免疫学的検出方法
【課題】本発明の課題は簡易、迅速、かつ高感度の免疫学的検出方法を提供することにある。
【解決手段】免疫学的検出方法であって、ａ）検体または検体を含む試料に、金属を含む標識により修飾された検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第一の蛋白質（Ｙ）を作用させ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成させる工程、ｂ）前記工程において生じた前記複合体と分析対象物と複合体を形成しなかった前記標識を含む第一の蛋白質Ｙとを分離する工程、ｃ）前記複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる工程、及びｄ）前記ＣＤおよび前記Ｃｐより生じた色素を検出する工程を有し、前記ＣＤが下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【解決手段】免疫学的検出方法であって、ａ）検体または検体を含む試料に、金属を含む標識により修飾された検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第一の蛋白質（Ｙ）を作用させ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成させる工程、ｂ）前記工程において生じた前記複合体と分析対象物と複合体を形成しなかった前記標識を含む第一の蛋白質Ｙとを分離する工程、ｃ）前記複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる工程、及びｄ）前記ＣＤおよび前記Ｃｐより生じた色素を検出する工程を有し、前記ＣＤが下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析対象物を含む試料を、簡易、迅速、高感度で検知することができる免疫学的検出方法に関する。特に発色反応を用いて高精度で分析対象物を検出する免疫学的検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質又は環境汚染物質の中には、極微量で作用するものが非常に多い。従って、これらの物質の定性的及び定量的測定には、従来、高感度分析が可能な機器分析法が広く用いられてきた。しかし、機器分析法は、特異性が低く、試料の前処理工程を含め、分析に時間を要する上、操作が煩雑なため、近年要求されている迅速簡便測定目的には不都合である。一方、免疫学的測定法は、特異性も高く、操作も機器分析よりはるかに簡便であることから、生理活性物質又は環境汚染物質の測定分野に徐々に普及してきた。この中にはラテックス凝集法、ＲＩＡ法あるいはＥＩＡ法（酵素免疫測定法）といった免疫学的測定法があるが、ラテックス凝集法は必ずしも測定の迅速簡便性あるいは検出感度を満たすものではなく、ＲＩＡ法は標識物質に放射性同位元素を使用するので、特殊な環境が必要である。
【０００３】
酵素免疫測定法は、人体に対して危険性の少ない免疫測定法として開発され、種々の物質の測定系に利用されている。しかしながら、臨床化学分析においては、その測定対象が生体試料（主として血清、尿等）であり、その測定値は病態の診断又は経過観察等に用いられることが多く、そのためのより高感度及び高精度な測定の要求を比色法で完全に満足させることは難しい。この要求を満たすことを目的として化学発光酵素免疫法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。化学発光酵素免疫測定法は、酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する測定対象物質の量を定量する方法である。この方法においては、化学反応により化学発光性物質を発光させるため光源が不要であり、光源に起因するバックグラウンドの上昇等がないため測定の高感度化が可能である。
【０００４】
しかしながら、ウイルスのような増殖する分析対象物の場合、より早い段階、すなわち少ないウイルス量での検出が必要であり、さらに高感度で簡便な検出方法が望まれていた。
【特許文献１】特開２０００−１４６９６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、分析対象物を含む試料を、簡易、迅速、高感度で検知することができる免疫学的検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。
【０００７】
＜１＞ 免疫学的検出方法であって、
ａ）検体または検体を含む試料に、金属を含む標識により修飾された検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第一の蛋白質（Ｙ）を作用させ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成させる工程、
ｂ）前記工程において生じた前記複合体と分析対象物と複合体を形成しなかった前記標識を含む第一の蛋白質Ｙとを分離する工程、
ｃ）前記複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる工程、及びｄ）前記ＣＤおよび前記Ｃｐより生じた色素を検出する工程を有し、前記ＣＤが下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする免疫学的検出方法：
【０００８】
【化１】
【０００９】
（一般式（Ｉ）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。Ｘは−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−ＣＯＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−、−ＣＯＣＯ−Ｏ−、−ＣＯＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−または−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ１３）−である。ここでＲ１３は水素原子または前記Ｒ１２として挙げた基より選ばれる基である。）。
＜２＞ 金属を含む標識が銀、金および白金原子の少なくとも１つを含むことを特徴とする＜１＞に記載の免疫学的検出方法。
＜３＞ 金属を含む標識が銀粒子であることを特徴とする＜２＞に記載の免疫学的検出方法。
＜４＞ 金属を含む標識がハロゲン化銀粒子であることを特徴とする＜１＞又は＜２＞に記載の免疫学的検出方法。
＜５＞ 前記ＣＤが、下記一般式（II）で表される化合物であることを特徴とする＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法：
【００１０】
【化２】
【００１１】
（一般式（II）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。）。
＜６＞ 前記ＣＤが、下記一般式（III）で表される化合物であることを特徴とする＜５＞に記載の免疫学的検出方法：
【００１２】
【化３】
【００１３】
（一般式（III）においてＲ１２はアルキル基、ヘテロ環基を表し、Ｘ２１、Ｘ２３、及びＸ２５は、それぞれ独立に、水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基を表し、Ｘ２２、Ｘ２４は、それぞれ独立に、水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子、アシルオキシ基、アシルチオ基を表す。ただし、Ｘ２１、Ｘ２３、Ｘ２５のハメットのσｐ値とＸ２２、Ｘ２４のハメットのσｍ値の和は１．５以上である。）。
＜７＞ 前記ＣＤが一般式（IV）で表される化合物であることを特徴とする＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法：
【００１４】
【化４】
【００１５】
（一般式（IV）におけるＲ１１とＲ１２は、それぞれ一般式（Ｉ）におけるものと同義である。）。
＜８＞ 前記ＣＤが親油性微粒子中に含有されていることを特徴とする＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
＜９＞ 前記Ｃｐが下記一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）および（Ｙ−３）よりなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法：
【００１６】
【化５】
【００１７】
（式中、Ｘ１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立に、電子求引性の置換基を表し、Ｒ１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【００１８】
【化６】
【００１９】
（式中、Ｘ２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ３とＲ４が互いに連結して環を形成してもよい。）；
【００２０】
【化７】
【００２１】
（式中、Ｘ３は水素原子または離脱基を表し、Ｒ５はカルバモイル基またはスルファモイル基を表し、Ｒ６は水素原子または置換基を表す。）；
【００２２】
【化８】
【００２３】
（式中、Ｘ４は水素原子または離脱基を表し、Ｒ７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ８は置換基を表す。）；
【００２４】
【化９】
【００２５】
（式中、Ｘ５は水素原子または離脱基を表し、Ｒ９はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ１０は置換基を表す。）；
【００２６】
【化１０】
【００２７】
（式中、Ｘ６は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１１はアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基を表し、Ｒ１０はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【００２８】
【化１１】
【００２９】
（式中、Ｘ７は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１３はアルキル基、アリール基、インドレニル基を表し、Ｒ１４はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【００３０】
【化１２】
【００３１】
（式中、Ｘ８は水素原子または離脱基を表し、Ｚは５員ないし７員の環を形成するのに必要な２価の基を表し、Ｒ１５はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【００３２】
【化１３】
【００３３】
（式中、Ｘ９は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、それぞれ独立に、置換基を表し、ｎは０ないし４の、ｍは０ないし５のいずれかの整数を表す。ｎまたはｍが２以上のとき、複数のＲ１６およびＲ１７はそれぞれ同一の基であってもよいし、別々の基であってもよい。）。
＜１０＞検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第二の蛋白質（Ｘ）および検体中の分析対象物を特異的に認識し得る酵素標識により修飾された第一の蛋白質（Ｙ）を同時にまたは段階的に作用させ、前記Ｘ、前記分析対象物および前記Ｙの複合体を形成させる工程を含むことを特徴とする＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
＜１１＞ 前記分析対象物が抗原であり、前記分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質が抗体であることを特徴とする＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
＜１２＞ 前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする＜１１＞に記載の免疫学的検出方法。
＜１３＞ 前記分析対象物を特異的に認識し得る前記蛋白質Ｘが不溶性担体に坦持されていることを特徴とする＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明により、試料中に含まれる分析対象物を、簡易、迅速、高感度で検知することができる免疫学的検出方法が提供される。特に増幅された発色反応を用いて分析対象物を高精度で検出する免疫学的検出方法が提供される。
本発明は、抗原抗体反応を利用し、抗体または抗原上に固定された標識を触媒とした酸化還元反応を増幅して、さらに発色反応を誘導し発色した色を検知することにより、簡便に高精度で検出するものである。また、分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質の１つを基質に固定化して、クロマトグラフによりさらに簡便に高精度で検出することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明の免疫学的検出方法は下記の工程を含む。
ａ）検体または検体を含む試料に、金属を含む標識により修飾された検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第一の蛋白質（Ｙ）を作用させ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成する工程
【００３６】
本工程においては、分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質を標識化した第一の蛋白質（Ｙ）を準備する。分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質としては、抗原抗体反応を利用する場合、抗体が好ましく用いられる。本発明に於いては、標識としては、過酸化物の酸化還元反応の触媒として機能することができる金属標識が用いられる。そのような金属標識としては、銀、金、白金などの金属、あるいはハロゲン化銀などの金属塩から選ばれる金属が用いられる。
検体または検体を緩衝液などに分散した検体を含む測定用試料に、第一の蛋白質（Ｙ）を作用させると、抗原抗体反応などの特異的相互作用により分析対象物と第一の蛋白質（Ｙ）を含む複合体が形成される。
【００３７】
ｂ）前記複合体と前記複合体を形成していない前記第一の蛋白質（Ｙ）とを分離する工程
該分離工程は、前記形成された複合体を複合体を形成していない遊離の第一の蛋白質（Ｙ）から分離する工程である。即ち、該分離工程では検体中に存在する分析対象物の量に対応した量の複合体が分離される。
【００３８】
ｃ）前記分離された複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる発色工程
複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させると、金属を含む標識が触媒となって、過酸化物を介した連鎖反応が起こり、還元剤が酸化され、還元剤の酸化体を生成する。続いて還元剤の酸化体と発色素材との発色反応が起こり、発色色素を生成する。生成する色素の量は、複合体量に依存するので、分析対象物の量に相当する。
【００３９】
ｄ）前記発色工程により生成した色素を検出する工程
生成した色素量は、公知の種々の手段により検出することができる。例えば、分析対象物の有無は、発色の有無を視覚的に官能評価することにより、瞬時に判定することができる。色素量を定量的に測定することも、濃度計、或いは分光光度計を用いて行うことが可能である。
【００４０】
該分離工程に用いることのできる複合体の分離手段としては、比重差を利用した遠心分離や超遠心分離法、溶解度差を利用して沈降法、塩析法、濾過法、透析法、限外濾過法、磁気を利用した分離法などの従来公知の分離手段を利用することができるが、本発明で特に有効は分離手段は、分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質を予めメンブレンあるいはクロマトグラフの固定層などの不溶性坦体上に固定化しておき、複合体を形成後、複合体を形成していない検体中の成分や検体試料作製に用いた成分等を洗浄して洗い流すか、あるいはクロマトグラフにより分離する方法である。
【００４１】
また、分離された他方の成分である遊離の第一の蛋白質（Ｙ）の量は、当初含有する第一の蛋白質（Ｙ）の量から複合体を形成した量を差し引いた量に相当するので、この量も検体中に存在する分析対象物の量を反映した量である。従って、複合体量及び遊離の第一の蛋白質（Ｙ）量のいずれも分析対象物の量の検出に利用することができる。高精度かつ簡便に検出するには、複合体を直接検出する手段が好ましい。
【００４２】
分離された複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる手段としては、過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）のそれぞれを含有するかもしくはこれらの２以上を混合して含有する溶液もしくは分散液の状態で作用させる方法を用いることができる。別の態様として、過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）の少なくとも１つを含有する発色シートを準備し、分離された複合体に該発色シートを重ね合わせて、該複合体と発色剤とを接触させ、発色反応を起こさせる方法である。好ましくは、発色シートが還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を含有し、過酸化物を含有する溶液を該複合体と発色シートの重ね合わせ体に供給する方法である。
【００４３】
本発明においては、発色反応には、好ましくは、還元剤の酸化体とカプラーのカップリング反応が用いられる。特に、有機銀塩を用いた熱現像記録材料中で熱現像により効率的にカップリング反応が可能な一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表される還元剤と一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）および（Ｙ−３）よりなる群より選ばれる少なくとも１種のカプラーが好ましく用いられる。
