人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞または組織特異的細胞を誘導するための新規タンパク質送達系
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を誘導するための新規タンパク質送達系を記述する。この送達系は、体細胞内の受容体を認識する受容体結合領域、サイトゾル空間にインデューサーを移動させるトランスロケーショントランスロケーション領域、およびインデューサーが付着しインデューサーが細胞に移動するのを容易にする積荷ベアリング領域を持つコンストラクトを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療目的のためのタンパク質送達系に関する。より詳しくは、このタンパク質送達系は、再生医療または疾病処置のために体細胞を分化させて人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞または組織特異的細胞に誘導する再プログラム因子を送達するために利用できる。
【背景技術】
【０００２】
過去には、多能性幹細胞は、核移植と細胞融合によって産生した（Ｓｈｉｎｙａ Ｙａｍａｎａｋａ、Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ、Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ． ３６３（１５００）：２０７９−２０８７ （Ｊｕｎｅ ２７， ２００８））。両方の方法は胚幹細胞を必要とし、それは研究と治療用途のために倫理的ジレンマを提起している。この問題は最近発見された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞で克服され、それは胚性幹（ＥＳ）細胞の同様な魅惑的な生物学的性質を共有している（Ｙａｍａｎａｋａ， Ａ Ｆｒｅｓｈ Ｌｏｏｋ ａｔ ｉＰＳ Ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ １３７： １３−１７ （Ｓ． ２００９））。
【０００３】
人工多能性幹細胞は、２００６年にマウス繊維芽細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｙ． ａｎｄ Ｓ． Ｙａｍａｎａｋａ， Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ Ａｄｕｌｔ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆａｃｔｏｒｓ， Ｃｅｌｌ １２６： ６６３−６７６ （２００６））から、そして２００７年には人間の繊維芽細胞（Ｙｕ Ｊｕｎｙｉｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８： １９１７−１９２０ （２００７）， Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｆｒｏｍ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆａｃｔｏｒｓ， Ｃｅｌｌ １３１ ： ８６１−８７２ （２００７））、Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｆｒｏｍ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆａｃｔｏｒｓ， Ｃｅｌｌ １３１ ： ８６１−８７２ （２００７））から明確な因子を強制的に発現させて初めて産生した。２セットの因子は、これらの研究において大人の体細胞を再プログラムさせてｉＰＳ細胞にすることを引き起こすのに用いられた。１つの因子は、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃを含み（Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｃｅｌｌ １２６： ６６３−６７６； Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｃｅｌｌ １３１：８６１−８７２）、そして、もう一つの因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を含む（Ｊｕｎｙｉｎｇ、Ｃｅｌｌ ３１８：１９１７−１９２０）。これらの明確な因子の再プログラム効率は、ｐ５３活性をノックダウンすることによって１０倍増加できる。
【０００４】
２００８年に、メルトンのグループは、３つの転写制御因子、Ｎｇｎ３（別名Ｎｅｕｒｏｇ３）、ＰｄｘｌおよびＭａｆａの特定の組合せを送達することによって、成熟したマウスの分化した膵臓外分泌細胞が、β細胞に密接に類似している細胞に再プログラムされたことを証明した（Ｚｈｏｕ， Ｑ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｅｘｏｃｒｉｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ β−ｃｅｌｌｓ， Ｎａｔｕｒｅ ４５５： ６２７−６３３ （２００８））。誘発されたβ細胞は、内因性島β細胞と形態学的に区別がつかない。これらは、β細胞機能に必須な遺伝子を発現し、局所維管束走向を改造して、インシュリンを分泌することによって、高血糖を改善することができる。この研究は、大人の体細胞が多能性幹細胞状態への復帰なしに転写制御因子の特定の組合せによって直接組織特異的細胞に再プログラムできることを示唆する。
【０００５】
ｉＰＳ細胞の将来性は、莫大である。しかし、ｉＰＳ細胞の臨床応用は、多くの障害に直面する（Ｙａｍａｎａｋａ， Ｃｅｌｌ １３７： １３−１７； Ｍｉｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（８）：７４３−７４５ （２００９）； Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｓａｆｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７： ６０６−６１３（２００９））。１つの大きな困難は、再プログラミング因子の送達伝達手段に、直接関連している。最初に、再プログラミング因子遺伝子は、レトロなまたはレンチウイルスベクトルによって体性繊維芽細胞に導入された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｃｅｌｌ １２６： ６６３−６７６； Ｊｕｎｙｉｎｇ， Ｃｅｌｌ ３１８： １９１７−１９２０； Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｃｅｌｌ １３１：８６１−８７２３−５）。レトロまたはレンチウイルスベクトルによる再プログラミングのプロセスの効率は僅か０．０５％以下（（Ｏｋｉｔａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２： ９４９−９５３； Ｙａｍａｎａｋａ， Ｓ． Ｅｌｉｔｅ ａｎｄ Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ Ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ４６０： ４９−５２ （２００９））であった。
【０００６】
これらのベクトルはランダムに宿主のゲノムに統合されるので、オンコジーンの挿入活性化は、常にレトロまたはレンチウイルスベクトルを使用する際の大きな懸念である。導入遺伝子は主にｉＰＳ細胞で発現停止させられるが、ｃ−Ｍｙｃトランス遺伝子の再活性化が結果として腫瘍化に導くことがあった（Ｏｋｉｔａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｎａｔｕｒｅ ４４８： ３１３−３１８ （２００７））。これらの導入遺伝子の漏出発現は完全なｉＰＳ細胞分化と成熟も妨げるかもしれない。そして、結果としてテラトーマ構造のより大きな危険性に導かれる（Ｙａｍａｎａｋａ， Ｃｅｌｌ １３７： １３−１７）。そのうえ、導入遺伝子はｉＰＳ細胞から再分化される細胞で再活性化し発現できるであろう。そして、結果としてｉＰＳ細胞または腫瘍形成の分化状態を再プログラムする危険に導かれるであろう。
【０００７】
アデノウイルスベクトルのような非組込ウイルスベクトルは、後にこれらの再プログラミング因子遺伝子を送達するのに用いられた（Ｚｈｏｕ， Ｎａｔｕｒｅ ４５５：６２７−６３３；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ、Ｍ． ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２：９４５−９４９の（２００８））。しかし、大量のアデノウイルスベクトル（それは細胞の上で細胞変性効果を引き起こす場合がある）は、アデノウイルス受容体ＣＡＲが不足する細胞型に、効果的に形質導入するために必要とされる。そのうえ、「不活性ではない」アデノウイルスベクトルが伝達媒体に選択されるならば、いくつかのアデノウイルス遺伝子の低次発現は形質転換された細胞に影響を及ぼすかもしれない。
【０００８】
再プログラミングは、直接プラスミド形質移入を通して達成されることもある（Ｏｋｉｔａ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２： ９４９−９５３； Ｙｕ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｆｒｅｅ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４： ７９７−８０１ （２００９））、しかし、それはレトロウイルスベクトルのそれより１００倍以上効率的でない（Ｏｋｉｔａ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２： ９４９−９５３）。アデノウイルスベクトル伝達とプラスミド形質移入は、安定した組込を除外しないかもしれない。アデノウイルスベクトルの組込周波数は、細胞につき１０-3〜１０-5までである（Ｈａｒｕｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３： ６１４１−６１４６ （１９９９））。
【０００９】
多能性幹細胞を産生する方法の比較は、表１に示される。
【表１】
【００１０】
１９９８年に、フランケル（Ｆｒａｎｋｅｌ）とグリーン（Ｇｒｅｅｎ）は、ＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質がレセプター非依存の様式で細胞に侵入できること別々に観察した（Ｆｒａｎｋｅｌ， Ａ． ａｎｄ Ｃ． Ｐａｂｏ， Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ， Ｃｅｌｌ ５５： １１８９−１１９３ （１９８８）；Ｇｒｅｅｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｐ． Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ， Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｔａｔ Ｔｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｃｅｌｌ ５５： １１７９−１１８８ （１９８８））。ＨＩＶ−１ Ｔａｔの短い塩基アルギニンリッチな領域（ａａ４８−５７）を含むＴａｔタンパク質伝達領域（ＰＴＤ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのペプチドを含む様々な分子を送達するために広く使われている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ： Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｏ Ｍｏｕｓｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５： １５６９−１５７２ （１９９９）；Ｌｉｎｄｓａｙ， Ｍ． Ａ． Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｒｇｅｔ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２：５８７−５９４ （２００２）；Ｋｗｏｎ， Ｙ． Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｔａｔ−Ｐｄｘｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １２： ２８−３２ （２００５）； Ｋｉｍ， Ｄ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４： ４７２−４７６ （２００９）； Ｗａｄｉａ， Ｊ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｄｕｃｉｂｌｅ Ｔａｔ−ＨＡ Ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｅｓｃａｐｅ ｏｆ Ｔａｔ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｆｔｅｒ Ｌｉｐｉｄ Ｒａｆｔ Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０：３１０−３１５ （２００９）； Ｚｈｏｕ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４： ３８１−３８４．１９−２４ （２００９））。
【００１１】
タンパク質ベースの媒体で分子を送達するこの方法は、タンパク質伝達と呼ばれている。イオン相互作用を通してＴａｔ−ＰＴＤを細胞表面に結びつけることは、脂質ラフト依存のマクロピノサイトーシス（Ｗａｄｉａ， Ｊ． Ｓ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０：３１０−３１５）によって、結果としてＴａｔ−融合タンパクの内面化に導かれる。しかしながら、大部分のＴａｔ−融合タンパクは、マクロピノソームで捕捉されたままであり、これはマクロピノソームからのペプチドまたはタンパク質の逸脱は非効率なプロセスであることを示す（Ｗａｄｉａ， Ｊ． Ｓ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０：３１０−３１５）。近年では、うまく４つの再プログラミング因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）のＣ末端に融合されたポリアルギニン（１１Ｒまたは９Ｒ）ＰＴＤが、マウス胚繊維芽細胞（Ｚｈｏｕ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４： ３８１−３８４ （２００９））、また新生児の繊維芽細胞（Ｋｉｍ， Ｄ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４： ４７２−４７６）を非常に低い効率であるがｉＰＳ細胞に再プログラムすることに成功した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、遺伝子発現ベクトルを使用することなくｉＰＳ細胞または組織特異的細胞を産生するために、大人の体細胞に再プログラム因子を送達する新規タンパク質ベースの系である。この系は、受容体結合領域、トランスロケーション領域、積荷保有領域及びインデューサーを持つコンストラクトを含む。受容体結合領域は、コンストラクトを体細胞に向かわせる。トランスロケーション領域は、積荷ベアリング領域とインデューサーを細胞に輸送するのを容易にする。積荷ベアリング領域は、インデューサーを細胞に送達する。本発明の１つの実施形態において、コンストラクトはコンストラクトの結合、トランスロケーションと積荷機能のために外毒素領域を利用する。そのような外毒素のいくつかは、クロストリジウム・ディフィシルＴｃｄＡとＴｃｄＢ毒素（クロストリジウム・ボツリヌス菌ＢｏＮＴＡ〜ＧおよびＣ２毒素）を含む。コンストラクトの様々な領域は、様々なサイズのインデューサーを収容し、インデューサーを特異的結合レセプターを持つ体細胞に向けさせるために交換されることを有する。
【００１３】
前記コンストラクトは、細胞がｉＰＳ細胞となるよう、多能性インデューサーを体細胞に送達するために用いることができる。本発明のもう一つの実施形態は、体細胞が１つまたは複数のインデューサーを支持するコンストラクトに接触するｉＰＳ細胞を産生する方法をさらに提供する。前記コンストラクトは、他のコンストラクト（例えばｉＰＳ細胞を産生するレンチウイルス、小タンパク質送達系、または小分子）と一緒に利用しても良い。
