免疫学的測定試薬および免疫学的測定方法
【課題】検出用抗体が遊離型抗原および複合型抗原と等価に反応するような、補助抗体を含む免疫学的測定試薬を提供する。
【解決手段】遊離型抗原に対する反応性が、遊離型抗原と遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体の反応性を等価に補正する補助抗体を含む免疫学的測定試薬であって、補助抗体は遊離型抗原と複合型抗原の両方に結合可能であり、かつ遊離型抗原と補助抗体との反応性が複合型抗原と補助抗体との反応性よりも高く、検出用抗体が加えられた場合に、遊離型抗原と検出用抗体との反応が複合型抗原と検出用抗体との反応よりも強く抑制される。
【解決手段】遊離型抗原に対する反応性が、遊離型抗原と遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体の反応性を等価に補正する補助抗体を含む免疫学的測定試薬であって、補助抗体は遊離型抗原と複合型抗原の両方に結合可能であり、かつ遊離型抗原と補助抗体との反応性が複合型抗原と補助抗体との反応性よりも高く、検出用抗体が加えられた場合に、遊離型抗原と検出用抗体との反応が複合型抗原と検出用抗体との反応よりも強く抑制される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遊離型と複合型の２つの型を有する抗原の測定法に関し、さらに詳しくは補助抗体を用いた免疫学的凝集法および試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中などに存在する蛋白質には、遊離型として単独で存在するものと、別の蛋白質と結合して複合型蛋白質として存在するものがあり、その一例として前立腺特異抗原（以下「ＰＳＡ」と略）がある。
【０００３】
ＰＳＡは、１９７９年にＷａｎｇらによって最初に精製された抗原であり、前立腺上皮細胞より産生される分子量約３４,０００のセリンプロテアーゼである。アミノ酸配列と蛋白質分解酵素の機能に関する研究から、ＰＳＡは、１９６４年に原らにより見出されたγ−セミノプロテインと同一物質であることが明らかとなった。
【０００４】
ＰＳＡの分泌は、男性の前立腺に特異的ではあるが、前立腺癌に特異的というわけではない。たとえば、ＰＳＡの血中濃度は、前立腺肥大症や前立腺炎等の前立腺癌以外の前立腺疾患でも上昇することが報告されている。また、ＰＳＡは、正常な前立腺細胞でも産生され、血液中に浸出する場合がある。
【０００５】
ＰＳＡは、精液という比較的入手しやすい検体からも精製可能であるため、前立腺癌の各種治療の効果判定、治療後の再発・再燃の評価、さらには根治的前立腺全摘除術後の残存腫瘍の早期検出等の、前立腺癌に関連する幅広い用途に対し、非常に有用な指標となりうる。そのためＰＳＡは、従来利用されてきた前立腺酸性ホスファターゼに代わって、前立腺特異的な腫瘍マーカーとして位置付けられている。
【０００６】
健常な成人男子では、血液中のＰＳＡの濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ以下と非常に低濃度である。一方、前立腺疾患患者では、悪性、良性を問わず、血液中のＰＳＡの濃度は、健常な成人男子の数１０倍の濃度となる。前立腺疾患において血清中に放出されたＰＳＡの大部分は、蛋白質分解酵素による組織障害を防ぐ作用のあるα１−アンチキモトリプシン（以下「ＡＣＴ」と略）やα２−マクログロブリン（以下「α２Ｍ」と略）等の蛋白質分解酵素阻害蛋白との複合型として存在している。しかし、ＰＳＡの一部は、非複合型である遊離型ＰＳＡ（以下「Ｆ−ＰＳＡ」と略）として存在しているため、ＡＣＴ複合型であるＰＳＡ(以下「ＰＳＡ−ＡＣＴ」と略)の濃度を測定しただけでは、ＰＳＡの濃度を正確に測定することはできない。
【０００７】
したがって、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの総ＰＳＡの濃度（以下「Ｔ−ＰＳＡ」と略）を正確に測定することが、前立腺疾患の検出等においては非常に重要である。なお、免疫学的に測定される複合型ＰＳＡは、通常ＰＳＡ−ＡＣＴである。α２Ｍと結合しているＰＳＡは、ＰＳＡ抗原全体がα２Ｍで覆われており、抗ＰＳＡ抗体では認識できず、ＰＳＡとして免疫学的に測定することはできないと考えられている。
【０００８】
ＰＳＡの測定法はいくつか開発されているが、免疫放射定量法（以下「ＩＲＭＡ法」と略）や化学発光免疫測定法（以下「ＣＬＩＡ法」と略）等の免疫学的測定法が主流である。現在、Ｔ−ＰＳＡ測定用として、免疫学的測定法を利用した様々なキットが市販されている。しかし、血清中のＴ−ＰＳＡ濃度の測定値がキット間で大きく異なる点が問題とされている。これは、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴのそれぞれに対する試薬の反応性が、キット毎に異なることが主な原因であると考えられている。特に、複合体であるＰＳＡ−ＡＣＴに対する各試薬の反応性の違いが、キット間の測定値のばらつきの原因であると考えられている。また、ＰＳＡ−ＡＣＴに比べてＦ−ＰＳＡの存在比が低くなると、キット間の測定値のばらつきがさらに顕著になると報告されている。
【０００９】
１９９７年以降、血清Ｔ−ＰＳＡの標準化を目指した調査が、日本泌尿器科学会主催で行われている。Ｔ−ＰＳＡの標準化においては、臨床や検診の場で最も問題となる、２０ｎｇ／ｍＬ以下（特に４〜１０ｎｇ／ｍＬのグレーゾーン）の濃度でＴ−ＰＳＡを正確に測定できる試薬キットが要望されている。そのため、Ｔ−ＰＳＡを精度良く測定するために、血清中のＦ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの存在比に関係なく、それぞれに対する反応性が等価（等モル反応）となるような測定法が求められている。
【００１０】
ＩＲＭＡ法やＣＬＩＡ法においては、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴそれぞれに対するモノクローナル抗体を組み合わせることにより、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴが等モルで反応することが報告されている（非特許文献１）。ＩＲＭＡ法やＣＬＩＡ法では、検出用抗体として使用される２つのモノクローナル抗体のうちの一方が、標識抗体として反応液中で自由に動き回れ（自由度が高い）、ＰＳＡ−ＡＣＴとの反応性が高いため、等モル反応が起きやすいと考えられる。
【００１１】
一方、ラテックス粒子等を使用する免疫学的凝集測定法では、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの反応性を等価にすることが困難であるとされてきた。その理由は、免疫学的凝集測定法では、使用される抗体が固相化されており、ＣＬＩＡ法等の場合とは異なり標識抗体の自由度が低いため、検出用抗体とＰＳＡ−ＡＣＴとの反応性が制限されるためであると考えられる。
【００１２】
しかし、免疫学的凝集測定法は検出方法が簡便かつ迅速であるため、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴを等モルで反応できるようにすることのメリットは大きい。そこで、免疫学的凝集測定法において、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの反応性を等価にする方法、またはＦ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの両方の濃度を測定する方法として、幾つかの方法が提案されている。
【００１３】
