全血試料の前処理方法及び核酸増幅方法
【課題】全血試料中の核酸を増幅するにあたって夾雑物を簡単に除去できる、核酸増幅のための全血試料の前処理方法、及び、全血試料中の核酸を効率良く増幅させることができる核酸増幅方法を提供する。
【解決手段】全血試料中の核酸を増幅するための前処理方法であって、(i)全血試料を希釈する工程と、(ii)希釈された全血試料を熱処理する工程と、(iii)熱処理後の試料を遠心分離する工程とを含む前処理方法。
この前処理により得られた遠心上清をそのまま用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅反応。
【解決手段】全血試料中の核酸を増幅するための前処理方法であって、(i)全血試料を希釈する工程と、(ii)希釈された全血試料を熱処理する工程と、(iii)熱処理後の試料を遠心分離する工程とを含む前処理方法。
この前処理により得られた遠心上清をそのまま用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅反応。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全血試料中の核酸増幅方法及びそのための全血試料の前処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
PCR法は、核酸の変性工程、プライマーのアニーリング工程及びDNAポリメラーゼによるプライマーの伸長反応工程を含む一連の操作を繰り返すことにより、特定の核酸配列を増幅する方法である。これらの工程を含む操作を多数回繰り返すことにより、特定配列のコピー数を著しく増大させることができる。PCR法により、従来非常に困難であった生物試料中の極微量な核酸の検出が可能となって、遺伝子解析が飛躍的に容易になった。またPCR法は、感染症や遺伝子疾患などのDNAまたはRNAレベルでの診断に利用されている。
【０００３】
しかし、通常の生物試料中にはタンパク質、脂質、糖質などの夾雑物質が大量に含まれており、これらが核酸の増幅や検出を妨げる恐れがある。従って、生物試料中の核酸を増幅するに当たっては、予め生物試料中のこれらの夾雑物質を除去する操作、又は生物試料から核酸を抽出し、精製する操作が必要となる。
核酸の抽出方法としては、フェノールや水酸化ナトリウムを用いる方法が知られているが、これらの物質は取り扱いに注意を要し、また廃棄方法が煩雑である。さらに、これらの方法は、操作に技術的な熟練を要し、試料中の核酸の回収量が一定しない場合も多く、再現性よく実施するのは困難な方法である。
【０００４】
核酸の抽出方法としては、生物試料中の核酸を磁性シリカ粒子に結合させた後、磁気を利用して、核酸が結合した粒子を分離及び洗浄し、核酸を回収する方法も知られている(特開平9-19292号公報)。この方法は有機溶媒や水酸化ナトリウムのような取り扱いに注意を要する物質を使用しないが、抽出効率は検体の種類の影響を受け易く、血液検体、特に全血検体のように夾雑物質を多く含む検体からの核酸の回収は困難である。
【０００５】
生物試料中の核酸の増幅方法であって有機溶媒などを使用しない簡単な方法としては、血清を熱処理した後、核酸増幅反応を行う方法が知られている（特許文献１）。この方法は、肝炎、エイズなどの原因ウィルス、細菌、細胞などを含む可能性のある血清試料を熱処理することにより、血液成分を凝固させた後、遠心上清を直接核酸増幅反応に供する方法である。
【０００６】
しかし、特許文献１に記載の方法は夾雑物質の少ない血清試料を対象としており、全血からの簡便な核酸増幅方法は知られていない。
【特許文献１】特開平８−１７３１９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、全血試料中の核酸を増幅するにあたって夾雑物を簡単に除去できる、核酸増幅のための全血試料の前処理方法、及び、全血試料中の核酸を効率良く増幅させることができる核酸増幅方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、全血試料を水又は水溶液等で希釈した後、熱処理し、凝固した夾雑物を遠心分離により除去するという簡便な方法により核酸増幅を阻害する物質を検体から除去でき、効率的に核酸を増幅させ得ることを見出した。
【０００９】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の方法を提供する。
【００１０】
項１． 全血試料中の核酸を増幅するための前処理方法であって、
(i) 全血試料を希釈する工程と、
(ii) 希釈された全血試料を熱処理する工程と、
(iii) 熱処理後の試料を遠心分離する工程と
を含む全血試料の前処理方法。
【００１１】
項２． 工程(i)における全血試料の希釈溶媒が、水または水溶液である項１に記載の方法。
【００１２】
項３． 工程(i)において希釈溶媒として使用する水溶液が、塩化カリウム、塩化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、及び塩化アンモニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む項１又は２に記載の方法。
【００１３】
項４． 工程(ii)における熱処理温度が６５〜１００℃である項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００１４】
項５． 工程(iii)において、５００〜２００００gで遠心分離を行う項１〜４のいずれかに記載の方法。
【００１５】
項６． 項１〜５のいずれかに記載の前処理方法において遠心分離により得られる上清を用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅方法。
【００１６】
項７． 核酸増幅方法がPCR法である項６に記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、全血試料について非常に簡単な前処理を行うだけで、効率的にその中に含まれる核酸を増幅させることができる。本発明の方法は、取り扱いに注意を要する試薬を用いることなく、また試料に依存せず安定的に夾雑物質を除去して効率良く核酸を増幅させることができる。また、本発明によれば、操作手順が少ないため環境中の細菌、取扱者のDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼなどのコンタミネーションが生じにくい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明の全血試料中の核酸増幅のための前処理方法は、
(i) 全血試料を希釈する工程と、
(ii) 希釈された全血試料を熱処理する工程と、
(iii) 熱処理後の試料を遠心分離する工程と
を含む方法である。
【００２０】
また本発明の核酸増幅方法は、上記前処理方法において遠心分離により得られた上清を用いて核酸増幅反応を行う方法である。即ち、本発明の全血試料の核酸増幅方法は、
(i) 全血試料を希釈する工程と、
(ii) 希釈された全血試料を熱処理する工程と、
(iii) 熱処理後の試料を遠心分離する工程と、
(iv) 遠心処理後の上清を用いて核酸増幅反応を行う工程と
を含む方法である。
全血試料
本発明における全血試料の由来は特に限定されない。本発明方法は、生物種及び固体差を問わず、効率的にその中に含まれる核酸を効率的かつ再現性よく増幅できる点に特長がある。
