「免疫応答を生じさせるのに有効な量」とは、疾患作用物質、および具体的にはネコカリシウイルスの感染によって引き起こされる有害な健康上の影響またはその合併症を含めた疾患の徴候または症状を防止しまたは改善するのに十分であるレシピエントでの免疫原性応答を誘導するのに有効な量である。液性免疫または細胞性免疫またはその両方を誘導することができる。例えば抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイにより間接的に、または野生型株での誘発後に徴候および症状をモニターすることにより直接的に、ワクチン組成物に対する動物の免疫原性応答を評価することができる。ワクチンによって付与される防御免疫は、例えば、死亡率、罹患率、体温や全体的な身体状態などの臨床的徴候の低下、ならびに対象の全体的な健康および能力を測定することによって評価することができる。免疫応答は、それだけに限らないが、細胞性および／または液性免疫の誘導を含み得る。治療上有効なワクチンの量は使用する特定のウイルス、またはネコの状態に応じて様々となり得、それは獣医により決定することができる。
【００３１】
「鼻内」投与とは、鼻を介しまたはそれを経由する対象の体内へのワクチンなどの物質の導入を指し、主として鼻粘膜を介する物質の輸送が関与する。
【００３２】
ポリヌクレオチドやポリペプチドなど任意の具体的に定義された物質について記載するのに使用するとき「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」とは、ポリペプチドや核酸などの物質が通常認められる元の細胞環境から分離した物質を指す。したがって、本明細書において、ほんの一例として、本発明のポリヌクレオチドを用いて構築された組換え細胞系統は、「単離された」核酸を使用している。あるいは、ＦＣＶキャプシドタンパク質または特異的免疫原性断片をワクチンとして使用することもでき、したがって、本来それがどのように存在し得るかと比較して、それが同定され、分離されある程度精製されているので、それは単離されたとみなされる。キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片が、抗原を産生する組換え細菌または真核生物発現ベクター中で産生される場合、それは、単離されたタンパク質または核酸として存在するとみなされる。例えば、ポリヌクレオチドを用いて構築された組換え細胞系統は、「単離された」核酸を使用している。
【００３３】
「モノクローナル抗体」とは、単一の系統のハイブリドーマ細胞によって産生される抗体を指し、すべてが特定の抗原上の１つのエピトープに対して誘導されるものである。モノクローナル抗体の作製に使用される抗原は、病原体の単離タンパク質または病原体全体として提供することができる。ハイブリドーマとは、骨髄腫細胞と特定の抗体産生細胞の融合によって形成されるハイブリッド細胞からなるクローン細胞系統である。一般に、モノクローナル抗体は、マウス由来のものである；しかし、モノクローナル抗体はまた、ファージディスプレイ技術またはファージディスプレイと同等の方法またはマウス由来でないハイブリッド細胞によって産生される、抗原の特定のエピトープに対して作製された抗体のクローン集団をも指す。
【００３４】
「Ｎ日」、「Ｎ」の間隔もしくは期間、または事象後「Ｍ日」とは、それぞれ事象後Ｎ日目またはＭ日目における任意の時間を指す。例えば、第１のワクチンの投与後３日での対象への第２のワクチンのワクチン接種とは、第１のワクチンの後３日目における任意の時間に第２のワクチンを投与することを意味する。この記載は、第１と第２のワクチン接種の間隔にしばしば適用される。通常好ましいＮの間隔は約３週間または１７〜２５日間であるが、約２〜４週間または１０〜４０日間も一般的であり、ここで本発明は、３〜１２０日のＮの期間で有効である。
【００３５】
「経口」または「経口的」投与とは、口を介しまたはそれを経由する対象の体内へのワクチンなどの物質の導入を指し、嚥下または口腔粘膜を介する輸送（例えば、舌下または口腔吸収）またはその両方が関与する。
【００３６】
「口鼻」投与とは、例えば、鼻の中に液滴を１滴または複数滴入れることにより行われる、鼻および口を介しまたはそれを経由する対象の体内へのワクチンなどの物質の導入を指す。口鼻投与には、経口投与および鼻内投与と関係する輸送過程が関与する。
【００３７】
「非経口投与」とは、消化管を含まない経路を介しまたはそれを経由する対象の体内へのワクチンなどの物質の導入を指す。非経口投与には、皮下投与、筋内投与、経皮投与、皮内投与、腹腔内投与、眼内投与、および静脈内投与がある。この開示の目的で、非経口投与は、口、鼻、気管、および肺中の粘膜組織を介する物質の輸送が主として関与する投与経路を排除するものである。
【００３８】
「受動免疫」とは、ＦＣＶ株に対する抗体または免疫原性構成成分もしくはその構成成分の断片を含むワクチンをネコにワクチン接種した結果ネコにもたらされるネコカリシウイルスに対する防御を指す。
【００３９】
「薬学的に許容できる」とは、正しい医学的判断の範囲内にある、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずに対象の組織と接触させて使用するのに適し、相応の対危険便益比と釣り合い、その使用目的に有効である物質を指す。
【００４０】
「ポリクローナル抗体」とは、特定の病原体または抗原に対して作製された抗体の混合集団を指す。一般に、その集団は様々な抗体の群を含有し、各群は、病原体または抗原の特定のエピトープに対して誘導されたものである。ポリクローナル抗体を作製するために、病原体全体または単離抗原を接種または感染により宿主中に導入し、それが宿主を誘導して、病原体または抗原に対して抗体が作製される。
【００４１】
「呼吸器」投与とは、噴霧（霧化）物質の吸入を介しまたはそれを経由する対象の体内へのワクチンなどの物質の導入を指す。呼吸器投与では、主要な輸送機構には気管、気管支、および肺中の粘膜を介する霧化物質の吸収が関与し、したがって、鼻内または経口的投与と異なる。
【００４２】
「単回投与」とは、同じ日またはほぼ同じ日の投与、すなわちほぼ１日以内に投与するすべての構成成分を意味する。構成成分は、単一容器中に入れてもよく、または入れなくてもよい。
【００４３】
本発明の抗体について記載するのに使用するとき「に特異的な（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ）」は、本発明の抗体の可変領域が特定のウイルス株を認識し排他的にそれと結合する（すなわち、ＦＣＶキャプシドタンパク質とそのようなポリペプチドの間に限局的な配列同一性、相同性、または類似性が存在するにも関わらず、結合親和性の測定可能な違いにより特定のＦＣＶキャプシドタンパク質を他の知られているタンパク質と区別することができる）ことを示す。特定の抗体がまた、抗体の可変領域の外側、具体的には分子の定常領域中にある配列との相互作用により、他のタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡ技術での黄色ブドウ球菌プロテインＡまたは他の抗体）と相互作用することもできることが理解されるであろう。本発明の抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイは周知であり、当技術分野で日常的に実施されている。そのようなアッセイの包括的な論述については、Ｈａｒｌｏｗら（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）、第６章を参照されたい。抗体がＦＣＶキャプシドタンパク質に特異的であるという条件で、本発明のＦＣＶキャプシドタンパク質の断片を認識しそれと結合する抗体も意図される。本発明の抗体は、当技術分野で周知であり日常的に実施されている任意の方法を使用して作製することができる。
【００４４】
「特異的免疫原性断片」とは、下記で詳細に定義づけるように、その配列に特異的な抗体によって認識可能な配列の部分を意味する。
【００４５】
「対象」とは、免疫系を有する任意の動物を指し、ネコなどの哺乳動物を含む。
【００４６】
「サブユニットワクチン」とは、１つまたは複数の抗原を含むが、すべての抗原を含むわけではないワクチンの型を指し、その抗原は、ウイルス、細菌、寄生虫や真菌など、対象とする病原体の抗原に由来しまたはそれと同種である。そのような組成物は、完全な病原体細胞もしくは病原性粒子、またはそのような細胞もしくは粒子の溶解物を実質的に含まない。したがって、病原体またはその類似体から少なくとも部分的に精製し、または実質的に精製した免疫原性ポリペプチドからサブユニットワクチンを調製することができる。サブユニットワクチン中の１つまたは複数の抗原を得る方法には、標準的な精製技術、組換えによる作製、または化学合成がある。
【００４７】
「ＴＣＩＤ５０」とは「組織培養感染量」を指し、所与のバッチの接種細胞培養物の５０％に感染させるのに必要なウイルスの希釈率と定義される。本明細書全体にわたって利用されるＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を含めた様々な方法を使用して、ＴＣＩＤ５０を計算することができる。Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法の記載については、Ｂ．Ｗ．ＭａｈｙおよびＨ．Ｏ．Ｋａｎｇｒｏ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ、２５〜４６（１９９６）を参照されたい。
【００４８】
この開示の文脈で「治療有効量」とは、ウイルス（例えば、ＦＣＶ）、細菌、寄生虫や真菌などの病原体の感染によって引き起こされる有害な健康上の影響またはその合併症を含めた疾患の徴候または症状を防止しまたは改善するのに十分である、抗原またはワクチンを投与した対象（例えば、ネコ）中で免疫応答を誘導する抗原またはワクチンの量を指す。液性免疫または細胞性免疫または液性免疫と細胞性免疫の両方を誘導することができる。例えば抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイにより間接的に、または野生型株での誘発後に徴候および症状をモニターすることにより直接的に、ワクチン組成物に対する動物の免疫原性応答を評価することができる。ワクチンによって付与される防御免疫は、例えば、死亡率、罹患率、体温などの臨床的徴候の低下、対象の全体的な身体状態ならびに全体的な健康および能力を測定することによって評価することができる。治療上有効なワクチンの量は使用する特定のウイルス、または対象の状態に応じて様々となり得、それは医師により決定することができる。
【００４９】
「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、そのような用語が当てはまる障害、状態もしくは疾患から回復させ、それを改善し、その進行を阻害し、もしくはそれを防止すること、またはそのような障害、状態もしくは疾患の１つもしくは複数の症状を防止することを指す。
【００５０】
「治療」とは、直前で定義した「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」行為を指す。
【００５１】
「ワクチン」とは、抗原を含み、下記で定義するいわゆる「サブユニットワクチン」を包含する組成物を指す。対象にワクチンを投与すると免疫応答が生じる。非経口、経口などを含めた任意の知られている投与経路によりワクチンを対象中に直接導入することができる。
【００５２】
第１部
本発明のワクチン、ウイルス株、キャプシドタンパク質、および抗体
本発明は、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４からなる群から選択される生のまたは死滅したＦＣＶ株に基づくワクチンを提供する。本発明は、本発明のＦＣＶ株由来のＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする核酸ワクチンをさらに提供する。本発明は、本発明のＦＣＶ株に由来する単離キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をさらに提供する。
【００５３】
ＦＣＶ株では、キャプシドタンパク質から生じる抗原決定基によって良好な免疫応答が誘導される。ここで、密接に関連するキャプシドタンパク質およびその変異体を含めてＦＣＶのいくつかの株を記載し特許請求する。具体的には、ＦＣＶ−２１株およびタンパク質配列（配列番号１３）または９１．２％、９５％もしくは９９％以上の同一性を有する配列；ＦＣＶ−４９株およびタンパク質配列（配列番号１５）または９２．７％、９５％もしくは９９％以上の同一性を有する配列；ＦＣＶ−２６３９１−４株およびタンパク質配列（配列番号１７）または９１．８％、９５％もしくは９９％以上の同一性を有する配列を記載する。
【００５４】
本発明のワクチンは一般に、ネコカリシウイルスの病原性株によって引き起こされる疾患に対してネコを免疫感作する予防的処置となることが意図される。しかし、ワクチンはまた、ネコカリシウイルスの病原性株にすでに感染しているネコの治療的処置にも意図される。例えば、ＦＣＶキャプシドまたはその免疫原性構成成分で異種の宿主を免疫感作することによって産生される抗体を含むワクチンは、ネコカリシウイルスに感染したネコの治療的処置に使用される。
【００５５】
しかし、能動免疫をもたらすワクチン、すなわちＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４からなる群から選択されるＦＣＶ株、またはその突然変異体、または本発明のＦＣＶ株に由来するキャプシドタンパク質、またはそのキャプシドタンパク質の特異的免疫原性断片を含むワクチンでも、様々な疾患に対する治療的処置として投与したときに有効となることが予想される。したがって、本発明によってもたらされる免疫は能動免疫でもよく、または受動免疫でもよく、ワクチンの使用目的は予防的でもよく、または治療的でもよい。
【００５６】
本発明のワクチンのいずれか１つの実施形態での投与経路には、それだけに限らないが、口鼻、筋内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内、および経口ならびに経皮、または吸入もしくは坐剤による投与がある。好ましい投与経路には、口鼻、筋内、腹腔内、皮内、および皮下注射がある。ワクチンは、任意の手段によって投与することができ、その手段には、それだけに限らないが、シリンジ、噴霧器、霧吹き、無針注射機器、または微粒子遺伝子銃（微粒子銃）がある。
【００５７】
本発明のいずれか１つの実施形態でのワクチンは、使用する投与形態に従って、薬学的に許容される担体中で製剤される。当業者なら、生のまたは死滅したＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９またはＦＣＶ２６３９１−４、本発明のＦＣＶ株のいずれかに由来するキャプシドタンパク質またはその免疫原性断片、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９もしくはＦＣＶ２６３９１−４キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする組換えウイルスベクター、またはＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９もしくはＦＣＶ２６３９１−４に由来するキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードするＤＮＡ分子を含むワクチンを容易に製剤することができる。筋内注射が好ましい場合では、等張性の製剤が好ましい。一般に、等張性のための添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースがあり得る。特定の場合では、リン酸緩衝溶液などの等張溶液が好ましい。製剤は、ゼラチンやアルブミンなどの安定化剤をさらに提供することができる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤を製剤に添加する。本発明による医薬製剤は、滅菌され、発熱物質を含まない状態で提供される。しかし、本発明のワクチンを含む、薬学的に許容される担体に好ましい製剤が、生ネコカリシウイルスワクチン、死滅ネコカリシウイルスワクチン、ポリペプチド（抗原）サブユニットワクチン、組換えウイルスベクターワクチン、抗体ワクチン、およびＤＮＡワクチンについて、米国農務省（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）、またはカナダ、メキシコや欧州各国のいずれか一国などの外国における同等の政府機関によって公布された規則で承認された薬学的担体であることは当業者に周知である。したがって、本発明のワクチンの商業生産について薬学的に許容される担体は、米国または外国における適当な政府機関によってすでに承認され、または承認される予定である担体である。ワクチンは、薬学的に許容できるアジュバントとさらに混合することができる。本発明のワクチンの特定の製剤では、ワクチンを他のネコワクチンと混合して、他のネコ病原体によって引き起こされる広範な疾患に対してネコを防御することができる多価ワクチン製品を生産する。現在、ネコワクチンの商業的製造業者も最終消費者も多価ワクチン製品の方を好む。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、ネコカリシウイルス、ならびに好ましくはネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコクラミジア、およびネコ汎白血球減少ウイルスからなる群から選択される少なくとも１つの他のネコ病原体に対してネコを免疫感作する多価ワクチンを提供する。
【００５８】
ネコへの接種は、好ましくは、完全な幅広い免疫原性応答を生じさせる単回ワクチン接種によって行う。本発明の他の実施形態では、ネコに一連のワクチン接種を施して、完全な幅広い免疫応答を生じさせる。一連のワクチン接種を行うとき、ほぼ１日から４週間以上の間隔でワクチン接種を行うことができる。特定の実施形態では、同時に異なる部位でネコにワクチン接種する。経路および投与についてのさらなる詳細は、下記の「カリシウイルスに対してネコを免疫感作する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ Ｃａｔｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ．）」という名称の節で見出される。
【００５９】
ワクチン組成物は、薬学的媒体、賦形剤、または媒質として働く、ワクチンと適合性のある薬学的に許容できる（すなわち、滅菌され毒性のない）液体、半固体、または固体希釈剤を含んでもよい。希釈剤には、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどがあり得る。等張剤には、とりわけ塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースがあり得る。安定化剤にはとりわけアルブミンがある。フロイント完全アジュバントやフロイント不完全アジュバントなどの油に基づくアジュバント、ミコール酸に基づくアジュバント（例えば、トレハロースジミコレート）、細菌リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（すなわち、ムレイン、ムコペプチド、またはＮ−Ｏｐａｃａなどの糖タンパク質、ムラミルジペプチド［ＭＤＰ］、またはＭＤＰ類似体）、プロテオグリカン（例えば、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から抽出されるもの）、レンサ球菌製剤（例えば、ＯＫ４３２）、Ｂｉｏｓｔｉｍ（商標）（例えば、０１Ｋ２）、ＥＰ １０９ ９４２、ＥＰ １８０ ５６４およびＥＰ ２３１ ０３９の「Ｉｓｃｏｍ」、水酸化アルミニウム、サポニン、ＤＥＡＥ−デキストラン、中性油（ミグリオル（ｍｉｇｌｙｏｌ）など）、植物油（ラッカセイ油など）、リポソーム、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオールを含めて、当技術分野で知られている任意のアジュバントをワクチン組成物中で使用することができる。アジュバントには、それだけに限らないが、他に多数ある中でもＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、コレステロール、水中油型乳剤、例えばフロイント完全およびフロイント不完全アジュバントなどの油中水型乳剤、ブロックコポリマー（Ｂｌｏｃｋ ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒ）（ＣｙｔＲｘ、ジョージア州Ａｔｌａｎｔａ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア州Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、アラバマ州Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）もしくは他のサポニン分画、モノホスホリル脂質Ａ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来の熱不安定性エンテロトキシン（組換えまたはその他によるもの）、コレラ毒素、またはムラミルジペプチドがある。免疫原性組成物は、例えば、インターロイキン、インターフェロンや他のサイトカインなどの１つまたは複数の他の免疫調節作用物質をさらに含んでよい。免疫原性組成物はまた、ゲンタマイシンおよびＭｅｒｔｈｉｏｌａｔｅを含んでもよい。本発明との関連で有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は当業者により容易に決定することができるが、本発明は、アジュバントを約５０μｇ〜約２０００μｇ、好ましくはワクチン組成物の投与量２ｍｌ当たり約５００μｇ含む組成物を意図するものである。他の好ましい実施形態では、本発明は、約１μｇ／ｍｌ〜約６０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約３０μｇ／ｍｌ未満の抗生物質を含むワクチン組成物を意図するものである。
【００６０】
本発明の免疫原性組成物は、投与経路に応じて様々な形態で作製することができる。例えば、免疫原性組成物は、注射可能な使用に適した滅菌水溶液剤もしくは分散剤の形態で作製することもでき、または凍結乾燥技術を使用して凍結乾燥した形態で作製することもできる。凍結乾燥した免疫原性組成物は通常約４℃で維持され、アジュバントを含むまたは含まない安定化溶液、例えば食塩水または／およびＨＥＰＥＳ中で再調製することができる。
【００６１】
さらに、本発明の免疫原性ワクチン組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容できる担体を含んでよい。本明細書において、「薬学的に許容できる担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散用媒質、被覆、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などを含む。（複数の）担体は、本発明の構成成分と適合性があり、免疫感作する対象にとって有害でないという意味で「許容でき」なければならない。通常、担体は滅菌され、発熱物質を含まない。
【００６２】
生ワクチン
本発明のワクチンの一実施形態では、ワクチンは生ワクチンを含み、ＦＣＶ構成成分は、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４からなる群から選択される。これらの株が非病原性の型で単離されたので、それらは、疾患を引き起こさずにネコの免疫系を刺激する生ワクチンの調製に特に好ましい。
【００６３】
ウイルスをさらに弱毒化する方法は当技術分野で周知であり、適切な細胞系統での細胞培養における連続的な継代や、紫外線または化学的突然変異生成などの方法を含む。
【００６４】
不活性化ワクチン
本発明の他の実施形態では、ワクチンは、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４からなる群から選択されるＦＣＶ株を含む不活性化または死滅ＦＣＶワクチンを含む。不活性化ワクチンは、当技術分野で周知の方法によって作製される。例えば、ウイルスを増殖させて高力価にした後、当技術分野で周知の方法によってウイルス抗原量を得ることができることが当業者には容易に明らかとなるであろう。例えば、ウイルス抗原量は、希釈、濃縮、または抽出によって得ることができる。ワクチンの産生に適したウイルス抗原量を得るのにこれらの方法がすべて使用されている。カリシウイルスは、ホルマリン、ベータプロプリオラクトン（ＢＰＬ）、もしくは二成分エチレンイミン（ＢＥＩ）での処理、または当業者に知られている他の方法によって不活性化する。
【００６５】
ホルマリンによる不活性化は、カリシウイルス懸濁物を３７％ホルムアルデヒドと混合してホルムアルデヒドの終濃度を０．０５％にすることによって行う。室温で約２４時間絶えず撹拌することによってカリシウイルス−ホルムアルデヒド混合物を混合する。次いで、不活性化したカリシウイルス混合物を、ＣＲＦＫ細胞などの適切なネコ細胞系統での増殖についてアッセイを行うことにより、生きているウイルスが残存するかどうか試験する。
【００６６】
ＢＥＩによる不活性化は、本発明のカリシウイルス懸濁物を０．１Ｍ ＢＥＩ（０．１７５Ｎ ＮａＯＨ中の２−ブロモ−エチルアミン）と混合してＢＥＩの終濃度を１ｍＭにすることによって行う。室温で約４８時間絶えず撹拌し、その後１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウムを添加して終濃度０．１ｍＭにすることによってカリシウイルス−ＢＥＩ混合物を混合する。さらに２時間混合を継続する。不活性化したカリシウイルス混合物を、ＮＬＦＫ細胞などの適切なネコ細胞系統での増殖についてアッセイを行うことにより、生きているカリシウイルスが残存するかどうか試験する。
【００６７】
本発明の上記の不活性化カリシウイルスを、不活性化ウイルスワクチンを製剤するための薬学的担体のいずれか１つと混合して適当な投与レベルにする。不活性化ワクチンは、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４からなる群から選択されるＦＣＶ構成成分に加えて、好ましくはＦＣＶ−Ｆ９、ＦＣＶ−Ｍ８、ＦＣＶ−２５５、およびＦＣＶ−２２８０からなる群から選択される少なくとも１つの他のネコカリシウイルス株をさらに含んでよい。好ましい実施形態では、ワクチンは、好ましくはネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコクラミジア、およびネコ汎白血球減少ウイルスからなる群から選択される１つまたは複数の他のネコ病原体に対してネコを免疫感作するためのワクチンをさらに含む。
【００６８】
組換えワクチン
本発明のさらなる実施形態では、ワクチンは、本明細書で開示されるＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする核酸を含有する組換えウイルスベクターを含む。
【００６９】
特定の一実施形態では、組換えウイルスベクターは、ネコカリシウイルスとネコヘルペスウイルスの両方に対してネコを免疫感作するネコヘルペスウイルスである。他の実施形態では、組換えウイルスベクターは、好ましくはネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコクラミジア、およびネコ汎白血球減少ウイルス、狂犬病ウイルスおよび気管支敗血症菌からなる群から選択される１つまたは複数の抗原を含む。
【００７０】
ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を発現する組換えウイルスベクターを作製するには、キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードするｃＤＮＡを、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスやアデノウイルスなどのウイルスベクターのゲノム中に挿入する。Ｗａｒｄｌｅｙらの米国特許第５，７１６，８２２号には、ネコカリシウイルス株ＣＦＩ−６８ ＦＩＶキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡをネコヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子中に挿入する方法が記載されている。本発明によって包含される他の組換えウイルスベクターワクチンには、それだけに限らないが、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を発現するアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、および種々のポックスウイルスベクターがある。具体的には、本発明は、外来抗原を発現するワクシニアウイルスまたはカナリアポックスウイルスからなる組換えウイルスワクチンを教示するＰａｏｌｅｔｔｉらの米国特許第５，３３８，６８３号および第５，４９４，８０７号；狂犬病ウイルス抗原を発現する組換えアライグマポックスウイルスベクターを教示するＥｓｐｏｓｉｔｏらの米国特許第５，２６６，３１３号；ならびにネコヘルペスウイルスｇＤまたはｇＢ抗原を発現する組換えアライグマポックスウイルスベクターを教示するＭａｅｓらの米国特許第６，０１０，７０３号のいずれか１つで教示される方法に従って作製されたＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を発現する組換えポックスウイルスベクターワクチンを含む。
【００７１】
上記の組換えウイルスベクターのいずれかでは、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードするｃＤＮＡが、抗原をコードするｃＤＮＡの５’末端で真核生物プロモーターと、抗原をコードするｃＤＮＡの３’末端で真核生物終結シグナルおよびポリ（Ａ）シグナルと作動的に連結している。本明細書において、「作動的に連結している」という用語は、（ｃＤＮＡ分子である）本発明のポリヌクレオチド、ならびに発現調節配列、例えば転写プロモーターおよび終結配列を含有するポリヌクレオチド（ＤＮＡ）がベクターまたは細胞中に位置し、その結果、ｃＤＮＡによってコードされる抗原の発現が発現調節配列によって制御されることを意味する。ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードするｃＤＮＡなどのＤＮＡをクローン化し、発現調節配列を含有するＤＮＡをそれと作動的に連結する方法は当技術分野で周知である。組換えウイルスベクター中でのＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の発現に適したプロモーターの例は、サイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）前初期プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターなどの誘導性プロモーターである。終結およびポリ（Ａ）シグナルを有するＤＮＡの例は、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）領域である。抗原の産生に適したウイルス発現系の他の例は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なシンドビス発現系である。市販されている発現ベクターおよび発現系の使用は当技術分野で周知である。
【００７２】
核酸またはＤＮＡ分子ワクチン
本発明のさらなる実施形態では、ネコにおいて活発な免疫応答を誘発する核酸またはＤＮＡ分子ワクチンとしてワクチンが提供される。ＤＮＡ分子ワクチンは、本明細書で開示されるＦＣＶキャプシドタンパク質のキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする核酸配列を有するＤＮＡからなる。
【００７３】
好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子ワクチンは、配列番号１３、１５、もしくは１７または配列番号１３、１５、もしくは１７の特異的免疫原性断片をコードする配列番号１２、１４、もしくは１６、またはその断片の核酸配列を含む。キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする核酸は、転写プロモーターで、またはその近くで作動的に連結している。これにより、核酸をネコの細胞中に接種したときに核酸からのキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の転写が可能となる。好ましくは、ＤＮＡ分子はプラスミドである。ＤＮＡワクチンに有用なプロモーターは当技術分野で周知であり、そのプロモーターには、それだけに限らないが、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、およびＳＶ４０Ｔ抗原プロモーターがある。核酸が、キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする配列の終結コドンでまたはその近くで、転写終結シグナルおよびポリ（Ａ）認識シグナルを含む核酸断片と作動的に連結していることがさらに好ましい。許容される薬学的担体、またはＦｅｌｇｎｅｒの米国特許第５，７０３，０５５号中で開示されているものと類似した脂質もしくはリポソーム担体中のＤＮＡワクチンをネコに提供する。ＤＮＡワクチンは、筋内注射、イントラジェット（ｉｎｔｒａｊｅｔ）注射や、微粒子銃などの様々な方法によってネコに提供することができる。ＤＮＡワクチンの作製およびその使用方法は、どちらもＦｅｌｇｎｅｒの米国特許第５，５８９，４６６号と第５，５８０，８５９号において示されている。最後に、医薬品用品質のプラスミドＤＮＡを作製する方法は、Ｍａｒｑｕｅｔらの米国特許第５，５６１，０６４号で教示されている。
【００７４】
したがって、上記の方法を使用して、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を発現するＤＮＡワクチンを使用して、病原性ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作する。ＤＮＡワクチンの利点は、好都合なことに、ＤＮＡ分子が、ワクチンを産生するための単純かつ安価な手段であるプラスミドとして増殖され、ワクチンが生でないので、生の組換えウイルスベクターワクチンに関係する規制の問題の多くがＤＮＡワクチンでは問題とならないことである。当業者なら、本発明のＤＮＡワクチンが、当技術分野で周知の化学合成の方法によって作製された、合成により生成された核酸を含んでよいことを理解するであろう。
【００７５】
単離および精製されたＦＣＶキャプシドタンパク質
本発明のさらなる実施形態では、ワクチンは、単離および精製されたＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片からなる。具体的には、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片が配列番号１３、１５、１７のアミノ酸配列を含むワクチンが提供される。好ましくは、キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片は、単離および精製してワクチンを作製することができる抗原を産生する組換え細菌または真核生物発現ベクター中で産生される。例えば、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片は、細菌、酵母や真菌などの微生物中で、哺乳動物細胞や昆虫細胞などの真核生物細胞中で、またはアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルスやセンダイウイルスなどの組換えウイルスベクターを介して産生される。ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の産生に適した細菌には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、または異種ポリペプチドを発現することができる任意の他の細菌がある。ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の発現に適した酵母の種類には、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、または異種ポリペプチドを発現することができる任意の他の酵母がある。上記の細菌、真核細胞または組換えウイルスベクターを使用してワクチン用の抗原を産生する方法は、当技術分野で周知である。
【００７６】
キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片からなるワクチンを作製するには、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする核酸をプラスミド中にクローン化し、その核酸を、微生物中でキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の発現を実施するプロモーターと作動的に連結する。適切なプロモーターには、それだけに限らないが、Ｔ７ファージプロモーター、Ｔ３ファージプロモーター、β−ガラクトシダーゼプロモーター、およびＳｐ６ファージプロモーターがある。微生物中でのＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の発現によって、大量の組換え抗原ポリペプチドの生産に商業的に使用される発酵技術を使用してキャプシドタンパク質を生産することが可能となる。抗原を単離および精製する方法は当技術分野で周知であり、その方法には、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーや遠心分離などの方法がある。
【００７７】
ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の単離を促進するために、融合ポリペプチドを作製し、キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を、アフィニティークロマトグラフィーによる単離を可能にする他のポリペプチドと連結する。好ましくは、下記の発現系の１つを使用して融合ポリペプチドを作製する。例えば、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードするｃＤＮＡ核酸配列を、５’末端または３’末端で、ポリペプチドをコードする核酸と連結する。核酸を適当なコドンの読み枠で連結して融合ポリペプチドの産生を可能にし、キャプシドタンパク質またはその部分のアミノ末端および／またはカルボキシル末端をポリペプチドと融合し、それによって融合ポリペプチドとして抗原の回収を単純化することが可能となる。融合ポリペプチドはまた、精製中に抗原が分解されることを防止することができる。融合ポリペプチドを含むワクチンは有効であるが、ある場合には、精製後に第２のポリペプチドを除去することが望ましい可能性がある。したがって、融合ポリペプチドが、抗原とポリペプチドの結合部に切断部位を含有することも意図される。切断部位は、その部位のアミノ酸配列に特異的な酵素で切断されるアミノ酸配列からなる。意図されるそのような切断部位の例には、エンテロキナーゼによって切断されるエンテロキナーゼ切断部位、第Ｘａ因子によって切断される第Ｘａ因子切断部位、ＧＥＮＥＮＡＳＥによって切断されるＧＥＮＥＮＡＳＥ切断部位（ＧＥＮＥＮＡＳＥは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙの商標である）がある。下記のものは、融合ポリペプチド、またはポリペプチドを含まない単離抗原としてキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を産生する方法である。
【００７８】
ワクチンで使用する融合ポリペプチドとしてＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を産生する原核生物発現系の例は、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１発現ベクタープラスミドを使用する、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙから入手可能なグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合系である。キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードするｃＤＮＡを、適当なコドンの読み枠で、ＧＳＴをコードするＤＮＡと融合する。融合ポリペプチドのＧＳＴ部は、グルタチオンセファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィーを使用した融合ポリペプチドの迅速な精製を可能にする。精製後、融合ポリペプチドのＧＳＴ部分をトロンビンや第Ｘａ因子などの部位特異的プロテアーゼでの切断により除去して、ＧＳＴポリペプチドを含まない抗原を産生することができる。ＧＳＴポリペプチドを含まないキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片は、２回目のグルタチオンセファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィーによって産生される。
【００７９】
ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を含むワクチンを作製する他の方法は、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で、抗原をコードするｃＤＮＡとポリヒスチジンをコードするＤＮＡコドンを連結する方法である。ポリヒスチジンは、好ましくは、６個のヒスチジン残基を含み、それによって、金属アフィニティークロマトグラフィー、好ましくはニッケルアフィニティークロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの精製が可能となる。ポリヒスチジンを含まないキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を産生するには、エンテロキナーゼ切断部位などの切断部位を、適当なコドンの読み枠で、ポリヒスチジンをコードするコドンと、抗原をコードするコドンの間に融合する。エンテロキナーゼでの切断、その後の、遊離ポリヒスチジンを結合する２回目の金属アフィニティークロマトグラフィーによって、抗原からポリヒスチジンを除去する。この方法は、ペスト菌（Ｙ． ｐｅｓｔｉｓ）のＬｃｒＶ抗原の調製に有用であることが示され、それはＭｏｔｉｎら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：４３１３〜４３１８（１９９６））で開示された。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄから入手可能なＸｐｒｅｓｓ系は、ポリヒスチジン−ポリペプチド融合タンパク質を作製し次いでそれを単離するのに利用可能な市販のキットの例である。
【００８０】
ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を含むワクチンを作製するさらなる方法は、Ｍｏｔｉｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６４：３０２１〜３０２９（１９９５）によって開示される方法を使用する。Ｍｏｔｉｎらは、プロテインＡの部分をコードするＤＮＡと連結した抗原をコードするＤＮＡからなる、融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを開示し、エンテロキナーゼ切断部位をコードするＤＮＡが、プロテインＡと抗原をコードするＤＮＡ間の適当なコドンの読み枠中に介在する。プロテインＡは、ＩｇＧアフィニティークロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの単離を可能にし、エンテロキナーゼでの切断により、プロテインＡを含まないキャプシドタンパク質が産生される。次いで、２回目のＩｇＧアフィニティークロマトグラフィーによってプロテインＡが除去される。
【００８１】
ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を含むワクチンを作製する他の方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｄａｎｉｅｌｓらの米国特許第５，７２５，８６３号で開示される方法に基づく。Ｄａｎｉｅｌｓらの方法を使用して、各分子がＦＣＶキャプシドタンパク質の１００アミノ酸残基以上を挿入したエンテロトキシン分子からなるＦＣＶキャプシドワクチンを作製することができる。本発明のワクチンの作製に使用することができる、融合ポリペプチドワクチンを作製する他の方法は、Ｍｏｎｄらの米国特許第５，５８５，１００号、およびＬｉｓｃｏｍｂｅの米国特許第５，５８９，３８４号で開示されている。最後に、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能なｐＭＡＬ融合および精製系が、融合ポリペプチドを作製する方法の他の例であり、マルトース結合タンパク質をキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片に融合する。マルトース結合タンパク質は、アミロースアフィニティークロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの単離を促進する。マルトース結合タンパク質を含まない抗原を作製することを可能にする上記で述べた切断部位の１つによって、マルトース結合タンパク質を抗原と連結することができる。
【００８２】
ワクチン用のＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の産生に細菌の方法が使用されるが、真核生物発現系中でキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を産生することが望ましい可能性がある。特に有用な系は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｍａｔｓｕｕｒａらの米国特許第５，２２９，２９３号で開示されているバキュロウイルス発現系である。キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の産生に適したバキュロウイルス発現ベクターは、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＰｂａｃおよびｐＭｂａｃベクター；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄから入手可能なＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅベクター、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ベクター、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２−Ａ、Ｂ、Ｃ、およびｐＭｅｌＢａｃである。
【００８３】
ワクチン用のＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の発現に有用な他の真核生物系は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なＥＳＰ酵母タンパク質発現および精製系などの酵母発現系である。他の酵母発現系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）に基づく発現系のいずれか１つである。哺乳動物発現系も本発明によって包含される。哺乳動物発現系の例は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＬａｃＳｗｉｔｃｈＩＩ系、ｐＢＫファージミド、ｐＸＴ１ベクター系、およびｐＳＧ５ベクター系；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎから入手可能なｐＴａｒｇｅＴ哺乳動物発現ベクター系、ｐＳＩ哺乳動物発現ベクター、ｐＣＩ哺乳動物発現ベクター、およびｐＡｄＶａｎｔａｇｅベクター；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なエクジソン誘導哺乳動物発現系、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、およびｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐである。
【００８４】
本発明は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ａｃｈｅｓｏｎらの米国特許第５，８００，８２１号で教示される方法に従って作製される熱安定性胞子送達系の構成成分としてＦＣＶキャプシドタンパク質またはキャプシドタンパク質の特定のエピトープを含むワクチンからなる実施形態をさらに含む。したがって、本発明は、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする核酸を含有する遺伝子操作された細菌細胞を提供する。組換え細菌胞子ワクチンをネコに経口投与したとき、胞子がネコの胃腸管で出芽し、細菌がキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を発現し、それがネコの免疫系と接触し、免疫応答を誘発するようになる。そのワクチンは、熱安定性であるという利点を有し、したがって、それは無期限に室温で貯蔵することができる。
【００８５】
受動免疫ワクチン
本発明の上記の実施形態はネコカリシウイルスに対する能動免疫をもたらすが、本発明は、ネコカリシウイルスに対する受動免疫をもたらすワクチンをさらに含む。ネコカリシウイルスに対する受動免疫を誘発するワクチンは、ＦＣＶキャプシドタンパク質、その特異的免疫原性断片、またはＦＣＶウイルス全体に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体からなる。
【００８６】
ポリクローナル抗体を含む受動免疫ワクチンを作製するには、そのＦＣＶキャプシドタンパク質、またはその特異的免疫原性断片を、抗体の調製に適した宿主中に注射し、好ましくは、宿主はウマ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、またはヤギである。これらの宿主からポリクローナル抗体ワクチンを作製する方法は当技術分野で周知である。一例として、キャプシドタンパク質もしくはその特異的免疫原性断片またはカリシウイルスＦＣＶキャプシド全体を、フロイント完全アジュバントや、ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒｐ．、ジョージア州Ｎｏｒｃｒｏｓｓから入手可能な毒性の低いＴｉｔｅｒＭａｘなどのアジュバントと混合し、次いで、当技術分野で周知の方法によってそれを宿主に投与する。抗体産生をモニターし、十分な抗体が産生されたとき、宿主から血清を取り出し、好ましくは血清から抗体を回収する。
【００８７】
受動免疫ワクチンは、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはＦＣＶウイルス全体の１つまたは複数のエピトープに対する１つまたは複数のモノクローナル抗体を含んでよい。モノクローナル抗体を産生する方法およびハイブリドーマは当技術分野で周知である。当技術分野で周知のハイブリドーマ技術を使用してモノクローナル抗体を作製することができるが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｍａｒｋｓらの米国特許第５，９７７，３２２号で開示されているものなどのファージディスプレイ法に従って、抗原に対するモノクローナル抗体を作製することもできる。キャプシドタンパク質またはその部分に対するネコ化抗体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、どちらもＱｕｅｅｎらの米国特許第５，６９３，７６２号および第５，６９３，７６１号で開示されているものなどの、抗体をヒト化するのに使用されている方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体の作製に有用なファージディスプレイキットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手可能なＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍである。
【００８８】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
本発明はまた、いくつかの非常に重要なモノクローナル抗体を含み、それについて記載し特許請求するものである。ここで、これらの抗体は、本明細書に記載のウイルス株を迅速に同定し、ある場合にはそれを定義するために開発された。モノクローナル抗体の具体例およびその記載は、下記の実施例で見出すことができる。具体的には、実施例１−２および表１−２、特に実施例１−８、表１−４を参照されたい。
【００８９】
下記の実施例は、本発明のさらなる理解を促進するが、それを限定しないものとする。
【実施例】
【００９０】
第１部の実施例
（実施例１−１）
ＦＣＶ−２１の単離および増殖
１９９３年６月に、ミシガン州Ａｎｎ Ａｒｂｏｒのネコのショーからネコカリシウイルス（ＦＣＶ）株２１（ＦＣＶ−２１）を収集した。それを１％の培地を含有する９６穴用微小管中で希釈し、１：１０希釈物を作製した。希釈した試料１００ｕｌを、９６穴プレート中でＣＲＦＫ細胞１００ｕｌに添加した。
【００９１】
９６穴プレート中で、限界希釈によりＦＣＶ−２１ウイルスを３回精製した。最終精製物からウイルス上清を取り出し、それを使用して、Ｔ２５フラスコ中で集密度７５％まで増殖させたＣＲＦＫ細胞に感染させた。１００％のＣＰＥが観察されたとき、懸濁液の凍結／解凍を３回行い、それを分注して凍結バイアル（１ｍｌ／バイアル）にした。このウイルスストックの力価は、１．５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌであると決定された。
【００９２】
ＦＣＶ−２１は米国基準菌株保存機構（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ ２０１１０、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ １０８０１に寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−＿を割り当てられた。
【００９３】
（実施例１−２）
様々な市販のまたは既存のモノクローナル抗体を使用したＦＣＶ−２１の免疫蛍光法およびＥＬＩＳＡ
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）では、ＦＣＶ−２１のウイルスストックを使用して、約９０％の集密度まで増殖させたＮＬＦＫ細胞を播いた２４穴プレートに感染させた。感染から約２０時間後、プレートを１×ＰＢＳで２回洗浄し、８０％アセトンで固定した。様々なモノクローナル抗体を約２ｕｇ／ｕｌに希釈し、それをプレートの個々の穴に添加した（１穴当たり０．２ｍｌ）。室温（ＲＴ）で撹拌しながら１時間インキュベートした後、各穴を１×ＰＢＳで２回洗浄し、二次抗体（抗マウスＦＩＴＣ、１０ｕｇ／ｍｌ）を添加した。プレートをアルミニウムホイルで被覆し、ＲＴで撹拌しながら３０分間インキュベートした後、各穴を１×ＰＢＳで２回洗浄し、風乾した。次いで、蛍光顕微鏡下で、ＦＩＴＣでの染色の強度について各穴を観察した。
【００９４】
ＥＬＩＳＡアッセイでは、炭酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３１．５９ｇおよびＮａＨＣＯ３２．９３ｇを水１リットル中に溶解）で１：１５００に希釈した抗ＦＣＶウサギポリクローナル抗体（Ｐｆｉｚｅｒ＃１６）２００ｕｌで９６穴ＥＬＩＳＡプレートをコートした。プレートを４℃で１晩インキュベートした。プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、次いで、ＰＢＳＴ中の１％カゼイン２００ｕｌで、３７℃で１時間ブロッキング処理した。様々なモノクローナル抗体を約０．１ｕｇ／ｍｌに希釈し、それを個々の穴に添加した（１穴当たり１００ｕｌ）。各試料を３連で行った。３７℃で１時間インキュベートした後、各穴をＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２００に希釈したペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５−０３５−１５０）１００ｕｌとともに３７℃で１時間インキュベートした。次いで各穴をＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、カタログ番号５０−６６−１８）を各穴に１００ｕｌ添加した。ＲＴで約１０分後、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５〜４９０ｎｍ（二重波長）でプレートを読み取った。シグナル／ノイズ比に基づいて比活性を計算した。
【００９５】
ＩＦＡとＥＬＩＳＡアッセイのデータの組は、互いによく相関し（表１−２）、そのデータの組から、ＦＣＶ−２１が、一般に使用されるＦＣＶワクチン株であるＦ９と免疫学的に異なることが示唆された。２つのモノクローナル抗体（ＦＣＶ１−４３およびＭＡＢ７９１Ｐ）がＦ９と反応したが、ＦＣＶ−２１とは反応しなかった（表１−２）。
【００９６】
【表２】
【００９７】
（実施例１−３）
ＦＣＶ−２１のキャプシド配列分析
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を使用して、ＦＣＶ−２１感染細胞培養物の上清から全ＲＮＡを単離した。ランダムプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して「第１鎖」ｃＤＮＡ調製物を合成した。ＸＬ ｒＴｔｈポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）ならびにオリゴヌクレオチドプライマーＤＥＬ−６５３（配列番号１）およびＤＥＬ−６５１（配列番号２）を使用してＰＣＲ反応を行った。ＢｉｇＤｙｅ化学反応法およびＡＢＩ３７７ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、得られたＰＣＲ産物の配列を決定した。完全なキャプシド配列は、ヌクレオチド配列については配列番号１２として、コードされたアミノ酸配列については配列番号１３として列挙する。
【００９８】
（実施例１−４）
ＦＣＶ−４９の単離および増殖
１９９３年に、ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａのネコのショーからネコカリシウイルス（ＦＣＶ）株４９（ＦＣＶ−４９、ＰＨＡ−４９とも呼ばれる）を収集した。その検体を、１％の培地を含有する９６穴用微小管中で希釈し、１：１０希釈物を作製した。希釈した試料１００ｕｌを、９６穴プレート中でＣＲＦＫ細胞１００ｕｌに添加した。９６穴プレート中で、限界希釈によりＦＣＶ−４９ウイルスを３回精製した。最終精製物からウイルス上清を取り出し、それを使用して、Ｔ２５フラスコ中で集密度７５％まで増殖させたＣＲＦＫ細胞に感染させた。１００％のＣＰＥが観察されたとき、懸濁液の凍結／解凍を３回行い、それを分注して凍結バイアル（１ｍｌ／バイアル）にした。このウイルスストックの力価は、６．８×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌであると決定された。
【００９９】
ＦＣＶ−４９は米国基準菌株保存機構（ＡＴＣＣ）、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ ２０１１０、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ １０８０１に寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−＿を割り当てられた。
【０１００】
（実施例１−５）
ＦＣＶ−４９のキャプシド配列分析
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を使用して、ＦＣＶ−４９感染細胞培養物の上清から全ＲＮＡを単離した。ランダムプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して「第１鎖」ｃＤＮＡ調製物を合成した。ＸＬ ｒＴｔｈポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）ならびにオリゴヌクレオチドプライマーＤＥＬ−６５３（配列番号１）およびＤＥＬ−６５１（配列番号２）を使用してＰＣＲ反応を行った。ＢｉｇＤｙｅ化学反応法およびＡＢＩ３７７ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、得られたＰＣＲ産物の配列を決定した。完全なキャプシド配列は、ヌクレオチド配列については配列番号１４として、コードされたアミノ酸配列については配列番号１５として記載する。
【０１０１】
（実施例１−６）
ＦＣＶ−２６３９１−４の単離および増殖
２００３年に、Ｈｕｍａｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂａｙ Ｃｏｕｎｔｙ（フロリダ州Ｐａｎａｍａ Ｃｉｔｙ）からネコカリシウイルス（ＦＣＶ）株２６３９１−４（ＦＣＶ−２６３９１−４）を収集した。２％ウシ胎児血清入りのＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する９６穴プレート中で、限界希釈によりそれを１回精製した。次いでその精製ウイルスを使用して、ＮＬＦＫ（Ｎｏｒｄｅｎ Ｌａｂネコ腎）細胞を含有するＴ１５０フラスコに感染させた。１００％のＣＰＥに達した後、懸濁液の凍結／解凍を１回行い、それを分注して凍結バイアル（０．８５ｍｌ／バイアル）にした。このストックのウイルス力価は、５．６×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌであると決定された。
【０１０２】
ＦＣＶ−２６３９１−４は米国基準菌株保存機構（ＡＴＣＣ）、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ ２０１１０、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ １０８０１に寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−＿を割り当てられた。
【０１０３】
（実施例１−７）
ＦＣＶ−２６３９１−４のキャプシド配列分析
ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）を使用して、ＦＣＶ−２６３９１−４感染細胞培養物の上清から全ＲＮＡを単離した。約１ｕｇのウイルスＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｗｉｔｈ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で使用した。反応条件は下記の通りであった：５０℃で３０分；９４℃で２分；その後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、および７０℃で２分を４０サイクル；その後７２℃で１０分の最後のインキュベーションを行い、４℃で貯蔵。使用したプライマーは、ＦＣＶ−Ｎ２（配列番号３）およびＦＣＶ−プライマー２（配列番号９）であった。次いで、様々なオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、および１１）を使用してＰＣＲ産物の配列を決定した。ＦＣＶ−２６３９１−４のキャプシド全体の配列は、ヌクレオチド配列については配列番号１６として、コードされたアミノ酸配列については配列番号１７として示す。
【０１０４】
ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ−２６３９１−４由来のキャプシド遺伝子のアミノ酸配列を、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な完全長ＦＣＶキャプシド配列すべてと整列させた。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）、ＰＡＭ２５０重み行列（Ｄａｙｈｏｆｆら、１９７８）、および初期設定プログラムパラメーター（ＭｅｇＡｌｉｇｎ；ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．；ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して、アラインメントを作成した。ＧｅｎＢａｎｋ中のすべての登録配列の中で最も高い、ＦＣＶ−２１とＦＣＶ２１３−９５のキャプシドタンパク質配列間での同一性は９０．７％である。ＦＣＶ−４９とＦＣＶ２１３−９５のキャプシド配列は９２．２％同一である。ＦＣＶ２６３９１−４とＦＣＶ ＣＦＩ−６８のキャプシド配列は互いに９１．３％同一である。
【０１０５】
ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ−２６３９１−４について単一のキャプシド配列を示し、それは、得られたＰＣＲ産物の直接配列決定に基づいている。しかし、これらの各配列は、ＲＮＡウイルス集団内に存在することが知られているウイルス準種（総説については、Ｄｏｍｉｎｇｏら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．８２：３９〜４４；２００２を参照）の集団の間での平均または共通の配列を表す。準種は、ＲＮＡゲノム複製の間に起こる誤りの直接的な結果物であり、そのゲノム内に突然変異を有する子孫を生じさせる。したがって、これらおよび他のＦＣＶキャプシド遺伝子配列についてキャプシド配列の少量の変異体が天然に存在することが予想される。しかし、各配列内の突然変異の分布は、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ−２６３９１−４を含めた株間での全体的な同一性にほとんど／全く影響を及ぼさないようなものである。
【０１０６】
（実施例１−８）
ＦＣＶ−２１に特異的なモノクローナル抗体の生成
Ａ．ＦＣＶ−２１の精製。ＦＣＶ−２１を感染させたＮＬＦＫ細胞の細胞培養上清約２００ｍｌを、３０００ｒｐｍで、１０℃で３０分間遠心分離した。上清２５ｍｌをＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｌｅａｒ遠心分離管中に移し、１０％スクロース溶液１０ｍｌを管の底に入れた。次いで、２７，０００ｒｐｍで管を１５℃で２時間遠心分離した。遠心分離後、上清を取り出しそれを捨て、滅菌水２５０ｕｌ中でペレットを再懸濁した。Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を使用して、タンパク質濃度が７ｍｇ／ｍｌであると決定された。
【０１０７】
マウスの免疫感作およびハイブリドーマ細胞クローンの生成
精製ＦＣＶ−２１ウイルスタンパク質約１００ｕｇを、フロイントアジュバントと一緒に各マウスに注射した。マウス８匹にワクチン接種した。ＲＩＢＩアジュバントを伴う精製ＦＣＶ−２１ １００ｕｇを用いて追加免疫感作を４週間の間隔で２回実施した。この８匹のマウスの免疫応答が、精製ＦＣＶ−２１を使用したＥＬＩＳＡで３１２５０以上の力価を有することが決定された。細胞融合を実施してハイブリドーマクローンを作製した。そのような細胞クローン６８個を増殖させ、ＦＣＶ−２１との反応性について上清を試験した。
【０１０８】
このＥＬＩＳＡでは、９６穴ＥＬＩＳＡプレートを、１×ＰＢＳで希釈した濃度５ｕｇ／ｍｌの精製ＦＣＶ１００ｕｌでコートした。加湿していないインキュベーター中で覆いをかけずにプレートを３７℃で１晩乾燥させた。メタノール０．１ｍｌをかけ室温で５分間インキュベートすることによってプレート上のウイルスを固定した。次いでプレートを蒸留水で８回洗浄し、次いで、１×ＰＢＳ中の１０％ウマ血清２００ｕｌで、４℃で１晩ブロッキング処理した。再度プレートを蒸留水で８回洗浄した。マウス血清試料の様々な希釈物を個々の穴に添加した（１穴当たり１００ｕｌ）。各試料を３連で行った。３７℃で１時間インキュベートした後、各穴をＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２００に希釈したペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５−０３５−１５０）１００ｕｌとともに３７℃で１時間インキュベートした。次いで各穴をＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、カタログ番号５０−６６−１８）を各穴に１００ｕｌ添加した。ＲＴで約１０分後、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５〜４９０ｎｍ（二重波長）でプレートを読み取った。シグナル／ノイズ比に基づいて比活性を計算した。
【０１０９】
ＦＣＶ−２１特異的モノクローナル抗体の反応性
上記のハイブリドーマ細胞クローンの上清を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイでＦＣＶ−２１ならびにＦ９に対するその反応性について試験した。簡潔に述べると、炭酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３１．５９ｇおよびＮａＨＣＯ３２．９３ｇを水１リットル中に溶解）で１：１５００に希釈した抗ＦＣＶウサギポリクローナル抗体（Ｐｆｉｚｅｒ＃１６）２００ｕｌで９６穴ＥＬＩＳＡプレートをコートした。プレートを４℃で１晩インキュベートした。プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、次いで、ＰＢＳＴ中の１％カゼイン２００ｕｌで、３７℃で１時間ブロッキング処理した。ＦＣＶ−２１およびＦ−９の上清を、１：１０の希釈で各穴に添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、様々なハイブリドーマの上清およびその様々な希釈物を個々の穴に３連で添加した（１穴当たり１００ｕｌ）。次いでプレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２００に希釈したペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５−０３５−１５０）１００ｕｌとともに３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、カタログ番号５０−６６−１８）を各穴に１００ｕｌ添加した。ＲＴで約１０分後、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５〜４９０ｎｍ（二重波長）でプレートを読み取った。シグナル／ノイズ比に基づいて比活性を計算した。
【０１１０】
【表３−１】
【０１１１】
【表３−２】
【０１１２】
Ｂ．ＦＣＶ−２１に特異的であり、他のＦＣＶ株には特異的でないモノクローナル抗体。１８個のハイブリドーマ細胞クローン（３、７、１７、２３、２７、２９、３０、３６、３７、４０、４１、４２、４４、５３、５６、５９、６０および６１）を選択して、ＦＣＶ−２１に対するその特異性についてさらに試験した。１１種のＦＣＶウイルスをアッセイで使用した（ＦＣＶ−２１、４９、２６３９１−４、Ｆ９、ＣＦＩ−６８、３３５８５、８９３９１、２５５、Ｊ−１、２２８０およびＨ）。さらに、上記に記載のように、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した。結果の概要を表１−４に示す。
【０１１３】
【表４】
【０１１４】
上記で示したように、ハイブリドーマ細胞系統２３、４１、４４および５６はＦＣＶ−２１に特異的であり、試験した他のどのＦＣＶにも特異的でない。したがって、ＦＣＶ−２１の診断ツールとしてこれらのモノクローナル抗体を使用することができる。さらに、ハイブリドーマ３６は、ワクチンＦＣＶ株だけ（ＦＣＶ−２１、４９、２６３９１−４）と反応し、他のどのＦＣＶ株とも反応しないように思われる。
【０１１５】
ハイブリドーマ細胞系統２３、３６、４１、４４および５６はすべて米国基準菌株保存機構（ＡＴＣＣ）、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ ２０１１０、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ １０８０１に寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号：
ＰＴＡ−７３４９（２３）
ＰＴＡ−７３５０（３６）
ＰＴＡ−７３５３（４１）
ＰＴＡ−７３５１（４４）
ＰＴＡ−７３５２（５６）
を割り当てられた。
【０１１６】
（実施例１−９）
１９９３年に単離されたＦＣＶウイルスに対するＦＣＶ−２１およびＦＣＶ−４９の血清の血清交差中和分析
Ａ．同種抗血清の力価測定。１２種のＦＣＶ単離物に対する回復期抗血清を特定病原体除去（ＳＰＦ）ネコで産生させ、１回目および２回目の接種後に収集した。ウイルス接種物はストックの力価に応じて様々であり、ネコ１匹当たり１０４〜１０８ＴＣＩＤ５０であった。最初にネコに接種を行い、３週間後に追加免疫し、次いで追加免疫から２週間後に血清用にそれを出血させた。１２種の単離物には、Ｆ９、ＣＦＩ−６８、ＬＳＯ１２、ＪＯＫ６３、ＪＯＫ９２、ならびに野外単離物１８、２１、４９、５０、５４、２７、および１１があった。野外単離物は、各株のキャプシドタンパク質配列の、超可変領域の配列の系統発生分析に基づいて選択した。最も分岐している単離物を試験用に選択した。
【０１１７】
血清を５６℃で３０分間熱非働化し、標準的な不変ウイルス−可変血清技術（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｖｉｒｕｓ−ｖａｒｙｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（Ｇｒｉｅｓｔ １９７９、Ｍａｈｙ １９９６）を使用してその同種ウイルスに対する力価測定を行った。簡潔に述べると、培地（１００〜１５０μｌ）を９６穴組織培養プレートの各穴に添加した。血清（１００〜１５０μｌ）を一番上の列の各穴に添加し（最初の１：２または１：４血清希釈物；Ｆ９およびＬＳＯ１２は１：４）、多連式ピペッターで混合後（１：２希釈）１００μｌをプレートの下方へと移した。最後の１００μｌを捨てた。力価測定した同種ウイルス（５０μｌ当たり２００ＴＣＩＤ５０に希釈）５０μｌを各穴に添加し、ＣＯ２インキュベーター中でプレートを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁させたＣＲＦＫ細胞の１：１０希釈物５０μｌを各穴に添加した。適当な接種物が各穴に確実に添加されるように、希釈したウイルスを使用してウイルス力価測定プレートを構成した。培地１５０μｌを含有する一番上の列中にウイルス５０μｌを使用し、プレートの残りは１穴当たり１８０μｌを含有し、２０μｌを用いてプレートの下方へと１０倍希釈を実施した。プレートを４日間インキュベートし、Ｋａｒｂｅｒの公式を使用して血清とウイルスの力価をどちらも計算した（血清の力価の場合、防御されなかった穴に対する防御された穴の割合を方程式中で使用した）。
【０１１８】
血清の力価測定のとき、ＴＣＩＤ５０は、５０％中和の終点の希釈率と定義した（Ｇｒｉｅｓｔ １９７９）。１抗体価（ＡＵ）は、試験培養物の５０％で３２〜３２０ＴＣＩＤ５０の同種ウイルスを中和することができる抗血清の最も高い希釈率と定義した。したがって、得られたＴＣＩＤ５０は１ＡＵと等しい。２．５、５、１０および２０ＡＵの血清濃度に対してウイルス交差中和を実施した。
【０１１９】
Ｂ．ウイルス交差中和アッセイ。各ウイルス野外単離物、ならびにＦ９、ＬＳＯ１２、ＪＯＫ６３、ＪＯＫ９２、ＳＡ１１３およびＣＦＩ−６８を、交差中和アッセイにおいて１２種の各ＦＣＶ抗血清に対して試験した。各ウイルスについて９６穴プレートを５枚必要とした。各血清を２．５、５、１０および２０ＡＵに希釈し、プレートの下方へと８個の複製物をそのプレート（プレート１枚当たり血清３種、合計でプレート４枚）および（血清力価測定と同様にして構成した）ウイルス力価測定プレートに入れた。最初に血清を２０ＡＵに希釈し、次いで２倍希釈を実施して２．５ＡＵまで下げることによりＤＭＥＭ中で抗血清希釈物を調製した。次いで各希釈物のアリコート（１００μｌ）をプレート上の穴の各カラムに添加した。ウイルスを３７℃で迅速に解凍し、それを氷上に置き、次いで１穴当たり２００ＴＣＩＤ５０に希釈した（氷上で維持した）。一貫性を維持するために、ほとんどのウイルスストックで３ステップの希釈工程を使用し、どのステップでも１：１００より高くはならなかった。希釈したウイルスストック（５０μｌ）を血清プレートのすべての穴に添加し、前記に記載したように力価測定を行った。ＣＯ２インキュベーター中でプレートを３７℃で２時間インキュベートし、その後周密状態まで予め増殖させたＣＲＦＫ細胞懸濁液の１：１０希釈物５０μｌを各穴に添加した。ピペットチップおよび貯蔵トラフは、プレート５枚の各セット後に交換した。４日後にプレートをスコア化した。一部の場合では、予め力価測定し予め希釈したウイルスを使用した。
【０１２０】
【表５−１】
【０１２１】
【表５−２】
【０１２２】
交差中和データの概要を表１−５に示す。各データ点は、アッセイを行った８個の複製穴を表す。「Ｎ」、「ｎ」、または「−」は、防御されなかった穴に対する防御された穴の割合を表し、それは、交差中和の程度を示すものである。その同種ウイルスに対して試験した各単一特異性血清と対応する血清中和の結果を表中で太字表記している。これらの血清は完全に中和するはずであり、その大部分については中和する。少数の例外、最も顕著にはＪＯＫ６３、ＪＯＫ９２および１１は高いＡＵ値で完全な中和を示すが、２．５ＡＵでは示さない。これは、希釈の誤りに起因する可能性が高い。このデータ組の最も著しい結果は、血清ＦＣＶ−２１およびＦＣＶ−４９、特に後者によって示された高度の交差中和である。これらの血清の交差中和のパターンはＦ９のものと類似しているように思われる。（Ｆ９のデータ組、ならびに２０ＡＵでのＦＣＶ−２１およびＦＣＶ−４９のデータ組が、血清の量が不十分であることにより不完全であることに留意されたい。）３種の血清（ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９、およびＦ９）間で中和パターンにいくらかの違いが認められるが、単離物１１、３８および３９は、その３種のどれによっても一貫して中和されなかった。
【０１２３】
（実施例１−１０）
２００３年に単離されたＦＣＶウイルスに対するＦＣＶ−２１およびＦＣＶ−４９抗血清の交差中和分析
この試験におけるＦＣＶ抗血清は、１０５〜１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＦＣＶをネコ（１群当たりネコ４〜５匹）に鼻内接種することによって生成した。同量のウイルスを使用して、３週間後に追加接種を実施した。追加免疫から２週間後に血清を収集し、それを５６℃で３０分間熱処理した。
【０１２４】
ワクチン接種した各ネコの血清試料を、２６種の各ＦＣＶ株（表１−６）に対する血清中和アッセイで使用した。血清試料を１：８に希釈し、その後体積６００ｕｌで１：１６３８４まで連続２倍希釈（合計１２回の希釈）を行った。６００ｕｌ中で力価が５０〜５００ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＦＣＶを、希釈した血清試料と混合し、それを室温で４５分間インキュベートした。次いで試料２００ｕｌを、ＣＲＦＫ細胞を４連で播いた９６穴プレートの各穴に移した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートし、終点の中和力価を決定した。血清中和（ＳＮ）力価と誘発ウイルス逆力価はどちらもＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの方法（Ｓｐｅａｒｍａｎ Ｃ、１９０８、Ｂｒｉｔ Ｊ Ｐｓｙｃｈｏｌ ２：２２７〜２４２；Ｋａｒｂｅｒ Ｇ、１９３１、Ａｒｃｈ ｅｘｐ Ｐａｔｈ Ｐｈａｒｍａｋ １６２：４８０〜４８７）によって計算した。
【０１２５】
＞２３および＞１５および＞１０の遮断力価を用いて血清中和データを分析した。その結果を表１−７に示す。そのデータから、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４が幅広い交差中和特性を有し、したがって現在のＦＣＶワクチン株Ｆ９より良好なワクチンの候補であることが示唆される。
【０１２６】
【表６】
【０１２７】
【表７】
【０１２８】
（実施例１−１１）
ＦＣＶ−２１を伴うＦＥＬＯＣＥＬＬ４構成成分およびＦＣＶ−２１を伴わないＦＥＬＯＣＥＬＬ４構成成分でワクチン接種したネコの死亡率および臨床スコア
約８週齢の、家庭向けの短毛のネコに、他のＦＣＶ株であるＦＣＶ−２１を伴うまたは伴わない、改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス［ＦＨＶ］、カリシウイルス［ＦＣＶ−Ｆ９］、汎白血球減少ウイルス［ＦＰ］およびオウム病クラミジアを含有するＦＥＬＯＣＥＬＬ４（登録商標）構成成分でワクチン接種した。評価したワクチン接種法には以下のものがあった：最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に皮下追加免疫（ＳＱ／ＳＱ）；最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に１回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口）；または最初に経口免疫感作、その後２１日目に２回目の経口ワクチン接種。経口ワクチン接種は、口の中へのワクチンの投与によって行った。４２日目に、約１ｍＬの病原性全身性ＦＣＶ−３３５８５（３ｌｏｇのＴＣＩＤ５０／ｍＬ）ですべてのネコを誘発した。疾患の臨床的徴候（体温、結膜炎の漿液性漏出、結膜炎の粘液膿性漏出、鼻炎の漿液性漏出、鼻炎の粘液膿性漏出、くしゃみ、可聴性ラ音、せき、開口呼吸、食欲不振、脱水症、１つの口腔潰瘍＜４ｍｍ、複数の口腔潰瘍、口腔潰瘍＞４ｍｍ、流涎、非出血性外部潰瘍、出血性外部潰瘍）について、誘発後の１４日間すべてのネコをモニターした。カリシウイルスの病原性と一致する誘発後の重度の臨床的徴候を示すネコを安楽死させた。
【０１２９】
表１−８に示すように、新たな株ＦＣＶ−２１を加えると、ＦＣＶ−Ｆ９が存在してもまたはしなくてもＦＥＬＯＣＥＬＬ４の効果が著しく増大する。ＳＱ／ＳＱワクチン接種もＳＱ／経口ワクチン接種もＦＣＶ感染の防止に有効であると思われる。さらに、ＦＥＬＯＣＥＬＬ４およびＦＥＬＯＣＥＬＬ３でＦＣＶ−２１を加えＦ９を除いた経口／経口ワクチン接種でもＦＣＶ感染に対する効果が示された（ＦＥＬＯＣＥＬＬ３とは、オウム病クラミジアを含まないＦＥＬＯＣＥＬＬ４である）。
【０１３０】
表１−９で、評価したワクチン接種法には、最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目および４２日目に２回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口／経口）があった。ＦＣＶ−２１を加えると、ＦＥＬＯＣＥＬＬ４中にＦＣＶ−Ｆ９を含んでもまたは含まなくても、死亡率と臨床スコアの両方が著しく低下することが示された。
【０１３１】
【表８】
【０１３２】
【表９】
