中和ヒト抗ＩＧＦＲ抗体
【課題】ＩＧＦＲ１によって媒介される疾患（例えば、悪性疾患）を処置または予防するために有用な、完全ヒト抗ヒトＩＧＦＲ１モノクローナル抗体を提供すること。
【解決手段】本発明は、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列とからなる群から選択されるメンバーを含むことを特徴とするＩＧＦＲ１に特異的に結合する結合組成物を提供する。本発明は、ヒト・インスリン様増殖因子受容体−Ｉ（ＩＧＦＲ１）に対する完全ヒト中和モノクローナル抗体を包含する。該抗体は、被験体中の癌を処置または予防するために有用である。本発明の抗体を使用および生産する方法も包含される。
【解決手段】本発明は、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列とからなる群から選択されるメンバーを含むことを特徴とするＩＧＦＲ１に特異的に結合する結合組成物を提供する。本発明は、ヒト・インスリン様増殖因子受容体−Ｉ（ＩＧＦＲ１）に対する完全ヒト中和モノクローナル抗体を包含する。該抗体は、被験体中の癌を処置または予防するために有用である。本発明の抗体を使用および生産する方法も包含される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願６０／３８３，４５９号（２００２年５月２４日出願）、米国仮出願６０／３９３，２１４号（２００２年７月２日出願）、および米国仮出願６０／４３６，２５４号（２００２年１２月２３日出願）の優先権を主張するもので、上記出願のそれぞれの全体を本明細書では援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、完全ヒトモノクローナル抗インスリン様増殖因子受容体−Ｉ（ＩＧＦＲ１）抗体と、該抗体の使用方法および該抗体の生産方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ソマトメジンとしても知られるインスリン様増殖因子は、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびインスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）を含む（非特許文献１、および非特許文献２）。これらの増殖因子は、インスリン様増殖因子受容体−１（ＩＧＦＲ１）と命名される共通の受容体に結合する（非特許文献３）ことによって、腫瘍細胞を含む種々の細胞型にマイトジェン活性を作用させる（非特許文献４）。ＩＧＦＲ１とＩＧＦとの相互作用によって、チロシン残基上の該受容体の自己リン酸化を誘引してこの受容体が活性化される（非特許文献５）。活性化されると、今度は、ＩＧＦＲ１が細胞内標的をリン酸化して、細胞シグナル伝達経路を活性化させる。この受容体活性化は、腫瘍細胞の増殖および生存の刺激にとって不可欠である。したがって、ＩＧＦＲ１活性の阻害は、ヒト癌および他の増殖性疾患の増殖を処置または予防する有用な潜在的方法を表す。
【０００４】
様々な系列の証拠は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、およびそれらの受容体ＩＧＦＲ１が悪性の表現型の重要な媒介物質であることを示している。ＩＦＧ−Ｉの血漿レベルが前立腺癌の危険性を最も強力に予測する判断材料であることが判明（非特許文献６）しており、同様の疫学研究は、乳癌、結腸癌、および肺癌の危険性と血漿ＩＧＦ−Ｉレベルを強く関連付けている。
【０００５】
インスリン様増殖因子受容体−Ｉの過剰発現がいくつかの癌細胞株および腫瘍組織で証明されている。ＩＧＦＲ１は、全ての乳癌細胞株の４０％で過剰発現し（非特許文献７）、肺癌細胞株の１５％で過剰発現する。乳癌腫瘍組織では、ＩＧＦＲ１は、６〜１４倍過剰発現し、ＩＧＦＲ１は、正常組織と比べて２〜４倍高いキナーゼ活性を示す（非特許文献８、および非特許文献９）。９０％の結腸直腸癌組織生検は、増加したＩＧＦＲ１レベルを示し、この際、ＩＧＦＲ１発現の程度は、疾患の重症度に相関している。子宮頸癌細胞の初代培養および子宮頸癌細胞株の分析によって、正常子宮頸部細胞と比べて、それぞれ３倍および５倍のＩＧＦＲ１過剰発現が明らかになった（非特許文献１０）。滑膜肉腫細胞でのＩＧＦＲ１の発現も侵襲性の強い表現型（すなわち、転移および高増殖率；非特許文献１１）と相関していた。徐々に進展する疾患である先端巨大症は、成長ホルモンおよびＩＧＦ−Ｉの分泌過多が原因である（非特許文献１２）。ＩＧＦＲ１機能の拮抗作用がこの疾患を処置する際有用である。当該技術分野で公知の抗体が複数あり、ＩＧＦＲ１の活性を示す。しかし、治療上の有用性は比較的低い。例えば、α−ＩＲ３（非特許文献１３）、１Ｈ７（非特許文献１４、および非特許文献１５）、およびＭＡＢ３９１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）は、マウスモノクローナル抗体であり、ＩＧＦＲ１と相互作用し、その活性を示す。これらは、マウス抗体であるので、ヒトでのその治療上の有用性は限られている。免疫応答性ヒト被験体に一服のマウス抗体を投与すると、該被験体は、マウス免疫グロブリン配列に対する抗体を産生する。これらのヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）は、治療用抗体を中和し、急性毒性（すなわち、ＨＡＭＡ応答）を誘導する可能性がある。
ＨＡＭＡ応答を回避するための一方法は、いずれの外来（例えば、マウス）アミノ酸配列も持たない完全ヒト抗体の使用を介する。完全ヒト抗体の使用は、治療用抗体のヒト宿主免疫拒絶反応を低減および予防するためには有効な方法であるが、完全ヒト抗体の拒絶反応が生じうる。ヒト抗体の人体拒絶反応は、ヒト抗ヒト抗体応答（ＨＡＨＡ応答）と呼ばれる。ＨＡＨＡ応答は、完全ヒト抗体中の極めて少ない低発生アミノ酸配列の存在等の因子により媒介されうる。この理由のため、治療用抗体も、非免疫原性ヒト抗体フレームワーク配列の内包または弱免疫原性ヒト抗体フレームワーク配列のみの内包によって最適化されうる。好ましくは、該配列は、多くの場合、他のヒト抗体内で生じる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｌａｐｐｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９８３）１１２：ｐ２２１５
【非特許文献２】Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔら、Ｆｅｂｓ．Ｌｅｔｔ．（１９７８）８９：ｐ２８３
【非特許文献３】Ｓｅｐｐ−Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（１９９８）４７：ｐ２３５
【非特許文献４】Ｍａｃａｕｌａｙ、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９２）６５：ｐ３１１
【非特許文献５】Ｂｕｔｌｅｒら、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（１９９８）１２１：ｐ１９
【非特許文献６】Ｃｈａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２７９：ｐ５６３
【非特許文献７】Ｐａｎｄｉｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９９）５：ｐ１９３５
【非特許文献８】Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９６）５６：ｐ２７８１
【非特許文献９】Ｐｅｋｏｎｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９８）４８：ｐ１３４３
【非特許文献１０】Ｓｔｅｌｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９６）５６：ｐ１７６２
【非特許文献１１】Ｘｉｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９９）５９：ｐ３５８８
【非特許文献１２】Ｂｅｎ−Ｓｃｈｌｏｍｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．（２００１）３０：ｐ５６５−５８３
【非特許文献１３】Ｋｕｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）２５８：ｐ６５６１
【非特許文献１４】Ｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９３）１９６．ｐ９２−９８
【非特許文献１５】Ｘｉｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ（１９９２）８９：ｐ５３５６−５３６０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、例えば、以下の手段を提供する：
（項目１）ａ）配列番号８によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１０によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
ｂ）配列番号３１によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３２によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
ｃ）配列番号１４または配列番号１７によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１６によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列と、
ｄ）配列番号３７または配列番号７０によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３９によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列
からなる群から選択されるメンバーを含むことを特徴とするＩＧＦＲ１に特異的に結合する結合組成物。
（項目２）（ａ）配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目と、
（ｃ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｆ）配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目と、
（ｇ）配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｈ）配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｉ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｊ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目
からなる群から選択される可変領域を含むことを特徴とする、項目１に記載のＩＧＦＲ１に特異的に結合する結合組成物。
（項目３）（ａ）配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目を含む軽鎖可変領域および配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目を含む重鎖可変領域と、
（ｃ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｅ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｆ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｇ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｈ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｉ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｊ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域からなる群から選択されるメンバーを含むことを特徴とするＩＧＦＲ１に特異的に結合する結合組成物。
（項目４）項目１に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
（項目５）（ａ）配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目と、
（ｃ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｆ）配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目と、
（ｇ）配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｈ）配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｉ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｊ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目
からなる群から選択される、ポリペプチドをコードする単離核酸。
（項目６）（ａ）配列番号１のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｂ）配列番号２４のヌクレオチド６１〜３９０番目と、
（ｃ）配列番号７１のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｄ）配列番号７３のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｅ）配列番号３のヌクレオチド５８〜４１１番目と、
（ｆ）配列番号２６のヌクレオチド５８〜４２０番目と、
（ｇ）配列番号４４のヌクレオチド５８〜４１１番目と、
（ｈ）配列番号１１１のヌクレオチド５８〜４１１番目と、
（ｉ）配列番号７５のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｊ）配列番号７７のヌクレオチド５８〜３８４番目
からなる群から選択される、項目５に記載の核酸。
（項目７）項目５に記載の核酸を含むことを特徴とする組み換え型ベクター。
（項目８）項目７に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
（項目９）ポリペプチドを生産するための方法であって、
前記ポリペプチドが生産される条件下で、項目８に記載の宿主細胞を培養することを包含することを特徴とする方法。
（項目１０）病状がインスリン様増殖因子受容体−Ｉの発現または活性の増加によって媒介される被験体の病状を処置または予防するための方法であって、項目１に記載の結合組成物を前記被験体に投与することを包含することを特徴とする方法。
（項目１１）前記病状が先端巨大症、膀胱癌、ウイルムス腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、良性前立腺肥大症、乳癌、前立腺癌、骨癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉腫、転移性カルチノイドに関連する下痢、血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋再狭窄、および不適当な微小血管の増殖からなる群から選択されることを特徴とする項目１０に記載の方法。
（項目１２）前記結合組成物が非経口経路によって前記被験体に投与されることを特徴とする項目１０に記載の方法。
（項目１３）付加的な抗癌療法剤または抗癌療法手順に関連させて前記結合組成物が前記被験体に投与されることを特徴とする項目１０に記載の方法。
（項目１４）病状がインスリン様増殖因子受容体−Ｉの発現または活性の増加によって媒介される被験体の病状を処置または予防するための方法であって、
（ａ）配列番号８によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１０によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号３１によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３２によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号１４または配列番号１７によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１６によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列と、
（ｄ）配列番号３７または配列番号７０によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３９によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列
からなる群から選択されるメンバーを含むＩＧＦＲ１に特異的に結合する結合組成物をその被験体に投与することを包含することを特徴する方法。
（項目１５）前記病状が先端巨大症、膀胱癌、ウイルムス腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、良性前立腺肥大症、乳癌、前立腺癌、骨癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉腫、転移性カルチノイドに関連する下痢、血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋再狭窄、および不適当な微小血管の増殖からなる群から選択されることを特徴とする項目１４に記載の方法。
（項目１６）ＩＧＦＲ１に特異的に結合する完全ヒト・モノクローナル抗体を生産するための方法であって、
（ｉ）トランスジェニック非ヒト動物のＢ細胞によって前記抗体が産生されるように、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するそのトランスジェニック非ヒト動物をＩＧＦＲ１抗原ポリペプチドで免疫化するステップと、
（ｉｉ）その動物のそのＢ細胞を単離するステップと、
（ｉｉｉ）そのＢ細胞を骨髄腫細胞と融合して、その抗体を分泌する不死ハイブリドーマ細胞を形成するステップと、
（ｉｖ）そのハイブリドーマ細胞からその抗体を単離するステップ
を包含することを特徴とする方法。
（項目１７）前記抗原ポリペプチドが配列番号１９のアミノ酸３０〜９０２番目であることを特徴とする、項目１６に記載の方法。
（項目１８）（ａ）約８６×１０−１１以下のＫｄでＩＧＦＲ１に結合することと、
（ｂ）ＩＧＦＲ１に対して、約６．５０×１０−５以下の解離速度（Ｋｏｆｆ）を有することと、
（ｃ）ＩＧＦＲ１に対して、約０．７×１０５以上の結合速度（Ｋｏｎ）を有することと、
（ｄ）ＩＧＦＲ１への結合をＩＧＦ１と競合することと、
（ｅ）ＩＧＦＲ１の自己リン酸化を阻害することと、
（ｆ）ＩＧＦＲ１を発現する細胞の足場非依存性増殖を阻害することｓ
からなる群から選択される特性を含むことを特徴とする、ヒトＩＧＦＲ１に特異的に結合する結合組成物。
（項目１９）前記特性を全て含むことを特徴とする項目１８に記載の結合組成物。
（項目２０）（ａ）配列番号８によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１０によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号３１によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３２によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号１４または配列番号１７によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１６によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列と、
（ｄ）配列番号３７または配列番号７０によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３９によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列
からなる群から選択されるメンバーを含むことを特徴とする、項目１８に記載の結合組成物。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、完全ヒト抗ヒトＩＧＦＲ１モノクローナル抗体を提供し、これは、好ましくは、ヒト被験体に投与される際に、ＨＡＭＡ応答もＨＡＨＡ応答を誘導せず、かつＩＧＦＲ１によって媒介される疾患（例えば、悪性疾患）を処置または予防するために有用である。
【０００９】
本発明は、軽鎖を含む結合組成物（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）を提供し、この際、その軽鎖は、配列番号８または３１によって定義される軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号９または３２によって定義される軽鎖ＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号１０または３３によって定義される軽鎖ＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含む。重鎖を含む結合組成物（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）も提供し、この際、その重鎖は、配列番号１４または３７によって定義される重鎖ＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列、配列番号１５または３８によって定義される重鎖ＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号１６または３９によって定義される重鎖ＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明の結合組成物（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）は、配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目、配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目、配列番号４１もしくは４３のアミノ酸２０〜１２８番目、または配列番号４１、４３、７２、７４、７６、もしくは７８のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域、好ましくは成熟軽鎖可変領域、および／あるいは配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目、配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目、配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目、または配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域、好ましくは成熟重鎖可変領域を含む。
【００１０】
本発明の結合組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も本発明により提供される。本発明の結合組成物をポリエチレングリコール等の物質と連結してもよい。
【００１１】
本発明は、ヒトＩＧＦＲ１に特異的に結合する結合組成物（例えば、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント）も包含し、その結合組成物は、
（ａ）約８６×１０−１１以下のＫｄでＩＧＦＲ１（例えば、ヒトＩＧＦＲ１）に結合することと、
（ｂ）ＩＧＦＲ１（例えば、ヒトＩＧＦＲ１）に対して、約６．５０×１０−５以下の解離速度（Ｋｏｆｆ）を有することと、
（ｃ）ＩＧＦＲ１（例えば、ヒトＩＧＦＲ１）に対して、約０．７Ｘ１０５以上の結合速度（Ｋｏｎ）を有することと、
（ｄ）ＩＧＦＲ１（例えば、ヒトＩＧＦＲ１）への結合に関してＩＧＦ１と競合することと、
（ｅ）ＩＧＦＲ１（例えば、ヒトＩＧＦＲ１）の自己リン酸化を（例えば、０．１０ｎＭのＩＣ５０で）阻害することと、
（ｆ）ＩＧＦＲ１（例えば、ヒトＩＧＦＲ１）を発現する細胞の足場非依存性増殖を阻害することと
からなる群から選択される特性を含む。好ましくは、その結合組成物は、上記特性（ａ〜ｆ）の全てを含む。より好ましくは、その結合組成物（例えば、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント）は、
（ａ）配列番号８によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１０によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号３１によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３２によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号１４または配列番号１７によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１６によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列と、
（ｄ）配列番号３７または配列番号７０によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３９によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列と
から選択されるメンバーを含む。
【００１２】
本発明は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目と、
（ｃ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ａ）配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｂ）配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目と、
（ｃ）配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｄ）配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｅ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｆ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目と
から選択されるペプチドをコードする単離核酸も包含する。
【００１３】
好ましくは、その核酸は、
（ａ）配列番号１のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｂ）配列番号２４のヌクレオチド６１〜３９０番目と、
（ｃ）配列番号７１のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｄ）配列番号７３のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｅ）配列番号３のヌクレオチド５８〜４１１番目と、
（ｆ）配列番号２６のヌクレオチド５８〜４２０番目と、
（ｇ）配列番号４４のヌクレオチド５８〜４１１番目と、
（ｈ）配列番号１１１のヌクレオチド５８〜４１１番目と、
（ｉ）配列番号７５のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｊ）配列番号７７のヌクレオチド５８〜３８４番目と
から選択される。本発明は、任意の前述のポリヌクレオチドを含む組み換え型ベクターも、そのベクターを含む宿主細胞とともに提供する。
【００１４】
本発明は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目と、
（ｃ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｆ）配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目と、
（ｇ）配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｈ）配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｉ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｊ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目と
から選択されるポリペプチドも含む。
【００１５】
好ましくは、本発明の結合組成物は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（１５Ｈ１２／１９Ｄ１２成熟ＬＣ−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２成熟ＨＣ）と、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目を含む軽鎖可変領域および配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目を含む重鎖可変領域（１Ｈ３成熟ＬＣ−１Ｈ３成熟ＨＣ）と、
（ｃ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＣ−成熟ＨＣＡ）と、
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＤ−成熟ＨＣＡ）と、
（ｅ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＥ−成熟ＨＣＡ）と、
（ｆ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＦ−成熟ＨＣＡ）と、
（ｇ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＣ−成熟ＨＣＢ）と、
（ｈ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＤ−成熟ＨＣＢ）と、
（ｉ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＥ−成熟ＨＣＢ）と、
（ｊ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＦ−成熟ＨＣＢ）と
から選択される少なくとも１つ（例えば、１または２）の軽鎖／重鎖組み合わせを含むヒト抗体である。
【００１６】
より好ましくは、そのヒト抗体は、前述の軽鎖／重鎖対の２つを含む四量体である。好ましくは、そのヒト抗体は、成熟ＨＣＡまたは成熟ＨＣＢと対になった成熟ＬＣＦを含む。
【００１７】
配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目、配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目、配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目、配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目、配列番号４１、４３、７２、７４、７６または７８のアミノ酸２０〜１２８番目、配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目、あるいは配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含むポリペプチドを生成する方法も提供し、その方法は、そのポリペプチドが産生される条件下で、宿主細胞を培養することを含む。好ましくは、そのポリペプチドをその宿主細胞から単離もする。
【００１８】
本発明は、インスリン様増殖因子受容体−Ｉの発現または活性の増加によってあるいは１種類以上のそのリガンド（例えば、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ）の発現の増加によって媒介される被験体の病状を処置または予防する方法も提供し、その方法は、本発明の結合組成物（例えば、本発明の抗体または抗原結合フラグメント）をその被験体に投与することを含む。
【００１９】
好ましくは、その結合組成物は、
（ａ）配列番号８によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１０によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号３１によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３２によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号１４または配列番号１７によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１６によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列と、
（ｄ）配列番号３７または配列番号７０によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３９によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列と
から選択されるメンバーを含む。
【００２０】
本発明は、
（ｉ）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ４）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ４）」
ＡＴＣＣ登録番号＿＿＿＿＿＿と、
（ｉｉ）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢ（γ４）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢ（γ４）」
ＡＴＣＣ登録番号＿＿＿＿＿＿と、
（ｉｉｉ）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ１）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ１）」
ＡＴＣＣ登録番号＿＿＿＿＿＿と、
（ｉｖ）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ（κ）」
ＡＴＣＣ登録番号＿＿＿＿＿＿と、
（ｖ）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＤ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＤ（κ）」
ＡＴＣＣ登録番号＿＿＿＿＿＿と、
（ｖｉ）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ（κ）」 ＡＴＣＣ登録番号＿＿＿＿＿＿と、
（ｖｉｉ）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ（κ）」
ＡＴＣＣ登録番号＿＿＿＿＿＿と、
任意の前述のプラスミドの核酸挿入断片と
からなる群から選択される任意のプラスミドを包含する。免疫グロブリン定常領域を任意で含む（すなわち、シグナル配列を除く）プラスミド挿入断片中に含まれる免疫グロブリン可変領域をコードする挿入断片の核酸部分も包含される。任意の前述のプラスミド挿入断片の核酸にコードされる任意のポリペプチドと、免疫グロブリン定常領域を任意で含む（すなわち、シグナル配列を除く）任意の挿入断片中に含まれる免疫グロブリン可変領域をコードするポリペプチドとも包含される。
【００２１】
上記に特定したプラスミドは、ブタペスト条約の下、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ；Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９）に＿＿＿＿＿＿日付で寄託した。ＡＴＣＣに寄託したプラスミドへのアクセス制限の全ては、特許の付与により解除される。
【００２２】
好ましくは、結合組成物は、医薬組成物内で、薬学的に許容される担体と組み合わされている。本発明によって考察される病状としては、先端巨大症、卵巣癌、膵臓癌、良性前立腺肥大症、乳癌、前立腺癌、骨癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉腫、転移性カルチノイドに関連する下痢、血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋再狭窄、および不適当な微小血管の増殖が挙げられる。
【００２３】
例えば非経口経路によって、結合組成物を被験体に投与し得る。抗癌療法剤と関連させてまたは抗癌療法手順と関連させて、本発明の結合組成物の投与を含む併用療法も提供する。
【００２４】
完全ヒト抗ＩＦＧＲ１抗体を生産するための方法も提供し、上記方法は、トランスジェニック非ヒト動物のＢ細胞によって上記抗体が産生されるように、ＩＧＦＲ１抗原ポリペプチド、好ましくは配列番号１９のアミノ酸３０〜９０２および／またはその表面上にＩＦＧＲ１を発現する細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）で、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物を免疫化する工程、上記動物のＢ細胞を単離する工程と、上記Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合して、ＩＧＦＲ１に特異的なヒト・モノクローナル抗体を分泌する不死ハイブリドーマ細胞を形成する工程、ならびに上記ＩＧＦＲ１に特異的なヒト・モノクローナル抗体を単離する工程と含む。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（詳細な説明）
本発明の好ましい実施形態は、インスリン様増殖因子レセプターＩを特異的に認識および結合する完全ヒト・モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、好ましくは配列番号１９のアミノ酸３０〜９０２を包含する。好ましくは、上記抗体またはその抗原結合フラグメントは、１Ｈ３、１５Ｈ１２、１９Ｄ１２、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＢ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＤ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ、または１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢである。
【００２６】
結合組成物または結合作用物質は、例えばリガンド−レセプター型様式または抗体−抗原相互作用で、ＩＧＦＲ１と特異的に結合する分子、例えば共有結合または非共有結合のいずれかで天然の生理学的に関連するタンパク質−タンパク質相互作用で、例えばＩＧＦＲ１に特異的に結合するタンパク質を指す。用語「結合組成物」は、好ましくは、本発明の完全抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＢ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＤ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ、または１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢ、あるいは表１で下記に記載する任意のペプチド）等のポリペプチドである。
【００２７】
本発明の抗体および抗原結合フラグメントを用いて、細胞（好ましくは悪性細胞）の増殖をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボ両方で阻害し得る。単一の理論に制限されることなしに、本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、ＩＧＦＲ１とこのレセプターに対するリガンド（例えば、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦＩ）またはインスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ））との間の相互作用を阻害することによって、細胞増殖を阻害し得る。抗体および抗原結合フラグメントは、ＩＧＦＲ１自己リン酸化を阻害すること、ＩＧＦＲ１を発現する細胞（例えば、癌細胞）の足場非依存性増殖を阻害すること、およびＩＧＦＲ１の分解を誘導することによってＡＫＴキナーゼの活性化を阻害することもし得る。好ましくは、抗体および抗原結合フラグメントは、ＩＧＦＲ１の活性を中和し、かつ／またはＩＧＦＲ１を下方制御する。抗体および抗原結合フラグメントを用いて、ＩＧＦＲ１によって媒介される疾患を処置または予防し得る。本発明は、本発明の抗体および抗原結合フラグメントを生成する方法も提供する。
【００２８】
用語「抗体分子」とは、抗体全体（例えば、ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４）およびそのフラグメント、好ましくは抗原結合フラグメントを指す。抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント、およびｄｓＦｖ抗体フラグメントが挙げられる。
【００２９】
用語「ＩＧＦＲ１」、「インスリン様増殖因子レセプターＩ」、および「Ｉ型インスリン様増殖因子レセプター」は、当上記技術分野で周知である。ＩＧＦＲ１は、任意の生体由来でもよいが、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはイヌ）、最も好ましくはヒト由来である。典型的なヒトＩＧＦＲ１前駆体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ０４４３４またはＮＭ＿０００８７５（配列番号１９）を有する。前駆体の切断（例えば、アミノ酸７１０と７１１との間での切断）は、結合して成熟レセプターを形成するαサブユニットおよびβサブユニットを産生する。本発明の好ましい実施形態では、完全長ＩＧＦＲ１ポリペプチド由来のアミノ酸３０〜９０２を抗ＩＧＦＲ１抗体の生成用の抗原として用いる。
【００３０】
用語「ＩＧＦＩ」、「インスリン様増殖因子Ｉ」、および「Ｉ型インスリン様増殖因子」も当上記技術分野で周知である。用語「ＩＧＦＩＩ」、「インスリン様増殖因子ＩＩ」、および「ＩＩ型インスリン様増殖因子」も当上記技術分野で周知である。ＩＧＦＩまたはＩＧＦＩＩは、任意の生体由来でよいが、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはイヌ）、最も好ましくはヒト由来である。典型的なヒトＩＧＦＩおよびＩＧＦＩＩの核酸配列およびアミノ酸配列はそれぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＸＭ＿０５２６４８（配列番号２０）およびＮＭ＿０００６１２（配列番号２１）を有する。用語「ｓＩＧＦＲ１」または「可溶性ＩＧＦＲ１」としては、ＩＧＦＲ１（例えば、ヒトＩＧＦＲ１）の任意の可溶性フラグメント、好ましくはレセプター膜貫通領域が欠失したフラグメント、より好ましくは配列番号１９のアミノ酸３０〜９０２が挙げられる。
【００３１】
本発明の好ましい完全ヒト・モノクローナル抗ＩＧＦＲ１抗体分子の可変領域のアミノ酸配列（例えば、１Ｈ３、１５Ｈ１２、および１９Ｄ１２）を、上記領域をコードする核酸のヌクレオチド配列とともに表１に概要を示す。本発明は、表１で下記に記載する核酸またはポリペプチド（その成熟フラグメントを含む）のいずれかのうちの１種類以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）を含む任意の核酸またはポリペプチド（例えば、抗体）を包含する。表１は、抗体のＣＤＲ領域に対応するアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の概要も包含する。１５Ｈ１２および１９Ｄ１２の可変領域に対応するアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は同一である。この理由のため、各可変領域またはＣＤＲに対する単一配列のみを示す。
【００３２】
（表１ 本発明のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の概要）
【００３３】
【表１−１】
【００３４】
【表１−２】
【００３５】
【表１−３】
【００３６】
【表１−４】
【００３７】
【表１−５】
【００３８】
【表１−６】
【００３９】
【表１−７】
【００４０】
【表１−８】
ＣＤＲ−Ｌ１は、軽鎖で生じる第１の相補性決定領域（ＣＤＲ）であり、ＣＤＲ−Ｌ２は、軽鎖で生じる第２のＣＤＲであり、ＣＤＲ−Ｌ３は、軽鎖で生じる第３のＣＤＲである。
【００４１】
同様に、ＣＤＲ−Ｈ１は、重鎖で生じる第１のＣＤＲであり、ＣＤＲ−Ｈ２は、重鎖で生じる第２のＣＤＲであり、ＣＤＲ−Ｈ３は、重鎖で生じる第３のＣＤＲである。
【００４２】
ＦＲ−Ｌ１は、軽鎖の第１のフレームワーク領域であり、ＦＲ−Ｌ２は、軽鎖の第２のフレームワーク領域であり、ＦＲ−Ｌ３は、軽鎖の第３のフレームワーク領域であり、ＦＲ−Ｌ４は、軽鎖の第４のフレームワーク領域である。ＦＲ−Ｈ１は、重鎖の第１のフレームワーク領域であり、ＦＲ−Ｈ２は、重鎖の第２のフレームワーク領域であり、ＦＲ−Ｈ３は、重鎖の第３のフレームワーク領域であり、ＦＲ−Ｈ４は、重鎖の第４のフレームワーク領域である。これらの用語と、免疫グロブリン鎖上のＣＤＲおよびＦＲの配置とは、当その技術分野で周知である。
【００４３】
シグナル・ペプチド（すなわち、最初の１９または２０残基）を持たない本発明の成熟軽鎖可変領域は、配列番号１、４０、４２、７１、７３、７５、または７７のヌクレオチド５８〜３８４番目にコードされる配列番号２、４１、４３、７２、７４、７６、または７８のアミノ酸２０〜１２８番目、あるいは配列番号２４のヌクレオチド６１〜３９０番目にコードされる配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目である。
【００４４】
シグナル・ペプチド（すなわち、最初の１９残基）を持たない成熟重鎖可変領域は、配列番号３、４４、または１１１のヌクレオチド５８〜４１１番目にコードされる配列番号４、４５、または１１２のアミノ酸２０〜１３７番目、あるいは配列番号２６のヌクレオチド５８〜４２０番目にコードされる配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目である。
【００４５】
複数の実施形態では、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２ ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１８のヌクレオチド配列にコードされるＧＦＴＦＳＳＦＡＭＨ（配列番号１７）である。複数の実施形態では、１Ｈ３ ＣＤＲ−Ｈ１は、ＮＹＡＭＨ（配列番号７０）である。
【００４６】
本発明は、本発明の抗体および抗原結合フラグメントのフレームワーク領域を含む抗体および抗原結合フラグメントも包含する。好ましくは、ＦＲ−Ｌ１は、配列番号２のアミノ酸２０〜４２番目または配列番号２５のアミノ酸２１〜４３番目であり、ＦＲ−Ｌ２は、配列番号２のアミノ酸５４〜６８番目または配列番号２５のアミノ酸５５〜６９番目であり、ＦＲ−Ｌ３は、配列番号２のアミノ酸７６〜１０７番目または配列番号２５のアミノ酸７７〜１０８番目であり、ＦＲ−Ｌ４は、配列番号２のアミノ酸１１７〜１２８番目または配列番号２５のアミノ酸１２８〜１３０番目である。ＦＲ−Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸２０〜４４番目または２０〜４９番目あるいは配列番号２７のアミノ酸２０〜４４番目または２０〜４９番目であり、ＦＲ−Ｈ２は、配列番号４のアミノ酸５５〜６８番目または配列番号２７のアミノ酸５５〜６８番目であり、ＦＲ−Ｈ３は、配列番号４のアミノ酸８５〜１１６番目または配列番号２７のアミノ酸８５〜１１６番目であり、ＦＲ−Ｈ４は、配列番号４のアミノ酸１２７〜１３７番目または配列番号２７のアミノ酸１３０〜１４０番目である。
【００４７】
好ましい実施形態では、本発明の抗体分子は、配列番号４１または４３のアミノ酸２０〜４２番目によって定義されるＦＲ−Ｌ１、配列番号４１または４３のアミノ酸５４〜６８番目によって定義されるＦＲ−Ｌ２、配列番号４１または４３のアミノ酸７６〜１０７番目によって定義されるＦＲ−Ｌ３、および配列番号４１または４３のアミノ酸１１７〜１２８番目によって定義されるＦＲ−Ｌ４を含む。さらに、好ましい実施形態には、配列番号４５のアミノ酸２０〜４４番目によって定義されるＦＲ−Ｈ１、配列番号４５のアミノ酸５５〜６８番目によって定義されるＦＲ−Ｈ２、配列番号４５のアミノ酸８５〜１１６番目によって定義されるＦＲ−Ｈ３、および配列番号４５のアミノ酸１２７〜１３７番目によって定義されるＦＲ−Ｈ４含む抗体分子が包含される。
【００４８】
（分子生物学）
本発明にしたがって、当その技術分野の技術内にある従来の分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技術を用いることが可能である。このような技術は、文献内で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（本明細書で、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照せよ。
【００４９】
「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」、「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」、または「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、一本鎖型、二本鎖型、またはその他の型で、リン酸エステル高分子形態のリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン（「ＲＮＡ分子（ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」））またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン（「ＤＮＡ分子（ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」））、あるいはホスホロチオエート類およびチオエステル類等のその任意のリン酸エステル類似体を指すことが可能である。
【００５０】
「ポリヌクレオチド配列（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、または「ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸中の一続きのヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とも呼ぶ）であり、２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。
【００５１】
「コード配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」あるいはＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素等の発現産物を「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」配列とは、発現される際に産物を産生するヌクレオチド配列である。
【００５２】
用語「遺伝子（ｇｅｎｅ）」とは、１種類以上のＲＮＡ分子、タンパク質または酵素の全てまたは部分を含むリボヌクレオチドまたはアミノ酸の特定の配列をコードするか、またはその特定の配列に対応し、かつ例えば遺伝子が発現する条件を決定するプロモーター配列等の調節ＤＮＡ配列を含んでもよく、または含まなくてもよいＤＮＡ配列を意味する。遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡに転写され、そのＲＮＡは、アミノ酸配列に翻訳されてもよく、または翻訳されなくてもよい。
【００５３】
