免疫グロブリンの精製
本発明は、望ましくない夾雑物の混合物から抗体または抗体断片を含むタンパク質（Ｆｃ融合タンパク質等）を単離するための、色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーを使用する改善された方法に関する。具体的には、抗体／色素リガンドクロマトグラフィーによる単離手順の溶出段階においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の有機ポリマーを使用することにより、望ましくない夾雑物からの標的抗体の分離が改善される。本明細書に記載される方法は、標的抗体から、抗体凝集体、ミスフォールド抗体、およびウイルス夾雑物を分離または除去する際に特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、望ましくない夾雑物（ＰＲＩつまり「目的物質由来不純物」としても知られる）の混合物から抗体または抗体断片を含有するタンパク質（Ｆｃ融合タンパク質等）を単離または精製するための、色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーを使用する改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体およびＦｃ融合タンパク質は、細胞培養物中で絶え間なく大量に生成されている。これには、目的物質由来不純物（ＰＲＩ、例えば、凝集体、半抗体、ミスフォールド抗体の形態）を除去することが可能でありながら十分な樹脂能力を維持するという、より大きな下流における課題が付随する。従来のプロテインＡの精製プロセスは、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡを除去するために、ＰＲＩがほとんど除去されない、高価な捕獲ステップを用いるため、（例えば、ＨＩＣ、ＳＥＣを使用して）ＰＲＩを除去する負担が下流へと移動し、実質的に収率損失を生じることが多い。これらのＰＲＩの除去は、出発量の多さ、対象とする生成物との生化学的類似性、およびプロテインＡクロマトグラフィー媒体に対する濃縮に起因して、精製プロセスのうちの最も課題の多い側面であり得る。捕獲のための代替アプローチを低コストで行うことも可能だが、純度が損なわれることが多い。よって、理想的なプロセスは、高純度、高収率、および低ＰＲＩ含有量の生成物をもたらす、低コストの捕獲ステップである。
【０００３】
プロテインＡ樹脂に匹敵する負荷能力でＦｃ含有タンパク質を捕獲するための、低コストの非従来的なクロマトグラフィー樹脂（色素リガンドクロマトグラフィー樹脂）を使用する方法の開発に成功した。移動相修飾剤を用いた洗浄ステップおよび溶出ステップの最適化は、高い生成物純度および収率を維持しながら、ＰＲＩを有意に除去する結果をもたらした。
【０００４】
色素リガンドアフィニティークロマトグラフィー
【０００５】
色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーは、「混合モード」のクロマトグラフィー媒体であるが、なぜなら、そのような媒体は、標的分子を結合させるために２つの別個の力に依存するからである。色素リガンドアフィニティー媒体の場合、これらの２つの力とは、陽イオン交換および疎水性相互作用である。図１３を参照のこと。
【０００６】
色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーにおける従来の方法に関するさらなる情報については、容易に入手可能であって、当業者に理解される、多数の刊行物が存在する。例えば、以下を参照のこと：
【０００７】
Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｂｙ Ｄａｖｉｄ Ｓ．Ｈａｇｅ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００６，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ，ｖｏｌ．９２，Ｃｈａｐｔｅｒ ９，“Ｄｙｅ−Ｌｉｇａｎｄ ａｎｄ Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００６，ＩＳＢＮ０８２４７４０５７２および９７８０８２４７４０５７３）、
【０００８】
Ｄｙｅ−ｌｉｇａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．３（Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９８７）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．より発行（ＩＳＳＮ０２７３−２２８９（印刷物）１５９９−０２９１（オンライン）、
【０００９】
Ｄｙｅ−ｌｉｇａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３ＧＡ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｂｙ Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ｓ．，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６（２）：１６９−２０５（１９８４）、
【００１０】
Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ ｔｒｉａｚｉｎｅ ｄｙｅｓ−Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｂｙ Ｙ．Ｄ．Ｃｌｏｎｉｓ ａｎｄ Ｃ．Ｒ．Ｌｏｗｅ ＣＲ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．，６５９（１）：８６−９８（１９８１）、
【００１１】
Ｔｒｉａｚｉｎｅ−ｄｙｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ；ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｂｙ Ｔ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．，９（４）：２９０−３（１９８１）、
【００１２】
Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｙ．Ｄ．Ｃｌｏｎｉｓ，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７（４）：２６３−７９（１９８８）、
【００１３】
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８２：３４３−５７（１９９０）、
【００１４】
Ｄｙｅ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，Ｎ．Ｇａｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ，９（４）：２５９−７４（１９９６）、
【００１５】
Ｄｙｅ−ｌｉｇａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍｓ，ｂｙ Ａ．Ｄｅｎｉｚｌｉ ａｎｄ Ｅ．Ｐｉｓｋｉｎ，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４９（１−３）：３９１−４１６（２００１）、および
【００１６】
Ｗｅｌｌ ｄｅｆｉｎｅｄ ｄｙｅ ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓｃｏｂｌｅ ａｎｄ Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ，９（５−６）：７２８−３２（１９９６）。
【００１７】
色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーは比較的廉価であり、化学分解および生物学的分解に対して耐性があり、ｉｎ ｓｉｔｕ洗浄および滅菌に好適であるため、抗体および抗体断片を含有するタンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）等のポリペプチドを精製するための色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーの使用は、そのような媒体を有効的および効果的に使用することができる場合に、最適な望ましい方法である。
【００１８】
タンパク質精製のための色素リガンドの潜在的有用性は、１９６０年代に、科学者が、カラムクロマトグラフィーによる精製手順の間に、酵素ピルビン酸キナーゼがＢｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎと共溶出したことを見出したときに発見された。同様に、Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎは、ヒト赤血球からピルビン酸キナーゼを精製するために後に使用された。Ｈａｇｅの２３２ページを参照のこと。
【００１９】
１９６０年代から、アルブミンおよび他の血液タンパク質等のタンパク質、オキシドレダクターゼ、デカルボキシラーゼ、糖分解酵素、ヌクレアーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、シンターゼ、およびトランスフェラーゼを精製するためのリガンドとして、色素が使用されてきた。Ｈａｇｅの２３２ページを参照のこと。
【００２０】
色素リガンドクロマトグラフィー媒体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、およびＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．等の多数の市販源から入手可能である。そのような媒体の例は、ＢＬＵＥ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥ、ＡＦＦＩ−ＧＥＬ（商標）Ｂｌｕｅ Ａｇａｒｏｓｅ、ＣＢ３ＧＡ−アガロース、Ｂｌｕｅ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｒｏｗｎ １０−セファロース、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｇｒｅｅｎ １９−セファロース、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−セファロース、およびＲｅａｃｔｉｖｅ Ｙｅｌｌｏｗ ３−セファロースを含む。不溶性のクロマトグラフィー支持マトリックスに結合され得る色素分子の追加例は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３ＧＡ、Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｒｅｄ ＨＥ−３Ｂ、Ｐｒｏｃｉｏｎｅ Ｒｕｂｉｎｅ ＭＸ−Ｂ、Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ Ｈ−Ａ、およびＴｕｒｑｏｕｉｓｅ ＭＸ−Ｇを含む。Ｈａｇｅの２３３ページを参照のこと。
【００２１】
トリアジン色素は、色素リガンドクロマトグラフィーで使用される最も一般的な分子である。そのような分子の化学構造は、通常、不溶性支持体（アガロース、デキストラン、またはセルロース等）への結合のために使用される別の有機分子（１，３，５−ｓｙｍ−トリクロロトリアジン等）にアミノ架橋を介して結合される発色団単位（色を生成する部分）を含む。
【００２２】
ＢＬＵＥ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、またはより具体的にはＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から市販されるアフィニティークロマトグラフィー媒体である。ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、約７マイクロモルのＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３Ｇが排水した媒体１ｍＬ当たり３ｇの濃度で、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３Ｇ色素が共有結合された６％高度架橋アガロースビーズ構造を含む、クロマトグラフィー媒体である。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅは、「ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、トリアジンカップリング法によりＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗマトリックスに共有結合されたＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３Ｇである。これらの青色色素は、アルブミン、インターフェロン、リポタンパク質、および血液凝固因子等の多くのタンパク質に結合する。また、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ、およびアデニル含有（例えば、ＮＡＤ＋）を必要とするほとんどの酵素を含む、幾つかの酵素にも結合する。高度に架橋したマトリックスは、安定した剛性媒体を提供する。Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳ（商標）媒体ファミリーに属する。ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳ（商標）媒体は、産業スケール、特に医療用品の製造のために開発、作製、および支持される分離媒体である。それらの高い物理的および化学的安定性、バッチごとの非常に高い再現性、ならびに法規制に関するサポートファイルのバックアップにより、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ媒体は、プロセスの開発からスケールアップおよび生産まで、操作のすべての段階に理想的である」と報告している。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ文献ファイルＮｏ．７１−７０５５−００ ＡＧ（ｐｒｉｎｔｅｄ ｉｎ Ｓｗｅｄｅｎ ｂｙ Ｗｉｋｓｔｒｏｅｍｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｊａｎ．２００６（Ｎｏ．１０５０９９１））を参照のこと（この文献ファイルは、本特許出願の教示に矛盾しないまたは相違しない範囲で、参照によってのみ本明細書に組み込まれるものとし、矛盾または相違がある場合には、本出願が優先し、かつ／または、任意のそのような矛盾または相違する事項に優先することが意図される）。
【００２３】
ＣＡＰＴＯ（商標） ＢＬＵＥは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から市販されるアフィニティークロマトグラフィー媒体である。ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥクロマトグラフィー媒体は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ色素が媒体１ｍＬ当たりＣｉｂａｃｒｏｎ約１１〜１６マイクロモルの濃度で共有結合された、高度架橋アガロースのビーズ構造を含むクロマトグラフィー媒体である。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅは、ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥを「アルブミンの捕獲、ならびに実験室およびプロセススケールでの酵素および組み換えタンパク質の精製向けに」市販する。また、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅは、ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥは「Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗから開発され、［また］Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅは、その前身よりも化学的に安定しており、剛性のアガロースベースのマトリックスを有する。これらの改善によって、より早い流速およびより大きな試料体積の使用が可能となり、結合能を有意に低下せずに、より高いスループットをもたらす」と報告している。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ＳｃｉｅｎｃｅｓデータファイルＮｏ．２８−９３９２−４６ＡＡ（０６／２００８）を参照のこと（このデータファイルは、本特許出願の教示に矛盾しないまたは相違しない範囲で、参照によってのみ本明細書に組み込まれるものとし、矛盾または相違がある場合には、本出願が優先し、かつ／または、任意のそのような矛盾または相違する事項に優先することが意図される）。
