低い数の精子細胞を有する哺乳動物の性特異的受精
【課題】
雌雄識別された受精を、より低い投与量で、現実的な商業環境の下で作動する様式において達成すること。
【解決手段】
予め決定された性を有する哺乳動物を産生する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ．哺乳動物の種の雄から精子細胞を収集する工程；
ｂ．複数の該精子細胞の性特徴を決定する工程；
ｃ．該その性特徴の決定に従って、該精子細胞を選別する工程；
ｄ．代表的な未選別の人工受精サンプルと比較して、該精子細胞の数の約１０％〜約５０％を有する選別された人工受精サンプルを確立する工程；
ｅ．該選別された人工受精サンプルを該哺乳動物の該種の雌に挿入する工程；
ｆ．少なくとも１つの卵を、該代表的な未選別の人工受精投与量に対して統計学的比較可能な成功レベル（ｐ＞０．１）で、該哺乳動物の該種の該雌内に受精させる工程；および
ｇ．所望の性の子孫哺乳動物を産生する工程、
を包含する、方法。
雌雄識別された受精を、より低い投与量で、現実的な商業環境の下で作動する様式において達成すること。
【解決手段】
予め決定された性を有する哺乳動物を産生する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ．哺乳動物の種の雄から精子細胞を収集する工程；
ｂ．複数の該精子細胞の性特徴を決定する工程；
ｃ．該その性特徴の決定に従って、該精子細胞を選別する工程；
ｄ．代表的な未選別の人工受精サンプルと比較して、該精子細胞の数の約１０％〜約５０％を有する選別された人工受精サンプルを確立する工程；
ｅ．該選別された人工受精サンプルを該哺乳動物の該種の雌に挿入する工程；
ｆ．少なくとも１つの卵を、該代表的な未選別の人工受精投与量に対して統計学的比較可能な成功レベル（ｐ＞０．１）で、該哺乳動物の該種の該雌内に受精させる工程；および
ｇ．所望の性の子孫哺乳動物を産生する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は、一般的に、哺乳動物子孫の性選択の分野に関する。本発明は特に、所望の性の子孫を生成するための低用量人工受精の局面および卵生成の増加の局面に関連する。詳細には、本発明は、選別技術、人工受精時および増加した排卵の結果となる技術での性特異的かつ低用量の努力のためにフローサイトメトリーを介して精子を選別するためのシステム、などにかかわらず、低投与量での、雌雄識別した（ｓｅｘｅｄ）人工受精を達成することに関する。
【背景技術】
【０００２】
（従来の技術）
長期間の間、特定の子孫の性を選択することが所望されている。明らかな心理学的局面を超えて、哺乳動物子孫の実際の性選択は、食料生産動物（例えば、畜牛）ならびに有名な優勝動物（例えば、ウマ）などへのその適用を考える場合には、有意な経済的意義を有する。この大きな望みは、性が選択された子孫を達成するための有意な種々の努力となっている。おそらく、所望の結果を達成する可能性が最も高いようであった努力は、受精の前にＸ精子とＹ精子との間の選別および選択をする際の努力であった。
【０００３】
Ｘ精子とＹ精子とを選別する際の努力が直面した難題の１つは、関与する精子の数が大きいことである。自然受精では、精子は、数種においては、数十億で生産される；しかし、人工受精なしでは、依然として有意に大きな数の精子が用いられる。例えば、人工受精技術は、通常、１０００万〜５０億個（種に依存する）の精子を使用する。従って、有意な数の精子が、人工受精の環境においてさえも、必要である。
【０００４】
多くの方法が、Ｘ染色体を保有する精子とＹ染色体を保有する精子との分離を達成するために試みられている。これらの方法は、米国特許第４２７６１３９号に開示されて現れるような磁気的技術から、米国特許第５５１４５３７号に開示されて現れるような柱状技術、米国特許第３８９４５２９号、再発行特許第３２３５０号、米国特許第４０９２２２９号、同第４０６７９６５号、および同第４１５５８３１号に考察されるような重量計測技術までの範囲にわたっている。電気的特性はまた、Ｕ．Ｓ．４０８３９５７に示されるように、ならびに電気的特性と重量測定特性との組合せは米国特許第４２２５４０５号、同第４６９８１４２号、および同第４７４９４５８号に考察されるように試みられている。運動性の努力もまた、米国特許第４００９２６０号および同第４３３９４３４号に示されるように試みられている。米国特許第４５１１６６１号および同第４９９９２８３号（モノクローナル抗体を含む）、ならびに米国特許第５０２１２４４号、同第５３４６９９０号、同第５４３９３６２号、および同第５６６０９９７号（膜タンパク質を含む）、ならびに米国特許第３６８７８０３号、同第４１９１７４９号、同第４４４８７６７号、および同第４６８０２５８号（抗体を含む）に示すような化学的技術、ならびに米国特許第４０８５２０５号に示すような血清成分の添加。これらの技術の各々は、効率が高いかのように示されているが、実際は現時点では、これらの技術はいずれも所望のレベルの性予備選択を生じない。しかし、分離技術が最終的に用いられるにかかわらず、天然に存在する精子が多数であること、およびＸ染色体を保有する精子とＹ染色体を保有する精子とを分離するアプローチの競合する組合せは、より少数の精子を用いて受精を達成する能力を開発することを望ましくしている。
【０００５】
現時点では、フローサイトメトリーの技術を介する精子の個々の分別および分離を含む、Ｘ染色体保有精子とＹ染色体保有精子との分離を達成するために用いられる唯一の定量的技術が存在している。この技術は、Ｘ染色体保有精子およびＹ染色体保有精子の差示的色素吸収を含む進歩および発見の結果として可能であるようであった。これは、米国特許第４３６２２４６号において最初に考察され、そして米国特許第５１３５７５９号においてＬａｗｒｅｎｃｅ Ｊｏｈｎｓｏｎにより開示される技術を通して有意に拡大された。フローサイトメトリーを利用してＸ染色体保有精子とＹ染色体保有精子とを分離するＪｏｈｎｓｏｎの技術は、このような精子の商業的分離を初めて可能にした、非常に有意な進歩であった。依然として実験的であるとはいえ、分離は、高速フローサイトメーター（例えば、Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．により製造されるＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメーター）の利用により有意に増強され、そして米国特許第５１５０３１３号、同第５６０２０３９号、同第５６０２３４９号、および同第５６４３７９６号、ならびに国際ＰＣＴ特許公開ＷＯ９６／１２１７１を含む種々の他の特許に考察された。ＣｙｔｏｍａｔｉｏｎのＭｏＦｌｏ（登録商標）サイトメーターの利用は、速度が大いに増加するのを可能にし、一方、これらの速度の増加は、しばしば使用される精子が多数であることを考慮すれば特に適切であるが、特定の問題が依然として残っている。ＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメーターによる可能な速度のほぼ１０倍の進歩にもかかわらず、さらにより短い分別時間がいくつかの理由から望まれている。最初に、実際問題として、精子は時間が重要な細胞であることが発見された。これらは、使用されないままの時間が長いほど、それらの有効性を失う。第２に、収集、分別、および受精のタイミングは、速度を商業的に非常に重要な項目にした。従って、精子細胞およびプロセスにとって時間が重要であるという性質は、速度を高い効力および成功率を達成する際の必須の要素とした。
【０００６】
他の問題がまた、実用的な問題から仮想的な問題までの範囲で存在する。実用的側面では、安価な使い捨て構成要素および物質を用いて、雌雄識別した精子サンプルを達成することが所望された。また、費用の側面では、できる限り効率的な労力の結果で選別（ならびに収集および受精）を達成し得ることが所望された。従って、この分野での商業的生産および成功のために、効率の増加のみを示し得る改良が依然として重要であり得る。費用の実用的局面に関連するのは、プロセス全体の繊細さおよび感度の実用的局面である。このことについては、このプロセスを単純化し、そして手順についてできる限り強健にし、その結果、操作者の誤りまたは技術が減りつづける役割を果たし得ることが所望されている。彼らはまた、組み合わさって、より低い投与量での受精をさらにより望ましいものとした。
【０００７】
このプロセスの繊細さに加えて、精子自体が非常に繊細な細胞であることが常に公知であった。この因子は一見したところでは、容易に理解されるとみなされ得るように見えるが、実際は、この細胞の全部の程度の感度は未だに充分には調査されていない。一般にフローサイトメトリーの状況では、大部分の選別された細胞または粒子は、しばしば球状であるか、さもなければ種々の乱用に身体的に抵抗し得る。これは、精子細胞については事実ではない。実際、本発明が開示するように、通常のフローサイトメーター技術を介するプロセシングは、実際に、特定の適用において精子細胞のサイトメトリー選別に受け入れられないかもしれない。感度は、希釈の問題、および各々の細胞を個々に単離し、そして区別するためのフローサイトメーターの固有の必要性、ならびに代表的なフローサイトメトリーが、本発明の以前に、選別した細胞または他の物質に付与した圧力および他のストレスにわたった。これはまた、精子細胞の独特の因子を示し得る。なぜなら、精子細胞がフローサイトメーターを通過し得るようであり、そして肉眼的に識別可能な副作用を有さずに選別し得たとしても、実際は、この細胞自体は、受精プロセスにおいて最適より劣って機能するという点でストレスが与えられ得るようであるからである。従って、因子の相互作用が関連するように見え、そして精子細胞選別の見込みおよび人工受精のための最終的な使用から通常でない問題を生じた。
【０００８】
（Ｊｏｈｎｓｏｎの特許および関連技術により達成された大きな進歩にもかかわらず）残っている別の問題は、本発明の前には、使用される分離技術にかかわらず、雌雄識別した精子を用いて、より低い投与量の受精を達成することが極めて困難であったという事実である。歴史的に、低用量受精はいくらか達成されているが、商業的適用において経験されるようであるかまたは適用可能であるような環境ではなく、理論的または実験室的環境では、より多いようであった。このことについて、要望は、低用量受精を達成することだけでなく、むしろ現在の、雌雄識別していない高投与量人工受精努力と匹敵する妊娠成功率で低用量受精を達成することであった。従って、雌雄識別され、かつ低用量の両方である人工受精において本発明者らによって達成された進歩は、初めて、商業的適用を可能にし得る有意な進歩を示す。
【０００９】
（さらに、Ｊｏｈｎｓｏｎの特許および関連する技術による大きな進歩にもかかわらず）産業界の当業者が直面した別の問題は、この問題自体が、すなわち、高い成功率での人工受精が、多数の因子が相互作用するようである統計学的性質の１つであるという事実である。従って、提案される解決策は、ある程度、徹底的に統計学的に研究した場合に、単独または他の因子との組み合わせのいずれかで必要であることが示される因子の組合せを含み得る。このような決定はさらに、結果自体が種によって変化するという事実によって妥協され、そして大きな充分なデータベースに対する検定および統計学的サンプリングが最初の段階での努力に見合わないようであるという事実のために確認することが困難であり得る。これらの理由から、本発明はまた、個々でまたは組合せで、所定の適用のために適切な溶液を示し得る因子の組合せを含み得る。従って、この開示は、開示される技術の種々の組合せおよび普及が達成され得るために充分に広いとみなされる。未知の相乗作用が他の因子について存在し得る。このような因子は、選別またはおそらくフローサイトメーター工程における因子から、収集工程および受精工程における因子の範囲であり得る。現在、研究は主にウシの種において達成されているが、これらの技術がこのような種に限定される、またはこのような問題が精子細胞のみに限定されるとは考えられない。使用される技術が、選別されるいずれかの感受性部材を含む領域へのまさに精子細胞を超える適用、またはこの部材が選別された際のフローサイトメトリーのストレスの影響の単なる最小化を有し得るようである。
【００１０】
興味深いことに、本発明は、精子細胞に対する選別の影響またはストレスを最小にするためのアプローチをとるが、他者は、速度および他のこのような性能についての圧力および要求を増加させることにより、実際にはこの方向からはなれて行動したようである。本質的に、個々の、またはおそらく相互に関連した様式での、低用量受精および高速プロセシングのための動因は、互いに制限される問題を与えるかもしれない。従って、長い間感じられていたが満足されていない、高速で雌雄識別した低用量受精についての必要性が存在しており、そして実行する技術および要素が長い間利用可能であるが、本発明の前には、進歩またはおそらく進歩の組合せは、当業者によって明らかに見落とされていた。おそらく、ある程度まで、当業者は、この問題が、因子の相互作用、およびこの分野に関与する型の細胞（精子細胞またはおそらく種特異的精子細胞）についての特有の必要性を含むことを認識できなかった。興味深いことに、本考察における先の努力のリストが示すように、実質的な試みが行われたが、これらはこのような領域において雌雄識別した低用量受精として固有の問題を明らかに理解できず、そしておそらく自然種付け事象はおそらく数十億の精子を含むので、４桁も数が少ない数での人工受精の達成についての物理的制限が存在し得ると仮定された。従って、ある程度は、本発明者らが行った技術方向とは実際の逆の教示（ｔｅａｃｈ ａｗａｙ）が存在したことは、驚くべきことではないかもしれない。おそらく、この結果はさらに、ある程度まで予期されないとみなされ得る。なぜなら、この結果は、雌雄識別された低用量の人工受精が、雌雄識別していない高用量の人工受精の成功率と匹敵し得る成功率で達成され得ることを示したからである。本発明の技術および進歩を実際に組合せて、示された大きな結果が達成されることはある人にとってはさらに驚くべきことであり得る。各技術が、単離において、ある人によっては驚きではないと概説され得るとはいえ、実際は、単独で考慮されても、または他のわずかな変更との組合せで考慮されても、わずかな変更が最終的な結果に有意な進歩を与えるようである。
【００１１】
従って、本発明までは、雌雄識別した低用量人工受精についての成功率の達成は、必要な性能のレベルでは、または商業的実施を達成するために必要であるようである単純化された手順では、可能でなかった。しかし、今までに達成された商業的レベルの雌雄識別した低用量受精を超えて、本発明はまた、改善された性能の達成を可能にし、従って、所望される最終結果、すなわち、商業ベースでの雌雄識別した低用量人工受精を容易にする、技術を開示する。
【００１２】
（ＩＩＩ．発明の開示）
従って、本発明は、商業的レベルでの低用量受精および哺乳動物の性を予め決定するために適用されるような結果の達成を請求する。本発明はまた、フローサイトメーター分離技術を通してそれらの性を決定するための、精子細胞の選別のための改善されたシースシステムおよびコレクターシステムを提供する。この分離技術では、フローサイトメーターにおいて代表的に使用されるようなシース液は、精子細胞が選別されるときの精子細胞に対するストレスを最小にする流体で置換される。さらに、収集システムを改良して精子細胞が受ける物理的ストレスおよび化学的ストレスの両方を最小にする。種々の技術および物質が示されるが、当業者が容易に理解するように、種々の組合せおよび置換が、特定のプロセシング適用において関与する種、分離技術、目的、および他のパラメーターに基づく性能に最適化され得る様式で用いられ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の目的は、雌雄識別された受精を、より低い投与量で、現実的な商業環境の下で作動する様式において単に達成することである。目的はまた、物質（例えば、精子細胞）についてのより良好な選別を達成することである。関連する目的は、選別機能自体が細胞または選別され得る他の感受性部材に対して有する衝撃を最小にすることである。フローサイトメトリー選別技術について、具体的な目的は、シース液が細胞に与える衝撃を最小にし、そして関与する種々のストレスを扱う際に細胞を補助するように肯定的に作用するシース液を潜在的に提供することである。類似の目的は、一般的には精子細胞に、ウシ精子細胞に、ウマ精子細胞に、そしてＸ染色体保有構成要素およびＹ染色体保有構成要素へのこのような精子細胞の分離のために特に適切である物質および技術を提供することである。同様に、１つの目的は、収集期（例えば、選別後）が細胞に対して有する衝撃を最小にすること、ならびにこのような雌雄識別された精子細胞に対する物理的衝撃および化学的衝撃を最小にすることである。従って、１つの目的は、できる限り影響の少ない、選別の結果を達成することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、代表的な、雌雄識別していない高用量人工受精のレベルおよび成功率に匹敵するレベルおよび成功率を有する低用量の選別された受精を達成することである。この目的に一致して、目標は、商業的に実用的な様式でこの目的を達成し得る、人工受精についての全般的なシステムを提示することである。従って、精子細胞に対するストレスまたは潜在的な損傷を最小にするという先の目的は重要である。高速および低ストレスの両方の選別を提供し、そして低用量の状況での精子細胞選別に特に適応する様式の選別は、その上重要な目的である。精子の受精能に負に影響を与えず、かつ人工受精と適合するシース液および他の流体を提供するという目的もまた重要である。
【００１５】
当然、本発明のさらなる目的は、明細書および特許請求の範囲の他の領域を通して開示される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明によれば、予め決定された性を有する哺乳動物を産生する方法が提供され、この方法は、以下の工程：
ａ．哺乳動物の種の雄から精子細胞を収集する工程；
ｂ．複数の精子細胞の性特徴を決定する工程；
ｃ．その性特徴の決定に従って、精子細胞を選別する工程；
ｄ．代表的な人工受精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する工程；
ｅ．この受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する工程；
ｆ．哺乳動物の種の雌内の少なくとも１つの卵を、代表的な雌雄識別されていない人工受精投与量に対して統計学的比較可能な成功レベルで受精させる工程；
および
ｇ．所望の性の子孫哺乳動物を産生する工程、
を包含する。
【００１７】
１つの実施形態においては、哺乳動物の種の雌内の少なくとも１つの卵を、代表的な人工受精投与量に対して統計学的比較可能な成功レベルで受精させる上記工程が、この哺乳動物の種の雌内の少なくとも１つの卵を、少なくとも３５％、少なくとも４１％、少なくとも５０％、および少なくとも９０％からなる群より選択される成功レベルで受精させる工程を包含する。
【００１８】
１つの実施形態においては、哺乳動物の種の雄から精子細胞を収集する上記工程が、ウシおよびウマからなる群から選択される哺乳動物の種の雄から精子細胞を収集する工程を包含する。
【００１９】
１つの実施形態においては、代表的な人工受精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する上記工程が、代表的な雌雄識別されていない人工授精事象において提供される精子の代表的な数の１０％以下を有する受精サンプルを確立する工程を包含する。
【００２０】
１つの実施形態においては、代表的な人工受精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する上記工程が、１０万以下の精子細胞のウシ受精サンプル、２５万以下の精子細胞のウシ受精サンプル、３０万以下の精子細胞のウシ受精サンプル、１００万以下の精子細胞のウマ受精サンプル、５００万以下の精子細胞のウマ受精サンプル、１０００万以下の精子細胞のウマ受精サンプル、および２５００万以下の精子細胞のウマ受精サンプルからなる群より選択される受精サンプルを確立する工程を包含する。
【００２１】
１つの実施形態においては、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程、および哺乳動物の種の雌内の少なくとも１つの卵を、代表的な雌雄識別されていない人工受精投与量に対して統計学的比較可能な成功レベルで受精させる上記工程が、各々野外環境において達成される。
【００２２】
１つの実施形態においては、野外環境において、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程、および野外環境において哺乳動物の種の雌内の少なくとも１つの卵を代表的な雌雄識別されていない人工受精投与量に対して統計学的比較可能な成功レベルで受精させる上記工程が、有意な数の受精サンプルを、有意な数の哺乳動物の種の雌に、迅速に連続してかつ農場または牧場条件で反復的に挿入する工程を包含する。
【００２３】
１つの実施形態においては、上記哺乳動物が子宮角を有し、そして受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程が、受精サンプルを、同側および対側の両方で、哺乳動物の種の雌の子宮角内に挿入する工程を包含する。
【００２４】
１つの実施形態においては、上記哺乳動物が少なくとも１つの子宮角を有し、そして受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程が、受精サンプルを子宮角内に深く挿入する工程を包含する。
【００２５】
１つの実施形態においては、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程が、受精サンプルを子宮角内に深く挿入する工程をさらに包含する。
【００２６】
１つの実施形態においては、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程が、受精サンプルを、胎芽移植機器の使用によって子宮角内に挿入する工程をさらに包含する。
【００２７】
１つの実施形態においては、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程が、受精サンプルを、胎芽移植機器の使用によって子宮角内に挿入する工程をさらに包含する。
【００２８】
１つの実施形態においては、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程が、受精サンプルを、一般的に単一の人工受精に至適であると考えられている時間の１２時間後に挿入する工程を包含する。
【００２９】
１つの実施形態においては、代表的な人工授精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する上記工程が、凍結されていない受精サンプルを確立する工程を包含し、ここで、精子細胞を、その性特徴の決定に従って選別する上記工程を、選別時間で行い、そしてここで受精サンプルの少なくとも一部を、哺乳動物の雌種に挿入する上記工程を、選別時間から約１７時間より遅れずに行う。
【００３０】
１つの実施形態においては、代表的な人工授精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する上記工程が、凍結されていない受精サンプルを確立する工程を包含し、ここで、精子細胞をその性特徴の決定に従って選別する上記工程を、選別時間で行い、そしてここで受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の雌種に挿入する上記工程を、選別時間から約１０時間より遅れずに行う。
【００３１】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程が、細胞を、高濃度の染料を用いて染色する工程を包含する。
【００３２】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程が、細胞を、少なくとも約３８μＭ含量の染料を用いて染色する工程を包含する。
【００３３】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程、および精子細胞をその性特徴の決定に従って選別する上記工程が、以下の工程：
ａ．選別される細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．シース流体を化学的に調整して、細胞のためのシース流体環境を作製する工程であって、シース流体が、選別前細胞流体環境および選別後細胞流体環境の両方で調整される、工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
【００３４】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程、および精子細胞をその性特徴の決定に従って選別する上記工程が、以下の工程：
ａ．選別される細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．シース流体を化学的に調整して、細胞のためのシース流体環境を作製する工程であって、シース流体が、選別前細胞流体環境および選別後細胞流体環境の両方で調整される、工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
【００３５】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程、および精子細胞をその性特徴の決定に従って選別する上記工程が、以下の工程：
ａ．選別されるウシ精子細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．ウシ精子細胞のための、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含むシース流体を確立する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
【００３６】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程、および精子細胞をその性特徴の決定に従って選別する上記工程が、以下の工程：
ａ．選別されるウマ精子細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．ウマ精子細胞のための、ヘペス緩衝化培地を含むシース流体を確立する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
【００３７】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程、および精子細胞をその性特徴の決定に従って選別する上記工程が、以下の工程：
ａ．選別される細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．細胞のためのシース流体を確立する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集し、一方細胞を収集容器との衝撃から緩衝する工程、
を包含する。
【００３８】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程、および精子細胞をその性特徴の決定に従って選別する上記工程が、以下の工程：
ａ．選別されるウシ精子細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．ウシ精子細胞のためのシース流体を確立する工程；
ｃ．ウシ精子細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有するウシ精子細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の性特徴を有するウシ精子細胞を、上記収集工程を開始する前に約６％の卵黄を含むクエン酸収集液中で収集する、工程、
を包含する。
【００３９】
本発明の別の局面によれば、所望の性の哺乳動物を産生する方法が提供され、この方法は、上記プロセスを使用して上記哺乳動物を産生する工程を包含する。
【００４０】
１つの実施形態においては、上記方法は、精子細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【００４１】
１つの実施形態においては、上記方法は、排卵製剤を用いて、複数の卵の産生を生じる工程をさらに包含し、そしてここで哺乳動物の種の雌内の少なくとも１つの卵を、代表的な雌雄識別されていない人工受精投与量に対して統計学的に比較可能な成功レベルで受精する上記工程が、複数の卵を受精して、雌雄識別された複数の胚を産生する工程を包含する。
【００４２】
１つの実施形態においては、排卵製剤を用いて、複数の卵の産生を生じる上記工程が、１投与量の卵胞刺激ホルモンを一日に複数回注入する工程を包含する。
【００４３】
１つの実施形態においては、卵胞刺激ホルモンの投与量を一日に複数回注入する上記工程が、おおよそ半日の増分で、発情周期の９日目と１２日目との間の６、６、４、４、２、２、２、および２ｍｇの投与量レベルを含む卵胞刺激ホルモンを注入する工程を包含し、そして卵胞刺激ホルモンの第６および第７の投与量において、それぞれ２５および１２．５ｍｇのプロスタグランジンＦ−２−αを注入する工程をさらに包含する。
【００４４】
１つの実施形態においては、上記方法が、以下の工程：
ａ．雄哺乳動物の精子細胞を染色する工程；
ｂ．精子細胞の性に従って、高速フローサイトメトリーの使用によって選別する工程；および
ｃ．選別された精子細胞を濃縮する工程、
さらに包含する。
【００４５】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のための、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含むシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
【００４６】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、ウシ精子細胞を含む。
【００４７】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のための、ヘペス緩衝化培地を含むシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
【００４８】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、ウマ精子細胞を含む。
【００４９】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、そして約６％の卵黄を含むクエン酸コレクター流体を含む、コレクター、
を備える。
【００５０】
１つの実施形態においては、上記シース流体供給源が、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含む溶液を含む。