工程(i)
工程(i)では全血試料を希釈する。前述した特許文献１は、血清試料を加熱処理する方法を開示している。しかし、全血試料を熱処理すると多量に含まれる血液成分が凝固してしまい、試料の吸引が困難になり以後の各工程を円滑に進行させ難くなる。このため、本発明方法では、熱処理の前に、全血試料を希釈する。
【００２１】
希釈倍率は、７倍程度までが好ましく、１.５〜３倍程度がより好ましい。上記希釈倍率の範囲であれば、その後の熱処理によっても吸引が困難にならず、しかも実用的な時間内の核酸増幅反応により電気泳動などの汎用の方法で核酸を検出できる程度に試料中の核酸を増幅させることができる。ヒト全血試料を上記範囲の倍率で希釈することにより、ゲノムDNAのコピー数を１μl当たり１０００〜５０００コピー程度に調整することができる。
【００２２】
全血試料の希釈は、通常水又は水溶液を用いて行えばよい。水溶液は核酸増幅反応を阻害しないものであれば特に限定されない。また、核酸増幅を阻害しない限度で有機溶媒や界面活性剤が含まれていてもよく、懸濁液であってもよい。
【００２３】
水溶液の一例として緩衝液を挙げることができる。緩衝液は、核酸を用いた実験に一般に使用されているものであればよく、特に限定されない。また、pHは６〜９程度であればよい。このような緩衝液として、例えば、TE緩衝液（トリス塩酸−EDTA)、TNE緩衝液（トリス−塩化ナトリウム−EDTA）、SSC緩衝液（クエン酸ナトリウム−塩化ナトリウム）、PBS緩衝液（塩化ナトリウム−塩化カリウム−リン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素カリウム）、STE緩衝液（塩化ナトリウム−トリス−EDTA）、TNM緩衝液（トリス−塩化ナトリウム−塩化マグネシウム）などを例示できる。
【００２４】
希釈に用いる水溶液で好ましいのは、塩化カリウム、塩化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、塩化アンモニウムのいずれか一つまたは二つ以上を含むものである。さらに好ましくは、塩化カリウム、塩化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンのいずれか一つまたは二つ以上を含むものである。
【００２５】
上記の水溶液濃度は、全血試料を希釈したときに、溶質分子が10〜1000mM程度含まれるような濃度であることが好ましく、溶質分子が100〜500mM程度含まれるような濃度であることがより好ましい。
本発明方法における全血試料の希釈液として最も好ましいのは、全血試料を希釈したときに、塩化カリウム、塩化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンのいずれか一つまたは二つ以上が、各々100〜500mM程度含まれるような濃度の水溶液である。
工程(ii)
希釈後の全血試料を熱処理する。熱処理温度は、６５〜１００℃程度が好ましく、７５〜１００℃程度がより好ましく、９０〜１００℃程度がさらにより好ましい。熱処理により、タンパク質等の夾雑物質を凝固させるとともに、核酸を含む細胞の膜を破壊し核酸を溶出させることができる。上記温度範囲であれば、夾雑物質の凝固及び細胞の膜の破壊を十分に行うことができる。
【００２６】
熱処理時間は、１秒間〜６０分間程度が好ましく、５分間〜１０分間程度がより好ましい。
工程(iii)
次いで、試料を遠心分離する。遠心分離時の加速度は、例えば５００〜２００００g程度とすればよく、特に７０００〜２００００g程度が好ましい。上記範囲であれば、タンパク質、脂質、糖質などの夾雑物を十分に沈殿させることができるとともに、核酸を上清に残し、その結果核酸と夾雑物とを十分に分離することができる。
【００２７】
また遠心時間は、１〜２０分間程度とすればよく、５〜１０分間が好ましい。
工程(iv)
本発明の核酸増幅方法においては、遠心上清をそのまま用いて核酸増幅反応を行う。全血試料中には、通常DNA及びRNAの双方が含まれる。全血中にはウィルスや細菌などが存在する場合もあるため、DNAとしては、２本鎖DNAの他に１本鎖DNAが含まれる場合もあり、ゲノムDNAの他にｃDNAなどが含まれる場合もある。またRNAとしては、通常ｔ−RNA、ｍ−RNA、ｒ−RNAなどが含まれる。
【００２８】
本発明方法に従い前処理した全血試料はどのような反応によっても核酸を増幅させることができる。公知の核酸増幅反応としては、PCR法（polymerase chain reaction；米国特許4,683,195号)、LCR法（ligase chain reaction;欧州特許出願320,308号）、SDA法（strand displacement amplification；特公平7-114718号）、LAMP法（Loop-Mediated Isothermal Amplification;）、ICAN法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids;）などを挙げることができる。
【００２９】
本発明において、核酸増幅反応の代表例であるPCRにより核酸増幅を行う場合について説明する。プライマーセット、DNAポリメラーゼ及び４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸および反応緩衝液を含む増幅反応液に対して、遠心上清を通常２〜１０容量％程度添加する。
【００３０】
プライマー、DNAポリメラーゼ、緩衝液、熱サイクル条件などは通常のPCRの条件とすればよい。例えばプライマーは、通常10〜50bp程度、好ましくは15〜30bp程度の長さのものを使用すればよい。増幅反応液に含まれるプライマー量は0.1〜100pmol程度、好ましくは１〜40pmol程度とすればよい。DNAポリメラーゼとしては、KOD DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼなどを使用できる。
【００３１】
緩衝液としては、例えばトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液（pH７.５〜９程度）を使用することができ、これにMgCl2 、KClなどの無機塩や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤、BSAなどのタンパク質を含んでいてもよい。
実施例
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
ヒト全血を水を用いて２倍に希釈した。この希釈液を１００℃で１０分間加熱処理した後、１００００rpmで１０分間遠心分離を行った。
【００３２】
遠心上清１μlを下記のPCR増幅液２５μｌに添加し、PCRを行った。
【００３３】
PCRプライマーとしては、ヒトのβ-globin領域内を増幅させることができるオリゴヌクレオチドＦ及びオリゴヌクレオチドＲを用いた。これらのプライマーの塩基配列は次の通りである。この２種類のプライマーを用いたPCRにより、プライマー対応部分を含めて４０８bpの増幅産物を得ることができる。
・オリゴヌクレオチド Ｆ：
5'-GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3'（配列番号１）
