低い反応成分比を用いて、ＰＥＧ−ヘモグロビン結合体を調製するための方法
本発明は、一般に、低い反応成分比を用いて、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）結合体化ヘモグロビン（「Ｈｂ」）を調製するための方法に関する。より具体的には、本発明は、高められた収量および純度でＰＥＧ結合体化Ｈｂ（「ＰＥＧ−Ｈｂ」）を調製するための方法に関する。上記方法は、ａ）水性希釈剤中でヘモグロビン（Ｈｂ）を２−イミノチオラン（２−ＩＴ）と混合してチオール化Ｈｂを形成する工程；および該水性希釈剤中でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−マレイミド（Ｍａｌ）を該チオール化Ｈｂに加えてＰＥＧ−Ｈｂ結合体を形成する工程を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、低い反応成分比を用いて、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）結合体化ヘモグロビン（「Ｈｂ」）を調製するための方法に関する。より具体的には、本発明は、高められた収量および純度でＰＥＧ結合体化Ｈｂ（「ＰＥＧ−Ｈｂ」）を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
酸素療法（時折、「酸素を運搬する血漿増量剤」と称される）として有用である酸素運搬体は、以下の３つカテゴリーに分類され得る：ｉ）ペルフルオロカーボンベースのエマルジョン、ｉｉ）リポソーム封入（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）Ｈｂ、およびｉｉｉ）改変されたＨｂ。下で議論されるように、どれも完全にうまくいったというわけではないが、改変された、細胞を含まないＨｂを含む生成物は、最も見込みがあると考えられる。過フルオロ化合物ベースのエマルジョンは、リガンドとして酸素を結合することとは対照的に酸素を溶解させる。生物学的システムにおいて使用されるために、上記過フルオロ化合物は、脂質、代表的に卵黄リン脂質で、乳化されなければならない。ペルフルオロカーボンエマルジョンは、製造するのに費用がかからないが、それらは、有効であるのに十分な酸素を、臨床的に許容される用量で運搬しない。反対に、リポソーム封入Ｈｂは、有効であると示されているが、普及して使用するには費用がかかりすぎる（一般に、Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．，「Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｂａｓｅｄ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ」，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９９２）を参照のこと）。
【０００３】
赤血球代用物として、赤血球溶血物由来の遊離Ｈｂを利用する最初の試みは、うまくいかなかった。ストローマの構成要素は、毒性であることが見出され、凝固障害および関連する腎不全をもたらした。１９６７年に、ストローマフリーのＨｂ（「ＳＦＨ」）溶液が調製された（Ｒａｂｉｎｅｒ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９６７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２６：１１２７−１１４２）。しかし、それらは、わずか約１００分間の輸血半減期を有することが見出された。
【０００４】
ＳＦＨの短い循環半減期の理由は、そのタンパク質がその四量体形態から二量体に解離する能力に起因し、それは腎臓によって循環から迅速に濾過される。従って、Ｈｂの管外遊出を制限または防ぐために、架橋Ｈｂのための多数の方法、および高分子との結合体化によってＨｂの流体力学的サイズを増加させるための他の手段が考案されてきた。ＳＦＨを架橋することによるポリ−Ｈｂの形成が、特許文献１、および特許文献２に記載される。サブユニット間のアミノ酸残基を結合する、内部架橋Ｈｂは、ジアスピリン（特許文献３に記載されるようなビス−３，５−ジブロモサリチレート（ｂｉｓ−３，５−ｄｉｂｒｏｍｏｓａｌｉｏｃｙｌａｔｅ）のジエステル）、または２−Ｎ−２−ホルミル−ピリドキサル−５’−ホスフェート、および水素化ホウ素（Ｂｅｎｅｓｃｈ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ，．１９７５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６２：１１２３−１１２９）を用いて達成され得る。二量体の形成を防ぐための四量体Ｈｂユニットのサブユニットを化学的に結合する分子内架橋は、特許文献４に開示される。さらに、Ｓｉｍｏｎ，Ｓ．Ｒ．およびＫｏｎｉｇｓｂｅｒｇ，Ｗ．Ｈ．は、分子内架橋Ｈｂを生成するためのビス−（Ｎ−マレイミドメチル）エーテル（「ＢＭＥ」）の使用を開示し（１９６６，ＰＮＡＳ ５６：７４９−５６）、その分子内架橋Ｈｂは、ラットおよびイヌに注入されるときに、半減期が４倍増加することが報告された（Ｂｕｎｎ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２９：９０９−２４）。しかし、ＨｂとＢＭＥとの架橋は、同時に、Ｈｂの酸素親和性における増加をもたらし、このことは、当時は、潜在的なＨｂ−ベースの酸素運搬体（「ＨＢＯＣ」）としてのその使用を妨げると考えられた。
【０００５】
ＳＦＨはまた、他の高分子（例えば、デキストラン）（Ｃｈａｎｇ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ，．１９７７，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：３９８−４０３）、ヒドロキシエチルデンプン（特許文献５）、ゼラチン（特許文献６）、アルブミン（特許文献６）、およびＰＥＧ（特許文献７、特許文献８、特許文献９、および特許文献１０）に繋がれた。
【０００６】
これらの酸素運搬溶液の生理的効果のいくつかは、完全には理解されていない。これらのうち、おそらく最も議論の的となるものは、動物およびヒトにおいて高血圧症として現れ得る、血管収縮を引き起こす傾向である（Ａｍｂｅｒｓｏｎ，Ｗ．，１９４７，Ｓｃｉｅｎｃｅ １０６：１１７−１１７）（Ｋｅｉｐｅｒｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３３：７０１−７０８）。α−鎖とビス−ジブロモサリチル−フマレートとの間で架橋されるヒトＨｂ（「ααＨｂ」）は、モデル赤血球代用物として、米国陸軍によって開発されたが、それが、肺および全身の血管抵抗の深刻な増加を示した後に断念された（Ｈｅｓｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｌｏｏｄ ７８：３５６Ａ）。この生成物の市販版はまた、期待はずれの第三相臨床試験後に断念された（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．，２０００，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ７９：１−２０）。
【０００７】
細胞を含まないＨｂによって生み出される血管収縮についての最も一般的な説明は、それが、内皮由来血管弛緩因子（ＥＤＲＦ）である、一酸化窒素（「ＮＯ」）を容易に結合するということである。２つの分子アプローチは、ＨｂのＮＯ結合活性を克服する試みにおいて進歩してきた。第一のアプローチは、組換えＤＮＡを利用することであり、このアプローチは遠位ヘムポケットの部位特異的変異誘発によって、ＨｂのＮＯ結合を低減することを試みた（Ｅｉｃｈ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：６９７６−８３）。第二のアプローチは、Ｈｂのサイズがオリゴマー化を介して高められる化学的改変を利用し、このアプローチは血管裂孔（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｐａｃｅ）から組織間隙（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｓｐａｃｅ）へのＨｂの管外遊出を低減するか、またはそれをできる限り完全に阻害することを試みた（Ｈｅｓｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７４：１７６９−７８；Ｍｕｌｄｏｏｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２８：５７９−８３；Ｍａｃｄｏｎａｌ，Ｖ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：５６５−７５；Ｆｕｒｃｈｇｏｔｔ，Ｒ．，１９８４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４：１７５−９７；およびＫｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９：１５５−６２）。
【０００８】
実際に、ＮＯへの親和性が低減した組換えＨｂが生み出されている。このものは、最大負荷（ｔｏｐ−ｌｏａｄ）したラット実験において、高血圧性がより低い（Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ｈ．ｅｔｇ ａｌ．１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：６７２−６７６、およびＬｅｍｏｎ，Ｄ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４：３７８）。しかし、研究は、ＮＯ結合がＨｂの血管作用に対する唯一の説明ではない可能性があることを示唆する。特定の大きなＨｂ分子（例えば、ＰＥＧを用いて改変されたもの）は、たとえ、それらのＮＯ結合速度が、重度に高血圧性のααＨｂのものと同一であっても、事実上、高血圧作用を有さないことが見出されている（Ｒｏｈｌｆｓ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１２１２８−１２１３４）。さらに、ＰＥＧ−Ｈｂは、出血の前の交換輸血として与えられるとき、結果として起こる出血を防ぐことにおいて並外れて有効であることが見出された（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５：９９３−１００３）。
【０００９】
Ｈｂに対するＰＥＧの結合体化は、その抗原性を低減し、その循環半減期を延長する。しかし、上記ＰＥＧ結合体化反応は、αβ−二量体サブユニットへのＨｂ四量体の解離をもたらし、４０，０００ダルトン（「Ｄａ」）より小さいＨｂモノマー単位のＰＥＧ−結合体を受けて交換輸血されたラットにおいて肉眼的（ｇｒｏｓｓ）ヘモグロビン尿症を引き起こすことが報告されている（Ｉｗａｓｈｉｔａ ａｎｄ Ａｊｉｓａｋａ Ｏｒｇａｎ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ：Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄｉｃｉｅｓ Ｍｅｃｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．，Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．１９８１，Ｅｄｓ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ ｐｇｓ ９７−１０１）。８４，０００Ｄａよりも大きい分子量を有するポリアルキレンオキシド（「ＰＡＯ」）結合体化Ｈｂは、Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．によって調製され（特許文献１１）、それは、Ｈｂのαおよびε−アミノ基においてＨｂに繋げられた１０コピーのＰＥＧ−５，０００鎖を有した。この置換の程度は、哺乳動物においてヘモグロビン尿症に関連する、臨床的に重要な腎毒性を避けるとして記載された。しかし、上記結合体化反応は、不均一な結合体集団をもたらし、カラムクロマトグラフィーによって除去されなければならない他の望ましくない反応成分を含んだ。
【００１０】
ＰＥＧ結合体化は、代表的に、生体分子の表面上の官能基と活性化されたＰＥＧとの反応を介して実施される。最も一般的な官能基は、リジン残基およびヒスチジン残基のアミノ基、ならびにタンパク質のＮ末端；システイン残基のチオール基；そして、セリン残基、トレオニン残基、およびチロシン残基のヒドロキシル基、ならびに上記タンパク質のＣ末端である。ＰＥＧは、通常、ヒドロキシル末端を、温和な水性環境においてこれらの官能基と反応することが可能な、反応性の部分に転換することによって、活性化される。治療用生物製剤（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）の結合体化に使用される最も一般的な一官能性ＰＥＧのうちの１つは、メトキシ−ＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」）であり、これは、たった１つの官能基（すなわち、ヒドロキシル）を有し、従って、二官能性ＰＥＧに関連する架橋および凝集の問題を最小限にする。しかし、ｍＰＥＧは、しばしば高分子量の二官能性ＰＥＧ（すなわち、「ＰＥＧジオール」）が夾雑しており、それはその製造プロセスに起因して、１０％〜１５％ほど高い範囲に及び得る（Ｄｕｓｔ Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９０，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ２３：３７４２−３７４６）。この二官能性ＰＥＧジオールは、所望される一官能性ＰＥＧのおおよそ２倍のサイズを有する。その夾雑の問題は、ＰＥＧの分子量が増加するに従って、さらに悪化する。ｍＰＥＧの純度は、ＦＤＡが、高レベルの、製造プロセスにおける再現性および最終薬物生成物の質を要求するので、ＰＥＧ化生物治療剤（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の製造について特に重要である。
【００１１】
ＰＡＯに対するＨｂの結合体化は、酸素化状態および脱酸素状態の両方において、行われてきている。特許文献１２は、結果として生じるＰＥＧ−Ｈｂ結合体の酸素親和性を高めるために酸素化、すなわち「Ｒ」状態でＨｂを結合体化することを記載する。これは、結合体化の前にＨｂを大気と平衡させることによって達成される。他の発明者ら（ｏｔｈｅｒｓ）は、酸素親和性を減少させ、構造上の安定性を増加させて、Ｈｂが化学的改変、ダイアフィルトレーションおよび／または滅菌濾過、ならびに滅菌の物理的ストレスに耐えるのを可能にする、結合体化の前の脱酸素ステップを記載する（米国特許第５，２３４，９０３）。Ｈｂの分子内架橋について、改変前にＨｂを脱酸素する工程が、そのα−鎖のリジン９９を架橋試薬に曝すために必要とされ得ることが示唆される（米国特許第５，２３４，９０３）。
