免疫検出性の改善
本開示では、場合により希釈された血液、血清または血漿サンプル中の少なくとも１種のタンパク質の免疫検出性の改善方法が提供され、それは、サンプルと、該少なくとも１種のタンパク質の検出および／または定量用の少なくとも１種の親和性リガンドとを接触させることに先立ち、サンプルを６４−８５℃の温度に加熱する段階を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血液または血液由来サンプル中のタンパク質の検出の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
現在、幅広く使用され、十分に受け入れられているプロテオーム分析の技術は質量分析であり、しばしば、２Ｄ−ゲル電気泳動またはクロマトグラフィー技法と組み合わせて用いられる。しかしながら、最近の小型化および並行化技術基盤の発展は、質量分析を支持し、補完する可能性を開いた。
【発明の概要】
【０００３】
概要
第１に、場合により希釈された血液、血清または血漿サンプル中の少なくとも１種のタンパク質の免疫検出性の改善方法が提供され、それは、サンプルと少なくとも１種の親和性リガンドを接触させることに先立ち、サンプルを５０−８５℃の温度に加熱する段階を含む。
【０００４】
第２に、対象由来の血液、血清または血漿中のタンパク質を検出および／または定量する方法が提供され：
ａ）第１および第２の場合により希釈した対象由来の血液、血清または血漿サンプルを提供し；
ｂ）第１のサンプルを５０−８５℃の温度に加熱し；
ｃ）第１のサンプルを、ｂ）の加熱に続いて、加熱により免疫検出性が高められた標的タンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させ；
ｄ）加熱に付していない第２のサンプルを、加熱により免疫検出性が高められていない標的タンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させ；
ｅ）段階ｃ）およびｄ）で形成された抗体と対応する標的タンパク質との間の相互作用を検出し、それにより、血液、血清または血漿中のタンパク質を検出および／または定量する。
【０００５】
第３に、医学的状態のバイオマーカーを同定する方法が提供され、それは、
ａ）その医学的状態を有する第１対象群およびその医学的状態を有さない第２対象群からの血液、血清または血漿サンプルを提供すること、
ｂ）サンプルを、場合により希釈後に、５０−８５℃の温度に加熱すること、
ｃ）少なくとも１種のタンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドとサンプルを接触させ、各群の少なくとも１種のタンパク質のレベルを測定すること、
ｄ）そのレベルを比較し、第１群からのサンプル中に第２群からのサンプル中よりも高いか、または低い程度で生じるタンパク質を同定し、かくしてその医学的状態のバイオマーカーを同定すること、
を含む。
上記の方法の様々な実施態様を、下記でより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図面の簡単な説明
図１−４において、実線は血漿中のタンパク質を表し、破線は血清中のタンパク質を表す。
【図１】図１は、異なる温度（ｘ軸）での熱処理後に少なくとも２倍上昇した免疫検出性を示す血漿または血清中のタンパク質の数（ｙ軸）を示す。
【図２】図２は、異なる温度（ｘ軸）での熱処理後に少なくとも２倍低下した免疫検出性を示す血漿または血清中のタンパク質の数（ｙ軸）を示す。
【図３】図３は、異なる温度（ｘ軸）での熱処理後に少なくとも２倍上昇した免疫検出性を示す血漿または血清中のタンパク質の数（ｙ軸）を示す。
【図４】図４は、異なる温度（ｘ軸）での熱処理後に少なくとも２倍低下した免疫検出性を示す血漿または血清中のタンパク質の数（ｙ軸）を示す。
【図５】図５は、２３℃、５６℃および７２℃での処理後の、血清中のタンパク質と相互作用する６種の異なる親和性リガンドからのシグナルを示す。未加工の蛍光シグナル強度のデータから、３回繰り返した分析の結果に基づいて、ボックスプロットを作成した。ＭＦＩ＝中央値の蛍光強度、ＡＵ＝任意単位。
【図６】図６は、２３℃、５６℃および７２℃での処理後の、血漿中のタンパク質と相互作用する６種の異なる親和性リガンドからのシグナルを示す。未加工の蛍光シグナル強度のデータから、３回繰り返した分析の結果に基づいて、ボックスプロットを作成した。ＭＦＩ＝中央値の蛍光強度、ＡＵ＝任意単位。
【図７】図７は、７２℃での処理後のＰＳＡ低または高患者（ＰＳＡ＞６０ｎｇ／ｍｌ）からの血漿中のタンパク質のレベルの差異を示す。結果を火山型プロット（volcano plot）として提示した。ここで、相対的な倍率変化（fold-change）（ｘ軸）を、ｔ検定結果の有意さ（Ｐ値）（ｙ軸）に対してプロットする。実線はｐ値＜０.０１を表し、破線はｐ値＜０.０５を表す。破線のボックスは…を表す。
【図８】図８は、２３℃での処理後のＰＳＡ低または高患者（ＰＳＡ＞６０ｎｇ／ｍｌ）からの血漿中のタンパク質のレベルの差異を示す。結果を火山型プロットとして提示した。ここで、相対的な倍率変化（ｘ軸）を、ｔ検定結果の有意さ（Ｐ値）（ｙ軸）に対してプロットする。実線はｐ値＜０.０１を表し、破線はｐ値＜０.０５を表す。破線のボックスは、小さい倍率変化および有意さの値のタンパク質が位置する火山型プロットの領域の拡大を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
詳細な説明
本開示の第１の態様として、場合により希釈された血液、血清または血漿サンプル中の少なくとも１種のタンパク質の免疫検出性の改善方法が提供され、それは、サンプルと少なくとも１種の親和性リガンドを接触させることに先立ち、サンプルを５０−８５℃の温度に加熱する段階を含む。
【０００８】
第１の態様の構成として、血液、血清または血漿サンプル中のタンパク質の検出方法が提供され、それは、
ａ）サンプルを５０−８５℃の温度に加熱すること；
ｂ）サンプルを既知の標的タンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させること；
ｃ）少なくとも１種の親和性リガンドと対応するサンプル由来の標的タンパク質との相互作用を検出し、それにより、サンプル中のタンパク質を検出すること、
を含む。
【０００９】
本開示は、血漿および血清サンプルのいくつかのタンパク質は、血漿または血清サンプルを分析前に加熱すると、高い程度で抗体により検出されるという知見に基づく。いかなる特定の科学的理論にも縛られないが、抗体と血清または血漿タンパク質中のそれらの対応するエピトープとの相互作用は、加熱により助長されると考えられる。
【００１０】
本開示の知見は、数々の利点を伴い得る。加熱を使用して、以前には免疫学的方法を使用して検出できなかったタンパク質を検出することが可能であり得る。結果的に、複雑な生物学的サンプルのタンパク質内容のより包括的な像を入手し得る。また、加熱は、そのような複雑な生物学的サンプルに低レベルで存在するタンパク質の検出を可能にし得る。多くの興味深いバイオマーカーは低濃度範囲で見出されると報告されてきたので、これは、特に興味深いものであり得る。従って、本開示の加熱は、プロテオミクス研究の感受性を高める有用な手段であり得る。
【００１１】
本開示の文脈では、タンパク質の「免疫検出性」は、タンパク質の線状または構造的エピトープが、そのようなエピトープと選択的に相互作用できる抗体などの親和性リガンドにより検出され得る程度を表す。
【００１２】
さらに、本開示の文脈では、タンパク質の免疫検出性の「改善」は、エピトープ認識に基づく分析におけるタンパク質からのシグナル（または出力）を、加熱を実施しなかったときのタンパク質からのシグナル（または出力）と比較して高めることを表す。結果的に、免疫検出性が改善されたか否かを決定するために、問題のタンパク質からのシグナルを同時に患者から採られた２種のサンプルで測定し得、ここで、サンプルの一方を測定前に加熱する。加熱したサンプル中のタンパク質からのシグナルが、非加熱サンプル中のタンパク質からのシグナルよりも高いならば、免疫検出性は改善されている。そのような比較の正確さを改善するために、各サンプルの１回より多い測定、および／または、各カテゴリーの１種より多いサンプルの測定を実施し得る。いくつかの実施態様では、シグナルが絶対値で１.５倍または２倍高まっていれば、免疫検出性が改善されたと見なし得る。
【００１３】
「サンプルと少なくとも１種の親和性リガンドを接触させること」は、サンプル中のタンパク質の検出および／または定量を可能にする。結果的に、親和性リガンドの選択性は、親和性リガンドが認識するタンパク質の存在および／または存在量を測定するのに用い得る。接触は、下記でさらに論ずる通り、様々な構成および形式を使用して実施し得る。
【００１４】
本開示の第２の態様として、対象由来の血液、血清または血漿中のタンパク質を検出および／または定量する方法が提供され：
ａ）第１および第２の場合により希釈した対象由来の血液、血清または血漿サンプルを提供し；
ｂ）第１のサンプルを５０−８５℃の温度に加熱し；
ｃ）第１のサンプルを、ｂ）の加熱に続いて、加熱により免疫検出性が高められた標的タンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させ；
ｄ）加熱に付していない第２のサンプルを、加熱により免疫検出性が高められていない標的タンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させ；
ｅ）段階ｃ）およびｄ）で形成された抗体と対応する標的タンパク質との間の相互作用を検出し、それにより、血液、血清または血漿中のタンパク質を検出および／または定量する。
【００１５】
第２の態様は、いくつかのタンパク質の免疫検出性は、本開示の熱処理中に改善されるが、いくつかの他のタンパク質の免疫検出性は上昇せず、減少しさえするという、本発明者らの洞察に基づく。従って、前者のタンパク質の検出を加熱したサンプルで実施し、後者のタンパク質の検出を非加熱サンプルで実施するならば、幅広いタンパク質での感受性の最適化が達成され得る。
【００１６】
当業者は、同じタンパク質の測定を、１回は加熱サンプルで、１回は非加熱サンプルで、単純に２回実施し、得られたシグナルを比較することにより、タンパク質の免疫検出性が改善されたか否かを過度な負担なく決定し得る。熱処理サンプルでシグナルが高ければ、そのタンパク質は、免疫検出性が加熱により高められるタンパク質として選択され、将来の分析では、対応する親和性リガンドを熱処理サンプルと接触させる。
【００１７】
本開示の第３の態様として、医学的状態のバイオマーカーを同定する方法が提供され、それは、
ａ）その医学的状態を有する第１対象群およびその医学的状態を有さない第２対象群からの血液、血清または血漿サンプルを提供すること、
ｂ）サンプルを、場合により希釈後に、５０−８５℃の温度に加熱すること、
ｃ）サンプルを、加熱後に、少なくとも１種のタンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させ、各群の少なくとも１種のタンパク質のレベルを測定すること、
ｄ）そのレベルを比較し、第１群からのサンプル中に第２群からのサンプル中よりも高いか、または低い程度で生じるタンパク質を同定し、かくしてその医学的状態のバイオマーカーを同定すること、
を含む。
【００１８】
本開示の第３の態様は、正常な患者および病気の患者からの加熱サンプルの比較は、非加熱サンプルを分析したときには検出できなかったタンパク質発現における差異を明らかにしたという、発明者らの知見に基づく。結果的に、本開示の方法を使用して、以前には認識できなかったバイオマーカーを同定し得る。これは、図７および８に図解され、そこには、正常な対象と前立腺癌を有する対象に由来する加熱および非加熱サンプル中のある種のタンパク質のレベルが示され、２種の前立腺癌のタンパク質バイオマーカーが同定されている。
【００１９】
第３の態様の医学的状態は、例えば、癌などの疾患または他の医学的障害であり得る。
当業者は、段階ｄ）で２つの群からのレベルを比較し、レベル間の差異が、そのタンパク質がバイオマーカーであると結論づけるのに十分であるか否かを決定する方法を理解している。
【００２０】
第３の態様のある実施態様では、タンパク質は、その濃度が第１の群のサンプル中で第２の群のサンプル中より少なくとも２５％高く、例えば少なくとも５０％高く、例えば少なくとも１００％高いならば、段階ｄ）でバイオマーカーとして同定される。さらに、タンパク質は、検出システムにおけるそこからのシグナルが第１の群のサンプル中で第２の群のサンプル中より少なくとも２５％高く、例えば少なくとも５０％高く、例えば少なくとも１００％高いならば、バイオマーカーとして同定される。ここで、比較されるべき濃度またはシグナルは、サンプル中の濃度の平均または中央値であり得る。また、状況は、タンパク質がサンプルのいくつかでのみ検出されるものであり得、そのような場合、タンパク質は、それが第１の群のサンプルで第２の群よりも高い割合で検出されるならば、段階ｄ）でバイオマーカーとして同定され得る。
また、タンパク質は、それが疾患の群のサンプルで低い程度で検出されるならば、バイオマーカーとして同定され得る。
【００２１】
本開示の実施態様では、本方法は、血液、血漿または血清の非免疫グロブリンタンパク質の検出および／または定量のみに関する。免疫グロブリンタンパク質のいくつかのエピトープの検出性は、免疫グロブリンタンパク質がその抗原と会合しているか否かにより影響される。いかなる特定の科学的理論にも縛られないが、本発明者らは、そのような標的タンパク質の相互作用の形成または解離は加熱の効果の源ではないと考える。加えて、サンプルを加熱することは、免疫グロブリンタンパク質の結合活性を変更し、それによりそれらの機能性の同定を損ない得る。結果的に、本開示の方法の実施態様では、少なくとも１種の親和性リガンドは、少なくとも１種の非免疫グロブリンタンパク質と選択的に相互作用できるものである。
【００２２】
本開示の方法では、サンプルを５０−８５℃の温度に加熱する。下記の実施例の実施態様および図１では、そのような温度範囲は、免疫検出性の上昇をもたらすと示されている。本開示の方法の実施態様では、サンプルを６４−８５℃、例えば６６−７８℃、例えば７０−７４℃、例えば約７２℃の温度に加熱する。下記の実施例の実施態様および図１、３および４では、そのような範囲内の温度は、少なくともいくつかの態様で、５０−８５℃の広い範囲よりも良好であると示されている。