【００２４】
色素リガンドクロマトグラフィー媒体を使用してタンパク質を単離するための最適な条件は、単離されるべき特定の標的タンパク質に依存して経験的に決定される。有効的かつ効果的にタンパク質を単離または精製する能力に有意な影響を与える可能性がある変数は、ｐＨ、溶液のイオン強度、タンパク質が入っている混合物の組成、温度、試料サイズ、そして、当然のことながら、使用されている特定の色素リガンドおよび支持マトリックスを含む。
【００２５】
プロテインＡおよび他の手順を使用した抗体の精製
【００２６】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）およびＦｃ融合タンパク質の捕獲および単離のために最も広く使用される方法の１つである。プロテインＡは、比較的高い収率の抗体混合物を生成する一方で、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡの除去に非常に有効である。しかしながら、プロテインＡを使用することの短所は、ＰＲＩと標的抗体との結合および共溶出、凝集体の共溶出、ミスフォールドした抗体の形成、および半抗体を含む。したがって、プロテインＡの精製後には、ＰＲＩを除去することを目的とするその後の手順（例えば、イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィー法）のために、抗体収率の相当の損失が生じることが多い。
【００２７】
他の分離方法も、抗体の精製のために日常的に用いられてきた。そのような方法は、一般的に、負荷（例えば、イオン交換）、疎水性（ＨＩＣ、疎水性相互作用クロマトグラフィー）、サイズ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、アフィニティー（プロテインＡと同様）、またはそのような方法の組み合わせに基づく相互作用に依存する。
【００２８】
Ｇａｇｎｏｎによる特許出願は、混合モードクロマトグラフィーによる抗体精製手順におけるＰＥＧ（または他の水溶性の非イオン性有機ポリマー）の使用を教示している。２００８年１月７日に出願され、２００８年７月２４日に公開された特許文献１（これ以後、Ｇａｇｎｏｎと称する）を参照のこと。しかしながら、本発明のＧａｇｎｏｎとの重要な相違は、Ｇａｇｎｏｎが、ＰＥＧの使用により、そこに列挙される種々の種類の混合モードクロマトグラフィー樹脂に対する抗体、凝集体、およびウイルスの結合能が向上されることを教示していることである。とりわけ、Ｇａｇｎｏｎは、樹脂への結合能を向上させる手段として、クロマトグラフィー精製ステップを通してのＰＥＧの使用（すなわち、抗体が最初にカラムに適用されるときのＰＥＧの組み込み、ならびに洗浄および溶出段階におけるＰＥＧの使用）を強調している。実際に、Ｇａｇｎｏｎは、「非イオン性有機ポリマーの存在により、ほとんどの夾雑タンパク質と比較して、混合モードクロマトグラフィー支持体に対する抗体の保持が好ましく向上される」と教示している。例えば、Ｇａｇｎｏｎの２ページ［００１４］段落目（強調表示されている）を参照のこと。Ｇａｇｎｏｎは、複数の種類の利用可能な混合モードクロマトグラフィー樹脂および相互作用力の種類を列挙しているが（例えば、Ｇａｇｎｏｎの［０００３］段落目および［００１２］段落目を参照）、Ｇａｇｎｏｎにおける明確な強調は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂に関するものであり、すべての実施例はそれを用いて行われている。より具体的には、Ｇａｇｎｏｎは、一般的に、色素リガンドクロマトグラフィー樹脂に関する言及を含まず、または具体的には、青色色素クロマトグラフィー樹脂に関する言及を含まない。さらに、Ｇａｇｎｏｎにおいて教示される、有機ポリマーの存在下で混合モード樹脂に対する抗体の「保持の向上」とは対照的に、本発明は、溶出段階（単一ステップまたは勾配溶出段階において）のみに有機ポリマー（ＰＥＧ等）を組み込むことによって、色素リガンドクロマトグラフィー樹脂から標的抗体を特異的に溶出するための、有機ポリマー（ＰＥＧ等）の使用に関する。換言すると、色素リガンドクロマトグラフィー樹脂では、ＰＥＧ等の有機ポリマーは、樹脂に対する抗体の結合を向上させるためには使用されないが、その代わりに、樹脂から標的抗体を溶出するために使用される。実際に、この相違により、Ｇａｇｎｏｎにおける「混合モードクロマトグラフィー支持体は、イオン交換等の単一モードクロマトグラフィー法を用いて再現することができない独特の選択性を提供するが、方法の開発は複雑であり、予測不可能であり、また、広範囲のリソースを必要とする可能性がある。それでも、ヒドロキシアパタイトによって例示されるように、有用な手順の開発に長い期間を必要とする可能性がある」という所見が説明され得る。Ｇａｇｎｏｎの［０００４］段落目を参照のこと。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０１７７０４８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、望ましくない夾雑物の混合物から抗体または抗体断片を含有するタンパク質（Ｆｃ融合タンパク質等）を単離または精製するための、色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーを使用する改善された方法に関する。（簡略化するために、別途記載のない限り、図および特許請求の範囲を含む本明細書の至るところで使用される「抗体」（単数または複数）という用語は、当該技術分野において一般的に理解されるこれらのポリペプチドのような抗体を含むこと、およびＦｃ融合タンパク質等の抗体の一部を含むタンパク質を含むことが意図される）。
【００３１】
抗体／色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーによる単離手順の溶出段階においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の有機ポリマーを使用することにより、（ＰＥＧ等の有機ポリマーの非存在下で溶出が行われる同じ手順と比較して）抗体混合物中に最初に存在する夾雑物からの標的抗体の分離が向上される（改善される）ことが現在明らかになっている。一実施形態において、本明細書に記載される方法は、標的抗体から抗体凝集体、ミスフォールド抗体、およびウイルス夾雑物を分離または除去するのに特に有用である。ミスフォールド抗体と抗体凝集体とは、後者と比較して前者の分子量が低いことによって区別することができる。ミスフォールド抗体と、同分子量の適切にフォールドされた抗体とは、後者と比較して前者が生物学的に不活性であることによって区別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥに対するＦｃ融合タンパク質の結合をＢｌｕｅ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）に対するＦｃ融合タンパク質の結合と比較する結合能試験。
【図２】ＮａＣｌ勾配溶出実験は、凝集体の溶出不良および不活性形態を示した。
【図３】不活性種の除去を試みた洗浄実験。
【図４】ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥ樹脂は、プロセス由来不純物を除去するための最適化に、より多くの機会を提供した。
【図５】ＰＥＧは、Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）およびＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥクロマトグラフィー媒体の両方を使用して凝集体の除去を改善した。
【図６】ＰＥＧは、融合タンパク質からの凝集体の分離を改善した。
【図７】ＰＥＧは、ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）およびＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥの両方を使用して、ｍＡｂ混合物からの凝集体の分離を改善した。
【図８】ＰＥＧ−３３５０は、３０ｋＤａダイアフィルトレーションを使用して除去することができる。
【図９】ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）は、プロテインＡ／イオン交換による精製手順と比較して優れた収率および純度を提供した。
【図１０】ＰＥＧは、青色樹脂クロマトグラフィーによる精製手順におけるウイルスのクリアランスを向上させた。
【図１１】溶出段階においてＰＥＧとともにＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）を使用する、改善された抗体単離の例示的プロトコル。
【図１２】溶出段階においてＰＥＧとともにＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）によって抗体を単離したときに得られた結果の例。
【図１３】例示的な色素リガンドアフィニティークロマトグラフィー部分。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の開発は、抗体およびＦｃ融合タンパク質を精製する、比較的廉価ではあるが、迅速かつ効率的な手段を実施するという要望が動機であった。具体的には、色素アフィニティークロマトグラフィーによる単離手順における移動相修飾剤（ＰＥＧ等）の効果を調査した。色素リガンドクロマトグラフィーによる精製手順の溶出段階の間に有機ポリマー（ＰＥＧ等）を使用することにより、ウイルス、ミスフォールド抗体、および抗体凝集体等のＰＲＩからの標的抗体のクリアランス（精製）が向上されることが明らかになった。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「有機ポリマー」は、有機組成物の水溶性、非荷電性の線形ポリマー、分岐ポリマー、または別様の構造化ポリマーを指す。その例として、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。例として、１００〜２０，０００ダルトンの範囲の平均ポリマー分子量の組成物が挙げられるが、これらに限定されない。市販のＰＥＧ製剤の平均分子量は、通常、ハイフン付きの接尾語によって示される。例えば、ＰＥＧ−３５００は、約３，５００ダルトンの平均分子量を有する製剤を指す。
【００３５】
ＰＥＧは、その親水性によって、タンパク質表面から「優先的に溶出された」非荷電性有機ポリマーである。ＰＥＧの存在により、タンパク質は、水分子の少なくとも１つの分子層でタンパク質（抗体等）が包囲またはコーティングされた「水和シェル」を共有する。しかしながら、この状態は、熱力学的に不利な条件を作り出す。よって、ＰＥＧの存在下において、抗体および他の分子または夾雑物は、色素リガンドアフィニティーマトリックスと会合することによって見出され得るような、より有利な熱力学的条件をより強く「求める」か、またはそれを引き付ける高い力を有する。
【００３６】
ＰＥＧの他のいくつかの利点は、それが廉価であり、多様な分子量（ＭＷ）で入手可能であることである。ＰＥＧは、ＭＷが＜１０００Ｄａである場合は液体形状で存在し、＞１０００Ｄａである場合は粉末形状で存在する。種々の異なるＭＷのＰＥＧが入手可能であることにより、標的タンパク質および抗体の異なるＭＷおよびｐＩ（等電点）に基づいて最適なサイズのＰＥＧ分子を組み合わせる際に、選択性が可能になる。
【００３７】
本明細書に記載されるように、本発明の一実施形態は、ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）クロマトグラフィーを用いる抗体精製手順にＰＥＧを含めることにより、標的抗体を含有する初期混合物からの凝集体の良好な捕獲（単離）および除去の改善がもたらされるという発見に起因するものである。実際に、溶出緩衝液にＰＥＧを添加すると、樹脂に密接に結合した凝集体を維持する一方で、抗体モノマーの高度に選択的な溶出がもたらされた。
【００３８】
さらに、ＰＥＧと同様の様式で色素リガンドクロマトグラフィー媒体上の抗体の単離または精製にも使用され得る、ＰＥＧに類似する非イオン性水溶性有機ポリマーは、エチレン、グリコール、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールを含むが、これらに限定されない。
【００３９】
エチレングリコール
【００４０】
エチレングリコール（モノエチレングリコール（ＭＥＧ）、１，２−エタンジオール）は、２つの「ＯＨ」基（すなわち、ジオール）を有するアルコールである。その純粋な形態において、エチレングリコールは、無臭、無色の、甘味のある毒性の液体である。エチレングリコールは、中間体であるエチレンオキシドを介してエチレンから生成される。エチレンオキシドは、以下の化学式により、水と反応してエチレングリコールを生成する：
【００４１】
Ｃ２Ｈ４Ｏ＋Ｈ２Ｏ→ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ。
【００４２】
この反応は、酸もしくは塩基のいずれかによって触媒され得るか、または、温度上昇下において中性ｐＨで生じ得る。主な副産物は、オリゴマーのエチレングリコール生成物である、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、およびテトラエチレングリコールである。本発明の実施形態は、抗体の単離（精製）におけるエチレングリコールの任意の利用可能な形態の使用を含む。
【００４３】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
【００４４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られる有機ポリマーである（具体的には、エチレンオキシドのポリマーであるため、ポリエーテルの一種である）。ＰＥＧは、エチレンオキシドの重合によって調製され、以下の構造を有する３００ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌの幅広い分子量範囲で市販されている：
【００４５】
ＨＯ−ＣＨ２−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−）ｎ−ＣＨ２−ＯＨ。
【００４６】
（式中、「ｎ」は、３００ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を生じさせる任意の数である）。
【００４７】
ほとんどのＰＥＧ組成物は、単一の一様な分子量ではなく、分子量分布を有する分子を含む。このサイズ分布は、その平均分子量（ＭＷ）によって統計的に特徴付けることができる。またＰＥＧは、異なる形状でも入手可能である。分岐ＰＥＧは、一般に、中心のコア基から生じる３〜１０個のＰＥＧ鎖を有する。「星型」ＰＥＧは、一般に、中心のコア基から生じる１０〜１００個のＰＥＧ鎖を有する。「櫛形」ＰＥＧは、一般に、ポリマー骨格にグラフトされた複数のＰＥＧ鎖を有する。本発明の実施形態は、抗体の単離（精製）におけるＰＥＧの任意の利用可能な形態の使用を含む。
【００４８】
ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）
【００４９】