例えば、Ｆ−ＰＳＡに特異的な（ＰＳＡ−ＡＣＴとは反応しない）補助抗体を試料に添加し、次にＰＳＡに対する検出用抗体を感作した担体を添加する方法が提案されている（特許文献１）。本技術は、ＡＣＴと結合可能なＦ−ＰＳＡの領域に、ある程度分子量の大きい蛋白質（抗体）を結合させ、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの分子量を近づけ、エピトープの数を揃えることで、検出用抗体に対するＦ−ＰＳＡの反応性とＰＳＡ−ＡＣＴの反応性を近づけ、ＰＳＡに対する検出用抗体を感作した担体と、補助抗体が結合したＦ−ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴとを等モル反応で測定する方法であるとされている。
【００１４】
また、Ｆ−ＰＳＡにもＰＳＡ−ＡＣＴにも反応するが互いに競合しない２種のモノクローナル抗体と、Ｆ−ＰＳＡには反応せずＰＳＡ−ＡＣＴには反応するモノクローナル抗体とを別々に不溶性担体に感作し、Ｔ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴを測定する免疫凝集測定法が開示されている（特許文献２）。本技術は、３種類のモノクローナル抗体を感作したラテックスについて、それぞれ特定の２種類を組み合わせて（混合させて）用いることで、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの存在比に影響されることなく測定できる試薬と、複合体のみに特異的な試薬であるとされている。
【００１５】
また、ラテックス等の不溶性担体粒子を使用した免疫学的凝集測定法において、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴに対し、反応性の異なるモノクローナル抗体を利用した測定法およびそれに使用する測定試薬が開示されている（特許文献３）。本技術は、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの両方に反応するが、Ｆ−ＰＳＡより反応が遅いＰＳＡ−ＡＣＴにより強く結合することによって凝集速度を早め、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴが等モル反応となるようにした測定法であるとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００１−３１１７３３号公報
【特許文献２】特開２００１−１０８６８１号公報
【特許文献３】特開２００５−３２６１５０号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｓｔａｍｅｙ ＴＡ「Ｕｒｏｌｏｇｙ」１９９５年、４５巻、２号、Ｐ．１７３−１８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかし、たとえば、特許文献１に係る方法では、必ずしもＦ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴが等モルにならないという問題があった。つまり、特許文献１に習い、Ｆ−ＰＳＡ特異的なモノクローナル抗体を補助抗体として使用しても、検出用抗体に対するＦ−ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴの反応が等価にならない場合があるという問題があった。
【００１９】
また、特許文献２に係る方法では、Ｆ−ＰＳＡに対してもＰＳＡ−ＡＣＴに対しても結合力に違いがない補助抗体が使用されていた。その結果、検出用抗体との反応性が、Ｆ−ＰＳＡの１００％に対し、ＰＳＡ−ＡＣＴでは約８０％しかなく、検出用抗体とＦ−ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴとを、等価に反応させることができないという問題があった。
【００２０】
本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、検出用抗体が遊離型抗原および複合型抗原と等価に反応するような、補助抗体を用いた測定方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記課題を解決するために、本発明のある態様の免疫学的測定試薬は、遊離型抗原に対する反応性が、遊離型抗原と遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体の反応性を等価に補正する補助抗体を含む免疫学的測定試薬であって、補助抗体は遊離型抗原と複合型抗原の両方に結合可能であり、かつ遊離型抗原と補助抗体との反応性が複合型抗原と補助抗体との反応性よりも高く、検出用抗体が加えられた場合に、遊離型抗原と検出用抗体との反応が複合型抗原と検出用抗体との反応よりも強く抑制される。
【００２２】
本発明の別の態様は、免疫学的測定方法である。この方法は、遊離型抗原に対する反応性が、遊離型抗原と遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体の反応性を等価に補正する補助抗体を用いた免疫学的測定方法であって、遊離型抗原とも複合型抗原とも結合し、遊離型抗原との反応性が複合型抗原との反応性よりも高い補助抗体を添加し、続いて検出用抗体を用いて補助抗体を添加後の遊離型抗原と複合型抗原を含む溶液の濃度を測定する場合に、遊離型抗原の濃度の低下率を複合型抗原の濃度の低下率よりも高くした。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、検出用抗体が遊離型抗原および複合型抗原と等価に反応することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、実施の形態に係る免疫学的測定試薬および免疫学的測定方法について説明する。
【００２５】
本実施形態は、抗原が、遊離型と複合型の２つの型を有する場合に、（１）まず補助抗体を含む第１試薬を抗原に加えることによって、遊離型抗原と複合型抗原の検出用抗体に対する反応性を等価にし、（２）次いで検出用抗体を含む第２試薬を加え、免疫学的測定法により抗原の総量を測定する技術に関する発明である。つまり、本実施形態の免疫学的測定試薬は、測定対象物である抗原と結合する抗体として、遊離型抗原と複合型抗原の反応性を等価に補正する抗体である補助抗体と、その後に抗原の濃度の測定のために用いられる検出用抗体の２種類の抗体とを含む。
【００２６】
本実施形態の補助抗体は、遊離型抗原に対する反応性が、遊離型抗原と遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体の反応性を等価に補正する抗体である。また、補助抗体は、遊離型抗原と複合型抗原の両方に結合可能であり、かつ遊離型抗原と補助抗体との反応性が複合型抗原と補助抗体との反応性よりも高い。その結果、検出用抗体が加えられた場合に、遊離型抗原と検出用抗体との反応が複合型抗原と検出用抗体との反応よりも強く抑制される。これにより、遊離型抗原および複合型抗原が、検出用抗体と等モルで反応するように補正することができる。補助抗体はモノクローナル抗体であることが望ましい。
【００２７】
本実施形態の免疫学的測定試薬は、上記の補助抗体を含む試薬であり、補助抗体を含む第１試薬に限られず、第１試薬および第２試薬を含む試薬もしくは免疫学的測定用キットであってもよい。
【００２８】
検出用抗体は、抗原の濃度測定のために用いられる、第２試薬に含まれる抗体である。検出用抗体は、不溶性担体粒子に感作された状態で使用される。検出用抗体は、複合型抗原と反応するポリクローナル抗体であるか、または異なるエピトープを認識し、かつ遊離型抗原および複合型抗原の両方に結合する２種類以上のモノクローナル抗体である。