【００１４】
本発明の上記あるいは他の特徴、態様、および長所は、添付の図面に示されるこれらの実施形態の以下の説明に関して、更に詳細に考慮される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】本発明のクロストリジウム・ディフィシル構造のグラフを示す図である。
【図１Ｂ】本発明のクロストリジウム・ディフィシル立体配置を使う様々な可能なコンストラクトのグラフを示す図である。
【図２Ａ】Ｏｃｔ４およびＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグとスペーサーの間での移行を意味する。
【図２Ｂ】Ｏｃｔ４およびＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグとスペーサーの間での移行を意味する。
【図２Ｃ】Ｏｃｔ４およびＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグとスペーサーの間での移行を意味する。
【図２Ｄ】Ｏｃｔ４およびＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグとスペーサーの間での移行を意味する。
【図３Ａ】Ｓｏｘ２とＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図３Ｂ】Ｓｏｘ２とＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図３Ｃ】Ｓｏｘ２とＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図３Ｄ】Ｓｏｘ２とＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図４Ａ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、Ｃ２Ｉ、およびＣ２ＩＩを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図４Ｂ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、Ｃ２Ｉ、およびＣ２ＩＩを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図４Ｃ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、Ｃ２Ｉ、およびＣ２ＩＩを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図４Ｄ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、Ｃ２Ｉ、およびＣ２ＩＩを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図４Ｅ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、Ｃ２Ｉ、およびＣ２ＩＩを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図５Ａ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、ＢｏＮＴｓ、および他のＲＢＤを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間で移行を意味する。
【図５Ｂ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、ＢｏＮＴｓ、および他のＲＢＤを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間で移行を意味する。
【図５Ｃ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、ＢｏＮＴｓ、および他のＲＢＤを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間で移行を意味する。
【図５Ｄ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、ＢｏＮＴｓ、および他のＲＢＤを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間で移行を意味する。
【図５Ｅ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、ＢｏＮＴｓ、および他のＲＢＤを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間で移行を意味する。
【図５Ｆ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、ＢｏＮＴｓ、および他のＲＢＤを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間で移行を意味する。
【図６】誘導の２〜３時間後にバチルスメガテリウムによる組換え型ＴｃｄＢタンパク質発現を示す時間経過ウエスタンブロット解析である。
【図７】ＴｃｄＢおよび無毒ＴｃｄＢにさらされるマウス結腸直腸腫瘍ＣＴ２６細胞を表す画像である。
【図８】（Ａ）は、ＴｃｄＢおよび積荷としてのＳＮＡＰを持つＴｃｄＢのテストコンストラクトのグラフを示す図である。（Ｂ）は、精製されたＳＮＡＰ−ＴｃｄＢコンストラクトを示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルを示す図である。（Ｃ）は、抗ＳＮＡＰ−タグ抗体を使う精製された試料のウエスタンブロット解析を示す図である。（Ｄ）は、ＳＮＡＰ−ＴｃｄＢコンストラクトが野生型ＴｃｄＢと同様に有毒であることを示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
上に要約された発明は以下の説明を参照することによってよりよく理解できる。そしてその説明の中で参照番号がその部分に対して使われていて、付随する請求項と図面とともに読むべきである。実施形態のこの説明は、発明の実施を構築して使用するのを可能にするために以下で述べられていて、本発明に制限することを意図するわけでなく、本発明の特定の例としての役割を果たす。当業者は、本発明の同じ目的を遂行する他の方法および系を修正または設計するための基礎として開示された概念と特定の実施形態を直ちに使用できるということ理解すべきである。当業者は、そのような等価のコンストラクトと株化細胞が、その最も広い形式において本発明の精神および範囲から逸脱しないことも理解しなければならない。
【００１７】
本明細書に使われる用語、「コンストラクト」とはインデューサー配列と積荷送達配列を含むアミノ酸配列を有する組み換え型ポリペプチドを指す。コンストラクトは、他の成分を持つことがある。たとえば、コンストラクトは受容体結合領域（ＲＢＤ）、トランスロケーション領域（ＴＤ）、積荷ベアリング領域（ＣＢＤ）と切断配列（ＣＳ）を含むことがある。以下に詳細に記述するように、ＲＢＤによって、コンストラクトがレセプターを有する細胞を認識してそれと結合できる。
【００１８】
ＴＤによって、ＣＢＤ（インデューサーを含むことがある）をサイトゾルに輸送できる。ＣＢＤは、毒素の不活化有機活性領域である場合がある。より詳しくは、当業者に既知の方法によってＣＢＤが標的細胞に無毒になるものと理解されている。いくつかの実施形態において、ＣＢＤはＴＤに直接リンクしているインデューサーである場合がある。ＣＳとは、例えば、多能性インデューサーを運ぶＣＢＤを細胞内のコンストラクトから解放させる固有のシステインプロテアーゼ領域（ＣＰＤ）または別のプロテアーゼ配列である場合がある。
【００１９】
「インデューサー」とは、他の特徴の内、体細胞に導入されると体細胞がｉＰＳ細胞に転換するのを補助できる転写制御因子である。以下のインデューサーが同定された：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ｌｉｎ２８、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ）およびＳＶ４０大型Ｔ抗原。他のインデューサーは、ＭａｆＡ、Ｐｄｘ−１、Ｎｇｎ３、ＳＶ−４０ Ｔ−ａｇ、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ−２、ｈ−ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ｐ５３ ｓｉＲＮＡを含むことがある。上述の因子に加えて、インデューサーはｐ５３阻害遺伝子（例えばｐ５３、ｓｉＲＮＡｓ、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡとリボザイムを標的とする抗体と抗体フラグメント）も含むことがある。
【００２０】
当業者は、本明細書に記述される配列の「実質同一の」ホモログが本発明の例示的な実施形態を構成することを理解されたい。
【００２１】
以下のいずれかが成立するならば、２つのアミノ酸配列は「実質同一である」：（ｉ）結果として生じるポリペプチドの畳み込み活性に重大な影響を及ぼさない保守的なアミノ酸置換のみを有する、（ｉｉ）２つの整列化した配列の最も短い方のアミノ酸残基について、挿入、削除、そして、代入によるギャップの数が、最大で１０％、望ましくは５％でしかなく、または、（ｉｉ）最大でアミノ酸残基の３０％、望ましくは２０％、より望ましくは１５％または１０％しか、２つの配列の間で変化がない。米国特許出願番号ＵＳ２００３／０，１６１，８０９Ａ１号の中にヒューストンらによって記述された他の方法を使って、２つの配列がかなり同一かどうか決定しても良い。
【００２２】
クロストリジウム外毒素はそのＮ末端酵素領域に効果的な細胞取り込みとサイトゾル送達のためのすべてのメカニズムを備えていて、再プログラミングタンパク質を大人の体細胞に送達するのに用いることができる。特に、クロストリジウム外毒素とは、毒素を効率的にそのＮ末端酵素領域と、そのＮ末端に付随した全てをサイトゾル転位させるモジュラー多領域を示す。例えば、クロストリジウム・ボツリヌス神経毒タイプＤ（ＢｏＮＴ−Ｄ）とクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ型（ＴｃｄＢ）の両方は、毒素のＮ末端に付加された積荷をサイトゾルに送達する能力を示した（Ｂａｄｅ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｔｙｐｅ Ｄ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｃａｒｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｖｉａ Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９１： １４６１−１４７２２５−２６ （２００４）；
Ｐｆｅｉｆｅｒ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ Ｂ， Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃｙｔｏｓｏｌ ｏｆＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ， Ｊ． ｏｆ Ｂｏｉｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８：４４５３５−４４５４１（２００３））。
【００２３】
Ｉ． Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＴｃｄＡｏおよびＴｃｄＢ多能性インデューサーｉＰＳ細胞コンストラクト。
【００２４】
本発明の１つの実施形態は、図１で示すような３つの機能領域を有するクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ（ＴｃｄＡ）とＢ（ＴｃｄＢ）のコンストラクトを含む：（ａ）エンドサイトーシスのための標的細胞と結合するＲＢＤ；（ｂ）毒素の酵素領域のサイトゾル送達を促進するＴＤ；および、（ｃ）インデューサーを運ぶＣＢＤ（ＧＴ酵素領域の不活発な部分である）。図１Ａは、Ｎ末端グルコシル・トランスフェラーゼ領域（ＧＴ）、固有のシステインプロテアーゼ領域（ＣＰＤ）、中心トランスロケーション領域（ＴＤ）（疎水性部分（ＨＲ）を含む）、Ｃ末端受容体結合領域（ＲＢＤ）を有するクロストリジウムディフィシレ毒素の一次構造を示す。ＣＢＤは、エンジニアリング組換え型タンパク質のためのＧＴ領域の中に位置する。
【００２５】
図１Ｂで示すように、ＴｃｄＢ変異体の様々な異なるコンストラクトは、ＧＴタンパク質構造の先端を切り取ることによって無毒化される。野生型ＴｃｄＢ、無毒ＴｃｄＢ（ａＴｃｄＢ）、ならびに組換え型融合タンパクａＴｃｄＢ−Ｍｌ、ａＴｃｄＢ−Ｍ２、およびａＴｃｄＢ−Ｍ３、のタンパク質構造。ａＴｃｄＢ−Ｍｌによって、インデューサーがａＴｃｄＢのＮ末端に付加できる。ａＴｃｄＢ−Ｍ２は、先端が切り取られたグルコシル基転移酵素（ＧＴ）領域に付属する積荷を持ち、ａＴｃｄＢ−Ｍ３は、全てのＧＴ領域を置き換える積荷を持っている
【００２６】
最初のステップとして、ＴｃｄＡのＲＢＤとＴｃｄＢ ＲＢＤ（複数）が、Ｇａｌ−α１、３−Ｇａｌ−β１、４−ＧａｌＮＡｃを含む細胞表面炭水化物と結合する。これらの細胞表面炭水化物は、大部分の体細胞で見出される。このように、ＴｃｄＡ ＲＢＤは、大部分の体細胞と結合する。
【００２７】
ＲＢＤがそのレセプターと結合した後、ＣＢＤは受容体媒介エンドサイトーシスによって内在化される。ＴＤの疎水性部分（ＨＲ）は、ＣＢＤがそれを通ってサイトゾルに転位できる孔を作るために毒素の対応する部分がそれ自体をエンドソーム膜に挿入するのを可能にする。転位されたものは残りのコンストラクトから切り離されることができて、自己タンパク分解によってサイトゾルにリリースされることができる。そして、図１Ｂで示すようにＴＤのＮ末端部分で自己切断位に隣接している固有のシステインプロテアーゼ領域（ＣＰＤ）によって触媒作用を及ぼされる。その結果、本明細書に記述されているように、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢのＲＢＤおよびＴＤを含むコンストラクトを使用して多能性インデューサーを体細胞に導入することができる。
【００２８】
ＣＢＤは、インデューサーを運ぶ不活化ＧＴ領域である。ＧＴ領域は、当業者に知られている様々な方法を使用して不活性化できる。ＧＴ領域は切り詰めできる。活性は、その道筋でアミノ酸置換によって破壊できる。本発明の１つの実施形態に、ＴｃｄＡのＧＴはＤ２８５ＡとＤ２８７Ａの削除に引き続いて不活性化し、そして、ＴｃｄＢのＧＴはＤ２８６ＡとＤ２８８Ａの削除に引き続いて不活性化する。本発明のいくつかの実施形態において、活性に対して責務を担う領域部分が削除される様々な長さのＧＴ領域が利用できる。ＧＴ領域を不活化すると、ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢが無毒化しｉＰＳ細胞を産生するためのコンストラクト内での使用を実行可能にする。不活化ＧＴ領域は、インデューサーが付着できるＣＢＤになる。図１Ｂは、本発明の１つの実施形態に従うコンストラクトの様々な可能な配置を示す。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態に従い、図２Ａ〜図２Ｄは、ＴｃｄＢとＯｃｔ４とＳｏｘ２の様々な領域を利用する様々なコンストラクトを例示する。図２Ａの中で、Ｏｃｔ４−ａＴｃｄＢコンストラクト（配列番号１）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｏｃｔ４配列（ａａ５７−４１６）；ＣＢＤ（ａａ４２０−９６１）；ＣＰＤ（ａａ９６２−１１８５）；疎水性領域（ａａ１３７４−１５４６）を含むＴＤ（ａａ１１８６−２２６９）；ＲＢＤ（ａａ２２７０−２７８４）；そして、ヒスチジンタグ（ａａ２７８５−２７９０）。図２Ｂの中で、Ｏｃｔ４−ａＴｃｄＢ（ｄＧＴ）コンストラクト（配列番号２）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｏｃｔ４配列（ａａ５７−４１６）；ＣＢＤ（ａａ４１９−４８８）；ＣＰＤ（ａａ４８９−７１２）；疎水性領域（ａａ９０１−１０７３）を含むＴＤ（ａａ７１３−１７９６）；ＲＢＤ（ａａ１７９７−２３１１）；およびヒスチジンタグ（ａａ２３１２−２３１７）。ＳＢＰとヒスチジンタグが単にコンストラクトのためのタグであるものと理解される。それは他のタグを交換しても良いし、Ｏｃｔ４（インデューサー）をサイトゾル空間へのトランスロケーションさせるコンストラクト能力に影響を及ぼすことなく完全に除去しても良い。
【００３０】