【０１３３】
（実施例１−１２）
ＦＣＶ−２１を伴うＦＥＬＯＣＥＬＬ４構成成分およびＦＣＶ−２１を伴わないＦＥＬＯＣＥＬＬ４構成成分でワクチン接種したネコの血清の交差中和分析
実施例１−１１に記載の試験における各ネコの血清試料を、２回目のワクチン接種から８５での誘発までの間に収集した。試料を５６℃で３０分間熱処理し、前記の実施例１−１０（表１−６）に記載した２６種の各ＦＣＶ株に対する血清中和アッセイで評価した。
【０１３４】
＞２３および＞１５の遮断力価を用いて血清中和データを分析し、２つの遮断力価の平均を計算した（Ａｖｅ）。その結果を表１−１０に示す。そのデータから、ＦＣＶ−２１を含有するすべてのワクチン製剤が旧来のＦＣＶ−Ｆ９株を含有するワクチンより幅広い交差中和特性を有していた（約６０％対４０％）ことが示唆される。この結果、中和されたＦＣＶ株の数が約５０％増大した。
【０１３５】
【表１０】
【０１３６】
表１−１０にも示すように、新たな株ＦＣＶ−２１を加えると、ＦＣＶ−Ｆ９が存在してもまたはしなくてもＦＥＬＯＣＥＬＬ４の交差中和特性が著しく増大する。ＳＱ／ＳＱワクチン接種でもＳＱ／経口ワクチン接種でも幅広い交差中和特性が観察された。さらに、ＦＥＬＯＣＥＬＬ４およびＦＥＬＯＣＥＬＬ３でＦＣＶ−２１が存在するがＦ９が存在しない経口／経口ワクチン接種で交差中和特性の向上が示された。
【０１３７】
表１−１１で、評価したワクチン接種法には、最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目および４２日目に２回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口／経口）があった。その結果から、ＦＣＶ−２１を加えると、ＦＥＬＯＣＥＬＬ４中にＦＣＶ−Ｆ９を含んでもまたは含まなくても、交差中和特性が著しく幅広くなった（約４０％増大した）ことが示唆される。
【０１３８】
【表１１】
【０１３９】
本発明の番号付き記載。本発明のさらなる記載および例。１．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質を含むワクチン。２．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、前記キャプシドタンパク質が、タンパク質配列（配列番号１３）または少なくとも約９１．２％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、免疫応答を生じさせるのに有効な量提供されるワクチン。３．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するＤＮＡワクチンであって、ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１２）または少なくとも約７８．７％もしくは７９．２％の配列同一性を有し、保存的置換を許容する配列を含むＤＮＡワクチン。４．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質がＦＣＶ−４９株由来のタンパク質配列を含むワクチン。５．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、前記キャプシドタンパク質は、タンパク質配列（配列番号１５）または少なくとも約９２．７％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、免疫応答を生じさせるのに有効な量提供されるワクチン。６．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するＤＮＡワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１４）または少なくとも約７８．９％、すなわち７９．４％（７８．９＋０．５）の配列同一性を有し、保存的置換を許容する配列を含むＤＮＡワクチン。７．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質がＦＣＶ−２６３９１−４株由来のタンパク質配列を含むワクチン。８．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、前記キャプシドタンパク質が、タンパク質配列（配列番号１７）または少なくとも約９１．８％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、免疫応答を生じさせるのに有効な量提供されるワクチン。９．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するＤＮＡワクチンであって、ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１６）または少なくとも約７８．４％、すなわち７８．９％（７８．４＋０．５）の配列同一性を有する配列を含むＤＮＡワクチン。１０．ポリヌクレオチドが本質的に配列番号１２、１４、１６からなる群から選択される、請求項１から３のいずれかに記載のワクチン。１１．アジュバントを含有するワクチン、ＦＣＶ構成成分が生であるワクチン、ＦＣＶ構成成分を弱毒化したワクチン、ＦＣＶ構成成分を不活性化したワクチンのうち単独またはいずれかの組合せをさらに含み、ＦＣＶ−Ｆ９、ＦＣＶ−ＬＬＫ、ＦＣＶ−Ｍ８、ＦＣＶ−２５５、およびＦＣＶ−２２８０からなる群から選択される少なくとも１つの他のネコカリシウイルス株を含んでよい、請求項１から３のいずれかに記載のワクチン。１２．ネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、オウム病クラミジア、およびネコパルボウイルス、狂犬病ウイルスおよび気管支敗血症菌からなる群から選択される少なくとも１つの他のネコ病原体を含む、請求項１、４、および７に記載のワクチン。１３．免疫応答を生じさせるのに有効な量の、配列番号１３、１５、または１７と９３％以上の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるＦＣＶキャプシドタンパク質のヌクレオチド配列であって、ＦＣＶ単離物が株２１３−９５でなく、核酸配列が異種プロモーター配列と作動的に連結しているヌクレオチド配列と、薬学的に許容できる担体とを含む、ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチン。１４．ヌクレオチド配列が本質的に配列番号１２、１４および１６からなる群から選択される、請求項１３に記載のワクチン。１５．ヌクレオチド配列が、プラスミド、組換えウイルスベクターのいずれかの中にある、請求項１３に記載のワクチン。１６．組換えウイルスベクターが、ネコヘルペスウイルス、アライグマポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、アデノウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群から選択される、請求項１３に記載のワクチン。１７．獣医学的に許容できる賦形剤の媒体と、本明細書において２３、２６、４１、４４および５６と呼ばれるモノクローナル抗体から選択されるモノクローナル抗体と結合するＦＣＶの単離株とを含む免疫原性組成物。１８．獣医学的に許容できる賦形剤の媒体と、本明細書において２３、２６、４１、４４および５６と呼ばれるモノクローナル抗体から選択されるモノクローナル抗体と選択的に結合するＦＣＶの単離株とを含む免疫原性組成物。１９．ＦＣＶ株が不活性化され、前記ＦＣＶ株がワクチンであり、アジュバントを含む、請求項１７および１８に記載の免疫原性組成物。２０．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作する方法であって、有効投与量の請求項１から１４のいずれかに記載のワクチンをネコに投与するステップを含み、ワクチンがさらにアジュバントを含む方法。
【０１４０】
第２部
下記のこの節では、ウイルスに対して動物を、具体的にはカリシウイルスに対してネコを免疫感作する方法についての詳細な情報を提供する
別段示さない限り、下記の開示では上記および下記で示す定義を使用する。
【０１４１】
ワクチンで動物を、具体的にはネコカリシウイルス（ＦＣＶ）に対してネコを治療し免疫感作するための方法および材料を本明細書に記載する。その方法は、免疫応答を誘導し、具体的にはネコにおいてＦＣＶに対する免疫応答を誘導することができる、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含む。第１のワクチンは通常非経口投与するが、ある状況では経口投与することもでき、その一方で、第２のワクチンは、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に経口または口鼻投与する。これらのワクチンは、最初に経口投与した場合に通常は口腔病変を引き起こすので、通常は最初に非経口投与する。驚くべきことに、非常に安全かつ有効であるので第１の経口投与、その後の第２の経口投与として投与することができるＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４株をここで開示する。ここで、Ｎは３〜１２０（両端を含む）の整数であるが、通常は７〜４２（両端を含む）、または１４〜２８（両端を含む）の整数であり、約３週間が好ましく、約２〜４週間も好ましい。あるいは、ネコに約１：６、１：９、１：１２、１：１５、１：１８またはそれ以上のＦＣＶ血清中和力価が発生した後に第２のワクチンを投与することもできる。
【０１４２】
その方法はまた、第１のワクチンまたは第２のワクチンの投与後Ｍ日目の、ＦＣＶワクチンの１回または複数回のさらなる非経口、経口または口鼻投与を含むこともでき、Ｍは１〜１２０（両端を含む）の整数である。したがって、代表的なワクチン接種法には、（１）第１のＦＣＶワクチンの皮下投与、その後第２のＦＣＶワクチンの経口投与；（２）第１および第３のＦＣＶワクチンの連続皮下投与、その後第２のＦＣＶワクチンの経口投与；ならびに（３）第１のＦＣＶワクチンの皮下投与、その後第２および第３のＦＣＶワクチンの連続経口投与がある。
【０１４３】
上記に記載のように、第１のワクチンを非経口（例えば皮下）投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、任意選択の第３のワクチンは非経口、経口または口鼻投与してもよい。シリンジ、ドロッパー、無針注射機器などを含めた任意の機器を使用して、ワクチンを投与することができる。口鼻投与では、カニューレと適合するシリンジを使用して、ネコの鼻または口の中にワクチンの液滴を入れることができる。
【０１４４】
その方法は、第１のワクチンが非経口投与に適合し第２のワクチンが経口または口鼻投与に適合する限り、ネコにおいてＦＣＶに対する免疫応答を誘導することができる任意のワクチンを使用することができる。上記で述べた通り、任意選択の第３のワクチンは、非経口、経口、または口鼻投与に適合する。第１、第２、および任意選択の第３のワクチンは同じでもよく、または異なるものでもよく、それぞれが独立に、ＦＣＶの１つまたは複数の株に由来する１つまたは複数の抗原を含む。したがって、有用なワクチンには、生ウイルスワクチン、改変型生ウイルスワクチン、および不活性化ウイルスワクチンがある。生および改変型生ＦＣＶワクチンは、ネコにおいて疾患を引き起こさず、非病原性の型で単離され、または適切な細胞系統での連続的な継代または紫外線もしくは化学的突然変異原への曝露を含めた周知の方法を使用して弱毒化されたＦＣＶ株を含有する。不活性化または死滅ＦＣＶワクチンは、ホルマリン、ベータプロプリオラクトン、二成分エチレンイミンなどでの処理を含めた既知の方法で不活性化されたＦＣＶ株を含有する。例示的なワクチンには、ＦＣＶ−Ｆ９、ＦＣＶ−Ｍ８、ＦＣＶ−２５５、ＦＣＶ−２２８０、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９、ＦＣＶ２６３９１−４などから単独でまたは組み合わせて選択される非病原性株を含有するものがある。
【０１４５】
ＦＣＶの１つまたは複数の株に由来する他の有用なワクチンには、組換えワクチンおよびＤＮＡワクチン（すなわちサブユニットワクチン）がある。組換えワクチンには組換えウイルスベクターがあり、それぞれが、ＦＣＶの株に由来する抗原をコードする核酸を含有する。そのようなベクターは、ＦＣＶ株に由来する抗原（例えば、キャプシドタンパク質）をコードするｃＤＮＡを、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルスなどを含めた非病原性ウイルスのゲノム中に挿入することによって調製することができる。ウイルスベクターでは、ｃＤＮＡは、抗原をコードする配列の５’末端で真核生物転写プロモーターと作動的に連結し、抗原をコードする配列の３’末端で真核生物終結シグナルおよびポリ（Ａ）シグナルと作動的に連結し、その結果、転写プロモーターおよび終結配列が抗原の発現を制御する。有用な転写プロモーターには、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列プロモーター（ＲＳＶ−ＬＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要前初期プロモーター、シミアン空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）Ｔ抗原プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターなどの誘導性プロモーターがある。組換えＦＣＶワクチンの論述については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｗａｒｄｌｅｙらの米国特許第５，７１６，８２２号を参照されたい。
【０１４６】
ＤＮＡワクチンには、ネコにおいてＦＣＶに対する免疫応答を誘発するＦＣＶキャプシドタンパク質やその特異的免疫原性断片などのＦＣＶ抗原をコードする核酸配列を有するＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）がある。核酸コード配列は、ネコの細胞中に接種したときにＤＮＡの発現を可能にする転写プロモーターと作動的に連結している。有用なプロモーターには、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ主要前初期プロモーター、およびＳＶ４０Ｔ抗原プロモーターがある。さらに、核酸は、ＦＣＶ抗原をコードする配列の終結コドンで、またはその近くで、転写終結シグナルおよびポリ（Ａ）認識シグナルを含む核酸断片と作動的に連結することができる。ＤＮＡワクチンの論述については、Ｆｅｌｇｎｅｒらの米国特許第５，５８０，８５９号、米国特許第５，５８９，４６６号、および米国特許第５，７０３，０５５号を参照されたい。
【０１４７】
他の有用なワクチンには、単離および精製されたＦＣＶキャプシドタンパク質やキャプシドタンパク質の免疫原性断片などの１つまたは複数のサブユニット抗原を含有するものがある。サブユニット抗原は、上記に記載の方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原を産生する組換え発現ベクター中で産生することができる。得られた抗原をその後単離および精製する。有用な発現ベクターには、細菌、酵母および真菌を含めた様々な微生物、ならびに哺乳動物細胞や昆虫細胞などの真核生物がある。他の有用な発現ベクターには、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルスやセンダイウイルスなどのウイルスがある。微生物中でのＦＣＶサブユニット抗原の発現によって、商業規模の発酵技術を使用した抗原タンパク質の生産が可能となる。ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、遠心分離などを含めた様々な方法を使用して、抗原を単離および精製することができる。
【０１４８】
１つまたは複数のワクチンはまた、ＦＣＶの他に、ネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ汎白血球減少ウイルス、およびネコクラミジアを含めた１つまたは複数の病原体に対してネコを免疫感作する抗原をも含有する。
【０１４９】
ワクチンの他の構成成分には、担体、溶媒、および希釈剤を含めた薬学的に許容できる賦形剤、等張剤、緩衝化剤、安定化剤、保存剤、免疫調節作用物質（例えば、インターロイキン、インターフェロンおよび他のサイトカイン）、血管収縮剤、抗菌剤、抗真菌剤などがあり得る。典型的な担体、溶媒、および希釈剤には、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどがある。代表的な等張剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどがある。有用な安定化剤には、ゼラチン、アルブミンなどがある。
【０１５０】
ワクチンはまた、抗原に対する免疫応答を高める１つまたは複数のアジュバントを含んでもよい。代表的なアジュバントには、フロイント完全アジュバントやフロイント不完全アジュバントなどの油に基づくアジュバント、ミコール酸に基づくアジュバント（例えば、トレハロースジミコレート）、細菌リポポリサッカリド、ペプチドグリカン（すなわち、ムレイン、ムコペプチド、またはＮ−Ｏｐａｃａなどの糖タンパク質、ムラミルジペプチドまたはその類似体）、プロテオグリカン（例えば、肺炎桿菌から抽出されるもの）、レンサ球菌製剤（例えば、ＯＫ４３２）、ＢＩＯＳＴＩＭ（登録商標）（例えば、０１Ｋ２）、Ｉｓｃｏｍ（例えば、欧州特許出願ＥＰ１０９９４２、ＥＰ１８０５６４およびＥＰ２３１０３９を参照）、水酸化アルミニウム、サポニン、ジエチルアミノエチル−デキストラン、中性油（例えば、ミグリオル）、植物油（例えば、ラッカセイ油）、リポソーム、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオールがある。他のアジュバントには、とりわけ、ＲＩＢＩアジュバント系、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、コレステロール、水中油型乳剤、油中水型乳剤、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、ジョージア州Ａｔｌａｎｔａ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア州Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、アラバマ州Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）もしくは他のサポニン分画、モノホスホリル脂質Ａ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント、大腸菌由来の熱不安定性エンテロトキシン（組換えまたはその他によるもの）、コレラ毒素、またはムラミルジペプチドがある。
【０１５１】
ＦＣＶワクチンの投与サイズは通常、約１ｍＬ〜約２ｍＬ（両端を含む）である。各投与は治療有効量の１つまたは複数のＦＣＶ抗原を含有し、それはネコの齢数および一般状態、投与経路、ＦＣＶ抗原の性質、ならびに他のファクターに応じて様々となり得る。改変型生ウイルスまたは弱毒化ウイルスを含有するワクチンでは、治療有効投与量は一般に約１０６ＴＣＩＤ５０〜約１０８ＴＣＩＤ５０（両端を含む）である。ＦＣＶキャプシドタンパク質などのサブユニット抗原を含有するワクチンでは、治療有効投与量は一般に約１０μｇ〜約１００μｇ（両端を含む）である。ワクチンの物理的化学的特性が改変されるようにワクチンの他の構成成分を調整することができる。例えば、アジュバントは通常、投与量１ｍＬのうち約２５μｇ〜約１０００μｇ（両端を含む）を占める。同様に、抗生物質は通常、投与量１ｍＬのうち約１μｇ〜約６０μｇ（両端を含む）を占める。
【０１５２】
投与経路、貯蔵の必要性などに応じて、様々な形態でＦＣＶワクチンを提供する。例えば、ワクチンは、シリンジ、ドロッパーなどでの使用に適した水溶液剤もしくは分散剤として調製することもでき、または使用前に食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝液などの中で再調製する凍結乾燥粉末剤として調製することもできる。
【０１５３】
第２部の実施例および表
下記の実施例は、例示的かつ非限定的であるものとし、本発明の少数の具体的な実施形態を表す。
【０１５４】
（実施例２−１）
ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４およびＦＥＬ−Ｏ−ＶＡＸ（登録商標）での皮下／経口ワクチン接種法
４〜５ヶ月齢の、家庭向けの短毛のネコに、ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．；改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス［ＦＨＶ］、カリシウイルス［ＦＣＶ］、汎白血球減少ウイルス［ＦＰ］およびオウム病クラミジア）を、ＦＥＬ−Ｏ−ＶＡＸ（登録商標）（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ；死滅ＦＨＶ、ＦＣＶ、ＦＰおよびオウム病クラミジア）または滅菌希釈剤（対照群）とともにワクチン接種した。評価したワクチン接種法には以下のものがあった：最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目および４２日目に皮下追加免疫（ＳＱ／ＳＱ／ＳＱ）；最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目および４２日目に２回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口／経口）；または最初に経口ワクチン接種、その後２１日目に２回目の皮下ワクチン接種、および４２日目に経口追加免疫。投与量はすべて１ｍＬであった。経口ワクチン接種は、口の中へのワクチンの投与によって行った。９９日目に、約３．５ｍＬの病原性全身性ＦＣＶ−３３５８５（４．８ｌｏｇのＴＣＩＤ５０／ｍＬ）ですべてのネコを誘発した。誘発は、缶入りネコ用飼料で投与量約３ｍＬ、点鼻注入により０．０５ｍＬを投与することによって行った。疾患の臨床的徴候について、誘発後の１４日間すべてのネコをモニターした。カリシウイルスの病原性と一致する誘発後の重度の臨床的徴候を示すネコを安楽死させた。
【０１５５】
表２−１に示すように、ＳＱ／経口／経口の投与法を介してワクチン接種した群は死亡率がわずか１０％であったが、対照群は死亡率が９０％であった。ＳＱ／ＳＱ／ＳＱの投与法を介してワクチン接種した群は死亡率が５０％であったが、ＳＱ／ＳＱ／経口の投与法を介してワクチン接種した群は死亡率が２０％であった。これらの結果から、ＳＱワクチン接種を行い、その後経口追加免疫を行うと、病原性ＦＣＶ誘発に対するＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４ワクチン接種の有効性が高くなることが示唆される。経口ワクチン接種を投与法の一部にしたとき死亡率が５０％（ＳＱ／ＳＱ／ＳＱ）から１０％（ＳＱ／経口／経口）または２０％（ＳＱ／ＳＱ／経口）に低下しただけでなく、表２−２に示すように、皮膚病変（ＳＬ）、食欲不振（ＩＡ）、抑うつ（ＤＰ）、口腔潰瘍（ＯＵ）、歩行困難（ＬＮ）、くしゃみ（ＳＺ）、鼻漏（ＮＤ）や流涙（ＷＥ）などの臨床的徴候の重傷度が同様に低下した。
【０１５６】
【表１２】
【０１５７】
【表１３】
【０１５８】
（実施例２−２）
ＳＱ／経口ワクチン接種後の平均ＦＣＶ血清中和力価
実施例２−１のネコから採取した血液試料を、０、２１、４２、６３、９８および１１３日目の試験日に収集し、血清中和（ＳＮ）アッセイでＦＣＶを中和する能力についてそれを評価した。血清試料を１：８に希釈し、その後体積６００μｌで１：１６３８４まで連続２倍希釈（合計１２回の希釈）を行った。６００μｌ中で力価が５０〜５００ＴＣＩＤ５０／ｍＬのネコカリシウイルスを、希釈した血清試料と混合し、それを室温で４５分間インキュベートした。次いで希釈した各試料２００μｌを、Ｃｒａｎｄｅｌネコ腎（ＣｒＦＫ）細胞を４連で播いた９６穴プレートの別々の穴に移した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートし、そのとき終点の中和力価を決定した。血清中和（ＳＮ）力価と誘発ウイルス逆力価はどちらもＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの方法を使用して計算した。Ｃ．Ｓｐｅａｒｍａｎ、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｌ．２：２２７〜２４２（１９０８）およびＧ．Ｋａｒｂｅｒ、Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．Ｐｈａｒｍａｋ．１６２：４８０〜４８７（１９３１）を参照されたい。表２−３に示すように、ＳＱ／経口／経口またはＳＱ／ＳＱ／経口のワクチン接種法を介して投与したＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４は、ＦＣＶ ＳＮ力価が著しく高くなった。これらのデータは、実施例２−１で記載した死亡率の著しい低下と相関する。
【０１５９】
【表１４】
【０１６０】
（実施例２−３）
ネコ汎白血球減少ウイルスに対するＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４およびＦＥＬ−Ｏ−ＶＡＸ（登録商標）のＳＱ／経口投与の有効性
実施例２−１のネコの血清試料について、その平均ＦＰ力価のアッセイも行った。表２−４に示すように、すべてのネコが試験開始時に血清陰性であった。その後、対照群の平均力価は試料採取の合間の期間ずっと１のままであった（２１および４２日目）。しかし、他の４つのワクチン接種群の平均力価は著しく上昇した。
【０１６１】
【表１５】
【０１６２】
（実施例２−４）
様々な投与経路によってＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４でワクチン接種したネコの臨床症状
動物の鼻孔中への液滴の点滴注入によって、ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４の口鼻（ＯＮ）投与を行った。表２−５で示すように、表２−５で示す投与法：皮下のワクチン接種および追加免疫（ＳＱ／ＳＱ）；皮下ワクチン接種および口鼻追加免疫（ＳＱ／ＯＮ）；または口鼻のワクチン接種および追加免疫（ＯＮ／ＯＮ）に従って、６〜７ヶ月齢のネコ１０匹の群（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）にワクチン接種し、２１日目に追加免疫した。首の右側にワクチンを皮下投与し（１ｍＬ）、口鼻投与は、各鼻孔中にワクチンを０．５ｍＬ送達することによるものであった。１日目から開始して、一般健康状態についてすべてのネコを毎日観察した。
【０１６３】
【表１６】
【０１６４】
表２−５に示すように、どちらも口鼻でワクチン接種を受けているネコは、鼻潰瘍（ＮＵ）、口腔潰瘍（ＯＵ）、持続性のくしゃみ（ＳＺ）、鼻漏（ＮＤ）、流涙（ＷＥ）および一過性の食欲不振（ＩＡ）を含めて高レベルの臨床症状を有していた。しかし、ＳＱ／ＯＮの投与法を介してワクチン接種したネコは、ＯＮ／ＯＮワクチン接種ネコより低い臨床症状を示し、鼻潰瘍、口腔潰瘍、鼻漏、または流涙を示さなかった。また、ＳＱ／ＯＮ群の対象は、ＯＮ／ＯＮ群のネコより少ないくしゃみも示した。ＳＱ／ＯＮ群の安全性は、ＳＱ／ＳＱ群と類似していた。
【０１６５】
（実施例２−５）
ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４抗原に対する血清学的応答についての異なるワクチン接種経路の効果
実施例２−４に記載の試験に登録されたネコの血清試料について、ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４ワクチン中に存在する様々なウイルス抗原に対する血清学的反応性のアッセイを行った。０、２１および４２日目の試験日に、ＦＣＶ、ＦＨＶおよびＦＰに対する平均血清中和抗体力価を決定した。表２−６に示すように、３つすべてのワクチン接種法により、ＦＰに対する強い免疫応答が生じた。ＦＨＶに対する免疫応答は、アッセイの困難性によりわずかに検出可能であった。しかし、ＦＣＶに対する血清中和力価は、ＳＱ／ＳＱ群と比較して、ＯＮ／ＯＮおよびＳＱ／ＯＮ群で著しく高かった。これらの結果から、ＯＮ／ＯＮおよびＳＱ／ＯＮ群のネコは、病原性ＦＣＶの誘発に対して防御されるが、ＳＱ／ＳＱ群は防御されない可能性があることが示唆される。
【０１６６】
【表１７】
【０１６７】
（実施例２−６）
ＳＱまたはＯＮ経路を介して投与したＦＣＶ−Ｆ９に対する血清中和力価
１群当たり６匹のネコを、ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４ワクチン中に存在するＦＣＶ−Ｆ９抗原で、ＳＱまたはＯＮワクチン接種した。最初のワクチン接種から３週間後に、すべてのネコを、前記と同じ投与経路を介して同じ抗原で追加免疫した。投与量はすべて１ｍＬであった。追加免疫感作から３週間後に血清試料を収集した。表２−７に示すように、２６種のＦＣＶ株のパネルに対する血清中和力価をこれらの試料について決定した。そのパネルに選択されたＦＣＶ株は、（そのキャプシドの超可変領域の配列によって決定される）遺伝的多様性、ならびに地理的分布に基づいて選択された。さらに、各株の病原性の表現型も考慮された。Ｆ９でＯＮワクチン接種したネコの血清試料は、ＳＱワクチン接種したネコの試料と比較して、２６個の構成要素のパネルの中でよりＦＣＶ株を中和した。中和力価の遮断値として２３を使用すると、ＯＮワクチン接種ではパネルの構成要素の２６％で遮断値以上の力価となったが、ＳＱワクチン接種では１６％しか基準を満たさなかった。力価遮断値を１５にすると、ＯＮワクチン接種ではパネルの構成要素の３２％で遮断値以上となったが、ＳＱでは１７％でしかならなかった。
【０１６８】
【表１８】
【０１６９】
（実施例２−７）
ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４またはＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）３構成成分および改変型生ＦＣＶ−２１の２回の投与でワクチン接種したネコの死亡率および臨床スコア
約８週齢の、家庭向けの短毛のネコに、改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス（ＦＨＶ）、汎白血球減少ウイルス（ＦＰ）、オウム病クラミジア、ならびに（１）ＦＣＶ−Ｆ９（ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４またはＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）３）、（２）ＦＣＶ−Ｆ９およびＦＣＶ−２１（ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４＋ＦＣＶ−２１、またはＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）３＋ＦＣＶ−２１）、または（３）ＦＣＶ−２１（ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４ＡまたはＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）３Ａ）を含有するワクチンを投与した。ワクチン接種法には以下のものがあった：最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に皮下追加免疫（ＳＱ／ＳＱ）；最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に１回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口）；または最初に経口免疫感作、その後２１日目に２回目の経口ワクチン接種（経口／経口）。様々な投与法内での各ネコ（Ｔ１〜Ｔ１０の群、１群当たりネコ１０匹）にワクチン１ｍＬを投与した。経口ワクチン接種は、口の中へのワクチンの投与によって行った。４２日目に、約１ｍＬの病原性全身性ＦＣＶ−３３５８５（３ｌｏｇのＴＣＩＤ５０／ｍＬ）ですべてのネコを誘発した。誘発後の１４日間、体温の上昇、結膜炎の漿液性漏出、結膜炎の粘液膿性漏出、鼻炎の漿液性漏出、鼻炎の粘液膿性漏出、くしゃみ、可聴性ラ音、せき、開口呼吸、食欲不振、脱水症、１つの口腔潰瘍＜４ｍｍ、複数の口腔潰瘍、口腔潰瘍＞４ｍｍ、流涎、非出血性外部潰瘍、および出血性外部潰瘍を含めた疾患の臨床的徴候について、すべてのネコをモニターした。カリシウイルスの病原性と一致する誘発後の重度の臨床的徴候を示すネコを安楽死させた。
【０１７０】
表２−８に示すように、ＳＱ／ＳＱワクチン接種と比較したとき、ＳＱ／経口ワクチン接種法では、ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４でワクチン接種したネコで死亡率が４４％から１０％に低下し、中央臨床スコアが１２から５．５に改善された。さらに、ＦＣＶ−２１株をＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）３およびＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４に加えると誘発後死亡しなかった。ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）３およびＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４のＦＣＶ−Ｆ９株をＦＣＶ−２１株に置換すると、経口／経口ワクチン投与法でもＦＣＶ−Ｆ９とＦＣＶ−２１をどちらも含有するワクチンと同様の効果が得られた。
【０１７１】
【表１９】
【０１７２】
（実施例２−８）
ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４構成成分および改変型生ＦＣＶ−２１の３回の投与でワクチン接種したネコの死亡率および臨床スコア
約８週齢の、家庭向けの短毛のネコに、改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス（ＦＨＶ）、汎白血球減少ウイルス（ＦＰ）、オウム病クラミジア、ならびに（１）ＦＣＶ−Ｆ９（ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４）、（２）ＦＣＶ−Ｆ９およびＦＣＶ−２１（ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４Ａ）、または（３）ＦＣＶ−２１（ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４Ｂ）を含有するワクチンを投与した。各場合で、ネコに最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目および４２日目に連続経口投与を行った（ＳＱ／経口／経口）。様々な投与法内での各ネコ（Ｔ１〜Ｔ４の群、１群当たりネコ１０匹）にワクチン１ｍＬを投与した。経口ワクチン接種は、口の中へのワクチンの投与によって行った。６３日目に、約１ｍＬの病原性全身性ＦＣＶ−３３５８５（３ｌｏｇのＴＣＩＤ５０／ｍＬ）ですべてのネコを誘発した。誘発後の１４日間、実施例２−７と同様に疾患の臨床的徴候についてすべてのネコをモニターした。カリシウイルスの病原性と一致する誘発後の重度の臨床的徴候を示すネコを安楽死させた。表２−９に示すように、誘発後の死亡率および臨床スコアによって測定される三重投与法の効果は、実施例２−７に記載の二重投与法の効果と同等である。
【０１７３】
【表２０】
【０１７４】
（実施例２−９）
ＦＣＶ−２１を伴うＦＥＬＯＣＥＬＬ４構成成分およびＦＣＶ−２１を伴わないＦＥＬＯＣＥＬＬ４構成成分でワクチン接種したネコの血清の交差中和分析
実施例２−７に記載の試験における各ネコの血清試料を、２回目のワクチン接種から誘発までの間に収集した。試料を５６℃で３０分間熱処理し、前記の実施例１−１０（表１−６）に記載した２６種の各ＦＣＶ株に対する血清中和アッセイで評価した。
【０１７５】
＞２３および＞１５の遮断力価を用いて血清中和データを分析し、２つの遮断力価の平均を計算した（Ａｖｅ）。その結果を表２−１０に示す。そのデータから、（ＦＣＶ−Ｆ９を含有する）ＦＥＬＯＣＥＬＬ４の交差中和特性は、投与経路がＳＱ／ＳＱであれＳＱ／経口であれ一定のままであることが示唆される。しかし、ＦＣＶ−２１を加えると、ワクチンをＳＱ／ＳＱまたはＳＱ／経口で投与したときに交差中和特性が大いに向上する。さらに、（ＦＣＶ−２１を含有するが、ＦＣＶ−Ｆ９は含有しない）ＦＥＬＯＣＥＬＬ４Ａでは、ＳＱ／ＳＱ、ＳＱ／経口で、また経口／経口のワクチン接種経路でも交差中和特性が向上する。
【０１７６】
【表２１】
【０１７７】
表２−１１で、評価したワクチン接種法には、最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目および４２日目に２回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口／経口）があった。その結果から、ＦＣＶ−２１を加えると、ＦＥＬＯＣＥＬＬ４中にＦＣＶ−Ｆ９を含んでもまたは含まなくても、交差中和特性が著しく幅広くなった（約４０％増大した）ことが示唆される。
【０１７８】
【表２２】
【０１７９】
ＦＣＶ株ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４に関連するペプチド、タンパク質、およびＤＮＡとして本明細書に記載したワクチンを用いて、上記の実施例２−４および表２−５で述べた、以前に開示されている副作用を伴うことなく、第１の場合に経口または口鼻（ＯＮ）投与を、その後第２の経口または口鼻投与を実施することができるという、本発明者らの知見も開示する。
【０１８０】
本明細書および添付した特許請求の範囲において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」や「その（ｔｈｅ）」などの単数形の冠詞は、文脈上別段にはっきりと示されない限り、１つの対象または複数の対象を指す可能性があることに留意されたい。したがって、例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」を含有する組成物の指すものは、単一の化合物または２つ以上の化合物を含む可能性がある。
【０１８１】
上記の実施例および記載は、例示的であるものとし、限定的なものでないことを理解されたい。上記の記載を読んだ後、多数の実施形態が当業者には明らかとなるであろう。したがって、本発明の範囲は、特許請求の範囲に権利がある完全な範囲の同等物とともに、添付した特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。特許、特許出願および刊行物を含めたすべての論説および参照文献の開示は、参照によりその全体がすべての目的で本明細書に組み込まれている。
【０１８２】
表２−１〜２−９において、Ｆｅｌｏｃｅｌｌ（登録商標）４、Ｆｅｌｏｃｅｌｌ４、もしくはＦＥＬＯＣＥＬＬ４またはこれらの語の後に「３」の数が続くものはワクチンであり、名称Ｆｅｌｏｃｅｌｌの任意の変種は、Ｐｆｉｚｅｒによって所有されている。Ｆｅｌｏｃｅｌｌ４Ａの指すものは、ＦＣＶ−Ｆ９を含まないＦｅｌｏｃｅｌｌ４であり、Ｆｅｌｏｃｅｌｌ３Ａの指すものは、ＦＣＶ−Ｆ９を含まないＦｅｌｏｃｅｌｌ３である。これらの試験で使用した実際の抗原が市販の製品由来でなく、むしろ研究目的のみの小さなバッチで、しかし市販の製品と同じ形で抗原が調製されたことに留意されたい。
【０１８３】
本明細書で開示され、特許請求されているすべての組成物および／または方法は、本開示に照らして、過度な実験を行うことなく作製し実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態の点から説明してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および／または方法に、方法のステップまたはステップの順序に変更を当てはめることができることが当業者には明らかとなるであろう。より具体的には、化学的にも生理的にも関連する特定の作用物質で本明細書に記載の作用物質を置換することができ、その一方で、同じまたは類似した結果が実現されることが明らかとなるであろう。当業者にとって明らかであるそのような類似した置換および改変はすべて、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念の中にあるとみなされる。
【０１８４】
