共重合ポリエステルの製造法
【課題】安価なバイオマスを基本炭素源としてポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ））を生産することを目的とする。
【解決手段】本発明によれば、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）生産能を有する微生物をマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換し、炭素源を含有する培地で形質転換体を増殖させることにより、形質転換体内でポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）を製造する方法が提供される。
【解決手段】本発明によれば、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）生産能を有する微生物をマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換し、炭素源を含有する培地で形質転換体を増殖させることにより、形質転換体内でポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）を製造する方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖、植物油等のバイオマスを基本原料として、微生物により分解可能であり、生体適合性にも優れた共重合ポリエステルの１つであるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）を微生物により製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物が産生するポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、バイオマスを原料として生産可能な環境低負荷型の生分解性プラスチックである。代表的なＰＨＡであるポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（本明細書中「Ｐ（３ＨＢ）」と略記する。）を生合成し、エネルギーの貯蔵物質として菌体内に蓄積する微生物が存在する。この菌体から抽出したＰ（３ＨＢ）は、優れた生分解性と生体適合性を有するが、固くて脆いという物性のため実用化が困難である。
【０００３】
また、Ｐ（３ＨＢ）は、前述の微生物（菌体）を用いて糖や植物油等の炭素源から合成可能であるが、Ｐ（３ＨＢ）生産菌に与える炭素源を工夫することにより、第二のモノマーユニットを導入した共重合ポリエステルを合成することができる。一般に、共重合ポリエステルは、第二のモノマーユニットの構造や組成によって、生産される共重合ポリエステルの物性が変化することから、実用的な生分解性プラスチックとして利用できる共重合ポリエステルの微生物による合成が注目されている。
【０００４】
例えば、水素細菌の１種であるラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）に炭素源としてグルコースとプロピオン酸を与えることにより、３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とのランダム共重合ポリエステルであるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）が生合成される（米国特許第６，０９１，００２号）。ポリヒドロキシブタン酸合成酵素遺伝子が破壊されたシュードモナス・エスピー６１−３株をポリエステル重合酵素遺伝子、β−ケトチオラーゼ遺伝子及びＮＡＤＰＨ−アセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子を含有する組換えベクターで形質転換させ、Ｐ（３ＨＢ）と３−ヒドロキシアルカン酸（３ＨＡ）との共重合ポリエステルであるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を生合成できることも知られている（ＷＯ０１／１１０１４）。また、Ｐ（３ＨＢ）生産菌に３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）を含む混合炭素源を与えることにより、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）（本明細書中「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）」と略記する場合がある。）が生合成される。この共重合体は、Ｐ（３ＨＢ）と比較して、低融点及び高柔軟性を有する優れたプラスチック素材である（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．ら，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒｅｐ．，（１９９１）Ａ２８，１５−２４；Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｅ．ら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９９４）２７，４４２９−４４３５；Ｗａｎｇ，Ｙ．及びＩｎｏｕｅ，Ｙ．，（２００１）２８，２３５−２４３）。しかしながら、３ＨＰは高価であるため、炭素源として使用することは実用化の観点から現実的ではない。
【０００５】
なお、上述のラルストニア・ユートロファは、ラルストニア属に属する微生物であるが、本出願時において、該微生物は、クプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）と呼ばれることもある。このような微生物の属の分類に関しては、クプリアビダス属が正式な属名として一般的に使用されてきているが、今後、再分類により、属及び種の学術名が統一又は変更される場合がある。現時点において、微生物の分類学上、クプリアビダス属、ラルストニア属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ヒドロゲノモナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ）属、及びワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属は、同属又は近縁の属として知られている。しががって、これらの属のいずれかに属する菌体（種）であっても、異なる属・種名で呼ばれることは周知である。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，０９１，００２号公報
【０００７】
【特許文献２】国際公開ＷＯ０１／１１０１４公報
【０００８】
【非特許文献１】Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．ら，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒｅｐ．，（１９９１）Ａ２８，１５−２４
【０００９】
【非特許文献２】Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｅ．ら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９９４）２７，４４２９−４４３５
【００１０】
【非特許文献３】Ｗａｎｇ，Ｙ．及びＩｎｏｕｅ，Ｙ．，（２００１）２８，２３５−２４３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決するためになされたものである。本発明の課題は、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の微生物合成では、細胞内代謝で生じた３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡがポリエステル重合酵素の作用により重合されることを利用し、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（Ｐ（３ＨＢ））生産菌の菌体内で３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ（３ＨＰ−ＣｏＡ）を供給する人工代謝系を構築することにより、バイオマスを基本炭素源としたポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ））の微生物合成法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（Ｐ（３ＨＢ））生産能を有する微生物にマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を導入することにより、微生物内でポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ））を生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