・オリゴヌクレオチドＲ：
5'-GGA AAA TAG ACC AAT AGG CAG-3'（配列番号２）
増幅反応液
以下の試薬を混合し水でメスアップして25μlの反応液を調製した。
【００３４】
オリゴヌクレオチド F 12.5pmol
オリゴヌクレオチド R 12.5pmol
×10 rTaq緩衝液 2.5μl
2mM dNTP 2.5μl
25mM MgCl2 1.5μl
rTaq DNAポリメラーゼ(東洋紡績社製) 0.75U
反応条件-１
94℃で１分15秒間
94℃で45秒間、55℃で45秒間、72℃で １分間のサイクルを30サイクル
72℃で５分間
反応条件-２
94℃で１分15秒間
94℃で45秒間、55℃で45秒間、72℃で １分間のサイクルを35サイクル
72℃で５分間
上記条件でのPCR終了後、反応液10μｌを用い、２％アガロース及び0.05μl/ml臭化エチジウムを含むゲルで電気泳動を行い、紫外線照射によりDNAバンドを検出した。
比較例１
実施例１において、前処理後の試料１μlに代えて、ヒト全血０.５μlをそのままPCR反応に供した他は、実施例１と同様の操作を行った。即ち、希釈、熱処理及び遠心分離のいずれも行わなかった。
比較例２
実施例１において、ヒト全血を３０００rpmで１０分間遠心分離し、その上清０.５μlをPCR反応に供した他は、実施例１と同様の操作を行った。即ち、希釈及び熱処理は行わなかった。
比較例３
実施例１において、ヒト全血を１００℃で１０分間加熱し、１００００rpmで１０分間遠心分離し、その上清０.５μlをPCR反応に供した他は、実施例と同様の操作を行った。即ち、希釈は行わなかった。
比較例４
実施例１において、ヒト全血を水で２倍に希釈し、１００００rpmで１０分間遠心分離し、上清１μlをPCR反応に供した他は、実施例１と同様の操作を行った。即ち、熱処理は行わなかった。
比較例５
実施例１において、ヒト全血を水で２倍に希釈し、１００℃で１０分間加熱した液１μlをPCR反応に供した他は、実施例１と同様の操作を行った。即ち、遠心分離は行わなかった。
【００３５】
実施例１及び比較例１〜５の結果を図１に示す。
【００３６】
レーン１〜７はPCRを30サイクル行った結果であり、レーン８〜14は35サイクル行った結果である。
レーン１：精製されたヒトDNA のβ-globin領域内の配列をオリゴヌ
クレオチドF及びRで増幅させたコントロールDNA の結果
レーン２：比較例１（希釈、熱処理、遠心分離を行わない）
レーン３：比較例２（希釈、熱処理を行わない）
レーン４：比較例３（希釈を行わない）
レーン５：比較例４（熱処理を行わない）
レーン６：比較例５（遠心分離を行わない）
レーン７：実施例１
レーン８：精製されたヒトDNA のβ-globin領域内の配列をオリゴヌ
クレオチドF及びRで増幅させたコントロールDNA の結果
レーン９：比較例１（希釈、熱処理、遠心分離を行わない）
レーン１０：比較例２（希釈、熱処理を行わない）
レーン１１：比較例３（希釈を行わない）
レーン１２：比較例４（熱処理を行わない）
レーン１３：比較例５（遠心分離を行わない）
レーン１４：実施例１
上記PCR条件では、全血サンプルに熱処理を全く行わずにPCRに供したものについては増幅バンドを確認することはできなかった。また、熱処理を行っても遠心分離を行わずにPCRに供したものについても低濃度の増幅バンドしか確認できなかった。希釈、熱処理、遠心分離を行ってPCRに供したものについては増幅バンドを確認することができた。このことから、全血サンプルを熱処理し、遠心処理することが増幅バンドの検出に必要であることが分かる。
【００３７】
また全血サンプルを希釈せずに熱処理と遠心分離のみを行ったものについても、増幅バンドを確認できるが、遠心上清の量が非常に少なく、作業効率が急激に低下する。また、同一検体を複数回PCRに使用したい場合、使用回数が著しく制限されてしまう。よって、作業の利便性を損なわないために、また核酸を含有する上清の量を確保するためには、全血サンプルの希釈が必要である。
実施例２〜１４
実施例１において、全血サンプルの希釈倍率を、それぞれ1.1, 1.3, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10倍とした他は、実施例１と同様の操作を行った。
【００３８】
図２および３は、実施例２〜１４の結果を示している。レーン１５は、精製されたヒトDNAのβ-globin領域内の配列をオリゴヌクレオチドF及びRで増幅させたコントロールDNAの結果を示す（３０サイクル）。レーン１６は希釈を行わなかった他は実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３０サイクル）。レーン１７〜２９は、全血サンプルの希釈倍率を、それぞれ1.1, 1.3, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10倍とした他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３０サイクル）。
【００３９】
レーン３０は、精製されたヒトDNAのβ-globin領域内の配列をオリゴヌクレオチドF及びRで増幅させたコントロールDNAの結果を示す（３５サイクル）。レーン３１は希釈を行わなかった他は実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３５サイクル）。レーン３２〜４４は、全血サンプルの希釈倍率を、それぞれ1.1, 1.3, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10倍とした他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３５サイクル）。
全血サンプルの希釈に水を用いた場合は、反応条件-１（３０サイクル）では１.３倍程度、反応条件-２（３５サイクル）では４倍程度まで良好な増幅バンドが確認できた（図２、図３）。
実施例１５〜２２
実施例１において、塩化カリウム水溶液を用いて全血サンプルを希釈した。そのとき、全血サンプルと混和された状態での塩化カリウム濃度は250mMで、全血サンプルの希釈倍率を、それぞれ1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8倍とした他は、実施例１と同様の操作を行った（PCR反応条件-2を除く）。
【００４０】
図４は実施例１５〜２２の結果を示している。レーン４５〜５２は、全血サンプルと混和された状態での塩化カリウム濃度は250mMで、全血サンプルの希釈倍率を、それぞれ1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8倍とした他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３０サイクルのみ）
全血サンプルの希釈に塩化カリウム水溶液を用いた場合は、全血サンプルと混和した塩化カリウム水溶液の濃度が２５０mMであるとき、反応条件-１（３０サイクル）でも７倍まで良好な増幅バンドを確認することができた（図４）。
実施例２３〜３０
実施例１において、ヒト全血を塩化カリウム水溶液で２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った。使用した塩化カリウム水溶液の濃度は、0(水)，20, 100, 200, 500, 750, 1000, 2000mMの８種類であった。