【００２９】
本実施形態では、より具体的には、測定対象物である抗原は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）である。ＰＳＡは、遊離型（Ｆ−ＰＳＡ）および複合型（ＰＳＡ−ＡＣＴ）として生体中に存在する。
【００３０】
本実施形態に係るモノクローナル抗体は、公知の方法によって得ることができる。本実施形態に係るモノクローナル抗体は、公知の方法によって得ることができる。すなわち、マウスをポリクローナル抗体の免疫操作と同様に免疫し、抗体価の上昇を確認したところで、抗体産生細胞を回収する。回収した抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合を行った後に、抗体を産生する不死化した細胞を選択培地によって選択する。こうして得られたハイブリドーマから、目的の抗原と反応する抗体を産生している細胞をスクリーニングし、クローニングして抗体産生株として樹立する。得られた抗体産生株をマウスの腹腔に接種して培養し、腹水としてモノクローナル抗体を得る。なお、マウスにかえて、ラット等の免疫動物を用いてもよい。また、ミエローマとの細胞融合でハイブリドーマを作製するのにかえて、Ｂ細胞をＥＢＶトランスフォーム等により形質転換させ不死化してもよい。また、モノクローナル抗体の作製は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体産生株を大量に培養することによって行ってもよい。
【００３１】
本実施形態に係る検出用の抗体を感作する不溶性担体粒子としては、ラテックス粒子が好適である。ラテックス粒子は、様々な免疫化学項目の測定ができる専用型自動分析装置、および生化学活性等も測定が可能な汎用型自動分析装置で使用するのに適している。ラテックス粒子の材質としては、ポリスチレン、スチレン―ブタジエン重合体等が挙げられる。免疫学的凝集測定法で汎用されているポリスチレン製が材質として特に好ましいが、抗体感作に適していればポリスチレン製のラテックス粒子に限定されない。また、ラテックス粒子の粒子径は、不溶性担体粒子として通常使用されている５０〜７００ｎｍが好ましい。ラテックス粒子の粒子径は均一であってもよく、また異なる粒子径を有するラテックス粒子が混合されていてもよい。
【００３２】
ラテックス粒子への抗体の感作は、公知の技術を利用して実施できる。通常は、ポリスチレンの表面は疎水性であるため、ラテックス表面への物理的吸着で抗体の感作が可能である。また、表面にアミノ基やカルボキシル基を有するラテックス粒子を用いる場合、グルタルアルデヒド、カルボジイミド試薬を使用した化学的結合によって、ラテックス粒子表面に抗体を結合させてもよい。
【００３３】
（測定方法）
ここで、本実施形態の免疫学的測定方法について説明する。本実施形態の免疫学的測定方法は、遊離型抗原に対する反応性が、遊離型抗原と遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体の反応性を等価に補正する補助抗体を用い、遊離型抗原とも複合型抗原とも結合し、遊離型抗原との反応性が複合型抗原との反応性よりも高い補助抗体を添加し、続いて検出用抗体を用いて補助抗体を添加後の遊離型抗原と複合型抗原を含む溶液の濃度を測定する方法である。本実施形態の免疫学的測定方法では、遊離型抗原の濃度の低下率は、複合型抗原の濃度の低下率よりも高くなっている。
【００３４】
本実施形態では、測定対象物である抗原は、ＰＳＡである。ＰＳＡは、遊離型（Ｆ−ＰＳＡ）および複合型（ＰＳＡ−ＡＣＴ）として生体中に存在する。また、補助抗体はモノクローナル抗体であることが望ましい。
【００３５】
本実施形態では、抗原の濃度測定方法として免疫学的凝集測定法を用いたが、抗原の濃度測定は、公知の操作方法により行うことができる。例えば、抗原の濃度測定に光学的測定法を用いる場合、血清等の生体試料と、担体粒子に感作させた抗体とを反応させ、エンドポイント法またはレート法により、透過光や散乱光による吸光度を測定し、濃度を算出することができる。
【００３６】
本実施形態では、補助抗体を用いた補正により、抗原−補助抗体の複合体と検出用抗体との反応性が、遊離型抗原と検出用抗体との反応性と等価になることが特徴である。抗原がＰＳＡである場合、本反応のメカニズムとしては、例えば以下のものが想定される。
【００３７】
Ｆ−ＰＳＡの分子量は約３４，０００であるが、ＩｇＧである補助抗体および検出用抗体の分子量は共に約１５０，０００であり、Ｆ−ＰＳＡの分子量よりもＩｇＧの分子量は４倍以上と非常に大きい。そのため、補助抗体がＦ−ＰＳＡに結合すると、Ｆ−ＰＳＡのエピトープ部位の大部分が補助抗体との結合により覆われてしまうと考えられる。また、補助抗体との結合に関与していないエピトープ部位についても、立体障害により、検出用抗体がＦ−ＰＳＡと補助抗体の複合体（以下「補正後Ｆ−ＰＳＡ」と略）に接近しにくくなる可能性がある。以上の理由により、補助抗体を加えない場合に比べ、検出用抗体と補正後Ｆ−ＰＳＡとの反応性が大幅に低下するものと考えられる。
【００３８】
一方、ＰＳＡ−ＡＣＴでは、ＰＳＡのエピトープ部位の多くは、ＡＣＴとの結合により覆われている。また、ＡＣＴにより覆われていないエピトープ部位であっても、立体障害により、ＰＳＡ−ＡＣＴと補助抗体が結合できないか、または弱い結合しか形成できない可能性がある。そのため補助抗体は、ＡＣＴに覆われておらず、かつ立体障害も起こらないエピトープ部位でしかＰＳＡ−ＡＣＴとの複合体（以下「補正後ＰＳＡ−ＡＣＴ」と略）を形成できないと考えられる。以上の理由により、検出用抗体と補正後ＰＳＡ−ＡＣＴとの反応性は、補助抗体を加えない場合と比べて、それほど大きく低下しないと考えられる。
【００３９】
以上のように、本実施形態の補助抗体を用いれば、検出用抗体が補正後Ｆ−ＰＳＡおよび補正後ＰＳＡ−ＡＣＴと結合できる部位を、補正後Ｆ−ＰＳＡおよび補正後ＰＳＡ−ＡＣＴの両方において検出用抗体が立体障害を受けることなく結合可能な部位のみに制限することができる。これにより、検出用抗体が、補正後Ｆ−ＰＳＡとも補正後ＰＳＡ−ＡＣＴとも等価に反応するようになると考えられる。
【００４０】
本実施形態は、遊離型抗原と複合型抗原の反応性を、立体障害も考慮しつつ補正することにより、遊離型抗原と複合型抗原の反応性を等価にする技術を開示するものである。つまり、本発明の技術思想は、抗原がＰＳＡである場合に限定されず、抗原が遊離型と複合型として存在する場合であれば、あらゆる免疫学的測定に応用可能である。
【００４１】
なお、例えば引用文献１に係る発明では、遊離型に特異的な補助抗体を使用しているが、検出用抗体と補正後ＰＳＡ−ＡＣＴの反応において、立体障害による影響を考慮していなかった。したがって、補助抗体として用いるモノクローナル抗体のロットや実験条件によっては、検出用抗体と、補正後Ｆ−ＰＳＡおよび補正後ＰＳＡ−ＡＣＴの反応性を等価にできない場合があった。
【００４２】
一方、本実施形態では、補助抗体を用い、立体障害も考慮しつつ、遊離型抗原だけではなく複合型抗原のエピトープ部位の反応性をも補正するものである。つまり、本実施形態は、引用文献１等に係る発明とは技術思想を異にするものである。本実施形態では、遊離型抗原と複合型抗原の反応性が、条件に左右されず等価になる。さらに、両ＰＳＡ抗原の存在比や濃度に左右されることなく、等モル反応が起きるものと考えられる。
【００４３】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではなく、当業者の知識に基づいて各種の設計変更等の変形を加えることも可能である。
【００４４】
（実験１．補助抗体の取得）