Ｐ（３ＨＢ）生産菌では、糖質や植物油を代謝して生成したアセチル−ＣｏＡを出発物質として、チオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素の作用により生成した３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３ＨＢ−ＣｏＡ）をポリエステル重合酵素の作用によって重合することによりＰ（３ＨＢ）が生合成される。一方、前述の通り、水素細菌クプリアビダス・ネカトール、ラルストニア・ユートロファ等では、培地に３ＨＰを添加すると菌体内に３ＨＰを取り込んで、３ＨＰ−ＣｏＡに変換し、これをポリエステル重合酵素が３ＨＢ−ＣｏＡと共にランダムに高分子鎖に取り込んで共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）を合成することが知られている。
【００１４】
本発明では、このようなＰ（３ＨＢ）生産微生物の細胞内でアセチル−ＣｏＡを出発物質として３ＨＰ−ＣｏＡを生産させ、糖質や植物油のような安価なバイオマスからＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体を微生物により生合成させることとした。より具体的には、緑色非硫黄細菌クロロフレクサス・アウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）の非カルビン型炭酸固定経路である３−ヒドロキシプロピオン酸サイクル（Ａｌｂｅｒ，Ｂ．Ｅ．及びＦｕｃｈｓ，Ｇ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，１２１３７−１２１３に記載の図１を引用）を利用した（図１参照）。この経路では、アセチル−ＣｏＡを出発物質として、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニル−ＣｏＡ還元酵素、及びプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素中の３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素ドメイン（本明細書中「３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素」と記載する。）の３つの酵素により３ＨＰ−ＣｏＡが生成する。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、微生物一般に存在する酵素であることから、マロニル−ＣｏＡ還元酵素及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素の両遺伝子を導入したＰ（３ＨＢ）生産菌では、菌体内で３ＨＰ−ＣｏＡを生成し、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体が合成可能となる（図２参照）。なお、本発明の製造方法で使用する３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子（配列番号３）の１ドメインを構成する（Ａｌｂｅｒ，Ｂ．Ｅ．及びＦｕｃｈｓ，Ｇ．、上述）が、具体的には、配列番号３においてヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列からなる。
【００１５】
すなわち、本発明は、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（Ｐ（３ＨＢ））生産能を有するクプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ヒドロゲノモナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ）属、又はワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属に属する微生物をマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換し、炭素源を含有する培地で形質転換体を増殖させることにより、形質転換体内でポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ））を製造する方法を提供する。
【００１６】
また、本発明の好ましい態様として、本発明の製造方法に使用することができる微生物は、限定されないが、クプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、ヒドロゲノモナス・ユートロファ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ワウテルシア・ユートロファ（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）を含む。さらに好ましい態様として、クプリアビダス・ネカトールは、限定されないが、ＪＭＰ１３４株（ＤＳＭ４０５８）、Ｈ１６株（ＤＳＭ４２８）、及びこれらに由来する株を含む。
【００１７】
本発明によれば、本発明の製造方法に使用されるマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸であることができる。また、本発明の製造方法に使用されるマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸であることができる。
【００１８】
本発明によれば、本発明の製造方法に使用される３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸であることができる。また、本発明の製造方法に使用される３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、（ａ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列を含む核酸；又は（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する活性を有するタンパク質をコードする核酸であることができる。
【００１９】
本発明によれば、製造されるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）共重合体における３−ヒドロキシプロピオン酸分率が０．０１〜２０モル％であることを特徴とする前記共重合体を製造する方法が提供される。好ましい態様として、重量平均分子量１×１０5〜３×１０6の前記共重合体を製造する方法が提供される。
【００２０】
さらに、本発明によれば、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）の製造方法において使用される、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及びプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換した形質転換体が提供される。
【発明の効果】
【００２１】
従来より問題とされていた高価な３ＨＰを含む混合炭素源を使用せずに、微生物内に人工代謝系を構築することによって、より安価なバイオマスを基本炭素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）を生産することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
前述の通り、本発明は、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）生産能を有するクプリアビダス属、ラルストニア属、アルカリゲネス属、ヒドロゲノモナス属、又はワウテルシア属に属する微生物をマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換し、炭素源を含有する培地で形質転換体を増殖させることにより、形質転換体内でポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）を製造する方法に関する。
【００２３】
（１）マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子のクローニング
本発明の製造方法に使用されるマロニル−ＣｏＡ還元酵素をコードする核酸及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素をコードする核酸は、一本鎖又は二本鎖型ＤＮＡ、及びそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用される核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、各々のマロニル−ＣｏＡ還元酵素をコードする核酸の塩基配列及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素をコードする核酸の塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有する核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