【００１２】
ＰＥＧとの結合体化の前のイミノチオランを用いるＨｂチオール化の動力学は、Ａｃｈａｒｙａらによって調査された（特許文献１３）。イミノチオランの濃度を、１０倍（１四量体当たり平均５つの外因性チオールを導入した）から３０倍に増加させることにより、Ｈｂ上の外因性チオールの数をほぼ倍にすることが観測された。しかし、ＰＥＧ結合体化後に見られるサイズの増加は、たとえチオールの数が２倍になっても、ほぼ限界であった。これは、２０倍モル濃度過剰のマレイミジルＰＥＧ−５０００の存在下での結合体化反応が、より反応性の低いチオールをもつＨｂの表面を覆い、より反応性の高いチオールをもつＨｂのさらなる改変に抵抗する立体障害（ｓｔｅｒｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）をもたらしたことを示唆した。その結果、改変されたＨｂの所望される分子量（すなわち、１Ｈｂ分子当たり６±１ ＰＥＧ）を達成するために、Ａｃｈａｒｙａらは、Ｈｂを８〜１５モル濃度過剰のイミノチオランでチオール化し、次に、そのチオール化Ｈｂを１６〜３０倍モル濃度過剰のマレイミジルＰＥＧ−５０００で反応させた。しかし、大規模な生産における、これらの高いモル濃度過剰の反応成分濃度は、ＨＢＯＣを調製するための費用を著しく増大させる。さらに、このような高いモル濃度過剰のマレイミジルＰＥＧ−５０００は、より多くの不必要な反応成分の生成を伴う、より不均一な生成物をもたらす。
【００１３】
従って、費用が減らされ、効率が増加し、不純物の少ない、そして分子量範囲がより狭い、特定のサイズ範囲のＰＥＧ結合体化Ｈｂを調製する方法の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第４，００１，２００号明細書
【特許文献２】米国特許第４，００１，４０１号明細書
【特許文献３】米国特許第４，５２９，７１９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，２９６，４６５号明細書
【特許文献５】独国特許発明第２，１６１，０８６号明細書
【特許文献６】独国特許発明第２，４４９，８８５号明細書
【特許文献７】独国特許発明第３，０２６，３９８号明細書
【特許文献８】米国特許第４，６７０，４１７号明細書
【特許文献９】米国特許第４，４１２，９８９号明細書
【特許文献１０】米国特許第４，３０１，１４４号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，６５０，３８８号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，８４４，３１７号明細書
【特許文献１３】米国特許第７，５０１，４９９号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
本発明は、一般に、ポリエチレングリコール結合体化ヘモグロビン（「ＰＥＧ−Ｈｂ」）を調製するための方法に関し、この方法は、以下の工程：水性希釈剤中でヘモグロビン（Ｈｂ）を２−イミノチオラン（２−ＩＴ）と混合してチオール化Ｈｂを形成する工程であって、ここで上記２−ＩＴは、上記Ｈｂ濃度よりも、上記希釈剤中７モル濃度過剰と８モル濃度過剰との間の濃度で存在する、工程；および次に、上記水性希釈剤中でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−マレイミド（Ｍａｌ）を上記チオール化Ｈｂに加えてＰＥＧ−Ｈｂ結合体を形成する工程であって、ここで上記ＰＥＧ−Ｍａｌは、上記Ｈｂ濃度よりも、上記希釈剤中９モル濃度過剰と１５モル濃度過剰との間の濃度で存在し、ここで上記ＰＥＧ−Ｍａｌは、４，０００ダルトン（Ｄａ）と６，０００ダルトン（Ｄａ）との間の平均分子量を有する、工程、を含み；ここで結果として生じるＰＥＧ−Ｈｂ結合体は、１Ｈｂ当たり平均７．１個と８．９個との間のＰＥＧ分子を含む。
【００１６】
１つの実施形態において、上記２−ＩＴは、上記Ｈｂ濃度よりも、上記希釈剤中７．５モル濃度過剰の濃度で存在し、上記ＰＥＧ−Ｍａｌは、上記Ｈｂ濃度よりも、上記希釈剤中１２モル濃度過剰の濃度で存在し、そして／または上記ＰＥＧ−Ｍａｌは、５，０００ダルトンの平均分子量を有する。
【００１７】
本質的に同一の条件下で測定される場合、本発明の例示的な方法に従って調製されるＰＥＧ−Ｈｂ結合体が有する、上記Ｈｂが５０％飽和されるものである酸素分圧（ｐ５０）は、同等の供給源由来の天然のストローマフリーのヘモグロビンよりも小さい。１つの実施形態において、上記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の上記ｐ５０は、１０ミリメートル水銀柱（ｍｍＨｇ）未満（例えば、４ｍｍＨｇと８ｍｍＨｇとの間）である。
【００１８】
本発明の他の局面は、本明細書中いたるところに見出される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１：ＨｂのβＣｙｓ９３残基およびチオール化リジンは、ＰＥＧ化される。Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、Ｈｂの主鎖を表し；Ｒ４は、アルキル基であり、「ｎ」は、５，０００Ｄａ ＰＥＧのオキシエチレン単位の平均の数を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、一般に、低い反応成分比を用いて、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）結合体化ヘモグロビン（「Ｈｂ」）を調製するための方法に関する。より具体的には、本発明は、高められた収量および純度でＰＥＧ結合体化Ｈｂ（「ＰＥＧ−Ｈｂ」）を調製するための方法に関する。
【００２１】
以下の記載において、分子生物学、免疫学、および医学の分野において使用される多くの用語が広く利用される。このような用語に与えられるべき範囲を含む、本明細書および特許請求の範囲の明瞭で一貫した理解を提供するために、以下の非限定的な定義が提供される。
【００２２】
本開示において、用語「ｏｎｅ」、「ａ」、または「ａｎ」が使用されるとき、それらはそうでないと示されない限り、「少なくとも１つ」または「１つまたはそれより多く」を意味する。
【００２３】
本明細書中で用いられる場合、用語「活性化ポリアルキレンオキシド」または「活性化ＰＡＯ」は、少なくとも１つの官能基を有するＰＡＯ分子を指す。官能基は、ＰＡＯと結合体化されるべき分子上の遊離アミン、スルフヒドリル、またはカルボキシル基と相互作用する反応性の部分である。例えば、遊離スルフヒドリルと相互作用する１つのこのような官能基は、マレイミド基である。同様に、遊離アミンと相互作用する官能基は、スクシンイミド基である。
【００２４】
本明細書中で用いられる場合、用語「おおよそ」は、示される値の範囲内にある実際の値を指す。一般に、実際の値は、示される値の１０％以内（すなわち、±１０％）である。
【００２５】
本明細書中で用いられる場合、用語「ヘモグロビン」または「Ｈｂ」は、一般に、酸素を輸送する赤血球内に含まれるタンパク質を指す。Ｈｂの各分子は、４つのサブユニット、２つのα−鎖サブユニット、および２つのβ−鎖サブユニットを有し、これらは四量体構造に配置される。各サブユニットはまた、酸素を結合する鉄を含む中心である、１つのヘム基を含む。従って、各Ｈｂ分子は、４分子の酸素を結合し得る。
【００２６】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ」は、マレイミジル活性化ＰＥＧが結合体化されたＨｂを指す。上記結合体化は、ＭａｌＰＥＧをＨｂ上の表面チオール基（およびより少ない程度にアミノ基）と反応させて、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを形成することによって行われる。チオール基は、Ｈｂのアミノ酸配列に存在するシステイン残基において見出され、それはまた、チオール基を含むように表面アミノ基を改変することによって導入され得る。
【００２７】
本明細書中で用いられる場合、用語「メトヘモグロビン」または「ｍｅｔＨｂ」は、３価の鉄の状態にある鉄を含むＨｂの酸化形態を指す。ＭｅｔＨｂは、酸素運搬体として機能しない。本明細書中で用いられる場合、用語「メトヘモグロビン％」は、総Ｈｂに対する酸化Ｈｂの百分率を指す。
【００２８】
本明細書中で用いられる場合、用語「メトキシ−ＰＥＧ」または「ｍＰＥＧ」は、ＰＥＧのヒドロキシル末端の水素が、メチル（−ＣＨ３）基で置き換えられたＰＥＧを指す。
【００２９】
本明細書中で用いられる場合、用語「混合物」または「混合する工程」は、２つまたはそれより多くの物質を、それら個々の特性を消失させる反応が起こることなく、一緒に混ぜることを指す。用語「溶液」は、液体の混合物を指し、用語「水性溶液」は、いくらかの水を含み、また、水とともに１つまたはそれより多くの他の液体物質を含んで、複数の構成要素の溶液を形成し得る溶液を指す。
【００３０】
本明細書中で用いられる場合、用語「改変されたヘモグロビン」または「改変されたＨｂ」は、Ｈｂがもはやその「天然の」状態にないような、化学反応（例えば、分子内および分子間架橋）、組換え技術によって変更されたＨｂを指すが、これに限定されない。本明細書中で用いられる場合、用語「ヘモグロビン」または「Ｈｂ」は、それ自体が天然の改変されていないＨｂ、ならびに改変されたＨｂの両方を指す。
【００３１】
本明細書中で用いられる場合、用語「酸素親和性」は、酸素運搬体（例えば、Ｈｂ）が分子状酸素を結合するアビディティを指す。この特徴づけは、酸素によるＨｂ分子の飽和の程度（Ｙ軸）を酸素の分圧（Ｘ軸）に関連付ける、酸素平衡曲線によって定義される。この曲線の位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、Ｐ５０値によって示され、Ｐ５０値は、酸素運搬体が酸素で半分飽和される酸素分圧であり、酸素親和性に反比例する。それゆえに、Ｐ５０がより低くなればなるほど、酸素親和性がより高くなる。全血の（および全血の構成要素（例えば、赤血球およびＨｂ））の酸素親和性は、当該分野において公知である多様な方法によって測定され得る（例えば、Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７，２５２：２３３１−３７を参照のこと）。酸素親和性はまた、市販のＨＥＭＯＸＴＭ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＣＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ，ＰＡ）を用いて、決定され得る（例えば、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ ａｎｄ Ｓｈｒａｇｅｒ ｉｎ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ｅｖｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．）２３２：４６０（１９９４）を参照のこと）。
【００３２】
本明細書中で用いられる場合、用語「ペルフルオロカーボン」は、フッ素原子を含み、完全にハロゲン（Ｂｒ、Ｆ、Ｃｌ）および炭素原子からなる、合成の不活性な分子を指す。それらは、等量の血漿または水よりも幾倍も多くの酸素を溶解させる能力を有するので、それらは、エマルジョンの形態において、血液物質（ｂｌｏｏｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）として開発中である。
【００３３】
本明細書中で用いられる場合、用語「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、一般化学式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（α−ヒドロ−ω−ヒドロキシポリ−（オキシ−１，２−エタンジイル）としても公知である）（ここで「ｎ」は、４よりも大きいか、または４に等しい）の液体または固体のポリマーを指す。置換または非置換の任意のＰＥＧ処方物が、この用語によって包含される。ＰＥＧは、多くの処方物において市販されている（例えば、ＣａｒｂｏｗａｘＴＭ（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）、Ｐｏｌｙ−Ｇ（登録商標）（Ａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、およびＳｏｌｂａｓｅ）。
【００３４】
本明細書中で用いられる場合、用語「ポリエチレングリコール結合体化ヘモグロビン」または「ＰＥＧ−Ｈｂ結合体」は、ＰＥＧが共有結合的に結合したヘモグロビンを指す。
【００３５】
本明細書中で用いられる場合、用語「ストローマフリーのヘモグロビン」または「ＳＦＨ」は、全ての赤血球の膜が除去されているＨｂを指す。
【００３６】
本明細書中で用いられる場合、用語「表面が改変されたヘモグロビン」は、化学基、通常、ポリマー（例えば、デキストランまたはポリアルキレンオキシド）が結合したヘモグロビンを指す。用語「表面が改変された酸素化ヘモグロビン」は、表面が改変されるときに「Ｒ」状態にあるＨｂを指す。
【００３７】
有機ポリマー
以前の研究において、表面が改変されたヘモグロビンの分子サイズは、腎臓によって取り除かれることを避けるほど、および所望される循環半減期を達成するほど十分に大きくなければならないことが観測された。Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．らは、このことが８４，０００ダルトン（「Ｄａ」）の分子量で、または８４，０００ダルトン（「Ｄａ」）の分子量より上で達成され得ることを決定した（「Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ Ｅｘｐａｎｄｅｒｓ，」Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐａｇｅｓ ２０５−２１２（１９７８））。その研究において、その著者らは、様々な分子量のデキストランをＨｂに結合体化した。彼らは、Ｈｂ（６４，０００Ｄａの分子量を有する）とデキストラン（２０，０００Ｄａの分子量を有する）の結合体が、「循環からゆっくり取り除かれ、腎臓を通り抜けるのは無視できる程であった」と報告した。さらに、８４，０００Ｄａより上に分子量を増加させることにより、これらのクリアランス曲線が著しく変わることはないことが観測された。
【００３８】
本発明は、少なくとも８４，０００Ｄａの分子量が得られ得る、Ｈｂに対するＰＡＯの結合体化のための方法を提供する。適切なポリアルキレンオキシドポリマーとしては、ポリエチレンオキシド（−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−）、ポリプロピレンオキシド（−（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ）ｎ−）、およびポリエチレン／ポリプロピレンオキシドコポリマー（−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ）ｎ−）が挙げられる。本発明の実施において適切である、他の直鎖、分枝鎖および必要に応じて置換された合成ポリマーは、医学分野において周知である。