本明細書で使用されるように、ＤＮＡの「増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ＤＮＡ配列の混合物内の特定のＤＮＡ配列の濃度を増加させることを表すことが可能である。ＰＣＲの説明に関しては、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４８７を参照せよ。特定の実施形態では、本発明は、ＰＣＲによって増幅することができる抗ＩＧＦＲ１抗体、抗ＩＧＦＲ１抗体重鎖または軽鎖、抗ＩＧＦＲ１抗体重鎖または軽鎖可変領域、抗ＩＧＦＲ１抗体重鎖または軽鎖定常領域、あるいは抗ＩＧＦＲ１抗体ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、またはＣＤＲ−Ｈ３）をコードする核酸を包含する。
【００５４】
本明細書で使用するように、用語「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、一般的に少なくとも１０（例えば、１０、１１、１２、１３、または１４）、好ましくは少なくとも１５（例えば、１５、１６、１７、１８、または１９）、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）、好ましくは１００ヌクレオチド以下（例えば、４０、５０、６０、７０、８０、または９０）の核酸を指し、遺伝子、ｍＲＮＡ，ｃＤＮＡ、または他の対象核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズすることが可能である。例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、３Ｈ−ヌクレオチド、１４Ｃ−ヌクレオチド、３５Ｓ−ヌクレオチド、またはビオチン等の標識を共有結合的に連結したヌクレオチドを組み込むことによって、オリゴヌクレオチドを標識することができる。一実施形態では、標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、核酸の存在を検出することができる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドの１つまたは両方を標識することが可能）をＰＣＲプライマーとして用いて、遺伝子の完全長またはフラグメントをクローニングすること、あるいは核酸の存在を検出することのいずれかをすることができる。一般に、オリゴヌクレオチドを、好ましくは核酸合成装置で合成的に調製する。
【００５５】
任意の核酸（例えば、ＩＧＦＲ１遺伝子をコードする核酸あるいは抗ＩＧＦＲ１抗体またはそのフラグメントもしくは部分をコードする核酸）の配列を、当その技術分野で周知の任意の方法によってシーケンシングすることが可能である（例えば、化学的シーケンシングまたは酵素的シーケンシング）。ＤＮＡの「化学的シーケンシング（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」とは、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０）の方法等の方法を示し得、この際、個々の塩基特異的反応を用いてＤＮＡを無作為に切断する。ＤＮＡの「酵素的シーケンシング（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」とは、Ｓａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３）の方法等の方法を示すことが可能である。
【００５６】
本明細書中の核酸は、天然の調節（発現制御）配列が隣接（ｆｌａｎｋ）することが可能であり、またはプロモーター、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’および３’非コーディング領域等を含む異種配列と連結することが可能である。
【００５７】
「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」または「プロモーター配列（ｐｒｏｍｏｔｅｒ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを結合（例えば、直接に、あるいは他のプロモーター結合タンパク質または物質を介して）して、コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列は、一般的に、その３’末端で転写開始部位に結合され、上流（５’方向）に伸張し、任意のレベルで転写を開始するために必要な最少数の塩基またはエレメントを含む。転写開始部位（例えばヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって都合よく定義される）と、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）とをプロモーター配列内で見出すことが可能である。エンハンサーおよびリプレッサー配列を含む他の発現制御配列と、または本発明の核酸（例えば、配列番号１、３、５〜７、１１〜１３、１８、２２〜２４、２６、２８〜３０、または３４〜３６）とそのプロモーターを作用自在に連結することが可能である。遺伝子発現を制御するために用いることが可能なプロモーターとしては、限定はされないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および第５，１６８，０６２号）と、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）と、ラウス肉腫ウイルスの３’長鎖末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）内に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）と、ヘルペス・チミジン・キナーゼ・プロモーター（Ｗａｇｎｅｒら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５）と、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）、β−ラクタマーゼ・プロモーター等の原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）（”Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９８０）２４２：７４−９４も参照せよ）と、Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコール・デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロール・キナーゼ）プロモーター、またはアルカリ性ホスファターゼ・プロモーター等の酵母または他の真菌由来のプロモーター・エレメントとが挙げられる。
【００５８】
コード配列は、配列がＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ中にコード配列のＲＮＡポリメラーゼ媒介転写を誘導し、その後そのＲＮＡがトランスＲＮＡスプライシングされ（イントロンを含有する場合）、コード配列にコードされるタンパク質中に任意で翻訳されることが可能である際、細胞内の転写および翻訳制御配列「の制御下にある（ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ）」、「と機能的に連結する（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）」、または「と作用自在に連結する（ｏｐｅｒａｂｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）」ものである。
【００５９】
用語「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」および「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、遺伝子、ＲＮＡ、またはＤＮＡ配列内の情報を顕在化することを可能にするか、または引き起こすことを意味し、例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生することを意味する。ＤＮＡ配列は、細胞内でまたは細胞によって発現し、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質（例えば、抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２、または１９Ｄ１２、あるいはそのフラグメント）等の「発現産物（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）」を形成する。発現産物自体も、細胞によって「発現される（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）」と言うことが可能である。
【００６０】
用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」、「クローニング・ベクター（ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）」、および「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」とは、宿主を形質転換するようにＤＮＡまたはＲＮＡ配列が宿主細胞に導入され得、導入された配列の発現および／または複製を任意で促進し得る媒体（例えば、プラスミド）を意味する。
【００６１】
用語「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」または「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、細胞中への核酸の導入を意味する。これらの用語は、細胞中への抗ＩＧＦＲ１抗体またはそのフラグメントをコードする核酸の導入を指すことが可能である。導入された遺伝子または配列を「クローン（ｃｌｏｎｅ）」と呼ぶことが可能である。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け取る宿主細胞は、「形質転換され（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」、「形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）」または「クローン（ｃｌｏｎｅ）」となる。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の供給源に由来することができ、その供給源としては、宿主細胞と同じ属または種の細胞あるいは異なる属または種の細胞が挙げられる。
【００６２】
用語「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」とは、細胞による物質の産生、例えば細胞による遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、タンパク質、あるいは酵素の発現または複製のために、任意の方法で選択、修飾、トランスフェクション、形質転換、増殖、あるいは使用または操作される任意の生体の任意の細胞を意味する。
【００６３】
用語「発現系（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）」とは、適当な条件下で、ベクターによって運搬され宿主細胞に導入されるタンパク質または核酸を発現することができる宿主細胞および適合するベクターを意味する。通常の発現系としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびプラスミド・ベクターと、昆虫宿主細胞およびバキュロウイウルス・ベクターと、哺乳動物宿主細胞およびベクターとが挙げられる。特定の実施形態では、ＩＧＦＲ１または本発明の抗体および抗原結合フラグメントをヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）中で発現させることが可能である。他の適当な細胞としては、ＣＨＯ（チャイニーズ・ハムスター卵巣）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＮＩＨ ３Ｔ３細胞、およびＮＳＯ細胞（非Ｉｇ産生マウス骨髄腫細胞株）が挙げられる。米国特許第４，９５２，４９６号、第５，６９３，４８９号、および第５，８６９，３２０号、ならびにＤａｖａｎｌｏｏ，Ｐ．ら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，２０３５−２０３９；Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．ら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：１２５−１３５；およびＤｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．ら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６８：２５９（本明細書で参考として援用）とに開示されるように、本発明の抗体または抗原結合フラグメント、ｓＩＧＦＲ１またはＩＧＦＲ１をコードする核酸を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｔ７発現系で高レベルで発現させることが可能である。
【００６４】
本発明は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントに対応するアミノ酸またはヌクレオチド配列に対する任意の表面的なまたはわずかな修飾を考察する。具体的には、本発明は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸の配列保存的変異体を考察する。ポリヌクレオチド配列の「配列保存的変異体（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔ）」とは、所定のコドン内の１個以上のヌクレオチドの変化が、その位置でコードされるアミノ酸の改変を生じないものである。本発明の抗体の機能保存的変異体も本発明により考察される。「機能保存的変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔ）」とは、ポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能を改変することなしにタンパク質または酵素内の１個以上のアミノ酸残基を変化させたものであり、その変化には、決して限定はされないが、類似の特性を有するアミノ酸でのアミノ酸の置換が含まれる。類似の特性を有するアミノ酸は、当その技術分野で周知である。例えば、交換可能であり得る極性／親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、トレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が挙げられる。交換可能であり得る非極性／疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。交換可能であり得る酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、交換可能であり得る塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンが挙げられる。
【００６５】
本発明は、表１に記載されるような核酸と、それにハイブリダイズする核酸とにコードされる抗ＩＧＦＲ１抗体およびそのフラグメントを包含する。核酸は、好ましくは低ストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中ストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、好ましくはＩＧＦＲ１結合活性を示す。適当な温度条件および溶液イオン強度条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）を参照せよ）下で、一本鎖型の核酸分子が他の核酸分子にアニールすることができる際に、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ等の別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ）」である。温度条件およびイオン強度条件によって、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」が決定される。通常の低ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件は、５５℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％乳汁、およびホルムアミドなしまたは３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでありうる。通常、中ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件は、５×または６×ＳＳＣを用いて４０％ホルムアミド内でハイブリダイゼーションを実行する以外は、低ストリンジェンシー条件と同様である。高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件は、任意でより高い温度（例えば、５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃、または６８℃）で、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣ内でハイブリダイゼーション条件を実行する以外は、低ストリンジェンシー条件と同様である。一般に、ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍクエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションには、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能であるが、２個の核酸が相補配列を含有することが必要となる。核酸をハイブリダイズするための適当なストリンジェンシーは、当その技術分野で周知の変数である核酸の長さおよび相補性の度合いに依存する。２個のヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合いが大きくなるほど、核酸がハイブリダイズすることが可能なストリンジェンシーが高くなる。１００ヌクレオチド長を超える混成体に対して、融解温度を計算するための方程式が導き出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）、９．５０〜９．５１を参照せよ）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さによって、その特異性が決定される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）、１１．７〜１１．８を参照せよ）。
【００６６】
各参照配列間の全長にわたって、それぞれの配列間で最大一致（マッチ）を得るようにアルゴリズムのパラメータを選択して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較を実行する際に、表１の参照ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一なヌクレオチド配列を含む核酸およびアミノ酸配列を含むポリペプチドも本発明に包含される。各参照配列間の全長にわたって、それぞれの配列間で最大一致を得るようにアルゴリズムのパラメータを選択して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較を実行する際に、表１の参照アミノ酸配列（例えば、配列番号２（例えば、アミノ酸２０〜１２８番目）、配列番号４（例えば、アミノ酸２０〜１３７番目）、配列番号８〜１０、１４〜１６、１７、２５（例えば、アミノ酸２１〜１３０番目）、配列番号２７（例えば、アミノ酸２０〜１４０番目）、配列番号３１〜３３、または配列番号３７〜３９）に、少なくとも約７０％類似、好ましくは少なくとも約８０％類似、より好ましくは少なくとも約９０％類似、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）類似のアミノ酸配列を含むポリペプチドも本発明に包含される。
【００６７】
配列同一性は、比較している２個の配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸間での厳密な一致を指す。配列類似性は、非同一な生化学的に関連するアミノ酸間の一致に加えて、比較している２個のポリペプチドのアミノ酸間の厳密な一致両方を指す。類似の特性を共有し、かつ交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸については、上記で論じている。
【００６８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する以下の参考文献を本明細書で参考として援用する：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；アラインメント・スコアリング・システム：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら”Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９７８）第５巻，補遺３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら”Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．”Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９７８）第５巻，補遺３．”Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；アラインメント統計学：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．”Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．”Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編）（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
【００６９】
（抗体構造）
一般に、基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２個の同一対を含み、各対は、１個の「軽（ｌｉｇｈｔ）」鎖（約２５ｋＤａ）および１個の「重（ｈｅａｖｙ）」鎖（約５０ないし７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００ないし１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含むことが可能である。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を定義することが可能である。通常、ヒト軽鎖は、κおよびλ軽鎖として分類される。さらに、ヒト重鎖は、通常、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖内では、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖も約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（全ての目的のためにその全体を本明細書で参考として援用する）を参照せよ。
【００７０】
各重鎖／軽鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成することが可能である。したがって、一般的に、インタクトなＩｇＧ抗体は、２個の結合部位を有する。二機能性または二重特異性の抗体内以外では、２個の結合部位は、一般的に同じものである。
【００７１】
通常、鎖全ては、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３個の超可変領域によって連結される比較的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２個の鎖由来のＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列され、特異的なエピトープへの結合を可能にする。一般に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖および重鎖両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔら；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；第５版；ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５；Ｋａｂａｔら（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、またはＣｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３の定義に従う。本発明は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ（上記参考文献参照）によって定義されるような１Ｈ３、１５Ｈ１２、および１９Ｄ１２（例えば、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＢ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ、配列番号２、４、２５、２７、４１、４３、および４５）の軽鎖および重鎖由来のＣＤＲおよびＦＲを含む本発明の抗体または抗原結合フラグメントを提供する。
【００７２】
（抗体分子）
用語「抗体分子」としては、限定はされないが、抗体およびそのフラグメント、好ましくは抗原結合フラグメントが挙げられる。その用語には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント、およびｄｓＦｖ抗体フラグメントが包含される。さらに、本発明の抗体分子は、完全ヒト抗体またはキメラ抗体でもよい。好ましくは、抗体分子は、モノクローナル完全ヒト抗体である。より好ましくは、抗体分子は、１Ｈ３、１５Ｈ１２、または１９Ｄ１２である。好ましくは、抗体分子は、１個以上の可変領域およびＣＤＲを含み、そのアミノ酸およびヌクレオチドの配列は表１に記載されている。
【００７３】
本発明は、ＣＤＲを含む任意の抗体分子を包含し、そのＣＤＲは、
ＲＡＳＱＳＩＧＳＳＬＨ（配列番号８）
ＹＡＳＱＳＬＳ（配列番号９）
ＨＱＳＳＲＬＰＨＴ（配列番号１０）
ＳＦＡＭＨ（配列番号１４）
ＧＦＴＦＳＳＦＡＭＨ（配列番号１７）
ＶＩＤＴＲＧＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１５）
ＬＧＮＦＹＹＧＭＤＶ（配列番号１６）
ＲＡＳＱＳＶＳＳＦＬＡ（配列番号３１）
ＤＡＳＮＲＡＰ（配列番号３２）
ＱＱＲＳＮＷＰＲＷＴ（配列番号３３）
ＧＦＴＦＳＮＹＡＭＨ（配列番号３７）
ＡＩＧＡＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３８）、および
ＧＲＨＲＮＷＹＹＹＮＫＤＹ（配列番号：３９）
ＮＹＡＭＨ（配列番号７０）から選択される。
【００７４】
本発明の範囲には、任意の免疫グロブリン定常領域に結合した本発明の抗体可変領域（例えば、表１に示される成熟のまたはプロセッシングされていな任意の可変領域）が包含される。軽鎖可変領域が定常領域に結合する場合、好ましくは、その定常領域は、κ鎖である。重鎖可変領域が定常領域に結合する場合、好ましくは、その定常領域は、γ１、γ２、γ３、またはγ４定常領域であり、より好ましくはγ１、γ２、またはγ４であり、さらにより好ましくはγ１またはγ４である。
【００７５】
本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体分子は、好ましくは、ヒトＩＧＦＲ１、好ましくはｓＩＧＦＲ１を認識する。しかし、本発明は、異なる種、好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはイヌ）由来のＩＧＦＲ１を認識する抗体分子を包含する。本発明はまた、ＩＧＦＲ１または任意のそのフラグメント（例えば、配列番号９のアミノ酸３０ないし９０２番目）、あるいは細胞表面上にＩＧＦＲ１またはその任意の部分もしくはフラグメントを発現する任意の細胞（例えば、ヒトＩＧＦＲ１またはＭＣＦ７（例えば、ＡＴＣＣ細胞株番号ＨＴＢ−２２）で安定に形質転換されるＨＥＫ２９３細胞）と複合体を形成する抗ＩＧＦＲ１抗体またはそのフラグメントも包含する。抗体または抗体フラグメントをＩＧＦＲ１またはＩＧＦＲ１フラグメントと接触させることによって、そのような複合体を生成することが可能である。
【００７６】
好ましい実施形態では、マウス免疫系の代わりにヒト免疫系の部分を保有するトランスジェニック・マウスを用いて、ＩＧＦＲ１に対する完全ヒト・モノクローナル抗体を生成する。これらのトランスジェニック・マウス（本明細書で、「ＨｕＭＡｂ」マウスともいう）は、ヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含有し、そのミニ遺伝子座は、内因性のμ鎖遺伝子座およびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化突然変異と一緒に、再編成されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードする（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９）。したがって、そのマウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖の導入遺伝子は、クラス・スイッチングおよび体細胞突然変異を受け、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９４）（前出）；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、およびＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７６４：５３６−５４６内で総説される）。ＨｕＭａｂマウスの調製については、当その分野で公知であり、例えばＴａｙｌｏｒ，Ｌ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３７２０−３７２４；Ｃｈｏｉら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−１２３；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８２１−８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ら（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９−５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１、およびＨａｒｄｉｎｇら（１９９５）Ａｎｎａｌｓ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６（上記全ての内容全体を本明細書で参考として援用）に記載されている。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８７７，３９７号、同第５，６６１，０１６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７４，２９９号、同第５，７７０，４２９号、および同第５，５４５，８０７号、ならびに国際特許出願公報ＷＯ ９８／２４８８４、ＷＯ ９４／２５５８５、ＷＯ ９３／１２２２７、ＷＯ ９２／２２６４５、およびＷＯ ９２／０３９１８（上記全ての開示の全体を本明細書で参考として援用する）を参照せよ。
【００７７】
ＩＧＦＲ１に対する完全ヒト・モノクローナル抗体を生成するために、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１、およびＷＯ ９８／２４８８４に記載されるように、抗原性ＩＧＦＲ１ポリペプチド、好ましくは配列番号１９のアミノ酸３０ないし９０２番目を用いて、ＨｕＭａｂマウスを免疫化することができる。好ましくは、そのマウスは、最初の免疫化時には、６ないし１６週齢である。例えば、ＩＧＦＲ１またはｓＩＧＦＲ１の精製調製物を用いて、ＨｕＭａｂマウスを腹腔内で免疫化することができる。そのマウスをまた、ＩＧＦＲ１遺伝子で安定に形質転換またはトランスフェクションされるＨＥＫ２９３細胞全体で免疫化することもできる。「抗原性ＩＧＦＲ１ポリペプチド（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ＩＧＦＲ１ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、抗ＩＧＦＲ１免疫応答を好ましくはＨｕＭａｂマウス内で誘発するＩＧＦＲ１ポリペプチドまたは任意のそのフラグメント、好ましくは配列番号１９のアミノ酸３０ないし９０２番目を指すことが可能である。
【００７８】
一般に、ＨｕＭＡｂトランスジェニック・マウスは、初めにフロイント完全アジュバント内の抗原を用いて腹腔内（ＩＰ）で免疫化された後に、フロイントの不完全アジュバント内の抗原を用いた隔週のＩＰ免疫化（通常、全数６回まで）を行う場合、十分に応答する。初めにＩＧＦＲ１を発現する細胞（例えば、安定に形質転換されたＨＥＫ２９３細胞）で、その後ＩＧＦＲ１の可溶性フラグメント（例えば、配列番号１９のアミノ酸３０ないし９０２番目）でマウスを免疫化することができ、そのマウスは、連続的に、この２個の抗原で交互に免疫化を受けることができる。眼後出血によって得られる血漿試料を用いた免疫化プロトコールの全工程にわたって、免疫応答をモニタリングすることができる。例えばＥＬＩＳＡによって、抗ＩＧＦＲ１抗体の存在に対してその血漿をスクリーニングすることができ、十分な力価の免疫グロブリンを有するマウスを融合のために用いることができる。屠殺および脾臓除去前３日に、抗原を用いてマウスを静脈内で追加免疫することができる。各抗原に対する２ないし３回の融合の実行が必要となる可能性があると考えられる。複数匹のマウスを各抗原に対して免疫化することができる。例えば、ＨＣ０７およびＨＣ０１２系統の全数１２匹のＨｕＭＡｂマウスを免疫化することができる。
【００７９】
モノクローナル完全ヒト抗ＩＧＦＲ１抗体を産生するハイブリドーマ細胞を当その分野で公知の方法によって生産することが可能である。これらの方法としては、限定はされないが、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）によって当初開発されたハイブリドーマ技術と、トリオーマ技術（Ｈｅｒｉｎｇら（１９８８）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．４７：２１１−２１６、およびＨａｇｉｗａｒａら（１９９３）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ４：１５）と、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２、およびＣｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ８０：２０２６−２０３０）と、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６，１９８５）とが挙げられる。好ましくは、標準的プロトコールに基づいて、マウス脾細胞を単離して、ＰＥＧを用いてマウス骨髄腫細胞株と融合する。その後、得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生に対してスクリーニングすることが可能である。例えば、５０％ＰＥＧを用いて、免疫化したマウス由来の脾臓リンパ球の単一細胞懸濁物を１／６数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ １５８０）に融合することが可能である。細胞を平底マイクロタイター・プレート中に約２×１０５細胞／ｍＬで播種した後、２０％胎児クローン血清、１８％「６５３」馴化培地、５％オリゲン（ｏｒｉｇｅｎ）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、および１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、ＨＡＴは融合後２４時間目に添加）を含有する選択培地中で２週間インキュベートすることが可能である。２週間後に、ＨＡＴをＨＴと取り換えた培地中で細胞を培養することが可能である。その後、ヒト抗ＩＧＦＲ１モノクローナルＩｇＧ抗体に対して個々のウェルをＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることが可能である。広範なハイブリドーマ増殖が生じたら、通常、１０〜１４日後に培地を観察することができる。抗体分泌ハイブリドーマを再播種して、再度スクリーニングし、依然としてヒトＩｇＧに対して陽性である場合は、限界希釈法によって、抗ＩＧＦＲ１モノクローナル抗体を少なくとも２回サブクローニングすることができる。その後、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴づけのために組織培地中で少量の抗体を生成することが可能である。
【００８０】
本発明の抗ＩＧＦＲ抗体分子はまた、組み換え的に生産することも可能である（例えば、上記で論じたようなＥ．ｃｏｌｉ／Ｔ７発現系で）。この実施形態では、本発明の抗体分子（例えば、ＶＨまたはＶＬ）をコードする核酸をｐＥＴベースのプラスミド中に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｔ７系で発現させることが可能である。当その分野で公知の組み換え型抗体を生産する方法が複数ある。抗体の組み換え的生産のための方法の一例は、米国特許第４，８１６，５６７号（本明細書で参考として援用）に開示されている。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法によってであり得る。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドの導入方法は、当その分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中でのポリヌクレオチドの被包、微粒子銃注入（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。さらに、ウイルス・ベクターによって、核酸分子を哺乳動物細胞に導入することが可能である。細胞を形質転換する方法は、当その分野で周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号を参照せよ。
【００８１】
発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当その分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。これらの細胞株としては、特に、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、および多数の他の細胞株が挙げられる。哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、およびハムスターの細胞が挙げられる。どの細胞株が高発現レベルを有するかについて決定することによって、特に好ましい細胞株を選択する。使用可能な他の細胞株は、Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞株、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞、および真菌細胞である。重鎖またはその抗原結合部分、軽鎖、および／またはその抗原結合部分をコードする組み換え型発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する際は、宿主細胞中での抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞を増殖させる培養培地中への抗体の５分泌（５ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）を可能にする十分な期間で宿主細胞を培養することによって、抗体を生産する。
【００８２】
標準的なタンパク質精製法を用いて、抗体を培養培地から回収することができる。さらに、多数の公知の技術を用いて、産生細胞株からの本発明の抗体（またはそれ由来の他の部分）の発現を高めることができる。例えば、グルタミン・シンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を高めるための共通のアプローチである。ＧＳ系については、欧州特許第０ ２１６ ８４６号、第０ ２５６ ０５５号、および第０ ３２３ ９９７号、ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号に関連して完全にまたは部分的に論じられている。
【００８３】
異なる細胞株によってまたはトランスジェニック動物内で発現される抗体は、互いに異なるグリコシル化を有する可能性がある。しかし、本明細書で提供する核酸分子にコードされるか、または本明細書で提供するアミノ酸配列を含む抗体の全ては、抗体のグリコシル化に関わらず本発明の部分である。
【００８４】
「Ｋｏｆｆ」とは、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に対する解離速度定数を指す。
【００８５】
「Ｋｏｎ」とは、抗体が抗原に結合する時の速度を指す。
【００８６】
「Ｋｄ」とは、特定の抗体／抗原相互作用の解離定数を指す。Ｋｄ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ。
【００８７】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用するように、実質的に相同な抗体の集団から得た抗体、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、より少ない量で存在しうる可能な自然発生的な突然変異以外は同一であることを指す。モノクローナル抗体は、非常に特異的であるので、単一の抗原部位に向けられる。モノクローナル抗体は、本質的に他の免疫グロブリンが混入していないハイブリドーマ培養によって合成すること可能である点で有利である。修飾語句「モノクローナル」とは、実質的に相同な抗体集団間にあるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とするとは解釈されない。上述のように、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって初めに記載されたハイブリドーマ法によって、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体を生成することが可能である。
【００８８】
ポリクローナル抗体は、１種類以上の他の非同一抗体間でまたはその非同一抗体の存在下で産生される抗体である。一般に、非同一抗体を産生する複数の他のＢリンパ球の存在下で、Ｂリンパ球からポリクローナル抗体が生産される。通常、免疫化した動物からポリクローナル抗体が直接得られる。
【００８９】
二重特異性または二機能性抗体は、２個の異なる重鎖／軽鎖対および２個の異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含む様々な方法によって、二重特異性抗体を生産することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉら（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１，Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照せよ。さらに、二重特異性抗体を「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８）として、または「Ｊａｎｕｓｉｎ」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５−３６５９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：５１−５２）として形成することが可能である。
【００９０】
用語「完全ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリン・タンパク質配列のみを含む抗体を指す。完全ヒト抗体は、マウス内、マウス細胞内、またはマウス細胞由来のハイブリドーマ内で産生される場合は、マウス糖鎖を含有してもよい。同様に、「マウス抗体」とは、マウス免疫グロブリン配列のみを含む抗体を指す。
【００９１】
本発明は、別の非ヒト種（例えば、マウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリ）由来の抗体領域（例えば、定常領域）に融合またはキメラ化された本発明の可変領域を含む抗体である「キメラ抗体」を包含する。これらの抗体を用いて、非ヒト種内でＩＧＦＲ１の発現または活性を調節することが可能である。
【００９２】
「単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを有し、この際、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチド・リンカーをさらに含み、そのポリペプチド・リンカーは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。単鎖抗体の生産について記載される技術（米国特許第５，４７６，７８６号、同第５，１３２，４０５号、および同第４，９４６，７７８号）を適合させて、抗ＩＧＦＲ１特異的単鎖抗体を生産することができる。ＳＦｖの総説に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照せよ。
【００９３】
「ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント」および「ｄｓＦｖ」とは、ジスルフィド架橋によって結合する可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含む抗体分子を指す。
【００９４】
本発明の範囲内の抗体フラグメントは、例えばペプシンによるＩｇＧの酵素切断によって産生されうるＦ（ａｂ）２フラグメントも含む。例えばジチオトレイトールまたはメルカプトエチルアミンを用いたＦ（ａｂ）２の還元によって、Ｆａｂフラグメントを生産することが可能である。Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィド架橋によってＶＨ−ＣＨ１鎖に付加されるＶＬ−ＣＬ鎖である。Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、次に２つのジスルフィド架橋によって付加される２個のＦａｂフラグメントである。Ｆ（ａｂ）２分子のＦａｂ部分は、ジスルフィド架橋が位置するＦｃ領域の一部分を含む。
【００９５】
ＦＶフラグメントは、ＶＬまたはＶＨ領域である。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。少なくとも５つの主要な免疫グロブリンのクラスがある。すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４と、ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２とにさらに分けることが可能である。
【００９６】
本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体分子を化学的部に結合することも可能である。化学的部は、特に、高分子、放射性核種、または細胞障害性因子でもよい。好ましくは、化学的部は、被験体の体内で抗体分子の半減期を増加させる高分子である。適当な高分子としては、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、分子量２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａを有するＰＥＧ）、デキストラン、およびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が挙げられる。Ｌｅｅ他（１９９９）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１０：９７３−９８１）は、ＰＥＧ結合単鎖抗体を開示している。Ｗｅｎ他（２００１）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１２：５４５−５５３）は、放射性金属キレート化剤（ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ））に結合するＰＥＧとの結合抗体を開示している。
【００９７】
９９Ｔｃ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７ＣＵ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈ、４０Ｋ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒ、および５６Ｆｅ等の標識と本発明の抗体および抗体フラグメントを結合することもできる。
【００９８】
希土類キレート等の蛍光団、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレサミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識、ならびに安定遊離基を含む蛍光または化学発光標識と本発明の抗体および抗体フラグメントを結合することもできる。
【００９９】
ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質および化合物（例えば、脂肪酸）、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サボンソウ（ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ならびにエノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）等の細胞障害性因子と抗体分子を結合することも可能である。
【０１００】
本発明の抗体分子を種々の部に結合するための当その技術分野で公知の任意の方法を用いることが可能であり、その方法としては、Ｈｕｎｔｅｒら（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５；Ｄａｖｉｄら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４；Ｐａｉｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．（１９８２）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７によって記載されるものが挙げられる。抗体を結合するための方法は、従来からあり、当その技術分野で非常に公知である。
【０１０１】
（改変抗体分子）
本発明は、配列番号４１、４３、７２、７４、７６、または７８の軽鎖（１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、ＬＣＢ、ＬＣＣ、ＬＣＤ、ＬＣＥ、またはＬＣＦ）、好ましくは配列番号４１、４３、７２、７４、７６、７８のアミノ酸２０〜１２８番目（成熟１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、ＬＣＢ、ＬＣＣ、ＬＣＤ、ＬＣＥ、またはＬＣＦ）を含む抗体および抗原結合フラグメント（例えば、完全ヒト抗体、ＳＦｖ、ｄｓｖ、Ｆｖ、キメラ抗体）を包含する。本発明は、配列番号４５または１１２の重鎖（１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡまたはＨＣＢ）、好ましくは配列番号４５または１１２のアミノ酸２０〜１３７番目（成熟１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡまたはＨＣＢ）を含む抗体分子も包含する。
【０１０２】
１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、ＬＣＢ、ＬＣＣ、ＬＣＤ、ＬＣＥ、およびＬＣＦを、任意の他の免疫グロブリン重鎖、好ましくは本発明の免疫グロブリン重鎖を用いて二量体化することが可能である。同様に、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡまたはＨＣＢも、任意の軽鎖、好ましくは本発明の軽鎖を用いて二量体化することが可能である。例えば、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡまたはＨＣＢを１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ、ＬＣＤ、ＬＣＥ、またはＬＣＦで二量体化することが可能である。
