免疫細胞の新規エンドヌクレアーゼ、これを製造するための方法およびこれを用いる免疫アジュバント
【課題】免疫細胞から分泌され、そして外来性物質として細菌ＤＮＡを認識し、またそれをプロセシングして免疫応答に関わるＣｐＧモチーフを含む約10塩基対の一本鎖オリゴヌクレオチドを生産する新規エンドヌクレアーゼの提供。
【解決手段】当該エンドヌクレアーゼを製造するための方法であって、ヒトＢ−リンパ芽球ＩＭ９細胞系またはＴＰＡで処理された骨髄性Ｕ937細胞系を適切な培地にて培養して当該エンドヌクレアーゼを生産する工程、および細胞溶解物または培養培地から当該エンドヌクレアーゼを単離する工程を含む方法。加うるに、当該エンドヌクレアーゼによって細菌ＤＮＡを処理することによって生産される、ＣｐＧモチーフを有する約10塩基対の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む免疫アジュバント。
【解決手段】当該エンドヌクレアーゼを製造するための方法であって、ヒトＢ−リンパ芽球ＩＭ９細胞系またはＴＰＡで処理された骨髄性Ｕ937細胞系を適切な培地にて培養して当該エンドヌクレアーゼを生産する工程、および細胞溶解物または培養培地から当該エンドヌクレアーゼを単離する工程を含む方法。加うるに、当該エンドヌクレアーゼによって細菌ＤＮＡを処理することによって生産される、ＣｐＧモチーフを有する約10塩基対の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む免疫アジュバント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫細胞から分泌され、外来性物質として細菌ＤＮＡを認識し、そしてそれをプロセシングして、免疫応答に関わることが知られているＣｐＧモチーフを含むおよそ10塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する、新規エンドヌクレアーゼ酵素に関する。加えて本発明は、前記エンドヌクレアーゼ酵素によって産生される前記のおよそ10塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む免疫アジュバントに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物は、外来性物質に対して防御をするための免疫系を有している。その免疫系は、自然の（非特異的）免疫または後天性の（抗原特異的）免疫に分類される。生得的な、あるいは非特異的な免疫は、一つの種によって引き起こされる疾病に対する第一次の抵抗であり、構造的、生理的、エンドサイトーシス、およびファゴサイトーシス、ならびに炎症性応答などの４つのタイプとしての防御バリアを創出する。代表的な構造的防御バリアの例としては、皮膚および粘膜が挙げられる。生理的防御バリアには、例えば、温度、ｐＨ、酸素圧、および様々な水溶性因子が包含される。エンドサイトーシスおよびファゴサイトーシスの防御バリアとは、外来性の巨大分子が特定の細胞の中に取り込まれてその後分解される、エンドサイトーシスおよびファゴサイトーシスの分解システムのことをいう。炎症の防御バリアは、細菌の侵入とそれに続く皮膚の損傷によって産生される様々な血管作用性および化学走性物質によって導かれる炎症性応答である。その後、凝固、キニン、線維素溶解性などの酵素系または補体が活性化される。後天的免疫は、生得的な免疫と、前者が特異性、多様性、記憶ならびに自己および／または非自己認識を備えているという点で相違している。後天的免疫の特性は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、抗体、サイトカイン等により応答する、体液性および細胞性の免疫に由来する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
微生物の侵入による免疫応答は、侵入の初期段階で微生物の特定の分子を速やかに認識する生得的な機構によって発生する。微生物に存在するタンパク質および脂質は、抗原に特異的に応答する免疫系を誘導する物質としてよく知られている。ＬＰＳ、ホルミルメチオニン、リポアラビノマンナン、ペプチドグリカン等は、補体系を直接的に活性化する物質としてよく知られている（Marrack, P., および Kapple, J. W. (1994) Cell 76, 323-332）。近年、哺乳動物において体液性および細胞性免疫が、それらの内因性ＤＮＡを細菌ＤＮＡから識別し、そしてその細菌ＤＮＡを異物として認識することにより活性化されること、そしてかかる細菌ＤＮＡが生得的免疫に関わることが、多くの研究者によって明らかにされてきている。
【０００４】
全身性狼蒼エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫疾患の際に、大量の抗−ＤＮＡ抗体が産生されるという事実から、抗原または自己抗原の観点でＤＮＡが研究されてきている。抗−ＤＮＡ抗体は、ＳＬＥに関連して血清学的に最も重要であると考えられ、それは腎損傷、皮膚の発疹、関節炎等に関わる主要なメディエーターとして機能する。（Tan, E. M. (1989) A Textbook in Rheumatology, 11版, D. J. McCarty, 編, Led および Febiger, Philadelphoa, ＰＡ, 1049；Isenberg, D. A. ら (1997) 1996年5月、ロンドンで開催されたＤＮＡ抗体に関する国際ワークショップでの、全身性狼蒼エリテマトーデス−ＡにおけるＤＮＡに対する抗体の役割の、概説および序論、Lupus 6, 290-304；Swaak, A. J. G. ら (1979) Arthritis Rheum. 22, 226-235；ならびにIsenberg, D. A. ら (1994) Arthritis Rheum. 37, 169-180）。これらの抗体は、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡに存在する構造決定因子に結合することが示された（Isenberg, D. A. ら (1994) Arthritis Rheum. 37, 169-180；Pisetskyi, D. S. (1992) Rheum. Dis. Clin. North. Am. 18, 437-454；ならびに Shoenfield, Y., および Isenberg, D. A., (1989) Immunol. Today 10, 123-126）。ＳＬＥの原因は正確には解明していないが、最近の研究により、ＤＮＡ抗原がその疾病に顕著に関係していることが明示されている（Shlomechik, M. J. ら (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 9150-9154；Shlomechik, M. J. ら (1990) J. Exp. Med. 171, 265-292；および Tillman, D. M. ら (1992) J. Exp. Med. 176, 761-779）。研究者らは、細菌ＤＮＡに対する免疫応答を調べるために、正常マウスおよび自己免疫疾患マウスを使用した（Gilkeson, G. S. ら (1989) Clin. Immunol. Immunopathol. 51, 1482-1486；Gilkeson, G. S. ら (1993) J. Immunol. 151, 1353-1364；および Gilkeson, G. S. ら (1995) J. Clin. Invest. 95, 1398-1402）。哺乳動物ＤＮＡとは異なり、細菌ＤＮＡはポリクローナルＢ細胞を活性化し、そしてマウスでの特異性を有する抗体を生産するという、強力な免疫特性を保有している（Gilkeson, G. S. ら (1995) J. Clin. Invest. 95, 1398-1402；および Gilkeson, G. S. ら (1991) Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 288-300）。活性の程度は、細菌ＤＮＡに存在する塩基配列モチーフが哺乳動物ＤＮＡの塩基配列モチーフと相違し、そして異物、すなわち非自己として認識し得るという事実に起因している（Messina, J. P. ら (1993) Cell. Immunol. 147, 148-157；Krieg, A. M. ら (1995) Nature 374, 546-549；および Halpern, M. D. ら (1996) Cell Immunol. 167, 72-78）。正常マウスに細菌ＤＮＡで免疫誘発処理されると、マウスは細菌の二本鎖ＤＮＡだけでなく哺乳動物および細菌の一本鎖ＤＮＡにも結合することができる抗体を生産する（Gilkeson, G. S. ら (1991) Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 288-300）。しかしながら、哺乳動物の二本鎖ＤＮＡと交差反応性を有する自己抗体はまったく生産されなかった。正常マウスと異なり、二本鎖ＤＮＡによって免疫誘発処理された前自己免疫（NZB X NZW） F1 （NZB/W）マウスは、哺乳動物の二本鎖ＤＮＡと結合する交差反応性抗体を生産した（Gilkeson, G. S. ら (1995) J. Clin. Invest. 95, 1398-1402）。このように、自己免疫疾患マウスは、細菌ＤＮＡで免疫付与されると、その動物は哺乳動物ＤＮＡと交差反応性を有する抗−二本鎖ＤＮＡ抗体を生産する能力を有する。それは、NZB/W マウスでの免疫レギュレーターの欠如において、細菌ＤＮＡによって生産される自己応答性の抗−二本鎖ＤＮＡ Ｂ細胞がそれらの内因性ＤＮＡに応答する誤寛容が起こることに起因しており、かくして細菌ＤＮＡのみならずそれら自体のＤＮＡにも応答する病原性自己抗体が増加したのである（Whock, M. K. ら (1997) J. Immunol. 158, 4500-4506）。
【０００５】
タンパク質抗原でＢ細胞を刺激および活性化することによる抗体の生産は、タンパク質抗原が抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってプロセシングされ、そして主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に結合して、ＭＨＣによって限定されるＴ細胞が活性化されてその活性化されたＴ細胞がサイトカインを分泌してＢ細胞を活性化するように抗原の提示を誘導するプロセスとしてよく知られている（Parker, D. C. (1993) Annu. Rev. Immunol. 11, 331-360；ならびに Clark, E. A. および Ledbetter, J. A. (1994) Nature 367, 425-428）。タンパク質抗原と異なるミコバクテリアの細胞壁の構成要素の加工体であるリポアラビノマンナンリポグリカン（ＬＡＭ）、ミコール酸脂質が、ｈＣＤ１ｂ（Beckman, E. M. ら (1994) Nature 372, 691-694；Bendelac, A. (1995) Science 269, 185-186；Sieling, P. A. ら (1995) Science 269, 227-230；およびPrigozy, T. I. ら (1997) Immunity 6, 187）およびｈＣＤ１ｃ （Beckman, E. M. ら (1996) J. Immunol. 157, 2795-2803）によって提示され得ることもよく知られている。ＣＤ１ファミリーは、ＭＨＣ分子と異なる部位にてコードされる非多形細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ１−Ｔ細胞の結合は明瞭には特定されていないが、ｍＣＤ１ｄ１はＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によって認識され（Castano, A. R. ら (1995) Science 269, 223-226；Cardell, S. ら (1995) J. Exp. Med. 182, 993-1004）そしてｈＣＤ１ｂはＣＤ４-およびＣＤ８- Ｔ細胞によって認識される（Bendelac, A. (1995) Science 269, 185-186）らしいことが示唆された。このように、ＣＤ１は病原性微生物に認められるタンパク質以外の様々な抗原の提示に関わることが推定される。多くの研究で、ＤＮＡは抗−ＤＮＡ−特異的なＢ細胞刺激に関わっていることが報告された。Krishnan および Marionは、ＤＮＡおよびペプチドの組み合わせでのマウスの免疫付与によって抗−ＤＮＡ抗体を誘発できることを示した（Krishnaa, M. R. および Marion, T. N. (1993) J. Immunol. 150, 4948-4957）。従って、抗−ＤＮＡ抗体が様々な自己免疫疾患の際に産生されるという事実に鑑みて、抗−ＤＮＡ抗体の生産のためのＢ細胞の活性化が、ＭＨＣで限定されるＴ細胞刺激に依存しているか否かを確かめることが重要である。Waisman は、ＤＮＡによるＴ細胞の特異的活性化がＭＨＣクラスII分子によるＤＮＡ提示に関わることを示唆した（Waisman, A. ら (1996) Cell. Immunol. 173, 7-14）。すなわち、彼はＡＰＣ表面上のＭＨＣクラスII分子にＤＮＡが結合し、そしてその結果、Ｔ細胞はＤＮＡによって特異的に増殖されることができるという事実を示し、その事実に基づいて、ＤＮＡが自己免疫疾患で重大な役割を果たしていると提唱した。しかしながら、ＤＮＡ抗原のプロセシングおよび提示機構に関するさらなる研究および知見はまったくない。例えば、細菌ＤＮＡがＡＰＣによってプロセシングされ、タンパク質抗原におけるようにＭＨＣ分子により提示されるか否か、または他の分子がこのような提示に関わっているのかどうかは、未だ解明されていない。
【０００６】
脊椎動物は、細菌ＤＮＡ由来とそれらの内因性ＤＮＡを識別し、それにより免疫細胞が細菌ＤＮＡによって活性化されることを、多くの研究者が示した。脊椎動物によって非自己として認識される細菌ＤＮＡは、高レベルで非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを産生していることにより特徴付けられる。細菌ＤＮＡと脊椎動物ＤＮＡとの間の甚だしい相違は、以下のように要約され得る。第１に、細菌ＤＮＡは最多レベルで16ジヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドを産生しているが、脊椎動物ＤＮＡでは、細菌ＤＮＡの 1/4 を産生している。このことは、ＣｐＧ抑制が脊椎動物ＤＮＡに存在することを意味している。第２に、細菌ＤＮＡに存在するＣｐＧジヌクレオチドのメチル化頻度は低い。脊椎動物ＤＮＡは80％のメチル化を示すが、微生物のシトシンのメチル化はほとんど認められない（Bird, A. P. (1995) Trends Genet. 11, 94-100）。第３に、細菌ＤＮＡは、ＣｐＧジヌクレオチドの両側端部で２つの5'-プリンおよび２つの3'-ピリミジンの側方に位置する頻度が、脊椎動物ＤＮＡよりも高い（Razin A., および Friedman, J. (1981) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 25, 33-52）。「ＣｐＧモチーフ」と称される細菌ＤＮＡのその特異的な構造は、免疫応答を活性化することが報告された。すなわち、２つの5'-プリンおよび２つの3'-ピリミジンがＣｐＧジヌクレオチドの両側端部で側方に位置する場合（マイトジェン性ＣｐＧ）、他の塩基がＣｐＧジヌクレオチドの両側端部で側方に位置する場合（非刺激性ＣｐＧ）に比較して、免疫細胞の活性化は随分高い。
【０００７】
多くの研究者は、細菌ＤＮＡの特異的塩基配列による免疫細胞の活性化および作用を解明するために、化学的に合成されたオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）を使用した。Yamamoto および他の研究者は、細菌ＤＮＡがＮＫ細胞の溶解性活性化を増加させ、またインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の生産を誘導することを示した（Yamamoto, S. ら (1992) J. Immunol. 148, 4072-4076；Cowdery, J. S. ら (1996) J. Immunol. 156, 4570-4575；および Ballas, Z. K. ら (1996) J. Immunol. 157, 1840-1845）。Kuramoto は、このような効果が、細菌ＤＮＡに含まれるＣｐＧモチーフのパリンドロームの塩基配列に関連することを報告した（Kuramoto, E. ら (1992) J. Cancer Res. 83, 1128-1131；およびKimura, Y. ら (1994) J. Biochem. 116, 991-994）。加うるに、細菌ＤＮＡはＤＮＡ結合性タンパク質に結合して、Ｂ細胞の活性化を誘導することが報告された（Gilkeson, G. S. ら (1989) J. Immunol. 142, 1398-1402；Yamamoto, S. ら (1992) J. Immunol. 148, 4072-4076；Gilkeson, G. S. ら (1989) J. Immunol. 142, 1482-1486；Messina, J. P. ら (1991) J. Immunol. 147, 1759-1764；Field, A. K. ら (1967) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58, 1004-1010；ならびにOehler, J. R. および Herverman, R. B. (1978) Int. J. Cancer 21, 221-220）。すなわち、Ｂ細胞の活性化は、細菌の６塩基からなるＣｐＧモチーフによって促進されることが理解される。細菌感染による、Ｂ細胞の活性化を包含した免疫応答は、免疫調節性サイトカインを生産することによって特徴付けられる（Van Damme, J. ら (1989) Eur. J. Immunol. 19, 163-168；およびPaul, W. E. ら Adv. Immunol. 53, 1-29）。さらにまた、ＣｐＧモチーフは、細胞性免疫に関わるＩＬ−12および体液性免疫に関わるＩＬ−６の分泌に関与することも報告された（Halpern, M. D. ら (1996) Cell, Immunol. 167, 72-78；Yi, A. K. ら (1996) J. Immunol. 157, 5394-5402；およびKlinman, D. M. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2879-2883）。それより生じるサイトカインとして、Ｔ細胞およびＢ細胞を活性化するうえで役割を果たすＩＬ−６（Uyttenhove, C. ら (1988) J. Exp. Med. 167, 1417-1427；Muraguchi, A. ら (1988) J. Exp. Med. 167, 332-344；Le, J. M., および Vilcek, J. (1989) Lab. Invest. 61, 588-602；ならびに Hirano, T. ら (1990) Immunol. Today 11, 443-449）、細胞内および細胞外病原性細菌を排除するマクロファージの機能を促進するＩＦＮ−γ（Murray, H. W. (1990) Diagn. Microbial. Infect. Dis. 13, 411-421）およびＩＦＮ−γの生産を調節しＮＫ細胞を活性化するＩＬ−12（Trinchieri, G. (1994) Blood 84, 4008-4027；Zhan, Y., および Cheers, C. (1995) Infect. Immun. 63, 1387-1390；ならびに Bohn, E. ら (1994) Infect. Immun. 62, 3027-3032）が挙げられる。ＩＬ−12およびＩＦＮ−γは、１型サイトカインを増加することによりヒト病原性細菌を排除する、重要な役割を果たしている（Klinman, D. M. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2879-2883；Zhan, Y., および Cheers, C. (1995) Infect. Immun. 63, 1387-1390；Bohn, E. ら (1994) Infect. Immun. 62, 3027-3032；ならびにHeinzel, F. P. ら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7011-7015）。ＩＬ−６は、２型サイトカインによってＴ細胞およびＢ細胞の成長および分化を促進することにより抗体の生産を刺激する（Uyttenhove, C. ら (1988) J. Exp. Med. 167, 1417-1427；Muraguchi, A. ら (1988) J. Exp. Med. 167, 332-344；Le, J. M., および Vilcek, J. (1989) Lab. Invest. 61, 588-602；ならびに Hirano, T. ら (1990) Immunol. Today 11, 443-449）。実際、ノックアウトＩＬ−６遺伝子を有するマウスは、容易に感染されることが観察された（Yi, A. K. ら (1996) J. Immunol. 157, 5394-5402；および Libert, C. ら (1994) Eur. J. Immunol. 24, 2237-2242）。このように、細菌ＤＮＡは、細胞性および体液性免疫に関わるサイトカインの生産を誘導することが理解される。近年、Ｂ細胞の増殖および発生は、細菌ＤＮＡによってもたらされることが、さらに報告されている（Krieg, A. M. ら (1995) Nature 374, 546-549；Liang, H., (1996) J. Clin. Invest. 98, 1119-1129；および Yi, A. K. ら (1996) J. Immunol. 156, 558-564）。Krieg の研究は、ＯＤＮに存在するＣｐＧモチーフが、Ｂ細胞の活性化および増殖を行ないつつＩｇＭの分泌を誘導するのに必須であること、ならびにＢ細胞が活性化された場合に起こる典型的な現象であるクラスII ＭＨＣ分子の発現が増大し、そしてＧ０からＧ１まで細胞周期が開始することを示した。Sato の報告（Sato, Y. ら (1996) Science 273, 352-354）によると、免疫刺激性ＤＮＡ配列（ＩＳＳ）を短いＣｐＧモチーフと共に含むプラスミドＤＮＡが単球にトランスフェクトされた場合に、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＬ−12の量が増加することが見られた。この結果は、ＩＳＳを含むプラスミドが骨髄幹細胞へトランスフェクトされると、その後周囲のマクロファージおよびＴ細胞が活性化されて、その幹細胞のイン・ビボの再配置が誤って起こり得ることを示唆するものである。かくして、体細胞または幹細胞置換療法のためのベクターは、ＩＳＳを含まないように設計されるべきなのである。対照として、ワクチンの効能を改善するための一つのアプローチは、多くの反復ＩＳＳを含むようにプラスミドＤＮＡを設計することである。
【０００８】
細胞を活性化するために、細菌ＤＮＡは細胞内に取り込まれるべきである。細胞培養容器上に吸着されたＯＤＮは、Ｂ細胞を活性化しないこと（Krieg, A. M. ら (1995) Nature 374, 546-549）そしてオリゴヌクレオチドがリポフェクトされた場合に、ＮＫ細胞の活性化が大幅に増大するに伴って、その取り込みが増大すること（Yamamoto, T. ら (1994) Microbiol. Immunol. 38, 831-836）が見出された。また、ＣｐＧモチーフを含んでいるか否かに関わらず、オリゴヌクレオチドが細胞表面に結合する能力の間に有意な差異はないことも見出された（Krieg, A. M. ら (1995) Nature 374, 546-549；および Yamamoto, T. ら (1994) Microbiol. Immunol. 38, 831-836）。Bennett は、単核細胞内に取り込まれたＤＮＡがエンドソーム画分にて分解されることを示した（Bennett, R. M. ら (1985) J. Clin. Invest. 76, 2182-2190）。Stacey は、細菌ＤＮＡがマクロファージ中の転写因子核因子−ｋＢに結合し、そしてＴＮＦ−α、ＩＬ１−βおよびプラスミノーゲン活性化インヒビター−２ ｍＲＮＡの発現が大幅に増大することを示した（Stacey, K. J. ら (1996) J. Immunol. 157, 2116-2122）。細胞表面上のレセプターの媒介を伴う、オリゴヌクレオチドの細胞内への取り込みは、エンドサイトーシスによって引き起こされるであろうことが予期された（Bennett, R. M. ら (1985) J. Clin. Invest. 76, 2182-2190）。また、蛍光でラベルされたホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを末梢血、骨髄細胞および白血球細胞系で使用することによっても、研究が実施された（Loke, S. L. ら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3474-3478；Yakubov, L. A. ら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6454-6458；Zhao, Q. ら (1996) Blood 88, 1788-1795；Ribeiro J. M., および Carson D. A. (1993) Biochemistry 32, 9129-9136）が、その特性および機構は未だまったく明確にされていない。
【０００９】
細菌ＤＮＡはこれまでに、免疫系において重大な役割を果たすことが理解されている。自己免疫疾患であるＳＬＥは、細菌ＤＮＡによって抗−ＤＮＡ抗体が産生されることによって発症すること、そして細菌ＤＮＡのＣｐＧモチーフは免疫細胞内へ取り込まれて細胞を活性化し、それによりサイトカインおよびＩｇＭの分泌を促進することが知られている。しかしながら、どのような機構によって、このように重大な細菌ＤＮＡが抗体を生産することが可能ならしめられるのか、そしてＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドがどのように細胞内で作られるのかについての報告はまったくない。
【００１０】
本発明者らにより、ＤＮＡ−未変性−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥ）を使用して、ヒトＢ−リンパ芽球ＩＭ９細胞、および12-O-テトラデカノイルホルボール 13-アセテートで処理された分化型骨髄性Ｕ937ならびにその培養培地から、新規エンドヌクレアーゼが同定された。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一側面において、本発明は、免疫細胞から分泌され、そして外来性物質として細菌ＤＮＡを認識し、またそれをプロセシングして免疫応答に関わるＣｐＧモチーフを有する約10塩基対の一本鎖オリゴヌクレオチドを生産する新規エンドヌクレアーゼに関する。
【００１２】
別の側面において、本発明は、本発明のエンドヌクレアーゼを製造するための方法であって、ヒトＢ−リンパ芽球ＩＭ９またはＴＰＡで処理された骨髄性Ｕ937細胞系を適切な培地にて培養して当該エンドヌクレアーゼを生産する工程、および細胞溶解物または培養培地から当該エンドヌクレアーゼを単離する工程を含む方法を提供する。
【００１３】
さらなる側面において、本発明は、本発明のエンドヌクレアーゼを用いて細菌ＤＮＡを処理することによって生産されるＣｐＧモチーフを有する、約10塩基対の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む免疫アジュバントを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
新規エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥヌクレアーゼアッセイシステムを使用して、ＩＭ９細胞溶解物および培養培地から同定された。そのエンドヌクレアーゼの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより72.4 kDと測定された。本発明のエンドヌクレアーゼ活性は、培養時間の間にはＩＭ９細胞核に検出され、そして酵素活性の蓄積が、アポトーシス細胞のＩＭ９細胞核タンパク質抽出物中に示された。骨髄性Ｕ937細胞の増殖および分化に対するシグナルは、リポ多糖（ＬＰＳ）および12-O-テトラデカノイルホルビル 13-アセテート（ＴＰＡ）などの細胞外刺激により提供される。実験結果から、ＴＰＡがエンドヌクレアーゼ分泌の程度に対して有意な効果を有することが示唆された。その酵素活性はＬＰＳ処理によりＵ937細胞において誘導されたが、一方酵素の分泌は培養培地では検出されなかった。多重高次コイルプラスミドＤＮＡを基質として用いて、細胞培養培地から単離された酵素についてエンドヌクレアーゼ活性を定量した。エンドヌクレアーゼは、Ｍｇ2+のみと共に、プラスミドＤＮＡの直鎖状体への変換を触媒し、続いてさらに分解することができた。触媒活性に必要とされるｐＨ至適値は、ｐＨ 6.6〜7.4の範囲に決定された。ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥアッセイシステムで、免疫細胞系のエンドヌクレアーゼ活性は、ＤＮアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼ）Ｉのものと異なることが、実験結果から明らかに立証された。抗−ＤＮアーゼＩ抗体を使用した免疫沈降分析で、分泌されたエンドヌクレアーゼはその抗体によって認識されないことが示された。本発明によって特徴付けられたＭｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼは、酵素活性に対する陽イオン依存性、未変性−ＰＡＧＥにおける電気泳動移動度、および触媒作用に必要とされる至適ｐＨを含めたいくつかの側面で、これまでに報告されたヌクレアーゼと異なると考えられる。エンドヌクレアーゼ活性によってプロセシングされるＤＮＡ断片は、免疫細胞系でのサザンブロット分析によって検出した。細胞培養培地にて部分的にプロセシングされた外来性ＤＮＡ抗原は、細胞表面に結合し、その後細胞内へと取り込まれるようである。放射ラベルされたＤＮＡ断片を外来性抗原として用い、オートラジオグラフィーによって、免疫細胞系でのＤＮＡ抗原のさらなるプロセシングを立証した。エンドヌクレアーゼによって産生されたおよそ10塩基の一本鎖ＤＮＡ断片は、Ｓ１ヌクレアーゼ反応によって分解されることが、実験結果によって示された。短い一本鎖ＤＮＡ配列は、２つの5'-プリンおよび２つの3'-ピリミジンが側方に位置する非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有するＣｐＧモチーフを含む、相補的合成オリゴヌクレオチドに、首尾良くハイブリダイズした。本発明は、ヒト免疫細胞系およびそれらの培養培地の双方に存在する新規エンドヌクレアーゼの存在および特徴を示すものである。また本発明は、免疫細胞由来のエンドヌクレアーゼが、異物として細菌ＤＮＡを認識し、そしてＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ断片を産生することにより免疫学的プロセスを遂行することも示している。
【００１５】
本発明は、以下の実施例によって例証されよう。
【００１６】
実施例１：
免疫細胞由来のエンドヌクレアーゼの生合成および分泌
ＤＮアーゼＩの酵素活性がヒトの組織および体液に広く分布しているという事実から、その酵素は消化機能に加えて、特定の生理的なイン・ビボの機構を保有していることが推定された（Nadano D. ら (1993) Clin. Chem. 39, 448-452；および Yasuda T. ら (1993) Clin. Chim. Acta 218, 5-16）。ＤＮアーゼＩは、アポトーシスの際にヌクレオソーム間ＤＮＡを切断することが知られている（Peitsch M. C. ら (1993) EMBO J. 12, 371-377）。ヒト血清中にＤＮアーゼＩが存在すること、およびその生化学的特性が報告された（Love J. D., および Hewitt R. R. (1979) J. Biol. Chem. 254, 12588-12594；ならびに Kishi K. ら(1990) Am. J. Hum. Genet. 47, 121-126）。血清ＤＮアーゼＩは、膵臓から分泌されることが教示された（Love J. D., および Hewitt R. R. (1979) J. Biol. Chem. 254, 12588-12594；ならびに Ito K. ら (1984) J. Biochem. 95, 1399-1406）が、他の組織からの分泌についての研究がなお必要である。Messina の研究では、ＤＮアーゼＩが細菌ＤＮＡを完全に分解するので、Ｂ細胞およびマクロファージを活性化するＣｐＧモチーフを生産しないことが示された（Messina, J. P. ら (1991) J. Immunol. 147, 1759-1764）。加えて、Messinaの研究から、ＤＮアーゼＩによって処理されていない細菌ＤＮＡは、免疫細胞を活性化し、サイトカインおよびＩｇＭの分泌を促進することが明らかにされた。これらのことは、ＣｐＧモチーフを有するＯＤＮで細胞が処理された場合に得られた結果に一致するものである。従って、外来性ＤＮＡを認識し、プロセシングによってＣｐＧモチーフを生産することができる、１つの新しいタイプのエンドヌクレアーゼが免疫細胞に存在しているとの推定のもとに、本発明者らは、このようなエンドヌクレアーゼの活性の存在を確認すべく、様々な免疫細胞系を使用して実験を行なった。