Ｆ−ＰＳＡとの反応性がＰＳＡ−ＡＣＴとの反応性よりも強い補助抗体の取得を行った。本実施例では、まず以下の手順により、Ｆ−ＰＳＡに対するモノクローナル抗体（補助抗体）を得た。
【００４５】
ポリクローナル抗体の免疫操作と同様にマウスを免疫し、抗体価の上昇を確認したところで、その抗体産生細胞を回収した。回収した抗体産生細胞を、マウスミエローマ細胞との細胞融合により、ハイブリドーマとした。これを抗体産生能に基づきスクリーニングし、更に必要な活性を持つ抗体を産生する株をクローニングし、抗体産生株を樹立した。抗体産生株をマウスの腹腔に接種して培養し、腹水としてモノクローナル抗体を得た。
【００４６】
次に、得られたＰＳＡに対するモノクローナル抗体（補助抗体）から、Ｆ−ＰＳＡとの反応性がＰＳＡ−ＡＣＴとの反応性よりも強い補助抗体を選別した。本実施形態では、二抗体法（ＲＩＡ）により抗体力価の測定を行うことにより、抗ＰＳＡモノクローナル抗体の抗原に対する結合力を測定した。具体的には、以下の手順により、測定を行った。
【００４７】
試験管に、得られた補助抗体であるモノクローナル抗体を含む第１試薬（１ｍｇ／Ｌ）０．０１ｍＬと、１２５Ｉで標識した各抗原（Ｆ−ＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ）０．２ｍＬとを加えて混和した後、静置（２時間、室温）した。次に、検出用抗体として抗マウスＩｇＧ抗体を含む第２試薬を０．１ｍＬ加えて混和した後、静置（３０分間、４℃）した。遠心（３，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）後、上清を吸引し、沈殿の放射能量を測定した。沈殿の放射能量の、試験管に加えた標識体の総放射能量に対する比率（％）を算出し、抗体力価とした。
【００４８】
本実施例の実験結果を表１に示す。Ｆ−ＰＳＡとの反応性は強いがＰＳＡ−ＡＣＴとも弱く反応する補助抗体として、抗体Ｌｏｔ Ｎｏ．ＰＡ０５（以下「実施例」とする）が得られた。一方、Ｆ−ＰＳＡに特異的な補助抗体として得られた抗体Ｌｏｔ Ｎｏ．ＰＡ０８（以下「比較例１」とする）も、比較のために示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
本実験においては、抗体（補助抗体）の抗原に対する反応性を、抗体力価の値（％）に基づき、以下の４段階に分類した。
４０％以上（強く反応する場合）： ＋＋＋
２０〜４０％（中程度に反応する場合）：＋＋
５〜２０％（弱く反応する場合）： ＋
５％未満（全く反応しない場合）： −
【００５１】
Ｆ−ＰＳＡとの反応においては、実施例、比較例１の抗体とも反応性が「＋＋＋」であり、非常に高い抗体力価を示した。一方、ＰＳＡ-ＡＣＴに対する比較例１の抗体の反応性は「−」であり、抗体を加えない対照実験の抗体力価と同程度であった。また、実施例の抗体のＰＳＡ−ＡＣＴに対する反応性は「＋」であり、バックグランドよりは３倍以上高かったが、実施例の抗体のＦ−ＰＳＡに対する反応性の１／５程度であった。
【００５２】
（実験２．補助抗体を用いた免疫学的測定）
実験１で得られた、Ｆ−ＰＳＡと強く反応しＰＳＡ−ＡＣＴとも弱く反応する実施例の抗体（ＰＡ０５）を補助抗体として使用した。また、Ｆ−ＰＳＡに特異的な補助抗体である比較例１の抗体（ＰＡ０８）も、比較のために使用した。これらの補助抗体を補正用の第１試薬に添加し、Ｆ−ＰＳＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＰＳＡ−ＡＣＴ（１０ｎｇ／ｍＬ）の各抗原と反応させた。次に、２つの抗ＰＳＡモノクローナル抗体（検出用抗体）を感作したラテックス試薬である測定用の第２試薬を用いて、生化学自動分析装置でＦ−ＰＳＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＰＳＡ−ＡＣＴ（１０ｎｇ／ｍＬ）の濃度を測定した。対照として、補助抗体が添加されていない第１試薬に関しても測定を行い（比較例２）、それらの測定値を比較した。
【００５３】
実施例および比較例１、２の測定結果を表２に示す。補助抗体を未添加の場合（比較例２）、検出用抗体のＦ−ＰＳＡに対する反応性（以下「反応性（１）」と略）が、検出用抗体のＰＳＡ―ＡＣＴに対する反応性（以下「反応性（２）」と略）より高く、等価な反応性を示さなかった。
【００５４】
また、第１試薬に比較例１の補助抗体（ＰＡ０８）を添加した場合、反応性（１）、反応性（２）の値とも、補助抗体を未添加の場合よりいずれもわずかに高く、その結果、反応性（１）／反応性（２）比は補助抗体を未添加の場合（比較例２）とほぼ同程度となった。
【００５５】
一方、第１試薬に実施例の補助抗体（ＰＡ０５）を添加した場合、反応性（２）は補助抗体を未添加の場合（比較例２）および比較例１の補助抗体を添加した場合よりわずかに高かったが、補助抗体を未添加の場合（比較例２）および比較例１の補助抗体を添加した場合よりも反応性（１）が低い値を示した。その結果、反応性（１）／反応性（２）比は１．００となった。
【００５６】
第１試薬に補助抗体を未添加の場合（比較例２）との比較から、Ｆ−ＰＳＡを特異的に補正する補助抗体（ＰＡ０８）を補助抗体として用いた場合（比較例１）、検出用抗原に対するＦ−ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴの反応性を等価にできなかった。一方、補助抗体を未添加の場合（比較例２）および補助抗体を添加した場合（比較例１）との比較から、実施例の補助抗体（ＰＡ０５）を用いた場合（実施例）、Ｆ−ＰＳＡと検出用抗体の反応性を抑制することにより、ＰＡ０５およびＦ−ＰＳＡと、ＰＡ０５およびＰＳＡ−ＡＣＴとの反応性が等価になることが確認された。
【００５７】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遊離型と複合型の２つの型を有する抗原の測定法に関し、さらに詳しくは補助抗体を用いた免疫学的凝集法および試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中などに存在する蛋白質には、遊離型として単独で存在するものと、別の蛋白質と結合して複合型蛋白質として存在するものがあり、その一例として前立腺特異抗原（以下「ＰＳＡ」と略）がある。
【０００３】
ＰＳＡは、１９７９年にＷａｎｇらによって最初に精製された抗原であり、前立腺上皮細胞より産生される分子量約３４,０００のセリンプロテアーゼである。アミノ酸配列と蛋白質分解酵素の機能に関する研究から、ＰＳＡは、１９６４年に原らにより見出されたγ−セミノプロテインと同一物質であることが明らかとなった。
【０００４】
ＰＳＡの分泌は、男性の前立腺に特異的ではあるが、前立腺癌に特異的というわけではない。たとえば、ＰＳＡの血中濃度は、前立腺肥大症や前立腺炎等の前立腺癌以外の前立腺疾患でも上昇することが報告されている。また、ＰＳＡは、正常な前立腺細胞でも産生され、血液中に浸出する場合がある。
【０００５】
ＰＳＡは、精液という比較的入手しやすい検体からも精製可能であるため、前立腺癌の各種治療の効果判定、治療後の再発・再燃の評価、さらには根治的前立腺全摘除術後の残存腫瘍の早期検出等の、前立腺癌に関連する幅広い用途に対し、非常に有用な指標となりうる。そのためＰＳＡは、従来利用されてきた前立腺酸性ホスファターゼに代わって、前立腺特異的な腫瘍マーカーとして位置付けられている。
【０００６】