【０１０３】
１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＢ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＤ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ、または１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢ、あるいはその任意のフラグメントを含む抗体および抗原結合フラグメントは、ヒト被験体内で最少の免疫原生を示すことによって、ヒト被験体に投与される際、ＨＡＨＡ応答の発生率は低い。
【０１０４】
好ましい抗体鎖を下記に示す。点線の下線が引かれている型は、シグナル・ペプチドをコードする。実線の下線が引かれている型は、ＣＤＲをコードする。下線のない型は、フレームワーク領域をコードする。最も好ましくは、抗体鎖は、シグナル・ペプチドを持たない成熟フラグメントである。
修飾１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｃ（配列番号７１）
【０１０５】
【化１Ａ】
（配列番号７２）
【０１０６】
【化１Ｂ】
修飾１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｄ（配列番号７３）
【０１０７】
【化１Ｃ】
（配列番号７４）
【０１０８】
【化１Ｄ】
修飾１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｅ（配列番号７５）
【０１０９】
【化１Ｅ】
（配列番号７６）
【０１１０】
【化１Ｆ】
修飾１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｆ（配列番号７７）
【０１１１】
【化１Ｇ】
（配列番号７８）
【０１１２】
【化１Ｈ】
修飾１９Ｄ１２／１５Ｈ１２重鎖−Ａ（配列番号４４）
【０１１３】
【化１Ｉ】
（配列番号４５）
【０１１４】
【化１Ｊ】
修飾１９Ｄ１２／１５Ｈ１２重鎖−Ｂ（配列番号１１１）
【０１１５】
【化１Ｋ】
（配列番号１１２）
【０１１６】
【化１Ｌ】
（遺伝子療法）
本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体を遺伝子療法手法で被験体に投与することも可能である。遺伝子療法手法では、本発明の抗体をコードする核酸で被験体の細胞を形質転換する。その後、その核酸を含む被験体は、抗体分子を内因的に産生する。先行して、Ａｌｖａｒｅｚ他（２０００）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０８１−３０８７）は、遺伝子療法手法を用いて、一本鎖抗ＥｒｂＢ２抗体を被験体に導入した。Ａｌｖａｒｅｚ他によって記載される方法は、被験体への本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体分子をコードする核酸の導入に容易に適合されうる。
【０１１７】
本発明の任意のポリペプチドまたは抗体分子をコードする核酸を被験体に導入することが可能であるが、好ましい実施形態では、その抗体分子は、完全ヒト単鎖抗体である。
【０１１８】
当その技術分野で公知の任意の手段によって、核酸を被験体の細胞に導入することが可能である。好ましい実施形態では、核酸をウイルス・ベクターの部分として導入する。ベクターが由来する好ましいウイルスの例としては、レンチウイルス、ヘルペス・ウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニア・ウイルス、バキュロウイルス、アルファウイルス、インフルエンザ・ウイルス、および望ましい細胞向性を有する他の組み換え型ウイルスが挙げられる。
【０１１９】
様々な企業がウイルス・ベクターを商業的に生産しており、決して限定はされないが、アビジェン社（Ａｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ（ＡＡＶベクター））、セル・ジェネシス（Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ（レトロウイルス・ベクター、アデノウイルス・ベクター、ＡＡＶベクター、およびレンチウイルス・ベクター））、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルス・ベクターおよびバキュロウイルス・ベクター））、ジェノーボ社（Ｇｅｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．，Ｓｈａｒｏｎ Ｈｉｌｌ，ＰＡ（アデノウイルス・ベクターおよびＡＡＶベクター））、ジェネベック（Ｇｅｎｖｅｃ（アデノウイルス・ベクター））、イントロジーン（ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（アデノウイルス・ベクター））、モレキュラー・メディシン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイルス・ベクター、アデノウイルス・ベクター、ＡＡＶベクター、およびヘルペス・ウイルス・ベクター））、ノルジェン（Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルス・ベクター））、オックスフォード・バイオメディカル（Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ（レンチウイルス・ベクター））、およびトランスジーン（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ（アデノウイルス・ベクター、ワクシニア・ベクター、レトロウイルス・ベクター、およびレンチウイルス・ベクター））が挙げられる。
【０１２０】
ウイルス・ベクターを構築および使用するための方法は、当その技術分野で公知である（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０を参照せよ）。好ましくは、ウイルス・ベクターは、複製欠損型であり、すなわち、そのウイルス・ベクターは、自律的に複製することができず、そのため標的細胞内で非感染性である。好ましくは、複製欠損ウイルスは、最小限のウイルスである。すなわち、その複製欠損ウイルスは、ゲノムをキャプシド被包してウイルス粒子を産生するために必要なそのゲノムの配列のみを保有する。ウイルス遺伝子を完全にまたはほぼ完全に持たない欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルス・ベクターを用いることによって、そのベクターが他の細胞に感染する恐れがなく、特定の局所的領域中の細胞への投与が可能になる。したがって、特定の組織を特異的に標的することができる。
【０１２１】
弱毒化されたＤＮＡウイルス配列または欠損ＤＮＡウイルス配列を含むベクターの例としては、限定はされないが、欠損ヘルペス・ウイルス・ベクター（Ｋａｎｎｏら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６：１４７−１５４；Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．７１：１２５−１３２、およびＫａｐｌｉｔｔら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃ．１９：１３７−１４７）が挙げられる。
【０１２２】
アデノウイルスは、修飾されて本発明の核酸を種々の細胞型に効率的に送達することができる真核生物ＤＮＡウイルスである。Ｓｔｒａｆｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら（１９９２）（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０）によって記載されるベクター等の弱毒化されたアデノウイルス・ベクターが複数の例で望ましい。種々の複製欠損アデノウイルスおよび最小限のアデノウイルス・ベクターについて記載されている（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２６９１４、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７、およびＷＯ９６／２２３７８）。本発明の係る複製欠損組み換え型アデノウイルスを当業者に公知の任意の技術によって調製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏら（１９９１）Ｇｅｎｅ １０１：１９５；ＥＰ １８５５７３；Ｇｒａｈａｍ（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２９１７；Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）。
【０１２３】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、このウイルスが感染する細胞のゲノム中に安定かつ部位特異的な様式で組み込まれうる比較的に小型のＤＮＡウイルスである。アデノ関連ウイルスは、細胞増殖、形態、または分化に何ら影響を引き起こすことなしに、広範囲な細胞に感染することができ、ヒトの病状へは関与しないようである。遺伝子をインビトロおよびインビボで移送するためのＡＡＶに由来するベクターの使用について記載されている（Ｄａｌｙら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３４３−１３４６，１２４５−１３１５；Ｌａｒｓｏｎら（２００１）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．４８９：４５−５７；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１８０８８およびＷＯ９３／０９２３９；米国特許第４，７９７，３６８号および第５，１３９，９４１号、ならびにＥＰ ４８８５２８Ｂ１を参照せよ）。
【０１２４】
別の実施形態では、例えば米国特許第５，３９９，３４６号、第４，６５０，７６４号、第４，９８０，２８９号、および第５，１２４，２６３号；Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：１５３；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１１２０；ＥＰ ４５３２４２およびＥＰ１７８２２０に記載されるように、遺伝子をレトロウイルス・ベクター内に導入することができる。レトロウイルスは、分裂細胞に感染する組み込み型ウイルスである。
【０１２５】
脳、網膜、筋肉、肝臓、および血液を含む複数の組織型で本発明の抗体分子コードする核酸の直接送達および持続性発現のための物質として、レンチウイルス・ベクターを用いることができる。そのベクターは、これらの組織内の分裂および非分裂細胞を効率的に形質導入することができ、抗体分子の長期的な発現を維持することができる。概要については、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−８０、およびＫａｆｒｉら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：３１６−３２６を参照せよ。レンチウイルス・パッキング細胞株が利用可能であり、当その技術分野で公知である。その細胞株は、遺伝子療法のための高力価のレンチウイルス・ベクターの生産を促進する。一例としては、少なくとも３〜４日間１０６ＩＵ／ｍｌより多い力価でウイルス粒子を生成することができるテトラサイクリン誘導性ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルス・パッキング細胞株がある。Ｋａｆｒｉら（１９９９）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５７６−５８４）を参照せよ。非分裂細胞をインビトロおよびインビボで効率的に形質導入するために、誘導性細胞株によって産生されるベクターを必要に応じて濃縮することができる。
【０１２６】
シンドビス・ウイルスは、アルファウイルス属のメンバーであり、世界の様々な場所で、１９５３年に始まってその発見以来広範囲に研究されている。アルファウイルス、特にシンドビス・ウイルスにもとづいた遺伝子形質導入は、インビトロで十分に研究されている（Ｓｔｒａｕｓら（１９９４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５８：４９１−５６２；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７；６４３９−６４４６ Ｉｉｊｉｍａら（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８０：１１０−１１８、およびＳａｗａｉら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４８：３１５−３２３を参照せよ）。アルファウイルス・ベクターの多くの特性によって、そのベクターが開発されている他のウイルス由来のベクター系に対する望ましい代替物となり、その特性としては、発現コンストラクトの迅速な操作、感染性粒子の高力価ストックの生産、非分裂細胞の感染、および高度の発現が含まれる（Ｓｔｒａｕｓｓら（１９９４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１−５６２）。遺伝子療法のためのシンドビス・ウイルスの使用について記載されている（Ｗａｈｌｆｏｒｓら（２０００）Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７：４７２−４８０、およびＬｕｎｄｓｔｒｏｍ（１９９９）Ｊ．Ｒｅｃｅｐ．Ｓｉｇ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．１９（１−４）：６７３−６８６）。
【０１２７】
別の実施形態では、リポフェクションまたは他のトランスフェクション促進物質（ペプチド、高分子等）によってベクターを細胞に導入することができる。合成カチオン性脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のインビボおよびインビトロトランスフェクションのためにリポソームを調製することができる（Ｆｅｉｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７、およびＷａｎｇら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１−７８５５）。核酸の移送のための有用な脂質化合物および組成物についてはＰＣＴ公開ＷＯ ９５／１８８６３およびＷＯ９６／１７８２３、ならびに米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。
【０１２８】
ベクターを裸ＤＮＡプラスミドとしてインビボで導入することも可能である。当その技術分野で公知の方法、例えば電気穿孔、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体の使用によって、遺伝子療法用の裸ＤＮＡベクターを所望の宿主細胞中に導入することができる（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０を参照せよ）。受容体媒介ＤＮＡ送達手法も用いることができる（Ｗｕら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４）。米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号は、哺乳動物内でのトランスフェクション促進物質なしでの外因性ＤＮＡ配列の送達を開示している。近年、電子移動と称される比較的に低電圧の高効率性インビボＤＮＡ移送技術について記載されている（Ｖｉｌｑｕｉｎら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１０９７；Ｐａｙｅｎら（２００１）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２９：２９５−３００；Ｍｉｒ（２００１）Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５３：１−１０；ＰＣＴ公開ＷＯ９９／０１１５７、ＷＯ９９／０１１５８、およびＷＯ９９／０１１７５）。
【０１２９】
（薬学的組成物）
インビボでの被験体への投与に適した薬学的に受容可能なキャリアとともに、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを薬学的組成物に組み込むことができる。本発明の範囲には、任意の経路（例えば、経口、眼、局所的、または肺経路（吸入））によって被験体に投与されうる薬学的組成物が包含されるが、腫瘍内注射、静脈内注射、皮下注射、または筋肉内注射等の非経口経路による投与が好ましい。好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、１Ｈ３、１５Ｈ１２、１９Ｄ１２、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＢ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ＬＣＤ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ、または１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【０１３０】
配合に関する一般的情報については、例えばＧｉｌｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０），Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９０），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ．；Ａｖｉｓら（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ａ．Ｗａｌｔｅｒｓ（ｅｄ．）（２００２）Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｖｏｌ １１９，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒを参照せよ。
【０１３１】
薬学的に受容可能なキャリアは、従来からあり、当その技術分野で非常に公知である。例としては、生理学的に適合している水性および非水性キャリア、安定剤、酸化防止剤、溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤、緩衝剤、血清タンパク質、等張剤、吸収遅延剤等が挙げられる。好ましくは、キャリアは、被験体体内への注入に適している。
【０１３２】
本発明の薬学的組成物で使用可能な適当な水性および非水性キャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）およびその適当な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）、ならびに注入可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。例えば、レクチン等の被覆物質を使用することによって、分散剤の場合は必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。
【０１３３】
乾燥または凍結乾燥の分解作用から、本発明の抗体分子を安定化するために、α、α−トレハロースニ水和物等の安定剤を含むことが可能である。
【０１３４】
薬学的に受容可能な酸化防止剤の例としては、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の水溶性酸化防止剤と、アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール等の油可溶性酸化防止剤と、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等の金属キレート化剤とが挙げられる。
【０１３５】
殺菌手順と、種々の抗菌剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等）の内包との両方によって、微生物の存在の予防を確実にすることが可能である。
【０１３６】
本発明の医薬組成物内に含まれ得る適当な緩衝剤としては、Ｌ−ヒスチジン系緩衝剤、リン酸系緩衝剤（例えば、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ約７）、ソルベート系緩衝剤、またはグリシン系緩衝剤が挙げられる。
【０１３７】
本発明の医薬組成物内に含まれ得る血清タンパク質としては、ヒト血清アルブミンを挙げることが可能である。
【０１３８】
砂糖、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコール、マンニトール、またはソルビトール）、クエン酸ナトリウム、または塩化ナトリウム（例えば、緩衝食塩水）等の等張剤も本発明の医薬組成物内に含むことが可能である。
【０１３９】
モノステアリン酸アルミニウムおよび／またはゼラチン等の吸収を遅延させる作用物質を内包することによって、注入可能な医薬形態の持続性吸収を引き起こすことが可能である。
【０１４０】
グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびその混合物内で、ならびに油内で、分散剤を調製することも可能である。
【０１４１】
薬学的に許容される担体には、無菌注入可能溶液または分散剤の即時調製のための無菌水溶液または分散剤、および無菌粉剤が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当その技術分野で周知である。
【０１４２】
必要に応じて、任意で上記に列記した成分の１種類のまたは組み合わせとともに、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを必要量の適当な溶媒内に組み込み、その後無菌微細濾過することによって、無菌注入可能溶液を調製することができる。一般に、基本的な分散媒および上記に列記したもののなかから必要な他の成分を含有する無菌媒体の中に抗体分子を組み込むことによって分散剤を調製する。無菌注入可能溶液の調製のための無菌粉剤の場合、好ましい調製方法は、予め無菌濾過した溶液から任意の付加的な所望の成分に加えて活性成分の粉剤を生成する真空乾燥および凍結乾燥（凍結乾燥法（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））である。
【０１４３】
本発明の抗体または抗原結合フラグメントを経口投与することも可能である。経口投与用の医薬組成物は、結合組成物に加えて、テンプン（例えば、ジャガイモ、トウモロコシ、または小麦のデンプンまたはセルロース）、デンプン誘導体（例えば、微晶質セルロースまたはシリカ）、砂糖（例えば、ラクトース）、タルク、ステアレート、炭酸マグネシウム、または燐酸カルシウム等の添加剤を含有することが可能である。本発明の抗体または抗原結合フラグメントを含む経口組成物が患者の消化系に十分に許容されることを確実にするために、粘膜構成物または樹脂を含むことが可能である。胃液に溶けないカプセル内に抗体または抗原結合フラグメントを配合することによって、許容度を改善することも望ましくあり得る。粉末形態、ラクトース、タルク、およびステアリン酸マグネシウム内の本発明の抗体または抗原結合フラグメントを標準的な二構成硬ゼラチン・カプセルに充填することによって、カプセル形態でのこの発明の例示的な医薬組成物を調製する。免疫グロブリンの経口投与について記載されている（Ｆｏｓｔｅｒら（２００１）Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｒｅｖ．３：ＣＤ００１８１６）。
【０１４４】
本発明の抗体または抗原結合フラグメントを、局所投与用の医薬組成物内に含むことも可能である。局所投与に適した配合物としては、皮膚を介して処置が必要な部位へと浸透させるために適した液状または半液状製剤が含まれ、例えば、眼、耳、または鼻への投与に適したリニメント剤、ローション、クリーム、軟膏またはペースト、およびドロップがある。
【０１４５】
本発明に係るドロップは、無菌水性もしくは油性溶液または懸濁液を含むことが可能であり、抗体または抗原結合フラグメントを殺菌剤および／または殺真菌剤ならびに／あるいは任意の他の適当な防腐剤の適当な水溶液に溶解し、かつ好ましくは界面活性剤を含むことによって調製され得る。その後、濾過によって得られた溶液を浄化することが可能である。
【０１４６】
本発明に係るローションとしては、皮膚または眼への適用に適したものが含まれる。眼用ローションは、殺菌剤を必要に応じて含有する無菌水性溶液を含むことが可能であり、ドロップの調製方法と同様の方法によって調製され得る。皮膚への適用のためのローションまたはリニメント剤には、乾燥を促進する作用物質および皮膚を冷却する作用物質も含むことが可能であり、その作用物質には、例えば、アルコールまたはアセトン、および／または加湿剤（例えば、グリセロール、あるいはひまし油または落花生油などの油）がある。本発明に係るクリーム、軟膏、またはペーストは、外用のための活性成分の半固体状配合物である。細かく分包された形態または粉末形態の本発明の抗体または抗原結合フラグメントを単独で、あるいは水性流体または非水性流体の溶液または懸濁液中で油脂性または非油脂性の主剤と適当な機器の補助によって混合することによって、それらを作製することが可能である。主剤は、炭化水素（例えば、硬パラフィン、軟パラフィン、液状パラフィン、グリセロール、蜜蝋、金属石鹸）か、粘漿剤か、天然由来の油（例えば、アーモンド油、コーン油、ピーナッツ油、ひまし油、オリーブ油）か、羊毛脂またはその誘導体か、あるいはアルコール（例えば、プロピレングリコール）またはマクロゲルと組み合わせた脂肪酸（例えば、ステアリン酸またはオレイン酸）かを含むことが可能である。配合物は、アニオン性、カチオン性、非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体）などの任意の適当な界面活性剤を組み込むことが可能である。天然ゴム、セルロース誘導体、または無機物質（例えば、珪質シリカ）、および他の成分（例えば、ラノリン）等の懸濁剤も含むことが可能である。
【０１４７】
本発明の抗体および抗原結合フラグメントを吸入によって投与することも可能である。吸入に適当な医薬組成物は、エアロゾルでありうる。本発明の抗体または抗原結合フラグメントの吸入のための例示的な医薬組成物としては、１５ないし２０ｍｌの容積を有するエアロゾル容器が含まれ、そのエアロゾル容器は、好ましくは１，２−ジクロロテトラフルオロエタンおよびジフルオロクロロメタンと組み合わせた推進薬（例えば、フレオン）内に分散させた本発明の抗体または抗原結合フラグメントおよび潤滑剤（例えば、ポリソルベート８５またはオレイン酸）を含み得る。好ましくは、その組成物は、経鼻または経口吸入投与のいずれかに適合させた適当なエアロゾル容器中にある。
【０１４８】
本発明のさらに別の実施形態では、多剤併用療法によって、医薬組成物を投与することができる。例えば、多剤併用療法は、１種類以上の抗癌療法剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂抑制剤、クロマチン機能阻害剤、抗血管形成剤、抗エストロゲン、抗アンドロゲン、抗体療法、または免疫調節剤）と関連させて本発明の医薬組成物を含むことができる。
【０１４９】
「抗癌療法剤（ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」とは、被験体に投与される際に、被験体体内で癌の発達を処置または予防する物質である。１種類以上の抗癌療法手順（例えば、放射線療法または外科的腫瘍摘出術）と関連させて本発明の組成物を投与することが可能である。「抗癌療法手順（ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）」とは、被験体の癌の発病を処置または低減させる被験体でおこなわれる過程である。多剤併用療法を用いる際は、本発明の抗体または抗原結合フラグメント、あるいはその医薬組成物を同時送達のために単一の組成物に配合することが可能であり、または２種類以上の組成物（例えば、キット）に別々に配合することが可能である。さらに、他の療法剤または療法手順を投与する時以外の異なる時間に、抗体または抗原結合フラグメントを被験体に投与することが可能である。例えば、所定の期間にわたって、複数の間隔で非同時的に各投与を与えることが可能である。
【０１５０】
「アルキル化剤」とは、細胞内の任意の分子、好ましくは核酸（例えば、ＤＮＡ）を架橋またはアルキル化することができる任意の物質を指す。アルキル化剤の例としては、メクロレタミン、シクロフォスファミド、イホスファミド、フェニルアラニンマスタード、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌｅｎ）、クロラムブシル（ｓｈｌｏｒａｍｂｕｃｏｌ）、ウラシルマスタード、エストラムスチン、チオテパ、ブスルファン、ロムスチン、カルムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、およびアルトレタミンが挙げられる。
【０１５１】
「代謝拮抗剤」とは、特定の活性、通常はＤＮＡ合成に干渉することによって、細胞増殖および／または代謝を遮断する物質を指す。代謝拮抗剤の例としては、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシン、およびペントスタチンが挙げられる。
【０１５２】
「抗腫瘍抗生物質」とは、ＤＮＡ合成、ＲＮＡ合成、および／またはタンパク質合成を防止または阻害し得る化合物を指す。抗腫瘍抗生物質の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、およびプロカルバジンが挙げられる。
【０１５３】
「有糸分裂抑制剤」は、細胞周期および有糸分裂の正常な進行を防止する。一般に、パクリタキセルおよびドセタキセルなどの微小血管阻害剤が有糸分裂を阻害することができる。ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンなどのビンカアルカロイドも有糸分裂を阻害することができる。
【０１５４】
「クロマチン機能阻害剤」とは、トポイソメラーゼＩまたはトポイソメラーゼＩＩ等のクロマチン・モデリング・タンパク質の正常機能を阻害する物質を指す。クロマチン機能阻害剤の例としては、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、およびテニポシドが挙げられる。
【０１５５】
「抗血管形成剤」とは、血管成長を阻害する任意の薬剤、化合物、物質、または作用物質を指す。例示的な抗血管形成剤としては、決して限定はされないが、ラゾキシン（ｒａｚｏｘｉｎ）、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−α、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、およびバイタクシンが挙げられる。
【０１５６】
「抗エストロゲン」または「抗エストロゲン剤」とは、エストロゲンの作用を低減、拮抗、または阻害する任意の物質を指す。抗エストロゲン剤の例としては、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、アナストロゾール、レトロゾール、およびエキセメスタンが挙げられる。
【０１５７】
「抗アンドロゲン」または「抗アンドロゲン剤」とは、アンドロゲンの作用を低減、拮抗、または阻害する任意の物質を指す。抗アンドロゲンの例には、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、スピロノラクトン、酢酸シプロテロン、フィナステリド、およびシメチジンがある。
【０１５８】
本発明の抗体または抗原結合フラグメントと組み合わせて投与することが可能な抗体療法としては、トラスズマブ（例えば、ハーセプチン）（例えば、Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら（１９９９）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６（４ Ｓｕｐｐｌ １２）：６０−７０を参照せよ）、バイタクシン、およびリツキシマブが挙げられる。
【０１５９】
「免疫調節剤」は、免疫系を刺激する物質である。免疫調節剤の例としては、デニロイキンジフチトックス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、５−フルオロウラシルと組み合わせたレバミソール、インターフェロン、およびインターロイキン−２が挙げられる。「放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）」または「放射線療法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）」とは、電離放射線の投与（好ましくは、腫瘍部位への）によって癌等の疾患を処置することを指す。投与可能な電離放射線の例としては、Ｘ線、ガンマ線（例えば、ラジウム、ウラン、またはコバルト６０により放出）、および粒子線放射（例えば、プロトン、中性子、パイオン、または重イオン）が挙げられる。
【０１６０】
（投与量）
好ましくは、未処置の被験体と比べて、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０ないし１００％の任意の程度までＩＧＦＲ１媒介疾患または症状（例えば、腫瘍増殖）を好適に阻害する「治療上有効な投与量」で本発明の抗体または抗原結合フラグメントを被験体に投与する。癌を阻害する本発明の抗体または抗原結合フラグメントの能力を、ヒト腫瘍での効力を予測する動物モデル系で評価することができる。また、腫瘍細胞増殖を阻害する本発明の抗体または抗原結合フラグメントの能力を当業者に周知のアッセイ（下記参照）によって生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で調べることによって、組成物のこの特性を評価することができる。当業者は、被験体サイズ、被験体の症状の重症度、および選択した特定の組成物または投与経路等の因子にもとづいて、そのような量を決定することができる。
【０１６１】
投与計画を調整して、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供することが可能である。例えば、単一のボーラスを投与することが可能であり、複数回に分けた分量を期間にわたって投与することが可能であり、または治療状況の緊急性によって示されることに比例して分量を減少または増加させることが可能である。投与および投与量の均一性を容易にするために、投与単位形態の非経口組成物を配合することが特に有利である。
【０１６２】
当その技術分野の通常の技術を有する医師または獣医師は、必要とされる有効量の医薬組成物を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医師は、医薬組成物に用いられる本発明の抗体または抗原結合フラグメントの容量を、所望の治療効果を達成するために必要なものより低度で開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させることが可能である。一般に、本発明の組成物の適当な日用量は、治療効果を生むために効果的な最少用量である化合物量であり得る。そのような有効投与量は、一般に、上述の因子に依存する。好ましくは標的部位（例えば、腫瘍）に近接した注 入による投与が好ましい。所望される場合、１日の間で適当な間隔で別々に投与される２回、３回、４回、５回、６回、またはより多くの副用量で、有効な日用量の医薬組成物を投与することが可能である。
【０１６３】
（治療法および投与）
被験体の任意の疾患または症状を処置または予防するために、本発明の抗体または抗原結合フラグメント、および本発明の抗体または抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を用いることが可能であり、その疾患または症状は、ＩＧＦＲ１の発現または活性の増加によってあるいはそのリガンド（例えば、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ）の発現の増加によって媒介され、かつＩＧＦＲ１リガンド結合、活性、または発現の調節によって処置または予防され得る。好ましくは、その疾患または症状は、ＩＧＦＲ１、ＩＧＦ−Ｉ、またはＩＧＲ−ＩＩの濃度の増加によって媒介され、ＩＧＦＲ１リガンド結合、活性（例えば、自己リン酸化活性）、または発現を低下させることによって処置または予防される。好ましくは、その疾患または症状は、悪性疾患であり、より好ましくはＩＧＦＲ１を発現する腫瘍によって特徴付けられる悪性疾患であり、例えば、限定はされないが、膀胱癌、ウイルムス腫瘍、骨癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、子宮頸癌、滑膜肉腫、卵巣癌、膵臓癌、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、転移性カルチノイドに関連する下痢、および血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍（例えば、ビポーマまたはヴァーナー・モリソン症候群）がある。先端巨大症も本発明の抗体分子で処置することが可能である。ＩＧＦ−Ｉの拮抗作用が先端巨大症の処置に関して報告されている（Ｄｒａｋｅら（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．１２：４０８−４１３）。本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体を投与することによっても被験体内で処置することが可能な他の非悪性病状としては、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋再狭窄、または糖尿病の、特に眼の合併症として見出される不適当な微小血管の増殖が挙げられる。
【０１６４】
用語「被験体」とは、任意の生体、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒトを指すことが可能である。好ましい実施形態では、注入等の侵襲性経路（上記参照）によって本発明の抗体および抗原結合フラグメントならびにその医薬組成物を投与する。非侵襲性経路（上記参照）による投与も本発明の範囲内にある。
当その技術分野で公知の医療機器を用いて、組成物を投与することができる。例えば、好ましい実施形態では、皮下用注射針を用いた注入によって、本発明の医薬組成物を投与することができる。
【０１６５】
米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６号に開示される機器等の注射針を用いない皮下注入用機器を用いて、本発明の医薬組成物を投与することも可能である。
【０１６６】
本発明で有用な周知のインプラントおよびモジュールの例としては、調節された速度で薬物を分注するための埋め込み型マイクロインフュージョン・ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、精密な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な薬剤送達のための可変流埋め込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、多重チャンバ区画を有する浸透圧性薬剤送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号が挙げられる。多くの他のそのようなインプラント、送達系、およびモジュールが当業者に周知である。
【０１６７】
（アッセイ）
抗ＩＧＦＲ１抗体を用いて、生体試料中のＩＧＦＲ１を生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で検出することが可能である（例えば、Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）を参照せよ）。抗ＩＧＦＲ１抗体を従来のイムノアッセイで用いることが可能であり、そのイムノアッセイとしては、限定はされないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学、ウエスタン・ブロット法、または免疫沈降法が挙げられる。本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体を用いて、ヒトからＩＧＦＲ１を検出することが可能である。本発明は、生体試料内のＩＧＦＲ１を検出するための方法を提供し、その方法は、生体試料を本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体に接触させることと、ＩＧＦＲ１に結合した抗ＩＧＦＲ１抗体を検出することとによって、生体試料内のＩＧＦＲ１の存在を示すことを包含する。一実施形態では、抗ＩＧＦＲ１抗体を検出可能な標識で直接標識し、直接検出することが可能である。別の実施形態では、抗ＩＧＦＲ１抗体（第１の抗体）を標識せずに、抗ＩＧＦＲ１抗体に結合することができる２次抗体をまたは他の分子を標識する。当業者に周知であるように、第１の抗体の特定の種およびクラスに特異的に結合することができる２次抗体を選択する。例えば、抗ＩＧＦＲ１抗体がヒトＩｇＧである場合、２次抗体は、抗ヒトＩｇＧでよい。標識した２次抗体の存在を検出することによって、生体試料内の抗ＩＧＦＲ１／ＩＧＦＲ１複合体の存在を検出することができる。抗体（例えば、抗ＩＧＦＲ１抗体）に結合することができる他の分子としては、限定はされないが、プロテインＡおよびプロテインＧが挙げられ、それら両方が、例えばピアース・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から市販されている。
【０１６８】
抗ＩＧＦＲ１抗体または２次抗体に適当な標識が開示されており（上掲）、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、磁性物質、および放射性物質を含む。適当な酵素の例としては、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンステラーゼが挙げられる。適当な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロチリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる。磁性物質の例としては、ガドリニウムが挙げられる。適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
【０１６９】
別の実施形態では、検出可能な物質で標識したＩＧＦＲ１標準および標識していない抗ＩＧＦＲ１抗体を利用する競合イムノアッセイによって、ＩＧＦＲ１を生体試料内でアッセイし得る。このアッセイでは、生体試料、標識ＩＧＦＲ１標準、および抗ＩＧＦＲ１抗体を組み合わせて、未標識抗体に結合した標識ＩＧＦＲ１標準の量を測定する。生体試料内のＩＧＦＲ１の量は、抗ＩＧＦＲ１抗体に結合した標識ＩＧＦＲ１標準の量に反比例する。多数の目的のために、上記に開示するイムノアッセイが用いられうる。一実施形態では、抗ＩＧＦＲ１抗体を用いて、細胞培養での細胞内のＩＧＦＲ１を検出し得る。好ましい実施形態では、抗ＩＧＦＲ１抗体を用いて、種々の化合物での細胞処置後に、チロシン・リン酸化の程度、ＩＧＦＲ１のチロシン自己リン酸化の程度、および／または細胞表面上のＩＧＦＲ１の量を測定し得る。この方法を用いて、ＩＧＦＲ１を活性化または阻害するために用いられうる化合物を試験することができる。この方法では、一定期間、１種類の細胞試料を試験化合物で処置し、その一方で別の試料を処置しないでおく。チロシン自己リン酸化を測定しようとする場合、細胞を溶解して、例えば上記に記載したようなイムノアッセイを用いてＩＧＦＲ１のチロシン・リン酸化を測定する。ＩＧＦＲ１の全濃度を測定しようとする場合、細胞を溶解し、上述のイムノアッセイの１つを用いて、全ＩＧＦＲ濃度を測定する。
【０１７０】
ＩＧＦＲ１チロシンリン酸化を測定するための、または全ＩＧＦＲ１濃度を測定するための好ましいイムノアッセイは、ＥＬＩＳＡまたはウエスタン・ブロット法である。ＩＧＦＲの細胞表面濃度のみを測定しようとする場合、細胞を溶解せずに、上記のイムノアッセイの１つを用いて、ＩＧＦＲ１の細胞表面濃度を測定する。ＩＧＦＲ１の細胞表面濃度を測定するための好ましいイムノアッセイは、ビオチンまたは１２５Ｉ等の検出可能な標識で細胞表面タンパク質を標識するステップと、抗ＩＧＦＲ１抗体を用いてＩＧＦＲ１を免疫沈降するステップと、その後標識ＩＧＦＲ１を検出するステップとを包含する。ＩＧＦＲ１の局在化、例えば細胞表面濃度を測定するための別の好ましいイムノアッセイは、免疫組織化学を用いることによるものである。ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタン・ブロット法、免疫組織化学、内在性膜タンパク質の細胞表面標識、および免疫沈降法等の方法は、当その技術分野で公知である。さらに、ＩＧＦＲ１の活性化または阻害のいずれかについて多数の化合物を試験するために、ハイ・スループット・スクリーニングに対してイムノアッセイをスケール・アップすることが可能である。
【０１７１】
また、本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体を用いて、組織またはその組織に由来する細胞内のＩＧＦＲ１の濃度を測定し得る。好ましい実施形態では、その組織は、疾患組織である。より好ましい実施形態では、その組織は腫瘍またはその生検である。その方法の好ましい実施形態では、組織またはその生検は、患者から切除される。その後、その組織または生検をイムノアッセイで用いて、例えばＩＧＦＲ１濃度、ＩＧＦＲ１の細胞表面濃度、ＩＧＦＲ１のチロシン・リン酸化程度、またはＩＧＦＲ１の局在化を、上記に論じた方法によって測定する。その方法を用いて、腫瘍がＩＧＦＲ１を高濃度で発現するか否かを決定し得る。
【０１７２】
上記の診断法を用いて、腫瘍が高濃度のＩＧＦＲ１を発現するかどうかを決定し得、これは、腫瘍が抗ＩＧＦＲ１抗体での処置に十分に応答していることを示し得る。また、その診断法を用いて、腫瘍が高濃度のＩＧＦＲ１を発現する場合は潜在的に癌性であるか、または腫瘍が低濃度のＩＧＦＲ１を発現する場合は良性であるかを決定し得る。さらにまた、その診断法を用いて、抗ＩＧＦＲ１抗体での処置が腫瘍に低濃度のＩＧＦＲを発現させるか否か、および／またはより低度のチロシン自己リン酸化を示させるか否かをも決定し得るため、その方法を用いて処置が成功したかどうかを決定し得る。一般に、抗ＩＧＦＲ１抗体がチロシン・リン酸化を減少させるかどうかを決定する方法は、対象の細胞または組織内のチロシン・リン酸化の程度を測定するステップと、抗ＩＧＦＲ１抗体またはその抗原結合部分を用いてその細胞または組織をインキュベートするステップと、その後その細胞または組織内のチロシン・リン酸化の程度を再測定するステップとを包含する。ＩＧＦＲ１または別のタンパク質（群）のチロシン・リン酸化を測定し得る。その診断法を用いて、組織または細胞が、小人症、骨粗しょう症、または糖尿病に罹患する個体の症例でありうる十分に高濃度のＩＧＦＲ１または十分に高濃度の活性化ＩＧＦＲ１を発現していないかどうかをも決定し得る。ＩＧＦＲ１または活性ＩＧＦＲ１の濃度が低すぎるという診断は、抗ＩＧＦＲ１抗体、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、またはＩＧＦＲ１濃度または活性を増加させるための他の療法用作用物質での処置のために用いられうる。
【０１７３】
また、本発明の抗体を生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で用いて、ＩＧＦＲ１を発現する組織および器官を局在化させ得る。好ましい実施形態では、抗ＩＧＦＲ１抗体を用いて、ＩＧＦＲ１を発現する腫瘍を局在化させ得る。本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体の利点は、その抗ＩＧＦＲ１抗体が、投与時に免疫応答を生じないことである。その方法は、抗ＩＧＦＲ１抗体またはその医薬組成物をそのような診断試験が必要な患者に投与するステップと、その患者に画像診断分析を受けさせ、ＩＧＦＲ１発現組織の位置を決定するステップとを包含する。画像診断分析は、医療技術分野で公知であり、限定はされないが、Ｘ線分析、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、またはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）が挙げられる。その方法の別の実施形態では、患者から生検を得て、その患者に画像診断分析を受けさせる代わりに、対象組織がＩＧＦＲ１を発現するかどうかを決定する。好ましい実施形態では、患者内で画像化できる検出可能な作用物質で抗ＩＧＦＲ１抗体を標識し得る。例えば、Ｘ線分析で使用可能なバリウム等の造影剤で、あるいはＭＲＩまたはＣＴで使用可能なガドリニウムキレート化合物等の磁性造影剤で抗体を標識し得る。他の標識用作用物質としては、限定はされないが、９９Ｔｃ等の放射性同位体が挙げられる。別の実施形態では、抗ＩＧＦＲ１抗体を標識せずに、検出可能でありかつ抗ＩＧＦＲ１抗体に結合し得る２次抗体または他の分子を投与することによって画像化する。
【実施例】
【０１７４】
本発明をさらに説明するために以下の実施例を提供するが、本発明の範囲を限定するとは何ら解釈されない。
【０１７５】
（実施例１ 完全ヒト抗ＩＧＦＲ１抗体の構築）
（１．０ 序文）
Ｈｃｏ７遺伝子型のＨｕＭａｂマウス（下記参照）から、ヒト・インスリン様増殖因子受容体１（ＩＧＦＲ１）に特異的な完全ヒト・モノクローナル抗体を生成し、組み換え型ｓＩＧＦＲ１およびＩＧＦＲ１でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞で免疫化した。Ｈｃｏ７マウスの詳細な説明は、米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、第５，７７０，４２９号、第５，７８９，６５０号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９号、および第５，８７７，３９７号、ならびにＨａｒｄｉｎｇら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６に提供される。免疫化用抗原に対して抗原特異的な２５，６００力価の血清ＩｇＧの存在にもとづく融合のために選択したＨｕＭａｂマウス（本明細書中で、番号２３７１６と呼ばれる）から抗体１Ｈ３、抗体１５Ｈ１２、および抗体１９Ｄ１２を単離した。１Ｈ３抗体、１５Ｈ１２抗体、および１９Ｄ１２１抗体は、ＩＧＦＲ１に結合することが判明した。
【０１７６】
（２．０ 材料および方法および結果）
（２．１．抗原）
（２．１．１．）
２種類の形態の抗原、すなわち（１）生細胞（ＩＧＦＲ１でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞）および（２）精製タンパク質（ｓＩＧＦＲ１、α−サブユニットと、ＩＧＦＲ１のβ−サブユニットの細胞外ドメインとを包含するＮＳＯ発現組み換え型タンパク質）でマウスを免疫化した。このタンパク質の生物学的活性型は、グリコシル化形態である。
【０１７７】
（２．１．２．）
可溶性ＩＧＦＲ１抗原による３回の免疫化と、最終尾静脈免疫追加とを、濃度２．６７ｍｇ／ｍｌの精製ＩＧＦＲ１調製物を用いて実行した。可溶性ＩＧＦＲ１をフロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバント（ＣＦＡおよびＩＦＡ）のいずれかと混合し、マウス腹腔内に０．２ｃｃ（立方センチメートル）調製抗原を注入した。無菌ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）内の可溶性ＩＧＦＲ１で最終尾静脈免疫化を実行した。
【０１７８】
（２．１．３．）
ＩＧＦＲ１ ＤＮＡでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を用いた免疫化もまた、実行した。具体的には、ＩＧＦＲ１を発現する１．０〜２．０×１０７ＨＥＫ２９３細胞を含有する無菌食塩水０．２ｃｃを腹腔内に注入することによって、各マウスを免疫化した。
【０１７９】
（２．２．トランスジェニック・マウス）
（２．２．１．）
フィルタ・ケージ内でマウスを飼育し、免疫化時、採血時および融合を実行した日に良好な健康状態であることを評価した。
【０１８０】
（２．２．２．）
選択したハイブリドーマを産生したマウスは、（ＣＭＤ）＋＋、（Ｈｃｏ７）１１９５２＋、（ＪＫＤ）＋＋、（ＫＣｏ５）９２７２＋遺伝子型の雄（マウスＩＤ番号２３７１６）であった。個々の導入遺伝子の名称は、括弧内にあり、その後に、無作為に組み込んだ導入遺伝子に関する系統番号が続く。記号＋＋および＋は、ホモ接合性またはヘミ接合性であることを示す。しかし、慣用的に、無作為に組み込まれたヒトＩｇ導入遺伝子に対してはヘテロ接合性とホモ接合性との間の識別が不可能なＰＣＲにもとづくアッセイを用いてマウスをスクリーニングするので、＋名称を、これらのエレメントに対して実質的にホモ接合性のマウスとし得る。