ポリプロピレングリコールまたはポリプロピレンオキシドは、プロピレングリコールのポリマー（グリセリン骨格に結合した長鎖ポリマー）である。ポリプロピレングリコールは、ポリエーテルである。ポリプロピレングリコールまたはＰＰＧという用語は、通常はヒドロキシル基である末端基の性質がその分子の総分子量と有意な関係がある場合、低分子量〜中分子量の範囲の分子量のポリマーに使われる。「オキシド」という用語は、末端基がポリマーの特性にもはや影響を与えない場合、高分子量の範囲の分子量のポリマーに使用される。ＰＰＧは、ポリエチレングリコールと共通する多くの特性を有する。このポリマーは、室温では液体である。水中溶解度は、モル質量の増加とともに急速に低下する。ほとんどのＰＰＧ組成物は、単一の一様な分子量ではなく、分子量分布を有する分子を含む。そのサイズ分布は、その平均分子量（ＭＷ）によって統計的に特徴付けることが出来る。
【化１】
【００５０】
本発明の実施形態は、抗体の単離（精製）におけるＰＥＧの任意の利用可能な形態の使用を含む。
【００５１】
夾雑物または目的物質由来不純物
【００５２】
本明細書で使用される「夾雑物」または目的物質由来不純物（ＰＲＩ）は、標的分子から好ましくまたは望ましく除去または分離される任意の分子または化合物を指す。（本発明の目的のために、標的分子は、抗体またはＦｃ融合タンパク質等の抗体断片を含有するタンパク質である）。夾雑物またはＰＲＩの例として、ウイルス、宿主細胞タンパク質、ミスフォールドタンパク質、凝集タンパク質、半抗体、タンパク質のダイマー、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸、およびエンドトキシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
クロマトグラフィー媒体および色素の例
【００５４】
有機ポリマーと併せて抗体の精製のために使用することができる色素リガンドクロマトグラフィー媒体の例として、
・ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥ、
・ＢＬＵＥ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、
・ＡＦＦＩ−ＧＥＬ ＢＬＵＥ（商標）アガロース、
・ＣＢ３ＧＡ−アガロース、
・Ｂｌｕｅ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、
・Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｒｏｗｎ １０−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、
・Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｇｒｅｅｎ １９−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、
・Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、
・Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｙｅｌｌｏｗ ３−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが挙げられるが、これらに限定されない。
＊ＡＦＦＩ−ＧＥＬ ＢＬＵＥ（商標）アガロースは、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３ＧＡ色素が共有結合した架橋アガロースビーズであり、この媒体はＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）より市販されている。
【００５５】
（有機ポリマーと併せて）抗体の精製のためにクロマトグラフィー媒体と併せて使用することができる色素の例として、
・Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ、
・Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｌｕｅ ２、
・Ｂｌｕｅ−Ｂ、
・Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ、
・Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｒｅｄ ＨＥ−３Ｂ、
・Ｐｒｏｃｉｏｎｅ Ｒｕｂｉｎｅ ＭＸ−Ｂ、
・Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ Ｈ−Ａ、
・Ｔｕｒｑｏｕｉｓｅ ＭＸ−Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
抗体
【００５７】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語（またはそれらの複数形）は、本明細書において交換可能に使用され得る。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）を参照のこと。「抗体」という用語は、生化学的に区別することができる幅広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、その間にいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）を伴って、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として重鎖を分類できることを理解するであろう。それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして抗体の「クラス」を決定することがこの鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等は、十分に特徴付けられており、機能分化を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプの各々が修飾されたものは、当業者に容易に認識され、したがって、本発明の範囲内である。
【００５８】
抗体および抗体断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成される断片、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示されるＩＧＦ−１Ｒ抗体に対する抗Ｉｄ抗体）を含むが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであり得る。
【００５９】
本発明の抗体またはその抗体断片は、鳥類および哺乳類を含む任意の動物が起源であり得る。好ましくは、これらの抗体は、ヒト、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。別の実施形態において、可変領域は、軟骨魚類が起源（例えば、サメ由来）であってもよい。
【００６０】
Ｆｃ融合タンパク質
本明細書で使用される場合、別途記載のない限り、「Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域を有する、含有する、または含むタンパク質を含むことが意図される。組み換えられ得るまたは自然に発生し得るＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域または免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む。Ｆｃ含有タンパク質の例は、酵素的に活性な因子ＶＩＩＩ：Ｆｃ融合タンパク質等のタンパク質である。Ｆｃ融合タンパク質は、本発明の方法による単離または精製のために酵素的に活性である必要はない。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を指すことが意図される。一実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を指す（例えば、配列番号１を参照のこと）。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はやや変化してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、天然ポリペプチドのＣｙｓ２２６位（または配列番号１のＣｙｓ１０９）のアミノ酸残基からカルボキシル末端までの範囲であると定義される。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域」という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域の自然に発生する対立遺伝子変異体、および置換、付加、または欠失をもたらす変化を有する、遺伝子的にまたは人工的に操作された変異体を含むことが意図される。例えば、実質的に機能を損なうことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端から１つもしくは複数のアミノ酸が欠失していてもよい。同様に、実質的に機能を損なうことなく、１つもしくは複数のアミノ酸がＦｃ領域に挿入されていても、そこから欠失していても、またはその中で置換されていてもよい。そのような変異体は、色素リガンドクロマトグラフィー媒体による単離の活性または効率に与える影響が最小限になるように、当該技術分野で既知である生化学的原理にしたがって作られてもよい。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「融合」および「キメラの」という用語は、Ｆｃ融合タンパク質等のポリペプチドに関連して用いられる場合、別個の遺伝子でコードされるタンパク質の一部分等の、２つ以上の異種のポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す（前記遺伝子は、同じかまたは異なる生物種のいずれかに生じる）。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「変異体」（または類似体）という用語は、例えば、突然変異誘発等の組み換えＤＮＡ技術を使用して作製されるアミノ酸の挿入、欠質、および置換によるＦｃＲｎ等の、具体的に列挙される本発明のポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。対象となる活性を無効にすることなく、どのアミノ酸残基を置換、付加、または欠失することができるかを決定する指針は、特定のポリペプチドの配列を、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、ウシ、ブタの相同なペプチドの配列と比較し、相同性の高い領域（保存領域）におけるアミノ酸配列の変化数を最小限に抑えることによって、またはアミノ酸をコンセンサス配列と交換することによって、見出すことができる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「天然の」（または自然に発生する）ポリペプチドは、自然によく見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を指す。例えば、天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（非ＡおよびＡアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域、および天然配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域、ならびにそれらの自然に発生する変異体を含む。他の配列も企図され、それらは種々のデータベース（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））から容易に得られる。
【実施例】
【００６６】
実施例
色素リガンドクロマトグラフィー手順の間に特定の抗体を単離するための最適条件を経験的に確立する際に考慮されるべきいくつかのパラメータは、最適なｐＨの決定、出発試料、洗浄液、および溶出液のイオン強度（例えば、塩化ナトリウムの濃度）、ならびにＰＥＧまたは使用される他の有機ポリマーの濃度およびＭＷを含むが、これらに限定されない。
【００６７】
実行される実験の具体的な例を本明細書に示した図に示すと同時に説明する。これらの実験の結果として決定された結論は、色素リガンドクロマトグラフィー分離手順の溶出ステップの一部としてＰＥＧ等の有機ポリマーを組み込むことは、良好に、効果的に、および有効的に、以下を行う能力を提供するという発見を含むが、これに限定されない。
【００６８】
・多数の夾雑物を含有する溶液の複合混合物から抗体およびＦｃ含有タンパク質を単離（精製）する（例えば、組み換え細胞培養物から採取した浄化細胞媒体からの抗体の単離）。
【００６９】
・高収率の標的タンパク質を提供する一方で、目的物質由来不純物を除去する。
【００７０】
・ミスフォールド抗体の形態を除去する。
【００７１】
・抗体凝集体の分解およびクリアランスを改善する。
【００７２】
・ウイルスのクリアランスを有意に向上させる。
【００７３】
・プロテインＡの手順よりも４〜６倍低コストである精製プロセスを提供する。
【００７４】
ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥ樹脂は、表１および図４に示すように、目的物質由来不純物を除去するための最適化により多くの機会を提供した。
【表１】
【００７５】
表１において、Ｉ−１およびＩ−２は、それぞれ不活性形態１および２である。溶出液に対するＰＥＧ付加を伴うｐＨ洗浄により、ミスフォールド形態を除去した。「ＣＭ」は、浄化媒体である。
【００７６】
表２および図５に示すように、ＰＥＧは、ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）およびＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥクロマトグラフィー媒体の両方を使用して凝集体の除去を改善した。
【表２】
【００７７】
表２において、１０〜１１％のＰＥＧは、実質的に凝集体を減少させ、より高いモノマー収率を提供した。ほぼ同じ条件が、２つの樹脂間で同程度の結果をもたらした。ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥは、より高い結合能を有する。「ＨＭＷ」は、高分子量である。
【００７８】
表３および図７に示すように、ＰＥＧは、ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）およびＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥの両方を使用してｍＡｂ混合物からの凝集体の分離を改善した。
【表３】
【００７９】
表３および図７に示すように、ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）およびＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥの両方に、それぞれ７．５％および２％のＰＥＧを付加することにより、高いモノマー収率で、凝集体の実質的な減少がもたらされた。ｍＡｂは、融合タンパク質よりも少ないＰＥＧを必要とすると考えられる。
【００８０】
表４および図１０に示すように、ＰＥＧは、青色樹脂クロマトグラフィーによる精製手順（融合タンパク質）においてウイルスのクリアランスを向上させた。
【表４】
【００８１】
表４および図１０に示すように、溶出ステップにＰＥＧを用いるかまたは用いないことを除いた同一条件下で、２つのウイルスについてウイルスクリアランス試験を実行した（重複実験）。結果は、溶出ステップにＰＥＧを付加することにより、ＭＭＶで１．５ｌｏｇ１０、Ｘ−ＭＬＶで３．０ｌｏｇ１０と、ウイルスクリアランスが有意に増加されたことを示す。表４および図１０を参照のこと。
【００８２】
溶出段階の間にＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）をＰＥＧとともに使用して改善された抗体の単離の例示的プロトコルは、以下の通りである：
【００８３】
（１））クロマトグラフィーカラムを２５ｍＭアセテート、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５で平衡化（ＥＱ）
【００８４】
（２）負荷：ｐＨ４．５に調整した抗体ＣＭ（力価１３ｍｇ／ｍＬの樹脂）
【００８５】
（３）洗浄１：２５ｍＭアセテート、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５
【００８６】
（４）洗浄２：２５ｍＭアセテート、ｐＨ４．５