【００５１】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、ウシ精子細胞を含む。
【００５２】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源
；
ｂ．細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、そして流動に適合される容器
の物理的特徴を有する試験管を備える、コレクター、
を備える。
【００５３】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、機械的に繊細である細胞を含む。
【００５４】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、周囲の流体環境の化学的組成物に対して過応答受性である細胞を含む。
【００５５】
１つの実施形態においては、上記コレクターが、低用量の精子を提供するために使用される。
【００５６】
１つの実施形態においては、上記ノズル、上記発振器、上記細胞感受システム、および上記ソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの部分であり、そしてここでこのフローサイトメーターシステムが、高速セルソーターを備える。
【００５７】
１つの実施形態においては、上記ノズル、上記発振器、上記細胞感受システム、および上記ソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの部分であり、そしてここでこのフローサイトメーターシステムが、高速セルソーターを備える。
【００５８】
本発明の別の局面によれば、雌雄識別された精子標本が提供され、この標本は、上記システムに従って産生される。
【００５９】
１つの実施形態においては、上記コレクターは、低用量の精子を提供するために使用される。
【００６０】
１つの実施形態においては、上記ノズル、上記発振器、上記細胞感受システム、および上記ソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの部分であり、そしてここでこのフローサイトメーターシステムが、高速セルソーターを備える。
【００６１】
１つの実施形態においては、上記コレクターは、低用量の精子を提供するために使用される。
【００６２】
本発明の別の局面によれば、上記のシステムに従って産生される雌雄識別された精子標本を使用して産生される、哺乳動物が提供される。
【００６３】
１つの実施形態においては、上記哺乳動物は、低用量の精子の使用によって産生される。
【００６４】
１つの実施形態においては、上記ノズル、上記発振器、上記細胞感受システム、および上記ソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの部分であり、そしてここでこのフローサイトメーターシステムが、高速セルソーターを備える。
【００６５】
１つの実施形態においては、上記哺乳動物は、低用量の精子の使用によって産生される。
【００６６】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための、改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する、細胞供給源；
ｂ．選別前および選別後の細胞流体環境の両方で調整されるように選択される、細胞のためのシース流体環境を作製する、化学的に調整されたシース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するために作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
【００６７】
１つの実施形態においては、上記選別前および選別後の細胞流体環境が、上記細胞が特に応答性である少なくとも１つの過応答性化学組成物を含み、そして上記化学的に調整されるシース流体供給源が、この過応答性化学的組成物に対する変化を最小化する。
【００６８】
１つの実施形態においては、上記過応答性化学的組成物が、代謝性化学的組成物を含む。
【００６９】
１つの実施形態においては、上記過応答性化学的組成物がクエン酸を含む。
【００７０】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、上記選別前細胞流体環境を作製し、そして上記コレクターが、上記選別後細胞流体環境を作製する。
【００７１】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が非修復細胞を含む。
【００７２】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、非転写ＤＮＡを有する細胞を含む。
【００７３】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、非複製ＤＮＡを有する細胞を含む。
【００７４】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、精子細胞を含む。
【００７５】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、ウシ精子細胞を含む。
【００７６】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、ウマ精子細胞を含む。
【００７７】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、シース流体環境中の化学的組成物に対して過応答受性である細胞を含む。
【００７８】
１つの実施形態においては、上記コレクターが、低用量の精子を提供するために使用される。
【００７９】
１つの実施形態においては、上記低用量の精子が、代表的な投与量の約１０％未満の投与量を含む。
【００８０】
１つの実施形態においては、上記精子細胞がウシ精子細胞を含み、そして上記低用量の精子が、約５０万未満の精子の投与量を含む。
【００８１】
１つの実施形態においては、上記精子細胞がウシ精子細胞を含み、そして上記低用量の精子が、約３０万未満の精子の投与量を含む。
【００８２】
１つの実施形態においては、上記精子細胞がウマ精子細胞を含み、そして上記低用量の精子が、約１０００万未満の精子の投与量を含む。
【００８３】
１つの実施形態においては、上記化学的に調整されたシース流体供給源が、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含む溶液を含む。
【００８４】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、ウシ精子細胞を含む。
【００８５】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のための、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含む溶液を含むシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
【００８６】
１つの実施形態においては、上記コレクターは、人工授精のための精子を提供するために使用される。
【００８７】
１つの実施形態においては、上記コレクターは、人工授精のための低用量の精子を提供するために使用される。
【００８８】
１つの実施形態においては、上記化学的に調整されたシース流体供給源が、ヘペス緩衝化培地を含む溶液を含む。
【００８９】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、ウマ精子細胞を含む。
【００９０】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサ
イトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のための、ヘペス緩衝化培地を含む溶液を含むシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
【００９１】
１つの実施形態においては、上記コレクターは、人工授精のための精子を提供するために使用される。
【００９２】
１つの実施形態においては、上記コレクターは、人工授精のための低用量の精子を提供するために使用される。
【００９３】
１つの実施形態においては、上記ノズル、上記発振器、上記細胞感受システム、および上記ソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの部分であり、そしてここでこのフローサイトメーターシステムが、高速セルソーターを備える。
【００９４】
１つの実施形態においては、上記高速セルソーターが、１秒あたり少なくとも約５００を選別する速度で、分析されるべき細胞を選別する。
【００９５】
１つの実施形態においては、上記高速セルソーターが、１平方インチあたり少なくとも約５０ポンドの圧力で操作される。
【００９６】
１つの実施形態においては、上記コレクターが緩衝要素を含む容器を備える。
【００９７】
１つの実施形態においては、上記容器が、広い収集管を備える。
【００９８】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべきウシ精子細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のための、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含むシース流体環境を作製する、化学的に調整されたシース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、約６％の卵黄を含むクエン酸収集流体を含み、そして約５０万未満の精子の投与量を提供するために使用される、コレクター、
を備え、
ここで、これらのノズル、発振器、細胞感受システム、およびソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの一部であって、このフローサイトメーターシステムが、１秒あたり少なくとも約５００を選別する速度で、分析されるべき精子細胞を選別し、そして１平方インチあたり少なくとも約５０ポンドの圧力で操作される。
【００９９】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべきウマ精子細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のための、ヘペス緩衝化培地を含むシース流体環境を作製する、化学的に調整されたシース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、ヘペス緩衝化培地を含む収集流体を含み、そして約１０００万未満の精子の投与量を提供するために使用される、コレクター、
を備え、
ここで、これらのノズル、発振器、細胞感受システム、およびソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの一部であって、このフローサイトメーターシステムが、１秒あたり少なくとも約５００を選別する速度で、分析されるべき細胞を選別し、そして１平方インチあたり少なくとも約５０ポンドの圧力で操作される。
【０１００】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための、改良されたフロー
サイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する、細胞供給源；
ｂ．細胞のためのシース流体環境と、選別前および選別後の細胞流体環境の両方との間の変化を最小化するための手段；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するために作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
【０１０１】
１つの実施形態においては、細胞のためのシース流体環境と選別前および選別後の細胞流体環境の両方との間の変化を最小化するための上記手段が、上記シース流体を含む。
【０１０２】
１つの実施形態においては、上記コレクターがコレクター流体を含み、そして細胞のためのシース流体環境と選別前および選別後の細胞流体環境の両方との間の変化を最小化するための上記手段が、このコレクター流体を含む。
【０１０３】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、そして化学的に調整されたコレクター流体シース流体共有源を備える、コレクターであって、このコレクター流体シース流体供給源が、以前の細胞流体環境で調整されるよう選択される、細胞のためのコレクター流体環境を作製する、コレクター、を備える。
【０１０４】
１つの実施形態においては、上記コレクター流体が、細胞の選別の完了後に栄養分のレベルを平均化するために調整される栄養分を含む。
【０１０５】
１つの実施形態においては、上記コレクター流体が、約６％の卵黄を含むクエン酸溶液を含む。
【０１０６】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、上記コレクター流体環境中の化学的組成物に対して過応答性である細胞を含む。
【０１０７】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が精子細胞を含む。
【０１０８】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源がウシ精子細胞を含む。
【０１０９】
１つの実施形態においては、上記コレクターが、低用量の精子を提供するために使用される。
【０１１０】
１つの実施形態においては、上記低用量の精子が、代表的な投与量の約１０％未満の投与量を含む。
【０１１１】
１つの実施形態においては、上記精子細胞がウシ精子細胞を含み、そして上記低用量の精子が、約５０万未満の精子の投与量を含む。
【０１１２】
１つの実施形態においては、上記精子細胞がウシ精子細胞を含み、そして上記低用量の精子が、約３０万未満の精子の投与量を含む。
【０１１３】
１つの実施形態においては、上記ノズル、上記発振器、上記細胞感受システム、および上記ソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの部分であり、そしてここで、このフローサイトメーターシステムが、高速セルソーターを備える。
【０１１４】
１つの実施形態においては、上記高速セルソーターが、分析されるべき細胞を、１秒あたり少なくとも約５００を選別する速度で選別する。
【０１１５】
１つの実施形態においては、上記高速セルソーターが、１平方インチあたり少なくとも約５０ポンドの圧力で操作される。
【０１１６】
１つの実施形態においては、上記シース流体供給源が、選別前および選別後の精子流体環境の両方で調整されるように選択される、細胞のためのシース流体環境を作製する、化学的に調整されたシース流体供給源を備える。
【０１１７】
１つの実施形態においては、上記化学的に調整されたシース流体供給源が、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含む溶液を含む。
【０１１８】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．緩衝要素を備えるコレクター、
を備える。
【０１１９】
１つの実施形態においては、上記コレクターが、上記緩衝要素を備える容器を備える。
【０１２０】
１つの実施形態においては、上記容器が広い収集管を備える。
【０１２１】
１つの実施形態においては、上記広い収集管が、少なくとも約１５ｍｍの幅である。
【０１２２】
１つの実施形態においては、上記容器が、流動に適合される容器の物理的特徴を有する試験管を備える。
【０１２３】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、機械的に繊細である細胞を含む。
【０１２４】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が精子細胞を含む。
【０１２５】
１つの実施形態においては、上記コレクターが緩衝要素を備える。
【０１２６】
１つの実施形態においては、上記コレクターが、上記緩衝要素を備える容器を備える。
【０１２７】
１つの実施形態においては、上記容器が広い収集管を備える。
【０１２８】
１つの実施形態においては、上記広い収集管が、少なくとも約１５ｍｍの幅である。
【０１２９】
１つの実施形態においては、上記容器が、流動に適合される容器の物理的特徴を有する試験管を備える。
【０１３０】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、機械的に繊細である細胞を含む。
【０１３１】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が精子細胞を含む。
【０１３２】
１つの実施形態においては、上記ノズル、上記発振器、上記細胞感受システム、および上記ソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの部分であり、そしてここで、このフローサイトメーターシステムが、高速セルソーターを備える。
【０１３３】
１つの実施形態においては、上記セルソーターが、１秒あたり少なくとも約５００を選別する速度で、分析されるべき細胞を選別する。
【０１３４】
１つの実施形態においては、上記高速セルソーターが、１平方インチあたり少なくとも約５０ポンドの圧力で操作される。
【０１３５】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための、改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する、細胞供給源；
ｂ．細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．細胞とコレクターとの間の衝撃を回避するための手段を備える、コレクター、
を備える。
【０１３６】
本発明の別の局面によれば、予め決定された性を有する哺乳動物を産生する方法が提供され、この方法は、以下の工程：
ａ．哺乳動物の雄の種から精子細胞を収集する工程；
ｂ．複数の精子細胞の性特徴を決定する工程；
ｃ．その性特徴の決定に従って精子細胞を選別する工程；
ｄ．代表的な人工受精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する工程；
ｅ．受精サンプルの少なくとも一部を、哺乳動物の雌種に挿入する工程；
ｆ．哺乳動物の雌種内の少なくとも１つの卵を受精させる工程；ならびに
ｇ．所望の性の子孫哺乳動物を産生する工程、
を包含する。
【０１３７】
１つの実施形態においては、哺乳動物の雄の種から精子細胞を収集する上記工程が、ウシおよびウマからなる群より選択される哺乳動物の雄の種から精子細胞を収集する工程を包含する。
【０１３８】
１つの実施形態においては、代表的な人工受精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する上記工程が、代表的な雌雄識別されていない人工授精事象において提供される精子の代表的な数の１０％以下を有する受精サンプルを確立する工程を包含する。
【０１３９】
１つの実施形態においては、代表的な人工受精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する上記工程が、１０万以下の精子細胞のウシ受精サンプル、２５万以下の精子細胞のウシ受精サンプル、３０万以下の精子細胞のウシ受精サンプル、１００万以下の精子細胞のウマ受精サンプル、５００万以下の精子細胞のウマ受精サンプル、１０００万以下の精子細胞のウマ受精サンプル、および２５００万以下の精子細胞のウマ受精サンプルからなる群より選択される受精サンプルを確立する工程を包含する。
【０１４０】
１つの実施形態においては、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程、および少なくとも１つの卵を哺乳動物の種の雌内で受精させる上記工程が、各々野外環境において達成される。
【０１４１】
１つの実施形態においては、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程が、受精サンプルを、胎芽移植機器の使用によって子宮角内に挿入する工程をさらに包含する。
【０１４２】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程が、細胞を、高濃度の染料を用いて染色する工程を包含する。
【０１４３】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程、およびその性特徴の決定に従って精子細胞を選別する上記工程が、以下の工程：
ａ．選別されるべき細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．選別前細胞流体環境および選別後細胞流体環境の両方で調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；ならびに
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
【０１４４】
本発明の別の局面によれば、所望の性の哺乳動物を産生する方法が提供され、この方法は、上記プロセスを使用して上記哺乳動物を産生する工程を包含する。
【０１４５】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【０１４６】
本発明の別の局面によれば、細胞を選別する方法が提供され、この方法は、以下の工程：
ａ．選別される細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．選別前および選別後の細胞流体環境の両方で調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の特徴を有する細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
【０１４７】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記細胞が上記シース流体に供される結果として供される化学的変化を最小化する工程をさらに包含する。
【０１４８】
１つの実施形態においては、細胞供給源を確立する上記工程が、非修復細胞の供給源を確立する工程を包含する。
【０１４９】
１つの実施形態においては、細胞供給源を確立する上記工程が、精子細胞の供給源を確立する工程を包含する。
【０１５０】
１つの実施形態においては、細胞供給源を確立する上記工程が、ウシ精子細胞の供給源を確立する工程を包含する。
【０１５１】
１つの実施形態においては、細胞供給源を確立する上記工程が、ウマ精子細胞の供給源を確立する工程を包含する。
【０１５２】
１つの実施形態においては、上記方法は、低用量の上記精子細胞を使用して哺乳動物を受精させる工程をさらに包含する。
【０１５３】
１つの実施形態においては、選別前および選別後の細胞流体環境の両方で調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する上記工程が、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含むシース流体を確立する工程を包含する。
【０１５４】
１つの実施形態においては、選別前および選別後の細胞流体環境の両方で調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する上記工程が、ヘペス緩衝化培地を含むシース流体を確立する工程を包含する。
【０１５５】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【０１５６】
１つの実施形態においては、細胞を高速で選別する上記工程が、細胞を１平方インチあたり少なくとも約５０ポンドの圧力に供する工程を包含する。
【０１５７】
１つの実施形態においては、所望の特徴を有する細胞を収集する上記工程が、上記細胞の上記収集容器との衝撃を緩衝する工程を包含する。
【０１５８】
１つの実施形態においては、細胞の収集容器との衝撃を緩衝する上記工程が、広い開口部をこの容器に提供する工程を包含する。
【０１５９】
本発明の別の局面によれば、細胞を選別する方法が提供され、この方法は、以下の工程：
ａ．選別されるべき細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を確立する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；
ｅ．所望の性特徴を有する細胞をコレクター流体において収集する工程；ならびに
ｆ．選別前流体環境で調整される、細胞のための終了コレクター流体環境を作製するために、このコレクター流体を化学的に調整する工程、
を包含する。
【０１６０】
１つの実施形態においては、細胞供給源を確立する上記工程が、細胞のための最初の栄養素を提供する工程を包含し、そしてさらに、細胞のための収集流体栄養素を提供する工程を包含し、そしてコレクター流体において所望の特徴を有する細胞を収集する上記工程が、細胞を収集する工程の完了後に、最初の栄養素とコレクター流体栄養素とを平衡化させる工程を包含する。
【０１６１】
１つの実施形態においては、コレクター流体において所望の特徴を有する細胞を収集する上記工程が、収集するこの工程を開始する前に、約６％の卵黄を含むクエン酸収集流体を確立する工程を包含する。
【０１６２】
１つの実施形態においては、細胞供給源を確立する上記工程が、ウシ精子細胞の供給源を確立する工程を包含する。
【０１６３】
１つの実施形態においては、上記方法は、低用量の上記精子細胞を使用して、哺乳動物を受精させる工程をさらに包含する。
【０１６４】
本発明の別の局面によれば、細胞を選別する方法が提供され、この方法は、以下の工程：
ａ．選別されるべき細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を確立する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；ならびに
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集する工程であって、細胞が収集容器と衝突することを緩衝する工程を包含する、工程、
を包含する。
【０１６５】
１つの実施形態においては、細胞が収集容器と衝突することを緩衝する上記工程が、この容器に広い開口部を提供する工程を包含する。
【０１６６】
１つの実施形態においては、細胞供給源を提供する上記工程が、機械的に繊細である細胞の供給源を確立する工程を包含する。
【０１６７】
１つの実施形態においては、細胞供給源を確立する上記工程が、精子細胞の供給源を確立する工程を包含する。
【０１６８】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【０１６９】
１つの実施形態においては、細胞を高速で選別する上記工程が、細胞を、１平方インチあたり少なくとも約５０ポンドの圧力に供する工程を包含する。
【０１７０】
本発明の別の局面によれば、雌雄識別された精子標本を産生する方法が提供され、この方法は、上記プロセスを使用して標本を作製する工程を包含する。
【０１７１】
１つの実施形態によれば、上記方法は、上記細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【０１７２】
１つの実施形態においては、上記方法は、低用量の上記精子細胞を使用して哺乳動物を受精させるための、雌雄識別された精子標本を提供する工程を、さらに包含する。
【０１７３】
１つの実施形態においては、上記方法は、低用量の精子細胞を使用して哺乳動物を受精させるための、雌雄識別された精子標本を提供する工程を、さらに包含する。
【０１７４】
本発明の別の局面によれば、所望の性別の哺乳動物を産生する方法が提供され、この方法は、上記プロセスのいずれかを使用して哺乳動物を産生する工程を包含する。
【０１７５】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【０１７６】
１つの実施形態においては、上記方法は、低用量の精子細胞を使用して、哺乳動物を受精させる工程をさらに包含する。
【０１７７】
１つの実施形態においては、上記方法は、低用量の精子細胞を使用して、哺乳動物を受精させる工程をさらに包含する。
【０１７８】
本発明の別の局面によれば、雌の哺乳動物から、雌雄識別された性を有する胚を複数産生する方法が提供され、この方法は、以下の工程：
ａ．複数の卵が産生されるために排卵製剤を使用する工程を包含する、少なくとも２つの卵を作製するために哺乳動物において過剰排卵を作製する工程；
ｂ．雄の哺乳動物の精子細胞の性を決定する工程；
ｃ．精子細胞の性に従って選別する工程；
ｄ．排卵の開始後に、雌の哺乳動物の子宮内に選別された精子細胞の少なくとも一部を挿入する工程；および
ｅ．雌雄識別された胚を複数産生するために、子宮中の複数の卵を受精させる工程、
を包含する。
【０１７９】
１つの実施形態においては、過剰排卵を作製する上記工程が、発情周期の間に促進される。
【０１８０】
１つの実施形態においては、排卵製剤を使用する上記工程が、排卵製剤を、発情周期の任意の２日目と１８日目との間、半日の増分で注入する工程を包含する。
【０１８１】
１つの実施形態においては、排卵製剤を半日の増分で注入する上記工程が、少なくとも７回の注射で注射する工程を包含し、そしてさらに少なくとも約６回目および７回目の注射の際に排卵操作システムを組み入れる工程を包含する。
【０１８２】
１つの実施形態においては、子宮内に選別された精子細胞の少なくとも一部を挿入する上記工程が、精子細胞を、この子宮の両方の子宮角に挿入する工程を包含する。
【０１８３】
１つの実施形態においては、両方の子宮角内に挿入する上記工程が、上記排卵の開始後約２０〜２４時間で精子細胞を挿入する工程を包含する。
【０１８４】
１つの実施形態においては、複数の卵が産生されるために排卵製剤を使用する上記工程が、１投与量の卵胞刺激ホルモンを１日複数回注入する工程を包含する。
【０１８５】
１つの実施形態においては、少なくとも２つの卵を作製するために哺乳動物において過剰排卵を作製する上記工程が、上記投与量の卵胞刺激ホルモンにプロスタグランジンＦ−２−αを補充する工程を包含する、排卵操作システムを組み入れる工程をさらに包含する。
【０１８６】
１つの実施形態においては、１日複数回卵胞刺激ホルモンの投与量を注入する上記工程が、上記発情期の９日と１２日との間の６、６、４、４、２、２、２、および２ｍｇの投与量レベルでの約半日の増分において卵胞刺激ホルモンを注入する工程を包含し、ここで、卵胞刺激ホルモンの投与量にプロスタグランジンＦ−２−αを補給する工程が、卵胞刺激ホルモンのそれぞれ第６および第７の投与量において、２５ｍｇおよび１２．５ｍｇのプロスタグランジンＦ−２−αを注入する工程を包含する。
【０１８７】
１つの実施形態においては、上記方法は、以下の工程：
ａ．雄の哺乳動物の精子細胞を染色する工程；