【０１８１】
（２．３．免疫化手順および計画表）
（２．３．１．）
免疫化計画表を下記の表に示す。
【０１８２】
（表２ マウス免疫化計画表）
【０１８３】
【表２】
１力価情報を下記に示す。
２１３１日目に融合を実行した。
【０１８４】
（表３ 表２（上記参照）に記載するマウス２３７１６の免疫化期間中のＩＧＦＲ１特異的抗体の力価）
【０１８５】
【表３】
（２．４．ハイブリドーマ調製および試験）
（２．４．１．）
ＳＰ２／０−ＡＧ１４骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８１）を融合のために用いた。最初のＡＴＣＣバイアルを解凍して、培養で増殖させた。冷凍バイアルの種（ｓｅｅｄ ｓｔｏｃｋ）をこの増殖から調製した。６〜８週間、細胞を培養物中で維持して、１週間に２度移した。
【０１８６】
（２．４．２．）
１０％ＦＢＳ、抗生物質−抗真菌剤（１００×）、および０．１％Ｌ−グルタミンを含有する高グルコースＤＭＥＭを用いて、骨髄腫細胞を培養した。５％オリゲン・ハイブリドーマ・クローニング・ファクター（Ｏｒｉｇｅｎ−−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｓｕｗａｎｅｅ，ＧＡ）、４．５×１０−４Ｍピルビン酸ナトリウム、ＨＡＴ １．０×１０−４Ｍヒポキサンチン、４．０×１０−７Ｍアミノプテリン、１．６×１０−５ＭチミジンまたはＨＴ １．０×１０−４Ｍヒポキサチン、１．６×１０−５Ｍチミジン、および特性が明らかな胎児ウシ血清を含むハイブリドーマ増殖培地に追加の培地補充を加えた。
【０１８７】
（２．４．３．）
マウス番号２３７１６由来の脾臓は、大きさが正常であり、５．７３×１０８生細胞を産生した。
【０１８８】
（２．４．４．）
以下の手順にしたがって脾細胞を融合した。すなわち、
１．ＤＭＥＭ＋１０％ＰＢＳ約１０ｍｌを５０ｍＬ管に入れる。
【０１８９】
２．静脈内で追加免疫したマウスを屠殺する。
【０１９０】
３．そのマウスをペーパー・タオル上のフード中に移す。
【０１９１】
４．マウスをアルコールに浸して、その右側を上にして置く。
【０１９２】
５．脾臓領域の上方の皮膚を小さく切断する。
【０１９３】
６．両手を使ってマウスから皮膚を引き剥がす。
【０１９４】
７．アルコールに再び浸す。
【０１９５】
８．無菌器具を用いて、腹膜を開口する。
【０１９６】
９．鋏の先端を脾臓の下に挿入し、ピンセットで脾臓を掴む余地があるように鋏を広げる。
【０１９７】
１０．脾臓を取り出して、ＤＭＥＭ＋１０％ＰＢＳを含有する管に入れる。無菌組織培養室に移す。
【０１９８】
１１．無菌フード内部で、２つの無菌６０ｍｍ培養皿のそれぞれに、無血清のＤＭＥＭ約７ｍＬを添加する。
【０１９９】
１２．脾臓を第１の皿に移す。
【０２００】
１３．無菌器具を用いて、脾臓からいずれの付着物も除去する。
【０２０１】
１４．無菌ホモジナイザーの底部を試験管ラック（支持用）に置く。
【０２０２】
１５．浄化した脾臓をそのホモジナイザーに加える。
【０２０３】
１６．ＤＭＥＭ約５ｍＬを添加して、４回の操作で均質化する。無菌５０ｍＬ遠心管に注ぐ。
【０２０４】
１７．ホモジナイザーにＤＭＥＭをさらに５ないし６ｍｌ添加して、さらに３ないし４回追加の操作をする。
【０２０５】
１８．上記のように同管に注ぐ。
【０２０６】
１９．遠心機で、１０００ｒｐｍで１０分間細胞をスピンする。
【０２０７】
２０．上清を除去する。ペレットをＤＭＥＭに注いで再懸濁する。
【０２０８】
２１．脾臓細胞を計数する。
【０２０９】
２２．適当な容量のＳＰ２／０細胞（ＳＰ２／０細胞１個あたり６個の脾臓細胞）を５０ｍＬ遠心管に移す。容量を記録する。
【０２１０】
２３．遠心のために都合よく均衡させるために、ＤＭＥＭを用いて脾臓細胞の容量を調整する。
【０２１１】
２４．遠心機で、１０分間１０００ｒｐｍで細胞をスピンする。
【０２１２】
２５．上清を除去する。ＤＭＥＭ洗浄培地（無血清）３０〜４０ｍＬにペレットを注いで再懸濁する。全ての細胞を１つの管にまとめる。
【０２１３】
２６．上記のように再びスピンする。
【０２１４】
２７．上清を除去して、ペレットを再懸濁する。
【０２１５】
２８．３７℃水を含有するビーカー内で管を穏やかに旋回させながらＰＥＧ（ポリエチレングリコール）約１．２ｍＬを約１分目に添加する。
【０２１６】
２９．管を９０秒静置し、その後、３分目にＤＭＥＭ洗浄培地１５ｍＬを添加する。
【０２１７】
３０．上記のように管をスピンする。
【０２１８】
３１．上清を除去して、ペレットを穏やかに再懸濁する。
【０２１９】
３２．Ｈａｔ培地約１０ｍＬを管に添加する。
【０２２０】
３３．ＨＡＴ培地の全容量中に細胞をピペッティングする。播種前に、インキュベーター内で細胞を３０〜６０分間静置する。
【０２２１】
３４．２００μＬ／ウェル（９６ウェル・プレートあたり約１×１０７細胞）で、９６ウェル培養プレート中に細胞を播種する。
【０２２２】
３５．７日目に、２５０μｌ／ウェルでＨＴ培地（アミノプテリンを除いたＨＡＴ培地と同様のＨＴ培地）を細胞に供給する。
【０２２３】
（２．４．５．）
融合後７〜１０日目に、下記の手順にしたがってヒトＩｇＧκ抗体に対する最初のＥＬＩＳＡスクリーニングを実行した。すなわち、
１．５０μＬ／ウェルで、１×ＰＢＳ中の抗ｈｕ−κ（１μｇ／ｍＬ）または抗ｈｕ−γ（１μｇ／ｍＬ）でプレートを一晩被覆する。冷蔵庫内で保存する。
【０２２４】
２．プレートを空にして、１×ＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎを有するＰＢＳ）＋５％ニワトリ血清中でプレートを１時間室温で遮断する（１００μＬ／ウェル）。
【０２２５】
３．プレートを空にして、１×ＰＢＳＴを用いて、手動で洗浄ビンによって（３回）、またはプレート洗浄器によって（３回）洗浄する。洗浄ビンを用いる場合は、プレートをペーパー・タオル上で排水する。
【０２２６】
４．クローンの生産程度を試験するために標準を用いる。未知物を有する希釈を作製する（第１のウェル中で１：１０で希釈し、そしてプレート全体にわたって２倍で希釈する）。Ｈｕ−ＩｇＧ標準は、１０００ｎｇ／ｍＬで開始し、プレート全体にわたって２倍で希釈する。少数のウェルをブランク用に残しておく。すなわち、１００μＬ／ウェルで、希釈用に用いた１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清。室温で１時間インキュベートする。遮断用緩衝液で１：２に希釈して、融合スクリーニングおよびサブクローニングを一般的に試験する。融合およびサブクローニングをスクリーニングする際、陽性対照もまた用い得る。
【０２２７】
５．洗浄ステップ３を繰り返す。
【０２２８】
６．２次抗体ＨＲＰ（ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ）−抗ｈｕＩｇＧ−Ｆｃ試薬またはＨＲＰ−抗ｈｕ−κを、１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清中で、１：５０００で希釈する。１００μＬ／ウェルで添加する。室温で１時間インキュベートする。
【０２２９】
７．洗浄ステップ３を繰り返す（２回）。
【０２３０】
８．プレート毎に１０ｍｌクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、８０μＬ ＡＢＴＳ、８μＬ Ｈ２Ｏ２を用いて、プレートを展開する。
【０２３１】
９．室温で３０分〜１時間インキュベートする。ＯＤ４１５ｎｍ〜４９０ｎｍでプレートを読み取る。
【０２３２】
（溶液）
１×ＰＢＳＴ＝１×ＰＢＳ＋０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０
クエン酸リン酸緩衝液＝２１ｇｍ／Ｌクエン酸、１４．２ｇｍ／Ｌリン酸水素二ナトリウム（無水）（ｐＨ４．０）
ＡＢＴＳ＝クエン酸緩衝液中２７．８ｍｇ／ｍＬ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チオゾリン−６−スルホン酸）ニアンモニウム塩、１ｍＬアリコートを冷凍。
【０２３３】
プレート＝９６ウェル・アッセイ・プレート
ハイブリドーマ１Ｈ３、１５Ｈ１２、および１９Ｄ１２に対応するウェル中で、陽性ＥＬＩＳＡシグナルを検出し、これらのハイブリドーマがヒトＩｇＧ抗体を産生することが実証された。
【０２３４】
（２．４．６．）
その後、以下の手順にしたがって、ヒトＩｇＧκ陽性ウェルに対応するハイブリドーマ上清を可溶性ＩＧＦＲ１被覆ＥＬＩＳＡプレート上でスクリーニングした。すなわち、
１．５０μＬ／ウェルで、１×ＰＢＳ中のＩＧＦＲ１（１．０μｇ／ｍＬ）でプレートを一晩被覆する。冷蔵庫で保存する。プレートを被覆するためには５ミリリットルが必要である。
【０２３５】
２．プレートを空にして、１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清中でプレートを１時間室温で遮断する（１００μＬ／ウェル）。
【０２３６】
３．プレートを空にして、１×ＰＢＳＴを用いて、手動で洗浄ビンによって（３回）、またはプレート洗浄器によって（３回）洗浄する。洗浄ビンを用いる場合は、プレートをペーパー・タオル上で排水する。
【０２３７】
４．遮断用緩衝液を希釈剤として用いる。プレートの最上列で１：５０希釈率で始めて血清を試験し、プレートの列を下がるごとに２倍で希釈する（７回）。室温で１時間インキュベートする。サブクローン・スクリーニングのために、遮断用緩衝液中の１：１希釈の培養上清を出発物質として用いる。
【０２３８】
５．洗浄ステップ３を繰り返す。
【０２３９】
６．１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清中で、２次ＨＲＰ−抗ｈｕ ＩｇＧ−Ｆｃ特異的試薬および／またはＨＲＰ−抗ｈｕ−κ試薬を１：２５００〜５０００で希釈し、１００μＬ／ウェルで添加する。室温で１時間インキュベートする。
【０２４０】
７．洗浄ステップ３を繰り返す（２回）。
【０２４１】
８．プレート毎に１０ｍＬクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、８０μＬ ＡＢＴＳ、８μＬ Ｈ２Ｏ２を用いて、プレートを展開する。
【０２４２】
９．室温で３０分〜１時間インキュベートする。ＯＤ４１５ｎｍ−４９０ｎｍでプレートを読み取る。バックグラウンド力価限度にわたって２回検討する。
【０２４３】
これらのアッセイで、ハイブリドーマ１５Ｈ１２および１９Ｄ１２は、陽性ＥＬＩＳＡシグナルを産生した。これらのデータによって、そのハイブリドーマが、可溶性ＩＧＦＲ１に結合することができる抗体を産生することが実証される。
【０２４４】
その後、抗原陽性ハイブリドーマを２４ウェルプレートに移し、最終的には組織培養フラスコに移した。ＩＧＦＲ１特異的ハイブリドーマを限界希釈法によってサブクローニングして、単クローン性を確認した。オリゲン（Ｏｒｉｇｅｎ）ＤＭＳＯ冷凍培地（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｓｕｗａｎｅｅ，ＧＡ）中で細胞を冷凍することによって、展開過程の複数の段階で抗原陽性ハイブリドーマを保存した。
【０２４５】
（２．４．７．）
以下の手順にしたがって抗体アイソタイプを測定した。すなわち：
１．５０μＬ／ウェルで、１×ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬ可溶性ＩＧＦＲ１でプレートを一晩冷蔵庫内で被覆する。プレートを空にする。
【０２４６】
２．室温で１時間、１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清を添加する（１００μＬ／ウェル）。プレートを空にする。
【０２４７】
３．ブロッキング緩衝液を希釈剤として用い、試験すべき上清または精製物質を、試験すべき２次抗体（５０μＬ／ウェル）あたり１ウェルで添加する。室温で９０分間インキュベートする。プレートを空にする。
【０２４８】
４．プレートを空にして、１×ＰＢＳＴを用いて、手動で洗浄ビンによって（３回）、またはプレート洗浄器によって（３回）洗浄する。洗浄ビンを用いる場合は、プレートをペーパータオル上で排水する。
【０２４９】
５．ブロッキング緩衝液を希釈剤として用い、１：１０００で希釈した２次抗体、すなわち：
ＨＲＰ−抗ｈｕ−γ、
ＨＲＰ−抗ｈｕ−κ、
ＨＲＰ−抗ヒトＩｇＧＩ、または
ＨＲＰ−抗ヒトＩｇＧ３
を添加する。室温で４５分間インキュベートする。プレートを空にする。
【０２５０】
６．洗浄ステップ４を繰り返す（３回）
７．プレート毎に１０ｍＬクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、８０μＬ ＡＢＴＳ、８μＬ Ｈ２Ｏ２を用いて、プレートを展開する。
【０２５１】
８．室温で３０分〜１時間インキュベートする。ＯＤ４１５ｎｍ−４９０ｎｍでプレートを読み取る。
【０２５２】
これらのアッセイから得たデータを下記に表４で示す。
【０２５３】
（表４ アイソタイプＥＬＩＳＡ結果＊）
【０２５４】
【表４】
＊各数値は、各２次抗体に関して観察されたＥＬＩＳＡシグナルの大きさ（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）を表す。
【０２５５】
これらのデータによって、抗体１５Ｈ１２がＩｇＧ３κ抗体であることが実証される。
【０２５６】
(２．４．８)
固定化細胞ＥＬＩＳＡアッセイで、ＩＧＦＲ１を発現する細胞に直接結合する能力に関して、ハイブリドーマ上清（１Ｈ３、１５Ｈ１２、および１９Ｄ１２）ならびにＭＡＢ３９１も試験した。そのアッセイでは、ＩＧＦＲ１ ＤＮＡでトランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞またはＨＥＫ２９３細胞を用いた。アッセイを以下のように実行した。すなわち：
１．９６ウェルプレートの各ウェルに、１×ＰＢＳ中の２０μｇ／ｍＬポリ−Ｌ−リジン溶液を５０μｇ／ウェルで添加し、室温で３０分間または４℃で一晩インキュベートする。プレートを空にして、ウェルからポリ−Ｌ−リジンを除去し、使用するまで室温で乾燥させる。
【０２５７】
２．遠心（１０００ＲＰＭ／５分）によって、１×ＰＢＳを用いて生細胞を３回洗浄する。１×ＰＢＳ中で、最終細胞濃度をウェルあたり２×１０６細胞に調整する。この細胞懸濁液をウェルあたり５０μＬ添加する。
【０２５８】
３．細胞を５分間２０００ＲＰＭでスピンする。緩衝液を破棄する。
【０２５９】
４．１×ＰＢＳ中の０．５％氷冷グルタルアルデヒドを５０μＬ／ウェルで添加する。室温で１５分間静置する。プレートを空にする。
【０２６０】
５．１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清を添加して、室温で１時間インキュベートする（１００μＬ／ウェル）。プレートを空にする。
【０２６１】
６．１×ＰＢＳＴを用いてプレートを穏やかに洗浄する（２回）。細胞の損失を避けるために、任意のプレート洗浄器は避けて容器内で、このステップを手動でおこなうべきである。
【０２６２】
７．ブロッキング緩衝液を希釈剤として用いて、１：１希釈の１００μｇを添加することによって培養上清を試験する。室温で１時間インキュベートする。
【０２６３】
８．ステップ６を繰り返す（３回）。
【０２６４】
９．１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清で２次ＨＲＰ−抗ｈｕ ＩｇＧ−Ｆｃ特異的試薬および／またはＨＲＰ−抗ｈｕ−κ試薬を１：２５００〜５０００に希釈し、１００μＬ／ウェルで添加する。室温で１時間インキュベートする。
【０２６５】
１０．ステップ６を繰り返す（３回）
１１．プレート毎に１０ｍｌクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、８０μＬ ＡＢＴＳ、８μＬ Ｈ２Ｏ２を用いて、プレートを展開する。
【０２６６】
１２．室温で１５分〜２０分インキュベートする。ＯＤ４１５ｎｍ−４９０ｎｍでプレートを読み取る。
【０２６７】
これらのアッセイから得た結果によって、ハイブリドーマ１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２が、ＩＧＦＲ１を発現するＨＥＫ２９３細胞に結合する免疫グロブリンを産生することならびに、ハイブリドーマ１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２が、内因性ＩＧＦＲ１を発現するＭＣＦ−７細胞に結合する免疫グロブリンを産生することとが実証された。さらに、この結果によって、ＩＧＦＲ１発現ＨＥＫ２９３細胞に、かつＭＣＦ−７細胞にＭＡＢ３９１が結合することが実証された。
【０２６８】
（２．４．９．）
１）ＩＧＦＲ１発現ＨＥＫ２９３細胞上およびＭＣＦ７細胞上の上清の染色強度ならびに、２）ＩＧＦＲ１発現細胞へのＩＧＦ１−ビオチンの結合を阻害する上清の能力とを測定することによって、ハイブリドーマ上清（１Ｈ３、１５Ｈ１２、および１９Ｄ１２）のＩＧＦＲ１に対するＩＧＦ１の結合を阻害する能力を評価した。最初に、本発明の抗体によるＩＧＦ１のその受容体への結合の阻害を評価するための適切な濃度を確立するために、ＩＧＦＲ１発現ＨＥＫ２９３細胞上でビオチン標識ＩＧＦ１を滴定した。以下の手順によってこれをおこなった。すなわち：
１．フラスコを叩いて円錐管にピペッティングした細胞をほぐすことによって、ＩＧＦＲ１発現ＨＥＫ２９３細胞をフラスコから回収する。その後、その細胞を３００×ｇで５分間遠心して、細胞をペレット化する。その後、培地を吸引する。
【０２６９】
２．０．０２％ アジ化ナトリウムを含有する１０〜２０ｍＬＰＢＳで、細胞を洗浄し、約２．５×１０６細胞／ｍＬ（±１０６細胞）で、同緩衝液中で再懸濁する。４℃で、同緩衝液中で、９６ウェルマイクロタイタープレート中に細胞を２００μＬ／ウェルでアリコートする。細胞をペレット化し、上清を吸引する。
【０２７０】
３．同緩衝液中で、５０μＬ／ウェルの連続希釈したＩＧＦ１−ビオチンを添加することによって、細胞を染色する。１：５希釈で開始して、その後４倍連続希釈する。プレートを軽く叩くか、または穏やかにボルテックスして、細胞の均一な懸濁液が懸濁されていることを確実する。その後、細胞を４℃で３０分間インキュベートする。
【０２７１】
４．最初の洗浄のために１５０μＬ緩衝液を添加することによって、細胞を３回洗浄し、その後ペレット化する。上清を吸引して、２００μＬ緩衝液を添加する。再び、細胞をペレット化して、上清を吸引する。この洗浄ステップをさらにもう１度繰り返す。ストレプトアビジン−ＰＥ（ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン）を添加して、細胞を４℃で３０分間インキュベートする。
【０２７２】
５．２％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化物を含有するＰＢＳで、細胞を１回洗浄し、５０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムも含有する以外は同じ緩衝液で再懸濁し、死細胞を除外する。
【０２７３】
６．細胞をＦＡＣＳによって分析する。
【０２７４】
ブロッキングアッセイを以下のように実行した。すなわち、
１．フラスコ側面を叩いて細胞をほぐすことによって、組織培養フラスコからＭＣＦ７細胞またはＨＥＫ２９３／ＩＧＦＲ１細胞を回収する。細胞を円錐管にピペッティングする。その管を３００×ｇで５分間遠心して、細胞をペレット化する。培地を吸引する。
【０２７５】
２．２％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＰＦＡ）１０〜２０ｍＬで、細胞を洗浄し、約２．５×１０６（±１×１０６）で、同緩衝液中で再懸濁する。４℃で、同緩衝液中で、９６ウェルマイクロタイタープレート中に２００μＬ／ウェルでアリコートする。細胞をペレット化し、緩衝液を吸引する。
【０２７６】
３．培地（陰性）対照および陽性対照としてのＭＡＢ３９１を含む１００μＬ／ウェルを添加することによって、各ＩＧＦＲ１ハイブリドーマ上清で細胞を染色する。プレートを軽く叩いて、細胞の均一な懸濁を確実にする。４℃で３０〜６０分間インキュベートする。
【０２７７】
４．最初の洗浄のために１００μＬ緩衝液を添加することによって、ＰＦＡ中で細胞を３回洗浄し、ペレット化および吸引をして、２００μＬ緩衝液中で再懸濁し、ペレット化および吸引をして、２００μＬ緩衝液中で再び再懸濁し、各試料を２つのウェルに分けてペレット化する。
【０２７８】
５．ウェルの１セットに、上清染色試料および培地対照に対してＰＦＡ（パラ−ホルムアルデヒド）で１：１００で希釈した抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣを添加し、ＭＡＢ３９１染色試料に対して１：２００希釈の抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣを添加し、再び、細胞の均一な分散を確実にする（染色アッセイ）。４℃で３０分間インキュベートする。
【０２７９】
６．ウェルの第２のセットに、０．０２％アジ化物を含有するＰＢＳ（ＦＢＳなし）で１：５００で希釈したＩＧＦ１−ビオチンを添加し、４℃で３０分間インキュベートする。ステップ４に記載するように（ただし、試料の分割はせずに）、細胞を３回洗浄する。ＰＦＡ中でストレプトアビジン−ＰＥ（ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン）を添加することによって、これらの細胞を染色する（ブロッキングアッセイ）。４℃で３０分間インキュベートする。
【０２８０】
７．ＰＦＡで全ての試料を１回洗浄し、５０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムも含有する以外は同じ緩衝液中で再懸濁して、死細胞を除外する。
【０２８１】
８．ＦＡＣＳ分析によって分析する。
【０２８２】
これらのブロッキングアッセイから得た結果によって、ハイブリドーマ１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２由来の上清が、ビオチン標識ＩＧＦ１のＩＧＦＲ１への結合を阻害し、内因性ＩＧＦＲ１を発現するＭＣＦ７細胞を染色し、かつＩＧＦＲ１を発現するＨＥＫ２９３細胞を染色することが実証された。
【０２８３】
（２．４．１０）
以下の手順にしたがって、ＩＧＦＲ１へのビオチン標識ＩＧＦ１の結合を阻害する精製抗体１Ｈ３および１５Ｈ１２の能力をＥＬＩＳＡアッセイで評価するとともに、ＩＧＦＲ１へのビオチン標識ＭＡＢ３９１の結合を阻害する抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２の能力もＥＬＩＳＡアッセイで評価した。
【０２８４】
１．５０μＬ／ウェルの１×ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬ可溶性ＩＧＦＲ１でプレートを一晩冷蔵庫内で被覆する。
【０２８５】
２．室温で１時間、１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清を添加する（１００μＬ／ウェル）。プレートを空にする。
【０２８６】
３．洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを３回洗浄する。プレートを叩いて乾燥させる。
【０２８７】
４．プレート全体にわたって、２μｇ／ｍＬ １Ｈ３、１５Ｈ１２または１９Ｄ１２あるいは陽性または陰性対照抗体をブロッキング緩衝液中で希釈する。プレートを室温で１時間インキュベートする。
【０２８８】
５．洗浄緩衝液中でプレートを３回洗浄する。
【０２８９】
６．ビオチン−ＩＧＦ１またはビオチン−ＭＡＢ３９１を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で３０分間インキュベートする。
【０２９０】
７．プレートを３回洗浄する。
【０２９１】
８．ストレプトアビジン標識アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で３０分間インキュベートする。
【０２９２】
９．プレートを３回洗浄する。使用する標識に応じた適当な試薬で展開する。
【０２９３】
１０．１０〜１５分後に読み取る。
以下の手順にしたがって、ＭＡＢ３９１をビオチン標識した。すなわち、
１．ＰＢＳ緩衝液中でＭＡＢ３９１を調製する（透析または脱塩カラムを用いて、Ｔｒｉｓまたはグリシン等の不要な緩衝液を除去する）。
【０２９４】
２．スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン溶液の新たなストック溶液を使用直前に調製する。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン２．０ｍｇを２００ｍＬ蒸留水に添加する。ＭＡＢ３９１の１０ｍｇ／ｍＬで作業する場合は１２倍過剰モルで、またはＭＡＢ３９１（２ｍｇ／ｍＬ）の希釈調製物で作業する際は２０倍過剰モルで、この試薬をＭＡＢ３９１に添加する。
【０２９５】
３．計算：ミリモルＭＡＢ３９１＝ｍｇタンパク質／１５０，０００ミリモル×１２または２０＝添加するミリモルビオチン試薬
添加するミリモルビオチン×５５６＝添加するｍｇビオチン試薬
１ｍｇ／ｍＬについて：
１／１５００００＝６．６×１０−６
２０×６．６×１０−６ミリモル＝１／３２×１０−４ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン
１．３２×１０−４×５５６＝０．０７３ｍｇスルホＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン
ストックＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン溶液から、１または２ｍｇに対するｍｇＩｇＧあたり１０μＬ（１００μｇ）の溶液を用いる。
【０２９６】
４．氷上で２時間または室温で３０分間インキュベートする。ＰＢＳに対して透析するか、または脱塩カラムを用いて、未反応のビオチン試薬を除去する。ＰＢＳ ０．１％アジ化ナトリウム中で、４℃で保存する。一般に、標識した各ＩｇＧ分子に３〜５個のビオチンを添加すべきである。
【０２９７】
これらのブロッキングアッセイから得た結果によって、抗体１Ｈ３および１５Ｈ１２が、ｓＩＧＦＲ１へのビオチン標識ＩＧＦ１の結合を遮断することと、抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２が、ｓＩＧＦＲ１へのビオチン標識ＭＡＢ３９１の結合をブロッキングすることとが実証された。
【０２９８】
（２．４．１１．）
以下の手順にしたがって、ＩＧＦＲ１と１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２抗体との間の結合をビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）／表面プラズモン共鳴アッセイで評価した。すなわち：
１．アミンカップリング法によって、フローセル上で３５０．４応答単位のレベルに、ＩＧＦＲ１をＣＭ−５チップ上で固定化する。固定化に用いるＩＧＦＲ１の濃度は、酢酸ナトリウム緩衝液中で２．５μｇ／ｍＬであり、タンパク質をｐＨ３．５で固定化する。
【０２９９】
２．プロテインＡまたはプロテインＧカラム上でハイブリドーマ上清から抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって純度に関して試験する（４％〜１２％Ｔｒｉｓ−グリシン）。
【０３００】
３．上記で調製したＩＧＦＲ１表面にわたって抗体を流れさせる。
【０３０１】
４．用いる抗体の濃度範囲は、４、２、１、０．５および０．２５μｇ／ｍＬである。バックグラウンド置換のためにブランクも用いる。試料をＨＢＳ緩衝液中で調製する。
【０３０２】
５．注入時間（結合相）は、流速２０μＬ／分で１０分間であり、解離時間（解離相）は、同じ流速で１時間である。
【０３０３】
６．２５℃および３７℃両方でアッセイを実行する。全ての実験を二連でおこなう。
【０３０４】
７．ビア−エバリュエーション（Ｂｉａ−Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）ソフトウェアｖ．３．０．２（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、データ分析を実行する。
【０３０５】
８．ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）３０００表面プラズモン共鳴機器（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、全ての実験を実行する。
【０３０６】
これらのアッセイの結果によって、抗体１５Ｈ１２および１９Ｄ１２が２５℃および３７℃でＩＧＦＲ１と結合することと、抗体１Ｈ３が２５℃でＩＧＦＲ１と結合することとが実証された。これらの実験から得たデータを用いて、ＩＧＦＲ１に結合する１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２の親和性および速度定数も計算した（下記、表５参照を参照のこと）。
【０３０７】
（表５ ＩＧＦＲ１との抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２の親和性および速度定数）
【０３０８】
【表５】
＃半減期として計算＝ｌｎ（２／ｋｏｆｆ）
【０３０９】
（実施例２ 細胞にもとづく受容体結合アッセイ）
細胞にもとづく受容体結合アッセイを用いて、ＩＧＦＲ１への結合に対して抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２がＩＧＦ１と競合するか否かについて測定した。
【０３１０】
このアッセイでは、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳを用いて９６ウェルフィルタプレート（１．２μｍ孔）を４℃で２時間予め湿らせた。その後、緩衝液を真空マニホルドで除去した。種々の濃度の６×対照または試験抗体（１Ｈ３、１５Ｈ１２または１９Ｄ１２）をウェルに添加した（２５μＬ）。その後、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−１リガンドをＢＳＡ／ＰＢＳ中での最終濃度０．３７５ｎＭでウェルに添加した。細胞解離溶液を用いて、細胞を回収し、トリパンブルーで計数し、細胞数１〜３×１０５／ｍｌに０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで再懸濁した。１００μｌの細胞（１０，０００〜３０，０００個）を各ウェルに添加した。プレートを４℃で１時間振盪した。その後、プレートを吸引して、真空マニホルドを用いて、氷冷ＰＢＳによって３回洗浄した。フィルタに孔をあけて、ガンマ線計数器で計数した。競合結合に関してデータを分析した。
これらの実験の結果によって、ＩＧＦＲ１への結合に対して１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２がＩＧＦ−Ｉと競合できることが示された。
【０３１１】
（実施例３：ＩＧＦＲ１自己リン酸化アッセイ）
ＩＧＦＲ１自己リン酸化を阻害する１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２の能力も測定した。
【０３１２】
抗体（１Ｈ３、１５Ｈ１２または１９Ｄ１２）を、ＩＧＦＲ１を保持する細胞に種々の時間長で添加した。その後、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−Ｉで細胞を３７℃で５分間刺激した。０．１ｍＭバナジン酸ナトリウムを含有する冷ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％トリトン×−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤および２ｍＭバナジン酸ナトリウム）中で溶解した。溶解物を氷上で３０分間インキュベートし、その後４℃で１０分間１３，０００ＲＰＭで遠心した。クーマシー比色定量アッセイによって溶解物のタンパク質濃度を測定し、免疫沈降法およびウエスタンブロット法をおこなった。
【０３１３】
これらのアッセイの結果によって、抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２が０．１０ｎＭのＩＣ５０でＩＧＦＲ１自己リン酸化を阻害することが示された。
【０３１４】
（実施例４ 足場非依存性増殖（軟寒天）アッセイ）
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７、ヒト結腸直腸癌細胞ＨＴ２９、およびヒト前立腺癌細胞ＤＵ１４５を含む種々の細胞の足場非依存性増殖を阻害する抗ＩＧＦＲ１抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２、１９Ｄ１２、およびＭＡＢ３９１の能力を評価した。
【０３１５】
これらの実験では、完全ＭＥＭ培地中の０．６％アガロース３ミリリットルを６ウェル組織培養プレート中の各ウェルに添加し、固体化させた（下層）。抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２、１９Ｄ１２、またはＭＡＢ３９１（上記に論じた）の１００マイクロリットルを様々な濃度で培養管に添加した。細胞を回収した。細胞のアリコート（１５，０００個の細胞）を、抗体を含有する培養管に添加し、室温で１０ないし１５分間インキュベートした。０．３５％アガロース／完全最小必須培地（ＭＥＭ）層（上層）の３ミリリットルを抗体／細胞混合物に添加して、その後、固体化下層にプレートした。上層を固体化させた。その後、プレートを３週間インキュベートした。ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−臭化テトラゾリウム）をウェルに添加して、１ないし２時間インキュベートした。プレートを走査して、カスタマイズしたコロニー計数器適用プログラムを用いてコロニーを計数および分析した。
【０３１６】
これらの実験の結果によって、抗ＩＧＦＲ１抗体が試験した３種類の悪性細胞株全ての足場非依存性増殖を阻害することができることが実証された。
【０３１７】
（実施例５ ハイブリドーマ由来抗体の可変領域のクローニング）
以下の手順にしたがって、１Ｈ３、１５Ｈ１２、および１９Ｄ１２可変領域をコードする核酸をハイブリドーマから得た。
【０３１８】
マイクロ−ファースト・トラック（Ｍｉｃｒｏ−Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、２×１０６ハイブリドーマ細胞由来のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製した。「ｃＤＮＡサイクル（ｃＤＮＡ Ｃｙｃｌｅ）」キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に記載される手順にしたがって、その可変領域をコードする細胞ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製した。
【０３１９】
５’ＲＡＣＥ（Ｃｌｏｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）技術を利用して、ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて抗体可変領域をＰＣＲ増幅した。以下の３’プライマー配列を用いて、重鎖を増幅した。すなわち、５’−ＴＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧ−３’（配列番号２２）である。以下の３’プライマー配列を用いて軽鎖を増幅した。すなわち、５’−ＣＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号２３）である。さらに、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲプライマー（Ｃｌｏｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を各増幅で用いた。
【０３２０】
ＰＣＲ反応混合物には、適当な緩衝液中のＰｆｕ Ｉポリメラーゼの２．５単位（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｏｌａ，ＣＡ）、各ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、各５’および３’プライマー７５０ｎＭ、およびｃＤＮＡテンプレートを含めた。全反応容量は、５０μｌであった。サーモサイクラーを用いて、以下のＰＣＲサイクル・プログラムを実行した。すなわち、
１× ９４℃、２分 １０× ９４℃、４５秒
６５℃、４５秒。サイクルごとに−１℃
７２℃、１分、
２５× ９４℃、４５秒
５５℃、４５秒
７２℃、１分
１× ７２℃、１５分
である。
【０３２１】
得られたＰＣＲ増幅産物をゼロ・ブラント・トポ（Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ）ＰＣＲクローニング・ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に挿入した。制限酵素分析によって挿入断片の同一性を検証し、その後、シーケンシングによって挿入のヌクレオチド配列を得た。
【０３２２】
（実施例６ 抗体鎖の組み換え的発現）
この実験では、本発明の種々の抗ＩＧＦＲ１抗体鎖をコードする核酸を用いて、ｄｈｆｒ−哺乳動物細胞株（ＣＨＯ−ＤＸＢ１１）をトランスフェクションし、その中でその鎖を発現させた。下記に列記するプラスミド１ないし１１から選択される１個の重鎖（γ１またはγ４）および１個の軽鎖（κ）プラスミドの種々の組み合わせで細胞株の共トランスフェクションによって一時的なトランスフェクションを実行した。下記に列記する単一のプラスミド１２または１３のいずれかによるトランスフェクションによって安定細胞株の構築を以下のように実行した。すなわち、核酸を単一のプラスミド内に配置し、作用自在にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに結合させた。プラスミドは、プラスミド増幅のために用いられるマウス乳癌ウイルス長末端配列（ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ））に作用自在に結合するＤＨＦＲ ｃＤＮＡも含有していた。プラスミドは、哺乳動物細胞内での選択のためのＴＫプロモーターに作用自在に結合するハイグロマイシンＢ遺伝子をさらに含んだ。
【０３２３】
下記に、構築した１３種類のプラスミド内のプロモーター発現カセットを記載する。ブダペスト条約のもと、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ；Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に＿＿＿＿＿＿で、表示した名称および登録番号の下で、表示したプラスミド（２ないし４および８ないし１１）を寄託した。すなわち、
（１）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣ（γ４）
挿入配列：配列番号３、
（２）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ４）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ４）」
ＡＴＣＣ登録番号：
挿入配列：配列番号４４
（３）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢ（γ４）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢ（γ４）」
ＡＴＣＣ登録番号：
挿入配列：配列番号１１１
（４）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ１）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ１）」
ＡＴＣＣ登録番号：
挿入配列：配列番号４４
（５）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣ（κ）
挿入配列：配列番号１
（６）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ（κ）
挿入配列：配列番号４０
（７）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＢ（κ）
挿入配列：配列番号４２
（８）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ（κ）」
ＡＴＣＣ登録番号：
挿入配列：配列番号７１
（９）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＤ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＤ（κ）」
ＡＴＣＣ登録番号：
挿入配列：配列番号７３
（１０）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ（κ）」
ＡＴＣＣ登録番号：
挿入配列：配列番号７５
（１１）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ（κ）」
ＡＴＣＣ登録番号：
挿入配列：配列番号７７
（１２）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣ（γ４）およびＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣ（κ）
（１３）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ１）およびＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣ（κ）
ＡＴＣＣに寄託したプラスミドへのアクセス制限の全ては特許の付与により解除される。
【０３２４】
各カセットの３’末端をβ−グロブリン・ポリＡシグナルに結合させた。発現させた可変鎖を括弧内で示した定常領域（すなわち、γ１、γ４、またはκ）に結合させた。各プラスミドを含有するトランスフェクションした細胞株の分析によって、対応する抗体鎖ポリペプチドが発現する（発現産物のアミノ酸配列は確認せず）ことが示された。
【０３２５】
上記に参照したプラスミドのそれぞれは、本発明の部分を構成する。さらに、各発現カセット内に位置する核酸は、その中の免疫グロブリン可変領域とともに、その成熟プロセッシング型（すなわち、シグナル配列を持たない）とともに、特に配列番号４４の成熟ＨＣＡ（配列番号４４のヌクレオチド５８ないし４１１）、配列番号１１１の成熟ＨＣＢ（配列番号１１１のヌクレオチド５８ないし４１１）、配列番号７１の成熟ＬＣＣ（配列番号７１のヌクレオチド５８ないし３８４）、配列番号７３の成熟ＬＣＤ（配列番号７３のヌクレオチド５８ないし３８４）、配列番号７５の成熟ＬＣＥ（配列番号７５のヌクレオチド５８ないし３８４）、配列番号７７すなわち成熟ＬＣＦ（配列番号７７のヌクレオチド５８ないし３８４）とともに、任意の前述の核酸にコードされる任意のポリペプチドとともに免疫グロブリン定常領域を任意で含み、成熟または非プロセッシング鎖を含み、免疫グロブリン定常領域を任意で含み、本発明の一部である。さらに、コードされたポリペプチドの１つを含む、それらの任意の抗体または抗原結合フラグメントは、本発明の一部である。
【０３２６】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態による範囲に限定されない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な変更は、前述の記載および添付図面から当業者には自明であるだろう。そのような変更は、添付の請求項の記載の範囲内にあることが意図される。
【０３２７】
特許、特許明細書、ジーンバンク登録番号、および刊行物がこの明細書全体を通して引用されている。それらの開示の全体を参考として本明細書で援用する。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願６０／３８３，４５９号（２００２年５月２４日出願）、米国仮出願６０／３９３，２１４号（２００２年７月２日出願）、および米国仮出願６０／４３６，２５４号（２００２年１２月２３日出願）の優先権を主張するもので、上記出願のそれぞれの全体を本明細書では援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、完全ヒトモノクローナル抗インスリン様増殖因子受容体−Ｉ（ＩＧＦＲ１）抗体と、該抗体の使用方法および該抗体の生産方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ソマトメジンとしても知られるインスリン様増殖因子は、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびインスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）を含む（非特許文献１、および非特許文献２）。これらの増殖因子は、インスリン様増殖因子受容体−１（ＩＧＦＲ１）と命名される共通の受容体に結合する（非特許文献３）ことによって、腫瘍細胞を含む種々の細胞型にマイトジェン活性を作用させる（非特許文献４）。ＩＧＦＲ１とＩＧＦとの相互作用によって、チロシン残基上の該受容体の自己リン酸化を誘引してこの受容体が活性化される（非特許文献５）。活性化されると、今度は、ＩＧＦＲ１が細胞内標的をリン酸化して、細胞シグナル伝達経路を活性化させる。この受容体活性化は、腫瘍細胞の増殖および生存の刺激にとって不可欠である。したがって、ＩＧＦＲ１活性の阻害は、ヒト癌および他の増殖性疾患の増殖を処置または予防する有用な潜在的方法を表す。
【０００４】
様々な系列の証拠は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、およびそれらの受容体ＩＧＦＲ１が悪性の表現型の重要な媒介物質であることを示している。ＩＦＧ−Ｉの血漿レベルが前立腺癌の危険性を最も強力に予測する判断材料であることが判明（非特許文献６）しており、同様の疫学研究は、乳癌、結腸癌、および肺癌の危険性と血漿ＩＧＦ−Ｉレベルを強く関連付けている。
【０００５】
インスリン様増殖因子受容体−Ｉの過剰発現がいくつかの癌細胞株および腫瘍組織で証明されている。ＩＧＦＲ１は、全ての乳癌細胞株の４０％で過剰発現し（非特許文献７）、肺癌細胞株の１５％で過剰発現する。乳癌腫瘍組織では、ＩＧＦＲ１は、６〜１４倍過剰発現し、ＩＧＦＲ１は、正常組織と比べて２〜４倍高いキナーゼ活性を示す（非特許文献８、および非特許文献９）。９０％の結腸直腸癌組織生検は、増加したＩＧＦＲ１レベルを示し、この際、ＩＧＦＲ１発現の程度は、疾患の重症度に相関している。子宮頸癌細胞の初代培養および子宮頸癌細胞株の分析によって、正常子宮頸部細胞と比べて、それぞれ３倍および５倍のＩＧＦＲ１過剰発現が明らかになった（非特許文献１０）。滑膜肉腫細胞でのＩＧＦＲ１の発現も侵襲性の強い表現型（すなわち、転移および高増殖率；非特許文献１１）と相関していた。徐々に進展する疾患である先端巨大症は、成長ホルモンおよびＩＧＦ−Ｉの分泌過多が原因である（非特許文献１２）。ＩＧＦＲ１機能の拮抗作用がこの疾患を処置する際有用である。当該技術分野で公知の抗体が複数あり、ＩＧＦＲ１の活性を示す。しかし、治療上の有用性は比較的低い。例えば、α−ＩＲ３（非特許文献１３）、１Ｈ７（非特許文献１４、および非特許文献１５）、およびＭＡＢ３９１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）は、マウスモノクローナル抗体であり、ＩＧＦＲ１と相互作用し、その活性を示す。これらは、マウス抗体であるので、ヒトでのその治療上の有用性は限られている。免疫応答性ヒト被験体に一服のマウス抗体を投与すると、該被験体は、マウス免疫グロブリン配列に対する抗体を産生する。これらのヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）は、治療用抗体を中和し、急性毒性（すなわち、ＨＡＭＡ応答）を誘導する可能性がある。
ＨＡＭＡ応答を回避するための一方法は、いずれの外来（例えば、マウス）アミノ酸配列も持たない完全ヒト抗体の使用を介する。完全ヒト抗体の使用は、治療用抗体のヒト宿主免疫拒絶反応を低減および予防するためには有効な方法であるが、完全ヒト抗体の拒絶反応が生じうる。ヒト抗体の人体拒絶反応は、ヒト抗ヒト抗体応答（ＨＡＨＡ応答）と呼ばれる。ＨＡＨＡ応答は、完全ヒト抗体中の極めて少ない低発生アミノ酸配列の存在等の因子により媒介されうる。この理由のため、治療用抗体も、非免疫原性ヒト抗体フレームワーク配列の内包または弱免疫原性ヒト抗体フレームワーク配列のみの内包によって最適化されうる。好ましくは、該配列は、多くの場合、他のヒト抗体内で生じる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｌａｐｐｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９８３）１１２：ｐ２２１５
【非特許文献２】Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔら、Ｆｅｂｓ．Ｌｅｔｔ．（１９７８）８９：ｐ２８３
【非特許文献３】Ｓｅｐｐ−Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（１９９８）４７：ｐ２３５
【非特許文献４】Ｍａｃａｕｌａｙ、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９２）６５：ｐ３１１
【非特許文献５】Ｂｕｔｌｅｒら、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（１９９８）１２１：ｐ１９
【非特許文献６】Ｃｈａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２７９：ｐ５６３
【非特許文献７】Ｐａｎｄｉｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９９）５：ｐ１９３５
【非特許文献８】Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９６）５６：ｐ２７８１
【非特許文献９】Ｐｅｋｏｎｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９８）４８：ｐ１３４３
【非特許文献１０】Ｓｔｅｌｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９６）５６：ｐ１７６２
【非特許文献１１】Ｘｉｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９９）５９：ｐ３５８８
【非特許文献１２】Ｂｅｎ−Ｓｃｈｌｏｍｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．（２００１）３０：ｐ５６５−５８３
【非特許文献１３】Ｋｕｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）２５８：ｐ６５６１
【非特許文献１４】Ｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９３）１９６．ｐ９２−９８
【非特許文献１５】Ｘｉｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ（１９９２）８９：ｐ５３５６−５３６０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、例えば、以下の手段を提供する：
（項目１）ａ）配列番号８によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１０によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
ｂ）配列番号３１によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３２によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
ｃ）配列番号１４または配列番号１７によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１６によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列と、
ｄ）配列番号３７または配列番号７０によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３９によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列
からなる群から選択されるメンバーを含むことを特徴とするＩＧＦＲ１に特異的に結合する結合組成物。
（項目２）（ａ）配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目と、
（ｃ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｆ）配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目と、