【００４４】
本発明の好ましい態様は、さらに検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第二の蛋白質（Ｘ）を含み、該第二の蛋白質（Ｘ）を前記分析対象物および前記第一の蛋白質（Ｙ）に同時にまたは段階的に作用させ、前記Ｘ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成する工程を有する。
【００４５】
好ましくは、前記分析対象物が抗原であり、前記分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質が抗体である。より好ましくは、前記抗体がモノクローナル抗体である。
さらに本発明の好ましい態様は、前記第二の蛋白質（Ｘ）を不溶性担体に坦持し、クロマトグラフにより複合体を分離して検出するイムノクロマトグラフである。
【００４６】
本発明に利用できる免疫反応段階を構成する抗原抗体反応は任意であり、従来公知のいずれの反応も採用することができる。
【００４７】
本発明においては、分離工程に用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等の種々の形状で用いることができる。
さらに、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。
【００４８】
また、本発明において用いられる抗体類（第一の蛋白質（Ｘ）、第二の蛋白質（Ｙ）は、分析対象によって適当なものを適宜用いることができる。ここで、抗体類としてモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれを使うことも可能であり、その形態としては全抗体又はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ等の断片を用いることができる。また、抗体の起源は任意であるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来する抗体が好適に用いられる。第一の蛋白質および第二の蛋白質の両方または一方がモノクローナル抗体であること、又はＦ（ａｂ’）２またはＦ（ａｂ’）であることが好ましい。
【００４９】
本発明の抗体とタンパク質との結合は、通常緩衝液中で行なわれる。ここに用いる緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
【００５０】
本発明における免疫学的検出方法は、分析対象物と該分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質との相互作用による複合体形成工程、該複合体の分離工程、分離された複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）及び発色素材（Ｃｐ）を作用させ発色させる発色工程を有する。複合体形成工程に要する温度及び時間は、用いられる分析対象物と蛋白質の組合せによって異なるが、概ね０℃〜５０℃で、１０秒〜１時間である。また、発色工程に要する温度及び時間は、用いられる複合体、還元剤（ＣＤ）及び発色素材（Ｃｐ）の組合せによって異なるが、概ね５℃〜６０℃で、３０秒〜３０分である。
複合体の分離工程は、分離方法によって、それぞれ好ましい工程所要時間が設定される。
発色の判定時間は任意であるが、上記発色工程の後に、発色濃度が高く維持され、発色が安定した時間を選択することが望ましい。発色の判定時間は、概ね発色工程の後、０〜２４時間が好ましく、より好ましくは０〜２時間、特に好ましくは０〜３０分である。発色工程の後の時間が長すぎると発色した色素の変色や退色が起こるので好ましくない。
【００５１】
本発明においては、抗原抗体反応などの免疫学的反応を増幅して検出する手段として、金属を触媒中心とした過酸化物の酸化還元反応を利用したものである。金属を触媒中心とした過酸化物の酸化還元反応は、一般的に知られていて、例えば、引例ＵＳ特許４４１４３０５号明細書にはカラー現像液およびＨ２Ｏ２を含む現像補力液で処理する処理方法が開示されている。
【００５２】
金属としては、金、銀、白金およびこれらの合金、あるいはハロゲン化銀（塩化銀、臭化銀、沃化銀、塩臭化銀、沃臭化銀、塩沃臭化銀等）が用いられる。また、錫や鉄などの過酸化物を分解することが知られている金属も用いることができる。本発明に於いては、特に好ましくは、金または銀である。金属の粒子サイズは特に制限されないが、好ましくは、球相当粒径が１ｎｍ〜１μｍであり、１０ｎｍ〜１００ｎｍがより好ましい。
これらの金属に過酸化物が接触すると該金属を反応中心として過酸化物から活性酸化成分が生成する。該活性酸化成分が還元剤（ＣＤ）に作用し、該ＣＤを酸化し、その酸化体（ＣＤｏｘ）を生成し、活性酸化成分より過酸化物を再生する。再生された過酸化物は再び活性酸化成分を生成するので一連のサイクルが繰り返し進行する。酸化体（ＣＤｏｘ）は発色色剤（Ｃｐ）をカップリング反応して色素を形成する。チェインリアクションによって酸化体（ＣＤｏｘ）が増幅して形成されるので、増幅されて色素が生成する。従って、抗体に金属標識を修飾することによって微量の抗体量を大きく増幅する結果、検出精度を飛躍的に高めることができる。
【００５３】
（過酸化物）
本発明に用いられる過酸化物は、過酸化水素の金属塩の化学式で表される無機過酸化物やペルオキソ酸化合物、又は過カルボン酸を有する有機過酸化物を用いることができ、過酸化水素又は過酸化水素を放出する化合物が好ましい。過酸化水素を放出する化合物としては過ホウ酸又は過炭酸等が好ましい。この中では過酸化水素が特に好ましい。使用する量は発色するＣｐに対して、同じモル数から１００万倍程度が好ましく。同じモル数から１万倍がさらに好ましい。
【００５４】
（還元剤）
本発明に用いられる還元剤は、その酸化体が発色素材とカップリングして色素を形成し得る還元剤（ＣＤ）であり、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【００５５】
【化１４】
【００５６】
一般式（Ｉ）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。Ｘは−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−ＣＯＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−、−ＣＯＣＯ−Ｏ−、−ＣＯＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−または−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ１３）−である。ここでＲ１３は水素原子または前記Ｒ１２として挙げた基より選ばれる基である。
還元剤（ＣＤ）の好ましい態様の１つは、下記一般式（II）で表される化合物である。
【００５７】
【化１５】
【００５８】
一般式（II）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。
さらに好ましくは、前記一般式（II）で表される化合物が、下記一般式（III）で表される化合物である。
【００５９】
【化１６】
【００６０】
一般式（III）においてＲ１２はアルキル基、ヘテロ環基を表し、Ｘ２１、Ｘ２３、及びＸ２５は、それぞれ独立に、水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基を表し、Ｘ２２、Ｘ２４は、それぞれ独立に、水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子、アシルオキシ基、アシルチオ基を表す。ただし、Ｘ２１、Ｘ２３、Ｘ２５のハメットのσｐ値とＸ２２、Ｘ２４のハメットのσｍ値の和は１．５以上である。
還元剤（ＣＤ）の好ましい別の態様は、下記一般式（IV）で表される化合物である。
【００６１】
【化１７】
【００６２】
一般式（IV）におけるＲ１１とＲ１２は、それぞれ一般式（Ｉ）におけるものと同義である。
【００６３】
本発明に用いられる一般式（Ｉ）で表される還元剤は、特開昭６４−１０２３３号等に記載された造核作用を有するヒドラジン化合物とは異なり、アルカリ溶液中、露光されたハロゲン化銀によって酸化された現像主薬と直接または間接に酸化反応し、酸化される化合物であり、その酸化体は更に色素形成カプラーと反応し、色素を形成することを特徴とする化合物である。
【００６４】
以下に還元剤ＣＤの構造について詳しく説明する。Ｒ１１は置換基を有してもよいアリール基またはヘテロ環基を示す。Ｒ１１のアリール基としては好ましくは炭素数６ないし１４のもので、例えば、フェニルやナフチルが挙げられる。Ｒ１１のヘテロ環基としては、好ましくは窒素、酸素、硫黄、セレンのうち少なくとも一つを含有する飽和または不飽和の５員環、６員環または７員環のものである。これらにベンゼン環またはヘテロ環が縮合していても良い。Ｒ１１のヘテロ環の例としては、フラニル、チエニル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピロリジニル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ピリジル、ピリダジル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、キノリニル、イソキノリニル、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、プリニル、プテリジニル、アゼピニル、ベンゾオキセピニル等が挙げられる。
【００６５】
Ｒ１１の有する置換基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、アシルオキシ基、アシルチオ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、アミド基、アルコキシカルボニルアミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホンアミド基、スルファモイルアミノ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、アシルカルバモイル基、カルバモイルカルバモイル基、スルホニルカルバモイル基、スルファモイルカルバモイル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルコキシスルホニル基、アリールオキシスルホニル基、スルファモイル基、アシルスルファモイル基、カルバモイルスルファモイル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、スルホ基、ホスホノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、イミド基、アゾ基等が挙げられる。Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基を表わす。
【００６６】
Ｒ１２のアルキル基としては好ましくは炭素数１ないし１６の直鎖、分岐または環状のもので、例えばメチル、エチル、ヘキシル、ドデシル、２−オクチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等が挙げられる。Ｒ１２のアルケニル基としては、好ましくは炭素数２ないし１６の鎖状または環状のもので、例えばビニル、１−オクテニル、シクロヘキセニルが挙げられる。
【００６７】
Ｒ１２のアルキニル基としては、好ましくは炭素数２ないし１６のもので、例えば１−ブチニル、フェニルエチニル等が挙げられる。Ｒ１２のアリール基及びヘテロ環基としては、Ｒ１１で述べたものが挙げられる。Ｒ１２の有する置換基としてはＲ１１の置換基で述べたものが挙げられる。Ｘとして好ましくは−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−ＣＯＣＯ−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−であり、さらに好ましくは、−ＳＯ２−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−である。特にＸが−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−であるとき、この化合物と反応するカプラーとして２当量カプラーを用いることができ、また未処理の感光材料の長期保存によるステインの上昇も本発明において特に効果的に低く抑えることができ、好ましい。
【００６８】
またＲ１１としては好ましくは含窒素ヘテロ環基または一般式（Ｖ）で表される基であり、一般式（ＩＶ）で表される化合物については好ましくは６員環の含窒素ヘテロ環基または一般式（Ｖ）で表される基であり、一般式（ＩＩ）で表される化合物については好ましくは一般式（Ｖ）で表される基である。
【００６９】
【化１８】
【００７０】
一般式（Ｖ）において、Ｘ２１、Ｘ２３、Ｘ２５は水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基を表し、Ｘ２２、Ｘ２４は水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子、アシルオキシ基、アシルチオ基を表す。ただし、Ｘ２１、Ｘ２３、Ｘ２５のハメットのσｐ値とＸ２２、Ｘ２４のハメットのσｍ値の和は１．５以上である。本発明の還元剤は層中で非拡散性のものが好ましい。以下に一般式（Ｉ）の具体的化合物例を示す。
【００７１】
【化１９】
【００７２】
【化２０】
【００７３】
【化２１】
【００７４】
【化２２】
【００７５】
【化２３】
【００７６】
【化２４】
【００７７】
【化２５】
【００７８】
【化２６】
【００７９】
【化２７】
【００８０】
【化２８】
【００８１】
【化２９】
【００８２】
【化３０】
【００８３】
【化３１】
【００８４】
【化３２】
【００８５】
【化３３】
【００８６】
【化３４】
【００８７】
【化３５】
【００８８】
【化３６】
【００８９】
【化３７】
【００９０】
【化３８】
【００９１】
【化３９】
【００９２】
【化４０】
【００９３】
本発明の一般式（Ｉ）で表わされる化合物の一部は、例えば米国特許第２，４２４，２５６号、同第４，４８１，２６８号、欧州特許第５６５，１６５Ａ１号、特開昭６１−２５９２４９号等に記載されており、他の化合物に記載されている方法で合成できる。本発明において、前記の一般式（Ｉ）の還元剤と酸化カップリング反応によって色素を形成する化合物（カプラー）を使用する。このカプラーは４当量カプラーであっても２当量カプラーであってもよいが、還元剤がスルホンヒドラシドの場合は４当量カプラーが好ましい。何故ならば、第一に還元剤のカップリング部位であるアミノ基がスルホニル基（置換基Ｘ）によって保護されており、カップリング時にカプラー側のカップリング部位に置換基があると立体障害によって反応が阻害されるからである。第二に、このスルホニル基はカップリング後、スルフィン酸として離脱するため、カプラー側の離脱基はカチオンとして離脱しなければならず、通常の２当量カプラーではこのような離脱基にはなりえないからである。カプラーの具体例は、４当量、２当量の両者ともセオリー・オブ・ザ・フォトグラフィック・プロセス（４ｔｈ．Ｅｄ．Ｔ．Ｈ．Ｊａｍｅｓ 編集 Ｍａｃｍｉｌｌａｎ ，１９７７）２９１頁〜３３４頁、および３５４頁〜３６１頁、特開昭５８−１２３５３号、同５８−１４９０４６号、同５８−１４９０４７号、同５９−１１１１４号、同５９−１２４３９９号、同５９−１７４８３５号、同５９−２３１５３９号、同５９−２３１５４０号、同６０−２９５１号、同６０−１４２４２号、同６０−２３４７４号、同６０−６６２４９号などに詳しく記載されている。
【００９４】
（還元剤の添加方法）
本発明においては、還元剤は、水溶液あるいは有機溶剤に溶解した溶液、乳化分散物、あるいは固体状分散物で用いることができる。
【００９５】
微粒子分散物で用いられる場合の数平均粒子サイズは、０．００１μｍ〜５μｍであることが好ましく、０．００１μｍ〜０．５μｍであることが更に好ましい。
【００９６】
（還元剤及びカプラーの添加量）
本発明における還元剤ＣＤは十分な発色濃度を得るために、発色層１層当たり０．００１ｍｍｏｌ／ｍ２〜１０ｍｍｏｌ／ｍ２使用することが好ましい。更に好ましい使用量は０．００５ｍｍｏｌ／ｍ２〜５ｍｍｏｌ／ｍ２であり特に好ましい使用量は０．０１ｍｍｏｌ／ｍ２〜１ｍｍｏｌ／ｍ２である。
本発明におけるカプラーの好ましい使用量は、還元剤に対してモル換算で０．０５倍〜２０倍で、更に好ましくは０．１倍〜１０倍、特に好ましくは０．２倍〜５倍である。
本発明の還元剤とカプラーは親油性微粒子中に含有されて親水性コロイド層に分散されているのが好ましい。親油性微粒子は高沸点有機溶媒からなるのが一般的であるが、必須ではない。
【００９７】
（カプラー）
以下、本発明に用いることの出来るカプラーについて詳細に説明する。
本発明に用いることの出来るカプラーは、本発明の還元剤の酸化体とカップリングして可視部に吸収を持つ色素を形成できる化合物であればいかなる構造をしていてもよい。このような化合物はカラー写真系ではよく知られた化合物であり、その代表例としてピロロトリアゾール型カプラー、フェノール型カプラー、ナフトール型カプラー、ピラゾロトリアゾール型カプラー、ピラゾロン型カプラー、アシルアセトアニリド型カプラーなどが挙げられる。
【００９８】
本発明において好ましいカプラーは一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）、または（Ｙ−３）で表される構造を有するカプラーである。
【００９９】
【化４１】
【０１００】
式中、Ｘ１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ１およびＹ２は電子求引性の置換基を表し、Ｒ１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。
【０１０１】
【化４２】
【０１０２】
式中、Ｘ２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ３とＲ４が互いに連結して環を形成してもよい。