ｂ．高速フローサイトメトリーを使用して、精子細胞の性に従って選別する工程；および
ｃ．選別された精子細胞を濃縮する工程、
をさらに包含する。
【０１８８】
１つの実施形態においては、選別された精子細胞の少なくとも一部を挿入する上記工程が、低用量の精子細胞を使用する工程を包含する。
【０１８９】
１つの実施形態においては、選別された精子細胞の少なくとも一部を挿入する上記工程が、低用量の精子細胞を使用する工程を包含する。
【０１９０】
本発明の別の局面においては、所望の性の哺乳動物を産生する方法が提供され、この方法は、上記プロセスを使用して上記哺乳動物を産生する工程を包含する。
【０１９１】
本発明の別の局面においては、所望の性の哺乳動物を産生する方法が提供され、この方法は、上記プロセスを使用して、雌雄識別された精子細胞の哺乳動物を産生する工程を包含し、そして上記細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【０１９２】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記雌の哺乳動物を、低用量の精子細胞を使用して受精させる工程をさらに包含する。
【０１９３】
１つの実施形態においては、上記方法は、選別前および選別後の細胞流体環境の両方で調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する上記工程をさらに包含し、この工程は、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含むシース流体を確立する工程を包含する。
【０１９４】
１つの実施形態においては、選別前および選別後の細胞流体環境の両方で調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する上記工程が、ヘペス緩衝化培地含むシース流体を確立する工程を包含する。
【０１９５】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記性の精子細胞を収集する工程、および細胞が収集容器と衝突することを緩衝する工程を、さらに包含する。
【０１９６】
本発明の別の局面によれば、細胞を選別する方法が提供され、この方法は、以下の工程：
ａ．選別されるべき細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．選別前の細胞流体環境と選別後の細胞流体環境との両方によって調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
【０１９７】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【発明の効果】
【０１９８】
本発明によれば、雌雄識別された受精が、より低い投与量で、現実的な商業環境の下で作動する様式において達成される。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】図１は、本発明についてのフローサイトメーター分離技術によるソーターシステムの模式図である。
【図２】図２は、代表的なフローサイトメーターの自由落下領域において飛沫同伴した細胞の図である。
【図３】図３は、本発明の結果としてほぼ表れた差異を示す概念図である。
【図４】図４は、着陸帯領域において収集されるような選別した細胞流の図である。
【発明を実施するための形態】
【０２００】
みられるように、本発明の基本概念は、種々の方法において組み合わせられ、そして包含され得る。本発明は、単に、商業的に実用的な低用量、性交での受精およびこの結果を含む。フローサイトメトリ分離技術について、本発明はまた、改良されたフローサイトメーターシステム、ならびに人工受精およびこのような技術により産生される動物に使用され得る性特異的精子サンプルの作製についてのシステムの両方を含む。本発明は、高い成功率が商業的な環境においてでさえ可能である全体的なプロセスを含む。さらに、この技術は、一般的な様式で開示されるので、一旦、この一般的な原理が理解されると、これらの技術が特定のシステムおよび適用に適用され得る。デバイス増強が開示されるが、これらの増強は、特定の方法を達成するのみではなく、多数の方法において変動され、そして組み合わされ得ることが理解されるべきである。重要なことに、上記の全てに関して、これらの様相の各々が、本開示により包含されることが理解されるべきである。
【０２０１】
述べたように、基本的な目的は、Ｙ保有精子からＸ保有精子を分離することである。これは、各々を別々に包装し、そして処理し得るように、２つの型の精子を単離する様式において実行される。現在、この単離は、好ましくは、フローサイトメトリの使用を通じて実行される。一般にフローサイトメトリは、よく理解される技術である。例えば、それの基本的な局面は、Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．に対する種々の特許（例えば、米国特許および先に列挙された他の刊行物）において示され、そして議論される。これらの特許および本明細書中で引用される参考文献の各々は、参考として援用される；従って、当業者は、含まれる基本的な原理を容易に理解し得る。
【０２０２】
本質的に、フローサイトメトリは、いくつかの型の細胞供給源を通じてフローサイトメーター機器に提供された、選別する対象（例えば、細胞）を含む。概念的な機器を図１に示す。このフローサイトメーター装置は、フローサイトメーターにより分析される細胞またはいくつかの他の型の対象を確立するかまたは供給するように作用する、細胞供給源（１）を備える。この細胞は、細胞がシース液（３）により包囲されるような様式において、ノズル（２）内に蓄積される。このシース液（３）は、通常、この細胞供給源（１）がその細胞を供給し、このシース液（３）がノズル（２）を介して同時に給送されるような、いくらかのシース液源（４）により供給される。この様式において、このシース液（３）が細胞のためのシース液環境をどのように形成するか容易に理解され得る。種々の流体は、同じ圧力でフローサイトメーターに提供されるために、それらはノズル（２）から流出し、そしてノズル開口部（５）で出る。発振制御（１９）を通じて非常に正確に制御され得るいくつかの型の発振器（６）を提供することによって、気圧波は、ノズル（２）内に定着され、そしてノズル開口部（５）でのノズル（２）を出す流体に変換され得る。従って、発振器（６）は、シース液（３）に作用するために、ノズル開口部（５）を出る流動（７）は、最終的および調節的にドロップ（８）を形成する。細胞は、シース液環境に包囲されているので、ドロップ（８）は、それらの内部に個々の単離された細胞または他の対象を含み得る。
【０２０３】
ドロップ（８）は一般に、単離された細胞を含むために、このフローサイトメーターは、適切な細胞（単数または複数）がドロップ内に含まれるか否かに基づいて液滴を区別し、そして分離し得る。これは、細胞感受システム（９）を通じて達成される。この細胞感受システムは、Ｌａｒｒｙ Ｊｏｈｎｓｏｎ、すなわち、米国特許第５１３５７５９号による独創的な研究（語呂合わせは意図されない）の長さで議論されるように、各ドロップ（８）内に含まれる細胞に応答する少なくともいくつかの型のセンサー（１０）を備える。Ｊｏｈｎｓｏｎ特許が精子細胞を説明するように、この細胞感受システム（９）は、レーザー励磁機（１１）のようないくつかの刺激により励磁され得る特定の色素の相対的な存在または相対的な非存在に依存する作用を生じ得る。各々の型の精子細胞は、この色素により染色されるが、Ｘ染色体およびＹ染色体の異なる長さは、異なるレベルの染色を生じる。従って、精子細胞中に存在する色素の程度を検出することによって、それらの異なる発光レベルによりＸ保有精子とＹ保有精子との間を識別することが可能である。
【０２０４】
フローサイトメーター分離技術において適切な細胞の究極的な分離および単離を達成するために、センサー（１０）により受け取られるシグナルは、いくつかの型のソーター識別システム（１２）に送り込まれ、このシステムは、非常に迅速に決定を行い、そして所望の細胞がドロップ（８）内に存在するか否かの決定に基づいて各ドロップ（８）を差示的に荷電し得る。この様式において、このソーター識別システム（１２）は、それらが適切な細胞または他の対象を含むか否かに基づいて、静電気的な偏向プレート（１３）が、ドロップ（８）を偏向させることを許容するように作用する。結果として、このフローサイトメーターは、細胞を１つ以上のコレクター（１４）に収集させることによって、細胞を分類するように作用する。従って、細胞または他の対象のいくつかの性質を感受することによって、このフローサイトメーターは、特定の特徴に基づく細胞間を識別し、そして適切なコレクター（１４）に細胞を配置する。精子を分類するために現在使用されるシステムにおいて、Ｘ保有精子液滴は、正に荷電され、従って、１つの方向へ偏向し、Ｙ保有精子液滴は、負に荷電され、従って、他の向きに偏向し、そして廃棄された流動（すなわち、選別不能細胞）は、荷電されず、従って、偏向されない流動中において吸水管などに収集される。
【０２０５】
図２を参照すると、このプロセスは、さらによく理解され得る。この図に示されるように、ノズル（２）は、発振器（６）（図２で示されず）がドロップ（８）を形成するので、流動（７）を発する。細胞供給源（１）（図２に示されず）は、Ｊｏｈｎｓｏｎの技術に従い染色されている精子細胞（１５）を供給し得るので、レーザー励磁機（１１）による光刺激は、それが流動（７）から分離するように各ドロップ（８）上の電荷の存在または非存在が、フローサイトメーターにより制御され得るように、センサー（１０）によって差示的に決定される。この制御は、それらの内容物に基づいて、正荷電、負荷電、および非荷電ドロップ（８）を生じる。図２に示されるように、特定のドロップは、偏向されたドロップ（１６）として示される。これらの偏向されたドロップ（１６）は、一方の性または他方の性の精子細胞（１５）を含むドロップである。次いで、それらは、後の使用のために適切なコレクター（１４）に蓄積される。
【０２０６】
精子の選別に対するその適用に特に重要であるフローサイトメトリの１つの局面は、フローサイトメーターの高速な作動である。進歩は、ＭｏＦｌｏ（登録商標）商標の下でＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を介して入手可能なフローサイトメーターにより特に作製されている。これらのフローサイトメーターは、並外れて増加した選別速度を有し、従って、フローサイトメトリを精子選別の現実的な商業的適用（他の商業的適用）にするようである技術にした。それらは、別の利用される分類よりも著しくより速い速度での高速選別を達成するように作用する。具体的には、Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ’ｓ ＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメーターは約５ｋＨｚよりも大きい発振器の周波数で作用し、そしてより具体的には、１０〜３０か、またはさらに５０ｋＨｚの範囲内において操作され得る。従って、液滴は非常に高周波数で形成され、そしてシース液環境内に含まれる細胞は、ノズル（２）から非常に迅速に放射され得る。結果として、フローサイトメーターシステムを構成しそして部分である、ノズル（２）、発振器（６）などのような構成要素の各々は、設定されるかまたは選択され、高速な細胞ソーターを生じ得る。精子細胞の選別に対する高速な細胞ソーターの適用において、１秒当たり約５００を選別するよりも大きい速度での選別が達成される。実際、１０００および１２００の範囲での選別速度は、高速な細胞ソーターを介して既に達成されている。重要なことに、用語「高速」は、フローサイトメトリにおける他の利点および特定の適用が達成されるような相対的な用語であり、「高」とみなされる局面は、変動し得るかまたは絶対的なままであり得ることが理解されるべきである。いずれかの定義において、この一般原理は、精子細胞のような特定の細胞を選別する場合、この分類が、フローサイトメーターのパラメーターおよび物理的な性質が細胞自体に対して有意である速度で生じ得ることである。
【０２０７】
フローサイトメーター分離技術を介して精子細胞を選別する場合に効果を示すようである高速選別の１つの局面は、精子細胞がフローサイトメーター内に供される、圧力および他のストレスのそれである。例えば、高速（および「高速」の代替的な定義）で操作した場合、フローサイトメーターを、１インチの２乗当たり５０ポンドおよび１インチの２乗当たり６０以上のポンドの圧力で操作され得る。これらの圧力は、高いとみなされ得る。なぜなら、これらの圧力は、選別されている細胞に効果を生じ得るからである。この様相に対して本発明で開示されるような手がかりは、特定の細胞のストレス閾値が決定因子であるという事実である。さらに、さらなる知識が得られるので、ストレスの閾値は、細胞の、特定の種、あるいは特定の前かまたは続く取扱いのような、組み合わされた効果の関数であることが示され得る。このことに関しての手がかりは、細胞に課されたストレスが、実際、所望の結果を達成するためにそれらの生存率およびそれらの能力を変化し得ることである。圧力の場合では、その圧力でフローサイトメーターの操作の結果として精子細胞をより高い圧力に単に供することは、細胞の減少した性能を生じ得る。１つの点に関して、本発明は、これらのストレスを最小化するように作用し、従って、以下で議論されるようなより大きい効率ならびに低い用量を生じる。
【０２０８】
細胞のストレスの局面を考慮する際に、本発明は、このストレスを最小化する様式で作用する。これらのストレスは、周期あるいは動物を制御、選別、または受精させるプロセスの全てにわたって任意の時点で最小化され得る。重要なことに、フローサイトメーター内で細胞を取扱うことによって課されるストレスは、この適用に有意であるようである。本発明の１つの実施形態において、シース液は、特異的に選択され、選別前細胞流体の環境または選別後細胞流体の環境の両方（またはいずれか）の調製された様式において供し得る。天然では、選別前流体または選別後流体のいずれかで調節することが可能であるが、１つの実施形態では、本発明は、シース液（３）を調節し、以前に達成されたよりもその細胞において有意に少ないストレスを課する。１つの点に関して、本発明は、細胞自体からのストレスを取扱いそして取り除く際の焦点に対して、フローサイトメーターの操作の焦点から総焦点を取り除くという点で顕著である。例えば、適切なｐＨ因子または浸透圧（ｏｓｍｏａｌｉｔｙ）を有する流体を利用することは公知となっているが、本発明は、細胞が過応答受性であり得る特定の化学的組成物が存在し得ることを認識する。これらの過応答性の化学的組成物は、天然で、細胞に基づいて、または細胞の取扱いの前でさえ変動し得る。重要なことに現在、精子細胞の特定の代謝性化学的組成物（例えば、クエン酸）は、細胞上の異常な高ストレスを予防するようであることが明白である。従って、過応答性の化学的組成物は、細胞がそれらの機能性および既存の取扱い技術の状況内で特に応答性である化学的組成物として規定され得る。精子細胞に関して、代謝性組成物、具体的には、ウシ精子細胞についてのクエン酸定常性およびウマ精子細胞についてのｈｅｐｅｓ緩衝液定常性は、非常に重要であり得ることが明らかである。従って、本発明は、操作の型または基質の選択を介する変化を最小にするように作用し、これは、細胞が経験する変化を最小にするための手段として作用し得る。
【０２０９】
シース液について、物質は、本発明の１つの実施形態に従って選択され、その結果、最小の変化を与えるように化学的に調整され得る。従って、フローサイトメトリのパラメータの状況内のみではなく、むしろ細胞のパラメータ自体の状況内でもまた適切なシース液を選択することによって、細胞が経験した変化およびこの選別全体にわたる結果が増強され得る。これは、図３に概念的に示される。図３は、いくつかの型の化学的な因子（例えば、クエン酸または他の因子）を示す。なぜなら、それはこのプロセスの種々の相の至るところで存在し得るからである。例えば、示される４つの相は、フローサイトメトリ分離技術について示され限定されない以下を表す：相Ｉは、細胞供給源（１）内の細胞の存在を表し得、相ＩＩは、シース液環境内で選別されるような細胞の存在を示し得、相ＩＩＩは、選別後に収集される細胞のような細胞を示し、および相ＩＶは、選別後の貯蔵培地において再構成された細胞を示し得る。先行技術に示されるようなこれらの４つの相は、非常に異なる化学的因子の環境を経験し得る。しかし、本発明で概念的に示されるように、細胞は、非常に小さい変化を経験し得、最も著しくは、この相Ｉと相ＩＩとの間を経験したディップまたはドロップは、実質的に存在し得ない。これは、上記のような適切なシース液の選択の結果としてである。従って、適切なシース液に供されている結果として、本発明における細胞は、非常に低いレベルのストレスを経験し得る。
【０２１０】
この現象に関して存在し得る可能性のある普遍性の１つは、特定の化学的組成物が他よりも過応答性である化学的組成物を表し得るという事実である。天然では、これは精子の種、この取扱い、または含まれる細胞の型にさえ依存して変動し得るが、それらの意図する目的（ここでは、人工受精）についての細胞の生存率は、大きく、天然もしくは選別または両方のため、変動して、この細胞は、その化学的組成物に関して過応答性である特徴を示すようである。特定の代謝性の化学的組成物を選択することによって、クエン酸回路内にある最も著しいクエン酸または化学物質は、大きな利点が可能なようである。従って、ウシ精子の適用について、このシース液（３）は、約２．９パーセントのクエン酸ナトリウム組成物を提示するように選択され、そして調整される。具体的には、２．９パーセントクエン酸ナトリウム溶液は、以下のように作製され得る：
１．１，０００ｍｌの容積測定フラスコ中に２９．０ｇのクエン酸ナトリウム２水和物（Ｎａ3Ｃ6Ｈ5Ｏ7・２Ｈ2Ｏ）を置く
ａ．３／４の水バッチにクエン酸ナトリウムを溶解し、次いで、容積まで水を加える
２．脱イオン化またはＮａｎｏｐｕｒｅ水を加え１，０００ｍｌの最終容積にする。
３．ボトルに移し、そして１５ ｌｂｓ圧力（２４５oＦ）で少なくとも３０分間オートクレーブする。
【０２１１】
ａ．蒸発を最小にする条件を使用して溶液をオートクレーブする（カバーを緩める）。
【０２１２】
ｂ．水が蒸発しないことに注意。
４．室温で緩徐に冷やす。
５．５℃の低温室で密閉して貯蔵する。
さらに、シース液について、クエン酸ナトリウム溶液を濾過し得る。
６．無菌技術を使用して０．２２ミクロンフィルターで濾過する。
【０２１３】
興味深いことに、ウマの精子細胞については、このような組成物は、同様に実行しない。むしろ、ウマの精子細胞について、ｈｅｐｅｓウシ配偶子培地のような、ｈｅｐｅｓ緩衝化培地−特に、ウシの適用のためにＪ．Ｊ．Ｐａｒｒｉｓｈにより以前に作製されたＨＢＧＭ３−が功を奏する。この培地は、本明細書中で参考として援用される論文「Ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｐｅｒｍ ｂｙ Ｈｅｐａｒｉｎ」、３８ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １１７１（１９８８）中で議論される。ウシ精子に利用されるのと同じ型の物質ではないために、これは驚きだけではなく、実際の緩衝液もまた、本来、ウシの適用に開発された。従って、ウマの適用において、ｈｅｐｅｓ緩衝液を含むシース液が選択される。この溶液は、以下の組成を有する、室温で約７．５４のｐＨ（３９℃でｐＨ＝７．４）を有し得る：
【０２１４】
【表１】
【０２１５】
本発明において相互作用し得る１つの他の局面は、含まれる細胞が、異常な感受性を経験し得るという事実である。１つの点に関して、これは精子細胞が非修復細胞である細胞のクラス内であるという事実に起因し得る。すなわち、それらは、それ自体を修復する能力を有さず、それ故、それらは、フローサイトメーターまたは他の取扱い設備に対して代表的であるよりも感受的に処置されることを必要とし得る。従って、フローサイトメーター、または他の分離デバイスが精子細胞の供給源を確立するように作用する場合、この増強は、特に適用可能であることが適切であり得る。精子細胞のような細胞のクラスに独特であり得る、別の可能性のある関連する局面は、それらのＤＮＡが非修復、非複製、および非転写であるという事実である。これらの因子のいずれかは、効果を示し得、そしてそれらは、個々または一緒のいずれかで関連し得る。従って、本発明の教示は、非修復、非翻訳、非転写細胞である、全ての配偶子細胞またはウイルスなどにさえも適用し得る。
【０２１６】
また重要であり得るフローサイトメーター処理の別々の局面は、選別された後に化学的および物理的の両方で細胞を適切に処理する事実である。図４に示されるように、ドロップ（８）内の細胞をコレクター（１４）内に獲得するために、コレクターを構成する容器は、適切なサイズであり、その結果細胞と容器自体との間の衝撃を回避するいくつかの手段として作用することが重要であり得る。細胞が容器の底部にぶつからないようにするため、細胞を収集する容器の底部に最初のコレクター流体（１７）を置くことは公知であるが、容器内への細胞の衝突に起因する流動の提示ならびに回避不能なはね（ｓｐｌａｓｈｉｎｇ）において変動に処理を施すための容器の単純な広さは、この結果を増強するために使用され得ることが明らかである。１つの点に関して、これは緩衝要素として作用し得、その結果機械的に繊細であり得る細胞、すなわち、衝撃により破壊するかまたは損傷を受け得る細胞は、適切に処理され得る。従って、サイトメーター供給源が、選別されるべき細胞のように物理的に繊細な細胞である細胞を確立する場合、開口部の広さ（１８）が細胞との接触を回避する様式において容器の壁を配置するために供する、広い収集管のようないくつかの型の緩衝要素を提供することは重要であり得る。従って、この管は、側壁にそれほど近接して存在しないので、選別されるそれらの細胞と管壁との間に接触の任意の有意な見込みが存在する。この様式において、コレクター流体（１７）に加えて、同様に広い収集管を備えることが所望される。おそらく、コレクター（１４）の部分として供する容器に広い開口部を単に提供することは、有意であり得る。精子細胞の高速分類を利用する適用のために、少なくとも１５ミリメーターの内部直径の開口部を有する容器を提供することが有意であると考えられることが見出されている。具体的に、このような適用において１４ｍｌのＦａｌｃｏｎ試験管を利用する場合、コレクター（１４）の結果として細胞への最小の物理的損傷が発見されている。
【０２１７】
１４ｍｌのファルコン試験管ですらも最適ではないかもしれないことに注意すべきである。特に、流れの幾何学に適した収集容器（すなわち、「流れ適合容器（ｓｔｒｅａｍ−ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）」）を設計することが最良であり得ると考えられる。この流れ適合容器は、以下の特徴のいずれかまたは全てを有し得る：相対的に広い開口部、楕円形に成形された開口部、現在関わっているものより小さな高さ：幅の比、角度がつけられているか、またはそうでなければ落下流に対して平行な側壁を示し得るように調整された体裁など。ボールベアリングなどのような可動要素または媒体のような取り付け要素を提供して、試験管の可変性の配向を、収集することが所望される落下流に適合させることもまた望ましい。さらに、既存の試験管（「ファルコン型」試験管として記載される）のような容器の分類についての物理的特徴としては、試験管の幅だけでなく試験管が作製される材質（例えば、細胞が固着しないポリスチレン）もまた挙げられ得る。（これらの材質選択は、１４ｍｌファルコン試験管について周知である。）従って、この容器およびその収集液はまた、緩衝要素として作用して、細胞への物理的損傷を最小限にし得る。これは、サイズによっては、有意な希釈効果なく精子の適切な数の収集を容易にするためにもまた作用し得る。
【０２１８】
コレクター液（１７）の別の局面は、細胞に対する化学的ストレスを最小にするためにもまた作用し得るという事実であり得る。１つの点では、選別の前後両方で細胞に栄養素を与えることが重要であり得るので、コレクター液（１７）は、調整されたレベルの栄養素を提供するように選択され得るため、この栄養素レベルは選別の前後両方で平衡化される。２％卵黄レベルで卵黄クエン酸塩の栄養素が利用されるウシ精子に関しては、６％卵黄クエン酸塩レベル（すなわち、クエン酸塩溶液中に６％の卵黄含量）を利用することが良好な結果を提供することが発見された。これは、選別事象の前後に存在する容量の結果である。コレクター液（１７）は、約２ｍｌの容量で（選別前に）開始され得る。選別事象によって、この容量の約２倍が添加され得（最初の開始容量の３倍で終了する）、（目詰まりおよび他のフローサイトメーターの考慮すべき事項に起因して）溶液中に卵黄クエン酸塩はほとんどない。従って、存在する卵黄クエン酸塩の量のレベルという点では、最終結果は、開始結果、すなわち、含まれる容量に起因して、クエン酸溶液中に２％卵黄クエン酸含量に等しくあり得る。従って、コレクター液（１７）は、最終コレクター液環境を作り出すように選択され得、この最終コレクター液環境は、最初の栄養素または他の流体環境と平衡化される。この様式で、コレクター液は、細胞が供される時間および組成のレベルの変化を最小にするために作用し得る。もちろん、これらの流体環境は、フローサイトメーター内で示されていてもよいし、ある他の重要な時間に存在していてもよく、重要な点は、細胞の寿命における任意の時点で細胞が供されるストレスをほとんど最小化しないことである。さらに、最初の化学物質量が変動され得る（例えば、クエン酸塩中のパーセント卵黄含量は、上下に変動され得る）ので、同様に、開始収集液環境または種々の容量もまた、最終結果が同じであるように変動され得る。従って、選別プロセスを開始する前に、コレクター液は、クエン酸塩溶液中６％卵黄含量で存在し、そして選別事象が終了した後には、コレクター液（性特定精子を有する）は、結果的に最初の栄養素含量と同様にクエン酸塩溶液中２％卵黄含量になり得る。
【０２１９】
後者の使用では、これらの精子細胞は、他の理由のためにクエン酸塩液中２０％卵黄含量に対して処理され得る。しかし、これらの変更は、全体的な受精プロセスの公知の部分に過ぎないように、細胞に対するストレスを提供するとは認められない。もちろん、このレベルは当業者によって容易に理解され得るので、変動され得るが、２０％卵黄クエン酸塩緩衝液は、以下のように構成され得る：
Ｉ．最終組成：
８０％ クエン酸ナトリウム溶液（７２ｍＭ）
２０％ （容量／容量）卵黄
ＩＩ．１Ｌ用の調製：
Ａ．クエン酸ナトリウム溶液
１．１，０００ｍｌ容積フラスコ中に２９．０ｇのクエン酸ナトリウム二水和物（Ｎａ3Ｃ6Ｈ5Ｏ7・２Ｈ2Ｏ）を入れる
２．最終容量が１，０００ｍｌになるように脱イオン水またはナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）水を添加する
３．瓶に移し、１５ｌｂｓ圧力（２４５Ｆ°）で少なくとも３０分間オートクレーブにかける
ａ．蒸発を最小にするための条件を使用して溶液をオートクレーブにかける（緩くふたをする）
ｂ．水が沸騰して外に漏れないように注意する
４．室温でゆっくり冷却する
５．密栓して５℃の低温室で保存する
Ｂ．卵調製物
１．新鮮な鶏卵を優良な商業供給源から得る
２．埃がないように卵を洗浄し（過剰な界面活性剤は使用しない）、そしてすすぐ
３．卵を７０％エタノールに２〜５分間浸漬する
４．卵を取り出し、乾燥させ（または拭いて乾燥させ）、そして清潔なタオル上で保存する
Ｃ．エキステンダーの調製
１．清潔な滅菌ガラス製品を使用する
２．Ａ−画分（グリセロールなし画分）
ａ．１，０００ｍｌのメスシリンダーに８００ｍｌの２．９％クエン酸ナトリウム溶液を入れる
ｂ．エキステンダーのグリセロールなし画分（Ａ画分）についての抗生物質レベルは、以下のとおりであり得る；
ｉ．タイロシン＝１００μｇ／ｍｌ
ｉｉ．ゲンタマイシン＝５００μｇ／ｍｌ
ｉｉｉ．リンコ−スペクチン＝３００／６００μｇ／ｍｌ
ｃ．２００ｍｌの新鮮卵黄を以下に概説するように添加する（Ｄ節）
ｉ．徹底的に混合する
ｄ．これは、２０％卵黄およびウシ精子に対して非毒性であることが公知の濃度の抗生物質を有する２．９％クエン酸ナトリウムに基づいたＡ画分エキステンダーを提供する
ｅ．エキステンダーは、一晩５℃で保存され得る。
【０２２０】
ｆ．次の日に上清（上部の８００ｍｌ）をデカントする
ｇ．次の日の使用前に３７℃に暖める
Ｄ．緩衝化溶液に卵黄を添加するために、以下の手順を十分に行う
１．卵を十分に洗浄し、清潔にする（上記Ｂを参照のこと）
２．卵を割り、卵黄分離器を用いて卵白と卵黄を分離する。あるいは、卵黄を卵の殻に左右交互に２〜３回出し入れする。卵黄膜を破らないこと
３．卵黄を１５ｃｍの滅菌濾紙上におく
４．緩衝液を入れたメスシリンダーの上に濾紙を配置し、（卵黄膜を破りながら）卵黄を絞り出し、金で処理した（ｇｏｌｄｅｄ）濾紙からメスシリンダーへ流出させる。代表的には、約１２〜１５ｍｌの卵黄が１つの卵から得られ得る。
【０２２１】
本発明の種々の因子で相互作用し合い得る別の局面は、人工受精などのために低用量の精子を利用する局面である。雌雄識別した、人工受精の局面のさらなる背景は、「Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｐｅｒｍ」、Ｒｕｐｅｒｔ Ｐ．ＡｍｍａｎおよびＧｅｏｒｇｅ Ｅ．Ｓｅｉｄｅｌ，Ｊｒ．，Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８２）（本明細書中に参考として援用される）に見いだされ得る。言及したように、自然な受精は、何十億ものオーダーの精子数が関与する。代表的な人工受精は、現在では、ウシ種に関しては数百万の精子で行われ、そしてウマ種に関しては数億の精子で行われる。用語「低用量」によって、受精事象で用いられる精子の投与量が、代表的な人工受精事象で提供される代表的精子数の１／２より少ないか、または好ましくはそれの約１０％より少なくさえあることを意味する。従って、用語「低用量」は、代表的な人工受精投与量の状況で考えられることであり、絶対数としてもまた考えられる。現在百万〜一千万の精子が提供されるウシ精子に関しては、低用量プロセスは、約５００，０００精子数の絶対数、またはおそらく３００，０００精子以下と考えられ得る。事実、本発明の技術を利用することによって、良好な割合での人工受精の成功は、４８Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ １２５５（１９９７）で公開された論文「Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｈｏｒｎ Ｉｎｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｉｆｅｒｓ Ｗｉｔｈ Ｖｅｒｙ Ｌｏｗ Ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ Ｎｏｎ−ｆｒｏｚｅｎ ａｎｄ Ｓｅｘｅｄ Ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ」（これは、本明細書中に参考として援用される）に示されるように、１００，０００および２５０，０００精子（それぞれ妊娠率は４１％および５０％）の受精のレベルで示された。精子細胞は、希釈に対する感受性を示すようであるため、これらの結果は、本発明の種々の技術に関して、低用量の精子サンプルの利用に対して特定の相互依存性を示し得る。絶対数は、種依存性であり得る。ウマ種では、たとえ、約二千五百万、一千万、五百万、または百万の精子より少ないにしても低用量プロセスが考えられ得る。