【００３９】
Ｈｂの表面を改変するために現在使用される最も一般的なＰＡＯは、その薬学的受容可能性および商業的利用可能性に起因して、ＰＥＧである。さらに、ＰＥＧは、その分子内のエチレンオキシド（すなわち、−ＯＣＨ２ＣＨ２−）の繰り返しサブユニットの数に基づいて、多様な分子量において利用可能である。ＰＥＧ処方物は、通常、それらの平均分子量に対応する数によって示される。例えば、ＰＥＧ−２００は、２００Ｄａの平均分子量を有し、１９０〜２１０Ｄａの分子量範囲を有し得る。
【００４０】
ヘモグロビン改変
本方法において利用されるＨｂは、その供給源によって限定されず、ヒトもしくは動物由来であり得るか、または組換え技術に由来し得る。それは、天然（改変されていない）であるか、もしくは改変されているかのいずれかであり得、または組換えにより操作され得る。ヒトα−グロビン遺伝子およびヒトβ−グロビン遺伝子は、両方ともクローン化され、配列を決定されている（Ｌｉｅｂｈａｂｅｒ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １９８０，７７：７０５４−７０５８；Ｍａｒｏｔｔａ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７，３５３：５０４０−５０５３（β−グロビン ｃＤＮＡ））。さらに、多くの組換えにより改変されたＨｂは、現在、部位特異的変異誘発を用いて生産されているが、これらの「変異体」Ｈｂの多様性は、望ましくなく高い酸素親和性を有することが報告されている（例えば、Ｎａｇａｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １９８５，８２：７２５２−７２５５）。好ましくは、上記Ｈｂは、ストローマフリーであり、内毒素を含まない。
【００４１】
Ｈｂ上の利用可能な結合体部位の数を増やすための１つの方法は、遊離アミンよりもＰＥＧ−Ｍａｌとの反応性が高い傾向があるスルフヒドリル基（「−ＳＨ」）を導入することである。多様な方法が、タンパク質のチオール化についての分野において公知である。これらとしては、例えば、上記タンパク質の残基を含む遊離アミンを、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートとの反応後に、その３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル結合体をジチオトレイトール（「ＤＴＴ」）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（「ＴＣＥＰ」）を用いて還元することよって、チオール化することが挙げられる。アミンはまた、スクシンイミジルアセチルチオアセテートとの反応後に、中性に近いｐＨで、５０ｍＭのヒドロキシルアミンまたはヒドラジンを用いてアセチル基を除去することによって、間接的にチオール化され得る。さらに、２−イミノチオラン（２−ＩＴ）は、遊離アミン基をチオール基に転換するために使用され得る。
【００４２】
天然のヒトＨｂは、チオール化のために利用されて、その後マレイミド活性化ＰＡＯ分子に結合体化し得る、固定数のアミノ酸残基側鎖を有する。これらは、下の表に表される。
【００４３】
【化１】
結合体化後に上記Ｈｂのアミノ（α−またはε−）基の本来の陽電荷を維持することは、有益であることが示唆されている。これを達成するために、その表面リジン残基のε−アミノ基を用いて、ＰＥＧをＨｂに結合させるためのプロトコルが開発され、ここで上記Ｈｂは、依然として上記アミノ基の本来の陽電荷を保持する（米国特許第５，５８５，４８４号明細書）。これは、Ｈｂ上にスルフヒドリル基を導入するための、２−イミノチオランによるそのタンパク質のε−アミノ基のアミド化を含み、そのスルフヒドリル基は、その後、マレイミド−ＰＥＧを用いる結合体化反応の間にＰＥＧのための結合部位として標的化される。
【００４４】
このアプローチは、以前に使用されたスクシンイミジル化学よりも、少なくとも２つのさらなる特定の利益を有する：（１）スルフヒドリル基を有するマレイミド基の非常に高い反応性および選択性は、制限された過剰な試薬を用いて、チオールのほぼ定量的な改変を容易にする；および（２）２−イミノチオランのチオール基は、潜伏性であり、そのタンパク質のアミノ基と試薬との反応の結果として、インサイチューでのみ生成される。従って、Ｈｂは、ＰＥＧでの表面装飾のためのチオール化およびＰＥＧ化する試薬と同時にインキュベートされ得る。
【００４５】
１つの実施形態において、上記チオール化反応は、反応の程度を最適化するために、反応が完了する前に２−ＩＴが著しく加水分解するｐＨより下であり、また、リジンのｐＫａより下である７〜９との間のｐＨで実施される。
【００４６】
結合体化
本明細書中のどこか他のところで議論されるように、結合体化反応における反応成分のモル濃度比を増加させることにより、Ｈｂに結合体化されるようになるＰＥＧ分子の数の増加をもたらすことが以前に仮定された。これは、Ｈｂのチオール化プロセス（すなわち、Ｈｂに対するチオール化剤のモル濃度比を増加させる工程）、および表面改変プロセス（すなわち、チオール化Ｈｂに対する活性化されたＰＥＧのモル濃度比を増加させる工程）の両方を含んだ。これらの研究により、１０倍よりも大きいモル濃度過剰のイミノチオランが、Ｈｂ上のチオール化部位の数を、反応の最初の２時間において１四量体当たり４つの新しい反応性−ＳＨ基から１１時間後に１四量体当たり約７つの新しい反応性−ＳＨ基まで、実質的に増加させることが実証された。１０倍から３０倍にモル濃度比を増加させることは、Ｈｂ上のチオールの総数をほぼ２倍にした。同様に、チオール化Ｈｂに対するチオール活性化ＰＥＧ（ｔｈｉｏｌ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＰＥＧ）のモル濃度比を増加させること（すなわち、２０倍）はまた、チオール化Ｈｂに結合体化され得るマレイミド活性化ＰＥＧ分子の数を増加させた（米国特許第７，５０１，４９９号明細書を参照のこと）。これらの過剰モル濃度比は、その表面上に共有結合的に結合する、６±１ ＰＥＧ分子を有するＨｂをもたらした。しかし、記載されるように反応成分比を増加させることは、反応動力学を遅くさせ、望ましくない副産物のレベルを増加させ、ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の分子量の分布を増加させる。
【００４７】
本発明は、特定の分子量のＰＥＧを用いて、正確に制御された反応成分比で、優れたＰＥＧ−Ｈｂ結合体が生産され得るという予期しない発見に基づく。本発明の方法は、Ｈｂチオール化反応ならびにＰＥＧ結合体化反応の両方において、低いモル濃度比の反応成分を利用する。思いがけなく、そしてより高い濃度の反応成分が収量および結合体化効率の両方を増加させるという昔から正しいとされている通念に反して、より多くの数のＰＥＧ分子が、より低いモル濃度比の反応成分を用いて、改変されたＨｂに結合体化され得るということが見出された。別の利益として、結果として生じる結合体化生成物が、より高い比を用いる同じ生成物よりも狭い（ｔｉｇｈｔｅｒ）分子量分布を有することが見出された。より具体的には、上記チオール化反応において、８倍未満のモル濃度過剰の２−ＩＴ、特に７倍と８倍との間のモル濃度過剰、およびより具体的には、７．５倍のモル濃度過剰；ならびに上記結合体化反応において、１５倍未満のモル濃度過剰のＰＥＧ−Ｍａｌ、特に９倍と１５倍との間のモル濃度過剰、およびより具体的には、１２倍のモル濃度過剰が、１Ｈｂ当たり、７．１個と８．９個との間の、および特に８個の、平均数のＰＥＧ分子をもたらした。議論されるように、より低いモル濃度比の反応成分を用いることは、いくつかの利点を有する。それは、最終生成物において不純物を低減し、このことは、精製プロセスの効率を容易にし、高められた分子の分散を介する反応効率を増加させる。効率の増加はまた、マレイミド環の加水分解および失活（ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を完了するための反応時間を低減する。さらに、反応成分の量を減らすことによって、それらのそれぞれの反応からの副産物も低減される。具体的には、２−ＩＴからの加水分解副産物（４−ブトリチオラクトン（４−ｂｕｔｒｙｔｈｉｏｌａｃｔｏｎｅ）および４−チオ酪酸が挙げられる）、ならびに環が開いた非反応性のＰＥＧの副産物が、著しく減る。
【００４８】
上に記載されるように、上記結合体化反応における、Ｈｂに対するＰＥＧ−Ｍａｌのモル濃度比は、１５倍未満である。このモル濃度比は、反応性のＰＥＧ−Ｍａｌの濃度に基づいており、Ｈｂに対するＰＥＧ−Ｍａｌの絶対比には基づかない。上記ＰＥＧ−Ｍａｌにおいて閉じた環構造を有する反応性のマレイミドの百分率は、その「末端活性（ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」と称される。従って、全てのマレイミドが反応性である場合、上記ＰＥＧ−Ｍａｌは、１００％の末端活性を有する。ＰＥＧ−ＭａｌのＨｂに対するモル濃度比は、本明細書中に記載されるように、Ｈｂに対する末端活性のＰＥＧ−Ｍａｌのモル濃度比に基づく。従って、ＰＥＧ−Ｍａｌ試薬の末端活性が９０％である場合、さらに１０％が、同じモル濃度比を達成するためにＨｂに添加される必要がある。
【００４９】
残留未反応のＰＥＧにおける低減は、生産における効率および最終生成物の質を増加させる追加の利益を有する。上記ＰＥＧ結合体化反応後、残留反応成分は、１０体積の最終生成物希釈剤（例えば、リンゲル乳酸塩または酢酸塩溶液）を用いてダイアフィルトレーションによって除去される。この工程に必要とされる時間の量は、ダイアフィルトレーションプロセスの容積流動（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｆｌｕｘ）によって決定される。所定のフィルターサイズについて、上記ダイアフィルトレーションプロセスは、本発明の反応比が利用されるとき、より速く終了する。上記反応成分の洗い流しは、指数関数的減衰に従い、結果として、不純物（上記反応成分中の残留反応成分および不純物）の初期濃度が減ることは、その生成物におけるそれらの最終濃度を減らす。同様に、試薬の総量を最小限にすることは、上記生成物における不純物の総量を低減し得る。
【００５０】
ＰＥＧ−Ｈｂ結合体
本発明のＰＥＧ−Ｈｂ結合体は、通常、全血よりも大きい酸素親和性を有し、より具体的には、全血の２倍またはさらに３倍の酸素親和性を有する。換言すると、上記ＰＥＧ−Ｈｂは、通常、同じ条件下で測定されるとき、ストローマフリーのヘモグロビン（ＳＦＨ）の酸素親和性よりも大きい酸素親和性を有する。これは、上記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体が、一般に、１０ミリメートル水銀柱（ｍｍＨｇ）未満だが３ｍｍＨｇよりも大きいＰ５０を有することを意味する。ＳＦＨは、３７℃、ｐＨ７．４でおおよそ１５ｍｍＨｇのｐ５０を有し、ここで全血についての上記ｐ５０は、同じ条件下でおおよそ２８ｍｍＨｇである。ヘモグロビンベースの酸素運搬体（ＨＢＯＣ）の酸素親和性を増加させるにより、上記ｐ５０を低下させることは、組織への酸素の送達を高め得ること、ＳＦＨの酸素親和性よりも低い酸素親和性は、受容可能ではないことが示唆された。Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ｉｎ「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ」（１９９７），Ｂｉｒｋａｅｕｓｅｒ，ｅｄｓ．Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，ａｔ ｐａｇｅ １６７、および米国特許第６，０５４，４２７号明細書を参照のこと。この示唆は、ＨＢＯＣが、より低い酸素親和性、具体的には全血の酸素親和性に近似するｐ５０を有するはずであるという広く行き渡った考えに矛盾する。それゆえに、多くの研究者は、ピリドキシル化Ｈｂは、ＳＦＨと比較してより容易に酸素を放出するので、ＳＦＨのｐ５０を、１０ｍｍＨｇからおおよそ２０ｍｍＨｇ〜２２ｍｍＨｇまで上げるためにピリドキサールリン酸を使用してきた。
【００５１】
高い酸素親和性でＨＢＯＣを製造することに対する多くの異なる科学的アプローチが存在する（すなわち、ＳＦＨよりも低いｐ５０を有するもの）。例えば、研究により、酸素親和性において重要な役割を果たすアミノ酸残基（例えば、（β９３システイン））を同定した。これらの発見に起因して、部位特異的変異誘発は、所望されるレベルまで酸素親和性を操作するために、現在容易に実施され得る（例えば、米国特許第５，６６１，１２４号明細書を参照のこと）。上記β９３システイン残基は、直接的にヘム鉄に配位結合する、β−サブユニットにおける唯一の残基である近位β９２ヒスチジン残基にすぐ隣接して位置する。β９３システインに対する剛性で、かさのあるマレイミド基の結合は、低親和性Ｔ−状態のＨｂコンホメーションを通常安定化させる塩橋を置き換える（Ｐｅｒｕｔｚ Ｍ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７４，１３：２１６３−２１７３）。このシフトは、Ｒ状態に対する四級のコンホメーションであり、より高いＯ２親和性をもたらす（Ｉｍａｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７３，１２：７９８−８０７）。多くの他のアプローチが米国特許第６，０５４，４２７号明細書において議論されている。
【００５２】
インビボ投与のための処方物
本発明のＰＥＧ−Ｈｂ結合体は、インビボ投与に適している水性希釈剤中で処方される。上記希釈剤における酸素運搬体の濃度は、その適用に従って変動し得るが、上記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の高められた酸素の送達および治療効果に起因して、通常、Ｈｂの１０ｇ／ｄｌの濃度を超えない。より具体的には、上記濃度は、通常、０．１ｇ／ｄｌ Ｈｂと８ｇ／ｄｌ Ｈｂとの間である。
【００５３】
適切な水性希釈剤（すなわち、静脈内注射について薬学的に受容可能であるもの）としては、とりわけ、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、および他のコロイドの水性溶液が挙げられる。これらの実施形態が、任意の特定の希釈剤に限定されることは意図されない。結果としては、希釈剤は、アルブミン、他のコロイド、または他の非酸素運搬構成要素の、細胞を含まない水性溶液を包含し得る。
【００５４】