【０１０３】
【化４３】
【０１０４】
式中、Ｘ３は水素原子または離脱基を表し、Ｒ５はカルバモイル基またはスルファモイル基を表し、Ｒ６は水素原子または置換基を表す。
【０１０５】
【化４４】
【０１０６】
式中、Ｘ４は水素原子または離脱基を表し、Ｒ７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ８は置換基を表す。
【０１０７】
【化４５】
【０１０８】
式中、Ｘ５は水素原子または離脱基を表し、Ｒ９はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ１０は置換基を表す。
【０１０９】
【化４６】
【０１１０】
式中、Ｘ６は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１１はアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基を表し、Ｒ１０はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。
【０１１１】
【化４７】
【０１１２】
式中、Ｘ７は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１３はアルキル基、アリール基、インドレニル基を表し、Ｒ１４はアリール基またはヘテロ環基を表す。
【０１１３】
【化４８】
【０１１４】
式中、Ｘ８は水素原子または離脱基を表し、Ｚは５員ないし７員の環を形成するのに必要な２価の基を表し、Ｒ１５はアリール基またはヘテロ環基を表す。
【０１１５】
【化４９】
【０１１６】
式中、Ｘ９は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８はそれぞれ置換基を表し、ｎは０ないし４の、ｍは０ないし５のいずれかの整数を表す。ｎまたはｍが２以上のとき、複数のＲ１６およびＲ１７はそれぞれ同一の基であってもよいし、別々の基であってもよい。
【０１１７】
一般式（Ｃ−１）において、Ｘ１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ１およびＹ２は電子求引性の置換基を表し、Ｒ１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい。
Ｘ１は水素原子または離脱基で、好ましくは離脱基である。
本発明で言う離脱基とは、還元剤の酸化体とカップリングし、色素を形成する際に母核から離脱可能な基を意味する。離脱基としてはハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルオキシ基、カルバモイルオキシ基、イミド基、メチロール基、ヘテロ環基等が挙げられる。Ｘ１としてはカルバモイルオキシ基またはベンゾイルオキシ基がより好ましい。Ｙ１およびＹ２は電子求引性基を表す。具体的には、シアノ基、ニトロ基、アシル基、オキシカルボニル基、カルバモイル基、スルホニル基、スルホキシド基、オキシスルホニル基、スルファモイル基、ヘテロ環基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子が挙げられる。その中でも好ましくはシアノ基、オキシカルボニル基、スルホニル基で、より好ましくはシアノ基、オキシカルボニル基である。Ｙ１とＹ２のいずれか一方がシアノ基であることがさらに好ましく、Ｙ１がシアノ基であることが特に好ましい。Ｙ２はオキシカルボニル基であることが好ましく、かさ高い基で置換されたオキシカルボニル基（例えば２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルピペラジニルオキシカルボニル基）が特に好ましい。Ｒ１は好ましくはアルキル基またはアリール基であり、これらの基は置換基を有していてもよい。アルキル基としては２級または３級のアルキル基が好ましく、より好ましくは３級のアルキル基である。アルキル基としては炭素数の和が３〜１２の範囲であることが好ましく４〜８の範囲であることがより好ましい。アリール基としてはフェニル基が好ましく、置換基を有していてもよいが、炭素数の和が６〜１６の範囲であることが好ましく、６〜１２の範囲であることがより好ましい。一般式（Ｃ−１）のカプラーは分子量が７００以下であることが好ましく、６５０以下であることがより好ましく、６００以下であることがさらに好ましい。
【０１１８】
一般式（Ｃ−２）において、Ｘ２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ３とＲ４が互いに連結して環を形成してもよい。
Ｘ２は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基であるが、Ｘ２として好ましいのはハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基、アリールチオ基またはアルキルチオ基で、ハロゲン原子またはアリールオキシ基がより好ましい。Ｒ２は好ましくはアシルアミノ基またはウレイド基である。Ｒ２としては炭素数の総和が２〜１２の範囲が好ましく、より好ましくは２〜８の範囲である。Ｒ３は好ましくは炭素数１〜４のアルキル基または炭素数２〜１２のアシルアミノ基であり、より好ましくは炭素数２〜４のアルキル基または炭素数２〜８のアシルアミノ基である。Ｒ４は好ましくはハロゲン原子、アルコキシ基、アシルアミノ基、アルキル基であり、より好ましくはハロゲン原子またはアシルアミノ基で、特に塩素原子が好ましい。一般式（Ｃ−２）のカプラーは分子量が５００以下であることが好ましく、４５０以下であることがより好ましく、４００以下であることがさらに好ましい。
【０１１９】
一般式（Ｃ−３）において、Ｘ３は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基であるが、Ｘ３として好ましいのはハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基、アリールチオ基またはアルキルチオ基で、アルコキシ基またはアルキルチオ基がより好ましい。Ｒ５はアシル基、オキシカルボニル基、カルバモイル基またはスルファモイル基が好ましく、カルバモイル基またはスルファモイル基がより好ましい。Ｒ５として炭素数の和が１〜１２の基が好ましく、より好ましくは炭素数が２〜１０である。Ｒ６は水素原子もしくは置換基であるが、置換基としては好ましくはアミド基、スルホンアミド基、ウレタン基またはウレイド基であり、アミド基またはウレタン基がより好ましい。置換位置としてはナフトール環の５位または８位が好ましく、５位がより好ましい。Ｒ６として炭素数の和が２〜１０の基が好ましく、より好ましくは炭素数が２〜６である。一般式（Ｃ−２）のカプラーは分子量が５５０以下であることが好ましく、５００以下であることがより好ましく、４５０以下であることがさらに好ましい。
【０１２０】
一般式（Ｍ−１）においてＸ４は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基あるが、Ｘ４として好ましいのはハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基、アリールチオ基、アルキルチオ基またはヘテロ環基で、ハロゲン原子、アリールオキシ基、アリールチオ基またはヘテロ環基がより好ましい。ヘテロ環基としてはピラゾール基、イミダゾール基、トリアゾール基、テトラゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾトリアゾール基等のアゾール基が好ましく、ピラゾール基がより好ましい。Ｒ７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基で、これらの基は置換基を有していてもよい。好ましくは２級もしくは３級のアルキル基またはアリール基である。アルキル基としては炭素数が２〜１４の基が好ましく、より好ましくは炭素数３〜１０の基である。アリール基としては好ましくは炭素数が６〜１８の基で、より好ましくは６〜１４の基である。Ｒ８は好ましくはアルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基またはヘテロ環であり、これらの基は置換基を有していてもよい。アルキル基としては２級または３級のアルキル基が好ましく、より好ましくは３級のアルキル基である。アルキル基としては炭素数の和が３〜１２の範囲であることが好ましく４〜８の範囲であることがより好ましい。アリール基としてはフェニル基が好ましく、置換基を有していてもよいが、炭素数の和が６〜１６の範囲であることが好ましく、６〜１２の範囲であることがより好ましい。アルコキシ基としては炭素数１〜８のアルコキシ基が好ましく、より好ましくは炭素数１〜４のアルコキシ基である。アリールオキシ基としては炭素数６〜１４のアリールオキシ基が好ましく炭素数６〜１０の基がより好ましい。アルキルチオ基、アリールチオ基もそれぞれアルコキシ基、アリールオキシ基と同様の炭素数の基が好ましい。一般式（Ｍ−１）のカプラーは分子量が６００以下であることが好ましく、５５０以下であることがより好ましく、５００以下であることがさらに好ましい。
【０１２１】
一般式（Ｍ−２）のカプラーのＸ５、Ｒ９およびＲ１０で表される基はそれぞれ一般式（Ｍ−１）のカプラーのＸ４、Ｒ７およびＲ８で表される基と同様の基で、それぞれの基の好ましい範囲も一般式（Ｍ−１）のカプラーと同様である。
【０１２２】
一般式（Ｍ−３）において、Ｘ６は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基あるが、Ｘ６として好ましいのはアルキルチオ基、アリールチオ基またはヘテロ環基で、より好ましくはアリールチオ基またはヘテロ環基である。アリールチオ基としてはフェニル基が好ましく、特に２位にアルコキシ基、アミド基が置換したアリールチオ基が好ましい。アリールチオ基の炭素数の和は６〜１６の範囲が好ましく、７〜１２の範囲がより好ましい。ヘテロ環基としてはピラゾール基、イミダゾール基、トリアゾール基、テトラゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾトリアゾール基等のアゾール基が好ましく、ピラゾール基がより好ましい。Ｒ１１としてはアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基が好ましく、アシルアミノ基またはアニリノ基がより好ましい。最も好ましいのはアニリノ基である。アルキル基としては炭素数１〜８のアルキル基が好ましく、アリール基としては炭素数６〜１４のアリール基が好ましい。アシルアミノ基としては炭素数２〜１４の基が好ましく２〜１０の基がより好ましい。アニリノ基としては炭素数６〜１６の基が好ましく６〜１２の基がより好ましい。アニリノ基の置換基としてはハロゲン原子、アシルアミノ基が好ましい。一般式（Ｍ−３）のカプラーは分子量が７００以下であることが好ましく、６５０以下であることがより好ましく、６００以下であることがさらに好ましい。
【０１２３】
一般式（Ｙ−１）において、Ｘ７は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基あるが、Ｘ７として好ましいのはアリールオキシ基、イミド基またはヘテロ環基である。アリールオキシ基としては電子求引性基で置換されたアリールオキシ基が好ましい。イミド基としては環状のイミド基が好ましく、ヒダントイン基、１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオン基およびコハクイミド基が特に好ましい。イミド基の炭素数の総和は３〜１５の範囲が好ましく、より好ましくは４〜１１の範囲で、さらに好ましくは５〜９の範囲である。ヘテロ環基としてはピラゾール基、イミダゾール基、トリアゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾトリアゾール基が好ましく、イミダゾール基がより好ましい。アゾール基の炭素数の総和は３〜１２の範囲が好ましく、より好ましくは３〜１０の範囲で、さらに好ましくは３〜８の範囲である。Ｒ１３は好ましくは２級もしくは３級のアルキル基、アリール基またはヘテロ環基である。アルキル基はシクロアルキル基、ビシクロアルキル基であってもよく３級アルキル基がより好ましい。１−アルキルシクロプロピル基、ビシクロアルキル基、アダマンチル基は特に好ましい。Ｒ１４はアリール基もしくはヘテロ環基で、アリール基がより好ましい。そのなかでも２位にハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基またはアリールチオ基が置換したフェニル基が特に好ましい。Ｒ１４の炭素数の総和は６〜１８の範囲が好ましく、より好ましくは７〜１６の範囲、さらに好ましくは８〜１４の範囲である。一般式（Ｙ−１）のカプラーは分子量が７００以下であることが好ましく、６５０以下であることがより好ましく、６００以下であることがさらに好ましい。
【０１２４】
一般式（Ｙ−２）のカプラーのＸ８およびＲ１５で表される基はそれぞれ一般式（Ｙ−１）のカプラーのＸ７、Ｒ１４で表される基と同様の基で、それぞれの基の好ましい範囲も一般式（Ｙ−１）のカプラーと同様である。Ｚは５ないし７員の環を形成するために必要な２価の基を表し、この環には置換基があってもよいし、別の環が縮環していてもよい。
【０１２５】
一般式（Ｙ−２）のなかでも好ましいのは一般式（Ｙ−３）で表されるカプラーである。
一般式（Ｙ−３）のカプラーにおいて、Ｘ９は一般式（Ｙ−１）のＸ７と同義で、好ましい範囲も同じである。Ｒ１６は好ましくはハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、アシルオキシ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニル基、スルホンアミド基、シアノ基、スルホニル基、スルファモイル基、カルバモイル基またはアルキルチオ基で炭素数１〜４の置換基であることがより好ましい。ｎは好ましくは０〜３の整数で、より好ましくは０〜２、さらに好ましくは０〜１、最も好ましくは０である。Ｒ１７は好ましくはＲ１６と同様の基で、より好ましくはハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アシルアミノ基、スルホンアミド基、アルコキシカルボニル基、スルファモイル基、スルホニル基である。特にＮＨ基に対してオルト位にハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基であるＲ１７が置換されていることがより好ましい。最も好ましいのはアルキルチオ基である。一般式（Ｙ−３）のカプラーは分子量が７５０以下であることが好ましく、７００以下であることがより好ましく、６５０以下であることがさらに好ましい。
以下に本発明のカプラーの具体例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１２６】
【化５０】
【０１２７】
【化５１】
【０１２８】
【化５２】
【０１２９】
【化５３】
【０１３０】
【化５４】
【０１３１】
【化５５】
【０１３２】
【化５６】
【０１３３】
【化５７】
【０１３４】
【化５８】
【０１３５】
【化５９】
【０１３６】
【化６０】
【０１３７】
【化６１】
【０１３８】
【化６２】
【０１３９】
【化６３】
【０１４０】
【化６４】
【０１４１】
【化６５】
【０１４２】
【化６６】
【０１４３】
【化６７】
【０１４４】
【化６８】
【０１４５】
【化６９】
【０１４６】
【化７０】
【０１４７】
【化７１】
【０１４８】
【化７２】
【０１４９】
【化７３】
【０１５０】
【化７４】
【０１５１】
【化７５】
【０１５２】
【化７６】
【０１５３】
【化７７】
【０１５４】
【化７８】
【０１５５】
【化７９】
【０１５６】
【化８０】
【０１５７】
上記の他に、特開２００４−４４３９に記載の化合物Ｎｏ．ＣＰ１０１〜ＣＰ１１７、ＣＰ２０１〜ＣＰ２２０、およびＣＰ３０１〜ＣＰ３３１なども本発明に用いることが出来る。
【０１５８】
本発明のカプラーはオイル乳化物あるいは固体微粒子分散物として、例えばゼラチンやポリマーラテックスをバインダーとした塗布膜として用いることができる。このときの塗布量は、好ましくは１×１０−６モル／ｍ２〜１×１０−２モル／ｍ２が好ましく、さらに好ましくは１×１０−５モル／ｍ２〜１×１０−３モル／ｍ２で使用することである。
【０１５９】
（不活性坦体）
本発明に用いられる不活性坦体（基質）は坦持する抗体蛋白を含むメンブレンや固定層に拡散せず、生成した複合体がメンブレンや固定層に固定もしくは拡散するのを妨害することのない不活性な材料が好ましい。
本発明に用いられる不活性坦体としては、例えば、ニトロセルロースが挙げられる。
本発明に用いられる不活性坦体が発色した色素を観察する背景となる場合は、白色の光反射性基質であることが好ましく、また、不活性坦体を通りして発色した色素を観察する場合は、透明基質であることが好ましい。
【実施例】
【０１６０】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１６１】
実施例１
１．発色シートＡ〜Ｅの作製
表１に記載の本願の還元剤もしくは比較用還元剤、Ｃｐ、色像安定剤（ＳＴ−１）１．３ｇ、色像安定剤（ＳＴ−２）０．２２ｇ、色像安定剤（ＳＴ−３）１．４ｇを溶媒（ＳＯＬ−１）６．７ｇ、溶媒（ＳＯＬ−２）６．７ｇおよび溶媒（酢酸エチル）１９ｇに溶解し、この液を１．０ｇのドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含む２５質量％のゼラチン水溶液８４ｍＬと混合して、高速攪拌乳化機（ディゾルバー）で乳化分散し、さらに水を加えて２３０ｇの乳化分散物Ａ〜Ｅを作製した。
得られたそれぞれの乳化分散物とゼラチン水溶液を加えて塗布溶液とし、以下の組成（１ｍｍ２あたりの塗布量として表した）となるようにトリアセチルセルロース（ＴＡＣ）支持体上に塗布した。これを５ｍｍ×１８ｍｍのサイズに裁断し、発色シートＡ〜Ｅを作製した。
【０１６２】
ＣＤ−１ 表１に記載
ＣＰ−１ 表１に記載
ＳＴ−１ ０．０７９ｇ
ＳＴ−２ ０．０１３３ｇ
ＳＴ−３ ０．０８５ｇ
ＳＯＬ−１ ０．４１ｇ
ＳＯＬ−２ ０．４１ｇ
ゼラチン ２．２ｇ
Ｈ−１ ０．０２６ｇ