【００４１】
図５は実施例２３〜３０の結果を示している。レーン５３〜６０は、0(水)，20, 100, 200, 500, 750, 1000, 2000mMの濃度の塩化カリウム水溶液でヒト全血を２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３０サイクル）。レーン６１〜６８は、0(水)，20, 100, 200, 500, 750, 1000, 2000mMの濃度の塩化カリウム水溶液でヒト全血を２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３５サイクル）。
２０〜２０００mMの塩化カリウム水溶液で２倍に希釈してPCRに供した場合、全血サンプルと混和したときに１００〜１０００mMの塩化カリウムが含まれていると特に良好な増幅バンドを確認できた。この結果は、実施例１５〜２２(図４）の結果と一致する。
実施例３１〜３８
実施例１において、ヒト全血を塩化ナトリウム水溶液で２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った（PCR反応条件-2を除く）。使用した塩化ナトリウム水溶液の濃度は、0(水)，20, 100, 200, 500, 750, 1000, 2000mMの８種類であった。
実施例３９〜４６
実施例１において、ヒト全血をトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン水溶液で２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った（PCR反応条件-2を除く）。使用したトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン水溶液の濃度は、0(水)，20, 100, 200, 500, 750, 1000, 2000mMの８種類であった。
【００４２】
実施例３１〜３８及び実施例３９〜４６の結果を図６に示す。レーン６９〜７６は、0(水)，20, 100, 200, 500, 750, 1000, 2000mMの濃度の塩化ナトリウム水溶液でヒト全血を２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３０サイクルのみ）。レーン７７〜８４は、0(水)，20, 100, 200, 500, 750, 1000, 2000mMの濃度のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン水溶液でヒト全血を２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３０サイクルのみ）。
【００４３】
塩化ナトリウム水溶液、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン水溶液を希釈に用いた場合も、塩化カリウム水溶液を用いた場合と同様であった。
実施例４７〜５０
実施例１において、ヒト全血を５００mMのグアニジン塩酸塩、ホウ酸、塩化アンモニウム、スクロース水溶液で２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った（PCR反応条件-2を除く）。
【００４４】
実施例４７〜５０の結果を図７に示す。レーン８５〜８８は、ヒト全血を５００mMのグアニジン塩酸塩、ホウ酸、塩化アンモニウム、スクロース水溶液で２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３０サイクルのみ）。
【００４５】
ヒト全血を５００mMの塩化アンモニウムで２倍に希釈してPCRに供したものについては良好なバンドを確認することができたが、グアニジン塩酸塩、ホウ酸、スクロース水溶液で希釈したものについては増幅バンドをほとんど確認することができなかった（図７）。
一般に、作業効率を低下させないように希釈倍率を大きくすれば、それにともなって増幅量が少なくなってしまう。しかし、塩化カリウムや塩化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、塩化アンモニウムなどが一つまたは二つ以上含まれる水溶液を用いて希釈を行うことによって、作業効率を低下させることなく、目的配列を検出可能な増幅量を得ることができるようになった。
【００４６】
また、希釈に用いられた水溶液の一部が増幅反応液に持ち込まれることにより増幅反応を阻害することも考えられるが、塩化カリウムや塩化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、塩化アンモニウムを含む水溶液であれば増幅反応にほとんど影響を与えない。
【００４７】
上記実施例の条件で増幅バンドを検出できなかった場合も、PCR反応条件のサイクル数を多くする、マグネシウム濃度やプライマー量、酵素量、アニール温度を変更する、使用するプライマーを変更して増幅領域長を短くする、増幅領域を変更する、Nested-PCRを行うなどの手段を講じることにより電気泳動で増幅バンドを検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ヒト全血中の核酸をPCRにより増幅させた結果を示す電気泳動パターンである。
【図２】ヒト全血中の核酸をPCRにより増幅させた結果を示す電気泳動パターンである。
【図３】ヒト全血中の核酸をPCRにより増幅させた結果を示す電気泳動パターンである。
【図４】ヒト全血中の核酸をPCRにより増幅させた結果を示す電気泳動パターンである。
【図５】ヒト全血中の核酸をPCRにより増幅させた結果を示す電気泳動パターンである。
【図６】ヒト全血中の核酸をPCRにより増幅させた結果を示す電気泳動パターンである。
【図７】ヒト全血中の核酸をPCRにより増幅させた結果を示す電気泳動パターンである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全血試料中の核酸増幅方法及びそのための全血試料の前処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
PCR法は、核酸の変性工程、プライマーのアニーリング工程及びDNAポリメラーゼによるプライマーの伸長反応工程を含む一連の操作を繰り返すことにより、特定の核酸配列を増幅する方法である。これらの工程を含む操作を多数回繰り返すことにより、特定配列のコピー数を著しく増大させることができる。PCR法により、従来非常に困難であった生物試料中の極微量な核酸の検出が可能となって、遺伝子解析が飛躍的に容易になった。またPCR法は、感染症や遺伝子疾患などのDNAまたはRNAレベルでの診断に利用されている。
【０００３】
しかし、通常の生物試料中にはタンパク質、脂質、糖質などの夾雑物質が大量に含まれており、これらが核酸の増幅や検出を妨げる恐れがある。従って、生物試料中の核酸を増幅するに当たっては、予め生物試料中のこれらの夾雑物質を除去する操作、又は生物試料から核酸を抽出し、精製する操作が必要となる。
核酸の抽出方法としては、フェノールや水酸化ナトリウムを用いる方法が知られているが、これらの物質は取り扱いに注意を要し、また廃棄方法が煩雑である。さらに、これらの方法は、操作に技術的な熟練を要し、試料中の核酸の回収量が一定しない場合も多く、再現性よく実施するのは困難な方法である。