【００８７】
（５）洗浄３：２５ｍＭ Ｂｉｓ ＴＲＩＳ、ｐＨ６．０（ＮａＣｌ＜１２．５ｍＭ ＮａＣｌ）
【００８８】
注：洗浄はミスフォールド形態を減少させる／除去するために使用される。
【００８９】
（６）洗浄４：２５ｍＭ Ｂｉｓ ＴＲＩＳ、１１％ＰＥＧ、ｐＨ６．０
【００９０】
（７）溶出：２５ｍＭ Ｂｉｓ ＴＲＩＳ、１１％ＰＥＧ＊、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０（１＋７ＣＶ）
【００９１】
注：溶出緩衝液中のＰＥＧは、樹脂に凝集体が結合した状態を維持したままで、抗体モノマーを溶出する。
【００９２】
（８）清潔なストリップカラム：２５ｍＭ Ｂｉｓ ＴＲＩＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０
【００９３】
（９）再生カラム：０．５Ｎ ＮａＯＨ
【００９４】
（１０）溶出液の画分中に採取した標的抗体の、貯蔵、定量化、生理活性の測定、またはさもなければ特徴付けを行う。
【００９５】
注）：実験の結果は、モノクローナル抗体の単離は、Ｆｃ融合タンパク質の単離と比較してより低濃度のＰＥＧを必要とするようであることを示唆している。例えば、表２および図５（１０〜１１％のＰＥＧで溶出したＦｃ融合タンパク質）と表３および図７（２％（ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥ）および７．５％ＰＥＧ（ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標））で溶出したＭａｂ）とを比較。
【００９６】
要約の部分ではなく、詳細な説明の部分が、特許請求の範囲を解釈するために使用されることが意図されることを理解されたい。要約は、１つもしくは複数の例示的な実施形態を記載しているかもしれないが、発明者（複数可）によって企図される本発明の全ての例示的な実施形態を記載しているわけではなく、よって、いかなる意味でも本発明および添付の特許請求の範囲を制限することを意図するものではない。
【００９７】
以上、本発明を特定の機能およびそれらの関係の実行を例示する機能的な構成要素を用いて説明した。これらの機能的な構成要素の範囲は、説明の便宜上、本明細書において任意に定義されている。特定の機能およびそれらの関係が適切に行われる限り、大体の範囲が定義されてもよい。
【００９８】
特定の実施形態の前述の記載は、当業者が、当該分野の技能内の知識を適用することによって、過渡の実験をせず、本発明の一般的概念から逸脱することなく、特定の実施形態のような種々の用途を容易に修正および／または用途に適合させることができるという、本発明の一般的性質を明らかにする。そのため、かかる適応および修正は、本明細書に提示した教示および指導に基づき、開示する実施形態の同等物の意味および範囲内であるように意図される。本明細書の中の表現または用語は、本明細書の用語または表現が、教示および指導を踏まえ当業者によって解釈されるように、説明のためであって、限定するものではないことが理解されるべきである。
【００９９】
本明細書に引用されるすべての参考文献は、個々の刊行物または特許または特許出願が、参照によりその全体がすべての目的のために具体的かつ個別に組み込まれるべく示されるのと同程度に、参照によりその全体がすべての目的のために組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する場合は、本明細書が優先するか、および／またはそのようないずれの矛盾する事項にも優先することが意図される。
【０１００】
明細書、図面、および特許請求の範囲において使用される成分、クロマトグラフィー条件等の量を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると解釈されたい。したがって、特に記載のない限り、明細書、図面、および特許請求の範囲に記載される数値的パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の性質に応じて変化し得る近似値である。
【０１０１】
本発明の広さと範囲は上述の例示的実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびその等価物に従ってのみ定義されるべきである。
【０１０２】
【表５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、望ましくない夾雑物（ＰＲＩつまり「目的物質由来不純物」としても知られる）の混合物から抗体または抗体断片を含有するタンパク質（Ｆｃ融合タンパク質等）を単離または精製するための、色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーを使用する改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体およびＦｃ融合タンパク質は、細胞培養物中で絶え間なく大量に生成されている。これには、目的物質由来不純物（ＰＲＩ、例えば、凝集体、半抗体、ミスフォールド抗体の形態）を除去することが可能でありながら十分な樹脂能力を維持するという、より大きな下流における課題が付随する。従来のプロテインＡの精製プロセスは、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡを除去するために、ＰＲＩがほとんど除去されない、高価な捕獲ステップを用いるため、（例えば、ＨＩＣ、ＳＥＣを使用して）ＰＲＩを除去する負担が下流へと移動し、実質的に収率損失を生じることが多い。これらのＰＲＩの除去は、出発量の多さ、対象とする生成物との生化学的類似性、およびプロテインＡクロマトグラフィー媒体に対する濃縮に起因して、精製プロセスのうちの最も課題の多い側面であり得る。捕獲のための代替アプローチを低コストで行うことも可能だが、純度が損なわれることが多い。よって、理想的なプロセスは、高純度、高収率、および低ＰＲＩ含有量の生成物をもたらす、低コストの捕獲ステップである。
【０００３】
プロテインＡ樹脂に匹敵する負荷能力でＦｃ含有タンパク質を捕獲するための、低コストの非従来的なクロマトグラフィー樹脂（色素リガンドクロマトグラフィー樹脂）を使用する方法の開発に成功した。移動相修飾剤を用いた洗浄ステップおよび溶出ステップの最適化は、高い生成物純度および収率を維持しながら、ＰＲＩを有意に除去する結果をもたらした。
【０００４】
色素リガンドアフィニティークロマトグラフィー
【０００５】
色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーは、「混合モード」のクロマトグラフィー媒体であるが、なぜなら、そのような媒体は、標的分子を結合させるために２つの別個の力に依存するからである。色素リガンドアフィニティー媒体の場合、これらの２つの力とは、陽イオン交換および疎水性相互作用である。図１３を参照のこと。
【０００６】
色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーにおける従来の方法に関するさらなる情報については、容易に入手可能であって、当業者に理解される、多数の刊行物が存在する。例えば、以下を参照のこと：
【０００７】
Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｂｙ Ｄａｖｉｄ Ｓ．Ｈａｇｅ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００６，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ，ｖｏｌ．９２，Ｃｈａｐｔｅｒ ９，“Ｄｙｅ−Ｌｉｇａｎｄ ａｎｄ Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００６，ＩＳＢＮ０８２４７４０５７２および９７８０８２４７４０５７３）、
【０００８】
Ｄｙｅ−ｌｉｇａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．３（Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９８７）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．より発行（ＩＳＳＮ０２７３−２２８９（印刷物）１５９９−０２９１（オンライン）、
【０００９】
Ｄｙｅ−ｌｉｇａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３ＧＡ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｂｙ Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ｓ．，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６（２）：１６９−２０５（１９８４）、
【００１０】
Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ ｔｒｉａｚｉｎｅ ｄｙｅｓ−Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｂｙ Ｙ．Ｄ．Ｃｌｏｎｉｓ ａｎｄ Ｃ．Ｒ．Ｌｏｗｅ ＣＲ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．，６５９（１）：８６−９８（１９８１）、
【００１１】
Ｔｒｉａｚｉｎｅ−ｄｙｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ；ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｂｙ Ｔ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．，９（４）：２９０−３（１９８１）、
【００１２】
Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｙ．Ｄ．Ｃｌｏｎｉｓ，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７（４）：２６３−７９（１９８８）、
【００１３】
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８２：３４３−５７（１９９０）、
【００１４】
Ｄｙｅ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，Ｎ．Ｇａｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ，９（４）：２５９−７４（１９９６）、
【００１５】
Ｄｙｅ−ｌｉｇａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍｓ，ｂｙ Ａ．Ｄｅｎｉｚｌｉ ａｎｄ Ｅ．Ｐｉｓｋｉｎ，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４９（１−３）：３９１−４１６（２００１）、および
【００１６】
Ｗｅｌｌ ｄｅｆｉｎｅｄ ｄｙｅ ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓｃｏｂｌｅ ａｎｄ Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ，９（５−６）：７２８−３２（１９９６）。
【００１７】
色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーは比較的廉価であり、化学分解および生物学的分解に対して耐性があり、ｉｎ ｓｉｔｕ洗浄および滅菌に好適であるため、抗体および抗体断片を含有するタンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）等のポリペプチドを精製するための色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーの使用は、そのような媒体を有効的および効果的に使用することができる場合に、最適な望ましい方法である。
【００１８】
タンパク質精製のための色素リガンドの潜在的有用性は、１９６０年代に、科学者が、カラムクロマトグラフィーによる精製手順の間に、酵素ピルビン酸キナーゼがＢｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎと共溶出したことを見出したときに発見された。同様に、Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎは、ヒト赤血球からピルビン酸キナーゼを精製するために後に使用された。Ｈａｇｅの２３２ページを参照のこと。
【００１９】
１９６０年代から、アルブミンおよび他の血液タンパク質等のタンパク質、オキシドレダクターゼ、デカルボキシラーゼ、糖分解酵素、ヌクレアーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、シンターゼ、およびトランスフェラーゼを精製するためのリガンドとして、色素が使用されてきた。Ｈａｇｅの２３２ページを参照のこと。
【００２０】
色素リガンドクロマトグラフィー媒体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、およびＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．等の多数の市販源から入手可能である。そのような媒体の例は、ＢＬＵＥ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥ、ＡＦＦＩ−ＧＥＬ（商標）Ｂｌｕｅ Ａｇａｒｏｓｅ、ＣＢ３ＧＡ−アガロース、Ｂｌｕｅ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｒｏｗｎ １０−セファロース、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｇｒｅｅｎ １９−セファロース、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−セファロース、およびＲｅａｃｔｉｖｅ Ｙｅｌｌｏｗ ３−セファロースを含む。不溶性のクロマトグラフィー支持マトリックスに結合され得る色素分子の追加例は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３ＧＡ、Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｒｅｄ ＨＥ−３Ｂ、Ｐｒｏｃｉｏｎｅ Ｒｕｂｉｎｅ ＭＸ−Ｂ、Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ Ｈ−Ａ、およびＴｕｒｑｏｕｉｓｅ ＭＸ−Ｇを含む。Ｈａｇｅの２３３ページを参照のこと。
【００２１】
トリアジン色素は、色素リガンドクロマトグラフィーで使用される最も一般的な分子である。そのような分子の化学構造は、通常、不溶性支持体（アガロース、デキストラン、またはセルロース等）への結合のために使用される別の有機分子（１，３，５−ｓｙｍ−トリクロロトリアジン等）にアミノ架橋を介して結合される発色団単位（色を生成する部分）を含む。
【００２２】