【０１６３】
【表１】
【０１６４】
【化８１】
【０１６５】
【化８２】
【０１６６】
【化８３】
【０１６７】
２．ｈＣＧ検出イムノクロマトキットの作製
【０１６８】
（１）ｈＣＧ検出イムノクロマトキットの作製
（１−１）抗ｈＣＧ抗体修飾銀コロイドの作製
直径８０ｎｍ銀コロイド溶液（ＥＭ．ＳＣ８０、ＢＢＩ社）９０ｍＬを８０００Ｇ、４℃、１５分遠心（ｈｉｍａｃＣＦ１６ＲＸ、日立）し上精を取り除くことで９ｍｌにまで濃縮した。この銀コロイド溶液に２０ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ９．０）１ｍＬを加えることでｐＨを調整した銀コロイド溶液に、６０μｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社、等電点＝７．４）溶液１ｍＬを加え攪拌した。１０分間静置した後、１質量％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ Ｍｗ．２００００、品番１６８−１１２８５、和光純薬）水溶液を５５０μＬ加え攪拌し、続いて１０質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、品番Ａ−７９０６、ＳＩＧＭＡ）水溶液を１．１ｍＬ加え攪拌した。この溶液を８０００Ｇ、４℃、３０分遠心（ｈｉｍａｃＣＦ１６ＲＸ、日立）した後、１ｍＬ程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により銀コロイドを再分散した。この後、２０ｍＬの銀コロイド保存液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．２），０．０５質量％ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１質量％ＢＳＡ，０．１質量％ＮａＮ３）に分散し、再び８０００Ｇ、４℃、３０分間遠心した後、１ｍＬ程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により銀コロイドを再分散し、抗体修飾銀コロイド（８０ｎｍ）溶液を得た。
【０１６９】
（１−２）銀コロイド抗体保持パットの作製
（１−１）で作製した各抗体修飾銀コロイドを、銀コロイド塗布液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌバッファー（ｐＨ８．２），０．０５質量％ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００），５質量％スクロース）及び水により希釈した。その際、光路長１ｃｍの条件で４５５ｎｍの単色光により光学濃度を測定し、１．２５となるように希釈した。この溶液を、８ｍｍ×１５０ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ、ミリポア社）１枚あたり０．８ｍＬずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、銀コロイド抗体保持パッドを得た。
【０１７０】
（１−３）抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作製
２５ｍｍ×２００ｍｍに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、ＨｉＦｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１２０、ミリポア社）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作製した。メンブレンの長辺を下にし、下から８ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した固定化用抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−Ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ６６０１ ＳＰＲ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社、等電点＝７．４）溶液をインクジェット方式の塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて幅１ｍｍ程度のライン状に塗布した。同様に、下から１２ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製したコントロール用抗マウスＩｇＧ抗体（抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ウサギＦ（ａｂ’）２，品番５６６−７０６２１、和光純薬）溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で５０℃、３０分間乾燥した。ブロッキング液（０．５質量％カゼイン（乳由来、品番０３０−０１５０５、和光純薬）含有５０ ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．５））５００ｍＬをバットに入れ、そのまま３０分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（０．５質量％スクロースおよび０．０５質量％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファー）５００ｍＬに移して浸し、そのまま３０分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
【０１７１】
（１−４）イムノクロマトグラフキットの作製
バック粘着シート（ＡＲｃａｒｅ９０２０、ニップンテクノクラスタ社）に、（１−３）で作製した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗ｈＣＧ抗体ライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約２ｍｍ重なるように（１−２）で作製した銀コロイド抗体保持パッドを貼り付け、約４ｍｍ重なるようにして銀コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド（１８ｍｍ×１５０ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約５ｍｍ重なるように吸収パッド（８０ｍｍ×１５０ｍｍに切ったセルロース・グラス膜（ＣＦ６、ワットマン社））を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材を、部材の長辺側を５ｍｍ幅になるように短辺に平行にギロチン式カッター（ＣＭ４０００、ニップンテクノクラスタ社）切断していくことで、５ｍｍ×５５ｍｍのイムノクロマト用ストリップを作製した。これらをプラスチックケース（ニップンテクノクラスタ社）に入れ、試験用イムノクロマトキットとした。
【０１７２】
（１−５）現像液の作製
リン酸水素カリウム４６、亜硫酸カリウム０．５ｇを含む水溶液に水酸化カリウムを加えてｐＨ１２．８のバッファー水溶液１Ｌを調製し、現像処理液とした。
【０１７３】
（２）検出ラインでのシグナル増幅
（２−１）検出ラインでの抗体修飾金属コロイドの吸着処理
１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーにｈＣＧ（リコンビナントｈＣＧ Ｒ−５０６、ロ−ト製薬（株）製）を溶解し、各濃度の試験用ｈＣＧ溶液を作製した。この試験用ｈＣＧ溶液を各試験用イムノクロマトキットの試料添加パッドに１００μＬ滴下し、１０分静置した。
【０１７４】
（２−２）発色シートおよび現像液によるシグナル増幅
（２−１）の処理後のイムノクロマトキットのケースからメンブレンを取り出し、さらに吸水パットを取り除き、新たな吸水パットとして５×２０ｍｍ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ、ミリポア社））を取り除いた場所に３枚をセロハンテープで付けた。検出ライン部に発色シートを重ね、その重ねた部位を２枚のアクリル板で挟み固定した。このメンブレンを、現像液９ｍＬに３０質量％の過酸化水素水を混合した液を２００μＬ入れたマイクロチューブ（ビーエム機器（株）、ＢＭ４０２０）に検体滴下部が液に漬かるように立てかけた。立てかけた時点を０分として１０分後に取り出し、発色シートを剥がし１質量％酢酸溶液に１分間浸すことで発色反応を停止させた。
【０１７５】
（実施例２）
（１−１）で示した抗ｈＣＧ抗体修飾銀コロイドの作製において、濃縮した銀コロイドの代わりとして、直径５０ｎｍ金コロイド溶液（ＥＭ．ＧＣ５０、ＢＢＩ社）９ｍＬに５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ７．０）１ｍＬを加えることでｐＨを調整した金コロイド溶液に、５０μｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体溶液１ｍＬを加え攪拌したこと以外は同様にして、イムノクロマトキットを得た。ただし、金コロイド抗体保持パッドの作製における金コロイド塗布液は、光路長１ｃｍの条件で５２０ｎｍの単色光により光学濃度を測定し、１．５となるように希釈して作製したものを使用した。
次いで、実施例１と同様に検出ラインでのシグナル増幅処理を実施した。
【０１７６】
（実施例３）（比較例）
実施例１同様に抗体修飾銀コロイドを標識としたイムノクロマトキットを作製した。得られたイムノクロマトキットを用いて実施例１と同様に検出ラインでの検出を行った。但し、実施例１で行った発色シートおよび現像液によるシグナル増幅処理を施さなかった。
【０１７７】
（実施例４）（比較例））
実施例２同様に抗体修飾金コロイドを標識としたイムノクロマトキットを作製した。得られたイムノクロマトキットを用いて実施例１と同様に検出ラインでの検出を行った。但し、実施例１で行った発色シートおよび現像液によるシグナル増幅処理を施さなかった。
【０１７８】
＜検出結果＞
実施例および比較例で得られたメンブレンの検出ラインに接した発色シートの部位もしくはメンブレンの検出ラインを、通常の明るさの蛍光灯を照明とした室内で目視観察した。得られた各イムノクロマトキットの評価結果を表２に示した。
表中、判定基準は下記に従った。
○：コントロール（ｈＣＧ濃度０）の場合と明確に識別できる。
×：コントロールとの識別ができない。
【０１７９】
【表２】
【０１８０】
上記表に示されるように、本発明の発色シートを用いてシグナル増幅処理をすることで、少ない抗原（ｈＣＧ）量でも検出できた（検出感度を増加できた）。特に、銀コロイドを標識とした場合に検出感度増加が大きかった。また、還元剤のなかで本発明の一般式（Ｉ）で表される還元剤が顕著な効果を示すことがわかった。
従って、本発明により極めて検出感度が高い免疫学的検出方法が得られる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析対象物を含む試料を、簡易、迅速、高感度で検知することができる免疫学的検出方法に関する。特に発色反応を用いて高精度で分析対象物を検出する免疫学的検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質又は環境汚染物質の中には、極微量で作用するものが非常に多い。従って、これらの物質の定性的及び定量的測定には、従来、高感度分析が可能な機器分析法が広く用いられてきた。しかし、機器分析法は、特異性が低く、試料の前処理工程を含め、分析に時間を要する上、操作が煩雑なため、近年要求されている迅速簡便測定目的には不都合である。一方、免疫学的測定法は、特異性も高く、操作も機器分析よりはるかに簡便であることから、生理活性物質又は環境汚染物質の測定分野に徐々に普及してきた。この中にはラテックス凝集法、ＲＩＡ法あるいはＥＩＡ法（酵素免疫測定法）といった免疫学的測定法があるが、ラテックス凝集法は必ずしも測定の迅速簡便性あるいは検出感度を満たすものではなく、ＲＩＡ法は標識物質に放射性同位元素を使用するので、特殊な環境が必要である。
【０００３】
酵素免疫測定法は、人体に対して危険性の少ない免疫測定法として開発され、種々の物質の測定系に利用されている。しかしながら、臨床化学分析においては、その測定対象が生体試料（主として血清、尿等）であり、その測定値は病態の診断又は経過観察等に用いられることが多く、そのためのより高感度及び高精度な測定の要求を比色法で完全に満足させることは難しい。この要求を満たすことを目的として化学発光酵素免疫法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。化学発光酵素免疫測定法は、酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する測定対象物質の量を定量する方法である。この方法においては、化学反応により化学発光性物質を発光させるため光源が不要であり、光源に起因するバックグラウンドの上昇等がないため測定の高感度化が可能である。
【０００４】
しかしながら、ウイルスのような増殖する分析対象物の場合、より早い段階、すなわち少ないウイルス量での検出が必要であり、さらに高感度で簡便な検出方法が望まれていた。
【特許文献１】特開２０００−１４６９６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、分析対象物を含む試料を、簡易、迅速、高感度で検知することができる免疫学的検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。
【０００７】
＜１＞ 免疫学的検出方法であって、
ａ）検体または検体を含む試料に、金属を含む標識により修飾された検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第一の蛋白質（Ｙ）を作用させ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成させる工程、
ｂ）前記工程において生じた前記複合体と分析対象物と複合体を形成しなかった前記標識を含む第一の蛋白質Ｙとを分離する工程、
ｃ）前記複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる工程、及びｄ）前記ＣＤおよび前記Ｃｐより生じた色素を検出する工程を有し、前記ＣＤが下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする免疫学的検出方法：
【０００８】
【化１】
【０００９】
（一般式（Ｉ）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。Ｘは−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−ＣＯＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−、−ＣＯＣＯ−Ｏ−、−ＣＯＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−または−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ１３）−である。ここでＲ１３は水素原子または前記Ｒ１２として挙げた基より選ばれる基である。）。
＜２＞ 金属を含む標識が銀、金および白金原子の少なくとも１つを含むことを特徴とする＜１＞に記載の免疫学的検出方法。
＜３＞ 金属を含む標識が銀粒子であることを特徴とする＜２＞に記載の免疫学的検出方法。
＜４＞ 金属を含む標識がハロゲン化銀粒子であることを特徴とする＜１＞又は＜２＞に記載の免疫学的検出方法。
＜５＞ 前記ＣＤが、下記一般式（II）で表される化合物であることを特徴とする＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法：
【００１０】
【化２】
【００１１】
（一般式（II）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。）。
＜６＞ 前記ＣＤが、下記一般式（III）で表される化合物であることを特徴とする＜５＞に記載の免疫学的検出方法：
【００１２】
【化３】
【００１３】
（一般式（III）においてＲ１２はアルキル基、ヘテロ環基を表し、Ｘ２１、Ｘ２３、及びＸ２５は、それぞれ独立に、水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基を表し、Ｘ２２、Ｘ２４は、それぞれ独立に、水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子、アシルオキシ基、アシルチオ基を表す。ただし、Ｘ２１、Ｘ２３、Ｘ２５のハメットのσｐ値とＸ２２、Ｘ２４のハメットのσｍ値の和は１．５以上である。）。
＜７＞ 前記ＣＤが一般式（IV）で表される化合物であることを特徴とする＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法：
【００１４】
【化４】
【００１５】
（一般式（IV）におけるＲ１１とＲ１２は、それぞれ一般式（Ｉ）におけるものと同義である。）。
＜８＞ 前記ＣＤが親油性微粒子中に含有されていることを特徴とする＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
＜９＞ 前記Ｃｐが下記一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）および（Ｙ−３）よりなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法：
【００１６】
【化５】
【００１７】
（式中、Ｘ１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立に、電子求引性の置換基を表し、Ｒ１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【００１８】
【化６】
【００１９】
（式中、Ｘ２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ３とＲ４が互いに連結して環を形成してもよい。）；