【００２３】
通常、本開示の加熱は、時間的に制限されている。これは、サンプルを最初にある温度に加熱し、その温度でしばらく維持し、次いで通常室温ほどの温度、例えば２０−２５℃に冷却することを意味する。結果的に、加熱に続く段階、例えば、親和性リガンドとの接触は、通常、高い温度では実施されない。本発明者らは、加熱および場合により冷却は、サーモサイクラーで実施し得ることを見出した。（サーモサイクラーは、通常はＰＣＲで使用される。）しかしながら、他の加熱手段も使用し得る。
【００２４】
加熱時間は、労力および材料の効率的な使用を提供し、それにより分析の経済の改善を提供するために、短く維持され得る。例えば、これは、多くのタンパク質を大きい対象群で分析し得るプロテオミクスにおいて有利であり得る。本発明者らは、１時間より短い、または、半時間より短い加熱期間でさえ、満足な結果を得るのに十分であると示した。従って、本開示の実施態様では、加熱は、０.５−５５分間、例えば１−４０分間、例えば１−２９分間、例えば５−２０分間、例えば約１５分間実施する。
【００２５】
下記の実施例では、加熱前にサンプルのタンパク質を標識化する。標識を後にフルオロフォアと反応させ、最後の検出段階で検出する。本発明者らは、そのような標識化は効率的な分析プロトコールを提供し、加熱前の標識化は、加熱後の標識化よりも多数の免疫検出性が上昇したタンパク質をもたらすことを示した。さらに、標識化と加熱の間にサンプルを希釈し得る（例えば１０−１００倍）。
【００２６】
本開示の実施態様では、サンプルのタンパク質は、サンプルと少なくとも１種の親和性リガンドとの接触に続く検出段階で直接的または間接的に検出できる標識で、加熱前に標識化し得る。標識は、例えばビオチンを含み得る。即ち、標識化は、例えばビオチン化であり得る。標識は、それ自体で（直接的）、または、二次標識を介して（間接的）、検出可能であり得る。従って、本開示の方法の実施態様では、標識化されたタンパク質を、親和性リガンドとの接触後、後続の検出段階で検出可能な二次標識と接触させ得る。二次標識は、例えば、フルオロフォアであり得る。
【００２７】
本開示の方法のサンプルは、加熱前に希釈し得る。希釈は、一般的に、免疫学的検出を基礎とする分析において、バックグラウンドのシグナル（ノイズ）並びに標的タンパク質からのシグナルを減らすと考えられる。本開示の実施態様では、加熱前にサンプルを１０−１００００倍、例えば１００−２５００倍、例えば２００−１０００倍、例えば約５００倍に希釈し得る。
【００２８】
サンプルを、例えば、添加物、例えば、ウサギＩｇＧおよび／またはカゼインを含むバッファーを使用して希釈し得る。これらの添加物は、サンプル中のタンパク質と（特異的）親和性リガンドの非特異的結合をクエンチし、それにより検出のノイズを低減し得る。
【００２９】
バッファー中のクエンチする抗体の濃度は、０.０５−５ｍｇ／ｍｌ、例えば０.１−２ｍｇ／ｍｌ、例えば約０.５ｍｇ／ｍｌであり得、バッファー中のカゼインの濃度は、０.０１−１０％（ｗ／ｖ）、例えば０.０５−２％（ｗ／ｖ）、例えば約０.１％（ｗ／ｖ）であり得る。
【００３０】
いくつかのタンパク質の同時検出を提供し、それにより血液、サンプルまたは血漿のタンパク質内容の効率的な分析を提供するために、サンプルを同じ反応区画中の１種より多い親和性リガンドと接触させ得る。３０種より多い異なるタンパク質を同じサンプル中で検出するために、リガンドを後続の検出段階で分析されるビーズに結合させる小型化および並行化されたシステムで、親和性リガンドを使用するのが有利である。さらに、そのようなビーズは、シグナルを後続の検出段階で親和性リガンドに、次いで、タンパク質に結びつける識別を施されていてもよい。そのようなビーズは、「コード化された粒子」と呼ばれることもある；Kingsmore, S.F. Nat Rev. Drug Discovery 2006, 5(4), 310-320 参照。伝統的なサンドイッチアッセイを使用すると、３０種より多い異なるタンパク質を同じサンプルから検出できる設定を提供することは実際的に非常に困難であり、時間がかかる。
【００３１】
結果的に、本開示の方法の実施態様では、加熱は、サンプルを、少なくとも４種、例えば少なくとも１０種、例えば少なくとも３０種、例えば少なくとも５０種の異なる親和性リガンドと接触させる前に実施する。
【００３２】
タンパク質に結合した直接的または間接的に検出可能な標識、および、親和性リガンドに結合した識別を有する検出可能な部分を用いることにより、タンパク質と会合した標識および親和性リガンドと会合した部分からのシグナルを提供しない要素は無視され得るので、検出段階の偽陰性の数を少なく維持し得る。
【００３３】
上記の実施態様は、主に第１の態様を参照して説明されている。しかしながら、当業者は、これらの実施態様は、必要な変更を加えて第２および第３の態様にも適用されることを理解する。
【００３４】
本開示の文脈では、「少なくとも１種の親和性リガンド」は、少なくとも１種類の親和性リガンドを表し、その種類は、親和性リガンドの特異性により定義される。従って、当業者は、１種類の親和性リガンドは、すべて同じ抗原と選択的に相互作用できるポリクローナル抗体の群を表し得ることを理解する。
従って、「異なる親和性リガンド」は、異なる特異性を有する親和性リガンドを表す。
【００３５】
本開示に従って、適切な親和性リガンドを選択または製造し、検出および／または定量に適切な形式および条件を選択することは、当業者の能力に範囲内にあると認められる。それでもやはり、有用であると証明された親和性リガンドの実施例、および、検出および／または定量の形式および条件の実施例を、例示説明のために後述する。
【００３６】
従って、本開示の実施態様では、親和性リガンドは、抗体、その断片およびその誘導体、即ち、免疫グロブリン骨格をベースとする親和性リガンドからなる群から選択され得る。抗体およびその断片または誘導体は、単離され、かつ／または、単一特異性であってよい。抗体は、任意の起源のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含み、ネズミ、ウサギ、ヒトおよび他の抗体、並びに異なる種に由来する配列を含むキメラ抗体、例えば、部分的にヒト化された抗体、例えば、部分的にヒト化されたマウス抗体を含む。ポリクローナル抗体は、選択された抗原による動物の免疫化により産生し得る。定義された特異性のモノクローナル抗体は、Koehler and Milstein (Koehler G and Milstein C (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519) により開発されたハイブリドーマ技術を使用して産生できる。本開示の抗体断片および誘導体は、それらの断片または誘導体の抗体と同じ抗原と選択的に相互作用できるものである。抗体断片および誘導体は、完全な免疫グロブリンタンパク質の重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）からなるＦａｂ断片；２個の可変抗体ドメインＶＨおよびＶＬからなるＦｖ断片 (Skerra A and Plueckthun A (1988) Science 240:1038-1041); 可動性ペプチドリンカーにより一緒に連結された２個のＶＨおよびＶＬドメインからなる一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）(Bird RE and Walker BW (1991) Trends Biotechnol. 9:132-137); Bence Jones dimers (Stevens FJ et al. (1991) Biochemistry 30:6803-6805); ラクダ科の重鎖二量体 (Hamers-Casterman C et al. (1993) Nature 363:446-448) および単一可変領域 (Cai X and Garen A (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:6280-6285; Masat L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:893-896)、および、テンジクザメの新規抗原受容体（the New Antigen Receptor (NAR)）などの単一ドメイン骨格 (Dooley H et al. (2003) Mol. Immunol. 40:25-33) および、可変重鎖ドメインに基づくミニボディー（minibody）(Skerra A and Plueckthun A (1988) Science 240:1038-1041)を含む。
【００３７】
本開示の文脈では、「単一特異性抗体（mono-specific antibody）」は、それ自体の抗原で親和性精製し、それによりそのような単一特異性抗体を他の抗血清タンパク質および非特異的抗体から分離した、ポリクローナル抗体の集団の１つである。この親和性精製は、その抗原に選択的に結合する抗体をもたらす。本開示の方法で使用できる単一特異性抗体を得るために、ポリクローナル血清を２段階の免疫親和性を基礎とするプロトコールにより精製し、標的タンパク質に選択的な単一特異性抗体を入手し得る。捕捉剤としての不動化したタグタンパク質を使用して、抗原断片の一般的な親和性タグに対する抗体を第１の減少段階で除去する。第１の減少段階に続き、抗原に特異的な抗体を濃縮するために、抗原を捕捉剤として血清を第２の親和性カラムに載せる（Nilsson P et al. (2005) Proteomics 5:4327-4337も参照）。
【００３８】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、並びにそれらの断片および誘導体は、本開示によるタンパク質の検出および／または定量のような選択的なバイオマーカーの認識を必要とする応用における親和性リガンドの伝統的な選択肢である。しかしながら、当業者は、選択的に結合するリガンドの高処理量生成および低コストの産生システムへの要望が高まっているため、新しい生体分子多様性技術が開発されてきたことを知っている。これは、免疫グロブリンおよび非免疫グロブリンの両方を起源とする新しいタイプの親和性リガンドの生成を可能にし、それは、生体分子認識の応用における結合リガンドとして同等に有用であると証明される場合もあり、免疫グロブリンの代わりに、または、それと共に、使用できる。
【００３９】
親和性リガンドの選択に必要な生体分子の多様性は、複数の可能な骨格分子の１つの組合せ工学により生成し得、次いで、適当な選択基盤を使用して、特異的かつ／または選択的親和性リガンドを選択する。骨格分子は、免疫グロブリンタンパク質起源のもの（Bradbury AR and Marks JD (2004) J. Immunol. Meths. 290:29-49）、非免疫グロブリンタンパク質起源のもの（Nygren PÅ and Skerra A (2004) J. Immunol. Meths. 290:3-28）、または、オリゴヌクレオチド起源のもの（Gold L et al. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64:763-797) であり得る。
【００４０】
多数の非免疫グロブリンタンパク質の足場が、新規結合タンパク質の開発における支持構造として使用されてきた。本開示に従って使用するための親和性リガンドの生成に有用なそのような構造の非限定的な例は、ブドウ球菌プロテインＡおよびそのドメインおよびこれらのドメインの誘導体、例えば、プロテインＺ（Nord K et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:772-777）；リポカリン（Beste G et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:1898-1903）；アンキリンリピートドメイン（Binz HK et al. (2003) J. Mol. Biol. 332:489-503）；セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）（Smith GP et al. (1998) J. Mol. Biol. 277:317-332; Lehtioe J et al. (2000) Proteins 41:316-322）；γ結晶（Fiedler U and Rudolph R, WO01/04144）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Peelle B et al. (2001) Chem. Biol. 8:521-534）；ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）（Hufton SE et al. (2000) FEBS Lett. 475:225-231; Irving RA et al. (2001) J. Immunol. Meth. 248:31-45）；プロテアーゼ阻害因子、例えばノッティン（Knottin）タンパク質（Wentzel A et al. (2001) J. Bacteriol. 183:7273-7284; Baggio R et al. (2002) J. Mol. Recognit. 15:126-134）およびクニッツ（Kunitz）ドメイン（Roberts BL et al. (1992) Gene 121:9-15; Dennis MS and Lazarus RA (1994) J. Biol. Chem. 269:22137-22144）；ＰＤＺドメイン（Schneider S et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:170-175）；チオレドキシンなどのペプチドアプタマー（Lu Z et al. (1995) Biotechnology 13:366-372; Klevenz B et al. (2002) Cell. Mol. Life Sci. 59:1993-1998）；ブドウ球菌ヌクレアーゼ（Norman TC et al. (1999) Science 285:591-595）；テンダミスタット（tendamistats）(McConell SJ and Hoess RH (1995) J. Mol. Biol. 250:460-479; Li R et al. (2003) Protein Eng. 16:65-72）；フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づくトリネクチン（trinectin）(Koide A et al. (1998) J. Mol. Biol. 284:1141-1151; Xu L et al. (2002) Chem. Biol. 9:933-942）；およびジンクフィンガー（Bianchi E et al. (1995) J. Mol. Biol. 247:154-160; Klug A (1999) J. Mol. Biol. 293:215-218; Segal DJ et al. (2003) Biochemistry 42:2137-2148）である。