（ｉ）マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子のクローニング
マロニル−ＣｏＡ還元酵素は、ＮＡＤＰＨの存在下でマロニル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する酵素である（図１、２を参照）。本発明の製造方法においては、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子として、例えば、公知のマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ５３００１９）を利用することができる。該酵素をコードする遺伝子は、ＡＹ５３００１９に示されるヌクレオチド１−３８９８のうちヌクレオチド７９−３７４１である。本明細書では、該遺伝子の塩基配列（ＡＹ５３００１９のヌクレオチド７９−３７４１に相当）及びそれがコードする推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２として配列表に記載する。
【００２５】
本発明の一態様として、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる。
【００２６】
本発明の好ましい態様として、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質；又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる。
【００２７】
本発明の別の態様として、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【００２８】
本発明の別の好ましい態様として、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列から成る核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列から成る核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【００２９】
マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（本明細書中「ｍｃｒ」と称することがある。）は、例えば、後述する実施例１に記載するように、配列番号１の塩基配列に基づいてプライマーとして合成ヌクレオチド（配列番号５及び６）を設計し、クロロフレクサス・アウランティアカスＤＳＭ６３６株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅することができる。
【００３０】
（ｉｉ）３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子のクローニング
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子（配列番号３）の１ドメインを構成することが知られている（Ａｌｂｅｒ，Ｂ．Ｅ．及びＦｕｃｈｓ，Ｇ．、上述）。典型的には、該酵素の遺伝子は、配列番号３においてヌクレオチド１−２６４３に相当する塩基配列からなる。この合成酵素は、３−ヒドロキシプロピオン酸サイクルのうちＣｏＡ及びＡＴＰの存在下で３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを合成する酵素である（図１、２を参照）。本発明の製造方法においては、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素を使用することもできるが、該遺伝子の１ドメインである３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素を使用することが好ましい。
【００３１】
本発明の製造方法においては、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素として、例えば、公知のプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４４５０７９）を利用することができる。該酵素をコードする遺伝子は、ＡＦ４４５０７９に示されるヌクレオチド１−５４６９の塩基配列を有する。本明細書では、該遺伝子の塩基配列及びそれがコードする推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４として配列表に記載する。
【００３２】
本発明の一態様として、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ配列で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる。
【００３３】
本発明の好ましい態様として、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ配列で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質；又は
（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる。
【００３４】
本発明の別の態様として、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【００３５】
本発明の別の好ましい態様として、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列から成る核酸；又は
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列から成る核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【００３６】
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子（本明細書中「ａｃｓ」と称することがある。）は、例えば、後述する実施例１に記載するように、配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列に基づいてプライマーとして合成ヌクレオチド（配列番号７及び８）を設計し、クロロフレクサス・アウランティアカスＤＳＭ６３６株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅することができる。
【００３７】
なお、実施例１に示すように、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子については、配列番号５及び６のプライマー、そして、３−ヒドロキシプロピオニル合成酵素遺伝子については、配列番号７及び８のプライマーを使用した場合、ＰＣＲ産物としてそれぞれ約３．７ｋｂｐ及び約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られるので、例えば、これらをアガロースゲル電気泳動等の分子量によりＤＮＡ断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って核酸を単離することができる。
【００３８】
ここで、核酸を増幅するための手法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ Ｄ．Ｙ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９））、及び転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ Ｄ．Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）； Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２））、自己保持配列複製（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０））、及びＱβレプリカーゼシステム（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１１９７−１２０２（１９８８））等の恒温反応を利用することができるが、これらに限定されない。本発明の製造法においては、ＰＣＲ法を使用することが好ましい。
【００３９】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，７．４２−７．４５（２００１）に示されるが、ニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０〜５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及び約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度及び洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
【００４０】
上記のような核酸増幅反応又はハイブリダイゼーション等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号１又は３に記載の塩基配列に対して少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する。