【００２０】
【化７】
【００２１】
（式中、Ｘ３は水素原子または離脱基を表し、Ｒ５はカルバモイル基またはスルファモイル基を表し、Ｒ６は水素原子または置換基を表す。）；
【００２２】
【化８】
【００２３】
（式中、Ｘ４は水素原子または離脱基を表し、Ｒ７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ８は置換基を表す。）；
【００２４】
【化９】
【００２５】
（式中、Ｘ５は水素原子または離脱基を表し、Ｒ９はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ１０は置換基を表す。）；
【００２６】
【化１０】
【００２７】
（式中、Ｘ６は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１１はアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基を表し、Ｒ１０はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【００２８】
【化１１】
【００２９】
（式中、Ｘ７は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１３はアルキル基、アリール基、インドレニル基を表し、Ｒ１４はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【００３０】
【化１２】
【００３１】
（式中、Ｘ８は水素原子または離脱基を表し、Ｚは５員ないし７員の環を形成するのに必要な２価の基を表し、Ｒ１５はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【００３２】
【化１３】
【００３３】
（式中、Ｘ９は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、それぞれ独立に、置換基を表し、ｎは０ないし４の、ｍは０ないし５のいずれかの整数を表す。ｎまたはｍが２以上のとき、複数のＲ１６およびＲ１７はそれぞれ同一の基であってもよいし、別々の基であってもよい。）。
＜１０＞検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第二の蛋白質（Ｘ）および検体中の分析対象物を特異的に認識し得る酵素標識により修飾された第一の蛋白質（Ｙ）を同時にまたは段階的に作用させ、前記Ｘ、前記分析対象物および前記Ｙの複合体を形成させる工程を含むことを特徴とする＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
＜１１＞ 前記分析対象物が抗原であり、前記分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質が抗体であることを特徴とする＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
＜１２＞ 前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする＜１１＞に記載の免疫学的検出方法。
＜１３＞ 前記分析対象物を特異的に認識し得る前記蛋白質Ｘが不溶性担体に坦持されていることを特徴とする＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明により、試料中に含まれる分析対象物を、簡易、迅速、高感度で検知することができる免疫学的検出方法が提供される。特に増幅された発色反応を用いて分析対象物を高精度で検出する免疫学的検出方法が提供される。
本発明は、抗原抗体反応を利用し、抗体または抗原上に固定された標識を触媒とした酸化還元反応を増幅して、さらに発色反応を誘導し発色した色を検知することにより、簡便に高精度で検出するものである。また、分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質の１つを基質に固定化して、クロマトグラフによりさらに簡便に高精度で検出することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明の免疫学的検出方法は下記の工程を含む。
ａ）検体または検体を含む試料に、金属を含む標識により修飾された検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第一の蛋白質（Ｙ）を作用させ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成する工程
【００３６】
本工程においては、分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質を標識化した第一の蛋白質（Ｙ）を準備する。分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質としては、抗原抗体反応を利用する場合、抗体が好ましく用いられる。本発明に於いては、標識としては、過酸化物の酸化還元反応の触媒として機能することができる金属標識が用いられる。そのような金属標識としては、銀、金、白金などの金属、あるいはハロゲン化銀などの金属塩から選ばれる金属が用いられる。
検体または検体を緩衝液などに分散した検体を含む測定用試料に、第一の蛋白質（Ｙ）を作用させると、抗原抗体反応などの特異的相互作用により分析対象物と第一の蛋白質（Ｙ）を含む複合体が形成される。
【００３７】
ｂ）前記複合体と前記複合体を形成していない前記第一の蛋白質（Ｙ）とを分離する工程
該分離工程は、前記形成された複合体を複合体を形成していない遊離の第一の蛋白質（Ｙ）から分離する工程である。即ち、該分離工程では検体中に存在する分析対象物の量に対応した量の複合体が分離される。
【００３８】
ｃ）前記分離された複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる発色工程
複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させると、金属を含む標識が触媒となって、過酸化物を介した連鎖反応が起こり、還元剤が酸化され、還元剤の酸化体を生成する。続いて還元剤の酸化体と発色素材との発色反応が起こり、発色色素を生成する。生成する色素の量は、複合体量に依存するので、分析対象物の量に相当する。
【００３９】
ｄ）前記発色工程により生成した色素を検出する工程
生成した色素量は、公知の種々の手段により検出することができる。例えば、分析対象物の有無は、発色の有無を視覚的に官能評価することにより、瞬時に判定することができる。色素量を定量的に測定することも、濃度計、或いは分光光度計を用いて行うことが可能である。
【００４０】
該分離工程に用いることのできる複合体の分離手段としては、比重差を利用した遠心分離や超遠心分離法、溶解度差を利用して沈降法、塩析法、濾過法、透析法、限外濾過法、磁気を利用した分離法などの従来公知の分離手段を利用することができるが、本発明で特に有効は分離手段は、分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質を予めメンブレンあるいはクロマトグラフの固定層などの不溶性坦体上に固定化しておき、複合体を形成後、複合体を形成していない検体中の成分や検体試料作製に用いた成分等を洗浄して洗い流すか、あるいはクロマトグラフにより分離する方法である。
【００４１】
また、分離された他方の成分である遊離の第一の蛋白質（Ｙ）の量は、当初含有する第一の蛋白質（Ｙ）の量から複合体を形成した量を差し引いた量に相当するので、この量も検体中に存在する分析対象物の量を反映した量である。従って、複合体量及び遊離の第一の蛋白質（Ｙ）量のいずれも分析対象物の量の検出に利用することができる。高精度かつ簡便に検出するには、複合体を直接検出する手段が好ましい。
【００４２】
分離された複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる手段としては、過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）のそれぞれを含有するかもしくはこれらの２以上を混合して含有する溶液もしくは分散液の状態で作用させる方法を用いることができる。別の態様として、過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）の少なくとも１つを含有する発色シートを準備し、分離された複合体に該発色シートを重ね合わせて、該複合体と発色剤とを接触させ、発色反応を起こさせる方法である。好ましくは、発色シートが還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を含有し、過酸化物を含有する溶液を該複合体と発色シートの重ね合わせ体に供給する方法である。
【００４３】
本発明においては、発色反応には、好ましくは、還元剤の酸化体とカプラーのカップリング反応が用いられる。特に、有機銀塩を用いた熱現像記録材料中で熱現像により効率的にカップリング反応が可能な一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表される還元剤と一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）および（Ｙ−３）よりなる群より選ばれる少なくとも１種のカプラーが好ましく用いられる。
【００４４】
本発明の好ましい態様は、さらに検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第二の蛋白質（Ｘ）を含み、該第二の蛋白質（Ｘ）を前記分析対象物および前記第一の蛋白質（Ｙ）に同時にまたは段階的に作用させ、前記Ｘ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成する工程を有する。
【００４５】
好ましくは、前記分析対象物が抗原であり、前記分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質が抗体である。より好ましくは、前記抗体がモノクローナル抗体である。
さらに本発明の好ましい態様は、前記第二の蛋白質（Ｘ）を不溶性担体に坦持し、クロマトグラフにより複合体を分離して検出するイムノクロマトグラフである。
【００４６】
本発明に利用できる免疫反応段階を構成する抗原抗体反応は任意であり、従来公知のいずれの反応も採用することができる。
【００４７】
本発明においては、分離工程に用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等の種々の形状で用いることができる。
さらに、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。
【００４８】
また、本発明において用いられる抗体類（第一の蛋白質（Ｘ）、第二の蛋白質（Ｙ）は、分析対象によって適当なものを適宜用いることができる。ここで、抗体類としてモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれを使うことも可能であり、その形態としては全抗体又はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ等の断片を用いることができる。また、抗体の起源は任意であるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来する抗体が好適に用いられる。第一の蛋白質および第二の蛋白質の両方または一方がモノクローナル抗体であること、又はＦ（ａｂ’）２またはＦ（ａｂ’）であることが好ましい。
【００４９】
本発明の抗体とタンパク質との結合は、通常緩衝液中で行なわれる。ここに用いる緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
【００５０】
本発明における免疫学的検出方法は、分析対象物と該分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質との相互作用による複合体形成工程、該複合体の分離工程、分離された複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）及び発色素材（Ｃｐ）を作用させ発色させる発色工程を有する。複合体形成工程に要する温度及び時間は、用いられる分析対象物と蛋白質の組合せによって異なるが、概ね０℃〜５０℃で、１０秒〜１時間である。また、発色工程に要する温度及び時間は、用いられる複合体、還元剤（ＣＤ）及び発色素材（Ｃｐ）の組合せによって異なるが、概ね５℃〜６０℃で、３０秒〜３０分である。
複合体の分離工程は、分離方法によって、それぞれ好ましい工程所要時間が設定される。
発色の判定時間は任意であるが、上記発色工程の後に、発色濃度が高く維持され、発色が安定した時間を選択することが望ましい。発色の判定時間は、概ね発色工程の後、０〜２４時間が好ましく、より好ましくは０〜２時間、特に好ましくは０〜３０分である。発色工程の後の時間が長すぎると発色した色素の変色や退色が起こるので好ましくない。
【００５１】
本発明においては、抗原抗体反応などの免疫学的反応を増幅して検出する手段として、金属を触媒中心とした過酸化物の酸化還元反応を利用したものである。金属を触媒中心とした過酸化物の酸化還元反応は、一般的に知られていて、例えば、引例ＵＳ特許４４１４３０５号明細書にはカラー現像液およびＨ２Ｏ２を含む現像補力液で処理する処理方法が開示されている。
【００５２】
金属としては、金、銀、白金およびこれらの合金、あるいはハロゲン化銀（塩化銀、臭化銀、沃化銀、塩臭化銀、沃臭化銀、塩沃臭化銀等）が用いられる。また、錫や鉄などの過酸化物を分解することが知られている金属も用いることができる。本発明に於いては、特に好ましくは、金または銀である。金属の粒子サイズは特に制限されないが、好ましくは、球相当粒径が１ｎｍ〜１μｍであり、１０ｎｍ〜１００ｎｍがより好ましい。
これらの金属に過酸化物が接触すると該金属を反応中心として過酸化物から活性酸化成分が生成する。該活性酸化成分が還元剤（ＣＤ）に作用し、該ＣＤを酸化し、その酸化体（ＣＤｏｘ）を生成し、活性酸化成分より過酸化物を再生する。再生された過酸化物は再び活性酸化成分を生成するので一連のサイクルが繰り返し進行する。酸化体（ＣＤｏｘ）は発色色剤（Ｃｐ）をカップリング反応して色素を形成する。チェインリアクションによって酸化体（ＣＤｏｘ）が増幅して形成されるので、増幅されて色素が生成する。従って、抗体に金属標識を修飾することによって微量の抗体量を大きく増幅する結果、検出精度を飛躍的に高めることができる。
【００５３】
（過酸化物）
本発明に用いられる過酸化物は、過酸化水素の金属塩の化学式で表される無機過酸化物やペルオキソ酸化合物、又は過カルボン酸を有する有機過酸化物を用いることができ、過酸化水素又は過酸化水素を放出する化合物が好ましい。過酸化水素を放出する化合物としては過ホウ酸又は過炭酸等が好ましい。この中では過酸化水素が特に好ましい。使用する量は発色するＣｐに対して、同じモル数から１００万倍程度が好ましく。同じモル数から１万倍がさらに好ましい。
【００５４】
（還元剤）
本発明に用いられる還元剤は、その酸化体が発色素材とカップリングして色素を形成し得る還元剤（ＣＤ）であり、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【００５５】
【化１４】
【００５６】
一般式（Ｉ）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。Ｘは−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−ＣＯＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−、−ＣＯＣＯ−Ｏ−、−ＣＯＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−または−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ１３）−である。ここでＲ１３は水素原子または前記Ｒ１２として挙げた基より選ばれる基である。
還元剤（ＣＤ）の好ましい態様の１つは、下記一般式（II）で表される化合物である。
【００５７】
【化１５】
【００５８】
一般式（II）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。
さらに好ましくは、前記一般式（II）で表される化合物が、下記一般式（III）で表される化合物である。
【００５９】
【化１６】
【００６０】
一般式（III）においてＲ１２はアルキル基、ヘテロ環基を表し、Ｘ２１、Ｘ２３、及びＸ２５は、それぞれ独立に、水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基を表し、Ｘ２２、Ｘ２４は、それぞれ独立に、水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子、アシルオキシ基、アシルチオ基を表す。ただし、Ｘ２１、Ｘ２３、Ｘ２５のハメットのσｐ値とＸ２２、Ｘ２４のハメットのσｍ値の和は１．５以上である。
還元剤（ＣＤ）の好ましい別の態様は、下記一般式（IV）で表される化合物である。
【００６１】
【化１７】
【００６２】
一般式（IV）におけるＲ１１とＲ１２は、それぞれ一般式（Ｉ）におけるものと同義である。
【００６３】
本発明に用いられる一般式（Ｉ）で表される還元剤は、特開昭６４−１０２３３号等に記載された造核作用を有するヒドラジン化合物とは異なり、アルカリ溶液中、露光されたハロゲン化銀によって酸化された現像主薬と直接または間接に酸化反応し、酸化される化合物であり、その酸化体は更に色素形成カプラーと反応し、色素を形成することを特徴とする化合物である。
【００６４】