本発明の番号付き記載。さらなる記載および例。１．ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）に対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＣＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを非経口投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０日（両端を含む）の整数であり、約３週間および約２〜４週間のＮも記載される方法。２．ワクチンがそれぞれ独立に生ウイルスワクチン、改変型生ウイルスワクチン、不活性化ウイルスワクチン、組換えワクチン、ＤＮＡワクチン、またはサブユニット抗原ワクチンを単独でまたは組み合わせて含む、請求項１に記載の方法。３．少なくとも１つのワクチンが、ＦＣＶの１つまたは複数の株を含む、請求項１に記載の方法。４．ＦＣＶの１つまたは複数の株が、Ｆ９もしくはＦＣＶ−２１またはＦ９およびＦＣＶ−２１を含む、請求項３に記載の方法。５．ワクチンが同じものである、請求項１に記載の方法。６．少なくとも１つのワクチンがまた、ネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ汎白血球減少ウイルス、およびネコクラミジアから選択される１つまたは複数の病原体に対する免疫応答の誘導にも適合する、請求項１に記載の方法。７．第１のワクチンを皮下投与する、請求項１に記載の方法。８．第２のワクチンを経口または口鼻投与する、請求項１に記載の方法。９．ネコに約１：６またはそれ以上のＦＣＶ血清中和力価が発生した後に第２のワクチンまたはその後のワクチンを投与する、請求項１に記載の方法。１０．治療有効量の第３のワクチンをネコに投与するステップをさらに含み、第３のワクチンがＦＣＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１または第２のワクチンの投与後Ｍ日目にそれを非経口、経口、または口鼻投与し、Ｍが１〜１２０日（両端を含む）の整数である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。１１．第３のワクチンを皮下投与する、請求項１０に記載の方法。１２．ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）に対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＣＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、約３週間および約２〜４週間のＮも指定される方法。１３．ＦＣＶ株が、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９、ＦＣＶ２６３９１−４からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。１４．動物に免疫感作する方法であって、任意選択の第３のワクチンとともに、治療有効量の第１および第２のワクチンを動物に投与するステップを含み、第１および第２および任意選択の第３のワクチンが免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを非経口または経口投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２および任意選択の第３のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、約３週間および約２〜４週間のＮも指定され、約１年のＭ期間を含むワクチンの任意選択の年１回の追加免疫投与を含んでよい方法。
【０１８５】
第３部
この部では、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）およびネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）に対して動物を免疫感作するための方法および組成物を提供する
ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）によって引き起こされるネコ呼吸器疾患、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）によって引き起こされるネコ汎白血球減少、ネコ鼻気管支炎ウイルスとも呼ばれているネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）によって引き起こされるネコウイルス性鼻気管支炎に対してワクチンで動物を、具体的にはネコを治療し免疫感作するための方法および材料を本明細書に記載する。記載した形でネコに与えたとき、ＦＰＶおよび／またはＦＨＶワクチンの両方の有効な単回経口および経口／経口および皮下／経口送達を可能にするワクチンの新規の組合せを下記に記載する。
【０１８６】
単回経口とは、ワクチン接種された動物に有効な防御を付与する単回経口送達を意味する。経口／経口とは、上記の第２部での記載と同様に２回行う経口送達を意味し、すなわちどちらかの経口の後いくらかの期間が続き、次いで経口経路を介して別の投与を行い、皮下／経口とは、皮下で行う第１の投与の後いくらかの期間が続き、次いで経口経路を介して別の投与を行うことである。
【０１８７】
本明細書に記載するものは、改変型生クラミジアワクチン、または改変型生クラミジアワクチンの任意の構成成分、例えば増殖培地、細胞溶解物または細胞全体、クラミジア自体の任意の構成成分と組み合わせた、改変型生ＦＰＶおよび／または改変型生ＦＨＶの組合せの送達である。クラミジアはまた、ネコクラミジア、またはネコオウム病クラミジアまたはＦＣｐとも称される。
【０１８８】
改変型生ＦＰＶをそれ自体でまたは改変型生ＦＣＶ、もしくは改変型生ＦＨＶワクチンと組み合わせて投与するとき、経口／経口の形で送達するときにＦＰＶは有効でなく、ＳＱ／経口の投与経路ではＳＮ力価の低下を示す。同様に、改変型生ＦＨＶをそれ自体でまたは改変型生ＦＣＶ、もしくは改変型生ＦＰＶワクチンと組み合わせて投与するとき、経口／経口の形で送達するときにＦＨＶは有効でなく、ＳＱ／経口の投与経路では効果の低下を示す。ＦＰＶおよび／またはＦＨＶを改変型生クラミジアワクチンと組み合わせて投与するときだけ、その混合ワクチンの送達が皮下／経口または経口／経口の経路を介するときにＦＰＶおよび／またはＦＨＶに対する十分な防御がもたらされる。
【０１８９】
上記に従って、下記の実施例を提供する。下記の実施例は、例示的かつ非限定的であるものとし、本発明の少数の具体的な実施形態を表す。
【０１９０】
（実施例３−１）
（観念上）ＦＰＶおよびクラミジアでの皮下／経口ワクチン接種法。ＦＰＶおよびクラミジア（または改変型生クラミジアワクチンの任意の構成成分）を、他の構成成分を含むまたは含まない混合ワクチンとして提供する。改変型生ワクチンは、皮下／経口で送達することができる。
【０１９１】
（実施例３−２）
（観念上）ＦＰＶおよびクラミジアでの経口／経口ワクチン接種法。ＦＰＶおよびクラミジア（または改変型生クラミジアワクチンの任意の構成成分）を、他の構成成分を含むまたは含まない混合ワクチンとして提供する。改変型生ワクチンは、経口／経口で送達することができる。
【０１９２】
（実施例３−３）
（観念上）ＦＰＶ、ＦＨＶおよびクラミジアでの皮下／経口ワクチン接種法。ＦＰＶ、ＦＨＶおよびクラミジア（または改変型生クラミジアワクチンの任意の構成成分）を、他の構成成分を含むまたは含まない混合ワクチンとして提供する。改変型生ワクチンは、皮下／経口で送達することができる。
【０１９３】
（実施例３−４）
（観念上）ＦＰＶ、ＦＨＶおよびクラミジアでの経口／経口ワクチン接種法。ＦＰＶ、ＦＨＶおよびクラミジア（または改変型生クラミジアワクチンの任意の構成成分）を、他の構成成分を含むまたは含まない混合ワクチンとして提供する。改変型生ワクチンは、経口／経口で送達することができる。
【０１９４】
（実施例３−５）
（実際上）ＦＰＶ、ＦＨＶ、ＦＣＶおよびクラミジアでの皮下／経口ワクチン接種法。ＦＰＶ、ＦＨＶ、ＦＣＶおよびクラミジア（または改変型生クラミジアワクチンの任意の構成成分）を、他の構成成分を含むまたは含まない混合ワクチンとして提供する。改変型生ワクチンは、経口／経口で送達することができる（表３−１）。
【０１９５】
（実施例３−６）
（実際上）ＦＰＶ、ＦＨＶ、ＦＣＶおよびクラミジアでの経口／経口ワクチン接種法。ＦＰＶ、ＦＨＶ、ＦＣＶおよびクラミジア（または改変型生クラミジアワクチンの任意の構成成分）を、他の構成成分を含むまたは含まない混合ワクチンとして提供する。改変型生ワクチンは、経口／経口で送達することができる。表３−１を参照されたい。
【０１９６】
約８週齢の、家庭向けの短毛のネコに、改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス［ＦＨＶ］、カリシウイルス［ＦＣＶ−２１］、汎白血球減少ウイルス［ＦＰＶ］およびオウム病クラミジア［ＦＣｐ］を含有するＦＥＬＯＣＥＬＬ４Ａおよび３Ａ構成成分でワクチン接種した。評価したワクチン接種法には以下のものがあった：最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に皮下追加免疫（ＳＱ／ＳＱ）；最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に１回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口）；または最初に経口ワクチン接種、その後２１日目に２回目の経口ワクチン接種。経口ワクチン接種は、口の中へのワクチンの投与によって行った。各ネコの血清試料を２回目のワクチン接種後に収集し、それを５６℃で３０分間熱処理した。ＦＰＶに対する血清中和アッセイで試料を評価した。
【０１９７】
【表２３】
【０１９８】
表３−１の結果から、文献中で以前に報告されたように、ネコがＦＰＶ抗原に対して最小限に応答したことが示唆される。（Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｆｔｅｒ ｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｆｅｌｉｎｅ ｐａｎｌｅｕｋｏｐｅｎｉａ ｖｉｒｕｓ．Ｓｃｈｕｌｔｓ ＲＤ、Ｓｃｏｔｔ ＦＷ、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．１９７３年４月７日（４）：５４７〜９）。しかし、クラミジア、またはクラミジアワクチンと関係する任意の構成成分が存在すると、ＦＰＶ ＳＮ力価がはるかに高くなり、このことから、ＦＰＶ誘発に対するｉｎ ｖｉｖｏでの効果が示唆される。さらに、ＳＱ／ＳＱ、ＳＱ／経口だけでなく、経口／経口の群でも高いＦＰＶ免疫原性が観察された。
【０１９９】
（実施例３−７）
（実際上）ＦＰＶ、ＦＨＶ、ＦＣＶでの経口／経口ワクチン接種法
ＦＰＶ、ＦＨＶ、ＦＣＶを、他の構成成分を含むまたは含まない混合ワクチンとして提供する。改変型生ワクチンは、経口／経口で送達することができる。表３−２を参照されたい。
【０２００】
約８週齢の、家庭向けの短毛のネコに、改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス［ＦＨＶ］、カリシウイルス［ＦＣＶ−２１］および汎白血球減少ウイルス［ＦＰＶ］を含有するＦＥＬＯＣＥＬＬ３Ａでワクチン接種した。評価したワクチン接種法には以下のものがあった：最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に皮下追加免疫（ＳＱ／ＳＱ）；最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に１回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口）；または最初に経口ワクチン接種、その後２１日目に２回目の経口ワクチン接種。経口ワクチン接種は、口の中へのワクチンの投与によって行った。各ネコの血清試料を１回目および２回目のワクチン接種後に収集し、それを５６℃で３０分間熱処理した。ＦＰＶに対する血清中和アッセイで試料を分析した。
【０２０１】
【表２４】
【０２０２】
表３−２の結果から、経口／経口で投与したとき、ＦＥＬＯＣＥＬＬ３Ａワクチン中に存在するＦＰＶ抗原が最小限の免疫応答を誘導したことが示唆される（表３−１の結果と一致）。しかし、ワクチンをＳＱ／ＳＱまたはＳＱ／経口で投与したとき、ｉｎ ｖｉｖｏでの効果を示す高いＦＰＶ ＳＮ力価が観察された。
【０２０３】
本発明の番号付き記載。さらなる記載および例。下記で、ＦＣＶはネコカリシウイルスであり、ＦＰＶは、汎白血球減少またはＦＰＬとも呼ばれているネコパルボウイルスであり、最後にＦＨＶはネコヘルペスウイルスであることに留意されたい。１．単回投与で投与される改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアをどちらも含む免疫原性組成物。２．２回別々の単回投与でネコに送達される改変型生ＦＰＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日、または約３週間または約２週間離れているワクチン。３．ＦＰＶに対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＰＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、またはＮが約３週間であり、またはＮが約２週間であり、前記第１および第２のワクチンが、改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアの両方からなる方法。４．単回投与で投与される改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアをどちらも含む免疫原性組成物。５．２回別々の単回投与でネコに送達される改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日、または約３週間または約２週間離れているワクチン。６．ＦＨＶに対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＨＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、またはＮが約３週間であり、またはＮが約２週間であり、前記第１および第２のワクチンが、改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアの両方からなる方法。７．単回投与で投与される改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアをどちらも含む免疫原性組成物。８．２回別々の単回投与でネコに送達される改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日、または約３週間または約２週間離れているワクチン。９．ＦＣＶに対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＣＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、またはＮが約３週間であり、またはＮが約２週間であり、前記第１および第２のワクチンが、改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアの両方からなる方法。１０．単回投与で投与される改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含む免疫原性組成物。１１．２回別々の単回投与でネコに送達される改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日、または約３週間または約２週間離れているワクチン。１２．ＦＰＶおよびＦＨＶに対してネコを同時に免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＰＶおよびＦＨＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、またはＮが約３週間であり、またはＮが約２週間であり、前記第１および第２のワクチンが、改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含む方法。１３．単回投与で投与される改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含む免疫原性組成物。
１４．２回別々の単回投与でネコに送達される改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日、または約３週間または約２週間離れているワクチン。１５．ＦＰＶおよびＦＣＶに対してネコを同時に免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＰＶおよびＦＨＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、またはＮが約３週間であり、またはＮが約２週間であり、前記第１および第２のワクチンが、改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含む方法。１６．単回投与で投与される改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含む免疫原性組成物。１７．２回別々の単回投与でネコに送達される改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日、または約３週間または約２週間離れているワクチン。１８．ＦＨＶおよびＦＣＶに対してネコを同時に免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＨＶおよびＦＣＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、またはＮが約３週間であり、またはＮが約２週間であり、前記第１および第２のワクチンが、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含む方法。１９．単回投与で投与される改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含む免疫原性組成物。２０．２回別々の単回投与でネコに送達される改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日、または約３週間または約２週間離れているワクチン。２１．ＦＰＶ、ＦＨＶおよびＦＣＶに対してネコを同時に免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＰＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが１〜１２０（両端を含む）の整数であり、またはＮが約３週間であり、またはＮが約２週間であり、前記第１および第２のワクチンが、改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含む方法。
【０２０４】
１．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質を含むワクチン。
２．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、前記キャプシドタンパク質が、タンパク質配列（配列番号１３）または少なくとも約９１．２％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、免疫応答を生じさせるのに有効な量提供されるワクチン。
３．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するＤＮＡワクチンであって、ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１２）または少なくとも約７８．７％、もしくは７９．２％の配列同一性を有し、保存的置換を許容する配列を含むＤＮＡワクチン。
４．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質がＦＣＶ−４９株由来のタンパク質配列を含むワクチン。
５．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、前記キャプシドタンパク質が、タンパク質配列（配列番号１５）または少なくとも約９２．７％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、免疫応答を生じさせるのに有効な量提供されるワクチン。
６．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するＤＮＡワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１４）または少なくとも約７８．９％、すなわち７９．４％（７８．９＋０．５）の配列同一性を有し、保存的置換を許容する配列を含むＤＮＡワクチン。
７．アジュバントを含有するか、ＦＣＶ構成成分が生であるか、ＦＣＶ構成成分が弱毒化されているか、ＦＣＶ構成成分が不活性化されているか、のうち単独またはいずれかの組合せをさらに含み、ＦＣＶ−Ｆ９、ＦＣＶ−ＬＬＫ、ＦＣＶ−Ｍ８、ＦＣＶ−２５５、およびＦＣＶ−２２８０からなる群から選択される少なくとも１つの他のネコカリシウイルス株を含んでよい、１．から６．のいずれかに記載のワクチン。
８．ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）に対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＣＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを非経口投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０日（両端を含む）の整数である方法。
９．ワクチンがそれぞれ独立に生ウイルスワクチン、改変型生ウイルスワクチン、不活性化ウイルスワクチン、組換えワクチン、ＤＮＡワクチン、またはサブユニット抗原ワクチンを単独でまたは組み合わせて含む、８．に記載の方法。
１０．少なくとも１つのワクチンが、ＦＣＶの１つまたは複数の株を含む、９．に記載の方法。
１１．ＦＣＶの１つまたは複数の株が、Ｆ９もしくはＦＣＶ−２１またはＦ９およびＦＣＶ−２１を含む、１０．に記載の方法。
１２．単回投与で投与される、改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含む免疫原性組成物。
１３．２回別々の単回投与でネコに送達される、改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日離れているワクチン。
１４．ＦＰＶ、ＦＣＶおよび／またはＦＨＶに対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＰＶ、および／またはＦＣＶおよび／またはＦＨＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、前記第１および第２のワクチンが、ａ）改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／またはｂ）改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／またはｃ）改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／またはｄ）改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／またはｅ）改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／またはｆ）改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／またはｇ）改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジア、もしくはその任意の組合せを含む組成物からなる方法。
１５．本明細書に記載されている、動物、特にネコを治療するための任意の免疫原性組成物、ワクチン、および方法。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々のワクチンを種々の動物に投与する新たな方法の提供に関する。本発明は、いくつかの単離ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）を開示する。本発明は、ＦＣＶワクチンをネコに与える新たな方法を開示する。本発明はまた、ネコカリシウイルスをコードする核酸クローンにも関する。本発明は、ＦＣＶキャプシドタンパク質、生または死滅ワクチン、キャプシドタンパク質を含むサブユニットワクチン、核酸ワクチン、および単離ネコカリシウイルスのキャプシドタンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスベクターワクチンに関する。本発明はまた、ワクチン組成物の作製に有用なネコカリシウイルスを同定する方法、およびネコカリシウイルスに感染したネコを診断するアッセイにも関する。本発明はまた、新たなＦＣＶワクチンおよび古いＦＣＶワクチンをネコ科動物に投与する新たな方法をも提供する。
【背景技術】
【０００２】
カリシウイルスは、ネコにおける疾患の重要な原因であることが報告されている。発熱、鼻炎、くしゃみ、軽度の結膜炎、眼漏、外鼻孔、口腔粘膜中または舌上の小疱、肺炎、気管気管支炎（ｔｒａｃｈｅａｌ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、下痢、筋肉痛、こわばった口（ｓｔｉｆｆ ｇａｔｅ）や知覚過敏などの多様な症状が観察される。日和見細菌感染はしばしばＦＣＶ感染を伴い、それによって治療および回復が複雑となる。重度のＦＣＶ感染により、特に幼若なネコで死に至る可能性がある。そのような徴候は、報告によれば自然の場合では一般的であるが、実験的感染ではいつも顕著であるというわけではないことに留意されたい。ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）の種々の野外株が疾患を引き起こすその潜在性において異なり、または他の作用物質との同時感染が疾患の症状に影響を及ぼすように思われる。
【０００３】
ネコカリシウイルスに対するワクチンは、２０年を超える期間利用可能であった。多数のＦＣＶ血清型が存在するが、Ｆ９などの特定の株は、広範囲のＦＣＶ株に対して抗体を誘導することが分かった。Ｊ．Ｌ．ＢｉｔｔｌｅおよびＷ．Ｊ．Ｒｕｂｉｃ、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．、３７：２７５〜７８（１９７６）を参照されたい。結果的に、ネコカリシウイルスに対する最も初期のワクチンでは、改変型または弱毒化型のＦＣＶ−Ｆ９株が使用された。参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＪ．Ｌ．ＢｉｔｔｌｅおよびＷ．Ｊ．Ｒｕｂｉｃの米国特許第３，９３７，８１２号を参照されたい。
【０００４】
ＦＣＶ−Ｆ９由来のワクチンおよび他の市販されているワクチンは多数の野外単離物からの防御をもたらすが、これらのワクチンがすべての株の感染を防止することは真実ではない。さらに、ＦＣＶが進化し続けるにつれて、ＦＣＶ−Ｆ９に基づくワクチンは、ますます少数の野外単離物に対してしか防御をもたらさなくなる（Ｌａｕｒｉｔｚｅｎら、１９９７、Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５６：５５〜６３）。さらに、獣医は、単一の血清型に基づくワクチンの効果に対して懸念を示している。実際、野外研究から、ＦＣＶ−Ｆ９株に由来するワクチンがネコカリシウイルスの多数の株に対して不十分な免疫しかもたらさないことが示唆される。例えば、Ｎ．Ｃ．Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、Ｆｅｌｉｎｅ Ｐｒａｃｔ．、１３（１）：２６〜３５（１９８３）；Ｓ．Ｄａｗｓｏｎら、Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１３２：３４６〜５０（１９９３）を参照されたい。獣医にはまた、ある状況では、そうでなければ健康な動物に疾患を引き起こす可能性がある改変型生ウイルスの投与についての懸念も起こっている。研究者は、皮下投与するＦＣＶワクチンの不注意な経口投与により急性疾患が生じることを報告している。Ｒ．Ｃ．Ｐｏｖｅｙ、Ｆｅｌｉｎｅ Ｐｒａｃｔ．、７（５）：１２〜１６（１９７７）を参照されたい。したがって、それ自体でまたは他のワクチンと組み合わせるとネコへのワクチン接種後に所望の防御をもたらすワクチンの開発には引き続き関心がある。ネコから単離されたいくつかの単離物を本明細書に記載し、免疫感作したネコにおいて広い防御をもたらす手段を提供する。
【０００５】
情報の開示
米国特許文献
３９３７８１２ １９７６年２月 Ｂｉｔｔｌｅら、３９４４４６９ １９７６年３月 Ｂｉｔｔｌｅら
４４８６５３０ １９８４年１２月 Ｄａｖｉｄら、４７８６５８９ １９８８年１１月 Ｒｏｕｎｄｓら、
５１６９７８９ １９９２年１２月 Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、５２２９２９３ １９９３年７月 Ｍａｔｓｕｕｒａら
５２６６３１３ １９９３年１１月 Ｅｓｐｏｓｉｔｏら、５３３８６８３ １９９４年８月 Ｐａｏｌｅｔｔｉら
５４９４８０７ １９９６年２月 Ｐａｏｌｅｔｔｉら、５５５９０４１ １９９６年９月 Ｋａｎｇら
５５６１０６４ １９９６年１０月 Ｍａｒｑｕｅｔら、５５８０８５９ １９９６年１２月 Ｆｅｌｇｎｅｒ
５５８５１００ １９９６年１２月 Ｍｏｎｄら、５５８９３８４ １９９６年１２月 Ｌｉｓｃｏｍｂｅ
５５８９４６６ １９９６年１２月 Ｆｅｌｇｎｅｒ、５６２０８４５ １９９７年４月 Ｇｏｕｌｄら
５６５６４４８ １９９７年８月 Ｋａｎｇら、５６９３７６１ １９９７年１２月 Ｑｕｅｅｎら
５６９３７６２ １９９７年１２月 Ｑｕｅｅｎら、５６９５９２８ １９９７年１２月 Ｓｔｅｗａｒｔら
５７０３０５５ １９９７年１２月 Ｆｅｌｇｎｅｒ、５７１６７８４ １９９８年２月 ＤｉＣｅｓａｒｅ
５７１６８２２ １９９８年２月 Ｗａｒｄｌｅｙ、５７１８９０１ １９９８年２月 Ｗａｒｄｌｅｙ
５７２５８６３ １９９８年３月 Ｄａｎｉｅｌｓら、５７２８５８７ １９９８年３月 Ｋａｎｇら
５８００８２１ １９９８年９月 Ａｃｈｅｓｏｎら、５９７７３２２ １９９９年１１月 Ｍａｒｋｓら
６０１０７０３ ２０００年１月 Ｍａｅｓら、６３５５２４６ ２００２年３月 Ｋｒｕｇｅｒら
６，５３４，０６６Ｂ１ ２００３年３月 Ｐｏｕｌｅｔら
外国特許文献
０４８４３８２ １９９５年３月 ＥＰ、ＷＯ２００４／０８３３９０
他の刊行物
Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ，Ｊ．ＮおよびＢｒｏｗｎ，Ｆ．，Ｊ．、Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、２２、ｐｐ．２８１〜２８５（１９７４）
ＣｌａｒｋｅおよびＬａｍｂｄｅｎ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７８：２９１〜３０１（１９９７）
Ｇｒｉｅｓｔ，Ｎ．Ｒ．、１９７９、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第３版）、ｐｐ．８４〜８５、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ
Ｊ．Ｌ．ＢｉｔｔｌｅおよびＷ．Ｊ．Ｒｕｂｉｃ、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３７：２７５〜７８（１９７６）
Ｌａｕｒｉｔｚｅｎら、Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５６：５５〜６３（１９９７）
Ｍａｋｙ，Ｂｒｉａｎ Ｗ．Ｊ．およびＫａｎｇｒｏ，Ｈｉｌｌａｒ Ｏ．、１９９６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ、ｐｐ．３５〜３７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
Ｍｏｔｉｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６４：４３１３〜４３１８（１９９６）
Ｎ．Ｃ．Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、Ｆｅｌｉｎｅ Ｐｒａｃｔ．１３（１）：２６〜３５（１９８３）
Ｏｇｌｅｓｂｙ，Ａ．Ｓ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４、ｐｐ．３２９〜３４１（１９７１）
Ｐｏｕｌｅｔら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １０６：１７〜３１（２００５）
Ｐｏｕｌｅｔら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４５：２４３〜２６１（２０００）
Ｒ．Ｃ．Ｐｏｖｅｙ、Ｆｅｌｉｎｅ Ｐｒａｃｔ．、７（５）：１２〜１６（１９７７）
Ｓ．Ｄａｗｓｏｎら、Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．、１３２：３４６〜５０（１９９３）
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、英国Ｏｘｆｏｒｄ
Ｓｏｅｒｇｅｌ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、５、ｐｐ２３９〜２４４（１９７５）
Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｎ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、第１４巻、第１７／１８号、ｐｐ．１６５７〜１６６３（１９９６）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、いくつかの単離ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）の新たな株を提供し、そのウイルスに関する。本発明はまた、ワクチンを動物に、具体的にはＦＣＶワクチンをネコに与える新たな方法をも開示する。本発明はまた、ネコカリシウイルスをコードする核酸クローンにも関する。本発明は、ＦＣＶキャプシドタンパク質、生または死滅ワクチン、キャプシドタンパク質を含むサブユニットワクチン、核酸ワクチン、および単離ネコカリシウイルスのキャプシドタンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスベクターワクチンに関する。本発明はまた、ワクチン組成物の作製に有用なネコカリシウイルスを同定する方法、およびネコカリシウイルスに感染したネコを診断するアッセイにも関する。本発明はまた、新たなＦＣＶワクチンおよび古いＦＣＶワクチンをネコ科動物に投与する新たな方法をも提供する。汎白血球減少またはＦＰＬとも呼ばれているＦＰＶまたはネコパルボウイルスと、ネコ鼻気管支炎ウイルスとも呼ばれている他の疾患のＦＨＶまたはネコヘルペスウイルスの両方に対するワクチンで動物を、具体的にはネコを治療し免疫感作するための方法および材料も本明細書に記載する。記載するようにネコ科動物に与えたときＦＰＶおよび／またはＦＨＶワクチンの両方の有効な経口／経口および皮下／経口送達が可能となるワクチンの新規の組合せを下記に記載する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
具体的には、本発明は、ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作する下記のワクチンを開示する。ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質（配列番号１３）、または少なくとも約９１．２％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列。ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１２）または少なくとも約７８．７％もしくは７９．２％の配列同一性を有し、保存的置換を許容する配列を含むＤＮＡワクチン。
【０００８】
ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質が、ＦＣＶ−４９株由来のタンパク質配列（配列番号１５）または少なくとも約９２．７％、９５％もしくは９９％の同一性を有し、有効量提供されるワクチン。ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１４）または少なくとも約７８．９％、すなわち７９．４％（７８．９＋０．５）の配列同一性を有し、保存的置換を許容する配列を含むＤＮＡワクチン。
【０００９】
ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質がＦＣＶ−２６３９１−４株由来のタンパク質配列を含むワクチン。ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質がタンパク質配列（配列番号１７）または少なくとも約９１．８％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含むワクチン。ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１６）または少なくとも約７８．４％、すなわち７８．９％（７８．４＋０．５）の配列同一性を有する配列を含むＤＮＡワクチン。
【００１０】
ポリヌクレオチドが本質的に配列番号１２、１４、１６からなる群から選択されるワクチン。そのワクチンは、アジュバントを含有するワクチン、ＦＣＶ構成成分が生であるワクチン、ＦＣＶ構成成分を弱毒化したワクチン、ＦＣＶ構成成分を不活性化したワクチンのうち単独でもよく、またはいずれかの組合せでもよく、それはＦＣＶ−Ｆ９、ＦＣＶ−ＬＬＫ、ＦＣＶ−Ｍ８、ＦＣＶ−２５５、およびＦＣＶ−２２８０からなる群から選択される少なくとも１つの他のネコカリシウイルス株を含んでよい。
【００１１】
免疫応答を生じさせるのに有効な量の、配列番号１３、１５、または１７と９３％以上の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるＦＣＶキャプシドタンパク質のヌクレオチド配列であって、ＦＣＶ単離物が株２１３−９５でなく、核酸配列が異種プロモーター配列と作動的に連結しているヌクレオチド配列と、薬学的に許容できる担体とを含む、ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチン。本質的に配列番号１２、１４、１６からなる群から選択される群から選択されるＦＣＶキャプシドタンパク質のヌクレオチド配列を含む、ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチン。ヌクレオチド配列が、プラスミド、組換えウイルスベクター、または任意の他のヌクレオチドベクターのいずれかの中にあるワクチン。
【００１２】
組換えウイルスベクターが、ネコヘルペスウイルス、アライグマポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、アデノウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群から選択されるワクチン。
【００１３】
獣医学的に許容できる賦形剤の媒体と、本明細書において２３、２６、４１、４４および５６と呼ばれるモノクローナル抗体から選択されるモノクローナル抗体と結合するＦＣＶの単離株とを含む免疫原性組成物についても記載する。本発明の一部の型では、免疫原性組成物は、獣医学的に許容できる賦形剤の媒体と、本明細書において２３、２６、４１、４４および５６と呼ばれるモノクローナル抗体から選択されるモノクローナル抗体と選択的に結合するＦＣＶの単離株とを含む。これらの免疫原性組成物は、ＦＣＶ株が不活性化され、前記ＦＣＶ株がワクチンであり、アジュバントを含む組成物が含まれる。
【００１４】
本明細書に記載のワクチンは、ネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｓｉｔｔａｃｉ）、およびネコパルボウイルス、狂犬病ウイルスおよび気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）からなる群から選択される少なくとも１つの他のネコ病原体を含んでよい。ワクチンはまた、アジュバントをさらに含んでもよく、それとともに投与してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）と関係する死亡率を有意に低下させ、ＦＣＶワクチンの安全性を高めるワクチン接種法を提供する。さらに、特許請求に係るワクチン接種法は、既存のＦＣＶ−Ｆ９ワクチンプロトコールより幅広い血清交差中和特性を誘導し、それはネコカリシウイルスの異なる株全体に対してより良好な免疫をもたらすはずである。
【００１６】
本発明の一態様は、ワクチンで動物を、具体的にはネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作する方法を提供する。２つの他のネコ疾患であるＦＰＶおよびＦＨＶも、本明細書に記載する新規の治療を有する。その方法は、ネコに治療有効量の第１のワクチン、第２のワクチンを投与するステップを含み、年１回の追加免疫として約１年後、上記のように１２０日以内、またはより頻繁に第３のワクチンの投与を行ってもよい。第１のワクチンを非経口（例えば、皮下、筋内など）投与する。第１のワクチンの投与後約Ｎ日目に第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１または第２のワクチンの投与後約Ｍ日目に第３のワクチンを非経口、経口または口鼻投与する。ここで、ＮおよびＭは、それぞれ独立に、３〜１２０（両端を含む）の整数である。Ｎが約３週間および約２〜４週間である場合も好ましい。さらに、同定された特定のワクチンを２回の経口投与として投与することができ、最初に非経口投与する必要がない本発明の一態様を提供する。年１回の追加免疫についても助言する。
【００１７】
配列表の簡単な説明
配列番号１：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＥＬ−６５３
配列番号２：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＥＬ−６５１
配列番号３：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｎ２
配列番号４：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｎ３
配列番号５：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｎ４
配列番号６：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｎ５