【００４１】
なお、同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３）を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。
【００４２】
タンパク質に関して、一般に、酵素のような生理活性を有するタンパク質において、そのアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維持されることがあることは周知である。また、天然産のタンパク質の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在等に起因して、１から数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは知られている。
【００４３】
したがって、上記の通り、本発明の製造方法において使用されるマロニル−ＣｏＡ還元酵素及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素は、典型的には、それぞれ配列番号２及び４に記載のアミノ酸配列を有するが、各酵素がそれぞれの活性を有する限り、当該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加等の変異が生じてもよい。ここで、用語「数個」とは、本明細書中で使用するとき、好ましくは２〜１００個、より好ましくは２〜５０個、さらにより好ましくは２〜２０個、最も好ましくは２〜１０個である。一般的には、部位特異的な変異によってアミノ酸が置換された場合に、元々のタンパク質が有する活性を保持する程度に置換が可能なアミノ酸の個数は、好ましくは１〜１０個である。
【００４４】
本発明の最も好ましい態様として、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする核酸、又は配列番号１で表される塩基配列から成る核酸である。
【００４５】
本発明の最も好ましい態様として、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子が配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする核酸、又は配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列から成る核酸である。
【００４６】
（２）組換えベクターの構築及び形質転換体の作製
本発明によれば、単離したマロニル−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターが提供される。各遺伝子は、同一のベクター又は別個のベクターに組み込むことができる。別個のベクターに各遺伝子を組み込む場合、各ベクターの種類は同一であるか又は異なっていてもよい。なお、上述の通り、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素は、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子の１ドメインを構成するため、本発明の製造方法においては、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子（配列番号３）を組み込んだベクターを使用することもできる。
【００４７】
プラスミド等のベクターに遺伝子を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、タカラバイオ製等）を用いることもできる。
【００４８】
ベクターは、簡単には当業界において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、グラム陰性菌で自律複製することが知られている広宿主域ベクターｐＢＢＲ１−ＭＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ２３７５１）、ｐＪＲＤ２１５（Ｍ１６１９８）（Ｄａｖｉｓｉｏｎ，Ｊ．ら、（１９８７）Ｇｅｎｅ，５１，２７５−８０を参照）、ｐＪＢ８６１（Ｕ８２０００）、ｐＨＲＰ３１１（Ｐａｒａｌｅｓ，Ｒ．Ｅ．及びＨａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｓ．（１９９３）Ｇｅｎｅ，１３３，２３−３０を参照）が例示されるが、これらに限定されない。また、大腸菌用のプラスミドとして、例えば、ｐＢＡＤ２４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ８１８３７）、ｐＤＯＮＲ２０１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等を使用することができる。
【００４９】
当業者であれば、発現ベクターに適合するように制限末端を適宜選択することが可能である。また、当業者であれば、所望のタンパク質を発現させるために、宿主細胞に適した発現ベクターを適宜選択することができる。このようにベクターは、本発明で使用する遺伝子が目的の宿主細胞中で発現し得るように遺伝子発現に関与する領域（必要に応じて、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（カナマイシン耐性遺伝子など）、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列））が適切に配列されており又は導入することにより、該核酸が適切に発現するように構築されている又は構築することが好ましい。後述する実施例２に示すように、大腸菌においてアラビノースの添加で発現を誘導できるＢＡＤプロモーターを有するプラスミドｐＢＡＤ２４（上述）から転写因子ａｒａＣ、ＢＡＤプロモーター領域、マルチクローニングサイト、ｒｒｎＢターミネーター領域を含むＤＮＡ断片を切り出し、これらＤＮＡ断片、ｍｃｒ及びａｃｓ（上述）を広宿主域ベクターｐＢＢＲ−ＭＣＳ２に連結することにより、目的とする発現ベクター（ｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓ）を構築することができる。なお、本発明の製造方法においては、既存のベクターを使用することもでき、その種類は、原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されない。
【００５０】
一般的に、形質転換体は、発現ベクターを宿主細胞に組み込むことによって作製することができる。この場合、宿主細胞として原核細胞（例えば、大腸菌（Ｓ１７−１株等）、枯草菌）であっても真核細胞（哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても使用することができる。発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転換）は公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９））やコンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１））、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ラルストニア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属等に属する菌体への発現ベクターの導入では、接合伝達法を使用することができる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４７，１９８（１９８１））。
【００５１】
この接合伝達法は、簡単には、細胞同士の接触によって染色体ゲノム又はプラスミドを一方の細胞から他方の細胞に移行させる細胞の性質を利用したものであり、例えば、目的のＤＮＡを担持する自己伝達性プラスミドが導入された供与菌と該プラスミドを有しない受容菌との接合に始まり、両菌体における橋の形成、該プラスミドの複製と移行、並びにＤＮＡ合成の完了と共に菌体の分離といった一連の工程によって遺伝子導入を可能にする手段である。
【００５２】
本発明の製造方法に使用される宿主細胞は、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（Ｐ（３ＨＢ）生産能を有する機能を有する微生物であれば、特に限定されない。本発明によれば、このような機能を有する天然に存在する細胞（細菌）を使用してもよく、又は、遺伝子工学的手法により作製したこのような機能を発現する形質転換体（細胞株、菌株など）を使用してもよい。
【００５３】