以下に還元剤ＣＤの構造について詳しく説明する。Ｒ１１は置換基を有してもよいアリール基またはヘテロ環基を示す。Ｒ１１のアリール基としては好ましくは炭素数６ないし１４のもので、例えば、フェニルやナフチルが挙げられる。Ｒ１１のヘテロ環基としては、好ましくは窒素、酸素、硫黄、セレンのうち少なくとも一つを含有する飽和または不飽和の５員環、６員環または７員環のものである。これらにベンゼン環またはヘテロ環が縮合していても良い。Ｒ１１のヘテロ環の例としては、フラニル、チエニル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピロリジニル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ピリジル、ピリダジル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、キノリニル、イソキノリニル、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、プリニル、プテリジニル、アゼピニル、ベンゾオキセピニル等が挙げられる。
【００６５】
Ｒ１１の有する置換基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、アシルオキシ基、アシルチオ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、アミド基、アルコキシカルボニルアミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホンアミド基、スルファモイルアミノ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、アシルカルバモイル基、カルバモイルカルバモイル基、スルホニルカルバモイル基、スルファモイルカルバモイル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルコキシスルホニル基、アリールオキシスルホニル基、スルファモイル基、アシルスルファモイル基、カルバモイルスルファモイル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、スルホ基、ホスホノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、イミド基、アゾ基等が挙げられる。Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基を表わす。
【００６６】
Ｒ１２のアルキル基としては好ましくは炭素数１ないし１６の直鎖、分岐または環状のもので、例えばメチル、エチル、ヘキシル、ドデシル、２−オクチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等が挙げられる。Ｒ１２のアルケニル基としては、好ましくは炭素数２ないし１６の鎖状または環状のもので、例えばビニル、１−オクテニル、シクロヘキセニルが挙げられる。
【００６７】
Ｒ１２のアルキニル基としては、好ましくは炭素数２ないし１６のもので、例えば１−ブチニル、フェニルエチニル等が挙げられる。Ｒ１２のアリール基及びヘテロ環基としては、Ｒ１１で述べたものが挙げられる。Ｒ１２の有する置換基としてはＲ１１の置換基で述べたものが挙げられる。Ｘとして好ましくは−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−ＣＯＣＯ−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−であり、さらに好ましくは、−ＳＯ２−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−である。特にＸが−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−であるとき、この化合物と反応するカプラーとして２当量カプラーを用いることができ、また未処理の感光材料の長期保存によるステインの上昇も本発明において特に効果的に低く抑えることができ、好ましい。
【００６８】
またＲ１１としては好ましくは含窒素ヘテロ環基または一般式（Ｖ）で表される基であり、一般式（ＩＶ）で表される化合物については好ましくは６員環の含窒素ヘテロ環基または一般式（Ｖ）で表される基であり、一般式（ＩＩ）で表される化合物については好ましくは一般式（Ｖ）で表される基である。
【００６９】
【化１８】
【００７０】
一般式（Ｖ）において、Ｘ２１、Ｘ２３、Ｘ２５は水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基を表し、Ｘ２２、Ｘ２４は水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子、アシルオキシ基、アシルチオ基を表す。ただし、Ｘ２１、Ｘ２３、Ｘ２５のハメットのσｐ値とＸ２２、Ｘ２４のハメットのσｍ値の和は１．５以上である。本発明の還元剤は層中で非拡散性のものが好ましい。以下に一般式（Ｉ）の具体的化合物例を示す。
【００７１】
【化１９】
【００７２】
【化２０】
【００７３】
【化２１】
【００７４】
【化２２】
【００７５】
【化２３】
【００７６】
【化２４】
【００７７】
【化２５】
【００７８】
【化２６】
【００７９】
【化２７】
【００８０】
【化２８】
【００８１】
【化２９】
【００８２】
【化３０】
【００８３】
【化３１】
【００８４】
【化３２】
【００８５】
【化３３】
【００８６】
【化３４】
【００８７】
【化３５】
【００８８】
【化３６】
【００８９】
【化３７】
【００９０】
【化３８】
【００９１】
【化３９】
【００９２】
【化４０】
【００９３】
本発明の一般式（Ｉ）で表わされる化合物の一部は、例えば米国特許第２，４２４，２５６号、同第４，４８１，２６８号、欧州特許第５６５，１６５Ａ１号、特開昭６１−２５９２４９号等に記載されており、他の化合物に記載されている方法で合成できる。本発明において、前記の一般式（Ｉ）の還元剤と酸化カップリング反応によって色素を形成する化合物（カプラー）を使用する。このカプラーは４当量カプラーであっても２当量カプラーであってもよいが、還元剤がスルホンヒドラシドの場合は４当量カプラーが好ましい。何故ならば、第一に還元剤のカップリング部位であるアミノ基がスルホニル基（置換基Ｘ）によって保護されており、カップリング時にカプラー側のカップリング部位に置換基があると立体障害によって反応が阻害されるからである。第二に、このスルホニル基はカップリング後、スルフィン酸として離脱するため、カプラー側の離脱基はカチオンとして離脱しなければならず、通常の２当量カプラーではこのような離脱基にはなりえないからである。カプラーの具体例は、４当量、２当量の両者ともセオリー・オブ・ザ・フォトグラフィック・プロセス（４ｔｈ．Ｅｄ．Ｔ．Ｈ．Ｊａｍｅｓ 編集 Ｍａｃｍｉｌｌａｎ ，１９７７）２９１頁〜３３４頁、および３５４頁〜３６１頁、特開昭５８−１２３５３号、同５８−１４９０４６号、同５８−１４９０４７号、同５９−１１１１４号、同５９−１２４３９９号、同５９−１７４８３５号、同５９−２３１５３９号、同５９−２３１５４０号、同６０−２９５１号、同６０−１４２４２号、同６０−２３４７４号、同６０−６６２４９号などに詳しく記載されている。
【００９４】
（還元剤の添加方法）
本発明においては、還元剤は、水溶液あるいは有機溶剤に溶解した溶液、乳化分散物、あるいは固体状分散物で用いることができる。
【００９５】
微粒子分散物で用いられる場合の数平均粒子サイズは、０．００１μｍ〜５μｍであることが好ましく、０．００１μｍ〜０．５μｍであることが更に好ましい。
【００９６】
（還元剤及びカプラーの添加量）
本発明における還元剤ＣＤは十分な発色濃度を得るために、発色層１層当たり０．００１ｍｍｏｌ／ｍ２〜１０ｍｍｏｌ／ｍ２使用することが好ましい。更に好ましい使用量は０．００５ｍｍｏｌ／ｍ２〜５ｍｍｏｌ／ｍ２であり特に好ましい使用量は０．０１ｍｍｏｌ／ｍ２〜１ｍｍｏｌ／ｍ２である。
本発明におけるカプラーの好ましい使用量は、還元剤に対してモル換算で０．０５倍〜２０倍で、更に好ましくは０．１倍〜１０倍、特に好ましくは０．２倍〜５倍である。
本発明の還元剤とカプラーは親油性微粒子中に含有されて親水性コロイド層に分散されているのが好ましい。親油性微粒子は高沸点有機溶媒からなるのが一般的であるが、必須ではない。
【００９７】
（カプラー）
以下、本発明に用いることの出来るカプラーについて詳細に説明する。
本発明に用いることの出来るカプラーは、本発明の還元剤の酸化体とカップリングして可視部に吸収を持つ色素を形成できる化合物であればいかなる構造をしていてもよい。このような化合物はカラー写真系ではよく知られた化合物であり、その代表例としてピロロトリアゾール型カプラー、フェノール型カプラー、ナフトール型カプラー、ピラゾロトリアゾール型カプラー、ピラゾロン型カプラー、アシルアセトアニリド型カプラーなどが挙げられる。
【００９８】
本発明において好ましいカプラーは一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）、または（Ｙ−３）で表される構造を有するカプラーである。
【００９９】
【化４１】
【０１００】
式中、Ｘ１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ１およびＹ２は電子求引性の置換基を表し、Ｒ１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。
【０１０１】
【化４２】
【０１０２】
式中、Ｘ２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ３とＲ４が互いに連結して環を形成してもよい。
【０１０３】
【化４３】
【０１０４】
式中、Ｘ３は水素原子または離脱基を表し、Ｒ５はカルバモイル基またはスルファモイル基を表し、Ｒ６は水素原子または置換基を表す。
【０１０５】
【化４４】
【０１０６】
式中、Ｘ４は水素原子または離脱基を表し、Ｒ７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ８は置換基を表す。
【０１０７】
【化４５】
【０１０８】
式中、Ｘ５は水素原子または離脱基を表し、Ｒ９はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ１０は置換基を表す。
【０１０９】
【化４６】
【０１１０】
式中、Ｘ６は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１１はアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基を表し、Ｒ１０はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。
【０１１１】
【化４７】
【０１１２】
式中、Ｘ７は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１３はアルキル基、アリール基、インドレニル基を表し、Ｒ１４はアリール基またはヘテロ環基を表す。
【０１１３】
【化４８】
【０１１４】
式中、Ｘ８は水素原子または離脱基を表し、Ｚは５員ないし７員の環を形成するのに必要な２価の基を表し、Ｒ１５はアリール基またはヘテロ環基を表す。
【０１１５】
【化４９】
【０１１６】
式中、Ｘ９は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８はそれぞれ置換基を表し、ｎは０ないし４の、ｍは０ないし５のいずれかの整数を表す。ｎまたはｍが２以上のとき、複数のＲ１６およびＲ１７はそれぞれ同一の基であってもよいし、別々の基であってもよい。
【０１１７】
一般式（Ｃ−１）において、Ｘ１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ１およびＹ２は電子求引性の置換基を表し、Ｒ１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい。
Ｘ１は水素原子または離脱基で、好ましくは離脱基である。
本発明で言う離脱基とは、還元剤の酸化体とカップリングし、色素を形成する際に母核から離脱可能な基を意味する。離脱基としてはハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルオキシ基、カルバモイルオキシ基、イミド基、メチロール基、ヘテロ環基等が挙げられる。Ｘ１としてはカルバモイルオキシ基またはベンゾイルオキシ基がより好ましい。Ｙ１およびＹ２は電子求引性基を表す。具体的には、シアノ基、ニトロ基、アシル基、オキシカルボニル基、カルバモイル基、スルホニル基、スルホキシド基、オキシスルホニル基、スルファモイル基、ヘテロ環基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子が挙げられる。その中でも好ましくはシアノ基、オキシカルボニル基、スルホニル基で、より好ましくはシアノ基、オキシカルボニル基である。Ｙ１とＹ２のいずれか一方がシアノ基であることがさらに好ましく、Ｙ１がシアノ基であることが特に好ましい。Ｙ２はオキシカルボニル基であることが好ましく、かさ高い基で置換されたオキシカルボニル基（例えば２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルピペラジニルオキシカルボニル基）が特に好ましい。Ｒ１は好ましくはアルキル基またはアリール基であり、これらの基は置換基を有していてもよい。アルキル基としては２級または３級のアルキル基が好ましく、より好ましくは３級のアルキル基である。アルキル基としては炭素数の和が３〜１２の範囲であることが好ましく４〜８の範囲であることがより好ましい。アリール基としてはフェニル基が好ましく、置換基を有していてもよいが、炭素数の和が６〜１６の範囲であることが好ましく、６〜１２の範囲であることがより好ましい。一般式（Ｃ−１）のカプラーは分子量が７００以下であることが好ましく、６５０以下であることがより好ましく、６００以下であることがさらに好ましい。
【０１１８】
一般式（Ｃ−２）において、Ｘ２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ３とＲ４が互いに連結して環を形成してもよい。
Ｘ２は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基であるが、Ｘ２として好ましいのはハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基、アリールチオ基またはアルキルチオ基で、ハロゲン原子またはアリールオキシ基がより好ましい。Ｒ２は好ましくはアシルアミノ基またはウレイド基である。Ｒ２としては炭素数の総和が２〜１２の範囲が好ましく、より好ましくは２〜８の範囲である。Ｒ３は好ましくは炭素数１〜４のアルキル基または炭素数２〜１２のアシルアミノ基であり、より好ましくは炭素数２〜４のアルキル基または炭素数２〜８のアシルアミノ基である。Ｒ４は好ましくはハロゲン原子、アルコキシ基、アシルアミノ基、アルキル基であり、より好ましくはハロゲン原子またはアシルアミノ基で、特に塩素原子が好ましい。一般式（Ｃ−２）のカプラーは分子量が５００以下であることが好ましく、４５０以下であることがより好ましく、４００以下であることがさらに好ましい。
【０１１９】
一般式（Ｃ−３）において、Ｘ３は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基であるが、Ｘ３として好ましいのはハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基、アリールチオ基またはアルキルチオ基で、アルコキシ基またはアルキルチオ基がより好ましい。Ｒ５はアシル基、オキシカルボニル基、カルバモイル基またはスルファモイル基が好ましく、カルバモイル基またはスルファモイル基がより好ましい。Ｒ５として炭素数の和が１〜１２の基が好ましく、より好ましくは炭素数が２〜１０である。Ｒ６は水素原子もしくは置換基であるが、置換基としては好ましくはアミド基、スルホンアミド基、ウレタン基またはウレイド基であり、アミド基またはウレタン基がより好ましい。置換位置としてはナフトール環の５位または８位が好ましく、５位がより好ましい。Ｒ６として炭素数の和が２〜１０の基が好ましく、より好ましくは炭素数が２〜６である。一般式（Ｃ−２）のカプラーは分子量が５５０以下であることが好ましく、５００以下であることがより好ましく、４５０以下であることがさらに好ましい。
【０１２０】
一般式（Ｍ−１）においてＸ４は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基あるが、Ｘ４として好ましいのはハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基、アリールチオ基、アルキルチオ基またはヘテロ環基で、ハロゲン原子、アリールオキシ基、アリールチオ基またはヘテロ環基がより好ましい。ヘテロ環基としてはピラゾール基、イミダゾール基、トリアゾール基、テトラゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾトリアゾール基等のアゾール基が好ましく、ピラゾール基がより好ましい。Ｒ７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基で、これらの基は置換基を有していてもよい。好ましくは２級もしくは３級のアルキル基またはアリール基である。アルキル基としては炭素数が２〜１４の基が好ましく、より好ましくは炭素数３〜１０の基である。アリール基としては好ましくは炭素数が６〜１８の基で、より好ましくは６〜１４の基である。Ｒ８は好ましくはアルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基またはヘテロ環であり、これらの基は置換基を有していてもよい。アルキル基としては２級または３級のアルキル基が好ましく、より好ましくは３級のアルキル基である。アルキル基としては炭素数の和が３〜１２の範囲であることが好ましく４〜８の範囲であることがより好ましい。アリール基としてはフェニル基が好ましく、置換基を有していてもよいが、炭素数の和が６〜１６の範囲であることが好ましく、６〜１２の範囲であることがより好ましい。アルコキシ基としては炭素数１〜８のアルコキシ基が好ましく、より好ましくは炭素数１〜４のアルコキシ基である。アリールオキシ基としては炭素数６〜１４のアリールオキシ基が好ましく炭素数６〜１０の基がより好ましい。アルキルチオ基、アリールチオ基もそれぞれアルコキシ基、アリールオキシ基と同様の炭素数の基が好ましい。一般式（Ｍ−１）のカプラーは分子量が６００以下であることが好ましく、５５０以下であることがより好ましく、５００以下であることがさらに好ましい。