【００１７】
１−１ 細胞培養および前処理
ヒトＢ−リンパ芽球（ＩＭ９およびＲＰＭＩ1788）細胞系、Ｔリンパ芽球（Molt-4 および Jurkat）細胞系ならびに骨髄性（Ｕ937）細胞系は、American Type Culture Collection から購入した。細胞は、加熱した胎児ウシ血清（ＦＢＳ、Gibco ＢＲＬ）10％を含有するＲＰＭＩ1640 で、4〜5 x 105 細胞/mlに維持して培養した。細胞培養は、37℃にて、5％ ＣＯ2を含むインキュベーター（Forma）で行なった。培養中の細胞数および細胞の生存度は、血球計数器を使用して、トリパンブルー除去法によって定期的に測定した。細胞の生存度は、実験全体にわたって95％以上に保った。ＩＭ９細胞系は、細胞におけるエンドヌクレアーゼの生合成を確認するべく、アクチノマイシンＤ（ＡＣＤ、Sigma）0.33 ug/mlで前処理した（Cooper H. L., および Braverman R. (1977) Nature 269, 527-529）。ＩＭ９細胞系は、ＡＣＤで処理して、30分間培養し、洗浄した。その後、細胞を10％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ1640 にて48時間培養しながら、エンドヌクレアーゼの酵素活性を定期的な間隔で測定した。
【００１８】
ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥヌクレアーゼ活性アッセイを実施して、細胞培養溶液および細胞溶解物中のエンドヌクレアーゼ酵素活性を検出した。試験した細胞培養物に分泌されたエンドヌクレアーゼの活性は、ＩＭ９細胞系のみで観察された（図５Ｂ、レーン２）。しかしながら、そのエンドヌクレアーゼ活性は常に、ヒトＴリンパ芽球 Molt-4 細胞系の細胞溶解物中に常に検出された（図５Ａ、レーン４）が、細胞培養溶液中には検出されなかった。骨髄性Ｕ937細胞系、Ｂリンパ芽球ＲＰＭＩ1788細胞系およびＴリンパ芽球Jurkat細胞系については、エンドヌクレアーゼ活性は細胞溶解物または細胞培養溶液のいずれにも検出されなかった。図４に示すように、細胞におけるエンドヌクレアーゼの生合成（図４Ａ）および細胞培養溶液中へのエンドヌクレアーゼの分泌（図４Ｂ）は、ＡＣＤ前処理の後、初期に顕著に減少した。これらの結果から、ＩＭ９細胞系におけるエンドヌクレアーゼの生合成と分泌に、密接な相関関係があることが示唆される。
【００１９】
エンドヌクレアーゼのサイトカインおよび分泌に対するサイトカインの効果を確認するべく、サイトカインが関与する免疫応答を、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ、10 単位/ml、Genetech Inc.）およびインターロイキン−1β（ＩＬ−1β、10 単位/ml、Genetech Inc.）で処理した。ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥアッセイは、インターロイキンを含有する培地にて24時間細胞を培養しながら行なった。図６に示すように、このようなサイトカインはエンドヌクレアーゼの分泌に有意に影響を及ぼさなかった。また、リポ多糖（ＬＰＳ）またはテトラデカノイルホルボール 13-アセテート（ＴＰＡ、Sigma）のいずれも、エンドヌクレアーゼの分泌に影響を及ぼさないことも観察された。
【００２０】
示された時間にわたり、異なる濃度にてＴＰＡでＵ937細胞を処理しながら、生合成および分泌を観察した。シクロヘキシミド（ＣＨＸ、10 ug/ml、Sigma）およびＬＰＳ（1 ng/ml、Sigma）によって処理されたＵ937細胞を、ＴＰＡによって処理されたＵ937細胞と比較した。細胞はリン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ、137 mM ＮａＣｌ、2.7 mM ＫＣｌ、10 mM Ｎａ2ＨＰＯ4、1.8 mM ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ 7.4）で洗浄し、そして様々な薬剤による処理の後の細胞形状を観察するために、細胞遠心分離スライド上でライト−ギムザ（Sigma）によって染色した。その結果、ＴＰＡ刺激で分化したヒト骨髄性白血病細胞系の細胞形状は、成熟するようになって成長が停止するが、ＬＰＳの刺激後の細胞には増殖が起こった。このようなマイトジェンによって刺激される細胞の成長曲線を、図９に示す。図９から、Ｕ937細胞系はＴＰＡによって分化されて細胞形状を変化させ、そして最終的に成長が終了することと、そしてその細胞はＬＰＳによって増殖したことが認められる。加えて、アポトーシスを引き起こす薬剤であるＣＨＸの処理によって、細胞は死滅することが観察された。さらなる実験を行ない、このような培養条件下でエンドヌクレアーゼが生産および分泌されるか否かを確認した。図１０Ａは、漸増ＴＰＡ濃度で処理した細胞系で、細胞内のエンドヌクレアーゼの生合成が、増加したことを示す。図１０Ｂは、細胞内でのエンドヌクレアーゼの生合成が増加すると同時にエンドヌクレアーゼ酵素が細胞から分泌されたことを示している。また図１０Ａは、10 ng/ml以上のＴＰＡでエンドヌクレアーゼの生合成が速やかに増加したことを示している。図１１には、10 ng/mlのＴＰＡによる、Ｕ937細胞培養溶液の処置後に、定期的な間隔でエンドヌクレアーゼ活性を観察して得られた結果を示している。エンドヌクレアーゼ酵素の生合成および分泌はＴＰＡの処理６時間後に開始され、そしてＴＰＡの処理後24時間にそのピークに達することが認められる。図１２には、1 ng/mlのＬＰＳによる処理後、定期的な間隔でエンドヌクレアーゼ活性を定量して得られた結果を示す。その結果、ＬＰＳの処理後12時間で細胞溶解物にエンドヌクレアーゼ活性が検出され、そして24時間にわたり細胞培養溶液中にはまったくエンドヌクレアーゼ活性は検出されなかったことが示唆されている。Ｕ937細胞系は、アポトーシスを誘導する薬剤であるＣＨＸによる処理に際して死滅し、そしてこのような処理はエンドヌクレアーゼの生合成に影響しないことが、顕微鏡的に観察された（図１３、レーン４）。ＴＰＡ、ＬＰＳおよびＣＨＸによる、Ｕ937細胞系の処理後のエンドヌクレアーゼ活性を、図１３に示す。
【００２１】
１−２ 細胞溶解物の調製およびＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥでのエンドヌクレアーゼ活性の定量
細胞培養物は、1,500 rpmで５分間遠心分離し、そして上清を取り出した。遠心分離された細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして150 mM ＮａＣｌ、10 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.5、1 mM ＥＤＴＡおよび1 mM ＰＭＳＦを含有する 0.5％ Nonidet Ｐ-40 （ＮＰ−40）緩衝溶液（溶解緩衝溶液）中に、1 x 10７細胞/mlとなるように再懸濁した。その溶液を4℃にて15分間静置した後、それを12,000 rpm、4℃にて15分間遠心分離し、そして上清を細胞溶解物として使用した。
【００２２】
修正された未変性ポリアクリルアミドゲルアッセイシステムを使用して、エンドヌクレアーゼ活性を定量し、その特徴を同定した。Hoefer Tall Mighty Small（0.75 mm x 8 cm x 11 cm）垂直電気泳動装置を使用することにより、150 /mlの最終濃度となるように多重高次コイルプラスミドＤＮＡ（ＰＧＥＭ−Ｔベクター、3.0 kb、Promega）を含む 7％ポリアクリルアミドゲルを重合した。細胞培養溶液または細胞溶解物のタンパク質試料ウェル当たり10 ug を付し、次いで4℃にて電気泳動を行なった。電気泳動後、ゲルを蒸留水で３回洗浄し、そして20 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.0、1 mM ＣａＣｌ2および10 mM ＭｇＣｌ2を含有する反応緩衝溶液（ＴＣＭ緩衝液）中で、37℃にて4時間、攪拌しながら反応させた。エンドヌクレアーゼ酵素の酵素活性を、反応時間を変えながら観察して、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥでその酵素の反応特異性を同定した。反応したゲルは、1/ml エチジウムブロミドを含むＴＣＭ緩衝溶液で37℃にて30分間染色し、そして302 nmトランスイルミネーターで撮影した。ゲル上でヌクレアーゼ活性を呈している部位は、オレンジの背景上で黒いバンドとして観察された。エンドヌクレアーゼ活性に対する標準は、ウシ膵臓ＤＮアーゼＩ（ＲＮアーゼ不含 10〜50 x 103単位/ml、Boehringer Mannheim）であった。
【００２３】
細胞培養物および細胞溶解物における酵素活性は、感度と共に、本発明のために設計されたＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥヌクレアーゼアッセイシステムによって定量することができる（図１）。10 ugのタンパク質を含む細胞培養溶液および細胞溶解物中のエンドヌクレアーゼ活性を呈する部位で、強い反応バンドが観察された。ＩＭ９細胞の、示した時間の間でのエンドヌクレアーゼの生合成および分泌の分析結果を、図１に示す。細胞溶解物中のエンドヌクレアーゼ活性は、48時間培養している間、絶えず検出された（図１Ａ）が、同じ反応条件下に、細胞培養溶液中のエンドヌクレアーゼ活性はかなり蓄積した（図１Ｂ）。ＩＭ９細胞培養物をＰＢＳで数回洗浄し、その後無血清培地に移すと、図１Ｂに示すエンドヌクレアーゼ活性に対する主要バンドが実際に検出されたが、ＤＮアーゼＩ酵素活性はまったく検出されなかった（図１Ｃ）。この結果は、ＩＭ９細胞培養物および細胞溶解物で検出されたエンドヌクレアーゼは、細胞が培養された培地組成物の成分であるＦＢＳに由来するものでなく、細胞で合成されて培地へと分泌されたものであることを示唆している。図１Ｂの細胞培養物での電気泳動上で速やかに移動したヌクレアーゼ活性の弱いバンドは、Boehringer Mannheimから入手したウシＤＮアーゼＩと比較することによって、ＤＮアーゼＩとして同定された。
【００２４】
図２は、異なる反応溶液の条件下にＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって検出された1時間および4時間の酵素活性を示す。10 mM Ｍｇ2+を含有する 20 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.0の緩衝溶液で1時間反応が実施されると、活性は、図２Ａに示すように、ＩＭ９細胞によって分泌されたエンドヌクレアーゼのみに検出された。しかしながら、4時間というさらに長い時間にわたり同じ条件下に反応を行なった場合、購入したＤＮアーゼＩのみならずＦＢＳ中に存在するＤＮアーゼＩも、同じ部位に酵素活性を示した。この結果は、ＩＭ９細胞によって合成および分泌されたエンドヌクレアーゼの未変性−ＰＡＧＥ上の移動距離は、ＤＮアーゼの移動距離と異なっており、そして所定反応条件下では酵素反応性もまた、互いに異なっていることを示している。
【００２５】
１−３ ＤＮアーゼＩに対する抗体の生産および免疫沈降
免疫前の血清を得るために、Sprague Dawley（ＳＤ、150〜250 g）の尾から血液を採取した。ウシ膵臓ＤＮアーゼＩ（Sigma）は、免疫付与のために滅菌ＰＢＳ中で小断片へと消化した。ＳＤラットは、標準法に従って、100 ugのタンパク質で免疫付与した（Harlow, E., および Lane, D. (1988) Antibodies, 実験マニュアル、Cold Spring Harbor, New York）。ラットを４回免疫誘発処理して10日後に血液を採取し、そして抗体価および特異性をアッセイした。ＤＮアーゼＩを含む血清中の抗−ＤＮアーゼＩ抗体は、Immunopure plus protein Ａ/Ｇ IgG 精製キット（Pierce）およびウシＤＮアーゼＩを結合させたSepharose−ＣＬ 4Ｂを使用することによって精製した。ＰＢＳで10倍に希釈した、50 mlの細胞培養液または50 mlのヒト血清を、精製抗−ＤＮアーゼＩ抗体およびProtein A-Sepharose−ＣＬ 4Ｂを結合させたビーズによって免疫沈降させた。免疫沈降は、攪拌しながら4℃にて６時間実施した。免疫沈降された上清を集めて、エンドヌクレアーゼの酵素活性をＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥで検出した。
【００２６】
図３Ａは、調製された抗体が、ＦＢＳに由来するＤＮアーゼＩを認識し、そしてヒト血清に存在するＤＮアーゼＩと交差反応性を有することを示している。免疫前血清は、ＦＢＳおよびヒト血清ＤＮアーゼＩを認識しなかった。それより調製されたＤＮアーゼＩを使用することによって、分泌されたエンドヌクレアーゼの各ＤＮアーゼＩとの交差反応性を検出した。抗−ＤＮアーゼＩ抗体によりＩＭ９細胞培養溶液から免疫沈降された上清は、速やかに移動するＤＮアーゼＩ酵素活性を示したが、分泌されたエンドヌクレアーゼの酵素活性は、免疫沈降されず、実際に回収されなかった。この結果は、ＩＭ９細胞系から分泌されるエンドヌクレアーゼが、免疫学的にＤＮアーゼＩと異なることを立証するものである。
【００２７】
１−４ エンドヌクレアーゼ活性の部分精製および特徴付け
ＩＭ９細胞の培養溶液からエンドヌクレアーゼを部分的に精製するために、前記実施例１―２による電気泳動によって酵素活性を呈するタンパク質バンドを溶出した。ヌクレアーゼ活性を呈するタンパク質バンドを切り出し、小片に断片化してエッペンドルフミクロチューブに移した。その後、20 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.0 緩衝溶液を使用することにより、攪拌しながら4℃にて10時間、溶出を行なった。試料は、4℃、14,000 rpmにて10分間遠心分離し、そして上清を20 ulに分けた。溶出されたタンパク質試料の20 ngを、20 mM Tris−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ 7.0）中で、高次構造コイルプラスミドＤＮＡと37℃にて10時間反応させた。酵素活性に対するｐＨの効果を調べるために、各々異なるｐＨを有する、1 mM ＣａＣｌ2および10 mM ＭｇＣｌ2を含有する20 mM ＭＯＰＳ緩衝溶液中で酵素活性を定量した。示した反応時間のエンドヌクレアーゼの酵素活性を分析するために、10 mM ＭｇＣｌ2を含有する20 mM Tris−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ 7.0）中において、37℃にて180分間の間における定期的な間隔で、酵素反応を観察した。ＤＮＡ試料緩衝溶液（30％ グリセロール、0.5％ ブロモフェノールブルーおよび0.5％ キシレンシノール）を含有するＴＥ（10 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.6、1 mM ＥＤＴＡ）緩衝溶液を添加した後、氷を添加することによって反応を停止した。エチジウムブロミド（0.5 ng/ml）を含有する1％ アガロースゲルで電気泳動を行なうことによって、反応産物を同定した。単離された酵素は、ｐＨ 7に至適活性を有していることが調べられた。しかしながら、触媒活性は比較的広い範囲のｐＨで検出された（図７）。20 mM Tris−ＨＣｌ（ｐＨ 7.0）緩衝溶液中でのエンドヌクレアーゼの酵素活性は、Ｍｇ2+に依存しており、Ｃａ2+によっては影響を受けなかった（図８Ａ）。酵素は、1から10 mMのＣａ2+の範囲で活性化されなかったが、Ｍｇ2+の濃度に依存した酵素活性によりプラスミドから直鎖状ＤＮＡが形成され、示した反応時間での、エンドヌクレアーゼによる直鎖状ＤＮＡの形成が観察された。高次構造コイルプラスミドＤＮＡの直鎖状ＤＮＡへの変換反応は、10分間反応後に始まり、そして60分の反応まで徐々に増加した。ヌクレアーゼ活性は、同じ実験条件下に180分間持続した（図８Ｂ）。このように、本酵素は高次構造コイルプラスミドＤＮＡを直鎖状ＤＮＡに変換し、続いてそのＤＮＡを消化することが確認された。この結果は、ＩＭ９免疫細胞によって分泌されるエンドヌクレアーゼ活性は、Ｍｇ2+−依存性であることを立証している。
【００２８】
本発明は、Ｍｇ2+−依存性のエンドヌクレアーゼ活性が一定量生産され、そして細胞培養物に定常的に分泌されていることを示した。また、そのエンドヌクレアーゼは、ＦＢＳおよびヒト血清中に存在するＤＮアーゼＩと異なるという事実が、未変性−ＰＡＧＥでの移動距離の差異と、抗−ＤＮアーゼＩ抗体を使用することにより得られた免疫沈降の結果によって確認された。これらは、本発明のエンドヌクレアーゼが、酵素活性に対する陽イオン−依存性、未変性−ＰＡＧＥでの移動度、活性に必要とされる至適ｐＨ等といった様々な生化学的特性の側面において、これまでに報告されていた、アポトーシスのプロセスでＤＮＡを消化するエンドヌクレアーゼと異なることを示唆するものである。また、エンドヌクレアーゼが、Ｕ937細胞系が分化した際に生産および分泌されるという事実は、そのエンドヌクレアーゼが、免疫反応において外来性ＤＮＡを認識して好適なサイズへと消化することができる、非常に重要な生物学的機能を有することを確証するものである。本発明のエンドヌクレアーゼの機能は、細菌ＤＮＡが細胞内に取り込まれるとマクロファージが活性化されるという Staceyの報告、および単核細胞／マクロファージによって媒介される細胞毒性がヌクレアーゼによって引き起こされ得るというHigashiの報告を裏付けるものである（Stacey, K. J. ら (1986) J. Immunol. 157, 2116-2122；および Higashi, N. ら (1993) Cell. Immunol. 150, 333-342）。
【００２９】
実施例２：
ヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化を誘導する、Ｍｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼの同定
アポトーシスは、クロマチン凝縮、膜小疱形成、またはエンドヌクレアーゼ活性による様々なヌクレオソームサイズとしてのクロマチン断片化などといった「細胞死」の特定のタイプとして定義される（Wyllie, A. H. ら (1984) J. Pathol. 142, 67-77；Wyllie, A. H. (1980) Nature 284, 555-556；および Kerr, J. F. R. ら (1972) Cancer. 26, 239-257）。エンドヌクレアーゼ活性化は、アポトーシスのプロセスの重大な原因を担っている（Arends, M. J., およびWyllie, A. H. (1990) J. Pathol. 136, 593-608）。多くの研究者が、ヌクレオソーム断片化に関わる様々な酵素があることを示した。ヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化に関わる酵素の例としては、ＤＮアーゼＩ（Peitsch M. C. ら (1993) EMBO J. 12, 371-377）、ＤＮアーゼII（Torriglia A., (1995) J. Biol. Chem. 270, 28579-28585；ならびに Barry M. A., および Eastman A. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 300, 440-450）およびＮＵＣ−18（Wawabata, H. ら (1997) Biochem. Biophys. Res. Comun. 233, 133-138）が挙げられる。また、様々なタイプの組織および細胞内のヌクレオソーム間ＤＮＡは、Ｃａ2+/Ｍｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼ（Stratling, W. H. ら (1984) J. Biol. Chem. 259, 5893-5898；Pandey S. ら (1997) Biochemistry 36, 711-720；ならびに Ribeiro J. M. および Carson D. A. (1993) Biochemistry 32, 9129-9136）またはＭｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼ（Anzai N. ら (1995) Blood 86, 917-923；Kawabata, H. ら (1993) Biochem. Biophys. Res. Comun. 191, 247-254；Sun X. M. および Cohen G. M. (1994) J. Biol. Chem. 269, 14857-14860；ならびに Wawabata, H., Anzai, N. ら (1997) Biochem. Biophys. Res. Comun. 233, 133-138）によって断片化され得ることを提唱する多くの報告がある。しかしながら、多くのエンドヌクレアーゼの各々が、異なる複合的な細胞システムに関与していること、あるいは、細胞死があらゆるタイプの細胞で活発に起こった場合に、クロマチン断片化のために働くなんらかの未知酵素が存在することは、未だ立証されていない。従って、アポトーシスに関与するエンドヌクレアーゼを特徴付けし、そしてその機構を明らかにすることが必要とされている。
【００３０】
ヒトＢリンパ芽球ＩＭ９細胞系によるエンドヌクレアーゼ酵素の生合成、およびＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによる当該エンドヌクレアーゼの単離を、前記実施例１に例証した。単離されたエンドヌクレアーゼ酵素は、未変性−ＰＡＧＥでの電気泳動の移動度、触媒のために必要とされる至適ｐＨおよび酵素活性への二価陽イオン依存性の側面において、これまでに知られているエンドヌクレアーゼのいずれのものとも判別されることが今回見出された。
【００３１】
また、本発明者らにより、前記実施例によって調製された細胞溶媒溶液および細胞溶解物中に存在するエンドヌクレアーゼと同一と考えられる酵素の活性が、細胞核に検出され、その酵素はアポトーシスのプロセスの間は核に沈着することも見出された。このようなエンドヌクレアーゼが、核におけるヌクレオソームの断片化を誘導するという事実は、殺される標的とされる細胞が、このような作用によって排除されるという点において、防御作用として解釈され得る。アガロースゲル電気泳動によって、ＩＭ９細胞系がＣＨＸによって処理されると、ＤＮＡのオリゴヌクレオソーム断片が生産されることが立証された。かかる断片の産生は、アポトーシスに際した生化学的現象のアペックスとして知られている。加えて、典型的なＤＮＡの断片化が、ＩＭ９細胞系から単離された核をＭｇ2+の存在下に反応させた場合に見出された。自己消化によるＤＮＡ断片化は、Ｍｇ2+−依存性かつＣａ2+−非依存性であることが同定された。核に存在するエンドヌクレアーゼ酵素の活性は、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥアッセイシステムによっても観察された。その酵素に対する至適ｐＨは、6.5と7.5の間であった。これらの結果は、前記実施例１にて記載したＩＭ９細胞系によって合成および分泌されたエンドヌクレアーゼが、ＩＭ９細胞系の核に存在する酵素と同じであることを立証するものである。そのエンドヌクレアーゼは、様々な組織および細胞に存在すると多くの研究者によって報告された、Ｍｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼに密接に関連すると推定される（Anzai N. ら (1995) Blood 86, 917-923；Kawabata, H. ら (1993) Biochem. Biophys. Res. Comun. 191, 247-254；Sun X. M. および Cohen G. M. (1994) J. Biol. Chem. 269, 14857-14860；ならびに Wawabata, H., Anzai, N. ら (1997) Biochem. Biophys. Res. Comun. 233, 133-138）。しかしながら、これまでに公表されたアポトーシスに関与するエンドヌクレアーゼについての報告のいずれも、Ｍｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼが、タンパク質バンドまたは酵素活性バンドとして同定されたことは教示していない。
【００３２】
カルシウム依存性、未変性−ＰＡＧＥでの移動距離および至適ｐＨの側面において、本発明者らによって同定されたエンドヌクレアーゼは、例えば、Ｃａ2+/Ｍｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼ（Stratling, W. H. ら (1984) J. Biol. Chem. 259, 5893-5898；Pandey S. ら (1997) Biochemistry 36, 711-720；ならびに Ribeiro J. M. および Carson D. A. (1993) Biochemistry 32, 9129-9136）、ＤＮアーゼＩ（Peitsch M. C. ら (1993) EMBO J. 12, 371-377）、ＤＮアーゼII（Torriglia A., ら (1995) J. Biol. Chem. 270, 28579-28585；ならびに Barry M. A., および Eastman A. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 300, 440-450）およびＮＵＣ−18（Kawabata, H. ら (1997) Biochem. Biophys. Res. Comun. 233, 133-138）などといった、これまでに報告されたＤＮＡのヌクレオソーム間断片化に関与する酵素と異なっている。本発明のエンドヌクレアーゼは、アポトーシスのプロセス中に細胞核内に観察されるので、そのエンドヌクレアーゼはアポトーシスのプロセスにおいて重要な役割を果たすものと考えられる。
【００３３】
２−１ アポトーシスの誘導
ヒトＢ−リンパ芽球（ＩＭ９）細胞を培養し、次いでその細胞を、10 ug/ml ＣＨＸ（Sigma）で処理し、その後それらを24時間培養することによって、アポトーシスを誘導した（Chow, S. C. ら (1995) Exp. Cell. Res. 216, 149-159）。ＣＨＸによって誘導されたアポトーシス細胞の形状の変化は、遠心分離スライド上でライト−ギムザ（Sigma）によって染色することによって同定した。
【００３４】
図１５Ａには、ＩＭ９細胞のＣＨＸ（10 /ml）での24時間の処理によって、ヌクレオソーム間ＤＮＡ消化の特徴的な形態としてのＤＮＡ断片が提供されることが示されている。24時間後にＣＨＸの効果が呈され、そしてさらに24時間後に大量のＤＮＡ断片が形成された。アポトーシスによって起こされる、細胞死の際の細胞形状を観察するべく、細胞をライト−ギムザ染料で染色した。その結果を図１５Ｃに示す。多くのアポトーシス細胞がＣＨＸ処理によって産生され、そして歪曲、染色体凝集および核断片化によって特徴付けられる細胞形状が、正常に成長している細胞のものと異なっていた。
【００３５】
２−２ ＣＨＸで処理されたＩＭ９細胞のエンドヌクレアーゼによるＤＮＡ断片化の同定
ＩＭ９細胞系は、5 x 105細胞/ml にまで培養し、そして 10 ug/mlのＣＨＸ（Sigma）で処理した。24時間培養を行ないながら、定期的な間隔で1 x 106 細胞を集め、その後 Blin および Stafford（Blin, N., および Stafford, D. W. (1976) Nucleic Acid Res. 3, 2303-2308）の変法に従ってＤＮＡを抽出した。1 x 106 細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そしてＴＥ緩衝溶液中に再懸濁した。1 mlのＤＮＡ抽出緩衝溶液（10 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.6、10 mM ＥＤＴＡ、100 mM ＮａＣｌ、0.2％ ＳＤＳおよび100 ug/ml プロテイナーゼＫ）を添加した後、反応混合液を50℃にて8時間反応させ、そしてタンパク質を除去するべくフェノール／クロロホルムで２回処理した。0.3 M 酢酸ナトリウム（ｐＨ 5.2）を添加した後、反応混合液を冷エタノールで沈殿させた。沈殿をＴＥ（10 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.6、10 mM ＥＤＴＡ）緩衝溶液に再溶解して、ＲＮアーゼ（リボヌクレアーゼ）Ａで処理した。次いで、1.8％アガロースゲルにて電気泳動を行なった。電気泳動ゲルは、0.5 ug/ml エチジウムブロミドを含有する溶液中に 30分間入れ、そしてＵＶ下に撮影した。
【００３６】
ＣＨＸで処理したＩＭ９細胞を定期的な間隔で集め、そして細胞溶解物および核を調製した。細胞溶解物および核を可溶化した後、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥヌクレアーゼ活性のゲルアッセイを実施して、核に存在するエンドヌクレアーゼの酵素活性を同定した。図１６Ａには、ＩＭ９細胞を24時間培養すると、エンドヌクレアーゼの酵素活性が、その期間中にわたって絶えず細胞溶解物中に検出されたことが示されている。しかしながら、ＣＨＸで処理された細胞溶解物中の酵素活性は、6から12時間に減少し（図１６Ｂ）、一方核内の酵素活性は蓄積された（図１６Ｃ）。
【００３７】
２−３ 細胞核の単離および自己溶解
1 x 107 細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、そして 50 ml Tris-ＨＣｌ、ｐＨ 8.0、0.5 mM ＭｇＣｌ2および 0.9 M スクロースを含む 0.5 mlの冷緩衝溶液中に40℃にて20分間可溶化し、細胞の核を単離した。調製された細胞溶解物を、0.5 mlの1.2 M スクロース溶液中に入れ、そして800 gにて 40分間遠心分離した。この結果得られた沈殿を20 mM Tris-ＨＣｌ、ｐＨ 7.0の緩衝溶液中に懸濁して、核を得た。
【００３８】
単離された核の自己溶解を、Ｍｇ2+およびＣａ2+の濃度を変化させることによって、37℃にて定期的な間隔で行なった。10 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.5、100 ml ＮａＣｌ、1 mM ＥＤＴＡ、1％ ＳＤＳ プロテイナーゼＫを含む、0.5 mlのＤＮＡ抽出緩衝溶液を添加することによって、反応を停止した。混合液は、50℃にて30分間反応させ、タンパク質を除去するべくフェノール／クロロホルムで２回処理した。0.3 M 酢酸ナトリウム、ｐＨ 5.2を添加した後、混合液を冷エタノールで沈殿させた。沈殿をＴＥ緩衝溶液に溶解した後、その溶液をＲＮアーゼＡで処理した。次いで、1.8％アガロースゲルにて電気泳動を行なった。電気泳動ゲルは、0.5 /ml エチジウムブロミドを含有する溶液中に入れ、そしてＵＶ下に撮影した。
【００３９】
単離された細胞核の自己溶解法を使用することによって、ＩＭ９細胞の核に存在するエンドヌクレアーゼの酵素活性を定量して、ＤＮＡ断片がＭｇ2+濃度に依存して生産される現象を観察した。しかしながら、同じ実験条件下にＭｇ2+をＣａ2+に置き換えたところ、このようなＤＮＡ断片は観察されなかった。Ｃａ2+およびＭｇ2+の双方の存在下では、Ｍｇ2+のみが存在する場合と同じタイプのＤＮＡ断片が生産された。その結果から、Ｍｇ2+の濃度に依存して、ＤＮＡがエンドヌクレアーゼによって消化されることが示唆される。1 mM Ｚｎ2+および5 mM ＥＤＴＡの存在下では、ＤＮＡ断片は核内に生産されなかった（図１４Ｂ）。ＤＮＡ断片化は、Ｍｇ2+（10 mM）およびＣａ2+（10 mM）の一定濃度で、0〜4 時間行なった。その結果、Ｍｇ2+のみの存在下で反応が開始された後30分で、ＤＮＡ断片が生産され、そして60から240分に、ＤＮＡ断片は蓄積された（図１４Ｃ）。しかし、Ｃａ2+の存在下では、ＤＮＡ断片の形成は4時間にわたって観察されることがなかった（図１４Ｄ）。これらの結果は、ＩＭ９細胞の核に活性を有して存在するエンドヌクレアーゼがＤＮＡ断片を形成するには、Ｍｇ2+が必要とされることを示唆するものである。
【００４０】
２−４ 細胞の核に存在するエンドヌクレアーゼの部分精製および特徴付け
細胞の核に存在するエンドヌクレアーゼを、核を可溶化し、そして前記実施例１−４に記載したようにエンドヌクレアーゼ活性を呈するタンパク質バンドを溶出させることによって部分精製した。酵素活性は、基質として高次構造コイルプラスミドＤＮＡを使用することによって測定し、そして二価陽イオン依存性を、前記実施例１−４に従って観察した。また、アポトーシス阻害物質であるＺｎＣｌ２、およびキレート剤であるＥＤＴＡの処理による、酵素活性の変化も観察した。
【００４１】
酵素は、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって同定されたＩＭ９細胞の核に存在するエンドヌクレアーゼの酵素活性を特徴付けするべく、未変性−ＰＡＧＥによって単離および溶出した。観察によって、そのエンドヌクレアーゼがＭｇ2+−依存性であることが明らかになった（図１７）。そのエンドヌクレアーゼ活性は、アポトーシス阻害物質であるＺｎ2+、およびキレート剤であるＥＤＴＡによって完全に阻害された。その結果は、高次構造コイルプラスミドＤＮＡを直鎖状ＤＮＡへと変換するのに、Ｍｇ2+が必要とされることを示唆するもので、これは図８に示された結果に一致するものである。
【００４２】
実施例３