図２Ｃの中で、Ｏｃｔ４−ａＴｃｄＡコンストラクト（配列番号３）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｏｃｔ４配列（ａａ５８−４１６）；ＣＢＤ（ａａ４２０−９５９）；ＣＰＤ（ａａ９６０−１１８７）；疎水性領域（ａａ９００−１３７６）を含むＴＤ（ａａ１１８８−２２６７）；ＲＢＤ（ａａ２２６８−３１２８）；およびヒスチジンタグ（ａａ３１２８−３１３４）。図２Ｄの中で、Ｏｃｔ４−ａＴｃｄＡ（ｄＧＴ）コンストラクト（配列番号４）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｏｃｔ４配列（ａａ５８−４１６）；ＣＢＤ（ａａ４１９−４８６）；ＣＰＤ（ａａ４８７−７１４）；疎水性領域（ａａ９０３−１０７５）を含むＴＤ（ａａ７１５−１７９４）；ＲＢＤ（ａａ１７９５−２６５５）；およびヒスチジンタグ（ａａ２６５６−２６６１）。
【００３１】
同様に、図３Ａ〜図３Ｄは、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢとＳｏｘ２を利用するコンストラクトを例示する。図３Ａの中で、Ｓｏｘ２−ａＴｃｄＢコンストラクト（配列番号５）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｓｏｘ２配列（ａａ５８−３７３）；ＣＢＤ（ａａ３７７−９１８）；ＣＰＤ（ａａ９１９−１１４２）；疎水性領域（ａａ１３３１−１５０３）を含むＴＤ（ａａ１１４３−２２２６）；ＲＢＤ（ａａ２２６８−３１２８）；およびヒスチジンタグ（ａａ２２２７−２７４１）。図３Ｂの中で、Ｓｏｘ２−ａＴｃｄＢ（ｄＧＴ）コンストラクト（配列番号６）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｓｏｘ２配列（ａａ５８−３７３）；ＣＢＤ（ａａ３７６−４４５）；ＣＰＤ（ａａ４４６−６６９）；疎水性領域（ａａ８５８−１０３０）を含むＴＤ（ａａ６７０−１７５３）；ＲＢＤ（ａａ１７５４−２２６８）；およびヒスチジンタグ（ａａ２２６９−２２７４）。
【００３２】
図３Ｃの中で、Ｓｏｘ２−ａＴｃｄＡコンストラクト（配列番号７）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｓｏｘ２配列（ａａ５８−３７３）；ＣＢＤ（ａａ３７７−９１６）；ＣＰＤ（ａａ９１７−１１４４）；疎水性領域（ａａ１３３３−１５０５）を含むＴＤ（ａａ１１４５−２２２４）；ＲＢＤ（ａａ２２２５−３０８５）；およびヒスチジンタグ（ａａ３０８６−３０９１）。図３Ｄの中で、Ｓｏｘ２−ａＴｃｄＡ（ｄＧＴ）コンストラクト（配列番号８）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｓｏｘ２配列（ａａ５８−３７３）；ＣＢＤ（ａａ３７６−４４３）；ＣＰＤ（ａａ４４４−６７１）；疎水性領域（ａａ８６０−１０３２）を含むＴＤ（ａａ６７２−１７５１）；ＲＢＤ（ａａ１７５２−２６１２）；およびヒスチジンタグ（ａａ２６１３−２６１８）。
【００３３】
ＩＩ． クロストリジウム・ボツリヌス菌神経毒多能性インデューサーｉＰＳ細胞コンストラクト
【００３４】
クロストリジウム・ボツリヌス菌神経毒（ＢｏＮＴ）は、多分化能インデューサー送達のために使うことができるクロストリジウム外毒素のもう１つの候補である。ＢｏＮＴは、特定のニューロン・レセプターを認識するＲＢＤから構成される。ＢｏＮＴ毒素のＨ鎖（Ｈｅ）は、コンストラクトのためのＴＤとして機能する。本発明の１つの実施形態のコンストラクトのＣＢＤは、Ｌ鎖の膜への非パルミトイル化された係留防御を持つクロストリジウム・ボツリヌス菌神経毒Ｌ鎖または先端を切り取ったＬ鎖でありえる。Ｌ鎖は、ＢｏＮＴのＡ型〜Ｇ型から選ばれてコンストラクトによって送達されるインデューサーの薬理効果の異なる寿命を提供する。
【００３５】
ＩＩＩ． クロストリジウム属Ｃ２毒素コンストラクト
【００３６】
クロストリジウム属Ｃ２毒素は、Ｃ２ＩＩ鎖が酵素により活性化したＡＤＰリボシル化鎖のＣ２Ｉの細胞レセプター結合、エンドサイトーシス、小孔形成、およびトランスロケーションに関与する二成分毒素構造を持つ。本発明の１つの実施形態に従うコンストラクトは、Ｃ２ＩＩ鎖に多能性インデューサーを融合させて作ることができる。Ｃ２Ｉ鎖の一部の省略によって、コンストラクトをｉＰＳ細胞の産生のプロモーターとして使用するために無毒で安全にする。代わりに、Ｃ２Ｉ領域は、活性部位の修飾または削除によって不活性化させることができる。また、残基のいくつかは、下記の図で示すように変質させても良い。
【００３７】
図４Ａ〜図４Ｅは、本発明の１つの実施形態に従って作れるコンストラクトのいくつかの代表例を表す。図４Ａで、基本的なＣ２ＩＩコンストラクトは、ＳＢＰとヒスチジンタグで提示される（配列番号９）。図４Ｂは、Ｏｃｔ４と不活化Ｃ２Ｉ領域（配列番号１０）を有するコンストラクトを表す。Ｃ２Ｉ領域は、コンストラクトのａａ６００、６０２、８０４、８０５および８０７で点突然変異によって不活性化されることを有する。ＳＢＰとヒスチジンタグは、任意である。図４Ｃは、Ｏｃｔ４と先端を切ったＣ２Ｉ（配列番号１１）を有するコンストラクトを表し、そしてその切断がそれを不活発にする。図４Ｄは、Ｓｏｘ２と不活化したＣ２Ｉ配列（配列番号１２）を有するコンストラクトを表す。図４Ｅは、Ｓｏｘ２を有する先端を切ったＣ２Ｉを表す（配列番号１３）。
【００３８】
ＩＶ． クロストリジウム毒素領域スワッピング
【００３９】
様々なクロストリジウム毒素は、異なる細胞型と結合する。クロストリジウム毒素のＲＢＤは、交換／スワップできてインデューサーを体細胞に送達することができる様々な異なるコンストラクトの存在を証明する。Ｃ末端ＲＢＤの領域スワッピングによって、細胞型、組織、特異的送達のための異なるコンストラクトを作ることができる。１つの実施形態おいて、ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢのＲＢＤは、標的神経細胞のためにＢｏＮＴから選択されるＲＢＤと入れ替えることができる。もう１つの実施形態おいて、ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢのＲＢＤは、細胞型または組織特異細胞表面レセプターと結合し、レセプター媒介内在化を誘発するリガンドと置換することができる。全体で、異なるユーティリティに対応する順序を変えたタンパク質ベースの送達媒介は、Ｎ末端領域スワッピングとＣ末端領域スワッピングとの組合せによって作成することができる。
【００４０】
送達媒介である以上に、ＢｏＮＴのＣ末端ＲＢＤは、ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢのＲＢＤに取って代わることができ、特に神経細胞を標的とするタンパク質送達媒介を作製するのに用いることができる。同様に、ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢのＲＢＤは、ＢｏＮＴのＲＢＤに取って代わるのに用いることができ結果としてＢｏＮＴコンストラクトによってインデューサーの非細胞特異標的になる。さらにまた、ＢｏＮＴＬ鎖は、ＴｃｄＢまたはＴｃｄＡのＮ末端に取って代わるのに用いることができＢｏＮＴＬ鎖のＮ末端に融合する積荷タンパク質の望ましい生物学的機能を強化する。Ｌ鎖はＢｏＮＴのＡ型からＧ型まで、好ましくはクロストリジウム・ボツリヌス菌神経毒Ａ型のＬ鎖までの間で選択される。従って、本明細書に示されているように、クロストリジウム外毒素間の領域交換を用いることによって、様々な多能性インデューサー送達媒介が合成できる。
【００４１】
図５Ａ〜図５Ｄは、本発明の１つの実施形態に従って作ることができるコンストラクトのいくつかの代表例を表す。図５Ａの中で、Ｏｃｔ４は、ＴＤとＴｃｄＢ ＲＢＤ（配列番号１４）のようにＢｏＮＴ／Ｃｌに付着する。図４Ａのコンストラクトにおいて、ＢｏＮＴ／ＣｌのＬ鎖の活性は、示されている修飾によって破壊できる。図４Ｂは、ＢｏＮＴ／Ｃｌ ＴＤとＴｃｄＢ ＲＢＤを有するＳｏｘ２を表す（配列番号１５）。図５Ｃは、インデューサーとしてのＯｃｔ４、ＴＤとしてのＣ２ＩおよびＲＢＤとしてのトランスフェリンを有するコンストラクトを表す。図５Ｄは図５Ｃと類似しているが、Ｏｃｔ４の代わりに、Ｓｏｘ２を利用する（配列番号１６）。図５Ｅは、インデューサーがＯｃｔ４であり、ＣＢＤとＴＤがＢｏＮＴ／Ｃｌによって提供され、そしてＲＢＤがＩＬＧＦと一致する本発明の１つの実施形態に従うコンストラクトの更なる例を提供する（配列番号１７）。図５Ｆは、インデューサーがＳｏｘ２であり、ＣＢＤとＴＤがＢｏＮＴ／Ｃｌによって提供され、そしてＲＢＤがＩＬＧＦと一致する本発明の１つの実施形態に従うコンストラクトの更なる例を提供する（配列番号１８）。
【００４２】
当業者は、コンストラクトが標準的方法によって作製できることを理解するであろう。たとえば、コンストラクトは標準的方法によって大腸菌または藻類系で発現することができる。Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ， Ｄａｖｉｄ Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ： Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ ａｔ ｔｈｅ ５９ Ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２０， ２５２−２６４ （２０００）； Ｇｒｉｓｗｏｌｄ， Ｋａｒｌ Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｖｅｒｓｕｓ Ｐｕｔａｔｉｖｅ ５０−ｍＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｃｕｔｉｎａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２７： １３４−１４２ （２００３）； Ｍａｙｆｉｅｌｄ， Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ａｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １８： １２６？ １３３ （２００７）。
【００４３】
Ｖ． 例
ＴｃｄＢコンストラクトの調製
【００４４】
我々は、バチルスメガテリウム発現系を使うクロストリジウム・ディフィシル毒素の強い組み換え型発現度を成功裏に示した。ＴｃｄＡとＴｃｄＢ遺伝子の両方を、ＰＣＲによってクロストリジウム・ディフィシル（ＶＰＩ １０４６３）ゲノムＤＮＡから増幅した。これらのＰＣＲ産物を、クローン化してバチルスメガテリウム発現ベクトルｐＨｉｓ１５２２を作った（ＭｏＢｉＴｅｃ、ドイツ）。我々も、グルコシル基転移酵素領域での基質結合のために重要なアミノ酸を変異させて無毒ＴｃｄＢ遺伝子を作った。これらのコンストラクトを使ってバチルスメガテリウムプロトプラスト（ＭｏＢｉＴｅｃ）を形質移入した。その上、我々も将来において組み換え型コンストラクトに役立つためにＴｃｄＢをコードする完全な合成遺伝子のコンストラクトを生み出した。ＧＴを切り詰めた変異体も、自己切断部位（−ΔＧＴ６８）の僅か６８個のアミノ酸上流で、Ｇａｌ４−ＴＦ／ａＴｃｄＢから作られた。陽性クローンは組み換え型タンパク質発現のために選ばれた、そして細菌性可溶化液から組み換え型ヒスチジンタグされた組換え型ＴｃｄＢ（ｒＴｃｄＢ）の精製を、イオン交換分画の後でＮｉ−アフィニティークロマトグラフィーによって実行した。これらのクローンで、我々は、図６で示すように小規模の時間経過発現研究を行って、両方の組み換え型タンパク質のピーク発現がキシロース誘導後の２〜３時間であると分かった。
【００４５】
我々は、１リットルの総菌液の可溶化液から平均５〜１０ｍｇの高度に精製された組み換え型タンパク質を得ることができた。精製したｒＴｃｄＢを、細胞病理と細胞毒性の効果およびＲａｃ１のグルコシル化についてマウス腸の上皮ＣＴ２６細胞内で機能的にテストした。長い期間の無毒ＴｃｄＢ（ａＴｃｄＢ）で可能な限りの最高線量への細胞の露顕は、変異体ＧＴは酵素活性（〜５ｌｏｇｓ）が実質的に欠けていて、劇的に減少した細胞障害性（＞５ｌｏｇｓ）を示した。図４は、細胞変性効果は、ａＴｃｄＢで処置したこれらの細胞の上では観察されなかったことを示す。
【００４６】
組換え型ＴｃｄＢがヒューズのついた積荷を細胞に送達することができることを確かめるために、我々はＴｃｄＢのアミノ末端に、小さな酵素（Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキル基転移酵素、ニューイングランドバイオラボによってＳＮＡＰ−タグと呼ばれている）を付加した。我々は、ＳＮＡＰ−タグのキメラ融合を活性化組換え型ＴｃｄＢに効率的に発現させることができる。キメラタンパク質は野生型ＴｃｄＢに粗等しい毒性を保持する。このことは図７で示すように積荷がサイトゾルに達した後のみに毒性を引き起こすＴｃｄＢのグルコシル基転移酵素領域に付加されるので、積荷が細胞サイトゾルにアクセスしたに違い無いことを示す。
【００４７】
ＳＮＡＰ−ＴｃｄＢ融合タンパクの作製、精製および生物学的機能の実証
【００４８】
図８Ａで示すように、Ｎ修飾ＳＮＡＰ−ＴｃｄＢ融合のドメイン構造は、野生型が２９０ｋＤであるのと比較して、２７０ｋＤペプチドである。野生型ＴｃｄＢコンストラクトには、ヘキサヒスチジンタグがあった。ＳＮＡＰ−ＴｃｄＢコンストラクトは、親和性精製のためにヘキサヒスチジンとストレプトアビジンタグで標識された。図８Ｂは、ストレプトアビジン精製によって回収された全長のＳＮＡＰ−ＴｃｄＢ産物を表す；溶出剤（Ｅ）と（ＦＴ）を通る流れは野生型（Ｗ）標本と比較され、予想通りに産物を産生しなかった。図８Ｃの中で、精製した標本をウエスタンブロット解析すると、抗ＳＮＡＰタグ抗体を使う強い信号を示す。最後に、図８Ｄの中で、ベロー細胞は、１時間精製したＳＮＡＰ−ＴｃｄＢまたは野生型ＴｃｄＢの異なる用量にさらし、そして細胞円形化の％を評価した。結果は、融合パートナーをＴｃｄＢに添加すると逆にその生物学的機能をすることなく、細胞に積荷を送達可能なままであることが確認された。
【００４９】
既存の細胞ベース系のリポーターコンストラクトの構築と機能テスト
【００５０】
上記の機能ＴｃｄＢペプチドは、本発明の１つの実施形態に従うコンストラクトを開発するのに使用できる。コンストラクトは、多能性インデューサーの配列をａＴｃｄＢコンストラクトのＮ末端終わりに加えることによって構築できる。次に多能性インデューサー／ＴｃｄＢコンストラクトを、２つの系の内の１つでテストできる。
【００５１】
Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合領域／ＮＦｋＢ活性化領域ベースのキメラの転写制御因子（Ｇａｌ４−ＴＦ）の存在を検出するのに用いる哺乳類のリポーター株化細胞は修飾できて、多能性インデューサーコンストラクトテストのためのリポーターとして使われる。ＨＥＫ２９３株化細胞は、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子（ＧＬｕｃ）遺伝子が続くＹＦＰＶｅｎｕｓ遺伝子を含む２つのシストロン性リポーター遺伝子を発現するＧａｌ４応答プロモーターから構成される合成リポーターコンストラクトを持つ。ＶｅｎｕｓとＧＬｕｃは、２つのリポータータンパク質の独立した発現度を可能にさせる口蹄疫ウイルスの「自己切断」ペプチド２Ａによって切り離される。両方のリポーター遺伝子の包含によって、ＧＬｕｃ生物発光の検出のみならずＶｅｎｕｓ蛍光のための細胞の顕微鏡での瞬間的な検査が可能になる。ａＴｃｄＢへの積荷附属器としてのＧａｌ４ベースの転写制御因子を持って、この系を転写制御因子／多能性インデューサーの機能細胞送達をテストするのに用いることができる。ＨＥＫ２９３Ｖｅｎｕｓ／Ｇｌｕｅリポーター系のＧａｌ４ ＤＮＡ結合配列プロモーターを、４回反復Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２成分と置換できる。他の多能性インデューサーを、ＨＥＫ２９３Ｖｅｎｕｓ／Ｇｌｕｅリポーター系のＧａｌ４ ＤＮＡ結合配列プロモーターをそれぞれの配列で置換することによってテストすることもできる。
【００５２】