ＰＥＧ−Ｈｂ結合体のこの溶液特性は、ＰＥＧ鎖と溶媒の水分子との間の強い相互作用に起因する。これは、２つの理由で、ＨＢＯＣについての重要な属性であると考えられる：１）より高い粘度は、両方のＰＥＧ−Ｈｂ分子の拡散係数を減らし、２）より高い粘度は内皮壁に対する上記溶液の流れのせん断応力を増加させ、血管収縮を和らげるための血管拡張物質（ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒ）の放出を誘発する。従って、上記水性希釈剤中のＰＥＧ−Ｈｂの処方物は、通常、少なくとも２センチポイズ（ｃＰ）の粘度を有する。より具体的には、２ｃＰと４ｃＰとの間、特に約２．５ｃＰである。他の実施形態において、上記水性溶液の粘度は、６ｃＰまたはそれより大きいものであり得るが、通常、８ｃＰ超ではない。
【００５５】
上記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体は、任意の他のこのような生成物と同様にヘモグロビンベースの酸素運搬体としての使用に適している。例えば、それは、器官保存のための血液代用物として、手術などの間に血行動態の安定性を促進するために有用である。
【実施例】
【００５６】
実施例
実施例１
Ｈｂのチオール化
１． ＳＦＨの生成
濃厚赤血球（「ＲＢＣ：Ｐａｃｋｅｄ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ」）を市販の供給源から（例えば、地方の血液バンク、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ血液センター、または米国赤十字から）手に入れる。その材料を、収集時から４５日以内に取得する。全てのユニットを、使用前に、ウイルスの感染についてスクリーニングし、核酸試験に供する。非白血球除去（Ｎｏｎ−ｌｅｕｋｏｄｅｐｌｅｔｅｄ）のプールされたユニットを、膜濾過によって白血球除去（ｌｅｕｋｏｄｅｐｌｅｔｅ）して、白血球を除去する。濃厚ＲＢＣを、滅菌管にプールし、さらなる処理まで２〜１５℃で保存する。その体積を記録し、市販のコオキシメーター（ｃｏ−ｏｘｉｍｅｔｅｒ）、または他の当該技術分野で認められた方法を用いて、Ｈｂ濃度を決定する。
【００５７】
ＲＢＣを、０．４５μｍのタンジェンシャルフロー濾過を用いて６体積の０．９％塩化ナトリウムで洗浄し、その後、塩の濃度を減らすことによって細胞を溶解する。Ｈｂの抽出を、同じ膜を用いて行う。その細胞洗浄物を分析して、アルブミンについての分光光度アッセイによって血漿構成要素の除去を確かめる。その溶解産物を、冷却下で０．１６μｍの膜を介して処理して、Ｈｂを精製する。その精製されたＨｂを、滅菌の発熱性物質が除かれたもの（ｉｎ ａ ｓｔｅｒｉｌｅ ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ）で収集し、次に限外濾過してウイルスを除去する。さらなるウイルス低減工程（溶媒／洗剤処理、ナノ濾過、およびアニオンＱ膜精製が挙げられる）が行われ得る。このプロセスにおける全ての工程は、２℃〜１５℃で実施する。
【００５８】
溶解産物由来のＨｂを、３０ｋＤの膜を用いて、リンゲル液（「ＲＬ」）、またはリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」、ｐＨ７．４）に交換する。上記Ｈｂを、１．１ｍＭ〜１．５ｍＭ（四量体において）まで濃縮する。１０体積〜１２体積のＲＬまたはＰＢＳを溶媒交換のために使用する。このプロセスを、２℃〜１５℃で実施する。ＲＬまたはＰＢＳにおいて調製される上記溶液のｐＨを、チオール化の前に８．０に調整する。上記Ｈｂを、０．４５μｍまたは０．２μｍのディスポーザブルフィルターカプセルを介して滅菌濾過し、化学改変反応が行われる前に４±２℃で保存する。
【００５９】
２． 上記ＳＦＨのチオール化
上に記載されるように調製されたＳＦＨを用いて、チオール化を、Ｈｂに対して８倍未満のモル濃度過剰の２−ＩＴを用いて実施する。その比および反応時間を、ＰＥＧ結合体化についてのチオール基の数を最大限にするため、および生成物の不均一性を最小限にするために最適化する。ＲＬ（ｐＨ７．０〜８．５）、ＰＢＳ、または任意の同様のバッファーにおける、おおよそ１ｍＭのＨｂ（四量体）を、同じバッファーにおいて、８ｍＭ未満の２−ＩＴと組み合わせる。この混合物を、１０±５℃で６時間未満、連続して撹拌する。
【００６０】
ジチオピリジン比色定量アッセイ（Ａｍｐｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９６９，３２：１６３−１６９）を、チオール化の前および後に、および次に、再度Ｈｂ−ＰＥＧ結合体化の後に、上記Ｈｂ四量体の表面上の利用可能なチオール基の数を測定するために使用する。ヒトＨｂは、β９３システイン残基に２つの内因性の反応性チオール基を含み、それは、ジチオピリジン反応によって確認される。１：＜８（ＳＦＨ：２−ＩＴ）の比でのＳＦＨのチオール化後、反応性のチオール基の数は、２個のチオールから７個超のチオールまで増加する。
【００６１】
実施例２
ＰＥＧ−Ｍａｌに対するＨｂの結合体化
出発四量体Ｈｂの濃度に対して１００％の末端活性に基づく、１５倍未満のモル濃度過剰のＰＥＧ−Ｍａｌを用いて、ＰＥＧ−Ｍａｌを実施例１からのチオール化Ｈｂに結合体化する。上記Ｈｂをまず、そのＨｂを酸素化するように大気と平衡させる。ＲＬ（ｐＨ７．０〜８．５）、ＰＢＳ、または任意の同様のバッファーにおける、おおよそ１ｍＭのチオール化Ｈｂを、同じバッファーにおいて、１５ｍＭ未満のＰＥＧ−Ｍａｌと組み合わせる。この混合物を、１０±５℃で６時間未満、連続して撹拌する。
【００６２】
ＰＥＧ−Ｈｂ結合体を、７０ｋＤの膜を介して処理して（すなわち、＜０の体積濾過（＜０−ｖｏｌｕｍｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ））、未反応の試薬を除去する。このプロセスを、５４０ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるサイズ排除液体クロマトグラフィー（「ＬＣ」）によってモニターする。その濃度を４ｇ／ｄｌ Ｈｂに調整し、そのｐＨを６．０±７．８に調整する。
【００６３】
その最終ＰＥＧ−Ｈｂ結合体生成物を、４±２℃で、０．２μｍの滅菌ディスポーザブルカプセルを用いて滅菌濾過し、滅菌の発熱性物質が除かれた管に収集する。上記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体を、４ｇ／ｄｌのＲＬに希釈し、そのｐＨを７．４±０．２のｐＨに調整し、次に滅菌濾過（０．２μｍ）し、内毒素を含まない滅菌容器に等分する。
【００６４】
実施例３
上記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の特徴づけ
１． 生理化学的な分析のための方法論
上記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の均質性および分子サイズを、ＬＣによって特徴づけて、未反応のＰＥＧ−Ｍａｌの除去を評価する。その溶出物におけるＨｂの量を、５４０ｎｍにおける吸光度をモニターすることによって決定する。これは、それらの分子量の違いに基づくピークの位置によって未反応のＨｂからＰＥＧ−Ｈｂ結合体を分離（ｒｅｓｏｌｖｅ）する。その溶出物における未反応のＰＥＧ−Ｍａｌの量を２８０ｎｍにおける吸光度をモニターすることによって決定する。これにより、遊離ＰＥＧ−ＭａｌからＰＥＧ−Ｈｂ結合体が分離される。その遊離ＰＥＧ−Ｍａｌは、ＰＥＧ−Ｍａｌにおけるマレイミド環の構造に起因するスペクトルのうちの紫外（「ＵＶ」）領域において吸収する。
【００６５】
ラピッドスキャンダイオードアレイ分光光度計を用いてソーレーおよび可視領域における光学スペクトルを収集し、複数の構成要素の分析によりＨｂ濃度およびｍｅｔＨｂ％を分析する。
【００６６】
ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の濃度およびｍｅｔＨｂ％を、コオキシメーター（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて決定する。粘度を、レオメーター（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ，ＭＡ））を用いて決定する。コロイド浸透圧を、コロイドオスモメーター、Ｏｓｍｏｍａｔ ０５０（Ｇｏｎｏｔｅｃ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定する。酸素結合パラメーターを、Ｈｅｍｏｘ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＣＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ，ＰＡ）を用いて酸素平衡曲線から決定する。
【００６７】
２． ＰＥＧ−Ｈｂ結合体についての規格
本発明の例示的な血液代用物組成物についての規格を、下の表１に表す。
【００６８】
【表１】
上に明記される実施例は、上記組成物の好ましい実施形態をどのように作製および使用するかの完全な開示および記載を当業者に与えるために提供され、それらは、本発明者らが、自らの発明としてみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。上に記載される様式の改変（本発明を実施するために、当業者に明らかである改変）は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもこのような刊行物、特許、および特許出願のそれぞれが、具体的および個々に本明細書中で参考として援用されることが示しているかのごとく、本明細書中で参考として援用される。
【００６９】
（項目１）
ポリエチレングリコール結合体化ヘモグロビン（「ＰＥＧ−Ｈｂ」）を調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）水性希釈剤中でヘモグロビン（Ｈｂ）を２−イミノチオラン（２−ＩＴ）と混合してチオール化Ｈｂを形成する工程であって、ここで該２−ＩＴは、該Ｈｂ濃度よりも、該希釈剤中７モル濃度過剰と８モル濃度過剰との間の濃度で存在する、工程；および
ｂ）該水性希釈剤中でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−マレイミド（Ｍａｌ）を該チオール化Ｈｂに加えてＰＥＧ−Ｈｂ結合体を形成する工程であって、ここで該ＰＥＧ−Ｍａｌは、該Ｈｂ濃度よりも、該希釈剤中９モル濃度過剰と１５モル濃度過剰との間の濃度で存在し、ここで該ＰＥＧ−Ｍａｌは、４，０００ダルトン（Ｄａ）と６，０００ダルトン（Ｄａ）との間の平均分子量を有する、工程、を含み；
ここで該ＰＥＧ−Ｈｂ結合体は、１Ｈｂ当たり平均７．１個と８．９個との間のＰＥＧ分子を含む、
方法。
【００７０】
（項目２）
前記２−ＩＴが、前記Ｈｂ濃度よりも、前記希釈剤中７．５モル濃度過剰の濃度で存在する、項目１に記載の方法。
【００７１】
（項目３）
前記ＰＥＧ−Ｍａｌが、前記Ｈｂ濃度よりも、前記希釈剤中１２モル濃度過剰の濃度で存在する、項目１に記載の方法。
【００７２】
（項目４）
前記ＰＥＧ−Ｍａｌが、５，０００Ｄａの平均分子量を有する、項目１に記載の方法。
【００７３】
（項目５）
本質的に同一の条件下で測定される場合、前記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体が有する、前記Ｈｂが５０％飽和されるものである酸素分圧（ｐ５０）は、同等の供給源由来の天然のストローマフリーのヘモグロビンよりも小さい、項目１に記載の方法。
【００７４】
（項目６）
前記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の前記ｐ５０が、１０ミリメートル水銀柱（ｍｍＨｇ）未満である、項目５に記載の方法。
【００７５】
（項目７）
前記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の前記ｐ５０が、４ｍｍＨｇと８ｍｍＨｇとの間である、項目５に記載の方法。
【００７６】
（項目８）
工程ａ）が７と９との間のｐＨで実施される、項目５に記載の方法。
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、低い反応成分比を用いて、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）結合体化ヘモグロビン（「Ｈｂ」）を調製するための方法に関する。より具体的には、本発明は、高められた収量および純度でＰＥＧ結合体化Ｈｂ（「ＰＥＧ−Ｈｂ」）を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
酸素療法（時折、「酸素を運搬する血漿増量剤」と称される）として有用である酸素運搬体は、以下の３つカテゴリーに分類され得る：ｉ）ペルフルオロカーボンベースのエマルジョン、ｉｉ）リポソーム封入（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）Ｈｂ、およびｉｉｉ）改変されたＨｂ。下で議論されるように、どれも完全にうまくいったというわけではないが、改変された、細胞を含まないＨｂを含む生成物は、最も見込みがあると考えられる。過フルオロ化合物ベースのエマルジョンは、リガンドとして酸素を結合することとは対照的に酸素を溶解させる。生物学的システムにおいて使用されるために、上記過フルオロ化合物は、脂質、代表的に卵黄リン脂質で、乳化されなければならない。ペルフルオロカーボンエマルジョンは、製造するのに費用がかからないが、それらは、有効であるのに十分な酸素を、臨床的に許容される用量で運搬しない。反対に、リポソーム封入Ｈｂは、有効であると示されているが、普及して使用するには費用がかかりすぎる（一般に、Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．，「Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｂａｓｅｄ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ」，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９９２）を参照のこと）。
【０００３】
赤血球代用物として、赤血球溶血物由来の遊離Ｈｂを利用する最初の試みは、うまくいかなかった。ストローマの構成要素は、毒性であることが見出され、凝固障害および関連する腎不全をもたらした。１９６７年に、ストローマフリーのＨｂ（「ＳＦＨ」）溶液が調製された（Ｒａｂｉｎｅｒ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９６７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２６：１１２７−１１４２）。しかし、それらは、わずか約１００分間の輸血半減期を有することが見出された。
【０００４】