免疫細胞中の外来ＤＮＡに対するエンドヌクレアーゼの作用および反応生成物の特徴付け
細菌のＤＮＡが、哺乳動物のＤＮＡ中には存在しない種々の構造を決定する因子を含む外来因子としてこれまでのところ認識されており、そしてこのような因子が免疫細胞の作用に関係することは、公知である（Ｇｉｌｋｅｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．ら（１９９５）Ｊ．Ｇｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５，１３９８−１４０２；Ｇｉｌｋｅｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．ら（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．５９，２８８−３００；Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７，１４８−１５７；Ｋｒｅｉｇ，Ａ．Ｍ．ら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ、３７４、５４６−５４９；およびＨａｌｐｅｒｍ，Ｍ．Ｄ．ら（１９９６）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６７，７２−７８）。細菌のＤＮＡとの哺乳動物のＤＮＡの差異の１つは、哺乳動物のＤＮＡが、多量のＣｐＧ制限を受け、そしてＣｐＧジヌクレオチドのシトシンに対して選択的にメチル化されることである（Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｐ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１１、９４−１００；Ｒａｚｉｎ，Ａ．，およびＦｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．（１９８１）Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，３３−５２；ならびにＨａｎ，Ｊ．ら（１９９４）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．４，５３−６５）。最近の報告は、細菌のＤＮＡ中に存在するＣｐＧモチーフが、ＩｇＭの分泌を促進するようにポリクローナルＢ細胞を活性化することを示し（Ｋｒｅｉｇ，Ａ．Ｍ．ら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ、３７４、５４６−５４９；Ｌｉａｎｇ，Ｈ．ら（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８，１１１９−１１２９；およびＹｉ，Ａ．−Ｋ．ら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６、５５８−５６４）、そして細胞周期が、抗ＩｇＭ抗体によって停止させられ、そして細菌性のＣｐＧモチーフがＢ細胞のｃ−ｍｙｃの発現を阻害するが、一方、アポトーシスからの細胞の保護のために、ｍｙｎ、ｂｌｃ、およびｂｃｌ−Ｘ1 ｍＲＮＡの発現を増大させることを示唆する（Ｙ．Ａ．Ｋ．ら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、４９１８−４９２５）。Ｈａｌｐｅｎは、ＣｐＧモチーフが、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の短期間での分泌を促進するようにＢ細胞を直接活性化することを報告した（Ｈａｌｐｅｍ，Ｍ．Ｄ．ら（１９９６）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，７２−７８；Ｙｉ．Ａ．−Ｋ．ら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、５３９４−５４０２；およびＫｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３、２８７９−２８８３）。Ｂｉｒｄは、ＣｐＧモチーフが、ＮＫ細胞に対してＣＤ４+からＩＦＮ−γを誘導するように弱く作用することを示した（Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｐ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ，１１、９４−１００；ａｌｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．ら（１９９２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６、９８３−９９７）。従って、ＣｐＧ ＤＮＡによる免疫細胞の活性化は、ＩＬ−６による体液性の免疫を増大させ、そしてＩＦＮ−γの分泌による細胞性免疫を増大させる。細菌のＤＮＡがマクロファージによって消化され、そして次いでマクロファージがＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびプラスミノーゲン活性化因子インヒビター−２ ｍＲＮＡを産生するように活性化されることが知られている（Ｓｔａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．ら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、２１１６−２１２２）。
【００４３】
３−１ エンドヌクレアーゼによる細菌のＤＮＡのプロセシング
ＩＭ９細胞の培養溶液を、エンドヌクレアーゼの酵素活性の特異性、および最終反応生成物の特性を分析するために、酵素供給源として使用した。ＩＭ９細胞を、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で、５％のＣＯ2インキュベーター中で３７℃にて４８時間培養し、そして次いで、培養溶液を、酵素供給源として使用した。３６時間のＦＢＳを含有しない培地中で細胞を培養することによって得た培養溶液を、ＤＮａｓｅＩを含まないＩＮ９細胞によって分泌されたエンドヌクレアーゼのみを含む酵素供給源として使用した。
【００４４】
酵素の基質として使用したプラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔベクター、３．０Ｋｂ）を、アルカリ溶解法（Ｂｉｒｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．，およびＤｏｌｙ，Ｊ．（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７、１５１３−１５２３）によってＥ．ｃｏｌｉを破壊させ、続いてフェノール／クロロホルムで２回抽出し、そしてエタノールで沈殿させることによって得た。Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡおよびＩＭ９細胞のＤＮＡを、ＢｌｉｍおよびＳｔａｆｆｏｒｄの改変された方法によって抽出した。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＴＥ緩衝溶液に浮かべた。ＤＮＡ抽出緩衝溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％のＳＤＳ，２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ）を添加し、そして溶液を、３７℃にて１０分間放置した。プロテイナーゼＫを１００μｇ／ｍｌまで添加し、そして混合溶液を５０℃にて８時間反応させた。反応溶液を、タンパク質を除去するためにフェノール／クロロホルムで３回抽出し、そしてエタノール沈殿反応を、ゲノムＤＮＡに対して行った。サケの精子ＤＮＡをもまた抽出し、そして上記のように使用した。ＤＮＡ中に存在するＬＰＳの量を、Ｌｉｍｕｌｕｓ変形細胞溶解物アッセイ（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｄ．ら（１９７６）、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ａ．Ｗ．Ｂｅｒｎｈｅｉｍｅｒ編、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２１７頁）によって測定し、そして２．５ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満であった。
【００４５】
１０％のＦＢＳを含有する培地上で培養されたＩＭ９細胞中とＦＢＳを含有しない培地上で培養されたＩＭ９細胞中との酵素活性を比較するために、１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、２０μｌの各培養物と混合し、そして３７℃にて一定の間隔で反応させた。細胞培養物を使用することによるエンドヌクレアーゼの酵素活性のアッセイにおいては、ＦＢＳを含有しない培地上での細胞培養物を、ＦＢＳ中に存在するＤＮａｓｅＩの影響を排除するために使用した。また、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＩＭ９細胞、およびサケの精子の、１００ｎｇの各ゲノムＤＮＡを、上記のような同じ条件下で反応させ、そして従って、酵素活性を、１％のアガロースゲル電気泳動において決定した。
【００４６】
１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地およびＩＭ９細胞培養物を、インビトロでの細菌のＤＮＡの消化の程度を観察するために、細菌のＤＮＡと直接反応させた。図１８Ａは、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地中のプラスミドＤＮＡの消化の程度を示す。図１Ｄに示す結果とは異なり、この結果は、ＤＮａｓｅＩが培地中に存在するにもかかわらず、弱い酵素活性が検出されることを示した。このことは、培地が、ＤＮａｓｅＩ活性に対して影響を与え得るイオンまたはインヒビターを含むことを示す。しかし、プラスミドＤＮＡは、ＦＢＳを含有しない細胞培養溶液または１０％のＦＢＳを含有する細胞培養溶液によって消化された（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。このことは、プラスミドＤＮＡが、ＩＭ９細胞株によって分泌されたエンドヌクレアーゼによって消化されたことを示す。図１８Ｂと図１８Ｃとの比較は、１０％のＦＢＳを含有する細胞培養溶液中での酵素活性がより高いことを示す。細胞培養が、２×１０5細胞／ｍｌで開始された場合には、ＦＢＳの存在下での細胞の増殖が活性に生じ、そして大量のエンドヌクレアーゼが分泌された。図１９は、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＩＭ９細胞のＤＮＡ、およびサケの精子のＤＮＡの全てが、エンドヌクレアーゼによって消化されたことを示す。
【００４７】
３．２ 細胞中への細菌のＤＮＡの取りこみおよびＤＮＡ塩基配列の分析
ＩＭ９細胞株を、加熱した１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地とＩＭ９細胞培養溶液（４８時間培養した）との１：１で混合した培地上で培養した。細菌のＤＮＡ（２５μｇ／ｍｌ）を、培養溶液に添加した。ＩＭ９細胞株を１×１０6細胞／ｍｌの細胞密度で培養しながら、細胞を一定の間隔で回収し、そして細胞中に取りこまれたＤＮＡを抽出するために使用した。
【００４８】
ＩＭ９細胞株を細菌のＤＮＡで処理した後、細胞を一定の間隔で回収し、そしてＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、冷却した溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、および０．５％のＮＰ−４０）中に再懸濁し、細胞溶解物を、上記の実施例１−２に記載した方法によって得た。同じ容量のＤＮＡ抽出緩衝液を細胞溶解物に添加し、そして４２℃にて３時間放置し、そして次いで、タンパク質を除去するためにフェノール／クロロホルムで２回処理した。次いで、細胞溶解物中に存在するＤＮＡを、エタノール沈殿によって抽出した。沈殿物を、ＴＥ緩衝液中に溶解させ、そしてＲＮａｓｅＡで処理し、そしてサザンブロッティングのサンプルに使用した。
【００４９】
細胞溶解物から抽出したＤＮＡを、１．８％のアガロースゲル上での電気移動によって分離し、そしてサザン転移を行った。電気泳動後、アガロースゲルを、およそ２００ｍｌのアルカリ溶液（１．５ＭのＮａＣｌおよび０．５ＭのＮａＯＨ）中で２０分間振盪させ、滅菌水で洗浄し、そしておよそ２００ｍｌの中和溶液（１．５ＭのＮａＣｌ、０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５）中に２０分間放置した。続いて、アガロースゲルを、新しい中和溶液中で振盪した。１７５．３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのクエン酸ナトリウム溶液、および２ｍｌの０．５ＭのＥＤＴＡを滅菌水に添加して、１ｌの溶液を作成し、そして得られた溶液を、ＳＳＣ溶液を得るために１２１℃でオートクレーブした。容器１の底が容器Ｂ中に含まれる容器の表面に配置され得るように、１つの長方形の容器Ａを、２０×ＳＳＣを含有する別の容器Ｂ上に逆向きに置いた。２０×ＳＳＣで飽和させた２ｍｍの幅のＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．３ペーパーを、両方の２０×ＳＳＣがくっつき得るように、気泡を含まずに容器Ａの底に置いた。アガロースゲルをペーパー上に逆向きにお気、そしてＨｙｂｏｎｄ+ナイロンメンブレンを、気泡が生じることを防ぐためにアガロースゲル上に置いた。アガロースゲルよりも小さい３枚のＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．３ペーパーを、それぞれを２ｍｍで４面に置き、気泡を含まないようにＨｙｂｏｎｄ+ナイロンメンブレン上に置いた。次いで、ペーパータオルを、１０から２０ｃｍまでの高さになるように、積み上げ、そして約５００ｇの錘を置いた。ゲルの底の周辺は、パラフィルムで囲み、そして毛細管転移を、８時間行った。ＤＮＡが載っているメンブレンを、１２０，０００μｌ／ｃｍのＵＶ照射に２分間曝して、ＵＶによって架橋した。
【００５０】
細菌のＤＮＡを、３７℃にて３０分間、エンドヌクレアーゼと反応させ、そして得られた１００から２００ｂｐの生成物を、１％のアガロースゲル上で電気泳動した。Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）を使用して、ＤＮＡをゲルから回収し、そしてＤＮＡプローブとして使用した。５０から１００ｎｇのＤＮＡを１００℃の水中で３分間加熱し、そしてすぐに氷上で冷却して、ＤＮＡフラグメントに分離させ、次いで、32Ｐで標識した。ＤＮＡ標識反応を、ランダムプライム法に従って行った。ここでは、１０ｎｇのランダムプライマー、４μｇの緩衝溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、５ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．６）、２５μＭのｄＡＴＰ、２５μＭのｄＧＴＰ、２５μＭのｄＴＴＰ、６０μＣｉ［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ、および５μｌのＫｌｅｎｏｗ酵素から構成される２０μｌの混合物を、３７℃にて２時間反応させた。２μｌの０．５ＭのＥＤＴＡを反応混合物に添加して反応を停止させ、そして次いで、同じ容量の３Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２および２０μｇのサケの精子のＤＮＡを添加した。２倍の容量のエタノールを反応混合物に添加して、所望のＤＮＡを沈殿させた。沈殿物をＴＥ寛容液中に溶解させ、１００℃に加熱し、そして氷上で迅速に冷却した。
【００５１】
ＵＶ架橋したＨｙｂｏｎｄ+ナイロンメンブレンを、６８℃に予め暖めた予備ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．０５％のピロリン酸ナトリウム、０．５％のＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌのサケの精子のＤＮＡ）に添加し、そして６８℃にて少なくとも１時間振盪した。標識したプローブ（ランダムプライミング法によって調製し、そして氷上で冷却した）を添加して、約１２時間ハイブリダイズさせた。フィルターを、洗浄溶液Ｉ（２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）に移し、そして約１０分間室温で洗浄した。次いで、フィルターを、６８℃に予め暖めた洗浄溶液Ｉに移し、そして約２５分間洗浄した。続いて、フィルターを洗浄溶液ＩＩ（０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）に移し、そしてＧｅｉｇｅｒカウンターによってフィルター上の放射活性を測定しながら洗浄した。フィルターを、増感紙およびＸ線フィルムを取りつけたカセットに挿入した。−７０℃で１２から２４時間後、フィルターを現像した。
【００５２】
細菌のＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを、細胞培養の間に添加し、そして３７℃にて１時間インキュベートした。細胞溶解物中に存在するＤＮＡフラグメントを、１．８％のアガロースゲル上で電気泳動した。次いで、サザン転移による５０−２００ｂｐの部位のゲルを、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）を使用して回収した。ＤＮＡフラグメントを、塩基配列を同定するために、図２１に示すようにｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）中に導入した。得られたベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ中にクローン化し、そしてサンガージデオキシリボヌクレオチド鎖終結方法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４、５４６３−５４６７）に従って、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（登録商標）バージョン２．０ ＤＮＡ配列決定キット（ＵＳＢ）によって分析した。以下の表１に記載するＭＢ正方向／逆方向プライマーを、配列決定のためのプライマーとして使用した。クローン化したＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌｓ）プログラムによって、細菌のＤＮＡフラグメントまたはプラスミドＤＮＡフラグメントとして確認した。
【００５３】
【表１】
【００５４】
試験結果は、２５μｇ／ｍｌの細菌のＤＮＡをＩＭ９細胞とともにインキュベートした場合に、ＤＮＡは細胞培養物中で適切にプロセシングされ、そして細胞中に取りこまれることを示す。このことを、サザンハイブリダイゼーションによって確認した（図２０）。１００−２００ｂｐのＤＮＡの存在が、細胞培養の３０分後に見出された。細胞中の１００−２００ｂｐのＤＮＡの量は、培養時間の経過に伴って減少した。これらの結果は、適切にプロセシングされたＤＮＡがＩＭ９細胞株中に取りこまれ、そしてプロセシングが細胞中で継続されることを示唆する。
【００５５】
エンドヌクレアーゼの酵素活性によって得られた生成物の特性を同定するために、細胞中に取りこまれた細菌のＤＮＡを単離し、そしてそのＤＮＡ配列を、図２１に示すように分析した。表２に示すように、エンドヌクレアーゼの反応生成物は、特徴的な塩基配列（すなわち、５’末端に２つのプリン塩基を有し、そして３’末端に２つのピリミジン塩基を有するＣｐＧモチーフ）を有した。ＣｐＧモチーフが免疫システムにおいてＢ細胞またはマクロファージを活性化し、そしてシトシンおよびＩｇＭの分泌を促進し、そして高い頻度で細菌のＤＮＡ中に存在することは、公知である。従って、エンドヌクレアーゼがＩＭ９細胞培養溶液中に存在し、そして細胞中の酵素活性によるＤＮＡのプロセシングがＣｐＧモチーフ（これは、免疫細胞を活性化するように機能する）を生成することが、ここで見出された。
【００５６】
【表２】
【００５７】
３．３ 細胞中に取りこまれたＤＮＡのプロセシングの確認
どのようにして細胞中に取りこまれた５０−２００ｂｐのクローン化されたＤＮＡフラグメントが細胞内でさらにプロセシングされるか、およびＤＮＡフラグメントの塩基配列が細胞に対してどのような影響を与えるか確認するために、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応溶液は、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌのプライマー、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、および２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼを含んだ。５’−ＣＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧ−３’および５’−ＴＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣ−３’（表Ｉ）を合成し、そしてＰＣＲプライマーとして使用した。ＰＣＲ反応を、以下の条件下で３５回繰り返した：変性（９４℃で３０秒間）；プライマーのアニーリング（４２℃で３０秒間）；プライマーの伸張（７２℃で５０秒間）。ＰＣＲ生成物を、８％の未変性のＰＡＧＥ上でＴＢＥ緩衝溶液中で泳動し、そしてエチジウムブロマイドで染色した。続いて、ＤＮＡを、ＰＣＲ反応生成物のゲルから分離した。分離したＤＮＡをエタノールで沈殿させ、そして細胞培養物についてはＰＢＳ中に溶解させるか、またはエンドヌクレアーゼの活性の検出のためにはＴＥ緩衝液中に溶解させた。
【００５８】
最終生成物の形態が、１００−２００ｂｐの細菌のＤＮＡをクローニングしているベクター（これは、エンドヌクレアーゼの活性によって切断された）中のＰＣＲ増幅によって得られた生成物が細胞に導入された後に存在することを確認するために、ＥＣ１、ＥＣ２、およびＨＣ１のＤＮＡフラグメントを、ランダムプライマーおよびＫｌｅｎｏｗ酵素を使用するランダムプライミング方法によって32Ｐで標識した。32Ｐで標識した１００ｎｇ／ｍｌのＤＮＡフラグメントが、ＩＧ９細胞株、Ｕ９３７細胞株、およびＴＰＡで処理したＵ９３７細胞株中に取りこまれた。ＤＮＡが細胞に取りこまれたかどうかを、一定の間隔で確認した。エンドヌクレアーゼを、０．２ｍＭのＺｎＳＯ4（Ｓｉｇｍａ）で処理して、その酵素活性を停止させた。細胞中に取りこまれたＤＮＡを細胞溶解物中で回収し、そしてＴＢＥ緩衝溶液中で２０％の未変性のＰＡＧＥ上で泳動させた。ゲルを乾燥させ、そして細胞内およびエンドヌクレアーゼ反応によって得られた最終生成物中のＤＮＡのプロセシングを確認するためにオートラジオグラフした。
【００５９】
32Ｐで標識したＥＣ１のＤＮＡフラグメントは、ＩＭ９細胞株中に取りこまれた。細胞中に取りこまれたＤＮＡを細胞溶解物から抽出し、そして２０％の未変性のＰＡＧＥを行った。32Ｐで標識されたプロセシングされたＤＮＡをゲルから抽出し、そしてそれらの互いの塩基配列を比較するために、種々の合成したオリゴヌクレオチドとアニーリングさせた。予め決定した量の、32Ｐで標識した抽出したＤＮＡおよび１０ｎｇの各オリゴヌクレオチドを、６×ＳＳＣと混合した。混合物を、１００℃の温度で５分間沸騰させ、そして３０秒間で１℃で温度を下げてアニーリングさせた。アニーリングさせた反応物を、２０％の未変性のＰＡＧＥ上で４℃にて泳動し、そして反応物についてのオートラジオグラフィーを行った。このようにして、細胞中に取りこまれたＤＮＡに相補的に結合したオリゴヌクレオチドを確認した。標準として、アニーリングしていないＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドとの混合物、および変性させそして細胞中に取りこまれたＤＮＡのみとアニーリングさせたＤＮＡを使用した。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列は、オリゴＡおよびＢ（これらは、ＥＣ１のＤＮＡフラグメント中に存在する）、ならびにオリゴＣ、Ｄ、およびＥ（これらは、ＥＣ１のＤＮＡ中には存在しない）を使用した。
【００６０】
外部のＤＮＡがヒトのＢ−リンパ芽球ＩＭ９細胞株、Ｕ９３７細胞株、およびＴＰＡでの処理によって分化させられたＵ９３７細胞株中に取りこまれること、ならびに細胞中でプロセシングされることが確認された。試験の結果として、プロセシングされた生成物を、ＰＣＲ増幅した32Ｐで標識した細菌のＤＮＡフラグメントとして同定した。ＩＭ９細胞株中での外部のＤＮＡの取りこみおよびプロセシングを、図２２に示すように確認した。１５７ｂｐ（ＥＣ１）のＤＮＡフラグメントは、４℃では細胞中には取り込まれなかったが、細胞膜に結合した。３７℃の温度では、ＤＮＡフラグメントは、培養時間の経過に伴って細胞中でプロセシングされた。２４時間以内に、約１０ｂｐのＤＮＡフラグメントが、２０％の未変性のＰＡＧＥにおいて最終産物として生じた。続く試験においては、１０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、一本鎖のＤＮＡ構造として同定した。ＤＮＡフラグメントをまた、２０％の未変性のＰＡＧＥ（８．３Ｍの尿素）上で一本鎖のＤＮＡ構造として同定した。図２３は、Ｕ９３７細胞株、およびＴＰＡでの処理によって分化させられたＵ９３７細胞株中で観察された外部のＤＮＡの取りこみ、ならびに細胞中でのプロセシングを示す。しかし、図２３Ｂは、ＴＰＡでの処理によって分化させられたＵ９３７細胞株によるＤＮＡの取りこみおよび細胞中でのプロセシングを示す。図２３Ｂに示すように、細胞中でのＤＮＡのプロセシングは、０．２ｍＭのＺｎ2+によって阻害された。
【００６１】
試験結果は、免疫細胞が外部のＤＮＡをプロセシングすることによって、１０塩基の最終生成物を生じることを実証する。ＤＮＡフラグメントの塩基配列の特性をもまた確認した。ＰＣＲによって増幅したＥＣ１のＤＮＡ産物を32Ｐで標識し、そして細胞中に取りこませた後、細胞性のエンドヌクレアーゼによってプロセシングされた１０塩基のＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドと相補的に結合した塩基配列を同定するために、ＥＣ１の部分的な配列と一致するいくつかのタイプの合資のオリゴヌクレオチドとアニーリングさせた（図２４）。アニーリングの結果として、オリゴヌクレオチド（そのほとんどが、塩基配列と相補的に結合した）は、表１のオリゴＡの配列（すなわち、ＡＡＣＧＴＴモチーフを有し、そしてＥＣ１のＤＮＡ中に存在する塩基配列）であった。上記の結果から、細胞中のエンドヌクレアーゼの酵素的活性によって免疫細胞を活性化する細菌のＤＮＡの塩基配列として公知のＣｐＧモチーフが産生されたことを、明らかに確認した。
【００６２】
３−４ 細菌のＤＮＡによるＩＭ９細胞株のＩｇＭ分泌の確認
Ｂ細胞を活性化することによって、サイトカインおよびＩｇＭを分泌することが公知のＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドを合成した。エンドヌクレアーゼの作用によって産生されたＤＮＡフラグメントの中でも、ＥＣ１中に存在するオリゴＡ、およびＥＣ２に存在するオリゴＢ、およびＣｐＧモチーフを有さないオリゴＥを合成した（表１）。いくつかのＣｐＧモチーフを含有するＥＣ１またはＥＣ２のＰＣＲ生成物、およびいくつかのタイプのＤＮＡをもまた、この実験において使用した。ＣｐＧモチーフをメチル化するために、細菌のＤＮＡをエンドヌクレアーゼによって消化し、それによって１００−２００ｂｐを有するフラグメントを得た。メチル化を、３０μｇのＤＮＡを、ＣｐＧメチラーゼおよび１６０μＭのＳ−アデノシルメチオニンを含有する緩衝溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＤＴＴ）と混合し、そして３７℃にて３時間反応させることによって行った。ＣｐＧメチル化を、ＨｐａＩＩで消化することによって確認した。
【００６３】
ＩＭ９細胞株、ヒトＢリンパ芽球細胞株を、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で、培養の開始時点で２×１０5の細胞数で培養した。培養物をいくつかのタイプの予め調製した２５μｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡで処理し、そして２４時間培養した後、細胞培養物を得た。
【００６４】
０．１Ｍの炭水化物緩衝溶液（ｐＨ９．６）中の抗−ヒト−μ−鎖特異的ＩｇＭ（５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を、１００μｌ／ウェルで平底プレート中に取りこみ、そして次いで、プレートを４℃にて１６時間放置した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、そして室温で２時間放置した。続いて、プレートを、ＴＰＢＳ（ＰＢＳ中の０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。１００μｇ／ウェルで、ざっと希釈した細胞培養物または精製したヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ）を導入した。室温で２時間放置した後、これをＴＰＢＳで３回洗浄した。１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中で１／４０，０００中に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させ抗ヒトＩｇを導入し、そして室温にて１時間放置し、そして次いで、ＴＰＢＳで３回洗浄した。続いてプレートを、０．０５Ｍのリン酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）中で３０分間、Ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライドで処理した。プレートを、０．６７ＮのＨ2ＳＯ4で処理して反応を停止させ、そしてＩｇＭをマイクロリーダーを使用して定量した。
【００６５】
ＩＭ９細胞株を合成のオリゴヌクレオチドと反応させた後の４８時間に分泌されたＩｇＭの量を測定しながら、ＣｐＧモチーフを有するオリゴＡおよびオリゴにおいては、ＩｇＭの２−３ｎｇ／ｍｌが分泌されたが、ＣｐＧモチーフを有さないオリゴＥにおいては、０．５ｎｇ／ｍｌのＩｇＭが合成されたことを確認した（図２５）。さらに、２−３ｎｇ／ｍｌのＩｇＭがまた、細菌のＤＮＡおよびいくつかのＣｐＧモチーフを有する細菌のＤＮＡのＰＣＲ生成物（表１、ＥＣ１、ＥＣ２のＤＮＡ）中で分泌されたことを観察した。しかし、細菌のＤＮＡのＩｇＭのＣｐＧモチーフがメチル化されそして細胞株の培養物中で処理される場合は、これは分泌されなかった（図２５）。細菌のＤＮＡと比較して、ＩｇＭの分泌は、サケの精子のＤＮＡによっては増大させられなかった。上記の結果から、細菌のＤＮＡのＣｐＧモチーフは、ＩＭ９細胞株を活性化することによってＩｇＭの分泌を増大させることを確認した。そしてこのことは、上記のいく人かの研究者らによって合成されたＣｐＧモチーフを使用することによって証明された研究の結果と一致した。
【００６６】
３−５ 外来ＤＮＡのプロセシングに関与するエンドヌクレアーゼの酵素活性の特性
ＰＣＲによって増幅したＥＣ１、ＥＣ２、およびＨＣ１のＤＮＡを、ランダムプライマーおよびＫｌｅｎｏｗ酵素を使用する32Ｐランダムプライミング方法で標識した。より短いＤＮＡを得るために、ＥＣ２のＤＮＡをＡｌｕ １（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）で消化し、そしてその５’末端が32Ｐで標識されたフラグメントを、基質として使用した。エンドヌクレアーゼの酵素活性の特性を同定するために、ＥＣ１のＤＮＡを５’−末端または３’−末端標識し、そして利用した。５’−末端標識を、１０ｎｇのＥＣ１のＤＮＡ、［γ−32Ｐ］ＡＴＰ ５０μＣｉ、キナーゼ緩衝溶液、および５ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）を混合し、そして３７℃にて１時間反応させることによって行った。３’−末端標識を、１０ｎｇのＥＣ１のＤＮＡ、［α−32Ｐ］ＣＴＰ ５０μＣｉ、ＴｄＴ緩衝溶液、および５ユニットの末端デオキシトランスフェラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を混合すること、および３７℃にて１時間反応させることによって行い、そして利用した。
【００６７】
上記のように調製した５ｎｇのＥＣ１、ＥＣ２、およびＨＣ１のＤＮＡを、ランダムプライミング方法によって標識し、Ａｌｕ Ｉで消化し、そして５’−標識したそしてＥＣ２のＤＮＡを、ＩＭ９細胞培養物（これは、ＦＢＳを含まず、そして一定の時間の間隔で反応させた）と混合した。酵素活性をまた、細胞培養物の量を増大させることによって測定した。反応混合物を、フェノール／クロロホルムで処理してタンパク質を除去し、冷却したエタノールで沈殿させ、そして２０％の未変性のＰＡＧＥおよび２０％の変性させたＰＡＧＥ（８．３Ｍの尿素）を用いてＴＢＥ緩衝溶液中で電気泳動した。ゲルを乾燥させ、そしてオートラジオグラフした。反応生成物を酵素活性について分析した。ＦＢＳ中のＤＮａｓｅＩの酵素活性を比較するために、１０％のＦＢＳを含有する１０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地をもまた、いくつかの基質と反応させた。さらに、エンドヌクレアーゼのインヒビターであるＺｎ2+（１ｍＭ）およびキレート剤であるＥＤＴＡ（１０Ｍｍ）が与える影響が、酵素活性を有することを確認した。この時に、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）およびキシレンシアノ−ル（ＸＣ）を、分子量の標準として使用した。変性させたＰＡＧＥにおいては、ＢＰＢは、８塩基で配置され、そしてＸＣは２８塩基であった。未変性のＰＡＧＥにおいては、ＢＰＢおよびＸＣは、それぞれ、１２ｂｐおよび４５ｂｐであった。