ＢＬＵＥ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、またはより具体的にはＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から市販されるアフィニティークロマトグラフィー媒体である。ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、約７マイクロモルのＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３Ｇが排水した媒体１ｍＬ当たり３ｇの濃度で、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３Ｇ色素が共有結合された６％高度架橋アガロースビーズ構造を含む、クロマトグラフィー媒体である。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅは、「ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、トリアジンカップリング法によりＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗマトリックスに共有結合されたＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３Ｇである。これらの青色色素は、アルブミン、インターフェロン、リポタンパク質、および血液凝固因子等の多くのタンパク質に結合する。また、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ、およびアデニル含有（例えば、ＮＡＤ＋）を必要とするほとんどの酵素を含む、幾つかの酵素にも結合する。高度に架橋したマトリックスは、安定した剛性媒体を提供する。Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳ（商標）媒体ファミリーに属する。ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳ（商標）媒体は、産業スケール、特に医療用品の製造のために開発、作製、および支持される分離媒体である。それらの高い物理的および化学的安定性、バッチごとの非常に高い再現性、ならびに法規制に関するサポートファイルのバックアップにより、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ媒体は、プロセスの開発からスケールアップおよび生産まで、操作のすべての段階に理想的である」と報告している。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ文献ファイルＮｏ．７１−７０５５−００ ＡＧ（ｐｒｉｎｔｅｄ ｉｎ Ｓｗｅｄｅｎ ｂｙ Ｗｉｋｓｔｒｏｅｍｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｊａｎ．２００６（Ｎｏ．１０５０９９１））を参照のこと（この文献ファイルは、本特許出願の教示に矛盾しないまたは相違しない範囲で、参照によってのみ本明細書に組み込まれるものとし、矛盾または相違がある場合には、本出願が優先し、かつ／または、任意のそのような矛盾または相違する事項に優先することが意図される）。
【００２３】
ＣＡＰＴＯ（商標） ＢＬＵＥは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から市販されるアフィニティークロマトグラフィー媒体である。ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥクロマトグラフィー媒体は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ色素が媒体１ｍＬ当たりＣｉｂａｃｒｏｎ約１１〜１６マイクロモルの濃度で共有結合された、高度架橋アガロースのビーズ構造を含むクロマトグラフィー媒体である。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅは、ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥを「アルブミンの捕獲、ならびに実験室およびプロセススケールでの酵素および組み換えタンパク質の精製向けに」市販する。また、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅは、ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥは「Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗから開発され、［また］Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅは、その前身よりも化学的に安定しており、剛性のアガロースベースのマトリックスを有する。これらの改善によって、より早い流速およびより大きな試料体積の使用が可能となり、結合能を有意に低下せずに、より高いスループットをもたらす」と報告している。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ＳｃｉｅｎｃｅｓデータファイルＮｏ．２８−９３９２−４６ＡＡ（０６／２００８）を参照のこと（このデータファイルは、本特許出願の教示に矛盾しないまたは相違しない範囲で、参照によってのみ本明細書に組み込まれるものとし、矛盾または相違がある場合には、本出願が優先し、かつ／または、任意のそのような矛盾または相違する事項に優先することが意図される）。
【００２４】
色素リガンドクロマトグラフィー媒体を使用してタンパク質を単離するための最適な条件は、単離されるべき特定の標的タンパク質に依存して経験的に決定される。有効的かつ効果的にタンパク質を単離または精製する能力に有意な影響を与える可能性がある変数は、ｐＨ、溶液のイオン強度、タンパク質が入っている混合物の組成、温度、試料サイズ、そして、当然のことながら、使用されている特定の色素リガンドおよび支持マトリックスを含む。
【００２５】
プロテインＡおよび他の手順を使用した抗体の精製
【００２６】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）およびＦｃ融合タンパク質の捕獲および単離のために最も広く使用される方法の１つである。プロテインＡは、比較的高い収率の抗体混合物を生成する一方で、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡの除去に非常に有効である。しかしながら、プロテインＡを使用することの短所は、ＰＲＩと標的抗体との結合および共溶出、凝集体の共溶出、ミスフォールドした抗体の形成、および半抗体を含む。したがって、プロテインＡの精製後には、ＰＲＩを除去することを目的とするその後の手順（例えば、イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィー法）のために、抗体収率の相当の損失が生じることが多い。
【００２７】
他の分離方法も、抗体の精製のために日常的に用いられてきた。そのような方法は、一般的に、負荷（例えば、イオン交換）、疎水性（ＨＩＣ、疎水性相互作用クロマトグラフィー）、サイズ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、アフィニティー（プロテインＡと同様）、またはそのような方法の組み合わせに基づく相互作用に依存する。
【００２８】
Ｇａｇｎｏｎによる特許出願は、混合モードクロマトグラフィーによる抗体精製手順におけるＰＥＧ（または他の水溶性の非イオン性有機ポリマー）の使用を教示している。２００８年１月７日に出願され、２００８年７月２４日に公開された特許文献１（これ以後、Ｇａｇｎｏｎと称する）を参照のこと。しかしながら、本発明のＧａｇｎｏｎとの重要な相違は、Ｇａｇｎｏｎが、ＰＥＧの使用により、そこに列挙される種々の種類の混合モードクロマトグラフィー樹脂に対する抗体、凝集体、およびウイルスの結合能が向上されることを教示していることである。とりわけ、Ｇａｇｎｏｎは、樹脂への結合能を向上させる手段として、クロマトグラフィー精製ステップを通してのＰＥＧの使用（すなわち、抗体が最初にカラムに適用されるときのＰＥＧの組み込み、ならびに洗浄および溶出段階におけるＰＥＧの使用）を強調している。実際に、Ｇａｇｎｏｎは、「非イオン性有機ポリマーの存在により、ほとんどの夾雑タンパク質と比較して、混合モードクロマトグラフィー支持体に対する抗体の保持が好ましく向上される」と教示している。例えば、Ｇａｇｎｏｎの２ページ［００１４］段落目（強調表示されている）を参照のこと。Ｇａｇｎｏｎは、複数の種類の利用可能な混合モードクロマトグラフィー樹脂および相互作用力の種類を列挙しているが（例えば、Ｇａｇｎｏｎの［０００３］段落目および［００１２］段落目を参照）、Ｇａｇｎｏｎにおける明確な強調は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂に関するものであり、すべての実施例はそれを用いて行われている。より具体的には、Ｇａｇｎｏｎは、一般的に、色素リガンドクロマトグラフィー樹脂に関する言及を含まず、または具体的には、青色色素クロマトグラフィー樹脂に関する言及を含まない。さらに、Ｇａｇｎｏｎにおいて教示される、有機ポリマーの存在下で混合モード樹脂に対する抗体の「保持の向上」とは対照的に、本発明は、溶出段階（単一ステップまたは勾配溶出段階において）のみに有機ポリマー（ＰＥＧ等）を組み込むことによって、色素リガンドクロマトグラフィー樹脂から標的抗体を特異的に溶出するための、有機ポリマー（ＰＥＧ等）の使用に関する。換言すると、色素リガンドクロマトグラフィー樹脂では、ＰＥＧ等の有機ポリマーは、樹脂に対する抗体の結合を向上させるためには使用されないが、その代わりに、樹脂から標的抗体を溶出するために使用される。実際に、この相違により、Ｇａｇｎｏｎにおける「混合モードクロマトグラフィー支持体は、イオン交換等の単一モードクロマトグラフィー法を用いて再現することができない独特の選択性を提供するが、方法の開発は複雑であり、予測不可能であり、また、広範囲のリソースを必要とする可能性がある。それでも、ヒドロキシアパタイトによって例示されるように、有用な手順の開発に長い期間を必要とする可能性がある」という所見が説明され得る。Ｇａｇｎｏｎの［０００４］段落目を参照のこと。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０１７７０４８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、望ましくない夾雑物の混合物から抗体または抗体断片を含有するタンパク質（Ｆｃ融合タンパク質等）を単離または精製するための、色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーを使用する改善された方法に関する。（簡略化するために、別途記載のない限り、図および特許請求の範囲を含む本明細書の至るところで使用される「抗体」（単数または複数）という用語は、当該技術分野において一般的に理解されるこれらのポリペプチドのような抗体を含むこと、およびＦｃ融合タンパク質等の抗体の一部を含むタンパク質を含むことが意図される）。
【００３１】
抗体／色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーによる単離手順の溶出段階においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の有機ポリマーを使用することにより、（ＰＥＧ等の有機ポリマーの非存在下で溶出が行われる同じ手順と比較して）抗体混合物中に最初に存在する夾雑物からの標的抗体の分離が向上される（改善される）ことが現在明らかになっている。一実施形態において、本明細書に記載される方法は、標的抗体から抗体凝集体、ミスフォールド抗体、およびウイルス夾雑物を分離または除去するのに特に有用である。ミスフォールド抗体と抗体凝集体とは、後者と比較して前者の分子量が低いことによって区別することができる。ミスフォールド抗体と、同分子量の適切にフォールドされた抗体とは、後者と比較して前者が生物学的に不活性であることによって区別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥに対するＦｃ融合タンパク質の結合をＢｌｕｅ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）に対するＦｃ融合タンパク質の結合と比較する結合能試験。
【図２】ＮａＣｌ勾配溶出実験は、凝集体の溶出不良および不活性形態を示した。
【図３】不活性種の除去を試みた洗浄実験。
【図４】ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥ樹脂は、プロセス由来不純物を除去するための最適化に、より多くの機会を提供した。
【図５】ＰＥＧは、Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）およびＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥクロマトグラフィー媒体の両方を使用して凝集体の除去を改善した。
【図６】ＰＥＧは、融合タンパク質からの凝集体の分離を改善した。
【図７】ＰＥＧは、ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）およびＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥの両方を使用して、ｍＡｂ混合物からの凝集体の分離を改善した。
【図８】ＰＥＧ−３３５０は、３０ｋＤａダイアフィルトレーションを使用して除去することができる。
【図９】ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）は、プロテインＡ／イオン交換による精製手順と比較して優れた収率および純度を提供した。
【図１０】ＰＥＧは、青色樹脂クロマトグラフィーによる精製手順におけるウイルスのクリアランスを向上させた。
【図１１】溶出段階においてＰＥＧとともにＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）を使用する、改善された抗体単離の例示的プロトコル。
【図１２】溶出段階においてＰＥＧとともにＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）によって抗体を単離したときに得られた結果の例。
【図１３】例示的な色素リガンドアフィニティークロマトグラフィー部分。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の開発は、抗体およびＦｃ融合タンパク質を精製する、比較的廉価ではあるが、迅速かつ効率的な手段を実施するという要望が動機であった。具体的には、色素アフィニティークロマトグラフィーによる単離手順における移動相修飾剤（ＰＥＧ等）の効果を調査した。色素リガンドクロマトグラフィーによる精製手順の溶出段階の間に有機ポリマー（ＰＥＧ等）を使用することにより、ウイルス、ミスフォールド抗体、および抗体凝集体等のＰＲＩからの標的抗体のクリアランス（精製）が向上されることが明らかになった。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「有機ポリマー」は、有機組成物の水溶性、非荷電性の線形ポリマー、分岐ポリマー、または別様の構造化ポリマーを指す。その例として、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。例として、１００〜２０，０００ダルトンの範囲の平均ポリマー分子量の組成物が挙げられるが、これらに限定されない。市販のＰＥＧ製剤の平均分子量は、通常、ハイフン付きの接尾語によって示される。例えば、ＰＥＧ−３５００は、約３，５００ダルトンの平均分子量を有する製剤を指す。
【００３５】
ＰＥＧは、その親水性によって、タンパク質表面から「優先的に溶出された」非荷電性有機ポリマーである。ＰＥＧの存在により、タンパク質は、水分子の少なくとも１つの分子層でタンパク質（抗体等）が包囲またはコーティングされた「水和シェル」を共有する。しかしながら、この状態は、熱力学的に不利な条件を作り出す。よって、ＰＥＧの存在下において、抗体および他の分子または夾雑物は、色素リガンドアフィニティーマトリックスと会合することによって見出され得るような、より有利な熱力学的条件をより強く「求める」か、またはそれを引き付ける高い力を有する。
【００３６】
ＰＥＧの他のいくつかの利点は、それが廉価であり、多様な分子量（ＭＷ）で入手可能であることである。ＰＥＧは、ＭＷが＜１０００Ｄａである場合は液体形状で存在し、＞１０００Ｄａである場合は粉末形状で存在する。種々の異なるＭＷのＰＥＧが入手可能であることにより、標的タンパク質および抗体の異なるＭＷおよびｐＩ（等電点）に基づいて最適なサイズのＰＥＧ分子を組み合わせる際に、選択性が可能になる。
【００３７】
本明細書に記載されるように、本発明の一実施形態は、ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）クロマトグラフィーを用いる抗体精製手順にＰＥＧを含めることにより、標的抗体を含有する初期混合物からの凝集体の良好な捕獲（単離）および除去の改善がもたらされるという発見に起因するものである。実際に、溶出緩衝液にＰＥＧを添加すると、樹脂に密接に結合した凝集体を維持する一方で、抗体モノマーの高度に選択的な溶出がもたらされた。
【００３８】