配列番号７：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｎ６
配列番号８：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｎ９
配列番号９：
オリゴヌクレオチドプライマー、プライマー２
配列番号１０：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｃ４
配列番号１１：
オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＣＶ−ＳＲ Ｃ８
配列番号１２：
ＦＣＶ−２１キャプシド遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号１３：
ＦＣＶ−２１キャプシド遺伝子のコードされたアミノ酸配列
配列番号１４：
ＦＣＶ−４９キャプシド遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号１５：
ＦＣＶ−４９キャプシド遺伝子のコードされたアミノ酸配列
配列番号１６：
ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシド遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号１７：
ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシド遺伝子のコードされたアミノ酸配列
【００１８】
定義および略語
測定可能な数値変数に関して使用するとき「約（ａｂｏｕｔ）」とは、「約３週間」が１７〜２５日間であり、約２〜４週間が１０〜４０日間である週単位の時間間隔に関して約（ａｂｏｕｔ）を使用する場合を除いて、変数の示された値、および示された値の実験誤差内（例えば平均の９５％信頼区間内）または示された値の１０パーセント以内のどちらか大きい方に入る変数のすべての値を指す。
【００１９】
「能動免疫」は、本発明のワクチンでのネコのワクチン接種によって誘導されるネコウイルスに対する液性免疫および／または細胞性免疫をどちらも含む。
【００２０】
「抗体」とは、特定の抗原との免疫応答の結果、その抗原と結合することができるイムノグロブリン分子を指す。イムノグロブリンは、「定常」領域および「可変」領域を有するポリペプチド「軽」鎖および「重」鎖から構成される血清タンパク質であり、定常領域の組成に基づいてクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）に分けられる。所与の抗原に「特異的」である抗体は、抗体の可変領域が特定の抗原を認識し排他的にそれと結合することを示し、例えば、抗体は、キャプシドタンパク質と他のポリペプチドの間に限局的な配列同一性、相同性、または類似性が存在するにも関わらず、結合親和性の測定可能な違いにより特定のキャプシドタンパク質を他の知られているタンパク質と区別することができる。特定の抗体はまた、抗体の可変領域の外側、具体的には分子の定常領域中にある配列との相互作用により、他のタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡ技術での黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡまたは他の抗体）と相互作用することもできる。抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイは周知である。そのようなアッセイの包括的な論述については、Ｈａｒｌｏｗら（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第６章（１９８８）を参照されたい。抗体はまた、抗体がＦＣＶキャプシドタンパク質に特異的であるという条件で、ＦＣＶキャプシドタンパク質の断片を認識しそれと結合することもできる。抗体は、当技術分野で知られている方法を使用して作製することができる。
【００２１】
「抗原」または「免疫原」とは、対象にさらされた後その抗原に特異的な免疫応答を誘導する１つまたは複数の（直線的、高次構造的またはその両方の）エピトープを含有する分子を指す。エピトープとは、Ｔ細胞受容体または特定の抗体と結合する抗原の特定の部位であり、通常は約３アミノ酸残基〜約２０アミノ酸残基を含む。抗原という用語は、サブユニット抗原という、本来抗原が結合している生物全体、ならびに死滅し、弱毒化しまたは不活性化した細菌、ウイルス、真菌、寄生虫または他の微生物から離れそれと別々となった抗原を指す。抗原という用語はまた、抗イディオタイプ抗体やその断片などの抗体、および抗原または抗原決定基（エピトープ）を模倣することができる合成ペプチドミモトープをも指す。抗原という用語はまた、ＤＮＡ免疫感作の適用などで、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをも指す。
【００２２】
「賦形剤」とは、抗原でないワクチンの任意の構成成分を指す。
【００２３】
ＦＥＬＯＣＥＬＬ３とは、オウム病クラミジアを含まないＦＥＬＯＣＥＬＬ４である。
【００２４】
ＦＥＬＯＣＥＬＬ４は、改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス［ＦＨＶ］、カリシウイルス［ＦＣＶ−Ｆ９］、汎白血球減少ウイルス［ＦＰＶ］およびオウム病クラミジア［ＦＣｐ］を含有する。ＦＥＬＯＣＥＬＬ４Ａは、改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス［ＦＨＶ］、カリシウイルス［ＦＣＶ−２１］、汎白血球減少ウイルス［ＦＰＶ］およびオウム病クラミジア［ＦＣｐ］を含有する。ＦＥＬＯＣＥＬＬ４Ａは、ＦＣＶ−Ｆ９を含まないがＦＣＶ−２１を含むＦＥＬＯＣＥＬＬ４である。ＦＥＬＯＣＥＬＬ３Ａは、ＦＣＶ−Ｆ９を含まないがＦＣＶ−２１を含むＦＥＬＯＣＥＬＬ３である。Ｆｅｌｏｃｅｌｌ（登録商標）４、Ｆｅｌｏｃｅｌｌ４、もしくはＦＥＬＯＣＥＬＬ４またはこれらの語の後に「３」もしくは「４」の数が続くものはワクチンであり、名称Ｆｅｌｏｃｅｌｌの任意の変種は、Ｐｆｉｚｅｒによって所有されている。
【００２５】
「第１のワクチン」、「第２のワクチン」、「第３のワクチン」などは、別々に投与可能なワクチンを指し、それは同じものでもよくまたは異なるものでもよく、一般に任意の順番で投与することができる。したがって、第３のワクチンは、第２のワクチンの前後に対象に投与することができる。
【００２６】
ポリペプチドに関するパーセントアミノ酸配列「同一性」に関して「同一性」とは、両方の配列を整列し必要な場合にギャップを導入して最大のパーセント配列同一性にした後に、標的配列中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率と本明細書で定義する。パーセント配列同一性は、従来の方法によって決定される。簡潔に述べると、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら；Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０；１９９４）およびＰＡＭ２５０重み行列（Ｄａｙｈｏｆｆら、「Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．」、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、５：３４５〜３５８（１９７８））およびプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．；ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）によって提供される初期設定のパラメーターを使用して、２つのアミノ酸配列を整列してアラインメントスコアを最適化する。ＰＡＭ２５０重み行列表を、表１−１として示す（アミノ酸は標準的な１文字のコードで示す）。
【００２７】
【表１】
【００２８】
次いでパーセント同一性を下記のように計算する：
同一整合の合計数＿×１００
［長い配列の長さ＋２つの配列を整列するために長い配列中に導入したギャップの数］
【００２９】
対象中での「免疫応答」とは、抗原に対する液性免疫応答、細胞性免疫応答、または液性および細胞性免疫応答の発生を指す。「液性免疫応答」とは、抗体によって媒介されるものを指す。「細胞性免疫応答」とは、Ｔリンパ球または他の白血球またはその両方によって媒介されるものであり、活性化したＴ細胞、白血球、またはその両方によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、および同様の分子の産生を含む。免疫応答は、当技術分野で知られている標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを使用して決定することができる。
【００３０】
抗原の「免疫学的防御量」または「免疫応答を生じさせるのに有効な量」とは、疾患作用物質、および具体的にはネコカリシウイルスの感染によって引き起こされる有害な健康上の影響またはその合併症を含めた疾患の徴候または症状を防止しまたは改善するのに十分であるレシピエントでの免疫原性応答を誘導するのに有効な量である。液性免疫または細胞性免疫またはその両方を誘導することができる。例えば抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイにより間接的に、または野生型株での誘発後に徴候および症状をモニターすることにより直接的に、ワクチン組成物に対する動物の免疫原性応答を評価することができる。ワクチンによって付与される防御免疫は、例えば、死亡率、罹患率、体温や全体的な身体状態などの臨床的徴候の低下、ならびに対象の全体的な健康および能力を測定することによって評価することができる。免疫応答は、それだけに限らないが、細胞性および／または液性免疫の誘導を含み得る。治療上有効なワクチンの量は使用する特定のウイルス、またはネコの状態に応じて様々となり得、それは獣医により決定することができる。
【００３１】
「鼻内」投与とは、鼻を介しまたはそれを経由する対象の体内へのワクチンなどの物質の導入を指し、主として鼻粘膜を介する物質の輸送が関与する。
【００３２】
ポリヌクレオチドやポリペプチドなど任意の具体的に定義された物質について記載するのに使用するとき「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」とは、ポリペプチドや核酸などの物質が通常認められる元の細胞環境から分離した物質を指す。したがって、本明細書において、ほんの一例として、本発明のポリヌクレオチドを用いて構築された組換え細胞系統は、「単離された」核酸を使用している。あるいは、ＦＣＶキャプシドタンパク質または特異的免疫原性断片をワクチンとして使用することもでき、したがって、本来それがどのように存在し得るかと比較して、それが同定され、分離されある程度精製されているので、それは単離されたとみなされる。キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片が、抗原を産生する組換え細菌または真核生物発現ベクター中で産生される場合、それは、単離されたタンパク質または核酸として存在するとみなされる。例えば、ポリヌクレオチドを用いて構築された組換え細胞系統は、「単離された」核酸を使用している。
【００３３】
「モノクローナル抗体」とは、単一の系統のハイブリドーマ細胞によって産生される抗体を指し、すべてが特定の抗原上の１つのエピトープに対して誘導されるものである。モノクローナル抗体の作製に使用される抗原は、病原体の単離タンパク質または病原体全体として提供することができる。ハイブリドーマとは、骨髄腫細胞と特定の抗体産生細胞の融合によって形成されるハイブリッド細胞からなるクローン細胞系統である。一般に、モノクローナル抗体は、マウス由来のものである；しかし、モノクローナル抗体はまた、ファージディスプレイ技術またはファージディスプレイと同等の方法またはマウス由来でないハイブリッド細胞によって産生される、抗原の特定のエピトープに対して作製された抗体のクローン集団をも指す。
【００３４】
「Ｎ日」、「Ｎ」の間隔もしくは期間、または事象後「Ｍ日」とは、それぞれ事象後Ｎ日目またはＭ日目における任意の時間を指す。例えば、第１のワクチンの投与後３日での対象への第２のワクチンのワクチン接種とは、第１のワクチンの後３日目における任意の時間に第２のワクチンを投与することを意味する。この記載は、第１と第２のワクチン接種の間隔にしばしば適用される。通常好ましいＮの間隔は約３週間または１７〜２５日間であるが、約２〜４週間または１０〜４０日間も一般的であり、ここで本発明は、３〜１２０日のＮの期間で有効である。
【００３５】
「経口」または「経口的」投与とは、口を介しまたはそれを経由する対象の体内へのワクチンなどの物質の導入を指し、嚥下または口腔粘膜を介する輸送（例えば、舌下または口腔吸収）またはその両方が関与する。
【００３６】
「口鼻」投与とは、例えば、鼻の中に液滴を１滴または複数滴入れることにより行われる、鼻および口を介しまたはそれを経由する対象の体内へのワクチンなどの物質の導入を指す。口鼻投与には、経口投与および鼻内投与と関係する輸送過程が関与する。
【００３７】
「非経口投与」とは、消化管を含まない経路を介しまたはそれを経由する対象の体内へのワクチンなどの物質の導入を指す。非経口投与には、皮下投与、筋内投与、経皮投与、皮内投与、腹腔内投与、眼内投与、および静脈内投与がある。この開示の目的で、非経口投与は、口、鼻、気管、および肺中の粘膜組織を介する物質の輸送が主として関与する投与経路を排除するものである。
【００３８】
「受動免疫」とは、ＦＣＶ株に対する抗体または免疫原性構成成分もしくはその構成成分の断片を含むワクチンをネコにワクチン接種した結果ネコにもたらされるネコカリシウイルスに対する防御を指す。
【００３９】
「薬学的に許容できる」とは、正しい医学的判断の範囲内にある、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずに対象の組織と接触させて使用するのに適し、相応の対危険便益比と釣り合い、その使用目的に有効である物質を指す。
【００４０】
「ポリクローナル抗体」とは、特定の病原体または抗原に対して作製された抗体の混合集団を指す。一般に、その集団は様々な抗体の群を含有し、各群は、病原体または抗原の特定のエピトープに対して誘導されたものである。ポリクローナル抗体を作製するために、病原体全体または単離抗原を接種または感染により宿主中に導入し、それが宿主を誘導して、病原体または抗原に対して抗体が作製される。
【００４１】
「呼吸器」投与とは、噴霧（霧化）物質の吸入を介しまたはそれを経由する対象の体内へのワクチンなどの物質の導入を指す。呼吸器投与では、主要な輸送機構には気管、気管支、および肺中の粘膜を介する霧化物質の吸収が関与し、したがって、鼻内または経口的投与と異なる。
【００４２】
「単回投与」とは、同じ日またはほぼ同じ日の投与、すなわちほぼ１日以内に投与するすべての構成成分を意味する。構成成分は、単一容器中に入れてもよく、または入れなくてもよい。
【００４３】
本発明の抗体について記載するのに使用するとき「に特異的な（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ）」は、本発明の抗体の可変領域が特定のウイルス株を認識し排他的にそれと結合する（すなわち、ＦＣＶキャプシドタンパク質とそのようなポリペプチドの間に限局的な配列同一性、相同性、または類似性が存在するにも関わらず、結合親和性の測定可能な違いにより特定のＦＣＶキャプシドタンパク質を他の知られているタンパク質と区別することができる）ことを示す。特定の抗体がまた、抗体の可変領域の外側、具体的には分子の定常領域中にある配列との相互作用により、他のタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡ技術での黄色ブドウ球菌プロテインＡまたは他の抗体）と相互作用することもできることが理解されるであろう。本発明の抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイは周知であり、当技術分野で日常的に実施されている。そのようなアッセイの包括的な論述については、Ｈａｒｌｏｗら（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）、第６章を参照されたい。抗体がＦＣＶキャプシドタンパク質に特異的であるという条件で、本発明のＦＣＶキャプシドタンパク質の断片を認識しそれと結合する抗体も意図される。本発明の抗体は、当技術分野で周知であり日常的に実施されている任意の方法を使用して作製することができる。
【００４４】
「特異的免疫原性断片」とは、下記で詳細に定義づけるように、その配列に特異的な抗体によって認識可能な配列の部分を意味する。
【００４５】
「対象」とは、免疫系を有する任意の動物を指し、ネコなどの哺乳動物を含む。
【００４６】
「サブユニットワクチン」とは、１つまたは複数の抗原を含むが、すべての抗原を含むわけではないワクチンの型を指し、その抗原は、ウイルス、細菌、寄生虫や真菌など、対象とする病原体の抗原に由来しまたはそれと同種である。そのような組成物は、完全な病原体細胞もしくは病原性粒子、またはそのような細胞もしくは粒子の溶解物を実質的に含まない。したがって、病原体またはその類似体から少なくとも部分的に精製し、または実質的に精製した免疫原性ポリペプチドからサブユニットワクチンを調製することができる。サブユニットワクチン中の１つまたは複数の抗原を得る方法には、標準的な精製技術、組換えによる作製、または化学合成がある。
【００４７】
「ＴＣＩＤ５０」とは「組織培養感染量」を指し、所与のバッチの接種細胞培養物の５０％に感染させるのに必要なウイルスの希釈率と定義される。本明細書全体にわたって利用されるＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を含めた様々な方法を使用して、ＴＣＩＤ５０を計算することができる。Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法の記載については、Ｂ．Ｗ．ＭａｈｙおよびＨ．Ｏ．Ｋａｎｇｒｏ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ、２５〜４６（１９９６）を参照されたい。
【００４８】
この開示の文脈で「治療有効量」とは、ウイルス（例えば、ＦＣＶ）、細菌、寄生虫や真菌などの病原体の感染によって引き起こされる有害な健康上の影響またはその合併症を含めた疾患の徴候または症状を防止しまたは改善するのに十分である、抗原またはワクチンを投与した対象（例えば、ネコ）中で免疫応答を誘導する抗原またはワクチンの量を指す。液性免疫または細胞性免疫または液性免疫と細胞性免疫の両方を誘導することができる。例えば抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイにより間接的に、または野生型株での誘発後に徴候および症状をモニターすることにより直接的に、ワクチン組成物に対する動物の免疫原性応答を評価することができる。ワクチンによって付与される防御免疫は、例えば、死亡率、罹患率、体温などの臨床的徴候の低下、対象の全体的な身体状態ならびに全体的な健康および能力を測定することによって評価することができる。治療上有効なワクチンの量は使用する特定のウイルス、または対象の状態に応じて様々となり得、それは医師により決定することができる。
【００４９】
「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、そのような用語が当てはまる障害、状態もしくは疾患から回復させ、それを改善し、その進行を阻害し、もしくはそれを防止すること、またはそのような障害、状態もしくは疾患の１つもしくは複数の症状を防止することを指す。
【００５０】
「治療」とは、直前で定義した「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」行為を指す。
【００５１】
「ワクチン」とは、抗原を含み、下記で定義するいわゆる「サブユニットワクチン」を包含する組成物を指す。対象にワクチンを投与すると免疫応答が生じる。非経口、経口などを含めた任意の知られている投与経路によりワクチンを対象中に直接導入することができる。
【００５２】
第１部
本発明のワクチン、ウイルス株、キャプシドタンパク質、および抗体
本発明は、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４からなる群から選択される生のまたは死滅したＦＣＶ株に基づくワクチンを提供する。本発明は、本発明のＦＣＶ株由来のＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする核酸ワクチンをさらに提供する。本発明は、本発明のＦＣＶ株に由来する単離キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をさらに提供する。
【００５３】
ＦＣＶ株では、キャプシドタンパク質から生じる抗原決定基によって良好な免疫応答が誘導される。ここで、密接に関連するキャプシドタンパク質およびその変異体を含めてＦＣＶのいくつかの株を記載し特許請求する。具体的には、ＦＣＶ−２１株およびタンパク質配列（配列番号１３）または９１．２％、９５％もしくは９９％以上の同一性を有する配列；ＦＣＶ−４９株およびタンパク質配列（配列番号１５）または９２．７％、９５％もしくは９９％以上の同一性を有する配列；ＦＣＶ−２６３９１−４株およびタンパク質配列（配列番号１７）または９１．８％、９５％もしくは９９％以上の同一性を有する配列を記載する。
【００５４】
本発明のワクチンは一般に、ネコカリシウイルスの病原性株によって引き起こされる疾患に対してネコを免疫感作する予防的処置となることが意図される。しかし、ワクチンはまた、ネコカリシウイルスの病原性株にすでに感染しているネコの治療的処置にも意図される。例えば、ＦＣＶキャプシドまたはその免疫原性構成成分で異種の宿主を免疫感作することによって産生される抗体を含むワクチンは、ネコカリシウイルスに感染したネコの治療的処置に使用される。
【００５５】
しかし、能動免疫をもたらすワクチン、すなわちＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４からなる群から選択されるＦＣＶ株、またはその突然変異体、または本発明のＦＣＶ株に由来するキャプシドタンパク質、またはそのキャプシドタンパク質の特異的免疫原性断片を含むワクチンでも、様々な疾患に対する治療的処置として投与したときに有効となることが予想される。したがって、本発明によってもたらされる免疫は能動免疫でもよく、または受動免疫でもよく、ワクチンの使用目的は予防的でもよく、または治療的でもよい。
【００５６】
本発明のワクチンのいずれか１つの実施形態での投与経路には、それだけに限らないが、口鼻、筋内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内、および経口ならびに経皮、または吸入もしくは坐剤による投与がある。好ましい投与経路には、口鼻、筋内、腹腔内、皮内、および皮下注射がある。ワクチンは、任意の手段によって投与することができ、その手段には、それだけに限らないが、シリンジ、噴霧器、霧吹き、無針注射機器、または微粒子遺伝子銃（微粒子銃）がある。
【００５７】
本発明のいずれか１つの実施形態でのワクチンは、使用する投与形態に従って、薬学的に許容される担体中で製剤される。当業者なら、生のまたは死滅したＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９またはＦＣＶ２６３９１−４、本発明のＦＣＶ株のいずれかに由来するキャプシドタンパク質またはその免疫原性断片、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９もしくはＦＣＶ２６３９１−４キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする組換えウイルスベクター、またはＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９もしくはＦＣＶ２６３９１−４に由来するキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードするＤＮＡ分子を含むワクチンを容易に製剤することができる。筋内注射が好ましい場合では、等張性の製剤が好ましい。一般に、等張性のための添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースがあり得る。特定の場合では、リン酸緩衝溶液などの等張溶液が好ましい。製剤は、ゼラチンやアルブミンなどの安定化剤をさらに提供することができる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤を製剤に添加する。本発明による医薬製剤は、滅菌され、発熱物質を含まない状態で提供される。しかし、本発明のワクチンを含む、薬学的に許容される担体に好ましい製剤が、生ネコカリシウイルスワクチン、死滅ネコカリシウイルスワクチン、ポリペプチド（抗原）サブユニットワクチン、組換えウイルスベクターワクチン、抗体ワクチン、およびＤＮＡワクチンについて、米国農務省（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）、またはカナダ、メキシコや欧州各国のいずれか一国などの外国における同等の政府機関によって公布された規則で承認された薬学的担体であることは当業者に周知である。したがって、本発明のワクチンの商業生産について薬学的に許容される担体は、米国または外国における適当な政府機関によってすでに承認され、または承認される予定である担体である。ワクチンは、薬学的に許容できるアジュバントとさらに混合することができる。本発明のワクチンの特定の製剤では、ワクチンを他のネコワクチンと混合して、他のネコ病原体によって引き起こされる広範な疾患に対してネコを防御することができる多価ワクチン製品を生産する。現在、ネコワクチンの商業的製造業者も最終消費者も多価ワクチン製品の方を好む。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、ネコカリシウイルス、ならびに好ましくはネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコクラミジア、およびネコ汎白血球減少ウイルスからなる群から選択される少なくとも１つの他のネコ病原体に対してネコを免疫感作する多価ワクチンを提供する。
【００５８】
ネコへの接種は、好ましくは、完全な幅広い免疫原性応答を生じさせる単回ワクチン接種によって行う。本発明の他の実施形態では、ネコに一連のワクチン接種を施して、完全な幅広い免疫応答を生じさせる。一連のワクチン接種を行うとき、ほぼ１日から４週間以上の間隔でワクチン接種を行うことができる。特定の実施形態では、同時に異なる部位でネコにワクチン接種する。経路および投与についてのさらなる詳細は、下記の「カリシウイルスに対してネコを免疫感作する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ Ｃａｔｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ．）」という名称の節で見出される。
【００５９】
ワクチン組成物は、薬学的媒体、賦形剤、または媒質として働く、ワクチンと適合性のある薬学的に許容できる（すなわち、滅菌され毒性のない）液体、半固体、または固体希釈剤を含んでもよい。希釈剤には、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどがあり得る。等張剤には、とりわけ塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースがあり得る。安定化剤にはとりわけアルブミンがある。フロイント完全アジュバントやフロイント不完全アジュバントなどの油に基づくアジュバント、ミコール酸に基づくアジュバント（例えば、トレハロースジミコレート）、細菌リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（すなわち、ムレイン、ムコペプチド、またはＮ−Ｏｐａｃａなどの糖タンパク質、ムラミルジペプチド［ＭＤＰ］、またはＭＤＰ類似体）、プロテオグリカン（例えば、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から抽出されるもの）、レンサ球菌製剤（例えば、ＯＫ４３２）、Ｂｉｏｓｔｉｍ（商標）（例えば、０１Ｋ２）、ＥＰ １０９ ９４２、ＥＰ １８０ ５６４およびＥＰ ２３１ ０３９の「Ｉｓｃｏｍ」、水酸化アルミニウム、サポニン、ＤＥＡＥ−デキストラン、中性油（ミグリオル（ｍｉｇｌｙｏｌ）など）、植物油（ラッカセイ油など）、リポソーム、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオールを含めて、当技術分野で知られている任意のアジュバントをワクチン組成物中で使用することができる。アジュバントには、それだけに限らないが、他に多数ある中でもＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、コレステロール、水中油型乳剤、例えばフロイント完全およびフロイント不完全アジュバントなどの油中水型乳剤、ブロックコポリマー（Ｂｌｏｃｋ ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒ）（ＣｙｔＲｘ、ジョージア州Ａｔｌａｎｔａ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア州Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、アラバマ州Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）もしくは他のサポニン分画、モノホスホリル脂質Ａ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来の熱不安定性エンテロトキシン（組換えまたはその他によるもの）、コレラ毒素、またはムラミルジペプチドがある。免疫原性組成物は、例えば、インターロイキン、インターフェロンや他のサイトカインなどの１つまたは複数の他の免疫調節作用物質をさらに含んでよい。免疫原性組成物はまた、ゲンタマイシンおよびＭｅｒｔｈｉｏｌａｔｅを含んでもよい。本発明との関連で有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は当業者により容易に決定することができるが、本発明は、アジュバントを約５０μｇ〜約２０００μｇ、好ましくはワクチン組成物の投与量２ｍｌ当たり約５００μｇ含む組成物を意図するものである。他の好ましい実施形態では、本発明は、約１μｇ／ｍｌ〜約６０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約３０μｇ／ｍｌ未満の抗生物質を含むワクチン組成物を意図するものである。
【００６０】
本発明の免疫原性組成物は、投与経路に応じて様々な形態で作製することができる。例えば、免疫原性組成物は、注射可能な使用に適した滅菌水溶液剤もしくは分散剤の形態で作製することもでき、または凍結乾燥技術を使用して凍結乾燥した形態で作製することもできる。凍結乾燥した免疫原性組成物は通常約４℃で維持され、アジュバントを含むまたは含まない安定化溶液、例えば食塩水または／およびＨＥＰＥＳ中で再調製することができる。
【００６１】
さらに、本発明の免疫原性ワクチン組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容できる担体を含んでよい。本明細書において、「薬学的に許容できる担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散用媒質、被覆、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などを含む。（複数の）担体は、本発明の構成成分と適合性があり、免疫感作する対象にとって有害でないという意味で「許容でき」なければならない。通常、担体は滅菌され、発熱物質を含まない。
【００６２】
生ワクチン
本発明のワクチンの一実施形態では、ワクチンは生ワクチンを含み、ＦＣＶ構成成分は、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４からなる群から選択される。これらの株が非病原性の型で単離されたので、それらは、疾患を引き起こさずにネコの免疫系を刺激する生ワクチンの調製に特に好ましい。
【００６３】
ウイルスをさらに弱毒化する方法は当技術分野で周知であり、適切な細胞系統での細胞培養における連続的な継代や、紫外線または化学的突然変異生成などの方法を含む。
【００６４】
不活性化ワクチン
本発明の他の実施形態では、ワクチンは、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４からなる群から選択されるＦＣＶ株を含む不活性化または死滅ＦＣＶワクチンを含む。不活性化ワクチンは、当技術分野で周知の方法によって作製される。例えば、ウイルスを増殖させて高力価にした後、当技術分野で周知の方法によってウイルス抗原量を得ることができることが当業者には容易に明らかとなるであろう。例えば、ウイルス抗原量は、希釈、濃縮、または抽出によって得ることができる。ワクチンの産生に適したウイルス抗原量を得るのにこれらの方法がすべて使用されている。カリシウイルスは、ホルマリン、ベータプロプリオラクトン（ＢＰＬ）、もしくは二成分エチレンイミン（ＢＥＩ）での処理、または当業者に知られている他の方法によって不活性化する。
【００６５】
ホルマリンによる不活性化は、カリシウイルス懸濁物を３７％ホルムアルデヒドと混合してホルムアルデヒドの終濃度を０．０５％にすることによって行う。室温で約２４時間絶えず撹拌することによってカリシウイルス−ホルムアルデヒド混合物を混合する。次いで、不活性化したカリシウイルス混合物を、ＣＲＦＫ細胞などの適切なネコ細胞系統での増殖についてアッセイを行うことにより、生きているウイルスが残存するかどうか試験する。
【００６６】
ＢＥＩによる不活性化は、本発明のカリシウイルス懸濁物を０．１Ｍ ＢＥＩ（０．１７５Ｎ ＮａＯＨ中の２−ブロモ−エチルアミン）と混合してＢＥＩの終濃度を１ｍＭにすることによって行う。室温で約４８時間絶えず撹拌し、その後１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウムを添加して終濃度０．１ｍＭにすることによってカリシウイルス−ＢＥＩ混合物を混合する。さらに２時間混合を継続する。不活性化したカリシウイルス混合物を、ＮＬＦＫ細胞などの適切なネコ細胞系統での増殖についてアッセイを行うことにより、生きているカリシウイルスが残存するかどうか試験する。
【００６７】
本発明の上記の不活性化カリシウイルスを、不活性化ウイルスワクチンを製剤するための薬学的担体のいずれか１つと混合して適当な投与レベルにする。不活性化ワクチンは、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４からなる群から選択されるＦＣＶ構成成分に加えて、好ましくはＦＣＶ−Ｆ９、ＦＣＶ−Ｍ８、ＦＣＶ−２５５、およびＦＣＶ−２２８０からなる群から選択される少なくとも１つの他のネコカリシウイルス株をさらに含んでよい。好ましい実施形態では、ワクチンは、好ましくはネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコクラミジア、およびネコ汎白血球減少ウイルスからなる群から選択される１つまたは複数の他のネコ病原体に対してネコを免疫感作するためのワクチンをさらに含む。
【００６８】
組換えワクチン
本発明のさらなる実施形態では、ワクチンは、本明細書で開示されるＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする核酸を含有する組換えウイルスベクターを含む。
【００６９】
特定の一実施形態では、組換えウイルスベクターは、ネコカリシウイルスとネコヘルペスウイルスの両方に対してネコを免疫感作するネコヘルペスウイルスである。他の実施形態では、組換えウイルスベクターは、好ましくはネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコクラミジア、およびネコ汎白血球減少ウイルス、狂犬病ウイルスおよび気管支敗血症菌からなる群から選択される１つまたは複数の抗原を含む。
【００７０】
ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を発現する組換えウイルスベクターを作製するには、キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードするｃＤＮＡを、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスやアデノウイルスなどのウイルスベクターのゲノム中に挿入する。Ｗａｒｄｌｅｙらの米国特許第５，７１６，８２２号には、ネコカリシウイルス株ＣＦＩ−６８ ＦＩＶキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡをネコヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子中に挿入する方法が記載されている。本発明によって包含される他の組換えウイルスベクターワクチンには、それだけに限らないが、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を発現するアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、および種々のポックスウイルスベクターがある。具体的には、本発明は、外来抗原を発現するワクシニアウイルスまたはカナリアポックスウイルスからなる組換えウイルスワクチンを教示するＰａｏｌｅｔｔｉらの米国特許第５，３３８，６８３号および第５，４９４，８０７号；狂犬病ウイルス抗原を発現する組換えアライグマポックスウイルスベクターを教示するＥｓｐｏｓｉｔｏらの米国特許第５，２６６，３１３号；ならびにネコヘルペスウイルスｇＤまたはｇＢ抗原を発現する組換えアライグマポックスウイルスベクターを教示するＭａｅｓらの米国特許第６，０１０，７０３号のいずれか１つで教示される方法に従って作製されたＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を発現する組換えポックスウイルスベクターワクチンを含む。
【００７１】
上記の組換えウイルスベクターのいずれかでは、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードするｃＤＮＡが、抗原をコードするｃＤＮＡの５’末端で真核生物プロモーターと、抗原をコードするｃＤＮＡの３’末端で真核生物終結シグナルおよびポリ（Ａ）シグナルと作動的に連結している。本明細書において、「作動的に連結している」という用語は、（ｃＤＮＡ分子である）本発明のポリヌクレオチド、ならびに発現調節配列、例えば転写プロモーターおよび終結配列を含有するポリヌクレオチド（ＤＮＡ）がベクターまたは細胞中に位置し、その結果、ｃＤＮＡによってコードされる抗原の発現が発現調節配列によって制御されることを意味する。ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードするｃＤＮＡなどのＤＮＡをクローン化し、発現調節配列を含有するＤＮＡをそれと作動的に連結する方法は当技術分野で周知である。組換えウイルスベクター中でのＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の発現に適したプロモーターの例は、サイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）前初期プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターなどの誘導性プロモーターである。終結およびポリ（Ａ）シグナルを有するＤＮＡの例は、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）領域である。抗原の産生に適したウイルス発現系の他の例は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なシンドビス発現系である。市販されている発現ベクターおよび発現系の使用は当技術分野で周知である。
【００７２】
核酸またはＤＮＡ分子ワクチン
本発明のさらなる実施形態では、ネコにおいて活発な免疫応答を誘発する核酸またはＤＮＡ分子ワクチンとしてワクチンが提供される。ＤＮＡ分子ワクチンは、本明細書で開示されるＦＣＶキャプシドタンパク質のキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする核酸配列を有するＤＮＡからなる。
【００７３】
好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子ワクチンは、配列番号１３、１５、もしくは１７または配列番号１３、１５、もしくは１７の特異的免疫原性断片をコードする配列番号１２、１４、もしくは１６、またはその断片の核酸配列を含む。キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする核酸は、転写プロモーターで、またはその近くで作動的に連結している。これにより、核酸をネコの細胞中に接種したときに核酸からのキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の転写が可能となる。好ましくは、ＤＮＡ分子はプラスミドである。ＤＮＡワクチンに有用なプロモーターは当技術分野で周知であり、そのプロモーターには、それだけに限らないが、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、およびＳＶ４０Ｔ抗原プロモーターがある。核酸が、キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする配列の終結コドンでまたはその近くで、転写終結シグナルおよびポリ（Ａ）認識シグナルを含む核酸断片と作動的に連結していることがさらに好ましい。許容される薬学的担体、またはＦｅｌｇｎｅｒの米国特許第５，７０３，０５５号中で開示されているものと類似した脂質もしくはリポソーム担体中のＤＮＡワクチンをネコに提供する。ＤＮＡワクチンは、筋内注射、イントラジェット（ｉｎｔｒａｊｅｔ）注射や、微粒子銃などの様々な方法によってネコに提供することができる。ＤＮＡワクチンの作製およびその使用方法は、どちらもＦｅｌｇｎｅｒの米国特許第５，５８９，４６６号と第５，５８０，８５９号において示されている。最後に、医薬品用品質のプラスミドＤＮＡを作製する方法は、Ｍａｒｑｕｅｔらの米国特許第５，５６１，０６４号で教示されている。