【０２２２】
重要であり得る別の局面は、本発明の（または他の）技術によって精子の雌雄識別が人工受精システムで利用されるという事実である。従って、フローサイトメーター技術に関しては、コレクター（１４）を使用して、人工受精のための精子を提供するときに、本発明の技術は、特に関連し得る。さらに、人工受精の使用および低用量環境での使用の両方の組み合わせは、ともに相乗効果を奏し得、これは、本発明の種々の技術を特に適切にすることが可能である。当然、雌雄識別された精子は、ただ人工受精態様だけではなく、インビトロ受精技術などのような他の技術においても利用され得る。
【０２２３】
フローサイトメトリーの使用または他の分離技術によって動物を収集、選別、および実際に人工受精するプロセスは、種々の工程を包含する。ウシの人工受精の状況で、第１に、精液を人工膣を使用してウシから収集する。これは、約１５億精子／ｍｌの割合である。この生の精液を分光光度計を使用してチェックして、濃度を評価し得る。そしてこの精液を検鏡によって評価して、適切な運動性および生存性基準を満たすことを確実にし得る。次いで、抗生物質が添加され得る。結果として、最初のサンプルは、１回の射精あたり約６０〜７０％の前進運動性を有し得る。処理工程に関しては、ある型のＴＡＬＰ（タイロードアルブミンラクテートピルベート）による希釈を用いて、約１億／ｍｌの管理可能なレベルで（フロー分析について）精子数を入手し得る。ＴＡＬＰは、精子細胞に栄養を与えるだけでなく、精子を染色工程のために機能亢進させ得る。染色前に、ウマ種のようないくつかの種では、遠心分離が行われ得る。染色工程を、多重染色または単色染色プロトコルに従って行い得、後者は、Ｊｏｈｎｓｏｎ特許および関連技術である。染色工程を、適切な栄養素環境を作り出すためにエキステンダーもまた調節しながら行い得る。ウシの適用において、これは、染色後すぐにクエン酸塩溶液中に約２０％卵黄含量を添加する工程を包含する。さらに、精子細胞を染色することにおいて、ある範囲まで予測され得るよりも高い染色量によって、より良好な結果が達成されることが発見された。これは、高濃度染色工程が、数１０μＭ含量の染料量（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染料が３８μＭ含量で使用される以下の実施例で議論される）を使用する工程を包含し得る。
【０２２４】
染料を添加した後のインキュベーション期間としては、例えば、約一億精子細胞／ｍｌの濃度で染料取り込みを促進するために３４℃で１時間インキュベートする工程を用い得る。次いで、それらを濾過して、精子細胞の凝集を取り除き得る。次いで、約一億精子細胞／ｍｌの所望の選別濃度への希釈または拡大が行われ得る。次いで、先に議論された種々の技術に従う選別工程が行われ、ここから精子細胞が収集相で回収され得る。先に言及されたように、収集は、約２％卵黄クエン酸塩濃度含量（ウシ種について）を有するサンプルで生じ得る。次いで、このサンプルを、シース液および保存液が除去され得る後に遠心分離によって、約３００〜５００万精子細胞／ｍｌに濃縮し得る。次いで、最終的な拡大は、２０％卵黄クエン酸塩またはＣｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｅｘｔｅｎｄｅｒなどのいずれかで達成され得る。Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｅｘｔｅｎｄｅｒは、１０００ｍｌについて以下の組成を有し得る：
１４．５ｇ クエン酸ナトリウム二水和物
２．１ｇ ＮａＨＣＯ3
０．４ｇ ＫＣｌ
３．０ｇ グルコース
９．３７ｇ グリシン
０．８７ｇ クエン酸
２０％卵黄組成については、上記調製物の８００ｍｌおよび約２００ｍｌの卵黄を使用し得る。
【０２２５】
この最後の拡大後に、３００〜５００万精子／ｍｌ（ウシ種について）が生じ得る。次いで、このサンプルを精子の代謝を緩慢にするように、そしてより長い期間にわたる使用を可能にするように冷却され得る。次いで、ウマ種では、このサンプルは、当業者がよく理解するように、卵管プロセスまたは他の受精プロセスで使用され得る。ウシの精子では、サンプルは、所望の投与レベルまでさらに１回希釈され得る。希釈は、精子細胞の生存性に影響をもたらし得るために、より少量のサンプルを提供することによって希釈のレベルがあまりに大きくなり過ぎることを避けることが適切であり得ることが見いだされた。それにもかかわらず、使用されている分離技術のうち、現在では、約３００，０００精子／０．１８４ｍｌの低投与量が達成され得る。さらに、約５％のレベルで精漿のレベルを維持することが所望され得るが、この必要性の結果は、現在では結びつけられている。次いで、精子細胞試料は、人工受精に使用するためのストローに配置され、そして受精させるために経産牛または未経産牛に輸送され得る。
【０２２６】
都合のよいタイミングでの人工受精を達成するために、未経産牛または経産牛の発情期を、当該分野で周知の技術に従って、プロスタグランジンＦ２αの利用のような公知の技術により同期化させ得る。この後者の内容は、論文「Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ２α−Ａ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ Ｄｒｕｇ ｉｎ Ｄａｉｒｙ Ｃａｔｔｌｅ？」１８ Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２４５（１９８２）（これは、本明細書中に参考として援用される）で議論されるように未経産牛での受精能の増強を潜在的に達成することが報告されたという点で特に価値があり得る。最近の結果では、前述の事項は維持されなかったが、本発明は、雌雄識別された低用量の受精の状況で特別の生存性を実証することであり得る。次いで、ウシ種に関しては、人工受精は、子宮角内深くに精子細胞を配置する胎芽移植機器の使用によって達成され得る。これは、人工受精において代表的に使用されるピーク時ではなく、むしろピーク時の１２時間後のようないくらか遅い時期に達成され得る。なぜなら、雌雄識別された人工受精に関する受精は、わずかにより遅く生じ得るいくらかの可能性があるからである。胎芽移植機器の利用は、このような低用量の雌雄識別された受精に関して、子宮壁が非常に敏感であり得るために使用され得る。
【０２２７】
さらに、この技術を組み合わせて、さらにより効率的な生産を達成し得る。特に、高速選別および雌雄識別された胚の低用量人工受精を可能にする、たった今発明されたプロセスの各々は、過排卵動物において実行可能である。過排卵は、排卵誘発剤（ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｏｒｙ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）の使用または他の任意の技術によって達成され得る。排卵誘発剤は、例えば、正常よりも多く卵の生成を達成するために一連の反応によって直接または間接に作用し得る。過排卵との組み合わせは、以前、過排卵がこのような組み合わせを妨げると認められたので驚くべきことである。精子輸送は、過排卵処理されたウシで損なわれるので、動物を複数の機会でおよび／または複数の用量の精液で、頻繁に人工受精していた。また、精液を雌雄識別する以前の手順は、比較的緩慢であった；従って、これらの新たな技術の組み合わせを用いて、過排卵誘発剤（例えば、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン））処置ウシの、合計６００，０００の雌雄識別した未凍結精子を用いた１回の人工受精後の受精率を決定することは、興味深いことである。
【０２２８】
例示として、１２頭のＡｎｇｕｓ交雑未経産牛を、標準的手順を使用して過排卵処理した：６、６、４、４、２、２、２、および２ｍｇのＦＳＨを発情周期の９日目と１２日目の間で始まる半日間隔で筋肉内注射した；２５ｍｇおよび１２．５ｍｇのプロスタグランジンＦ−２αを６回目と７回目のＦＳＨ注射とともに筋肉内注射した。未知の受精能のウシからの精子をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、次いで、ＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメーター／セルソーターを使用して選別し、７００〜８００の生きた精子を各々の性／秒で得た。平均選別純度は、所望される性の８９％であった。選別された精子を、５℃に冷却して６５０ｇ、１０分間で遠心分離することによって３．３６×１０6精子／ｍｌに濃縮し、そして４時間保存した。次いで、１８４μｌを０．２５ｍｌのプラスチックストローに入れ；この用量の半分を自動側壁開口胎芽移植シース（ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｉｄｅ−ｏｐｅｎｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｈｅａｔｈ）を使用して発情後２０〜２４時間後に各子宮角に人工受精した。胚を標準的な非外科的手順によって発情後７または１６日目に収集した。結果は、７日目と１６日目での収集との間およびＸおよびＹ選別精子で同様であった。胚を９頭の未経産牛から回収した。発生の正常段階で５２胚（平均４．３±５．３／ドナー）、１３の発達の遅れた胚および３１の未受精卵が存在した。４６胚が、Ｙ染色体特異的ＤＮＡ配列についてのプライマーを使用してＰＣＲによって雌雄識別され；そのうち４３（９３％）が意図された性であった。この研究は、少数の動物に関与しただけであるが、驚くべきことに、わずか合計６００，０００の（生存した）雌雄識別した未凍結精子での過排卵処置した未経産牛の人工受精は、従来の手順と同様の結果を与えた。上記のバリエーションはまた、フローサイトメーター手段以外によって選別する工程、他の様式で過排卵を達成する工程、他の様式で受精能を増加させる工程など（を含むが、これらに限定されない）で達成され得る。
【０２２９】
さらに、受精能を損なうことなく、ＤＮＡ含量に基づいて精子を雌雄識別する方法、高速フローサイトメーター／セルソーター、および合計５００，０００より少ない精子で未経産牛を人工受精する手順の調和が、わずか数年内にウシにおける生存可能な雌雄識別した精液産業の可能性を生じた。８５％より高い正確性で雌雄識別した精子についての多くの適用が存在する。おそらく、最も明白なのは、雌の群を置換するために、一方のサブセット（乳牛および肉牛の両方）のウシを人工受精すること、および逆のサブセット（乳牛および肉牛の両方）を肉用に生産された雄に対して全く異なるタイプのウシと交配させることである。上記の非常に重要なサブセットは、Ｘ染色体保有精子で未経産牛に人工受精して、雌ウシを生産することである。これは、主にサイズがより小さいことに起因して、雄ウシより難産の発生率は低くなる。さらに、若い乳用種牛を提供することは、未経産牛の優勢にはるかにより有効である。８５％より多い未経産牛を有することはまた、乳牛を管理することを可能にするために、それらは、平均すると、寿命あたり２頭の生存牛より少ない。これは、妊娠および分娩に関連する問題を減少させるためには魅力的なものである。肉生産の単一性別システム（ｓｉｎｇｌｅ ｓｅｘ ｓｙｓｔｅｍ）もまた可能になる。ここで、各雌をそれ自身が交換し、そして２〜３年の間で屠殺されるため、成長のためのシステム中ではるかにより高い栄養素を使用して、そして維持する割合はより低い。雌雄識別した精液は、インビトロ人工受精のために、および胎芽移植のために過剰排卵処理したウシを人工受精するために有用である。頻繁には、ある性のウシが他方よりかなり価値があり、そして胚を雌雄識別する正確な方法が利用可能であるにもかかわらず、それらは、時間がかかり、そして生成された胚のうちの半分は、あまり価値のない性である。正確に雌雄識別された精液は、雌雄識別の追加料金が低く、かつ受精能が最小限にしか損なわれない場合、ウシの人工受精に広範に適合すると推測される。人工受精される肉牛の割合は、おそらく、実質的に雌雄識別された精液での肉牛が増えるであろう。
【０２３０】
興味深いことに、このような受精が通常配置される子宮体内への受精よりも、子宮角内深くへの受精によって、より良好な結果が達成され得る。おそらく、このようにはるかに研究されたサンプルは、子宮角内深くで達成された場合に、同側性の受精と対側性の受精との間に違いを示さないこともまた驚くべきことである。深いことによって、その挿入は、胎芽移植機器を使用して、子宮角に良好に配置されることが理解されるべきである。同側性の受精と対側性の受精を使用して、結果が有意に異ならないようであるという事実は、本発明者らに、両方の受精の使用の提案を導き、その結果、適切な子宮角を同定するプロセスはもはや必要であり得ない。
【０２３１】
受精の結果として、当然のこととして、所望の性の動物が産生されることが所望される。この動物は、雌雄選別された精子標品の使用を介する先に議論した系に従って産生され得る。本発明の技術は、例えば、腹腔鏡検査的（ｌａｐｒｏｓｃｏｐｉｃ）受精、卵管受精などのような他の技術における適用を見い出し得ることがまた、理解されるべきである。
【０２３２】
実施例として、以下の実験が行われた。本明細書に記載される本発明のあらゆる局面のすべての使用ではなく、それらは、本発明の異なる局面を通して可能な実行の増強を示す。さらに、いくつかの実験の要約は、以前に引用した論文「非常に少数の非凍結および雌雄選別された精子を用いた未経産牛の子宮角受精」に含まれる。この論文は、本発明の有効性を示すデータのいくつかを要約する。実験については、雌雄選別された非凍結精子細胞を用いて行われ、以下のように高い成功を収めた。
【実施例】
【０２３３】
（実施例１）
Ａｎｇｕｓ未経産牛（１３〜１４月齢（ｍｏ）であり、そして中程度の体調）は、１２日間の間隔をあけて２５ｍｇのプロスタグランジンＦ−２αを用いて同期化させ、そして直立発情期（ｓｔａｎｄｉｎｇ ｅｓｔｒｕｓ）が観察された６〜２６時間後、受精させた。１４〜２６月齢の３頭の雄ウシから新鮮に収集した精液を、ＴＡＬＰ培地中で１時間、３４℃で、７５×１０6精子／ｍｌで、３８μＭ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２中でインキュベートした。精子を、５０ｐｓｉで操作するＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメーター／セルソーターを使用して、そしてシース液として、２．９％ クエン酸Ｎａを使用して、１５０ｍＷでの３５１ｎｍおよび３６４ｎｍにおけるレーザー励起からの落射蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）に基づいて、性染色体によって選別した。Ｘ染色体を有する精子（超音波処理した精子アリコートを回復させることによって確認されたように、約９０％の純度）を、約５００生精子／秒で、１００μｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（ＣＵＥ）を含む２−ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に、２０％卵黄とともに収集した。収集した精子を、６００×ｇで１０分間遠心分離し、そして１．６３×１０6生精子／ｍｌでＣＵＥ中に再懸濁した。雌雄選別されていない精液のコントロールについて；Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色精子を、シース液で、９×１０5精子／ｍｌに希釈し、そして遠心分離し、そしてＣＵＥ中で１．６３×１０6の進行的に運動性の精子／ｍｌに再懸濁した。雌雄選別された精液および液体コントロール精液を５℃に７５分間冷却し、そして０．２５ｍｌストロー（１８４ｕｌ／ストロー）にロードした。ストローを、受精のために、分取の５〜９時間後に３〜５℃の温度制御飲料冷却機２４０ｋｍに移した。雌雄選別された精液および液体コントロール精液を、側開口青色シース（ｓｉｄｅ−ｏｐｅｎｉｎｇ ｂｌｕｅ ｓｈｅａｔｈｓ（ＩＭＶ））を使用して受精し、各々のストローの半分を、各々の子宮角に入れた（３×１０5生精子／未経産牛）。標準的なコントロールとして、同じ雄ウシ由来の精液を、標準的な手順によって０．５ｃｃストロー中で冷凍し（平均１５．６×１０6の運動性の精子／溶解後用量）、３５℃で３０秒間溶解し、そして子宮体中に受精させた。処置を、３頭の雄ウシおよび２人の受精者に対して、雌雄選別された精液および２つのコントロールについて３：２：２の受精の比で平均化した。妊娠を、胎仔もまた雌雄選別された場合（盲目的に）、受精の３１〜３４日後超音波で決定し、そして６４〜６７日後に確認した。データを表に示す。
【０２３４】
【表２】
【０２３５】
a,b異なる上付き文字を有する値の雌雄選別比は異なる（ｐ＜０．０２）。
【０２３６】
雌雄選別された精液を用いた妊娠率は、コントロールの８０％にすぎなかったが、この差異は統計学的に有意でなかった（＞０．１）。１回の妊娠は、雌雄選別されかつ凍結したコントロール群の各々において６４〜６７日で失われる；雌雄選別群中で１９胎児のうちの１８（９５％）は雌であり、そしてコントロール群の３０のうちの２０（６７％）は雌であった。液体精液コントロールは、５０倍より多い運動性の精液（全精子の１２０倍以上）を含む凍結精液コントロールに対して実質的に同一の妊娠率を産み出し、このことは、子宮角中への低用量受精の有効性を例証する。本発明者らは、フローサイトメーター技術および人工受精を使用して、ウシでの性比率を有意に変更した。
【０２３７】
同様に、雌雄選別されていない、非凍結の精子細胞を用いて１つの実験を行い、そして以下のように報告し得る。
【０２３８】
（実施例２） 実験の目的は、理想的な野外の条件下で、極度に少ない数の凍結精子を用いて未経産牛に受精させた場合に、妊娠率を決定することであった。上記の平均妊娠率である３頭のＨｏｌｓｔｅｉｎ雄ウシ由来の精液を、均質化ミルク、７％グリセロール（ＣＳＳ）エキステンダー、および５％相同精液漿中で、０．２５ｍｌフレンチストローあたり総精子２×１０5、５×１０5、または１０×１０6（コントロール）まで広げ、そして液体窒素蒸気に移して凍結させた。精液を、３７℃の水浴中で２０秒間融解した。１３〜１５月齢で３５０〜４５０ｋｇの体重のＨｏｌｓｔｅｉｎ未経産牛に、２５ｍｇのプロスタグランジンＦ−２−α（Ｌｕｔａｌｙｓｅ（登録商標））を、１２日間の間隔をあけて２回注入し、そして胎芽移植ストローガン（ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｔｒａｗ ｇｕｎ）および側開口シースを用いて受精させ、そして精液の半分は、発情期の検出の１２時間または２４時間後、各々の子宮角深くに入る。実験を５ヶ月にわたって５回の反復で行い、そして２人の受精者で平均された。繁殖の周囲温度はしばしば−１０℃から−２０℃であったので、受精器具を暖かく保つことに注意が払われた。妊娠を、発情から４０〜４４日後に、超音波を使用して、生存可能な胎仔の検出によって決定し、そして発情後５５〜６２日後に確認し；２０２の受胎産物のうちの４つが、これらの時期に失われた。５５〜６２日では、妊娠率は２×１０5、５×１０5、および１０×１０6総精子／受精（Ｐ＜．１）について、５５／１０３（５３％）、７１／１０１（７０％）および７２／１０２（７１％）であった。妊娠率は、雄ウシの間で異なっていたが（５９、６２、および７４％、Ｐ＜．０５）、実験者の間で（６４および６５％）、または発情後の受精回数（１２時間で６５％、２４時間で６４％、Ｎ＝１５３、各回）では異ならなかった。記載した方法を用いる、未経産牛における妊娠率は、受精あたり５×１０5および１０×１０6総精子を用いるのと同様であった。
【０２３９】
１つの実験がまた、雌雄選別された非凍結の精子細胞で行われ、そして以下のように報告され得る：
（実施例３）
精液を、Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｂｒｅｅｄｅｒｓ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅの雄ウシから収集し、ＨＥＰＥＳ緩衝化エキステンダー＋０．１％ＢＳＡで１：４に希釈し、そしてＭａｒｙｌａｎｄ、Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅまで１６０ｋｍ（約２時間）輸送した。ここで精液を、周囲温度において、以前に記載された方法（Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ４１：１９９）を使用して、ＴＥＳＴ収量（２０％）エキステンダー中にフローサイトメトリーによって選別した。約９０％純度において、５〜６時間あたり各性の２×１０6精子までの選別速度を達成した。精子を、遠心分離（３００ｇで４分間）によって、２×１０6精子／ｍｌまで濃縮した。いくらかの精子を、相同な精液漿を含むエキステンダー中に選別した（最終濃度５％）。選別した精子を、飛行機でコロラドまで輸送し（約２，６００ｋｍ）、そして周囲温度または５℃のいずれかで保存した（Ｅｑｕｉｔａｉｎｅｒ（氷を含む仕切りを用いる遮蔽された装置）中で６時間以上輸送の間冷却した）。発情が検出されるよりも１１〜３６時間早くに、未経産牛または乳の出なくなったウシに、精子選別セッションの終わりの９〜２９時間以内に受精させた。精子（０．１ｍｌ中に１〜２×１０5）を、受精の際に超音波によって決定された最も大きい濾胞を有する卵巣に対して同側の子宮角に深く入れた。
【０２４０】
輸送され、周囲温度で保存された精子を受精させた場合に、１０頭の雌はいずれも妊娠しなかった。輸送の間に５℃で冷却された精子を受精させた２９頭の雌の内、１４頭が４週間、そして１２頭（４１％）が８週間の妊娠期間の間妊娠した。選別の最後の１０時間以内に受精させた２２頭の内１１頭が８週間妊娠したが、しかし選別の１７〜２４時間後に受精させた７頭の内１頭のみが妊娠した。精液漿の添加の有意な効果はなかった。１２の胎仔の内の１つは予測された性ではなく、１つは不明瞭であり、そして１０は、妊娠の６０〜７０日間の超音波検査によって決定されたように、予測された性であった。
【０２４１】
引き続いて、３３のさらなる未経産牛に、超音波検査の使用なしで各々の子宮角中に０．０５ｍｌ（上記のように広げた精液）を用いて受精させた；３例のみが受精後４週間妊娠し、そして１例のみが８週間妊娠したままであった。しかし、先の群からの異なる雄ウシを使用して、そしてすべての受精は、選別１８〜２９時間後に行った。別の雄ウシ由来の選別された精子を用いて、本発明者らの研究室から２００ｋｍの、さらなる３８例の未経産牛を同様に受精させた（選別約２２時間後）；これらのいずれも、受精後８週間妊娠しなかった。
【０２４２】
要約すると、フローサイトメトリーによって性染色体について選別された精子の人工受精によって、ウシにおいて妊娠を達成することは可能であり、そして胎仔の性比率は、選別された精子のＤＮＡ含有量についての再分析によって予測される性比率に近づく（９０％）。しかし、妊娠率は、長距離の精子の輸送を必要とした、これらの予備的実験において大きく変動した。受精率は、選別後１７時間で急激に減少したが、いくぶんかの混乱が存在した。なぜなら、異なった時間に異なった雄ウシを使用したからである。妊娠率に見られる変動は、雄ウシの違いによるものか、受精の技術によるものか、選別と受精の間の間隔によるものか、または他の因子によるものかを決定するために、さらなる研究が必要とされている。
【０２４３】
最後に、１つの実験がまた、雌雄選別されていない、非凍結精子細胞を用いて行われ、そして以下のように報告され得る。
【０２４４】
（実施例４）
この実施例の目的は、未経産牛に理想的な実験条件下で非常に少数の精子を用いて受精させた場合に、妊娠率を決定することであった。３頭のＨｏｌｓｔｅｉｎ雄ウシ由来の精液を、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｅｘｔｅｎｄｅｒおよび５％の均質な精液漿中で１×１０5または２．５×１０5精子／０．１ｍｌまで広げた；２．５×１０6全精子／０．２５ｍｌをコントロールとして使用した。十分に広げた精液を、０．１または０．２５ｍｌの受精用量を送達するために、改変した０．２５ｍｌプラスチックフレンチストロー中に詰めた。精液を５℃に冷却し、そして収集の２６〜５７時間後に使用した。Ｈｏｌｓｔｅｉｎ未経産牛１３〜１５月齢、体重３５０〜４５０ｋｇに、１２日間の間隔で、２５ｍｇ プロスタグランジンＦ−２α（Ｌｕｔａｌｙｓｅ（登録商標））を注射し、そして発情の検出から２４時間後に、胎芽移植ストローガンおよび側開口シースを用いて、１つの子宮角に受精させた。受精は、発情１２時間後超音波によって決定された最大の濾胞を有する側に対して同側性であった；排卵の側は、発情７〜９日後超音波によって黄体の検出によって確認した。妊娠は、発情４２〜４５日後超音波によって胎仔の検出によって決定した。この実験は、４回反復し、そして３人の受精技術者で平均した。排卵の側は、２２５未経産牛のうち２０５で正しく決定された（９１％）；驚くべきことに、妊娠率は、同側および対側の受精でほとんど同一であった。妊娠率は、１×１０5、２．５×１０5、および２．５×１０6精子／受精（Ｐ＞．１）について、３８／９３（４１％）、４５／８７（５２％）、および２５／４５（５６％）であった。技術者の間で、有意な妊娠率の違い（Ｐ＜．０５）が存在したが、雄ウシの間にはなかった。フローサイトメーターを用いて性によって選別された精子が、商業的な適用を有する記載した方法を用いて、受精あたりの精子の数を十分に減らすことが可能であり得る。
【０２４５】
上述のように、そして種々の実験から見られ得るように、野外は統計学的に根拠のあるものであり、従って種々のさらなる実験が、適切な組み合わせおよび制限のストラテジーを示すために行われ得る。従って、種々の影響の間の相乗作用（例えば、レーザー励起を用いる色素の効果および組み合わされた色素の効果が研究され得る例）が、さらに同定される。
【０２４６】
本出願に含まれる議論は、基本的な記載として働くことを意図している。読者は、特定の議論が明白にすべての可能な実施形態を記載しなくてもよいし；多くの代替手段が暗黙のものであることに気付くべきである。それはまた、本発明の一般的な性質について十分に説明しなくともよいし、そしてそれぞれの特色または要素が、実際により広い機能をいかにして示し得るか、または非常に多様な代替手段もしくは等価な要素をいかにして示し得るかを明白に示さなくともよい。かさねて、これらは、暗黙に本開示中に含まれる。本発明が、デバイスを指向する用語において記載されている場合には、各々のデバイスの要素は、暗黙に機能を行う。装置の請求項は、記載されるデバイスについて含まれてもよいだけではなく、また、方法またはプロセスの請求項が、本発明および各々の要素が行う機能を扱うために含まれ得る。記載または用語のいずれもが、提出され得る請求項の範囲を限定することを意図するものではない。種々の変更が、本発明の本質から離れることなくなされ得ることが理解されるべきである。このような変更はまた、明細書中に暗黙に含まれ得る。これらもなお、本発明の範囲にある。示される明白な実施形態、非常に多様な暗黙の代替的な実施形態、および広い方法もしくはプロセスなどの両方を含む広い開示が、本開示によって含まれる。
【０２４７】
さらに、本発明の種々の要素および請求項のそれぞれがまた、種々の様式において達成され得る。本開示は、このような各々のバリエーション（任意の器具の実施形態のバリエーションの実施形態、方法またはプロセスの実施形態、またはこれらの任意の要素のバリエーションにさえすぎない）を含むことが理解されるべきである。特に、本発明の要素に言及する開示として、各々の要素についての語が、たとえ機能または結果のみが同じであるとしても、等価な器具の用語または方法の用語によって表現され得ることが理解されるべきである。このような等価な、より広い、またはより一般的でさえある用語は、各々の要素または作用の記載に含まれるとみなされるべきである。このような用語は、本発明が権利を与えられる暗黙の広い適用範囲を明白にすることが所望される場合に置き換えられ得る。１つの例としてではなく、すべての作用が、その作用を獲得するための手段として、またはその作用を起こす要素として表現され得ることが理解されるべきである。同様に、開示された各々の物理的要素は、物理的要素が容易にする作用の開示を含むと理解されるべきである。この局面の１つの例としてではなく、「コレクター」の開示が、明白に議論されるか否かにかかわらず、「収集すること」の作用の開示を含むことが理解されるべきであり、そして逆に、「収集すること」の作用の開示のみが存在する場合、このような開示は、「コレクター」の開示を含むことが理解されるべきである。このような変更および代替的な用語は、本明細書中に明白に含まれることが理解される。さらに、最初に提示した請求項に加えて、その請求項は、少なくとも以下により広く取り組むために変更され得ることが理解されるべきである：ｉ）本明細書中に開示および記載されるデバイス、ｉｉ）開示および記載される関連方法、ｉｉｉ）そしてこれらのデバイスおよび方法の各々の、同様の、等価な、暗黙でさえのバリエーション、ｉｖ）開示および記載されるとして示される機能のそれぞれを達成するこれらの代替的な設計、ｖ）開示および記載されることを達成するために暗黙であるとして示される機能の各々を達成する、代替的な設計および方法、ｖｉ）別個のかつ独立した発明として示される各々の特徴、要素、および工程、ならびにｖｉｉ）上記の各々の種々の組み合わせおよび順列。
【０２４８】
本発明の理解を助けるために、種々の刊行された引用文献が役立ち得る。これらは以下に列挙され、そしてそれによって参考として援用される；しかし、記載がこの／これらの発明の特許化と矛盾しているとみなされ得る点で、これらの記載は明白に出願人によってなされたとはみなされない。強力に役立つ引用文献は、米国特許第５６６０９９７号；同第５５８９４５７号；同第５５１４５３７号；同第５４３９３６２号；同第５３４６９９０号；同第５１３５７５９号；同第５０２１２４４号；同第４９９９２８３号；同第４７４９４５８号；同第４６９８１４２号；同第４６８０２５８号；同第４５１１６６１号；同第４４４８７６７号；同第４３６２２４６号；同第４３３９４３４号；同第４２７６１３９号；同第４２２５４０５号；同第４１９１７４９号；同第４１５５８３１号；同第４０９２２２９号；同第４０８５２０５号；同第４０８３９５７号；同第４０６７９６５号；同第４００９２６０号；同第３８９４５２９号；同第３６８７８０６号；ＲＥ３２３５０号を含む。役立つ引用文献はまた、以下の刊行物を含み得る：
【０２４９】
【表３】
【０２５０】
【０２５１】
本明細書を通して、その文脈がそれ以外に必要としない限りは、語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」または、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」のようなバリエーションは、言及された要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を含むが、任意の他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を排除しないことを暗示することが理解される。