健常な成人男子では、血液中のＰＳＡの濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ以下と非常に低濃度である。一方、前立腺疾患患者では、悪性、良性を問わず、血液中のＰＳＡの濃度は、健常な成人男子の数１０倍の濃度となる。前立腺疾患において血清中に放出されたＰＳＡの大部分は、蛋白質分解酵素による組織障害を防ぐ作用のあるα１−アンチキモトリプシン（以下「ＡＣＴ」と略）やα２−マクログロブリン（以下「α２Ｍ」と略）等の蛋白質分解酵素阻害蛋白との複合型として存在している。しかし、ＰＳＡの一部は、非複合型である遊離型ＰＳＡ（以下「Ｆ−ＰＳＡ」と略）として存在しているため、ＡＣＴ複合型であるＰＳＡ(以下「ＰＳＡ−ＡＣＴ」と略)の濃度を測定しただけでは、ＰＳＡの濃度を正確に測定することはできない。
【０００７】
したがって、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの総ＰＳＡの濃度（以下「Ｔ−ＰＳＡ」と略）を正確に測定することが、前立腺疾患の検出等においては非常に重要である。なお、免疫学的に測定される複合型ＰＳＡは、通常ＰＳＡ−ＡＣＴである。α２Ｍと結合しているＰＳＡは、ＰＳＡ抗原全体がα２Ｍで覆われており、抗ＰＳＡ抗体では認識できず、ＰＳＡとして免疫学的に測定することはできないと考えられている。
【０００８】
ＰＳＡの測定法はいくつか開発されているが、免疫放射定量法（以下「ＩＲＭＡ法」と略）や化学発光免疫測定法（以下「ＣＬＩＡ法」と略）等の免疫学的測定法が主流である。現在、Ｔ−ＰＳＡ測定用として、免疫学的測定法を利用した様々なキットが市販されている。しかし、血清中のＴ−ＰＳＡ濃度の測定値がキット間で大きく異なる点が問題とされている。これは、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴのそれぞれに対する試薬の反応性が、キット毎に異なることが主な原因であると考えられている。特に、複合体であるＰＳＡ−ＡＣＴに対する各試薬の反応性の違いが、キット間の測定値のばらつきの原因であると考えられている。また、ＰＳＡ−ＡＣＴに比べてＦ−ＰＳＡの存在比が低くなると、キット間の測定値のばらつきがさらに顕著になると報告されている。
【０００９】
１９９７年以降、血清Ｔ−ＰＳＡの標準化を目指した調査が、日本泌尿器科学会主催で行われている。Ｔ−ＰＳＡの標準化においては、臨床や検診の場で最も問題となる、２０ｎｇ／ｍＬ以下（特に４〜１０ｎｇ／ｍＬのグレーゾーン）の濃度でＴ−ＰＳＡを正確に測定できる試薬キットが要望されている。そのため、Ｔ−ＰＳＡを精度良く測定するために、血清中のＦ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの存在比に関係なく、それぞれに対する反応性が等価（等モル反応）となるような測定法が求められている。
【００１０】
ＩＲＭＡ法やＣＬＩＡ法においては、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴそれぞれに対するモノクローナル抗体を組み合わせることにより、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴが等モルで反応することが報告されている（非特許文献１）。ＩＲＭＡ法やＣＬＩＡ法では、検出用抗体として使用される２つのモノクローナル抗体のうちの一方が、標識抗体として反応液中で自由に動き回れ（自由度が高い）、ＰＳＡ−ＡＣＴとの反応性が高いため、等モル反応が起きやすいと考えられる。
【００１１】
一方、ラテックス粒子等を使用する免疫学的凝集測定法では、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの反応性を等価にすることが困難であるとされてきた。その理由は、免疫学的凝集測定法では、使用される抗体が固相化されており、ＣＬＩＡ法等の場合とは異なり標識抗体の自由度が低いため、検出用抗体とＰＳＡ−ＡＣＴとの反応性が制限されるためであると考えられる。
【００１２】
しかし、免疫学的凝集測定法は検出方法が簡便かつ迅速であるため、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴを等モルで反応できるようにすることのメリットは大きい。そこで、免疫学的凝集測定法において、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの反応性を等価にする方法、またはＦ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの両方の濃度を測定する方法として、幾つかの方法が提案されている。
【００１３】
例えば、Ｆ−ＰＳＡに特異的な（ＰＳＡ−ＡＣＴとは反応しない）補助抗体を試料に添加し、次にＰＳＡに対する検出用抗体を感作した担体を添加する方法が提案されている（特許文献１）。本技術は、ＡＣＴと結合可能なＦ−ＰＳＡの領域に、ある程度分子量の大きい蛋白質（抗体）を結合させ、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの分子量を近づけ、エピトープの数を揃えることで、検出用抗体に対するＦ−ＰＳＡの反応性とＰＳＡ−ＡＣＴの反応性を近づけ、ＰＳＡに対する検出用抗体を感作した担体と、補助抗体が結合したＦ−ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴとを等モル反応で測定する方法であるとされている。
【００１４】
また、Ｆ−ＰＳＡにもＰＳＡ−ＡＣＴにも反応するが互いに競合しない２種のモノクローナル抗体と、Ｆ−ＰＳＡには反応せずＰＳＡ−ＡＣＴには反応するモノクローナル抗体とを別々に不溶性担体に感作し、Ｔ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴを測定する免疫凝集測定法が開示されている（特許文献２）。本技術は、３種類のモノクローナル抗体を感作したラテックスについて、それぞれ特定の２種類を組み合わせて（混合させて）用いることで、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの存在比に影響されることなく測定できる試薬と、複合体のみに特異的な試薬であるとされている。
【００１５】
また、ラテックス等の不溶性担体粒子を使用した免疫学的凝集測定法において、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴに対し、反応性の異なるモノクローナル抗体を利用した測定法およびそれに使用する測定試薬が開示されている（特許文献３）。本技術は、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴの両方に反応するが、Ｆ−ＰＳＡより反応が遅いＰＳＡ−ＡＣＴにより強く結合することによって凝集速度を早め、Ｆ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴが等モル反応となるようにした測定法であるとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００１−３１１７３３号公報
【特許文献２】特開２００１−１０８６８１号公報
【特許文献３】特開２００５−３２６１５０号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｓｔａｍｅｙ ＴＡ「Ｕｒｏｌｏｇｙ」１９９５年、４５巻、２号、Ｐ．１７３−１８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかし、たとえば、特許文献１に係る方法では、必ずしもＦ−ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴが等モルにならないという問題があった。つまり、特許文献１に習い、Ｆ−ＰＳＡ特異的なモノクローナル抗体を補助抗体として使用しても、検出用抗体に対するＦ−ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴの反応が等価にならない場合があるという問題があった。