【００４１】
上記の非免疫グロブリンタンパク質骨格の例には、新しい結合特異性の生成に使用される単一の無作為化されたループを提示する足場タンパク質、タンパク質表面から突出している側鎖が新規結合特異性の生成のために無作為化された強固な二次構造を有するタンパク質骨格、および、新規結合特異性の生成に使用される非連続的高可変ループ領域を示す足場が含まれる。
【００４２】
非免疫グロブリンタンパク質に加えて、オリゴヌクレオチドも親和性リガンドとして使用され得る。アプタマーまたはデコイと呼ばれる一本鎖核酸は、十分に定義された三次元構造に折り畳まれ、高い親和性および特異性でそれらの標的に結合する。(Ellington AD and Szostak JW (1990) Nature 346:818-822; Brody EN and Gold L (2000) J. Biotechnol. 74:5-13; Mayer G and Jenne A (2004) BioDrugs 18:351-359）。オリゴヌクレオチドリガンドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、幅広い標的の分子クラスに結合できる。
【００４３】
上記の足場構造のいずれかの変異体のプールから所望の親和性リガンドを選択するために、選択された標的タンパク質に対する特異的新規リガンドの単離のための数々の選択基盤が利用可能である。選択基盤には、ファージディスプレイ（Smith GP (1985) Science 228:1315-1317）、リボソームディスプレイ（Hanes J and Plueckthun A (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4937-4942）、酵母ツーハイブリッド法（Fields S and Song O (1989) Nature 340:245-246）、酵母ディスプレイ（Gai SA and Wittrup KD (2007) Curr Opin Struct Biol 17:467-473）、ｍＲＮＡディスプレイ（Roberts RW and Szostak JW (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12297-12302）、細菌ディスプレイ（Daugherty PS (2007) Curr Opin Struct Biol 17:474-480, Kronqvist N et al. (2008) Protein Eng Des Sel 1-9, Harvey BR et al. (2004) PNAS 101(25):913-9198）、ミクロビーズディスプレイ（Nord O et al. (2003) J Biotechnol 106:1-13, WO01/05808）、ＳＥＬＥＸ（System Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) (Tuerk C and Gold L (1990) Science 249:505-510）およびタンパク質断片相補性アッセイ（ＰＣＡ）（Remy I and Michnick SW (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:5394-5399）が含まれるがこれらに限定されない。
【００４４】
従って、本開示の実施態様では、親和性リガンドは、上記のタンパク質足場のいずれかに由来する非免疫グロブリン親和性リガンド、または、オリゴヌクレオチド分子であり得る。
【００４５】
本開示の検出および／または定量は、抗体のような親和性リガンドと抗原との間の相互作用を基礎とするアッセイにおける結合試薬の検出および／または定量のために当業者に知られているどのような方法でも達成し得る。従って、上記の親和性リガンドのいずれも、血液または血液由来サンプル中のタンパク質の存在を定量的および／または定性的に検出するのに使用し得る。これらの「一次」親和性リガンドは、様々なマーカーでそれら自体標識され得るか、または、検出、可視化および／または定量を可能にする二次的な標識化された親和性リガンドにより検出され得る。これは、一次または二次親和性リガンドに結合できる多数の標識の１種またはそれ以上を使用して、当業者に知られている多数の技法の１つまたはそれ以上を使用して、そしていかなる過度な実験も伴わずに、達成できる。
【００４６】
一次および／または二次親和性リガンドに結合させられる標識の非限定的な例には、蛍光染料または金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレサミン）、発色団の染料（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、ルミナール、イミダゾール）および生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えば、ビオチン）が含まれる。様々な他の有用な発蛍光物質（fluorescers）および発色団が、Stryer L (1968) Science 162:526-533 and Brand L and Gohlke JR (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868 に記載されている。親和性リガンドは、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ）および粒子（例えば、金）で標識することもできる。本開示の文脈では、「粒子」は、分子の標識化に適する金属粒子などの粒子を表す。さらに、親和性リガンドは、蛍光性半導体ナノ結晶（量子ドット）でも標識し得る。量子ドットは、有機発蛍光団と比較して量子収率に優れ、より光安定性であり、従って、より容易に検出される（Chan et al. (2002) Curr Opi Biotech. 13: 40-46）。様々なタイプの標識を、様々な化学、例えば、アミン反応またはチオール反応を使用して、親和性リガンドに結合させることができる。しかしながら、アミンおよびチオール以外の反応基、例えば、アルデヒド、カルボン酸およびグルタミンを使用できる。
上記の方法の態様は、いくつかの既知の形式および構成のいずれかで実践し得、その非限定的な選択を下記で論ずる。
【００４７】
親和性リガンドの標識の可視化方法には、蛍光定量的、発光定量的および／または酵素的技法が含まれ得るが、これらに限定されない。蛍光は、蛍光標識を特定の波長の光に曝し、その後、特定の波長領域で発せられる光を検出および／または定量することにより、検出および／または定量する。発光的にタグ付けされた親和性リガンドの存在は、化学反応中に生じる発光により検出および／または定量し得る。酵素的反応の検出は、化学反応から生じるサンプル中の色の変化による。様々なタイプのＥＬＩＳＡ：ｓは、酵素的反応を基礎とする方法の例である。当業者は、適切な検出および／または定量のために、様々な異なるプロトコールを改変できることを知っている。
【００４８】
いかなる特定の科学的理論にも縛られないが、本発明者らは、本開示の加熱を使用すると、線状エピトープの免疫検出性が上昇すると考える。従って、本開示の方法の実施態様では、親和性リガンドは、線状／連続的エピトープと選択的に相互作用できるものであり得る。一例として、線状／連続的エピトープと選択的に相互作用できる抗体は、そのエピトープを含むが（強固な）二次構造を形成していないペプチドで動物を免疫化することにより産生し得る。下記の実施例のセクションで用いる抗体は、線状／連続的エピトープを認識する抗体を頻繁にもたらすタンパク質エピトープシグニチャータグ（Protein Epitope Signature Tag）（ＰｒＥＳＴ）免疫化を使用して産生した。
【実施例】
【００４９】
例示的実施態様の詳細な説明
材料と方法
ビーズカップリング
単一特異性抗体を、微細な改変を加えた製造業者のプロトコールに従い、カルボキシル化ビーズ（COOH Micorspheres, Luminex-Corp.）にカップリングさせた。前立腺癌のアプローチには、各抗体３.２μｇを、遠心分離のフィルターユニット（Ultrafree-MC, Millipore）を使用して１０６個のビーズにカップリングし、最終濃度４０μｇ／ｍｌとした。ビーズを、ＮａＮ３を含むタンパク質を含有するバッファー（Blocking Reagent for ELISA, Roche）中に保存した。すべてのカップリングしたビーズを超音波洗浄機（Branson, Ultrasonic Corporation）中で５分間超音波処理して再懸濁し、その後４℃で保存した。１００−ｐｌｅｘのビーズ混合物を溶液中に創製し、以前に記載された通りに最適化し（Schwenk et al (2007) Mol Cell Proteomics 6, 125-132）、この研究を通して利用した。
【００５０】
下記の第１および第２のアプローチのために、磁気カルボキシル化ビーズ（MagPlex Micorspheres, Luminex-Corp.）を利用した。上記のプロトコールとの違いは、ビーズをマイクロタイタープレート（Greiner Bioone）中でカップリングさせ、プレートを磁石（LifeSept, Dexter）の上に置いてビーズを洗浄することである。最後に、７６−ｐｌｅｘのビーズ混合物を溶液中に創製した。
【００５１】
血清および血漿の標識化およびアッセイの手順
最初に、サンプル（血漿または血清）を室温で融解し、１０分間１０,０００ｒｐｍで遠心分離した。各サンプル３０μｌをマイクロタイタープレート（Abgene）に移し、次いで、プレートを密閉し、ボルテックスし、遠心分離した（１分間、３,０００ｒｐｍ）。次に、各サンプル３μｌを新しいマイクロタイタープレートに移し、続いてリキッドハンドラー（Plate mate 2x2, Matrix）を使用して１×ＰＢＳ２２μｌを各サンプルに添加し、次いで、プレートを密閉し、ボルテックスし、遠心分離した（１分間、３,０００ｒｐｍ）。続いて、ビオチノイル−テトラオキサペンタデカン酸のＮ−ヒドロキシサクシニミジルエステル（NHS-PEO4-Biotin, Pierce）を１０倍のモル過剰で添加し、総合して１／１０のサンプル希釈物を得、続いて２時間４℃でマイクロタイタープレートシェーカー（Thermomixer, Eppendorf）中でインキュベートした。ビオチンに対して２５０倍のモル過剰のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０の添加により反応を停止させ、さらに２０分間４℃でインキュベートした。次いで、サンプルをすぐに使用するか、または、−８０℃で保存した。
【００５２】
全サンプルを、組み込まれていないビオチンを除去せずに利用し、１／５０に、即ち、サンプル１μｌおよびアッセイバッファー（０.５％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコールおよび０.８％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（Sigma）、０.１％（ｗ／ｖ）カゼイン中、ＰＢＳ（ＰＶＸＣ）中、０.５ｍｇ／ｍｌ非特異的ウサギＩｇＧ（Bethyl）を添加）４９μｌに希釈した。対照として、非特異的ウサギＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch）およびＨＳＡ結合 Affibody (Affibody AB）を含めた。次に、プレートを、サーモサイクラー（DNA Engine Tetrad cycler, PTC225, BioRad）中で、７２℃で１５分間熱処理し、続いて１５分間２３℃でインキュベートした。次いで、プレートを遠心分離し（１分間、３,０００ｒｐｍ）、各サンプル４５μｌをビーズ混合物５μｌに添加した。インキュベーションを終夜シェーカーで２３℃で行い、これに続いて、ウェル中で、３×５０μｌＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ ｐＨ７.４、０.１％ Tween20）でビーズを洗浄した。
【００５３】
磁気ビーズを用いて行う第１および第２のアプローチには、マイクロタイタープレート (Greiner Bioone) を、プレート洗浄用の磁気ビーズ沈降に関連して使用した。上記の前立腺癌のアプローチには、底にフィルターのあるマイクロタイタープレート (Millipore) を用い、ビーズの洗浄に吸引装置 (Millipore) を利用した。
【００５４】
洗浄に続いて、ＰＢＳ中にパラホルムアルデヒド０.１％を含有する停止溶液５０μｌと共に１０分間インキュベートした。次に、１×５０μｌのＰＢＳＴおよび５０μｌの０.５μｇ／ｍｌ Ｒ−フィコエリトリン標識ストレプトアビジン（Invitrogen）（ＰＢＳＴ中）をビーズ混合物に添加し、２０分間、シェーカーで、２３℃でインキュベートした。最後に、ウェルをＰＢＳＴ３×５０μｌで洗浄し、ＰＢＳＴ１００μｌ中で測定した。
【００５５】
読み取りおよびデータ分析
測定は、Luminex LX200 機器で Luminex IS 2.3 ソフトウェアを使用して実施し、各シグナル特異性分析のために、色コードＩＤ毎に１００事象を計測した。各抗体のカップリング効率を、Ｒ−フィコエリトリン標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch）により測定した。抗体−タンパク質相互作用を示すために、中央値の蛍光強度（ＭＦＩ）を選択した。データ分析およびグラフ表示は、Microsoft Office Excel 2003 または R、統計的コンピューター処理およびグラフィックスの言語と環境 (Ihaka, R et al (1996) J. Comput. Graph. Stat. 5, 299-3214) を使用して実施した。