【０１２１】
一般式（Ｍ−２）のカプラーのＸ５、Ｒ９およびＲ１０で表される基はそれぞれ一般式（Ｍ−１）のカプラーのＸ４、Ｒ７およびＲ８で表される基と同様の基で、それぞれの基の好ましい範囲も一般式（Ｍ−１）のカプラーと同様である。
【０１２２】
一般式（Ｍ−３）において、Ｘ６は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基あるが、Ｘ６として好ましいのはアルキルチオ基、アリールチオ基またはヘテロ環基で、より好ましくはアリールチオ基またはヘテロ環基である。アリールチオ基としてはフェニル基が好ましく、特に２位にアルコキシ基、アミド基が置換したアリールチオ基が好ましい。アリールチオ基の炭素数の和は６〜１６の範囲が好ましく、７〜１２の範囲がより好ましい。ヘテロ環基としてはピラゾール基、イミダゾール基、トリアゾール基、テトラゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾトリアゾール基等のアゾール基が好ましく、ピラゾール基がより好ましい。Ｒ１１としてはアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基が好ましく、アシルアミノ基またはアニリノ基がより好ましい。最も好ましいのはアニリノ基である。アルキル基としては炭素数１〜８のアルキル基が好ましく、アリール基としては炭素数６〜１４のアリール基が好ましい。アシルアミノ基としては炭素数２〜１４の基が好ましく２〜１０の基がより好ましい。アニリノ基としては炭素数６〜１６の基が好ましく６〜１２の基がより好ましい。アニリノ基の置換基としてはハロゲン原子、アシルアミノ基が好ましい。一般式（Ｍ−３）のカプラーは分子量が７００以下であることが好ましく、６５０以下であることがより好ましく、６００以下であることがさらに好ましい。
【０１２３】
一般式（Ｙ−１）において、Ｘ７は水素原子もしくはＸ１と同様の離脱基あるが、Ｘ７として好ましいのはアリールオキシ基、イミド基またはヘテロ環基である。アリールオキシ基としては電子求引性基で置換されたアリールオキシ基が好ましい。イミド基としては環状のイミド基が好ましく、ヒダントイン基、１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオン基およびコハクイミド基が特に好ましい。イミド基の炭素数の総和は３〜１５の範囲が好ましく、より好ましくは４〜１１の範囲で、さらに好ましくは５〜９の範囲である。ヘテロ環基としてはピラゾール基、イミダゾール基、トリアゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾトリアゾール基が好ましく、イミダゾール基がより好ましい。アゾール基の炭素数の総和は３〜１２の範囲が好ましく、より好ましくは３〜１０の範囲で、さらに好ましくは３〜８の範囲である。Ｒ１３は好ましくは２級もしくは３級のアルキル基、アリール基またはヘテロ環基である。アルキル基はシクロアルキル基、ビシクロアルキル基であってもよく３級アルキル基がより好ましい。１−アルキルシクロプロピル基、ビシクロアルキル基、アダマンチル基は特に好ましい。Ｒ１４はアリール基もしくはヘテロ環基で、アリール基がより好ましい。そのなかでも２位にハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基またはアリールチオ基が置換したフェニル基が特に好ましい。Ｒ１４の炭素数の総和は６〜１８の範囲が好ましく、より好ましくは７〜１６の範囲、さらに好ましくは８〜１４の範囲である。一般式（Ｙ−１）のカプラーは分子量が７００以下であることが好ましく、６５０以下であることがより好ましく、６００以下であることがさらに好ましい。
【０１２４】
一般式（Ｙ−２）のカプラーのＸ８およびＲ１５で表される基はそれぞれ一般式（Ｙ−１）のカプラーのＸ７、Ｒ１４で表される基と同様の基で、それぞれの基の好ましい範囲も一般式（Ｙ−１）のカプラーと同様である。Ｚは５ないし７員の環を形成するために必要な２価の基を表し、この環には置換基があってもよいし、別の環が縮環していてもよい。
【０１２５】
一般式（Ｙ−２）のなかでも好ましいのは一般式（Ｙ−３）で表されるカプラーである。
一般式（Ｙ−３）のカプラーにおいて、Ｘ９は一般式（Ｙ−１）のＸ７と同義で、好ましい範囲も同じである。Ｒ１６は好ましくはハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、アシルオキシ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニル基、スルホンアミド基、シアノ基、スルホニル基、スルファモイル基、カルバモイル基またはアルキルチオ基で炭素数１〜４の置換基であることがより好ましい。ｎは好ましくは０〜３の整数で、より好ましくは０〜２、さらに好ましくは０〜１、最も好ましくは０である。Ｒ１７は好ましくはＲ１６と同様の基で、より好ましくはハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アシルアミノ基、スルホンアミド基、アルコキシカルボニル基、スルファモイル基、スルホニル基である。特にＮＨ基に対してオルト位にハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基であるＲ１７が置換されていることがより好ましい。最も好ましいのはアルキルチオ基である。一般式（Ｙ−３）のカプラーは分子量が７５０以下であることが好ましく、７００以下であることがより好ましく、６５０以下であることがさらに好ましい。
以下に本発明のカプラーの具体例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１２６】
【化５０】
【０１２７】
【化５１】
【０１２８】
【化５２】
【０１２９】
【化５３】
【０１３０】
【化５４】
【０１３１】
【化５５】
【０１３２】
【化５６】
【０１３３】
【化５７】
【０１３４】
【化５８】
【０１３５】
【化５９】
【０１３６】
【化６０】
【０１３７】
【化６１】
【０１３８】
【化６２】
【０１３９】
【化６３】
【０１４０】
【化６４】
【０１４１】
【化６５】
【０１４２】
【化６６】
【０１４３】
【化６７】
【０１４４】
【化６８】
【０１４５】
【化６９】
【０１４６】
【化７０】
【０１４７】
【化７１】
【０１４８】
【化７２】
【０１４９】
【化７３】
【０１５０】
【化７４】
【０１５１】
【化７５】
【０１５２】
【化７６】
【０１５３】
【化７７】
【０１５４】
【化７８】
【０１５５】
【化７９】
【０１５６】
【化８０】
【０１５７】
上記の他に、特開２００４−４４３９に記載の化合物Ｎｏ．ＣＰ１０１〜ＣＰ１１７、ＣＰ２０１〜ＣＰ２２０、およびＣＰ３０１〜ＣＰ３３１なども本発明に用いることが出来る。
【０１５８】
本発明のカプラーはオイル乳化物あるいは固体微粒子分散物として、例えばゼラチンやポリマーラテックスをバインダーとした塗布膜として用いることができる。このときの塗布量は、好ましくは１×１０−６モル／ｍ２〜１×１０−２モル／ｍ２が好ましく、さらに好ましくは１×１０−５モル／ｍ２〜１×１０−３モル／ｍ２で使用することである。
【０１５９】
（不活性坦体）
本発明に用いられる不活性坦体（基質）は坦持する抗体蛋白を含むメンブレンや固定層に拡散せず、生成した複合体がメンブレンや固定層に固定もしくは拡散するのを妨害することのない不活性な材料が好ましい。
本発明に用いられる不活性坦体としては、例えば、ニトロセルロースが挙げられる。
本発明に用いられる不活性坦体が発色した色素を観察する背景となる場合は、白色の光反射性基質であることが好ましく、また、不活性坦体を通りして発色した色素を観察する場合は、透明基質であることが好ましい。
【実施例】
【０１６０】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１６１】
実施例１
１．発色シートＡ〜Ｅの作製
表１に記載の本願の還元剤もしくは比較用還元剤、Ｃｐ、色像安定剤（ＳＴ−１）１．３ｇ、色像安定剤（ＳＴ−２）０．２２ｇ、色像安定剤（ＳＴ−３）１．４ｇを溶媒（ＳＯＬ−１）６．７ｇ、溶媒（ＳＯＬ−２）６．７ｇおよび溶媒（酢酸エチル）１９ｇに溶解し、この液を１．０ｇのドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含む２５質量％のゼラチン水溶液８４ｍＬと混合して、高速攪拌乳化機（ディゾルバー）で乳化分散し、さらに水を加えて２３０ｇの乳化分散物Ａ〜Ｅを作製した。
得られたそれぞれの乳化分散物とゼラチン水溶液を加えて塗布溶液とし、以下の組成（１ｍｍ２あたりの塗布量として表した）となるようにトリアセチルセルロース（ＴＡＣ）支持体上に塗布した。これを５ｍｍ×１８ｍｍのサイズに裁断し、発色シートＡ〜Ｅを作製した。
【０１６２】
ＣＤ−１ 表１に記載
ＣＰ−１ 表１に記載
ＳＴ−１ ０．０７９ｇ
ＳＴ−２ ０．０１３３ｇ
ＳＴ−３ ０．０８５ｇ
ＳＯＬ−１ ０．４１ｇ
ＳＯＬ−２ ０．４１ｇ
ゼラチン ２．２ｇ
Ｈ−１ ０．０２６ｇ
【０１６３】
【表１】
【０１６４】
【化８１】
【０１６５】
【化８２】
【０１６６】
【化８３】
【０１６７】
２．ｈＣＧ検出イムノクロマトキットの作製
【０１６８】
（１）ｈＣＧ検出イムノクロマトキットの作製
（１−１）抗ｈＣＧ抗体修飾銀コロイドの作製
直径８０ｎｍ銀コロイド溶液（ＥＭ．ＳＣ８０、ＢＢＩ社）９０ｍＬを８０００Ｇ、４℃、１５分遠心（ｈｉｍａｃＣＦ１６ＲＸ、日立）し上精を取り除くことで９ｍｌにまで濃縮した。この銀コロイド溶液に２０ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ９．０）１ｍＬを加えることでｐＨを調整した銀コロイド溶液に、６０μｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社、等電点＝７．４）溶液１ｍＬを加え攪拌した。１０分間静置した後、１質量％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ Ｍｗ．２００００、品番１６８−１１２８５、和光純薬）水溶液を５５０μＬ加え攪拌し、続いて１０質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、品番Ａ−７９０６、ＳＩＧＭＡ）水溶液を１．１ｍＬ加え攪拌した。この溶液を８０００Ｇ、４℃、３０分遠心（ｈｉｍａｃＣＦ１６ＲＸ、日立）した後、１ｍＬ程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により銀コロイドを再分散した。この後、２０ｍＬの銀コロイド保存液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．２），０．０５質量％ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１質量％ＢＳＡ，０．１質量％ＮａＮ３）に分散し、再び８０００Ｇ、４℃、３０分間遠心した後、１ｍＬ程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により銀コロイドを再分散し、抗体修飾銀コロイド（８０ｎｍ）溶液を得た。
【０１６９】
（１−２）銀コロイド抗体保持パットの作製
（１−１）で作製した各抗体修飾銀コロイドを、銀コロイド塗布液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌバッファー（ｐＨ８．２），０．０５質量％ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００），５質量％スクロース）及び水により希釈した。その際、光路長１ｃｍの条件で４５５ｎｍの単色光により光学濃度を測定し、１．２５となるように希釈した。この溶液を、８ｍｍ×１５０ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ、ミリポア社）１枚あたり０．８ｍＬずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、銀コロイド抗体保持パッドを得た。
【０１７０】
（１−３）抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作製
２５ｍｍ×２００ｍｍに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、ＨｉＦｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１２０、ミリポア社）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作製した。メンブレンの長辺を下にし、下から８ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した固定化用抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−Ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ６６０１ ＳＰＲ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社、等電点＝７．４）溶液をインクジェット方式の塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて幅１ｍｍ程度のライン状に塗布した。同様に、下から１２ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製したコントロール用抗マウスＩｇＧ抗体（抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ウサギＦ（ａｂ’）２，品番５６６−７０６２１、和光純薬）溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で５０℃、３０分間乾燥した。ブロッキング液（０．５質量％カゼイン（乳由来、品番０３０−０１５０５、和光純薬）含有５０ ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．５））５００ｍＬをバットに入れ、そのまま３０分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（０．５質量％スクロースおよび０．０５質量％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファー）５００ｍＬに移して浸し、そのまま３０分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
【０１７１】
（１−４）イムノクロマトグラフキットの作製
バック粘着シート（ＡＲｃａｒｅ９０２０、ニップンテクノクラスタ社）に、（１−３）で作製した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗ｈＣＧ抗体ライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約２ｍｍ重なるように（１−２）で作製した銀コロイド抗体保持パッドを貼り付け、約４ｍｍ重なるようにして銀コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド（１８ｍｍ×１５０ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約５ｍｍ重なるように吸収パッド（８０ｍｍ×１５０ｍｍに切ったセルロース・グラス膜（ＣＦ６、ワットマン社））を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材を、部材の長辺側を５ｍｍ幅になるように短辺に平行にギロチン式カッター（ＣＭ４０００、ニップンテクノクラスタ社）切断していくことで、５ｍｍ×５５ｍｍのイムノクロマト用ストリップを作製した。これらをプラスチックケース（ニップンテクノクラスタ社）に入れ、試験用イムノクロマトキットとした。
【０１７２】
（１−５）現像液の作製
リン酸水素カリウム４６、亜硫酸カリウム０．５ｇを含む水溶液に水酸化カリウムを加えてｐＨ１２．８のバッファー水溶液１Ｌを調製し、現像処理液とした。
【０１７３】
（２）検出ラインでのシグナル増幅
（２−１）検出ラインでの抗体修飾金属コロイドの吸着処理
１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーにｈＣＧ（リコンビナントｈＣＧ Ｒ−５０６、ロ−ト製薬（株）製）を溶解し、各濃度の試験用ｈＣＧ溶液を作製した。この試験用ｈＣＧ溶液を各試験用イムノクロマトキットの試料添加パッドに１００μＬ滴下し、１０分静置した。
【０１７４】
（２−２）発色シートおよび現像液によるシグナル増幅
（２−１）の処理後のイムノクロマトキットのケースからメンブレンを取り出し、さらに吸水パットを取り除き、新たな吸水パットとして５×２０ｍｍ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ、ミリポア社））を取り除いた場所に３枚をセロハンテープで付けた。検出ライン部に発色シートを重ね、その重ねた部位を２枚のアクリル板で挟み固定した。このメンブレンを、現像液９ｍＬに３０質量％の過酸化水素水を混合した液を２００μＬ入れたマイクロチューブ（ビーエム機器（株）、ＢＭ４０２０）に検体滴下部が液に漬かるように立てかけた。立てかけた時点を０分として１０分後に取り出し、発色シートを剥がし１質量％酢酸溶液に１分間浸すことで発色反応を停止させた。
【０１７５】
（実施例２）
（１−１）で示した抗ｈＣＧ抗体修飾銀コロイドの作製において、濃縮した銀コロイドの代わりとして、直径５０ｎｍ金コロイド溶液（ＥＭ．ＧＣ５０、ＢＢＩ社）９ｍＬに５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ７．０）１ｍＬを加えることでｐＨを調整した金コロイド溶液に、５０μｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体溶液１ｍＬを加え攪拌したこと以外は同様にして、イムノクロマトキットを得た。ただし、金コロイド抗体保持パッドの作製における金コロイド塗布液は、光路長１ｃｍの条件で５２０ｎｍの単色光により光学濃度を測定し、１．５となるように希釈して作製したものを使用した。