ＳＦＨの短い循環半減期の理由は、そのタンパク質がその四量体形態から二量体に解離する能力に起因し、それは腎臓によって循環から迅速に濾過される。従って、Ｈｂの管外遊出を制限または防ぐために、架橋Ｈｂのための多数の方法、および高分子との結合体化によってＨｂの流体力学的サイズを増加させるための他の手段が考案されてきた。ＳＦＨを架橋することによるポリ−Ｈｂの形成が、特許文献１、および特許文献２に記載される。サブユニット間のアミノ酸残基を結合する、内部架橋Ｈｂは、ジアスピリン（特許文献３に記載されるようなビス−３，５−ジブロモサリチレート（ｂｉｓ−３，５−ｄｉｂｒｏｍｏｓａｌｉｏｃｙｌａｔｅ）のジエステル）、または２−Ｎ−２−ホルミル−ピリドキサル−５’−ホスフェート、および水素化ホウ素（Ｂｅｎｅｓｃｈ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ，．１９７５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６２：１１２３−１１２９）を用いて達成され得る。二量体の形成を防ぐための四量体Ｈｂユニットのサブユニットを化学的に結合する分子内架橋は、特許文献４に開示される。さらに、Ｓｉｍｏｎ，Ｓ．Ｒ．およびＫｏｎｉｇｓｂｅｒｇ，Ｗ．Ｈ．は、分子内架橋Ｈｂを生成するためのビス−（Ｎ−マレイミドメチル）エーテル（「ＢＭＥ」）の使用を開示し（１９６６，ＰＮＡＳ ５６：７４９−５６）、その分子内架橋Ｈｂは、ラットおよびイヌに注入されるときに、半減期が４倍増加することが報告された（Ｂｕｎｎ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２９：９０９−２４）。しかし、ＨｂとＢＭＥとの架橋は、同時に、Ｈｂの酸素親和性における増加をもたらし、このことは、当時は、潜在的なＨｂ−ベースの酸素運搬体（「ＨＢＯＣ」）としてのその使用を妨げると考えられた。
【０００５】
ＳＦＨはまた、他の高分子（例えば、デキストラン）（Ｃｈａｎｇ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ，．１９７７，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：３９８−４０３）、ヒドロキシエチルデンプン（特許文献５）、ゼラチン（特許文献６）、アルブミン（特許文献６）、およびＰＥＧ（特許文献７、特許文献８、特許文献９、および特許文献１０）に繋がれた。
【０００６】
これらの酸素運搬溶液の生理的効果のいくつかは、完全には理解されていない。これらのうち、おそらく最も議論の的となるものは、動物およびヒトにおいて高血圧症として現れ得る、血管収縮を引き起こす傾向である（Ａｍｂｅｒｓｏｎ，Ｗ．，１９４７，Ｓｃｉｅｎｃｅ １０６：１１７−１１７）（Ｋｅｉｐｅｒｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３３：７０１−７０８）。α−鎖とビス−ジブロモサリチル−フマレートとの間で架橋されるヒトＨｂ（「ααＨｂ」）は、モデル赤血球代用物として、米国陸軍によって開発されたが、それが、肺および全身の血管抵抗の深刻な増加を示した後に断念された（Ｈｅｓｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｌｏｏｄ ７８：３５６Ａ）。この生成物の市販版はまた、期待はずれの第三相臨床試験後に断念された（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．，２０００，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ７９：１−２０）。
【０００７】
細胞を含まないＨｂによって生み出される血管収縮についての最も一般的な説明は、それが、内皮由来血管弛緩因子（ＥＤＲＦ）である、一酸化窒素（「ＮＯ」）を容易に結合するということである。２つの分子アプローチは、ＨｂのＮＯ結合活性を克服する試みにおいて進歩してきた。第一のアプローチは、組換えＤＮＡを利用することであり、このアプローチは遠位ヘムポケットの部位特異的変異誘発によって、ＨｂのＮＯ結合を低減することを試みた（Ｅｉｃｈ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：６９７６−８３）。第二のアプローチは、Ｈｂのサイズがオリゴマー化を介して高められる化学的改変を利用し、このアプローチは血管裂孔（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｐａｃｅ）から組織間隙（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｓｐａｃｅ）へのＨｂの管外遊出を低減するか、またはそれをできる限り完全に阻害することを試みた（Ｈｅｓｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７４：１７６９−７８；Ｍｕｌｄｏｏｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２８：５７９−８３；Ｍａｃｄｏｎａｌ，Ｖ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：５６５−７５；Ｆｕｒｃｈｇｏｔｔ，Ｒ．，１９８４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４：１７５−９７；およびＫｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９：１５５−６２）。
【０００８】
実際に、ＮＯへの親和性が低減した組換えＨｂが生み出されている。このものは、最大負荷（ｔｏｐ−ｌｏａｄ）したラット実験において、高血圧性がより低い（Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ｈ．ｅｔｇ ａｌ．１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：６７２−６７６、およびＬｅｍｏｎ，Ｄ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４：３７８）。しかし、研究は、ＮＯ結合がＨｂの血管作用に対する唯一の説明ではない可能性があることを示唆する。特定の大きなＨｂ分子（例えば、ＰＥＧを用いて改変されたもの）は、たとえ、それらのＮＯ結合速度が、重度に高血圧性のααＨｂのものと同一であっても、事実上、高血圧作用を有さないことが見出されている（Ｒｏｈｌｆｓ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１２１２８−１２１３４）。さらに、ＰＥＧ−Ｈｂは、出血の前の交換輸血として与えられるとき、結果として起こる出血を防ぐことにおいて並外れて有効であることが見出された（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５：９９３−１００３）。
【０００９】
Ｈｂに対するＰＥＧの結合体化は、その抗原性を低減し、その循環半減期を延長する。しかし、上記ＰＥＧ結合体化反応は、αβ−二量体サブユニットへのＨｂ四量体の解離をもたらし、４０，０００ダルトン（「Ｄａ」）より小さいＨｂモノマー単位のＰＥＧ−結合体を受けて交換輸血されたラットにおいて肉眼的（ｇｒｏｓｓ）ヘモグロビン尿症を引き起こすことが報告されている（Ｉｗａｓｈｉｔａ ａｎｄ Ａｊｉｓａｋａ Ｏｒｇａｎ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ：Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄｉｃｉｅｓ Ｍｅｃｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．，Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．１９８１，Ｅｄｓ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ ｐｇｓ ９７−１０１）。８４，０００Ｄａよりも大きい分子量を有するポリアルキレンオキシド（「ＰＡＯ」）結合体化Ｈｂは、Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．によって調製され（特許文献１１）、それは、Ｈｂのαおよびε−アミノ基においてＨｂに繋げられた１０コピーのＰＥＧ−５，０００鎖を有した。この置換の程度は、哺乳動物においてヘモグロビン尿症に関連する、臨床的に重要な腎毒性を避けるとして記載された。しかし、上記結合体化反応は、不均一な結合体集団をもたらし、カラムクロマトグラフィーによって除去されなければならない他の望ましくない反応成分を含んだ。
【００１０】
ＰＥＧ結合体化は、代表的に、生体分子の表面上の官能基と活性化されたＰＥＧとの反応を介して実施される。最も一般的な官能基は、リジン残基およびヒスチジン残基のアミノ基、ならびにタンパク質のＮ末端；システイン残基のチオール基；そして、セリン残基、トレオニン残基、およびチロシン残基のヒドロキシル基、ならびに上記タンパク質のＣ末端である。ＰＥＧは、通常、ヒドロキシル末端を、温和な水性環境においてこれらの官能基と反応することが可能な、反応性の部分に転換することによって、活性化される。治療用生物製剤（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）の結合体化に使用される最も一般的な一官能性ＰＥＧのうちの１つは、メトキシ−ＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」）であり、これは、たった１つの官能基（すなわち、ヒドロキシル）を有し、従って、二官能性ＰＥＧに関連する架橋および凝集の問題を最小限にする。しかし、ｍＰＥＧは、しばしば高分子量の二官能性ＰＥＧ（すなわち、「ＰＥＧジオール」）が夾雑しており、それはその製造プロセスに起因して、１０％〜１５％ほど高い範囲に及び得る（Ｄｕｓｔ Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９０，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ２３：３７４２−３７４６）。この二官能性ＰＥＧジオールは、所望される一官能性ＰＥＧのおおよそ２倍のサイズを有する。その夾雑の問題は、ＰＥＧの分子量が増加するに従って、さらに悪化する。ｍＰＥＧの純度は、ＦＤＡが、高レベルの、製造プロセスにおける再現性および最終薬物生成物の質を要求するので、ＰＥＧ化生物治療剤（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の製造について特に重要である。
【００１１】
ＰＡＯに対するＨｂの結合体化は、酸素化状態および脱酸素状態の両方において、行われてきている。特許文献１２は、結果として生じるＰＥＧ−Ｈｂ結合体の酸素親和性を高めるために酸素化、すなわち「Ｒ」状態でＨｂを結合体化することを記載する。これは、結合体化の前にＨｂを大気と平衡させることによって達成される。他の発明者ら（ｏｔｈｅｒｓ）は、酸素親和性を減少させ、構造上の安定性を増加させて、Ｈｂが化学的改変、ダイアフィルトレーションおよび／または滅菌濾過、ならびに滅菌の物理的ストレスに耐えるのを可能にする、結合体化の前の脱酸素ステップを記載する（米国特許第５，２３４，９０３）。Ｈｂの分子内架橋について、改変前にＨｂを脱酸素する工程が、そのα−鎖のリジン９９を架橋試薬に曝すために必要とされ得ることが示唆される（米国特許第５，２３４，９０３）。
【００１２】
ＰＥＧとの結合体化の前のイミノチオランを用いるＨｂチオール化の動力学は、Ａｃｈａｒｙａらによって調査された（特許文献１３）。イミノチオランの濃度を、１０倍（１四量体当たり平均５つの外因性チオールを導入した）から３０倍に増加させることにより、Ｈｂ上の外因性チオールの数をほぼ倍にすることが観測された。しかし、ＰＥＧ結合体化後に見られるサイズの増加は、たとえチオールの数が２倍になっても、ほぼ限界であった。これは、２０倍モル濃度過剰のマレイミジルＰＥＧ−５０００の存在下での結合体化反応が、より反応性の低いチオールをもつＨｂの表面を覆い、より反応性の高いチオールをもつＨｂのさらなる改変に抵抗する立体障害（ｓｔｅｒｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）をもたらしたことを示唆した。その結果、改変されたＨｂの所望される分子量（すなわち、１Ｈｂ分子当たり６±１ ＰＥＧ）を達成するために、Ａｃｈａｒｙａらは、Ｈｂを８〜１５モル濃度過剰のイミノチオランでチオール化し、次に、そのチオール化Ｈｂを１６〜３０倍モル濃度過剰のマレイミジルＰＥＧ−５０００で反応させた。しかし、大規模な生産における、これらの高いモル濃度過剰の反応成分濃度は、ＨＢＯＣを調製するための費用を著しく増大させる。さらに、このような高いモル濃度過剰のマレイミジルＰＥＧ−５０００は、より多くの不必要な反応成分の生成を伴う、より不均一な生成物をもたらす。
【００１３】
従って、費用が減らされ、効率が増加し、不純物の少ない、そして分子量範囲がより狭い、特定のサイズ範囲のＰＥＧ結合体化Ｈｂを調製する方法の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第４，００１，２００号明細書
【特許文献２】米国特許第４，００１，４０１号明細書
【特許文献３】米国特許第４，５２９，７１９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，２９６，４６５号明細書
【特許文献５】独国特許発明第２，１６１，０８６号明細書
【特許文献６】独国特許発明第２，４４９，８８５号明細書
【特許文献７】独国特許発明第３，０２６，３９８号明細書
【特許文献８】米国特許第４，６７０，４１７号明細書
【特許文献９】米国特許第４，４１２，９８９号明細書
【特許文献１０】米国特許第４，３０１，１４４号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，６５０，３８８号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，８４４，３１７号明細書
【特許文献１３】米国特許第７，５０１，４９９号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
本発明は、一般に、ポリエチレングリコール結合体化ヘモグロビン（「ＰＥＧ−Ｈｂ」）を調製するための方法に関し、この方法は、以下の工程：水性希釈剤中でヘモグロビン（Ｈｂ）を２−イミノチオラン（２−ＩＴ）と混合してチオール化Ｈｂを形成する工程であって、ここで上記２−ＩＴは、上記Ｈｂ濃度よりも、上記希釈剤中７モル濃度過剰と８モル濃度過剰との間の濃度で存在する、工程；および次に、上記水性希釈剤中でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−マレイミド（Ｍａｌ）を上記チオール化Ｈｂに加えてＰＥＧ−Ｈｂ結合体を形成する工程であって、ここで上記ＰＥＧ−Ｍａｌは、上記Ｈｂ濃度よりも、上記希釈剤中９モル濃度過剰と１５モル濃度過剰との間の濃度で存在し、ここで上記ＰＥＧ−Ｍａｌは、４，０００ダルトン（Ｄａ）と６，０００ダルトン（Ｄａ）との間の平均分子量を有する、工程、を含み；ここで結果として生じるＰＥＧ−Ｈｂ結合体は、１Ｈｂ当たり平均７．１個と８．９個との間のＰＥＧ分子を含む。