第２のＯｃｔ４／Ｓｏｘ２ベースの株化細胞リポーターを、コンストラクトをテストするために利用することができる。この第２の系は、部位特異的プロモーター活性化のＯｃｔ４とＳｏｘ２のために必要とされるＤＮＡ結合領域から成る（Ａｍｂｒｏｓｅｔｔｉ Ｄ−Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｘ２ ａｎｄ Ｏｃｔ−３ ｏｎ ｔｈｅ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−４ Ｅｎｈａｎｃｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ． ２７５：２３３８７−２３３９７ （２０００））。ｐＣＡＴＳ０３と呼ばれるプロモーターリポーター遺伝子コンストラクトは、ＳＶ４０プロモーターの上流に位置するＦＧＦ−４エンハンサーに存在するＨＭＧとＰＯＵのモチーフを６部含む。ＨＭＧのモチーフはＳｏｘ２と結合し、そして、隣接したＰＯＵのモチーフはＯｃｔ４と結合する（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＰＰＡ４ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｇｅｎｅｓ ａｓ Ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｓｏｘ２： Ｏｃｔ−３／４ Ｔａｒｇｅｔ Ｇｅｎｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙｓ， Ｊ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２１６：６５１−６６２ （２００８）； Ｒｉｚｚｉｎｏ， Ａ． Ｓｏｘ２ ａｎｄ Ｏｃｔ−３／４： Ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｐａｉｒ ｏｆ Ｍａｓｔｅｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｔｈａｔ Ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅ ｔｈｅ Ｓｅｌｆ−Ｒｅｎｅｗａｌ ａｎｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ ａｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｈｅｏｓｔａｔｓ， Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＷＩＲＥｓ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １（２）， （２００９））。ヒーラー細胞、ｐＣＡＴＳ０３は極めて低いレベルのリポーター遺伝子を発現する。このプロモーターリポーター遺伝子コンストラクトは、ベースラインでＨｅＬａ細胞内に発現しないＳｏｘ２とＯｃｔ４の存在に非常に敏感である。ＨｅＬａ細胞がＳｏｘ２とＯｃｔ４の発現ベクトルとともにｐＣＡＴＳ０３を形質移入されると、リポーター遺伝子の強い刺激（〉４０倍）がある。Ｓｏｘ２とＯｃｔ４それぞれは、各々リポーター遺伝子〜３倍刺激する。Ｓｏｘ２とＯｃｔ４への共働応答があれば、このアッセイは、Ｓｏｘ２−とＯｃｔ４−ａＴｃｄＢ融合タンパクが協力して一緒に働く能力を測定する非常に感度が高いテストを提供できる。
【００５３】
Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２リポーター株化細胞へのａＴｃｄＢによる生理活性Ｏｃｔ４とＳｏｘ２の送達の実証
【００５４】
細胞ベースの分化アッセイについて、我々は、スミスとＲｉｚｚｉｎｏ研究所によってなされたＯｃｔ４またはＳｏｘ２のレベルの小さな増加（〜２倍）がマウスＥＳ細胞の分化を誘発することを示す発見を活用する（Ｎｉｗａ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏｃｔ−３／４ Ｄｅｆｉｎｅｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｒ Ｓｅｌｆ−Ｒｅｎｅｗａｌ ｏｆ ＥＳ Ｃｅｌｌｓ， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２４：３７２−３７６ （２０００）； Ｋｏｐｐ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｍａｌｌ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｓｏｘ２ Ｔｒｉｇｇｅｒ ｔｈｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６：９０３−９１１ （２００８））。
【００５５】
Ｏｃｔ４が上がる場合には、ＥＳ細胞は４８時間以内に胚体外内胚葉と栄養外胚葉のマーカーを発現する細胞に分化する（Ｎｉｗａ Ｈ， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２４：３７２−３７６）。Ｓｏｘ２が上がる場合には、ＥＳ細胞は４８時間以内に外胚葉、中胚葉、および栄養外胚葉で、しかし内胚葉ではないところにマーカーを発現する細胞に分化する（Ｋｏｐｐ， Ｊ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６：９０３−９１１）。これらの分化マーカーは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使うＲＮＡ分析で直ちに測定される（Ｋｏｐｐ， Ｊ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６：９０３−９１１）。
【００５６】
このアッセイを使って、Ｏｃｔ４−ａＴｃｄＢ融合タンパクとＳｏｘ２−ａＴｃｄＢ融合タンパクの各々の機能は、ＥＳ細胞の分化を特定の分化した細胞に駆動するそれらの能力を測定することによって評価できる。
【００５７】
細胞ベースの転写アッセイのために、我々はＯｃｔ４−およびＳｏｘ２−ａＴｃｄＢ融合タンパクがヒーラー細胞に安定して形質移入されたプロモーター／リポーター遺伝子コンストラクトを刺激する能力を検査するつもりである。以前に記述されたように、この細胞リポーター系が構築され、この種のアッセイにはよく機能する。Ｓｏｘ２−とＯｃｔ４−ａＴｃｄＢ融合タンパクは、タンパク質濃度の範囲に亘り個々にまた組合せでテストされる。これらの研究のために、我々は、Ｓｏｘ２−とＯｃｔ４−ａＴｃｄＢの融合タンパクがプロモーターリポーター遺伝子コンストラクトを刺激する能力を、レンチウイルスベクトルで送達されたＳｏｘ２とＯｃｔ４がｐＣＡＴＳ０３を刺激す能力と比較する（Ｎｏｗｌｉｎｇ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｏｘ−２ ａｎｄ ｉｔｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：３８１０−３８１８ （２０００））。
【００５８】
その上、密接にＧａｌ４−ＴＦ株化細胞に関係するＯｃｔ４／Ｓｏｘ２リポーター細胞系を作成でき、直接のプラスミド形質移入でテストできる。Ｓ０３プロモーターから発現したＶｅｎｕｓ／ＧＬｕｃを含む合成リポーターコンストラクトは、Ｓｏｘ２／Ｏｃｔ４と結合するＨＭＧとＰＯＵのモチーフ６部を含み、レンチウイルスベクトルにクローン化できる。ｓｏｘ２とｏｃｔ４遺伝子の両方が合成でき、ｐｃＤＮＡ哺乳類の発現プラスミドにクローン化できる。この系は、リポーターコンストラクトと両方のｓｏｘ２とｏｃｔ４発現プラスミドを持つＨＥＫ２９３細胞を同時形質導入させることによって確認できる。このリポーターの活性化は、ＧＬｕｃアッセイとＶｅｎｕｓ（ＹＦＰ）生物発光によってモニターできる。細胞内のＯｃｔ４／Ｓｏｘ２活性を確認した後に、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２は、インデューサーコンストラクトの産生のためのａＴｃｄＢ送達プラスミドに別々にクローン化して良い。リポーターを、他の因子（即ち、Ｏｃｔ４）のタンパク質送達によって補われる胚性トランス活性化因子（即ち、Ｓｏｘ２）のうちの１つのプラスミド形質移入によって、かつ逆に個々に送達されたタンパク質に対するリポーター応答をアッセイするために、さらに確認できる。最後に、ａＴｃｄＢインデューサーコンストラクトは、ｉＰＳ細胞産生系の組み合わせ効果と効率をテストするために両方の因子を送達するのに用いることができる。比較のために、タンパク質送達ペプチド（例えば、Ｔａｔ−Ｏｃｔ４）を、多能性インデューサーコンストラクトの増改善した効率を示すのに用いることができる。
【００５９】
ａＴｃｄＢ経由のＳｏｘ２およびＯｃｔ４の送達によるマウス胚性繊維芽細胞からｉＰＳ細胞への脱分化
【００６０】
融合タンパク質媒介再プログラムの効率をＭＥＦが４つの適切に特徴がはっきりした再プログラム転写制御因子を発現するレンチウイルスに感染する時に認められた再プログラム効率と比較できる（Ｃｏｘ， Ｊ．Ｌ．， ａｎｄ Ｒｉｚｚｉｎｏ， Ａ． Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ｗｈａｔ Ｌｉｅｓ Ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ Ｐａｒａｄｉｇｍ Ｓｈｉｆｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３５： １４８−１５８ （２０１０））。ＭＥＦは、自己切断ペプチド（口蹄疫ウイルスからの２Ａ）によってお互いから切り離されているＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃをコードする多シストロン性コピーを発現するレンチウイルスベクトルを使用して再プログラムされてきた。各々の多能性インデューサーコンストラクトを、ＭＥＦをドキシサイクリンに応じてＫｌｆ４とｃ−Ｍｙｃだけを発現する誘導性レンチウイルスベクトルに感染させることによってテストできる。そしてこれらの細胞を使用して、ＭＥＦの形成を促進させるためにドキシサイクリンとともに毎日培地に加えられるＳｏｘ２−とＯｃｔ４−ａＴｃｄＢ融合タンパクの能力をアッセイできる。
【００６１】
再プログラムの効率（再プログラムされた細胞のパーセンテージ）を測定することに加えて、産生するｉＰＳ細胞の品質は、以下を含む多能性幹細胞の広範な確立した特性を検査することによって評価されることができる：内因性の多能性転写制御因子（例えば、内因性のＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＵＴＦ１）の発現、内因性のＯｃｔ４とＮａｎｏｇの遺伝子の脱メチル化、細胞表面マーカーＳＳＥＡ−１の発現、および胚様体を使う胚性胚芽の各々からマーカーを発現する細胞に分化するｉＰＳ細胞の能力。（哺乳類の胚形成のための試験管内モデル系の転写調節（Ｒｉｚｚｉｎｏ， Ａ． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ）ｉｎ ａｎ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｏｄｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ， “Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ”， ｅｄｓ． Ｒ．Ｂ． Ｄｉｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｓ． Ｓａｌｏｍｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． １１５−１２９ （１９９８）内に記載）。
【００６２】
本発明は、好ましい実施形態を参照して記述された。特定の値、関係、物質とステップは発明の概念を記述する目的のために述べられていて、多数の変更および？または修正が広範囲に記述された発明の基本的概念と実施原則の精神と範囲を逸脱しない限り特定の実施形態で示されるように発明に加えて良いことを当業者は理解できるであろう。上記の教示に照らしてみれば、当業者が、本明細書に教示された本発明から逸脱しない範囲でこれらの明細を修正できることを理解されたい。ここで本発明の基礎をなしている概念の好ましい実施形態と特定の修正を明記したので、本明細書に示され記述された実施形態の特定の変更および修正のみならず様々な他の実施形態を、その根底にある概念に精通すれば、即座に明白に当業者は気づくであろう。添付の請求項またはその等価物の範囲内にある限りそのような修正、代替物、およびその他の実施形態を含むことを目的とする。したがって、本明細書に特に述べられているのでなければ、発明を実施できることを、よく理解すべきである。従って、本実施例は、あらゆる点において例示的であって制限的でないとみなされる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療目的のためのタンパク質送達系に関する。より詳しくは、このタンパク質送達系は、再生医療または疾病処置のために体細胞を分化させて人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞または組織特異的細胞に誘導する再プログラム因子を送達するために利用できる。
【背景技術】
【０００２】
過去には、多能性幹細胞は、核移植と細胞融合によって産生した（Ｓｈｉｎｙａ Ｙａｍａｎａｋａ、Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ、Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ． ３６３（１５００）：２０７９−２０８７ （Ｊｕｎｅ ２７， ２００８））。両方の方法は胚幹細胞を必要とし、それは研究と治療用途のために倫理的ジレンマを提起している。この問題は最近発見された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞で克服され、それは胚性幹（ＥＳ）細胞の同様な魅惑的な生物学的性質を共有している（Ｙａｍａｎａｋａ， Ａ Ｆｒｅｓｈ Ｌｏｏｋ ａｔ ｉＰＳ Ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ １３７： １３−１７ （Ｓ． ２００９））。
【０００３】
人工多能性幹細胞は、２００６年にマウス繊維芽細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｙ． ａｎｄ Ｓ． Ｙａｍａｎａｋａ， Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ Ａｄｕｌｔ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆａｃｔｏｒｓ， Ｃｅｌｌ １２６： ６６３−６７６ （２００６））から、そして２００７年には人間の繊維芽細胞（Ｙｕ Ｊｕｎｙｉｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８： １９１７−１９２０ （２００７）， Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｆｒｏｍ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆａｃｔｏｒｓ， Ｃｅｌｌ １３１ ： ８６１−８７２ （２００７））、Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｆｒｏｍ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆａｃｔｏｒｓ， Ｃｅｌｌ １３１ ： ８６１−８７２ （２００７））から明確な因子を強制的に発現させて初めて産生した。２セットの因子は、これらの研究において大人の体細胞を再プログラムさせてｉＰＳ細胞にすることを引き起こすのに用いられた。１つの因子は、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃを含み（Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｃｅｌｌ １２６： ６６３−６７６； Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｃｅｌｌ １３１：８６１−８７２）、そして、もう一つの因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を含む（Ｊｕｎｙｉｎｇ、Ｃｅｌｌ ３１８：１９１７−１９２０）。これらの明確な因子の再プログラム効率は、ｐ５３活性をノックダウンすることによって１０倍増加できる。
【０００４】
２００８年に、メルトンのグループは、３つの転写制御因子、Ｎｇｎ３（別名Ｎｅｕｒｏｇ３）、ＰｄｘｌおよびＭａｆａの特定の組合せを送達することによって、成熟したマウスの分化した膵臓外分泌細胞が、β細胞に密接に類似している細胞に再プログラムされたことを証明した（Ｚｈｏｕ， Ｑ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｅｘｏｃｒｉｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ β−ｃｅｌｌｓ， Ｎａｔｕｒｅ ４５５： ６２７−６３３ （２００８））。誘発されたβ細胞は、内因性島β細胞と形態学的に区別がつかない。これらは、β細胞機能に必須な遺伝子を発現し、局所維管束走向を改造して、インシュリンを分泌することによって、高血糖を改善することができる。この研究は、大人の体細胞が多能性幹細胞状態への復帰なしに転写制御因子の特定の組合せによって直接組織特異的細胞に再プログラムできることを示唆する。