【００１９】
また、特許文献２に係る方法では、Ｆ−ＰＳＡに対してもＰＳＡ−ＡＣＴに対しても結合力に違いがない補助抗体が使用されていた。その結果、検出用抗体との反応性が、Ｆ−ＰＳＡの１００％に対し、ＰＳＡ−ＡＣＴでは約８０％しかなく、検出用抗体とＦ−ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴとを、等価に反応させることができないという問題があった。
【００２０】
本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、検出用抗体が遊離型抗原および複合型抗原と等価に反応するような、補助抗体を用いた測定方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記課題を解決するために、本発明のある態様の免疫学的測定試薬は、遊離型抗原に対する反応性が、遊離型抗原と遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体の反応性を等価に補正する補助抗体を含む免疫学的測定試薬であって、補助抗体は遊離型抗原と複合型抗原の両方に結合可能であり、かつ遊離型抗原と補助抗体との反応性が複合型抗原と補助抗体との反応性よりも高く、検出用抗体が加えられた場合に、遊離型抗原と検出用抗体との反応が複合型抗原と検出用抗体との反応よりも強く抑制される。
【００２２】
本発明の別の態様は、免疫学的測定方法である。この方法は、遊離型抗原に対する反応性が、遊離型抗原と遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体の反応性を等価に補正する補助抗体を用いた免疫学的測定方法であって、遊離型抗原とも複合型抗原とも結合し、遊離型抗原との反応性が複合型抗原との反応性よりも高い補助抗体を添加し、続いて検出用抗体を用いて補助抗体を添加後の遊離型抗原と複合型抗原を含む溶液の濃度を測定する場合に、遊離型抗原の濃度の低下率を複合型抗原の濃度の低下率よりも高くした。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、検出用抗体が遊離型抗原および複合型抗原と等価に反応することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、実施の形態に係る免疫学的測定試薬および免疫学的測定方法について説明する。
【００２５】
本実施形態は、抗原が、遊離型と複合型の２つの型を有する場合に、（１）まず補助抗体を含む第１試薬を抗原に加えることによって、遊離型抗原と複合型抗原の検出用抗体に対する反応性を等価にし、（２）次いで検出用抗体を含む第２試薬を加え、免疫学的測定法により抗原の総量を測定する技術に関する発明である。つまり、本実施形態の免疫学的測定試薬は、測定対象物である抗原と結合する抗体として、遊離型抗原と複合型抗原の反応性を等価に補正する抗体である補助抗体と、その後に抗原の濃度の測定のために用いられる検出用抗体の２種類の抗体とを含む。
【００２６】
本実施形態の補助抗体は、遊離型抗原に対する反応性が、遊離型抗原と遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体の反応性を等価に補正する抗体である。また、補助抗体は、遊離型抗原と複合型抗原の両方に結合可能であり、かつ遊離型抗原と補助抗体との反応性が複合型抗原と補助抗体との反応性よりも高い。その結果、検出用抗体が加えられた場合に、遊離型抗原と検出用抗体との反応が複合型抗原と検出用抗体との反応よりも強く抑制される。これにより、遊離型抗原および複合型抗原が、検出用抗体と等モルで反応するように補正することができる。補助抗体はモノクローナル抗体であることが望ましい。
【００２７】
本実施形態の免疫学的測定試薬は、上記の補助抗体を含む試薬であり、補助抗体を含む第１試薬に限られず、第１試薬および第２試薬を含む試薬もしくは免疫学的測定用キットであってもよい。
【００２８】
検出用抗体は、抗原の濃度測定のために用いられる、第２試薬に含まれる抗体である。検出用抗体は、不溶性担体粒子に感作された状態で使用される。検出用抗体は、複合型抗原と反応するポリクローナル抗体であるか、または異なるエピトープを認識し、かつ遊離型抗原および複合型抗原の両方に結合する２種類以上のモノクローナル抗体である。
【００２９】
本実施形態では、より具体的には、測定対象物である抗原は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）である。ＰＳＡは、遊離型（Ｆ−ＰＳＡ）および複合型（ＰＳＡ−ＡＣＴ）として生体中に存在する。
【００３０】
本実施形態に係るモノクローナル抗体は、公知の方法によって得ることができる。本実施形態に係るモノクローナル抗体は、公知の方法によって得ることができる。すなわち、マウスをポリクローナル抗体の免疫操作と同様に免疫し、抗体価の上昇を確認したところで、抗体産生細胞を回収する。回収した抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合を行った後に、抗体を産生する不死化した細胞を選択培地によって選択する。こうして得られたハイブリドーマから、目的の抗原と反応する抗体を産生している細胞をスクリーニングし、クローニングして抗体産生株として樹立する。得られた抗体産生株をマウスの腹腔に接種して培養し、腹水としてモノクローナル抗体を得る。なお、マウスにかえて、ラット等の免疫動物を用いてもよい。また、ミエローマとの細胞融合でハイブリドーマを作製するのにかえて、Ｂ細胞をＥＢＶトランスフォーム等により形質転換させ不死化してもよい。また、モノクローナル抗体の作製は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体産生株を大量に培養することによって行ってもよい。
【００３１】
本実施形態に係る検出用の抗体を感作する不溶性担体粒子としては、ラテックス粒子が好適である。ラテックス粒子は、様々な免疫化学項目の測定ができる専用型自動分析装置、および生化学活性等も測定が可能な汎用型自動分析装置で使用するのに適している。ラテックス粒子の材質としては、ポリスチレン、スチレン―ブタジエン重合体等が挙げられる。免疫学的凝集測定法で汎用されているポリスチレン製が材質として特に好ましいが、抗体感作に適していればポリスチレン製のラテックス粒子に限定されない。また、ラテックス粒子の粒子径は、不溶性担体粒子として通常使用されている５０〜７００ｎｍが好ましい。ラテックス粒子の粒子径は均一であってもよく、また異なる粒子径を有するラテックス粒子が混合されていてもよい。
【００３２】
ラテックス粒子への抗体の感作は、公知の技術を利用して実施できる。通常は、ポリスチレンの表面は疎水性であるため、ラテックス表面への物理的吸着で抗体の感作が可能である。また、表面にアミノ基やカルボキシル基を有するラテックス粒子を用いる場合、グルタルアルデヒド、カルボジイミド試薬を使用した化学的結合によって、ラテックス粒子表面に抗体を結合させてもよい。
【００３３】
（測定方法）
ここで、本実施形態の免疫学的測定方法について説明する。本実施形態の免疫学的測定方法は、遊離型抗原に対する反応性が、遊離型抗原と遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体の反応性を等価に補正する補助抗体を用い、遊離型抗原とも複合型抗原とも結合し、遊離型抗原との反応性が複合型抗原との反応性よりも高い補助抗体を添加し、続いて検出用抗体を用いて補助抗体を添加後の遊離型抗原と複合型抗原を含む溶液の濃度を測定する方法である。本実施形態の免疫学的測定方法では、遊離型抗原の濃度の低下率は、複合型抗原の濃度の低下率よりも高くなっている。