【０００４】
核酸の抽出方法としては、生物試料中の核酸を磁性シリカ粒子に結合させた後、磁気を利用して、核酸が結合した粒子を分離及び洗浄し、核酸を回収する方法も知られている(特開平9-19292号公報)。この方法は有機溶媒や水酸化ナトリウムのような取り扱いに注意を要する物質を使用しないが、抽出効率は検体の種類の影響を受け易く、血液検体、特に全血検体のように夾雑物質を多く含む検体からの核酸の回収は困難である。
【０００５】
生物試料中の核酸の増幅方法であって有機溶媒などを使用しない簡単な方法としては、血清を熱処理した後、核酸増幅反応を行う方法が知られている（特許文献１）。この方法は、肝炎、エイズなどの原因ウィルス、細菌、細胞などを含む可能性のある血清試料を熱処理することにより、血液成分を凝固させた後、遠心上清を直接核酸増幅反応に供する方法である。
【０００６】
しかし、特許文献１に記載の方法は夾雑物質の少ない血清試料を対象としており、全血からの簡便な核酸増幅方法は知られていない。
【特許文献１】特開平８−１７３１９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、全血試料中の核酸を増幅するにあたって夾雑物を簡単に除去できる、核酸増幅のための全血試料の前処理方法、及び、全血試料中の核酸を効率良く増幅させることができる核酸増幅方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、全血試料を水又は水溶液等で希釈した後、熱処理し、凝固した夾雑物を遠心分離により除去するという簡便な方法により核酸増幅を阻害する物質を検体から除去でき、効率的に核酸を増幅させ得ることを見出した。
【０００９】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の方法を提供する。
【００１０】
項１． 全血試料中の核酸を増幅するための前処理方法であって、
(i) 全血試料を希釈する工程と、
(ii) 希釈された全血試料を熱処理する工程と、
(iii) 熱処理後の試料を遠心分離する工程と
を含む全血試料の前処理方法。
【００１１】
項２． 工程(i)における全血試料の希釈溶媒が、水または水溶液である項１に記載の方法。
【００１２】
項３． 工程(i)において希釈溶媒として使用する水溶液が、塩化カリウム、塩化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、及び塩化アンモニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む項１又は２に記載の方法。
【００１３】
項４． 工程(ii)における熱処理温度が６５〜１００℃である項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００１４】
項５． 工程(iii)において、５００〜２００００gで遠心分離を行う項１〜４のいずれかに記載の方法。
【００１５】
項６． 項１〜５のいずれかに記載の前処理方法において遠心分離により得られる上清を用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅方法。
【００１６】
項７． 核酸増幅方法がPCR法である項６に記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、全血試料について非常に簡単な前処理を行うだけで、効率的にその中に含まれる核酸を増幅させることができる。本発明の方法は、取り扱いに注意を要する試薬を用いることなく、また試料に依存せず安定的に夾雑物質を除去して効率良く核酸を増幅させることができる。また、本発明によれば、操作手順が少ないため環境中の細菌、取扱者のDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼなどのコンタミネーションが生じにくい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明の全血試料中の核酸増幅のための前処理方法は、
(i) 全血試料を希釈する工程と、
(ii) 希釈された全血試料を熱処理する工程と、
(iii) 熱処理後の試料を遠心分離する工程と
を含む方法である。
【００２０】
また本発明の核酸増幅方法は、上記前処理方法において遠心分離により得られた上清を用いて核酸増幅反応を行う方法である。即ち、本発明の全血試料の核酸増幅方法は、
(i) 全血試料を希釈する工程と、
(ii) 希釈された全血試料を熱処理する工程と、
(iii) 熱処理後の試料を遠心分離する工程と、
(iv) 遠心処理後の上清を用いて核酸増幅反応を行う工程と
を含む方法である。
全血試料
本発明における全血試料の由来は特に限定されない。本発明方法は、生物種及び固体差を問わず、効率的にその中に含まれる核酸を効率的かつ再現性よく増幅できる点に特長がある。
工程(i)
工程(i)では全血試料を希釈する。前述した特許文献１は、血清試料を加熱処理する方法を開示している。しかし、全血試料を熱処理すると多量に含まれる血液成分が凝固してしまい、試料の吸引が困難になり以後の各工程を円滑に進行させ難くなる。このため、本発明方法では、熱処理の前に、全血試料を希釈する。
【００２１】
希釈倍率は、７倍程度までが好ましく、１.５〜３倍程度がより好ましい。上記希釈倍率の範囲であれば、その後の熱処理によっても吸引が困難にならず、しかも実用的な時間内の核酸増幅反応により電気泳動などの汎用の方法で核酸を検出できる程度に試料中の核酸を増幅させることができる。ヒト全血試料を上記範囲の倍率で希釈することにより、ゲノムDNAのコピー数を１μl当たり１０００〜５０００コピー程度に調整することができる。
【００２２】
全血試料の希釈は、通常水又は水溶液を用いて行えばよい。水溶液は核酸増幅反応を阻害しないものであれば特に限定されない。また、核酸増幅を阻害しない限度で有機溶媒や界面活性剤が含まれていてもよく、懸濁液であってもよい。
【００２３】
水溶液の一例として緩衝液を挙げることができる。緩衝液は、核酸を用いた実験に一般に使用されているものであればよく、特に限定されない。また、pHは６〜９程度であればよい。このような緩衝液として、例えば、TE緩衝液（トリス塩酸−EDTA)、TNE緩衝液（トリス−塩化ナトリウム−EDTA）、SSC緩衝液（クエン酸ナトリウム−塩化ナトリウム）、PBS緩衝液（塩化ナトリウム−塩化カリウム−リン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素カリウム）、STE緩衝液（塩化ナトリウム−トリス−EDTA）、TNM緩衝液（トリス−塩化ナトリウム−塩化マグネシウム）などを例示できる。
【００２４】
希釈に用いる水溶液で好ましいのは、塩化カリウム、塩化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、塩化アンモニウムのいずれか一つまたは二つ以上を含むものである。さらに好ましくは、塩化カリウム、塩化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンのいずれか一つまたは二つ以上を含むものである。
【００２５】
上記の水溶液濃度は、全血試料を希釈したときに、溶質分子が10〜1000mM程度含まれるような濃度であることが好ましく、溶質分子が100〜500mM程度含まれるような濃度であることがより好ましい。