【０００５】
ｉＰＳ細胞の将来性は、莫大である。しかし、ｉＰＳ細胞の臨床応用は、多くの障害に直面する（Ｙａｍａｎａｋａ， Ｃｅｌｌ １３７： １３−１７； Ｍｉｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（８）：７４３−７４５ （２００９）； Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｓａｆｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７： ６０６−６１３（２００９））。１つの大きな困難は、再プログラミング因子の送達伝達手段に、直接関連している。最初に、再プログラミング因子遺伝子は、レトロなまたはレンチウイルスベクトルによって体性繊維芽細胞に導入された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｃｅｌｌ １２６： ６６３−６７６； Ｊｕｎｙｉｎｇ， Ｃｅｌｌ ３１８： １９１７−１９２０； Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｃｅｌｌ １３１：８６１−８７２３−５）。レトロまたはレンチウイルスベクトルによる再プログラミングのプロセスの効率は僅か０．０５％以下（（Ｏｋｉｔａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２： ９４９−９５３； Ｙａｍａｎａｋａ， Ｓ． Ｅｌｉｔｅ ａｎｄ Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ Ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ４６０： ４９−５２ （２００９））であった。
【０００６】
これらのベクトルはランダムに宿主のゲノムに統合されるので、オンコジーンの挿入活性化は、常にレトロまたはレンチウイルスベクトルを使用する際の大きな懸念である。導入遺伝子は主にｉＰＳ細胞で発現停止させられるが、ｃ−Ｍｙｃトランス遺伝子の再活性化が結果として腫瘍化に導くことがあった（Ｏｋｉｔａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｎａｔｕｒｅ ４４８： ３１３−３１８ （２００７））。これらの導入遺伝子の漏出発現は完全なｉＰＳ細胞分化と成熟も妨げるかもしれない。そして、結果としてテラトーマ構造のより大きな危険性に導かれる（Ｙａｍａｎａｋａ， Ｃｅｌｌ １３７： １３−１７）。そのうえ、導入遺伝子はｉＰＳ細胞から再分化される細胞で再活性化し発現できるであろう。そして、結果としてｉＰＳ細胞または腫瘍形成の分化状態を再プログラムする危険に導かれるであろう。
【０００７】
アデノウイルスベクトルのような非組込ウイルスベクトルは、後にこれらの再プログラミング因子遺伝子を送達するのに用いられた（Ｚｈｏｕ， Ｎａｔｕｒｅ ４５５：６２７−６３３；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ、Ｍ． ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２：９４５−９４９の（２００８））。しかし、大量のアデノウイルスベクトル（それは細胞の上で細胞変性効果を引き起こす場合がある）は、アデノウイルス受容体ＣＡＲが不足する細胞型に、効果的に形質導入するために必要とされる。そのうえ、「不活性ではない」アデノウイルスベクトルが伝達媒体に選択されるならば、いくつかのアデノウイルス遺伝子の低次発現は形質転換された細胞に影響を及ぼすかもしれない。
【０００８】
再プログラミングは、直接プラスミド形質移入を通して達成されることもある（Ｏｋｉｔａ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２： ９４９−９５３； Ｙｕ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｆｒｅｅ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４： ７９７−８０１ （２００９））、しかし、それはレトロウイルスベクトルのそれより１００倍以上効率的でない（Ｏｋｉｔａ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２： ９４９−９５３）。アデノウイルスベクトル伝達とプラスミド形質移入は、安定した組込を除外しないかもしれない。アデノウイルスベクトルの組込周波数は、細胞につき１０-3〜１０-5までである（Ｈａｒｕｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３： ６１４１−６１４６ （１９９９））。
【０００９】
多能性幹細胞を産生する方法の比較は、表１に示される。
【表１】
【００１０】
１９９８年に、フランケル（Ｆｒａｎｋｅｌ）とグリーン（Ｇｒｅｅｎ）は、ＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質がレセプター非依存の様式で細胞に侵入できること別々に観察した（Ｆｒａｎｋｅｌ， Ａ． ａｎｄ Ｃ． Ｐａｂｏ， Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ， Ｃｅｌｌ ５５： １１８９−１１９３ （１９８８）；Ｇｒｅｅｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｐ． Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ， Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｔａｔ Ｔｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｃｅｌｌ ５５： １１７９−１１８８ （１９８８））。ＨＩＶ−１ Ｔａｔの短い塩基アルギニンリッチな領域（ａａ４８−５７）を含むＴａｔタンパク質伝達領域（ＰＴＤ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのペプチドを含む様々な分子を送達するために広く使われている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ： Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｏ Ｍｏｕｓｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５： １５６９−１５７２ （１９９９）；Ｌｉｎｄｓａｙ， Ｍ． Ａ． Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｒｇｅｔ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２：５８７−５９４ （２００２）；Ｋｗｏｎ， Ｙ． Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｔａｔ−Ｐｄｘｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １２： ２８−３２ （２００５）； Ｋｉｍ， Ｄ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４： ４７２−４７６ （２００９）； Ｗａｄｉａ， Ｊ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｄｕｃｉｂｌｅ Ｔａｔ−ＨＡ Ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｅｓｃａｐｅ ｏｆ Ｔａｔ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｆｔｅｒ Ｌｉｐｉｄ Ｒａｆｔ Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０：３１０−３１５ （２００９）； Ｚｈｏｕ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４： ３８１−３８４．１９−２４ （２００９））。
【００１１】
タンパク質ベースの媒体で分子を送達するこの方法は、タンパク質伝達と呼ばれている。イオン相互作用を通してＴａｔ−ＰＴＤを細胞表面に結びつけることは、脂質ラフト依存のマクロピノサイトーシス（Ｗａｄｉａ， Ｊ． Ｓ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０：３１０−３１５）によって、結果としてＴａｔ−融合タンパクの内面化に導かれる。しかしながら、大部分のＴａｔ−融合タンパクは、マクロピノソームで捕捉されたままであり、これはマクロピノソームからのペプチドまたはタンパク質の逸脱は非効率なプロセスであることを示す（Ｗａｄｉａ， Ｊ． Ｓ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０：３１０−３１５）。近年では、うまく４つの再プログラミング因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）のＣ末端に融合されたポリアルギニン（１１Ｒまたは９Ｒ）ＰＴＤが、マウス胚繊維芽細胞（Ｚｈｏｕ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４： ３８１−３８４ （２００９））、また新生児の繊維芽細胞（Ｋｉｍ， Ｄ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４： ４７２−４７６）を非常に低い効率であるがｉＰＳ細胞に再プログラムすることに成功した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、遺伝子発現ベクトルを使用することなくｉＰＳ細胞または組織特異的細胞を産生するために、大人の体細胞に再プログラム因子を送達する新規タンパク質ベースの系である。この系は、受容体結合領域、トランスロケーション領域、積荷保有領域及びインデューサーを持つコンストラクトを含む。受容体結合領域は、コンストラクトを体細胞に向かわせる。トランスロケーション領域は、積荷ベアリング領域とインデューサーを細胞に輸送するのを容易にする。積荷ベアリング領域は、インデューサーを細胞に送達する。本発明の１つの実施形態において、コンストラクトはコンストラクトの結合、トランスロケーションと積荷機能のために外毒素領域を利用する。そのような外毒素のいくつかは、クロストリジウム・ディフィシルＴｃｄＡとＴｃｄＢ毒素（クロストリジウム・ボツリヌス菌ＢｏＮＴＡ〜ＧおよびＣ２毒素）を含む。コンストラクトの様々な領域は、様々なサイズのインデューサーを収容し、インデューサーを特異的結合レセプターを持つ体細胞に向けさせるために交換されることを有する。
【００１３】
前記コンストラクトは、細胞がｉＰＳ細胞となるよう、多能性インデューサーを体細胞に送達するために用いることができる。本発明のもう一つの実施形態は、体細胞が１つまたは複数のインデューサーを支持するコンストラクトに接触するｉＰＳ細胞を産生する方法をさらに提供する。前記コンストラクトは、他のコンストラクト（例えばｉＰＳ細胞を産生するレンチウイルス、小タンパク質送達系、または小分子）と一緒に利用しても良い。
【００１４】
本発明の上記あるいは他の特徴、態様、および長所は、添付の図面に示されるこれらの実施形態の以下の説明に関して、更に詳細に考慮される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】本発明のクロストリジウム・ディフィシル構造のグラフを示す図である。
【図１Ｂ】本発明のクロストリジウム・ディフィシル立体配置を使う様々な可能なコンストラクトのグラフを示す図である。
【図２Ａ】Ｏｃｔ４およびＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグとスペーサーの間での移行を意味する。
【図２Ｂ】Ｏｃｔ４およびＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグとスペーサーの間での移行を意味する。
【図２Ｃ】Ｏｃｔ４およびＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグとスペーサーの間での移行を意味する。
【図２Ｄ】Ｏｃｔ４およびＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグとスペーサーの間での移行を意味する。
【図３Ａ】Ｓｏｘ２とＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図３Ｂ】Ｓｏｘ２とＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図３Ｃ】Ｓｏｘ２とＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図３Ｄ】Ｓｏｘ２とＴｃｄＢ／ＴｃｄＡを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図４Ａ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、Ｃ２Ｉ、およびＣ２ＩＩを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図４Ｂ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、Ｃ２Ｉ、およびＣ２ＩＩを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図４Ｃ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、Ｃ２Ｉ、およびＣ２ＩＩを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図４Ｄ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、Ｃ２Ｉ、およびＣ２ＩＩを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図４Ｅ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、Ｃ２Ｉ、およびＣ２ＩＩを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間での移行を意味する。
【図５Ａ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、ＢｏＮＴｓ、および他のＲＢＤを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間で移行を意味する。
【図５Ｂ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、ＢｏＮＴｓ、および他のＲＢＤを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間で移行を意味する。
【図５Ｃ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、ＢｏＮＴｓ、および他のＲＢＤを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間で移行を意味する。
【図５Ｄ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、ＢｏＮＴｓ、および他のＲＢＤを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間で移行を意味する。
【図５Ｅ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、ＢｏＮＴｓ、および他のＲＢＤを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間で移行を意味する。
【図５Ｆ】Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２、ＢｏＮＴｓ、および他のＲＢＤを含むコンストラクトの様々な領域のグラフを示す図である。下線が引かれた配列は、毒素の活性部位を不活性化する突然変異である。ダッシュ記号は、領域、タグおよびスペーサーの間で移行を意味する。
【図６】誘導の２〜３時間後にバチルスメガテリウムによる組換え型ＴｃｄＢタンパク質発現を示す時間経過ウエスタンブロット解析である。
【図７】ＴｃｄＢおよび無毒ＴｃｄＢにさらされるマウス結腸直腸腫瘍ＣＴ２６細胞を表す画像である。