【００６８】
エンドヌクレアーゼの酵素活性の特性、およびに得られる生成物の特性を同定するために、表２に列挙したＥＣ１、ＥＣ２、およびＨＣ１のＤＮＡをランダムプライミング方法によって32Ｐで標識し、そして基質として利用した。ＦＢＳを含有しない培地中で培養したＩＭ９細胞株とのこれらの基質の反応が、図２６、２７、および２８に示すような、およそ１０塩基を有するＤＮＡ反応生成物を生じることを、確認した。この結果は、エンドヌクレアーゼがＤＮＡの塩基配列を特異的に認識するのではないことを示す。塩基の配列にはかかわらず、エンドヌクレアーゼは外来のＤＮＡに対して作用し、それによっておよそ１０塩基を有するＤＮＡフラグメントを生じる。酵素活性が、エンドヌクレアーゼのインヒビターであるＺｎ2+およびキレート剤であるＥＤＴＡによって阻害されることもまた、確認した（図２６、２７、２８、および２９）。インビトロでの実験によって、得られる生成物が、エンドヌクレアーゼの作用によって細胞中に取りこまれたＤＮＡをプロセシングすることによって産生される反応産物と一致することを確認した。エンドヌクレアーゼの酵素活性の反応によって得られる生成物が、およそ１０塩基を有するＤＮＡフラグメントからなることを確認した。エンドヌクレアーゼの量を増大させ（図３０）、そして反応時間を２４時間まで維持した場合でもなお、およそ１０塩基を有するＤＮＡフラグメント（すなわち、酵素反応によって形成される反応によって得られる生成物）はさらには消化されなかった。言い換えれば、本発明によって証明されたエンドヌクレアーゼは、およそ１０より短い塩基を有するＤＮＡフラグメントに対しては活性を全く発揮しない。
【００６９】
図３２は、いくつかのＤＮＡフラグメントを示す。すなわち、ＰＣＲによって増幅されたＥＣ２のＤＮＡ生成物がＡｌｕＩで消化されそしてＤＮＡフラグメントが生じる前に形成されたエンドヌクレアーゼ反応生成物を、最終生成物を生じるようにエンドヌクレアーゼと反応させた。この実験において使用した基質を、ＡｌｕＩと反応させたＤＮＡの５’−末端中で32Ｐで標識した。標識した酵素の反応によって得られた生成物は、およそ１０塩基を有するＤＮＡフラグメントであった。この事実から、一本鎖のＤＮＡを産生する５’−エンドヌクレアーゼの酵素活性は存在しないことを確認した。
【００７０】
ＩＭ９細胞株のエンドヌクレアーゼが、３’−エキソヌクレアーゼまたは５’−エキソヌクレアーゼ活性を有するかどうかを確認するために、５’−末端または３’−末端で32Ｐで標識したＥＣ２のＤＮＡを基質として使用し、そして３７℃にて１時間、エンドヌクレアーゼと反応させた。反応によって得られる生成物を、上記に記載したものと同じ方法によってオートラジオグラフによって比較した。エンドヌクレアーゼの酵素活性が一本鎖のＤＮＡ中に出現するかどうかを確認するために、標識したＤＮＡを１００℃にて５分間沸騰させ、氷上で冷却し、そして上記のようにエンドヌクレアーゼと反応させた。
【００７１】
図３３は、およそ１０塩基を有するＤＮＡフラグメントが、５’−末端（５’−末端標識、レーン２）中で標識した基質に対するエンドヌクレアーゼの作用によって形成されることを示す。結果は、図３２に示すものと同じである。すなわち、５’−エキソヌクレアーゼ活性はエンドヌクレアーゼ中には存在しなかった。しかし、およし１０塩基を有するＤＮＡフラグメント（すなわち、酵素反応によって得られた生成物）は、３’−末端中で32Ｐで標識した基質においては形成されなかった。32Ｐで標識した基質を１００℃で１０分間沸騰させ、氷上で冷却させて一本鎖のＤＮＡに転換させ、そして次いでエンドヌクレアーゼと反応させた後、およそ１０塩基を有する標識されたＤＮＡフラグメントが、５’−末端および３’−末端の両方において標識されたＤＮＡ基質において酵素反応生成物として形成された。試験結果に基づくと、３’−エキソヌクレアーゼ活性は、一本鎖に対しては作用しない。
【００７２】
細胞培養物中に存在するエンドヌクレアーゼの酵素活性によって産生される反応によって得られる生成物を、細胞中でのプロセシングによって産生される生成物およびＤＮａｓｅＩの作用によって産生される反応の最終生成物と比較するために、５ユニットのウシすい臓のＤＮａｓｅＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およびランダムプライミング方法によって32Ｐで標識したＥＣ１のＤＮＡを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ2緩衝得溶液中で、３７℃にて１時間反応させた。反応物を、２０％の未変性のＰＡＧＥおよび２０％の変性させたＰＡＧＥ（８．３Ｍの尿素）上で泳動し、オートラジオグラフし、そしてエンドヌクレアーゼの酵素反応によって得られた生成物と比較した。また、エンドヌクレアーゼ活性の得られる生成物が一本鎖で存在することを確認するために、これをＳ１ヌクレアーゼで処理した。Ｓ１ヌクレアーゼの酵素活性を、Ｓ１ヌクレアーゼ反応緩衝溶液（７×緩衝溶液、０．３Ｍの酢酸カリウム、ｐＨ４．６、２．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＺｎＳＯ4、５０％のグリセロール）中に含まれる３ユニットのＳ１ヌクレアーゼと、ランダムプライミング方法によって32Ｐで標識した基質に対する作用によるエンドヌクレアーゼの反応によって得られる生成物とを混合すること、そして３７℃にて１時間、混合物を反応させることによってによって確認した。反応物を、上記と同じ方法によってオートラジオグラフによって確認した。
【００７３】
エンドヌクレアーゼの酵素活性によって生じる得られる生成物と、ＤＮａｓｅＩの作用によって生じる反応生成物との比較によって、図３４に示すように、細胞培養物のエンドヌクレアーゼによってプロセシングされたＤＮＡ反応生成物（レーン２）および細胞性のエンドヌクレアーゼによってプロセシングされたＤＮＡ反応生成物（レーン３）は全て、およそ１０塩基を有するＤＮＡフラグメントである。しかし、ＤＮａｓｅＩの作用によると（レーン４）、ＤＮＡフラグメントは、１０塩基未満にまで分解された。フラグメントは、続いて、モノヌクレオチドにまで分解された。エンドヌクレアーゼ反応によって得られる生成物が一本鎖の形態で存在するかどうかを確認するために、生成物をＳ１ヌクレアーゼで処理し、そして酵素反応生成物を観察した。およそ１０塩基を有する反応生成物（すなわち、エンドヌクレアーゼの生成物）をＳ１ヌクレアーゼと再び反応させた場合は、図３５に示すように、完全にモノヌクレオチドにまで分解された。このことは、エンドヌクレアーゼの酵素活性によって産生されたおよそ１０塩基を有するＤＮＡフラグメントが、一本鎖の形態で存在することを提供する明らかな証拠である。
【００７４】
実施例４
ＩＭ９細胞株から分泌されたエンドヌクレアーゼの精製および同定
ＩＭ９細胞株が合成され、そしてＭｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼ（これは、これまでに既知であるヌクレアーゼとは異なる）を分泌することが、ここで見出された。エンドヌクレアーゼがＩＭ９細胞株の核内に存在し、そしてアポトーシスのプロセスに関与することもまた、見出された。アポトーシスに関与するエンドヌクレアーゼとして、Ｍｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼ（Ａｎｚａｉ Ｎ．ら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８６、９１７−９２３；Ｋａｗａｂａｔａ Ｈ．ら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９１，２５７−２５４；Ｓｕｎ Ｘ．Ｍ．，およびＣｏｈｅｎ Ｇ．Ｍ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１４８５７−１４８６０；ならびにＫａｗａｂａｔａ，Ｈ．ら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３３，１３３−１３８）、Ｃａ2+／Ｍｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼ（Ｓｔｒａｔｌｉｎｇ Ｗ．Ｈ．ら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，５８９３−５８９８；Ｐａｎｄｅｙ Ｓ．ら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２、９１２９−９１３６）、ＤＮａｓｅＩ（Ｐｅｉｔｅｃｈ Ｍ．Ｃ．ら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２，３７１−３７７）、ＮＵＣ１８（Ｋａｗａｂａｔａ，Ｈ．ら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３３，１３３−１３８）などが挙げられる。しかし、上記の既知のエンドヌクレアーゼの精製、生化学的特徴、および生理学的な機能は、明らかには同定されていない。さらに、細菌のＤＮＡを外来因子として認識し得、そしてそれらをプロセシングし得るエンドヌクレアーゼについての報告は全く存在しない。本発明によって、ＩＧ９細胞株によって合成されそして分泌されるエンドヌクレアーゼが精製され、そしてその特性が本明細書中で同定された。
【００７５】
４−１ タンパク質の供給源およびエンドヌクレアーゼの酵素活性についてのアッセイ
エンドヌクレアーゼを分泌するＩＭ９細胞株を、加熱した１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で大規模に培養し、そして得られた細胞培養物を、酵素の供給源として使用した。細胞培養物を１，５００×ｇで５分間遠心分離した後、ＩＭ９細胞株を廃棄し、そして細胞培養溶液を回収した。１０ｌの細胞培養溶液を、１４，０００×ｇで３０分間、４℃にて遠心分離し，そして得られた上清を酵素の供給源として使用した。
【００７６】
エンドヌクレアーゼの精製の間に、酵素活性を、基質として使用したスーパーコイルプラスミドＤＮＡからの直鎖上のＤＮＡの形成および消化の程度として測定した。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１０ｍＭのＭｇＣｌ2を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０緩衝溶液に添加し、そして混合物を、３７℃にて１０分間のタンパク質の精製の間に得られた２０μｌのサンプルと反応させた。酵素反応を、ＤＮＡサンプル緩衝液を用いて停止させ、そして酵素活性を、１％のアガロースゲル上での電気泳動によってアッセイした。
【００７７】
４．２ エンドヌクレアーゼの精製
細胞培養溶液を、ＮＨ4ＳＯ4をゆっくりと添加することによって８０％の濃度まで飽和させ、そして次いで１４，０００×ｇで遠心分離した。得られる沈殿物を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ５．２）中で一晩透析した。酵素溶液の５ｍｌのアリコートを、５ｍｌの同じ緩衝溶液で予め平衡化したＭｏｎｏ−Ｓカラム（０，５×５．０ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）上にロードした。タンパク質を、同じ緩衝溶液中の０−０．０８ＭのＮａＣｌ（１５ｍｌ）の直線状の濃度勾配によって最初に溶出し、そして次いで、０．０８ＭのＮａＣｌを含有する１５ｍｌの同じ緩衝溶液を通過させた。続いて、タンパク質を、０．０８−０．２ＭのＮａＣｌ（２０ｍｌ）の直線状の濃度勾配を用いて再度溶出した。各画分の容量は１ｍｌであり、そして流速は０．５ｍｌ／分であった。上記の手順を繰り返し、そしてエンドヌクレアーゼを含有する画分をプールし、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎを使用して濃縮し、そして次いで、１．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4を含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）で平衡化した。この酵素供給源を、ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥカラム（０．６４×３０ｍｍ、１ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）上にロードし、そして疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った。カラムを１５μｌの同じ緩衝溶液で洗浄し、そしてタンパク質を、１．５−０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4（２５ｍｌ）の直線状の勾配を用いて溶出した。酵素活性を有する画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ中で濃縮し、そして２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．０）を用いて平衡化した。
【００７８】
ＩＭ９細胞培養溶液を硫酸アンモニウム上で濃縮し、そして精製のために使用した。硫酸アンモニウム上でのディファレンシャルな沈殿を、濃度の差異に依存して行ったが、酵素の単離に対する有意な影響はなかった。従って、培養溶液を８０％まで濃縮し、そしてタンパク質を精製のために沈殿させた。Ｍｏｎｏ Ｓカラム上を通過させたサンプル中の酵素活性を、０．０８−０．２ＭのＮａＣｌの直線状の濃度勾配によって回収した（図３６）。陽イオン交換樹脂上で活性を示す画分をプールし、そして疎水性相互作用クロマトグラフィー中においてＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥカラム上を通過させた。タンパク質を、１．５−０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4の直線状の濃度勾配を用いて溶出した場合は、エンドヌクレアーゼの活性は、上記の勾配の中で、０．７Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4勾配から得られたタンパク質画分中で検出された（図３７）。１０μｇのエンドヌクレアーゼを、およそ１０ｇのタンパク質を含有する１０ｌのＩＭ９細胞培養溶液から精製した。
【００７９】
４−３ 未変性の有孔性の勾配ＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の決定
陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー上で酵素活性を示す画分をプールし、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ中で濃縮した。濃縮した溶液を、アクリルアミド勾配ゲルの４−１５％の直線状の勾配上にロードし、そして電気泳動を、４℃にて１８時間、４−５ｍＡで行った。次いで、ゲルを、タンパク質バンドを検出するためにクマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。タンパク質バンドのゲルの部分を切り出して、染色の前に小さい断片を作成し、そして２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．０）を用いて４℃にて８時間溶出した。溶出したタンパク質画分の中の酵素活性を、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを基質として使用して検出した。酵素活性画分を濃縮し、そしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。スタッキングゲルおよび泳動ゲルの濃度は、それぞれ、４％および７％であった。未変性の有孔性の勾配ＰＡＧＥ中の標準タンパク質は、フェリチン（４４０ｋＤ）、カタラーゼ（２３２ｋＤ）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（１４０ｋＤ）、およびウシ血清アルブミン（８７ｋＤ）の混合物であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける標準タンパク質は、ミオシン（２００ｋＤ）、β−ガラクトシダーゼ（１１６．３ｋＤ）、ホスホリラーゼＢ（９７．４ｋＤ）、ウシ血清アルブミン（６６．２ｋＤ）、およびオボアルブミン（４５ｋＤ）の混合物であった。
【００８０】
ＭｏｎｏＳカラム上で溶出した酵素活性画分を濃縮し、そして４−１５％の未変性の有孔性の勾配ゲル電気泳動を、酵素活性を示すタンパク質バンドを検出するために行った（図４０）。酵素活性を示すタンパク質バンドは、明確な単一のバンドは示さず、そして標準タンパク質と比較して１４０ｋＤの周辺に広がった。酵素活性を示すタンパク質バンドを溶出した。濃縮後、電気泳動を、ＳＤＳ−ＰＡＧ上で行った（図４１）。精製したタンパク質バンドは、クロマトグラフィーによって精製したエンドヌクレアーゼト同じ部位で示され、そしてタンパク質の分子量を、およそ７２．４ｋＤと決定した（図３９）。未変性の有孔性の勾配ゲル電気泳動とＳＤＳ−ＰＡＧＥとの結果の比較は、エンドヌクレアーゼがホモダイマーの形態で酵素活性を示すことを明らかにした。
【００８１】
４−４ 精製した酵素の特徴付け
４時間の間全くエンドヌクレアーゼ酵素活性が検出されなかったＵ９３７細胞から核を単離し、基質として使用した。酵素活性の特異性を、１ｍＭのＣａ2+、１ｍＭのＭｇ2+、およびＥＤＴＡを、単離した核を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．０）に添加すること、そして３７℃で１０分間反応させることによって確認した。
【００８２】
Ｕ９３７細胞株から単離した核を基質として使用した場合には、精製した酵素の活性は、Ｍｇ2+の存在下で示され、そしてアポトーシスのインヒビターであるＺｎ2+およびキレート剤であるＥＤＴＡによって完全に阻害された（図４２）。特徴的な酵素活性は、上記の酵素活性のものと一致した。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明のエンドヌクレアーゼは、外来の細菌のＤＮＡを分解し、そして細胞中にＤＮＡフラグメントを取りこむことが可能である。細胞中に取りこまれたＤＮＡは、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを生成するように、細胞内のエンドヌクレアーゼによってプロセシングされ、そして次いで免疫細胞が、抗体の分泌を促進するようにＣｐＧモチーフによって活性化される。従って、本発明のエンドヌクレアーゼは、薬学的な免疫アジュバントとして産業的に価値がある。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１には、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって分析された、本発明のＩＭ９細胞のエンドヌクレアーゼ活性を示す。ＩＭ９細胞溶解物（Ａ）、培地（Ｂ）および無血清にて培養された培地（Ｃ）におけるエンドヌクレアーゼ活性を、ゲル内システムで検出した。ウシＤＮアーゼＩ（レーン）および培養培地エンドヌクレアーゼ活性（レーン２）を比較した（Ｄ）。
【図２】図２には、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって分析された、ＤＮアーゼＩ（Ａ）およびＩＭ９培養培地（Ｂ）のエンドヌクレアーゼ活性を示す。
【図３】図３には、抗−ウシＤＮアーゼＩ抗体による、エンドヌクレアーゼ活性の免疫沈降を示す。免疫沈降（ＩＰ）後の上清におけるエンドヌクレアーゼ活性を、「材料および方法」に記載したとおりＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって、示した抗血清処理について評価した。Ａ，10％ＦＢＳ培地およびヒト血清；Ｂ，ＩＭ９細胞培養培地。
【図４】図４には、アクチノマイシンＤでのＩＭ９細胞の前処理と、エンドヌクレアーゼの分泌を示す。本発明の細胞溶解物（Ａ）および培養培地（Ｂ）におけるエンドヌクレアーゼ活性を、前処理後に、示した培養期間分析した。
【図５】図５には、本発明の免疫細胞系におけるエンドヌクレアーゼ活性の比較分析を示す。各細胞系の溶解物（Ａ）および培養培地（Ｂ）におけるエンドヌクレアーゼ活性を、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって分析した。レーン１，10％ ＦＢＳ含有培地；レーン２，ＩＭ９；レーン３，ＲＰＭＩ1788；レーン４，Molt-4；レーン５，Jurkat；レーン６，Ｕ937。
【図６】図６には、ＩＦＮ−γまたはＩＦＮ−1βで処理された、本発明のＩＭ９細胞培養培地および細胞溶解物の、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって分析されたエンドヌクレアーゼ活性を示す。ＩＭ９細胞は、10 単位/mlのＩＦＮ−γまたはＩＦＮ−1βで、示した培養時間処理された。対照，10％ ＦＢＳを含有するＲＰＭ 16-40培地で12時間の、ＩＭ９培養培地。
【図７】図７には、本発明のエンドヌクレアーゼ活性に対する至適ｐＨを示す。
【図８】図８には、本発明のエンドヌクレアーゼ活性に対する二価陽イオン要求性を示す。Ａ，酵素は、20 mM Tris-ＨＣｌ，ｐＨ 7.0 中、示した濃度のＣａ2+および／またはＭｇ2+の存在下または非存在下に10分間、37にて、100 ngのプラスミドＤＮＡと反応させられた、Ｂ，酵素活性は、10 mMのＭｇ2+の存在下に180分間、許容した。
【図９】図９には、ＴＰＡ、ＬＰＳ、およびＣＨＸで処理されたＵ937細胞の成長曲線を示す。Ｕ937細胞は、ＴＰＡ（10 ng/ml）、ＬＰＳ（1 ng/ml）、およびＣＨＸ（10 /ml）で、示した時間処理した。細胞数および生存度は、培養時間中に血球計数器で、トリパンブルー除去によって評価した。
【図１０】図１０には、Ｕ937細胞におけるエンドヌクレアーゼの、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって分析されたＴＰＡ濃度依存性の合成および分泌を示す。細胞溶解物（Ａ）および培養培地（Ｂ）は、示したＴＰＡ濃度にて24時間インキュベートすることにより調製した。
【図１１】図１１には、ＴＰＡで処理されたＵ937細胞溶解物および培養培地の、ゲル内システムによって分析されたエンドヌクレアーゼ活性を示す。Ｕ937細胞は、示した培養時間、10 ng/ml ＴＰＡで処理した。
【図１２】図１２には、ＬＰＳで処理されたＵ937細胞溶解物および培養培地のエンドヌクレアーゼ活性を示す。細胞溶解物（Ａ）および培地（Ｂ）におけるエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥにより、1 ng/mlのＬＰＳ処理後、示した培養時間に分析した。
【図１３】図１３には、刺激因子で処理されたＵ937細胞のエンドヌクレアーゼ活性を示す（レーン１，10％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ1640 培地にて48時間のＵ937細胞培養物；レーン２，48時間ＴＰＡ（10 ng/ml）処理；レーン３，24時間ＬＰＳ（1 ng/ml）処理；およびレーン４，12時間ＣＨＸ（10 /ml）処理）。
【図１４】図１４には、自己消化法による、ＩＭ９細胞から単離された核におけるエンドヌクレアーゼ活性を示す（Ａ，示した濃度のＣａ2+および／またはＭｇ2+の存在下または単独で37℃にて２時間、核をインキュベートした；Ｂ，ヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化の阻害；ＣおよびＤ，10 mM Ｍｇ2+（Ｃ）または10 mM Ｃａ2+（Ｄ）の存在下に37℃にて示したとおり0〜240分間、核をインキュベートした；ならびにマーカー、1 kb ラダー）。
【図１５】図１５には、ＣＨＸ処理によるＩＭ９細胞のアポトーシス細胞死を示す（Ａ，ＣＨＸ（10 /ml）で処理されたＩＭ９細胞からのＤＮＡの1.8％アガロースゲル電気泳動；未処理（Ｂ）およびＣＨＸで処理された（Ｃ）ＩＭ９細胞を24時間培養して遠心分離調製物をライト−ギムザで染色した）。
【図１６】図１６には、本発明の、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって分析されたＩＭ９細胞溶解物および核のエンドヌクレアーゼ活性を示す。エンドヌクレアーゼ活性は、示した時間、10 ug/ml ＣＨＸで処理されたＩＭ９細胞溶解物にて培養時間中（Ａ）、細胞溶解物（Ｂ）および核（Ｃ）で検出した。
【図１７】図１７には、本発明のエンドヌクレアーゼ活性に対する二価陽イオンの要求性を示す。エンドヌクレアーゼは核から単離し、そして酵素活性は、反応産物を1％アガロースゲルで解析することにより定量した。
【図１８】図１８には、本発明のエンドヌクレアーゼによる、プラスミドＤＮＡの分解の時間経過を示す。10％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地（Ａ）、無血清のＩＭ９細胞培養培地（Ｂ）および10％ ＦＢＳを含有するＩＭ９細胞培養物（Ｃ）のエンドヌクレアーゼ活性は、反応産物を1％アガロースゲルで解析することにより評価した。
【図１９】図１９には、E. coli ＤＮＡ、ＩＭ９細胞ＤＮＡ、およびサケ精子ＤＮＡでの、本発明のエンドヌクレアーゼ反応の産物を示す。
【図２０】図２０には、ＩＭ９細胞内に取り込まれた外来性ＤＮＡのサザンブロット分析を示す。エンドヌクレアーゼ反応産物の100〜200塩基対の断片を、プローブとして使用した。ブロットは、ランダム−プライミング法によって調製されたプローブで、55℃にて６時間ハイブリダイズさせた。
【図２１】図２１には、本発明のエンドヌクレアーゼ反応によって得られるＤＮＡ断片のクローニングおよび配列決定のための構築スキームを示す。
【図２２】図２２には、本発明のＩＭ９細胞における細菌ＤＮＡのプロセシングによって生産されたＤＮＡ断片を示す。
【図２３】図２３には、本発明のＵ937細胞における細菌ＤＮＡのプロセシングによって生産されたＤＮＡ断片を示す（Ａ，10％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ1640 培地にて48時間のＵ937細胞培養後のラベルされたＤＮＡの取り込み；およびＢ，ＴＰＡ（10 ng/ml）12時間処理後のラベルされたＤＮＡの取り込み）。
【図２４】図２４には、本発明のエンドヌクレアーゼ反応産物配列の検出を示す。エンドヌクレアーゼ反応産物は、「材料および方法」に記載のとおり合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。
【図２５】図２５には、細菌ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドにおけるＣｐＧモチーフによるＩｇＭ分泌の誘導を示す。ＩＭ９細胞は、オリゴヌクレオチド（25 /ml）または E. coli ＤＮＡ（25 /ml）で、24時間刺激した。
【図２６】図２６には、本発明の基質としてＥＣ１ ＰＣＲ産物を使用した、エンドヌクレアーゼ反応の産物を示す。
【図２７】図２７には、本発明の基質としてＥＣ２ ＰＣＲ産物を使用した、エンドヌクレアーゼ反応の産物を示す。
【図２８】図２８には、本発明の基質としてＨＣ１ ＰＣＲ産物を使用した、エンドヌクレアーゼ反応の産物を示す。
【図２９】図２９には、Ｚｎ2+およびＥＤＴＡによるエンドヌクレアーゼ活性の阻害を示す。
【図３０】図３０には、本発明に従い、示されたＩＭ９細胞培養培地量を用いて反応させた、ＥＣ１ ＰＣＲ産物からのエンドヌクレアーゼ反応の産物を示す。
【図３１】図３１には、本発明に従い、示された時間、ＥＣ１ ＰＣＲ産物と反応させた、エンドヌクレアーゼからの産物を示す。
【図３２】図３２には、ＥＣ２ ＰＣＲ産物（157 bp）を、AluIによって切断された短いＤＮＡ断片と比較する、エンドヌクレアーゼ活性を示す（レーン１，３２ＰでラベルされたＰＣＲ産物；レーン２，レーン１のエンドヌクレアーゼ消化産物；レーン３，３２Ｐでラベルされた、AluIで切断された短いＤＮＡ断片；レーン４，レーン３の30分反応物；レーン５，レーン３の１時間反応物；レーン６，レーン３の２時間反応物）。
【図３３】図３３には、エンドヌクレアーゼが分泌されたＩＭ９細胞における3'-エキソヌクレアーゼ活性の同定を示す（レーン１，ラベルされたＰＣＲ産物；レーン２，ラベルされた二本鎖ＤＮＡでのエンドヌクレアーゼ反応の産物；レーン３，ラベルされた一本鎖ＤＮＡでのエンドヌクレアーゼ反応の産物）。
【図３４】図３４には、エンドヌクレアーゼ反応産物と、ＤＮアーゼＩ反応産物を用いたＩＭ９細胞によるプロセシング産物との間の比較を示す（レーン１，ラベルされたＰＣＲ産物；レーン２，ＩＭ９細胞培養培地の反応産物；レーン３，ＩＭ９細胞におけるプロセシング産物；レーン４，ＤＮアーゼＩ反応産物；パネルＡ，ＴＢＥ緩衝液における、20％未変性−ＰＡＧＥ；パネルＢ，ＴＢＥ緩衝液における、変性−尿素（8.3 M）−ＰＡＧＥ）。
【図３５】図３５には、Ｓ１ヌクレアーゼ反応によるエンドヌクレアーゼ反応に由来する一本鎖断片の同定を示す（Ａ，ＴＢＥ緩衝液における、20％未変性−ＰＡＧＥ；Ｂ，ＴＢＥ緩衝液における、20％ 変性−尿素（8.3 M）−ＰＡＧＥ）。
【図３６】図３６には、Mono Ｓ ＨＲ５/５イオン交換クロマトグラフィーによる、ＩＭ９細胞培養培地のクロマトグラフィー分画を示す（Ａ，ＩＭ９培養培地のイオン交換プロファイル；Ｂ，1％アガロースゲルにて反応産物を解析することにより、示された保持時間に酵素活性を定量した）。
【図３７】図３７には、RESOURCE PHE 疎水性相互作用クロマトグラフィーによるエンドヌクレアーゼの精製を示す（Ａ，イオン交換クロマトグラフィーから得られた活性画分の疎水性相互作用プロファイル；Ｂ，1％アガロースゲルにて反応産物を解析することにより、ピーク画分にて酵素活性を定量した）。
【図３８】図３８には、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製されたエンドヌクレアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図３９】図３９には、精製されたエンドヌクレアーゼの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量定量を示す（マーカータンパク質は、ミオシン（200 kD）、β−ガラクトシダーゼ（116.3 kD）、ホスホリラーゼＢ（97.4 kD）、ウシ血清アルブミン（62.2 kD）およびオボアルブミン（45 kD））。
【図４０】図４０には、活性を含む、Mono Ｓクロマトグラフィー画分の未変性−ポア勾配ゲル電気泳動（4〜15％）（Ｂ）およびアガロースゲル電気泳動（Ａ）でパネルＢのゲルバンドから溶出されたタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を示す。
【図４１】図４１には、イオン交換クロマトグラフィーによる精製エンドヌクレアーゼのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および活性バンドの未変性勾配ＰＡＧＥゲル溶出を示す。
【図４２】図４２には、単離されたＵ937細胞中の、精製されたエンドヌクレアーゼ活性に対する陽イオンの効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫細胞から分泌され、外来性物質として細菌ＤＮＡを認識し、そしてそれをプロセシングして、免疫応答に関わることが知られているＣｐＧモチーフを含むおよそ10塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する、新規エンドヌクレアーゼ酵素に関する。加えて本発明は、前記エンドヌクレアーゼ酵素によって産生される前記のおよそ10塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む免疫アジュバントに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物は、外来性物質に対して防御をするための免疫系を有している。その免疫系は、自然の（非特異的）免疫または後天性の（抗原特異的）免疫に分類される。生得的な、あるいは非特異的な免疫は、一つの種によって引き起こされる疾病に対する第一次の抵抗であり、構造的、生理的、エンドサイトーシス、およびファゴサイトーシス、ならびに炎症性応答などの４つのタイプとしての防御バリアを創出する。代表的な構造的防御バリアの例としては、皮膚および粘膜が挙げられる。生理的防御バリアには、例えば、温度、ｐＨ、酸素圧、および様々な水溶性因子が包含される。エンドサイトーシスおよびファゴサイトーシスの防御バリアとは、外来性の巨大分子が特定の細胞の中に取り込まれてその後分解される、エンドサイトーシスおよびファゴサイトーシスの分解システムのことをいう。炎症の防御バリアは、細菌の侵入とそれに続く皮膚の損傷によって産生される様々な血管作用性および化学走性物質によって導かれる炎症性応答である。その後、凝固、キニン、線維素溶解性などの酵素系または補体が活性化される。後天的免疫は、生得的な免疫と、前者が特異性、多様性、記憶ならびに自己および／または非自己認識を備えているという点で相違している。後天的免疫の特性は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、抗体、サイトカイン等により応答する、体液性および細胞性の免疫に由来する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