【００３４】
本実施形態では、測定対象物である抗原は、ＰＳＡである。ＰＳＡは、遊離型（Ｆ−ＰＳＡ）および複合型（ＰＳＡ−ＡＣＴ）として生体中に存在する。また、補助抗体はモノクローナル抗体であることが望ましい。
【００３５】
本実施形態では、抗原の濃度測定方法として免疫学的凝集測定法を用いたが、抗原の濃度測定は、公知の操作方法により行うことができる。例えば、抗原の濃度測定に光学的測定法を用いる場合、血清等の生体試料と、担体粒子に感作させた抗体とを反応させ、エンドポイント法またはレート法により、透過光や散乱光による吸光度を測定し、濃度を算出することができる。
【００３６】
本実施形態では、補助抗体を用いた補正により、抗原−補助抗体の複合体と検出用抗体との反応性が、遊離型抗原と検出用抗体との反応性と等価になることが特徴である。抗原がＰＳＡである場合、本反応のメカニズムとしては、例えば以下のものが想定される。
【００３７】
Ｆ−ＰＳＡの分子量は約３４，０００であるが、ＩｇＧである補助抗体および検出用抗体の分子量は共に約１５０，０００であり、Ｆ−ＰＳＡの分子量よりもＩｇＧの分子量は４倍以上と非常に大きい。そのため、補助抗体がＦ−ＰＳＡに結合すると、Ｆ−ＰＳＡのエピトープ部位の大部分が補助抗体との結合により覆われてしまうと考えられる。また、補助抗体との結合に関与していないエピトープ部位についても、立体障害により、検出用抗体がＦ−ＰＳＡと補助抗体の複合体（以下「補正後Ｆ−ＰＳＡ」と略）に接近しにくくなる可能性がある。以上の理由により、補助抗体を加えない場合に比べ、検出用抗体と補正後Ｆ−ＰＳＡとの反応性が大幅に低下するものと考えられる。
【００３８】
一方、ＰＳＡ−ＡＣＴでは、ＰＳＡのエピトープ部位の多くは、ＡＣＴとの結合により覆われている。また、ＡＣＴにより覆われていないエピトープ部位であっても、立体障害により、ＰＳＡ−ＡＣＴと補助抗体が結合できないか、または弱い結合しか形成できない可能性がある。そのため補助抗体は、ＡＣＴに覆われておらず、かつ立体障害も起こらないエピトープ部位でしかＰＳＡ−ＡＣＴとの複合体（以下「補正後ＰＳＡ−ＡＣＴ」と略）を形成できないと考えられる。以上の理由により、検出用抗体と補正後ＰＳＡ−ＡＣＴとの反応性は、補助抗体を加えない場合と比べて、それほど大きく低下しないと考えられる。
【００３９】
以上のように、本実施形態の補助抗体を用いれば、検出用抗体が補正後Ｆ−ＰＳＡおよび補正後ＰＳＡ−ＡＣＴと結合できる部位を、補正後Ｆ−ＰＳＡおよび補正後ＰＳＡ−ＡＣＴの両方において検出用抗体が立体障害を受けることなく結合可能な部位のみに制限することができる。これにより、検出用抗体が、補正後Ｆ−ＰＳＡとも補正後ＰＳＡ−ＡＣＴとも等価に反応するようになると考えられる。
【００４０】
本実施形態は、遊離型抗原と複合型抗原の反応性を、立体障害も考慮しつつ補正することにより、遊離型抗原と複合型抗原の反応性を等価にする技術を開示するものである。つまり、本発明の技術思想は、抗原がＰＳＡである場合に限定されず、抗原が遊離型と複合型として存在する場合であれば、あらゆる免疫学的測定に応用可能である。
【００４１】
なお、例えば引用文献１に係る発明では、遊離型に特異的な補助抗体を使用しているが、検出用抗体と補正後ＰＳＡ−ＡＣＴの反応において、立体障害による影響を考慮していなかった。したがって、補助抗体として用いるモノクローナル抗体のロットや実験条件によっては、検出用抗体と、補正後Ｆ−ＰＳＡおよび補正後ＰＳＡ−ＡＣＴの反応性を等価にできない場合があった。
【００４２】
一方、本実施形態では、補助抗体を用い、立体障害も考慮しつつ、遊離型抗原だけではなく複合型抗原のエピトープ部位の反応性をも補正するものである。つまり、本実施形態は、引用文献１等に係る発明とは技術思想を異にするものである。本実施形態では、遊離型抗原と複合型抗原の反応性が、条件に左右されず等価になる。さらに、両ＰＳＡ抗原の存在比や濃度に左右されることなく、等モル反応が起きるものと考えられる。
【００４３】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではなく、当業者の知識に基づいて各種の設計変更等の変形を加えることも可能である。
【００４４】
（実験１．補助抗体の取得）
Ｆ−ＰＳＡとの反応性がＰＳＡ−ＡＣＴとの反応性よりも強い補助抗体の取得を行った。本実施例では、まず以下の手順により、Ｆ−ＰＳＡに対するモノクローナル抗体（補助抗体）を得た。
【００４５】
ポリクローナル抗体の免疫操作と同様にマウスを免疫し、抗体価の上昇を確認したところで、その抗体産生細胞を回収した。回収した抗体産生細胞を、マウスミエローマ細胞との細胞融合により、ハイブリドーマとした。これを抗体産生能に基づきスクリーニングし、更に必要な活性を持つ抗体を産生する株をクローニングし、抗体産生株を樹立した。抗体産生株をマウスの腹腔に接種して培養し、腹水としてモノクローナル抗体を得た。
【００４６】
次に、得られたＰＳＡに対するモノクローナル抗体（補助抗体）から、Ｆ−ＰＳＡとの反応性がＰＳＡ−ＡＣＴとの反応性よりも強い補助抗体を選別した。本実施形態では、二抗体法（ＲＩＡ）により抗体力価の測定を行うことにより、抗ＰＳＡモノクローナル抗体の抗原に対する結合力を測定した。具体的には、以下の手順により、測定を行った。
【００４７】
試験管に、得られた補助抗体であるモノクローナル抗体を含む第１試薬（１ｍｇ／Ｌ）０．０１ｍＬと、１２５Ｉで標識した各抗原（Ｆ−ＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ）０．２ｍＬとを加えて混和した後、静置（２時間、室温）した。次に、検出用抗体として抗マウスＩｇＧ抗体を含む第２試薬を０．１ｍＬ加えて混和した後、静置（３０分間、４℃）した。遠心（３，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）後、上清を吸引し、沈殿の放射能量を測定した。沈殿の放射能量の、試験管に加えた標識体の総放射能量に対する比率（％）を算出し、抗体力価とした。
【００４８】
本実施例の実験結果を表１に示す。Ｆ−ＰＳＡとの反応性は強いがＰＳＡ−ＡＣＴとも弱く反応する補助抗体として、抗体Ｌｏｔ Ｎｏ．ＰＡ０５（以下「実施例」とする）が得られた。一方、Ｆ−ＰＳＡに特異的な補助抗体として得られた抗体Ｌｏｔ Ｎｏ．ＰＡ０８（以下「比較例１」とする）も、比較のために示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
本実験においては、抗体（補助抗体）の抗原に対する反応性を、抗体力価の値（％）に基づき、以下の４段階に分類した。
４０％以上（強く反応する場合）： ＋＋＋
２０〜４０％（中程度に反応する場合）：＋＋
５〜２０％（弱く反応する場合）： ＋
５％未満（全く反応しない場合）： −
【００５１】
Ｆ−ＰＳＡとの反応においては、実施例、比較例１の抗体とも反応性が「＋＋＋」であり、非常に高い抗体力価を示した。一方、ＰＳＡ-ＡＣＴに対する比較例１の抗体の反応性は「−」であり、抗体を加えない対照実験の抗体力価と同程度であった。また、実施例の抗体のＰＳＡ−ＡＣＴに対する反応性は「＋」であり、バックグランドよりは３倍以上高かったが、実施例の抗体のＦ−ＰＳＡに対する反応性の１／５程度であった。
【００５２】
（実験２．補助抗体を用いた免疫学的測定）