【００７４】
したがって、上記の方法を使用して、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を発現するＤＮＡワクチンを使用して、病原性ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作する。ＤＮＡワクチンの利点は、好都合なことに、ＤＮＡ分子が、ワクチンを産生するための単純かつ安価な手段であるプラスミドとして増殖され、ワクチンが生でないので、生の組換えウイルスベクターワクチンに関係する規制の問題の多くがＤＮＡワクチンでは問題とならないことである。当業者なら、本発明のＤＮＡワクチンが、当技術分野で周知の化学合成の方法によって作製された、合成により生成された核酸を含んでよいことを理解するであろう。
【００７５】
単離および精製されたＦＣＶキャプシドタンパク質
本発明のさらなる実施形態では、ワクチンは、単離および精製されたＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片からなる。具体的には、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片が配列番号１３、１５、１７のアミノ酸配列を含むワクチンが提供される。好ましくは、キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片は、単離および精製してワクチンを作製することができる抗原を産生する組換え細菌または真核生物発現ベクター中で産生される。例えば、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片は、細菌、酵母や真菌などの微生物中で、哺乳動物細胞や昆虫細胞などの真核生物細胞中で、またはアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルスやセンダイウイルスなどの組換えウイルスベクターを介して産生される。ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の産生に適した細菌には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、または異種ポリペプチドを発現することができる任意の他の細菌がある。ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の発現に適した酵母の種類には、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、または異種ポリペプチドを発現することができる任意の他の酵母がある。上記の細菌、真核細胞または組換えウイルスベクターを使用してワクチン用の抗原を産生する方法は、当技術分野で周知である。
【００７６】
キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片からなるワクチンを作製するには、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする核酸をプラスミド中にクローン化し、その核酸を、微生物中でキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の発現を実施するプロモーターと作動的に連結する。適切なプロモーターには、それだけに限らないが、Ｔ７ファージプロモーター、Ｔ３ファージプロモーター、β−ガラクトシダーゼプロモーター、およびＳｐ６ファージプロモーターがある。微生物中でのＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の発現によって、大量の組換え抗原ポリペプチドの生産に商業的に使用される発酵技術を使用してキャプシドタンパク質を生産することが可能となる。抗原を単離および精製する方法は当技術分野で周知であり、その方法には、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーや遠心分離などの方法がある。
【００７７】
ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の単離を促進するために、融合ポリペプチドを作製し、キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を、アフィニティークロマトグラフィーによる単離を可能にする他のポリペプチドと連結する。好ましくは、下記の発現系の１つを使用して融合ポリペプチドを作製する。例えば、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードするｃＤＮＡ核酸配列を、５’末端または３’末端で、ポリペプチドをコードする核酸と連結する。核酸を適当なコドンの読み枠で連結して融合ポリペプチドの産生を可能にし、キャプシドタンパク質またはその部分のアミノ末端および／またはカルボキシル末端をポリペプチドと融合し、それによって融合ポリペプチドとして抗原の回収を単純化することが可能となる。融合ポリペプチドはまた、精製中に抗原が分解されることを防止することができる。融合ポリペプチドを含むワクチンは有効であるが、ある場合には、精製後に第２のポリペプチドを除去することが望ましい可能性がある。したがって、融合ポリペプチドが、抗原とポリペプチドの結合部に切断部位を含有することも意図される。切断部位は、その部位のアミノ酸配列に特異的な酵素で切断されるアミノ酸配列からなる。意図されるそのような切断部位の例には、エンテロキナーゼによって切断されるエンテロキナーゼ切断部位、第Ｘａ因子によって切断される第Ｘａ因子切断部位、ＧＥＮＥＮＡＳＥによって切断されるＧＥＮＥＮＡＳＥ切断部位（ＧＥＮＥＮＡＳＥは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙの商標である）がある。下記のものは、融合ポリペプチド、またはポリペプチドを含まない単離抗原としてキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を産生する方法である。
【００７８】
ワクチンで使用する融合ポリペプチドとしてＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を産生する原核生物発現系の例は、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１発現ベクタープラスミドを使用する、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙから入手可能なグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合系である。キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードするｃＤＮＡを、適当なコドンの読み枠で、ＧＳＴをコードするＤＮＡと融合する。融合ポリペプチドのＧＳＴ部は、グルタチオンセファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィーを使用した融合ポリペプチドの迅速な精製を可能にする。精製後、融合ポリペプチドのＧＳＴ部分をトロンビンや第Ｘａ因子などの部位特異的プロテアーゼでの切断により除去して、ＧＳＴポリペプチドを含まない抗原を産生することができる。ＧＳＴポリペプチドを含まないキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片は、２回目のグルタチオンセファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィーによって産生される。
【００７９】
ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を含むワクチンを作製する他の方法は、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で、抗原をコードするｃＤＮＡとポリヒスチジンをコードするＤＮＡコドンを連結する方法である。ポリヒスチジンは、好ましくは、６個のヒスチジン残基を含み、それによって、金属アフィニティークロマトグラフィー、好ましくはニッケルアフィニティークロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの精製が可能となる。ポリヒスチジンを含まないキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を産生するには、エンテロキナーゼ切断部位などの切断部位を、適当なコドンの読み枠で、ポリヒスチジンをコードするコドンと、抗原をコードするコドンの間に融合する。エンテロキナーゼでの切断、その後の、遊離ポリヒスチジンを結合する２回目の金属アフィニティークロマトグラフィーによって、抗原からポリヒスチジンを除去する。この方法は、ペスト菌（Ｙ． ｐｅｓｔｉｓ）のＬｃｒＶ抗原の調製に有用であることが示され、それはＭｏｔｉｎら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：４３１３〜４３１８（１９９６））で開示された。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄから入手可能なＸｐｒｅｓｓ系は、ポリヒスチジン−ポリペプチド融合タンパク質を作製し次いでそれを単離するのに利用可能な市販のキットの例である。
【００８０】
ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を含むワクチンを作製するさらなる方法は、Ｍｏｔｉｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６４：３０２１〜３０２９（１９９５）によって開示される方法を使用する。Ｍｏｔｉｎらは、プロテインＡの部分をコードするＤＮＡと連結した抗原をコードするＤＮＡからなる、融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを開示し、エンテロキナーゼ切断部位をコードするＤＮＡが、プロテインＡと抗原をコードするＤＮＡ間の適当なコドンの読み枠中に介在する。プロテインＡは、ＩｇＧアフィニティークロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの単離を可能にし、エンテロキナーゼでの切断により、プロテインＡを含まないキャプシドタンパク質が産生される。次いで、２回目のＩｇＧアフィニティークロマトグラフィーによってプロテインＡが除去される。
【００８１】
ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を含むワクチンを作製する他の方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｄａｎｉｅｌｓらの米国特許第５，７２５，８６３号で開示される方法に基づく。Ｄａｎｉｅｌｓらの方法を使用して、各分子がＦＣＶキャプシドタンパク質の１００アミノ酸残基以上を挿入したエンテロトキシン分子からなるＦＣＶキャプシドワクチンを作製することができる。本発明のワクチンの作製に使用することができる、融合ポリペプチドワクチンを作製する他の方法は、Ｍｏｎｄらの米国特許第５，５８５，１００号、およびＬｉｓｃｏｍｂｅの米国特許第５，５８９，３８４号で開示されている。最後に、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能なｐＭＡＬ融合および精製系が、融合ポリペプチドを作製する方法の他の例であり、マルトース結合タンパク質をキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片に融合する。マルトース結合タンパク質は、アミロースアフィニティークロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの単離を促進する。マルトース結合タンパク質を含まない抗原を作製することを可能にする上記で述べた切断部位の１つによって、マルトース結合タンパク質を抗原と連結することができる。
【００８２】
ワクチン用のＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の産生に細菌の方法が使用されるが、真核生物発現系中でキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を産生することが望ましい可能性がある。特に有用な系は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｍａｔｓｕｕｒａらの米国特許第５，２２９，２９３号で開示されているバキュロウイルス発現系である。キャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の産生に適したバキュロウイルス発現ベクターは、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＰｂａｃおよびｐＭｂａｃベクター；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄから入手可能なＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅベクター、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ベクター、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２−Ａ、Ｂ、Ｃ、およびｐＭｅｌＢａｃである。
【００８３】
ワクチン用のＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片の発現に有用な他の真核生物系は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なＥＳＰ酵母タンパク質発現および精製系などの酵母発現系である。他の酵母発現系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）に基づく発現系のいずれか１つである。哺乳動物発現系も本発明によって包含される。哺乳動物発現系の例は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＬａｃＳｗｉｔｃｈＩＩ系、ｐＢＫファージミド、ｐＸＴ１ベクター系、およびｐＳＧ５ベクター系；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎから入手可能なｐＴａｒｇｅＴ哺乳動物発現ベクター系、ｐＳＩ哺乳動物発現ベクター、ｐＣＩ哺乳動物発現ベクター、およびｐＡｄＶａｎｔａｇｅベクター；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なエクジソン誘導哺乳動物発現系、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、およびｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐである。
【００８４】
本発明は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ａｃｈｅｓｏｎらの米国特許第５，８００，８２１号で教示される方法に従って作製される熱安定性胞子送達系の構成成分としてＦＣＶキャプシドタンパク質またはキャプシドタンパク質の特定のエピトープを含むワクチンからなる実施形態をさらに含む。したがって、本発明は、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片をコードする核酸を含有する遺伝子操作された細菌細胞を提供する。組換え細菌胞子ワクチンをネコに経口投与したとき、胞子がネコの胃腸管で出芽し、細菌がキャプシドタンパク質またはその特異的免疫原性断片を発現し、それがネコの免疫系と接触し、免疫応答を誘発するようになる。そのワクチンは、熱安定性であるという利点を有し、したがって、それは無期限に室温で貯蔵することができる。
【００８５】
受動免疫ワクチン
本発明の上記の実施形態はネコカリシウイルスに対する能動免疫をもたらすが、本発明は、ネコカリシウイルスに対する受動免疫をもたらすワクチンをさらに含む。ネコカリシウイルスに対する受動免疫を誘発するワクチンは、ＦＣＶキャプシドタンパク質、その特異的免疫原性断片、またはＦＣＶウイルス全体に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体からなる。
【００８６】
ポリクローナル抗体を含む受動免疫ワクチンを作製するには、そのＦＣＶキャプシドタンパク質、またはその特異的免疫原性断片を、抗体の調製に適した宿主中に注射し、好ましくは、宿主はウマ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、またはヤギである。これらの宿主からポリクローナル抗体ワクチンを作製する方法は当技術分野で周知である。一例として、キャプシドタンパク質もしくはその特異的免疫原性断片またはカリシウイルスＦＣＶキャプシド全体を、フロイント完全アジュバントや、ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒｐ．、ジョージア州Ｎｏｒｃｒｏｓｓから入手可能な毒性の低いＴｉｔｅｒＭａｘなどのアジュバントと混合し、次いで、当技術分野で周知の方法によってそれを宿主に投与する。抗体産生をモニターし、十分な抗体が産生されたとき、宿主から血清を取り出し、好ましくは血清から抗体を回収する。
【００８７】
受動免疫ワクチンは、ＦＣＶキャプシドタンパク質またはＦＣＶウイルス全体の１つまたは複数のエピトープに対する１つまたは複数のモノクローナル抗体を含んでよい。モノクローナル抗体を産生する方法およびハイブリドーマは当技術分野で周知である。当技術分野で周知のハイブリドーマ技術を使用してモノクローナル抗体を作製することができるが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｍａｒｋｓらの米国特許第５，９７７，３２２号で開示されているものなどのファージディスプレイ法に従って、抗原に対するモノクローナル抗体を作製することもできる。キャプシドタンパク質またはその部分に対するネコ化抗体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、どちらもＱｕｅｅｎらの米国特許第５，６９３，７６２号および第５，６９３，７６１号で開示されているものなどの、抗体をヒト化するのに使用されている方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体の作製に有用なファージディスプレイキットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手可能なＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍである。
【００８８】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
本発明はまた、いくつかの非常に重要なモノクローナル抗体を含み、それについて記載し特許請求するものである。ここで、これらの抗体は、本明細書に記載のウイルス株を迅速に同定し、ある場合にはそれを定義するために開発された。モノクローナル抗体の具体例およびその記載は、下記の実施例で見出すことができる。具体的には、実施例１−２および表１−２、特に実施例１−８、表１−４を参照されたい。
【００８９】
下記の実施例は、本発明のさらなる理解を促進するが、それを限定しないものとする。
【実施例】
【００９０】
第１部の実施例
（実施例１−１）
ＦＣＶ−２１の単離および増殖
１９９３年６月に、ミシガン州Ａｎｎ Ａｒｂｏｒのネコのショーからネコカリシウイルス（ＦＣＶ）株２１（ＦＣＶ−２１）を収集した。それを１％の培地を含有する９６穴用微小管中で希釈し、１：１０希釈物を作製した。希釈した試料１００ｕｌを、９６穴プレート中でＣＲＦＫ細胞１００ｕｌに添加した。
【００９１】
９６穴プレート中で、限界希釈によりＦＣＶ−２１ウイルスを３回精製した。最終精製物からウイルス上清を取り出し、それを使用して、Ｔ２５フラスコ中で集密度７５％まで増殖させたＣＲＦＫ細胞に感染させた。１００％のＣＰＥが観察されたとき、懸濁液の凍結／解凍を３回行い、それを分注して凍結バイアル（１ｍｌ／バイアル）にした。このウイルスストックの力価は、１．５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌであると決定された。
【００９２】
ＦＣＶ−２１は米国基準菌株保存機構（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ ２０１１０、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ １０８０１に寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−＿を割り当てられた。
【００９３】
（実施例１−２）
様々な市販のまたは既存のモノクローナル抗体を使用したＦＣＶ−２１の免疫蛍光法およびＥＬＩＳＡ
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）では、ＦＣＶ−２１のウイルスストックを使用して、約９０％の集密度まで増殖させたＮＬＦＫ細胞を播いた２４穴プレートに感染させた。感染から約２０時間後、プレートを１×ＰＢＳで２回洗浄し、８０％アセトンで固定した。様々なモノクローナル抗体を約２ｕｇ／ｕｌに希釈し、それをプレートの個々の穴に添加した（１穴当たり０．２ｍｌ）。室温（ＲＴ）で撹拌しながら１時間インキュベートした後、各穴を１×ＰＢＳで２回洗浄し、二次抗体（抗マウスＦＩＴＣ、１０ｕｇ／ｍｌ）を添加した。プレートをアルミニウムホイルで被覆し、ＲＴで撹拌しながら３０分間インキュベートした後、各穴を１×ＰＢＳで２回洗浄し、風乾した。次いで、蛍光顕微鏡下で、ＦＩＴＣでの染色の強度について各穴を観察した。
【００９４】
ＥＬＩＳＡアッセイでは、炭酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３１．５９ｇおよびＮａＨＣＯ３２．９３ｇを水１リットル中に溶解）で１：１５００に希釈した抗ＦＣＶウサギポリクローナル抗体（Ｐｆｉｚｅｒ＃１６）２００ｕｌで９６穴ＥＬＩＳＡプレートをコートした。プレートを４℃で１晩インキュベートした。プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、次いで、ＰＢＳＴ中の１％カゼイン２００ｕｌで、３７℃で１時間ブロッキング処理した。様々なモノクローナル抗体を約０．１ｕｇ／ｍｌに希釈し、それを個々の穴に添加した（１穴当たり１００ｕｌ）。各試料を３連で行った。３７℃で１時間インキュベートした後、各穴をＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２００に希釈したペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５−０３５−１５０）１００ｕｌとともに３７℃で１時間インキュベートした。次いで各穴をＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、カタログ番号５０−６６−１８）を各穴に１００ｕｌ添加した。ＲＴで約１０分後、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５〜４９０ｎｍ（二重波長）でプレートを読み取った。シグナル／ノイズ比に基づいて比活性を計算した。
【００９５】
ＩＦＡとＥＬＩＳＡアッセイのデータの組は、互いによく相関し（表１−２）、そのデータの組から、ＦＣＶ−２１が、一般に使用されるＦＣＶワクチン株であるＦ９と免疫学的に異なることが示唆された。２つのモノクローナル抗体（ＦＣＶ１−４３およびＭＡＢ７９１Ｐ）がＦ９と反応したが、ＦＣＶ−２１とは反応しなかった（表１−２）。
【００９６】
【表２】
【００９７】
（実施例１−３）
ＦＣＶ−２１のキャプシド配列分析
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を使用して、ＦＣＶ−２１感染細胞培養物の上清から全ＲＮＡを単離した。ランダムプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して「第１鎖」ｃＤＮＡ調製物を合成した。ＸＬ ｒＴｔｈポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）ならびにオリゴヌクレオチドプライマーＤＥＬ−６５３（配列番号１）およびＤＥＬ−６５１（配列番号２）を使用してＰＣＲ反応を行った。ＢｉｇＤｙｅ化学反応法およびＡＢＩ３７７ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、得られたＰＣＲ産物の配列を決定した。完全なキャプシド配列は、ヌクレオチド配列については配列番号１２として、コードされたアミノ酸配列については配列番号１３として列挙する。
【００９８】
（実施例１−４）
ＦＣＶ−４９の単離および増殖
１９９３年に、ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａのネコのショーからネコカリシウイルス（ＦＣＶ）株４９（ＦＣＶ−４９、ＰＨＡ−４９とも呼ばれる）を収集した。その検体を、１％の培地を含有する９６穴用微小管中で希釈し、１：１０希釈物を作製した。希釈した試料１００ｕｌを、９６穴プレート中でＣＲＦＫ細胞１００ｕｌに添加した。９６穴プレート中で、限界希釈によりＦＣＶ−４９ウイルスを３回精製した。最終精製物からウイルス上清を取り出し、それを使用して、Ｔ２５フラスコ中で集密度７５％まで増殖させたＣＲＦＫ細胞に感染させた。１００％のＣＰＥが観察されたとき、懸濁液の凍結／解凍を３回行い、それを分注して凍結バイアル（１ｍｌ／バイアル）にした。このウイルスストックの力価は、６．８×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌであると決定された。
【００９９】
ＦＣＶ−４９は米国基準菌株保存機構（ＡＴＣＣ）、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ ２０１１０、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ １０８０１に寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−＿を割り当てられた。
【０１００】
（実施例１−５）
ＦＣＶ−４９のキャプシド配列分析
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を使用して、ＦＣＶ−４９感染細胞培養物の上清から全ＲＮＡを単離した。ランダムプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して「第１鎖」ｃＤＮＡ調製物を合成した。ＸＬ ｒＴｔｈポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）ならびにオリゴヌクレオチドプライマーＤＥＬ−６５３（配列番号１）およびＤＥＬ−６５１（配列番号２）を使用してＰＣＲ反応を行った。ＢｉｇＤｙｅ化学反応法およびＡＢＩ３７７ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、得られたＰＣＲ産物の配列を決定した。完全なキャプシド配列は、ヌクレオチド配列については配列番号１４として、コードされたアミノ酸配列については配列番号１５として記載する。
【０１０１】
（実施例１−６）
ＦＣＶ−２６３９１−４の単離および増殖
２００３年に、Ｈｕｍａｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂａｙ Ｃｏｕｎｔｙ（フロリダ州Ｐａｎａｍａ Ｃｉｔｙ）からネコカリシウイルス（ＦＣＶ）株２６３９１−４（ＦＣＶ−２６３９１−４）を収集した。２％ウシ胎児血清入りのＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する９６穴プレート中で、限界希釈によりそれを１回精製した。次いでその精製ウイルスを使用して、ＮＬＦＫ（Ｎｏｒｄｅｎ Ｌａｂネコ腎）細胞を含有するＴ１５０フラスコに感染させた。１００％のＣＰＥに達した後、懸濁液の凍結／解凍を１回行い、それを分注して凍結バイアル（０．８５ｍｌ／バイアル）にした。このストックのウイルス力価は、５．６×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌであると決定された。
【０１０２】
ＦＣＶ−２６３９１−４は米国基準菌株保存機構（ＡＴＣＣ）、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ ２０１１０、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ １０８０１に寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−＿を割り当てられた。
【０１０３】
（実施例１−７）
ＦＣＶ−２６３９１−４のキャプシド配列分析
ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）を使用して、ＦＣＶ−２６３９１−４感染細胞培養物の上清から全ＲＮＡを単離した。約１ｕｇのウイルスＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｗｉｔｈ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で使用した。反応条件は下記の通りであった：５０℃で３０分；９４℃で２分；その後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、および７０℃で２分を４０サイクル；その後７２℃で１０分の最後のインキュベーションを行い、４℃で貯蔵。使用したプライマーは、ＦＣＶ−Ｎ２（配列番号３）およびＦＣＶ−プライマー２（配列番号９）であった。次いで、様々なオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、および１１）を使用してＰＣＲ産物の配列を決定した。ＦＣＶ−２６３９１−４のキャプシド全体の配列は、ヌクレオチド配列については配列番号１６として、コードされたアミノ酸配列については配列番号１７として示す。
【０１０４】
ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ−２６３９１−４由来のキャプシド遺伝子のアミノ酸配列を、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な完全長ＦＣＶキャプシド配列すべてと整列させた。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）、ＰＡＭ２５０重み行列（Ｄａｙｈｏｆｆら、１９７８）、および初期設定プログラムパラメーター（ＭｅｇＡｌｉｇｎ；ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．；ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して、アラインメントを作成した。ＧｅｎＢａｎｋ中のすべての登録配列の中で最も高い、ＦＣＶ−２１とＦＣＶ２１３−９５のキャプシドタンパク質配列間での同一性は９０．７％である。ＦＣＶ−４９とＦＣＶ２１３−９５のキャプシド配列は９２．２％同一である。ＦＣＶ２６３９１−４とＦＣＶ ＣＦＩ−６８のキャプシド配列は互いに９１．３％同一である。
【０１０５】
ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ−２６３９１−４について単一のキャプシド配列を示し、それは、得られたＰＣＲ産物の直接配列決定に基づいている。しかし、これらの各配列は、ＲＮＡウイルス集団内に存在することが知られているウイルス準種（総説については、Ｄｏｍｉｎｇｏら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．８２：３９〜４４；２００２を参照）の集団の間での平均または共通の配列を表す。準種は、ＲＮＡゲノム複製の間に起こる誤りの直接的な結果物であり、そのゲノム内に突然変異を有する子孫を生じさせる。したがって、これらおよび他のＦＣＶキャプシド遺伝子配列についてキャプシド配列の少量の変異体が天然に存在することが予想される。しかし、各配列内の突然変異の分布は、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ−２６３９１−４を含めた株間での全体的な同一性にほとんど／全く影響を及ぼさないようなものである。
【０１０６】
（実施例１−８）
ＦＣＶ−２１に特異的なモノクローナル抗体の生成
Ａ．ＦＣＶ−２１の精製。ＦＣＶ−２１を感染させたＮＬＦＫ細胞の細胞培養上清約２００ｍｌを、３０００ｒｐｍで、１０℃で３０分間遠心分離した。上清２５ｍｌをＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｌｅａｒ遠心分離管中に移し、１０％スクロース溶液１０ｍｌを管の底に入れた。次いで、２７，０００ｒｐｍで管を１５℃で２時間遠心分離した。遠心分離後、上清を取り出しそれを捨て、滅菌水２５０ｕｌ中でペレットを再懸濁した。Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を使用して、タンパク質濃度が７ｍｇ／ｍｌであると決定された。
【０１０７】
マウスの免疫感作およびハイブリドーマ細胞クローンの生成
精製ＦＣＶ−２１ウイルスタンパク質約１００ｕｇを、フロイントアジュバントと一緒に各マウスに注射した。マウス８匹にワクチン接種した。ＲＩＢＩアジュバントを伴う精製ＦＣＶ−２１ １００ｕｇを用いて追加免疫感作を４週間の間隔で２回実施した。この８匹のマウスの免疫応答が、精製ＦＣＶ−２１を使用したＥＬＩＳＡで３１２５０以上の力価を有することが決定された。細胞融合を実施してハイブリドーマクローンを作製した。そのような細胞クローン６８個を増殖させ、ＦＣＶ−２１との反応性について上清を試験した。
【０１０８】
このＥＬＩＳＡでは、９６穴ＥＬＩＳＡプレートを、１×ＰＢＳで希釈した濃度５ｕｇ／ｍｌの精製ＦＣＶ１００ｕｌでコートした。加湿していないインキュベーター中で覆いをかけずにプレートを３７℃で１晩乾燥させた。メタノール０．１ｍｌをかけ室温で５分間インキュベートすることによってプレート上のウイルスを固定した。次いでプレートを蒸留水で８回洗浄し、次いで、１×ＰＢＳ中の１０％ウマ血清２００ｕｌで、４℃で１晩ブロッキング処理した。再度プレートを蒸留水で８回洗浄した。マウス血清試料の様々な希釈物を個々の穴に添加した（１穴当たり１００ｕｌ）。各試料を３連で行った。３７℃で１時間インキュベートした後、各穴をＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２００に希釈したペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５−０３５−１５０）１００ｕｌとともに３７℃で１時間インキュベートした。次いで各穴をＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、カタログ番号５０−６６−１８）を各穴に１００ｕｌ添加した。ＲＴで約１０分後、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５〜４９０ｎｍ（二重波長）でプレートを読み取った。シグナル／ノイズ比に基づいて比活性を計算した。
【０１０９】
ＦＣＶ−２１特異的モノクローナル抗体の反応性
上記のハイブリドーマ細胞クローンの上清を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイでＦＣＶ−２１ならびにＦ９に対するその反応性について試験した。簡潔に述べると、炭酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３１．５９ｇおよびＮａＨＣＯ３２．９３ｇを水１リットル中に溶解）で１：１５００に希釈した抗ＦＣＶウサギポリクローナル抗体（Ｐｆｉｚｅｒ＃１６）２００ｕｌで９６穴ＥＬＩＳＡプレートをコートした。プレートを４℃で１晩インキュベートした。プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、次いで、ＰＢＳＴ中の１％カゼイン２００ｕｌで、３７℃で１時間ブロッキング処理した。ＦＣＶ−２１およびＦ−９の上清を、１：１０の希釈で各穴に添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、様々なハイブリドーマの上清およびその様々な希釈物を個々の穴に３連で添加した（１穴当たり１００ｕｌ）。次いでプレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２００に希釈したペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５−０３５−１５０）１００ｕｌとともに３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、カタログ番号５０−６６−１８）を各穴に１００ｕｌ添加した。ＲＴで約１０分後、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５〜４９０ｎｍ（二重波長）でプレートを読み取った。シグナル／ノイズ比に基づいて比活性を計算した。
【０１１０】
【表３−１】
【０１１１】
【表３−２】
【０１１２】
Ｂ．ＦＣＶ−２１に特異的であり、他のＦＣＶ株には特異的でないモノクローナル抗体。１８個のハイブリドーマ細胞クローン（３、７、１７、２３、２７、２９、３０、３６、３７、４０、４１、４２、４４、５３、５６、５９、６０および６１）を選択して、ＦＣＶ−２１に対するその特異性についてさらに試験した。１１種のＦＣＶウイルスをアッセイで使用した（ＦＣＶ−２１、４９、２６３９１−４、Ｆ９、ＣＦＩ−６８、３３５８５、８９３９１、２５５、Ｊ−１、２２８０およびＨ）。さらに、上記に記載のように、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した。結果の概要を表１−４に示す。
【０１１３】
【表４】
【０１１４】
上記で示したように、ハイブリドーマ細胞系統２３、４１、４４および５６はＦＣＶ−２１に特異的であり、試験した他のどのＦＣＶにも特異的でない。したがって、ＦＣＶ−２１の診断ツールとしてこれらのモノクローナル抗体を使用することができる。さらに、ハイブリドーマ３６は、ワクチンＦＣＶ株だけ（ＦＣＶ−２１、４９、２６３９１−４）と反応し、他のどのＦＣＶ株とも反応しないように思われる。
【０１１５】
ハイブリドーマ細胞系統２３、３６、４１、４４および５６はすべて米国基準菌株保存機構（ＡＴＣＣ）、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ ２０１１０、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ １０８０１に寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号：
ＰＴＡ−７３４９（２３）
ＰＴＡ−７３５０（３６）
ＰＴＡ−７３５３（４１）
ＰＴＡ−７３５１（４４）
ＰＴＡ−７３５２（５６）
を割り当てられた。
【０１１６】
（実施例１−９）
１９９３年に単離されたＦＣＶウイルスに対するＦＣＶ−２１およびＦＣＶ−４９の血清の血清交差中和分析
Ａ．同種抗血清の力価測定。１２種のＦＣＶ単離物に対する回復期抗血清を特定病原体除去（ＳＰＦ）ネコで産生させ、１回目および２回目の接種後に収集した。ウイルス接種物はストックの力価に応じて様々であり、ネコ１匹当たり１０４〜１０８ＴＣＩＤ５０であった。最初にネコに接種を行い、３週間後に追加免疫し、次いで追加免疫から２週間後に血清用にそれを出血させた。１２種の単離物には、Ｆ９、ＣＦＩ−６８、ＬＳＯ１２、ＪＯＫ６３、ＪＯＫ９２、ならびに野外単離物１８、２１、４９、５０、５４、２７、および１１があった。野外単離物は、各株のキャプシドタンパク質配列の、超可変領域の配列の系統発生分析に基づいて選択した。最も分岐している単離物を試験用に選択した。
【０１１７】
血清を５６℃で３０分間熱非働化し、標準的な不変ウイルス−可変血清技術（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｖｉｒｕｓ−ｖａｒｙｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（Ｇｒｉｅｓｔ １９７９、Ｍａｈｙ １９９６）を使用してその同種ウイルスに対する力価測定を行った。簡潔に述べると、培地（１００〜１５０μｌ）を９６穴組織培養プレートの各穴に添加した。血清（１００〜１５０μｌ）を一番上の列の各穴に添加し（最初の１：２または１：４血清希釈物；Ｆ９およびＬＳＯ１２は１：４）、多連式ピペッターで混合後（１：２希釈）１００μｌをプレートの下方へと移した。最後の１００μｌを捨てた。力価測定した同種ウイルス（５０μｌ当たり２００ＴＣＩＤ５０に希釈）５０μｌを各穴に添加し、ＣＯ２インキュベーター中でプレートを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁させたＣＲＦＫ細胞の１：１０希釈物５０μｌを各穴に添加した。適当な接種物が各穴に確実に添加されるように、希釈したウイルスを使用してウイルス力価測定プレートを構成した。培地１５０μｌを含有する一番上の列中にウイルス５０μｌを使用し、プレートの残りは１穴当たり１８０μｌを含有し、２０μｌを用いてプレートの下方へと１０倍希釈を実施した。プレートを４日間インキュベートし、Ｋａｒｂｅｒの公式を使用して血清とウイルスの力価をどちらも計算した（血清の力価の場合、防御されなかった穴に対する防御された穴の割合を方程式中で使用した）。