【００５６】
結果
ａ）第１のアプローチ
１人の正常な患者からの血清および血漿サンプルを、ＥＵプロジェクトの MolPAGE を通じて入手した。
既知の血清タンパク質などの様々なクラスのタンパク質を標的とし、研究する抗体を選択した。９３種の独特のタンパク質をコードする遺伝子の産物を標的とする全部で１３５種の単一特異性抗体 (msAbs) をこの研究に含めた。単一特異性抗体をＨＰＡプロジェクト (www.proteinatlas.org) から得た。対照として、非特異的ウサギＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch）およびＨＳＡ結合 Affibody (Affibody AB）を含めた。すべての血清および血漿サンプルをトリプリケートで分析した。ここで、血漿と血清の両方につき、温度毎に１つの期間を調べた。サンプルをしかるべく希釈し、標識化し、アッセイバッファー中で調製した。次いで、処理は、２３℃、３７℃、４５℃、５６℃で３０分間、並びに、７２℃で１５分間および９６℃で５分間を含んだ。各熱処理期間の後、全サンプルを２３℃に冷却し、次いで、ビーズ混合物と合わせた。
【００５７】
免疫検出性の最適化のために、ビオチン化に続き、ある範囲の温度でサンプルを熱処理した。試験に含まれた温度は、２３℃、３７℃、４５℃、５６℃、７２℃および９６℃であった。図１では、少なくとも２倍のシグナル強度の上昇を示すタンパク質の数を、熱処理温度に対してプロットしている。７２℃は、最高数のシグナルが増加したタンパク質をもたらした。５６℃もかなりの数のシグナルが増加したタンパク質をもたらしたが、その結果は特に血清サンプルにおいて７２℃より優れていなかった。９６℃は、少数のシグナルが増加したタンパク質しかもたらさなかった。
【００５８】
図２では、少なくとも２倍のシグナル強度の低下を示すタンパク質の数の熱処理温度に対するプロットにより、加熱の負の影響を示す。ここで、９６℃は、特に血清サンプルで、比較的多数のシグナルが減少したタンパク質をもたらすと示された。９６℃で、血清サンプルおよび血漿サンプルの両方において、シグナルが減少したタンパク質の数は、実際に、シグナルが増加したタンパク質の数よりも多かった。温度を５６℃から７２℃に上げると、シグナルが減少したタンパク質の数は血清で増加したが、血漿では減少した。
３７℃および４５℃への加熱は、シグナル強度に影響がないか、または、小さい影響しかないと示された。
【００５９】
ｂ）第２のアプローチ
１人の正常な患者からの血清および血漿サンプルを、ＥＵプロジェクトの MolPAGE を通じて入手した。
既知の血清タンパク質などの様々なクラスのタンパク質を標的とし、研究する抗体を選択した。９３種の独特のタンパク質をコードする遺伝子の産物を標的とする全部で１３５種の単一特異性抗体 (msAbs) をこの研究に含めた。単一特異性抗体をＨＰＡプロジェクト (www.proteinatlas.org) から得た。対照として、非特異的ウサギＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch）およびＨＳＡ結合 Affibody (Affibody AB）を含めた。ここで、血漿と血清の両方につき、２つの温度について４つの期間を調べた。サンプルをしかるべく希釈し、標識し、アッセイバッファー中で調製した。次いで、５６℃および７２℃の両方で、５、１０、１５および３０分間の期間を選択し、２３℃で３０分間と比較した。各熱処理期間の後、全サンプルを２３℃に冷却し、次いで、ビーズ混合物と合わせた。２３℃で３０分間、５６℃で３０分間および７２℃で１５分間の処理について、サンプルをトリプリケートで分析した。
【００６０】
図３では、第１のアプローチと同様に、少なくとも２倍のシグナル強度の上昇を示すタンパク質の数を熱処理温度に対してプロットしている。再度、７２℃は、血清および血漿の両方で最高数のシグナルが増加したタンパク質をもたらした。５６℃は血漿でかなりの数のシグナルが増加したタンパク質をもたらしたが、その結果は７２℃ほど良好ではなかった。
【００６１】
図４では、少なくとも２倍のシグナル強度の低下を示すタンパク質の数の熱処理温度に対するプロットにより、第２のアプローチの加熱の負の影響を示す。温度を５６℃から７２℃に上げると、シグナルが減少したタンパク質の数は、血清と血漿の両方で少なかった。一般的に、タンパク質は熱に誘導される凝固に伴ってより沈殿しやすいと考えられるので、これは驚異的であった。
【００６２】
図５は、２３℃、５６℃および７２℃での熱処理後の血清中の９２種のタンパク質のうち６種の検出レベルを示す。図６は、血漿で得られた対応する結果を示す。正規化していない中央値の蛍光強度のレベルを使用して、データをボックスプロットでまとめた。個々の標的タンパク質からのシグナル強度を、各々２３℃で３０分間の処理、５６℃で３０分間の加熱および７２℃で１５分間の加熱の処理後に、直接比較する。タンパク質のいくつかのシグナル強度は加熱後に低下したが、いくつかの他のタンパク質のシグナル強度は上昇した。しかしながら、図のすべてのタンパク質について、シグナルは５６℃の処理後よりも７２℃の処理後に高いことは、注目すべきである。実際に、第２のアプローチで検出されたすべてのタンパク質の中で、温度を５６℃から７２℃に上げたときに、シグナルは１種のタンパク質で減少したのみであった。
【００６３】
結論として、免疫学的検出を使用するとき、約５０℃ないし約８５℃の範囲の温度への加熱は、血液または血液由来サンプル中のタンパク質の分析に、有利な効果を有すると思われる。約７２℃の温度範囲、例えば、６４−８５℃、６６−７８℃または７０−７４℃は、特に有利であると思われる。
【００６４】
ｃ）前立腺癌コホート
スウェーデンの Lund and Malmoe University Hospitals の病理学部から血漿サンプルを得た。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のレベルの日常的な試験を受けた男性患者から、正常ＰＳＡレベルのサンプル２０個および高ＰＳＡレベルのサンプル２０個を集めた。後者の群は、前立腺癌の指標として供される６０−３,０００ｎｇ／ｍｌのＰＳＡレベルを有し、故にこの群を癌群と称した。正常の群は、＜１.５ｎｇ／ｍｌのＰＳＡレベルを有した。上述のＰＳＡレベル以外には、患者の情報は利用可能ではなく、倫理的要件を満たす匿名扱いのサンプルを得た。
【００６５】
研究した抗体は、過去の疾患の優先傾向を伴わず、ＨＰＡプロジェクト（www.proteinatlas.org）内で使用された検証手順におけるそれらの性能によってのみ選択された。９５種の異なる血清タンパク質を標的とする全部で９６種の単一特異性抗体（msAbs）をこの研究に含めた。加えて、３種の抗ＰＳＡ抗体（ＨＰＸ抗体）をRoche (Basel) および HyTest (Finland) から入手し、正の対照として含めた。すべての血漿サンプルを、無作為化したレイアウトで分析し、得られた強度の値を、ｌｏｇ２変換、積分的正規化（integral normalization）および確率的指数正規化（probabilistic quotient normalization）で加工した。
【００６６】
正常サンプルと癌サンプルの間で有意に異なる検出を示すタンパク質をスチューデントｔ検定により同定し、図７および８に示す通り、相対的な倍率変化に関して、火山型プロットにより可視化した。プロットは、正規化された蛍光強度の割合（ｘ軸）および対応する偽陽性率（false discovery rate）で補正されたＰ値（ｙ軸）を示し、一定のタンパク質がどのように異なって検出されるかの有意さを反映する。各標的のＰ値が低いほど、タンパク質が異なって存在する確率は高い。プロットの内側の水平の線は、一般的に使用されるＰ値０.０５および０.０１を各々示す。
【００６７】
図７では、材料と方法のセクションに記載の通り、サンプルを７２℃で熱処理した。３種のＨＰＸ抗体は、ＰＳＡを、正常な患者（低ＰＳＡレベル）と比較して、癌群（高ＰＳＡレベル）において有意に高いレベルで検出していると見出された。加えて、２種の新しいマーカータンパク質、ＨＰＡ０４６４（ｐ＜０.０１）およびＨＰＡ０４８１（ｐ＜０.０５）は、癌群で下方調節されると思われ、７２℃の加熱後にのみ見出された。図８では、サンプルを熱処理せず、これらの患者について、抗ＰＳＡ抗体の包括的な有意さは低下した。ここで、２種の新しいタンパク質が発見され、その中で、前立腺癌と診断されるリスクが高い患者において、ＨＰＡ０００６の標的レベルは高く、ＨＰＡ００５８のものは低かった。結論として、いくつかのタンパク質の免疫検出性は加熱により上昇したが、いくつかの他のタンパク質の免疫検出性は非加熱後に良好であった。
【００６８】
結論として、２種のタンパク質（ＨＰＡ０４６４およびＨＰＡ０４８１）は、健康な対象由来の熱処理サンプルよりも、前立腺癌を有する対象由来の熱処理サンプルにおいて、低い程度で検出された（図７）。しかしながら、この差異は、非熱処理サンプルでは見られない（図８）。その結果、熱処理は、このタイプの分析において、前立腺癌のバイオマーカーとしてのこの２種のタンパク質を同定するために必要であると思われる。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血液または血液由来サンプル中のタンパク質の検出の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
現在、幅広く使用され、十分に受け入れられているプロテオーム分析の技術は質量分析であり、しばしば、２Ｄ−ゲル電気泳動またはクロマトグラフィー技法と組み合わせて用いられる。しかしながら、最近の小型化および並行化技術基盤の発展は、質量分析を支持し、補完する可能性を開いた。
【発明の概要】
【０００３】
概要
第１に、場合により希釈された血液、血清または血漿サンプル中の少なくとも１種のタンパク質の免疫検出性の改善方法が提供され、それは、サンプルと少なくとも１種の親和性リガンドを接触させることに先立ち、サンプルを５０−８５℃の温度に加熱する段階を含む。
【０００４】
第２に、対象由来の血液、血清または血漿中のタンパク質を検出および／または定量する方法が提供され：
ａ）第１および第２の場合により希釈した対象由来の血液、血清または血漿サンプルを提供し；
ｂ）第１のサンプルを５０−８５℃の温度に加熱し；
ｃ）第１のサンプルを、ｂ）の加熱に続いて、加熱により免疫検出性が高められた標的タンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させ；
ｄ）加熱に付していない第２のサンプルを、加熱により免疫検出性が高められていない標的タンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させ；
ｅ）段階ｃ）およびｄ）で形成された抗体と対応する標的タンパク質との間の相互作用を検出し、それにより、血液、血清または血漿中のタンパク質を検出および／または定量する。
【０００５】
第３に、医学的状態のバイオマーカーを同定する方法が提供され、それは、
ａ）その医学的状態を有する第１対象群およびその医学的状態を有さない第２対象群からの血液、血清または血漿サンプルを提供すること、
ｂ）サンプルを、場合により希釈後に、５０−８５℃の温度に加熱すること、
ｃ）少なくとも１種のタンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドとサンプルを接触させ、各群の少なくとも１種のタンパク質のレベルを測定すること、
ｄ）そのレベルを比較し、第１群からのサンプル中に第２群からのサンプル中よりも高いか、または低い程度で生じるタンパク質を同定し、かくしてその医学的状態のバイオマーカーを同定すること、
を含む。
上記の方法の様々な実施態様を、下記でより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図面の簡単な説明
図１−４において、実線は血漿中のタンパク質を表し、破線は血清中のタンパク質を表す。
【図１】図１は、異なる温度（ｘ軸）での熱処理後に少なくとも２倍上昇した免疫検出性を示す血漿または血清中のタンパク質の数（ｙ軸）を示す。
【図２】図２は、異なる温度（ｘ軸）での熱処理後に少なくとも２倍低下した免疫検出性を示す血漿または血清中のタンパク質の数（ｙ軸）を示す。
【図３】図３は、異なる温度（ｘ軸）での熱処理後に少なくとも２倍上昇した免疫検出性を示す血漿または血清中のタンパク質の数（ｙ軸）を示す。
【図４】図４は、異なる温度（ｘ軸）での熱処理後に少なくとも２倍低下した免疫検出性を示す血漿または血清中のタンパク質の数（ｙ軸）を示す。
【図５】図５は、２３℃、５６℃および７２℃での処理後の、血清中のタンパク質と相互作用する６種の異なる親和性リガンドからのシグナルを示す。未加工の蛍光シグナル強度のデータから、３回繰り返した分析の結果に基づいて、ボックスプロットを作成した。ＭＦＩ＝中央値の蛍光強度、ＡＵ＝任意単位。
【図６】図６は、２３℃、５６℃および７２℃での処理後の、血漿中のタンパク質と相互作用する６種の異なる親和性リガンドからのシグナルを示す。未加工の蛍光シグナル強度のデータから、３回繰り返した分析の結果に基づいて、ボックスプロットを作成した。ＭＦＩ＝中央値の蛍光強度、ＡＵ＝任意単位。
【図７】図７は、７２℃での処理後のＰＳＡ低または高患者（ＰＳＡ＞６０ｎｇ／ｍｌ）からの血漿中のタンパク質のレベルの差異を示す。結果を火山型プロット（volcano plot）として提示した。ここで、相対的な倍率変化（fold-change）（ｘ軸）を、ｔ検定結果の有意さ（Ｐ値）（ｙ軸）に対してプロットする。実線はｐ値＜０.０１を表し、破線はｐ値＜０.０５を表す。破線のボックスは…を表す。
【図８】図８は、２３℃での処理後のＰＳＡ低または高患者（ＰＳＡ＞６０ｎｇ／ｍｌ）からの血漿中のタンパク質のレベルの差異を示す。結果を火山型プロットとして提示した。ここで、相対的な倍率変化（ｘ軸）を、ｔ検定結果の有意さ（Ｐ値）（ｙ軸）に対してプロットする。実線はｐ値＜０.０１を表し、破線はｐ値＜０.０５を表す。破線のボックスは、小さい倍率変化および有意さの値のタンパク質が位置する火山型プロットの領域の拡大を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
詳細な説明