（ｇ）配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｈ）配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｉ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｊ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目
からなる群から選択される可変領域を含むことを特徴とする、項目１に記載のＩＧＦＲ１に特異的に結合する結合組成物。
（項目３）（ａ）配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目を含む軽鎖可変領域および配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目を含む重鎖可変領域と、
（ｃ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｅ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｆ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｇ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｈ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｉ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域と、
（ｊ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域からなる群から選択されるメンバーを含むことを特徴とするＩＧＦＲ１に特異的に結合する結合組成物。
（項目４）項目１に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
（項目５）（ａ）配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目と、
（ｃ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｆ）配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目と、
（ｇ）配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｈ）配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｉ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｊ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目
からなる群から選択される、ポリペプチドをコードする単離核酸。
（項目６）（ａ）配列番号１のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｂ）配列番号２４のヌクレオチド６１〜３９０番目と、
（ｃ）配列番号７１のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｄ）配列番号７３のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｅ）配列番号３のヌクレオチド５８〜４１１番目と、
（ｆ）配列番号２６のヌクレオチド５８〜４２０番目と、
（ｇ）配列番号４４のヌクレオチド５８〜４１１番目と、
（ｈ）配列番号１１１のヌクレオチド５８〜４１１番目と、
（ｉ）配列番号７５のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｊ）配列番号７７のヌクレオチド５８〜３８４番目
からなる群から選択される、項目５に記載の核酸。
（項目７）項目５に記載の核酸を含むことを特徴とする組み換え型ベクター。
（項目８）項目７に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
（項目９）ポリペプチドを生産するための方法であって、
前記ポリペプチドが生産される条件下で、項目８に記載の宿主細胞を培養することを包含することを特徴とする方法。
（項目１０）病状がインスリン様増殖因子受容体−Ｉの発現または活性の増加によって媒介される被験体の病状を処置または予防するための方法であって、項目１に記載の結合組成物を前記被験体に投与することを包含することを特徴とする方法。
（項目１１）前記病状が先端巨大症、膀胱癌、ウイルムス腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、良性前立腺肥大症、乳癌、前立腺癌、骨癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉腫、転移性カルチノイドに関連する下痢、血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋再狭窄、および不適当な微小血管の増殖からなる群から選択されることを特徴とする項目１０に記載の方法。
（項目１２）前記結合組成物が非経口経路によって前記被験体に投与されることを特徴とする項目１０に記載の方法。
（項目１３）付加的な抗癌療法剤または抗癌療法手順に関連させて前記結合組成物が前記被験体に投与されることを特徴とする項目１０に記載の方法。
（項目１４）病状がインスリン様増殖因子受容体−Ｉの発現または活性の増加によって媒介される被験体の病状を処置または予防するための方法であって、
（ａ）配列番号８によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１０によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号３１によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３２によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号１４または配列番号１７によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１６によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列と、
（ｄ）配列番号３７または配列番号７０によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３９によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列
からなる群から選択されるメンバーを含むＩＧＦＲ１に特異的に結合する結合組成物をその被験体に投与することを包含することを特徴する方法。
（項目１５）前記病状が先端巨大症、膀胱癌、ウイルムス腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、良性前立腺肥大症、乳癌、前立腺癌、骨癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉腫、転移性カルチノイドに関連する下痢、血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋再狭窄、および不適当な微小血管の増殖からなる群から選択されることを特徴とする項目１４に記載の方法。
（項目１６）ＩＧＦＲ１に特異的に結合する完全ヒト・モノクローナル抗体を生産するための方法であって、
（ｉ）トランスジェニック非ヒト動物のＢ細胞によって前記抗体が産生されるように、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するそのトランスジェニック非ヒト動物をＩＧＦＲ１抗原ポリペプチドで免疫化するステップと、
（ｉｉ）その動物のそのＢ細胞を単離するステップと、
（ｉｉｉ）そのＢ細胞を骨髄腫細胞と融合して、その抗体を分泌する不死ハイブリドーマ細胞を形成するステップと、
（ｉｖ）そのハイブリドーマ細胞からその抗体を単離するステップ
を包含することを特徴とする方法。
（項目１７）前記抗原ポリペプチドが配列番号１９のアミノ酸３０〜９０２番目であることを特徴とする、項目１６に記載の方法。
（項目１８）（ａ）約８６×１０−１１以下のＫｄでＩＧＦＲ１に結合することと、
（ｂ）ＩＧＦＲ１に対して、約６．５０×１０−５以下の解離速度（Ｋｏｆｆ）を有することと、
（ｃ）ＩＧＦＲ１に対して、約０．７×１０５以上の結合速度（Ｋｏｎ）を有することと、
（ｄ）ＩＧＦＲ１への結合をＩＧＦ１と競合することと、
（ｅ）ＩＧＦＲ１の自己リン酸化を阻害することと、
（ｆ）ＩＧＦＲ１を発現する細胞の足場非依存性増殖を阻害することｓ
からなる群から選択される特性を含むことを特徴とする、ヒトＩＧＦＲ１に特異的に結合する結合組成物。
（項目１９）前記特性を全て含むことを特徴とする項目１８に記載の結合組成物。
（項目２０）（ａ）配列番号８によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１０によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号３１によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３２によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号１４または配列番号１７によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１６によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列と、
（ｄ）配列番号３７または配列番号７０によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３９によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列
からなる群から選択されるメンバーを含むことを特徴とする、項目１８に記載の結合組成物。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、完全ヒト抗ヒトＩＧＦＲ１モノクローナル抗体を提供し、これは、好ましくは、ヒト被験体に投与される際に、ＨＡＭＡ応答もＨＡＨＡ応答を誘導せず、かつＩＧＦＲ１によって媒介される疾患（例えば、悪性疾患）を処置または予防するために有用である。
【０００９】
本発明は、軽鎖を含む結合組成物（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）を提供し、この際、その軽鎖は、配列番号８または３１によって定義される軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号９または３２によって定義される軽鎖ＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号１０または３３によって定義される軽鎖ＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含む。重鎖を含む結合組成物（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）も提供し、この際、その重鎖は、配列番号１４または３７によって定義される重鎖ＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列、配列番号１５または３８によって定義される重鎖ＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号１６または３９によって定義される重鎖ＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明の結合組成物（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）は、配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目、配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目、配列番号４１もしくは４３のアミノ酸２０〜１２８番目、または配列番号４１、４３、７２、７４、７６、もしくは７８のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域、好ましくは成熟軽鎖可変領域、および／あるいは配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目、配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目、配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目、または配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域、好ましくは成熟重鎖可変領域を含む。
【００１０】
本発明の結合組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も本発明により提供される。本発明の結合組成物をポリエチレングリコール等の物質と連結してもよい。
【００１１】
本発明は、ヒトＩＧＦＲ１に特異的に結合する結合組成物（例えば、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント）も包含し、その結合組成物は、
（ａ）約８６×１０−１１以下のＫｄでＩＧＦＲ１（例えば、ヒトＩＧＦＲ１）に結合することと、
（ｂ）ＩＧＦＲ１（例えば、ヒトＩＧＦＲ１）に対して、約６．５０×１０−５以下の解離速度（Ｋｏｆｆ）を有することと、
（ｃ）ＩＧＦＲ１（例えば、ヒトＩＧＦＲ１）に対して、約０．７Ｘ１０５以上の結合速度（Ｋｏｎ）を有することと、
（ｄ）ＩＧＦＲ１（例えば、ヒトＩＧＦＲ１）への結合に関してＩＧＦ１と競合することと、
（ｅ）ＩＧＦＲ１（例えば、ヒトＩＧＦＲ１）の自己リン酸化を（例えば、０．１０ｎＭのＩＣ５０で）阻害することと、
（ｆ）ＩＧＦＲ１（例えば、ヒトＩＧＦＲ１）を発現する細胞の足場非依存性増殖を阻害することと
からなる群から選択される特性を含む。好ましくは、その結合組成物は、上記特性（ａ〜ｆ）の全てを含む。より好ましくは、その結合組成物（例えば、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント）は、
（ａ）配列番号８によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１０によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号３１によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３２によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号１４または配列番号１７によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１６によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列と、
（ｄ）配列番号３７または配列番号７０によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３９によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列と
から選択されるメンバーを含む。
【００１２】
本発明は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目と、
（ｃ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ａ）配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｂ）配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目と、
（ｃ）配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｄ）配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｅ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｆ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目と
から選択されるペプチドをコードする単離核酸も包含する。
【００１３】
好ましくは、その核酸は、
（ａ）配列番号１のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｂ）配列番号２４のヌクレオチド６１〜３９０番目と、
（ｃ）配列番号７１のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｄ）配列番号７３のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｅ）配列番号３のヌクレオチド５８〜４１１番目と、
（ｆ）配列番号２６のヌクレオチド５８〜４２０番目と、
（ｇ）配列番号４４のヌクレオチド５８〜４１１番目と、
（ｈ）配列番号１１１のヌクレオチド５８〜４１１番目と、
（ｉ）配列番号７５のヌクレオチド５８〜３８４番目と、
（ｊ）配列番号７７のヌクレオチド５８〜３８４番目と
から選択される。本発明は、任意の前述のポリヌクレオチドを含む組み換え型ベクターも、そのベクターを含む宿主細胞とともに提供する。
【００１４】
本発明は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目と、
（ｃ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｆ）配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目と、
（ｇ）配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｈ）配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目と、
（ｉ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目と、
（ｊ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目と
から選択されるポリペプチドも含む。
【００１５】
好ましくは、本発明の結合組成物は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（１５Ｈ１２／１９Ｄ１２成熟ＬＣ−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２成熟ＨＣ）と、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目を含む軽鎖可変領域および配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目を含む重鎖可変領域（１Ｈ３成熟ＬＣ−１Ｈ３成熟ＨＣ）と、
（ｃ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＣ−成熟ＨＣＡ）と、
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＤ−成熟ＨＣＡ）と、
（ｅ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＥ−成熟ＨＣＡ）と、
（ｆ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＦ−成熟ＨＣＡ）と、
（ｇ）配列番号７２のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＣ−成熟ＨＣＢ）と、
（ｈ）配列番号７４のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＤ−成熟ＨＣＢ）と、
（ｉ）配列番号７６のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＥ−成熟ＨＣＢ）と、
（ｊ）配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８番目を含む軽鎖可変領域および配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含む重鎖可変領域（成熟ＬＣＦ−成熟ＨＣＢ）と
から選択される少なくとも１つ（例えば、１または２）の軽鎖／重鎖組み合わせを含むヒト抗体である。
【００１６】
より好ましくは、そのヒト抗体は、前述の軽鎖／重鎖対の２つを含む四量体である。好ましくは、そのヒト抗体は、成熟ＨＣＡまたは成熟ＨＣＢと対になった成熟ＬＣＦを含む。
【００１７】
配列番号２のアミノ酸２０〜１２８番目、配列番号４のアミノ酸２０〜１３７番目、配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目、配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目、配列番号４１、４３、７２、７４、７６または７８のアミノ酸２０〜１２８番目、配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７番目、あるいは配列番号１１２のアミノ酸２０〜１３７番目を含むポリペプチドを生成する方法も提供し、その方法は、そのポリペプチドが産生される条件下で、宿主細胞を培養することを含む。好ましくは、そのポリペプチドをその宿主細胞から単離もする。
【００１８】
本発明は、インスリン様増殖因子受容体−Ｉの発現または活性の増加によってあるいは１種類以上のそのリガンド（例えば、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ）の発現の増加によって媒介される被験体の病状を処置または予防する方法も提供し、その方法は、本発明の結合組成物（例えば、本発明の抗体または抗原結合フラグメント）をその被験体に投与することを含む。
【００１９】
好ましくは、その結合組成物は、
（ａ）配列番号８によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１０によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号３１によって定義されるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３２によって定義されるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３によって定義されるＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖アミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号１４または配列番号１７によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１６によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列と、
（ｄ）配列番号３７または配列番号７０によって定義されるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８によって定義されるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３９によって定義されるＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖アミノ酸配列と
から選択されるメンバーを含む。
【００２０】
本発明は、
（ｉ）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ４）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ４）」
ＡＴＣＣ登録番号＿＿＿＿＿＿と、
（ｉｉ）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢ（γ４）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢ（γ４）」
ＡＴＣＣ登録番号＿＿＿＿＿＿と、
（ｉｉｉ）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ１）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ１）」
ＡＴＣＣ登録番号＿＿＿＿＿＿と、
（ｉｖ）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ（κ）」
ＡＴＣＣ登録番号＿＿＿＿＿＿と、
（ｖ）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＤ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＤ（κ）」
ＡＴＣＣ登録番号＿＿＿＿＿＿と、
（ｖｉ）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ（κ）」 ＡＴＣＣ登録番号＿＿＿＿＿＿と、
（ｖｉｉ）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ（κ）」
ＡＴＣＣ登録番号＿＿＿＿＿＿と、
任意の前述のプラスミドの核酸挿入断片と
からなる群から選択される任意のプラスミドを包含する。免疫グロブリン定常領域を任意で含む（すなわち、シグナル配列を除く）プラスミド挿入断片中に含まれる免疫グロブリン可変領域をコードする挿入断片の核酸部分も包含される。任意の前述のプラスミド挿入断片の核酸にコードされる任意のポリペプチドと、免疫グロブリン定常領域を任意で含む（すなわち、シグナル配列を除く）任意の挿入断片中に含まれる免疫グロブリン可変領域をコードするポリペプチドとも包含される。
【００２１】
上記に特定したプラスミドは、ブタペスト条約の下、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ；Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９）に＿＿＿＿＿＿日付で寄託した。ＡＴＣＣに寄託したプラスミドへのアクセス制限の全ては、特許の付与により解除される。
【００２２】
好ましくは、結合組成物は、医薬組成物内で、薬学的に許容される担体と組み合わされている。本発明によって考察される病状としては、先端巨大症、卵巣癌、膵臓癌、良性前立腺肥大症、乳癌、前立腺癌、骨癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉腫、転移性カルチノイドに関連する下痢、血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋再狭窄、および不適当な微小血管の増殖が挙げられる。
【００２３】
例えば非経口経路によって、結合組成物を被験体に投与し得る。抗癌療法剤と関連させてまたは抗癌療法手順と関連させて、本発明の結合組成物の投与を含む併用療法も提供する。
【００２４】
完全ヒト抗ＩＦＧＲ１抗体を生産するための方法も提供し、上記方法は、トランスジェニック非ヒト動物のＢ細胞によって上記抗体が産生されるように、ＩＧＦＲ１抗原ポリペプチド、好ましくは配列番号１９のアミノ酸３０〜９０２および／またはその表面上にＩＦＧＲ１を発現する細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）で、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物を免疫化する工程、上記動物のＢ細胞を単離する工程と、上記Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合して、ＩＧＦＲ１に特異的なヒト・モノクローナル抗体を分泌する不死ハイブリドーマ細胞を形成する工程、ならびに上記ＩＧＦＲ１に特異的なヒト・モノクローナル抗体を単離する工程と含む。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（詳細な説明）
本発明の好ましい実施形態は、インスリン様増殖因子レセプターＩを特異的に認識および結合する完全ヒト・モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、好ましくは配列番号１９のアミノ酸３０〜９０２を包含する。好ましくは、上記抗体またはその抗原結合フラグメントは、１Ｈ３、１５Ｈ１２、１９Ｄ１２、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＢ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＤ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ、または１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢである。
【００２６】
結合組成物または結合作用物質は、例えばリガンド−レセプター型様式または抗体−抗原相互作用で、ＩＧＦＲ１と特異的に結合する分子、例えば共有結合または非共有結合のいずれかで天然の生理学的に関連するタンパク質−タンパク質相互作用で、例えばＩＧＦＲ１に特異的に結合するタンパク質を指す。用語「結合組成物」は、好ましくは、本発明の完全抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＢ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＤ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ、または１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢ、あるいは表１で下記に記載する任意のペプチド）等のポリペプチドである。
【００２７】
本発明の抗体および抗原結合フラグメントを用いて、細胞（好ましくは悪性細胞）の増殖をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボ両方で阻害し得る。単一の理論に制限されることなしに、本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、ＩＧＦＲ１とこのレセプターに対するリガンド（例えば、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦＩ）またはインスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ））との間の相互作用を阻害することによって、細胞増殖を阻害し得る。抗体および抗原結合フラグメントは、ＩＧＦＲ１自己リン酸化を阻害すること、ＩＧＦＲ１を発現する細胞（例えば、癌細胞）の足場非依存性増殖を阻害すること、およびＩＧＦＲ１の分解を誘導することによってＡＫＴキナーゼの活性化を阻害することもし得る。好ましくは、抗体および抗原結合フラグメントは、ＩＧＦＲ１の活性を中和し、かつ／またはＩＧＦＲ１を下方制御する。抗体および抗原結合フラグメントを用いて、ＩＧＦＲ１によって媒介される疾患を処置または予防し得る。本発明は、本発明の抗体および抗原結合フラグメントを生成する方法も提供する。
【００２８】
用語「抗体分子」とは、抗体全体（例えば、ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４）およびそのフラグメント、好ましくは抗原結合フラグメントを指す。抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント、およびｄｓＦｖ抗体フラグメントが挙げられる。
【００２９】
用語「ＩＧＦＲ１」、「インスリン様増殖因子レセプターＩ」、および「Ｉ型インスリン様増殖因子レセプター」は、当上記技術分野で周知である。ＩＧＦＲ１は、任意の生体由来でもよいが、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはイヌ）、最も好ましくはヒト由来である。典型的なヒトＩＧＦＲ１前駆体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ０４４３４またはＮＭ＿０００８７５（配列番号１９）を有する。前駆体の切断（例えば、アミノ酸７１０と７１１との間での切断）は、結合して成熟レセプターを形成するαサブユニットおよびβサブユニットを産生する。本発明の好ましい実施形態では、完全長ＩＧＦＲ１ポリペプチド由来のアミノ酸３０〜９０２を抗ＩＧＦＲ１抗体の生成用の抗原として用いる。
【００３０】
用語「ＩＧＦＩ」、「インスリン様増殖因子Ｉ」、および「Ｉ型インスリン様増殖因子」も当上記技術分野で周知である。用語「ＩＧＦＩＩ」、「インスリン様増殖因子ＩＩ」、および「ＩＩ型インスリン様増殖因子」も当上記技術分野で周知である。ＩＧＦＩまたはＩＧＦＩＩは、任意の生体由来でよいが、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはイヌ）、最も好ましくはヒト由来である。典型的なヒトＩＧＦＩおよびＩＧＦＩＩの核酸配列およびアミノ酸配列はそれぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＸＭ＿０５２６４８（配列番号２０）およびＮＭ＿０００６１２（配列番号２１）を有する。用語「ｓＩＧＦＲ１」または「可溶性ＩＧＦＲ１」としては、ＩＧＦＲ１（例えば、ヒトＩＧＦＲ１）の任意の可溶性フラグメント、好ましくはレセプター膜貫通領域が欠失したフラグメント、より好ましくは配列番号１９のアミノ酸３０〜９０２が挙げられる。
【００３１】
本発明の好ましい完全ヒト・モノクローナル抗ＩＧＦＲ１抗体分子の可変領域のアミノ酸配列（例えば、１Ｈ３、１５Ｈ１２、および１９Ｄ１２）を、上記領域をコードする核酸のヌクレオチド配列とともに表１に概要を示す。本発明は、表１で下記に記載する核酸またはポリペプチド（その成熟フラグメントを含む）のいずれかのうちの１種類以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）を含む任意の核酸またはポリペプチド（例えば、抗体）を包含する。表１は、抗体のＣＤＲ領域に対応するアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の概要も包含する。１５Ｈ１２および１９Ｄ１２の可変領域に対応するアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は同一である。この理由のため、各可変領域またはＣＤＲに対する単一配列のみを示す。
【００３２】
（表１ 本発明のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の概要）
【００３３】
【表１−１】
【００３４】
【表１−２】
【００３５】
【表１−３】
【００３６】
【表１−４】
【００３７】
【表１−５】
【００３８】
【表１−６】
【００３９】
【表１−７】
【００４０】
【表１−８】
ＣＤＲ−Ｌ１は、軽鎖で生じる第１の相補性決定領域（ＣＤＲ）であり、ＣＤＲ−Ｌ２は、軽鎖で生じる第２のＣＤＲであり、ＣＤＲ−Ｌ３は、軽鎖で生じる第３のＣＤＲである。
【００４１】
同様に、ＣＤＲ−Ｈ１は、重鎖で生じる第１のＣＤＲであり、ＣＤＲ−Ｈ２は、重鎖で生じる第２のＣＤＲであり、ＣＤＲ−Ｈ３は、重鎖で生じる第３のＣＤＲである。
【００４２】
ＦＲ−Ｌ１は、軽鎖の第１のフレームワーク領域であり、ＦＲ−Ｌ２は、軽鎖の第２のフレームワーク領域であり、ＦＲ−Ｌ３は、軽鎖の第３のフレームワーク領域であり、ＦＲ−Ｌ４は、軽鎖の第４のフレームワーク領域である。ＦＲ−Ｈ１は、重鎖の第１のフレームワーク領域であり、ＦＲ−Ｈ２は、重鎖の第２のフレームワーク領域であり、ＦＲ−Ｈ３は、重鎖の第３のフレームワーク領域であり、ＦＲ−Ｈ４は、重鎖の第４のフレームワーク領域である。これらの用語と、免疫グロブリン鎖上のＣＤＲおよびＦＲの配置とは、当その技術分野で周知である。
【００４３】
シグナル・ペプチド（すなわち、最初の１９または２０残基）を持たない本発明の成熟軽鎖可変領域は、配列番号１、４０、４２、７１、７３、７５、または７７のヌクレオチド５８〜３８４番目にコードされる配列番号２、４１、４３、７２、７４、７６、または７８のアミノ酸２０〜１２８番目、あるいは配列番号２４のヌクレオチド６１〜３９０番目にコードされる配列番号２５のアミノ酸２１〜１３０番目である。
【００４４】
シグナル・ペプチド（すなわち、最初の１９残基）を持たない成熟重鎖可変領域は、配列番号３、４４、または１１１のヌクレオチド５８〜４１１番目にコードされる配列番号４、４５、または１１２のアミノ酸２０〜１３７番目、あるいは配列番号２６のヌクレオチド５８〜４２０番目にコードされる配列番号２７のアミノ酸２０〜１４０番目である。
【００４５】
複数の実施形態では、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２ ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１８のヌクレオチド配列にコードされるＧＦＴＦＳＳＦＡＭＨ（配列番号１７）である。複数の実施形態では、１Ｈ３ ＣＤＲ−Ｈ１は、ＮＹＡＭＨ（配列番号７０）である。
【００４６】
本発明は、本発明の抗体および抗原結合フラグメントのフレームワーク領域を含む抗体および抗原結合フラグメントも包含する。好ましくは、ＦＲ−Ｌ１は、配列番号２のアミノ酸２０〜４２番目または配列番号２５のアミノ酸２１〜４３番目であり、ＦＲ−Ｌ２は、配列番号２のアミノ酸５４〜６８番目または配列番号２５のアミノ酸５５〜６９番目であり、ＦＲ−Ｌ３は、配列番号２のアミノ酸７６〜１０７番目または配列番号２５のアミノ酸７７〜１０８番目であり、ＦＲ−Ｌ４は、配列番号２のアミノ酸１１７〜１２８番目または配列番号２５のアミノ酸１２８〜１３０番目である。ＦＲ−Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸２０〜４４番目または２０〜４９番目あるいは配列番号２７のアミノ酸２０〜４４番目または２０〜４９番目であり、ＦＲ−Ｈ２は、配列番号４のアミノ酸５５〜６８番目または配列番号２７のアミノ酸５５〜６８番目であり、ＦＲ−Ｈ３は、配列番号４のアミノ酸８５〜１１６番目または配列番号２７のアミノ酸８５〜１１６番目であり、ＦＲ−Ｈ４は、配列番号４のアミノ酸１２７〜１３７番目または配列番号２７のアミノ酸１３０〜１４０番目である。
【００４７】
好ましい実施形態では、本発明の抗体分子は、配列番号４１または４３のアミノ酸２０〜４２番目によって定義されるＦＲ−Ｌ１、配列番号４１または４３のアミノ酸５４〜６８番目によって定義されるＦＲ−Ｌ２、配列番号４１または４３のアミノ酸７６〜１０７番目によって定義されるＦＲ−Ｌ３、および配列番号４１または４３のアミノ酸１１７〜１２８番目によって定義されるＦＲ−Ｌ４を含む。さらに、好ましい実施形態には、配列番号４５のアミノ酸２０〜４４番目によって定義されるＦＲ−Ｈ１、配列番号４５のアミノ酸５５〜６８番目によって定義されるＦＲ−Ｈ２、配列番号４５のアミノ酸８５〜１１６番目によって定義されるＦＲ−Ｈ３、および配列番号４５のアミノ酸１２７〜１３７番目によって定義されるＦＲ−Ｈ４含む抗体分子が包含される。
【００４８】
（分子生物学）
本発明にしたがって、当その技術分野の技術内にある従来の分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技術を用いることが可能である。このような技術は、文献内で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（本明細書で、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照せよ。
【００４９】
「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」、「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」、または「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、一本鎖型、二本鎖型、またはその他の型で、リン酸エステル高分子形態のリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン（「ＲＮＡ分子（ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」））またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン（「ＤＮＡ分子（ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」））、あるいはホスホロチオエート類およびチオエステル類等のその任意のリン酸エステル類似体を指すことが可能である。
【００５０】
「ポリヌクレオチド配列（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、または「ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸中の一続きのヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とも呼ぶ）であり、２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。
【００５１】
「コード配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」あるいはＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素等の発現産物を「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」配列とは、発現される際に産物を産生するヌクレオチド配列である。
【００５２】
用語「遺伝子（ｇｅｎｅ）」とは、１種類以上のＲＮＡ分子、タンパク質または酵素の全てまたは部分を含むリボヌクレオチドまたはアミノ酸の特定の配列をコードするか、またはその特定の配列に対応し、かつ例えば遺伝子が発現する条件を決定するプロモーター配列等の調節ＤＮＡ配列を含んでもよく、または含まなくてもよいＤＮＡ配列を意味する。遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡに転写され、そのＲＮＡは、アミノ酸配列に翻訳されてもよく、または翻訳されなくてもよい。
【００５３】
本明細書で使用されるように、ＤＮＡの「増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ＤＮＡ配列の混合物内の特定のＤＮＡ配列の濃度を増加させることを表すことが可能である。ＰＣＲの説明に関しては、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４８７を参照せよ。特定の実施形態では、本発明は、ＰＣＲによって増幅することができる抗ＩＧＦＲ１抗体、抗ＩＧＦＲ１抗体重鎖または軽鎖、抗ＩＧＦＲ１抗体重鎖または軽鎖可変領域、抗ＩＧＦＲ１抗体重鎖または軽鎖定常領域、あるいは抗ＩＧＦＲ１抗体ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、またはＣＤＲ−Ｈ３）をコードする核酸を包含する。
【００５４】
本明細書で使用するように、用語「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、一般的に少なくとも１０（例えば、１０、１１、１２、１３、または１４）、好ましくは少なくとも１５（例えば、１５、１６、１７、１８、または１９）、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）、好ましくは１００ヌクレオチド以下（例えば、４０、５０、６０、７０、８０、または９０）の核酸を指し、遺伝子、ｍＲＮＡ，ｃＤＮＡ、または他の対象核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズすることが可能である。例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、３Ｈ−ヌクレオチド、１４Ｃ−ヌクレオチド、３５Ｓ−ヌクレオチド、またはビオチン等の標識を共有結合的に連結したヌクレオチドを組み込むことによって、オリゴヌクレオチドを標識することができる。一実施形態では、標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、核酸の存在を検出することができる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドの１つまたは両方を標識することが可能）をＰＣＲプライマーとして用いて、遺伝子の完全長またはフラグメントをクローニングすること、あるいは核酸の存在を検出することのいずれかをすることができる。一般に、オリゴヌクレオチドを、好ましくは核酸合成装置で合成的に調製する。
【００５５】
任意の核酸（例えば、ＩＧＦＲ１遺伝子をコードする核酸あるいは抗ＩＧＦＲ１抗体またはそのフラグメントもしくは部分をコードする核酸）の配列を、当その技術分野で周知の任意の方法によってシーケンシングすることが可能である（例えば、化学的シーケンシングまたは酵素的シーケンシング）。ＤＮＡの「化学的シーケンシング（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」とは、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０）の方法等の方法を示し得、この際、個々の塩基特異的反応を用いてＤＮＡを無作為に切断する。ＤＮＡの「酵素的シーケンシング（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」とは、Ｓａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３）の方法等の方法を示すことが可能である。
【００５６】
本明細書中の核酸は、天然の調節（発現制御）配列が隣接（ｆｌａｎｋ）することが可能であり、またはプロモーター、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’および３’非コーディング領域等を含む異種配列と連結することが可能である。
【００５７】
「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」または「プロモーター配列（ｐｒｏｍｏｔｅｒ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを結合（例えば、直接に、あるいは他のプロモーター結合タンパク質または物質を介して）して、コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列は、一般的に、その３’末端で転写開始部位に結合され、上流（５’方向）に伸張し、任意のレベルで転写を開始するために必要な最少数の塩基またはエレメントを含む。転写開始部位（例えばヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって都合よく定義される）と、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）とをプロモーター配列内で見出すことが可能である。エンハンサーおよびリプレッサー配列を含む他の発現制御配列と、または本発明の核酸（例えば、配列番号１、３、５〜７、１１〜１３、１８、２２〜２４、２６、２８〜３０、または３４〜３６）とそのプロモーターを作用自在に連結することが可能である。遺伝子発現を制御するために用いることが可能なプロモーターとしては、限定はされないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および第５，１６８，０６２号）と、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）と、ラウス肉腫ウイルスの３’長鎖末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）内に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）と、ヘルペス・チミジン・キナーゼ・プロモーター（Ｗａｇｎｅｒら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５）と、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）、β−ラクタマーゼ・プロモーター等の原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）（”Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９８０）２４２：７４−９４も参照せよ）と、Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコール・デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロール・キナーゼ）プロモーター、またはアルカリ性ホスファターゼ・プロモーター等の酵母または他の真菌由来のプロモーター・エレメントとが挙げられる。
【００５８】
コード配列は、配列がＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ中にコード配列のＲＮＡポリメラーゼ媒介転写を誘導し、その後そのＲＮＡがトランスＲＮＡスプライシングされ（イントロンを含有する場合）、コード配列にコードされるタンパク質中に任意で翻訳されることが可能である際、細胞内の転写および翻訳制御配列「の制御下にある（ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ）」、「と機能的に連結する（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）」、または「と作用自在に連結する（ｏｐｅｒａｂｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）」ものである。
【００５９】
用語「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」および「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、遺伝子、ＲＮＡ、またはＤＮＡ配列内の情報を顕在化することを可能にするか、または引き起こすことを意味し、例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生することを意味する。ＤＮＡ配列は、細胞内でまたは細胞によって発現し、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質（例えば、抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２、または１９Ｄ１２、あるいはそのフラグメント）等の「発現産物（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）」を形成する。発現産物自体も、細胞によって「発現される（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）」と言うことが可能である。
【００６０】
用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」、「クローニング・ベクター（ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）」、および「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」とは、宿主を形質転換するようにＤＮＡまたはＲＮＡ配列が宿主細胞に導入され得、導入された配列の発現および／または複製を任意で促進し得る媒体（例えば、プラスミド）を意味する。
【００６１】
用語「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」または「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、細胞中への核酸の導入を意味する。これらの用語は、細胞中への抗ＩＧＦＲ１抗体またはそのフラグメントをコードする核酸の導入を指すことが可能である。導入された遺伝子または配列を「クローン（ｃｌｏｎｅ）」と呼ぶことが可能である。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け取る宿主細胞は、「形質転換され（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」、「形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）」または「クローン（ｃｌｏｎｅ）」となる。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の供給源に由来することができ、その供給源としては、宿主細胞と同じ属または種の細胞あるいは異なる属または種の細胞が挙げられる。