【０１１８】
血清の力価測定のとき、ＴＣＩＤ５０は、５０％中和の終点の希釈率と定義した（Ｇｒｉｅｓｔ １９７９）。１抗体価（ＡＵ）は、試験培養物の５０％で３２〜３２０ＴＣＩＤ５０の同種ウイルスを中和することができる抗血清の最も高い希釈率と定義した。したがって、得られたＴＣＩＤ５０は１ＡＵと等しい。２．５、５、１０および２０ＡＵの血清濃度に対してウイルス交差中和を実施した。
【０１１９】
Ｂ．ウイルス交差中和アッセイ。各ウイルス野外単離物、ならびにＦ９、ＬＳＯ１２、ＪＯＫ６３、ＪＯＫ９２、ＳＡ１１３およびＣＦＩ−６８を、交差中和アッセイにおいて１２種の各ＦＣＶ抗血清に対して試験した。各ウイルスについて９６穴プレートを５枚必要とした。各血清を２．５、５、１０および２０ＡＵに希釈し、プレートの下方へと８個の複製物をそのプレート（プレート１枚当たり血清３種、合計でプレート４枚）および（血清力価測定と同様にして構成した）ウイルス力価測定プレートに入れた。最初に血清を２０ＡＵに希釈し、次いで２倍希釈を実施して２．５ＡＵまで下げることによりＤＭＥＭ中で抗血清希釈物を調製した。次いで各希釈物のアリコート（１００μｌ）をプレート上の穴の各カラムに添加した。ウイルスを３７℃で迅速に解凍し、それを氷上に置き、次いで１穴当たり２００ＴＣＩＤ５０に希釈した（氷上で維持した）。一貫性を維持するために、ほとんどのウイルスストックで３ステップの希釈工程を使用し、どのステップでも１：１００より高くはならなかった。希釈したウイルスストック（５０μｌ）を血清プレートのすべての穴に添加し、前記に記載したように力価測定を行った。ＣＯ２インキュベーター中でプレートを３７℃で２時間インキュベートし、その後周密状態まで予め増殖させたＣＲＦＫ細胞懸濁液の１：１０希釈物５０μｌを各穴に添加した。ピペットチップおよび貯蔵トラフは、プレート５枚の各セット後に交換した。４日後にプレートをスコア化した。一部の場合では、予め力価測定し予め希釈したウイルスを使用した。
【０１２０】
【表５−１】
【０１２１】
【表５−２】
【０１２２】
交差中和データの概要を表１−５に示す。各データ点は、アッセイを行った８個の複製穴を表す。「Ｎ」、「ｎ」、または「−」は、防御されなかった穴に対する防御された穴の割合を表し、それは、交差中和の程度を示すものである。その同種ウイルスに対して試験した各単一特異性血清と対応する血清中和の結果を表中で太字表記している。これらの血清は完全に中和するはずであり、その大部分については中和する。少数の例外、最も顕著にはＪＯＫ６３、ＪＯＫ９２および１１は高いＡＵ値で完全な中和を示すが、２．５ＡＵでは示さない。これは、希釈の誤りに起因する可能性が高い。このデータ組の最も著しい結果は、血清ＦＣＶ−２１およびＦＣＶ−４９、特に後者によって示された高度の交差中和である。これらの血清の交差中和のパターンはＦ９のものと類似しているように思われる。（Ｆ９のデータ組、ならびに２０ＡＵでのＦＣＶ−２１およびＦＣＶ−４９のデータ組が、血清の量が不十分であることにより不完全であることに留意されたい。）３種の血清（ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９、およびＦ９）間で中和パターンにいくらかの違いが認められるが、単離物１１、３８および３９は、その３種のどれによっても一貫して中和されなかった。
【０１２３】
（実施例１−１０）
２００３年に単離されたＦＣＶウイルスに対するＦＣＶ−２１およびＦＣＶ−４９抗血清の交差中和分析
この試験におけるＦＣＶ抗血清は、１０５〜１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＦＣＶをネコ（１群当たりネコ４〜５匹）に鼻内接種することによって生成した。同量のウイルスを使用して、３週間後に追加接種を実施した。追加免疫から２週間後に血清を収集し、それを５６℃で３０分間熱処理した。
【０１２４】
ワクチン接種した各ネコの血清試料を、２６種の各ＦＣＶ株（表１−６）に対する血清中和アッセイで使用した。血清試料を１：８に希釈し、その後体積６００ｕｌで１：１６３８４まで連続２倍希釈（合計１２回の希釈）を行った。６００ｕｌ中で力価が５０〜５００ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＦＣＶを、希釈した血清試料と混合し、それを室温で４５分間インキュベートした。次いで試料２００ｕｌを、ＣＲＦＫ細胞を４連で播いた９６穴プレートの各穴に移した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートし、終点の中和力価を決定した。血清中和（ＳＮ）力価と誘発ウイルス逆力価はどちらもＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの方法（Ｓｐｅａｒｍａｎ Ｃ、１９０８、Ｂｒｉｔ Ｊ Ｐｓｙｃｈｏｌ ２：２２７〜２４２；Ｋａｒｂｅｒ Ｇ、１９３１、Ａｒｃｈ ｅｘｐ Ｐａｔｈ Ｐｈａｒｍａｋ １６２：４８０〜４８７）によって計算した。
【０１２５】
＞２３および＞１５および＞１０の遮断力価を用いて血清中和データを分析した。その結果を表１−７に示す。そのデータから、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４が幅広い交差中和特性を有し、したがって現在のＦＣＶワクチン株Ｆ９より良好なワクチンの候補であることが示唆される。
【０１２６】
【表６】
【０１２７】
【表７】
【０１２８】
（実施例１−１１）
ＦＣＶ−２１を伴うＦＥＬＯＣＥＬＬ４構成成分およびＦＣＶ−２１を伴わないＦＥＬＯＣＥＬＬ４構成成分でワクチン接種したネコの死亡率および臨床スコア
約８週齢の、家庭向けの短毛のネコに、他のＦＣＶ株であるＦＣＶ−２１を伴うまたは伴わない、改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス［ＦＨＶ］、カリシウイルス［ＦＣＶ−Ｆ９］、汎白血球減少ウイルス［ＦＰ］およびオウム病クラミジアを含有するＦＥＬＯＣＥＬＬ４（登録商標）構成成分でワクチン接種した。評価したワクチン接種法には以下のものがあった：最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に皮下追加免疫（ＳＱ／ＳＱ）；最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に１回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口）；または最初に経口免疫感作、その後２１日目に２回目の経口ワクチン接種。経口ワクチン接種は、口の中へのワクチンの投与によって行った。４２日目に、約１ｍＬの病原性全身性ＦＣＶ−３３５８５（３ｌｏｇのＴＣＩＤ５０／ｍＬ）ですべてのネコを誘発した。疾患の臨床的徴候（体温、結膜炎の漿液性漏出、結膜炎の粘液膿性漏出、鼻炎の漿液性漏出、鼻炎の粘液膿性漏出、くしゃみ、可聴性ラ音、せき、開口呼吸、食欲不振、脱水症、１つの口腔潰瘍＜４ｍｍ、複数の口腔潰瘍、口腔潰瘍＞４ｍｍ、流涎、非出血性外部潰瘍、出血性外部潰瘍）について、誘発後の１４日間すべてのネコをモニターした。カリシウイルスの病原性と一致する誘発後の重度の臨床的徴候を示すネコを安楽死させた。
【０１２９】
表１−８に示すように、新たな株ＦＣＶ−２１を加えると、ＦＣＶ−Ｆ９が存在してもまたはしなくてもＦＥＬＯＣＥＬＬ４の効果が著しく増大する。ＳＱ／ＳＱワクチン接種もＳＱ／経口ワクチン接種もＦＣＶ感染の防止に有効であると思われる。さらに、ＦＥＬＯＣＥＬＬ４およびＦＥＬＯＣＥＬＬ３でＦＣＶ−２１を加えＦ９を除いた経口／経口ワクチン接種でもＦＣＶ感染に対する効果が示された（ＦＥＬＯＣＥＬＬ３とは、オウム病クラミジアを含まないＦＥＬＯＣＥＬＬ４である）。
【０１３０】
表１−９で、評価したワクチン接種法には、最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目および４２日目に２回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口／経口）があった。ＦＣＶ−２１を加えると、ＦＥＬＯＣＥＬＬ４中にＦＣＶ−Ｆ９を含んでもまたは含まなくても、死亡率と臨床スコアの両方が著しく低下することが示された。
【０１３１】
【表８】
【０１３２】
【表９】
【０１３３】
（実施例１−１２）
ＦＣＶ−２１を伴うＦＥＬＯＣＥＬＬ４構成成分およびＦＣＶ−２１を伴わないＦＥＬＯＣＥＬＬ４構成成分でワクチン接種したネコの血清の交差中和分析
実施例１−１１に記載の試験における各ネコの血清試料を、２回目のワクチン接種から８５での誘発までの間に収集した。試料を５６℃で３０分間熱処理し、前記の実施例１−１０（表１−６）に記載した２６種の各ＦＣＶ株に対する血清中和アッセイで評価した。
【０１３４】
＞２３および＞１５の遮断力価を用いて血清中和データを分析し、２つの遮断力価の平均を計算した（Ａｖｅ）。その結果を表１−１０に示す。そのデータから、ＦＣＶ−２１を含有するすべてのワクチン製剤が旧来のＦＣＶ−Ｆ９株を含有するワクチンより幅広い交差中和特性を有していた（約６０％対４０％）ことが示唆される。この結果、中和されたＦＣＶ株の数が約５０％増大した。
【０１３５】
【表１０】
【０１３６】
表１−１０にも示すように、新たな株ＦＣＶ−２１を加えると、ＦＣＶ−Ｆ９が存在してもまたはしなくてもＦＥＬＯＣＥＬＬ４の交差中和特性が著しく増大する。ＳＱ／ＳＱワクチン接種でもＳＱ／経口ワクチン接種でも幅広い交差中和特性が観察された。さらに、ＦＥＬＯＣＥＬＬ４およびＦＥＬＯＣＥＬＬ３でＦＣＶ−２１が存在するがＦ９が存在しない経口／経口ワクチン接種で交差中和特性の向上が示された。
【０１３７】
表１−１１で、評価したワクチン接種法には、最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目および４２日目に２回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口／経口）があった。その結果から、ＦＣＶ−２１を加えると、ＦＥＬＯＣＥＬＬ４中にＦＣＶ−Ｆ９を含んでもまたは含まなくても、交差中和特性が著しく幅広くなった（約４０％増大した）ことが示唆される。
【０１３８】
【表１１】
【０１３９】
本発明の番号付き記載。本発明のさらなる記載および例。１．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質を含むワクチン。２．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、前記キャプシドタンパク質が、タンパク質配列（配列番号１３）または少なくとも約９１．２％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、免疫応答を生じさせるのに有効な量提供されるワクチン。３．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するＤＮＡワクチンであって、ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１２）または少なくとも約７８．７％もしくは７９．２％の配列同一性を有し、保存的置換を許容する配列を含むＤＮＡワクチン。４．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質がＦＣＶ−４９株由来のタンパク質配列を含むワクチン。５．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、前記キャプシドタンパク質は、タンパク質配列（配列番号１５）または少なくとも約９２．７％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、免疫応答を生じさせるのに有効な量提供されるワクチン。６．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するＤＮＡワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１４）または少なくとも約７８．９％、すなわち７９．４％（７８．９＋０．５）の配列同一性を有し、保存的置換を許容する配列を含むＤＮＡワクチン。７．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質がＦＣＶ−２６３９１−４株由来のタンパク質配列を含むワクチン。８．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、前記キャプシドタンパク質が、タンパク質配列（配列番号１７）または少なくとも約９１．８％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、免疫応答を生じさせるのに有効な量提供されるワクチン。９．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するＤＮＡワクチンであって、ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２６３９１−４キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１６）または少なくとも約７８．４％、すなわち７８．９％（７８．４＋０．５）の配列同一性を有する配列を含むＤＮＡワクチン。１０．ポリヌクレオチドが本質的に配列番号１２、１４、１６からなる群から選択される、請求項１から３のいずれかに記載のワクチン。１１．アジュバントを含有するワクチン、ＦＣＶ構成成分が生であるワクチン、ＦＣＶ構成成分を弱毒化したワクチン、ＦＣＶ構成成分を不活性化したワクチンのうち単独またはいずれかの組合せをさらに含み、ＦＣＶ−Ｆ９、ＦＣＶ−ＬＬＫ、ＦＣＶ−Ｍ８、ＦＣＶ−２５５、およびＦＣＶ−２２８０からなる群から選択される少なくとも１つの他のネコカリシウイルス株を含んでよい、請求項１から３のいずれかに記載のワクチン。１２．ネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、オウム病クラミジア、およびネコパルボウイルス、狂犬病ウイルスおよび気管支敗血症菌からなる群から選択される少なくとも１つの他のネコ病原体を含む、請求項１、４、および７に記載のワクチン。１３．免疫応答を生じさせるのに有効な量の、配列番号１３、１５、または１７と９３％以上の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるＦＣＶキャプシドタンパク質のヌクレオチド配列であって、ＦＣＶ単離物が株２１３−９５でなく、核酸配列が異種プロモーター配列と作動的に連結しているヌクレオチド配列と、薬学的に許容できる担体とを含む、ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチン。１４．ヌクレオチド配列が本質的に配列番号１２、１４および１６からなる群から選択される、請求項１３に記載のワクチン。１５．ヌクレオチド配列が、プラスミド、組換えウイルスベクターのいずれかの中にある、請求項１３に記載のワクチン。１６．組換えウイルスベクターが、ネコヘルペスウイルス、アライグマポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、アデノウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群から選択される、請求項１３に記載のワクチン。１７．獣医学的に許容できる賦形剤の媒体と、本明細書において２３、２６、４１、４４および５６と呼ばれるモノクローナル抗体から選択されるモノクローナル抗体と結合するＦＣＶの単離株とを含む免疫原性組成物。１８．獣医学的に許容できる賦形剤の媒体と、本明細書において２３、２６、４１、４４および５６と呼ばれるモノクローナル抗体から選択されるモノクローナル抗体と選択的に結合するＦＣＶの単離株とを含む免疫原性組成物。１９．ＦＣＶ株が不活性化され、前記ＦＣＶ株がワクチンであり、アジュバントを含む、請求項１７および１８に記載の免疫原性組成物。２０．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作する方法であって、有効投与量の請求項１から１４のいずれかに記載のワクチンをネコに投与するステップを含み、ワクチンがさらにアジュバントを含む方法。
【０１４０】
第２部
下記のこの節では、ウイルスに対して動物を、具体的にはカリシウイルスに対してネコを免疫感作する方法についての詳細な情報を提供する
別段示さない限り、下記の開示では上記および下記で示す定義を使用する。
【０１４１】
ワクチンで動物を、具体的にはネコカリシウイルス（ＦＣＶ）に対してネコを治療し免疫感作するための方法および材料を本明細書に記載する。その方法は、免疫応答を誘導し、具体的にはネコにおいてＦＣＶに対する免疫応答を誘導することができる、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含む。第１のワクチンは通常非経口投与するが、ある状況では経口投与することもでき、その一方で、第２のワクチンは、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に経口または口鼻投与する。これらのワクチンは、最初に経口投与した場合に通常は口腔病変を引き起こすので、通常は最初に非経口投与する。驚くべきことに、非常に安全かつ有効であるので第１の経口投与、その後の第２の経口投与として投与することができるＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４株をここで開示する。ここで、Ｎは３〜１２０（両端を含む）の整数であるが、通常は７〜４２（両端を含む）、または１４〜２８（両端を含む）の整数であり、約３週間が好ましく、約２〜４週間も好ましい。あるいは、ネコに約１：６、１：９、１：１２、１：１５、１：１８またはそれ以上のＦＣＶ血清中和力価が発生した後に第２のワクチンを投与することもできる。
【０１４２】
その方法はまた、第１のワクチンまたは第２のワクチンの投与後Ｍ日目の、ＦＣＶワクチンの１回または複数回のさらなる非経口、経口または口鼻投与を含むこともでき、Ｍは１〜１２０（両端を含む）の整数である。したがって、代表的なワクチン接種法には、（１）第１のＦＣＶワクチンの皮下投与、その後第２のＦＣＶワクチンの経口投与；（２）第１および第３のＦＣＶワクチンの連続皮下投与、その後第２のＦＣＶワクチンの経口投与；ならびに（３）第１のＦＣＶワクチンの皮下投与、その後第２および第３のＦＣＶワクチンの連続経口投与がある。
【０１４３】
上記に記載のように、第１のワクチンを非経口（例えば皮下）投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、任意選択の第３のワクチンは非経口、経口または口鼻投与してもよい。シリンジ、ドロッパー、無針注射機器などを含めた任意の機器を使用して、ワクチンを投与することができる。口鼻投与では、カニューレと適合するシリンジを使用して、ネコの鼻または口の中にワクチンの液滴を入れることができる。
【０１４４】
その方法は、第１のワクチンが非経口投与に適合し第２のワクチンが経口または口鼻投与に適合する限り、ネコにおいてＦＣＶに対する免疫応答を誘導することができる任意のワクチンを使用することができる。上記で述べた通り、任意選択の第３のワクチンは、非経口、経口、または口鼻投与に適合する。第１、第２、および任意選択の第３のワクチンは同じでもよく、または異なるものでもよく、それぞれが独立に、ＦＣＶの１つまたは複数の株に由来する１つまたは複数の抗原を含む。したがって、有用なワクチンには、生ウイルスワクチン、改変型生ウイルスワクチン、および不活性化ウイルスワクチンがある。生および改変型生ＦＣＶワクチンは、ネコにおいて疾患を引き起こさず、非病原性の型で単離され、または適切な細胞系統での連続的な継代または紫外線もしくは化学的突然変異原への曝露を含めた周知の方法を使用して弱毒化されたＦＣＶ株を含有する。不活性化または死滅ＦＣＶワクチンは、ホルマリン、ベータプロプリオラクトン、二成分エチレンイミンなどでの処理を含めた既知の方法で不活性化されたＦＣＶ株を含有する。例示的なワクチンには、ＦＣＶ−Ｆ９、ＦＣＶ−Ｍ８、ＦＣＶ−２５５、ＦＣＶ−２２８０、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９、ＦＣＶ２６３９１−４などから単独でまたは組み合わせて選択される非病原性株を含有するものがある。
【０１４５】
ＦＣＶの１つまたは複数の株に由来する他の有用なワクチンには、組換えワクチンおよびＤＮＡワクチン（すなわちサブユニットワクチン）がある。組換えワクチンには組換えウイルスベクターがあり、それぞれが、ＦＣＶの株に由来する抗原をコードする核酸を含有する。そのようなベクターは、ＦＣＶ株に由来する抗原（例えば、キャプシドタンパク質）をコードするｃＤＮＡを、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルスなどを含めた非病原性ウイルスのゲノム中に挿入することによって調製することができる。ウイルスベクターでは、ｃＤＮＡは、抗原をコードする配列の５’末端で真核生物転写プロモーターと作動的に連結し、抗原をコードする配列の３’末端で真核生物終結シグナルおよびポリ（Ａ）シグナルと作動的に連結し、その結果、転写プロモーターおよび終結配列が抗原の発現を制御する。有用な転写プロモーターには、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列プロモーター（ＲＳＶ−ＬＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要前初期プロモーター、シミアン空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）Ｔ抗原プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターなどの誘導性プロモーターがある。組換えＦＣＶワクチンの論述については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｗａｒｄｌｅｙらの米国特許第５，７１６，８２２号を参照されたい。
【０１４６】
ＤＮＡワクチンには、ネコにおいてＦＣＶに対する免疫応答を誘発するＦＣＶキャプシドタンパク質やその特異的免疫原性断片などのＦＣＶ抗原をコードする核酸配列を有するＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）がある。核酸コード配列は、ネコの細胞中に接種したときにＤＮＡの発現を可能にする転写プロモーターと作動的に連結している。有用なプロモーターには、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ主要前初期プロモーター、およびＳＶ４０Ｔ抗原プロモーターがある。さらに、核酸は、ＦＣＶ抗原をコードする配列の終結コドンで、またはその近くで、転写終結シグナルおよびポリ（Ａ）認識シグナルを含む核酸断片と作動的に連結することができる。ＤＮＡワクチンの論述については、Ｆｅｌｇｎｅｒらの米国特許第５，５８０，８５９号、米国特許第５，５８９，４６６号、および米国特許第５，７０３，０５５号を参照されたい。
【０１４７】
他の有用なワクチンには、単離および精製されたＦＣＶキャプシドタンパク質やキャプシドタンパク質の免疫原性断片などの１つまたは複数のサブユニット抗原を含有するものがある。サブユニット抗原は、上記に記載の方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原を産生する組換え発現ベクター中で産生することができる。得られた抗原をその後単離および精製する。有用な発現ベクターには、細菌、酵母および真菌を含めた様々な微生物、ならびに哺乳動物細胞や昆虫細胞などの真核生物がある。他の有用な発現ベクターには、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルスやセンダイウイルスなどのウイルスがある。微生物中でのＦＣＶサブユニット抗原の発現によって、商業規模の発酵技術を使用した抗原タンパク質の生産が可能となる。ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、遠心分離などを含めた様々な方法を使用して、抗原を単離および精製することができる。
【０１４８】
１つまたは複数のワクチンはまた、ＦＣＶの他に、ネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ汎白血球減少ウイルス、およびネコクラミジアを含めた１つまたは複数の病原体に対してネコを免疫感作する抗原をも含有する。
【０１４９】
ワクチンの他の構成成分には、担体、溶媒、および希釈剤を含めた薬学的に許容できる賦形剤、等張剤、緩衝化剤、安定化剤、保存剤、免疫調節作用物質（例えば、インターロイキン、インターフェロンおよび他のサイトカイン）、血管収縮剤、抗菌剤、抗真菌剤などがあり得る。典型的な担体、溶媒、および希釈剤には、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどがある。代表的な等張剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどがある。有用な安定化剤には、ゼラチン、アルブミンなどがある。
【０１５０】
ワクチンはまた、抗原に対する免疫応答を高める１つまたは複数のアジュバントを含んでもよい。代表的なアジュバントには、フロイント完全アジュバントやフロイント不完全アジュバントなどの油に基づくアジュバント、ミコール酸に基づくアジュバント（例えば、トレハロースジミコレート）、細菌リポポリサッカリド、ペプチドグリカン（すなわち、ムレイン、ムコペプチド、またはＮ−Ｏｐａｃａなどの糖タンパク質、ムラミルジペプチドまたはその類似体）、プロテオグリカン（例えば、肺炎桿菌から抽出されるもの）、レンサ球菌製剤（例えば、ＯＫ４３２）、ＢＩＯＳＴＩＭ（登録商標）（例えば、０１Ｋ２）、Ｉｓｃｏｍ（例えば、欧州特許出願ＥＰ１０９９４２、ＥＰ１８０５６４およびＥＰ２３１０３９を参照）、水酸化アルミニウム、サポニン、ジエチルアミノエチル−デキストラン、中性油（例えば、ミグリオル）、植物油（例えば、ラッカセイ油）、リポソーム、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオールがある。他のアジュバントには、とりわけ、ＲＩＢＩアジュバント系、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、コレステロール、水中油型乳剤、油中水型乳剤、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、ジョージア州Ａｔｌａｎｔａ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア州Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、アラバマ州Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）もしくは他のサポニン分画、モノホスホリル脂質Ａ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント、大腸菌由来の熱不安定性エンテロトキシン（組換えまたはその他によるもの）、コレラ毒素、またはムラミルジペプチドがある。
【０１５１】
ＦＣＶワクチンの投与サイズは通常、約１ｍＬ〜約２ｍＬ（両端を含む）である。各投与は治療有効量の１つまたは複数のＦＣＶ抗原を含有し、それはネコの齢数および一般状態、投与経路、ＦＣＶ抗原の性質、ならびに他のファクターに応じて様々となり得る。改変型生ウイルスまたは弱毒化ウイルスを含有するワクチンでは、治療有効投与量は一般に約１０６ＴＣＩＤ５０〜約１０８ＴＣＩＤ５０（両端を含む）である。ＦＣＶキャプシドタンパク質などのサブユニット抗原を含有するワクチンでは、治療有効投与量は一般に約１０μｇ〜約１００μｇ（両端を含む）である。ワクチンの物理的化学的特性が改変されるようにワクチンの他の構成成分を調整することができる。例えば、アジュバントは通常、投与量１ｍＬのうち約２５μｇ〜約１０００μｇ（両端を含む）を占める。同様に、抗生物質は通常、投与量１ｍＬのうち約１μｇ〜約６０μｇ（両端を含む）を占める。
【０１５２】
投与経路、貯蔵の必要性などに応じて、様々な形態でＦＣＶワクチンを提供する。例えば、ワクチンは、シリンジ、ドロッパーなどでの使用に適した水溶液剤もしくは分散剤として調製することもでき、または使用前に食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝液などの中で再調製する凍結乾燥粉末剤として調製することもできる。
【０１５３】
第２部の実施例および表
下記の実施例は、例示的かつ非限定的であるものとし、本発明の少数の具体的な実施形態を表す。
【０１５４】
（実施例２−１）
ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４およびＦＥＬ−Ｏ−ＶＡＸ（登録商標）での皮下／経口ワクチン接種法
４〜５ヶ月齢の、家庭向けの短毛のネコに、ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．；改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス［ＦＨＶ］、カリシウイルス［ＦＣＶ］、汎白血球減少ウイルス［ＦＰ］およびオウム病クラミジア）を、ＦＥＬ−Ｏ−ＶＡＸ（登録商標）（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ；死滅ＦＨＶ、ＦＣＶ、ＦＰおよびオウム病クラミジア）または滅菌希釈剤（対照群）とともにワクチン接種した。評価したワクチン接種法には以下のものがあった：最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目および４２日目に皮下追加免疫（ＳＱ／ＳＱ／ＳＱ）；最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目および４２日目に２回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口／経口）；または最初に経口ワクチン接種、その後２１日目に２回目の皮下ワクチン接種、および４２日目に経口追加免疫。投与量はすべて１ｍＬであった。経口ワクチン接種は、口の中へのワクチンの投与によって行った。９９日目に、約３．５ｍＬの病原性全身性ＦＣＶ−３３５８５（４．８ｌｏｇのＴＣＩＤ５０／ｍＬ）ですべてのネコを誘発した。誘発は、缶入りネコ用飼料で投与量約３ｍＬ、点鼻注入により０．０５ｍＬを投与することによって行った。疾患の臨床的徴候について、誘発後の１４日間すべてのネコをモニターした。カリシウイルスの病原性と一致する誘発後の重度の臨床的徴候を示すネコを安楽死させた。
【０１５５】
表２−１に示すように、ＳＱ／経口／経口の投与法を介してワクチン接種した群は死亡率がわずか１０％であったが、対照群は死亡率が９０％であった。ＳＱ／ＳＱ／ＳＱの投与法を介してワクチン接種した群は死亡率が５０％であったが、ＳＱ／ＳＱ／経口の投与法を介してワクチン接種した群は死亡率が２０％であった。これらの結果から、ＳＱワクチン接種を行い、その後経口追加免疫を行うと、病原性ＦＣＶ誘発に対するＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４ワクチン接種の有効性が高くなることが示唆される。経口ワクチン接種を投与法の一部にしたとき死亡率が５０％（ＳＱ／ＳＱ／ＳＱ）から１０％（ＳＱ／経口／経口）または２０％（ＳＱ／ＳＱ／経口）に低下しただけでなく、表２−２に示すように、皮膚病変（ＳＬ）、食欲不振（ＩＡ）、抑うつ（ＤＰ）、口腔潰瘍（ＯＵ）、歩行困難（ＬＮ）、くしゃみ（ＳＺ）、鼻漏（ＮＤ）や流涙（ＷＥ）などの臨床的徴候の重傷度が同様に低下した。
【０１５６】
【表１２】
【０１５７】
【表１３】
【０１５８】
（実施例２−２）
ＳＱ／経口ワクチン接種後の平均ＦＣＶ血清中和力価
実施例２−１のネコから採取した血液試料を、０、２１、４２、６３、９８および１１３日目の試験日に収集し、血清中和（ＳＮ）アッセイでＦＣＶを中和する能力についてそれを評価した。血清試料を１：８に希釈し、その後体積６００μｌで１：１６３８４まで連続２倍希釈（合計１２回の希釈）を行った。６００μｌ中で力価が５０〜５００ＴＣＩＤ５０／ｍＬのネコカリシウイルスを、希釈した血清試料と混合し、それを室温で４５分間インキュベートした。次いで希釈した各試料２００μｌを、Ｃｒａｎｄｅｌネコ腎（ＣｒＦＫ）細胞を４連で播いた９６穴プレートの別々の穴に移した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートし、そのとき終点の中和力価を決定した。血清中和（ＳＮ）力価と誘発ウイルス逆力価はどちらもＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの方法を使用して計算した。Ｃ．Ｓｐｅａｒｍａｎ、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｌ．２：２２７〜２４２（１９０８）およびＧ．Ｋａｒｂｅｒ、Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．Ｐｈａｒｍａｋ．１６２：４８０〜４８７（１９３１）を参照されたい。表２−３に示すように、ＳＱ／経口／経口またはＳＱ／ＳＱ／経口のワクチン接種法を介して投与したＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４は、ＦＣＶ ＳＮ力価が著しく高くなった。これらのデータは、実施例２−１で記載した死亡率の著しい低下と相関する。
【０１５９】
【表１４】
【０１６０】
（実施例２−３）
ネコ汎白血球減少ウイルスに対するＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４およびＦＥＬ−Ｏ−ＶＡＸ（登録商標）のＳＱ／経口投与の有効性
実施例２−１のネコの血清試料について、その平均ＦＰ力価のアッセイも行った。表２−４に示すように、すべてのネコが試験開始時に血清陰性であった。その後、対照群の平均力価は試料採取の合間の期間ずっと１のままであった（２１および４２日目）。しかし、他の４つのワクチン接種群の平均力価は著しく上昇した。
【０１６１】
【表１５】
【０１６２】
（実施例２−４）
様々な投与経路によってＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４でワクチン接種したネコの臨床症状
動物の鼻孔中への液滴の点滴注入によって、ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４の口鼻（ＯＮ）投与を行った。表２−５で示すように、表２−５で示す投与法：皮下のワクチン接種および追加免疫（ＳＱ／ＳＱ）；皮下ワクチン接種および口鼻追加免疫（ＳＱ／ＯＮ）；または口鼻のワクチン接種および追加免疫（ＯＮ／ＯＮ）に従って、６〜７ヶ月齢のネコ１０匹の群（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）にワクチン接種し、２１日目に追加免疫した。首の右側にワクチンを皮下投与し（１ｍＬ）、口鼻投与は、各鼻孔中にワクチンを０．５ｍＬ送達することによるものであった。１日目から開始して、一般健康状態についてすべてのネコを毎日観察した。
【０１６３】
【表１６】
【０１６４】
表２−５に示すように、どちらも口鼻でワクチン接種を受けているネコは、鼻潰瘍（ＮＵ）、口腔潰瘍（ＯＵ）、持続性のくしゃみ（ＳＺ）、鼻漏（ＮＤ）、流涙（ＷＥ）および一過性の食欲不振（ＩＡ）を含めて高レベルの臨床症状を有していた。しかし、ＳＱ／ＯＮの投与法を介してワクチン接種したネコは、ＯＮ／ＯＮワクチン接種ネコより低い臨床症状を示し、鼻潰瘍、口腔潰瘍、鼻漏、または流涙を示さなかった。また、ＳＱ／ＯＮ群の対象は、ＯＮ／ＯＮ群のネコより少ないくしゃみも示した。ＳＱ／ＯＮ群の安全性は、ＳＱ／ＳＱ群と類似していた。
【０１６５】
（実施例２−５）
ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４抗原に対する血清学的応答についての異なるワクチン接種経路の効果
実施例２−４に記載の試験に登録されたネコの血清試料について、ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４ワクチン中に存在する様々なウイルス抗原に対する血清学的反応性のアッセイを行った。０、２１および４２日目の試験日に、ＦＣＶ、ＦＨＶおよびＦＰに対する平均血清中和抗体力価を決定した。表２−６に示すように、３つすべてのワクチン接種法により、ＦＰに対する強い免疫応答が生じた。ＦＨＶに対する免疫応答は、アッセイの困難性によりわずかに検出可能であった。しかし、ＦＣＶに対する血清中和力価は、ＳＱ／ＳＱ群と比較して、ＯＮ／ＯＮおよびＳＱ／ＯＮ群で著しく高かった。これらの結果から、ＯＮ／ＯＮおよびＳＱ／ＯＮ群のネコは、病原性ＦＣＶの誘発に対して防御されるが、ＳＱ／ＳＱ群は防御されない可能性があることが示唆される。
【０１６６】
【表１７】
【０１６７】
（実施例２−６）
ＳＱまたはＯＮ経路を介して投与したＦＣＶ−Ｆ９に対する血清中和力価
１群当たり６匹のネコを、ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４ワクチン中に存在するＦＣＶ−Ｆ９抗原で、ＳＱまたはＯＮワクチン接種した。最初のワクチン接種から３週間後に、すべてのネコを、前記と同じ投与経路を介して同じ抗原で追加免疫した。投与量はすべて１ｍＬであった。追加免疫感作から３週間後に血清試料を収集した。表２−７に示すように、２６種のＦＣＶ株のパネルに対する血清中和力価をこれらの試料について決定した。そのパネルに選択されたＦＣＶ株は、（そのキャプシドの超可変領域の配列によって決定される）遺伝的多様性、ならびに地理的分布に基づいて選択された。さらに、各株の病原性の表現型も考慮された。Ｆ９でＯＮワクチン接種したネコの血清試料は、ＳＱワクチン接種したネコの試料と比較して、２６個の構成要素のパネルの中でよりＦＣＶ株を中和した。中和力価の遮断値として２３を使用すると、ＯＮワクチン接種ではパネルの構成要素の２６％で遮断値以上の力価となったが、ＳＱワクチン接種では１６％しか基準を満たさなかった。力価遮断値を１５にすると、ＯＮワクチン接種ではパネルの構成要素の３２％で遮断値以上となったが、ＳＱでは１７％でしかならなかった。
【０１６８】
【表１８】
【０１６９】
（実施例２−７）
ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４またはＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）３構成成分および改変型生ＦＣＶ−２１の２回の投与でワクチン接種したネコの死亡率および臨床スコア
約８週齢の、家庭向けの短毛のネコに、改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス（ＦＨＶ）、汎白血球減少ウイルス（ＦＰ）、オウム病クラミジア、ならびに（１）ＦＣＶ−Ｆ９（ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４またはＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）３）、（２）ＦＣＶ−Ｆ９およびＦＣＶ−２１（ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４＋ＦＣＶ−２１、またはＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）３＋ＦＣＶ−２１）、または（３）ＦＣＶ−２１（ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４ＡまたはＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）３Ａ）を含有するワクチンを投与した。ワクチン接種法には以下のものがあった：最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に皮下追加免疫（ＳＱ／ＳＱ）；最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に１回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口）；または最初に経口免疫感作、その後２１日目に２回目の経口ワクチン接種（経口／経口）。様々な投与法内での各ネコ（Ｔ１〜Ｔ１０の群、１群当たりネコ１０匹）にワクチン１ｍＬを投与した。経口ワクチン接種は、口の中へのワクチンの投与によって行った。４２日目に、約１ｍＬの病原性全身性ＦＣＶ−３３５８５（３ｌｏｇのＴＣＩＤ５０／ｍＬ）ですべてのネコを誘発した。誘発後の１４日間、体温の上昇、結膜炎の漿液性漏出、結膜炎の粘液膿性漏出、鼻炎の漿液性漏出、鼻炎の粘液膿性漏出、くしゃみ、可聴性ラ音、せき、開口呼吸、食欲不振、脱水症、１つの口腔潰瘍＜４ｍｍ、複数の口腔潰瘍、口腔潰瘍＞４ｍｍ、流涎、非出血性外部潰瘍、および出血性外部潰瘍を含めた疾患の臨床的徴候について、すべてのネコをモニターした。カリシウイルスの病原性と一致する誘発後の重度の臨床的徴候を示すネコを安楽死させた。
【０１７０】