本発明に使用されるＰ（３ＨＢ）生産能を有する微生物は、限定されないが、クプリアビダス属、ラルストニア属、アルカリゲネス属、ヒドロゲノモナス属、又はワウテルシア属に属する微生物を含む。好ましい態様として、本発明の製造方法に使用される微生物は、限定されないが、クプリアビダス・ネカトール、ラルストニア・ユートロファ、アルカリゲネス・ユートロファス、ヒドロゲノモナス・ユートロファ、又はワウテルシア・ユートロファである。さらに、クプリアビダス・ネカトールに属する菌体は、ＪＭＰ１３４株（ＤＳＭ４０５８）、Ｈ１６株（ＤＳＭ４２８）、ＤＳＭ５３１株、これらに由来する株、より好ましくはＪＭＰ１３４株、Ｈ１６株、最も好ましくはＪＭＰ１３４株である。本発明の製造方法に使用されるこれらの株は、例えば、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）又はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から容易に入手可能である。なお、後述する実施例３では、作製した発現ベクター（ｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓ）を大腸菌に塩化カルシウム法によって遺伝子導入した後に、接合伝達法を用いて、この大腸菌からＰ（３ＨＢ）合成能を有するクプリアビダス・ネカトールＪＭＰ１３４株に発現ベクターを移入させ、これを形質転換体として使用した。
【００５４】
（３）共重合ポリエステルの合成
ポリエステル合成は、上述した形質転換体を所定の培地で培養し、培養細胞（例えば、菌体）内又は培養物（例えば、培地）中に共重合ポリエステルを生成及び蓄積させ、培養細胞又は培養物から目的とする共重合ポリエステルを採取することにより行われる。なお、本発明の製造方法に使用される形質転換体の培養法は、通常、宿主細胞の培養に使用される方法に従って行われる。
【００５５】
クプリアビダス属、ラルストニア属、アルカリゲネス属、ヒドロゲノモナス属、ワウテルシア属、シュードモナス属等に属する菌体を宿主とした場合の培地として、微生物が資化し得る炭素源を添加し、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源のいずれかを制限した培地が挙げられる。典型的には、培地温度を２５℃〜３７℃の範囲にし、好気的に１〜１０日培養することにより、共重合ポリエステルを菌体内に生成し蓄積させ、その後、回収・精製することによって所望の共重合ポリエステルを調製することができる。
【００５６】
本発明の製造方法で使用される菌体は、水素細菌であり、分子状水素と酸素の反応（爆鳴気反応）によって得られるエネルギーを利用し、炭酸を唯一の炭素源として成長し得る細菌として知られている。ここで、炭素源として、限定されないが、フルクトース、グルコース、スクロース、マルトース等が挙げられる。また、その他の炭素源として、グルコン酸、オクタン酸、大豆油、コーン油、オリーブ油、ヤシ油、ドデカン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸等の脂肪酸、又はこれらの脂肪酸エステル、アルコール類を使用してもよい。また、当業者であれば、使用する炭素源の濃度、種類等を適宜選択することができる。
【００５７】
また、必要であれば、培地中に窒素源や無機物を添加してもよい。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニア、ペプトン、酵母エキス等が列挙される。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化ナトリウム等が列挙される。
【００５８】
培養は、通常、振とう培養が用いられ、好気的条件下で、２５℃〜３７℃で遺伝子発現誘導後少なくとも１日以上行うことが好ましい。抗生物質として、カナマイシン、アンピシリン等を培地に添加してもよい。また、遺伝子発現誘導剤として、アラビノース、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を使用することができる。当業者であれば、所望の遺伝子発現のために可能な培養条件、遺伝子発現の誘導条件等を適宜選択できる。
【００５９】
（４）共重合ポリエステルの精製と構造解析
本発明において、共重合ポリエステルは、下記の通り精製することができる：培地から遠心分離によって形質転換体を回収し、蒸留水で洗浄後、乾燥又は凍結乾燥させる。その後、クロロホルムに乾燥した形質転換体を懸濁させ、室温で所定時間撹拌し、共重合ポリエステルを抽出する。抽出の段階で、必要であれば加熱してもよい。濾過によって残渣を除去し、上清にメタノールを加えて共重合ポリエステルを沈殿させ、沈殿物を濾過又は遠心分離によって、上清を除去し、乾燥させて精製した共重合ポリエステルを得ることができる。
【００６０】
得られた共重合ポリエステルが所望のものであることを確認するための手段は、限定されないが、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、ガスクロマトグラフィーを用いる方法を含む。本発明によれば、共重合ポリエステルのモノマーユニットの比、即ち、３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）の比を遺伝子発現条件、培養条件等を変えることにより適宜調節することができる。本発明の製造方法によって得られる共重合ポリエステルの３ＨＰ分率は、好ましくは０．０１〜２０モル％、より好ましくは０．０５〜２０モル％、さらにより好ましくは０．１〜１０モル％、さらになおより好ましくは０．１〜５．０モル％、最も好ましくは０．１〜２．０モル％である。用語「モル％」は、本明細書中で使用するとき、多成分系における各成分のモル数の和で、ある成分のモル数を割ったものをいう。例えば、本発明の製造方法により得られる共重合体の一般式を３ＨＢ及び３ＨＰのモノマーユニットの数として、それぞれ「ｘ」及び「ｙ」を用いて表記した場合（図６を参照）、３ＨＰ分率は、式：ｙ×１００／（ｘ＋ｙ）により求めることができる。なお、後述する実施例５で示すように、本発明の製造方法により、３ＨＰ分率が異なる共重合ポリエステルを得ることができた（表１等）。また、ＮＭＲによって、共重合体であることを確認した（図６）。
【００６１】
また、本発明の製造方法によって得られる共重合ポリエステルの平均分子量（例えば、重量平均分子量（Ｍｗ）及び数平均分子量（Ｍｎ））は、当業者に周知な方法、例えば、クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法、粘度法、末端基定量法、浸透圧法、光散乱法、沈降速度法により測定することができる。本明細書中で使用するとき、用語「重量平均分子量（Ｍｗ）」は、多分散系高分子化合物の分子量を意味する。具体的には、分子量Ｍｉの分子がｎｉ個（ｉ＝１、２、・・・）ある多分散系における重量平均分子量は、下式：
【化１】
で表される。本発明の製造方法によって得られる共重合ポリエステルの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは１×１０5〜３×１０6、より好ましくは５×１０5〜２×１０6、さらにより好ましくは１×１０6〜１．５×１０6である。また、用語「数平均分子量（Ｍｎ）」は、２個以上の原子より分子が構成されているときの平均分子量でｉ番目の原子量をＭｉ、その数をＮｉ個とすると、下式：
【化２】
で表される。本発明の共重合ポリエステルの数平均分子量（Ｍｎ）は、好ましくは５×１０4〜１．５×１０6、より好ましくは１×１０5〜１×１０6、さらにより好ましくは１×１０5〜５×１０5である。なお、後述する実施例６において共重合ポリエステルの分子量測定を行った結果、Ｍｗ＝約１．１６×１０6、Ｍｎ＝約３．３６×１０5であったことから、本発明の共重合ポリエステルは、従来技術によって得られる一般的な共重合ポリエステル（重量平均分子量：約１×１０3〜５×１０4）と比較して、非常に大きな分子量を有すると言える。
【００６２】
本発明の共重合ポリエステルの分子量分布は、Ｍｗ／Ｍｎ（分散比）によって表すことができる。分散比は、好ましくは２以上、より好ましくは３以上である。分散比が２以上の場合、共重合ポリエステルの網目が良好であることが予測される。
【００６３】
また、本発明の製造方法によって製造された共重合ポリエステルは、乾燥菌体重量当り１重量％以上、好ましくは１０重量％以上、より好ましくは２０重量％以上、さらにより好ましくは３０重量％以上、最も好ましくは５０重量％以上の割合で菌体に蓄積される。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１ マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子のクローニング
緑色非硫黄細菌クロロフレクサス・アウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＤＳＭ６３６株（ＤＳＭＺより入手）の凍結乾燥菌体を３ｍｌの滅菌生理食塩水に懸濁した後、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻、２．４．３頁、１９９４年；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ出版）により染色体ＤＮＡを得た。
【００６５】
また、公知のクロロフレクサス・アウランティアカス由来のマロニル−ＣｏＡ還元酵素の遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ５３００１９）（配列番号１を参照）に基づいて、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ｍｃｒ）を増幅するために、該遺伝子配列に相同な下記のプライマー：