【００６２】
用語「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」とは、細胞による物質の産生、例えば細胞による遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、タンパク質、あるいは酵素の発現または複製のために、任意の方法で選択、修飾、トランスフェクション、形質転換、増殖、あるいは使用または操作される任意の生体の任意の細胞を意味する。
【００６３】
用語「発現系（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）」とは、適当な条件下で、ベクターによって運搬され宿主細胞に導入されるタンパク質または核酸を発現することができる宿主細胞および適合するベクターを意味する。通常の発現系としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびプラスミド・ベクターと、昆虫宿主細胞およびバキュロウイウルス・ベクターと、哺乳動物宿主細胞およびベクターとが挙げられる。特定の実施形態では、ＩＧＦＲ１または本発明の抗体および抗原結合フラグメントをヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）中で発現させることが可能である。他の適当な細胞としては、ＣＨＯ（チャイニーズ・ハムスター卵巣）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＮＩＨ ３Ｔ３細胞、およびＮＳＯ細胞（非Ｉｇ産生マウス骨髄腫細胞株）が挙げられる。米国特許第４，９５２，４９６号、第５，６９３，４８９号、および第５，８６９，３２０号、ならびにＤａｖａｎｌｏｏ，Ｐ．ら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，２０３５−２０３９；Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．ら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：１２５−１３５；およびＤｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．ら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６８：２５９（本明細書で参考として援用）とに開示されるように、本発明の抗体または抗原結合フラグメント、ｓＩＧＦＲ１またはＩＧＦＲ１をコードする核酸を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｔ７発現系で高レベルで発現させることが可能である。
【００６４】
本発明は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントに対応するアミノ酸またはヌクレオチド配列に対する任意の表面的なまたはわずかな修飾を考察する。具体的には、本発明は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸の配列保存的変異体を考察する。ポリヌクレオチド配列の「配列保存的変異体（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔ）」とは、所定のコドン内の１個以上のヌクレオチドの変化が、その位置でコードされるアミノ酸の改変を生じないものである。本発明の抗体の機能保存的変異体も本発明により考察される。「機能保存的変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔ）」とは、ポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能を改変することなしにタンパク質または酵素内の１個以上のアミノ酸残基を変化させたものであり、その変化には、決して限定はされないが、類似の特性を有するアミノ酸でのアミノ酸の置換が含まれる。類似の特性を有するアミノ酸は、当その技術分野で周知である。例えば、交換可能であり得る極性／親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、トレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が挙げられる。交換可能であり得る非極性／疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。交換可能であり得る酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、交換可能であり得る塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンが挙げられる。
【００６５】
本発明は、表１に記載されるような核酸と、それにハイブリダイズする核酸とにコードされる抗ＩＧＦＲ１抗体およびそのフラグメントを包含する。核酸は、好ましくは低ストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中ストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、好ましくはＩＧＦＲ１結合活性を示す。適当な温度条件および溶液イオン強度条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）を参照せよ）下で、一本鎖型の核酸分子が他の核酸分子にアニールすることができる際に、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ等の別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ）」である。温度条件およびイオン強度条件によって、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」が決定される。通常の低ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件は、５５℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％乳汁、およびホルムアミドなしまたは３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでありうる。通常、中ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件は、５×または６×ＳＳＣを用いて４０％ホルムアミド内でハイブリダイゼーションを実行する以外は、低ストリンジェンシー条件と同様である。高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件は、任意でより高い温度（例えば、５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃、または６８℃）で、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣ内でハイブリダイゼーション条件を実行する以外は、低ストリンジェンシー条件と同様である。一般に、ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍクエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションには、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能であるが、２個の核酸が相補配列を含有することが必要となる。核酸をハイブリダイズするための適当なストリンジェンシーは、当その技術分野で周知の変数である核酸の長さおよび相補性の度合いに依存する。２個のヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合いが大きくなるほど、核酸がハイブリダイズすることが可能なストリンジェンシーが高くなる。１００ヌクレオチド長を超える混成体に対して、融解温度を計算するための方程式が導き出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）、９．５０〜９．５１を参照せよ）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さによって、その特異性が決定される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）、１１．７〜１１．８を参照せよ）。
【００６６】
各参照配列間の全長にわたって、それぞれの配列間で最大一致（マッチ）を得るようにアルゴリズムのパラメータを選択して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較を実行する際に、表１の参照ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一なヌクレオチド配列を含む核酸およびアミノ酸配列を含むポリペプチドも本発明に包含される。各参照配列間の全長にわたって、それぞれの配列間で最大一致を得るようにアルゴリズムのパラメータを選択して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較を実行する際に、表１の参照アミノ酸配列（例えば、配列番号２（例えば、アミノ酸２０〜１２８番目）、配列番号４（例えば、アミノ酸２０〜１３７番目）、配列番号８〜１０、１４〜１６、１７、２５（例えば、アミノ酸２１〜１３０番目）、配列番号２７（例えば、アミノ酸２０〜１４０番目）、配列番号３１〜３３、または配列番号３７〜３９）に、少なくとも約７０％類似、好ましくは少なくとも約８０％類似、より好ましくは少なくとも約９０％類似、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）類似のアミノ酸配列を含むポリペプチドも本発明に包含される。
【００６７】
配列同一性は、比較している２個の配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸間での厳密な一致を指す。配列類似性は、非同一な生化学的に関連するアミノ酸間の一致に加えて、比較している２個のポリペプチドのアミノ酸間の厳密な一致両方を指す。類似の特性を共有し、かつ交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸については、上記で論じている。
【００６８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する以下の参考文献を本明細書で参考として援用する：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；アラインメント・スコアリング・システム：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら”Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９７８）第５巻，補遺３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら”Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．”Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９７８）第５巻，補遺３．”Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；アラインメント統計学：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．”Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．”Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編）（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
【００６９】
（抗体構造）
一般に、基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２個の同一対を含み、各対は、１個の「軽（ｌｉｇｈｔ）」鎖（約２５ｋＤａ）および１個の「重（ｈｅａｖｙ）」鎖（約５０ないし７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００ないし１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含むことが可能である。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を定義することが可能である。通常、ヒト軽鎖は、κおよびλ軽鎖として分類される。さらに、ヒト重鎖は、通常、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖内では、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖も約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（全ての目的のためにその全体を本明細書で参考として援用する）を参照せよ。
【００７０】
各重鎖／軽鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成することが可能である。したがって、一般的に、インタクトなＩｇＧ抗体は、２個の結合部位を有する。二機能性または二重特異性の抗体内以外では、２個の結合部位は、一般的に同じものである。
【００７１】
通常、鎖全ては、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３個の超可変領域によって連結される比較的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２個の鎖由来のＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列され、特異的なエピトープへの結合を可能にする。一般に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖および重鎖両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔら；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；第５版；ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５；Ｋａｂａｔら（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、またはＣｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３の定義に従う。本発明は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ（上記参考文献参照）によって定義されるような１Ｈ３、１５Ｈ１２、および１９Ｄ１２（例えば、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＢ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ、配列番号２、４、２５、２７、４１、４３、および４５）の軽鎖および重鎖由来のＣＤＲおよびＦＲを含む本発明の抗体または抗原結合フラグメントを提供する。
【００７２】
（抗体分子）
用語「抗体分子」としては、限定はされないが、抗体およびそのフラグメント、好ましくは抗原結合フラグメントが挙げられる。その用語には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント、およびｄｓＦｖ抗体フラグメントが包含される。さらに、本発明の抗体分子は、完全ヒト抗体またはキメラ抗体でもよい。好ましくは、抗体分子は、モノクローナル完全ヒト抗体である。より好ましくは、抗体分子は、１Ｈ３、１５Ｈ１２、または１９Ｄ１２である。好ましくは、抗体分子は、１個以上の可変領域およびＣＤＲを含み、そのアミノ酸およびヌクレオチドの配列は表１に記載されている。
【００７３】
本発明は、ＣＤＲを含む任意の抗体分子を包含し、そのＣＤＲは、
ＲＡＳＱＳＩＧＳＳＬＨ（配列番号８）
ＹＡＳＱＳＬＳ（配列番号９）
ＨＱＳＳＲＬＰＨＴ（配列番号１０）
ＳＦＡＭＨ（配列番号１４）
ＧＦＴＦＳＳＦＡＭＨ（配列番号１７）
ＶＩＤＴＲＧＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１５）
ＬＧＮＦＹＹＧＭＤＶ（配列番号１６）
ＲＡＳＱＳＶＳＳＦＬＡ（配列番号３１）
ＤＡＳＮＲＡＰ（配列番号３２）
ＱＱＲＳＮＷＰＲＷＴ（配列番号３３）
ＧＦＴＦＳＮＹＡＭＨ（配列番号３７）
ＡＩＧＡＧＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３８）、および
ＧＲＨＲＮＷＹＹＹＮＫＤＹ（配列番号：３９）
ＮＹＡＭＨ（配列番号７０）から選択される。
【００７４】
本発明の範囲には、任意の免疫グロブリン定常領域に結合した本発明の抗体可変領域（例えば、表１に示される成熟のまたはプロセッシングされていな任意の可変領域）が包含される。軽鎖可変領域が定常領域に結合する場合、好ましくは、その定常領域は、κ鎖である。重鎖可変領域が定常領域に結合する場合、好ましくは、その定常領域は、γ１、γ２、γ３、またはγ４定常領域であり、より好ましくはγ１、γ２、またはγ４であり、さらにより好ましくはγ１またはγ４である。
【００７５】
本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体分子は、好ましくは、ヒトＩＧＦＲ１、好ましくはｓＩＧＦＲ１を認識する。しかし、本発明は、異なる種、好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはイヌ）由来のＩＧＦＲ１を認識する抗体分子を包含する。本発明はまた、ＩＧＦＲ１または任意のそのフラグメント（例えば、配列番号９のアミノ酸３０ないし９０２番目）、あるいは細胞表面上にＩＧＦＲ１またはその任意の部分もしくはフラグメントを発現する任意の細胞（例えば、ヒトＩＧＦＲ１またはＭＣＦ７（例えば、ＡＴＣＣ細胞株番号ＨＴＢ−２２）で安定に形質転換されるＨＥＫ２９３細胞）と複合体を形成する抗ＩＧＦＲ１抗体またはそのフラグメントも包含する。抗体または抗体フラグメントをＩＧＦＲ１またはＩＧＦＲ１フラグメントと接触させることによって、そのような複合体を生成することが可能である。
【００７６】
好ましい実施形態では、マウス免疫系の代わりにヒト免疫系の部分を保有するトランスジェニック・マウスを用いて、ＩＧＦＲ１に対する完全ヒト・モノクローナル抗体を生成する。これらのトランスジェニック・マウス（本明細書で、「ＨｕＭＡｂ」マウスともいう）は、ヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含有し、そのミニ遺伝子座は、内因性のμ鎖遺伝子座およびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化突然変異と一緒に、再編成されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードする（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９）。したがって、そのマウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖の導入遺伝子は、クラス・スイッチングおよび体細胞突然変異を受け、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９４）（前出）；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、およびＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７６４：５３６−５４６内で総説される）。ＨｕＭａｂマウスの調製については、当その分野で公知であり、例えばＴａｙｌｏｒ，Ｌ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３７２０−３７２４；Ｃｈｏｉら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−１２３；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８２１−８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ら（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９−５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１、およびＨａｒｄｉｎｇら（１９９５）Ａｎｎａｌｓ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６（上記全ての内容全体を本明細書で参考として援用）に記載されている。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８７７，３９７号、同第５，６６１，０１６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７４，２９９号、同第５，７７０，４２９号、および同第５，５４５，８０７号、ならびに国際特許出願公報ＷＯ ９８／２４８８４、ＷＯ ９４／２５５８５、ＷＯ ９３／１２２２７、ＷＯ ９２／２２６４５、およびＷＯ ９２／０３９１８（上記全ての開示の全体を本明細書で参考として援用する）を参照せよ。
【００７７】
ＩＧＦＲ１に対する完全ヒト・モノクローナル抗体を生成するために、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１、およびＷＯ ９８／２４８８４に記載されるように、抗原性ＩＧＦＲ１ポリペプチド、好ましくは配列番号１９のアミノ酸３０ないし９０２番目を用いて、ＨｕＭａｂマウスを免疫化することができる。好ましくは、そのマウスは、最初の免疫化時には、６ないし１６週齢である。例えば、ＩＧＦＲ１またはｓＩＧＦＲ１の精製調製物を用いて、ＨｕＭａｂマウスを腹腔内で免疫化することができる。そのマウスをまた、ＩＧＦＲ１遺伝子で安定に形質転換またはトランスフェクションされるＨＥＫ２９３細胞全体で免疫化することもできる。「抗原性ＩＧＦＲ１ポリペプチド（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ＩＧＦＲ１ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、抗ＩＧＦＲ１免疫応答を好ましくはＨｕＭａｂマウス内で誘発するＩＧＦＲ１ポリペプチドまたは任意のそのフラグメント、好ましくは配列番号１９のアミノ酸３０ないし９０２番目を指すことが可能である。
【００７８】
一般に、ＨｕＭＡｂトランスジェニック・マウスは、初めにフロイント完全アジュバント内の抗原を用いて腹腔内（ＩＰ）で免疫化された後に、フロイントの不完全アジュバント内の抗原を用いた隔週のＩＰ免疫化（通常、全数６回まで）を行う場合、十分に応答する。初めにＩＧＦＲ１を発現する細胞（例えば、安定に形質転換されたＨＥＫ２９３細胞）で、その後ＩＧＦＲ１の可溶性フラグメント（例えば、配列番号１９のアミノ酸３０ないし９０２番目）でマウスを免疫化することができ、そのマウスは、連続的に、この２個の抗原で交互に免疫化を受けることができる。眼後出血によって得られる血漿試料を用いた免疫化プロトコールの全工程にわたって、免疫応答をモニタリングすることができる。例えばＥＬＩＳＡによって、抗ＩＧＦＲ１抗体の存在に対してその血漿をスクリーニングすることができ、十分な力価の免疫グロブリンを有するマウスを融合のために用いることができる。屠殺および脾臓除去前３日に、抗原を用いてマウスを静脈内で追加免疫することができる。各抗原に対する２ないし３回の融合の実行が必要となる可能性があると考えられる。複数匹のマウスを各抗原に対して免疫化することができる。例えば、ＨＣ０７およびＨＣ０１２系統の全数１２匹のＨｕＭＡｂマウスを免疫化することができる。
【００７９】
モノクローナル完全ヒト抗ＩＧＦＲ１抗体を産生するハイブリドーマ細胞を当その分野で公知の方法によって生産することが可能である。これらの方法としては、限定はされないが、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）によって当初開発されたハイブリドーマ技術と、トリオーマ技術（Ｈｅｒｉｎｇら（１９８８）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．４７：２１１−２１６、およびＨａｇｉｗａｒａら（１９９３）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ４：１５）と、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２、およびＣｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ８０：２０２６−２０３０）と、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６，１９８５）とが挙げられる。好ましくは、標準的プロトコールに基づいて、マウス脾細胞を単離して、ＰＥＧを用いてマウス骨髄腫細胞株と融合する。その後、得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生に対してスクリーニングすることが可能である。例えば、５０％ＰＥＧを用いて、免疫化したマウス由来の脾臓リンパ球の単一細胞懸濁物を１／６数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ １５８０）に融合することが可能である。細胞を平底マイクロタイター・プレート中に約２×１０５細胞／ｍＬで播種した後、２０％胎児クローン血清、１８％「６５３」馴化培地、５％オリゲン（ｏｒｉｇｅｎ）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、および１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、ＨＡＴは融合後２４時間目に添加）を含有する選択培地中で２週間インキュベートすることが可能である。２週間後に、ＨＡＴをＨＴと取り換えた培地中で細胞を培養することが可能である。その後、ヒト抗ＩＧＦＲ１モノクローナルＩｇＧ抗体に対して個々のウェルをＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることが可能である。広範なハイブリドーマ増殖が生じたら、通常、１０〜１４日後に培地を観察することができる。抗体分泌ハイブリドーマを再播種して、再度スクリーニングし、依然としてヒトＩｇＧに対して陽性である場合は、限界希釈法によって、抗ＩＧＦＲ１モノクローナル抗体を少なくとも２回サブクローニングすることができる。その後、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴づけのために組織培地中で少量の抗体を生成することが可能である。
【００８０】
本発明の抗ＩＧＦＲ抗体分子はまた、組み換え的に生産することも可能である（例えば、上記で論じたようなＥ．ｃｏｌｉ／Ｔ７発現系で）。この実施形態では、本発明の抗体分子（例えば、ＶＨまたはＶＬ）をコードする核酸をｐＥＴベースのプラスミド中に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｔ７系で発現させることが可能である。当その分野で公知の組み換え型抗体を生産する方法が複数ある。抗体の組み換え的生産のための方法の一例は、米国特許第４，８１６，５６７号（本明細書で参考として援用）に開示されている。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法によってであり得る。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドの導入方法は、当その分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中でのポリヌクレオチドの被包、微粒子銃注入（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。さらに、ウイルス・ベクターによって、核酸分子を哺乳動物細胞に導入することが可能である。細胞を形質転換する方法は、当その分野で周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号を参照せよ。
【００８１】
発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当その分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。これらの細胞株としては、特に、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、および多数の他の細胞株が挙げられる。哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、およびハムスターの細胞が挙げられる。どの細胞株が高発現レベルを有するかについて決定することによって、特に好ましい細胞株を選択する。使用可能な他の細胞株は、Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞株、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞、および真菌細胞である。重鎖またはその抗原結合部分、軽鎖、および／またはその抗原結合部分をコードする組み換え型発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する際は、宿主細胞中での抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞を増殖させる培養培地中への抗体の５分泌（５ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）を可能にする十分な期間で宿主細胞を培養することによって、抗体を生産する。
【００８２】
標準的なタンパク質精製法を用いて、抗体を培養培地から回収することができる。さらに、多数の公知の技術を用いて、産生細胞株からの本発明の抗体（またはそれ由来の他の部分）の発現を高めることができる。例えば、グルタミン・シンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を高めるための共通のアプローチである。ＧＳ系については、欧州特許第０ ２１６ ８４６号、第０ ２５６ ０５５号、および第０ ３２３ ９９７号、ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号に関連して完全にまたは部分的に論じられている。
【００８３】
異なる細胞株によってまたはトランスジェニック動物内で発現される抗体は、互いに異なるグリコシル化を有する可能性がある。しかし、本明細書で提供する核酸分子にコードされるか、または本明細書で提供するアミノ酸配列を含む抗体の全ては、抗体のグリコシル化に関わらず本発明の部分である。
【００８４】
「Ｋｏｆｆ」とは、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に対する解離速度定数を指す。
【００８５】
「Ｋｏｎ」とは、抗体が抗原に結合する時の速度を指す。
【００８６】
「Ｋｄ」とは、特定の抗体／抗原相互作用の解離定数を指す。Ｋｄ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ。
【００８７】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用するように、実質的に相同な抗体の集団から得た抗体、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、より少ない量で存在しうる可能な自然発生的な突然変異以外は同一であることを指す。モノクローナル抗体は、非常に特異的であるので、単一の抗原部位に向けられる。モノクローナル抗体は、本質的に他の免疫グロブリンが混入していないハイブリドーマ培養によって合成すること可能である点で有利である。修飾語句「モノクローナル」とは、実質的に相同な抗体集団間にあるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とするとは解釈されない。上述のように、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって初めに記載されたハイブリドーマ法によって、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体を生成することが可能である。
【００８８】
ポリクローナル抗体は、１種類以上の他の非同一抗体間でまたはその非同一抗体の存在下で産生される抗体である。一般に、非同一抗体を産生する複数の他のＢリンパ球の存在下で、Ｂリンパ球からポリクローナル抗体が生産される。通常、免疫化した動物からポリクローナル抗体が直接得られる。
【００８９】
二重特異性または二機能性抗体は、２個の異なる重鎖／軽鎖対および２個の異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含む様々な方法によって、二重特異性抗体を生産することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉら（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１，Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照せよ。さらに、二重特異性抗体を「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８）として、または「Ｊａｎｕｓｉｎ」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５−３６５９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：５１−５２）として形成することが可能である。
【００９０】
用語「完全ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリン・タンパク質配列のみを含む抗体を指す。完全ヒト抗体は、マウス内、マウス細胞内、またはマウス細胞由来のハイブリドーマ内で産生される場合は、マウス糖鎖を含有してもよい。同様に、「マウス抗体」とは、マウス免疫グロブリン配列のみを含む抗体を指す。
【００９１】
本発明は、別の非ヒト種（例えば、マウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリ）由来の抗体領域（例えば、定常領域）に融合またはキメラ化された本発明の可変領域を含む抗体である「キメラ抗体」を包含する。これらの抗体を用いて、非ヒト種内でＩＧＦＲ１の発現または活性を調節することが可能である。
【００９２】
「単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを有し、この際、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチド・リンカーをさらに含み、そのポリペプチド・リンカーは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。単鎖抗体の生産について記載される技術（米国特許第５，４７６，７８６号、同第５，１３２，４０５号、および同第４，９４６，７７８号）を適合させて、抗ＩＧＦＲ１特異的単鎖抗体を生産することができる。ＳＦｖの総説に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照せよ。
【００９３】
「ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント」および「ｄｓＦｖ」とは、ジスルフィド架橋によって結合する可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含む抗体分子を指す。
【００９４】
本発明の範囲内の抗体フラグメントは、例えばペプシンによるＩｇＧの酵素切断によって産生されうるＦ（ａｂ）２フラグメントも含む。例えばジチオトレイトールまたはメルカプトエチルアミンを用いたＦ（ａｂ）２の還元によって、Ｆａｂフラグメントを生産することが可能である。Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィド架橋によってＶＨ−ＣＨ１鎖に付加されるＶＬ−ＣＬ鎖である。Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、次に２つのジスルフィド架橋によって付加される２個のＦａｂフラグメントである。Ｆ（ａｂ）２分子のＦａｂ部分は、ジスルフィド架橋が位置するＦｃ領域の一部分を含む。
【００９５】
ＦＶフラグメントは、ＶＬまたはＶＨ領域である。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。少なくとも５つの主要な免疫グロブリンのクラスがある。すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４と、ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２とにさらに分けることが可能である。
【００９６】
本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体分子を化学的部に結合することも可能である。化学的部は、特に、高分子、放射性核種、または細胞障害性因子でもよい。好ましくは、化学的部は、被験体の体内で抗体分子の半減期を増加させる高分子である。適当な高分子としては、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、分子量２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａを有するＰＥＧ）、デキストラン、およびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が挙げられる。Ｌｅｅ他（１９９９）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１０：９７３−９８１）は、ＰＥＧ結合単鎖抗体を開示している。Ｗｅｎ他（２００１）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１２：５４５−５５３）は、放射性金属キレート化剤（ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ））に結合するＰＥＧとの結合抗体を開示している。
【００９７】
９９Ｔｃ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７ＣＵ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈ、４０Ｋ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒ、および５６Ｆｅ等の標識と本発明の抗体および抗体フラグメントを結合することもできる。
【００９８】
希土類キレート等の蛍光団、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレサミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識、ならびに安定遊離基を含む蛍光または化学発光標識と本発明の抗体および抗体フラグメントを結合することもできる。
【００９９】
ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質および化合物（例えば、脂肪酸）、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サボンソウ（ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ならびにエノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）等の細胞障害性因子と抗体分子を結合することも可能である。
【０１００】
本発明の抗体分子を種々の部に結合するための当その技術分野で公知の任意の方法を用いることが可能であり、その方法としては、Ｈｕｎｔｅｒら（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５；Ｄａｖｉｄら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４；Ｐａｉｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．（１９８２）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７によって記載されるものが挙げられる。抗体を結合するための方法は、従来からあり、当その技術分野で非常に公知である。
【０１０１】
（改変抗体分子）
本発明は、配列番号４１、４３、７２、７４、７６、または７８の軽鎖（１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、ＬＣＢ、ＬＣＣ、ＬＣＤ、ＬＣＥ、またはＬＣＦ）、好ましくは配列番号４１、４３、７２、７４、７６、７８のアミノ酸２０〜１２８番目（成熟１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、ＬＣＢ、ＬＣＣ、ＬＣＤ、ＬＣＥ、またはＬＣＦ）を含む抗体および抗原結合フラグメント（例えば、完全ヒト抗体、ＳＦｖ、ｄｓｖ、Ｆｖ、キメラ抗体）を包含する。本発明は、配列番号４５または１１２の重鎖（１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡまたはＨＣＢ）、好ましくは配列番号４５または１１２のアミノ酸２０〜１３７番目（成熟１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡまたはＨＣＢ）を含む抗体分子も包含する。
【０１０２】
１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、ＬＣＢ、ＬＣＣ、ＬＣＤ、ＬＣＥ、およびＬＣＦを、任意の他の免疫グロブリン重鎖、好ましくは本発明の免疫グロブリン重鎖を用いて二量体化することが可能である。同様に、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡまたはＨＣＢも、任意の軽鎖、好ましくは本発明の軽鎖を用いて二量体化することが可能である。例えば、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡまたはＨＣＢを１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ、ＬＣＤ、ＬＣＥ、またはＬＣＦで二量体化することが可能である。
【０１０３】
１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＢ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＤ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ、または１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢ、あるいはその任意のフラグメントを含む抗体および抗原結合フラグメントは、ヒト被験体内で最少の免疫原生を示すことによって、ヒト被験体に投与される際、ＨＡＨＡ応答の発生率は低い。
【０１０４】
好ましい抗体鎖を下記に示す。点線の下線が引かれている型は、シグナル・ペプチドをコードする。実線の下線が引かれている型は、ＣＤＲをコードする。下線のない型は、フレームワーク領域をコードする。最も好ましくは、抗体鎖は、シグナル・ペプチドを持たない成熟フラグメントである。
修飾１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｃ（配列番号７１）
【０１０５】
【化１Ａ】
（配列番号７２）
【０１０６】
【化１Ｂ】
修飾１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｄ（配列番号７３）
【０１０７】
【化１Ｃ】
（配列番号７４）
【０１０８】
【化１Ｄ】
修飾１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｅ（配列番号７５）
【０１０９】
【化１Ｅ】
（配列番号７６）
【０１１０】
【化１Ｆ】
修飾１９Ｄ１２／１５Ｈ１２軽鎖−Ｆ（配列番号７７）
【０１１１】
【化１Ｇ】
（配列番号７８）
【０１１２】
【化１Ｈ】
修飾１９Ｄ１２／１５Ｈ１２重鎖−Ａ（配列番号４４）
【０１１３】
【化１Ｉ】
（配列番号４５）
【０１１４】
【化１Ｊ】
修飾１９Ｄ１２／１５Ｈ１２重鎖−Ｂ（配列番号１１１）
【０１１５】
【化１Ｋ】
（配列番号１１２）
【０１１６】
【化１Ｌ】
（遺伝子療法）
本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体を遺伝子療法手法で被験体に投与することも可能である。遺伝子療法手法では、本発明の抗体をコードする核酸で被験体の細胞を形質転換する。その後、その核酸を含む被験体は、抗体分子を内因的に産生する。先行して、Ａｌｖａｒｅｚ他（２０００）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０８１−３０８７）は、遺伝子療法手法を用いて、一本鎖抗ＥｒｂＢ２抗体を被験体に導入した。Ａｌｖａｒｅｚ他によって記載される方法は、被験体への本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体分子をコードする核酸の導入に容易に適合されうる。
【０１１７】
本発明の任意のポリペプチドまたは抗体分子をコードする核酸を被験体に導入することが可能であるが、好ましい実施形態では、その抗体分子は、完全ヒト単鎖抗体である。
【０１１８】
当その技術分野で公知の任意の手段によって、核酸を被験体の細胞に導入することが可能である。好ましい実施形態では、核酸をウイルス・ベクターの部分として導入する。ベクターが由来する好ましいウイルスの例としては、レンチウイルス、ヘルペス・ウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニア・ウイルス、バキュロウイルス、アルファウイルス、インフルエンザ・ウイルス、および望ましい細胞向性を有する他の組み換え型ウイルスが挙げられる。
【０１１９】
様々な企業がウイルス・ベクターを商業的に生産しており、決して限定はされないが、アビジェン社（Ａｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ（ＡＡＶベクター））、セル・ジェネシス（Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ（レトロウイルス・ベクター、アデノウイルス・ベクター、ＡＡＶベクター、およびレンチウイルス・ベクター））、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルス・ベクターおよびバキュロウイルス・ベクター））、ジェノーボ社（Ｇｅｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．，Ｓｈａｒｏｎ Ｈｉｌｌ，ＰＡ（アデノウイルス・ベクターおよびＡＡＶベクター））、ジェネベック（Ｇｅｎｖｅｃ（アデノウイルス・ベクター））、イントロジーン（ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（アデノウイルス・ベクター））、モレキュラー・メディシン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイルス・ベクター、アデノウイルス・ベクター、ＡＡＶベクター、およびヘルペス・ウイルス・ベクター））、ノルジェン（Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルス・ベクター））、オックスフォード・バイオメディカル（Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ（レンチウイルス・ベクター））、およびトランスジーン（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ（アデノウイルス・ベクター、ワクシニア・ベクター、レトロウイルス・ベクター、およびレンチウイルス・ベクター））が挙げられる。
【０１２０】
ウイルス・ベクターを構築および使用するための方法は、当その技術分野で公知である（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０を参照せよ）。好ましくは、ウイルス・ベクターは、複製欠損型であり、すなわち、そのウイルス・ベクターは、自律的に複製することができず、そのため標的細胞内で非感染性である。好ましくは、複製欠損ウイルスは、最小限のウイルスである。すなわち、その複製欠損ウイルスは、ゲノムをキャプシド被包してウイルス粒子を産生するために必要なそのゲノムの配列のみを保有する。ウイルス遺伝子を完全にまたはほぼ完全に持たない欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルス・ベクターを用いることによって、そのベクターが他の細胞に感染する恐れがなく、特定の局所的領域中の細胞への投与が可能になる。したがって、特定の組織を特異的に標的することができる。
【０１２１】
弱毒化されたＤＮＡウイルス配列または欠損ＤＮＡウイルス配列を含むベクターの例としては、限定はされないが、欠損ヘルペス・ウイルス・ベクター（Ｋａｎｎｏら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６：１４７−１５４；Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．７１：１２５−１３２、およびＫａｐｌｉｔｔら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃ．１９：１３７−１４７）が挙げられる。
【０１２２】
アデノウイルスは、修飾されて本発明の核酸を種々の細胞型に効率的に送達することができる真核生物ＤＮＡウイルスである。Ｓｔｒａｆｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら（１９９２）（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０）によって記載されるベクター等の弱毒化されたアデノウイルス・ベクターが複数の例で望ましい。種々の複製欠損アデノウイルスおよび最小限のアデノウイルス・ベクターについて記載されている（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２６９１４、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７、およびＷＯ９６／２２３７８）。本発明の係る複製欠損組み換え型アデノウイルスを当業者に公知の任意の技術によって調製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏら（１９９１）Ｇｅｎｅ １０１：１９５；ＥＰ １８５５７３；Ｇｒａｈａｍ（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２９１７；Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）。
【０１２３】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、このウイルスが感染する細胞のゲノム中に安定かつ部位特異的な様式で組み込まれうる比較的に小型のＤＮＡウイルスである。アデノ関連ウイルスは、細胞増殖、形態、または分化に何ら影響を引き起こすことなしに、広範囲な細胞に感染することができ、ヒトの病状へは関与しないようである。遺伝子をインビトロおよびインビボで移送するためのＡＡＶに由来するベクターの使用について記載されている（Ｄａｌｙら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３４３−１３４６，１２４５−１３１５；Ｌａｒｓｏｎら（２００１）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．４８９：４５−５７；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１８０８８およびＷＯ９３／０９２３９；米国特許第４，７９７，３６８号および第５，１３９，９４１号、ならびにＥＰ ４８８５２８Ｂ１を参照せよ）。
【０１２４】