表２−８に示すように、ＳＱ／ＳＱワクチン接種と比較したとき、ＳＱ／経口ワクチン接種法では、ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４でワクチン接種したネコで死亡率が４４％から１０％に低下し、中央臨床スコアが１２から５．５に改善された。さらに、ＦＣＶ−２１株をＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）３およびＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４に加えると誘発後死亡しなかった。ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）３およびＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４のＦＣＶ−Ｆ９株をＦＣＶ−２１株に置換すると、経口／経口ワクチン投与法でもＦＣＶ−Ｆ９とＦＣＶ−２１をどちらも含有するワクチンと同様の効果が得られた。
【０１７１】
【表１９】
【０１７２】
（実施例２−８）
ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４構成成分および改変型生ＦＣＶ−２１の３回の投与でワクチン接種したネコの死亡率および臨床スコア
約８週齢の、家庭向けの短毛のネコに、改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス（ＦＨＶ）、汎白血球減少ウイルス（ＦＰ）、オウム病クラミジア、ならびに（１）ＦＣＶ−Ｆ９（ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４）、（２）ＦＣＶ−Ｆ９およびＦＣＶ−２１（ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４Ａ）、または（３）ＦＣＶ−２１（ＦＥＬＯＣＥＬＬ（登録商標）４Ｂ）を含有するワクチンを投与した。各場合で、ネコに最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目および４２日目に連続経口投与を行った（ＳＱ／経口／経口）。様々な投与法内での各ネコ（Ｔ１〜Ｔ４の群、１群当たりネコ１０匹）にワクチン１ｍＬを投与した。経口ワクチン接種は、口の中へのワクチンの投与によって行った。６３日目に、約１ｍＬの病原性全身性ＦＣＶ−３３５８５（３ｌｏｇのＴＣＩＤ５０／ｍＬ）ですべてのネコを誘発した。誘発後の１４日間、実施例２−７と同様に疾患の臨床的徴候についてすべてのネコをモニターした。カリシウイルスの病原性と一致する誘発後の重度の臨床的徴候を示すネコを安楽死させた。表２−９に示すように、誘発後の死亡率および臨床スコアによって測定される三重投与法の効果は、実施例２−７に記載の二重投与法の効果と同等である。
【０１７３】
【表２０】
【０１７４】
（実施例２−９）
ＦＣＶ−２１を伴うＦＥＬＯＣＥＬＬ４構成成分およびＦＣＶ−２１を伴わないＦＥＬＯＣＥＬＬ４構成成分でワクチン接種したネコの血清の交差中和分析
実施例２−７に記載の試験における各ネコの血清試料を、２回目のワクチン接種から誘発までの間に収集した。試料を５６℃で３０分間熱処理し、前記の実施例１−１０（表１−６）に記載した２６種の各ＦＣＶ株に対する血清中和アッセイで評価した。
【０１７５】
＞２３および＞１５の遮断力価を用いて血清中和データを分析し、２つの遮断力価の平均を計算した（Ａｖｅ）。その結果を表２−１０に示す。そのデータから、（ＦＣＶ−Ｆ９を含有する）ＦＥＬＯＣＥＬＬ４の交差中和特性は、投与経路がＳＱ／ＳＱであれＳＱ／経口であれ一定のままであることが示唆される。しかし、ＦＣＶ−２１を加えると、ワクチンをＳＱ／ＳＱまたはＳＱ／経口で投与したときに交差中和特性が大いに向上する。さらに、（ＦＣＶ−２１を含有するが、ＦＣＶ−Ｆ９は含有しない）ＦＥＬＯＣＥＬＬ４Ａでは、ＳＱ／ＳＱ、ＳＱ／経口で、また経口／経口のワクチン接種経路でも交差中和特性が向上する。
【０１７６】
【表２１】
【０１７７】
表２−１１で、評価したワクチン接種法には、最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目および４２日目に２回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口／経口）があった。その結果から、ＦＣＶ−２１を加えると、ＦＥＬＯＣＥＬＬ４中にＦＣＶ−Ｆ９を含んでもまたは含まなくても、交差中和特性が著しく幅広くなった（約４０％増大した）ことが示唆される。
【０１７８】
【表２２】
【０１７９】
ＦＣＶ株ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９およびＦＣＶ２６３９１−４に関連するペプチド、タンパク質、およびＤＮＡとして本明細書に記載したワクチンを用いて、上記の実施例２−４および表２−５で述べた、以前に開示されている副作用を伴うことなく、第１の場合に経口または口鼻（ＯＮ）投与を、その後第２の経口または口鼻投与を実施することができるという、本発明者らの知見も開示する。
【０１８０】
本明細書および添付した特許請求の範囲において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」や「その（ｔｈｅ）」などの単数形の冠詞は、文脈上別段にはっきりと示されない限り、１つの対象または複数の対象を指す可能性があることに留意されたい。したがって、例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」を含有する組成物の指すものは、単一の化合物または２つ以上の化合物を含む可能性がある。
【０１８１】
上記の実施例および記載は、例示的であるものとし、限定的なものでないことを理解されたい。上記の記載を読んだ後、多数の実施形態が当業者には明らかとなるであろう。したがって、本発明の範囲は、特許請求の範囲に権利がある完全な範囲の同等物とともに、添付した特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。特許、特許出願および刊行物を含めたすべての論説および参照文献の開示は、参照によりその全体がすべての目的で本明細書に組み込まれている。
【０１８２】
表２−１〜２−９において、Ｆｅｌｏｃｅｌｌ（登録商標）４、Ｆｅｌｏｃｅｌｌ４、もしくはＦＥＬＯＣＥＬＬ４またはこれらの語の後に「３」の数が続くものはワクチンであり、名称Ｆｅｌｏｃｅｌｌの任意の変種は、Ｐｆｉｚｅｒによって所有されている。Ｆｅｌｏｃｅｌｌ４Ａの指すものは、ＦＣＶ−Ｆ９を含まないＦｅｌｏｃｅｌｌ４であり、Ｆｅｌｏｃｅｌｌ３Ａの指すものは、ＦＣＶ−Ｆ９を含まないＦｅｌｏｃｅｌｌ３である。これらの試験で使用した実際の抗原が市販の製品由来でなく、むしろ研究目的のみの小さなバッチで、しかし市販の製品と同じ形で抗原が調製されたことに留意されたい。
【０１８３】
本明細書で開示され、特許請求されているすべての組成物および／または方法は、本開示に照らして、過度な実験を行うことなく作製し実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態の点から説明してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および／または方法に、方法のステップまたはステップの順序に変更を当てはめることができることが当業者には明らかとなるであろう。より具体的には、化学的にも生理的にも関連する特定の作用物質で本明細書に記載の作用物質を置換することができ、その一方で、同じまたは類似した結果が実現されることが明らかとなるであろう。当業者にとって明らかであるそのような類似した置換および改変はすべて、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念の中にあるとみなされる。
【０１８４】
本発明の番号付き記載。さらなる記載および例。１．ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）に対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＣＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを非経口投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０日（両端を含む）の整数であり、約３週間および約２〜４週間のＮも記載される方法。２．ワクチンがそれぞれ独立に生ウイルスワクチン、改変型生ウイルスワクチン、不活性化ウイルスワクチン、組換えワクチン、ＤＮＡワクチン、またはサブユニット抗原ワクチンを単独でまたは組み合わせて含む、請求項１に記載の方法。３．少なくとも１つのワクチンが、ＦＣＶの１つまたは複数の株を含む、請求項１に記載の方法。４．ＦＣＶの１つまたは複数の株が、Ｆ９もしくはＦＣＶ−２１またはＦ９およびＦＣＶ−２１を含む、請求項３に記載の方法。５．ワクチンが同じものである、請求項１に記載の方法。６．少なくとも１つのワクチンがまた、ネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ汎白血球減少ウイルス、およびネコクラミジアから選択される１つまたは複数の病原体に対する免疫応答の誘導にも適合する、請求項１に記載の方法。７．第１のワクチンを皮下投与する、請求項１に記載の方法。８．第２のワクチンを経口または口鼻投与する、請求項１に記載の方法。９．ネコに約１：６またはそれ以上のＦＣＶ血清中和力価が発生した後に第２のワクチンまたはその後のワクチンを投与する、請求項１に記載の方法。１０．治療有効量の第３のワクチンをネコに投与するステップをさらに含み、第３のワクチンがＦＣＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１または第２のワクチンの投与後Ｍ日目にそれを非経口、経口、または口鼻投与し、Ｍが１〜１２０日（両端を含む）の整数である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。１１．第３のワクチンを皮下投与する、請求項１０に記載の方法。１２．ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）に対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＣＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、約３週間および約２〜４週間のＮも指定される方法。１３．ＦＣＶ株が、ＦＣＶ−２１、ＦＣＶ−４９、ＦＣＶ２６３９１−４からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。１４．動物に免疫感作する方法であって、任意選択の第３のワクチンとともに、治療有効量の第１および第２のワクチンを動物に投与するステップを含み、第１および第２および任意選択の第３のワクチンが免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを非経口または経口投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２および任意選択の第３のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、約３週間および約２〜４週間のＮも指定され、約１年のＭ期間を含むワクチンの任意選択の年１回の追加免疫投与を含んでよい方法。
【０１８５】
第３部
この部では、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）およびネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）に対して動物を免疫感作するための方法および組成物を提供する
ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）によって引き起こされるネコ呼吸器疾患、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）によって引き起こされるネコ汎白血球減少、ネコ鼻気管支炎ウイルスとも呼ばれているネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）によって引き起こされるネコウイルス性鼻気管支炎に対してワクチンで動物を、具体的にはネコを治療し免疫感作するための方法および材料を本明細書に記載する。記載した形でネコに与えたとき、ＦＰＶおよび／またはＦＨＶワクチンの両方の有効な単回経口および経口／経口および皮下／経口送達を可能にするワクチンの新規の組合せを下記に記載する。
【０１８６】
単回経口とは、ワクチン接種された動物に有効な防御を付与する単回経口送達を意味する。経口／経口とは、上記の第２部での記載と同様に２回行う経口送達を意味し、すなわちどちらかの経口の後いくらかの期間が続き、次いで経口経路を介して別の投与を行い、皮下／経口とは、皮下で行う第１の投与の後いくらかの期間が続き、次いで経口経路を介して別の投与を行うことである。
【０１８７】
本明細書に記載するものは、改変型生クラミジアワクチン、または改変型生クラミジアワクチンの任意の構成成分、例えば増殖培地、細胞溶解物または細胞全体、クラミジア自体の任意の構成成分と組み合わせた、改変型生ＦＰＶおよび／または改変型生ＦＨＶの組合せの送達である。クラミジアはまた、ネコクラミジア、またはネコオウム病クラミジアまたはＦＣｐとも称される。
【０１８８】
改変型生ＦＰＶをそれ自体でまたは改変型生ＦＣＶ、もしくは改変型生ＦＨＶワクチンと組み合わせて投与するとき、経口／経口の形で送達するときにＦＰＶは有効でなく、ＳＱ／経口の投与経路ではＳＮ力価の低下を示す。同様に、改変型生ＦＨＶをそれ自体でまたは改変型生ＦＣＶ、もしくは改変型生ＦＰＶワクチンと組み合わせて投与するとき、経口／経口の形で送達するときにＦＨＶは有効でなく、ＳＱ／経口の投与経路では効果の低下を示す。ＦＰＶおよび／またはＦＨＶを改変型生クラミジアワクチンと組み合わせて投与するときだけ、その混合ワクチンの送達が皮下／経口または経口／経口の経路を介するときにＦＰＶおよび／またはＦＨＶに対する十分な防御がもたらされる。
【０１８９】
上記に従って、下記の実施例を提供する。下記の実施例は、例示的かつ非限定的であるものとし、本発明の少数の具体的な実施形態を表す。
【０１９０】
（実施例３−１）
（観念上）ＦＰＶおよびクラミジアでの皮下／経口ワクチン接種法。ＦＰＶおよびクラミジア（または改変型生クラミジアワクチンの任意の構成成分）を、他の構成成分を含むまたは含まない混合ワクチンとして提供する。改変型生ワクチンは、皮下／経口で送達することができる。
【０１９１】
（実施例３−２）
（観念上）ＦＰＶおよびクラミジアでの経口／経口ワクチン接種法。ＦＰＶおよびクラミジア（または改変型生クラミジアワクチンの任意の構成成分）を、他の構成成分を含むまたは含まない混合ワクチンとして提供する。改変型生ワクチンは、経口／経口で送達することができる。
【０１９２】
（実施例３−３）
（観念上）ＦＰＶ、ＦＨＶおよびクラミジアでの皮下／経口ワクチン接種法。ＦＰＶ、ＦＨＶおよびクラミジア（または改変型生クラミジアワクチンの任意の構成成分）を、他の構成成分を含むまたは含まない混合ワクチンとして提供する。改変型生ワクチンは、皮下／経口で送達することができる。
【０１９３】
（実施例３−４）
（観念上）ＦＰＶ、ＦＨＶおよびクラミジアでの経口／経口ワクチン接種法。ＦＰＶ、ＦＨＶおよびクラミジア（または改変型生クラミジアワクチンの任意の構成成分）を、他の構成成分を含むまたは含まない混合ワクチンとして提供する。改変型生ワクチンは、経口／経口で送達することができる。
【０１９４】
（実施例３−５）
（実際上）ＦＰＶ、ＦＨＶ、ＦＣＶおよびクラミジアでの皮下／経口ワクチン接種法。ＦＰＶ、ＦＨＶ、ＦＣＶおよびクラミジア（または改変型生クラミジアワクチンの任意の構成成分）を、他の構成成分を含むまたは含まない混合ワクチンとして提供する。改変型生ワクチンは、経口／経口で送達することができる（表３−１）。
【０１９５】
（実施例３−６）
（実際上）ＦＰＶ、ＦＨＶ、ＦＣＶおよびクラミジアでの経口／経口ワクチン接種法。ＦＰＶ、ＦＨＶ、ＦＣＶおよびクラミジア（または改変型生クラミジアワクチンの任意の構成成分）を、他の構成成分を含むまたは含まない混合ワクチンとして提供する。改変型生ワクチンは、経口／経口で送達することができる。表３−１を参照されたい。
【０１９６】
約８週齢の、家庭向けの短毛のネコに、改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス［ＦＨＶ］、カリシウイルス［ＦＣＶ−２１］、汎白血球減少ウイルス［ＦＰＶ］およびオウム病クラミジア［ＦＣｐ］を含有するＦＥＬＯＣＥＬＬ４Ａおよび３Ａ構成成分でワクチン接種した。評価したワクチン接種法には以下のものがあった：最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に皮下追加免疫（ＳＱ／ＳＱ）；最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に１回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口）；または最初に経口ワクチン接種、その後２１日目に２回目の経口ワクチン接種。経口ワクチン接種は、口の中へのワクチンの投与によって行った。各ネコの血清試料を２回目のワクチン接種後に収集し、それを５６℃で３０分間熱処理した。ＦＰＶに対する血清中和アッセイで試料を評価した。
【０１９７】
【表２３】
【０１９８】
表３−１の結果から、文献中で以前に報告されたように、ネコがＦＰＶ抗原に対して最小限に応答したことが示唆される。（Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｆｔｅｒ ｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｆｅｌｉｎｅ ｐａｎｌｅｕｋｏｐｅｎｉａ ｖｉｒｕｓ．Ｓｃｈｕｌｔｓ ＲＤ、Ｓｃｏｔｔ ＦＷ、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．１９７３年４月７日（４）：５４７〜９）。しかし、クラミジア、またはクラミジアワクチンと関係する任意の構成成分が存在すると、ＦＰＶ ＳＮ力価がはるかに高くなり、このことから、ＦＰＶ誘発に対するｉｎ ｖｉｖｏでの効果が示唆される。さらに、ＳＱ／ＳＱ、ＳＱ／経口だけでなく、経口／経口の群でも高いＦＰＶ免疫原性が観察された。
【０１９９】
（実施例３−７）
（実際上）ＦＰＶ、ＦＨＶ、ＦＣＶでの経口／経口ワクチン接種法
ＦＰＶ、ＦＨＶ、ＦＣＶを、他の構成成分を含むまたは含まない混合ワクチンとして提供する。改変型生ワクチンは、経口／経口で送達することができる。表３−２を参照されたい。
【０２００】
約８週齢の、家庭向けの短毛のネコに、改変型生ネコ鼻気管支炎ウイルス［ＦＨＶ］、カリシウイルス［ＦＣＶ−２１］および汎白血球減少ウイルス［ＦＰＶ］を含有するＦＥＬＯＣＥＬＬ３Ａでワクチン接種した。評価したワクチン接種法には以下のものがあった：最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に皮下追加免疫（ＳＱ／ＳＱ）；最初に皮下ワクチン接種、その後２１日目に１回の経口追加免疫感作（ＳＱ／経口）；または最初に経口ワクチン接種、その後２１日目に２回目の経口ワクチン接種。経口ワクチン接種は、口の中へのワクチンの投与によって行った。各ネコの血清試料を１回目および２回目のワクチン接種後に収集し、それを５６℃で３０分間熱処理した。ＦＰＶに対する血清中和アッセイで試料を分析した。
【０２０１】
【表２４】
【０２０２】
表３−２の結果から、経口／経口で投与したとき、ＦＥＬＯＣＥＬＬ３Ａワクチン中に存在するＦＰＶ抗原が最小限の免疫応答を誘導したことが示唆される（表３−１の結果と一致）。しかし、ワクチンをＳＱ／ＳＱまたはＳＱ／経口で投与したとき、ｉｎ ｖｉｖｏでの効果を示す高いＦＰＶ ＳＮ力価が観察された。
【０２０３】
本発明の番号付き記載。さらなる記載および例。下記で、ＦＣＶはネコカリシウイルスであり、ＦＰＶは、汎白血球減少またはＦＰＬとも呼ばれているネコパルボウイルスであり、最後にＦＨＶはネコヘルペスウイルスであることに留意されたい。１．単回投与で投与される改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアをどちらも含む免疫原性組成物。２．２回別々の単回投与でネコに送達される改変型生ＦＰＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日、または約３週間または約２週間離れているワクチン。３．ＦＰＶに対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＰＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、またはＮが約３週間であり、またはＮが約２週間であり、前記第１および第２のワクチンが、改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアの両方からなる方法。４．単回投与で投与される改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアをどちらも含む免疫原性組成物。５．２回別々の単回投与でネコに送達される改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日、または約３週間または約２週間離れているワクチン。６．ＦＨＶに対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＨＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、またはＮが約３週間であり、またはＮが約２週間であり、前記第１および第２のワクチンが、改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアの両方からなる方法。７．単回投与で投与される改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアをどちらも含む免疫原性組成物。８．２回別々の単回投与でネコに送達される改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日、または約３週間または約２週間離れているワクチン。９．ＦＣＶに対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＣＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、またはＮが約３週間であり、またはＮが約２週間であり、前記第１および第２のワクチンが、改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアの両方からなる方法。１０．単回投与で投与される改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含む免疫原性組成物。１１．２回別々の単回投与でネコに送達される改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日、または約３週間または約２週間離れているワクチン。１２．ＦＰＶおよびＦＨＶに対してネコを同時に免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＰＶおよびＦＨＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、またはＮが約３週間であり、またはＮが約２週間であり、前記第１および第２のワクチンが、改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含む方法。１３．単回投与で投与される改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含む免疫原性組成物。
１４．２回別々の単回投与でネコに送達される改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日、または約３週間または約２週間離れているワクチン。１５．ＦＰＶおよびＦＣＶに対してネコを同時に免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＰＶおよびＦＨＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、またはＮが約３週間であり、またはＮが約２週間であり、前記第１および第２のワクチンが、改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含む方法。１６．単回投与で投与される改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含む免疫原性組成物。１７．２回別々の単回投与でネコに送達される改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日、または約３週間または約２週間離れているワクチン。１８．ＦＨＶおよびＦＣＶに対してネコを同時に免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＨＶおよびＦＣＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、またはＮが約３週間であり、またはＮが約２週間であり、前記第１および第２のワクチンが、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含む方法。１９．単回投与で投与される改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含む免疫原性組成物。２０．２回別々の単回投与でネコに送達される改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日、または約３週間または約２週間離れているワクチン。２１．ＦＰＶ、ＦＨＶおよびＦＣＶに対してネコを同時に免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＰＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが１〜１２０（両端を含む）の整数であり、またはＮが約３週間であり、またはＮが約２週間であり、前記第１および第２のワクチンが、改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含む方法。
【０２０４】
１．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質を含むワクチン。
２．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、前記キャプシドタンパク質が、タンパク質配列（配列番号１３）または少なくとも約９１．２％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、免疫応答を生じさせるのに有効な量提供されるワクチン。
３．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するＤＮＡワクチンであって、ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−２１キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１２）または少なくとも約７８．７％、もしくは７９．２％の配列同一性を有し、保存的置換を許容する配列を含むＤＮＡワクチン。
４．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質がＦＣＶ−４９株由来のタンパク質配列を含むワクチン。
５．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、前記キャプシドタンパク質が、タンパク質配列（配列番号１５）または少なくとも約９２．７％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、免疫応答を生じさせるのに有効な量提供されるワクチン。
６．ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するＤＮＡワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１４）または少なくとも約７８．９％、すなわち７９．４％（７８．９＋０．５）の配列同一性を有し、保存的置換を許容する配列を含むＤＮＡワクチン。
７．アジュバントを含有するか、ＦＣＶ構成成分が生であるか、ＦＣＶ構成成分が弱毒化されているか、ＦＣＶ構成成分が不活性化されているか、のうち単独またはいずれかの組合せをさらに含み、ＦＣＶ−Ｆ９、ＦＣＶ−ＬＬＫ、ＦＣＶ−Ｍ８、ＦＣＶ−２５５、およびＦＣＶ−２２８０からなる群から選択される少なくとも１つの他のネコカリシウイルス株を含んでよい、１．から６．のいずれかに記載のワクチン。
８．ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）に対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＣＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを非経口投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０日（両端を含む）の整数である方法。
９．ワクチンがそれぞれ独立に生ウイルスワクチン、改変型生ウイルスワクチン、不活性化ウイルスワクチン、組換えワクチン、ＤＮＡワクチン、またはサブユニット抗原ワクチンを単独でまたは組み合わせて含む、８．に記載の方法。
１０．少なくとも１つのワクチンが、ＦＣＶの１つまたは複数の株を含む、９．に記載の方法。
１１．ＦＣＶの１つまたは複数の株が、Ｆ９もしくはＦＣＶ−２１またはＦ９およびＦＣＶ−２１を含む、１０．に記載の方法。
１２．単回投与で投与される、改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含む免疫原性組成物。
１３．２回別々の単回投与でネコに送達される、改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日離れているワクチン。
１４．ＦＰＶ、ＦＣＶおよび／またはＦＨＶに対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＰＶ、および／またはＦＣＶおよび／またはＦＨＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、前記第１および第２のワクチンが、ａ）改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／またはｂ）改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／またはｃ）改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／またはｄ）改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／またはｅ）改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／またはｆ）改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／またはｇ）改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジア、もしくはその任意の組合せを含む組成物からなる方法。
１５．本明細書に記載されている、動物、特にネコを治療するための任意の免疫原性組成物、ワクチン、および方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質がＦＣＶ−４９株由来のタンパク質配列を含むワクチン。
【請求項２】
ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、前記キャプシドタンパク質が、タンパク質配列（配列番号１５）または少なくとも約９２．７％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、免疫応答を生じさせるのに有効な量提供されるワクチン。
【請求項３】
ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するＤＮＡワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１４）または少なくとも約７８．９％、すなわち７９．４％（７８．９＋０．５）の配列同一性を有し、保存的置換を許容する配列を含むＤＮＡワクチン。
【請求項４】
アジュバントを含有するか、ＦＣＶ構成成分が生であるか、ＦＣＶ構成成分が弱毒化されているか、ＦＣＶ構成成分が不活性化されているか、のうち単独またはいずれかの組合せをさらに含み、ＦＣＶ−Ｆ９、ＦＣＶ−ＬＬＫ、ＦＣＶ−Ｍ８、ＦＣＶ−２５５、およびＦＣＶ−２２８０からなる群から選択される少なくとも１つの他のネコカリシウイルス株を含んでよい、請求項１から３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】
ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）に対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＣＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを非経口投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０日（両端を含む）の整数である方法。
【請求項６】
ワクチンがそれぞれ独立に生ウイルスワクチン、改変型生ウイルスワクチン、不活性化ウイルスワクチン、組換えワクチン、ＤＮＡワクチン、またはサブユニット抗原ワクチンを単独でまたは組み合わせて含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのワクチンが、ＦＣＶの１つまたは複数の株を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＦＣＶの１つまたは複数の株が、Ｆ９もしくはＦＣＶ−２１またはＦ９およびＦＣＶ−２１を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
単回投与で投与される、改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含む免疫原性組成物。
【請求項１０】
２回別々の単回投与でネコに送達される、改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日離れているワクチン。
【請求項１１】
ＦＰＶ、ＦＣＶおよび／またはＦＨＶに対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＰＶ、および／またはＦＣＶおよび／またはＦＨＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、前記第１および第２のワクチンが、
ａ）改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または
ｂ）改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または
ｃ）改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または
ｄ）改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または
ｅ）改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または
ｆ）改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または
ｇ）改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジア、もしくはその任意の組合せを含む
組成物からなる方法。
【請求項１】
ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質を含み、前記キャプシドタンパク質がＦＣＶ−４９株由来のタンパク質配列を含むワクチン。
【請求項２】
ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質と、薬学的に許容できる担体とを含み、前記キャプシドタンパク質が、タンパク質配列（配列番号１５）または少なくとも約９２．７％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、免疫応答を生じさせるのに有効な量提供されるワクチン。
【請求項３】
ネコカリシウイルスに対してネコを免疫感作するＤＮＡワクチンであって、ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質または単離ＦＣＶ−４９キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記ＤＮＡが、配列（配列番号１４）または少なくとも約７８．９％、すなわち７９．４％（７８．９＋０．５）の配列同一性を有し、保存的置換を許容する配列を含むＤＮＡワクチン。
【請求項４】
アジュバントを含有するか、ＦＣＶ構成成分が生であるか、ＦＣＶ構成成分が弱毒化されているか、ＦＣＶ構成成分が不活性化されているか、のうち単独またはいずれかの組合せをさらに含み、ＦＣＶ−Ｆ９、ＦＣＶ−ＬＬＫ、ＦＣＶ−Ｍ８、ＦＣＶ−２５５、およびＦＣＶ−２２８０からなる群から選択される少なくとも１つの他のネコカリシウイルス株を含んでよい、請求項１から３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】
ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）に対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＣＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを非経口投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０日（両端を含む）の整数である方法。
【請求項６】
ワクチンがそれぞれ独立に生ウイルスワクチン、改変型生ウイルスワクチン、不活性化ウイルスワクチン、組換えワクチン、ＤＮＡワクチン、またはサブユニット抗原ワクチンを単独でまたは組み合わせて含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのワクチンが、ＦＣＶの１つまたは複数の株を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＦＣＶの１つまたは複数の株が、Ｆ９もしくはＦＣＶ−２１またはＦ９およびＦＣＶ−２１を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
単回投与で投与される、改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含む免疫原性組成物。
【請求項１０】
２回別々の単回投与でネコに送達される、改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含むワクチンであって、単回投与が経口または口鼻経路によってどちらも送達されるものであり、期間的に３〜１２０日離れているワクチン。
【請求項１１】
ＦＰＶ、ＦＣＶおよび／またはＦＨＶに対してネコを免疫感作する方法であって、治療有効量の第１および第２のワクチンをネコに投与するステップを含み、第１および第２のワクチンがＦＰＶ、および／またはＦＣＶおよび／またはＦＨＶに対するネコの免疫応答を誘導するように適合されており、第１のワクチンを経口または口鼻投与し、第２のワクチンを経口または口鼻投与し、第１のワクチンの投与後Ｎ日目に第２のワクチンを投与し、Ｎが３〜１２０（両端を含む）の整数であり、前記第１および第２のワクチンが、
ａ）改変型生ＦＰＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または
ｂ）改変型生ＦＨＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または
ｃ）改変型生ＦＣＶと改変型生クラミジアをどちらも含み、かつ／または
ｄ）改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または
ｅ）改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または
ｆ）改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジアを含み、かつ／または
ｇ）改変型生ＦＰＶ、改変型生ＦＨＶ、改変型生ＦＣＶおよび改変型生クラミジア、もしくはその任意の組合せを含む
組成物からなる方法。
【公開番号】特開２０１２−２１１１６１（Ｐ２０１２−２１１１６１Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１３７７２５（Ｐ２０１２−１３７７２５）
【出願日】平成２４年６月１９日（２０１２．６．１９）
【分割の表示】特願２００８−５２３４７９（Ｐ２００８−５２３４７９）の分割
【原出願日】平成１８年７月１７日（２００６．７．１７）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年６月１９日（２０１２．６．１９）
【分割の表示】特願２００８−５２３４７９（Ｐ２００８−５２３４７９）の分割
【原出願日】平成１８年７月１７日（２００６．７．１７）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
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