配列１：GGGGAATTCATGAGCGGAACAGGACGACTGG（配列番号５）
（下線部：配列番号１のヌクレオチド１−２２に対応）
配列２：GTAGAATTTACACGGTAATCGC（配列番号６）
（下線部：配列番号１のヌクレオチド３６６３−３６４９に対応）
を設計した。
【００６６】
公知のクロロフレクサス・アウランティアカス由来のプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素の遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４４５０７９）（配列番号３を参照）に基づいて、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子（ａｃｓ）を増幅するために、該遺伝子配列中の３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子に相当する部分に相同な下記のプライマー：
配列３：GCAGGAGGAATTACCATGATCGACACTGCGCCCCTTG（配列番号７）
（下線部：配列番号２のヌクレオチド１−２２に対応）
配列４：GGGGAATTCTTATGTCACCGTCACTACCGCG（配列番号８）
（下線部：配列番号２のヌクレオチド２６４３−２６２５に対応）
を設計した。なお、配列番号８の塩基１２−１０（ＡＴＴ）は、終始コドン（ＴＡＡ）の相補配列に対応し、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素が、配列番号３のヌクレオチド１−２６４３のみから翻訳されるよう付加した。
【００６７】
抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列１及び配列２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｍｃｒを増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤプラス（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で３０秒、７０℃で４分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。また、ａｃｓは配列３及び配列４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ法によって同様に増幅した。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で３０秒、６２℃で３０秒、６８℃で４分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
【００６８】
増幅したｍｃｒをＴ４キナーゼ（トーヨーボー社製）を用いて５’−末端をリン酸化した。また、ベクタープラスミドｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）を制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、脱リン酸化した状態で市販されているもの（タカラバイオ社製）と、リン酸化したｍｃｒ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（トーヨーボー社製）を用いて連結した。次いで、得られた組換えプラスミドを制限酵素ＳｍａＩで切断し、アルカリホスファターゼ（ロシュ社製）で脱リン酸化した。これと５’−リン酸化したａｃｓ断片を連結した。この際、ｍｃｒ−ａｃｓの順で同方向に連結された組換えプラスミドｐＵＣ−ｍｃｒａｃｓを選抜した。
【００６９】
実施例２ 組換えベクターの構築
多くのグラム陰性菌で自律複製することが知られている広宿主域ベクターｐＢＢＲ１−ＭＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ２３７５１）を制限酵素ＳｓｐＩで切断し、複製起点等を含むＤＮＡ断片を単離して脱リン酸化処理を行った。また、大腸菌においてアラビノースの添加で発現を誘導できるＢＡＤプロモーターを有するプロモーターを有するプラスミドｐＢＡＤ２４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ８１８３７）を制限酵素ＢａｎＩＩＩとＡｌｗ４４Ｉで切断し、転写因子ａｒａＣ、ＢＡＤプロモーター領域、マルチクローニングサイト、ｒｒｎＢターミネーター領域を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片をＢｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈ（トーヨーボー社製）を用いて末端平滑化し、次いで、上述のｐＢＢＲ１−ＭＣＳ２ ＳｓｐＩ断片と連結した。得られたｐＢＢＲ−ＢＡＤ（図３）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して脱リン酸化処理し、ｐＵＣ−ｍｃｒａｃｓから制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出したｍｃｒ−ａｃｓ断片と連結することで発現ベクターｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓ（図４）を構築した。また、このｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓを制限酵素ＸｂａＩで切断した後に、セルフライゲーションした。この処理によって、ａｃｓ領域を除去し、ｍｃｒ領域のみを含むｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒ（図５）を得た。
【００７０】
実施例３ 形質転換体の作製
得られた組換えプラスミドを用いて、Ｐ（３ＨＢ）生産菌であるクプリアビダス・ネカトールＪＭＰ１３４株（ＤＳＭ４０５８）又はＨ１６株（ＤＳＭ４２８）（ＤＳＭＺより入手）を接合伝達法によって形質転換した。まず、塩化カルシウム法によって、ｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓを大腸菌Ｓ１７−１株に導入した。次に、この組換え大腸菌をＬＢ培地（１％イーストエキス、０．５％トリプトン、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）１．５ｍｌ中で、３７℃で終夜培養した。これと並行して、クプリアビダス・ネカトールＪＭＰ１３４株又はＨ１６株をＮＲ培地（１％魚肉エキス、１％ポリペプトン、２％酵母エキス）１．５ｍｌ中で、３０℃で終夜培養した。その後、それぞれの培養液０．１ｍｌを混合して３０℃で４時間培養した。この菌体混合液を０．３ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＳｉｍｍｏｎｓ Ｃｉｔｒａｔｅ寒天培地（ディフコ社製）に塗布し、３０℃で５日間培養した。組換え大腸菌中のプラスミドが、クプリアビダス・ネカトールに伝達された場合、該菌体はカナマイシン耐性を示し、一方、組換え大腸菌はＳｉｍｍｏｎｓ Ｃｉｔｒａｔｅ寒天培地では増殖不能であるため、上記培地上で増殖したコロニーは、組換え大腸菌からｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓが伝達したクプリアビダス・ネカトール形質転換体である。ｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓをＪＭＰ１３４株に接合伝達した株を「ＪＭＡ６４株」、ｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒを伝達した株を「ＪＭ３７株」、ｐＢＢＲ−ＢＡＤを伝達した株を「ＪＢＡＤ株」と命名した。また、Ｈ１６株にｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓを接合伝達した株を「ＨＭＡ６４株」と命名した。
【００７１】
実施例４ クプリアビダス・ネカトール形質転換体による共重合ポリエステル合成
クプリアビダス・ネカトール形質転換体による共重合ポリエステル合成は、下記に示すように一段培養及び二段培養で行った。
（ａ）一段培養
ＮＲ培地（前述）で前培養したクプリアビダス・ネカトール形質転換体を１００ｍｌのＭＢ−Ｆｒｃ培地（０．９％ リン酸二ナトリウム、０．１５％ リン酸一カリウム、０．０５％ 塩化アンモニウム、１％ 微量金属溶液、０．５％又は２％ フルクトース）に植菌し、坂口フラスコ中、３０℃で７２時間振とう培養した。培養開始後８〜２４時間で遺伝子発現誘導剤であるアラビノースを所定量（０〜０．１％、表１等を参照）で添加した。
【００７２】
（ｂ）二段培養
０．１ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＮＲ培地でクプリアビダス・ネカトール形質転換体を３０℃、２４時間培養した。その後、遠心分離及び洗浄した菌体を０．１ｍｇ／ｍｌのカナマイシン及び所定量（０〜０．１％、表１等を参照）のアラビノースを添加した１００ｍｌ ＭＢ−Ｆｒｃ培地（塩化アンモニウム不含）に移し、３０℃で４８時間培養した。