別の実施形態では、例えば米国特許第５，３９９，３４６号、第４，６５０，７６４号、第４，９８０，２８９号、および第５，１２４，２６３号；Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：１５３；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１１２０；ＥＰ ４５３２４２およびＥＰ１７８２２０に記載されるように、遺伝子をレトロウイルス・ベクター内に導入することができる。レトロウイルスは、分裂細胞に感染する組み込み型ウイルスである。
【０１２５】
脳、網膜、筋肉、肝臓、および血液を含む複数の組織型で本発明の抗体分子コードする核酸の直接送達および持続性発現のための物質として、レンチウイルス・ベクターを用いることができる。そのベクターは、これらの組織内の分裂および非分裂細胞を効率的に形質導入することができ、抗体分子の長期的な発現を維持することができる。概要については、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−８０、およびＫａｆｒｉら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：３１６−３２６を参照せよ。レンチウイルス・パッキング細胞株が利用可能であり、当その技術分野で公知である。その細胞株は、遺伝子療法のための高力価のレンチウイルス・ベクターの生産を促進する。一例としては、少なくとも３〜４日間１０６ＩＵ／ｍｌより多い力価でウイルス粒子を生成することができるテトラサイクリン誘導性ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルス・パッキング細胞株がある。Ｋａｆｒｉら（１９９９）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５７６−５８４）を参照せよ。非分裂細胞をインビトロおよびインビボで効率的に形質導入するために、誘導性細胞株によって産生されるベクターを必要に応じて濃縮することができる。
【０１２６】
シンドビス・ウイルスは、アルファウイルス属のメンバーであり、世界の様々な場所で、１９５３年に始まってその発見以来広範囲に研究されている。アルファウイルス、特にシンドビス・ウイルスにもとづいた遺伝子形質導入は、インビトロで十分に研究されている（Ｓｔｒａｕｓら（１９９４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５８：４９１−５６２；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７；６４３９−６４４６ Ｉｉｊｉｍａら（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８０：１１０−１１８、およびＳａｗａｉら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４８：３１５−３２３を参照せよ）。アルファウイルス・ベクターの多くの特性によって、そのベクターが開発されている他のウイルス由来のベクター系に対する望ましい代替物となり、その特性としては、発現コンストラクトの迅速な操作、感染性粒子の高力価ストックの生産、非分裂細胞の感染、および高度の発現が含まれる（Ｓｔｒａｕｓｓら（１９９４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１−５６２）。遺伝子療法のためのシンドビス・ウイルスの使用について記載されている（Ｗａｈｌｆｏｒｓら（２０００）Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７：４７２−４８０、およびＬｕｎｄｓｔｒｏｍ（１９９９）Ｊ．Ｒｅｃｅｐ．Ｓｉｇ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．１９（１−４）：６７３−６８６）。
【０１２７】
別の実施形態では、リポフェクションまたは他のトランスフェクション促進物質（ペプチド、高分子等）によってベクターを細胞に導入することができる。合成カチオン性脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のインビボおよびインビトロトランスフェクションのためにリポソームを調製することができる（Ｆｅｉｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７、およびＷａｎｇら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１−７８５５）。核酸の移送のための有用な脂質化合物および組成物についてはＰＣＴ公開ＷＯ ９５／１８８６３およびＷＯ９６／１７８２３、ならびに米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。
【０１２８】
ベクターを裸ＤＮＡプラスミドとしてインビボで導入することも可能である。当その技術分野で公知の方法、例えば電気穿孔、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体の使用によって、遺伝子療法用の裸ＤＮＡベクターを所望の宿主細胞中に導入することができる（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０を参照せよ）。受容体媒介ＤＮＡ送達手法も用いることができる（Ｗｕら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４）。米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号は、哺乳動物内でのトランスフェクション促進物質なしでの外因性ＤＮＡ配列の送達を開示している。近年、電子移動と称される比較的に低電圧の高効率性インビボＤＮＡ移送技術について記載されている（Ｖｉｌｑｕｉｎら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１０９７；Ｐａｙｅｎら（２００１）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２９：２９５−３００；Ｍｉｒ（２００１）Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５３：１−１０；ＰＣＴ公開ＷＯ９９／０１１５７、ＷＯ９９／０１１５８、およびＷＯ９９／０１１７５）。
【０１２９】
（薬学的組成物）
インビボでの被験体への投与に適した薬学的に受容可能なキャリアとともに、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを薬学的組成物に組み込むことができる。本発明の範囲には、任意の経路（例えば、経口、眼、局所的、または肺経路（吸入））によって被験体に投与されうる薬学的組成物が包含されるが、腫瘍内注射、静脈内注射、皮下注射、または筋肉内注射等の非経口経路による投与が好ましい。好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、１Ｈ３、１５Ｈ１２、１９Ｄ１２、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＢ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ＬＣＤ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ、１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ、または１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【０１３０】
配合に関する一般的情報については、例えばＧｉｌｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０），Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９０），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ．；Ａｖｉｓら（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ａ．Ｗａｌｔｅｒｓ（ｅｄ．）（２００２）Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｖｏｌ １１９，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒを参照せよ。
【０１３１】
薬学的に受容可能なキャリアは、従来からあり、当その技術分野で非常に公知である。例としては、生理学的に適合している水性および非水性キャリア、安定剤、酸化防止剤、溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤、緩衝剤、血清タンパク質、等張剤、吸収遅延剤等が挙げられる。好ましくは、キャリアは、被験体体内への注入に適している。
【０１３２】
本発明の薬学的組成物で使用可能な適当な水性および非水性キャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）およびその適当な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）、ならびに注入可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。例えば、レクチン等の被覆物質を使用することによって、分散剤の場合は必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。
【０１３３】
乾燥または凍結乾燥の分解作用から、本発明の抗体分子を安定化するために、α、α−トレハロースニ水和物等の安定剤を含むことが可能である。
【０１３４】
薬学的に受容可能な酸化防止剤の例としては、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の水溶性酸化防止剤と、アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール等の油可溶性酸化防止剤と、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等の金属キレート化剤とが挙げられる。
【０１３５】
殺菌手順と、種々の抗菌剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等）の内包との両方によって、微生物の存在の予防を確実にすることが可能である。
【０１３６】
本発明の医薬組成物内に含まれ得る適当な緩衝剤としては、Ｌ−ヒスチジン系緩衝剤、リン酸系緩衝剤（例えば、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ約７）、ソルベート系緩衝剤、またはグリシン系緩衝剤が挙げられる。
【０１３７】
本発明の医薬組成物内に含まれ得る血清タンパク質としては、ヒト血清アルブミンを挙げることが可能である。
【０１３８】
砂糖、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコール、マンニトール、またはソルビトール）、クエン酸ナトリウム、または塩化ナトリウム（例えば、緩衝食塩水）等の等張剤も本発明の医薬組成物内に含むことが可能である。
【０１３９】
モノステアリン酸アルミニウムおよび／またはゼラチン等の吸収を遅延させる作用物質を内包することによって、注入可能な医薬形態の持続性吸収を引き起こすことが可能である。
【０１４０】
グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびその混合物内で、ならびに油内で、分散剤を調製することも可能である。
【０１４１】
薬学的に許容される担体には、無菌注入可能溶液または分散剤の即時調製のための無菌水溶液または分散剤、および無菌粉剤が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当その技術分野で周知である。
【０１４２】
必要に応じて、任意で上記に列記した成分の１種類のまたは組み合わせとともに、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを必要量の適当な溶媒内に組み込み、その後無菌微細濾過することによって、無菌注入可能溶液を調製することができる。一般に、基本的な分散媒および上記に列記したもののなかから必要な他の成分を含有する無菌媒体の中に抗体分子を組み込むことによって分散剤を調製する。無菌注入可能溶液の調製のための無菌粉剤の場合、好ましい調製方法は、予め無菌濾過した溶液から任意の付加的な所望の成分に加えて活性成分の粉剤を生成する真空乾燥および凍結乾燥（凍結乾燥法（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））である。
【０１４３】
本発明の抗体または抗原結合フラグメントを経口投与することも可能である。経口投与用の医薬組成物は、結合組成物に加えて、テンプン（例えば、ジャガイモ、トウモロコシ、または小麦のデンプンまたはセルロース）、デンプン誘導体（例えば、微晶質セルロースまたはシリカ）、砂糖（例えば、ラクトース）、タルク、ステアレート、炭酸マグネシウム、または燐酸カルシウム等の添加剤を含有することが可能である。本発明の抗体または抗原結合フラグメントを含む経口組成物が患者の消化系に十分に許容されることを確実にするために、粘膜構成物または樹脂を含むことが可能である。胃液に溶けないカプセル内に抗体または抗原結合フラグメントを配合することによって、許容度を改善することも望ましくあり得る。粉末形態、ラクトース、タルク、およびステアリン酸マグネシウム内の本発明の抗体または抗原結合フラグメントを標準的な二構成硬ゼラチン・カプセルに充填することによって、カプセル形態でのこの発明の例示的な医薬組成物を調製する。免疫グロブリンの経口投与について記載されている（Ｆｏｓｔｅｒら（２００１）Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｒｅｖ．３：ＣＤ００１８１６）。
【０１４４】
本発明の抗体または抗原結合フラグメントを、局所投与用の医薬組成物内に含むことも可能である。局所投与に適した配合物としては、皮膚を介して処置が必要な部位へと浸透させるために適した液状または半液状製剤が含まれ、例えば、眼、耳、または鼻への投与に適したリニメント剤、ローション、クリーム、軟膏またはペースト、およびドロップがある。
【０１４５】
本発明に係るドロップは、無菌水性もしくは油性溶液または懸濁液を含むことが可能であり、抗体または抗原結合フラグメントを殺菌剤および／または殺真菌剤ならびに／あるいは任意の他の適当な防腐剤の適当な水溶液に溶解し、かつ好ましくは界面活性剤を含むことによって調製され得る。その後、濾過によって得られた溶液を浄化することが可能である。
【０１４６】
本発明に係るローションとしては、皮膚または眼への適用に適したものが含まれる。眼用ローションは、殺菌剤を必要に応じて含有する無菌水性溶液を含むことが可能であり、ドロップの調製方法と同様の方法によって調製され得る。皮膚への適用のためのローションまたはリニメント剤には、乾燥を促進する作用物質および皮膚を冷却する作用物質も含むことが可能であり、その作用物質には、例えば、アルコールまたはアセトン、および／または加湿剤（例えば、グリセロール、あるいはひまし油または落花生油などの油）がある。本発明に係るクリーム、軟膏、またはペーストは、外用のための活性成分の半固体状配合物である。細かく分包された形態または粉末形態の本発明の抗体または抗原結合フラグメントを単独で、あるいは水性流体または非水性流体の溶液または懸濁液中で油脂性または非油脂性の主剤と適当な機器の補助によって混合することによって、それらを作製することが可能である。主剤は、炭化水素（例えば、硬パラフィン、軟パラフィン、液状パラフィン、グリセロール、蜜蝋、金属石鹸）か、粘漿剤か、天然由来の油（例えば、アーモンド油、コーン油、ピーナッツ油、ひまし油、オリーブ油）か、羊毛脂またはその誘導体か、あるいはアルコール（例えば、プロピレングリコール）またはマクロゲルと組み合わせた脂肪酸（例えば、ステアリン酸またはオレイン酸）かを含むことが可能である。配合物は、アニオン性、カチオン性、非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体）などの任意の適当な界面活性剤を組み込むことが可能である。天然ゴム、セルロース誘導体、または無機物質（例えば、珪質シリカ）、および他の成分（例えば、ラノリン）等の懸濁剤も含むことが可能である。
【０１４７】
本発明の抗体および抗原結合フラグメントを吸入によって投与することも可能である。吸入に適当な医薬組成物は、エアロゾルでありうる。本発明の抗体または抗原結合フラグメントの吸入のための例示的な医薬組成物としては、１５ないし２０ｍｌの容積を有するエアロゾル容器が含まれ、そのエアロゾル容器は、好ましくは１，２−ジクロロテトラフルオロエタンおよびジフルオロクロロメタンと組み合わせた推進薬（例えば、フレオン）内に分散させた本発明の抗体または抗原結合フラグメントおよび潤滑剤（例えば、ポリソルベート８５またはオレイン酸）を含み得る。好ましくは、その組成物は、経鼻または経口吸入投与のいずれかに適合させた適当なエアロゾル容器中にある。
【０１４８】
本発明のさらに別の実施形態では、多剤併用療法によって、医薬組成物を投与することができる。例えば、多剤併用療法は、１種類以上の抗癌療法剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂抑制剤、クロマチン機能阻害剤、抗血管形成剤、抗エストロゲン、抗アンドロゲン、抗体療法、または免疫調節剤）と関連させて本発明の医薬組成物を含むことができる。
【０１４９】
「抗癌療法剤（ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」とは、被験体に投与される際に、被験体体内で癌の発達を処置または予防する物質である。１種類以上の抗癌療法手順（例えば、放射線療法または外科的腫瘍摘出術）と関連させて本発明の組成物を投与することが可能である。「抗癌療法手順（ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）」とは、被験体の癌の発病を処置または低減させる被験体でおこなわれる過程である。多剤併用療法を用いる際は、本発明の抗体または抗原結合フラグメント、あるいはその医薬組成物を同時送達のために単一の組成物に配合することが可能であり、または２種類以上の組成物（例えば、キット）に別々に配合することが可能である。さらに、他の療法剤または療法手順を投与する時以外の異なる時間に、抗体または抗原結合フラグメントを被験体に投与することが可能である。例えば、所定の期間にわたって、複数の間隔で非同時的に各投与を与えることが可能である。
【０１５０】
「アルキル化剤」とは、細胞内の任意の分子、好ましくは核酸（例えば、ＤＮＡ）を架橋またはアルキル化することができる任意の物質を指す。アルキル化剤の例としては、メクロレタミン、シクロフォスファミド、イホスファミド、フェニルアラニンマスタード、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌｅｎ）、クロラムブシル（ｓｈｌｏｒａｍｂｕｃｏｌ）、ウラシルマスタード、エストラムスチン、チオテパ、ブスルファン、ロムスチン、カルムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、およびアルトレタミンが挙げられる。
【０１５１】
「代謝拮抗剤」とは、特定の活性、通常はＤＮＡ合成に干渉することによって、細胞増殖および／または代謝を遮断する物質を指す。代謝拮抗剤の例としては、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシン、およびペントスタチンが挙げられる。
【０１５２】
「抗腫瘍抗生物質」とは、ＤＮＡ合成、ＲＮＡ合成、および／またはタンパク質合成を防止または阻害し得る化合物を指す。抗腫瘍抗生物質の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、およびプロカルバジンが挙げられる。
【０１５３】
「有糸分裂抑制剤」は、細胞周期および有糸分裂の正常な進行を防止する。一般に、パクリタキセルおよびドセタキセルなどの微小血管阻害剤が有糸分裂を阻害することができる。ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンなどのビンカアルカロイドも有糸分裂を阻害することができる。
【０１５４】
「クロマチン機能阻害剤」とは、トポイソメラーゼＩまたはトポイソメラーゼＩＩ等のクロマチン・モデリング・タンパク質の正常機能を阻害する物質を指す。クロマチン機能阻害剤の例としては、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、およびテニポシドが挙げられる。
【０１５５】
「抗血管形成剤」とは、血管成長を阻害する任意の薬剤、化合物、物質、または作用物質を指す。例示的な抗血管形成剤としては、決して限定はされないが、ラゾキシン（ｒａｚｏｘｉｎ）、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−α、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、およびバイタクシンが挙げられる。
【０１５６】
「抗エストロゲン」または「抗エストロゲン剤」とは、エストロゲンの作用を低減、拮抗、または阻害する任意の物質を指す。抗エストロゲン剤の例としては、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、アナストロゾール、レトロゾール、およびエキセメスタンが挙げられる。
【０１５７】
「抗アンドロゲン」または「抗アンドロゲン剤」とは、アンドロゲンの作用を低減、拮抗、または阻害する任意の物質を指す。抗アンドロゲンの例には、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、スピロノラクトン、酢酸シプロテロン、フィナステリド、およびシメチジンがある。
【０１５８】
本発明の抗体または抗原結合フラグメントと組み合わせて投与することが可能な抗体療法としては、トラスズマブ（例えば、ハーセプチン）（例えば、Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら（１９９９）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６（４ Ｓｕｐｐｌ １２）：６０−７０を参照せよ）、バイタクシン、およびリツキシマブが挙げられる。
【０１５９】
「免疫調節剤」は、免疫系を刺激する物質である。免疫調節剤の例としては、デニロイキンジフチトックス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、５−フルオロウラシルと組み合わせたレバミソール、インターフェロン、およびインターロイキン−２が挙げられる。「放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）」または「放射線療法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）」とは、電離放射線の投与（好ましくは、腫瘍部位への）によって癌等の疾患を処置することを指す。投与可能な電離放射線の例としては、Ｘ線、ガンマ線（例えば、ラジウム、ウラン、またはコバルト６０により放出）、および粒子線放射（例えば、プロトン、中性子、パイオン、または重イオン）が挙げられる。
【０１６０】
（投与量）
好ましくは、未処置の被験体と比べて、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０ないし１００％の任意の程度までＩＧＦＲ１媒介疾患または症状（例えば、腫瘍増殖）を好適に阻害する「治療上有効な投与量」で本発明の抗体または抗原結合フラグメントを被験体に投与する。癌を阻害する本発明の抗体または抗原結合フラグメントの能力を、ヒト腫瘍での効力を予測する動物モデル系で評価することができる。また、腫瘍細胞増殖を阻害する本発明の抗体または抗原結合フラグメントの能力を当業者に周知のアッセイ（下記参照）によって生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で調べることによって、組成物のこの特性を評価することができる。当業者は、被験体サイズ、被験体の症状の重症度、および選択した特定の組成物または投与経路等の因子にもとづいて、そのような量を決定することができる。
【０１６１】
投与計画を調整して、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供することが可能である。例えば、単一のボーラスを投与することが可能であり、複数回に分けた分量を期間にわたって投与することが可能であり、または治療状況の緊急性によって示されることに比例して分量を減少または増加させることが可能である。投与および投与量の均一性を容易にするために、投与単位形態の非経口組成物を配合することが特に有利である。
【０１６２】
当その技術分野の通常の技術を有する医師または獣医師は、必要とされる有効量の医薬組成物を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医師は、医薬組成物に用いられる本発明の抗体または抗原結合フラグメントの容量を、所望の治療効果を達成するために必要なものより低度で開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させることが可能である。一般に、本発明の組成物の適当な日用量は、治療効果を生むために効果的な最少用量である化合物量であり得る。そのような有効投与量は、一般に、上述の因子に依存する。好ましくは標的部位（例えば、腫瘍）に近接した注 入による投与が好ましい。所望される場合、１日の間で適当な間隔で別々に投与される２回、３回、４回、５回、６回、またはより多くの副用量で、有効な日用量の医薬組成物を投与することが可能である。
【０１６３】
（治療法および投与）
被験体の任意の疾患または症状を処置または予防するために、本発明の抗体または抗原結合フラグメント、および本発明の抗体または抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を用いることが可能であり、その疾患または症状は、ＩＧＦＲ１の発現または活性の増加によってあるいはそのリガンド（例えば、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ）の発現の増加によって媒介され、かつＩＧＦＲ１リガンド結合、活性、または発現の調節によって処置または予防され得る。好ましくは、その疾患または症状は、ＩＧＦＲ１、ＩＧＦ−Ｉ、またはＩＧＲ−ＩＩの濃度の増加によって媒介され、ＩＧＦＲ１リガンド結合、活性（例えば、自己リン酸化活性）、または発現を低下させることによって処置または予防される。好ましくは、その疾患または症状は、悪性疾患であり、より好ましくはＩＧＦＲ１を発現する腫瘍によって特徴付けられる悪性疾患であり、例えば、限定はされないが、膀胱癌、ウイルムス腫瘍、骨癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、子宮頸癌、滑膜肉腫、卵巣癌、膵臓癌、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、転移性カルチノイドに関連する下痢、および血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍（例えば、ビポーマまたはヴァーナー・モリソン症候群）がある。先端巨大症も本発明の抗体分子で処置することが可能である。ＩＧＦ−Ｉの拮抗作用が先端巨大症の処置に関して報告されている（Ｄｒａｋｅら（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．１２：４０８−４１３）。本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体を投与することによっても被験体内で処置することが可能な他の非悪性病状としては、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋再狭窄、または糖尿病の、特に眼の合併症として見出される不適当な微小血管の増殖が挙げられる。
【０１６４】
用語「被験体」とは、任意の生体、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒトを指すことが可能である。好ましい実施形態では、注入等の侵襲性経路（上記参照）によって本発明の抗体および抗原結合フラグメントならびにその医薬組成物を投与する。非侵襲性経路（上記参照）による投与も本発明の範囲内にある。
当その技術分野で公知の医療機器を用いて、組成物を投与することができる。例えば、好ましい実施形態では、皮下用注射針を用いた注入によって、本発明の医薬組成物を投与することができる。
【０１６５】
米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６号に開示される機器等の注射針を用いない皮下注入用機器を用いて、本発明の医薬組成物を投与することも可能である。
【０１６６】
本発明で有用な周知のインプラントおよびモジュールの例としては、調節された速度で薬物を分注するための埋め込み型マイクロインフュージョン・ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、精密な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な薬剤送達のための可変流埋め込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、多重チャンバ区画を有する浸透圧性薬剤送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号が挙げられる。多くの他のそのようなインプラント、送達系、およびモジュールが当業者に周知である。
【０１６７】
（アッセイ）
抗ＩＧＦＲ１抗体を用いて、生体試料中のＩＧＦＲ１を生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で検出することが可能である（例えば、Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）を参照せよ）。抗ＩＧＦＲ１抗体を従来のイムノアッセイで用いることが可能であり、そのイムノアッセイとしては、限定はされないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学、ウエスタン・ブロット法、または免疫沈降法が挙げられる。本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体を用いて、ヒトからＩＧＦＲ１を検出することが可能である。本発明は、生体試料内のＩＧＦＲ１を検出するための方法を提供し、その方法は、生体試料を本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体に接触させることと、ＩＧＦＲ１に結合した抗ＩＧＦＲ１抗体を検出することとによって、生体試料内のＩＧＦＲ１の存在を示すことを包含する。一実施形態では、抗ＩＧＦＲ１抗体を検出可能な標識で直接標識し、直接検出することが可能である。別の実施形態では、抗ＩＧＦＲ１抗体（第１の抗体）を標識せずに、抗ＩＧＦＲ１抗体に結合することができる２次抗体をまたは他の分子を標識する。当業者に周知であるように、第１の抗体の特定の種およびクラスに特異的に結合することができる２次抗体を選択する。例えば、抗ＩＧＦＲ１抗体がヒトＩｇＧである場合、２次抗体は、抗ヒトＩｇＧでよい。標識した２次抗体の存在を検出することによって、生体試料内の抗ＩＧＦＲ１／ＩＧＦＲ１複合体の存在を検出することができる。抗体（例えば、抗ＩＧＦＲ１抗体）に結合することができる他の分子としては、限定はされないが、プロテインＡおよびプロテインＧが挙げられ、それら両方が、例えばピアース・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から市販されている。
【０１６８】
抗ＩＧＦＲ１抗体または２次抗体に適当な標識が開示されており（上掲）、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、磁性物質、および放射性物質を含む。適当な酵素の例としては、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンステラーゼが挙げられる。適当な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロチリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる。磁性物質の例としては、ガドリニウムが挙げられる。適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
【０１６９】
別の実施形態では、検出可能な物質で標識したＩＧＦＲ１標準および標識していない抗ＩＧＦＲ１抗体を利用する競合イムノアッセイによって、ＩＧＦＲ１を生体試料内でアッセイし得る。このアッセイでは、生体試料、標識ＩＧＦＲ１標準、および抗ＩＧＦＲ１抗体を組み合わせて、未標識抗体に結合した標識ＩＧＦＲ１標準の量を測定する。生体試料内のＩＧＦＲ１の量は、抗ＩＧＦＲ１抗体に結合した標識ＩＧＦＲ１標準の量に反比例する。多数の目的のために、上記に開示するイムノアッセイが用いられうる。一実施形態では、抗ＩＧＦＲ１抗体を用いて、細胞培養での細胞内のＩＧＦＲ１を検出し得る。好ましい実施形態では、抗ＩＧＦＲ１抗体を用いて、種々の化合物での細胞処置後に、チロシン・リン酸化の程度、ＩＧＦＲ１のチロシン自己リン酸化の程度、および／または細胞表面上のＩＧＦＲ１の量を測定し得る。この方法を用いて、ＩＧＦＲ１を活性化または阻害するために用いられうる化合物を試験することができる。この方法では、一定期間、１種類の細胞試料を試験化合物で処置し、その一方で別の試料を処置しないでおく。チロシン自己リン酸化を測定しようとする場合、細胞を溶解して、例えば上記に記載したようなイムノアッセイを用いてＩＧＦＲ１のチロシン・リン酸化を測定する。ＩＧＦＲ１の全濃度を測定しようとする場合、細胞を溶解し、上述のイムノアッセイの１つを用いて、全ＩＧＦＲ濃度を測定する。
【０１７０】
ＩＧＦＲ１チロシンリン酸化を測定するための、または全ＩＧＦＲ１濃度を測定するための好ましいイムノアッセイは、ＥＬＩＳＡまたはウエスタン・ブロット法である。ＩＧＦＲの細胞表面濃度のみを測定しようとする場合、細胞を溶解せずに、上記のイムノアッセイの１つを用いて、ＩＧＦＲ１の細胞表面濃度を測定する。ＩＧＦＲ１の細胞表面濃度を測定するための好ましいイムノアッセイは、ビオチンまたは１２５Ｉ等の検出可能な標識で細胞表面タンパク質を標識するステップと、抗ＩＧＦＲ１抗体を用いてＩＧＦＲ１を免疫沈降するステップと、その後標識ＩＧＦＲ１を検出するステップとを包含する。ＩＧＦＲ１の局在化、例えば細胞表面濃度を測定するための別の好ましいイムノアッセイは、免疫組織化学を用いることによるものである。ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタン・ブロット法、免疫組織化学、内在性膜タンパク質の細胞表面標識、および免疫沈降法等の方法は、当その技術分野で公知である。さらに、ＩＧＦＲ１の活性化または阻害のいずれかについて多数の化合物を試験するために、ハイ・スループット・スクリーニングに対してイムノアッセイをスケール・アップすることが可能である。
【０１７１】
また、本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体を用いて、組織またはその組織に由来する細胞内のＩＧＦＲ１の濃度を測定し得る。好ましい実施形態では、その組織は、疾患組織である。より好ましい実施形態では、その組織は腫瘍またはその生検である。その方法の好ましい実施形態では、組織またはその生検は、患者から切除される。その後、その組織または生検をイムノアッセイで用いて、例えばＩＧＦＲ１濃度、ＩＧＦＲ１の細胞表面濃度、ＩＧＦＲ１のチロシン・リン酸化程度、またはＩＧＦＲ１の局在化を、上記に論じた方法によって測定する。その方法を用いて、腫瘍がＩＧＦＲ１を高濃度で発現するか否かを決定し得る。
【０１７２】
上記の診断法を用いて、腫瘍が高濃度のＩＧＦＲ１を発現するかどうかを決定し得、これは、腫瘍が抗ＩＧＦＲ１抗体での処置に十分に応答していることを示し得る。また、その診断法を用いて、腫瘍が高濃度のＩＧＦＲ１を発現する場合は潜在的に癌性であるか、または腫瘍が低濃度のＩＧＦＲ１を発現する場合は良性であるかを決定し得る。さらにまた、その診断法を用いて、抗ＩＧＦＲ１抗体での処置が腫瘍に低濃度のＩＧＦＲを発現させるか否か、および／またはより低度のチロシン自己リン酸化を示させるか否かをも決定し得るため、その方法を用いて処置が成功したかどうかを決定し得る。一般に、抗ＩＧＦＲ１抗体がチロシン・リン酸化を減少させるかどうかを決定する方法は、対象の細胞または組織内のチロシン・リン酸化の程度を測定するステップと、抗ＩＧＦＲ１抗体またはその抗原結合部分を用いてその細胞または組織をインキュベートするステップと、その後その細胞または組織内のチロシン・リン酸化の程度を再測定するステップとを包含する。ＩＧＦＲ１または別のタンパク質（群）のチロシン・リン酸化を測定し得る。その診断法を用いて、組織または細胞が、小人症、骨粗しょう症、または糖尿病に罹患する個体の症例でありうる十分に高濃度のＩＧＦＲ１または十分に高濃度の活性化ＩＧＦＲ１を発現していないかどうかをも決定し得る。ＩＧＦＲ１または活性ＩＧＦＲ１の濃度が低すぎるという診断は、抗ＩＧＦＲ１抗体、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、またはＩＧＦＲ１濃度または活性を増加させるための他の療法用作用物質での処置のために用いられうる。
【０１７３】
また、本発明の抗体を生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で用いて、ＩＧＦＲ１を発現する組織および器官を局在化させ得る。好ましい実施形態では、抗ＩＧＦＲ１抗体を用いて、ＩＧＦＲ１を発現する腫瘍を局在化させ得る。本発明の抗ＩＧＦＲ１抗体の利点は、その抗ＩＧＦＲ１抗体が、投与時に免疫応答を生じないことである。その方法は、抗ＩＧＦＲ１抗体またはその医薬組成物をそのような診断試験が必要な患者に投与するステップと、その患者に画像診断分析を受けさせ、ＩＧＦＲ１発現組織の位置を決定するステップとを包含する。画像診断分析は、医療技術分野で公知であり、限定はされないが、Ｘ線分析、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、またはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）が挙げられる。その方法の別の実施形態では、患者から生検を得て、その患者に画像診断分析を受けさせる代わりに、対象組織がＩＧＦＲ１を発現するかどうかを決定する。好ましい実施形態では、患者内で画像化できる検出可能な作用物質で抗ＩＧＦＲ１抗体を標識し得る。例えば、Ｘ線分析で使用可能なバリウム等の造影剤で、あるいはＭＲＩまたはＣＴで使用可能なガドリニウムキレート化合物等の磁性造影剤で抗体を標識し得る。他の標識用作用物質としては、限定はされないが、９９Ｔｃ等の放射性同位体が挙げられる。別の実施形態では、抗ＩＧＦＲ１抗体を標識せずに、検出可能でありかつ抗ＩＧＦＲ１抗体に結合し得る２次抗体または他の分子を投与することによって画像化する。
【実施例】
【０１７４】
本発明をさらに説明するために以下の実施例を提供するが、本発明の範囲を限定するとは何ら解釈されない。
【０１７５】
（実施例１ 完全ヒト抗ＩＧＦＲ１抗体の構築）
（１．０ 序文）
Ｈｃｏ７遺伝子型のＨｕＭａｂマウス（下記参照）から、ヒト・インスリン様増殖因子受容体１（ＩＧＦＲ１）に特異的な完全ヒト・モノクローナル抗体を生成し、組み換え型ｓＩＧＦＲ１およびＩＧＦＲ１でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞で免疫化した。Ｈｃｏ７マウスの詳細な説明は、米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、第５，７７０，４２９号、第５，７８９，６５０号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９号、および第５，８７７，３９７号、ならびにＨａｒｄｉｎｇら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６に提供される。免疫化用抗原に対して抗原特異的な２５，６００力価の血清ＩｇＧの存在にもとづく融合のために選択したＨｕＭａｂマウス（本明細書中で、番号２３７１６と呼ばれる）から抗体１Ｈ３、抗体１５Ｈ１２、および抗体１９Ｄ１２を単離した。１Ｈ３抗体、１５Ｈ１２抗体、および１９Ｄ１２１抗体は、ＩＧＦＲ１に結合することが判明した。
【０１７６】
（２．０ 材料および方法および結果）
（２．１．抗原）
（２．１．１．）
２種類の形態の抗原、すなわち（１）生細胞（ＩＧＦＲ１でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞）および（２）精製タンパク質（ｓＩＧＦＲ１、α−サブユニットと、ＩＧＦＲ１のβ−サブユニットの細胞外ドメインとを包含するＮＳＯ発現組み換え型タンパク質）でマウスを免疫化した。このタンパク質の生物学的活性型は、グリコシル化形態である。
【０１７７】
（２．１．２．）
可溶性ＩＧＦＲ１抗原による３回の免疫化と、最終尾静脈免疫追加とを、濃度２．６７ｍｇ／ｍｌの精製ＩＧＦＲ１調製物を用いて実行した。可溶性ＩＧＦＲ１をフロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバント（ＣＦＡおよびＩＦＡ）のいずれかと混合し、マウス腹腔内に０．２ｃｃ（立方センチメートル）調製抗原を注入した。無菌ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）内の可溶性ＩＧＦＲ１で最終尾静脈免疫化を実行した。
【０１７８】
（２．１．３．）
ＩＧＦＲ１ ＤＮＡでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を用いた免疫化もまた、実行した。具体的には、ＩＧＦＲ１を発現する１．０〜２．０×１０７ＨＥＫ２９３細胞を含有する無菌食塩水０．２ｃｃを腹腔内に注入することによって、各マウスを免疫化した。
【０１７９】
（２．２．トランスジェニック・マウス）
（２．２．１．）
フィルタ・ケージ内でマウスを飼育し、免疫化時、採血時および融合を実行した日に良好な健康状態であることを評価した。
【０１８０】
（２．２．２．）
選択したハイブリドーマを産生したマウスは、（ＣＭＤ）＋＋、（Ｈｃｏ７）１１９５２＋、（ＪＫＤ）＋＋、（ＫＣｏ５）９２７２＋遺伝子型の雄（マウスＩＤ番号２３７１６）であった。個々の導入遺伝子の名称は、括弧内にあり、その後に、無作為に組み込んだ導入遺伝子に関する系統番号が続く。記号＋＋および＋は、ホモ接合性またはヘミ接合性であることを示す。しかし、慣用的に、無作為に組み込まれたヒトＩｇ導入遺伝子に対してはヘテロ接合性とホモ接合性との間の識別が不可能なＰＣＲにもとづくアッセイを用いてマウスをスクリーニングするので、＋名称を、これらのエレメントに対して実質的にホモ接合性のマウスとし得る。
【０１８１】
（２．３．免疫化手順および計画表）
（２．３．１．）
免疫化計画表を下記の表に示す。
【０１８２】
（表２ マウス免疫化計画表）
【０１８３】
【表２】
１力価情報を下記に示す。
２１３１日目に融合を実行した。
【０１８４】
（表３ 表２（上記参照）に記載するマウス２３７１６の免疫化期間中のＩＧＦＲ１特異的抗体の力価）
【０１８５】
【表３】
（２．４．ハイブリドーマ調製および試験）
（２．４．１．）
ＳＰ２／０−ＡＧ１４骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８１）を融合のために用いた。最初のＡＴＣＣバイアルを解凍して、培養で増殖させた。冷凍バイアルの種（ｓｅｅｄ ｓｔｏｃｋ）をこの増殖から調製した。６〜８週間、細胞を培養物中で維持して、１週間に２度移した。
【０１８６】
（２．４．２．）
１０％ＦＢＳ、抗生物質−抗真菌剤（１００×）、および０．１％Ｌ−グルタミンを含有する高グルコースＤＭＥＭを用いて、骨髄腫細胞を培養した。５％オリゲン・ハイブリドーマ・クローニング・ファクター（Ｏｒｉｇｅｎ−−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｓｕｗａｎｅｅ，ＧＡ）、４．５×１０−４Ｍピルビン酸ナトリウム、ＨＡＴ １．０×１０−４Ｍヒポキサンチン、４．０×１０−７Ｍアミノプテリン、１．６×１０−５ＭチミジンまたはＨＴ １．０×１０−４Ｍヒポキサチン、１．６×１０−５Ｍチミジン、および特性が明らかな胎児ウシ血清を含むハイブリドーマ増殖培地に追加の培地補充を加えた。
【０１８７】
（２．４．３．）
マウス番号２３７１６由来の脾臓は、大きさが正常であり、５．７３×１０８生細胞を産生した。
【０１８８】
（２．４．４．）
以下の手順にしたがって脾細胞を融合した。すなわち、
１．ＤＭＥＭ＋１０％ＰＢＳ約１０ｍｌを５０ｍＬ管に入れる。
【０１８９】
２．静脈内で追加免疫したマウスを屠殺する。
【０１９０】
３．そのマウスをペーパー・タオル上のフード中に移す。
【０１９１】
４．マウスをアルコールに浸して、その右側を上にして置く。
【０１９２】
５．脾臓領域の上方の皮膚を小さく切断する。
【０１９３】
６．両手を使ってマウスから皮膚を引き剥がす。
【０１９４】
７．アルコールに再び浸す。
【０１９５】
８．無菌器具を用いて、腹膜を開口する。
【０１９６】
９．鋏の先端を脾臓の下に挿入し、ピンセットで脾臓を掴む余地があるように鋏を広げる。
【０１９７】
１０．脾臓を取り出して、ＤＭＥＭ＋１０％ＰＢＳを含有する管に入れる。無菌組織培養室に移す。
【０１９８】
１１．無菌フード内部で、２つの無菌６０ｍｍ培養皿のそれぞれに、無血清のＤＭＥＭ約７ｍＬを添加する。
【０１９９】
１２．脾臓を第１の皿に移す。
【０２００】
１３．無菌器具を用いて、脾臓からいずれの付着物も除去する。
【０２０１】
１４．無菌ホモジナイザーの底部を試験管ラック（支持用）に置く。
【０２０２】
１５．浄化した脾臓をそのホモジナイザーに加える。
【０２０３】
１６．ＤＭＥＭ約５ｍＬを添加して、４回の操作で均質化する。無菌５０ｍＬ遠心管に注ぐ。
【０２０４】
１７．ホモジナイザーにＤＭＥＭをさらに５ないし６ｍｌ添加して、さらに３ないし４回追加の操作をする。
【０２０５】
１８．上記のように同管に注ぐ。
【０２０６】
１９．遠心機で、１０００ｒｐｍで１０分間細胞をスピンする。
【０２０７】
２０．上清を除去する。ペレットをＤＭＥＭに注いで再懸濁する。
【０２０８】
２１．脾臓細胞を計数する。
【０２０９】
２２．適当な容量のＳＰ２／０細胞（ＳＰ２／０細胞１個あたり６個の脾臓細胞）を５０ｍＬ遠心管に移す。容量を記録する。
【０２１０】
２３．遠心のために都合よく均衡させるために、ＤＭＥＭを用いて脾臓細胞の容量を調整する。
【０２１１】
２４．遠心機で、１０分間１０００ｒｐｍで細胞をスピンする。
【０２１２】
２５．上清を除去する。ＤＭＥＭ洗浄培地（無血清）３０〜４０ｍＬにペレットを注いで再懸濁する。全ての細胞を１つの管にまとめる。
【０２１３】
２６．上記のように再びスピンする。
【０２１４】
２７．上清を除去して、ペレットを再懸濁する。
【０２１５】
２８．３７℃水を含有するビーカー内で管を穏やかに旋回させながらＰＥＧ（ポリエチレングリコール）約１．２ｍＬを約１分目に添加する。
【０２１６】
２９．管を９０秒静置し、その後、３分目にＤＭＥＭ洗浄培地１５ｍＬを添加する。
【０２１７】
３０．上記のように管をスピンする。
【０２１８】
３１．上清を除去して、ペレットを穏やかに再懸濁する。
【０２１９】
３２．Ｈａｔ培地約１０ｍＬを管に添加する。
【０２２０】
３３．ＨＡＴ培地の全容量中に細胞をピペッティングする。播種前に、インキュベーター内で細胞を３０〜６０分間静置する。
【０２２１】
３４．２００μＬ／ウェル（９６ウェル・プレートあたり約１×１０７細胞）で、９６ウェル培養プレート中に細胞を播種する。
【０２２２】
３５．７日目に、２５０μｌ／ウェルでＨＴ培地（アミノプテリンを除いたＨＡＴ培地と同様のＨＴ培地）を細胞に供給する。
【０２２３】
（２．４．５．）
融合後７〜１０日目に、下記の手順にしたがってヒトＩｇＧκ抗体に対する最初のＥＬＩＳＡスクリーニングを実行した。すなわち、
１．５０μＬ／ウェルで、１×ＰＢＳ中の抗ｈｕ−κ（１μｇ／ｍＬ）または抗ｈｕ−γ（１μｇ／ｍＬ）でプレートを一晩被覆する。冷蔵庫内で保存する。
【０２２４】
２．プレートを空にして、１×ＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎを有するＰＢＳ）＋５％ニワトリ血清中でプレートを１時間室温で遮断する（１００μＬ／ウェル）。
【０２２５】
３．プレートを空にして、１×ＰＢＳＴを用いて、手動で洗浄ビンによって（３回）、またはプレート洗浄器によって（３回）洗浄する。洗浄ビンを用いる場合は、プレートをペーパー・タオル上で排水する。
【０２２６】
４．クローンの生産程度を試験するために標準を用いる。未知物を有する希釈を作製する（第１のウェル中で１：１０で希釈し、そしてプレート全体にわたって２倍で希釈する）。Ｈｕ−ＩｇＧ標準は、１０００ｎｇ／ｍＬで開始し、プレート全体にわたって２倍で希釈する。少数のウェルをブランク用に残しておく。すなわち、１００μＬ／ウェルで、希釈用に用いた１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清。室温で１時間インキュベートする。遮断用緩衝液で１：２に希釈して、融合スクリーニングおよびサブクローニングを一般的に試験する。融合およびサブクローニングをスクリーニングする際、陽性対照もまた用い得る。
【０２２７】
５．洗浄ステップ３を繰り返す。
【０２２８】
６．２次抗体ＨＲＰ（ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ）−抗ｈｕＩｇＧ−Ｆｃ試薬またはＨＲＰ−抗ｈｕ−κを、１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清中で、１：５０００で希釈する。１００μＬ／ウェルで添加する。室温で１時間インキュベートする。
【０２２９】
７．洗浄ステップ３を繰り返す（２回）。
【０２３０】
８．プレート毎に１０ｍｌクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、８０μＬ ＡＢＴＳ、８μＬ Ｈ２Ｏ２を用いて、プレートを展開する。
【０２３１】
９．室温で３０分〜１時間インキュベートする。ＯＤ４１５ｎｍ〜４９０ｎｍでプレートを読み取る。
【０２３２】
（溶液）
１×ＰＢＳＴ＝１×ＰＢＳ＋０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０
クエン酸リン酸緩衝液＝２１ｇｍ／Ｌクエン酸、１４．２ｇｍ／Ｌリン酸水素二ナトリウム（無水）（ｐＨ４．０）
ＡＢＴＳ＝クエン酸緩衝液中２７．８ｍｇ／ｍＬ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チオゾリン−６−スルホン酸）ニアンモニウム塩、１ｍＬアリコートを冷凍。
【０２３３】
プレート＝９６ウェル・アッセイ・プレート
ハイブリドーマ１Ｈ３、１５Ｈ１２、および１９Ｄ１２に対応するウェル中で、陽性ＥＬＩＳＡシグナルを検出し、これらのハイブリドーマがヒトＩｇＧ抗体を産生することが実証された。
【０２３４】
（２．４．６．）
その後、以下の手順にしたがって、ヒトＩｇＧκ陽性ウェルに対応するハイブリドーマ上清を可溶性ＩＧＦＲ１被覆ＥＬＩＳＡプレート上でスクリーニングした。すなわち、
１．５０μＬ／ウェルで、１×ＰＢＳ中のＩＧＦＲ１（１．０μｇ／ｍＬ）でプレートを一晩被覆する。冷蔵庫で保存する。プレートを被覆するためには５ミリリットルが必要である。
【０２３５】
２．プレートを空にして、１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清中でプレートを１時間室温で遮断する（１００μＬ／ウェル）。
【０２３６】
３．プレートを空にして、１×ＰＢＳＴを用いて、手動で洗浄ビンによって（３回）、またはプレート洗浄器によって（３回）洗浄する。洗浄ビンを用いる場合は、プレートをペーパー・タオル上で排水する。
【０２３７】
４．遮断用緩衝液を希釈剤として用いる。プレートの最上列で１：５０希釈率で始めて血清を試験し、プレートの列を下がるごとに２倍で希釈する（７回）。室温で１時間インキュベートする。サブクローン・スクリーニングのために、遮断用緩衝液中の１：１希釈の培養上清を出発物質として用いる。
【０２３８】
５．洗浄ステップ３を繰り返す。
【０２３９】
６．１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清中で、２次ＨＲＰ−抗ｈｕ ＩｇＧ−Ｆｃ特異的試薬および／またはＨＲＰ−抗ｈｕ−κ試薬を１：２５００〜５０００で希釈し、１００μＬ／ウェルで添加する。室温で１時間インキュベートする。
【０２４０】
７．洗浄ステップ３を繰り返す（２回）。
【０２４１】
８．プレート毎に１０ｍＬクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、８０μＬ ＡＢＴＳ、８μＬ Ｈ２Ｏ２を用いて、プレートを展開する。
【０２４２】