微生物の侵入による免疫応答は、侵入の初期段階で微生物の特定の分子を速やかに認識する生得的な機構によって発生する。微生物に存在するタンパク質および脂質は、抗原に特異的に応答する免疫系を誘導する物質としてよく知られている。ＬＰＳ、ホルミルメチオニン、リポアラビノマンナン、ペプチドグリカン等は、補体系を直接的に活性化する物質としてよく知られている（Marrack, P., および Kapple, J. W. (1994) Cell 76, 323-332）。近年、哺乳動物において体液性および細胞性免疫が、それらの内因性ＤＮＡを細菌ＤＮＡから識別し、そしてその細菌ＤＮＡを異物として認識することにより活性化されること、そしてかかる細菌ＤＮＡが生得的免疫に関わることが、多くの研究者によって明らかにされてきている。
【０００４】
全身性狼蒼エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫疾患の際に、大量の抗−ＤＮＡ抗体が産生されるという事実から、抗原または自己抗原の観点でＤＮＡが研究されてきている。抗−ＤＮＡ抗体は、ＳＬＥに関連して血清学的に最も重要であると考えられ、それは腎損傷、皮膚の発疹、関節炎等に関わる主要なメディエーターとして機能する。（Tan, E. M. (1989) A Textbook in Rheumatology, 11版, D. J. McCarty, 編, Led および Febiger, Philadelphoa, ＰＡ, 1049；Isenberg, D. A. ら (1997) 1996年5月、ロンドンで開催されたＤＮＡ抗体に関する国際ワークショップでの、全身性狼蒼エリテマトーデス−ＡにおけるＤＮＡに対する抗体の役割の、概説および序論、Lupus 6, 290-304；Swaak, A. J. G. ら (1979) Arthritis Rheum. 22, 226-235；ならびにIsenberg, D. A. ら (1994) Arthritis Rheum. 37, 169-180）。これらの抗体は、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡに存在する構造決定因子に結合することが示された（Isenberg, D. A. ら (1994) Arthritis Rheum. 37, 169-180；Pisetskyi, D. S. (1992) Rheum. Dis. Clin. North. Am. 18, 437-454；ならびに Shoenfield, Y., および Isenberg, D. A., (1989) Immunol. Today 10, 123-126）。ＳＬＥの原因は正確には解明していないが、最近の研究により、ＤＮＡ抗原がその疾病に顕著に関係していることが明示されている（Shlomechik, M. J. ら (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 9150-9154；Shlomechik, M. J. ら (1990) J. Exp. Med. 171, 265-292；および Tillman, D. M. ら (1992) J. Exp. Med. 176, 761-779）。研究者らは、細菌ＤＮＡに対する免疫応答を調べるために、正常マウスおよび自己免疫疾患マウスを使用した（Gilkeson, G. S. ら (1989) Clin. Immunol. Immunopathol. 51, 1482-1486；Gilkeson, G. S. ら (1993) J. Immunol. 151, 1353-1364；および Gilkeson, G. S. ら (1995) J. Clin. Invest. 95, 1398-1402）。哺乳動物ＤＮＡとは異なり、細菌ＤＮＡはポリクローナルＢ細胞を活性化し、そしてマウスでの特異性を有する抗体を生産するという、強力な免疫特性を保有している（Gilkeson, G. S. ら (1995) J. Clin. Invest. 95, 1398-1402；および Gilkeson, G. S. ら (1991) Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 288-300）。活性の程度は、細菌ＤＮＡに存在する塩基配列モチーフが哺乳動物ＤＮＡの塩基配列モチーフと相違し、そして異物、すなわち非自己として認識し得るという事実に起因している（Messina, J. P. ら (1993) Cell. Immunol. 147, 148-157；Krieg, A. M. ら (1995) Nature 374, 546-549；および Halpern, M. D. ら (1996) Cell Immunol. 167, 72-78）。正常マウスに細菌ＤＮＡで免疫誘発処理されると、マウスは細菌の二本鎖ＤＮＡだけでなく哺乳動物および細菌の一本鎖ＤＮＡにも結合することができる抗体を生産する（Gilkeson, G. S. ら (1991) Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 288-300）。しかしながら、哺乳動物の二本鎖ＤＮＡと交差反応性を有する自己抗体はまったく生産されなかった。正常マウスと異なり、二本鎖ＤＮＡによって免疫誘発処理された前自己免疫（NZB X NZW） F1 （NZB/W）マウスは、哺乳動物の二本鎖ＤＮＡと結合する交差反応性抗体を生産した（Gilkeson, G. S. ら (1995) J. Clin. Invest. 95, 1398-1402）。このように、自己免疫疾患マウスは、細菌ＤＮＡで免疫付与されると、その動物は哺乳動物ＤＮＡと交差反応性を有する抗−二本鎖ＤＮＡ抗体を生産する能力を有する。それは、NZB/W マウスでの免疫レギュレーターの欠如において、細菌ＤＮＡによって生産される自己応答性の抗−二本鎖ＤＮＡ Ｂ細胞がそれらの内因性ＤＮＡに応答する誤寛容が起こることに起因しており、かくして細菌ＤＮＡのみならずそれら自体のＤＮＡにも応答する病原性自己抗体が増加したのである（Whock, M. K. ら (1997) J. Immunol. 158, 4500-4506）。
【０００５】
タンパク質抗原でＢ細胞を刺激および活性化することによる抗体の生産は、タンパク質抗原が抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってプロセシングされ、そして主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に結合して、ＭＨＣによって限定されるＴ細胞が活性化されてその活性化されたＴ細胞がサイトカインを分泌してＢ細胞を活性化するように抗原の提示を誘導するプロセスとしてよく知られている（Parker, D. C. (1993) Annu. Rev. Immunol. 11, 331-360；ならびに Clark, E. A. および Ledbetter, J. A. (1994) Nature 367, 425-428）。タンパク質抗原と異なるミコバクテリアの細胞壁の構成要素の加工体であるリポアラビノマンナンリポグリカン（ＬＡＭ）、ミコール酸脂質が、ｈＣＤ１ｂ（Beckman, E. M. ら (1994) Nature 372, 691-694；Bendelac, A. (1995) Science 269, 185-186；Sieling, P. A. ら (1995) Science 269, 227-230；およびPrigozy, T. I. ら (1997) Immunity 6, 187）およびｈＣＤ１ｃ （Beckman, E. M. ら (1996) J. Immunol. 157, 2795-2803）によって提示され得ることもよく知られている。ＣＤ１ファミリーは、ＭＨＣ分子と異なる部位にてコードされる非多形細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ１−Ｔ細胞の結合は明瞭には特定されていないが、ｍＣＤ１ｄ１はＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によって認識され（Castano, A. R. ら (1995) Science 269, 223-226；Cardell, S. ら (1995) J. Exp. Med. 182, 993-1004）そしてｈＣＤ１ｂはＣＤ４-およびＣＤ８- Ｔ細胞によって認識される（Bendelac, A. (1995) Science 269, 185-186）らしいことが示唆された。このように、ＣＤ１は病原性微生物に認められるタンパク質以外の様々な抗原の提示に関わることが推定される。多くの研究で、ＤＮＡは抗−ＤＮＡ−特異的なＢ細胞刺激に関わっていることが報告された。Krishnan および Marionは、ＤＮＡおよびペプチドの組み合わせでのマウスの免疫付与によって抗−ＤＮＡ抗体を誘発できることを示した（Krishnaa, M. R. および Marion, T. N. (1993) J. Immunol. 150, 4948-4957）。従って、抗−ＤＮＡ抗体が様々な自己免疫疾患の際に産生されるという事実に鑑みて、抗−ＤＮＡ抗体の生産のためのＢ細胞の活性化が、ＭＨＣで限定されるＴ細胞刺激に依存しているか否かを確かめることが重要である。Waisman は、ＤＮＡによるＴ細胞の特異的活性化がＭＨＣクラスII分子によるＤＮＡ提示に関わることを示唆した（Waisman, A. ら (1996) Cell. Immunol. 173, 7-14）。すなわち、彼はＡＰＣ表面上のＭＨＣクラスII分子にＤＮＡが結合し、そしてその結果、Ｔ細胞はＤＮＡによって特異的に増殖されることができるという事実を示し、その事実に基づいて、ＤＮＡが自己免疫疾患で重大な役割を果たしていると提唱した。しかしながら、ＤＮＡ抗原のプロセシングおよび提示機構に関するさらなる研究および知見はまったくない。例えば、細菌ＤＮＡがＡＰＣによってプロセシングされ、タンパク質抗原におけるようにＭＨＣ分子により提示されるか否か、または他の分子がこのような提示に関わっているのかどうかは、未だ解明されていない。
【０００６】
脊椎動物は、細菌ＤＮＡ由来とそれらの内因性ＤＮＡを識別し、それにより免疫細胞が細菌ＤＮＡによって活性化されることを、多くの研究者が示した。脊椎動物によって非自己として認識される細菌ＤＮＡは、高レベルで非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを産生していることにより特徴付けられる。細菌ＤＮＡと脊椎動物ＤＮＡとの間の甚だしい相違は、以下のように要約され得る。第１に、細菌ＤＮＡは最多レベルで16ジヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドを産生しているが、脊椎動物ＤＮＡでは、細菌ＤＮＡの 1/4 を産生している。このことは、ＣｐＧ抑制が脊椎動物ＤＮＡに存在することを意味している。第２に、細菌ＤＮＡに存在するＣｐＧジヌクレオチドのメチル化頻度は低い。脊椎動物ＤＮＡは80％のメチル化を示すが、微生物のシトシンのメチル化はほとんど認められない（Bird, A. P. (1995) Trends Genet. 11, 94-100）。第３に、細菌ＤＮＡは、ＣｐＧジヌクレオチドの両側端部で２つの5'-プリンおよび２つの3'-ピリミジンの側方に位置する頻度が、脊椎動物ＤＮＡよりも高い（Razin A., および Friedman, J. (1981) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 25, 33-52）。「ＣｐＧモチーフ」と称される細菌ＤＮＡのその特異的な構造は、免疫応答を活性化することが報告された。すなわち、２つの5'-プリンおよび２つの3'-ピリミジンがＣｐＧジヌクレオチドの両側端部で側方に位置する場合（マイトジェン性ＣｐＧ）、他の塩基がＣｐＧジヌクレオチドの両側端部で側方に位置する場合（非刺激性ＣｐＧ）に比較して、免疫細胞の活性化は随分高い。
【０００７】
多くの研究者は、細菌ＤＮＡの特異的塩基配列による免疫細胞の活性化および作用を解明するために、化学的に合成されたオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）を使用した。Yamamoto および他の研究者は、細菌ＤＮＡがＮＫ細胞の溶解性活性化を増加させ、またインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の生産を誘導することを示した（Yamamoto, S. ら (1992) J. Immunol. 148, 4072-4076；Cowdery, J. S. ら (1996) J. Immunol. 156, 4570-4575；および Ballas, Z. K. ら (1996) J. Immunol. 157, 1840-1845）。Kuramoto は、このような効果が、細菌ＤＮＡに含まれるＣｐＧモチーフのパリンドロームの塩基配列に関連することを報告した（Kuramoto, E. ら (1992) J. Cancer Res. 83, 1128-1131；およびKimura, Y. ら (1994) J. Biochem. 116, 991-994）。加うるに、細菌ＤＮＡはＤＮＡ結合性タンパク質に結合して、Ｂ細胞の活性化を誘導することが報告された（Gilkeson, G. S. ら (1989) J. Immunol. 142, 1398-1402；Yamamoto, S. ら (1992) J. Immunol. 148, 4072-4076；Gilkeson, G. S. ら (1989) J. Immunol. 142, 1482-1486；Messina, J. P. ら (1991) J. Immunol. 147, 1759-1764；Field, A. K. ら (1967) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58, 1004-1010；ならびにOehler, J. R. および Herverman, R. B. (1978) Int. J. Cancer 21, 221-220）。すなわち、Ｂ細胞の活性化は、細菌の６塩基からなるＣｐＧモチーフによって促進されることが理解される。細菌感染による、Ｂ細胞の活性化を包含した免疫応答は、免疫調節性サイトカインを生産することによって特徴付けられる（Van Damme, J. ら (1989) Eur. J. Immunol. 19, 163-168；およびPaul, W. E. ら Adv. Immunol. 53, 1-29）。さらにまた、ＣｐＧモチーフは、細胞性免疫に関わるＩＬ−12および体液性免疫に関わるＩＬ−６の分泌に関与することも報告された（Halpern, M. D. ら (1996) Cell, Immunol. 167, 72-78；Yi, A. K. ら (1996) J. Immunol. 157, 5394-5402；およびKlinman, D. M. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2879-2883）。それより生じるサイトカインとして、Ｔ細胞およびＢ細胞を活性化するうえで役割を果たすＩＬ−６（Uyttenhove, C. ら (1988) J. Exp. Med. 167, 1417-1427；Muraguchi, A. ら (1988) J. Exp. Med. 167, 332-344；Le, J. M., および Vilcek, J. (1989) Lab. Invest. 61, 588-602；ならびに Hirano, T. ら (1990) Immunol. Today 11, 443-449）、細胞内および細胞外病原性細菌を排除するマクロファージの機能を促進するＩＦＮ−γ（Murray, H. W. (1990) Diagn. Microbial. Infect. Dis. 13, 411-421）およびＩＦＮ−γの生産を調節しＮＫ細胞を活性化するＩＬ−12（Trinchieri, G. (1994) Blood 84, 4008-4027；Zhan, Y., および Cheers, C. (1995) Infect. Immun. 63, 1387-1390；ならびに Bohn, E. ら (1994) Infect. Immun. 62, 3027-3032）が挙げられる。ＩＬ−12およびＩＦＮ−γは、１型サイトカインを増加することによりヒト病原性細菌を排除する、重要な役割を果たしている（Klinman, D. M. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2879-2883；Zhan, Y., および Cheers, C. (1995) Infect. Immun. 63, 1387-1390；Bohn, E. ら (1994) Infect. Immun. 62, 3027-3032；ならびにHeinzel, F. P. ら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7011-7015）。ＩＬ−６は、２型サイトカインによってＴ細胞およびＢ細胞の成長および分化を促進することにより抗体の生産を刺激する（Uyttenhove, C. ら (1988) J. Exp. Med. 167, 1417-1427；Muraguchi, A. ら (1988) J. Exp. Med. 167, 332-344；Le, J. M., および Vilcek, J. (1989) Lab. Invest. 61, 588-602；ならびに Hirano, T. ら (1990) Immunol. Today 11, 443-449）。実際、ノックアウトＩＬ−６遺伝子を有するマウスは、容易に感染されることが観察された（Yi, A. K. ら (1996) J. Immunol. 157, 5394-5402；および Libert, C. ら (1994) Eur. J. Immunol. 24, 2237-2242）。このように、細菌ＤＮＡは、細胞性および体液性免疫に関わるサイトカインの生産を誘導することが理解される。近年、Ｂ細胞の増殖および発生は、細菌ＤＮＡによってもたらされることが、さらに報告されている（Krieg, A. M. ら (1995) Nature 374, 546-549；Liang, H., (1996) J. Clin. Invest. 98, 1119-1129；および Yi, A. K. ら (1996) J. Immunol. 156, 558-564）。Krieg の研究は、ＯＤＮに存在するＣｐＧモチーフが、Ｂ細胞の活性化および増殖を行ないつつＩｇＭの分泌を誘導するのに必須であること、ならびにＢ細胞が活性化された場合に起こる典型的な現象であるクラスII ＭＨＣ分子の発現が増大し、そしてＧ０からＧ１まで細胞周期が開始することを示した。Sato の報告（Sato, Y. ら (1996) Science 273, 352-354）によると、免疫刺激性ＤＮＡ配列（ＩＳＳ）を短いＣｐＧモチーフと共に含むプラスミドＤＮＡが単球にトランスフェクトされた場合に、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＬ−12の量が増加することが見られた。この結果は、ＩＳＳを含むプラスミドが骨髄幹細胞へトランスフェクトされると、その後周囲のマクロファージおよびＴ細胞が活性化されて、その幹細胞のイン・ビボの再配置が誤って起こり得ることを示唆するものである。かくして、体細胞または幹細胞置換療法のためのベクターは、ＩＳＳを含まないように設計されるべきなのである。対照として、ワクチンの効能を改善するための一つのアプローチは、多くの反復ＩＳＳを含むようにプラスミドＤＮＡを設計することである。
【０００８】
細胞を活性化するために、細菌ＤＮＡは細胞内に取り込まれるべきである。細胞培養容器上に吸着されたＯＤＮは、Ｂ細胞を活性化しないこと（Krieg, A. M. ら (1995) Nature 374, 546-549）そしてオリゴヌクレオチドがリポフェクトされた場合に、ＮＫ細胞の活性化が大幅に増大するに伴って、その取り込みが増大すること（Yamamoto, T. ら (1994) Microbiol. Immunol. 38, 831-836）が見出された。また、ＣｐＧモチーフを含んでいるか否かに関わらず、オリゴヌクレオチドが細胞表面に結合する能力の間に有意な差異はないことも見出された（Krieg, A. M. ら (1995) Nature 374, 546-549；および Yamamoto, T. ら (1994) Microbiol. Immunol. 38, 831-836）。Bennett は、単核細胞内に取り込まれたＤＮＡがエンドソーム画分にて分解されることを示した（Bennett, R. M. ら (1985) J. Clin. Invest. 76, 2182-2190）。Stacey は、細菌ＤＮＡがマクロファージ中の転写因子核因子−ｋＢに結合し、そしてＴＮＦ−α、ＩＬ１−βおよびプラスミノーゲン活性化インヒビター−２ ｍＲＮＡの発現が大幅に増大することを示した（Stacey, K. J. ら (1996) J. Immunol. 157, 2116-2122）。細胞表面上のレセプターの媒介を伴う、オリゴヌクレオチドの細胞内への取り込みは、エンドサイトーシスによって引き起こされるであろうことが予期された（Bennett, R. M. ら (1985) J. Clin. Invest. 76, 2182-2190）。また、蛍光でラベルされたホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを末梢血、骨髄細胞および白血球細胞系で使用することによっても、研究が実施された（Loke, S. L. ら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3474-3478；Yakubov, L. A. ら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6454-6458；Zhao, Q. ら (1996) Blood 88, 1788-1795；Ribeiro J. M., および Carson D. A. (1993) Biochemistry 32, 9129-9136）が、その特性および機構は未だまったく明確にされていない。
【０００９】
細菌ＤＮＡはこれまでに、免疫系において重大な役割を果たすことが理解されている。自己免疫疾患であるＳＬＥは、細菌ＤＮＡによって抗−ＤＮＡ抗体が産生されることによって発症すること、そして細菌ＤＮＡのＣｐＧモチーフは免疫細胞内へ取り込まれて細胞を活性化し、それによりサイトカインおよびＩｇＭの分泌を促進することが知られている。しかしながら、どのような機構によって、このように重大な細菌ＤＮＡが抗体を生産することが可能ならしめられるのか、そしてＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドがどのように細胞内で作られるのかについての報告はまったくない。
【００１０】
本発明者らにより、ＤＮＡ−未変性−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥ）を使用して、ヒトＢ−リンパ芽球ＩＭ９細胞、および12-O-テトラデカノイルホルボール 13-アセテートで処理された分化型骨髄性Ｕ937ならびにその培養培地から、新規エンドヌクレアーゼが同定された。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一側面において、本発明は、免疫細胞から分泌され、そして外来性物質として細菌ＤＮＡを認識し、またそれをプロセシングして免疫応答に関わるＣｐＧモチーフを有する約10塩基対の一本鎖オリゴヌクレオチドを生産する新規エンドヌクレアーゼに関する。
【００１２】
別の側面において、本発明は、本発明のエンドヌクレアーゼを製造するための方法であって、ヒトＢ−リンパ芽球ＩＭ９またはＴＰＡで処理された骨髄性Ｕ937細胞系を適切な培地にて培養して当該エンドヌクレアーゼを生産する工程、および細胞溶解物または培養培地から当該エンドヌクレアーゼを単離する工程を含む方法を提供する。
【００１３】
さらなる側面において、本発明は、本発明のエンドヌクレアーゼを用いて細菌ＤＮＡを処理することによって生産されるＣｐＧモチーフを有する、約10塩基対の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む免疫アジュバントを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
新規エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥヌクレアーゼアッセイシステムを使用して、ＩＭ９細胞溶解物および培養培地から同定された。そのエンドヌクレアーゼの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより72.4 kDと測定された。本発明のエンドヌクレアーゼ活性は、培養時間の間にはＩＭ９細胞核に検出され、そして酵素活性の蓄積が、アポトーシス細胞のＩＭ９細胞核タンパク質抽出物中に示された。骨髄性Ｕ937細胞の増殖および分化に対するシグナルは、リポ多糖（ＬＰＳ）および12-O-テトラデカノイルホルビル 13-アセテート（ＴＰＡ）などの細胞外刺激により提供される。実験結果から、ＴＰＡがエンドヌクレアーゼ分泌の程度に対して有意な効果を有することが示唆された。その酵素活性はＬＰＳ処理によりＵ937細胞において誘導されたが、一方酵素の分泌は培養培地では検出されなかった。多重高次コイルプラスミドＤＮＡを基質として用いて、細胞培養培地から単離された酵素についてエンドヌクレアーゼ活性を定量した。エンドヌクレアーゼは、Ｍｇ2+のみと共に、プラスミドＤＮＡの直鎖状体への変換を触媒し、続いてさらに分解することができた。触媒活性に必要とされるｐＨ至適値は、ｐＨ 6.6〜7.4の範囲に決定された。ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥアッセイシステムで、免疫細胞系のエンドヌクレアーゼ活性は、ＤＮアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼ）Ｉのものと異なることが、実験結果から明らかに立証された。抗−ＤＮアーゼＩ抗体を使用した免疫沈降分析で、分泌されたエンドヌクレアーゼはその抗体によって認識されないことが示された。本発明によって特徴付けられたＭｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼは、酵素活性に対する陽イオン依存性、未変性−ＰＡＧＥにおける電気泳動移動度、および触媒作用に必要とされる至適ｐＨを含めたいくつかの側面で、これまでに報告されたヌクレアーゼと異なると考えられる。エンドヌクレアーゼ活性によってプロセシングされるＤＮＡ断片は、免疫細胞系でのサザンブロット分析によって検出した。細胞培養培地にて部分的にプロセシングされた外来性ＤＮＡ抗原は、細胞表面に結合し、その後細胞内へと取り込まれるようである。放射ラベルされたＤＮＡ断片を外来性抗原として用い、オートラジオグラフィーによって、免疫細胞系でのＤＮＡ抗原のさらなるプロセシングを立証した。エンドヌクレアーゼによって産生されたおよそ10塩基の一本鎖ＤＮＡ断片は、Ｓ１ヌクレアーゼ反応によって分解されることが、実験結果によって示された。短い一本鎖ＤＮＡ配列は、２つの5'-プリンおよび２つの3'-ピリミジンが側方に位置する非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有するＣｐＧモチーフを含む、相補的合成オリゴヌクレオチドに、首尾良くハイブリダイズした。本発明は、ヒト免疫細胞系およびそれらの培養培地の双方に存在する新規エンドヌクレアーゼの存在および特徴を示すものである。また本発明は、免疫細胞由来のエンドヌクレアーゼが、異物として細菌ＤＮＡを認識し、そしてＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ断片を産生することにより免疫学的プロセスを遂行することも示している。
【００１５】
本発明は、以下の実施例によって例証されよう。
【００１６】
実施例１：
免疫細胞由来のエンドヌクレアーゼの生合成および分泌
ＤＮアーゼＩの酵素活性がヒトの組織および体液に広く分布しているという事実から、その酵素は消化機能に加えて、特定の生理的なイン・ビボの機構を保有していることが推定された（Nadano D. ら (1993) Clin. Chem. 39, 448-452；および Yasuda T. ら (1993) Clin. Chim. Acta 218, 5-16）。ＤＮアーゼＩは、アポトーシスの際にヌクレオソーム間ＤＮＡを切断することが知られている（Peitsch M. C. ら (1993) EMBO J. 12, 371-377）。ヒト血清中にＤＮアーゼＩが存在すること、およびその生化学的特性が報告された（Love J. D., および Hewitt R. R. (1979) J. Biol. Chem. 254, 12588-12594；ならびに Kishi K. ら(1990) Am. J. Hum. Genet. 47, 121-126）。血清ＤＮアーゼＩは、膵臓から分泌されることが教示された（Love J. D., および Hewitt R. R. (1979) J. Biol. Chem. 254, 12588-12594；ならびに Ito K. ら (1984) J. Biochem. 95, 1399-1406）が、他の組織からの分泌についての研究がなお必要である。Messina の研究では、ＤＮアーゼＩが細菌ＤＮＡを完全に分解するので、Ｂ細胞およびマクロファージを活性化するＣｐＧモチーフを生産しないことが示された（Messina, J. P. ら (1991) J. Immunol. 147, 1759-1764）。加えて、Messinaの研究から、ＤＮアーゼＩによって処理されていない細菌ＤＮＡは、免疫細胞を活性化し、サイトカインおよびＩｇＭの分泌を促進することが明らかにされた。これらのことは、ＣｐＧモチーフを有するＯＤＮで細胞が処理された場合に得られた結果に一致するものである。従って、外来性ＤＮＡを認識し、プロセシングによってＣｐＧモチーフを生産することができる、１つの新しいタイプのエンドヌクレアーゼが免疫細胞に存在しているとの推定のもとに、本発明者らは、このようなエンドヌクレアーゼの活性の存在を確認すべく、様々な免疫細胞系を使用して実験を行なった。
【００１７】
１−１ 細胞培養および前処理
ヒトＢ−リンパ芽球（ＩＭ９およびＲＰＭＩ1788）細胞系、Ｔリンパ芽球（Molt-4 および Jurkat）細胞系ならびに骨髄性（Ｕ937）細胞系は、American Type Culture Collection から購入した。細胞は、加熱した胎児ウシ血清（ＦＢＳ、Gibco ＢＲＬ）10％を含有するＲＰＭＩ1640 で、4〜5 x 105 細胞/mlに維持して培養した。細胞培養は、37℃にて、5％ ＣＯ2を含むインキュベーター（Forma）で行なった。培養中の細胞数および細胞の生存度は、血球計数器を使用して、トリパンブルー除去法によって定期的に測定した。細胞の生存度は、実験全体にわたって95％以上に保った。ＩＭ９細胞系は、細胞におけるエンドヌクレアーゼの生合成を確認するべく、アクチノマイシンＤ（ＡＣＤ、Sigma）0.33 ug/mlで前処理した（Cooper H. L., および Braverman R. (1977) Nature 269, 527-529）。ＩＭ９細胞系は、ＡＣＤで処理して、30分間培養し、洗浄した。その後、細胞を10％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ1640 にて48時間培養しながら、エンドヌクレアーゼの酵素活性を定期的な間隔で測定した。
【００１８】
ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥヌクレアーゼ活性アッセイを実施して、細胞培養溶液および細胞溶解物中のエンドヌクレアーゼ酵素活性を検出した。試験した細胞培養物に分泌されたエンドヌクレアーゼの活性は、ＩＭ９細胞系のみで観察された（図５Ｂ、レーン２）。しかしながら、そのエンドヌクレアーゼ活性は常に、ヒトＴリンパ芽球 Molt-4 細胞系の細胞溶解物中に常に検出された（図５Ａ、レーン４）が、細胞培養溶液中には検出されなかった。骨髄性Ｕ937細胞系、Ｂリンパ芽球ＲＰＭＩ1788細胞系およびＴリンパ芽球Jurkat細胞系については、エンドヌクレアーゼ活性は細胞溶解物または細胞培養溶液のいずれにも検出されなかった。図４に示すように、細胞におけるエンドヌクレアーゼの生合成（図４Ａ）および細胞培養溶液中へのエンドヌクレアーゼの分泌（図４Ｂ）は、ＡＣＤ前処理の後、初期に顕著に減少した。これらの結果から、ＩＭ９細胞系におけるエンドヌクレアーゼの生合成と分泌に、密接な相関関係があることが示唆される。
【００１９】
エンドヌクレアーゼのサイトカインおよび分泌に対するサイトカインの効果を確認するべく、サイトカインが関与する免疫応答を、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ、10 単位/ml、Genetech Inc.）およびインターロイキン−1β（ＩＬ−1β、10 単位/ml、Genetech Inc.）で処理した。ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥアッセイは、インターロイキンを含有する培地にて24時間細胞を培養しながら行なった。図６に示すように、このようなサイトカインはエンドヌクレアーゼの分泌に有意に影響を及ぼさなかった。また、リポ多糖（ＬＰＳ）またはテトラデカノイルホルボール 13-アセテート（ＴＰＡ、Sigma）のいずれも、エンドヌクレアーゼの分泌に影響を及ぼさないことも観察された。
【００２０】