【図８】（Ａ）は、ＴｃｄＢおよび積荷としてのＳＮＡＰを持つＴｃｄＢのテストコンストラクトのグラフを示す図である。（Ｂ）は、精製されたＳＮＡＰ−ＴｃｄＢコンストラクトを示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルを示す図である。（Ｃ）は、抗ＳＮＡＰ−タグ抗体を使う精製された試料のウエスタンブロット解析を示す図である。（Ｄ）は、ＳＮＡＰ−ＴｃｄＢコンストラクトが野生型ＴｃｄＢと同様に有毒であることを示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
上に要約された発明は以下の説明を参照することによってよりよく理解できる。そしてその説明の中で参照番号がその部分に対して使われていて、付随する請求項と図面とともに読むべきである。実施形態のこの説明は、発明の実施を構築して使用するのを可能にするために以下で述べられていて、本発明に制限することを意図するわけでなく、本発明の特定の例としての役割を果たす。当業者は、本発明の同じ目的を遂行する他の方法および系を修正または設計するための基礎として開示された概念と特定の実施形態を直ちに使用できるということ理解すべきである。当業者は、そのような等価のコンストラクトと株化細胞が、その最も広い形式において本発明の精神および範囲から逸脱しないことも理解しなければならない。
【００１７】
本明細書に使われる用語、「コンストラクト」とはインデューサー配列と積荷送達配列を含むアミノ酸配列を有する組み換え型ポリペプチドを指す。コンストラクトは、他の成分を持つことがある。たとえば、コンストラクトは受容体結合領域（ＲＢＤ）、トランスロケーション領域（ＴＤ）、積荷ベアリング領域（ＣＢＤ）と切断配列（ＣＳ）を含むことがある。以下に詳細に記述するように、ＲＢＤによって、コンストラクトがレセプターを有する細胞を認識してそれと結合できる。
【００１８】
ＴＤによって、ＣＢＤ（インデューサーを含むことがある）をサイトゾルに輸送できる。ＣＢＤは、毒素の不活化有機活性領域である場合がある。より詳しくは、当業者に既知の方法によってＣＢＤが標的細胞に無毒になるものと理解されている。いくつかの実施形態において、ＣＢＤはＴＤに直接リンクしているインデューサーである場合がある。ＣＳとは、例えば、多能性インデューサーを運ぶＣＢＤを細胞内のコンストラクトから解放させる固有のシステインプロテアーゼ領域（ＣＰＤ）または別のプロテアーゼ配列である場合がある。
【００１９】
「インデューサー」とは、他の特徴の内、体細胞に導入されると体細胞がｉＰＳ細胞に転換するのを補助できる転写制御因子である。以下のインデューサーが同定された：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ｌｉｎ２８、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ）およびＳＶ４０大型Ｔ抗原。他のインデューサーは、ＭａｆＡ、Ｐｄｘ−１、Ｎｇｎ３、ＳＶ−４０ Ｔ−ａｇ、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ−２、ｈ−ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ｐ５３ ｓｉＲＮＡを含むことがある。上述の因子に加えて、インデューサーはｐ５３阻害遺伝子（例えばｐ５３、ｓｉＲＮＡｓ、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡとリボザイムを標的とする抗体と抗体フラグメント）も含むことがある。
【００２０】
当業者は、本明細書に記述される配列の「実質同一の」ホモログが本発明の例示的な実施形態を構成することを理解されたい。
【００２１】
以下のいずれかが成立するならば、２つのアミノ酸配列は「実質同一である」：（ｉ）結果として生じるポリペプチドの畳み込み活性に重大な影響を及ぼさない保守的なアミノ酸置換のみを有する、（ｉｉ）２つの整列化した配列の最も短い方のアミノ酸残基について、挿入、削除、そして、代入によるギャップの数が、最大で１０％、望ましくは５％でしかなく、または、（ｉｉ）最大でアミノ酸残基の３０％、望ましくは２０％、より望ましくは１５％または１０％しか、２つの配列の間で変化がない。米国特許出願番号ＵＳ２００３／０，１６１，８０９Ａ１号の中にヒューストンらによって記述された他の方法を使って、２つの配列がかなり同一かどうか決定しても良い。
【００２２】
クロストリジウム外毒素はそのＮ末端酵素領域に効果的な細胞取り込みとサイトゾル送達のためのすべてのメカニズムを備えていて、再プログラミングタンパク質を大人の体細胞に送達するのに用いることができる。特に、クロストリジウム外毒素とは、毒素を効率的にそのＮ末端酵素領域と、そのＮ末端に付随した全てをサイトゾル転位させるモジュラー多領域を示す。例えば、クロストリジウム・ボツリヌス神経毒タイプＤ（ＢｏＮＴ−Ｄ）とクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ型（ＴｃｄＢ）の両方は、毒素のＮ末端に付加された積荷をサイトゾルに送達する能力を示した（Ｂａｄｅ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｔｙｐｅ Ｄ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｃａｒｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｖｉａ Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９１： １４６１−１４７２２５−２６ （２００４）；
Ｐｆｅｉｆｅｒ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ Ｂ， Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃｙｔｏｓｏｌ ｏｆＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ， Ｊ． ｏｆ Ｂｏｉｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８：４４５３５−４４５４１（２００３））。
【００２３】
Ｉ． Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＴｃｄＡｏおよびＴｃｄＢ多能性インデューサーｉＰＳ細胞コンストラクト。
【００２４】
本発明の１つの実施形態は、図１で示すような３つの機能領域を有するクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ（ＴｃｄＡ）とＢ（ＴｃｄＢ）のコンストラクトを含む：（ａ）エンドサイトーシスのための標的細胞と結合するＲＢＤ；（ｂ）毒素の酵素領域のサイトゾル送達を促進するＴＤ；および、（ｃ）インデューサーを運ぶＣＢＤ（ＧＴ酵素領域の不活発な部分である）。図１Ａは、Ｎ末端グルコシル・トランスフェラーゼ領域（ＧＴ）、固有のシステインプロテアーゼ領域（ＣＰＤ）、中心トランスロケーション領域（ＴＤ）（疎水性部分（ＨＲ）を含む）、Ｃ末端受容体結合領域（ＲＢＤ）を有するクロストリジウムディフィシレ毒素の一次構造を示す。ＣＢＤは、エンジニアリング組換え型タンパク質のためのＧＴ領域の中に位置する。
【００２５】
図１Ｂで示すように、ＴｃｄＢ変異体の様々な異なるコンストラクトは、ＧＴタンパク質構造の先端を切り取ることによって無毒化される。野生型ＴｃｄＢ、無毒ＴｃｄＢ（ａＴｃｄＢ）、ならびに組換え型融合タンパクａＴｃｄＢ−Ｍｌ、ａＴｃｄＢ−Ｍ２、およびａＴｃｄＢ−Ｍ３、のタンパク質構造。ａＴｃｄＢ−Ｍｌによって、インデューサーがａＴｃｄＢのＮ末端に付加できる。ａＴｃｄＢ−Ｍ２は、先端が切り取られたグルコシル基転移酵素（ＧＴ）領域に付属する積荷を持ち、ａＴｃｄＢ−Ｍ３は、全てのＧＴ領域を置き換える積荷を持っている
【００２６】
最初のステップとして、ＴｃｄＡのＲＢＤとＴｃｄＢ ＲＢＤ（複数）が、Ｇａｌ−α１、３−Ｇａｌ−β１、４−ＧａｌＮＡｃを含む細胞表面炭水化物と結合する。これらの細胞表面炭水化物は、大部分の体細胞で見出される。このように、ＴｃｄＡ ＲＢＤは、大部分の体細胞と結合する。
【００２７】
ＲＢＤがそのレセプターと結合した後、ＣＢＤは受容体媒介エンドサイトーシスによって内在化される。ＴＤの疎水性部分（ＨＲ）は、ＣＢＤがそれを通ってサイトゾルに転位できる孔を作るために毒素の対応する部分がそれ自体をエンドソーム膜に挿入するのを可能にする。転位されたものは残りのコンストラクトから切り離されることができて、自己タンパク分解によってサイトゾルにリリースされることができる。そして、図１Ｂで示すようにＴＤのＮ末端部分で自己切断位に隣接している固有のシステインプロテアーゼ領域（ＣＰＤ）によって触媒作用を及ぼされる。その結果、本明細書に記述されているように、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢのＲＢＤおよびＴＤを含むコンストラクトを使用して多能性インデューサーを体細胞に導入することができる。
【００２８】
ＣＢＤは、インデューサーを運ぶ不活化ＧＴ領域である。ＧＴ領域は、当業者に知られている様々な方法を使用して不活性化できる。ＧＴ領域は切り詰めできる。活性は、その道筋でアミノ酸置換によって破壊できる。本発明の１つの実施形態に、ＴｃｄＡのＧＴはＤ２８５ＡとＤ２８７Ａの削除に引き続いて不活性化し、そして、ＴｃｄＢのＧＴはＤ２８６ＡとＤ２８８Ａの削除に引き続いて不活性化する。本発明のいくつかの実施形態において、活性に対して責務を担う領域部分が削除される様々な長さのＧＴ領域が利用できる。ＧＴ領域を不活化すると、ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢが無毒化しｉＰＳ細胞を産生するためのコンストラクト内での使用を実行可能にする。不活化ＧＴ領域は、インデューサーが付着できるＣＢＤになる。図１Ｂは、本発明の１つの実施形態に従うコンストラクトの様々な可能な配置を示す。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態に従い、図２Ａ〜図２Ｄは、ＴｃｄＢとＯｃｔ４とＳｏｘ２の様々な領域を利用する様々なコンストラクトを例示する。図２Ａの中で、Ｏｃｔ４−ａＴｃｄＢコンストラクト（配列番号１）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｏｃｔ４配列（ａａ５７−４１６）；ＣＢＤ（ａａ４２０−９６１）；ＣＰＤ（ａａ９６２−１１８５）；疎水性領域（ａａ１３７４−１５４６）を含むＴＤ（ａａ１１８６−２２６９）；ＲＢＤ（ａａ２２７０−２７８４）；そして、ヒスチジンタグ（ａａ２７８５−２７９０）。図２Ｂの中で、Ｏｃｔ４−ａＴｃｄＢ（ｄＧＴ）コンストラクト（配列番号２）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｏｃｔ４配列（ａａ５７−４１６）；ＣＢＤ（ａａ４１９−４８８）；ＣＰＤ（ａａ４８９−７１２）；疎水性領域（ａａ９０１−１０７３）を含むＴＤ（ａａ７１３−１７９６）；ＲＢＤ（ａａ１７９７−２３１１）；およびヒスチジンタグ（ａａ２３１２−２３１７）。ＳＢＰとヒスチジンタグが単にコンストラクトのためのタグであるものと理解される。それは他のタグを交換しても良いし、Ｏｃｔ４（インデューサー）をサイトゾル空間へのトランスロケーションさせるコンストラクト能力に影響を及ぼすことなく完全に除去しても良い。
【００３０】
図２Ｃの中で、Ｏｃｔ４−ａＴｃｄＡコンストラクト（配列番号３）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｏｃｔ４配列（ａａ５８−４１６）；ＣＢＤ（ａａ４２０−９５９）；ＣＰＤ（ａａ９６０−１１８７）；疎水性領域（ａａ９００−１３７６）を含むＴＤ（ａａ１１８８−２２６７）；ＲＢＤ（ａａ２２６８−３１２８）；およびヒスチジンタグ（ａａ３１２８−３１３４）。図２Ｄの中で、Ｏｃｔ４−ａＴｃｄＡ（ｄＧＴ）コンストラクト（配列番号４）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｏｃｔ４配列（ａａ５８−４１６）；ＣＢＤ（ａａ４１９−４８６）；ＣＰＤ（ａａ４８７−７１４）；疎水性領域（ａａ９０３−１０７５）を含むＴＤ（ａａ７１５−１７９４）；ＲＢＤ（ａａ１７９５−２６５５）；およびヒスチジンタグ（ａａ２６５６−２６６１）。
【００３１】
同様に、図３Ａ〜図３Ｄは、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢとＳｏｘ２を利用するコンストラクトを例示する。図３Ａの中で、Ｓｏｘ２−ａＴｃｄＢコンストラクト（配列番号５）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｓｏｘ２配列（ａａ５８−３７３）；ＣＢＤ（ａａ３７７−９１８）；ＣＰＤ（ａａ９１９−１１４２）；疎水性領域（ａａ１３３１−１５０３）を含むＴＤ（ａａ１１４３−２２２６）；ＲＢＤ（ａａ２２６８−３１２８）；およびヒスチジンタグ（ａａ２２２７−２７４１）。図３Ｂの中で、Ｓｏｘ２−ａＴｃｄＢ（ｄＧＴ）コンストラクト（配列番号６）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｓｏｘ２配列（ａａ５８−３７３）；ＣＢＤ（ａａ３７６−４４５）；ＣＰＤ（ａａ４４６−６６９）；疎水性領域（ａａ８５８−１０３０）を含むＴＤ（ａａ６７０−１７５３）；ＲＢＤ（ａａ１７５４−２２６８）；およびヒスチジンタグ（ａａ２２６９−２２７４）。
【００３２】
図３Ｃの中で、Ｓｏｘ２−ａＴｃｄＡコンストラクト（配列番号７）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｓｏｘ２配列（ａａ５８−３７３）；ＣＢＤ（ａａ３７７−９１６）；ＣＰＤ（ａａ９１７−１１４４）；疎水性領域（ａａ１３３３−１５０５）を含むＴＤ（ａａ１１４５−２２２４）；ＲＢＤ（ａａ２２２５−３０８５）；およびヒスチジンタグ（ａａ３０８６−３０９１）。図３Ｄの中で、Ｓｏｘ２−ａＴｃｄＡ（ｄＧＴ）コンストラクト（配列番号８）の配列は、以下の領域を備えている：ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）（ａａ１−５５）；Ｓｏｘ２配列（ａａ５８−３７３）；ＣＢＤ（ａａ３７６−４４３）；ＣＰＤ（ａａ４４４−６７１）；疎水性領域（ａａ８６０−１０３２）を含むＴＤ（ａａ６７２−１７５１）；ＲＢＤ（ａａ１７５２−２６１２）；およびヒスチジンタグ（ａａ２６１３−２６１８）。
【００３３】
ＩＩ． クロストリジウム・ボツリヌス菌神経毒多能性インデューサーｉＰＳ細胞コンストラクト
【００３４】
クロストリジウム・ボツリヌス菌神経毒（ＢｏＮＴ）は、多分化能インデューサー送達のために使うことができるクロストリジウム外毒素のもう１つの候補である。ＢｏＮＴは、特定のニューロン・レセプターを認識するＲＢＤから構成される。ＢｏＮＴ毒素のＨ鎖（Ｈｅ）は、コンストラクトのためのＴＤとして機能する。本発明の１つの実施形態のコンストラクトのＣＢＤは、Ｌ鎖の膜への非パルミトイル化された係留防御を持つクロストリジウム・ボツリヌス菌神経毒Ｌ鎖または先端を切り取ったＬ鎖でありえる。Ｌ鎖は、ＢｏＮＴのＡ型〜Ｇ型から選ばれてコンストラクトによって送達されるインデューサーの薬理効果の異なる寿命を提供する。
【００３５】
ＩＩＩ． クロストリジウム属Ｃ２毒素コンストラクト
【００３６】
クロストリジウム属Ｃ２毒素は、Ｃ２ＩＩ鎖が酵素により活性化したＡＤＰリボシル化鎖のＣ２Ｉの細胞レセプター結合、エンドサイトーシス、小孔形成、およびトランスロケーションに関与する二成分毒素構造を持つ。本発明の１つの実施形態に従うコンストラクトは、Ｃ２ＩＩ鎖に多能性インデューサーを融合させて作ることができる。Ｃ２Ｉ鎖の一部の省略によって、コンストラクトをｉＰＳ細胞の産生のプロモーターとして使用するために無毒で安全にする。代わりに、Ｃ２Ｉ領域は、活性部位の修飾または削除によって不活性化させることができる。また、残基のいくつかは、下記の図で示すように変質させても良い。
【００３７】
図４Ａ〜図４Ｅは、本発明の１つの実施形態に従って作れるコンストラクトのいくつかの代表例を表す。図４Ａで、基本的なＣ２ＩＩコンストラクトは、ＳＢＰとヒスチジンタグで提示される（配列番号９）。図４Ｂは、Ｏｃｔ４と不活化Ｃ２Ｉ領域（配列番号１０）を有するコンストラクトを表す。Ｃ２Ｉ領域は、コンストラクトのａａ６００、６０２、８０４、８０５および８０７で点突然変異によって不活性化されることを有する。ＳＢＰとヒスチジンタグは、任意である。図４Ｃは、Ｏｃｔ４と先端を切ったＣ２Ｉ（配列番号１１）を有するコンストラクトを表し、そしてその切断がそれを不活発にする。図４Ｄは、Ｓｏｘ２と不活化したＣ２Ｉ配列（配列番号１２）を有するコンストラクトを表す。図４Ｅは、Ｓｏｘ２を有する先端を切ったＣ２Ｉを表す（配列番号１３）。
【００３８】
ＩＶ． クロストリジウム毒素領域スワッピング
【００３９】