本発明方法における全血試料の希釈液として最も好ましいのは、全血試料を希釈したときに、塩化カリウム、塩化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンのいずれか一つまたは二つ以上が、各々100〜500mM程度含まれるような濃度の水溶液である。
工程(ii)
希釈後の全血試料を熱処理する。熱処理温度は、６５〜１００℃程度が好ましく、７５〜１００℃程度がより好ましく、９０〜１００℃程度がさらにより好ましい。熱処理により、タンパク質等の夾雑物質を凝固させるとともに、核酸を含む細胞の膜を破壊し核酸を溶出させることができる。上記温度範囲であれば、夾雑物質の凝固及び細胞の膜の破壊を十分に行うことができる。
【００２６】
熱処理時間は、１秒間〜６０分間程度が好ましく、５分間〜１０分間程度がより好ましい。
工程(iii)
次いで、試料を遠心分離する。遠心分離時の加速度は、例えば５００〜２００００g程度とすればよく、特に７０００〜２００００g程度が好ましい。上記範囲であれば、タンパク質、脂質、糖質などの夾雑物を十分に沈殿させることができるとともに、核酸を上清に残し、その結果核酸と夾雑物とを十分に分離することができる。
【００２７】
また遠心時間は、１〜２０分間程度とすればよく、５〜１０分間が好ましい。
工程(iv)
本発明の核酸増幅方法においては、遠心上清をそのまま用いて核酸増幅反応を行う。全血試料中には、通常DNA及びRNAの双方が含まれる。全血中にはウィルスや細菌などが存在する場合もあるため、DNAとしては、２本鎖DNAの他に１本鎖DNAが含まれる場合もあり、ゲノムDNAの他にｃDNAなどが含まれる場合もある。またRNAとしては、通常ｔ−RNA、ｍ−RNA、ｒ−RNAなどが含まれる。
【００２８】
本発明方法に従い前処理した全血試料はどのような反応によっても核酸を増幅させることができる。公知の核酸増幅反応としては、PCR法（polymerase chain reaction；米国特許4,683,195号)、LCR法（ligase chain reaction;欧州特許出願320,308号）、SDA法（strand displacement amplification；特公平7-114718号）、LAMP法（Loop-Mediated Isothermal Amplification;）、ICAN法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids;）などを挙げることができる。
【００２９】
本発明において、核酸増幅反応の代表例であるPCRにより核酸増幅を行う場合について説明する。プライマーセット、DNAポリメラーゼ及び４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸および反応緩衝液を含む増幅反応液に対して、遠心上清を通常２〜１０容量％程度添加する。
【００３０】
プライマー、DNAポリメラーゼ、緩衝液、熱サイクル条件などは通常のPCRの条件とすればよい。例えばプライマーは、通常10〜50bp程度、好ましくは15〜30bp程度の長さのものを使用すればよい。増幅反応液に含まれるプライマー量は0.1〜100pmol程度、好ましくは１〜40pmol程度とすればよい。DNAポリメラーゼとしては、KOD DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼなどを使用できる。
【００３１】
緩衝液としては、例えばトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液（pH７.５〜９程度）を使用することができ、これにMgCl2 、KClなどの無機塩や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤、BSAなどのタンパク質を含んでいてもよい。
実施例
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
ヒト全血を水を用いて２倍に希釈した。この希釈液を１００℃で１０分間加熱処理した後、１００００rpmで１０分間遠心分離を行った。
【００３２】
遠心上清１μlを下記のPCR増幅液２５μｌに添加し、PCRを行った。
【００３３】
PCRプライマーとしては、ヒトのβ-globin領域内を増幅させることができるオリゴヌクレオチドＦ及びオリゴヌクレオチドＲを用いた。これらのプライマーの塩基配列は次の通りである。この２種類のプライマーを用いたPCRにより、プライマー対応部分を含めて４０８bpの増幅産物を得ることができる。
・オリゴヌクレオチド Ｆ：
5'-GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3'（配列番号１）
・オリゴヌクレオチドＲ：
5'-GGA AAA TAG ACC AAT AGG CAG-3'（配列番号２）
増幅反応液
以下の試薬を混合し水でメスアップして25μlの反応液を調製した。
【００３４】
オリゴヌクレオチド F 12.5pmol
オリゴヌクレオチド R 12.5pmol
×10 rTaq緩衝液 2.5μl
2mM dNTP 2.5μl
25mM MgCl2 1.5μl
rTaq DNAポリメラーゼ(東洋紡績社製) 0.75U
反応条件-１
94℃で１分15秒間
94℃で45秒間、55℃で45秒間、72℃で １分間のサイクルを30サイクル
72℃で５分間
反応条件-２
94℃で１分15秒間
94℃で45秒間、55℃で45秒間、72℃で １分間のサイクルを35サイクル
72℃で５分間
上記条件でのPCR終了後、反応液10μｌを用い、２％アガロース及び0.05μl/ml臭化エチジウムを含むゲルで電気泳動を行い、紫外線照射によりDNAバンドを検出した。
比較例１
実施例１において、前処理後の試料１μlに代えて、ヒト全血０.５μlをそのままPCR反応に供した他は、実施例１と同様の操作を行った。即ち、希釈、熱処理及び遠心分離のいずれも行わなかった。
比較例２
実施例１において、ヒト全血を３０００rpmで１０分間遠心分離し、その上清０.５μlをPCR反応に供した他は、実施例１と同様の操作を行った。即ち、希釈及び熱処理は行わなかった。
比較例３
実施例１において、ヒト全血を１００℃で１０分間加熱し、１００００rpmで１０分間遠心分離し、その上清０.５μlをPCR反応に供した他は、実施例と同様の操作を行った。即ち、希釈は行わなかった。
比較例４
実施例１において、ヒト全血を水で２倍に希釈し、１００００rpmで１０分間遠心分離し、上清１μlをPCR反応に供した他は、実施例１と同様の操作を行った。即ち、熱処理は行わなかった。
比較例５
実施例１において、ヒト全血を水で２倍に希釈し、１００℃で１０分間加熱した液１μlをPCR反応に供した他は、実施例１と同様の操作を行った。即ち、遠心分離は行わなかった。
【００３５】
実施例１及び比較例１〜５の結果を図１に示す。
【００３６】
レーン１〜７はPCRを30サイクル行った結果であり、レーン８〜14は35サイクル行った結果である。
レーン１：精製されたヒトDNA のβ-globin領域内の配列をオリゴヌ
クレオチドF及びRで増幅させたコントロールDNA の結果
レーン２：比較例１（希釈、熱処理、遠心分離を行わない）
レーン３：比較例２（希釈、熱処理を行わない）
レーン４：比較例３（希釈を行わない）