実験１で得られた、Ｆ−ＰＳＡと強く反応しＰＳＡ−ＡＣＴとも弱く反応する実施例の抗体（ＰＡ０５）を補助抗体として使用した。また、Ｆ−ＰＳＡに特異的な補助抗体である比較例１の抗体（ＰＡ０８）も、比較のために使用した。これらの補助抗体を補正用の第１試薬に添加し、Ｆ−ＰＳＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＰＳＡ−ＡＣＴ（１０ｎｇ／ｍＬ）の各抗原と反応させた。次に、２つの抗ＰＳＡモノクローナル抗体（検出用抗体）を感作したラテックス試薬である測定用の第２試薬を用いて、生化学自動分析装置でＦ−ＰＳＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＰＳＡ−ＡＣＴ（１０ｎｇ／ｍＬ）の濃度を測定した。対照として、補助抗体が添加されていない第１試薬に関しても測定を行い（比較例２）、それらの測定値を比較した。
【００５３】
実施例および比較例１、２の測定結果を表２に示す。補助抗体を未添加の場合（比較例２）、検出用抗体のＦ−ＰＳＡに対する反応性（以下「反応性（１）」と略）が、検出用抗体のＰＳＡ―ＡＣＴに対する反応性（以下「反応性（２）」と略）より高く、等価な反応性を示さなかった。
【００５４】
また、第１試薬に比較例１の補助抗体（ＰＡ０８）を添加した場合、反応性（１）、反応性（２）の値とも、補助抗体を未添加の場合よりいずれもわずかに高く、その結果、反応性（１）／反応性（２）比は補助抗体を未添加の場合（比較例２）とほぼ同程度となった。
【００５５】
一方、第１試薬に実施例の補助抗体（ＰＡ０５）を添加した場合、反応性（２）は補助抗体を未添加の場合（比較例２）および比較例１の補助抗体を添加した場合よりわずかに高かったが、補助抗体を未添加の場合（比較例２）および比較例１の補助抗体を添加した場合よりも反応性（１）が低い値を示した。その結果、反応性（１）／反応性（２）比は１．００となった。
【００５６】
第１試薬に補助抗体を未添加の場合（比較例２）との比較から、Ｆ−ＰＳＡを特異的に補正する補助抗体（ＰＡ０８）を補助抗体として用いた場合（比較例１）、検出用抗原に対するＦ−ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴの反応性を等価にできなかった。一方、補助抗体を未添加の場合（比較例２）および補助抗体を添加した場合（比較例１）との比較から、実施例の補助抗体（ＰＡ０５）を用いた場合（実施例）、Ｆ−ＰＳＡと検出用抗体の反応性を抑制することにより、ＰＡ０５およびＦ−ＰＳＡと、ＰＡ０５およびＰＳＡ−ＡＣＴとの反応性が等価になることが確認された。
【００５７】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離型抗原に対する反応性が、前記遊離型抗原と前記遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体の反応性を等価に補正する補助抗体を含む免疫学的測定試薬であって、
前記補助抗体は前記遊離型抗原と前記複合型抗原の両方に結合可能であり、かつ
前記遊離型抗原と前記補助抗体との反応性が前記複合型抗原と前記補助抗体との反応性よりも高く、
前記検出用抗体が加えられた場合に、前記遊離型抗原と前記検出用抗体との反応が前記複合型抗原と前記検出用抗体との反応よりも強く抑制されることを特徴とする免疫学的測定試薬。
【請求項２】
前記抗原が前立腺特異抗原であることを特徴とする請求項１に記載の免疫学的測定試薬。
【請求項３】
遊離型抗原に対する反応性が、前記遊離型抗原と前記遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体とをさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の免疫学的測定試薬。
【請求項４】
遊離型抗原に対する反応性が、前記遊離型抗原と前記遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体の反応性を等価に補正する補助抗体を用いた免疫学的測定方法において、
前記遊離型抗原とも前記複合型抗原とも結合し、前記遊離型抗原との反応性が前記複合型抗原との反応性よりも高い前記補助抗体を添加し、
続いて検出用抗体を用いて前記補助抗体を添加後の前記遊離型抗原と前記複合型抗原を含む溶液の濃度を測定する場合に、前記遊離型抗原の濃度の低下率を前記複合型抗原の濃度の低下率よりも高くしたことを特徴とする免疫学的測定方法。
【請求項５】
前記抗原が前立腺特異抗原であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記濃度が吸光度を測定することにより算出されるものであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
不溶性担体粒子に結合した前記検出用抗体を抗原と反応させ、抗原抗体反応によって生じる不溶性担体粒子の凝集を観察することによって抗原を検出または測定することを特徴とする請求項４乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
遊離型抗原に対する反応性が、前記遊離型抗原と前記遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体の反応性を等価に補正する補助抗体を含む免疫学的測定試薬であって、
前記補助抗体は前記遊離型抗原と前記複合型抗原の両方に結合可能であり、かつ
前記遊離型抗原と前記補助抗体との反応性が前記複合型抗原と前記補助抗体との反応性よりも高く、
前記検出用抗体が加えられた場合に、前記遊離型抗原と前記検出用抗体との反応が前記複合型抗原と前記検出用抗体との反応よりも強く抑制されることを特徴とする免疫学的測定試薬。
【請求項２】
前記抗原が前立腺特異抗原であることを特徴とする請求項１に記載の免疫学的測定試薬。
【請求項３】
遊離型抗原に対する反応性が、前記遊離型抗原と前記遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体とをさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の免疫学的測定試薬。
【請求項４】
遊離型抗原に対する反応性が、前記遊離型抗原と前記遊離型抗原に結合する別の抗原とで形成される複合型抗原に対する反応性より高い検出用抗体の反応性を等価に補正する補助抗体を用いた免疫学的測定方法において、
前記遊離型抗原とも前記複合型抗原とも結合し、前記遊離型抗原との反応性が前記複合型抗原との反応性よりも高い前記補助抗体を添加し、
続いて検出用抗体を用いて前記補助抗体を添加後の前記遊離型抗原と前記複合型抗原を含む溶液の濃度を測定する場合に、前記遊離型抗原の濃度の低下率を前記複合型抗原の濃度の低下率よりも高くしたことを特徴とする免疫学的測定方法。
【請求項５】
前記抗原が前立腺特異抗原であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記濃度が吸光度を測定することにより算出されるものであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
不溶性担体粒子に結合した前記検出用抗体を抗原と反応させ、抗原抗体反応によって生じる不溶性担体粒子の凝集を観察することによって抗原を検出または測定することを特徴とする請求項４乃至６のいずれかに記載の方法。
【公開番号】特開２０１０−２３７１０５（Ｐ２０１０−２３７１０５Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８６８０７（Ｐ２００９−８６８０７）
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
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