本開示の第１の態様として、場合により希釈された血液、血清または血漿サンプル中の少なくとも１種のタンパク質の免疫検出性の改善方法が提供され、それは、サンプルと少なくとも１種の親和性リガンドを接触させることに先立ち、サンプルを５０−８５℃の温度に加熱する段階を含む。
【０００８】
第１の態様の構成として、血液、血清または血漿サンプル中のタンパク質の検出方法が提供され、それは、
ａ）サンプルを５０−８５℃の温度に加熱すること；
ｂ）サンプルを既知の標的タンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させること；
ｃ）少なくとも１種の親和性リガンドと対応するサンプル由来の標的タンパク質との相互作用を検出し、それにより、サンプル中のタンパク質を検出すること、
を含む。
【０００９】
本開示は、血漿および血清サンプルのいくつかのタンパク質は、血漿または血清サンプルを分析前に加熱すると、高い程度で抗体により検出されるという知見に基づく。いかなる特定の科学的理論にも縛られないが、抗体と血清または血漿タンパク質中のそれらの対応するエピトープとの相互作用は、加熱により助長されると考えられる。
【００１０】
本開示の知見は、数々の利点を伴い得る。加熱を使用して、以前には免疫学的方法を使用して検出できなかったタンパク質を検出することが可能であり得る。結果的に、複雑な生物学的サンプルのタンパク質内容のより包括的な像を入手し得る。また、加熱は、そのような複雑な生物学的サンプルに低レベルで存在するタンパク質の検出を可能にし得る。多くの興味深いバイオマーカーは低濃度範囲で見出されると報告されてきたので、これは、特に興味深いものであり得る。従って、本開示の加熱は、プロテオミクス研究の感受性を高める有用な手段であり得る。
【００１１】
本開示の文脈では、タンパク質の「免疫検出性」は、タンパク質の線状または構造的エピトープが、そのようなエピトープと選択的に相互作用できる抗体などの親和性リガンドにより検出され得る程度を表す。
【００１２】
さらに、本開示の文脈では、タンパク質の免疫検出性の「改善」は、エピトープ認識に基づく分析におけるタンパク質からのシグナル（または出力）を、加熱を実施しなかったときのタンパク質からのシグナル（または出力）と比較して高めることを表す。結果的に、免疫検出性が改善されたか否かを決定するために、問題のタンパク質からのシグナルを同時に患者から採られた２種のサンプルで測定し得、ここで、サンプルの一方を測定前に加熱する。加熱したサンプル中のタンパク質からのシグナルが、非加熱サンプル中のタンパク質からのシグナルよりも高いならば、免疫検出性は改善されている。そのような比較の正確さを改善するために、各サンプルの１回より多い測定、および／または、各カテゴリーの１種より多いサンプルの測定を実施し得る。いくつかの実施態様では、シグナルが絶対値で１.５倍または２倍高まっていれば、免疫検出性が改善されたと見なし得る。
【００１３】
「サンプルと少なくとも１種の親和性リガンドを接触させること」は、サンプル中のタンパク質の検出および／または定量を可能にする。結果的に、親和性リガンドの選択性は、親和性リガンドが認識するタンパク質の存在および／または存在量を測定するのに用い得る。接触は、下記でさらに論ずる通り、様々な構成および形式を使用して実施し得る。
【００１４】
本開示の第２の態様として、対象由来の血液、血清または血漿中のタンパク質を検出および／または定量する方法が提供され：
ａ）第１および第２の場合により希釈した対象由来の血液、血清または血漿サンプルを提供し；
ｂ）第１のサンプルを５０−８５℃の温度に加熱し；
ｃ）第１のサンプルを、ｂ）の加熱に続いて、加熱により免疫検出性が高められた標的タンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させ；
ｄ）加熱に付していない第２のサンプルを、加熱により免疫検出性が高められていない標的タンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させ；
ｅ）段階ｃ）およびｄ）で形成された抗体と対応する標的タンパク質との間の相互作用を検出し、それにより、血液、血清または血漿中のタンパク質を検出および／または定量する。
【００１５】
第２の態様は、いくつかのタンパク質の免疫検出性は、本開示の熱処理中に改善されるが、いくつかの他のタンパク質の免疫検出性は上昇せず、減少しさえするという、本発明者らの洞察に基づく。従って、前者のタンパク質の検出を加熱したサンプルで実施し、後者のタンパク質の検出を非加熱サンプルで実施するならば、幅広いタンパク質での感受性の最適化が達成され得る。
【００１６】
当業者は、同じタンパク質の測定を、１回は加熱サンプルで、１回は非加熱サンプルで、単純に２回実施し、得られたシグナルを比較することにより、タンパク質の免疫検出性が改善されたか否かを過度な負担なく決定し得る。熱処理サンプルでシグナルが高ければ、そのタンパク質は、免疫検出性が加熱により高められるタンパク質として選択され、将来の分析では、対応する親和性リガンドを熱処理サンプルと接触させる。
【００１７】
本開示の第３の態様として、医学的状態のバイオマーカーを同定する方法が提供され、それは、
ａ）その医学的状態を有する第１対象群およびその医学的状態を有さない第２対象群からの血液、血清または血漿サンプルを提供すること、
ｂ）サンプルを、場合により希釈後に、５０−８５℃の温度に加熱すること、
ｃ）サンプルを、加熱後に、少なくとも１種のタンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させ、各群の少なくとも１種のタンパク質のレベルを測定すること、
ｄ）そのレベルを比較し、第１群からのサンプル中に第２群からのサンプル中よりも高いか、または低い程度で生じるタンパク質を同定し、かくしてその医学的状態のバイオマーカーを同定すること、
を含む。
【００１８】
本開示の第３の態様は、正常な患者および病気の患者からの加熱サンプルの比較は、非加熱サンプルを分析したときには検出できなかったタンパク質発現における差異を明らかにしたという、発明者らの知見に基づく。結果的に、本開示の方法を使用して、以前には認識できなかったバイオマーカーを同定し得る。これは、図７および８に図解され、そこには、正常な対象と前立腺癌を有する対象に由来する加熱および非加熱サンプル中のある種のタンパク質のレベルが示され、２種の前立腺癌のタンパク質バイオマーカーが同定されている。
【００１９】
第３の態様の医学的状態は、例えば、癌などの疾患または他の医学的障害であり得る。
当業者は、段階ｄ）で２つの群からのレベルを比較し、レベル間の差異が、そのタンパク質がバイオマーカーであると結論づけるのに十分であるか否かを決定する方法を理解している。
【００２０】
第３の態様のある実施態様では、タンパク質は、その濃度が第１の群のサンプル中で第２の群のサンプル中より少なくとも２５％高く、例えば少なくとも５０％高く、例えば少なくとも１００％高いならば、段階ｄ）でバイオマーカーとして同定される。さらに、タンパク質は、検出システムにおけるそこからのシグナルが第１の群のサンプル中で第２の群のサンプル中より少なくとも２５％高く、例えば少なくとも５０％高く、例えば少なくとも１００％高いならば、バイオマーカーとして同定される。ここで、比較されるべき濃度またはシグナルは、サンプル中の濃度の平均または中央値であり得る。また、状況は、タンパク質がサンプルのいくつかでのみ検出されるものであり得、そのような場合、タンパク質は、それが第１の群のサンプルで第２の群よりも高い割合で検出されるならば、段階ｄ）でバイオマーカーとして同定され得る。
また、タンパク質は、それが疾患の群のサンプルで低い程度で検出されるならば、バイオマーカーとして同定され得る。
【００２１】
本開示の実施態様では、本方法は、血液、血漿または血清の非免疫グロブリンタンパク質の検出および／または定量のみに関する。免疫グロブリンタンパク質のいくつかのエピトープの検出性は、免疫グロブリンタンパク質がその抗原と会合しているか否かにより影響される。いかなる特定の科学的理論にも縛られないが、本発明者らは、そのような標的タンパク質の相互作用の形成または解離は加熱の効果の源ではないと考える。加えて、サンプルを加熱することは、免疫グロブリンタンパク質の結合活性を変更し、それによりそれらの機能性の同定を損ない得る。結果的に、本開示の方法の実施態様では、少なくとも１種の親和性リガンドは、少なくとも１種の非免疫グロブリンタンパク質と選択的に相互作用できるものである。
【００２２】
本開示の方法では、サンプルを５０−８５℃の温度に加熱する。下記の実施例の実施態様および図１では、そのような温度範囲は、免疫検出性の上昇をもたらすと示されている。本開示の方法の実施態様では、サンプルを６４−８５℃、例えば６６−７８℃、例えば７０−７４℃、例えば約７２℃の温度に加熱する。下記の実施例の実施態様および図１、３および４では、そのような範囲内の温度は、少なくともいくつかの態様で、５０−８５℃の広い範囲よりも良好であると示されている。
【００２３】
通常、本開示の加熱は、時間的に制限されている。これは、サンプルを最初にある温度に加熱し、その温度でしばらく維持し、次いで通常室温ほどの温度、例えば２０−２５℃に冷却することを意味する。結果的に、加熱に続く段階、例えば、親和性リガンドとの接触は、通常、高い温度では実施されない。本発明者らは、加熱および場合により冷却は、サーモサイクラーで実施し得ることを見出した。（サーモサイクラーは、通常はＰＣＲで使用される。）しかしながら、他の加熱手段も使用し得る。
【００２４】
加熱時間は、労力および材料の効率的な使用を提供し、それにより分析の経済の改善を提供するために、短く維持され得る。例えば、これは、多くのタンパク質を大きい対象群で分析し得るプロテオミクスにおいて有利であり得る。本発明者らは、１時間より短い、または、半時間より短い加熱期間でさえ、満足な結果を得るのに十分であると示した。従って、本開示の実施態様では、加熱は、０.５−５５分間、例えば１−４０分間、例えば１−２９分間、例えば５−２０分間、例えば約１５分間実施する。
【００２５】
下記の実施例では、加熱前にサンプルのタンパク質を標識化する。標識を後にフルオロフォアと反応させ、最後の検出段階で検出する。本発明者らは、そのような標識化は効率的な分析プロトコールを提供し、加熱前の標識化は、加熱後の標識化よりも多数の免疫検出性が上昇したタンパク質をもたらすことを示した。さらに、標識化と加熱の間にサンプルを希釈し得る（例えば１０−１００倍）。
【００２６】
本開示の実施態様では、サンプルのタンパク質は、サンプルと少なくとも１種の親和性リガンドとの接触に続く検出段階で直接的または間接的に検出できる標識で、加熱前に標識化し得る。標識は、例えばビオチンを含み得る。即ち、標識化は、例えばビオチン化であり得る。標識は、それ自体で（直接的）、または、二次標識を介して（間接的）、検出可能であり得る。従って、本開示の方法の実施態様では、標識化されたタンパク質を、親和性リガンドとの接触後、後続の検出段階で検出可能な二次標識と接触させ得る。二次標識は、例えば、フルオロフォアであり得る。
【００２７】
本開示の方法のサンプルは、加熱前に希釈し得る。希釈は、一般的に、免疫学的検出を基礎とする分析において、バックグラウンドのシグナル（ノイズ）並びに標的タンパク質からのシグナルを減らすと考えられる。本開示の実施態様では、加熱前にサンプルを１０−１００００倍、例えば１００−２５００倍、例えば２００−１０００倍、例えば約５００倍に希釈し得る。
【００２８】
サンプルを、例えば、添加物、例えば、ウサギＩｇＧおよび／またはカゼインを含むバッファーを使用して希釈し得る。これらの添加物は、サンプル中のタンパク質と（特異的）親和性リガンドの非特異的結合をクエンチし、それにより検出のノイズを低減し得る。
【００２９】
バッファー中のクエンチする抗体の濃度は、０.０５−５ｍｇ／ｍｌ、例えば０.１−２ｍｇ／ｍｌ、例えば約０.５ｍｇ／ｍｌであり得、バッファー中のカゼインの濃度は、０.０１−１０％（ｗ／ｖ）、例えば０.０５−２％（ｗ／ｖ）、例えば約０.１％（ｗ／ｖ）であり得る。
【００３０】
いくつかのタンパク質の同時検出を提供し、それにより血液、サンプルまたは血漿のタンパク質内容の効率的な分析を提供するために、サンプルを同じ反応区画中の１種より多い親和性リガンドと接触させ得る。３０種より多い異なるタンパク質を同じサンプル中で検出するために、リガンドを後続の検出段階で分析されるビーズに結合させる小型化および並行化されたシステムで、親和性リガンドを使用するのが有利である。さらに、そのようなビーズは、シグナルを後続の検出段階で親和性リガンドに、次いで、タンパク質に結びつける識別を施されていてもよい。そのようなビーズは、「コード化された粒子」と呼ばれることもある；Kingsmore, S.F. Nat Rev. Drug Discovery 2006, 5(4), 310-320 参照。伝統的なサンドイッチアッセイを使用すると、３０種より多い異なるタンパク質を同じサンプルから検出できる設定を提供することは実際的に非常に困難であり、時間がかかる。
【００３１】
結果的に、本開示の方法の実施態様では、加熱は、サンプルを、少なくとも４種、例えば少なくとも１０種、例えば少なくとも３０種、例えば少なくとも５０種の異なる親和性リガンドと接触させる前に実施する。
【００３２】
タンパク質に結合した直接的または間接的に検出可能な標識、および、親和性リガンドに結合した識別を有する検出可能な部分を用いることにより、タンパク質と会合した標識および親和性リガンドと会合した部分からのシグナルを提供しない要素は無視され得るので、検出段階の偽陰性の数を少なく維持し得る。
【００３３】
上記の実施態様は、主に第１の態様を参照して説明されている。しかしながら、当業者は、これらの実施態様は、必要な変更を加えて第２および第３の態様にも適用されることを理解する。
【００３４】
本開示の文脈では、「少なくとも１種の親和性リガンド」は、少なくとも１種類の親和性リガンドを表し、その種類は、親和性リガンドの特異性により定義される。従って、当業者は、１種類の親和性リガンドは、すべて同じ抗原と選択的に相互作用できるポリクローナル抗体の群を表し得ることを理解する。
従って、「異なる親和性リガンド」は、異なる特異性を有する親和性リガンドを表す。
【００３５】
本開示に従って、適切な親和性リガンドを選択または製造し、検出および／または定量に適切な形式および条件を選択することは、当業者の能力に範囲内にあると認められる。それでもやはり、有用であると証明された親和性リガンドの実施例、および、検出および／または定量の形式および条件の実施例を、例示説明のために後述する。