レーン５：比較例４（熱処理を行わない）
レーン６：比較例５（遠心分離を行わない）
レーン７：実施例１
レーン８：精製されたヒトDNA のβ-globin領域内の配列をオリゴヌ
クレオチドF及びRで増幅させたコントロールDNA の結果
レーン９：比較例１（希釈、熱処理、遠心分離を行わない）
レーン１０：比較例２（希釈、熱処理を行わない）
レーン１１：比較例３（希釈を行わない）
レーン１２：比較例４（熱処理を行わない）
レーン１３：比較例５（遠心分離を行わない）
レーン１４：実施例１
上記PCR条件では、全血サンプルに熱処理を全く行わずにPCRに供したものについては増幅バンドを確認することはできなかった。また、熱処理を行っても遠心分離を行わずにPCRに供したものについても低濃度の増幅バンドしか確認できなかった。希釈、熱処理、遠心分離を行ってPCRに供したものについては増幅バンドを確認することができた。このことから、全血サンプルを熱処理し、遠心処理することが増幅バンドの検出に必要であることが分かる。
【００３７】
また全血サンプルを希釈せずに熱処理と遠心分離のみを行ったものについても、増幅バンドを確認できるが、遠心上清の量が非常に少なく、作業効率が急激に低下する。また、同一検体を複数回PCRに使用したい場合、使用回数が著しく制限されてしまう。よって、作業の利便性を損なわないために、また核酸を含有する上清の量を確保するためには、全血サンプルの希釈が必要である。
実施例２〜１４
実施例１において、全血サンプルの希釈倍率を、それぞれ1.1, 1.3, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10倍とした他は、実施例１と同様の操作を行った。
【００３８】
図２および３は、実施例２〜１４の結果を示している。レーン１５は、精製されたヒトDNAのβ-globin領域内の配列をオリゴヌクレオチドF及びRで増幅させたコントロールDNAの結果を示す（３０サイクル）。レーン１６は希釈を行わなかった他は実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３０サイクル）。レーン１７〜２９は、全血サンプルの希釈倍率を、それぞれ1.1, 1.3, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10倍とした他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３０サイクル）。
【００３９】
レーン３０は、精製されたヒトDNAのβ-globin領域内の配列をオリゴヌクレオチドF及びRで増幅させたコントロールDNAの結果を示す（３５サイクル）。レーン３１は希釈を行わなかった他は実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３５サイクル）。レーン３２〜４４は、全血サンプルの希釈倍率を、それぞれ1.1, 1.3, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10倍とした他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３５サイクル）。
全血サンプルの希釈に水を用いた場合は、反応条件-１（３０サイクル）では１.３倍程度、反応条件-２（３５サイクル）では４倍程度まで良好な増幅バンドが確認できた（図２、図３）。
実施例１５〜２２
実施例１において、塩化カリウム水溶液を用いて全血サンプルを希釈した。そのとき、全血サンプルと混和された状態での塩化カリウム濃度は250mMで、全血サンプルの希釈倍率を、それぞれ1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8倍とした他は、実施例１と同様の操作を行った（PCR反応条件-2を除く）。
【００４０】
図４は実施例１５〜２２の結果を示している。レーン４５〜５２は、全血サンプルと混和された状態での塩化カリウム濃度は250mMで、全血サンプルの希釈倍率を、それぞれ1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8倍とした他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３０サイクルのみ）
全血サンプルの希釈に塩化カリウム水溶液を用いた場合は、全血サンプルと混和した塩化カリウム水溶液の濃度が２５０mMであるとき、反応条件-１（３０サイクル）でも７倍まで良好な増幅バンドを確認することができた（図４）。
実施例２３〜３０
実施例１において、ヒト全血を塩化カリウム水溶液で２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った。使用した塩化カリウム水溶液の濃度は、0(水)，20, 100, 200, 500, 750, 1000, 2000mMの８種類であった。
【００４１】
図５は実施例２３〜３０の結果を示している。レーン５３〜６０は、0(水)，20, 100, 200, 500, 750, 1000, 2000mMの濃度の塩化カリウム水溶液でヒト全血を２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３０サイクル）。レーン６１〜６８は、0(水)，20, 100, 200, 500, 750, 1000, 2000mMの濃度の塩化カリウム水溶液でヒト全血を２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３５サイクル）。
２０〜２０００mMの塩化カリウム水溶液で２倍に希釈してPCRに供した場合、全血サンプルと混和したときに１００〜１０００mMの塩化カリウムが含まれていると特に良好な増幅バンドを確認できた。この結果は、実施例１５〜２２(図４）の結果と一致する。
実施例３１〜３８
実施例１において、ヒト全血を塩化ナトリウム水溶液で２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った（PCR反応条件-2を除く）。使用した塩化ナトリウム水溶液の濃度は、0(水)，20, 100, 200, 500, 750, 1000, 2000mMの８種類であった。
実施例３９〜４６
実施例１において、ヒト全血をトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン水溶液で２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った（PCR反応条件-2を除く）。使用したトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン水溶液の濃度は、0(水)，20, 100, 200, 500, 750, 1000, 2000mMの８種類であった。
【００４２】
実施例３１〜３８及び実施例３９〜４６の結果を図６に示す。レーン６９〜７６は、0(水)，20, 100, 200, 500, 750, 1000, 2000mMの濃度の塩化ナトリウム水溶液でヒト全血を２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３０サイクルのみ）。レーン７７〜８４は、0(水)，20, 100, 200, 500, 750, 1000, 2000mMの濃度のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン水溶液でヒト全血を２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３０サイクルのみ）。