示された時間にわたり、異なる濃度にてＴＰＡでＵ937細胞を処理しながら、生合成および分泌を観察した。シクロヘキシミド（ＣＨＸ、10 ug/ml、Sigma）およびＬＰＳ（1 ng/ml、Sigma）によって処理されたＵ937細胞を、ＴＰＡによって処理されたＵ937細胞と比較した。細胞はリン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ、137 mM ＮａＣｌ、2.7 mM ＫＣｌ、10 mM Ｎａ2ＨＰＯ4、1.8 mM ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ 7.4）で洗浄し、そして様々な薬剤による処理の後の細胞形状を観察するために、細胞遠心分離スライド上でライト−ギムザ（Sigma）によって染色した。その結果、ＴＰＡ刺激で分化したヒト骨髄性白血病細胞系の細胞形状は、成熟するようになって成長が停止するが、ＬＰＳの刺激後の細胞には増殖が起こった。このようなマイトジェンによって刺激される細胞の成長曲線を、図９に示す。図９から、Ｕ937細胞系はＴＰＡによって分化されて細胞形状を変化させ、そして最終的に成長が終了することと、そしてその細胞はＬＰＳによって増殖したことが認められる。加えて、アポトーシスを引き起こす薬剤であるＣＨＸの処理によって、細胞は死滅することが観察された。さらなる実験を行ない、このような培養条件下でエンドヌクレアーゼが生産および分泌されるか否かを確認した。図１０Ａは、漸増ＴＰＡ濃度で処理した細胞系で、細胞内のエンドヌクレアーゼの生合成が、増加したことを示す。図１０Ｂは、細胞内でのエンドヌクレアーゼの生合成が増加すると同時にエンドヌクレアーゼ酵素が細胞から分泌されたことを示している。また図１０Ａは、10 ng/ml以上のＴＰＡでエンドヌクレアーゼの生合成が速やかに増加したことを示している。図１１には、10 ng/mlのＴＰＡによる、Ｕ937細胞培養溶液の処置後に、定期的な間隔でエンドヌクレアーゼ活性を観察して得られた結果を示している。エンドヌクレアーゼ酵素の生合成および分泌はＴＰＡの処理６時間後に開始され、そしてＴＰＡの処理後24時間にそのピークに達することが認められる。図１２には、1 ng/mlのＬＰＳによる処理後、定期的な間隔でエンドヌクレアーゼ活性を定量して得られた結果を示す。その結果、ＬＰＳの処理後12時間で細胞溶解物にエンドヌクレアーゼ活性が検出され、そして24時間にわたり細胞培養溶液中にはまったくエンドヌクレアーゼ活性は検出されなかったことが示唆されている。Ｕ937細胞系は、アポトーシスを誘導する薬剤であるＣＨＸによる処理に際して死滅し、そしてこのような処理はエンドヌクレアーゼの生合成に影響しないことが、顕微鏡的に観察された（図１３、レーン４）。ＴＰＡ、ＬＰＳおよびＣＨＸによる、Ｕ937細胞系の処理後のエンドヌクレアーゼ活性を、図１３に示す。
【００２１】
１−２ 細胞溶解物の調製およびＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥでのエンドヌクレアーゼ活性の定量
細胞培養物は、1,500 rpmで５分間遠心分離し、そして上清を取り出した。遠心分離された細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして150 mM ＮａＣｌ、10 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.5、1 mM ＥＤＴＡおよび1 mM ＰＭＳＦを含有する 0.5％ Nonidet Ｐ-40 （ＮＰ−40）緩衝溶液（溶解緩衝溶液）中に、1 x 10７細胞/mlとなるように再懸濁した。その溶液を4℃にて15分間静置した後、それを12,000 rpm、4℃にて15分間遠心分離し、そして上清を細胞溶解物として使用した。
【００２２】
修正された未変性ポリアクリルアミドゲルアッセイシステムを使用して、エンドヌクレアーゼ活性を定量し、その特徴を同定した。Hoefer Tall Mighty Small（0.75 mm x 8 cm x 11 cm）垂直電気泳動装置を使用することにより、150 /mlの最終濃度となるように多重高次コイルプラスミドＤＮＡ（ＰＧＥＭ−Ｔベクター、3.0 kb、Promega）を含む 7％ポリアクリルアミドゲルを重合した。細胞培養溶液または細胞溶解物のタンパク質試料ウェル当たり10 ug を付し、次いで4℃にて電気泳動を行なった。電気泳動後、ゲルを蒸留水で３回洗浄し、そして20 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.0、1 mM ＣａＣｌ2および10 mM ＭｇＣｌ2を含有する反応緩衝溶液（ＴＣＭ緩衝液）中で、37℃にて4時間、攪拌しながら反応させた。エンドヌクレアーゼ酵素の酵素活性を、反応時間を変えながら観察して、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥでその酵素の反応特異性を同定した。反応したゲルは、1/ml エチジウムブロミドを含むＴＣＭ緩衝溶液で37℃にて30分間染色し、そして302 nmトランスイルミネーターで撮影した。ゲル上でヌクレアーゼ活性を呈している部位は、オレンジの背景上で黒いバンドとして観察された。エンドヌクレアーゼ活性に対する標準は、ウシ膵臓ＤＮアーゼＩ（ＲＮアーゼ不含 10〜50 x 103単位/ml、Boehringer Mannheim）であった。
【００２３】
細胞培養物および細胞溶解物における酵素活性は、感度と共に、本発明のために設計されたＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥヌクレアーゼアッセイシステムによって定量することができる（図１）。10 ugのタンパク質を含む細胞培養溶液および細胞溶解物中のエンドヌクレアーゼ活性を呈する部位で、強い反応バンドが観察された。ＩＭ９細胞の、示した時間の間でのエンドヌクレアーゼの生合成および分泌の分析結果を、図１に示す。細胞溶解物中のエンドヌクレアーゼ活性は、48時間培養している間、絶えず検出された（図１Ａ）が、同じ反応条件下に、細胞培養溶液中のエンドヌクレアーゼ活性はかなり蓄積した（図１Ｂ）。ＩＭ９細胞培養物をＰＢＳで数回洗浄し、その後無血清培地に移すと、図１Ｂに示すエンドヌクレアーゼ活性に対する主要バンドが実際に検出されたが、ＤＮアーゼＩ酵素活性はまったく検出されなかった（図１Ｃ）。この結果は、ＩＭ９細胞培養物および細胞溶解物で検出されたエンドヌクレアーゼは、細胞が培養された培地組成物の成分であるＦＢＳに由来するものでなく、細胞で合成されて培地へと分泌されたものであることを示唆している。図１Ｂの細胞培養物での電気泳動上で速やかに移動したヌクレアーゼ活性の弱いバンドは、Boehringer Mannheimから入手したウシＤＮアーゼＩと比較することによって、ＤＮアーゼＩとして同定された。
【００２４】
図２は、異なる反応溶液の条件下にＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって検出された1時間および4時間の酵素活性を示す。10 mM Ｍｇ2+を含有する 20 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.0の緩衝溶液で1時間反応が実施されると、活性は、図２Ａに示すように、ＩＭ９細胞によって分泌されたエンドヌクレアーゼのみに検出された。しかしながら、4時間というさらに長い時間にわたり同じ条件下に反応を行なった場合、購入したＤＮアーゼＩのみならずＦＢＳ中に存在するＤＮアーゼＩも、同じ部位に酵素活性を示した。この結果は、ＩＭ９細胞によって合成および分泌されたエンドヌクレアーゼの未変性−ＰＡＧＥ上の移動距離は、ＤＮアーゼの移動距離と異なっており、そして所定反応条件下では酵素反応性もまた、互いに異なっていることを示している。
【００２５】
１−３ ＤＮアーゼＩに対する抗体の生産および免疫沈降
免疫前の血清を得るために、Sprague Dawley（ＳＤ、150〜250 g）の尾から血液を採取した。ウシ膵臓ＤＮアーゼＩ（Sigma）は、免疫付与のために滅菌ＰＢＳ中で小断片へと消化した。ＳＤラットは、標準法に従って、100 ugのタンパク質で免疫付与した（Harlow, E., および Lane, D. (1988) Antibodies, 実験マニュアル、Cold Spring Harbor, New York）。ラットを４回免疫誘発処理して10日後に血液を採取し、そして抗体価および特異性をアッセイした。ＤＮアーゼＩを含む血清中の抗−ＤＮアーゼＩ抗体は、Immunopure plus protein Ａ/Ｇ IgG 精製キット（Pierce）およびウシＤＮアーゼＩを結合させたSepharose−ＣＬ 4Ｂを使用することによって精製した。ＰＢＳで10倍に希釈した、50 mlの細胞培養液または50 mlのヒト血清を、精製抗−ＤＮアーゼＩ抗体およびProtein A-Sepharose−ＣＬ 4Ｂを結合させたビーズによって免疫沈降させた。免疫沈降は、攪拌しながら4℃にて６時間実施した。免疫沈降された上清を集めて、エンドヌクレアーゼの酵素活性をＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥで検出した。
【００２６】
図３Ａは、調製された抗体が、ＦＢＳに由来するＤＮアーゼＩを認識し、そしてヒト血清に存在するＤＮアーゼＩと交差反応性を有することを示している。免疫前血清は、ＦＢＳおよびヒト血清ＤＮアーゼＩを認識しなかった。それより調製されたＤＮアーゼＩを使用することによって、分泌されたエンドヌクレアーゼの各ＤＮアーゼＩとの交差反応性を検出した。抗−ＤＮアーゼＩ抗体によりＩＭ９細胞培養溶液から免疫沈降された上清は、速やかに移動するＤＮアーゼＩ酵素活性を示したが、分泌されたエンドヌクレアーゼの酵素活性は、免疫沈降されず、実際に回収されなかった。この結果は、ＩＭ９細胞系から分泌されるエンドヌクレアーゼが、免疫学的にＤＮアーゼＩと異なることを立証するものである。
【００２７】
１−４ エンドヌクレアーゼ活性の部分精製および特徴付け
ＩＭ９細胞の培養溶液からエンドヌクレアーゼを部分的に精製するために、前記実施例１―２による電気泳動によって酵素活性を呈するタンパク質バンドを溶出した。ヌクレアーゼ活性を呈するタンパク質バンドを切り出し、小片に断片化してエッペンドルフミクロチューブに移した。その後、20 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.0 緩衝溶液を使用することにより、攪拌しながら4℃にて10時間、溶出を行なった。試料は、4℃、14,000 rpmにて10分間遠心分離し、そして上清を20 ulに分けた。溶出されたタンパク質試料の20 ngを、20 mM Tris−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ 7.0）中で、高次構造コイルプラスミドＤＮＡと37℃にて10時間反応させた。酵素活性に対するｐＨの効果を調べるために、各々異なるｐＨを有する、1 mM ＣａＣｌ2および10 mM ＭｇＣｌ2を含有する20 mM ＭＯＰＳ緩衝溶液中で酵素活性を定量した。示した反応時間のエンドヌクレアーゼの酵素活性を分析するために、10 mM ＭｇＣｌ2を含有する20 mM Tris−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ 7.0）中において、37℃にて180分間の間における定期的な間隔で、酵素反応を観察した。ＤＮＡ試料緩衝溶液（30％ グリセロール、0.5％ ブロモフェノールブルーおよび0.5％ キシレンシノール）を含有するＴＥ（10 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.6、1 mM ＥＤＴＡ）緩衝溶液を添加した後、氷を添加することによって反応を停止した。エチジウムブロミド（0.5 ng/ml）を含有する1％ アガロースゲルで電気泳動を行なうことによって、反応産物を同定した。単離された酵素は、ｐＨ 7に至適活性を有していることが調べられた。しかしながら、触媒活性は比較的広い範囲のｐＨで検出された（図７）。20 mM Tris−ＨＣｌ（ｐＨ 7.0）緩衝溶液中でのエンドヌクレアーゼの酵素活性は、Ｍｇ2+に依存しており、Ｃａ2+によっては影響を受けなかった（図８Ａ）。酵素は、1から10 mMのＣａ2+の範囲で活性化されなかったが、Ｍｇ2+の濃度に依存した酵素活性によりプラスミドから直鎖状ＤＮＡが形成され、示した反応時間での、エンドヌクレアーゼによる直鎖状ＤＮＡの形成が観察された。高次構造コイルプラスミドＤＮＡの直鎖状ＤＮＡへの変換反応は、10分間反応後に始まり、そして60分の反応まで徐々に増加した。ヌクレアーゼ活性は、同じ実験条件下に180分間持続した（図８Ｂ）。このように、本酵素は高次構造コイルプラスミドＤＮＡを直鎖状ＤＮＡに変換し、続いてそのＤＮＡを消化することが確認された。この結果は、ＩＭ９免疫細胞によって分泌されるエンドヌクレアーゼ活性は、Ｍｇ2+−依存性であることを立証している。
【００２８】
本発明は、Ｍｇ2+−依存性のエンドヌクレアーゼ活性が一定量生産され、そして細胞培養物に定常的に分泌されていることを示した。また、そのエンドヌクレアーゼは、ＦＢＳおよびヒト血清中に存在するＤＮアーゼＩと異なるという事実が、未変性−ＰＡＧＥでの移動距離の差異と、抗−ＤＮアーゼＩ抗体を使用することにより得られた免疫沈降の結果によって確認された。これらは、本発明のエンドヌクレアーゼが、酵素活性に対する陽イオン−依存性、未変性−ＰＡＧＥでの移動度、活性に必要とされる至適ｐＨ等といった様々な生化学的特性の側面において、これまでに報告されていた、アポトーシスのプロセスでＤＮＡを消化するエンドヌクレアーゼと異なることを示唆するものである。また、エンドヌクレアーゼが、Ｕ937細胞系が分化した際に生産および分泌されるという事実は、そのエンドヌクレアーゼが、免疫反応において外来性ＤＮＡを認識して好適なサイズへと消化することができる、非常に重要な生物学的機能を有することを確証するものである。本発明のエンドヌクレアーゼの機能は、細菌ＤＮＡが細胞内に取り込まれるとマクロファージが活性化されるという Staceyの報告、および単核細胞／マクロファージによって媒介される細胞毒性がヌクレアーゼによって引き起こされ得るというHigashiの報告を裏付けるものである（Stacey, K. J. ら (1986) J. Immunol. 157, 2116-2122；および Higashi, N. ら (1993) Cell. Immunol. 150, 333-342）。
【００２９】
実施例２：
ヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化を誘導する、Ｍｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼの同定
アポトーシスは、クロマチン凝縮、膜小疱形成、またはエンドヌクレアーゼ活性による様々なヌクレオソームサイズとしてのクロマチン断片化などといった「細胞死」の特定のタイプとして定義される（Wyllie, A. H. ら (1984) J. Pathol. 142, 67-77；Wyllie, A. H. (1980) Nature 284, 555-556；および Kerr, J. F. R. ら (1972) Cancer. 26, 239-257）。エンドヌクレアーゼ活性化は、アポトーシスのプロセスの重大な原因を担っている（Arends, M. J., およびWyllie, A. H. (1990) J. Pathol. 136, 593-608）。多くの研究者が、ヌクレオソーム断片化に関わる様々な酵素があることを示した。ヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化に関わる酵素の例としては、ＤＮアーゼＩ（Peitsch M. C. ら (1993) EMBO J. 12, 371-377）、ＤＮアーゼII（Torriglia A., (1995) J. Biol. Chem. 270, 28579-28585；ならびに Barry M. A., および Eastman A. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 300, 440-450）およびＮＵＣ−18（Wawabata, H. ら (1997) Biochem. Biophys. Res. Comun. 233, 133-138）が挙げられる。また、様々なタイプの組織および細胞内のヌクレオソーム間ＤＮＡは、Ｃａ2+/Ｍｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼ（Stratling, W. H. ら (1984) J. Biol. Chem. 259, 5893-5898；Pandey S. ら (1997) Biochemistry 36, 711-720；ならびに Ribeiro J. M. および Carson D. A. (1993) Biochemistry 32, 9129-9136）またはＭｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼ（Anzai N. ら (1995) Blood 86, 917-923；Kawabata, H. ら (1993) Biochem. Biophys. Res. Comun. 191, 247-254；Sun X. M. および Cohen G. M. (1994) J. Biol. Chem. 269, 14857-14860；ならびに Wawabata, H., Anzai, N. ら (1997) Biochem. Biophys. Res. Comun. 233, 133-138）によって断片化され得ることを提唱する多くの報告がある。しかしながら、多くのエンドヌクレアーゼの各々が、異なる複合的な細胞システムに関与していること、あるいは、細胞死があらゆるタイプの細胞で活発に起こった場合に、クロマチン断片化のために働くなんらかの未知酵素が存在することは、未だ立証されていない。従って、アポトーシスに関与するエンドヌクレアーゼを特徴付けし、そしてその機構を明らかにすることが必要とされている。
【００３０】
ヒトＢリンパ芽球ＩＭ９細胞系によるエンドヌクレアーゼ酵素の生合成、およびＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによる当該エンドヌクレアーゼの単離を、前記実施例１に例証した。単離されたエンドヌクレアーゼ酵素は、未変性−ＰＡＧＥでの電気泳動の移動度、触媒のために必要とされる至適ｐＨおよび酵素活性への二価陽イオン依存性の側面において、これまでに知られているエンドヌクレアーゼのいずれのものとも判別されることが今回見出された。
【００３１】
また、本発明者らにより、前記実施例によって調製された細胞溶媒溶液および細胞溶解物中に存在するエンドヌクレアーゼと同一と考えられる酵素の活性が、細胞核に検出され、その酵素はアポトーシスのプロセスの間は核に沈着することも見出された。このようなエンドヌクレアーゼが、核におけるヌクレオソームの断片化を誘導するという事実は、殺される標的とされる細胞が、このような作用によって排除されるという点において、防御作用として解釈され得る。アガロースゲル電気泳動によって、ＩＭ９細胞系がＣＨＸによって処理されると、ＤＮＡのオリゴヌクレオソーム断片が生産されることが立証された。かかる断片の産生は、アポトーシスに際した生化学的現象のアペックスとして知られている。加えて、典型的なＤＮＡの断片化が、ＩＭ９細胞系から単離された核をＭｇ2+の存在下に反応させた場合に見出された。自己消化によるＤＮＡ断片化は、Ｍｇ2+−依存性かつＣａ2+−非依存性であることが同定された。核に存在するエンドヌクレアーゼ酵素の活性は、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥアッセイシステムによっても観察された。その酵素に対する至適ｐＨは、6.5と7.5の間であった。これらの結果は、前記実施例１にて記載したＩＭ９細胞系によって合成および分泌されたエンドヌクレアーゼが、ＩＭ９細胞系の核に存在する酵素と同じであることを立証するものである。そのエンドヌクレアーゼは、様々な組織および細胞に存在すると多くの研究者によって報告された、Ｍｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼに密接に関連すると推定される（Anzai N. ら (1995) Blood 86, 917-923；Kawabata, H. ら (1993) Biochem. Biophys. Res. Comun. 191, 247-254；Sun X. M. および Cohen G. M. (1994) J. Biol. Chem. 269, 14857-14860；ならびに Wawabata, H., Anzai, N. ら (1997) Biochem. Biophys. Res. Comun. 233, 133-138）。しかしながら、これまでに公表されたアポトーシスに関与するエンドヌクレアーゼについての報告のいずれも、Ｍｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼが、タンパク質バンドまたは酵素活性バンドとして同定されたことは教示していない。
【００３２】
カルシウム依存性、未変性−ＰＡＧＥでの移動距離および至適ｐＨの側面において、本発明者らによって同定されたエンドヌクレアーゼは、例えば、Ｃａ2+/Ｍｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼ（Stratling, W. H. ら (1984) J. Biol. Chem. 259, 5893-5898；Pandey S. ら (1997) Biochemistry 36, 711-720；ならびに Ribeiro J. M. および Carson D. A. (1993) Biochemistry 32, 9129-9136）、ＤＮアーゼＩ（Peitsch M. C. ら (1993) EMBO J. 12, 371-377）、ＤＮアーゼII（Torriglia A., ら (1995) J. Biol. Chem. 270, 28579-28585；ならびに Barry M. A., および Eastman A. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 300, 440-450）およびＮＵＣ−18（Kawabata, H. ら (1997) Biochem. Biophys. Res. Comun. 233, 133-138）などといった、これまでに報告されたＤＮＡのヌクレオソーム間断片化に関与する酵素と異なっている。本発明のエンドヌクレアーゼは、アポトーシスのプロセス中に細胞核内に観察されるので、そのエンドヌクレアーゼはアポトーシスのプロセスにおいて重要な役割を果たすものと考えられる。
【００３３】
２−１ アポトーシスの誘導
ヒトＢ−リンパ芽球（ＩＭ９）細胞を培養し、次いでその細胞を、10 ug/ml ＣＨＸ（Sigma）で処理し、その後それらを24時間培養することによって、アポトーシスを誘導した（Chow, S. C. ら (1995) Exp. Cell. Res. 216, 149-159）。ＣＨＸによって誘導されたアポトーシス細胞の形状の変化は、遠心分離スライド上でライト−ギムザ（Sigma）によって染色することによって同定した。
【００３４】
図１５Ａには、ＩＭ９細胞のＣＨＸ（10 /ml）での24時間の処理によって、ヌクレオソーム間ＤＮＡ消化の特徴的な形態としてのＤＮＡ断片が提供されることが示されている。24時間後にＣＨＸの効果が呈され、そしてさらに24時間後に大量のＤＮＡ断片が形成された。アポトーシスによって起こされる、細胞死の際の細胞形状を観察するべく、細胞をライト−ギムザ染料で染色した。その結果を図１５Ｃに示す。多くのアポトーシス細胞がＣＨＸ処理によって産生され、そして歪曲、染色体凝集および核断片化によって特徴付けられる細胞形状が、正常に成長している細胞のものと異なっていた。
【００３５】
２−２ ＣＨＸで処理されたＩＭ９細胞のエンドヌクレアーゼによるＤＮＡ断片化の同定
ＩＭ９細胞系は、5 x 105細胞/ml にまで培養し、そして 10 ug/mlのＣＨＸ（Sigma）で処理した。24時間培養を行ないながら、定期的な間隔で1 x 106 細胞を集め、その後 Blin および Stafford（Blin, N., および Stafford, D. W. (1976) Nucleic Acid Res. 3, 2303-2308）の変法に従ってＤＮＡを抽出した。1 x 106 細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そしてＴＥ緩衝溶液中に再懸濁した。1 mlのＤＮＡ抽出緩衝溶液（10 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.6、10 mM ＥＤＴＡ、100 mM ＮａＣｌ、0.2％ ＳＤＳおよび100 ug/ml プロテイナーゼＫ）を添加した後、反応混合液を50℃にて8時間反応させ、そしてタンパク質を除去するべくフェノール／クロロホルムで２回処理した。0.3 M 酢酸ナトリウム（ｐＨ 5.2）を添加した後、反応混合液を冷エタノールで沈殿させた。沈殿をＴＥ（10 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.6、10 mM ＥＤＴＡ）緩衝溶液に再溶解して、ＲＮアーゼ（リボヌクレアーゼ）Ａで処理した。次いで、1.8％アガロースゲルにて電気泳動を行なった。電気泳動ゲルは、0.5 ug/ml エチジウムブロミドを含有する溶液中に 30分間入れ、そしてＵＶ下に撮影した。
【００３６】
ＣＨＸで処理したＩＭ９細胞を定期的な間隔で集め、そして細胞溶解物および核を調製した。細胞溶解物および核を可溶化した後、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥヌクレアーゼ活性のゲルアッセイを実施して、核に存在するエンドヌクレアーゼの酵素活性を同定した。図１６Ａには、ＩＭ９細胞を24時間培養すると、エンドヌクレアーゼの酵素活性が、その期間中にわたって絶えず細胞溶解物中に検出されたことが示されている。しかしながら、ＣＨＸで処理された細胞溶解物中の酵素活性は、6から12時間に減少し（図１６Ｂ）、一方核内の酵素活性は蓄積された（図１６Ｃ）。
【００３７】
２−３ 細胞核の単離および自己溶解
1 x 107 細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、そして 50 ml Tris-ＨＣｌ、ｐＨ 8.0、0.5 mM ＭｇＣｌ2および 0.9 M スクロースを含む 0.5 mlの冷緩衝溶液中に40℃にて20分間可溶化し、細胞の核を単離した。調製された細胞溶解物を、0.5 mlの1.2 M スクロース溶液中に入れ、そして800 gにて 40分間遠心分離した。この結果得られた沈殿を20 mM Tris-ＨＣｌ、ｐＨ 7.0の緩衝溶液中に懸濁して、核を得た。
【００３８】
単離された核の自己溶解を、Ｍｇ2+およびＣａ2+の濃度を変化させることによって、37℃にて定期的な間隔で行なった。10 mM Tris−ＨＣｌ、ｐＨ 7.5、100 ml ＮａＣｌ、1 mM ＥＤＴＡ、1％ ＳＤＳ プロテイナーゼＫを含む、0.5 mlのＤＮＡ抽出緩衝溶液を添加することによって、反応を停止した。混合液は、50℃にて30分間反応させ、タンパク質を除去するべくフェノール／クロロホルムで２回処理した。0.3 M 酢酸ナトリウム、ｐＨ 5.2を添加した後、混合液を冷エタノールで沈殿させた。沈殿をＴＥ緩衝溶液に溶解した後、その溶液をＲＮアーゼＡで処理した。次いで、1.8％アガロースゲルにて電気泳動を行なった。電気泳動ゲルは、0.5 /ml エチジウムブロミドを含有する溶液中に入れ、そしてＵＶ下に撮影した。
【００３９】
単離された細胞核の自己溶解法を使用することによって、ＩＭ９細胞の核に存在するエンドヌクレアーゼの酵素活性を定量して、ＤＮＡ断片がＭｇ2+濃度に依存して生産される現象を観察した。しかしながら、同じ実験条件下にＭｇ2+をＣａ2+に置き換えたところ、このようなＤＮＡ断片は観察されなかった。Ｃａ2+およびＭｇ2+の双方の存在下では、Ｍｇ2+のみが存在する場合と同じタイプのＤＮＡ断片が生産された。その結果から、Ｍｇ2+の濃度に依存して、ＤＮＡがエンドヌクレアーゼによって消化されることが示唆される。1 mM Ｚｎ2+および5 mM ＥＤＴＡの存在下では、ＤＮＡ断片は核内に生産されなかった（図１４Ｂ）。ＤＮＡ断片化は、Ｍｇ2+（10 mM）およびＣａ2+（10 mM）の一定濃度で、0〜4 時間行なった。その結果、Ｍｇ2+のみの存在下で反応が開始された後30分で、ＤＮＡ断片が生産され、そして60から240分に、ＤＮＡ断片は蓄積された（図１４Ｃ）。しかし、Ｃａ2+の存在下では、ＤＮＡ断片の形成は4時間にわたって観察されることがなかった（図１４Ｄ）。これらの結果は、ＩＭ９細胞の核に活性を有して存在するエンドヌクレアーゼがＤＮＡ断片を形成するには、Ｍｇ2+が必要とされることを示唆するものである。
【００４０】
２−４ 細胞の核に存在するエンドヌクレアーゼの部分精製および特徴付け
細胞の核に存在するエンドヌクレアーゼを、核を可溶化し、そして前記実施例１−４に記載したようにエンドヌクレアーゼ活性を呈するタンパク質バンドを溶出させることによって部分精製した。酵素活性は、基質として高次構造コイルプラスミドＤＮＡを使用することによって測定し、そして二価陽イオン依存性を、前記実施例１−４に従って観察した。また、アポトーシス阻害物質であるＺｎＣｌ２、およびキレート剤であるＥＤＴＡの処理による、酵素活性の変化も観察した。
【００４１】
酵素は、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって同定されたＩＭ９細胞の核に存在するエンドヌクレアーゼの酵素活性を特徴付けするべく、未変性−ＰＡＧＥによって単離および溶出した。観察によって、そのエンドヌクレアーゼがＭｇ2+−依存性であることが明らかになった（図１７）。そのエンドヌクレアーゼ活性は、アポトーシス阻害物質であるＺｎ2+、およびキレート剤であるＥＤＴＡによって完全に阻害された。その結果は、高次構造コイルプラスミドＤＮＡを直鎖状ＤＮＡへと変換するのに、Ｍｇ2+が必要とされることを示唆するもので、これは図８に示された結果に一致するものである。
【００４２】
実施例３
免疫細胞中の外来ＤＮＡに対するエンドヌクレアーゼの作用および反応生成物の特徴付け
細菌のＤＮＡが、哺乳動物のＤＮＡ中には存在しない種々の構造を決定する因子を含む外来因子としてこれまでのところ認識されており、そしてこのような因子が免疫細胞の作用に関係することは、公知である（Ｇｉｌｋｅｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．ら（１９９５）Ｊ．Ｇｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５，１３９８−１４０２；Ｇｉｌｋｅｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．ら（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．５９，２８８−３００；Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７，１４８−１５７；Ｋｒｅｉｇ，Ａ．Ｍ．ら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ、３７４、５４６−５４９；およびＨａｌｐｅｒｍ，Ｍ．Ｄ．ら（１９９６）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６７，７２−７８）。細菌のＤＮＡとの哺乳動物のＤＮＡの差異の１つは、哺乳動物のＤＮＡが、多量のＣｐＧ制限を受け、そしてＣｐＧジヌクレオチドのシトシンに対して選択的にメチル化されることである（Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｐ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１１、９４−１００；Ｒａｚｉｎ，Ａ．，およびＦｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．（１９８１）Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，３３−５２；ならびにＨａｎ，Ｊ．ら（１９９４）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．４，５３−６５）。最近の報告は、細菌のＤＮＡ中に存在するＣｐＧモチーフが、ＩｇＭの分泌を促進するようにポリクローナルＢ細胞を活性化することを示し（Ｋｒｅｉｇ，Ａ．Ｍ．ら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ、３７４、５４６−５４９；Ｌｉａｎｇ，Ｈ．ら（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８，１１１９−１１２９；およびＹｉ，Ａ．−Ｋ．ら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６、５５８−５６４）、そして細胞周期が、抗ＩｇＭ抗体によって停止させられ、そして細菌性のＣｐＧモチーフがＢ細胞のｃ−ｍｙｃの発現を阻害するが、一方、アポトーシスからの細胞の保護のために、ｍｙｎ、ｂｌｃ、およびｂｃｌ−Ｘ1 ｍＲＮＡの発現を増大させることを示唆する（Ｙ．Ａ．Ｋ．ら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、４９１８−４９２５）。Ｈａｌｐｅｎは、ＣｐＧモチーフが、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の短期間での分泌を促進するようにＢ細胞を直接活性化することを報告した（Ｈａｌｐｅｍ，Ｍ．Ｄ．ら（１９９６）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，７２−７８；Ｙｉ．Ａ．−Ｋ．ら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、５３９４−５４０２；およびＫｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３、２８７９−２８８３）。Ｂｉｒｄは、ＣｐＧモチーフが、ＮＫ細胞に対してＣＤ４+からＩＦＮ−γを誘導するように弱く作用することを示した（Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｐ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ，１１、９４−１００；ａｌｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．ら（１９９２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６、９８３−９９７）。従って、ＣｐＧ ＤＮＡによる免疫細胞の活性化は、ＩＬ−６による体液性の免疫を増大させ、そしてＩＦＮ−γの分泌による細胞性免疫を増大させる。細菌のＤＮＡがマクロファージによって消化され、そして次いでマクロファージがＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびプラスミノーゲン活性化因子インヒビター−２ ｍＲＮＡを産生するように活性化されることが知られている（Ｓｔａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．ら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、２１１６−２１２２）。