【００１６】
１つの実施形態において、上記２−ＩＴは、上記Ｈｂ濃度よりも、上記希釈剤中７．５モル濃度過剰の濃度で存在し、上記ＰＥＧ−Ｍａｌは、上記Ｈｂ濃度よりも、上記希釈剤中１２モル濃度過剰の濃度で存在し、そして／または上記ＰＥＧ−Ｍａｌは、５，０００ダルトンの平均分子量を有する。
【００１７】
本質的に同一の条件下で測定される場合、本発明の例示的な方法に従って調製されるＰＥＧ−Ｈｂ結合体が有する、上記Ｈｂが５０％飽和されるものである酸素分圧（ｐ５０）は、同等の供給源由来の天然のストローマフリーのヘモグロビンよりも小さい。１つの実施形態において、上記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の上記ｐ５０は、１０ミリメートル水銀柱（ｍｍＨｇ）未満（例えば、４ｍｍＨｇと８ｍｍＨｇとの間）である。
【００１８】
本発明の他の局面は、本明細書中いたるところに見出される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１：ＨｂのβＣｙｓ９３残基およびチオール化リジンは、ＰＥＧ化される。Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、Ｈｂの主鎖を表し；Ｒ４は、アルキル基であり、「ｎ」は、５，０００Ｄａ ＰＥＧのオキシエチレン単位の平均の数を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、一般に、低い反応成分比を用いて、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）結合体化ヘモグロビン（「Ｈｂ」）を調製するための方法に関する。より具体的には、本発明は、高められた収量および純度でＰＥＧ結合体化Ｈｂ（「ＰＥＧ−Ｈｂ」）を調製するための方法に関する。
【００２１】
以下の記載において、分子生物学、免疫学、および医学の分野において使用される多くの用語が広く利用される。このような用語に与えられるべき範囲を含む、本明細書および特許請求の範囲の明瞭で一貫した理解を提供するために、以下の非限定的な定義が提供される。
【００２２】
本開示において、用語「ｏｎｅ」、「ａ」、または「ａｎ」が使用されるとき、それらはそうでないと示されない限り、「少なくとも１つ」または「１つまたはそれより多く」を意味する。
【００２３】
本明細書中で用いられる場合、用語「活性化ポリアルキレンオキシド」または「活性化ＰＡＯ」は、少なくとも１つの官能基を有するＰＡＯ分子を指す。官能基は、ＰＡＯと結合体化されるべき分子上の遊離アミン、スルフヒドリル、またはカルボキシル基と相互作用する反応性の部分である。例えば、遊離スルフヒドリルと相互作用する１つのこのような官能基は、マレイミド基である。同様に、遊離アミンと相互作用する官能基は、スクシンイミド基である。
【００２４】
本明細書中で用いられる場合、用語「おおよそ」は、示される値の範囲内にある実際の値を指す。一般に、実際の値は、示される値の１０％以内（すなわち、±１０％）である。
【００２５】
本明細書中で用いられる場合、用語「ヘモグロビン」または「Ｈｂ」は、一般に、酸素を輸送する赤血球内に含まれるタンパク質を指す。Ｈｂの各分子は、４つのサブユニット、２つのα−鎖サブユニット、および２つのβ−鎖サブユニットを有し、これらは四量体構造に配置される。各サブユニットはまた、酸素を結合する鉄を含む中心である、１つのヘム基を含む。従って、各Ｈｂ分子は、４分子の酸素を結合し得る。
【００２６】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ」は、マレイミジル活性化ＰＥＧが結合体化されたＨｂを指す。上記結合体化は、ＭａｌＰＥＧをＨｂ上の表面チオール基（およびより少ない程度にアミノ基）と反応させて、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを形成することによって行われる。チオール基は、Ｈｂのアミノ酸配列に存在するシステイン残基において見出され、それはまた、チオール基を含むように表面アミノ基を改変することによって導入され得る。
【００２７】
本明細書中で用いられる場合、用語「メトヘモグロビン」または「ｍｅｔＨｂ」は、３価の鉄の状態にある鉄を含むＨｂの酸化形態を指す。ＭｅｔＨｂは、酸素運搬体として機能しない。本明細書中で用いられる場合、用語「メトヘモグロビン％」は、総Ｈｂに対する酸化Ｈｂの百分率を指す。
【００２８】
本明細書中で用いられる場合、用語「メトキシ−ＰＥＧ」または「ｍＰＥＧ」は、ＰＥＧのヒドロキシル末端の水素が、メチル（−ＣＨ３）基で置き換えられたＰＥＧを指す。
【００２９】
本明細書中で用いられる場合、用語「混合物」または「混合する工程」は、２つまたはそれより多くの物質を、それら個々の特性を消失させる反応が起こることなく、一緒に混ぜることを指す。用語「溶液」は、液体の混合物を指し、用語「水性溶液」は、いくらかの水を含み、また、水とともに１つまたはそれより多くの他の液体物質を含んで、複数の構成要素の溶液を形成し得る溶液を指す。
【００３０】
本明細書中で用いられる場合、用語「改変されたヘモグロビン」または「改変されたＨｂ」は、Ｈｂがもはやその「天然の」状態にないような、化学反応（例えば、分子内および分子間架橋）、組換え技術によって変更されたＨｂを指すが、これに限定されない。本明細書中で用いられる場合、用語「ヘモグロビン」または「Ｈｂ」は、それ自体が天然の改変されていないＨｂ、ならびに改変されたＨｂの両方を指す。
【００３１】
本明細書中で用いられる場合、用語「酸素親和性」は、酸素運搬体（例えば、Ｈｂ）が分子状酸素を結合するアビディティを指す。この特徴づけは、酸素によるＨｂ分子の飽和の程度（Ｙ軸）を酸素の分圧（Ｘ軸）に関連付ける、酸素平衡曲線によって定義される。この曲線の位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、Ｐ５０値によって示され、Ｐ５０値は、酸素運搬体が酸素で半分飽和される酸素分圧であり、酸素親和性に反比例する。それゆえに、Ｐ５０がより低くなればなるほど、酸素親和性がより高くなる。全血の（および全血の構成要素（例えば、赤血球およびＨｂ））の酸素親和性は、当該分野において公知である多様な方法によって測定され得る（例えば、Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７，２５２：２３３１−３７を参照のこと）。酸素親和性はまた、市販のＨＥＭＯＸＴＭ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＣＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ，ＰＡ）を用いて、決定され得る（例えば、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ ａｎｄ Ｓｈｒａｇｅｒ ｉｎ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ｅｖｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．）２３２：４６０（１９９４）を参照のこと）。
【００３２】
本明細書中で用いられる場合、用語「ペルフルオロカーボン」は、フッ素原子を含み、完全にハロゲン（Ｂｒ、Ｆ、Ｃｌ）および炭素原子からなる、合成の不活性な分子を指す。それらは、等量の血漿または水よりも幾倍も多くの酸素を溶解させる能力を有するので、それらは、エマルジョンの形態において、血液物質（ｂｌｏｏｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）として開発中である。
【００３３】
本明細書中で用いられる場合、用語「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、一般化学式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（α−ヒドロ−ω−ヒドロキシポリ−（オキシ−１，２−エタンジイル）としても公知である）（ここで「ｎ」は、４よりも大きいか、または４に等しい）の液体または固体のポリマーを指す。置換または非置換の任意のＰＥＧ処方物が、この用語によって包含される。ＰＥＧは、多くの処方物において市販されている（例えば、ＣａｒｂｏｗａｘＴＭ（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）、Ｐｏｌｙ−Ｇ（登録商標）（Ａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、およびＳｏｌｂａｓｅ）。
【００３４】
本明細書中で用いられる場合、用語「ポリエチレングリコール結合体化ヘモグロビン」または「ＰＥＧ−Ｈｂ結合体」は、ＰＥＧが共有結合的に結合したヘモグロビンを指す。
【００３５】
本明細書中で用いられる場合、用語「ストローマフリーのヘモグロビン」または「ＳＦＨ」は、全ての赤血球の膜が除去されているＨｂを指す。
【００３６】
本明細書中で用いられる場合、用語「表面が改変されたヘモグロビン」は、化学基、通常、ポリマー（例えば、デキストランまたはポリアルキレンオキシド）が結合したヘモグロビンを指す。用語「表面が改変された酸素化ヘモグロビン」は、表面が改変されるときに「Ｒ」状態にあるＨｂを指す。
【００３７】
有機ポリマー
以前の研究において、表面が改変されたヘモグロビンの分子サイズは、腎臓によって取り除かれることを避けるほど、および所望される循環半減期を達成するほど十分に大きくなければならないことが観測された。Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．らは、このことが８４，０００ダルトン（「Ｄａ」）の分子量で、または８４，０００ダルトン（「Ｄａ」）の分子量より上で達成され得ることを決定した（「Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ Ｅｘｐａｎｄｅｒｓ，」Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐａｇｅｓ ２０５−２１２（１９７８））。その研究において、その著者らは、様々な分子量のデキストランをＨｂに結合体化した。彼らは、Ｈｂ（６４，０００Ｄａの分子量を有する）とデキストラン（２０，０００Ｄａの分子量を有する）の結合体が、「循環からゆっくり取り除かれ、腎臓を通り抜けるのは無視できる程であった」と報告した。さらに、８４，０００Ｄａより上に分子量を増加させることにより、これらのクリアランス曲線が著しく変わることはないことが観測された。
【００３８】
本発明は、少なくとも８４，０００Ｄａの分子量が得られ得る、Ｈｂに対するＰＡＯの結合体化のための方法を提供する。適切なポリアルキレンオキシドポリマーとしては、ポリエチレンオキシド（−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−）、ポリプロピレンオキシド（−（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ）ｎ−）、およびポリエチレン／ポリプロピレンオキシドコポリマー（−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ）ｎ−）が挙げられる。本発明の実施において適切である、他の直鎖、分枝鎖および必要に応じて置換された合成ポリマーは、医学分野において周知である。
【００３９】
Ｈｂの表面を改変するために現在使用される最も一般的なＰＡＯは、その薬学的受容可能性および商業的利用可能性に起因して、ＰＥＧである。さらに、ＰＥＧは、その分子内のエチレンオキシド（すなわち、−ＯＣＨ２ＣＨ２−）の繰り返しサブユニットの数に基づいて、多様な分子量において利用可能である。ＰＥＧ処方物は、通常、それらの平均分子量に対応する数によって示される。例えば、ＰＥＧ−２００は、２００Ｄａの平均分子量を有し、１９０〜２１０Ｄａの分子量範囲を有し得る。
【００４０】
ヘモグロビン改変
本方法において利用されるＨｂは、その供給源によって限定されず、ヒトもしくは動物由来であり得るか、または組換え技術に由来し得る。それは、天然（改変されていない）であるか、もしくは改変されているかのいずれかであり得、または組換えにより操作され得る。ヒトα−グロビン遺伝子およびヒトβ−グロビン遺伝子は、両方ともクローン化され、配列を決定されている（Ｌｉｅｂｈａｂｅｒ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １９８０，７７：７０５４−７０５８；Ｍａｒｏｔｔａ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７，３５３：５０４０−５０５３（β−グロビン ｃＤＮＡ））。さらに、多くの組換えにより改変されたＨｂは、現在、部位特異的変異誘発を用いて生産されているが、これらの「変異体」Ｈｂの多様性は、望ましくなく高い酸素親和性を有することが報告されている（例えば、Ｎａｇａｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １９８５，８２：７２５２−７２５５）。好ましくは、上記Ｈｂは、ストローマフリーであり、内毒素を含まない。
【００４１】
Ｈｂ上の利用可能な結合体部位の数を増やすための１つの方法は、遊離アミンよりもＰＥＧ−Ｍａｌとの反応性が高い傾向があるスルフヒドリル基（「−ＳＨ」）を導入することである。多様な方法が、タンパク質のチオール化についての分野において公知である。これらとしては、例えば、上記タンパク質の残基を含む遊離アミンを、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートとの反応後に、その３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル結合体をジチオトレイトール（「ＤＴＴ」）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（「ＴＣＥＰ」）を用いて還元することよって、チオール化することが挙げられる。アミンはまた、スクシンイミジルアセチルチオアセテートとの反応後に、中性に近いｐＨで、５０ｍＭのヒドロキシルアミンまたはヒドラジンを用いてアセチル基を除去することによって、間接的にチオール化され得る。さらに、２−イミノチオラン（２−ＩＴ）は、遊離アミン基をチオール基に転換するために使用され得る。
【００４２】
天然のヒトＨｂは、チオール化のために利用されて、その後マレイミド活性化ＰＡＯ分子に結合体化し得る、固定数のアミノ酸残基側鎖を有する。これらは、下の表に表される。
【００４３】
【化１】
結合体化後に上記Ｈｂのアミノ（α−またはε−）基の本来の陽電荷を維持することは、有益であることが示唆されている。これを達成するために、その表面リジン残基のε−アミノ基を用いて、ＰＥＧをＨｂに結合させるためのプロトコルが開発され、ここで上記Ｈｂは、依然として上記アミノ基の本来の陽電荷を保持する（米国特許第５，５８５，４８４号明細書）。これは、Ｈｂ上にスルフヒドリル基を導入するための、２−イミノチオランによるそのタンパク質のε−アミノ基のアミド化を含み、そのスルフヒドリル基は、その後、マレイミド−ＰＥＧを用いる結合体化反応の間にＰＥＧのための結合部位として標的化される。