さらに、ＰＥＧと同様の様式で色素リガンドクロマトグラフィー媒体上の抗体の単離または精製にも使用され得る、ＰＥＧに類似する非イオン性水溶性有機ポリマーは、エチレン、グリコール、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールを含むが、これらに限定されない。
【００３９】
エチレングリコール
【００４０】
エチレングリコール（モノエチレングリコール（ＭＥＧ）、１，２−エタンジオール）は、２つの「ＯＨ」基（すなわち、ジオール）を有するアルコールである。その純粋な形態において、エチレングリコールは、無臭、無色の、甘味のある毒性の液体である。エチレングリコールは、中間体であるエチレンオキシドを介してエチレンから生成される。エチレンオキシドは、以下の化学式により、水と反応してエチレングリコールを生成する：
【００４１】
Ｃ２Ｈ４Ｏ＋Ｈ２Ｏ→ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ。
【００４２】
この反応は、酸もしくは塩基のいずれかによって触媒され得るか、または、温度上昇下において中性ｐＨで生じ得る。主な副産物は、オリゴマーのエチレングリコール生成物である、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、およびテトラエチレングリコールである。本発明の実施形態は、抗体の単離（精製）におけるエチレングリコールの任意の利用可能な形態の使用を含む。
【００４３】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
【００４４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られる有機ポリマーである（具体的には、エチレンオキシドのポリマーであるため、ポリエーテルの一種である）。ＰＥＧは、エチレンオキシドの重合によって調製され、以下の構造を有する３００ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌの幅広い分子量範囲で市販されている：
【００４５】
ＨＯ−ＣＨ２−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−）ｎ−ＣＨ２−ＯＨ。
【００４６】
（式中、「ｎ」は、３００ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を生じさせる任意の数である）。
【００４７】
ほとんどのＰＥＧ組成物は、単一の一様な分子量ではなく、分子量分布を有する分子を含む。このサイズ分布は、その平均分子量（ＭＷ）によって統計的に特徴付けることができる。またＰＥＧは、異なる形状でも入手可能である。分岐ＰＥＧは、一般に、中心のコア基から生じる３〜１０個のＰＥＧ鎖を有する。「星型」ＰＥＧは、一般に、中心のコア基から生じる１０〜１００個のＰＥＧ鎖を有する。「櫛形」ＰＥＧは、一般に、ポリマー骨格にグラフトされた複数のＰＥＧ鎖を有する。本発明の実施形態は、抗体の単離（精製）におけるＰＥＧの任意の利用可能な形態の使用を含む。
【００４８】
ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）
【００４９】
ポリプロピレングリコールまたはポリプロピレンオキシドは、プロピレングリコールのポリマー（グリセリン骨格に結合した長鎖ポリマー）である。ポリプロピレングリコールは、ポリエーテルである。ポリプロピレングリコールまたはＰＰＧという用語は、通常はヒドロキシル基である末端基の性質がその分子の総分子量と有意な関係がある場合、低分子量〜中分子量の範囲の分子量のポリマーに使われる。「オキシド」という用語は、末端基がポリマーの特性にもはや影響を与えない場合、高分子量の範囲の分子量のポリマーに使用される。ＰＰＧは、ポリエチレングリコールと共通する多くの特性を有する。このポリマーは、室温では液体である。水中溶解度は、モル質量の増加とともに急速に低下する。ほとんどのＰＰＧ組成物は、単一の一様な分子量ではなく、分子量分布を有する分子を含む。そのサイズ分布は、その平均分子量（ＭＷ）によって統計的に特徴付けることが出来る。
【化１】
【００５０】
本発明の実施形態は、抗体の単離（精製）におけるＰＥＧの任意の利用可能な形態の使用を含む。
【００５１】
夾雑物または目的物質由来不純物
【００５２】
本明細書で使用される「夾雑物」または目的物質由来不純物（ＰＲＩ）は、標的分子から好ましくまたは望ましく除去または分離される任意の分子または化合物を指す。（本発明の目的のために、標的分子は、抗体またはＦｃ融合タンパク質等の抗体断片を含有するタンパク質である）。夾雑物またはＰＲＩの例として、ウイルス、宿主細胞タンパク質、ミスフォールドタンパク質、凝集タンパク質、半抗体、タンパク質のダイマー、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸、およびエンドトキシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
クロマトグラフィー媒体および色素の例
【００５４】
有機ポリマーと併せて抗体の精製のために使用することができる色素リガンドクロマトグラフィー媒体の例として、
・ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥ、
・ＢＬＵＥ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、
・ＡＦＦＩ−ＧＥＬ ＢＬＵＥ（商標）アガロース、
・ＣＢ３ＧＡ−アガロース、
・Ｂｌｕｅ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、
・Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｒｏｗｎ １０−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、
・Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｇｒｅｅｎ １９−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、
・Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、
・Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｙｅｌｌｏｗ ３−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが挙げられるが、これらに限定されない。
＊ＡＦＦＩ−ＧＥＬ ＢＬＵＥ（商標）アガロースは、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３ＧＡ色素が共有結合した架橋アガロースビーズであり、この媒体はＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）より市販されている。
【００５５】
（有機ポリマーと併せて）抗体の精製のためにクロマトグラフィー媒体と併せて使用することができる色素の例として、
・Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ、
・Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｌｕｅ ２、
・Ｂｌｕｅ−Ｂ、
・Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ、
・Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｒｅｄ ＨＥ−３Ｂ、
・Ｐｒｏｃｉｏｎｅ Ｒｕｂｉｎｅ ＭＸ−Ｂ、
・Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ Ｈ−Ａ、
・Ｔｕｒｑｏｕｉｓｅ ＭＸ−Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
抗体
【００５７】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語（またはそれらの複数形）は、本明細書において交換可能に使用され得る。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）を参照のこと。「抗体」という用語は、生化学的に区別することができる幅広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、その間にいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）を伴って、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として重鎖を分類できることを理解するであろう。それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして抗体の「クラス」を決定することがこの鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等は、十分に特徴付けられており、機能分化を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプの各々が修飾されたものは、当業者に容易に認識され、したがって、本発明の範囲内である。
【００５８】
抗体および抗体断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成される断片、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示されるＩＧＦ−１Ｒ抗体に対する抗Ｉｄ抗体）を含むが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであり得る。
【００５９】
本発明の抗体またはその抗体断片は、鳥類および哺乳類を含む任意の動物が起源であり得る。好ましくは、これらの抗体は、ヒト、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。別の実施形態において、可変領域は、軟骨魚類が起源（例えば、サメ由来）であってもよい。
【００６０】
Ｆｃ融合タンパク質
本明細書で使用される場合、別途記載のない限り、「Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域を有する、含有する、または含むタンパク質を含むことが意図される。組み換えられ得るまたは自然に発生し得るＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域または免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域を含む。Ｆｃ含有タンパク質の例は、酵素的に活性な因子ＶＩＩＩ：Ｆｃ融合タンパク質等のタンパク質である。Ｆｃ融合タンパク質は、本発明の方法による単離または精製のために酵素的に活性である必要はない。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を指すことが意図される。一実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を指す（例えば、配列番号１を参照のこと）。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はやや変化してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、天然ポリペプチドのＣｙｓ２２６位（または配列番号１のＣｙｓ１０９）のアミノ酸残基からカルボキシル末端までの範囲であると定義される。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域」という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域の自然に発生する対立遺伝子変異体、および置換、付加、または欠失をもたらす変化を有する、遺伝子的にまたは人工的に操作された変異体を含むことが意図される。例えば、実質的に機能を損なうことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端から１つもしくは複数のアミノ酸が欠失していてもよい。同様に、実質的に機能を損なうことなく、１つもしくは複数のアミノ酸がＦｃ領域に挿入されていても、そこから欠失していても、またはその中で置換されていてもよい。そのような変異体は、色素リガンドクロマトグラフィー媒体による単離の活性または効率に与える影響が最小限になるように、当該技術分野で既知である生化学的原理にしたがって作られてもよい。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「融合」および「キメラの」という用語は、Ｆｃ融合タンパク質等のポリペプチドに関連して用いられる場合、別個の遺伝子でコードされるタンパク質の一部分等の、２つ以上の異種のポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す（前記遺伝子は、同じかまたは異なる生物種のいずれかに生じる）。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「変異体」（または類似体）という用語は、例えば、突然変異誘発等の組み換えＤＮＡ技術を使用して作製されるアミノ酸の挿入、欠質、および置換によるＦｃＲｎ等の、具体的に列挙される本発明のポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。対象となる活性を無効にすることなく、どのアミノ酸残基を置換、付加、または欠失することができるかを決定する指針は、特定のポリペプチドの配列を、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、ウシ、ブタの相同なペプチドの配列と比較し、相同性の高い領域（保存領域）におけるアミノ酸配列の変化数を最小限に抑えることによって、またはアミノ酸をコンセンサス配列と交換することによって、見出すことができる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「天然の」（または自然に発生する）ポリペプチドは、自然によく見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を指す。例えば、天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（非ＡおよびＡアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域、および天然配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域、ならびにそれらの自然に発生する変異体を含む。他の配列も企図され、それらは種々のデータベース（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））から容易に得られる。
【実施例】
【００６６】
実施例
色素リガンドクロマトグラフィー手順の間に特定の抗体を単離するための最適条件を経験的に確立する際に考慮されるべきいくつかのパラメータは、最適なｐＨの決定、出発試料、洗浄液、および溶出液のイオン強度（例えば、塩化ナトリウムの濃度）、ならびにＰＥＧまたは使用される他の有機ポリマーの濃度およびＭＷを含むが、これらに限定されない。
【００６７】
実行される実験の具体的な例を本明細書に示した図に示すと同時に説明する。これらの実験の結果として決定された結論は、色素リガンドクロマトグラフィー分離手順の溶出ステップの一部としてＰＥＧ等の有機ポリマーを組み込むことは、良好に、効果的に、および有効的に、以下を行う能力を提供するという発見を含むが、これに限定されない。
【００６８】
・多数の夾雑物を含有する溶液の複合混合物から抗体およびＦｃ含有タンパク質を単離（精製）する（例えば、組み換え細胞培養物から採取した浄化細胞媒体からの抗体の単離）。
【００６９】
・高収率の標的タンパク質を提供する一方で、目的物質由来不純物を除去する。
【００７０】
・ミスフォールド抗体の形態を除去する。
【００７１】
・抗体凝集体の分解およびクリアランスを改善する。
【００７２】
・ウイルスのクリアランスを有意に向上させる。
【００７３】
・プロテインＡの手順よりも４〜６倍低コストである精製プロセスを提供する。