様々なクロストリジウム毒素は、異なる細胞型と結合する。クロストリジウム毒素のＲＢＤは、交換／スワップできてインデューサーを体細胞に送達することができる様々な異なるコンストラクトの存在を証明する。Ｃ末端ＲＢＤの領域スワッピングによって、細胞型、組織、特異的送達のための異なるコンストラクトを作ることができる。１つの実施形態おいて、ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢのＲＢＤは、標的神経細胞のためにＢｏＮＴから選択されるＲＢＤと入れ替えることができる。もう１つの実施形態おいて、ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢのＲＢＤは、細胞型または組織特異細胞表面レセプターと結合し、レセプター媒介内在化を誘発するリガンドと置換することができる。全体で、異なるユーティリティに対応する順序を変えたタンパク質ベースの送達媒介は、Ｎ末端領域スワッピングとＣ末端領域スワッピングとの組合せによって作成することができる。
【００４０】
送達媒介である以上に、ＢｏＮＴのＣ末端ＲＢＤは、ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢのＲＢＤに取って代わることができ、特に神経細胞を標的とするタンパク質送達媒介を作製するのに用いることができる。同様に、ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢのＲＢＤは、ＢｏＮＴのＲＢＤに取って代わるのに用いることができ結果としてＢｏＮＴコンストラクトによってインデューサーの非細胞特異標的になる。さらにまた、ＢｏＮＴＬ鎖は、ＴｃｄＢまたはＴｃｄＡのＮ末端に取って代わるのに用いることができＢｏＮＴＬ鎖のＮ末端に融合する積荷タンパク質の望ましい生物学的機能を強化する。Ｌ鎖はＢｏＮＴのＡ型からＧ型まで、好ましくはクロストリジウム・ボツリヌス菌神経毒Ａ型のＬ鎖までの間で選択される。従って、本明細書に示されているように、クロストリジウム外毒素間の領域交換を用いることによって、様々な多能性インデューサー送達媒介が合成できる。
【００４１】
図５Ａ〜図５Ｄは、本発明の１つの実施形態に従って作ることができるコンストラクトのいくつかの代表例を表す。図５Ａの中で、Ｏｃｔ４は、ＴＤとＴｃｄＢ ＲＢＤ（配列番号１４）のようにＢｏＮＴ／Ｃｌに付着する。図４Ａのコンストラクトにおいて、ＢｏＮＴ／ＣｌのＬ鎖の活性は、示されている修飾によって破壊できる。図４Ｂは、ＢｏＮＴ／Ｃｌ ＴＤとＴｃｄＢ ＲＢＤを有するＳｏｘ２を表す（配列番号１５）。図５Ｃは、インデューサーとしてのＯｃｔ４、ＴＤとしてのＣ２ＩおよびＲＢＤとしてのトランスフェリンを有するコンストラクトを表す。図５Ｄは図５Ｃと類似しているが、Ｏｃｔ４の代わりに、Ｓｏｘ２を利用する（配列番号１６）。図５Ｅは、インデューサーがＯｃｔ４であり、ＣＢＤとＴＤがＢｏＮＴ／Ｃｌによって提供され、そしてＲＢＤがＩＬＧＦと一致する本発明の１つの実施形態に従うコンストラクトの更なる例を提供する（配列番号１７）。図５Ｆは、インデューサーがＳｏｘ２であり、ＣＢＤとＴＤがＢｏＮＴ／Ｃｌによって提供され、そしてＲＢＤがＩＬＧＦと一致する本発明の１つの実施形態に従うコンストラクトの更なる例を提供する（配列番号１８）。
【００４２】
当業者は、コンストラクトが標準的方法によって作製できることを理解するであろう。たとえば、コンストラクトは標準的方法によって大腸菌または藻類系で発現することができる。Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ， Ｄａｖｉｄ Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ： Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ ａｔ ｔｈｅ ５９ Ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２０， ２５２−２６４ （２０００）； Ｇｒｉｓｗｏｌｄ， Ｋａｒｌ Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｖｅｒｓｕｓ Ｐｕｔａｔｉｖｅ ５０−ｍＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｃｕｔｉｎａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２７： １３４−１４２ （２００３）； Ｍａｙｆｉｅｌｄ， Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ａｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １８： １２６？ １３３ （２００７）。
【００４３】
Ｖ． 例
ＴｃｄＢコンストラクトの調製
【００４４】
我々は、バチルスメガテリウム発現系を使うクロストリジウム・ディフィシル毒素の強い組み換え型発現度を成功裏に示した。ＴｃｄＡとＴｃｄＢ遺伝子の両方を、ＰＣＲによってクロストリジウム・ディフィシル（ＶＰＩ １０４６３）ゲノムＤＮＡから増幅した。これらのＰＣＲ産物を、クローン化してバチルスメガテリウム発現ベクトルｐＨｉｓ１５２２を作った（ＭｏＢｉＴｅｃ、ドイツ）。我々も、グルコシル基転移酵素領域での基質結合のために重要なアミノ酸を変異させて無毒ＴｃｄＢ遺伝子を作った。これらのコンストラクトを使ってバチルスメガテリウムプロトプラスト（ＭｏＢｉＴｅｃ）を形質移入した。その上、我々も将来において組み換え型コンストラクトに役立つためにＴｃｄＢをコードする完全な合成遺伝子のコンストラクトを生み出した。ＧＴを切り詰めた変異体も、自己切断部位（−ΔＧＴ６８）の僅か６８個のアミノ酸上流で、Ｇａｌ４−ＴＦ／ａＴｃｄＢから作られた。陽性クローンは組み換え型タンパク質発現のために選ばれた、そして細菌性可溶化液から組み換え型ヒスチジンタグされた組換え型ＴｃｄＢ（ｒＴｃｄＢ）の精製を、イオン交換分画の後でＮｉ−アフィニティークロマトグラフィーによって実行した。これらのクローンで、我々は、図６で示すように小規模の時間経過発現研究を行って、両方の組み換え型タンパク質のピーク発現がキシロース誘導後の２〜３時間であると分かった。
【００４５】
我々は、１リットルの総菌液の可溶化液から平均５〜１０ｍｇの高度に精製された組み換え型タンパク質を得ることができた。精製したｒＴｃｄＢを、細胞病理と細胞毒性の効果およびＲａｃ１のグルコシル化についてマウス腸の上皮ＣＴ２６細胞内で機能的にテストした。長い期間の無毒ＴｃｄＢ（ａＴｃｄＢ）で可能な限りの最高線量への細胞の露顕は、変異体ＧＴは酵素活性（〜５ｌｏｇｓ）が実質的に欠けていて、劇的に減少した細胞障害性（＞５ｌｏｇｓ）を示した。図４は、細胞変性効果は、ａＴｃｄＢで処置したこれらの細胞の上では観察されなかったことを示す。
【００４６】
組換え型ＴｃｄＢがヒューズのついた積荷を細胞に送達することができることを確かめるために、我々はＴｃｄＢのアミノ末端に、小さな酵素（Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキル基転移酵素、ニューイングランドバイオラボによってＳＮＡＰ−タグと呼ばれている）を付加した。我々は、ＳＮＡＰ−タグのキメラ融合を活性化組換え型ＴｃｄＢに効率的に発現させることができる。キメラタンパク質は野生型ＴｃｄＢに粗等しい毒性を保持する。このことは図７で示すように積荷がサイトゾルに達した後のみに毒性を引き起こすＴｃｄＢのグルコシル基転移酵素領域に付加されるので、積荷が細胞サイトゾルにアクセスしたに違い無いことを示す。
【００４７】
ＳＮＡＰ−ＴｃｄＢ融合タンパクの作製、精製および生物学的機能の実証
【００４８】
図８Ａで示すように、Ｎ修飾ＳＮＡＰ−ＴｃｄＢ融合のドメイン構造は、野生型が２９０ｋＤであるのと比較して、２７０ｋＤペプチドである。野生型ＴｃｄＢコンストラクトには、ヘキサヒスチジンタグがあった。ＳＮＡＰ−ＴｃｄＢコンストラクトは、親和性精製のためにヘキサヒスチジンとストレプトアビジンタグで標識された。図８Ｂは、ストレプトアビジン精製によって回収された全長のＳＮＡＰ−ＴｃｄＢ産物を表す；溶出剤（Ｅ）と（ＦＴ）を通る流れは野生型（Ｗ）標本と比較され、予想通りに産物を産生しなかった。図８Ｃの中で、精製した標本をウエスタンブロット解析すると、抗ＳＮＡＰタグ抗体を使う強い信号を示す。最後に、図８Ｄの中で、ベロー細胞は、１時間精製したＳＮＡＰ−ＴｃｄＢまたは野生型ＴｃｄＢの異なる用量にさらし、そして細胞円形化の％を評価した。結果は、融合パートナーをＴｃｄＢに添加すると逆にその生物学的機能をすることなく、細胞に積荷を送達可能なままであることが確認された。
【００４９】
既存の細胞ベース系のリポーターコンストラクトの構築と機能テスト
【００５０】
上記の機能ＴｃｄＢペプチドは、本発明の１つの実施形態に従うコンストラクトを開発するのに使用できる。コンストラクトは、多能性インデューサーの配列をａＴｃｄＢコンストラクトのＮ末端終わりに加えることによって構築できる。次に多能性インデューサー／ＴｃｄＢコンストラクトを、２つの系の内の１つでテストできる。
【００５１】
Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合領域／ＮＦｋＢ活性化領域ベースのキメラの転写制御因子（Ｇａｌ４−ＴＦ）の存在を検出するのに用いる哺乳類のリポーター株化細胞は修飾できて、多能性インデューサーコンストラクトテストのためのリポーターとして使われる。ＨＥＫ２９３株化細胞は、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子（ＧＬｕｃ）遺伝子が続くＹＦＰＶｅｎｕｓ遺伝子を含む２つのシストロン性リポーター遺伝子を発現するＧａｌ４応答プロモーターから構成される合成リポーターコンストラクトを持つ。ＶｅｎｕｓとＧＬｕｃは、２つのリポータータンパク質の独立した発現度を可能にさせる口蹄疫ウイルスの「自己切断」ペプチド２Ａによって切り離される。両方のリポーター遺伝子の包含によって、ＧＬｕｃ生物発光の検出のみならずＶｅｎｕｓ蛍光のための細胞の顕微鏡での瞬間的な検査が可能になる。ａＴｃｄＢへの積荷附属器としてのＧａｌ４ベースの転写制御因子を持って、この系を転写制御因子／多能性インデューサーの機能細胞送達をテストするのに用いることができる。ＨＥＫ２９３Ｖｅｎｕｓ／Ｇｌｕｅリポーター系のＧａｌ４ ＤＮＡ結合配列プロモーターを、４回反復Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２成分と置換できる。他の多能性インデューサーを、ＨＥＫ２９３Ｖｅｎｕｓ／Ｇｌｕｅリポーター系のＧａｌ４ ＤＮＡ結合配列プロモーターをそれぞれの配列で置換することによってテストすることもできる。
【００５２】
第２のＯｃｔ４／Ｓｏｘ２ベースの株化細胞リポーターを、コンストラクトをテストするために利用することができる。この第２の系は、部位特異的プロモーター活性化のＯｃｔ４とＳｏｘ２のために必要とされるＤＮＡ結合領域から成る（Ａｍｂｒｏｓｅｔｔｉ Ｄ−Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｘ２ ａｎｄ Ｏｃｔ−３ ｏｎ ｔｈｅ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−４ Ｅｎｈａｎｃｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ． ２７５：２３３８７−２３３９７ （２０００））。ｐＣＡＴＳ０３と呼ばれるプロモーターリポーター遺伝子コンストラクトは、ＳＶ４０プロモーターの上流に位置するＦＧＦ−４エンハンサーに存在するＨＭＧとＰＯＵのモチーフを６部含む。ＨＭＧのモチーフはＳｏｘ２と結合し、そして、隣接したＰＯＵのモチーフはＯｃｔ４と結合する（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＰＰＡ４ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｇｅｎｅｓ ａｓ Ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｓｏｘ２： Ｏｃｔ−３／４ Ｔａｒｇｅｔ Ｇｅｎｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙｓ， Ｊ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２１６：６５１−６６２ （２００８）； Ｒｉｚｚｉｎｏ， Ａ． Ｓｏｘ２ ａｎｄ Ｏｃｔ−３／４： Ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｐａｉｒ ｏｆ Ｍａｓｔｅｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｔｈａｔ Ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅ ｔｈｅ Ｓｅｌｆ−Ｒｅｎｅｗａｌ ａｎｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ ａｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｈｅｏｓｔａｔｓ， Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＷＩＲＥｓ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １（２）， （２００９））。ヒーラー細胞、ｐＣＡＴＳ０３は極めて低いレベルのリポーター遺伝子を発現する。このプロモーターリポーター遺伝子コンストラクトは、ベースラインでＨｅＬａ細胞内に発現しないＳｏｘ２とＯｃｔ４の存在に非常に敏感である。ＨｅＬａ細胞がＳｏｘ２とＯｃｔ４の発現ベクトルとともにｐＣＡＴＳ０３を形質移入されると、リポーター遺伝子の強い刺激（〉４０倍）がある。Ｓｏｘ２とＯｃｔ４それぞれは、各々リポーター遺伝子〜３倍刺激する。Ｓｏｘ２とＯｃｔ４への共働応答があれば、このアッセイは、Ｓｏｘ２−とＯｃｔ４−ａＴｃｄＢ融合タンパクが協力して一緒に働く能力を測定する非常に感度が高いテストを提供できる。
【００５３】
Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２リポーター株化細胞へのａＴｃｄＢによる生理活性Ｏｃｔ４とＳｏｘ２の送達の実証
【００５４】
細胞ベースの分化アッセイについて、我々は、スミスとＲｉｚｚｉｎｏ研究所によってなされたＯｃｔ４またはＳｏｘ２のレベルの小さな増加（〜２倍）がマウスＥＳ細胞の分化を誘発することを示す発見を活用する（Ｎｉｗａ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏｃｔ−３／４ Ｄｅｆｉｎｅｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｒ Ｓｅｌｆ−Ｒｅｎｅｗａｌ ｏｆ ＥＳ Ｃｅｌｌｓ， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２４：３７２−３７６ （２０００）； Ｋｏｐｐ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｍａｌｌ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｓｏｘ２ Ｔｒｉｇｇｅｒ ｔｈｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６：９０３−９１１ （２００８））。
【００５５】
Ｏｃｔ４が上がる場合には、ＥＳ細胞は４８時間以内に胚体外内胚葉と栄養外胚葉のマーカーを発現する細胞に分化する（Ｎｉｗａ Ｈ， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２４：３７２−３７６）。Ｓｏｘ２が上がる場合には、ＥＳ細胞は４８時間以内に外胚葉、中胚葉、および栄養外胚葉で、しかし内胚葉ではないところにマーカーを発現する細胞に分化する（Ｋｏｐｐ， Ｊ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６：９０３−９１１）。これらの分化マーカーは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使うＲＮＡ分析で直ちに測定される（Ｋｏｐｐ， Ｊ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６：９０３−９１１）。
【００５６】
このアッセイを使って、Ｏｃｔ４−ａＴｃｄＢ融合タンパクとＳｏｘ２−ａＴｃｄＢ融合タンパクの各々の機能は、ＥＳ細胞の分化を特定の分化した細胞に駆動するそれらの能力を測定することによって評価できる。
【００５７】