【００４４】
このアプローチは、以前に使用されたスクシンイミジル化学よりも、少なくとも２つのさらなる特定の利益を有する：（１）スルフヒドリル基を有するマレイミド基の非常に高い反応性および選択性は、制限された過剰な試薬を用いて、チオールのほぼ定量的な改変を容易にする；および（２）２−イミノチオランのチオール基は、潜伏性であり、そのタンパク質のアミノ基と試薬との反応の結果として、インサイチューでのみ生成される。従って、Ｈｂは、ＰＥＧでの表面装飾のためのチオール化およびＰＥＧ化する試薬と同時にインキュベートされ得る。
【００４５】
１つの実施形態において、上記チオール化反応は、反応の程度を最適化するために、反応が完了する前に２−ＩＴが著しく加水分解するｐＨより下であり、また、リジンのｐＫａより下である７〜９との間のｐＨで実施される。
【００４６】
結合体化
本明細書中のどこか他のところで議論されるように、結合体化反応における反応成分のモル濃度比を増加させることにより、Ｈｂに結合体化されるようになるＰＥＧ分子の数の増加をもたらすことが以前に仮定された。これは、Ｈｂのチオール化プロセス（すなわち、Ｈｂに対するチオール化剤のモル濃度比を増加させる工程）、および表面改変プロセス（すなわち、チオール化Ｈｂに対する活性化されたＰＥＧのモル濃度比を増加させる工程）の両方を含んだ。これらの研究により、１０倍よりも大きいモル濃度過剰のイミノチオランが、Ｈｂ上のチオール化部位の数を、反応の最初の２時間において１四量体当たり４つの新しい反応性−ＳＨ基から１１時間後に１四量体当たり約７つの新しい反応性−ＳＨ基まで、実質的に増加させることが実証された。１０倍から３０倍にモル濃度比を増加させることは、Ｈｂ上のチオールの総数をほぼ２倍にした。同様に、チオール化Ｈｂに対するチオール活性化ＰＥＧ（ｔｈｉｏｌ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＰＥＧ）のモル濃度比を増加させること（すなわち、２０倍）はまた、チオール化Ｈｂに結合体化され得るマレイミド活性化ＰＥＧ分子の数を増加させた（米国特許第７，５０１，４９９号明細書を参照のこと）。これらの過剰モル濃度比は、その表面上に共有結合的に結合する、６±１ ＰＥＧ分子を有するＨｂをもたらした。しかし、記載されるように反応成分比を増加させることは、反応動力学を遅くさせ、望ましくない副産物のレベルを増加させ、ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の分子量の分布を増加させる。
【００４７】
本発明は、特定の分子量のＰＥＧを用いて、正確に制御された反応成分比で、優れたＰＥＧ−Ｈｂ結合体が生産され得るという予期しない発見に基づく。本発明の方法は、Ｈｂチオール化反応ならびにＰＥＧ結合体化反応の両方において、低いモル濃度比の反応成分を利用する。思いがけなく、そしてより高い濃度の反応成分が収量および結合体化効率の両方を増加させるという昔から正しいとされている通念に反して、より多くの数のＰＥＧ分子が、より低いモル濃度比の反応成分を用いて、改変されたＨｂに結合体化され得るということが見出された。別の利益として、結果として生じる結合体化生成物が、より高い比を用いる同じ生成物よりも狭い（ｔｉｇｈｔｅｒ）分子量分布を有することが見出された。より具体的には、上記チオール化反応において、８倍未満のモル濃度過剰の２−ＩＴ、特に７倍と８倍との間のモル濃度過剰、およびより具体的には、７．５倍のモル濃度過剰；ならびに上記結合体化反応において、１５倍未満のモル濃度過剰のＰＥＧ−Ｍａｌ、特に９倍と１５倍との間のモル濃度過剰、およびより具体的には、１２倍のモル濃度過剰が、１Ｈｂ当たり、７．１個と８．９個との間の、および特に８個の、平均数のＰＥＧ分子をもたらした。議論されるように、より低いモル濃度比の反応成分を用いることは、いくつかの利点を有する。それは、最終生成物において不純物を低減し、このことは、精製プロセスの効率を容易にし、高められた分子の分散を介する反応効率を増加させる。効率の増加はまた、マレイミド環の加水分解および失活（ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を完了するための反応時間を低減する。さらに、反応成分の量を減らすことによって、それらのそれぞれの反応からの副産物も低減される。具体的には、２−ＩＴからの加水分解副産物（４−ブトリチオラクトン（４−ｂｕｔｒｙｔｈｉｏｌａｃｔｏｎｅ）および４−チオ酪酸が挙げられる）、ならびに環が開いた非反応性のＰＥＧの副産物が、著しく減る。
【００４８】
上に記載されるように、上記結合体化反応における、Ｈｂに対するＰＥＧ−Ｍａｌのモル濃度比は、１５倍未満である。このモル濃度比は、反応性のＰＥＧ−Ｍａｌの濃度に基づいており、Ｈｂに対するＰＥＧ−Ｍａｌの絶対比には基づかない。上記ＰＥＧ−Ｍａｌにおいて閉じた環構造を有する反応性のマレイミドの百分率は、その「末端活性（ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」と称される。従って、全てのマレイミドが反応性である場合、上記ＰＥＧ−Ｍａｌは、１００％の末端活性を有する。ＰＥＧ−ＭａｌのＨｂに対するモル濃度比は、本明細書中に記載されるように、Ｈｂに対する末端活性のＰＥＧ−Ｍａｌのモル濃度比に基づく。従って、ＰＥＧ−Ｍａｌ試薬の末端活性が９０％である場合、さらに１０％が、同じモル濃度比を達成するためにＨｂに添加される必要がある。
【００４９】
残留未反応のＰＥＧにおける低減は、生産における効率および最終生成物の質を増加させる追加の利益を有する。上記ＰＥＧ結合体化反応後、残留反応成分は、１０体積の最終生成物希釈剤（例えば、リンゲル乳酸塩または酢酸塩溶液）を用いてダイアフィルトレーションによって除去される。この工程に必要とされる時間の量は、ダイアフィルトレーションプロセスの容積流動（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｆｌｕｘ）によって決定される。所定のフィルターサイズについて、上記ダイアフィルトレーションプロセスは、本発明の反応比が利用されるとき、より速く終了する。上記反応成分の洗い流しは、指数関数的減衰に従い、結果として、不純物（上記反応成分中の残留反応成分および不純物）の初期濃度が減ることは、その生成物におけるそれらの最終濃度を減らす。同様に、試薬の総量を最小限にすることは、上記生成物における不純物の総量を低減し得る。
【００５０】
ＰＥＧ−Ｈｂ結合体
本発明のＰＥＧ−Ｈｂ結合体は、通常、全血よりも大きい酸素親和性を有し、より具体的には、全血の２倍またはさらに３倍の酸素親和性を有する。換言すると、上記ＰＥＧ−Ｈｂは、通常、同じ条件下で測定されるとき、ストローマフリーのヘモグロビン（ＳＦＨ）の酸素親和性よりも大きい酸素親和性を有する。これは、上記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体が、一般に、１０ミリメートル水銀柱（ｍｍＨｇ）未満だが３ｍｍＨｇよりも大きいＰ５０を有することを意味する。ＳＦＨは、３７℃、ｐＨ７．４でおおよそ１５ｍｍＨｇのｐ５０を有し、ここで全血についての上記ｐ５０は、同じ条件下でおおよそ２８ｍｍＨｇである。ヘモグロビンベースの酸素運搬体（ＨＢＯＣ）の酸素親和性を増加させるにより、上記ｐ５０を低下させることは、組織への酸素の送達を高め得ること、ＳＦＨの酸素親和性よりも低い酸素親和性は、受容可能ではないことが示唆された。Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ｉｎ「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ」（１９９７），Ｂｉｒｋａｅｕｓｅｒ，ｅｄｓ．Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，ａｔ ｐａｇｅ １６７、および米国特許第６，０５４，４２７号明細書を参照のこと。この示唆は、ＨＢＯＣが、より低い酸素親和性、具体的には全血の酸素親和性に近似するｐ５０を有するはずであるという広く行き渡った考えに矛盾する。それゆえに、多くの研究者は、ピリドキシル化Ｈｂは、ＳＦＨと比較してより容易に酸素を放出するので、ＳＦＨのｐ５０を、１０ｍｍＨｇからおおよそ２０ｍｍＨｇ〜２２ｍｍＨｇまで上げるためにピリドキサールリン酸を使用してきた。
【００５１】
高い酸素親和性でＨＢＯＣを製造することに対する多くの異なる科学的アプローチが存在する（すなわち、ＳＦＨよりも低いｐ５０を有するもの）。例えば、研究により、酸素親和性において重要な役割を果たすアミノ酸残基（例えば、（β９３システイン））を同定した。これらの発見に起因して、部位特異的変異誘発は、所望されるレベルまで酸素親和性を操作するために、現在容易に実施され得る（例えば、米国特許第５，６６１，１２４号明細書を参照のこと）。上記β９３システイン残基は、直接的にヘム鉄に配位結合する、β−サブユニットにおける唯一の残基である近位β９２ヒスチジン残基にすぐ隣接して位置する。β９３システインに対する剛性で、かさのあるマレイミド基の結合は、低親和性Ｔ−状態のＨｂコンホメーションを通常安定化させる塩橋を置き換える（Ｐｅｒｕｔｚ Ｍ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７４，１３：２１６３−２１７３）。このシフトは、Ｒ状態に対する四級のコンホメーションであり、より高いＯ２親和性をもたらす（Ｉｍａｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７３，１２：７９８−８０７）。多くの他のアプローチが米国特許第６，０５４，４２７号明細書において議論されている。
【００５２】
インビボ投与のための処方物
本発明のＰＥＧ−Ｈｂ結合体は、インビボ投与に適している水性希釈剤中で処方される。上記希釈剤における酸素運搬体の濃度は、その適用に従って変動し得るが、上記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の高められた酸素の送達および治療効果に起因して、通常、Ｈｂの１０ｇ／ｄｌの濃度を超えない。より具体的には、上記濃度は、通常、０．１ｇ／ｄｌ Ｈｂと８ｇ／ｄｌ Ｈｂとの間である。
【００５３】
適切な水性希釈剤（すなわち、静脈内注射について薬学的に受容可能であるもの）としては、とりわけ、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、および他のコロイドの水性溶液が挙げられる。これらの実施形態が、任意の特定の希釈剤に限定されることは意図されない。結果としては、希釈剤は、アルブミン、他のコロイド、または他の非酸素運搬構成要素の、細胞を含まない水性溶液を包含し得る。
【００５４】
ＰＥＧ−Ｈｂ結合体のこの溶液特性は、ＰＥＧ鎖と溶媒の水分子との間の強い相互作用に起因する。これは、２つの理由で、ＨＢＯＣについての重要な属性であると考えられる：１）より高い粘度は、両方のＰＥＧ−Ｈｂ分子の拡散係数を減らし、２）より高い粘度は内皮壁に対する上記溶液の流れのせん断応力を増加させ、血管収縮を和らげるための血管拡張物質（ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒ）の放出を誘発する。従って、上記水性希釈剤中のＰＥＧ−Ｈｂの処方物は、通常、少なくとも２センチポイズ（ｃＰ）の粘度を有する。より具体的には、２ｃＰと４ｃＰとの間、特に約２．５ｃＰである。他の実施形態において、上記水性溶液の粘度は、６ｃＰまたはそれより大きいものであり得るが、通常、８ｃＰ超ではない。
【００５５】
上記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体は、任意の他のこのような生成物と同様にヘモグロビンベースの酸素運搬体としての使用に適している。例えば、それは、器官保存のための血液代用物として、手術などの間に血行動態の安定性を促進するために有用である。
【実施例】
【００５６】
実施例
実施例１
Ｈｂのチオール化
１． ＳＦＨの生成
濃厚赤血球（「ＲＢＣ：Ｐａｃｋｅｄ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ」）を市販の供給源から（例えば、地方の血液バンク、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ血液センター、または米国赤十字から）手に入れる。その材料を、収集時から４５日以内に取得する。全てのユニットを、使用前に、ウイルスの感染についてスクリーニングし、核酸試験に供する。非白血球除去（Ｎｏｎ−ｌｅｕｋｏｄｅｐｌｅｔｅｄ）のプールされたユニットを、膜濾過によって白血球除去（ｌｅｕｋｏｄｅｐｌｅｔｅ）して、白血球を除去する。濃厚ＲＢＣを、滅菌管にプールし、さらなる処理まで２〜１５℃で保存する。その体積を記録し、市販のコオキシメーター（ｃｏ−ｏｘｉｍｅｔｅｒ）、または他の当該技術分野で認められた方法を用いて、Ｈｂ濃度を決定する。
【００５７】
ＲＢＣを、０．４５μｍのタンジェンシャルフロー濾過を用いて６体積の０．９％塩化ナトリウムで洗浄し、その後、塩の濃度を減らすことによって細胞を溶解する。Ｈｂの抽出を、同じ膜を用いて行う。その細胞洗浄物を分析して、アルブミンについての分光光度アッセイによって血漿構成要素の除去を確かめる。その溶解産物を、冷却下で０．１６μｍの膜を介して処理して、Ｈｂを精製する。その精製されたＨｂを、滅菌の発熱性物質が除かれたもの（ｉｎ ａ ｓｔｅｒｉｌｅ ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ）で収集し、次に限外濾過してウイルスを除去する。さらなるウイルス低減工程（溶媒／洗剤処理、ナノ濾過、およびアニオンＱ膜精製が挙げられる）が行われ得る。このプロセスにおける全ての工程は、２℃〜１５℃で実施する。
【００５８】
溶解産物由来のＨｂを、３０ｋＤの膜を用いて、リンゲル液（「ＲＬ」）、またはリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」、ｐＨ７．４）に交換する。上記Ｈｂを、１．１ｍＭ〜１．５ｍＭ（四量体において）まで濃縮する。１０体積〜１２体積のＲＬまたはＰＢＳを溶媒交換のために使用する。このプロセスを、２℃〜１５℃で実施する。ＲＬまたはＰＢＳにおいて調製される上記溶液のｐＨを、チオール化の前に８．０に調整する。上記Ｈｂを、０．４５μｍまたは０．２μｍのディスポーザブルフィルターカプセルを介して滅菌濾過し、化学改変反応が行われる前に４±２℃で保存する。
【００５９】
２． 上記ＳＦＨのチオール化
上に記載されるように調製されたＳＦＨを用いて、チオール化を、Ｈｂに対して８倍未満のモル濃度過剰の２−ＩＴを用いて実施する。その比および反応時間を、ＰＥＧ結合体化についてのチオール基の数を最大限にするため、および生成物の不均一性を最小限にするために最適化する。ＲＬ（ｐＨ７．０〜８．５）、ＰＢＳ、または任意の同様のバッファーにおける、おおよそ１ｍＭのＨｂ（四量体）を、同じバッファーにおいて、８ｍＭ未満の２−ＩＴと組み合わせる。この混合物を、１０±５℃で６時間未満、連続して撹拌する。