【００７４】
ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥ樹脂は、表１および図４に示すように、目的物質由来不純物を除去するための最適化により多くの機会を提供した。
【表１】
【００７５】
表１において、Ｉ−１およびＩ−２は、それぞれ不活性形態１および２である。溶出液に対するＰＥＧ付加を伴うｐＨ洗浄により、ミスフォールド形態を除去した。「ＣＭ」は、浄化媒体である。
【００７６】
表２および図５に示すように、ＰＥＧは、ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）およびＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥクロマトグラフィー媒体の両方を使用して凝集体の除去を改善した。
【表２】
【００７７】
表２において、１０〜１１％のＰＥＧは、実質的に凝集体を減少させ、より高いモノマー収率を提供した。ほぼ同じ条件が、２つの樹脂間で同程度の結果をもたらした。ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥは、より高い結合能を有する。「ＨＭＷ」は、高分子量である。
【００７８】
表３および図７に示すように、ＰＥＧは、ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）およびＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥの両方を使用してｍＡｂ混合物からの凝集体の分離を改善した。
【表３】
【００７９】
表３および図７に示すように、ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）およびＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥの両方に、それぞれ７．５％および２％のＰＥＧを付加することにより、高いモノマー収率で、凝集体の実質的な減少がもたらされた。ｍＡｂは、融合タンパク質よりも少ないＰＥＧを必要とすると考えられる。
【００８０】
表４および図１０に示すように、ＰＥＧは、青色樹脂クロマトグラフィーによる精製手順（融合タンパク質）においてウイルスのクリアランスを向上させた。
【表４】
【００８１】
表４および図１０に示すように、溶出ステップにＰＥＧを用いるかまたは用いないことを除いた同一条件下で、２つのウイルスについてウイルスクリアランス試験を実行した（重複実験）。結果は、溶出ステップにＰＥＧを付加することにより、ＭＭＶで１．５ｌｏｇ１０、Ｘ−ＭＬＶで３．０ｌｏｇ１０と、ウイルスクリアランスが有意に増加されたことを示す。表４および図１０を参照のこと。
【００８２】
溶出段階の間にＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）をＰＥＧとともに使用して改善された抗体の単離の例示的プロトコルは、以下の通りである：
【００８３】
（１））クロマトグラフィーカラムを２５ｍＭアセテート、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５で平衡化（ＥＱ）
【００８４】
（２）負荷：ｐＨ４．５に調整した抗体ＣＭ（力価１３ｍｇ／ｍＬの樹脂）
【００８５】
（３）洗浄１：２５ｍＭアセテート、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５
【００８６】
（４）洗浄２：２５ｍＭアセテート、ｐＨ４．５
【００８７】
（５）洗浄３：２５ｍＭ Ｂｉｓ ＴＲＩＳ、ｐＨ６．０（ＮａＣｌ＜１２．５ｍＭ ＮａＣｌ）
【００８８】
注：洗浄はミスフォールド形態を減少させる／除去するために使用される。
【００８９】
（６）洗浄４：２５ｍＭ Ｂｉｓ ＴＲＩＳ、１１％ＰＥＧ、ｐＨ６．０
【００９０】
（７）溶出：２５ｍＭ Ｂｉｓ ＴＲＩＳ、１１％ＰＥＧ＊、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０（１＋７ＣＶ）
【００９１】
注：溶出緩衝液中のＰＥＧは、樹脂に凝集体が結合した状態を維持したままで、抗体モノマーを溶出する。
【００９２】
（８）清潔なストリップカラム：２５ｍＭ Ｂｉｓ ＴＲＩＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０
【００９３】
（９）再生カラム：０．５Ｎ ＮａＯＨ
【００９４】
（１０）溶出液の画分中に採取した標的抗体の、貯蔵、定量化、生理活性の測定、またはさもなければ特徴付けを行う。
【００９５】
注）：実験の結果は、モノクローナル抗体の単離は、Ｆｃ融合タンパク質の単離と比較してより低濃度のＰＥＧを必要とするようであることを示唆している。例えば、表２および図５（１０〜１１％のＰＥＧで溶出したＦｃ融合タンパク質）と表３および図７（２％（ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥ）および７．５％ＰＥＧ（ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標））で溶出したＭａｂ）とを比較。
【００９６】
要約の部分ではなく、詳細な説明の部分が、特許請求の範囲を解釈するために使用されることが意図されることを理解されたい。要約は、１つもしくは複数の例示的な実施形態を記載しているかもしれないが、発明者（複数可）によって企図される本発明の全ての例示的な実施形態を記載しているわけではなく、よって、いかなる意味でも本発明および添付の特許請求の範囲を制限することを意図するものではない。
【００９７】
以上、本発明を特定の機能およびそれらの関係の実行を例示する機能的な構成要素を用いて説明した。これらの機能的な構成要素の範囲は、説明の便宜上、本明細書において任意に定義されている。特定の機能およびそれらの関係が適切に行われる限り、大体の範囲が定義されてもよい。
【００９８】
特定の実施形態の前述の記載は、当業者が、当該分野の技能内の知識を適用することによって、過渡の実験をせず、本発明の一般的概念から逸脱することなく、特定の実施形態のような種々の用途を容易に修正および／または用途に適合させることができるという、本発明の一般的性質を明らかにする。そのため、かかる適応および修正は、本明細書に提示した教示および指導に基づき、開示する実施形態の同等物の意味および範囲内であるように意図される。本明細書の中の表現または用語は、本明細書の用語または表現が、教示および指導を踏まえ当業者によって解釈されるように、説明のためであって、限定するものではないことが理解されるべきである。
【００９９】
本明細書に引用されるすべての参考文献は、個々の刊行物または特許または特許出願が、参照によりその全体がすべての目的のために具体的かつ個別に組み込まれるべく示されるのと同程度に、参照によりその全体がすべての目的のために組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する場合は、本明細書が優先するか、および／またはそのようないずれの矛盾する事項にも優先することが意図される。
【０１００】
明細書、図面、および特許請求の範囲において使用される成分、クロマトグラフィー条件等の量を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると解釈されたい。したがって、特に記載のない限り、明細書、図面、および特許請求の範囲に記載される数値的パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の性質に応じて変化し得る近似値である。
【０１０１】
本発明の広さと範囲は上述の例示的実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびその等価物に従ってのみ定義されるべきである。
【０１０２】
【表５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つもしくは複数の夾雑物から抗体または抗体断片を含むタンパク質を分離する方法であって、
ａ）前記抗体またはタンパク質および前記１つもしくは複数の夾雑物を、色素リガンドクロマトグラフィー媒体と接触させることと、
ｂ）前記色素リガンドクロマトグラフィー媒体を有機ポリマーと接触させることと、
ｃ）ステップａ）およびｂ）の後に、前記抗体または前記タンパク質を前記色素リガンドクロマトグラフィー媒体との接触から取り出すことと、を含む、方法。
【請求項２】
ステップａ）とｂ）とは、同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）は、ステップｂ）の前に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）は、ステップｂ）の後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記有機ポリマーは、エチレングリコールである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記有機ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記有機ポリマーは、ポリプロピレングリコールまたはポリプロピレンオキシドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記色素リガンドクロマトグラフィー媒体は、トリアジン色素リガンドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記色素リガンドクロマトグラフィー媒体は、青色色素リガンドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記色素リガンドは、
ａ）Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ、
ｂ）Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｌｕｅ ２、
ｃ）Ｂｌｕｅ−Ｂ、
ｄ）Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ、
ｅ）Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｒｅｄ ＨＥ−３Ｂ、
ｆ）Ｐｒｏｃｉｏｎｅ Ｒｕｂｉｎｅ ＭＸ−Ｂ、
ｇ）Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ Ｈ−Ａ、および
ｈ）Ｔｕｒｑｏｕｉｓｅ ＭＸ−Ｇ
からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記色素リガンドクロマトグラフィー媒体は、
ａ）ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥ、
ｂ）ＢＬＵＥ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、
ｃ）ＡＦＦＩ−ＧＥＬ ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、
ｄ）ＣＢ３ＧＡ−アガロース、
ｅ）Ｂｌｕｅ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、
ｆ）Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｒｏｗｎ １０−セファロース、
ｇ）Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｇｒｅｅｎ １９−セファロース、
ｈ）Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−セファロース、および
ｉ）Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｙｅｌｌｏｗ ３−セファロース
からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体または抗体断片を含むタンパク質は、前記抗体またはタンパク質と最初に会合していた前記１つもしくは複数の夾雑物のある部分が存在せずに前記クロマトグラフィー媒体から溶出される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体または抗体断片を含むタンパク質は、前記抗体またはタンパク質と最初に会合していた１つもしくは複数の夾雑物のある部分から分離され、前記夾雑物は、
ａ）ミスフォールド抗体または抗体断片を含むミスフォールドタンパク質、
ｂ）凝集した抗体または抗体断片を含む凝集したタンパク質、
ｃ）半抗体、
ｄ）タンパク質のダイマー、
ｅ）ウイルスまたはウイルス粒子タンパク質、
ｆ）宿主細胞タンパク質、
ｇ）エンドトキシン、および
ｈ）核酸
からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体またはタンパク質から分離される前記夾雑物の部分は、
ａ）１つもしくは複数の夾雑物の約５０％以上、
ｂ）１つもしくは複数の夾雑物の約６０％以上、
ｃ）１つもしくは複数の夾雑物の約７０％以上、
ｄ）１つもしくは複数の夾雑物の約７５％以上、
ｅ）１つもしくは複数の夾雑物の約８０％以上、
ｆ）１つもしくは複数の夾雑物の約８５％以上、
ｇ）１つもしくは複数の夾雑物の約９０％以上、
ｈ）１つもしくは複数の夾雑物の約９５％以上、
ｉ）１つもしくは複数の夾雑物の約９６％以上、
ｊ）１つもしくは複数の夾雑物の約９７％以上、
ｋ）１つもしくは複数の夾雑物の約９８％以上、
ｌ）１つもしくは複数の夾雑物の約９９％以上、および
ｍ）１つもしくは複数の夾雑物の約１００％
からなる群から選択される割合である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗体断片を含む前記タンパク質の前記抗体断片部分は、抗体Ｆｃ領域または抗体Ｆｃドメインである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
抗体断片を含む前記タンパク質は、融合タンパク質である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記クロマトグラフィー媒体は、
ａ）約０．１〜約５０％のＰＥＧ、
ｂ）約０．１〜約４０％のＰＥＧ、
ｃ）約０．１〜約３０％のＰＥＧ、
ｄ）約０．１〜約２０％のＰＥＧ、
ｅ）約０．１〜約１０％のＰＥＧ、
ｆ）約０．１〜約５％のＰＥＧ、
ｇ）約０．１〜約２％のＰＥＧ、
ｈ）約１〜約５０％のＰＥＧ、
ｉ）約１〜約４０％のＰＥＧ、
ｊ）約１〜約３０％のＰＥＧ、
ｋ）約１〜約２０％のＰＥＧ、
ｌ）約１〜約１０％のＰＥＧ、
ｍ）約１〜約５％のＰＥＧ、
ｎ）約１〜約２％のＰＥＧ、
ｏ）約２〜約５０％のＰＥＧ、
ｐ）約２〜約４０％のＰＥＧ、
ｑ）約２〜約３０％のＰＥＧ、
ｒ）約２〜約２０％のＰＥＧ、
ｓ）約２〜約１０％のＰＥＧ、
ｔ）約２〜約５％のＰＥＧ、
ｕ）約５〜約５０％のＰＥＧ、
ｖ）約５〜約４０％のＰＥＧ、
ｗ）約５〜約３０％のＰＥＧ、
ｘ）約５〜約２０％のＰＥＧ、
ｙ）約５〜約１０％のＰＥＧ、
ｚ）約１０〜約５０％のＰＥＧ、
ａａ）約１０〜約４０％のＰＥＧ、
ａｂ）約１０〜約３０％のＰＥＧ、
ａｃ）約１０〜約２０％のＰＥＧ、
ａｄ）約０．１％のＰＥＧ、
ａｅ）約０．５％のＰＥＧ、
ａｆ）約１％のＰＥＧ、
ａｇ）約２％のＰＥＧ、
ａｈ）約３％のＰＥＧ、
ａｉ）約４％のＰＥＧ、
ａｋ）約５％のＰＥＧ、
ａｌ）約６％のＰＥＧ、
ａｍ）約７％のＰＥＧ、
ａｎ）約７．５％のＰＥＧ、
ａｏ）約８％のＰＥＧ、
ａｐ）約９％のＰＥＧ、
ａｑ）約１０％のＰＥＧ、
ａｒ）約１１％のＰＥＧ、
ａｓ）約１２％のＰＥＧ、
ａｔ）約１５％のＰＥＧ、
ａｕ）約２０％のＰＥＧ、
ａｖ）約２５％のＰＥＧ、
ａｗ）約３０％のＰＥＧ、
ａｘ）約３５％のＰＥＧ、
ａｙ）約４０％のＰＥＧ、
ａｚ）約４５％のＰＥＧ、および
ｂａ）約５０％のＰＥＧ
からなる群から選択される最終重量対体積濃度でＰＥＧと接触させられる、請求項１〜４、６、または１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記クロマトグラフィー媒体は、
ａ）約１００〜約２０，０００ダルトン、
ｂ）約１００〜約１５，０００ダルトン、
ｃ）約１００〜約１０，０００ダルトン、
ｄ）約１００〜約８，０００ダルトン、
ｅ）約１００〜約６，０００ダルトン、
ｆ）約１００〜約５，０００ダルトン、