【００３６】
従って、本開示の実施態様では、親和性リガンドは、抗体、その断片およびその誘導体、即ち、免疫グロブリン骨格をベースとする親和性リガンドからなる群から選択され得る。抗体およびその断片または誘導体は、単離され、かつ／または、単一特異性であってよい。抗体は、任意の起源のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含み、ネズミ、ウサギ、ヒトおよび他の抗体、並びに異なる種に由来する配列を含むキメラ抗体、例えば、部分的にヒト化された抗体、例えば、部分的にヒト化されたマウス抗体を含む。ポリクローナル抗体は、選択された抗原による動物の免疫化により産生し得る。定義された特異性のモノクローナル抗体は、Koehler and Milstein (Koehler G and Milstein C (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519) により開発されたハイブリドーマ技術を使用して産生できる。本開示の抗体断片および誘導体は、それらの断片または誘導体の抗体と同じ抗原と選択的に相互作用できるものである。抗体断片および誘導体は、完全な免疫グロブリンタンパク質の重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）からなるＦａｂ断片；２個の可変抗体ドメインＶＨおよびＶＬからなるＦｖ断片 (Skerra A and Plueckthun A (1988) Science 240:1038-1041); 可動性ペプチドリンカーにより一緒に連結された２個のＶＨおよびＶＬドメインからなる一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）(Bird RE and Walker BW (1991) Trends Biotechnol. 9:132-137); Bence Jones dimers (Stevens FJ et al. (1991) Biochemistry 30:6803-6805); ラクダ科の重鎖二量体 (Hamers-Casterman C et al. (1993) Nature 363:446-448) および単一可変領域 (Cai X and Garen A (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:6280-6285; Masat L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:893-896)、および、テンジクザメの新規抗原受容体（the New Antigen Receptor (NAR)）などの単一ドメイン骨格 (Dooley H et al. (2003) Mol. Immunol. 40:25-33) および、可変重鎖ドメインに基づくミニボディー（minibody）(Skerra A and Plueckthun A (1988) Science 240:1038-1041)を含む。
【００３７】
本開示の文脈では、「単一特異性抗体（mono-specific antibody）」は、それ自体の抗原で親和性精製し、それによりそのような単一特異性抗体を他の抗血清タンパク質および非特異的抗体から分離した、ポリクローナル抗体の集団の１つである。この親和性精製は、その抗原に選択的に結合する抗体をもたらす。本開示の方法で使用できる単一特異性抗体を得るために、ポリクローナル血清を２段階の免疫親和性を基礎とするプロトコールにより精製し、標的タンパク質に選択的な単一特異性抗体を入手し得る。捕捉剤としての不動化したタグタンパク質を使用して、抗原断片の一般的な親和性タグに対する抗体を第１の減少段階で除去する。第１の減少段階に続き、抗原に特異的な抗体を濃縮するために、抗原を捕捉剤として血清を第２の親和性カラムに載せる（Nilsson P et al. (2005) Proteomics 5:4327-4337も参照）。
【００３８】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、並びにそれらの断片および誘導体は、本開示によるタンパク質の検出および／または定量のような選択的なバイオマーカーの認識を必要とする応用における親和性リガンドの伝統的な選択肢である。しかしながら、当業者は、選択的に結合するリガンドの高処理量生成および低コストの産生システムへの要望が高まっているため、新しい生体分子多様性技術が開発されてきたことを知っている。これは、免疫グロブリンおよび非免疫グロブリンの両方を起源とする新しいタイプの親和性リガンドの生成を可能にし、それは、生体分子認識の応用における結合リガンドとして同等に有用であると証明される場合もあり、免疫グロブリンの代わりに、または、それと共に、使用できる。
【００３９】
親和性リガンドの選択に必要な生体分子の多様性は、複数の可能な骨格分子の１つの組合せ工学により生成し得、次いで、適当な選択基盤を使用して、特異的かつ／または選択的親和性リガンドを選択する。骨格分子は、免疫グロブリンタンパク質起源のもの（Bradbury AR and Marks JD (2004) J. Immunol. Meths. 290:29-49）、非免疫グロブリンタンパク質起源のもの（Nygren PÅ and Skerra A (2004) J. Immunol. Meths. 290:3-28）、または、オリゴヌクレオチド起源のもの（Gold L et al. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64:763-797) であり得る。
【００４０】
多数の非免疫グロブリンタンパク質の足場が、新規結合タンパク質の開発における支持構造として使用されてきた。本開示に従って使用するための親和性リガンドの生成に有用なそのような構造の非限定的な例は、ブドウ球菌プロテインＡおよびそのドメインおよびこれらのドメインの誘導体、例えば、プロテインＺ（Nord K et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:772-777）；リポカリン（Beste G et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:1898-1903）；アンキリンリピートドメイン（Binz HK et al. (2003) J. Mol. Biol. 332:489-503）；セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）（Smith GP et al. (1998) J. Mol. Biol. 277:317-332; Lehtioe J et al. (2000) Proteins 41:316-322）；γ結晶（Fiedler U and Rudolph R, WO01/04144）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Peelle B et al. (2001) Chem. Biol. 8:521-534）；ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）（Hufton SE et al. (2000) FEBS Lett. 475:225-231; Irving RA et al. (2001) J. Immunol. Meth. 248:31-45）；プロテアーゼ阻害因子、例えばノッティン（Knottin）タンパク質（Wentzel A et al. (2001) J. Bacteriol. 183:7273-7284; Baggio R et al. (2002) J. Mol. Recognit. 15:126-134）およびクニッツ（Kunitz）ドメイン（Roberts BL et al. (1992) Gene 121:9-15; Dennis MS and Lazarus RA (1994) J. Biol. Chem. 269:22137-22144）；ＰＤＺドメイン（Schneider S et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:170-175）；チオレドキシンなどのペプチドアプタマー（Lu Z et al. (1995) Biotechnology 13:366-372; Klevenz B et al. (2002) Cell. Mol. Life Sci. 59:1993-1998）；ブドウ球菌ヌクレアーゼ（Norman TC et al. (1999) Science 285:591-595）；テンダミスタット（tendamistats）(McConell SJ and Hoess RH (1995) J. Mol. Biol. 250:460-479; Li R et al. (2003) Protein Eng. 16:65-72）；フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づくトリネクチン（trinectin）(Koide A et al. (1998) J. Mol. Biol. 284:1141-1151; Xu L et al. (2002) Chem. Biol. 9:933-942）；およびジンクフィンガー（Bianchi E et al. (1995) J. Mol. Biol. 247:154-160; Klug A (1999) J. Mol. Biol. 293:215-218; Segal DJ et al. (2003) Biochemistry 42:2137-2148）である。
【００４１】
上記の非免疫グロブリンタンパク質骨格の例には、新しい結合特異性の生成に使用される単一の無作為化されたループを提示する足場タンパク質、タンパク質表面から突出している側鎖が新規結合特異性の生成のために無作為化された強固な二次構造を有するタンパク質骨格、および、新規結合特異性の生成に使用される非連続的高可変ループ領域を示す足場が含まれる。
【００４２】
非免疫グロブリンタンパク質に加えて、オリゴヌクレオチドも親和性リガンドとして使用され得る。アプタマーまたはデコイと呼ばれる一本鎖核酸は、十分に定義された三次元構造に折り畳まれ、高い親和性および特異性でそれらの標的に結合する。(Ellington AD and Szostak JW (1990) Nature 346:818-822; Brody EN and Gold L (2000) J. Biotechnol. 74:5-13; Mayer G and Jenne A (2004) BioDrugs 18:351-359）。オリゴヌクレオチドリガンドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、幅広い標的の分子クラスに結合できる。
【００４３】
上記の足場構造のいずれかの変異体のプールから所望の親和性リガンドを選択するために、選択された標的タンパク質に対する特異的新規リガンドの単離のための数々の選択基盤が利用可能である。選択基盤には、ファージディスプレイ（Smith GP (1985) Science 228:1315-1317）、リボソームディスプレイ（Hanes J and Plueckthun A (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4937-4942）、酵母ツーハイブリッド法（Fields S and Song O (1989) Nature 340:245-246）、酵母ディスプレイ（Gai SA and Wittrup KD (2007) Curr Opin Struct Biol 17:467-473）、ｍＲＮＡディスプレイ（Roberts RW and Szostak JW (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12297-12302）、細菌ディスプレイ（Daugherty PS (2007) Curr Opin Struct Biol 17:474-480, Kronqvist N et al. (2008) Protein Eng Des Sel 1-9, Harvey BR et al. (2004) PNAS 101(25):913-9198）、ミクロビーズディスプレイ（Nord O et al. (2003) J Biotechnol 106:1-13, WO01/05808）、ＳＥＬＥＸ（System Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) (Tuerk C and Gold L (1990) Science 249:505-510）およびタンパク質断片相補性アッセイ（ＰＣＡ）（Remy I and Michnick SW (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:5394-5399）が含まれるがこれらに限定されない。
【００４４】
従って、本開示の実施態様では、親和性リガンドは、上記のタンパク質足場のいずれかに由来する非免疫グロブリン親和性リガンド、または、オリゴヌクレオチド分子であり得る。
【００４５】
本開示の検出および／または定量は、抗体のような親和性リガンドと抗原との間の相互作用を基礎とするアッセイにおける結合試薬の検出および／または定量のために当業者に知られているどのような方法でも達成し得る。従って、上記の親和性リガンドのいずれも、血液または血液由来サンプル中のタンパク質の存在を定量的および／または定性的に検出するのに使用し得る。これらの「一次」親和性リガンドは、様々なマーカーでそれら自体標識され得るか、または、検出、可視化および／または定量を可能にする二次的な標識化された親和性リガンドにより検出され得る。これは、一次または二次親和性リガンドに結合できる多数の標識の１種またはそれ以上を使用して、当業者に知られている多数の技法の１つまたはそれ以上を使用して、そしていかなる過度な実験も伴わずに、達成できる。
【００４６】