【符号の説明】
【０２５２】
３ シース液
１４ 収集システム
１８ 精子細胞
【技術分野】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は、一般的に、哺乳動物子孫の性選択の分野に関する。本発明は特に、所望の性の子孫を生成するための低用量人工受精の局面および卵生成の増加の局面に関連する。詳細には、本発明は、選別技術、人工受精時および増加した排卵の結果となる技術での性特異的かつ低用量の努力のためにフローサイトメトリーを介して精子を選別するためのシステム、などにかかわらず、低投与量での、雌雄識別した（ｓｅｘｅｄ）人工受精を達成することに関する。
【背景技術】
【０００２】
（従来の技術）
長期間の間、特定の子孫の性を選択することが所望されている。明らかな心理学的局面を超えて、哺乳動物子孫の実際の性選択は、食料生産動物（例えば、畜牛）ならびに有名な優勝動物（例えば、ウマ）などへのその適用を考える場合には、有意な経済的意義を有する。この大きな望みは、性が選択された子孫を達成するための有意な種々の努力となっている。おそらく、所望の結果を達成する可能性が最も高いようであった努力は、受精の前にＸ精子とＹ精子との間の選別および選択をする際の努力であった。
【０００３】
Ｘ精子とＹ精子とを選別する際の努力が直面した難題の１つは、関与する精子の数が大きいことである。自然受精では、精子は、数種においては、数十億で生産される；しかし、人工受精なしでは、依然として有意に大きな数の精子が用いられる。例えば、人工受精技術は、通常、１０００万〜５０億個（種に依存する）の精子を使用する。従って、有意な数の精子が、人工受精の環境においてさえも、必要である。
【０００４】
多くの方法が、Ｘ染色体を保有する精子とＹ染色体を保有する精子との分離を達成するために試みられている。これらの方法は、米国特許第４２７６１３９号に開示されて現れるような磁気的技術から、米国特許第５５１４５３７号に開示されて現れるような柱状技術、米国特許第３８９４５２９号、再発行特許第３２３５０号、米国特許第４０９２２２９号、同第４０６７９６５号、および同第４１５５８３１号に考察されるような重量計測技術までの範囲にわたっている。電気的特性はまた、Ｕ．Ｓ．４０８３９５７に示されるように、ならびに電気的特性と重量測定特性との組合せは米国特許第４２２５４０５号、同第４６９８１４２号、および同第４７４９４５８号に考察されるように試みられている。運動性の努力もまた、米国特許第４００９２６０号および同第４３３９４３４号に示されるように試みられている。米国特許第４５１１６６１号および同第４９９９２８３号（モノクローナル抗体を含む）、ならびに米国特許第５０２１２４４号、同第５３４６９９０号、同第５４３９３６２号、および同第５６６０９９７号（膜タンパク質を含む）、ならびに米国特許第３６８７８０３号、同第４１９１７４９号、同第４４４８７６７号、および同第４６８０２５８号（抗体を含む）に示すような化学的技術、ならびに米国特許第４０８５２０５号に示すような血清成分の添加。これらの技術の各々は、効率が高いかのように示されているが、実際は現時点では、これらの技術はいずれも所望のレベルの性予備選択を生じない。しかし、分離技術が最終的に用いられるにかかわらず、天然に存在する精子が多数であること、およびＸ染色体を保有する精子とＹ染色体を保有する精子とを分離するアプローチの競合する組合せは、より少数の精子を用いて受精を達成する能力を開発することを望ましくしている。
【０００５】
現時点では、フローサイトメトリーの技術を介する精子の個々の分別および分離を含む、Ｘ染色体保有精子とＹ染色体保有精子との分離を達成するために用いられる唯一の定量的技術が存在している。この技術は、Ｘ染色体保有精子およびＹ染色体保有精子の差示的色素吸収を含む進歩および発見の結果として可能であるようであった。これは、米国特許第４３６２２４６号において最初に考察され、そして米国特許第５１３５７５９号においてＬａｗｒｅｎｃｅ Ｊｏｈｎｓｏｎにより開示される技術を通して有意に拡大された。フローサイトメトリーを利用してＸ染色体保有精子とＹ染色体保有精子とを分離するＪｏｈｎｓｏｎの技術は、このような精子の商業的分離を初めて可能にした、非常に有意な進歩であった。依然として実験的であるとはいえ、分離は、高速フローサイトメーター（例えば、Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．により製造されるＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメーター）の利用により有意に増強され、そして米国特許第５１５０３１３号、同第５６０２０３９号、同第５６０２３４９号、および同第５６４３７９６号、ならびに国際ＰＣＴ特許公開ＷＯ９６／１２１７１を含む種々の他の特許に考察された。ＣｙｔｏｍａｔｉｏｎのＭｏＦｌｏ（登録商標）サイトメーターの利用は、速度が大いに増加するのを可能にし、一方、これらの速度の増加は、しばしば使用される精子が多数であることを考慮すれば特に適切であるが、特定の問題が依然として残っている。ＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメーターによる可能な速度のほぼ１０倍の進歩にもかかわらず、さらにより短い分別時間がいくつかの理由から望まれている。最初に、実際問題として、精子は時間が重要な細胞であることが発見された。これらは、使用されないままの時間が長いほど、それらの有効性を失う。第２に、収集、分別、および受精のタイミングは、速度を商業的に非常に重要な項目にした。従って、精子細胞およびプロセスにとって時間が重要であるという性質は、速度を高い効力および成功率を達成する際の必須の要素とした。
【０００６】
他の問題がまた、実用的な問題から仮想的な問題までの範囲で存在する。実用的側面では、安価な使い捨て構成要素および物質を用いて、雌雄識別した精子サンプルを達成することが所望された。また、費用の側面では、できる限り効率的な労力の結果で選別（ならびに収集および受精）を達成し得ることが所望された。従って、この分野での商業的生産および成功のために、効率の増加のみを示し得る改良が依然として重要であり得る。費用の実用的局面に関連するのは、プロセス全体の繊細さおよび感度の実用的局面である。このことについては、このプロセスを単純化し、そして手順についてできる限り強健にし、その結果、操作者の誤りまたは技術が減りつづける役割を果たし得ることが所望されている。彼らはまた、組み合わさって、より低い投与量での受精をさらにより望ましいものとした。
【０００７】
このプロセスの繊細さに加えて、精子自体が非常に繊細な細胞であることが常に公知であった。この因子は一見したところでは、容易に理解されるとみなされ得るように見えるが、実際は、この細胞の全部の程度の感度は未だに充分には調査されていない。一般にフローサイトメトリーの状況では、大部分の選別された細胞または粒子は、しばしば球状であるか、さもなければ種々の乱用に身体的に抵抗し得る。これは、精子細胞については事実ではない。実際、本発明が開示するように、通常のフローサイトメーター技術を介するプロセシングは、実際に、特定の適用において精子細胞のサイトメトリー選別に受け入れられないかもしれない。感度は、希釈の問題、および各々の細胞を個々に単離し、そして区別するためのフローサイトメーターの固有の必要性、ならびに代表的なフローサイトメトリーが、本発明の以前に、選別した細胞または他の物質に付与した圧力および他のストレスにわたった。これはまた、精子細胞の独特の因子を示し得る。なぜなら、精子細胞がフローサイトメーターを通過し得るようであり、そして肉眼的に識別可能な副作用を有さずに選別し得たとしても、実際は、この細胞自体は、受精プロセスにおいて最適より劣って機能するという点でストレスが与えられ得るようであるからである。従って、因子の相互作用が関連するように見え、そして精子細胞選別の見込みおよび人工受精のための最終的な使用から通常でない問題を生じた。
【０００８】
（Ｊｏｈｎｓｏｎの特許および関連技術により達成された大きな進歩にもかかわらず）残っている別の問題は、本発明の前には、使用される分離技術にかかわらず、雌雄識別した精子を用いて、より低い投与量の受精を達成することが極めて困難であったという事実である。歴史的に、低用量受精はいくらか達成されているが、商業的適用において経験されるようであるかまたは適用可能であるような環境ではなく、理論的または実験室的環境では、より多いようであった。このことについて、要望は、低用量受精を達成することだけでなく、むしろ現在の、雌雄識別していない高投与量人工受精努力と匹敵する妊娠成功率で低用量受精を達成することであった。従って、雌雄識別され、かつ低用量の両方である人工受精において本発明者らによって達成された進歩は、初めて、商業的適用を可能にし得る有意な進歩を示す。
【０００９】
（さらに、Ｊｏｈｎｓｏｎの特許および関連する技術による大きな進歩にもかかわらず）産業界の当業者が直面した別の問題は、この問題自体が、すなわち、高い成功率での人工受精が、多数の因子が相互作用するようである統計学的性質の１つであるという事実である。従って、提案される解決策は、ある程度、徹底的に統計学的に研究した場合に、単独または他の因子との組み合わせのいずれかで必要であることが示される因子の組合せを含み得る。このような決定はさらに、結果自体が種によって変化するという事実によって妥協され、そして大きな充分なデータベースに対する検定および統計学的サンプリングが最初の段階での努力に見合わないようであるという事実のために確認することが困難であり得る。これらの理由から、本発明はまた、個々でまたは組合せで、所定の適用のために適切な溶液を示し得る因子の組合せを含み得る。従って、この開示は、開示される技術の種々の組合せおよび普及が達成され得るために充分に広いとみなされる。未知の相乗作用が他の因子について存在し得る。このような因子は、選別またはおそらくフローサイトメーター工程における因子から、収集工程および受精工程における因子の範囲であり得る。現在、研究は主にウシの種において達成されているが、これらの技術がこのような種に限定される、またはこのような問題が精子細胞のみに限定されるとは考えられない。使用される技術が、選別されるいずれかの感受性部材を含む領域へのまさに精子細胞を超える適用、またはこの部材が選別された際のフローサイトメトリーのストレスの影響の単なる最小化を有し得るようである。
【００１０】
興味深いことに、本発明は、精子細胞に対する選別の影響またはストレスを最小にするためのアプローチをとるが、他者は、速度および他のこのような性能についての圧力および要求を増加させることにより、実際にはこの方向からはなれて行動したようである。本質的に、個々の、またはおそらく相互に関連した様式での、低用量受精および高速プロセシングのための動因は、互いに制限される問題を与えるかもしれない。従って、長い間感じられていたが満足されていない、高速で雌雄識別した低用量受精についての必要性が存在しており、そして実行する技術および要素が長い間利用可能であるが、本発明の前には、進歩またはおそらく進歩の組合せは、当業者によって明らかに見落とされていた。おそらく、ある程度まで、当業者は、この問題が、因子の相互作用、およびこの分野に関与する型の細胞（精子細胞またはおそらく種特異的精子細胞）についての特有の必要性を含むことを認識できなかった。興味深いことに、本考察における先の努力のリストが示すように、実質的な試みが行われたが、これらはこのような領域において雌雄識別した低用量受精として固有の問題を明らかに理解できず、そしておそらく自然種付け事象はおそらく数十億の精子を含むので、４桁も数が少ない数での人工受精の達成についての物理的制限が存在し得ると仮定された。従って、ある程度は、本発明者らが行った技術方向とは実際の逆の教示（ｔｅａｃｈ ａｗａｙ）が存在したことは、驚くべきことではないかもしれない。おそらく、この結果はさらに、ある程度まで予期されないとみなされ得る。なぜなら、この結果は、雌雄識別された低用量の人工受精が、雌雄識別していない高用量の人工受精の成功率と匹敵し得る成功率で達成され得ることを示したからである。本発明の技術および進歩を実際に組合せて、示された大きな結果が達成されることはある人にとってはさらに驚くべきことであり得る。各技術が、単離において、ある人によっては驚きではないと概説され得るとはいえ、実際は、単独で考慮されても、または他のわずかな変更との組合せで考慮されても、わずかな変更が最終的な結果に有意な進歩を与えるようである。
【００１１】
従って、本発明までは、雌雄識別した低用量人工受精についての成功率の達成は、必要な性能のレベルでは、または商業的実施を達成するために必要であるようである単純化された手順では、可能でなかった。しかし、今までに達成された商業的レベルの雌雄識別した低用量受精を超えて、本発明はまた、改善された性能の達成を可能にし、従って、所望される最終結果、すなわち、商業ベースでの雌雄識別した低用量人工受精を容易にする、技術を開示する。
【００１２】
（ＩＩＩ．発明の開示）
従って、本発明は、商業的レベルでの低用量受精および哺乳動物の性を予め決定するために適用されるような結果の達成を請求する。本発明はまた、フローサイトメーター分離技術を通してそれらの性を決定するための、精子細胞の選別のための改善されたシースシステムおよびコレクターシステムを提供する。この分離技術では、フローサイトメーターにおいて代表的に使用されるようなシース液は、精子細胞が選別されるときの精子細胞に対するストレスを最小にする流体で置換される。さらに、収集システムを改良して精子細胞が受ける物理的ストレスおよび化学的ストレスの両方を最小にする。種々の技術および物質が示されるが、当業者が容易に理解するように、種々の組合せおよび置換が、特定のプロセシング適用において関与する種、分離技術、目的、および他のパラメーターに基づく性能に最適化され得る様式で用いられ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の目的は、雌雄識別された受精を、より低い投与量で、現実的な商業環境の下で作動する様式において単に達成することである。目的はまた、物質（例えば、精子細胞）についてのより良好な選別を達成することである。関連する目的は、選別機能自体が細胞または選別され得る他の感受性部材に対して有する衝撃を最小にすることである。フローサイトメトリー選別技術について、具体的な目的は、シース液が細胞に与える衝撃を最小にし、そして関与する種々のストレスを扱う際に細胞を補助するように肯定的に作用するシース液を潜在的に提供することである。類似の目的は、一般的には精子細胞に、ウシ精子細胞に、ウマ精子細胞に、そしてＸ染色体保有構成要素およびＹ染色体保有構成要素へのこのような精子細胞の分離のために特に適切である物質および技術を提供することである。同様に、１つの目的は、収集期（例えば、選別後）が細胞に対して有する衝撃を最小にすること、ならびにこのような雌雄識別された精子細胞に対する物理的衝撃および化学的衝撃を最小にすることである。従って、１つの目的は、できる限り影響の少ない、選別の結果を達成することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、代表的な、雌雄識別していない高用量人工受精のレベルおよび成功率に匹敵するレベルおよび成功率を有する低用量の選別された受精を達成することである。この目的に一致して、目標は、商業的に実用的な様式でこの目的を達成し得る、人工受精についての全般的なシステムを提示することである。従って、精子細胞に対するストレスまたは潜在的な損傷を最小にするという先の目的は重要である。高速および低ストレスの両方の選別を提供し、そして低用量の状況での精子細胞選別に特に適応する様式の選別は、その上重要な目的である。精子の受精能に負に影響を与えず、かつ人工受精と適合するシース液および他の流体を提供するという目的もまた重要である。
【００１５】
当然、本発明のさらなる目的は、明細書および特許請求の範囲の他の領域を通して開示される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明によれば、予め決定された性を有する哺乳動物を産生する方法が提供され、この方法は、以下の工程：
ａ．哺乳動物の種の雄から精子細胞を収集する工程；
ｂ．複数の精子細胞の性特徴を決定する工程；
ｃ．その性特徴の決定に従って、精子細胞を選別する工程；
ｄ．代表的な人工受精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する工程；
ｅ．この受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する工程；
ｆ．哺乳動物の種の雌内の少なくとも１つの卵を、代表的な雌雄識別されていない人工受精投与量に対して統計学的比較可能な成功レベルで受精させる工程；
および
ｇ．所望の性の子孫哺乳動物を産生する工程、
を包含する。
【００１７】
１つの実施形態においては、哺乳動物の種の雌内の少なくとも１つの卵を、代表的な人工受精投与量に対して統計学的比較可能な成功レベルで受精させる上記工程が、この哺乳動物の種の雌内の少なくとも１つの卵を、少なくとも３５％、少なくとも４１％、少なくとも５０％、および少なくとも９０％からなる群より選択される成功レベルで受精させる工程を包含する。
【００１８】
１つの実施形態においては、哺乳動物の種の雄から精子細胞を収集する上記工程が、ウシおよびウマからなる群から選択される哺乳動物の種の雄から精子細胞を収集する工程を包含する。
【００１９】
１つの実施形態においては、代表的な人工受精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する上記工程が、代表的な雌雄識別されていない人工授精事象において提供される精子の代表的な数の１０％以下を有する受精サンプルを確立する工程を包含する。
【００２０】
１つの実施形態においては、代表的な人工受精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する上記工程が、１０万以下の精子細胞のウシ受精サンプル、２５万以下の精子細胞のウシ受精サンプル、３０万以下の精子細胞のウシ受精サンプル、１００万以下の精子細胞のウマ受精サンプル、５００万以下の精子細胞のウマ受精サンプル、１０００万以下の精子細胞のウマ受精サンプル、および２５００万以下の精子細胞のウマ受精サンプルからなる群より選択される受精サンプルを確立する工程を包含する。
【００２１】
１つの実施形態においては、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程、および哺乳動物の種の雌内の少なくとも１つの卵を、代表的な雌雄識別されていない人工受精投与量に対して統計学的比較可能な成功レベルで受精させる上記工程が、各々野外環境において達成される。
【００２２】
１つの実施形態においては、野外環境において、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程、および野外環境において哺乳動物の種の雌内の少なくとも１つの卵を代表的な雌雄識別されていない人工受精投与量に対して統計学的比較可能な成功レベルで受精させる上記工程が、有意な数の受精サンプルを、有意な数の哺乳動物の種の雌に、迅速に連続してかつ農場または牧場条件で反復的に挿入する工程を包含する。
【００２３】
１つの実施形態においては、上記哺乳動物が子宮角を有し、そして受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程が、受精サンプルを、同側および対側の両方で、哺乳動物の種の雌の子宮角内に挿入する工程を包含する。
【００２４】
１つの実施形態においては、上記哺乳動物が少なくとも１つの子宮角を有し、そして受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程が、受精サンプルを子宮角内に深く挿入する工程を包含する。
【００２５】
１つの実施形態においては、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程が、受精サンプルを子宮角内に深く挿入する工程をさらに包含する。
【００２６】
１つの実施形態においては、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程が、受精サンプルを、胎芽移植機器の使用によって子宮角内に挿入する工程をさらに包含する。
【００２７】
１つの実施形態においては、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程が、受精サンプルを、胎芽移植機器の使用によって子宮角内に挿入する工程をさらに包含する。
【００２８】
１つの実施形態においては、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程が、受精サンプルを、一般的に単一の人工受精に至適であると考えられている時間の１２時間後に挿入する工程を包含する。
【００２９】
１つの実施形態においては、代表的な人工授精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する上記工程が、凍結されていない受精サンプルを確立する工程を包含し、ここで、精子細胞を、その性特徴の決定に従って選別する上記工程を、選別時間で行い、そしてここで受精サンプルの少なくとも一部を、哺乳動物の雌種に挿入する上記工程を、選別時間から約１７時間より遅れずに行う。
【００３０】
１つの実施形態においては、代表的な人工授精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する上記工程が、凍結されていない受精サンプルを確立する工程を包含し、ここで、精子細胞をその性特徴の決定に従って選別する上記工程を、選別時間で行い、そしてここで受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の雌種に挿入する上記工程を、選別時間から約１０時間より遅れずに行う。
【００３１】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程が、細胞を、高濃度の染料を用いて染色する工程を包含する。
【００３２】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程が、細胞を、少なくとも約３８μＭ含量の染料を用いて染色する工程を包含する。
【００３３】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程、および精子細胞をその性特徴の決定に従って選別する上記工程が、以下の工程：
ａ．選別される細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．シース流体を化学的に調整して、細胞のためのシース流体環境を作製する工程であって、シース流体が、選別前細胞流体環境および選別後細胞流体環境の両方で調整される、工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
【００３４】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程、および精子細胞をその性特徴の決定に従って選別する上記工程が、以下の工程：
ａ．選別される細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．シース流体を化学的に調整して、細胞のためのシース流体環境を作製する工程であって、シース流体が、選別前細胞流体環境および選別後細胞流体環境の両方で調整される、工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
【００３５】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程、および精子細胞をその性特徴の決定に従って選別する上記工程が、以下の工程：
ａ．選別されるウシ精子細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．ウシ精子細胞のための、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含むシース流体を確立する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
【００３６】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程、および精子細胞をその性特徴の決定に従って選別する上記工程が、以下の工程：
ａ．選別されるウマ精子細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．ウマ精子細胞のための、ヘペス緩衝化培地を含むシース流体を確立する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
【００３７】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程、および精子細胞をその性特徴の決定に従って選別する上記工程が、以下の工程：
ａ．選別される細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．細胞のためのシース流体を確立する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集し、一方細胞を収集容器との衝撃から緩衝する工程、
を包含する。
【００３８】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程、および精子細胞をその性特徴の決定に従って選別する上記工程が、以下の工程：
ａ．選別されるウシ精子細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．ウシ精子細胞のためのシース流体を確立する工程；
ｃ．ウシ精子細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有するウシ精子細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の性特徴を有するウシ精子細胞を、上記収集工程を開始する前に約６％の卵黄を含むクエン酸収集液中で収集する、工程、
を包含する。
【００３９】
本発明の別の局面によれば、所望の性の哺乳動物を産生する方法が提供され、この方法は、上記プロセスを使用して上記哺乳動物を産生する工程を包含する。
【００４０】
１つの実施形態においては、上記方法は、精子細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【００４１】
１つの実施形態においては、上記方法は、排卵製剤を用いて、複数の卵の産生を生じる工程をさらに包含し、そしてここで哺乳動物の種の雌内の少なくとも１つの卵を、代表的な雌雄識別されていない人工受精投与量に対して統計学的に比較可能な成功レベルで受精する上記工程が、複数の卵を受精して、雌雄識別された複数の胚を産生する工程を包含する。
【００４２】
１つの実施形態においては、排卵製剤を用いて、複数の卵の産生を生じる上記工程が、１投与量の卵胞刺激ホルモンを一日に複数回注入する工程を包含する。
【００４３】
１つの実施形態においては、卵胞刺激ホルモンの投与量を一日に複数回注入する上記工程が、おおよそ半日の増分で、発情周期の９日目と１２日目との間の６、６、４、４、２、２、２、および２ｍｇの投与量レベルを含む卵胞刺激ホルモンを注入する工程を包含し、そして卵胞刺激ホルモンの第６および第７の投与量において、それぞれ２５および１２．５ｍｇのプロスタグランジンＦ−２−αを注入する工程をさらに包含する。
【００４４】
１つの実施形態においては、上記方法が、以下の工程：
ａ．雄哺乳動物の精子細胞を染色する工程；
ｂ．精子細胞の性に従って、高速フローサイトメトリーの使用によって選別する工程；および
ｃ．選別された精子細胞を濃縮する工程、
さらに包含する。
【００４５】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のための、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含むシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
【００４６】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、ウシ精子細胞を含む。
【００４７】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のための、ヘペス緩衝化培地を含むシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
【００４８】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、ウマ精子細胞を含む。
【００４９】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、そして約６％の卵黄を含むクエン酸コレクター流体を含む、コレクター、
を備える。
【００５０】
１つの実施形態においては、上記シース流体供給源が、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含む溶液を含む。
【００５１】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、ウシ精子細胞を含む。
【００５２】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源
；
ｂ．細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、そして流動に適合される容器
の物理的特徴を有する試験管を備える、コレクター、
を備える。
【００５３】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、機械的に繊細である細胞を含む。
【００５４】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、周囲の流体環境の化学的組成物に対して過応答受性である細胞を含む。
【００５５】
１つの実施形態においては、上記コレクターが、低用量の精子を提供するために使用される。
【００５６】
１つの実施形態においては、上記ノズル、上記発振器、上記細胞感受システム、および上記ソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの部分であり、そしてここでこのフローサイトメーターシステムが、高速セルソーターを備える。
【００５７】
１つの実施形態においては、上記ノズル、上記発振器、上記細胞感受システム、および上記ソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの部分であり、そしてここでこのフローサイトメーターシステムが、高速セルソーターを備える。