ｇ）約１００〜約４，０００ダルトン、
ｈ）約１００〜約２，０００ダルトン、
ｉ）約１００〜約１，０００ダルトン、
ｊ）約１００〜約８００ダルトン、
ｋ）約１００〜約６００ダルトン、
ｌ）約１００〜約５００ダルトン、
ｍ）約１００〜約４００ダルトン、
ｎ）約１００〜約３００ダルトン、
ｏ）約１００〜約２００ダルトン、
ｐ）約４００〜約２０，０００ダルトン、
ｑ）約４００〜約１５，０００ダルトン、
ｒ）約４００〜約１０，０００ダルトン、
ｓ）約４００〜約８，０００ダルトン、
ｔ）約４００〜約６，０００ダルトン、
ｕ）約４００〜約５，０００ダルトン、
ｖ）約４００〜約４，０００ダルトン、
ｗ）約４００〜約２，０００ダルトン、
ｘ）約４００〜約１，０００ダルトン、
ｙ）約４００〜約８００ダルトン、
ｚ）約４００〜約６００ダルトン、
ａａ）約４００〜約５００ダルトン、
ａｂ）約６００〜約２０，０００ダルトン、
ａｃ）約６００〜約１５，０００ダルトン、
ａｄ）約６００〜約１０，０００ダルトン、
ａｅ）約６００〜約８，０００ダルトン、
ａｆ）約６００〜約６，０００ダルトン、
ａｇ）約６００〜約５，０００ダルトン、
ａｈ）約６００〜約４，０００ダルトン、
ａｉ）約６００〜約２，０００ダルトン、
ａｊ）約６００〜約１，０００ダルトン、
ａｋ）約６００〜約８００ダルトン、
ａｌ）約８００〜約２０，０００ダルトン、
ａｍ）約８００〜約１５，０００ダルトン、
ａｎ）約８００〜約１０，０００ダルトン、
ａｏ）約８００〜約８，０００ダルトン、
ａｐ）約８００〜約６，０００ダルトン、
ａｑ）約８００〜約５，０００ダルトン、
ａｒ）約８００〜約４，０００ダルトン、
ａｓ）約８００〜約２，０００ダルトン、
ａｔ）約８００〜約１，０００ダルトン、
ａｕ）約１，０００〜約２０，０００ダルトン、
ａｖ）約１，０００〜約１５，０００ダルトン、
ａｗ）約１，０００〜約１０，０００ダルトン、
ａｘ）約１，０００〜約８，０００ダルトン、
ａｙ）約１，０００〜約６，０００ダルトン、
ａｚ）約１，０００〜約５，０００ダルトン、
ｂａ）約１，０００〜約４，０００ダルトン、
ｂｂ）約１，０００〜約２，０００ダルトン、
ｂｃ）約４，０００〜約２０，０００ダルトン、
ｂｄ）約４，０００〜約１５，０００ダルトン、
ｂｅ）約４，０００〜約１０，０００ダルトン、
ｂｆ）約４，０００〜約８，０００ダルトン、
ｂｇ）約４，０００〜約６，０００ダルトン、
ｂｈ）約４，０００〜約５，０００ダルトン、
ｂｉ）約６，０００〜約２０，０００ダルトン、
ｂｊ）約６，０００〜約１５，０００ダルトン、
ｂｋ）約６，０００〜約１０，０００ダルトン、
ｂｌ）約６，０００〜約８，０００ダルトン、
ｂｍ）約２０，０００ダルトン、
ｂｎ）約１５，０００ダルトン、
ｂｏ）約１０，０００ダルトン、
ｂｐ）約８，０００ダルトン、
ｂｑ）約６，０００ダルトン、
ｂｒ）約５，０００ダルトン、
ｂｓ）約４，０００ダルトン、
ｂｔ）約２，０００ダルトン、
ｂｕ）約１，０００ダルトン、
ｂｖ）約８００ダルトン、
ｂｗ）約６００ダルトン、
ｂｘ）約５００ダルトン、
ｂｙ）約４００ダルトン、
ｂｚ）約３００ダルトン、
ｃａ）約２００ダルトン、および
ｃｂ）約１００ダルトン
からなる群から選択される平均分子量のＰＥＧと接触させられる、請求項１〜４、６、または８〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
１つもしくは複数の夾雑物から抗体または抗体断片を含むタンパク質を分離する方法であって、
ａ）前記抗体またはタンパク質および前記１つもしくは複数の夾雑物を、色素リガンドクロマトグラフィー媒体と接触させることと、
ｂ）前記色素リガンドクロマトグラフィー媒体を有機ポリマーと接触させることと、
ｃ）ステップａ）およびｂ）の後に、前記抗体または前記タンパク質を前記色素リガンドクロマトグラフィー媒体との接触から取り出すことと、を含む、方法。
【請求項２】
ステップａ）とｂ）とは、同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）は、ステップｂ）の前に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）は、ステップｂ）の後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記有機ポリマーは、エチレングリコールである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記有機ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記有機ポリマーは、ポリプロピレングリコールまたはポリプロピレンオキシドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記色素リガンドクロマトグラフィー媒体は、トリアジン色素リガンドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記色素リガンドクロマトグラフィー媒体は、青色色素リガンドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記色素リガンドは、
ａ）Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ、
ｂ）Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｌｕｅ ２、
ｃ）Ｂｌｕｅ−Ｂ、
ｄ）Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ、
ｅ）Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｒｅｄ ＨＥ−３Ｂ、
ｆ）Ｐｒｏｃｉｏｎｅ Ｒｕｂｉｎｅ ＭＸ−Ｂ、
ｇ）Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ Ｈ−Ａ、および
ｈ）Ｔｕｒｑｏｕｉｓｅ ＭＸ−Ｇ
からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記色素リガンドクロマトグラフィー媒体は、
ａ）ＣＡＰＴＯ（商標）ＢＬＵＥ、
ｂ）ＢＬＵＥ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、
ｃ）ＡＦＦＩ−ＧＥＬ ＢＬＵＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、
ｄ）ＣＢ３ＧＡ−アガロース、
ｅ）Ｂｌｕｅ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、
ｆ）Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｒｏｗｎ １０−セファロース、
ｇ）Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｇｒｅｅｎ １９−セファロース、
ｈ）Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０−セファロース、および
ｉ）Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｙｅｌｌｏｗ ３−セファロース
からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体または抗体断片を含むタンパク質は、前記抗体またはタンパク質と最初に会合していた前記１つもしくは複数の夾雑物のある部分が存在せずに前記クロマトグラフィー媒体から溶出される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体または抗体断片を含むタンパク質は、前記抗体またはタンパク質と最初に会合していた１つもしくは複数の夾雑物のある部分から分離され、前記夾雑物は、
ａ）ミスフォールド抗体または抗体断片を含むミスフォールドタンパク質、
ｂ）凝集した抗体または抗体断片を含む凝集したタンパク質、
ｃ）半抗体、
ｄ）タンパク質のダイマー、
ｅ）ウイルスまたはウイルス粒子タンパク質、
ｆ）宿主細胞タンパク質、
ｇ）エンドトキシン、および
ｈ）核酸
からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体またはタンパク質から分離される前記夾雑物の部分は、
ａ）１つもしくは複数の夾雑物の約５０％以上、
ｂ）１つもしくは複数の夾雑物の約６０％以上、
ｃ）１つもしくは複数の夾雑物の約７０％以上、
ｄ）１つもしくは複数の夾雑物の約７５％以上、
ｅ）１つもしくは複数の夾雑物の約８０％以上、
ｆ）１つもしくは複数の夾雑物の約８５％以上、
ｇ）１つもしくは複数の夾雑物の約９０％以上、
ｈ）１つもしくは複数の夾雑物の約９５％以上、
ｉ）１つもしくは複数の夾雑物の約９６％以上、
ｊ）１つもしくは複数の夾雑物の約９７％以上、
ｋ）１つもしくは複数の夾雑物の約９８％以上、
ｌ）１つもしくは複数の夾雑物の約９９％以上、および
ｍ）１つもしくは複数の夾雑物の約１００％
からなる群から選択される割合である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗体断片を含む前記タンパク質の前記抗体断片部分は、抗体Ｆｃ領域または抗体Ｆｃドメインである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
抗体断片を含む前記タンパク質は、融合タンパク質である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記クロマトグラフィー媒体は、
ａ）約０．１〜約５０％のＰＥＧ、
ｂ）約０．１〜約４０％のＰＥＧ、
ｃ）約０．１〜約３０％のＰＥＧ、
ｄ）約０．１〜約２０％のＰＥＧ、
ｅ）約０．１〜約１０％のＰＥＧ、
ｆ）約０．１〜約５％のＰＥＧ、
ｇ）約０．１〜約２％のＰＥＧ、
ｈ）約１〜約５０％のＰＥＧ、
ｉ）約１〜約４０％のＰＥＧ、
ｊ）約１〜約３０％のＰＥＧ、
ｋ）約１〜約２０％のＰＥＧ、
ｌ）約１〜約１０％のＰＥＧ、
ｍ）約１〜約５％のＰＥＧ、
ｎ）約１〜約２％のＰＥＧ、
ｏ）約２〜約５０％のＰＥＧ、
ｐ）約２〜約４０％のＰＥＧ、
ｑ）約２〜約３０％のＰＥＧ、
ｒ）約２〜約２０％のＰＥＧ、
ｓ）約２〜約１０％のＰＥＧ、
ｔ）約２〜約５％のＰＥＧ、
ｕ）約５〜約５０％のＰＥＧ、
ｖ）約５〜約４０％のＰＥＧ、
ｗ）約５〜約３０％のＰＥＧ、
ｘ）約５〜約２０％のＰＥＧ、
ｙ）約５〜約１０％のＰＥＧ、
ｚ）約１０〜約５０％のＰＥＧ、
ａａ）約１０〜約４０％のＰＥＧ、
ａｂ）約１０〜約３０％のＰＥＧ、
ａｃ）約１０〜約２０％のＰＥＧ、
ａｄ）約０．１％のＰＥＧ、
ａｅ）約０．５％のＰＥＧ、
ａｆ）約１％のＰＥＧ、
ａｇ）約２％のＰＥＧ、
ａｈ）約３％のＰＥＧ、
ａｉ）約４％のＰＥＧ、
ａｋ）約５％のＰＥＧ、
ａｌ）約６％のＰＥＧ、
ａｍ）約７％のＰＥＧ、
ａｎ）約７．５％のＰＥＧ、
ａｏ）約８％のＰＥＧ、
ａｐ）約９％のＰＥＧ、
ａｑ）約１０％のＰＥＧ、
ａｒ）約１１％のＰＥＧ、
ａｓ）約１２％のＰＥＧ、
ａｔ）約１５％のＰＥＧ、
ａｕ）約２０％のＰＥＧ、
ａｖ）約２５％のＰＥＧ、
ａｗ）約３０％のＰＥＧ、
ａｘ）約３５％のＰＥＧ、
ａｙ）約４０％のＰＥＧ、
ａｚ）約４５％のＰＥＧ、および
ｂａ）約５０％のＰＥＧ
からなる群から選択される最終重量対体積濃度でＰＥＧと接触させられる、請求項１〜４、６、または１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記クロマトグラフィー媒体は、
ａ）約１００〜約２０，０００ダルトン、
ｂ）約１００〜約１５，０００ダルトン、
ｃ）約１００〜約１０，０００ダルトン、
ｄ）約１００〜約８，０００ダルトン、
ｅ）約１００〜約６，０００ダルトン、
ｆ）約１００〜約５，０００ダルトン、
ｇ）約１００〜約４，０００ダルトン、
ｈ）約１００〜約２，０００ダルトン、
ｉ）約１００〜約１，０００ダルトン、
ｊ）約１００〜約８００ダルトン、
ｋ）約１００〜約６００ダルトン、
ｌ）約１００〜約５００ダルトン、
ｍ）約１００〜約４００ダルトン、
ｎ）約１００〜約３００ダルトン、
ｏ）約１００〜約２００ダルトン、
ｐ）約４００〜約２０，０００ダルトン、
ｑ）約４００〜約１５，０００ダルトン、
ｒ）約４００〜約１０，０００ダルトン、
ｓ）約４００〜約８，０００ダルトン、
ｔ）約４００〜約６，０００ダルトン、
ｕ）約４００〜約５，０００ダルトン、
ｖ）約４００〜約４，０００ダルトン、
ｗ）約４００〜約２，０００ダルトン、
ｘ）約４００〜約１，０００ダルトン、
ｙ）約４００〜約８００ダルトン、
ｚ）約４００〜約６００ダルトン、
ａａ）約４００〜約５００ダルトン、
ａｂ）約６００〜約２０，０００ダルトン、
ａｃ）約６００〜約１５，０００ダルトン、
ａｄ）約６００〜約１０，０００ダルトン、
ａｅ）約６００〜約８，０００ダルトン、
ａｆ）約６００〜約６，０００ダルトン、
ａｇ）約６００〜約５，０００ダルトン、
ａｈ）約６００〜約４，０００ダルトン、
ａｉ）約６００〜約２，０００ダルトン、
ａｊ）約６００〜約１，０００ダルトン、
ａｋ）約６００〜約８００ダルトン、
ａｌ）約８００〜約２０，０００ダルトン、
ａｍ）約８００〜約１５，０００ダルトン、
ａｎ）約８００〜約１０，０００ダルトン、
ａｏ）約８００〜約８，０００ダルトン、
ａｐ）約８００〜約６，０００ダルトン、
ａｑ）約８００〜約５，０００ダルトン、
ａｒ）約８００〜約４，０００ダルトン、
ａｓ）約８００〜約２，０００ダルトン、
ａｔ）約８００〜約１，０００ダルトン、
ａｕ）約１，０００〜約２０，０００ダルトン、
ａｖ）約１，０００〜約１５，０００ダルトン、
ａｗ）約１，０００〜約１０，０００ダルトン、
ａｘ）約１，０００〜約８，０００ダルトン、
ａｙ）約１，０００〜約６，０００ダルトン、
ａｚ）約１，０００〜約５，０００ダルトン、
ｂａ）約１，０００〜約４，０００ダルトン、
ｂｂ）約１，０００〜約２，０００ダルトン、
ｂｃ）約４，０００〜約２０，０００ダルトン、
ｂｄ）約４，０００〜約１５，０００ダルトン、
ｂｅ）約４，０００〜約１０，０００ダルトン、
ｂｆ）約４，０００〜約８，０００ダルトン、
ｂｇ）約４，０００〜約６，０００ダルトン、
ｂｈ）約４，０００〜約５，０００ダルトン、
ｂｉ）約６，０００〜約２０，０００ダルトン、
ｂｊ）約６，０００〜約１５，０００ダルトン、
ｂｋ）約６，０００〜約１０，０００ダルトン、
ｂｌ）約６，０００〜約８，０００ダルトン、
ｂｍ）約２０，０００ダルトン、
ｂｎ）約１５，０００ダルトン、
ｂｏ）約１０，０００ダルトン、
ｂｐ）約８，０００ダルトン、
ｂｑ）約６，０００ダルトン、
ｂｒ）約５，０００ダルトン、
ｂｓ）約４，０００ダルトン、
ｂｔ）約２，０００ダルトン、
ｂｕ）約１，０００ダルトン、
ｂｖ）約８００ダルトン、
ｂｗ）約６００ダルトン、
ｂｘ）約５００ダルトン、
ｂｙ）約４００ダルトン、
ｂｚ）約３００ダルトン、
ｃａ）約２００ダルトン、および
ｃｂ）約１００ダルトン
からなる群から選択される平均分子量のＰＥＧと接触させられる、請求項１〜４、６、または８〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図３】
【図９】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図３】
【図９】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１２−５１９７００（Ｐ２０１２−５１９７００Ａ）
【公表日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５３１１０（Ｐ２０１１−５５３１１０）
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２６２１９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０２１１４
【国際公開日】平成２２年９月１０日（２０１０．９．１０）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２６２１９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０２１１４
【国際公開日】平成２２年９月１０日（２０１０．９．１０）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
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