一次および／または二次親和性リガンドに結合させられる標識の非限定的な例には、蛍光染料または金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレサミン）、発色団の染料（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、ルミナール、イミダゾール）および生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えば、ビオチン）が含まれる。様々な他の有用な発蛍光物質（fluorescers）および発色団が、Stryer L (1968) Science 162:526-533 and Brand L and Gohlke JR (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868 に記載されている。親和性リガンドは、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ）および粒子（例えば、金）で標識することもできる。本開示の文脈では、「粒子」は、分子の標識化に適する金属粒子などの粒子を表す。さらに、親和性リガンドは、蛍光性半導体ナノ結晶（量子ドット）でも標識し得る。量子ドットは、有機発蛍光団と比較して量子収率に優れ、より光安定性であり、従って、より容易に検出される（Chan et al. (2002) Curr Opi Biotech. 13: 40-46）。様々なタイプの標識を、様々な化学、例えば、アミン反応またはチオール反応を使用して、親和性リガンドに結合させることができる。しかしながら、アミンおよびチオール以外の反応基、例えば、アルデヒド、カルボン酸およびグルタミンを使用できる。
上記の方法の態様は、いくつかの既知の形式および構成のいずれかで実践し得、その非限定的な選択を下記で論ずる。
【００４７】
親和性リガンドの標識の可視化方法には、蛍光定量的、発光定量的および／または酵素的技法が含まれ得るが、これらに限定されない。蛍光は、蛍光標識を特定の波長の光に曝し、その後、特定の波長領域で発せられる光を検出および／または定量することにより、検出および／または定量する。発光的にタグ付けされた親和性リガンドの存在は、化学反応中に生じる発光により検出および／または定量し得る。酵素的反応の検出は、化学反応から生じるサンプル中の色の変化による。様々なタイプのＥＬＩＳＡ：ｓは、酵素的反応を基礎とする方法の例である。当業者は、適切な検出および／または定量のために、様々な異なるプロトコールを改変できることを知っている。
【００４８】
いかなる特定の科学的理論にも縛られないが、本発明者らは、本開示の加熱を使用すると、線状エピトープの免疫検出性が上昇すると考える。従って、本開示の方法の実施態様では、親和性リガンドは、線状／連続的エピトープと選択的に相互作用できるものであり得る。一例として、線状／連続的エピトープと選択的に相互作用できる抗体は、そのエピトープを含むが（強固な）二次構造を形成していないペプチドで動物を免疫化することにより産生し得る。下記の実施例のセクションで用いる抗体は、線状／連続的エピトープを認識する抗体を頻繁にもたらすタンパク質エピトープシグニチャータグ（Protein Epitope Signature Tag）（ＰｒＥＳＴ）免疫化を使用して産生した。
【実施例】
【００４９】
例示的実施態様の詳細な説明
材料と方法
ビーズカップリング
単一特異性抗体を、微細な改変を加えた製造業者のプロトコールに従い、カルボキシル化ビーズ（COOH Micorspheres, Luminex-Corp.）にカップリングさせた。前立腺癌のアプローチには、各抗体３.２μｇを、遠心分離のフィルターユニット（Ultrafree-MC, Millipore）を使用して１０６個のビーズにカップリングし、最終濃度４０μｇ／ｍｌとした。ビーズを、ＮａＮ３を含むタンパク質を含有するバッファー（Blocking Reagent for ELISA, Roche）中に保存した。すべてのカップリングしたビーズを超音波洗浄機（Branson, Ultrasonic Corporation）中で５分間超音波処理して再懸濁し、その後４℃で保存した。１００−ｐｌｅｘのビーズ混合物を溶液中に創製し、以前に記載された通りに最適化し（Schwenk et al (2007) Mol Cell Proteomics 6, 125-132）、この研究を通して利用した。
【００５０】
下記の第１および第２のアプローチのために、磁気カルボキシル化ビーズ（MagPlex Micorspheres, Luminex-Corp.）を利用した。上記のプロトコールとの違いは、ビーズをマイクロタイタープレート（Greiner Bioone）中でカップリングさせ、プレートを磁石（LifeSept, Dexter）の上に置いてビーズを洗浄することである。最後に、７６−ｐｌｅｘのビーズ混合物を溶液中に創製した。
【００５１】
血清および血漿の標識化およびアッセイの手順
最初に、サンプル（血漿または血清）を室温で融解し、１０分間１０,０００ｒｐｍで遠心分離した。各サンプル３０μｌをマイクロタイタープレート（Abgene）に移し、次いで、プレートを密閉し、ボルテックスし、遠心分離した（１分間、３,０００ｒｐｍ）。次に、各サンプル３μｌを新しいマイクロタイタープレートに移し、続いてリキッドハンドラー（Plate mate 2x2, Matrix）を使用して１×ＰＢＳ２２μｌを各サンプルに添加し、次いで、プレートを密閉し、ボルテックスし、遠心分離した（１分間、３,０００ｒｐｍ）。続いて、ビオチノイル−テトラオキサペンタデカン酸のＮ−ヒドロキシサクシニミジルエステル（NHS-PEO4-Biotin, Pierce）を１０倍のモル過剰で添加し、総合して１／１０のサンプル希釈物を得、続いて２時間４℃でマイクロタイタープレートシェーカー（Thermomixer, Eppendorf）中でインキュベートした。ビオチンに対して２５０倍のモル過剰のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０の添加により反応を停止させ、さらに２０分間４℃でインキュベートした。次いで、サンプルをすぐに使用するか、または、−８０℃で保存した。
【００５２】
全サンプルを、組み込まれていないビオチンを除去せずに利用し、１／５０に、即ち、サンプル１μｌおよびアッセイバッファー（０.５％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコールおよび０.８％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（Sigma）、０.１％（ｗ／ｖ）カゼイン中、ＰＢＳ（ＰＶＸＣ）中、０.５ｍｇ／ｍｌ非特異的ウサギＩｇＧ（Bethyl）を添加）４９μｌに希釈した。対照として、非特異的ウサギＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch）およびＨＳＡ結合 Affibody (Affibody AB）を含めた。次に、プレートを、サーモサイクラー（DNA Engine Tetrad cycler, PTC225, BioRad）中で、７２℃で１５分間熱処理し、続いて１５分間２３℃でインキュベートした。次いで、プレートを遠心分離し（１分間、３,０００ｒｐｍ）、各サンプル４５μｌをビーズ混合物５μｌに添加した。インキュベーションを終夜シェーカーで２３℃で行い、これに続いて、ウェル中で、３×５０μｌＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ ｐＨ７.４、０.１％ Tween20）でビーズを洗浄した。
【００５３】
磁気ビーズを用いて行う第１および第２のアプローチには、マイクロタイタープレート (Greiner Bioone) を、プレート洗浄用の磁気ビーズ沈降に関連して使用した。上記の前立腺癌のアプローチには、底にフィルターのあるマイクロタイタープレート (Millipore) を用い、ビーズの洗浄に吸引装置 (Millipore) を利用した。
【００５４】
洗浄に続いて、ＰＢＳ中にパラホルムアルデヒド０.１％を含有する停止溶液５０μｌと共に１０分間インキュベートした。次に、１×５０μｌのＰＢＳＴおよび５０μｌの０.５μｇ／ｍｌ Ｒ−フィコエリトリン標識ストレプトアビジン（Invitrogen）（ＰＢＳＴ中）をビーズ混合物に添加し、２０分間、シェーカーで、２３℃でインキュベートした。最後に、ウェルをＰＢＳＴ３×５０μｌで洗浄し、ＰＢＳＴ１００μｌ中で測定した。
【００５５】
読み取りおよびデータ分析
測定は、Luminex LX200 機器で Luminex IS 2.3 ソフトウェアを使用して実施し、各シグナル特異性分析のために、色コードＩＤ毎に１００事象を計測した。各抗体のカップリング効率を、Ｒ−フィコエリトリン標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch）により測定した。抗体−タンパク質相互作用を示すために、中央値の蛍光強度（ＭＦＩ）を選択した。データ分析およびグラフ表示は、Microsoft Office Excel 2003 または R、統計的コンピューター処理およびグラフィックスの言語と環境 (Ihaka, R et al (1996) J. Comput. Graph. Stat. 5, 299-3214) を使用して実施した。
【００５６】
結果
ａ）第１のアプローチ
１人の正常な患者からの血清および血漿サンプルを、ＥＵプロジェクトの MolPAGE を通じて入手した。
既知の血清タンパク質などの様々なクラスのタンパク質を標的とし、研究する抗体を選択した。９３種の独特のタンパク質をコードする遺伝子の産物を標的とする全部で１３５種の単一特異性抗体 (msAbs) をこの研究に含めた。単一特異性抗体をＨＰＡプロジェクト (www.proteinatlas.org) から得た。対照として、非特異的ウサギＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch）およびＨＳＡ結合 Affibody (Affibody AB）を含めた。すべての血清および血漿サンプルをトリプリケートで分析した。ここで、血漿と血清の両方につき、温度毎に１つの期間を調べた。サンプルをしかるべく希釈し、標識化し、アッセイバッファー中で調製した。次いで、処理は、２３℃、３７℃、４５℃、５６℃で３０分間、並びに、７２℃で１５分間および９６℃で５分間を含んだ。各熱処理期間の後、全サンプルを２３℃に冷却し、次いで、ビーズ混合物と合わせた。
【００５７】
免疫検出性の最適化のために、ビオチン化に続き、ある範囲の温度でサンプルを熱処理した。試験に含まれた温度は、２３℃、３７℃、４５℃、５６℃、７２℃および９６℃であった。図１では、少なくとも２倍のシグナル強度の上昇を示すタンパク質の数を、熱処理温度に対してプロットしている。７２℃は、最高数のシグナルが増加したタンパク質をもたらした。５６℃もかなりの数のシグナルが増加したタンパク質をもたらしたが、その結果は特に血清サンプルにおいて７２℃より優れていなかった。９６℃は、少数のシグナルが増加したタンパク質しかもたらさなかった。
【００５８】
図２では、少なくとも２倍のシグナル強度の低下を示すタンパク質の数の熱処理温度に対するプロットにより、加熱の負の影響を示す。ここで、９６℃は、特に血清サンプルで、比較的多数のシグナルが減少したタンパク質をもたらすと示された。９６℃で、血清サンプルおよび血漿サンプルの両方において、シグナルが減少したタンパク質の数は、実際に、シグナルが増加したタンパク質の数よりも多かった。温度を５６℃から７２℃に上げると、シグナルが減少したタンパク質の数は血清で増加したが、血漿では減少した。
３７℃および４５℃への加熱は、シグナル強度に影響がないか、または、小さい影響しかないと示された。
【００５９】
ｂ）第２のアプローチ
１人の正常な患者からの血清および血漿サンプルを、ＥＵプロジェクトの MolPAGE を通じて入手した。
既知の血清タンパク質などの様々なクラスのタンパク質を標的とし、研究する抗体を選択した。９３種の独特のタンパク質をコードする遺伝子の産物を標的とする全部で１３５種の単一特異性抗体 (msAbs) をこの研究に含めた。単一特異性抗体をＨＰＡプロジェクト (www.proteinatlas.org) から得た。対照として、非特異的ウサギＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch）およびＨＳＡ結合 Affibody (Affibody AB）を含めた。ここで、血漿と血清の両方につき、２つの温度について４つの期間を調べた。サンプルをしかるべく希釈し、標識し、アッセイバッファー中で調製した。次いで、５６℃および７２℃の両方で、５、１０、１５および３０分間の期間を選択し、２３℃で３０分間と比較した。各熱処理期間の後、全サンプルを２３℃に冷却し、次いで、ビーズ混合物と合わせた。２３℃で３０分間、５６℃で３０分間および７２℃で１５分間の処理について、サンプルをトリプリケートで分析した。
【００６０】
図３では、第１のアプローチと同様に、少なくとも２倍のシグナル強度の上昇を示すタンパク質の数を熱処理温度に対してプロットしている。再度、７２℃は、血清および血漿の両方で最高数のシグナルが増加したタンパク質をもたらした。５６℃は血漿でかなりの数のシグナルが増加したタンパク質をもたらしたが、その結果は７２℃ほど良好ではなかった。
【００６１】
図４では、少なくとも２倍のシグナル強度の低下を示すタンパク質の数の熱処理温度に対するプロットにより、第２のアプローチの加熱の負の影響を示す。温度を５６℃から７２℃に上げると、シグナルが減少したタンパク質の数は、血清と血漿の両方で少なかった。一般的に、タンパク質は熱に誘導される凝固に伴ってより沈殿しやすいと考えられるので、これは驚異的であった。
【００６２】
図５は、２３℃、５６℃および７２℃での熱処理後の血清中の９２種のタンパク質のうち６種の検出レベルを示す。図６は、血漿で得られた対応する結果を示す。正規化していない中央値の蛍光強度のレベルを使用して、データをボックスプロットでまとめた。個々の標的タンパク質からのシグナル強度を、各々２３℃で３０分間の処理、５６℃で３０分間の加熱および７２℃で１５分間の加熱の処理後に、直接比較する。タンパク質のいくつかのシグナル強度は加熱後に低下したが、いくつかの他のタンパク質のシグナル強度は上昇した。しかしながら、図のすべてのタンパク質について、シグナルは５６℃の処理後よりも７２℃の処理後に高いことは、注目すべきである。実際に、第２のアプローチで検出されたすべてのタンパク質の中で、温度を５６℃から７２℃に上げたときに、シグナルは１種のタンパク質で減少したのみであった。