【００５８】
本発明の別の局面によれば、雌雄識別された精子標本が提供され、この標本は、上記システムに従って産生される。
【００５９】
１つの実施形態においては、上記コレクターは、低用量の精子を提供するために使用される。
【００６０】
１つの実施形態においては、上記ノズル、上記発振器、上記細胞感受システム、および上記ソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの部分であり、そしてここでこのフローサイトメーターシステムが、高速セルソーターを備える。
【００６１】
１つの実施形態においては、上記コレクターは、低用量の精子を提供するために使用される。
【００６２】
本発明の別の局面によれば、上記のシステムに従って産生される雌雄識別された精子標本を使用して産生される、哺乳動物が提供される。
【００６３】
１つの実施形態においては、上記哺乳動物は、低用量の精子の使用によって産生される。
【００６４】
１つの実施形態においては、上記ノズル、上記発振器、上記細胞感受システム、および上記ソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの部分であり、そしてここでこのフローサイトメーターシステムが、高速セルソーターを備える。
【００６５】
１つの実施形態においては、上記哺乳動物は、低用量の精子の使用によって産生される。
【００６６】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための、改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する、細胞供給源；
ｂ．選別前および選別後の細胞流体環境の両方で調整されるように選択される、細胞のためのシース流体環境を作製する、化学的に調整されたシース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するために作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
【００６７】
１つの実施形態においては、上記選別前および選別後の細胞流体環境が、上記細胞が特に応答性である少なくとも１つの過応答性化学組成物を含み、そして上記化学的に調整されるシース流体供給源が、この過応答性化学的組成物に対する変化を最小化する。
【００６８】
１つの実施形態においては、上記過応答性化学的組成物が、代謝性化学的組成物を含む。
【００６９】
１つの実施形態においては、上記過応答性化学的組成物がクエン酸を含む。
【００７０】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、上記選別前細胞流体環境を作製し、そして上記コレクターが、上記選別後細胞流体環境を作製する。
【００７１】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が非修復細胞を含む。
【００７２】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、非転写ＤＮＡを有する細胞を含む。
【００７３】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、非複製ＤＮＡを有する細胞を含む。
【００７４】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、精子細胞を含む。
【００７５】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、ウシ精子細胞を含む。
【００７６】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、ウマ精子細胞を含む。
【００７７】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、シース流体環境中の化学的組成物に対して過応答受性である細胞を含む。
【００７８】
１つの実施形態においては、上記コレクターが、低用量の精子を提供するために使用される。
【００７９】
１つの実施形態においては、上記低用量の精子が、代表的な投与量の約１０％未満の投与量を含む。
【００８０】
１つの実施形態においては、上記精子細胞がウシ精子細胞を含み、そして上記低用量の精子が、約５０万未満の精子の投与量を含む。
【００８１】
１つの実施形態においては、上記精子細胞がウシ精子細胞を含み、そして上記低用量の精子が、約３０万未満の精子の投与量を含む。
【００８２】
１つの実施形態においては、上記精子細胞がウマ精子細胞を含み、そして上記低用量の精子が、約１０００万未満の精子の投与量を含む。
【００８３】
１つの実施形態においては、上記化学的に調整されたシース流体供給源が、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含む溶液を含む。
【００８４】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、ウシ精子細胞を含む。
【００８５】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のための、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含む溶液を含むシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
【００８６】
１つの実施形態においては、上記コレクターは、人工授精のための精子を提供するために使用される。
【００８７】
１つの実施形態においては、上記コレクターは、人工授精のための低用量の精子を提供するために使用される。
【００８８】
１つの実施形態においては、上記化学的に調整されたシース流体供給源が、ヘペス緩衝化培地を含む溶液を含む。
【００８９】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、ウマ精子細胞を含む。
【００９０】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサ
イトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のための、ヘペス緩衝化培地を含む溶液を含むシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
【００９１】
１つの実施形態においては、上記コレクターは、人工授精のための精子を提供するために使用される。
【００９２】
１つの実施形態においては、上記コレクターは、人工授精のための低用量の精子を提供するために使用される。
【００９３】
１つの実施形態においては、上記ノズル、上記発振器、上記細胞感受システム、および上記ソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの部分であり、そしてここでこのフローサイトメーターシステムが、高速セルソーターを備える。
【００９４】
１つの実施形態においては、上記高速セルソーターが、１秒あたり少なくとも約５００を選別する速度で、分析されるべき細胞を選別する。
【００９５】
１つの実施形態においては、上記高速セルソーターが、１平方インチあたり少なくとも約５０ポンドの圧力で操作される。
【００９６】
１つの実施形態においては、上記コレクターが緩衝要素を含む容器を備える。
【００９７】
１つの実施形態においては、上記容器が、広い収集管を備える。
【００９８】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべきウシ精子細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のための、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含むシース流体環境を作製する、化学的に調整されたシース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、約６％の卵黄を含むクエン酸収集流体を含み、そして約５０万未満の精子の投与量を提供するために使用される、コレクター、
を備え、
ここで、これらのノズル、発振器、細胞感受システム、およびソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの一部であって、このフローサイトメーターシステムが、１秒あたり少なくとも約５００を選別する速度で、分析されるべき精子細胞を選別し、そして１平方インチあたり少なくとも約５０ポンドの圧力で操作される。
【００９９】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべきウマ精子細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のための、ヘペス緩衝化培地を含むシース流体環境を作製する、化学的に調整されたシース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、ヘペス緩衝化培地を含む収集流体を含み、そして約１０００万未満の精子の投与量を提供するために使用される、コレクター、
を備え、
ここで、これらのノズル、発振器、細胞感受システム、およびソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの一部であって、このフローサイトメーターシステムが、１秒あたり少なくとも約５００を選別する速度で、分析されるべき細胞を選別し、そして１平方インチあたり少なくとも約５０ポンドの圧力で操作される。
【０１００】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための、改良されたフロー
サイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する、細胞供給源；
ｂ．細胞のためのシース流体環境と、選別前および選別後の細胞流体環境の両方との間の変化を最小化するための手段；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するために作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置される、コレクター、
を備える。
【０１０１】
１つの実施形態においては、細胞のためのシース流体環境と選別前および選別後の細胞流体環境の両方との間の変化を最小化するための上記手段が、上記シース流体を含む。
【０１０２】
１つの実施形態においては、上記コレクターがコレクター流体を含み、そして細胞のためのシース流体環境と選別前および選別後の細胞流体環境の両方との間の変化を最小化するための上記手段が、このコレクター流体を含む。
【０１０３】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．所望の特徴を有する細胞が内部に配置され、そして化学的に調整されたコレクター流体シース流体共有源を備える、コレクターであって、このコレクター流体シース流体供給源が、以前の細胞流体環境で調整されるよう選択される、細胞のためのコレクター流体環境を作製する、コレクター、を備える。
【０１０４】
１つの実施形態においては、上記コレクター流体が、細胞の選別の完了後に栄養分のレベルを平均化するために調整される栄養分を含む。
【０１０５】
１つの実施形態においては、上記コレクター流体が、約６％の卵黄を含むクエン酸溶液を含む。
【０１０６】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、上記コレクター流体環境中の化学的組成物に対して過応答性である細胞を含む。
【０１０７】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が精子細胞を含む。
【０１０８】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源がウシ精子細胞を含む。
【０１０９】
１つの実施形態においては、上記コレクターが、低用量の精子を提供するために使用される。
【０１１０】
１つの実施形態においては、上記低用量の精子が、代表的な投与量の約１０％未満の投与量を含む。
【０１１１】
１つの実施形態においては、上記精子細胞がウシ精子細胞を含み、そして上記低用量の精子が、約５０万未満の精子の投与量を含む。
【０１１２】
１つの実施形態においては、上記精子細胞がウシ精子細胞を含み、そして上記低用量の精子が、約３０万未満の精子の投与量を含む。
【０１１３】
１つの実施形態においては、上記ノズル、上記発振器、上記細胞感受システム、および上記ソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの部分であり、そしてここで、このフローサイトメーターシステムが、高速セルソーターを備える。
【０１１４】
１つの実施形態においては、上記高速セルソーターが、分析されるべき細胞を、１秒あたり少なくとも約５００を選別する速度で選別する。
【０１１５】
１つの実施形態においては、上記高速セルソーターが、１平方インチあたり少なくとも約５０ポンドの圧力で操作される。
【０１１６】
１つの実施形態においては、上記シース流体供給源が、選別前および選別後の精子流体環境の両方で調整されるように選択される、細胞のためのシース流体環境を作製する、化学的に調整されたシース流体供給源を備える。
【０１１７】
１つの実施形態においては、上記化学的に調整されたシース流体供給源が、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含む溶液を含む。
【０１１８】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する細胞供給源；
ｂ．細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．緩衝要素を備えるコレクター、
を備える。
【０１１９】
１つの実施形態においては、上記コレクターが、上記緩衝要素を備える容器を備える。
【０１２０】
１つの実施形態においては、上記容器が広い収集管を備える。
【０１２１】
１つの実施形態においては、上記広い収集管が、少なくとも約１５ｍｍの幅である。
【０１２２】
１つの実施形態においては、上記容器が、流動に適合される容器の物理的特徴を有する試験管を備える。
【０１２３】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、機械的に繊細である細胞を含む。
【０１２４】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が精子細胞を含む。
【０１２５】
１つの実施形態においては、上記コレクターが緩衝要素を備える。
【０１２６】
１つの実施形態においては、上記コレクターが、上記緩衝要素を備える容器を備える。
【０１２７】
１つの実施形態においては、上記容器が広い収集管を備える。
【０１２８】
１つの実施形態においては、上記広い収集管が、少なくとも約１５ｍｍの幅である。
【０１２９】
１つの実施形態においては、上記容器が、流動に適合される容器の物理的特徴を有する試験管を備える。
【０１３０】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が、機械的に繊細である細胞を含む。
【０１３１】
１つの実施形態においては、上記細胞供給源が精子細胞を含む。
【０１３２】
１つの実施形態においては、上記ノズル、上記発振器、上記細胞感受システム、および上記ソーター識別システムが、フローサイトメーターシステムの部分であり、そしてここで、このフローサイトメーターシステムが、高速セルソーターを備える。
【０１３３】
１つの実施形態においては、上記セルソーターが、１秒あたり少なくとも約５００を選別する速度で、分析されるべき細胞を選別する。
【０１３４】
１つの実施形態においては、上記高速セルソーターが、１平方インチあたり少なくとも約５０ポンドの圧力で操作される。
【０１３５】
本発明の別の局面によれば、所望の細胞を単離するための、改良されたフローサイトメーターシステムが提供され、このシステムは、以下：
ａ．フローサイトメーターによって分析されるべき細胞を供給する、細胞供給源；
ｂ．細胞のためのシース流体環境を作製する、シース流体供給源；
ｃ．細胞が、シース流体環境に供される間に通過する、ノズル；
ｄ．シース流体がノズルを通過する際にシース流体に作用する、発振器；
ｅ．細胞に応答する、細胞感受システム；
ｆ．所望の特徴を有する細胞を選別するように作用する、ソーター識別システム；および
ｇ．細胞とコレクターとの間の衝撃を回避するための手段を備える、コレクター、
を備える。
【０１３６】
本発明の別の局面によれば、予め決定された性を有する哺乳動物を産生する方法が提供され、この方法は、以下の工程：
ａ．哺乳動物の雄の種から精子細胞を収集する工程；
ｂ．複数の精子細胞の性特徴を決定する工程；
ｃ．その性特徴の決定に従って精子細胞を選別する工程；
ｄ．代表的な人工受精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する工程；
ｅ．受精サンプルの少なくとも一部を、哺乳動物の雌種に挿入する工程；
ｆ．哺乳動物の雌種内の少なくとも１つの卵を受精させる工程；ならびに
ｇ．所望の性の子孫哺乳動物を産生する工程、
を包含する。
【０１３７】
１つの実施形態においては、哺乳動物の雄の種から精子細胞を収集する上記工程が、ウシおよびウマからなる群より選択される哺乳動物の雄の種から精子細胞を収集する工程を包含する。
【０１３８】
１つの実施形態においては、代表的な人工受精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する上記工程が、代表的な雌雄識別されていない人工授精事象において提供される精子の代表的な数の１０％以下を有する受精サンプルを確立する工程を包含する。
【０１３９】
１つの実施形態においては、代表的な人工受精投与量と比較して、少ない数の精子細胞を有する受精サンプルを確立する上記工程が、１０万以下の精子細胞のウシ受精サンプル、２５万以下の精子細胞のウシ受精サンプル、３０万以下の精子細胞のウシ受精サンプル、１００万以下の精子細胞のウマ受精サンプル、５００万以下の精子細胞のウマ受精サンプル、１０００万以下の精子細胞のウマ受精サンプル、および２５００万以下の精子細胞のウマ受精サンプルからなる群より選択される受精サンプルを確立する工程を包含する。
【０１４０】
１つの実施形態においては、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程、および少なくとも１つの卵を哺乳動物の種の雌内で受精させる上記工程が、各々野外環境において達成される。
【０１４１】
１つの実施形態においては、受精サンプルの少なくとも一部を哺乳動物の種の雌に挿入する上記工程が、受精サンプルを、胎芽移植機器の使用によって子宮角内に挿入する工程をさらに包含する。
【０１４２】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程が、細胞を、高濃度の染料を用いて染色する工程を包含する。
【０１４３】
１つの実施形態においては、複数の精子細胞の性特徴を決定する上記工程、およびその性特徴の決定に従って精子細胞を選別する上記工程が、以下の工程：
ａ．選別されるべき細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．選別前細胞流体環境および選別後細胞流体環境の両方で調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；ならびに
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
【０１４４】
本発明の別の局面によれば、所望の性の哺乳動物を産生する方法が提供され、この方法は、上記プロセスを使用して上記哺乳動物を産生する工程を包含する。
【０１４５】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【０１４６】
本発明の別の局面によれば、細胞を選別する方法が提供され、この方法は、以下の工程：
ａ．選別される細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．選別前および選別後の細胞流体環境の両方で調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の特徴を有する細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
【０１４７】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記細胞が上記シース流体に供される結果として供される化学的変化を最小化する工程をさらに包含する。
【０１４８】
１つの実施形態においては、細胞供給源を確立する上記工程が、非修復細胞の供給源を確立する工程を包含する。
【０１４９】
１つの実施形態においては、細胞供給源を確立する上記工程が、精子細胞の供給源を確立する工程を包含する。
【０１５０】
１つの実施形態においては、細胞供給源を確立する上記工程が、ウシ精子細胞の供給源を確立する工程を包含する。
【０１５１】
１つの実施形態においては、細胞供給源を確立する上記工程が、ウマ精子細胞の供給源を確立する工程を包含する。
【０１５２】
１つの実施形態においては、上記方法は、低用量の上記精子細胞を使用して哺乳動物を受精させる工程をさらに包含する。
【０１５３】
１つの実施形態においては、選別前および選別後の細胞流体環境の両方で調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する上記工程が、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含むシース流体を確立する工程を包含する。
【０１５４】
１つの実施形態においては、選別前および選別後の細胞流体環境の両方で調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する上記工程が、ヘペス緩衝化培地を含むシース流体を確立する工程を包含する。
【０１５５】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【０１５６】
１つの実施形態においては、細胞を高速で選別する上記工程が、細胞を１平方インチあたり少なくとも約５０ポンドの圧力に供する工程を包含する。
【０１５７】
１つの実施形態においては、所望の特徴を有する細胞を収集する上記工程が、上記細胞の上記収集容器との衝撃を緩衝する工程を包含する。
【０１５８】
１つの実施形態においては、細胞の収集容器との衝撃を緩衝する上記工程が、広い開口部をこの容器に提供する工程を包含する。
【０１５９】
本発明の別の局面によれば、細胞を選別する方法が提供され、この方法は、以下の工程：
ａ．選別されるべき細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を確立する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；
ｅ．所望の性特徴を有する細胞をコレクター流体において収集する工程；ならびに
ｆ．選別前流体環境で調整される、細胞のための終了コレクター流体環境を作製するために、このコレクター流体を化学的に調整する工程、
を包含する。
【０１６０】
１つの実施形態においては、細胞供給源を確立する上記工程が、細胞のための最初の栄養素を提供する工程を包含し、そしてさらに、細胞のための収集流体栄養素を提供する工程を包含し、そしてコレクター流体において所望の特徴を有する細胞を収集する上記工程が、細胞を収集する工程の完了後に、最初の栄養素とコレクター流体栄養素とを平衡化させる工程を包含する。
【０１６１】
１つの実施形態においては、コレクター流体において所望の特徴を有する細胞を収集する上記工程が、収集するこの工程を開始する前に、約６％の卵黄を含むクエン酸収集流体を確立する工程を包含する。
【０１６２】
１つの実施形態においては、細胞供給源を確立する上記工程が、ウシ精子細胞の供給源を確立する工程を包含する。
【０１６３】
１つの実施形態においては、上記方法は、低用量の上記精子細胞を使用して、哺乳動物を受精させる工程をさらに包含する。
【０１６４】
本発明の別の局面によれば、細胞を選別する方法が提供され、この方法は、以下の工程：
ａ．選別されるべき細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を確立する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；ならびに
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集する工程であって、細胞が収集容器と衝突することを緩衝する工程を包含する、工程、
を包含する。
【０１６５】
１つの実施形態においては、細胞が収集容器と衝突することを緩衝する上記工程が、この容器に広い開口部を提供する工程を包含する。
【０１６６】
１つの実施形態においては、細胞供給源を提供する上記工程が、機械的に繊細である細胞の供給源を確立する工程を包含する。
【０１６７】
１つの実施形態においては、細胞供給源を確立する上記工程が、精子細胞の供給源を確立する工程を包含する。
【０１６８】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【０１６９】
１つの実施形態においては、細胞を高速で選別する上記工程が、細胞を、１平方インチあたり少なくとも約５０ポンドの圧力に供する工程を包含する。
【０１７０】
本発明の別の局面によれば、雌雄識別された精子標本を産生する方法が提供され、この方法は、上記プロセスを使用して標本を作製する工程を包含する。
【０１７１】
１つの実施形態によれば、上記方法は、上記細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【０１７２】
１つの実施形態においては、上記方法は、低用量の上記精子細胞を使用して哺乳動物を受精させるための、雌雄識別された精子標本を提供する工程を、さらに包含する。
【０１７３】
１つの実施形態においては、上記方法は、低用量の精子細胞を使用して哺乳動物を受精させるための、雌雄識別された精子標本を提供する工程を、さらに包含する。
【０１７４】
本発明の別の局面によれば、所望の性別の哺乳動物を産生する方法が提供され、この方法は、上記プロセスのいずれかを使用して哺乳動物を産生する工程を包含する。
【０１７５】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【０１７６】
１つの実施形態においては、上記方法は、低用量の精子細胞を使用して、哺乳動物を受精させる工程をさらに包含する。
【０１７７】
１つの実施形態においては、上記方法は、低用量の精子細胞を使用して、哺乳動物を受精させる工程をさらに包含する。
【０１７８】
本発明の別の局面によれば、雌の哺乳動物から、雌雄識別された性を有する胚を複数産生する方法が提供され、この方法は、以下の工程：
ａ．複数の卵が産生されるために排卵製剤を使用する工程を包含する、少なくとも２つの卵を作製するために哺乳動物において過剰排卵を作製する工程；
ｂ．雄の哺乳動物の精子細胞の性を決定する工程；
ｃ．精子細胞の性に従って選別する工程；
ｄ．排卵の開始後に、雌の哺乳動物の子宮内に選別された精子細胞の少なくとも一部を挿入する工程；および
ｅ．雌雄識別された胚を複数産生するために、子宮中の複数の卵を受精させる工程、
を包含する。
【０１７９】
１つの実施形態においては、過剰排卵を作製する上記工程が、発情周期の間に促進される。
【０１８０】
１つの実施形態においては、排卵製剤を使用する上記工程が、排卵製剤を、発情周期の任意の２日目と１８日目との間、半日の増分で注入する工程を包含する。
【０１８１】
１つの実施形態においては、排卵製剤を半日の増分で注入する上記工程が、少なくとも７回の注射で注射する工程を包含し、そしてさらに少なくとも約６回目および７回目の注射の際に排卵操作システムを組み入れる工程を包含する。
【０１８２】
１つの実施形態においては、子宮内に選別された精子細胞の少なくとも一部を挿入する上記工程が、精子細胞を、この子宮の両方の子宮角に挿入する工程を包含する。
【０１８３】
１つの実施形態においては、両方の子宮角内に挿入する上記工程が、上記排卵の開始後約２０〜２４時間で精子細胞を挿入する工程を包含する。
【０１８４】
１つの実施形態においては、複数の卵が産生されるために排卵製剤を使用する上記工程が、１投与量の卵胞刺激ホルモンを１日複数回注入する工程を包含する。
【０１８５】
１つの実施形態においては、少なくとも２つの卵を作製するために哺乳動物において過剰排卵を作製する上記工程が、上記投与量の卵胞刺激ホルモンにプロスタグランジンＦ−２−αを補充する工程を包含する、排卵操作システムを組み入れる工程をさらに包含する。
【０１８６】
１つの実施形態においては、１日複数回卵胞刺激ホルモンの投与量を注入する上記工程が、上記発情期の９日と１２日との間の６、６、４、４、２、２、２、および２ｍｇの投与量レベルでの約半日の増分において卵胞刺激ホルモンを注入する工程を包含し、ここで、卵胞刺激ホルモンの投与量にプロスタグランジンＦ−２−αを補給する工程が、卵胞刺激ホルモンのそれぞれ第６および第７の投与量において、２５ｍｇおよび１２．５ｍｇのプロスタグランジンＦ−２−αを注入する工程を包含する。
【０１８７】
１つの実施形態においては、上記方法は、以下の工程：
ａ．雄の哺乳動物の精子細胞を染色する工程；
ｂ．高速フローサイトメトリーを使用して、精子細胞の性に従って選別する工程；および
ｃ．選別された精子細胞を濃縮する工程、
をさらに包含する。
【０１８８】
１つの実施形態においては、選別された精子細胞の少なくとも一部を挿入する上記工程が、低用量の精子細胞を使用する工程を包含する。
【０１８９】
１つの実施形態においては、選別された精子細胞の少なくとも一部を挿入する上記工程が、低用量の精子細胞を使用する工程を包含する。
【０１９０】
本発明の別の局面においては、所望の性の哺乳動物を産生する方法が提供され、この方法は、上記プロセスを使用して上記哺乳動物を産生する工程を包含する。
【０１９１】
本発明の別の局面においては、所望の性の哺乳動物を産生する方法が提供され、この方法は、上記プロセスを使用して、雌雄識別された精子細胞の哺乳動物を産生する工程を包含し、そして上記細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【０１９２】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記雌の哺乳動物を、低用量の精子細胞を使用して受精させる工程をさらに包含する。
【０１９３】
１つの実施形態においては、上記方法は、選別前および選別後の細胞流体環境の両方で調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する上記工程をさらに包含し、この工程は、約２．９％のクエン酸ナトリウムを含むシース流体を確立する工程を包含する。