９．室温で３０分〜１時間インキュベートする。ＯＤ４１５ｎｍ−４９０ｎｍでプレートを読み取る。バックグラウンド力価限度にわたって２回検討する。
【０２４３】
これらのアッセイで、ハイブリドーマ１５Ｈ１２および１９Ｄ１２は、陽性ＥＬＩＳＡシグナルを産生した。これらのデータによって、そのハイブリドーマが、可溶性ＩＧＦＲ１に結合することができる抗体を産生することが実証される。
【０２４４】
その後、抗原陽性ハイブリドーマを２４ウェルプレートに移し、最終的には組織培養フラスコに移した。ＩＧＦＲ１特異的ハイブリドーマを限界希釈法によってサブクローニングして、単クローン性を確認した。オリゲン（Ｏｒｉｇｅｎ）ＤＭＳＯ冷凍培地（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｓｕｗａｎｅｅ，ＧＡ）中で細胞を冷凍することによって、展開過程の複数の段階で抗原陽性ハイブリドーマを保存した。
【０２４５】
（２．４．７．）
以下の手順にしたがって抗体アイソタイプを測定した。すなわち：
１．５０μＬ／ウェルで、１×ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬ可溶性ＩＧＦＲ１でプレートを一晩冷蔵庫内で被覆する。プレートを空にする。
【０２４６】
２．室温で１時間、１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清を添加する（１００μＬ／ウェル）。プレートを空にする。
【０２４７】
３．ブロッキング緩衝液を希釈剤として用い、試験すべき上清または精製物質を、試験すべき２次抗体（５０μＬ／ウェル）あたり１ウェルで添加する。室温で９０分間インキュベートする。プレートを空にする。
【０２４８】
４．プレートを空にして、１×ＰＢＳＴを用いて、手動で洗浄ビンによって（３回）、またはプレート洗浄器によって（３回）洗浄する。洗浄ビンを用いる場合は、プレートをペーパータオル上で排水する。
【０２４９】
５．ブロッキング緩衝液を希釈剤として用い、１：１０００で希釈した２次抗体、すなわち：
ＨＲＰ−抗ｈｕ−γ、
ＨＲＰ−抗ｈｕ−κ、
ＨＲＰ−抗ヒトＩｇＧＩ、または
ＨＲＰ−抗ヒトＩｇＧ３
を添加する。室温で４５分間インキュベートする。プレートを空にする。
【０２５０】
６．洗浄ステップ４を繰り返す（３回）
７．プレート毎に１０ｍＬクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、８０μＬ ＡＢＴＳ、８μＬ Ｈ２Ｏ２を用いて、プレートを展開する。
【０２５１】
８．室温で３０分〜１時間インキュベートする。ＯＤ４１５ｎｍ−４９０ｎｍでプレートを読み取る。
【０２５２】
これらのアッセイから得たデータを下記に表４で示す。
【０２５３】
（表４ アイソタイプＥＬＩＳＡ結果＊）
【０２５４】
【表４】
＊各数値は、各２次抗体に関して観察されたＥＬＩＳＡシグナルの大きさ（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）を表す。
【０２５５】
これらのデータによって、抗体１５Ｈ１２がＩｇＧ３κ抗体であることが実証される。
【０２５６】
(２．４．８)
固定化細胞ＥＬＩＳＡアッセイで、ＩＧＦＲ１を発現する細胞に直接結合する能力に関して、ハイブリドーマ上清（１Ｈ３、１５Ｈ１２、および１９Ｄ１２）ならびにＭＡＢ３９１も試験した。そのアッセイでは、ＩＧＦＲ１ ＤＮＡでトランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞またはＨＥＫ２９３細胞を用いた。アッセイを以下のように実行した。すなわち：
１．９６ウェルプレートの各ウェルに、１×ＰＢＳ中の２０μｇ／ｍＬポリ−Ｌ−リジン溶液を５０μｇ／ウェルで添加し、室温で３０分間または４℃で一晩インキュベートする。プレートを空にして、ウェルからポリ−Ｌ−リジンを除去し、使用するまで室温で乾燥させる。
【０２５７】
２．遠心（１０００ＲＰＭ／５分）によって、１×ＰＢＳを用いて生細胞を３回洗浄する。１×ＰＢＳ中で、最終細胞濃度をウェルあたり２×１０６細胞に調整する。この細胞懸濁液をウェルあたり５０μＬ添加する。
【０２５８】
３．細胞を５分間２０００ＲＰＭでスピンする。緩衝液を破棄する。
【０２５９】
４．１×ＰＢＳ中の０．５％氷冷グルタルアルデヒドを５０μＬ／ウェルで添加する。室温で１５分間静置する。プレートを空にする。
【０２６０】
５．１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清を添加して、室温で１時間インキュベートする（１００μＬ／ウェル）。プレートを空にする。
【０２６１】
６．１×ＰＢＳＴを用いてプレートを穏やかに洗浄する（２回）。細胞の損失を避けるために、任意のプレート洗浄器は避けて容器内で、このステップを手動でおこなうべきである。
【０２６２】
７．ブロッキング緩衝液を希釈剤として用いて、１：１希釈の１００μｇを添加することによって培養上清を試験する。室温で１時間インキュベートする。
【０２６３】
８．ステップ６を繰り返す（３回）。
【０２６４】
９．１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清で２次ＨＲＰ−抗ｈｕ ＩｇＧ−Ｆｃ特異的試薬および／またはＨＲＰ−抗ｈｕ−κ試薬を１：２５００〜５０００に希釈し、１００μＬ／ウェルで添加する。室温で１時間インキュベートする。
【０２６５】
１０．ステップ６を繰り返す（３回）
１１．プレート毎に１０ｍｌクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、８０μＬ ＡＢＴＳ、８μＬ Ｈ２Ｏ２を用いて、プレートを展開する。
【０２６６】
１２．室温で１５分〜２０分インキュベートする。ＯＤ４１５ｎｍ−４９０ｎｍでプレートを読み取る。
【０２６７】
これらのアッセイから得た結果によって、ハイブリドーマ１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２が、ＩＧＦＲ１を発現するＨＥＫ２９３細胞に結合する免疫グロブリンを産生することならびに、ハイブリドーマ１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２が、内因性ＩＧＦＲ１を発現するＭＣＦ−７細胞に結合する免疫グロブリンを産生することとが実証された。さらに、この結果によって、ＩＧＦＲ１発現ＨＥＫ２９３細胞に、かつＭＣＦ−７細胞にＭＡＢ３９１が結合することが実証された。
【０２６８】
（２．４．９．）
１）ＩＧＦＲ１発現ＨＥＫ２９３細胞上およびＭＣＦ７細胞上の上清の染色強度ならびに、２）ＩＧＦＲ１発現細胞へのＩＧＦ１−ビオチンの結合を阻害する上清の能力とを測定することによって、ハイブリドーマ上清（１Ｈ３、１５Ｈ１２、および１９Ｄ１２）のＩＧＦＲ１に対するＩＧＦ１の結合を阻害する能力を評価した。最初に、本発明の抗体によるＩＧＦ１のその受容体への結合の阻害を評価するための適切な濃度を確立するために、ＩＧＦＲ１発現ＨＥＫ２９３細胞上でビオチン標識ＩＧＦ１を滴定した。以下の手順によってこれをおこなった。すなわち：
１．フラスコを叩いて円錐管にピペッティングした細胞をほぐすことによって、ＩＧＦＲ１発現ＨＥＫ２９３細胞をフラスコから回収する。その後、その細胞を３００×ｇで５分間遠心して、細胞をペレット化する。その後、培地を吸引する。
【０２６９】
２．０．０２％ アジ化ナトリウムを含有する１０〜２０ｍＬＰＢＳで、細胞を洗浄し、約２．５×１０６細胞／ｍＬ（±１０６細胞）で、同緩衝液中で再懸濁する。４℃で、同緩衝液中で、９６ウェルマイクロタイタープレート中に細胞を２００μＬ／ウェルでアリコートする。細胞をペレット化し、上清を吸引する。
【０２７０】
３．同緩衝液中で、５０μＬ／ウェルの連続希釈したＩＧＦ１−ビオチンを添加することによって、細胞を染色する。１：５希釈で開始して、その後４倍連続希釈する。プレートを軽く叩くか、または穏やかにボルテックスして、細胞の均一な懸濁液が懸濁されていることを確実する。その後、細胞を４℃で３０分間インキュベートする。
【０２７１】
４．最初の洗浄のために１５０μＬ緩衝液を添加することによって、細胞を３回洗浄し、その後ペレット化する。上清を吸引して、２００μＬ緩衝液を添加する。再び、細胞をペレット化して、上清を吸引する。この洗浄ステップをさらにもう１度繰り返す。ストレプトアビジン−ＰＥ（ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン）を添加して、細胞を４℃で３０分間インキュベートする。
【０２７２】
５．２％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化物を含有するＰＢＳで、細胞を１回洗浄し、５０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムも含有する以外は同じ緩衝液で再懸濁し、死細胞を除外する。
【０２７３】
６．細胞をＦＡＣＳによって分析する。
【０２７４】
ブロッキングアッセイを以下のように実行した。すなわち、
１．フラスコ側面を叩いて細胞をほぐすことによって、組織培養フラスコからＭＣＦ７細胞またはＨＥＫ２９３／ＩＧＦＲ１細胞を回収する。細胞を円錐管にピペッティングする。その管を３００×ｇで５分間遠心して、細胞をペレット化する。培地を吸引する。
【０２７５】
２．２％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＰＦＡ）１０〜２０ｍＬで、細胞を洗浄し、約２．５×１０６（±１×１０６）で、同緩衝液中で再懸濁する。４℃で、同緩衝液中で、９６ウェルマイクロタイタープレート中に２００μＬ／ウェルでアリコートする。細胞をペレット化し、緩衝液を吸引する。
【０２７６】
３．培地（陰性）対照および陽性対照としてのＭＡＢ３９１を含む１００μＬ／ウェルを添加することによって、各ＩＧＦＲ１ハイブリドーマ上清で細胞を染色する。プレートを軽く叩いて、細胞の均一な懸濁を確実にする。４℃で３０〜６０分間インキュベートする。
【０２７７】
４．最初の洗浄のために１００μＬ緩衝液を添加することによって、ＰＦＡ中で細胞を３回洗浄し、ペレット化および吸引をして、２００μＬ緩衝液中で再懸濁し、ペレット化および吸引をして、２００μＬ緩衝液中で再び再懸濁し、各試料を２つのウェルに分けてペレット化する。
【０２７８】
５．ウェルの１セットに、上清染色試料および培地対照に対してＰＦＡ（パラ−ホルムアルデヒド）で１：１００で希釈した抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣを添加し、ＭＡＢ３９１染色試料に対して１：２００希釈の抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣを添加し、再び、細胞の均一な分散を確実にする（染色アッセイ）。４℃で３０分間インキュベートする。
【０２７９】
６．ウェルの第２のセットに、０．０２％アジ化物を含有するＰＢＳ（ＦＢＳなし）で１：５００で希釈したＩＧＦ１−ビオチンを添加し、４℃で３０分間インキュベートする。ステップ４に記載するように（ただし、試料の分割はせずに）、細胞を３回洗浄する。ＰＦＡ中でストレプトアビジン−ＰＥ（ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン）を添加することによって、これらの細胞を染色する（ブロッキングアッセイ）。４℃で３０分間インキュベートする。
【０２８０】
７．ＰＦＡで全ての試料を１回洗浄し、５０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムも含有する以外は同じ緩衝液中で再懸濁して、死細胞を除外する。
【０２８１】
８．ＦＡＣＳ分析によって分析する。
【０２８２】
これらのブロッキングアッセイから得た結果によって、ハイブリドーマ１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２由来の上清が、ビオチン標識ＩＧＦ１のＩＧＦＲ１への結合を阻害し、内因性ＩＧＦＲ１を発現するＭＣＦ７細胞を染色し、かつＩＧＦＲ１を発現するＨＥＫ２９３細胞を染色することが実証された。
【０２８３】
（２．４．１０）
以下の手順にしたがって、ＩＧＦＲ１へのビオチン標識ＩＧＦ１の結合を阻害する精製抗体１Ｈ３および１５Ｈ１２の能力をＥＬＩＳＡアッセイで評価するとともに、ＩＧＦＲ１へのビオチン標識ＭＡＢ３９１の結合を阻害する抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２の能力もＥＬＩＳＡアッセイで評価した。
【０２８４】
１．５０μＬ／ウェルの１×ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬ可溶性ＩＧＦＲ１でプレートを一晩冷蔵庫内で被覆する。
【０２８５】
２．室温で１時間、１×ＰＢＳＴ＋５％ニワトリ血清を添加する（１００μＬ／ウェル）。プレートを空にする。
【０２８６】
３．洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを３回洗浄する。プレートを叩いて乾燥させる。
【０２８７】
４．プレート全体にわたって、２μｇ／ｍＬ １Ｈ３、１５Ｈ１２または１９Ｄ１２あるいは陽性または陰性対照抗体をブロッキング緩衝液中で希釈する。プレートを室温で１時間インキュベートする。
【０２８８】
５．洗浄緩衝液中でプレートを３回洗浄する。
【０２８９】
６．ビオチン−ＩＧＦ１またはビオチン−ＭＡＢ３９１を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で３０分間インキュベートする。
【０２９０】
７．プレートを３回洗浄する。
【０２９１】
８．ストレプトアビジン標識アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で３０分間インキュベートする。
【０２９２】
９．プレートを３回洗浄する。使用する標識に応じた適当な試薬で展開する。
【０２９３】
１０．１０〜１５分後に読み取る。
以下の手順にしたがって、ＭＡＢ３９１をビオチン標識した。すなわち、
１．ＰＢＳ緩衝液中でＭＡＢ３９１を調製する（透析または脱塩カラムを用いて、Ｔｒｉｓまたはグリシン等の不要な緩衝液を除去する）。
【０２９４】
２．スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン溶液の新たなストック溶液を使用直前に調製する。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン２．０ｍｇを２００ｍＬ蒸留水に添加する。ＭＡＢ３９１の１０ｍｇ／ｍＬで作業する場合は１２倍過剰モルで、またはＭＡＢ３９１（２ｍｇ／ｍＬ）の希釈調製物で作業する際は２０倍過剰モルで、この試薬をＭＡＢ３９１に添加する。
【０２９５】
３．計算：ミリモルＭＡＢ３９１＝ｍｇタンパク質／１５０，０００ミリモル×１２または２０＝添加するミリモルビオチン試薬
添加するミリモルビオチン×５５６＝添加するｍｇビオチン試薬
１ｍｇ／ｍＬについて：
１／１５００００＝６．６×１０−６
２０×６．６×１０−６ミリモル＝１／３２×１０−４ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン
１．３２×１０−４×５５６＝０．０７３ｍｇスルホＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン
ストックＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン溶液から、１または２ｍｇに対するｍｇＩｇＧあたり１０μＬ（１００μｇ）の溶液を用いる。
【０２９６】
４．氷上で２時間または室温で３０分間インキュベートする。ＰＢＳに対して透析するか、または脱塩カラムを用いて、未反応のビオチン試薬を除去する。ＰＢＳ ０．１％アジ化ナトリウム中で、４℃で保存する。一般に、標識した各ＩｇＧ分子に３〜５個のビオチンを添加すべきである。
【０２９７】
これらのブロッキングアッセイから得た結果によって、抗体１Ｈ３および１５Ｈ１２が、ｓＩＧＦＲ１へのビオチン標識ＩＧＦ１の結合を遮断することと、抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２が、ｓＩＧＦＲ１へのビオチン標識ＭＡＢ３９１の結合をブロッキングすることとが実証された。
【０２９８】
（２．４．１１．）
以下の手順にしたがって、ＩＧＦＲ１と１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２抗体との間の結合をビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）／表面プラズモン共鳴アッセイで評価した。すなわち：
１．アミンカップリング法によって、フローセル上で３５０．４応答単位のレベルに、ＩＧＦＲ１をＣＭ−５チップ上で固定化する。固定化に用いるＩＧＦＲ１の濃度は、酢酸ナトリウム緩衝液中で２．５μｇ／ｍＬであり、タンパク質をｐＨ３．５で固定化する。
【０２９９】
２．プロテインＡまたはプロテインＧカラム上でハイブリドーマ上清から抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって純度に関して試験する（４％〜１２％Ｔｒｉｓ−グリシン）。
【０３００】
３．上記で調製したＩＧＦＲ１表面にわたって抗体を流れさせる。
【０３０１】
４．用いる抗体の濃度範囲は、４、２、１、０．５および０．２５μｇ／ｍＬである。バックグラウンド置換のためにブランクも用いる。試料をＨＢＳ緩衝液中で調製する。
【０３０２】
５．注入時間（結合相）は、流速２０μＬ／分で１０分間であり、解離時間（解離相）は、同じ流速で１時間である。
【０３０３】
６．２５℃および３７℃両方でアッセイを実行する。全ての実験を二連でおこなう。
【０３０４】
７．ビア−エバリュエーション（Ｂｉａ−Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）ソフトウェアｖ．３．０．２（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、データ分析を実行する。
【０３０５】
８．ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）３０００表面プラズモン共鳴機器（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、全ての実験を実行する。
【０３０６】
これらのアッセイの結果によって、抗体１５Ｈ１２および１９Ｄ１２が２５℃および３７℃でＩＧＦＲ１と結合することと、抗体１Ｈ３が２５℃でＩＧＦＲ１と結合することとが実証された。これらの実験から得たデータを用いて、ＩＧＦＲ１に結合する１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２の親和性および速度定数も計算した（下記、表５参照を参照のこと）。
【０３０７】
（表５ ＩＧＦＲ１との抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２の親和性および速度定数）
【０３０８】
【表５】
＃半減期として計算＝ｌｎ（２／ｋｏｆｆ）
【０３０９】
（実施例２ 細胞にもとづく受容体結合アッセイ）
細胞にもとづく受容体結合アッセイを用いて、ＩＧＦＲ１への結合に対して抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２がＩＧＦ１と競合するか否かについて測定した。
【０３１０】
このアッセイでは、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳを用いて９６ウェルフィルタプレート（１．２μｍ孔）を４℃で２時間予め湿らせた。その後、緩衝液を真空マニホルドで除去した。種々の濃度の６×対照または試験抗体（１Ｈ３、１５Ｈ１２または１９Ｄ１２）をウェルに添加した（２５μＬ）。その後、［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−１リガンドをＢＳＡ／ＰＢＳ中での最終濃度０．３７５ｎＭでウェルに添加した。細胞解離溶液を用いて、細胞を回収し、トリパンブルーで計数し、細胞数１〜３×１０５／ｍｌに０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで再懸濁した。１００μｌの細胞（１０，０００〜３０，０００個）を各ウェルに添加した。プレートを４℃で１時間振盪した。その後、プレートを吸引して、真空マニホルドを用いて、氷冷ＰＢＳによって３回洗浄した。フィルタに孔をあけて、ガンマ線計数器で計数した。競合結合に関してデータを分析した。
これらの実験の結果によって、ＩＧＦＲ１への結合に対して１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２がＩＧＦ−Ｉと競合できることが示された。
【０３１１】
（実施例３：ＩＧＦＲ１自己リン酸化アッセイ）
ＩＧＦＲ１自己リン酸化を阻害する１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２の能力も測定した。
【０３１２】
抗体（１Ｈ３、１５Ｈ１２または１９Ｄ１２）を、ＩＧＦＲ１を保持する細胞に種々の時間長で添加した。その後、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ−Ｉで細胞を３７℃で５分間刺激した。０．１ｍＭバナジン酸ナトリウムを含有する冷ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％トリトン×−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤および２ｍＭバナジン酸ナトリウム）中で溶解した。溶解物を氷上で３０分間インキュベートし、その後４℃で１０分間１３，０００ＲＰＭで遠心した。クーマシー比色定量アッセイによって溶解物のタンパク質濃度を測定し、免疫沈降法およびウエスタンブロット法をおこなった。
【０３１３】
これらのアッセイの結果によって、抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２および１９Ｄ１２が０．１０ｎＭのＩＣ５０でＩＧＦＲ１自己リン酸化を阻害することが示された。
【０３１４】
（実施例４ 足場非依存性増殖（軟寒天）アッセイ）
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７、ヒト結腸直腸癌細胞ＨＴ２９、およびヒト前立腺癌細胞ＤＵ１４５を含む種々の細胞の足場非依存性増殖を阻害する抗ＩＧＦＲ１抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２、１９Ｄ１２、およびＭＡＢ３９１の能力を評価した。
【０３１５】
これらの実験では、完全ＭＥＭ培地中の０．６％アガロース３ミリリットルを６ウェル組織培養プレート中の各ウェルに添加し、固体化させた（下層）。抗体１Ｈ３、１５Ｈ１２、１９Ｄ１２、またはＭＡＢ３９１（上記に論じた）の１００マイクロリットルを様々な濃度で培養管に添加した。細胞を回収した。細胞のアリコート（１５，０００個の細胞）を、抗体を含有する培養管に添加し、室温で１０ないし１５分間インキュベートした。０．３５％アガロース／完全最小必須培地（ＭＥＭ）層（上層）の３ミリリットルを抗体／細胞混合物に添加して、その後、固体化下層にプレートした。上層を固体化させた。その後、プレートを３週間インキュベートした。ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−臭化テトラゾリウム）をウェルに添加して、１ないし２時間インキュベートした。プレートを走査して、カスタマイズしたコロニー計数器適用プログラムを用いてコロニーを計数および分析した。
【０３１６】
これらの実験の結果によって、抗ＩＧＦＲ１抗体が試験した３種類の悪性細胞株全ての足場非依存性増殖を阻害することができることが実証された。
【０３１７】
（実施例５ ハイブリドーマ由来抗体の可変領域のクローニング）
以下の手順にしたがって、１Ｈ３、１５Ｈ１２、および１９Ｄ１２可変領域をコードする核酸をハイブリドーマから得た。
【０３１８】
マイクロ−ファースト・トラック（Ｍｉｃｒｏ−Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、２×１０６ハイブリドーマ細胞由来のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製した。「ｃＤＮＡサイクル（ｃＤＮＡ Ｃｙｃｌｅ）」キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に記載される手順にしたがって、その可変領域をコードする細胞ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製した。
【０３１９】
５’ＲＡＣＥ（Ｃｌｏｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）技術を利用して、ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて抗体可変領域をＰＣＲ増幅した。以下の３’プライマー配列を用いて、重鎖を増幅した。すなわち、５’−ＴＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧ−３’（配列番号２２）である。以下の３’プライマー配列を用いて軽鎖を増幅した。すなわち、５’−ＣＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号２３）である。さらに、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲプライマー（Ｃｌｏｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を各増幅で用いた。
【０３２０】
ＰＣＲ反応混合物には、適当な緩衝液中のＰｆｕ Ｉポリメラーゼの２．５単位（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｏｌａ，ＣＡ）、各ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、各５’および３’プライマー７５０ｎＭ、およびｃＤＮＡテンプレートを含めた。全反応容量は、５０μｌであった。サーモサイクラーを用いて、以下のＰＣＲサイクル・プログラムを実行した。すなわち、
１× ９４℃、２分 １０× ９４℃、４５秒
６５℃、４５秒。サイクルごとに−１℃
７２℃、１分、
２５× ９４℃、４５秒
５５℃、４５秒
７２℃、１分
１× ７２℃、１５分
である。
【０３２１】
得られたＰＣＲ増幅産物をゼロ・ブラント・トポ（Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ）ＰＣＲクローニング・ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に挿入した。制限酵素分析によって挿入断片の同一性を検証し、その後、シーケンシングによって挿入のヌクレオチド配列を得た。
【０３２２】
（実施例６ 抗体鎖の組み換え的発現）
この実験では、本発明の種々の抗ＩＧＦＲ１抗体鎖をコードする核酸を用いて、ｄｈｆｒ−哺乳動物細胞株（ＣＨＯ−ＤＸＢ１１）をトランスフェクションし、その中でその鎖を発現させた。下記に列記するプラスミド１ないし１１から選択される１個の重鎖（γ１またはγ４）および１個の軽鎖（κ）プラスミドの種々の組み合わせで細胞株の共トランスフェクションによって一時的なトランスフェクションを実行した。下記に列記する単一のプラスミド１２または１３のいずれかによるトランスフェクションによって安定細胞株の構築を以下のように実行した。すなわち、核酸を単一のプラスミド内に配置し、作用自在にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに結合させた。プラスミドは、プラスミド増幅のために用いられるマウス乳癌ウイルス長末端配列（ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ））に作用自在に結合するＤＨＦＲ ｃＤＮＡも含有していた。プラスミドは、哺乳動物細胞内での選択のためのＴＫプロモーターに作用自在に結合するハイグロマイシンＢ遺伝子をさらに含んだ。
【０３２３】
下記に、構築した１３種類のプラスミド内のプロモーター発現カセットを記載する。ブダペスト条約のもと、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ；Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に＿＿＿＿＿＿で、表示した名称および登録番号の下で、表示したプラスミド（２ないし４および８ないし１１）を寄託した。すなわち、
（１）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣ（γ４）
挿入配列：配列番号３、
（２）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ４）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ４）」
ＡＴＣＣ登録番号：
挿入配列：配列番号４４
（３）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢ（γ４）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＢ（γ４）」
ＡＴＣＣ登録番号：
挿入配列：配列番号１１１
（４）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ１）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ１）」
ＡＴＣＣ登録番号：
挿入配列：配列番号４４
（５）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣ（κ）
挿入配列：配列番号１
（６）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＡ（κ）
挿入配列：配列番号４０
（７）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＢ（κ）
挿入配列：配列番号４２
（８）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＣ（κ）」
ＡＴＣＣ登録番号：
挿入配列：配列番号７１
（９）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＤ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＤ（κ）」
ＡＴＣＣ登録番号：
挿入配列：配列番号７３
（１０）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＥ（κ）」
ＡＴＣＣ登録番号：
挿入配列：配列番号７５
（１１）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ（κ）−
寄託名「１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣＦ（κ）」
ＡＴＣＣ登録番号：
挿入配列：配列番号７７
（１２）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣ（γ４）およびＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣ（κ）
（１３）ＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＨＣＡ（γ１）およびＣＭＶプロモーター−１５Ｈ１２／１９Ｄ１２ ＬＣ（κ）
ＡＴＣＣに寄託したプラスミドへのアクセス制限の全ては特許の付与により解除される。
【０３２４】
各カセットの３’末端をβ−グロブリン・ポリＡシグナルに結合させた。発現させた可変鎖を括弧内で示した定常領域（すなわち、γ１、γ４、またはκ）に結合させた。各プラスミドを含有するトランスフェクションした細胞株の分析によって、対応する抗体鎖ポリペプチドが発現する（発現産物のアミノ酸配列は確認せず）ことが示された。
【０３２５】
上記に参照したプラスミドのそれぞれは、本発明の部分を構成する。さらに、各発現カセット内に位置する核酸は、その中の免疫グロブリン可変領域とともに、その成熟プロセッシング型（すなわち、シグナル配列を持たない）とともに、特に配列番号４４の成熟ＨＣＡ（配列番号４４のヌクレオチド５８ないし４１１）、配列番号１１１の成熟ＨＣＢ（配列番号１１１のヌクレオチド５８ないし４１１）、配列番号７１の成熟ＬＣＣ（配列番号７１のヌクレオチド５８ないし３８４）、配列番号７３の成熟ＬＣＤ（配列番号７３のヌクレオチド５８ないし３８４）、配列番号７５の成熟ＬＣＥ（配列番号７５のヌクレオチド５８ないし３８４）、配列番号７７すなわち成熟ＬＣＦ（配列番号７７のヌクレオチド５８ないし３８４）とともに、任意の前述の核酸にコードされる任意のポリペプチドとともに免疫グロブリン定常領域を任意で含み、成熟または非プロセッシング鎖を含み、免疫グロブリン定常領域を任意で含み、本発明の一部である。さらに、コードされたポリペプチドの１つを含む、それらの任意の抗体または抗原結合フラグメントは、本発明の一部である。
【０３２６】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態による範囲に限定されない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な変更は、前述の記載および添付図面から当業者には自明であるだろう。そのような変更は、添付の請求項の記載の範囲内にあることが意図される。
【０３２７】
特許、特許明細書、ジーンバンク登録番号、および刊行物がこの明細書全体を通して引用されている。それらの開示の全体を参考として本明細書で援用する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７を含むポリペプチドを生成するための方法であって、該方法は、該ポリペプチドが宿主細胞において産生される条件下で、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを該宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが前記細胞から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、ＣＭＶプロモーターと作用自在に関連付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドがベクター内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターがＤＨＦＲ遺伝子を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＨＦＲ遺伝子が、マウス乳癌ウイルス長末端反復配列プロモーターに作用自在に連結される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターがハイグロマイシンＢ遺伝子を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ハイグロマイシンＢ遺伝子が、ＴＫプロモーターに作用自在に連結される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７を含むポリペプチドを生成するための請求項１に記載の方法であって、該方法は、該ポリペプチドがチャイニーズハムスター卵巣細胞において産生される条件下で、ＣＭＶプロモーターに作用自在に連結された該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、該チャイニーズハムスター卵巣細胞に導入する工程と、該ポリペプチドを単離する工程とを包含する、方法。
【請求項１３】
前記ベクターがＤＨＦＲ遺伝子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＨＦＲ遺伝子が、マウス乳癌ウイルス長末端反復配列プロモーターに作用自在に連結される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクターがハイグロマイシンＢ遺伝子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ハイグロマイシンＢ遺伝子が、ＴＫプロモーターに作用自在に連結される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドを生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法であって、該方法は、該ポリペプチドが宿主細胞において産生される条件下で、該配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、該宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが前記細胞から単離される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、ＣＭＶプロモーターと作用自在に関連付けられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドをコードするか、または、前記配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７を含むポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドがベクター内にある、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記ベクターがＤＨＦＲ遺伝子を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＨＦＲ遺伝子が、マウス乳癌ウイルス長末端反復配列プロモーターに作用自在に連結される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ベクターがハイグロマイシンＢ遺伝子を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ハイグロマイシンＢ遺伝子が、ＴＫプロモーターに作用自在に連結される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドがチャイニーズハムスター卵巣細胞において産生される条件下で、各々がＣＭＶプロモーターに作用自在に連結された、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド１種類以上を含む１種類以上のベクターを、該チャイニーズハムスター卵巣細胞に導入する工程と、該ポリペプチドを単離する工程とを包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ベクターがＤＨＦＲ遺伝子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＤＨＦＲ遺伝子が、マウス乳癌ウイルス長末端反復配列プロモーターに作用自在に連結される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ベクターがハイグロマイシンＢ遺伝子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ハイグロマイシンＢ遺伝子が、ＴＫプロモーターに作用自在に連結される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ベクターが、マウス乳癌ウイルス長末端反復配列プロモーターに作用自在に連結されたＤＨＦＲ遺伝子と、ＴＫプロモーターに作用自在に連結されたハイグロマイシンＢ遺伝子とを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７を含むポリペプチドが、γ１重鎖免疫グロブリン定常領域に連結され、そして、前記配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドが、κ軽鎖免疫グロブリン定常領域に連結される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
γ１重鎖免疫グロブリン定常領域に連結された前記配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７を含むポリペプチドおよびκ軽鎖免疫グロブリン定常領域に連結された前記配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリアと合わせる工程をさらに包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記薬学的に受容可能なキャリアが、水、緩衝剤および糖を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが、γ１重鎖免疫グロブリン定常領域に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、γ１重鎖免疫グロブリン定常領域に連結される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、γ１重鎖免疫グロブリン定常領域に連結される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７を含むポリペプチドが、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含み、そして、前記配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドが、配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項４３】
前記配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが、γ１重鎖免疫グロブリン定常領域に連結され、そして、前記配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが、κ軽鎖免疫グロブリン定常領域に連結される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７を含むポリペプチドが、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含み、そして、前記配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドが、配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
前記配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが、γ１重鎖免疫グロブリン定常領域に連結され、そして、前記配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが、κ軽鎖免疫グロブリン定常領域に連結される、請求項４４に記載の方法。
【請求項１】
配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７を含むポリペプチドを生成するための方法であって、該方法は、該ポリペプチドが宿主細胞において産生される条件下で、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを該宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが前記細胞から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、ＣＭＶプロモーターと作用自在に関連付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドがベクター内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターがＤＨＦＲ遺伝子を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＨＦＲ遺伝子が、マウス乳癌ウイルス長末端反復配列プロモーターに作用自在に連結される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターがハイグロマイシンＢ遺伝子を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ハイグロマイシンＢ遺伝子が、ＴＫプロモーターに作用自在に連結される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７を含むポリペプチドを生成するための請求項１に記載の方法であって、該方法は、該ポリペプチドがチャイニーズハムスター卵巣細胞において産生される条件下で、ＣＭＶプロモーターに作用自在に連結された該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、該チャイニーズハムスター卵巣細胞に導入する工程と、該ポリペプチドを単離する工程とを包含する、方法。
【請求項１３】
前記ベクターがＤＨＦＲ遺伝子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＨＦＲ遺伝子が、マウス乳癌ウイルス長末端反復配列プロモーターに作用自在に連結される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクターがハイグロマイシンＢ遺伝子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ハイグロマイシンＢ遺伝子が、ＴＫプロモーターに作用自在に連結される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドを生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法であって、該方法は、該ポリペプチドが宿主細胞において産生される条件下で、該配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、該宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが前記細胞から単離される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、ＣＭＶプロモーターと作用自在に関連付けられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドをコードするか、または、前記配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７を含むポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドがベクター内にある、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記ベクターがＤＨＦＲ遺伝子を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＨＦＲ遺伝子が、マウス乳癌ウイルス長末端反復配列プロモーターに作用自在に連結される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ベクターがハイグロマイシンＢ遺伝子を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ハイグロマイシンＢ遺伝子が、ＴＫプロモーターに作用自在に連結される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドがチャイニーズハムスター卵巣細胞において産生される条件下で、各々がＣＭＶプロモーターに作用自在に連結された、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド１種類以上を含む１種類以上のベクターを、該チャイニーズハムスター卵巣細胞に導入する工程と、該ポリペプチドを単離する工程とを包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ベクターがＤＨＦＲ遺伝子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＤＨＦＲ遺伝子が、マウス乳癌ウイルス長末端反復配列プロモーターに作用自在に連結される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ベクターがハイグロマイシンＢ遺伝子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ハイグロマイシンＢ遺伝子が、ＴＫプロモーターに作用自在に連結される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ベクターが、マウス乳癌ウイルス長末端反復配列プロモーターに作用自在に連結されたＤＨＦＲ遺伝子と、ＴＫプロモーターに作用自在に連結されたハイグロマイシンＢ遺伝子とを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７を含むポリペプチドが、γ１重鎖免疫グロブリン定常領域に連結され、そして、前記配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドが、κ軽鎖免疫グロブリン定常領域に連結される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
γ１重鎖免疫グロブリン定常領域に連結された前記配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７を含むポリペプチドおよびκ軽鎖免疫グロブリン定常領域に連結された前記配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリアと合わせる工程をさらに包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記薬学的に受容可能なキャリアが、水、緩衝剤および糖を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが、γ１重鎖免疫グロブリン定常領域に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、γ１重鎖免疫グロブリン定常領域に連結される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、γ１重鎖免疫グロブリン定常領域に連結される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７を含むポリペプチドが、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含み、そして、前記配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドが、配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項４３】
前記配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが、γ１重鎖免疫グロブリン定常領域に連結され、そして、前記配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが、κ軽鎖免疫グロブリン定常領域に連結される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記配列番号４５のアミノ酸２０〜１３７を含むポリペプチドが、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含み、そして、前記配列番号７８のアミノ酸２０〜１２８を含むポリペプチドが、配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
前記配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが、γ１重鎖免疫グロブリン定常領域に連結され、そして、前記配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが、κ軽鎖免疫グロブリン定常領域に連結される、請求項４４に記載の方法。
【公開番号】特開２０１０−２４６５６７（Ｐ２０１０−２４６５６７Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７４０４７（Ｐ２０１０−１７４０４７）
【出願日】平成２２年８月２日（２０１０．８．２）
【分割の表示】特願２００６−１３８１５６（Ｐ２００６−１３８１５６）の分割
【原出願日】平成１５年５月２２日（２００３．５．２２）
【出願人】（５９６１２９２１５）シェーリング コーポレイション (785)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２日（２０１０．８．２）
【分割の表示】特願２００６−１３８１５６（Ｐ２００６−１３８１５６）の分割
【原出願日】平成１５年５月２２日（２００３．５．２２）
【出願人】（５９６１２９２１５）シェーリング コーポレイション (785)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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