次いで、実施例１と同様に検出ラインでのシグナル増幅処理を実施した。
【０１７６】
（実施例３）（比較例）
実施例１同様に抗体修飾銀コロイドを標識としたイムノクロマトキットを作製した。得られたイムノクロマトキットを用いて実施例１と同様に検出ラインでの検出を行った。但し、実施例１で行った発色シートおよび現像液によるシグナル増幅処理を施さなかった。
【０１７７】
（実施例４）（比較例））
実施例２同様に抗体修飾金コロイドを標識としたイムノクロマトキットを作製した。得られたイムノクロマトキットを用いて実施例１と同様に検出ラインでの検出を行った。但し、実施例１で行った発色シートおよび現像液によるシグナル増幅処理を施さなかった。
【０１７８】
＜検出結果＞
実施例および比較例で得られたメンブレンの検出ラインに接した発色シートの部位もしくはメンブレンの検出ラインを、通常の明るさの蛍光灯を照明とした室内で目視観察した。得られた各イムノクロマトキットの評価結果を表２に示した。
表中、判定基準は下記に従った。
○：コントロール（ｈＣＧ濃度０）の場合と明確に識別できる。
×：コントロールとの識別ができない。
【０１７９】
【表２】
【０１８０】
上記表に示されるように、本発明の発色シートを用いてシグナル増幅処理をすることで、少ない抗原（ｈＣＧ）量でも検出できた（検出感度を増加できた）。特に、銀コロイドを標識とした場合に検出感度増加が大きかった。また、還元剤のなかで本発明の一般式（Ｉ）で表される還元剤が顕著な効果を示すことがわかった。
従って、本発明により極めて検出感度が高い免疫学的検出方法が得られる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫学的検出方法であって、
ａ）検体または検体を含む試料に、金属を含む標識により修飾された検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第一の蛋白質（Ｙ）を作用させ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成させる工程、
ｂ）前記工程において生じた前記複合体と分析対象物と複合体を形成しなかった前記標識を含む第一の蛋白質Ｙとを分離する工程、
ｃ）前記複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる工程、及びｄ）前記ＣＤおよび前記Ｃｐより生じた色素を検出する工程を有し、前記ＣＤが下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする免疫学的検出方法：
【化１】
（一般式（Ｉ）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。Ｘは−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−ＣＯＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−、−ＣＯＣＯ−Ｏ−、−ＣＯＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−または−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ１３）−である。ここでＲ１３は水素原子または前記Ｒ１２として挙げた基より選ばれる基である。）。
【請求項２】
金属を含む標識が銀、金および白金原子の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１に記載の免疫学的検出方法。
【請求項３】
金属を含む標識が銀粒子であることを特徴とする請求項２に記載の免疫学的検出方法。
【請求項４】
金属を含む標識がハロゲン化銀粒子であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の免疫学的検出方法。
【請求項５】
前記ＣＤが、下記一般式（II）で表される化合物であることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法：
【化２】
（一般式（II）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。）。
【請求項６】
前記ＣＤが、下記一般式（III）で表される化合物であることを特徴とする請求項５に記載の免疫学的検出方法：
【化３】
（一般式（III）においてＲ１２はアルキル基、ヘテロ環基を表し、Ｘ２１、Ｘ２３、及びＸ２５は、それぞれ独立に、水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基を表し、Ｘ２２、Ｘ２４は、それぞれ独立に、水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子、アシルオキシ基、アシルチオ基を表す。ただし、Ｘ２１、Ｘ２３、Ｘ２５のハメットのσｐ値とＸ２２、Ｘ２４のハメットのσｍ値の和は１．５以上である。）。
【請求項７】
前記ＣＤが一般式（IV）で表される化合物であることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法：
【化４】
（一般式（IV）におけるＲ１１とＲ１２は、それぞれ一般式（Ｉ）におけるものと同義である。）。
【請求項８】
前記ＣＤが親油性微粒子中に含有されていることを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
【請求項９】
前記Ｃｐが下記一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）および（Ｙ−３）よりなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法：
【化５】
（式中、Ｘ１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立に、電子求引性の置換基を表し、Ｒ１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【化６】
（式中、Ｘ２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ３とＲ４が互いに連結して環を形成してもよい。）；
【化７】
（式中、Ｘ３は水素原子または離脱基を表し、Ｒ５はカルバモイル基またはスルファモイル基を表し、Ｒ６は水素原子または置換基を表す。）；
【化８】
（式中、Ｘ４は水素原子または離脱基を表し、Ｒ７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ８は置換基を表す。）；
【化９】
（式中、Ｘ５は水素原子または離脱基を表し、Ｒ９はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ１０は置換基を表す。）；
【化１０】
（式中、Ｘ６は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１１はアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基を表し、Ｒ１０はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【化１１】
（式中、Ｘ７は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１３はアルキル基、アリール基、インドレニル基を表し、Ｒ１４はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【化１２】
（式中、Ｘ８は水素原子または離脱基を表し、Ｚは５員ないし７員の環を形成するのに必要な２価の基を表し、Ｒ１５はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【化１３】
（式中、Ｘ９は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、それぞれ独立に、置換基を表し、ｎは０ないし４の、ｍは０ないし５のいずれかの整数を表す。ｎまたはｍが２以上のとき、複数のＲ１６およびＲ１７はそれぞれ同一の基であってもよいし、別々の基であってもよい。）。
【請求項１０】
検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第二の蛋白質（Ｘ）および検体中の分析対象物を特異的に認識し得る酵素標識により修飾された第一の蛋白質（Ｙ）を同時にまたは段階的に作用させ、前記Ｘ、前記分析対象物および前記Ｙの複合体を形成させる工程を含むことを特徴とする請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
【請求項１１】
前記分析対象物が抗原であり、前記分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質が抗体であることを特徴とする請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
【請求項１２】
前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１に記載の免疫学的検出方法。
【請求項１３】
前記分析対象物を特異的に認識し得る前記蛋白質Ｘが不溶性担体に坦持されていることを特徴とする請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
【請求項１】
免疫学的検出方法であって、
ａ）検体または検体を含む試料に、金属を含む標識により修飾された検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第一の蛋白質（Ｙ）を作用させ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成させる工程、
ｂ）前記工程において生じた前記複合体と分析対象物と複合体を形成しなかった前記標識を含む第一の蛋白質Ｙとを分離する工程、
ｃ）前記複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる工程、及びｄ）前記ＣＤおよび前記Ｃｐより生じた色素を検出する工程を有し、前記ＣＤが下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする免疫学的検出方法：
【化１】
（一般式（Ｉ）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。Ｘは−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−ＣＯＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−、−ＣＯＣＯ−Ｏ−、−ＣＯＣＯ−Ｎ（Ｒ１３）−または−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ１３）−である。ここでＲ１３は水素原子または前記Ｒ１２として挙げた基より選ばれる基である。）。
【請求項２】
金属を含む標識が銀、金および白金原子の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１に記載の免疫学的検出方法。
【請求項３】
金属を含む標識が銀粒子であることを特徴とする請求項２に記載の免疫学的検出方法。
【請求項４】
金属を含む標識がハロゲン化銀粒子であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の免疫学的検出方法。
【請求項５】
前記ＣＤが、下記一般式（II）で表される化合物であることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法：
【化２】
（一般式（II）においてＲ１１は置換基を有してもよいアリール基又はヘテロ環基であり、Ｒ１２は置換基を有してもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはヘテロ環基である。）。
【請求項６】
前記ＣＤが、下記一般式（III）で表される化合物であることを特徴とする請求項５に記載の免疫学的検出方法：
【化３】
（一般式（III）においてＲ１２はアルキル基、ヘテロ環基を表し、Ｘ２１、Ｘ２３、及びＸ２５は、それぞれ独立に、水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基を表し、Ｘ２２、Ｘ２４は、それぞれ独立に、水素原子、またはニトロ基、シアノ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、スルファモイル基、カルバモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシル基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子、アシルオキシ基、アシルチオ基を表す。ただし、Ｘ２１、Ｘ２３、Ｘ２５のハメットのσｐ値とＸ２２、Ｘ２４のハメットのσｍ値の和は１．５以上である。）。
【請求項７】
前記ＣＤが一般式（IV）で表される化合物であることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法：
【化４】
（一般式（IV）におけるＲ１１とＲ１２は、それぞれ一般式（Ｉ）におけるものと同義である。）。
【請求項８】
前記ＣＤが親油性微粒子中に含有されていることを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
【請求項９】
前記Ｃｐが下記一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）および（Ｙ−３）よりなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法：
【化５】
（式中、Ｘ１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立に、電子求引性の置換基を表し、Ｒ１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【化６】
（式中、Ｘ２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ３とＲ４が互いに連結して環を形成してもよい。）；
【化７】
（式中、Ｘ３は水素原子または離脱基を表し、Ｒ５はカルバモイル基またはスルファモイル基を表し、Ｒ６は水素原子または置換基を表す。）；
【化８】
（式中、Ｘ４は水素原子または離脱基を表し、Ｒ７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ８は置換基を表す。）；
【化９】
（式中、Ｘ５は水素原子または離脱基を表し、Ｒ９はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ１０は置換基を表す。）；
【化１０】
（式中、Ｘ６は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１１はアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基を表し、Ｒ１０はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【化１１】
（式中、Ｘ７は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１３はアルキル基、アリール基、インドレニル基を表し、Ｒ１４はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【化１２】
（式中、Ｘ８は水素原子または離脱基を表し、Ｚは５員ないし７員の環を形成するのに必要な２価の基を表し、Ｒ１５はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；
【化１３】
（式中、Ｘ９は水素原子または離脱基を表し、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、それぞれ独立に、置換基を表し、ｎは０ないし４の、ｍは０ないし５のいずれかの整数を表す。ｎまたはｍが２以上のとき、複数のＲ１６およびＲ１７はそれぞれ同一の基であってもよいし、別々の基であってもよい。）。
【請求項１０】
検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第二の蛋白質（Ｘ）および検体中の分析対象物を特異的に認識し得る酵素標識により修飾された第一の蛋白質（Ｙ）を同時にまたは段階的に作用させ、前記Ｘ、前記分析対象物および前記Ｙの複合体を形成させる工程を含むことを特徴とする請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
【請求項１１】
前記分析対象物が抗原であり、前記分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質が抗体であることを特徴とする請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
【請求項１２】
前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１に記載の免疫学的検出方法。
【請求項１３】
前記分析対象物を特異的に認識し得る前記蛋白質Ｘが不溶性担体に坦持されていることを特徴とする請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
【公開番号】特開２００９−１６８６８１（Ｐ２００９−１６８６８１Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８３６８（Ｐ２００８−８３６８）
【出願日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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