【０１９４】
１つの実施形態においては、選別前および選別後の細胞流体環境の両方で調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する上記工程が、ヘペス緩衝化培地含むシース流体を確立する工程を包含する。
【０１９５】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記性の精子細胞を収集する工程、および細胞が収集容器と衝突することを緩衝する工程を、さらに包含する。
【０１９６】
本発明の別の局面によれば、細胞を選別する方法が提供され、この方法は、以下の工程：
ａ．選別されるべき細胞を供給する細胞供給源を確立する工程；
ｂ．選別前の細胞流体環境と選別後の細胞流体環境との両方によって調整される、細胞のためのシース流体環境を作製するために、シース流体を化学的に調整する工程；
ｃ．細胞の特性を感受する工程；
ｄ．所望の性特徴を有する細胞間を識別する工程；および
ｅ．所望の性特徴を有する細胞を収集する工程、
を包含する。
【０１９７】
１つの実施形態においては、上記方法は、上記細胞を高速で選別する工程をさらに包含する。
【発明の効果】
【０１９８】
本発明によれば、雌雄識別された受精が、より低い投与量で、現実的な商業環境の下で作動する様式において達成される。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】図１は、本発明についてのフローサイトメーター分離技術によるソーターシステムの模式図である。
【図２】図２は、代表的なフローサイトメーターの自由落下領域において飛沫同伴した細胞の図である。
【図３】図３は、本発明の結果としてほぼ表れた差異を示す概念図である。
【図４】図４は、着陸帯領域において収集されるような選別した細胞流の図である。
【発明を実施するための形態】
【０２００】
みられるように、本発明の基本概念は、種々の方法において組み合わせられ、そして包含され得る。本発明は、単に、商業的に実用的な低用量、性交での受精およびこの結果を含む。フローサイトメトリ分離技術について、本発明はまた、改良されたフローサイトメーターシステム、ならびに人工受精およびこのような技術により産生される動物に使用され得る性特異的精子サンプルの作製についてのシステムの両方を含む。本発明は、高い成功率が商業的な環境においてでさえ可能である全体的なプロセスを含む。さらに、この技術は、一般的な様式で開示されるので、一旦、この一般的な原理が理解されると、これらの技術が特定のシステムおよび適用に適用され得る。デバイス増強が開示されるが、これらの増強は、特定の方法を達成するのみではなく、多数の方法において変動され、そして組み合わされ得ることが理解されるべきである。重要なことに、上記の全てに関して、これらの様相の各々が、本開示により包含されることが理解されるべきである。
【０２０１】
述べたように、基本的な目的は、Ｙ保有精子からＸ保有精子を分離することである。これは、各々を別々に包装し、そして処理し得るように、２つの型の精子を単離する様式において実行される。現在、この単離は、好ましくは、フローサイトメトリの使用を通じて実行される。一般にフローサイトメトリは、よく理解される技術である。例えば、それの基本的な局面は、Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．に対する種々の特許（例えば、米国特許および先に列挙された他の刊行物）において示され、そして議論される。これらの特許および本明細書中で引用される参考文献の各々は、参考として援用される；従って、当業者は、含まれる基本的な原理を容易に理解し得る。
【０２０２】
本質的に、フローサイトメトリは、いくつかの型の細胞供給源を通じてフローサイトメーター機器に提供された、選別する対象（例えば、細胞）を含む。概念的な機器を図１に示す。このフローサイトメーター装置は、フローサイトメーターにより分析される細胞またはいくつかの他の型の対象を確立するかまたは供給するように作用する、細胞供給源（１）を備える。この細胞は、細胞がシース液（３）により包囲されるような様式において、ノズル（２）内に蓄積される。このシース液（３）は、通常、この細胞供給源（１）がその細胞を供給し、このシース液（３）がノズル（２）を介して同時に給送されるような、いくらかのシース液源（４）により供給される。この様式において、このシース液（３）が細胞のためのシース液環境をどのように形成するか容易に理解され得る。種々の流体は、同じ圧力でフローサイトメーターに提供されるために、それらはノズル（２）から流出し、そしてノズル開口部（５）で出る。発振制御（１９）を通じて非常に正確に制御され得るいくつかの型の発振器（６）を提供することによって、気圧波は、ノズル（２）内に定着され、そしてノズル開口部（５）でのノズル（２）を出す流体に変換され得る。従って、発振器（６）は、シース液（３）に作用するために、ノズル開口部（５）を出る流動（７）は、最終的および調節的にドロップ（８）を形成する。細胞は、シース液環境に包囲されているので、ドロップ（８）は、それらの内部に個々の単離された細胞または他の対象を含み得る。
【０２０３】
ドロップ（８）は一般に、単離された細胞を含むために、このフローサイトメーターは、適切な細胞（単数または複数）がドロップ内に含まれるか否かに基づいて液滴を区別し、そして分離し得る。これは、細胞感受システム（９）を通じて達成される。この細胞感受システムは、Ｌａｒｒｙ Ｊｏｈｎｓｏｎ、すなわち、米国特許第５１３５７５９号による独創的な研究（語呂合わせは意図されない）の長さで議論されるように、各ドロップ（８）内に含まれる細胞に応答する少なくともいくつかの型のセンサー（１０）を備える。Ｊｏｈｎｓｏｎ特許が精子細胞を説明するように、この細胞感受システム（９）は、レーザー励磁機（１１）のようないくつかの刺激により励磁され得る特定の色素の相対的な存在または相対的な非存在に依存する作用を生じ得る。各々の型の精子細胞は、この色素により染色されるが、Ｘ染色体およびＹ染色体の異なる長さは、異なるレベルの染色を生じる。従って、精子細胞中に存在する色素の程度を検出することによって、それらの異なる発光レベルによりＸ保有精子とＹ保有精子との間を識別することが可能である。
【０２０４】
フローサイトメーター分離技術において適切な細胞の究極的な分離および単離を達成するために、センサー（１０）により受け取られるシグナルは、いくつかの型のソーター識別システム（１２）に送り込まれ、このシステムは、非常に迅速に決定を行い、そして所望の細胞がドロップ（８）内に存在するか否かの決定に基づいて各ドロップ（８）を差示的に荷電し得る。この様式において、このソーター識別システム（１２）は、それらが適切な細胞または他の対象を含むか否かに基づいて、静電気的な偏向プレート（１３）が、ドロップ（８）を偏向させることを許容するように作用する。結果として、このフローサイトメーターは、細胞を１つ以上のコレクター（１４）に収集させることによって、細胞を分類するように作用する。従って、細胞または他の対象のいくつかの性質を感受することによって、このフローサイトメーターは、特定の特徴に基づく細胞間を識別し、そして適切なコレクター（１４）に細胞を配置する。精子を分類するために現在使用されるシステムにおいて、Ｘ保有精子液滴は、正に荷電され、従って、１つの方向へ偏向し、Ｙ保有精子液滴は、負に荷電され、従って、他の向きに偏向し、そして廃棄された流動（すなわち、選別不能細胞）は、荷電されず、従って、偏向されない流動中において吸水管などに収集される。
【０２０５】
図２を参照すると、このプロセスは、さらによく理解され得る。この図に示されるように、ノズル（２）は、発振器（６）（図２で示されず）がドロップ（８）を形成するので、流動（７）を発する。細胞供給源（１）（図２に示されず）は、Ｊｏｈｎｓｏｎの技術に従い染色されている精子細胞（１５）を供給し得るので、レーザー励磁機（１１）による光刺激は、それが流動（７）から分離するように各ドロップ（８）上の電荷の存在または非存在が、フローサイトメーターにより制御され得るように、センサー（１０）によって差示的に決定される。この制御は、それらの内容物に基づいて、正荷電、負荷電、および非荷電ドロップ（８）を生じる。図２に示されるように、特定のドロップは、偏向されたドロップ（１６）として示される。これらの偏向されたドロップ（１６）は、一方の性または他方の性の精子細胞（１５）を含むドロップである。次いで、それらは、後の使用のために適切なコレクター（１４）に蓄積される。
【０２０６】
精子の選別に対するその適用に特に重要であるフローサイトメトリの１つの局面は、フローサイトメーターの高速な作動である。進歩は、ＭｏＦｌｏ（登録商標）商標の下でＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を介して入手可能なフローサイトメーターにより特に作製されている。これらのフローサイトメーターは、並外れて増加した選別速度を有し、従って、フローサイトメトリを精子選別の現実的な商業的適用（他の商業的適用）にするようである技術にした。それらは、別の利用される分類よりも著しくより速い速度での高速選別を達成するように作用する。具体的には、Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ’ｓ ＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメーターは約５ｋＨｚよりも大きい発振器の周波数で作用し、そしてより具体的には、１０〜３０か、またはさらに５０ｋＨｚの範囲内において操作され得る。従って、液滴は非常に高周波数で形成され、そしてシース液環境内に含まれる細胞は、ノズル（２）から非常に迅速に放射され得る。結果として、フローサイトメーターシステムを構成しそして部分である、ノズル（２）、発振器（６）などのような構成要素の各々は、設定されるかまたは選択され、高速な細胞ソーターを生じ得る。精子細胞の選別に対する高速な細胞ソーターの適用において、１秒当たり約５００を選別するよりも大きい速度での選別が達成される。実際、１０００および１２００の範囲での選別速度は、高速な細胞ソーターを介して既に達成されている。重要なことに、用語「高速」は、フローサイトメトリにおける他の利点および特定の適用が達成されるような相対的な用語であり、「高」とみなされる局面は、変動し得るかまたは絶対的なままであり得ることが理解されるべきである。いずれかの定義において、この一般原理は、精子細胞のような特定の細胞を選別する場合、この分類が、フローサイトメーターのパラメーターおよび物理的な性質が細胞自体に対して有意である速度で生じ得ることである。
【０２０７】
フローサイトメーター分離技術を介して精子細胞を選別する場合に効果を示すようである高速選別の１つの局面は、精子細胞がフローサイトメーター内に供される、圧力および他のストレスのそれである。例えば、高速（および「高速」の代替的な定義）で操作した場合、フローサイトメーターを、１インチの２乗当たり５０ポンドおよび１インチの２乗当たり６０以上のポンドの圧力で操作され得る。これらの圧力は、高いとみなされ得る。なぜなら、これらの圧力は、選別されている細胞に効果を生じ得るからである。この様相に対して本発明で開示されるような手がかりは、特定の細胞のストレス閾値が決定因子であるという事実である。さらに、さらなる知識が得られるので、ストレスの閾値は、細胞の、特定の種、あるいは特定の前かまたは続く取扱いのような、組み合わされた効果の関数であることが示され得る。このことに関しての手がかりは、細胞に課されたストレスが、実際、所望の結果を達成するためにそれらの生存率およびそれらの能力を変化し得ることである。圧力の場合では、その圧力でフローサイトメーターの操作の結果として精子細胞をより高い圧力に単に供することは、細胞の減少した性能を生じ得る。１つの点に関して、本発明は、これらのストレスを最小化するように作用し、従って、以下で議論されるようなより大きい効率ならびに低い用量を生じる。
【０２０８】
細胞のストレスの局面を考慮する際に、本発明は、このストレスを最小化する様式で作用する。これらのストレスは、周期あるいは動物を制御、選別、または受精させるプロセスの全てにわたって任意の時点で最小化され得る。重要なことに、フローサイトメーター内で細胞を取扱うことによって課されるストレスは、この適用に有意であるようである。本発明の１つの実施形態において、シース液は、特異的に選択され、選別前細胞流体の環境または選別後細胞流体の環境の両方（またはいずれか）の調製された様式において供し得る。天然では、選別前流体または選別後流体のいずれかで調節することが可能であるが、１つの実施形態では、本発明は、シース液（３）を調節し、以前に達成されたよりもその細胞において有意に少ないストレスを課する。１つの点に関して、本発明は、細胞自体からのストレスを取扱いそして取り除く際の焦点に対して、フローサイトメーターの操作の焦点から総焦点を取り除くという点で顕著である。例えば、適切なｐＨ因子または浸透圧（ｏｓｍｏａｌｉｔｙ）を有する流体を利用することは公知となっているが、本発明は、細胞が過応答受性であり得る特定の化学的組成物が存在し得ることを認識する。これらの過応答性の化学的組成物は、天然で、細胞に基づいて、または細胞の取扱いの前でさえ変動し得る。重要なことに現在、精子細胞の特定の代謝性化学的組成物（例えば、クエン酸）は、細胞上の異常な高ストレスを予防するようであることが明白である。従って、過応答性の化学的組成物は、細胞がそれらの機能性および既存の取扱い技術の状況内で特に応答性である化学的組成物として規定され得る。精子細胞に関して、代謝性組成物、具体的には、ウシ精子細胞についてのクエン酸定常性およびウマ精子細胞についてのｈｅｐｅｓ緩衝液定常性は、非常に重要であり得ることが明らかである。従って、本発明は、操作の型または基質の選択を介する変化を最小にするように作用し、これは、細胞が経験する変化を最小にするための手段として作用し得る。
【０２０９】
シース液について、物質は、本発明の１つの実施形態に従って選択され、その結果、最小の変化を与えるように化学的に調整され得る。従って、フローサイトメトリのパラメータの状況内のみではなく、むしろ細胞のパラメータ自体の状況内でもまた適切なシース液を選択することによって、細胞が経験した変化およびこの選別全体にわたる結果が増強され得る。これは、図３に概念的に示される。図３は、いくつかの型の化学的な因子（例えば、クエン酸または他の因子）を示す。なぜなら、それはこのプロセスの種々の相の至るところで存在し得るからである。例えば、示される４つの相は、フローサイトメトリ分離技術について示され限定されない以下を表す：相Ｉは、細胞供給源（１）内の細胞の存在を表し得、相ＩＩは、シース液環境内で選別されるような細胞の存在を示し得、相ＩＩＩは、選別後に収集される細胞のような細胞を示し、および相ＩＶは、選別後の貯蔵培地において再構成された細胞を示し得る。先行技術に示されるようなこれらの４つの相は、非常に異なる化学的因子の環境を経験し得る。しかし、本発明で概念的に示されるように、細胞は、非常に小さい変化を経験し得、最も著しくは、この相Ｉと相ＩＩとの間を経験したディップまたはドロップは、実質的に存在し得ない。これは、上記のような適切なシース液の選択の結果としてである。従って、適切なシース液に供されている結果として、本発明における細胞は、非常に低いレベルのストレスを経験し得る。
【０２１０】
この現象に関して存在し得る可能性のある普遍性の１つは、特定の化学的組成物が他よりも過応答性である化学的組成物を表し得るという事実である。天然では、これは精子の種、この取扱い、または含まれる細胞の型にさえ依存して変動し得るが、それらの意図する目的（ここでは、人工受精）についての細胞の生存率は、大きく、天然もしくは選別または両方のため、変動して、この細胞は、その化学的組成物に関して過応答性である特徴を示すようである。特定の代謝性の化学的組成物を選択することによって、クエン酸回路内にある最も著しいクエン酸または化学物質は、大きな利点が可能なようである。従って、ウシ精子の適用について、このシース液（３）は、約２．９パーセントのクエン酸ナトリウム組成物を提示するように選択され、そして調整される。具体的には、２．９パーセントクエン酸ナトリウム溶液は、以下のように作製され得る：
１．１，０００ｍｌの容積測定フラスコ中に２９．０ｇのクエン酸ナトリウム２水和物（Ｎａ3Ｃ6Ｈ5Ｏ7・２Ｈ2Ｏ）を置く
ａ．３／４の水バッチにクエン酸ナトリウムを溶解し、次いで、容積まで水を加える
２．脱イオン化またはＮａｎｏｐｕｒｅ水を加え１，０００ｍｌの最終容積にする。
３．ボトルに移し、そして１５ ｌｂｓ圧力（２４５oＦ）で少なくとも３０分間オートクレーブする。
【０２１１】
ａ．蒸発を最小にする条件を使用して溶液をオートクレーブする（カバーを緩める）。
【０２１２】
ｂ．水が蒸発しないことに注意。
４．室温で緩徐に冷やす。
５．５℃の低温室で密閉して貯蔵する。
さらに、シース液について、クエン酸ナトリウム溶液を濾過し得る。
６．無菌技術を使用して０．２２ミクロンフィルターで濾過する。
【０２１３】
興味深いことに、ウマの精子細胞については、このような組成物は、同様に実行しない。むしろ、ウマの精子細胞について、ｈｅｐｅｓウシ配偶子培地のような、ｈｅｐｅｓ緩衝化培地−特に、ウシの適用のためにＪ．Ｊ．Ｐａｒｒｉｓｈにより以前に作製されたＨＢＧＭ３−が功を奏する。この培地は、本明細書中で参考として援用される論文「Ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｐｅｒｍ ｂｙ Ｈｅｐａｒｉｎ」、３８ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １１７１（１９８８）中で議論される。ウシ精子に利用されるのと同じ型の物質ではないために、これは驚きだけではなく、実際の緩衝液もまた、本来、ウシの適用に開発された。従って、ウマの適用において、ｈｅｐｅｓ緩衝液を含むシース液が選択される。この溶液は、以下の組成を有する、室温で約７．５４のｐＨ（３９℃でｐＨ＝７．４）を有し得る：
【０２１４】
【表１】
【０２１５】
本発明において相互作用し得る１つの他の局面は、含まれる細胞が、異常な感受性を経験し得るという事実である。１つの点に関して、これは精子細胞が非修復細胞である細胞のクラス内であるという事実に起因し得る。すなわち、それらは、それ自体を修復する能力を有さず、それ故、それらは、フローサイトメーターまたは他の取扱い設備に対して代表的であるよりも感受的に処置されることを必要とし得る。従って、フローサイトメーター、または他の分離デバイスが精子細胞の供給源を確立するように作用する場合、この増強は、特に適用可能であることが適切であり得る。精子細胞のような細胞のクラスに独特であり得る、別の可能性のある関連する局面は、それらのＤＮＡが非修復、非複製、および非転写であるという事実である。これらの因子のいずれかは、効果を示し得、そしてそれらは、個々または一緒のいずれかで関連し得る。従って、本発明の教示は、非修復、非翻訳、非転写細胞である、全ての配偶子細胞またはウイルスなどにさえも適用し得る。
【０２１６】
また重要であり得るフローサイトメーター処理の別々の局面は、選別された後に化学的および物理的の両方で細胞を適切に処理する事実である。図４に示されるように、ドロップ（８）内の細胞をコレクター（１４）内に獲得するために、コレクターを構成する容器は、適切なサイズであり、その結果細胞と容器自体との間の衝撃を回避するいくつかの手段として作用することが重要であり得る。細胞が容器の底部にぶつからないようにするため、細胞を収集する容器の底部に最初のコレクター流体（１７）を置くことは公知であるが、容器内への細胞の衝突に起因する流動の提示ならびに回避不能なはね（ｓｐｌａｓｈｉｎｇ）において変動に処理を施すための容器の単純な広さは、この結果を増強するために使用され得ることが明らかである。１つの点に関して、これは緩衝要素として作用し得、その結果機械的に繊細であり得る細胞、すなわち、衝撃により破壊するかまたは損傷を受け得る細胞は、適切に処理され得る。従って、サイトメーター供給源が、選別されるべき細胞のように物理的に繊細な細胞である細胞を確立する場合、開口部の広さ（１８）が細胞との接触を回避する様式において容器の壁を配置するために供する、広い収集管のようないくつかの型の緩衝要素を提供することは重要であり得る。従って、この管は、側壁にそれほど近接して存在しないので、選別されるそれらの細胞と管壁との間に接触の任意の有意な見込みが存在する。この様式において、コレクター流体（１７）に加えて、同様に広い収集管を備えることが所望される。おそらく、コレクター（１４）の部分として供する容器に広い開口部を単に提供することは、有意であり得る。精子細胞の高速分類を利用する適用のために、少なくとも１５ミリメーターの内部直径の開口部を有する容器を提供することが有意であると考えられることが見出されている。具体的に、このような適用において１４ｍｌのＦａｌｃｏｎ試験管を利用する場合、コレクター（１４）の結果として細胞への最小の物理的損傷が発見されている。
【０２１７】
１４ｍｌのファルコン試験管ですらも最適ではないかもしれないことに注意すべきである。特に、流れの幾何学に適した収集容器（すなわち、「流れ適合容器（ｓｔｒｅａｍ−ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）」）を設計することが最良であり得ると考えられる。この流れ適合容器は、以下の特徴のいずれかまたは全てを有し得る：相対的に広い開口部、楕円形に成形された開口部、現在関わっているものより小さな高さ：幅の比、角度がつけられているか、またはそうでなければ落下流に対して平行な側壁を示し得るように調整された体裁など。ボールベアリングなどのような可動要素または媒体のような取り付け要素を提供して、試験管の可変性の配向を、収集することが所望される落下流に適合させることもまた望ましい。さらに、既存の試験管（「ファルコン型」試験管として記載される）のような容器の分類についての物理的特徴としては、試験管の幅だけでなく試験管が作製される材質（例えば、細胞が固着しないポリスチレン）もまた挙げられ得る。（これらの材質選択は、１４ｍｌファルコン試験管について周知である。）従って、この容器およびその収集液はまた、緩衝要素として作用して、細胞への物理的損傷を最小限にし得る。これは、サイズによっては、有意な希釈効果なく精子の適切な数の収集を容易にするためにもまた作用し得る。
【０２１８】
コレクター液（１７）の別の局面は、細胞に対する化学的ストレスを最小にするためにもまた作用し得るという事実であり得る。１つの点では、選別の前後両方で細胞に栄養素を与えることが重要であり得るので、コレクター液（１７）は、調整されたレベルの栄養素を提供するように選択され得るため、この栄養素レベルは選別の前後両方で平衡化される。２％卵黄レベルで卵黄クエン酸塩の栄養素が利用されるウシ精子に関しては、６％卵黄クエン酸塩レベル（すなわち、クエン酸塩溶液中に６％の卵黄含量）を利用することが良好な結果を提供することが発見された。これは、選別事象の前後に存在する容量の結果である。コレクター液（１７）は、約２ｍｌの容量で（選別前に）開始され得る。選別事象によって、この容量の約２倍が添加され得（最初の開始容量の３倍で終了する）、（目詰まりおよび他のフローサイトメーターの考慮すべき事項に起因して）溶液中に卵黄クエン酸塩はほとんどない。従って、存在する卵黄クエン酸塩の量のレベルという点では、最終結果は、開始結果、すなわち、含まれる容量に起因して、クエン酸溶液中に２％卵黄クエン酸含量に等しくあり得る。従って、コレクター液（１７）は、最終コレクター液環境を作り出すように選択され得、この最終コレクター液環境は、最初の栄養素または他の流体環境と平衡化される。この様式で、コレクター液は、細胞が供される時間および組成のレベルの変化を最小にするために作用し得る。もちろん、これらの流体環境は、フローサイトメーター内で示されていてもよいし、ある他の重要な時間に存在していてもよく、重要な点は、細胞の寿命における任意の時点で細胞が供されるストレスをほとんど最小化しないことである。さらに、最初の化学物質量が変動され得る（例えば、クエン酸塩中のパーセント卵黄含量は、上下に変動され得る）ので、同様に、開始収集液環境または種々の容量もまた、最終結果が同じであるように変動され得る。従って、選別プロセスを開始する前に、コレクター液は、クエン酸塩溶液中６％卵黄含量で存在し、そして選別事象が終了した後には、コレクター液（性特定精子を有する）は、結果的に最初の栄養素含量と同様にクエン酸塩溶液中２％卵黄含量になり得る。
【０２１９】
後者の使用では、これらの精子細胞は、他の理由のためにクエン酸塩液中２０％卵黄含量に対して処理され得る。しかし、これらの変更は、全体的な受精プロセスの公知の部分に過ぎないように、細胞に対するストレスを提供するとは認められない。もちろん、このレベルは当業者によって容易に理解され得るので、変動され得るが、２０％卵黄クエン酸塩緩衝液は、以下のように構成され得る：
Ｉ．最終組成：
８０％ クエン酸ナトリウム溶液（７２ｍＭ）
２０％ （容量／容量）卵黄
ＩＩ．１Ｌ用の調製：
Ａ．クエン酸ナトリウム溶液
１．１，０００ｍｌ容積フラスコ中に２９．０ｇのクエン酸ナトリウム二水和物（Ｎａ3Ｃ6Ｈ5Ｏ7・２Ｈ2Ｏ）を入れる
２．最終容量が１，０００ｍｌになるように脱イオン水またはナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）水を添加する
３．瓶に移し、１５ｌｂｓ圧力（２４５Ｆ°）で少なくとも３０分間オートクレーブにかける
ａ．蒸発を最小にするための条件を使用して溶液をオートクレーブにかける（緩くふたをする）
ｂ．水が沸騰して外に漏れないように注意する
４．室温でゆっくり冷却する
５．密栓して５℃の低温室で保存する
Ｂ．卵調製物
１．新鮮な鶏卵を優良な商業供給源から得る
２．埃がないように卵を洗浄し（過剰な界面活性剤は使用しない）、そしてすすぐ
３．卵を７０％エタノールに２〜５分間浸漬する
４．卵を取り出し、乾燥させ（または拭いて乾燥させ）、そして清潔なタオル上で保存する
Ｃ．エキステンダーの調製
１．清潔な滅菌ガラス製品を使用する
２．Ａ−画分（グリセロールなし画分）
ａ．１，０００ｍｌのメスシリンダーに８００ｍｌの２．９％クエン酸ナトリウム溶液を入れる
ｂ．エキステンダーのグリセロールなし画分（Ａ画分）についての抗生物質レベルは、以下のとおりであり得る；
ｉ．タイロシン＝１００μｇ／ｍｌ
ｉｉ．ゲンタマイシン＝５００μｇ／ｍｌ
ｉｉｉ．リンコ−スペクチン＝３００／６００μｇ／ｍｌ
ｃ．２００ｍｌの新鮮卵黄を以下に概説するように添加する（Ｄ節）
ｉ．徹底的に混合する
ｄ．これは、２０％卵黄およびウシ精子に対して非毒性であることが公知の濃度の抗生物質を有する２．９％クエン酸ナトリウムに基づいたＡ画分エキステンダーを提供する
ｅ．エキステンダーは、一晩５℃で保存され得る。
【０２２０】
ｆ．次の日に上清（上部の８００ｍｌ）をデカントする
ｇ．次の日の使用前に３７℃に暖める
Ｄ．緩衝化溶液に卵黄を添加するために、以下の手順を十分に行う
１．卵を十分に洗浄し、清潔にする（上記Ｂを参照のこと）
２．卵を割り、卵黄分離器を用いて卵白と卵黄を分離する。あるいは、卵黄を卵の殻に左右交互に２〜３回出し入れする。卵黄膜を破らないこと
３．卵黄を１５ｃｍの滅菌濾紙上におく
４．緩衝液を入れたメスシリンダーの上に濾紙を配置し、（卵黄膜を破りながら）卵黄を絞り出し、金で処理した（ｇｏｌｄｅｄ）濾紙からメスシリンダーへ流出させる。代表的には、約１２〜１５ｍｌの卵黄が１つの卵から得られ得る。
【０２２１】
本発明の種々の因子で相互作用し合い得る別の局面は、人工受精などのために低用量の精子を利用する局面である。雌雄識別した、人工受精の局面のさらなる背景は、「Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｐｅｒｍ」、Ｒｕｐｅｒｔ Ｐ．ＡｍｍａｎおよびＧｅｏｒｇｅ Ｅ．Ｓｅｉｄｅｌ，Ｊｒ．，Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８２）（本明細書中に参考として援用される）に見いだされ得る。言及したように、自然な受精は、何十億ものオーダーの精子数が関与する。代表的な人工受精は、現在では、ウシ種に関しては数百万の精子で行われ、そしてウマ種に関しては数億の精子で行われる。用語「低用量」によって、受精事象で用いられる精子の投与量が、代表的な人工受精事象で提供される代表的精子数の１／２より少ないか、または好ましくはそれの約１０％より少なくさえあることを意味する。従って、用語「低用量」は、代表的な人工受精投与量の状況で考えられることであり、絶対数としてもまた考えられる。現在百万〜一千万の精子が提供されるウシ精子に関しては、低用量プロセスは、約５００，０００精子数の絶対数、またはおそらく３００，０００精子以下と考えられ得る。事実、本発明の技術を利用することによって、良好な割合での人工受精の成功は、４８Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ １２５５（１９９７）で公開された論文「Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｈｏｒｎ Ｉｎｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｉｆｅｒｓ Ｗｉｔｈ Ｖｅｒｙ Ｌｏｗ Ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ Ｎｏｎ−ｆｒｏｚｅｎ ａｎｄ Ｓｅｘｅｄ Ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ」（これは、本明細書中に参考として援用される）に示されるように、１００，０００および２５０，０００精子（それぞれ妊娠率は４１％および５０％）の受精のレベルで示された。精子細胞は、希釈に対する感受性を示すようであるため、これらの結果は、本発明の種々の技術に関して、低用量の精子サンプルの利用に対して特定の相互依存性を示し得る。絶対数は、種依存性であり得る。ウマ種では、たとえ、約二千五百万、一千万、五百万、または百万の精子より少ないにしても低用量プロセスが考えられ得る。
【０２２２】
重要であり得る別の局面は、本発明の（または他の）技術によって精子の雌雄識別が人工受精システムで利用されるという事実である。従って、フローサイトメーター技術に関しては、コレクター（１４）を使用して、人工受精のための精子を提供するときに、本発明の技術は、特に関連し得る。さらに、人工受精の使用および低用量環境での使用の両方の組み合わせは、ともに相乗効果を奏し得、これは、本発明の種々の技術を特に適切にすることが可能である。当然、雌雄識別された精子は、ただ人工受精態様だけではなく、インビトロ受精技術などのような他の技術においても利用され得る。
【０２２３】