細胞ベースの転写アッセイのために、我々はＯｃｔ４−およびＳｏｘ２−ａＴｃｄＢ融合タンパクがヒーラー細胞に安定して形質移入されたプロモーター／リポーター遺伝子コンストラクトを刺激する能力を検査するつもりである。以前に記述されたように、この細胞リポーター系が構築され、この種のアッセイにはよく機能する。Ｓｏｘ２−とＯｃｔ４−ａＴｃｄＢ融合タンパクは、タンパク質濃度の範囲に亘り個々にまた組合せでテストされる。これらの研究のために、我々は、Ｓｏｘ２−とＯｃｔ４−ａＴｃｄＢの融合タンパクがプロモーターリポーター遺伝子コンストラクトを刺激する能力を、レンチウイルスベクトルで送達されたＳｏｘ２とＯｃｔ４がｐＣＡＴＳ０３を刺激す能力と比較する（Ｎｏｗｌｉｎｇ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｏｘ−２ ａｎｄ ｉｔｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：３８１０−３８１８ （２０００））。
【００５８】
その上、密接にＧａｌ４−ＴＦ株化細胞に関係するＯｃｔ４／Ｓｏｘ２リポーター細胞系を作成でき、直接のプラスミド形質移入でテストできる。Ｓ０３プロモーターから発現したＶｅｎｕｓ／ＧＬｕｃを含む合成リポーターコンストラクトは、Ｓｏｘ２／Ｏｃｔ４と結合するＨＭＧとＰＯＵのモチーフ６部を含み、レンチウイルスベクトルにクローン化できる。ｓｏｘ２とｏｃｔ４遺伝子の両方が合成でき、ｐｃＤＮＡ哺乳類の発現プラスミドにクローン化できる。この系は、リポーターコンストラクトと両方のｓｏｘ２とｏｃｔ４発現プラスミドを持つＨＥＫ２９３細胞を同時形質導入させることによって確認できる。このリポーターの活性化は、ＧＬｕｃアッセイとＶｅｎｕｓ（ＹＦＰ）生物発光によってモニターできる。細胞内のＯｃｔ４／Ｓｏｘ２活性を確認した後に、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２は、インデューサーコンストラクトの産生のためのａＴｃｄＢ送達プラスミドに別々にクローン化して良い。リポーターを、他の因子（即ち、Ｏｃｔ４）のタンパク質送達によって補われる胚性トランス活性化因子（即ち、Ｓｏｘ２）のうちの１つのプラスミド形質移入によって、かつ逆に個々に送達されたタンパク質に対するリポーター応答をアッセイするために、さらに確認できる。最後に、ａＴｃｄＢインデューサーコンストラクトは、ｉＰＳ細胞産生系の組み合わせ効果と効率をテストするために両方の因子を送達するのに用いることができる。比較のために、タンパク質送達ペプチド（例えば、Ｔａｔ−Ｏｃｔ４）を、多能性インデューサーコンストラクトの増改善した効率を示すのに用いることができる。
【００５９】
ａＴｃｄＢ経由のＳｏｘ２およびＯｃｔ４の送達によるマウス胚性繊維芽細胞からｉＰＳ細胞への脱分化
【００６０】
融合タンパク質媒介再プログラムの効率をＭＥＦが４つの適切に特徴がはっきりした再プログラム転写制御因子を発現するレンチウイルスに感染する時に認められた再プログラム効率と比較できる（Ｃｏｘ， Ｊ．Ｌ．， ａｎｄ Ｒｉｚｚｉｎｏ， Ａ． Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ｗｈａｔ Ｌｉｅｓ Ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ Ｐａｒａｄｉｇｍ Ｓｈｉｆｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３５： １４８−１５８ （２０１０））。ＭＥＦは、自己切断ペプチド（口蹄疫ウイルスからの２Ａ）によってお互いから切り離されているＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃをコードする多シストロン性コピーを発現するレンチウイルスベクトルを使用して再プログラムされてきた。各々の多能性インデューサーコンストラクトを、ＭＥＦをドキシサイクリンに応じてＫｌｆ４とｃ−Ｍｙｃだけを発現する誘導性レンチウイルスベクトルに感染させることによってテストできる。そしてこれらの細胞を使用して、ＭＥＦの形成を促進させるためにドキシサイクリンとともに毎日培地に加えられるＳｏｘ２−とＯｃｔ４−ａＴｃｄＢ融合タンパクの能力をアッセイできる。
【００６１】
再プログラムの効率（再プログラムされた細胞のパーセンテージ）を測定することに加えて、産生するｉＰＳ細胞の品質は、以下を含む多能性幹細胞の広範な確立した特性を検査することによって評価されることができる：内因性の多能性転写制御因子（例えば、内因性のＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＵＴＦ１）の発現、内因性のＯｃｔ４とＮａｎｏｇの遺伝子の脱メチル化、細胞表面マーカーＳＳＥＡ−１の発現、および胚様体を使う胚性胚芽の各々からマーカーを発現する細胞に分化するｉＰＳ細胞の能力。（哺乳類の胚形成のための試験管内モデル系の転写調節（Ｒｉｚｚｉｎｏ， Ａ． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ）ｉｎ ａｎ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｏｄｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ， “Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ”， ｅｄｓ． Ｒ．Ｂ． Ｄｉｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｓ． Ｓａｌｏｍｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． １１５−１２９ （１９９８）内に記載）。
【００６２】
本発明は、好ましい実施形態を参照して記述された。特定の値、関係、物質とステップは発明の概念を記述する目的のために述べられていて、多数の変更および？または修正が広範囲に記述された発明の基本的概念と実施原則の精神と範囲を逸脱しない限り特定の実施形態で示されるように発明に加えて良いことを当業者は理解できるであろう。上記の教示に照らしてみれば、当業者が、本明細書に教示された本発明から逸脱しない範囲でこれらの明細を修正できることを理解されたい。ここで本発明の基礎をなしている概念の好ましい実施形態と特定の修正を明記したので、本明細書に示され記述された実施形態の特定の変更および修正のみならず様々な他の実施形態を、その根底にある概念に精通すれば、即座に明白に当業者は気づくであろう。添付の請求項またはその等価物の範囲内にある限りそのような修正、代替物、およびその他の実施形態を含むことを目的とする。したがって、本明細書に特に述べられているのでなければ、発明を実施できることを、よく理解すべきである。従って、本実施例は、あらゆる点において例示的であって制限的でないとみなされる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体結合領域、トランスロケーション領域、積荷ベアリング領域、およびインデューサーを含む人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を産生する、コンストラクト。
【請求項２】
前記受容体結合領域、前記トランスロケーション領域および前記積荷領域が外毒素領域である、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項３】
前記外毒素がクロストリジウム毒素である、請求項２に記載のコンストラクト。
【請求項４】
前記クロストリジウム毒素がクロストリジウム・ディフィシル毒素である、請求項３に記載のコンストラクト。
【請求項５】
前記クロストリジウム・ディフィシル毒素がＴｃｄＡである、請求項４に記載のコンストラクト。
【請求項６】
前記クロストリジウム・ディフィシル毒素がＴｃｄＢである、請求項４に記載のコンストラクト。
【請求項７】
前記外毒素が無毒である、請求項２に記載のコンストラクト。
【請求項８】
前記クロストリジウム毒素がクロストリジウム・ボツリヌス毒素である、請求項３に記載のコンストラクト。
【請求項９】
前記クロストリジウム・ボツリヌス毒素がＢｏＮＴＡ、ＢｏＮＴＢ、ＢｏＮＴＣ、ＢｏＮＴＤ、ＢｏＮＴＥ、ＢｏＮＴＦおよびＢｏＮＴＧから成る群から選択される、請求項７に記載のコンストラクト。
【請求項１０】
前記クロストリジウム・ボツリヌス毒素の受容体結合領域が非特異的受容体結合領域と入れ替えられる、請求項７に記載のコンストラクト。
【請求項１１】
前記クロストリジウム毒素がクロストリジウム属Ｃ２毒素である、請求項３に記載のコンストラクト。
【請求項１２】
前記インデューサーがＯｃｔ３／４である、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項１３】
前記コンストラクトが配列番号１を含む配列を有する、請求項１２に記載のコンストラクト。
【請求項１４】
前記コンストラクトが配列番号２を含む配列を有する、請求項１２に記載のコンストラクト。
【請求項１５】
前記コンストラクトが配列番号１および配列番号２からなる群から選択される配列と実質同一である配列を有する、請求項１２に記載のコンストラクト。
【請求項１６】
前記インデューサーがＳｏｘ２である、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項１７】
前記コンストラクトが配列番号３を含む配列を有する、請求項１６に記載のコンストラクト。
【請求項１８】
前記コンストラクトが配列番号４を含む配列を有する、請求項１６に記載のコンストラクト。
【請求項１９】
前記コンストラクトが配列番号１および配列番号２からなる群から選択される配列と実質同一である配列を有する、請求項１６に記載のコンストラクト。
【請求項２０】
前記インデューサーが、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ｌｉｎ２８、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ）およびＳＶ４０大型Ｔ抗原からなる群から選択される、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項２１】
前記積荷ベアリング領域が不活性外毒素領域である、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項２２】
前記クロストリジウム毒素が受容体結合領域およびトランスロケーション領域を更に含む、無毒クロストリジウム毒素およびインデューサーを含む、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を産生する、コンストラクト。
【請求項１】
受容体結合領域、トランスロケーション領域、積荷ベアリング領域、およびインデューサーを含む人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を産生する、コンストラクト。
【請求項２】
前記受容体結合領域、前記トランスロケーション領域および前記積荷領域が外毒素領域である、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項３】
前記外毒素がクロストリジウム毒素である、請求項２に記載のコンストラクト。
【請求項４】
前記クロストリジウム毒素がクロストリジウム・ディフィシル毒素である、請求項３に記載のコンストラクト。
【請求項５】
前記クロストリジウム・ディフィシル毒素がＴｃｄＡである、請求項４に記載のコンストラクト。
【請求項６】
前記クロストリジウム・ディフィシル毒素がＴｃｄＢである、請求項４に記載のコンストラクト。
【請求項７】
前記外毒素が無毒である、請求項２に記載のコンストラクト。
【請求項８】
前記クロストリジウム毒素がクロストリジウム・ボツリヌス毒素である、請求項３に記載のコンストラクト。
【請求項９】
前記クロストリジウム・ボツリヌス毒素がＢｏＮＴＡ、ＢｏＮＴＢ、ＢｏＮＴＣ、ＢｏＮＴＤ、ＢｏＮＴＥ、ＢｏＮＴＦおよびＢｏＮＴＧから成る群から選択される、請求項７に記載のコンストラクト。
【請求項１０】
前記クロストリジウム・ボツリヌス毒素の受容体結合領域が非特異的受容体結合領域と入れ替えられる、請求項７に記載のコンストラクト。
【請求項１１】
前記クロストリジウム毒素がクロストリジウム属Ｃ２毒素である、請求項３に記載のコンストラクト。
【請求項１２】
前記インデューサーがＯｃｔ３／４である、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項１３】
前記コンストラクトが配列番号１を含む配列を有する、請求項１２に記載のコンストラクト。
【請求項１４】
前記コンストラクトが配列番号２を含む配列を有する、請求項１２に記載のコンストラクト。
【請求項１５】
前記コンストラクトが配列番号１および配列番号２からなる群から選択される配列と実質同一である配列を有する、請求項１２に記載のコンストラクト。
【請求項１６】
前記インデューサーがＳｏｘ２である、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項１７】
前記コンストラクトが配列番号３を含む配列を有する、請求項１６に記載のコンストラクト。
【請求項１８】
前記コンストラクトが配列番号４を含む配列を有する、請求項１６に記載のコンストラクト。
【請求項１９】
前記コンストラクトが配列番号１および配列番号２からなる群から選択される配列と実質同一である配列を有する、請求項１６に記載のコンストラクト。
【請求項２０】
前記インデューサーが、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ｌｉｎ２８、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ）およびＳＶ４０大型Ｔ抗原からなる群から選択される、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項２１】
前記積荷ベアリング領域が不活性外毒素領域である、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項２２】
前記クロストリジウム毒素が受容体結合領域およびトランスロケーション領域を更に含む、無毒クロストリジウム毒素およびインデューサーを含む、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を産生する、コンストラクト。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１３−５０３１９８（Ｐ２０１３−５０３１９８Ａ）
【公表日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２７０５３（Ｐ２０１２−５２７０５３）
【出願日】平成２２年８月２７日（２０１０．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４７０５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３１５６８
【国際公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（５１２０４８７６７）シナプティック リサーチ，リミテッド ライアビリティ カンパニー (3)
【氏名又は名称原語表記】ＳＹＮＡＰＴＩＣ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】１４４８ Ｓｏｕｔｈ Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｒｏａｄ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２１２２７
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２７日（２０１０．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４７０５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３１５６８
【国際公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（５１２０４８７６７）シナプティック リサーチ，リミテッド ライアビリティ カンパニー (3)
【氏名又は名称原語表記】ＳＹＮＡＰＴＩＣ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】１４４８ Ｓｏｕｔｈ Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｒｏａｄ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２１２２７
【Ｆターム（参考）】
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