【００７３】
いずれの場合も培養終了後に遠心分離によって菌体を回収し、蒸留水で洗浄して凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
乾燥菌体１０〜３０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することにより、菌体内ポリエステル分解物のメチルエステルを得た。これに１ｍｌの蒸留水を添加して激しく撹拌した。静置して二層に分離させた後、下層の有機層を取り出した。有機層０．１ｍｌに０．１％のオクタン酸メチル・クロロホルム溶液を０．１ｍｌ、ジメチルホルムアミドを０．３ｍｌとビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドを０．１ｍｌを添加し、７０℃で３０分加熱して水酸基をトリメチルシリル化した。室温まで冷却し、１ｍＬのヘキサン及び１ｍＬのＨ2Ｏを添加して激しく撹拌し、静置後、上層の有機層をキャピラリーガスクロマトグラフィーによって分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所製ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＩｎｅｒｔＣａｐ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。温度条件は、初発温度１００℃から８℃／分の速度で昇温した。
【００７４】
一段培養では、親株であるＪＭＰ１３４株は、Ｐ（３ＨＢ）ホモポリマーのみが蓄積するが、これに対して、ＪＭＡ６４株は、アラビノースを０．０１％以上添加した場合に、３ＨＰ分率が０．７〜１．０モル％であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体を乾燥菌体重量当り５３〜５６重量％蓄積した。この際、アラビノースを添加しない、又は低濃度０．００１％の場合では、３ＨＰユニットの導入が見られなかったことから、導入したｍｃｒ−ａｃｓ遺伝子がアラビノースによって発現誘導され機能することがＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体の合成において必要であることがわかる（表１）。
【００７５】
二段培養の場合でも、ＪＭＰ６４株はアラビノース０．０１％以上の添加で３ＨＰ分率０．９〜１．９モル％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体を乾燥菌体重量当り２５〜２９重量％蓄積した。フルクトース濃度の違いによる影響は見られなかった（表１）。
【００７６】
【表１】
【００７７】
炭素源を脂肪酸（ドデカン酸）としても、３ＨＰ分率０．８モル％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体を乾燥菌体重量当り４９．１重量％蓄積した（表２）。
【００７８】
【表２】
【００７９】
また、ａｃｓを有しないｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒを伝達したＪＭ３７株、及びｍｃｒ、ａｃｓを両方とも有しないｐＢＢＲ−ＢＡＤを伝達したＪＢＡＤ株では、Ｐ（３ＨＢ）ホモポリマーのみが蓄積したことからも、ｍｃｒ、ａｃｓ両遺伝子が発現し機能することがＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体の合成において必要であることがわかる（表３）。さらに、Ｈ１６株を宿主としたＨＭＡ６４株においてもＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体の合成が確認できた。Ｈ１６株由来のＨＭＡ６４株では、糖質や脂肪酸に加え、植物油を炭素源とすることができる（表４）。
【００８０】
【表３】
【００８１】
【表４】
【００８２】
実施例５ 共重合ポリエステルの精製と構造解析
０．５％フルクトースで二段培養したクプリアビダス・ネカトールＪＭＰ６４株（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−１．９ｍｏｌ％３ＨＰ）を２４．５重量％で蓄積）の凍結乾燥菌体１５０ｍｇをクロロホルムに懸濁し、室温で４８時間撹拌した。フィルターで濾過し、上清の５倍量のメタノールを加え、沈殿したポリエステルを濾過により回収した。真空乾燥後の秤量により、２９．３ｍｇのポリエステルを得た。全量を重クロロホルムに溶解し、1Ｈ−ＮＭＲにより構造解析した（図６）。３−ヒドロキシプロピオニル基中の３位の炭素に結合したメチレン基に由来する水素のシグナルが４．３５ｐｐｍ付近に観察されたことから、このポリエステルがＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体であることが確認できた。ピーク面積積分値から３ＨＰ分率１．６モル％と産出された。これはガスクロマトグラフィーによる結果（１．９モル％）とほぼ一致している。
【００８３】
実施例６ 共重合ポリエステルの分子量測定
実施例５により得られた共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−１．９ｍｏｌ％３ＨＰの分子量測定は、クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法により行った。高速液体クロマトグラフィーは、島津製作所製ＬＣ−１０Ａ ＧＰＣを用い、カラムはショーデックス社製Ｋ８０６ＭカラムとＫ８０２カラムを連結して用いた。移動相は、クロロホルム０．８ｍｌ／分とし、乾燥菌体より精製した共重合体のクロロホルム溶液（濃度１ｍｇ／ｍｌ）を分析サンプルとした。分子量計算のための検量線はポリスチレン標準品により作製した。これにより、重量平均分子量（Ｍｗ）＝約１．１６×１０6、数平均分子量（Ｍｎ）＝３．３６×１０5が得られた。また、この共重合体の分散比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、約３．４５となる。したがって、本発明の製造方法によって、高分子量であり、かつ分子量分布のやや広い共重合ポリエステルが得られた。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の製造方法によって、安価なバイオマスを基本炭素源としてポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ））を生産することができ、さらに、３ＨＰ分率の高い共重合体を得ることができる。このような共重合ポリエステルは、熱安定や成形性に優れており、Ｐ（３ＨＢ）と比べて耐衝撃性に優れた生分解性プラスチックとなる点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、緑色非硫黄細菌クロロフレクサス・アウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）で提唱されている３−ヒドロキシプロピオン酸サイクルの概略図を示す。各酵素は、（１）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、（２）マロニル−ＣｏＡレダクターゼ、（３）プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、（４）プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、（５）メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、（６）メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、（７）スクシニル−ＣｏＡ：Ｌ−リンゴ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、（８）スクシニル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、（９）フマラーゼ、（１０）Ｌ−マリル−ＣｏＡリアーゼである。この概略図は、Ｂ．Ｅ．Ａｌｂｅｒ及びＧ．Ｆｕｃｈｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１２１３７−１２１４３（２００２）より転載した。
【図２】図２は、人工代謝経路によるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体の生合成のスキームを示す。
【図３】図３は、構築した組換えベクターｐＢＢＲ−ＢＡＤを示す。
【図４】図４は、構築した組換えベクターｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓを示す。
【図５】図５は、構築した組換えベクターｐＢＢ−ＢＡＤ−ｍｃｒを示す。