フローサイトメトリーの使用または他の分離技術によって動物を収集、選別、および実際に人工受精するプロセスは、種々の工程を包含する。ウシの人工受精の状況で、第１に、精液を人工膣を使用してウシから収集する。これは、約１５億精子／ｍｌの割合である。この生の精液を分光光度計を使用してチェックして、濃度を評価し得る。そしてこの精液を検鏡によって評価して、適切な運動性および生存性基準を満たすことを確実にし得る。次いで、抗生物質が添加され得る。結果として、最初のサンプルは、１回の射精あたり約６０〜７０％の前進運動性を有し得る。処理工程に関しては、ある型のＴＡＬＰ（タイロードアルブミンラクテートピルベート）による希釈を用いて、約１億／ｍｌの管理可能なレベルで（フロー分析について）精子数を入手し得る。ＴＡＬＰは、精子細胞に栄養を与えるだけでなく、精子を染色工程のために機能亢進させ得る。染色前に、ウマ種のようないくつかの種では、遠心分離が行われ得る。染色工程を、多重染色または単色染色プロトコルに従って行い得、後者は、Ｊｏｈｎｓｏｎ特許および関連技術である。染色工程を、適切な栄養素環境を作り出すためにエキステンダーもまた調節しながら行い得る。ウシの適用において、これは、染色後すぐにクエン酸塩溶液中に約２０％卵黄含量を添加する工程を包含する。さらに、精子細胞を染色することにおいて、ある範囲まで予測され得るよりも高い染色量によって、より良好な結果が達成されることが発見された。これは、高濃度染色工程が、数１０μＭ含量の染料量（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染料が３８μＭ含量で使用される以下の実施例で議論される）を使用する工程を包含し得る。
【０２２４】
染料を添加した後のインキュベーション期間としては、例えば、約一億精子細胞／ｍｌの濃度で染料取り込みを促進するために３４℃で１時間インキュベートする工程を用い得る。次いで、それらを濾過して、精子細胞の凝集を取り除き得る。次いで、約一億精子細胞／ｍｌの所望の選別濃度への希釈または拡大が行われ得る。次いで、先に議論された種々の技術に従う選別工程が行われ、ここから精子細胞が収集相で回収され得る。先に言及されたように、収集は、約２％卵黄クエン酸塩濃度含量（ウシ種について）を有するサンプルで生じ得る。次いで、このサンプルを、シース液および保存液が除去され得る後に遠心分離によって、約３００〜５００万精子細胞／ｍｌに濃縮し得る。次いで、最終的な拡大は、２０％卵黄クエン酸塩またはＣｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｅｘｔｅｎｄｅｒなどのいずれかで達成され得る。Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｅｘｔｅｎｄｅｒは、１０００ｍｌについて以下の組成を有し得る：
１４．５ｇ クエン酸ナトリウム二水和物
２．１ｇ ＮａＨＣＯ3
０．４ｇ ＫＣｌ
３．０ｇ グルコース
９．３７ｇ グリシン
０．８７ｇ クエン酸
２０％卵黄組成については、上記調製物の８００ｍｌおよび約２００ｍｌの卵黄を使用し得る。
【０２２５】
この最後の拡大後に、３００〜５００万精子／ｍｌ（ウシ種について）が生じ得る。次いで、このサンプルを精子の代謝を緩慢にするように、そしてより長い期間にわたる使用を可能にするように冷却され得る。次いで、ウマ種では、このサンプルは、当業者がよく理解するように、卵管プロセスまたは他の受精プロセスで使用され得る。ウシの精子では、サンプルは、所望の投与レベルまでさらに１回希釈され得る。希釈は、精子細胞の生存性に影響をもたらし得るために、より少量のサンプルを提供することによって希釈のレベルがあまりに大きくなり過ぎることを避けることが適切であり得ることが見いだされた。それにもかかわらず、使用されている分離技術のうち、現在では、約３００，０００精子／０．１８４ｍｌの低投与量が達成され得る。さらに、約５％のレベルで精漿のレベルを維持することが所望され得るが、この必要性の結果は、現在では結びつけられている。次いで、精子細胞試料は、人工受精に使用するためのストローに配置され、そして受精させるために経産牛または未経産牛に輸送され得る。
【０２２６】
都合のよいタイミングでの人工受精を達成するために、未経産牛または経産牛の発情期を、当該分野で周知の技術に従って、プロスタグランジンＦ２αの利用のような公知の技術により同期化させ得る。この後者の内容は、論文「Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ２α−Ａ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ Ｄｒｕｇ ｉｎ Ｄａｉｒｙ Ｃａｔｔｌｅ？」１８ Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２４５（１９８２）（これは、本明細書中に参考として援用される）で議論されるように未経産牛での受精能の増強を潜在的に達成することが報告されたという点で特に価値があり得る。最近の結果では、前述の事項は維持されなかったが、本発明は、雌雄識別された低用量の受精の状況で特別の生存性を実証することであり得る。次いで、ウシ種に関しては、人工受精は、子宮角内深くに精子細胞を配置する胎芽移植機器の使用によって達成され得る。これは、人工受精において代表的に使用されるピーク時ではなく、むしろピーク時の１２時間後のようないくらか遅い時期に達成され得る。なぜなら、雌雄識別された人工受精に関する受精は、わずかにより遅く生じ得るいくらかの可能性があるからである。胎芽移植機器の利用は、このような低用量の雌雄識別された受精に関して、子宮壁が非常に敏感であり得るために使用され得る。
【０２２７】
さらに、この技術を組み合わせて、さらにより効率的な生産を達成し得る。特に、高速選別および雌雄識別された胚の低用量人工受精を可能にする、たった今発明されたプロセスの各々は、過排卵動物において実行可能である。過排卵は、排卵誘発剤（ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｏｒｙ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）の使用または他の任意の技術によって達成され得る。排卵誘発剤は、例えば、正常よりも多く卵の生成を達成するために一連の反応によって直接または間接に作用し得る。過排卵との組み合わせは、以前、過排卵がこのような組み合わせを妨げると認められたので驚くべきことである。精子輸送は、過排卵処理されたウシで損なわれるので、動物を複数の機会でおよび／または複数の用量の精液で、頻繁に人工受精していた。また、精液を雌雄識別する以前の手順は、比較的緩慢であった；従って、これらの新たな技術の組み合わせを用いて、過排卵誘発剤（例えば、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン））処置ウシの、合計６００，０００の雌雄識別した未凍結精子を用いた１回の人工受精後の受精率を決定することは、興味深いことである。
【０２２８】
例示として、１２頭のＡｎｇｕｓ交雑未経産牛を、標準的手順を使用して過排卵処理した：６、６、４、４、２、２、２、および２ｍｇのＦＳＨを発情周期の９日目と１２日目の間で始まる半日間隔で筋肉内注射した；２５ｍｇおよび１２．５ｍｇのプロスタグランジンＦ−２αを６回目と７回目のＦＳＨ注射とともに筋肉内注射した。未知の受精能のウシからの精子をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、次いで、ＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメーター／セルソーターを使用して選別し、７００〜８００の生きた精子を各々の性／秒で得た。平均選別純度は、所望される性の８９％であった。選別された精子を、５℃に冷却して６５０ｇ、１０分間で遠心分離することによって３．３６×１０6精子／ｍｌに濃縮し、そして４時間保存した。次いで、１８４μｌを０．２５ｍｌのプラスチックストローに入れ；この用量の半分を自動側壁開口胎芽移植シース（ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｉｄｅ−ｏｐｅｎｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｈｅａｔｈ）を使用して発情後２０〜２４時間後に各子宮角に人工受精した。胚を標準的な非外科的手順によって発情後７または１６日目に収集した。結果は、７日目と１６日目での収集との間およびＸおよびＹ選別精子で同様であった。胚を９頭の未経産牛から回収した。発生の正常段階で５２胚（平均４．３±５．３／ドナー）、１３の発達の遅れた胚および３１の未受精卵が存在した。４６胚が、Ｙ染色体特異的ＤＮＡ配列についてのプライマーを使用してＰＣＲによって雌雄識別され；そのうち４３（９３％）が意図された性であった。この研究は、少数の動物に関与しただけであるが、驚くべきことに、わずか合計６００，０００の（生存した）雌雄識別した未凍結精子での過排卵処置した未経産牛の人工受精は、従来の手順と同様の結果を与えた。上記のバリエーションはまた、フローサイトメーター手段以外によって選別する工程、他の様式で過排卵を達成する工程、他の様式で受精能を増加させる工程など（を含むが、これらに限定されない）で達成され得る。
【０２２９】
さらに、受精能を損なうことなく、ＤＮＡ含量に基づいて精子を雌雄識別する方法、高速フローサイトメーター／セルソーター、および合計５００，０００より少ない精子で未経産牛を人工受精する手順の調和が、わずか数年内にウシにおける生存可能な雌雄識別した精液産業の可能性を生じた。８５％より高い正確性で雌雄識別した精子についての多くの適用が存在する。おそらく、最も明白なのは、雌の群を置換するために、一方のサブセット（乳牛および肉牛の両方）のウシを人工受精すること、および逆のサブセット（乳牛および肉牛の両方）を肉用に生産された雄に対して全く異なるタイプのウシと交配させることである。上記の非常に重要なサブセットは、Ｘ染色体保有精子で未経産牛に人工受精して、雌ウシを生産することである。これは、主にサイズがより小さいことに起因して、雄ウシより難産の発生率は低くなる。さらに、若い乳用種牛を提供することは、未経産牛の優勢にはるかにより有効である。８５％より多い未経産牛を有することはまた、乳牛を管理することを可能にするために、それらは、平均すると、寿命あたり２頭の生存牛より少ない。これは、妊娠および分娩に関連する問題を減少させるためには魅力的なものである。肉生産の単一性別システム（ｓｉｎｇｌｅ ｓｅｘ ｓｙｓｔｅｍ）もまた可能になる。ここで、各雌をそれ自身が交換し、そして２〜３年の間で屠殺されるため、成長のためのシステム中ではるかにより高い栄養素を使用して、そして維持する割合はより低い。雌雄識別した精液は、インビトロ人工受精のために、および胎芽移植のために過剰排卵処理したウシを人工受精するために有用である。頻繁には、ある性のウシが他方よりかなり価値があり、そして胚を雌雄識別する正確な方法が利用可能であるにもかかわらず、それらは、時間がかかり、そして生成された胚のうちの半分は、あまり価値のない性である。正確に雌雄識別された精液は、雌雄識別の追加料金が低く、かつ受精能が最小限にしか損なわれない場合、ウシの人工受精に広範に適合すると推測される。人工受精される肉牛の割合は、おそらく、実質的に雌雄識別された精液での肉牛が増えるであろう。
【０２３０】
興味深いことに、このような受精が通常配置される子宮体内への受精よりも、子宮角内深くへの受精によって、より良好な結果が達成され得る。おそらく、このようにはるかに研究されたサンプルは、子宮角内深くで達成された場合に、同側性の受精と対側性の受精との間に違いを示さないこともまた驚くべきことである。深いことによって、その挿入は、胎芽移植機器を使用して、子宮角に良好に配置されることが理解されるべきである。同側性の受精と対側性の受精を使用して、結果が有意に異ならないようであるという事実は、本発明者らに、両方の受精の使用の提案を導き、その結果、適切な子宮角を同定するプロセスはもはや必要であり得ない。
【０２３１】
受精の結果として、当然のこととして、所望の性の動物が産生されることが所望される。この動物は、雌雄選別された精子標品の使用を介する先に議論した系に従って産生され得る。本発明の技術は、例えば、腹腔鏡検査的（ｌａｐｒｏｓｃｏｐｉｃ）受精、卵管受精などのような他の技術における適用を見い出し得ることがまた、理解されるべきである。
【０２３２】
実施例として、以下の実験が行われた。本明細書に記載される本発明のあらゆる局面のすべての使用ではなく、それらは、本発明の異なる局面を通して可能な実行の増強を示す。さらに、いくつかの実験の要約は、以前に引用した論文「非常に少数の非凍結および雌雄選別された精子を用いた未経産牛の子宮角受精」に含まれる。この論文は、本発明の有効性を示すデータのいくつかを要約する。実験については、雌雄選別された非凍結精子細胞を用いて行われ、以下のように高い成功を収めた。
【実施例】
【０２３３】
（実施例１）
Ａｎｇｕｓ未経産牛（１３〜１４月齢（ｍｏ）であり、そして中程度の体調）は、１２日間の間隔をあけて２５ｍｇのプロスタグランジンＦ−２αを用いて同期化させ、そして直立発情期（ｓｔａｎｄｉｎｇ ｅｓｔｒｕｓ）が観察された６〜２６時間後、受精させた。１４〜２６月齢の３頭の雄ウシから新鮮に収集した精液を、ＴＡＬＰ培地中で１時間、３４℃で、７５×１０6精子／ｍｌで、３８μＭ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２中でインキュベートした。精子を、５０ｐｓｉで操作するＭｏＦｌｏ（登録商標）フローサイトメーター／セルソーターを使用して、そしてシース液として、２．９％ クエン酸Ｎａを使用して、１５０ｍＷでの３５１ｎｍおよび３６４ｎｍにおけるレーザー励起からの落射蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）に基づいて、性染色体によって選別した。Ｘ染色体を有する精子（超音波処理した精子アリコートを回復させることによって確認されたように、約９０％の純度）を、約５００生精子／秒で、１００μｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（ＣＵＥ）を含む２−ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に、２０％卵黄とともに収集した。収集した精子を、６００×ｇで１０分間遠心分離し、そして１．６３×１０6生精子／ｍｌでＣＵＥ中に再懸濁した。雌雄選別されていない精液のコントロールについて；Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色精子を、シース液で、９×１０5精子／ｍｌに希釈し、そして遠心分離し、そしてＣＵＥ中で１．６３×１０6の進行的に運動性の精子／ｍｌに再懸濁した。雌雄選別された精液および液体コントロール精液を５℃に７５分間冷却し、そして０．２５ｍｌストロー（１８４ｕｌ／ストロー）にロードした。ストローを、受精のために、分取の５〜９時間後に３〜５℃の温度制御飲料冷却機２４０ｋｍに移した。雌雄選別された精液および液体コントロール精液を、側開口青色シース（ｓｉｄｅ−ｏｐｅｎｉｎｇ ｂｌｕｅ ｓｈｅａｔｈｓ（ＩＭＶ））を使用して受精し、各々のストローの半分を、各々の子宮角に入れた（３×１０5生精子／未経産牛）。標準的なコントロールとして、同じ雄ウシ由来の精液を、標準的な手順によって０．５ｃｃストロー中で冷凍し（平均１５．６×１０6の運動性の精子／溶解後用量）、３５℃で３０秒間溶解し、そして子宮体中に受精させた。処置を、３頭の雄ウシおよび２人の受精者に対して、雌雄選別された精液および２つのコントロールについて３：２：２の受精の比で平均化した。妊娠を、胎仔もまた雌雄選別された場合（盲目的に）、受精の３１〜３４日後超音波で決定し、そして６４〜６７日後に確認した。データを表に示す。
【０２３４】
【表２】
【０２３５】
a,b異なる上付き文字を有する値の雌雄選別比は異なる（ｐ＜０．０２）。
【０２３６】
雌雄選別された精液を用いた妊娠率は、コントロールの８０％にすぎなかったが、この差異は統計学的に有意でなかった（＞０．１）。１回の妊娠は、雌雄選別されかつ凍結したコントロール群の各々において６４〜６７日で失われる；雌雄選別群中で１９胎児のうちの１８（９５％）は雌であり、そしてコントロール群の３０のうちの２０（６７％）は雌であった。液体精液コントロールは、５０倍より多い運動性の精液（全精子の１２０倍以上）を含む凍結精液コントロールに対して実質的に同一の妊娠率を産み出し、このことは、子宮角中への低用量受精の有効性を例証する。本発明者らは、フローサイトメーター技術および人工受精を使用して、ウシでの性比率を有意に変更した。
【０２３７】
同様に、雌雄選別されていない、非凍結の精子細胞を用いて１つの実験を行い、そして以下のように報告し得る。
【０２３８】
（実施例２） 実験の目的は、理想的な野外の条件下で、極度に少ない数の凍結精子を用いて未経産牛に受精させた場合に、妊娠率を決定することであった。上記の平均妊娠率である３頭のＨｏｌｓｔｅｉｎ雄ウシ由来の精液を、均質化ミルク、７％グリセロール（ＣＳＳ）エキステンダー、および５％相同精液漿中で、０．２５ｍｌフレンチストローあたり総精子２×１０5、５×１０5、または１０×１０6（コントロール）まで広げ、そして液体窒素蒸気に移して凍結させた。精液を、３７℃の水浴中で２０秒間融解した。１３〜１５月齢で３５０〜４５０ｋｇの体重のＨｏｌｓｔｅｉｎ未経産牛に、２５ｍｇのプロスタグランジンＦ−２−α（Ｌｕｔａｌｙｓｅ（登録商標））を、１２日間の間隔をあけて２回注入し、そして胎芽移植ストローガン（ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｔｒａｗ ｇｕｎ）および側開口シースを用いて受精させ、そして精液の半分は、発情期の検出の１２時間または２４時間後、各々の子宮角深くに入る。実験を５ヶ月にわたって５回の反復で行い、そして２人の受精者で平均された。繁殖の周囲温度はしばしば−１０℃から−２０℃であったので、受精器具を暖かく保つことに注意が払われた。妊娠を、発情から４０〜４４日後に、超音波を使用して、生存可能な胎仔の検出によって決定し、そして発情後５５〜６２日後に確認し；２０２の受胎産物のうちの４つが、これらの時期に失われた。５５〜６２日では、妊娠率は２×１０5、５×１０5、および１０×１０6総精子／受精（Ｐ＜．１）について、５５／１０３（５３％）、７１／１０１（７０％）および７２／１０２（７１％）であった。妊娠率は、雄ウシの間で異なっていたが（５９、６２、および７４％、Ｐ＜．０５）、実験者の間で（６４および６５％）、または発情後の受精回数（１２時間で６５％、２４時間で６４％、Ｎ＝１５３、各回）では異ならなかった。記載した方法を用いる、未経産牛における妊娠率は、受精あたり５×１０5および１０×１０6総精子を用いるのと同様であった。
【０２３９】
１つの実験がまた、雌雄選別された非凍結の精子細胞で行われ、そして以下のように報告され得る：
（実施例３）
精液を、Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｂｒｅｅｄｅｒｓ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅの雄ウシから収集し、ＨＥＰＥＳ緩衝化エキステンダー＋０．１％ＢＳＡで１：４に希釈し、そしてＭａｒｙｌａｎｄ、Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅまで１６０ｋｍ（約２時間）輸送した。ここで精液を、周囲温度において、以前に記載された方法（Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ４１：１９９）を使用して、ＴＥＳＴ収量（２０％）エキステンダー中にフローサイトメトリーによって選別した。約９０％純度において、５〜６時間あたり各性の２×１０6精子までの選別速度を達成した。精子を、遠心分離（３００ｇで４分間）によって、２×１０6精子／ｍｌまで濃縮した。いくらかの精子を、相同な精液漿を含むエキステンダー中に選別した（最終濃度５％）。選別した精子を、飛行機でコロラドまで輸送し（約２，６００ｋｍ）、そして周囲温度または５℃のいずれかで保存した（Ｅｑｕｉｔａｉｎｅｒ（氷を含む仕切りを用いる遮蔽された装置）中で６時間以上輸送の間冷却した）。発情が検出されるよりも１１〜３６時間早くに、未経産牛または乳の出なくなったウシに、精子選別セッションの終わりの９〜２９時間以内に受精させた。精子（０．１ｍｌ中に１〜２×１０5）を、受精の際に超音波によって決定された最も大きい濾胞を有する卵巣に対して同側の子宮角に深く入れた。
【０２４０】
輸送され、周囲温度で保存された精子を受精させた場合に、１０頭の雌はいずれも妊娠しなかった。輸送の間に５℃で冷却された精子を受精させた２９頭の雌の内、１４頭が４週間、そして１２頭（４１％）が８週間の妊娠期間の間妊娠した。選別の最後の１０時間以内に受精させた２２頭の内１１頭が８週間妊娠したが、しかし選別の１７〜２４時間後に受精させた７頭の内１頭のみが妊娠した。精液漿の添加の有意な効果はなかった。１２の胎仔の内の１つは予測された性ではなく、１つは不明瞭であり、そして１０は、妊娠の６０〜７０日間の超音波検査によって決定されたように、予測された性であった。
【０２４１】
引き続いて、３３のさらなる未経産牛に、超音波検査の使用なしで各々の子宮角中に０．０５ｍｌ（上記のように広げた精液）を用いて受精させた；３例のみが受精後４週間妊娠し、そして１例のみが８週間妊娠したままであった。しかし、先の群からの異なる雄ウシを使用して、そしてすべての受精は、選別１８〜２９時間後に行った。別の雄ウシ由来の選別された精子を用いて、本発明者らの研究室から２００ｋｍの、さらなる３８例の未経産牛を同様に受精させた（選別約２２時間後）；これらのいずれも、受精後８週間妊娠しなかった。
【０２４２】
要約すると、フローサイトメトリーによって性染色体について選別された精子の人工受精によって、ウシにおいて妊娠を達成することは可能であり、そして胎仔の性比率は、選別された精子のＤＮＡ含有量についての再分析によって予測される性比率に近づく（９０％）。しかし、妊娠率は、長距離の精子の輸送を必要とした、これらの予備的実験において大きく変動した。受精率は、選別後１７時間で急激に減少したが、いくぶんかの混乱が存在した。なぜなら、異なった時間に異なった雄ウシを使用したからである。妊娠率に見られる変動は、雄ウシの違いによるものか、受精の技術によるものか、選別と受精の間の間隔によるものか、または他の因子によるものかを決定するために、さらなる研究が必要とされている。
【０２４３】
最後に、１つの実験がまた、雌雄選別されていない、非凍結精子細胞を用いて行われ、そして以下のように報告され得る。
【０２４４】
（実施例４）
この実施例の目的は、未経産牛に理想的な実験条件下で非常に少数の精子を用いて受精させた場合に、妊娠率を決定することであった。３頭のＨｏｌｓｔｅｉｎ雄ウシ由来の精液を、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｅｘｔｅｎｄｅｒおよび５％の均質な精液漿中で１×１０5または２．５×１０5精子／０．１ｍｌまで広げた；２．５×１０6全精子／０．２５ｍｌをコントロールとして使用した。十分に広げた精液を、０．１または０．２５ｍｌの受精用量を送達するために、改変した０．２５ｍｌプラスチックフレンチストロー中に詰めた。精液を５℃に冷却し、そして収集の２６〜５７時間後に使用した。Ｈｏｌｓｔｅｉｎ未経産牛１３〜１５月齢、体重３５０〜４５０ｋｇに、１２日間の間隔で、２５ｍｇ プロスタグランジンＦ−２α（Ｌｕｔａｌｙｓｅ（登録商標））を注射し、そして発情の検出から２４時間後に、胎芽移植ストローガンおよび側開口シースを用いて、１つの子宮角に受精させた。受精は、発情１２時間後超音波によって決定された最大の濾胞を有する側に対して同側性であった；排卵の側は、発情７〜９日後超音波によって黄体の検出によって確認した。妊娠は、発情４２〜４５日後超音波によって胎仔の検出によって決定した。この実験は、４回反復し、そして３人の受精技術者で平均した。排卵の側は、２２５未経産牛のうち２０５で正しく決定された（９１％）；驚くべきことに、妊娠率は、同側および対側の受精でほとんど同一であった。妊娠率は、１×１０5、２．５×１０5、および２．５×１０6精子／受精（Ｐ＞．１）について、３８／９３（４１％）、４５／８７（５２％）、および２５／４５（５６％）であった。技術者の間で、有意な妊娠率の違い（Ｐ＜．０５）が存在したが、雄ウシの間にはなかった。フローサイトメーターを用いて性によって選別された精子が、商業的な適用を有する記載した方法を用いて、受精あたりの精子の数を十分に減らすことが可能であり得る。
【０２４５】
上述のように、そして種々の実験から見られ得るように、野外は統計学的に根拠のあるものであり、従って種々のさらなる実験が、適切な組み合わせおよび制限のストラテジーを示すために行われ得る。従って、種々の影響の間の相乗作用（例えば、レーザー励起を用いる色素の効果および組み合わされた色素の効果が研究され得る例）が、さらに同定される。
【０２４６】
本出願に含まれる議論は、基本的な記載として働くことを意図している。読者は、特定の議論が明白にすべての可能な実施形態を記載しなくてもよいし；多くの代替手段が暗黙のものであることに気付くべきである。それはまた、本発明の一般的な性質について十分に説明しなくともよいし、そしてそれぞれの特色または要素が、実際により広い機能をいかにして示し得るか、または非常に多様な代替手段もしくは等価な要素をいかにして示し得るかを明白に示さなくともよい。かさねて、これらは、暗黙に本開示中に含まれる。本発明が、デバイスを指向する用語において記載されている場合には、各々のデバイスの要素は、暗黙に機能を行う。装置の請求項は、記載されるデバイスについて含まれてもよいだけではなく、また、方法またはプロセスの請求項が、本発明および各々の要素が行う機能を扱うために含まれ得る。記載または用語のいずれもが、提出され得る請求項の範囲を限定することを意図するものではない。種々の変更が、本発明の本質から離れることなくなされ得ることが理解されるべきである。このような変更はまた、明細書中に暗黙に含まれ得る。これらもなお、本発明の範囲にある。示される明白な実施形態、非常に多様な暗黙の代替的な実施形態、および広い方法もしくはプロセスなどの両方を含む広い開示が、本開示によって含まれる。
【０２４７】
さらに、本発明の種々の要素および請求項のそれぞれがまた、種々の様式において達成され得る。本開示は、このような各々のバリエーション（任意の器具の実施形態のバリエーションの実施形態、方法またはプロセスの実施形態、またはこれらの任意の要素のバリエーションにさえすぎない）を含むことが理解されるべきである。特に、本発明の要素に言及する開示として、各々の要素についての語が、たとえ機能または結果のみが同じであるとしても、等価な器具の用語または方法の用語によって表現され得ることが理解されるべきである。このような等価な、より広い、またはより一般的でさえある用語は、各々の要素または作用の記載に含まれるとみなされるべきである。このような用語は、本発明が権利を与えられる暗黙の広い適用範囲を明白にすることが所望される場合に置き換えられ得る。１つの例としてではなく、すべての作用が、その作用を獲得するための手段として、またはその作用を起こす要素として表現され得ることが理解されるべきである。同様に、開示された各々の物理的要素は、物理的要素が容易にする作用の開示を含むと理解されるべきである。この局面の１つの例としてではなく、「コレクター」の開示が、明白に議論されるか否かにかかわらず、「収集すること」の作用の開示を含むことが理解されるべきであり、そして逆に、「収集すること」の作用の開示のみが存在する場合、このような開示は、「コレクター」の開示を含むことが理解されるべきである。このような変更および代替的な用語は、本明細書中に明白に含まれることが理解される。さらに、最初に提示した請求項に加えて、その請求項は、少なくとも以下により広く取り組むために変更され得ることが理解されるべきである：ｉ）本明細書中に開示および記載されるデバイス、ｉｉ）開示および記載される関連方法、ｉｉｉ）そしてこれらのデバイスおよび方法の各々の、同様の、等価な、暗黙でさえのバリエーション、ｉｖ）開示および記載されるとして示される機能のそれぞれを達成するこれらの代替的な設計、ｖ）開示および記載されることを達成するために暗黙であるとして示される機能の各々を達成する、代替的な設計および方法、ｖｉ）別個のかつ独立した発明として示される各々の特徴、要素、および工程、ならびにｖｉｉ）上記の各々の種々の組み合わせおよび順列。
【０２４８】
本発明の理解を助けるために、種々の刊行された引用文献が役立ち得る。これらは以下に列挙され、そしてそれによって参考として援用される；しかし、記載がこの／これらの発明の特許化と矛盾しているとみなされ得る点で、これらの記載は明白に出願人によってなされたとはみなされない。強力に役立つ引用文献は、米国特許第５６６０９９７号；同第５５８９４５７号；同第５５１４５３７号；同第５４３９３６２号；同第５３４６９９０号；同第５１３５７５９号；同第５０２１２４４号；同第４９９９２８３号；同第４７４９４５８号；同第４６９８１４２号；同第４６８０２５８号；同第４５１１６６１号；同第４４４８７６７号；同第４３６２２４６号；同第４３３９４３４号；同第４２７６１３９号；同第４２２５４０５号；同第４１９１７４９号；同第４１５５８３１号；同第４０９２２２９号；同第４０８５２０５号；同第４０８３９５７号；同第４０６７９６５号；同第４００９２６０号；同第３８９４５２９号；同第３６８７８０６号；ＲＥ３２３５０号を含む。役立つ引用文献はまた、以下の刊行物を含み得る：
【０２４９】
【表３】
【０２５０】
【０２５１】
本明細書を通して、その文脈がそれ以外に必要としない限りは、語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」または、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」のようなバリエーションは、言及された要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を含むが、任意の他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を排除しないことを暗示することが理解される。
【符号の説明】
【０２５２】
３ シース液
１４ 収集システム
１８ 精子細胞
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−７８３４６（Ｐ２０１３−７８３４６Ａ）
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１３−２１３３０（Ｐ２０１３−２１３３０）
【出願日】平成２５年２月６日（２０１３．２．６）
【分割の表示】特願２０１０−１３９９７８（Ｐ２０１０−１３９９７８）の分割
【原出願日】平成１０年１２月３１日（１９９８．１２．３１）
【出願人】（５００３０８４７３）エックスワイ，エルエルシー (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２５年２月６日（２０１３．２．６）
【分割の表示】特願２０１０−１３９９７８（Ｐ２０１０−１３９９７８）の分割
【原出願日】平成１０年１２月３１日（１９９８．１２．３１）
【出願人】（５００３０８４７３）エックスワイ，エルエルシー (17)
【Ｆターム（参考）】
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