【００６３】
結論として、免疫学的検出を使用するとき、約５０℃ないし約８５℃の範囲の温度への加熱は、血液または血液由来サンプル中のタンパク質の分析に、有利な効果を有すると思われる。約７２℃の温度範囲、例えば、６４−８５℃、６６−７８℃または７０−７４℃は、特に有利であると思われる。
【００６４】
ｃ）前立腺癌コホート
スウェーデンの Lund and Malmoe University Hospitals の病理学部から血漿サンプルを得た。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のレベルの日常的な試験を受けた男性患者から、正常ＰＳＡレベルのサンプル２０個および高ＰＳＡレベルのサンプル２０個を集めた。後者の群は、前立腺癌の指標として供される６０−３,０００ｎｇ／ｍｌのＰＳＡレベルを有し、故にこの群を癌群と称した。正常の群は、＜１.５ｎｇ／ｍｌのＰＳＡレベルを有した。上述のＰＳＡレベル以外には、患者の情報は利用可能ではなく、倫理的要件を満たす匿名扱いのサンプルを得た。
【００６５】
研究した抗体は、過去の疾患の優先傾向を伴わず、ＨＰＡプロジェクト（www.proteinatlas.org）内で使用された検証手順におけるそれらの性能によってのみ選択された。９５種の異なる血清タンパク質を標的とする全部で９６種の単一特異性抗体（msAbs）をこの研究に含めた。加えて、３種の抗ＰＳＡ抗体（ＨＰＸ抗体）をRoche (Basel) および HyTest (Finland) から入手し、正の対照として含めた。すべての血漿サンプルを、無作為化したレイアウトで分析し、得られた強度の値を、ｌｏｇ２変換、積分的正規化（integral normalization）および確率的指数正規化（probabilistic quotient normalization）で加工した。
【００６６】
正常サンプルと癌サンプルの間で有意に異なる検出を示すタンパク質をスチューデントｔ検定により同定し、図７および８に示す通り、相対的な倍率変化に関して、火山型プロットにより可視化した。プロットは、正規化された蛍光強度の割合（ｘ軸）および対応する偽陽性率（false discovery rate）で補正されたＰ値（ｙ軸）を示し、一定のタンパク質がどのように異なって検出されるかの有意さを反映する。各標的のＰ値が低いほど、タンパク質が異なって存在する確率は高い。プロットの内側の水平の線は、一般的に使用されるＰ値０.０５および０.０１を各々示す。
【００６７】
図７では、材料と方法のセクションに記載の通り、サンプルを７２℃で熱処理した。３種のＨＰＸ抗体は、ＰＳＡを、正常な患者（低ＰＳＡレベル）と比較して、癌群（高ＰＳＡレベル）において有意に高いレベルで検出していると見出された。加えて、２種の新しいマーカータンパク質、ＨＰＡ０４６４（ｐ＜０.０１）およびＨＰＡ０４８１（ｐ＜０.０５）は、癌群で下方調節されると思われ、７２℃の加熱後にのみ見出された。図８では、サンプルを熱処理せず、これらの患者について、抗ＰＳＡ抗体の包括的な有意さは低下した。ここで、２種の新しいタンパク質が発見され、その中で、前立腺癌と診断されるリスクが高い患者において、ＨＰＡ０００６の標的レベルは高く、ＨＰＡ００５８のものは低かった。結論として、いくつかのタンパク質の免疫検出性は加熱により上昇したが、いくつかの他のタンパク質の免疫検出性は非加熱後に良好であった。
【００６８】
結論として、２種のタンパク質（ＨＰＡ０４６４およびＨＰＡ０４８１）は、健康な対象由来の熱処理サンプルよりも、前立腺癌を有する対象由来の熱処理サンプルにおいて、低い程度で検出された（図７）。しかしながら、この差異は、非熱処理サンプルでは見られない（図８）。その結果、熱処理は、このタイプの分析において、前立腺癌のバイオマーカーとしてのこの２種のタンパク質を同定するために必要であると思われる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
場合により希釈された血液、血清または血漿サンプル中の少なくとも１種のタンパク質の免疫検出性の改善方法であって、サンプルと、該少なくとも１種のタンパク質の検出および／または定量用の少なくとも１種の親和性リガンドとを接触させることに先立ち、サンプルを６４ないし８５℃の温度に加熱する段階を含む方法。
【請求項２】
サンプルを６６ないし７８℃、例えば７０ないし７４℃、例えば約７２℃の温度に加熱する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルと、少なくとも４種、例えば少なくとも１０種、例えば少なくとも３０種、例えば少なくとも５０種の異なる親和性リガンドとの接触に先立ち、加熱を実施する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
温度を０.５ないし４５分間、例えば１ないし３０分間、例えば１ないし２９分間、例えば５ないし２０分間維持する、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
加熱に先立ち、サンプルと少なくとも１種の親和性リガンドとの接触後の検出段階で直接的または間接的に検出可能な標識によりサンプルのタンパク質を標識化する、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
標識がビオチンを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
加熱前にサンプルを１０ないし１００００倍、例えば１００ないし２５００倍に希釈する、請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ウサギＩｇＧおよび／またはカゼインを含むバッファーでサンプルを希釈する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
バッファー中のウサギＩｇＧの濃度が０.０５ないし５ｍｇ／ｍｌ、例えば０.１ないし２ｍｇ／ｍｌであり、バッファー中のカゼインの濃度が０.０１ないし１％（ｗ／ｖ）、例えば０.０５ないし２％（ｗ／ｖ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の親和性リガンドが少なくとも１種の抗体である、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１種の親和性リガンドを、同定可能な部分、例えば同定可能なビーズにカップリングさせる、請求項１ないし請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
対象由来の血液、血清または血漿中のタンパク質を検出および／または定量する方法であって：
ａ）第１および第２の場合により希釈した対象由来の血液、血清または血漿サンプルを提供し；
ｂ）第１のサンプルを５０ないし８５℃の温度に加熱し；
ｃ）第１のサンプルを、ｂ）の加熱に続いて、加熱により免疫検出性が高められる標的タンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させ；
ｄ）加熱に付していない第２のサンプルを、加熱により免疫検出性が高められない標的タンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させ；
ｅ）段階ｃ）およびｄ）で形成された抗体と対応する標的タンパク質との間の相互作用を検出し、それにより、血液、血清または血漿中のタンパク質を検出および／または定量する、方法。
【請求項１３】
医学的状態のバイオマーカーを同定する方法であって、
ａ）その医学的状態を有する第１対象群およびその医学的状態を有さない第２対象群からの血液、血清または血漿サンプルを提供すること、
ｂ）サンプルを、場合により希釈後に、５０ないし８５℃の温度に加熱すること、
ｃ）加熱後に、少なくとも１種のタンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドとサンプルを接触させ、各群の少なくとも１種のタンパク質のレベルを測定すること、
ｄ）そのレベルを比較し、第１群からのサンプル中に第２群からのサンプル中よりも高いか、または低い程度で生じるタンパク質を同定し、かくしてその医学的状態のバイオマーカーを同定すること、
を含む方法。
【請求項１】
場合により希釈された血液、血清または血漿サンプル中の少なくとも１種のタンパク質の免疫検出性の改善方法であって、サンプルと、該少なくとも１種のタンパク質の検出および／または定量用の少なくとも１種の親和性リガンドとを接触させることに先立ち、サンプルを６４ないし８５℃の温度に加熱する段階を含む方法。
【請求項２】
サンプルを６６ないし７８℃、例えば７０ないし７４℃、例えば約７２℃の温度に加熱する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルと、少なくとも４種、例えば少なくとも１０種、例えば少なくとも３０種、例えば少なくとも５０種の異なる親和性リガンドとの接触に先立ち、加熱を実施する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
温度を０.５ないし４５分間、例えば１ないし３０分間、例えば１ないし２９分間、例えば５ないし２０分間維持する、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
加熱に先立ち、サンプルと少なくとも１種の親和性リガンドとの接触後の検出段階で直接的または間接的に検出可能な標識によりサンプルのタンパク質を標識化する、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
標識がビオチンを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
加熱前にサンプルを１０ないし１００００倍、例えば１００ないし２５００倍に希釈する、請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ウサギＩｇＧおよび／またはカゼインを含むバッファーでサンプルを希釈する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
バッファー中のウサギＩｇＧの濃度が０.０５ないし５ｍｇ／ｍｌ、例えば０.１ないし２ｍｇ／ｍｌであり、バッファー中のカゼインの濃度が０.０１ないし１％（ｗ／ｖ）、例えば０.０５ないし２％（ｗ／ｖ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の親和性リガンドが少なくとも１種の抗体である、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１種の親和性リガンドを、同定可能な部分、例えば同定可能なビーズにカップリングさせる、請求項１ないし請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
対象由来の血液、血清または血漿中のタンパク質を検出および／または定量する方法であって：
ａ）第１および第２の場合により希釈した対象由来の血液、血清または血漿サンプルを提供し；
ｂ）第１のサンプルを５０ないし８５℃の温度に加熱し；
ｃ）第１のサンプルを、ｂ）の加熱に続いて、加熱により免疫検出性が高められる標的タンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させ；
ｄ）加熱に付していない第２のサンプルを、加熱により免疫検出性が高められない標的タンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドと接触させ；
ｅ）段階ｃ）およびｄ）で形成された抗体と対応する標的タンパク質との間の相互作用を検出し、それにより、血液、血清または血漿中のタンパク質を検出および／または定量する、方法。
【請求項１３】
医学的状態のバイオマーカーを同定する方法であって、
ａ）その医学的状態を有する第１対象群およびその医学的状態を有さない第２対象群からの血液、血清または血漿サンプルを提供すること、
ｂ）サンプルを、場合により希釈後に、５０ないし８５℃の温度に加熱すること、
ｃ）加熱後に、少なくとも１種のタンパク質と選択的に相互作用できる少なくとも１種の親和性リガンドとサンプルを接触させ、各群の少なくとも１種のタンパク質のレベルを測定すること、
ｄ）そのレベルを比較し、第１群からのサンプル中に第２群からのサンプル中よりも高いか、または低い程度で生じるタンパク質を同定し、かくしてその医学的状態のバイオマーカーを同定すること、
を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１２−５３１５８２（Ｐ２０１２−５３１５８２Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１７４３７（Ｐ２０１２−５１７４３７）
【出願日】平成２１年６月２６日（２００９．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００９／０００３２８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１５１１８０
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５０８１７８４９０）アトラス・アンティボディーズ・アクチボラゲット (11)
【氏名又は名称原語表記】Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＡＢ
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２６日（２００９．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００９／０００３２８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１５１１８０
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５０８１７８４９０）アトラス・アンティボディーズ・アクチボラゲット (11)
【氏名又は名称原語表記】Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＡＢ
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