【００４３】
塩化ナトリウム水溶液、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン水溶液を希釈に用いた場合も、塩化カリウム水溶液を用いた場合と同様であった。
実施例４７〜５０
実施例１において、ヒト全血を５００mMのグアニジン塩酸塩、ホウ酸、塩化アンモニウム、スクロース水溶液で２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った（PCR反応条件-2を除く）。
【００４４】
実施例４７〜５０の結果を図７に示す。レーン８５〜８８は、ヒト全血を５００mMのグアニジン塩酸塩、ホウ酸、塩化アンモニウム、スクロース水溶液で２倍に希釈した他は、実施例１と同様の操作を行った結果を示す（３０サイクルのみ）。
【００４５】
ヒト全血を５００mMの塩化アンモニウムで２倍に希釈してPCRに供したものについては良好なバンドを確認することができたが、グアニジン塩酸塩、ホウ酸、スクロース水溶液で希釈したものについては増幅バンドをほとんど確認することができなかった（図７）。
一般に、作業効率を低下させないように希釈倍率を大きくすれば、それにともなって増幅量が少なくなってしまう。しかし、塩化カリウムや塩化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、塩化アンモニウムなどが一つまたは二つ以上含まれる水溶液を用いて希釈を行うことによって、作業効率を低下させることなく、目的配列を検出可能な増幅量を得ることができるようになった。
【００４６】
また、希釈に用いられた水溶液の一部が増幅反応液に持ち込まれることにより増幅反応を阻害することも考えられるが、塩化カリウムや塩化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、塩化アンモニウムを含む水溶液であれば増幅反応にほとんど影響を与えない。
【００４７】
上記実施例の条件で増幅バンドを検出できなかった場合も、PCR反応条件のサイクル数を多くする、マグネシウム濃度やプライマー量、酵素量、アニール温度を変更する、使用するプライマーを変更して増幅領域長を短くする、増幅領域を変更する、Nested-PCRを行うなどの手段を講じることにより電気泳動で増幅バンドを検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ヒト全血中の核酸をPCRにより増幅させた結果を示す電気泳動パターンである。
【図２】ヒト全血中の核酸をPCRにより増幅させた結果を示す電気泳動パターンである。
【図３】ヒト全血中の核酸をPCRにより増幅させた結果を示す電気泳動パターンである。
【図４】ヒト全血中の核酸をPCRにより増幅させた結果を示す電気泳動パターンである。
【図５】ヒト全血中の核酸をPCRにより増幅させた結果を示す電気泳動パターンである。
【図６】ヒト全血中の核酸をPCRにより増幅させた結果を示す電気泳動パターンである。
【図７】ヒト全血中の核酸をPCRにより増幅させた結果を示す電気泳動パターンである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血試料中の核酸を増幅するための前処理方法であって、
(i) 全血試料を希釈する工程と、
(ii) 希釈された全血試料を熱処理する工程と、
(iii) 熱処理後の試料を遠心分離する工程と
を含む全血試料の前処理方法。
【請求項２】
工程(i)における全血試料の希釈溶媒が、水または水溶液である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程(i)において希釈溶媒として使用する水溶液が、塩化カリウム、塩化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、及び塩化アンモニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むものである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程(ii)における熱処理温度が６５〜１００℃である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程(iii)において、５００〜２００００gで遠心分離を行う請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の前処理方法において遠心分離により得られる上清を用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅方法。
【請求項７】
核酸増幅方法がPCR法である請求項６に記載の方法。
【請求項１】
全血試料中の核酸を増幅するための前処理方法であって、
(i) 全血試料を希釈する工程と、
(ii) 希釈された全血試料を熱処理する工程と、
(iii) 熱処理後の試料を遠心分離する工程と
を含む全血試料の前処理方法。
【請求項２】
工程(i)における全血試料の希釈溶媒が、水または水溶液である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程(i)において希釈溶媒として使用する水溶液が、塩化カリウム、塩化ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、及び塩化アンモニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むものである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程(ii)における熱処理温度が６５〜１００℃である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程(iii)において、５００〜２００００gで遠心分離を行う請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の前処理方法において遠心分離により得られる上清を用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅方法。
【請求項７】
核酸増幅方法がPCR法である請求項６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−１８７２２１（Ｐ２００６−１８７２２１Ａ）
【公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１９９（Ｐ２００５−１９９）
【出願日】平成１７年１月４日（２００５．１．４）
【出願人】（５９４１６２０７６）株式会社東洋紡ジーンアナリシス (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月４日（２００５．１．４）
【出願人】（５９４１６２０７６）株式会社東洋紡ジーンアナリシス (4)
【Ｆターム（参考）】
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