【００６０】
ジチオピリジン比色定量アッセイ（Ａｍｐｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９６９，３２：１６３−１６９）を、チオール化の前および後に、および次に、再度Ｈｂ−ＰＥＧ結合体化の後に、上記Ｈｂ四量体の表面上の利用可能なチオール基の数を測定するために使用する。ヒトＨｂは、β９３システイン残基に２つの内因性の反応性チオール基を含み、それは、ジチオピリジン反応によって確認される。１：＜８（ＳＦＨ：２−ＩＴ）の比でのＳＦＨのチオール化後、反応性のチオール基の数は、２個のチオールから７個超のチオールまで増加する。
【００６１】
実施例２
ＰＥＧ−Ｍａｌに対するＨｂの結合体化
出発四量体Ｈｂの濃度に対して１００％の末端活性に基づく、１５倍未満のモル濃度過剰のＰＥＧ−Ｍａｌを用いて、ＰＥＧ−Ｍａｌを実施例１からのチオール化Ｈｂに結合体化する。上記Ｈｂをまず、そのＨｂを酸素化するように大気と平衡させる。ＲＬ（ｐＨ７．０〜８．５）、ＰＢＳ、または任意の同様のバッファーにおける、おおよそ１ｍＭのチオール化Ｈｂを、同じバッファーにおいて、１５ｍＭ未満のＰＥＧ−Ｍａｌと組み合わせる。この混合物を、１０±５℃で６時間未満、連続して撹拌する。
【００６２】
ＰＥＧ−Ｈｂ結合体を、７０ｋＤの膜を介して処理して（すなわち、＜０の体積濾過（＜０−ｖｏｌｕｍｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ））、未反応の試薬を除去する。このプロセスを、５４０ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるサイズ排除液体クロマトグラフィー（「ＬＣ」）によってモニターする。その濃度を４ｇ／ｄｌ Ｈｂに調整し、そのｐＨを６．０±７．８に調整する。
【００６３】
その最終ＰＥＧ−Ｈｂ結合体生成物を、４±２℃で、０．２μｍの滅菌ディスポーザブルカプセルを用いて滅菌濾過し、滅菌の発熱性物質が除かれた管に収集する。上記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体を、４ｇ／ｄｌのＲＬに希釈し、そのｐＨを７．４±０．２のｐＨに調整し、次に滅菌濾過（０．２μｍ）し、内毒素を含まない滅菌容器に等分する。
【００６４】
実施例３
上記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の特徴づけ
１． 生理化学的な分析のための方法論
上記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の均質性および分子サイズを、ＬＣによって特徴づけて、未反応のＰＥＧ−Ｍａｌの除去を評価する。その溶出物におけるＨｂの量を、５４０ｎｍにおける吸光度をモニターすることによって決定する。これは、それらの分子量の違いに基づくピークの位置によって未反応のＨｂからＰＥＧ−Ｈｂ結合体を分離（ｒｅｓｏｌｖｅ）する。その溶出物における未反応のＰＥＧ−Ｍａｌの量を２８０ｎｍにおける吸光度をモニターすることによって決定する。これにより、遊離ＰＥＧ−ＭａｌからＰＥＧ−Ｈｂ結合体が分離される。その遊離ＰＥＧ−Ｍａｌは、ＰＥＧ−Ｍａｌにおけるマレイミド環の構造に起因するスペクトルのうちの紫外（「ＵＶ」）領域において吸収する。
【００６５】
ラピッドスキャンダイオードアレイ分光光度計を用いてソーレーおよび可視領域における光学スペクトルを収集し、複数の構成要素の分析によりＨｂ濃度およびｍｅｔＨｂ％を分析する。
【００６６】
ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の濃度およびｍｅｔＨｂ％を、コオキシメーター（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて決定する。粘度を、レオメーター（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ，ＭＡ））を用いて決定する。コロイド浸透圧を、コロイドオスモメーター、Ｏｓｍｏｍａｔ ０５０（Ｇｏｎｏｔｅｃ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定する。酸素結合パラメーターを、Ｈｅｍｏｘ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＣＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ，ＰＡ）を用いて酸素平衡曲線から決定する。
【００６７】
２． ＰＥＧ−Ｈｂ結合体についての規格
本発明の例示的な血液代用物組成物についての規格を、下の表１に表す。
【００６８】
【表１】
上に明記される実施例は、上記組成物の好ましい実施形態をどのように作製および使用するかの完全な開示および記載を当業者に与えるために提供され、それらは、本発明者らが、自らの発明としてみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。上に記載される様式の改変（本発明を実施するために、当業者に明らかである改変）は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもこのような刊行物、特許、および特許出願のそれぞれが、具体的および個々に本明細書中で参考として援用されることが示しているかのごとく、本明細書中で参考として援用される。
【００６９】
（項目１）
ポリエチレングリコール結合体化ヘモグロビン（「ＰＥＧ−Ｈｂ」）を調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）水性希釈剤中でヘモグロビン（Ｈｂ）を２−イミノチオラン（２−ＩＴ）と混合してチオール化Ｈｂを形成する工程であって、ここで該２−ＩＴは、該Ｈｂ濃度よりも、該希釈剤中７モル濃度過剰と８モル濃度過剰との間の濃度で存在する、工程；および
ｂ）該水性希釈剤中でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−マレイミド（Ｍａｌ）を該チオール化Ｈｂに加えてＰＥＧ−Ｈｂ結合体を形成する工程であって、ここで該ＰＥＧ−Ｍａｌは、該Ｈｂ濃度よりも、該希釈剤中９モル濃度過剰と１５モル濃度過剰との間の濃度で存在し、ここで該ＰＥＧ−Ｍａｌは、４，０００ダルトン（Ｄａ）と６，０００ダルトン（Ｄａ）との間の平均分子量を有する、工程、を含み；
ここで該ＰＥＧ−Ｈｂ結合体は、１Ｈｂ当たり平均７．１個と８．９個との間のＰＥＧ分子を含む、
方法。
【００７０】
（項目２）
前記２−ＩＴが、前記Ｈｂ濃度よりも、前記希釈剤中７．５モル濃度過剰の濃度で存在する、項目１に記載の方法。
【００７１】
（項目３）
前記ＰＥＧ−Ｍａｌが、前記Ｈｂ濃度よりも、前記希釈剤中１２モル濃度過剰の濃度で存在する、項目１に記載の方法。
【００７２】
（項目４）
前記ＰＥＧ−Ｍａｌが、５，０００Ｄａの平均分子量を有する、項目１に記載の方法。
【００７３】
（項目５）
本質的に同一の条件下で測定される場合、前記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体が有する、前記Ｈｂが５０％飽和されるものである酸素分圧（ｐ５０）は、同等の供給源由来の天然のストローマフリーのヘモグロビンよりも小さい、項目１に記載の方法。
【００７４】
（項目６）
前記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の前記ｐ５０が、１０ミリメートル水銀柱（ｍｍＨｇ）未満である、項目５に記載の方法。
【００７５】
（項目７）
前記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の前記ｐ５０が、４ｍｍＨｇと８ｍｍＨｇとの間である、項目５に記載の方法。
【００７６】
（項目８）
工程ａ）が７と９との間のｐＨで実施される、項目５に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール結合体化ヘモグロビン（「ＰＥＧ−Ｈｂ」）を調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）水性希釈剤中でヘモグロビン（Ｈｂ）を２−イミノチオラン（２−ＩＴ）と混合してチオール化Ｈｂを形成する工程であって、ここで該２−ＩＴは、該Ｈｂ濃度よりも、該希釈剤中７モル濃度過剰と８モル濃度過剰との間の濃度で存在する、工程；および
ｂ）該水性希釈剤中でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−マレイミド（Ｍａｌ）を該チオール化Ｈｂに加えてＰＥＧ−Ｈｂ結合体を形成する工程であって、ここで該ＰＥＧ−Ｍａｌは、該Ｈｂ濃度よりも、該希釈剤中９モル濃度過剰と１５モル濃度過剰との間の濃度で存在し、ここで該ＰＥＧ−Ｍａｌは、４，０００ダルトン（Ｄａ）と６，０００ダルトン（Ｄａ）との間の平均分子量を有する、工程；を含み、
ここで、該ＰＥＧ−Ｈｂ結合体は、１Ｈｂ当たり平均７．１個と８．９個との間のＰＥＧ分子を含み；ならびに
ここで該ＰＥＧ−Ｈｂ結合体は、より高いモル濃度比の２−ＩＴまたはＰＥＧ−Ｍａｌを用いて調製されるＰＥＧ−Ｈｂ結合体よりも狭い分子量分布を有する、
方法。
【請求項２】
前記２−ＩＴが、前記Ｈｂ濃度よりも、前記希釈剤中７．５モル濃度過剰の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＥＧ−Ｍａｌが、前記Ｈｂ濃度よりも、前記希釈剤中１２モル濃度過剰の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＥＧ−Ｍａｌが、５，０００Ｄａの平均分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
本質的に同一の条件下で測定される場合、前記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体が有する、前記Ｈｂが５０％飽和されるものである酸素分圧（ｐ５０）は、同等の供給源由来の天然のストローマフリーのヘモグロビンよりも小さい、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の前記ｐ５０が、１０ミリメートル水銀柱（ｍｍＨｇ）未満である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の前記ｐ５０が、４ｍｍＨｇと８ｍｍＨｇとの間である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）が７と９との間のｐＨで実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項１】
ポリエチレングリコール結合体化ヘモグロビン（「ＰＥＧ−Ｈｂ」）を調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）水性希釈剤中でヘモグロビン（Ｈｂ）を２−イミノチオラン（２−ＩＴ）と混合してチオール化Ｈｂを形成する工程であって、ここで該２−ＩＴは、該Ｈｂ濃度よりも、該希釈剤中７モル濃度過剰と８モル濃度過剰との間の濃度で存在する、工程；および
ｂ）該水性希釈剤中でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−マレイミド（Ｍａｌ）を該チオール化Ｈｂに加えてＰＥＧ−Ｈｂ結合体を形成する工程であって、ここで該ＰＥＧ−Ｍａｌは、該Ｈｂ濃度よりも、該希釈剤中９モル濃度過剰と１５モル濃度過剰との間の濃度で存在し、ここで該ＰＥＧ−Ｍａｌは、４，０００ダルトン（Ｄａ）と６，０００ダルトン（Ｄａ）との間の平均分子量を有する、工程；を含み、
ここで、該ＰＥＧ−Ｈｂ結合体は、１Ｈｂ当たり平均７．１個と８．９個との間のＰＥＧ分子を含み；ならびに
ここで該ＰＥＧ−Ｈｂ結合体は、より高いモル濃度比の２−ＩＴまたはＰＥＧ−Ｍａｌを用いて調製されるＰＥＧ−Ｈｂ結合体よりも狭い分子量分布を有する、
方法。
【請求項２】
前記２−ＩＴが、前記Ｈｂ濃度よりも、前記希釈剤中７．５モル濃度過剰の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＥＧ−Ｍａｌが、前記Ｈｂ濃度よりも、前記希釈剤中１２モル濃度過剰の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＥＧ−Ｍａｌが、５，０００Ｄａの平均分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
本質的に同一の条件下で測定される場合、前記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体が有する、前記Ｈｂが５０％飽和されるものである酸素分圧（ｐ５０）は、同等の供給源由来の天然のストローマフリーのヘモグロビンよりも小さい、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の前記ｐ５０が、１０ミリメートル水銀柱（ｍｍＨｇ）未満である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＥＧ−Ｈｂ結合体の前記ｐ５０が、４ｍｍＨｇと８ｍｍＨｇとの間である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）が７と９との間のｐＨで実施される、請求項５に記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１３−５２０５１２（Ｐ２０１３−５２０５１２Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５５１０５（Ｐ２０１２−５５５１０５）
【出願日】平成２３年２月２３日（２０１１．２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２５８８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０６３９６
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５０４２６７１１６）サンガート， インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２３日（２０１１．２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２５８８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０６３９６
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５０４２６７１１６）サンガート， インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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