【００４３】
３−１ エンドヌクレアーゼによる細菌のＤＮＡのプロセシング
ＩＭ９細胞の培養溶液を、エンドヌクレアーゼの酵素活性の特異性、および最終反応生成物の特性を分析するために、酵素供給源として使用した。ＩＭ９細胞を、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で、５％のＣＯ2インキュベーター中で３７℃にて４８時間培養し、そして次いで、培養溶液を、酵素供給源として使用した。３６時間のＦＢＳを含有しない培地中で細胞を培養することによって得た培養溶液を、ＤＮａｓｅＩを含まないＩＮ９細胞によって分泌されたエンドヌクレアーゼのみを含む酵素供給源として使用した。
【００４４】
酵素の基質として使用したプラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔベクター、３．０Ｋｂ）を、アルカリ溶解法（Ｂｉｒｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．，およびＤｏｌｙ，Ｊ．（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７、１５１３−１５２３）によってＥ．ｃｏｌｉを破壊させ、続いてフェノール／クロロホルムで２回抽出し、そしてエタノールで沈殿させることによって得た。Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡおよびＩＭ９細胞のＤＮＡを、ＢｌｉｍおよびＳｔａｆｆｏｒｄの改変された方法によって抽出した。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＴＥ緩衝溶液に浮かべた。ＤＮＡ抽出緩衝溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％のＳＤＳ，２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ）を添加し、そして溶液を、３７℃にて１０分間放置した。プロテイナーゼＫを１００μｇ／ｍｌまで添加し、そして混合溶液を５０℃にて８時間反応させた。反応溶液を、タンパク質を除去するためにフェノール／クロロホルムで３回抽出し、そしてエタノール沈殿反応を、ゲノムＤＮＡに対して行った。サケの精子ＤＮＡをもまた抽出し、そして上記のように使用した。ＤＮＡ中に存在するＬＰＳの量を、Ｌｉｍｕｌｕｓ変形細胞溶解物アッセイ（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｄ．ら（１９７６）、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ａ．Ｗ．Ｂｅｒｎｈｅｉｍｅｒ編、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２１７頁）によって測定し、そして２．５ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満であった。
【００４５】
１０％のＦＢＳを含有する培地上で培養されたＩＭ９細胞中とＦＢＳを含有しない培地上で培養されたＩＭ９細胞中との酵素活性を比較するために、１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、２０μｌの各培養物と混合し、そして３７℃にて一定の間隔で反応させた。細胞培養物を使用することによるエンドヌクレアーゼの酵素活性のアッセイにおいては、ＦＢＳを含有しない培地上での細胞培養物を、ＦＢＳ中に存在するＤＮａｓｅＩの影響を排除するために使用した。また、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＩＭ９細胞、およびサケの精子の、１００ｎｇの各ゲノムＤＮＡを、上記のような同じ条件下で反応させ、そして従って、酵素活性を、１％のアガロースゲル電気泳動において決定した。
【００４６】
１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地およびＩＭ９細胞培養物を、インビトロでの細菌のＤＮＡの消化の程度を観察するために、細菌のＤＮＡと直接反応させた。図１８Ａは、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地中のプラスミドＤＮＡの消化の程度を示す。図１Ｄに示す結果とは異なり、この結果は、ＤＮａｓｅＩが培地中に存在するにもかかわらず、弱い酵素活性が検出されることを示した。このことは、培地が、ＤＮａｓｅＩ活性に対して影響を与え得るイオンまたはインヒビターを含むことを示す。しかし、プラスミドＤＮＡは、ＦＢＳを含有しない細胞培養溶液または１０％のＦＢＳを含有する細胞培養溶液によって消化された（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。このことは、プラスミドＤＮＡが、ＩＭ９細胞株によって分泌されたエンドヌクレアーゼによって消化されたことを示す。図１８Ｂと図１８Ｃとの比較は、１０％のＦＢＳを含有する細胞培養溶液中での酵素活性がより高いことを示す。細胞培養が、２×１０5細胞／ｍｌで開始された場合には、ＦＢＳの存在下での細胞の増殖が活性に生じ、そして大量のエンドヌクレアーゼが分泌された。図１９は、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＩＭ９細胞のＤＮＡ、およびサケの精子のＤＮＡの全てが、エンドヌクレアーゼによって消化されたことを示す。
【００４７】
３．２ 細胞中への細菌のＤＮＡの取りこみおよびＤＮＡ塩基配列の分析
ＩＭ９細胞株を、加熱した１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地とＩＭ９細胞培養溶液（４８時間培養した）との１：１で混合した培地上で培養した。細菌のＤＮＡ（２５μｇ／ｍｌ）を、培養溶液に添加した。ＩＭ９細胞株を１×１０6細胞／ｍｌの細胞密度で培養しながら、細胞を一定の間隔で回収し、そして細胞中に取りこまれたＤＮＡを抽出するために使用した。
【００４８】
ＩＭ９細胞株を細菌のＤＮＡで処理した後、細胞を一定の間隔で回収し、そしてＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、冷却した溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、および０．５％のＮＰ−４０）中に再懸濁し、細胞溶解物を、上記の実施例１−２に記載した方法によって得た。同じ容量のＤＮＡ抽出緩衝液を細胞溶解物に添加し、そして４２℃にて３時間放置し、そして次いで、タンパク質を除去するためにフェノール／クロロホルムで２回処理した。次いで、細胞溶解物中に存在するＤＮＡを、エタノール沈殿によって抽出した。沈殿物を、ＴＥ緩衝液中に溶解させ、そしてＲＮａｓｅＡで処理し、そしてサザンブロッティングのサンプルに使用した。
【００４９】
細胞溶解物から抽出したＤＮＡを、１．８％のアガロースゲル上での電気移動によって分離し、そしてサザン転移を行った。電気泳動後、アガロースゲルを、およそ２００ｍｌのアルカリ溶液（１．５ＭのＮａＣｌおよび０．５ＭのＮａＯＨ）中で２０分間振盪させ、滅菌水で洗浄し、そしておよそ２００ｍｌの中和溶液（１．５ＭのＮａＣｌ、０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５）中に２０分間放置した。続いて、アガロースゲルを、新しい中和溶液中で振盪した。１７５．３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのクエン酸ナトリウム溶液、および２ｍｌの０．５ＭのＥＤＴＡを滅菌水に添加して、１ｌの溶液を作成し、そして得られた溶液を、ＳＳＣ溶液を得るために１２１℃でオートクレーブした。容器１の底が容器Ｂ中に含まれる容器の表面に配置され得るように、１つの長方形の容器Ａを、２０×ＳＳＣを含有する別の容器Ｂ上に逆向きに置いた。２０×ＳＳＣで飽和させた２ｍｍの幅のＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．３ペーパーを、両方の２０×ＳＳＣがくっつき得るように、気泡を含まずに容器Ａの底に置いた。アガロースゲルをペーパー上に逆向きにお気、そしてＨｙｂｏｎｄ+ナイロンメンブレンを、気泡が生じることを防ぐためにアガロースゲル上に置いた。アガロースゲルよりも小さい３枚のＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．３ペーパーを、それぞれを２ｍｍで４面に置き、気泡を含まないようにＨｙｂｏｎｄ+ナイロンメンブレン上に置いた。次いで、ペーパータオルを、１０から２０ｃｍまでの高さになるように、積み上げ、そして約５００ｇの錘を置いた。ゲルの底の周辺は、パラフィルムで囲み、そして毛細管転移を、８時間行った。ＤＮＡが載っているメンブレンを、１２０，０００μｌ／ｃｍのＵＶ照射に２分間曝して、ＵＶによって架橋した。
【００５０】
細菌のＤＮＡを、３７℃にて３０分間、エンドヌクレアーゼと反応させ、そして得られた１００から２００ｂｐの生成物を、１％のアガロースゲル上で電気泳動した。Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）を使用して、ＤＮＡをゲルから回収し、そしてＤＮＡプローブとして使用した。５０から１００ｎｇのＤＮＡを１００℃の水中で３分間加熱し、そしてすぐに氷上で冷却して、ＤＮＡフラグメントに分離させ、次いで、32Ｐで標識した。ＤＮＡ標識反応を、ランダムプライム法に従って行った。ここでは、１０ｎｇのランダムプライマー、４μｇの緩衝溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、５ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．６）、２５μＭのｄＡＴＰ、２５μＭのｄＧＴＰ、２５μＭのｄＴＴＰ、６０μＣｉ［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ、および５μｌのＫｌｅｎｏｗ酵素から構成される２０μｌの混合物を、３７℃にて２時間反応させた。２μｌの０．５ＭのＥＤＴＡを反応混合物に添加して反応を停止させ、そして次いで、同じ容量の３Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２および２０μｇのサケの精子のＤＮＡを添加した。２倍の容量のエタノールを反応混合物に添加して、所望のＤＮＡを沈殿させた。沈殿物をＴＥ寛容液中に溶解させ、１００℃に加熱し、そして氷上で迅速に冷却した。
【００５１】
ＵＶ架橋したＨｙｂｏｎｄ+ナイロンメンブレンを、６８℃に予め暖めた予備ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．０５％のピロリン酸ナトリウム、０．５％のＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌのサケの精子のＤＮＡ）に添加し、そして６８℃にて少なくとも１時間振盪した。標識したプローブ（ランダムプライミング法によって調製し、そして氷上で冷却した）を添加して、約１２時間ハイブリダイズさせた。フィルターを、洗浄溶液Ｉ（２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）に移し、そして約１０分間室温で洗浄した。次いで、フィルターを、６８℃に予め暖めた洗浄溶液Ｉに移し、そして約２５分間洗浄した。続いて、フィルターを洗浄溶液ＩＩ（０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）に移し、そしてＧｅｉｇｅｒカウンターによってフィルター上の放射活性を測定しながら洗浄した。フィルターを、増感紙およびＸ線フィルムを取りつけたカセットに挿入した。−７０℃で１２から２４時間後、フィルターを現像した。
【００５２】
細菌のＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを、細胞培養の間に添加し、そして３７℃にて１時間インキュベートした。細胞溶解物中に存在するＤＮＡフラグメントを、１．８％のアガロースゲル上で電気泳動した。次いで、サザン転移による５０−２００ｂｐの部位のゲルを、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）を使用して回収した。ＤＮＡフラグメントを、塩基配列を同定するために、図２１に示すようにｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）中に導入した。得られたベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ中にクローン化し、そしてサンガージデオキシリボヌクレオチド鎖終結方法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４、５４６３−５４６７）に従って、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（登録商標）バージョン２．０ ＤＮＡ配列決定キット（ＵＳＢ）によって分析した。以下の表１に記載するＭＢ正方向／逆方向プライマーを、配列決定のためのプライマーとして使用した。クローン化したＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌｓ）プログラムによって、細菌のＤＮＡフラグメントまたはプラスミドＤＮＡフラグメントとして確認した。
【００５３】
【表１】
【００５４】
試験結果は、２５μｇ／ｍｌの細菌のＤＮＡをＩＭ９細胞とともにインキュベートした場合に、ＤＮＡは細胞培養物中で適切にプロセシングされ、そして細胞中に取りこまれることを示す。このことを、サザンハイブリダイゼーションによって確認した（図２０）。１００−２００ｂｐのＤＮＡの存在が、細胞培養の３０分後に見出された。細胞中の１００−２００ｂｐのＤＮＡの量は、培養時間の経過に伴って減少した。これらの結果は、適切にプロセシングされたＤＮＡがＩＭ９細胞株中に取りこまれ、そしてプロセシングが細胞中で継続されることを示唆する。
【００５５】
エンドヌクレアーゼの酵素活性によって得られた生成物の特性を同定するために、細胞中に取りこまれた細菌のＤＮＡを単離し、そしてそのＤＮＡ配列を、図２１に示すように分析した。表２に示すように、エンドヌクレアーゼの反応生成物は、特徴的な塩基配列（すなわち、５’末端に２つのプリン塩基を有し、そして３’末端に２つのピリミジン塩基を有するＣｐＧモチーフ）を有した。ＣｐＧモチーフが免疫システムにおいてＢ細胞またはマクロファージを活性化し、そしてシトシンおよびＩｇＭの分泌を促進し、そして高い頻度で細菌のＤＮＡ中に存在することは、公知である。従って、エンドヌクレアーゼがＩＭ９細胞培養溶液中に存在し、そして細胞中の酵素活性によるＤＮＡのプロセシングがＣｐＧモチーフ（これは、免疫細胞を活性化するように機能する）を生成することが、ここで見出された。
【００５６】
【表２】
【００５７】
３．３ 細胞中に取りこまれたＤＮＡのプロセシングの確認
どのようにして細胞中に取りこまれた５０−２００ｂｐのクローン化されたＤＮＡフラグメントが細胞内でさらにプロセシングされるか、およびＤＮＡフラグメントの塩基配列が細胞に対してどのような影響を与えるか確認するために、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応溶液は、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌのプライマー、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、および２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼを含んだ。５’−ＣＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧ−３’および５’−ＴＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣ−３’（表Ｉ）を合成し、そしてＰＣＲプライマーとして使用した。ＰＣＲ反応を、以下の条件下で３５回繰り返した：変性（９４℃で３０秒間）；プライマーのアニーリング（４２℃で３０秒間）；プライマーの伸張（７２℃で５０秒間）。ＰＣＲ生成物を、８％の未変性のＰＡＧＥ上でＴＢＥ緩衝溶液中で泳動し、そしてエチジウムブロマイドで染色した。続いて、ＤＮＡを、ＰＣＲ反応生成物のゲルから分離した。分離したＤＮＡをエタノールで沈殿させ、そして細胞培養物についてはＰＢＳ中に溶解させるか、またはエンドヌクレアーゼの活性の検出のためにはＴＥ緩衝液中に溶解させた。
【００５８】
最終生成物の形態が、１００−２００ｂｐの細菌のＤＮＡをクローニングしているベクター（これは、エンドヌクレアーゼの活性によって切断された）中のＰＣＲ増幅によって得られた生成物が細胞に導入された後に存在することを確認するために、ＥＣ１、ＥＣ２、およびＨＣ１のＤＮＡフラグメントを、ランダムプライマーおよびＫｌｅｎｏｗ酵素を使用するランダムプライミング方法によって32Ｐで標識した。32Ｐで標識した１００ｎｇ／ｍｌのＤＮＡフラグメントが、ＩＧ９細胞株、Ｕ９３７細胞株、およびＴＰＡで処理したＵ９３７細胞株中に取りこまれた。ＤＮＡが細胞に取りこまれたかどうかを、一定の間隔で確認した。エンドヌクレアーゼを、０．２ｍＭのＺｎＳＯ4（Ｓｉｇｍａ）で処理して、その酵素活性を停止させた。細胞中に取りこまれたＤＮＡを細胞溶解物中で回収し、そしてＴＢＥ緩衝溶液中で２０％の未変性のＰＡＧＥ上で泳動させた。ゲルを乾燥させ、そして細胞内およびエンドヌクレアーゼ反応によって得られた最終生成物中のＤＮＡのプロセシングを確認するためにオートラジオグラフした。
【００５９】
32Ｐで標識したＥＣ１のＤＮＡフラグメントは、ＩＭ９細胞株中に取りこまれた。細胞中に取りこまれたＤＮＡを細胞溶解物から抽出し、そして２０％の未変性のＰＡＧＥを行った。32Ｐで標識されたプロセシングされたＤＮＡをゲルから抽出し、そしてそれらの互いの塩基配列を比較するために、種々の合成したオリゴヌクレオチドとアニーリングさせた。予め決定した量の、32Ｐで標識した抽出したＤＮＡおよび１０ｎｇの各オリゴヌクレオチドを、６×ＳＳＣと混合した。混合物を、１００℃の温度で５分間沸騰させ、そして３０秒間で１℃で温度を下げてアニーリングさせた。アニーリングさせた反応物を、２０％の未変性のＰＡＧＥ上で４℃にて泳動し、そして反応物についてのオートラジオグラフィーを行った。このようにして、細胞中に取りこまれたＤＮＡに相補的に結合したオリゴヌクレオチドを確認した。標準として、アニーリングしていないＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドとの混合物、および変性させそして細胞中に取りこまれたＤＮＡのみとアニーリングさせたＤＮＡを使用した。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列は、オリゴＡおよびＢ（これらは、ＥＣ１のＤＮＡフラグメント中に存在する）、ならびにオリゴＣ、Ｄ、およびＥ（これらは、ＥＣ１のＤＮＡ中には存在しない）を使用した。
【００６０】
外部のＤＮＡがヒトのＢ−リンパ芽球ＩＭ９細胞株、Ｕ９３７細胞株、およびＴＰＡでの処理によって分化させられたＵ９３７細胞株中に取りこまれること、ならびに細胞中でプロセシングされることが確認された。試験の結果として、プロセシングされた生成物を、ＰＣＲ増幅した32Ｐで標識した細菌のＤＮＡフラグメントとして同定した。ＩＭ９細胞株中での外部のＤＮＡの取りこみおよびプロセシングを、図２２に示すように確認した。１５７ｂｐ（ＥＣ１）のＤＮＡフラグメントは、４℃では細胞中には取り込まれなかったが、細胞膜に結合した。３７℃の温度では、ＤＮＡフラグメントは、培養時間の経過に伴って細胞中でプロセシングされた。２４時間以内に、約１０ｂｐのＤＮＡフラグメントが、２０％の未変性のＰＡＧＥにおいて最終産物として生じた。続く試験においては、１０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、一本鎖のＤＮＡ構造として同定した。ＤＮＡフラグメントをまた、２０％の未変性のＰＡＧＥ（８．３Ｍの尿素）上で一本鎖のＤＮＡ構造として同定した。図２３は、Ｕ９３７細胞株、およびＴＰＡでの処理によって分化させられたＵ９３７細胞株中で観察された外部のＤＮＡの取りこみ、ならびに細胞中でのプロセシングを示す。しかし、図２３Ｂは、ＴＰＡでの処理によって分化させられたＵ９３７細胞株によるＤＮＡの取りこみおよび細胞中でのプロセシングを示す。図２３Ｂに示すように、細胞中でのＤＮＡのプロセシングは、０．２ｍＭのＺｎ2+によって阻害された。
【００６１】
試験結果は、免疫細胞が外部のＤＮＡをプロセシングすることによって、１０塩基の最終生成物を生じることを実証する。ＤＮＡフラグメントの塩基配列の特性をもまた確認した。ＰＣＲによって増幅したＥＣ１のＤＮＡ産物を32Ｐで標識し、そして細胞中に取りこませた後、細胞性のエンドヌクレアーゼによってプロセシングされた１０塩基のＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドと相補的に結合した塩基配列を同定するために、ＥＣ１の部分的な配列と一致するいくつかのタイプの合資のオリゴヌクレオチドとアニーリングさせた（図２４）。アニーリングの結果として、オリゴヌクレオチド（そのほとんどが、塩基配列と相補的に結合した）は、表１のオリゴＡの配列（すなわち、ＡＡＣＧＴＴモチーフを有し、そしてＥＣ１のＤＮＡ中に存在する塩基配列）であった。上記の結果から、細胞中のエンドヌクレアーゼの酵素的活性によって免疫細胞を活性化する細菌のＤＮＡの塩基配列として公知のＣｐＧモチーフが産生されたことを、明らかに確認した。
【００６２】
３−４ 細菌のＤＮＡによるＩＭ９細胞株のＩｇＭ分泌の確認
Ｂ細胞を活性化することによって、サイトカインおよびＩｇＭを分泌することが公知のＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドを合成した。エンドヌクレアーゼの作用によって産生されたＤＮＡフラグメントの中でも、ＥＣ１中に存在するオリゴＡ、およびＥＣ２に存在するオリゴＢ、およびＣｐＧモチーフを有さないオリゴＥを合成した（表１）。いくつかのＣｐＧモチーフを含有するＥＣ１またはＥＣ２のＰＣＲ生成物、およびいくつかのタイプのＤＮＡをもまた、この実験において使用した。ＣｐＧモチーフをメチル化するために、細菌のＤＮＡをエンドヌクレアーゼによって消化し、それによって１００−２００ｂｐを有するフラグメントを得た。メチル化を、３０μｇのＤＮＡを、ＣｐＧメチラーゼおよび１６０μＭのＳ−アデノシルメチオニンを含有する緩衝溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＤＴＴ）と混合し、そして３７℃にて３時間反応させることによって行った。ＣｐＧメチル化を、ＨｐａＩＩで消化することによって確認した。
【００６３】
ＩＭ９細胞株、ヒトＢリンパ芽球細胞株を、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で、培養の開始時点で２×１０5の細胞数で培養した。培養物をいくつかのタイプの予め調製した２５μｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡで処理し、そして２４時間培養した後、細胞培養物を得た。
【００６４】
０．１Ｍの炭水化物緩衝溶液（ｐＨ９．６）中の抗−ヒト−μ−鎖特異的ＩｇＭ（５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を、１００μｌ／ウェルで平底プレート中に取りこみ、そして次いで、プレートを４℃にて１６時間放置した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、そして室温で２時間放置した。続いて、プレートを、ＴＰＢＳ（ＰＢＳ中の０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。１００μｇ／ウェルで、ざっと希釈した細胞培養物または精製したヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ）を導入した。室温で２時間放置した後、これをＴＰＢＳで３回洗浄した。１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中で１／４０，０００中に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させ抗ヒトＩｇを導入し、そして室温にて１時間放置し、そして次いで、ＴＰＢＳで３回洗浄した。続いてプレートを、０．０５Ｍのリン酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）中で３０分間、Ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライドで処理した。プレートを、０．６７ＮのＨ2ＳＯ4で処理して反応を停止させ、そしてＩｇＭをマイクロリーダーを使用して定量した。
【００６５】
ＩＭ９細胞株を合成のオリゴヌクレオチドと反応させた後の４８時間に分泌されたＩｇＭの量を測定しながら、ＣｐＧモチーフを有するオリゴＡおよびオリゴにおいては、ＩｇＭの２−３ｎｇ／ｍｌが分泌されたが、ＣｐＧモチーフを有さないオリゴＥにおいては、０．５ｎｇ／ｍｌのＩｇＭが合成されたことを確認した（図２５）。さらに、２−３ｎｇ／ｍｌのＩｇＭがまた、細菌のＤＮＡおよびいくつかのＣｐＧモチーフを有する細菌のＤＮＡのＰＣＲ生成物（表１、ＥＣ１、ＥＣ２のＤＮＡ）中で分泌されたことを観察した。しかし、細菌のＤＮＡのＩｇＭのＣｐＧモチーフがメチル化されそして細胞株の培養物中で処理される場合は、これは分泌されなかった（図２５）。細菌のＤＮＡと比較して、ＩｇＭの分泌は、サケの精子のＤＮＡによっては増大させられなかった。上記の結果から、細菌のＤＮＡのＣｐＧモチーフは、ＩＭ９細胞株を活性化することによってＩｇＭの分泌を増大させることを確認した。そしてこのことは、上記のいく人かの研究者らによって合成されたＣｐＧモチーフを使用することによって証明された研究の結果と一致した。
【００６６】
３−５ 外来ＤＮＡのプロセシングに関与するエンドヌクレアーゼの酵素活性の特性
ＰＣＲによって増幅したＥＣ１、ＥＣ２、およびＨＣ１のＤＮＡを、ランダムプライマーおよびＫｌｅｎｏｗ酵素を使用する32Ｐランダムプライミング方法で標識した。より短いＤＮＡを得るために、ＥＣ２のＤＮＡをＡｌｕ １（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）で消化し、そしてその５’末端が32Ｐで標識されたフラグメントを、基質として使用した。エンドヌクレアーゼの酵素活性の特性を同定するために、ＥＣ１のＤＮＡを５’−末端または３’−末端標識し、そして利用した。５’−末端標識を、１０ｎｇのＥＣ１のＤＮＡ、［γ−32Ｐ］ＡＴＰ ５０μＣｉ、キナーゼ緩衝溶液、および５ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）を混合し、そして３７℃にて１時間反応させることによって行った。３’−末端標識を、１０ｎｇのＥＣ１のＤＮＡ、［α−32Ｐ］ＣＴＰ ５０μＣｉ、ＴｄＴ緩衝溶液、および５ユニットの末端デオキシトランスフェラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を混合すること、および３７℃にて１時間反応させることによって行い、そして利用した。
【００６７】
上記のように調製した５ｎｇのＥＣ１、ＥＣ２、およびＨＣ１のＤＮＡを、ランダムプライミング方法によって標識し、Ａｌｕ Ｉで消化し、そして５’−標識したそしてＥＣ２のＤＮＡを、ＩＭ９細胞培養物（これは、ＦＢＳを含まず、そして一定の時間の間隔で反応させた）と混合した。酵素活性をまた、細胞培養物の量を増大させることによって測定した。反応混合物を、フェノール／クロロホルムで処理してタンパク質を除去し、冷却したエタノールで沈殿させ、そして２０％の未変性のＰＡＧＥおよび２０％の変性させたＰＡＧＥ（８．３Ｍの尿素）を用いてＴＢＥ緩衝溶液中で電気泳動した。ゲルを乾燥させ、そしてオートラジオグラフした。反応生成物を酵素活性について分析した。ＦＢＳ中のＤＮａｓｅＩの酵素活性を比較するために、１０％のＦＢＳを含有する１０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地をもまた、いくつかの基質と反応させた。さらに、エンドヌクレアーゼのインヒビターであるＺｎ2+（１ｍＭ）およびキレート剤であるＥＤＴＡ（１０Ｍｍ）が与える影響が、酵素活性を有することを確認した。この時に、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）およびキシレンシアノ−ル（ＸＣ）を、分子量の標準として使用した。変性させたＰＡＧＥにおいては、ＢＰＢは、８塩基で配置され、そしてＸＣは２８塩基であった。未変性のＰＡＧＥにおいては、ＢＰＢおよびＸＣは、それぞれ、１２ｂｐおよび４５ｂｐであった。
【００６８】
エンドヌクレアーゼの酵素活性の特性、およびに得られる生成物の特性を同定するために、表２に列挙したＥＣ１、ＥＣ２、およびＨＣ１のＤＮＡをランダムプライミング方法によって32Ｐで標識し、そして基質として利用した。ＦＢＳを含有しない培地中で培養したＩＭ９細胞株とのこれらの基質の反応が、図２６、２７、および２８に示すような、およそ１０塩基を有するＤＮＡ反応生成物を生じることを、確認した。この結果は、エンドヌクレアーゼがＤＮＡの塩基配列を特異的に認識するのではないことを示す。塩基の配列にはかかわらず、エンドヌクレアーゼは外来のＤＮＡに対して作用し、それによっておよそ１０塩基を有するＤＮＡフラグメントを生じる。酵素活性が、エンドヌクレアーゼのインヒビターであるＺｎ2+およびキレート剤であるＥＤＴＡによって阻害されることもまた、確認した（図２６、２７、２８、および２９）。インビトロでの実験によって、得られる生成物が、エンドヌクレアーゼの作用によって細胞中に取りこまれたＤＮＡをプロセシングすることによって産生される反応産物と一致することを確認した。エンドヌクレアーゼの酵素活性の反応によって得られる生成物が、およそ１０塩基を有するＤＮＡフラグメントからなることを確認した。エンドヌクレアーゼの量を増大させ（図３０）、そして反応時間を２４時間まで維持した場合でもなお、およそ１０塩基を有するＤＮＡフラグメント（すなわち、酵素反応によって形成される反応によって得られる生成物）はさらには消化されなかった。言い換えれば、本発明によって証明されたエンドヌクレアーゼは、およそ１０より短い塩基を有するＤＮＡフラグメントに対しては活性を全く発揮しない。
【００６９】
図３２は、いくつかのＤＮＡフラグメントを示す。すなわち、ＰＣＲによって増幅されたＥＣ２のＤＮＡ生成物がＡｌｕＩで消化されそしてＤＮＡフラグメントが生じる前に形成されたエンドヌクレアーゼ反応生成物を、最終生成物を生じるようにエンドヌクレアーゼと反応させた。この実験において使用した基質を、ＡｌｕＩと反応させたＤＮＡの５’−末端中で32Ｐで標識した。標識した酵素の反応によって得られた生成物は、およそ１０塩基を有するＤＮＡフラグメントであった。この事実から、一本鎖のＤＮＡを産生する５’−エンドヌクレアーゼの酵素活性は存在しないことを確認した。
【００７０】
ＩＭ９細胞株のエンドヌクレアーゼが、３’−エキソヌクレアーゼまたは５’−エキソヌクレアーゼ活性を有するかどうかを確認するために、５’−末端または３’−末端で32Ｐで標識したＥＣ２のＤＮＡを基質として使用し、そして３７℃にて１時間、エンドヌクレアーゼと反応させた。反応によって得られる生成物を、上記に記載したものと同じ方法によってオートラジオグラフによって比較した。エンドヌクレアーゼの酵素活性が一本鎖のＤＮＡ中に出現するかどうかを確認するために、標識したＤＮＡを１００℃にて５分間沸騰させ、氷上で冷却し、そして上記のようにエンドヌクレアーゼと反応させた。
【００７１】
図３３は、およそ１０塩基を有するＤＮＡフラグメントが、５’−末端（５’−末端標識、レーン２）中で標識した基質に対するエンドヌクレアーゼの作用によって形成されることを示す。結果は、図３２に示すものと同じである。すなわち、５’−エキソヌクレアーゼ活性はエンドヌクレアーゼ中には存在しなかった。しかし、およし１０塩基を有するＤＮＡフラグメント（すなわち、酵素反応によって得られた生成物）は、３’−末端中で32Ｐで標識した基質においては形成されなかった。32Ｐで標識した基質を１００℃で１０分間沸騰させ、氷上で冷却させて一本鎖のＤＮＡに転換させ、そして次いでエンドヌクレアーゼと反応させた後、およそ１０塩基を有する標識されたＤＮＡフラグメントが、５’−末端および３’−末端の両方において標識されたＤＮＡ基質において酵素反応生成物として形成された。試験結果に基づくと、３’−エキソヌクレアーゼ活性は、一本鎖に対しては作用しない。
【００７２】
細胞培養物中に存在するエンドヌクレアーゼの酵素活性によって産生される反応によって得られる生成物を、細胞中でのプロセシングによって産生される生成物およびＤＮａｓｅＩの作用によって産生される反応の最終生成物と比較するために、５ユニットのウシすい臓のＤＮａｓｅＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およびランダムプライミング方法によって32Ｐで標識したＥＣ１のＤＮＡを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ2緩衝得溶液中で、３７℃にて１時間反応させた。反応物を、２０％の未変性のＰＡＧＥおよび２０％の変性させたＰＡＧＥ（８．３Ｍの尿素）上で泳動し、オートラジオグラフし、そしてエンドヌクレアーゼの酵素反応によって得られた生成物と比較した。また、エンドヌクレアーゼ活性の得られる生成物が一本鎖で存在することを確認するために、これをＳ１ヌクレアーゼで処理した。Ｓ１ヌクレアーゼの酵素活性を、Ｓ１ヌクレアーゼ反応緩衝溶液（７×緩衝溶液、０．３Ｍの酢酸カリウム、ｐＨ４．６、２．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＺｎＳＯ4、５０％のグリセロール）中に含まれる３ユニットのＳ１ヌクレアーゼと、ランダムプライミング方法によって32Ｐで標識した基質に対する作用によるエンドヌクレアーゼの反応によって得られる生成物とを混合すること、そして３７℃にて１時間、混合物を反応させることによってによって確認した。反応物を、上記と同じ方法によってオートラジオグラフによって確認した。
【００７３】
エンドヌクレアーゼの酵素活性によって生じる得られる生成物と、ＤＮａｓｅＩの作用によって生じる反応生成物との比較によって、図３４に示すように、細胞培養物のエンドヌクレアーゼによってプロセシングされたＤＮＡ反応生成物（レーン２）および細胞性のエンドヌクレアーゼによってプロセシングされたＤＮＡ反応生成物（レーン３）は全て、およそ１０塩基を有するＤＮＡフラグメントである。しかし、ＤＮａｓｅＩの作用によると（レーン４）、ＤＮＡフラグメントは、１０塩基未満にまで分解された。フラグメントは、続いて、モノヌクレオチドにまで分解された。エンドヌクレアーゼ反応によって得られる生成物が一本鎖の形態で存在するかどうかを確認するために、生成物をＳ１ヌクレアーゼで処理し、そして酵素反応生成物を観察した。およそ１０塩基を有する反応生成物（すなわち、エンドヌクレアーゼの生成物）をＳ１ヌクレアーゼと再び反応させた場合は、図３５に示すように、完全にモノヌクレオチドにまで分解された。このことは、エンドヌクレアーゼの酵素活性によって産生されたおよそ１０塩基を有するＤＮＡフラグメントが、一本鎖の形態で存在することを提供する明らかな証拠である。
【００７４】
実施例４
ＩＭ９細胞株から分泌されたエンドヌクレアーゼの精製および同定
ＩＭ９細胞株が合成され、そしてＭｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼ（これは、これまでに既知であるヌクレアーゼとは異なる）を分泌することが、ここで見出された。エンドヌクレアーゼがＩＭ９細胞株の核内に存在し、そしてアポトーシスのプロセスに関与することもまた、見出された。アポトーシスに関与するエンドヌクレアーゼとして、Ｍｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼ（Ａｎｚａｉ Ｎ．ら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８６、９１７−９２３；Ｋａｗａｂａｔａ Ｈ．ら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９１，２５７−２５４；Ｓｕｎ Ｘ．Ｍ．，およびＣｏｈｅｎ Ｇ．Ｍ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１４８５７−１４８６０；ならびにＫａｗａｂａｔａ，Ｈ．ら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３３，１３３−１３８）、Ｃａ2+／Ｍｇ2+−依存性エンドヌクレアーゼ（Ｓｔｒａｔｌｉｎｇ Ｗ．Ｈ．ら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，５８９３−５８９８；Ｐａｎｄｅｙ Ｓ．ら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２、９１２９−９１３６）、ＤＮａｓｅＩ（Ｐｅｉｔｅｃｈ Ｍ．Ｃ．ら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２，３７１−３７７）、ＮＵＣ１８（Ｋａｗａｂａｔａ，Ｈ．ら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３３，１３３−１３８）などが挙げられる。しかし、上記の既知のエンドヌクレアーゼの精製、生化学的特徴、および生理学的な機能は、明らかには同定されていない。さらに、細菌のＤＮＡを外来因子として認識し得、そしてそれらをプロセシングし得るエンドヌクレアーゼについての報告は全く存在しない。本発明によって、ＩＧ９細胞株によって合成されそして分泌されるエンドヌクレアーゼが精製され、そしてその特性が本明細書中で同定された。
【００７５】
４−１ タンパク質の供給源およびエンドヌクレアーゼの酵素活性についてのアッセイ
エンドヌクレアーゼを分泌するＩＭ９細胞株を、加熱した１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で大規模に培養し、そして得られた細胞培養物を、酵素の供給源として使用した。細胞培養物を１，５００×ｇで５分間遠心分離した後、ＩＭ９細胞株を廃棄し、そして細胞培養溶液を回収した。１０ｌの細胞培養溶液を、１４，０００×ｇで３０分間、４℃にて遠心分離し，そして得られた上清を酵素の供給源として使用した。
【００７６】
エンドヌクレアーゼの精製の間に、酵素活性を、基質として使用したスーパーコイルプラスミドＤＮＡからの直鎖上のＤＮＡの形成および消化の程度として測定した。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１０ｍＭのＭｇＣｌ2を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０緩衝溶液に添加し、そして混合物を、３７℃にて１０分間のタンパク質の精製の間に得られた２０μｌのサンプルと反応させた。酵素反応を、ＤＮＡサンプル緩衝液を用いて停止させ、そして酵素活性を、１％のアガロースゲル上での電気泳動によってアッセイした。
【００７７】
４．２ エンドヌクレアーゼの精製
細胞培養溶液を、ＮＨ4ＳＯ4をゆっくりと添加することによって８０％の濃度まで飽和させ、そして次いで１４，０００×ｇで遠心分離した。得られる沈殿物を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ５．２）中で一晩透析した。酵素溶液の５ｍｌのアリコートを、５ｍｌの同じ緩衝溶液で予め平衡化したＭｏｎｏ−Ｓカラム（０，５×５．０ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）上にロードした。タンパク質を、同じ緩衝溶液中の０−０．０８ＭのＮａＣｌ（１５ｍｌ）の直線状の濃度勾配によって最初に溶出し、そして次いで、０．０８ＭのＮａＣｌを含有する１５ｍｌの同じ緩衝溶液を通過させた。続いて、タンパク質を、０．０８−０．２ＭのＮａＣｌ（２０ｍｌ）の直線状の濃度勾配を用いて再度溶出した。各画分の容量は１ｍｌであり、そして流速は０．５ｍｌ／分であった。上記の手順を繰り返し、そしてエンドヌクレアーゼを含有する画分をプールし、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎを使用して濃縮し、そして次いで、１．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4を含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）で平衡化した。この酵素供給源を、ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥカラム（０．６４×３０ｍｍ、１ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）上にロードし、そして疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った。カラムを１５μｌの同じ緩衝溶液で洗浄し、そしてタンパク質を、１．５−０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4（２５ｍｌ）の直線状の勾配を用いて溶出した。酵素活性を有する画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ中で濃縮し、そして２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．０）を用いて平衡化した。
【００７８】
ＩＭ９細胞培養溶液を硫酸アンモニウム上で濃縮し、そして精製のために使用した。硫酸アンモニウム上でのディファレンシャルな沈殿を、濃度の差異に依存して行ったが、酵素の単離に対する有意な影響はなかった。従って、培養溶液を８０％まで濃縮し、そしてタンパク質を精製のために沈殿させた。Ｍｏｎｏ Ｓカラム上を通過させたサンプル中の酵素活性を、０．０８−０．２ＭのＮａＣｌの直線状の濃度勾配によって回収した（図３６）。陽イオン交換樹脂上で活性を示す画分をプールし、そして疎水性相互作用クロマトグラフィー中においてＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥカラム上を通過させた。タンパク質を、１．５−０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4の直線状の濃度勾配を用いて溶出した場合は、エンドヌクレアーゼの活性は、上記の勾配の中で、０．７Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4勾配から得られたタンパク質画分中で検出された（図３７）。１０μｇのエンドヌクレアーゼを、およそ１０ｇのタンパク質を含有する１０ｌのＩＭ９細胞培養溶液から精製した。
【００７９】
４−３ 未変性の有孔性の勾配ＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の決定
陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー上で酵素活性を示す画分をプールし、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ中で濃縮した。濃縮した溶液を、アクリルアミド勾配ゲルの４−１５％の直線状の勾配上にロードし、そして電気泳動を、４℃にて１８時間、４−５ｍＡで行った。次いで、ゲルを、タンパク質バンドを検出するためにクマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。タンパク質バンドのゲルの部分を切り出して、染色の前に小さい断片を作成し、そして２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．０）を用いて４℃にて８時間溶出した。溶出したタンパク質画分の中の酵素活性を、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを基質として使用して検出した。酵素活性画分を濃縮し、そしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。スタッキングゲルおよび泳動ゲルの濃度は、それぞれ、４％および７％であった。未変性の有孔性の勾配ＰＡＧＥ中の標準タンパク質は、フェリチン（４４０ｋＤ）、カタラーゼ（２３２ｋＤ）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（１４０ｋＤ）、およびウシ血清アルブミン（８７ｋＤ）の混合物であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける標準タンパク質は、ミオシン（２００ｋＤ）、β−ガラクトシダーゼ（１１６．３ｋＤ）、ホスホリラーゼＢ（９７．４ｋＤ）、ウシ血清アルブミン（６６．２ｋＤ）、およびオボアルブミン（４５ｋＤ）の混合物であった。
【００８０】
ＭｏｎｏＳカラム上で溶出した酵素活性画分を濃縮し、そして４−１５％の未変性の有孔性の勾配ゲル電気泳動を、酵素活性を示すタンパク質バンドを検出するために行った（図４０）。酵素活性を示すタンパク質バンドは、明確な単一のバンドは示さず、そして標準タンパク質と比較して１４０ｋＤの周辺に広がった。酵素活性を示すタンパク質バンドを溶出した。濃縮後、電気泳動を、ＳＤＳ−ＰＡＧ上で行った（図４１）。精製したタンパク質バンドは、クロマトグラフィーによって精製したエンドヌクレアーゼト同じ部位で示され、そしてタンパク質の分子量を、およそ７２．４ｋＤと決定した（図３９）。未変性の有孔性の勾配ゲル電気泳動とＳＤＳ−ＰＡＧＥとの結果の比較は、エンドヌクレアーゼがホモダイマーの形態で酵素活性を示すことを明らかにした。
【００８１】
４−４ 精製した酵素の特徴付け
４時間の間全くエンドヌクレアーゼ酵素活性が検出されなかったＵ９３７細胞から核を単離し、基質として使用した。酵素活性の特異性を、１ｍＭのＣａ2+、１ｍＭのＭｇ2+、およびＥＤＴＡを、単離した核を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．０）に添加すること、そして３７℃で１０分間反応させることによって確認した。
【００８２】
Ｕ９３７細胞株から単離した核を基質として使用した場合には、精製した酵素の活性は、Ｍｇ2+の存在下で示され、そしてアポトーシスのインヒビターであるＺｎ2+およびキレート剤であるＥＤＴＡによって完全に阻害された（図４２）。特徴的な酵素活性は、上記の酵素活性のものと一致した。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明のエンドヌクレアーゼは、外来の細菌のＤＮＡを分解し、そして細胞中にＤＮＡフラグメントを取りこむことが可能である。細胞中に取りこまれたＤＮＡは、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを生成するように、細胞内のエンドヌクレアーゼによってプロセシングされ、そして次いで免疫細胞が、抗体の分泌を促進するようにＣｐＧモチーフによって活性化される。従って、本発明のエンドヌクレアーゼは、薬学的な免疫アジュバントとして産業的に価値がある。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１には、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって分析された、本発明のＩＭ９細胞のエンドヌクレアーゼ活性を示す。ＩＭ９細胞溶解物（Ａ）、培地（Ｂ）および無血清にて培養された培地（Ｃ）におけるエンドヌクレアーゼ活性を、ゲル内システムで検出した。ウシＤＮアーゼＩ（レーン）および培養培地エンドヌクレアーゼ活性（レーン２）を比較した（Ｄ）。
【図２】図２には、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって分析された、ＤＮアーゼＩ（Ａ）およびＩＭ９培養培地（Ｂ）のエンドヌクレアーゼ活性を示す。
【図３】図３には、抗−ウシＤＮアーゼＩ抗体による、エンドヌクレアーゼ活性の免疫沈降を示す。免疫沈降（ＩＰ）後の上清におけるエンドヌクレアーゼ活性を、「材料および方法」に記載したとおりＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって、示した抗血清処理について評価した。Ａ，10％ＦＢＳ培地およびヒト血清；Ｂ，ＩＭ９細胞培養培地。
【図４】図４には、アクチノマイシンＤでのＩＭ９細胞の前処理と、エンドヌクレアーゼの分泌を示す。本発明の細胞溶解物（Ａ）および培養培地（Ｂ）におけるエンドヌクレアーゼ活性を、前処理後に、示した培養期間分析した。
【図５】図５には、本発明の免疫細胞系におけるエンドヌクレアーゼ活性の比較分析を示す。各細胞系の溶解物（Ａ）および培養培地（Ｂ）におけるエンドヌクレアーゼ活性を、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって分析した。レーン１，10％ ＦＢＳ含有培地；レーン２，ＩＭ９；レーン３，ＲＰＭＩ1788；レーン４，Molt-4；レーン５，Jurkat；レーン６，Ｕ937。
【図６】図６には、ＩＦＮ−γまたはＩＦＮ−1βで処理された、本発明のＩＭ９細胞培養培地および細胞溶解物の、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって分析されたエンドヌクレアーゼ活性を示す。ＩＭ９細胞は、10 単位/mlのＩＦＮ−γまたはＩＦＮ−1βで、示した培養時間処理された。対照，10％ ＦＢＳを含有するＲＰＭ 16-40培地で12時間の、ＩＭ９培養培地。
【図７】図７には、本発明のエンドヌクレアーゼ活性に対する至適ｐＨを示す。
【図８】図８には、本発明のエンドヌクレアーゼ活性に対する二価陽イオン要求性を示す。Ａ，酵素は、20 mM Tris-ＨＣｌ，ｐＨ 7.0 中、示した濃度のＣａ2+および／またはＭｇ2+の存在下または非存在下に10分間、37にて、100 ngのプラスミドＤＮＡと反応させられた、Ｂ，酵素活性は、10 mMのＭｇ2+の存在下に180分間、許容した。
【図９】図９には、ＴＰＡ、ＬＰＳ、およびＣＨＸで処理されたＵ937細胞の成長曲線を示す。Ｕ937細胞は、ＴＰＡ（10 ng/ml）、ＬＰＳ（1 ng/ml）、およびＣＨＸ（10 /ml）で、示した時間処理した。細胞数および生存度は、培養時間中に血球計数器で、トリパンブルー除去によって評価した。
【図１０】図１０には、Ｕ937細胞におけるエンドヌクレアーゼの、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって分析されたＴＰＡ濃度依存性の合成および分泌を示す。細胞溶解物（Ａ）および培養培地（Ｂ）は、示したＴＰＡ濃度にて24時間インキュベートすることにより調製した。
【図１１】図１１には、ＴＰＡで処理されたＵ937細胞溶解物および培養培地の、ゲル内システムによって分析されたエンドヌクレアーゼ活性を示す。Ｕ937細胞は、示した培養時間、10 ng/ml ＴＰＡで処理した。
【図１２】図１２には、ＬＰＳで処理されたＵ937細胞溶解物および培養培地のエンドヌクレアーゼ活性を示す。細胞溶解物（Ａ）および培地（Ｂ）におけるエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥにより、1 ng/mlのＬＰＳ処理後、示した培養時間に分析した。
【図１３】図１３には、刺激因子で処理されたＵ937細胞のエンドヌクレアーゼ活性を示す（レーン１，10％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ1640 培地にて48時間のＵ937細胞培養物；レーン２，48時間ＴＰＡ（10 ng/ml）処理；レーン３，24時間ＬＰＳ（1 ng/ml）処理；およびレーン４，12時間ＣＨＸ（10 /ml）処理）。
【図１４】図１４には、自己消化法による、ＩＭ９細胞から単離された核におけるエンドヌクレアーゼ活性を示す（Ａ，示した濃度のＣａ2+および／またはＭｇ2+の存在下または単独で37℃にて２時間、核をインキュベートした；Ｂ，ヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化の阻害；ＣおよびＤ，10 mM Ｍｇ2+（Ｃ）または10 mM Ｃａ2+（Ｄ）の存在下に37℃にて示したとおり0〜240分間、核をインキュベートした；ならびにマーカー、1 kb ラダー）。
【図１５】図１５には、ＣＨＸ処理によるＩＭ９細胞のアポトーシス細胞死を示す（Ａ，ＣＨＸ（10 /ml）で処理されたＩＭ９細胞からのＤＮＡの1.8％アガロースゲル電気泳動；未処理（Ｂ）およびＣＨＸで処理された（Ｃ）ＩＭ９細胞を24時間培養して遠心分離調製物をライト−ギムザで染色した）。
【図１６】図１６には、本発明の、ＤＮＡ−未変性−ＰＡＧＥによって分析されたＩＭ９細胞溶解物および核のエンドヌクレアーゼ活性を示す。エンドヌクレアーゼ活性は、示した時間、10 ug/ml ＣＨＸで処理されたＩＭ９細胞溶解物にて培養時間中（Ａ）、細胞溶解物（Ｂ）および核（Ｃ）で検出した。
【図１７】図１７には、本発明のエンドヌクレアーゼ活性に対する二価陽イオンの要求性を示す。エンドヌクレアーゼは核から単離し、そして酵素活性は、反応産物を1％アガロースゲルで解析することにより定量した。
【図１８】図１８には、本発明のエンドヌクレアーゼによる、プラスミドＤＮＡの分解の時間経過を示す。10％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地（Ａ）、無血清のＩＭ９細胞培養培地（Ｂ）および10％ ＦＢＳを含有するＩＭ９細胞培養物（Ｃ）のエンドヌクレアーゼ活性は、反応産物を1％アガロースゲルで解析することにより評価した。
【図１９】図１９には、E. coli ＤＮＡ、ＩＭ９細胞ＤＮＡ、およびサケ精子ＤＮＡでの、本発明のエンドヌクレアーゼ反応の産物を示す。
【図２０】図２０には、ＩＭ９細胞内に取り込まれた外来性ＤＮＡのサザンブロット分析を示す。エンドヌクレアーゼ反応産物の100〜200塩基対の断片を、プローブとして使用した。ブロットは、ランダム−プライミング法によって調製されたプローブで、55℃にて６時間ハイブリダイズさせた。
【図２１】図２１には、本発明のエンドヌクレアーゼ反応によって得られるＤＮＡ断片のクローニングおよび配列決定のための構築スキームを示す。
【図２２】図２２には、本発明のＩＭ９細胞における細菌ＤＮＡのプロセシングによって生産されたＤＮＡ断片を示す。
【図２３】図２３には、本発明のＵ937細胞における細菌ＤＮＡのプロセシングによって生産されたＤＮＡ断片を示す（Ａ，10％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ1640 培地にて48時間のＵ937細胞培養後のラベルされたＤＮＡの取り込み；およびＢ，ＴＰＡ（10 ng/ml）12時間処理後のラベルされたＤＮＡの取り込み）。
【図２４】図２４には、本発明のエンドヌクレアーゼ反応産物配列の検出を示す。エンドヌクレアーゼ反応産物は、「材料および方法」に記載のとおり合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。
【図２５】図２５には、細菌ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドにおけるＣｐＧモチーフによるＩｇＭ分泌の誘導を示す。ＩＭ９細胞は、オリゴヌクレオチド（25 /ml）または E. coli ＤＮＡ（25 /ml）で、24時間刺激した。
【図２６】図２６には、本発明の基質としてＥＣ１ ＰＣＲ産物を使用した、エンドヌクレアーゼ反応の産物を示す。
【図２７】図２７には、本発明の基質としてＥＣ２ ＰＣＲ産物を使用した、エンドヌクレアーゼ反応の産物を示す。
【図２８】図２８には、本発明の基質としてＨＣ１ ＰＣＲ産物を使用した、エンドヌクレアーゼ反応の産物を示す。
【図２９】図２９には、Ｚｎ2+およびＥＤＴＡによるエンドヌクレアーゼ活性の阻害を示す。
【図３０】図３０には、本発明に従い、示されたＩＭ９細胞培養培地量を用いて反応させた、ＥＣ１ ＰＣＲ産物からのエンドヌクレアーゼ反応の産物を示す。
【図３１】図３１には、本発明に従い、示された時間、ＥＣ１ ＰＣＲ産物と反応させた、エンドヌクレアーゼからの産物を示す。
【図３２】図３２には、ＥＣ２ ＰＣＲ産物（157 bp）を、AluIによって切断された短いＤＮＡ断片と比較する、エンドヌクレアーゼ活性を示す（レーン１，３２ＰでラベルされたＰＣＲ産物；レーン２，レーン１のエンドヌクレアーゼ消化産物；レーン３，３２Ｐでラベルされた、AluIで切断された短いＤＮＡ断片；レーン４，レーン３の30分反応物；レーン５，レーン３の１時間反応物；レーン６，レーン３の２時間反応物）。
【図３３】図３３には、エンドヌクレアーゼが分泌されたＩＭ９細胞における3'-エキソヌクレアーゼ活性の同定を示す（レーン１，ラベルされたＰＣＲ産物；レーン２，ラベルされた二本鎖ＤＮＡでのエンドヌクレアーゼ反応の産物；レーン３，ラベルされた一本鎖ＤＮＡでのエンドヌクレアーゼ反応の産物）。
【図３４】図３４には、エンドヌクレアーゼ反応産物と、ＤＮアーゼＩ反応産物を用いたＩＭ９細胞によるプロセシング産物との間の比較を示す（レーン１，ラベルされたＰＣＲ産物；レーン２，ＩＭ９細胞培養培地の反応産物；レーン３，ＩＭ９細胞におけるプロセシング産物；レーン４，ＤＮアーゼＩ反応産物；パネルＡ，ＴＢＥ緩衝液における、20％未変性−ＰＡＧＥ；パネルＢ，ＴＢＥ緩衝液における、変性−尿素（8.3 M）−ＰＡＧＥ）。
【図３５】図３５には、Ｓ１ヌクレアーゼ反応によるエンドヌクレアーゼ反応に由来する一本鎖断片の同定を示す（Ａ，ＴＢＥ緩衝液における、20％未変性−ＰＡＧＥ；Ｂ，ＴＢＥ緩衝液における、20％ 変性−尿素（8.3 M）−ＰＡＧＥ）。
【図３６】図３６には、Mono Ｓ ＨＲ５/５イオン交換クロマトグラフィーによる、ＩＭ９細胞培養培地のクロマトグラフィー分画を示す（Ａ，ＩＭ９培養培地のイオン交換プロファイル；Ｂ，1％アガロースゲルにて反応産物を解析することにより、示された保持時間に酵素活性を定量した）。
【図３７】図３７には、RESOURCE PHE 疎水性相互作用クロマトグラフィーによるエンドヌクレアーゼの精製を示す（Ａ，イオン交換クロマトグラフィーから得られた活性画分の疎水性相互作用プロファイル；Ｂ，1％アガロースゲルにて反応産物を解析することにより、ピーク画分にて酵素活性を定量した）。
【図３８】図３８には、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製されたエンドヌクレアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図３９】図３９には、精製されたエンドヌクレアーゼの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量定量を示す（マーカータンパク質は、ミオシン（200 kD）、β−ガラクトシダーゼ（116.3 kD）、ホスホリラーゼＢ（97.4 kD）、ウシ血清アルブミン（62.2 kD）およびオボアルブミン（45 kD））。
【図４０】図４０には、活性を含む、Mono Ｓクロマトグラフィー画分の未変性−ポア勾配ゲル電気泳動（4〜15％）（Ｂ）およびアガロースゲル電気泳動（Ａ）でパネルＢのゲルバンドから溶出されたタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を示す。
【図４１】図４１には、イオン交換クロマトグラフィーによる精製エンドヌクレアーゼのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および活性バンドの未変性勾配ＰＡＧＥゲル溶出を示す。
【図４２】図４２には、単離されたＵ937細胞中の、精製されたエンドヌクレアーゼ活性に対する陽イオンの効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＢリンパ芽球ＩＭ９細胞株からなる免疫細胞から分泌され、そして外来因子として細菌のＤＮＡを認識し、そしてそれを免疫応答に関与するＣｐＧモチーフを含む約１０ｂｐの一本鎖のオリゴヌクレオチドを生じるようにプロセシングする酵素活性を備えている、エンドヌクレアーゼ酵素。
【請求項２】
１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール １３−アセテートで処理したＵ９３７細胞株からなる免疫細胞から分泌され、そして外来因子として細菌のＤＮＡを認識し、そしてそれを免疫応答に関与するＣｐＧモチーフを含む約１０ｂｐの一本鎖のオリゴヌクレオチドを生じるようにプロセシングする酵素活性を備えている、エンドヌクレアーゼ酵素。
【請求項３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって７２．４ｋＤの分子量を有する、請求項１または２に記載のエンドヌクレアーゼ酵素。
【請求項４】
Ｍｇ2+−依存性の酵素活性を示す、請求項１または２に記載のエンドヌクレアーゼ酵素。
【請求項５】
６．６から７．６の最適なｐＨを有する、請求項１または２に記載のエンドヌクレアーゼ酵素。
【請求項６】
未変性のＰＡＧＥによる酵素活性の移動度の距離が、ＤＮａｓｅＩのものとは明らかに異なる、請求項１または２に記載のエンドヌクレアーゼ酵素。
【請求項７】
ヒトのＢ−リンパ芽球ＩＭ９細胞株またはＴＰＡで処理した骨髄性Ｕ９３７細胞株を、エンドヌクレアーゼを産生するための適切な培地上で培養する工程、および細胞溶解物または該培養培地から該エンドヌクレアーゼを単離する工程を包含する、請求項１または請求項２に記載のエンドヌクレアーゼを産生するための、プロセス。
【請求項８】
請求項１から請求項６の何れか１項に記載のエンドヌクレアーゼ酵素による細菌のＤＮＡの処理によって産生されるＣｐＧモチーフを有する、約１０ｂｐの一本鎖のオリゴヌクレオチドを含有する、免疫アジュバント。
【請求項１】
ヒトＢリンパ芽球ＩＭ９細胞株からなる免疫細胞から分泌され、そして外来因子として細菌のＤＮＡを認識し、そしてそれを免疫応答に関与するＣｐＧモチーフを含む約１０ｂｐの一本鎖のオリゴヌクレオチドを生じるようにプロセシングする酵素活性を備えている、エンドヌクレアーゼ酵素。
【請求項２】
１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール １３−アセテートで処理したＵ９３７細胞株からなる免疫細胞から分泌され、そして外来因子として細菌のＤＮＡを認識し、そしてそれを免疫応答に関与するＣｐＧモチーフを含む約１０ｂｐの一本鎖のオリゴヌクレオチドを生じるようにプロセシングする酵素活性を備えている、エンドヌクレアーゼ酵素。
【請求項３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって７２．４ｋＤの分子量を有する、請求項１または２に記載のエンドヌクレアーゼ酵素。
【請求項４】
Ｍｇ2+−依存性の酵素活性を示す、請求項１または２に記載のエンドヌクレアーゼ酵素。
【請求項５】
６．６から７．６の最適なｐＨを有する、請求項１または２に記載のエンドヌクレアーゼ酵素。
【請求項６】
未変性のＰＡＧＥによる酵素活性の移動度の距離が、ＤＮａｓｅＩのものとは明らかに異なる、請求項１または２に記載のエンドヌクレアーゼ酵素。
【請求項７】
ヒトのＢ−リンパ芽球ＩＭ９細胞株またはＴＰＡで処理した骨髄性Ｕ９３７細胞株を、エンドヌクレアーゼを産生するための適切な培地上で培養する工程、および細胞溶解物または該培養培地から該エンドヌクレアーゼを単離する工程を包含する、請求項１または請求項２に記載のエンドヌクレアーゼを産生するための、プロセス。
【請求項８】
請求項１から請求項６の何れか１項に記載のエンドヌクレアーゼ酵素による細菌のＤＮＡの処理によって産生されるＣｐＧモチーフを有する、約１０ｂｐの一本鎖のオリゴヌクレオチドを含有する、免疫アジュバント。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【公開番号】特開２００９−６０９０９（Ｐ２００９−６０９０９Ａ）
【公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２４４２５５（Ｐ２００８−２４４２５５）
【出願日】平成２０年９月２４日（２００８．９．２４）
【分割の表示】特願２０００−５５０９７７（Ｐ２０００−５５０９７７）の分割
【原出願日】平成１０年５月３０日（１９９８．５．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １９９７年１２月３１日 「免疫細胞の新たなエンドニュークレアゼ（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）に対する生物科学的特性と機能の研究」に文書をもって発表
【出願人】（５０８１５６５０２）シージェイ第一製糖株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２４日（２００８．９．２４）
【分割の表示】特願２０００−５５０９７７（Ｐ２０００−５５０９７７）の分割
【原出願日】平成１０年５月３０日（１９９８．５．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １９９７年１２月３１日 「免疫細胞の新たなエンドニュークレアゼ（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）に対する生物科学的特性と機能の研究」に文書をもって発表
【出願人】（５０８１５６５０２）シージェイ第一製糖株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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