【図６】図６は、ラルストニア・ユートロファＪＭＰ６４株でフラクトースより合成したＰ（３ＨＢ−ｃｏ−１．６ｍｏｌ％３ＨＰ）の1Ｈ−ＮＭＲによる解析結果を示す。式中の各番号は、ＮＭＲデータ中の各ピークの番号に対応する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖、植物油等のバイオマスを基本原料として、微生物により分解可能であり、生体適合性にも優れた共重合ポリエステルの１つであるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）を微生物により製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物が産生するポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、バイオマスを原料として生産可能な環境低負荷型の生分解性プラスチックである。代表的なＰＨＡであるポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（本明細書中「Ｐ（３ＨＢ）」と略記する。）を生合成し、エネルギーの貯蔵物質として菌体内に蓄積する微生物が存在する。この菌体から抽出したＰ（３ＨＢ）は、優れた生分解性と生体適合性を有するが、固くて脆いという物性のため実用化が困難である。
【０００３】
また、Ｐ（３ＨＢ）は、前述の微生物（菌体）を用いて糖や植物油等の炭素源から合成可能であるが、Ｐ（３ＨＢ）生産菌に与える炭素源を工夫することにより、第二のモノマーユニットを導入した共重合ポリエステルを合成することができる。一般に、共重合ポリエステルは、第二のモノマーユニットの構造や組成によって、生産される共重合ポリエステルの物性が変化することから、実用的な生分解性プラスチックとして利用できる共重合ポリエステルの微生物による合成が注目されている。
【０００４】
例えば、水素細菌の１種であるラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）に炭素源としてグルコースとプロピオン酸を与えることにより、３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とのランダム共重合ポリエステルであるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）が生合成される（米国特許第６，０９１，００２号）。ポリヒドロキシブタン酸合成酵素遺伝子が破壊されたシュードモナス・エスピー６１−３株をポリエステル重合酵素遺伝子、β−ケトチオラーゼ遺伝子及びＮＡＤＰＨ−アセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子を含有する組換えベクターで形質転換させ、Ｐ（３ＨＢ）と３−ヒドロキシアルカン酸（３ＨＡ）との共重合ポリエステルであるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を生合成できることも知られている（ＷＯ０１／１１０１４）。また、Ｐ（３ＨＢ）生産菌に３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）を含む混合炭素源を与えることにより、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）（本明細書中「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）」と略記する場合がある。）が生合成される。この共重合体は、Ｐ（３ＨＢ）と比較して、低融点及び高柔軟性を有する優れたプラスチック素材である（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．ら，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒｅｐ．，（１９９１）Ａ２８，１５−２４；Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｅ．ら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９９４）２７，４４２９−４４３５；Ｗａｎｇ，Ｙ．及びＩｎｏｕｅ，Ｙ．，（２００１）２８，２３５−２４３）。しかしながら、３ＨＰは高価であるため、炭素源として使用することは実用化の観点から現実的ではない。
【０００５】
なお、上述のラルストニア・ユートロファは、ラルストニア属に属する微生物であるが、本出願時において、該微生物は、クプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）と呼ばれることもある。このような微生物の属の分類に関しては、クプリアビダス属が正式な属名として一般的に使用されてきているが、今後、再分類により、属及び種の学術名が統一又は変更される場合がある。現時点において、微生物の分類学上、クプリアビダス属、ラルストニア属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ヒドロゲノモナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ）属、及びワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属は、同属又は近縁の属として知られている。しががって、これらの属のいずれかに属する菌体（種）であっても、異なる属・種名で呼ばれることは周知である。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，０９１，００２号公報
【０００７】
【特許文献２】国際公開ＷＯ０１／１１０１４公報
【０００８】
【非特許文献１】Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．ら，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒｅｐ．，（１９９１）Ａ２８，１５−２４
【０００９】
【非特許文献２】Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｅ．ら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９９４）２７，４４２９−４４３５
【００１０】
【非特許文献３】Ｗａｎｇ，Ｙ．及びＩｎｏｕｅ，Ｙ．，（２００１）２８，２３５−２４３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決するためになされたものである。本発明の課題は、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の微生物合成では、細胞内代謝で生じた３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡがポリエステル重合酵素の作用により重合されることを利用し、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（Ｐ（３ＨＢ））生産菌の菌体内で３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ（３ＨＰ−ＣｏＡ）を供給する人工代謝系を構築することにより、バイオマスを基本炭素源としたポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ））の微生物合成法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（Ｐ（３ＨＢ））生産能を有する微生物にマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を導入することにより、微生物内でポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ））を生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
Ｐ（３ＨＢ）生産菌では、糖質や植物油を代謝して生成したアセチル−ＣｏＡを出発物質として、チオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素の作用により生成した３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３ＨＢ−ＣｏＡ）をポリエステル重合酵素の作用によって重合することによりＰ（３ＨＢ）が生合成される。一方、前述の通り、水素細菌クプリアビダス・ネカトール、ラルストニア・ユートロファ等では、培地に３ＨＰを添加すると菌体内に３ＨＰを取り込んで、３ＨＰ−ＣｏＡに変換し、これをポリエステル重合酵素が３ＨＢ−ＣｏＡと共にランダムに高分子鎖に取り込んで共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）を合成することが知られている。
【００１４】
本発明では、このようなＰ（３ＨＢ）生産微生物の細胞内でアセチル−ＣｏＡを出発物質として３ＨＰ−ＣｏＡを生産させ、糖質や植物油のような安価なバイオマスからＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体を微生物により生合成させることとした。より具体的には、緑色非硫黄細菌クロロフレクサス・アウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）の非カルビン型炭酸固定経路である３−ヒドロキシプロピオン酸サイクル（Ａｌｂｅｒ，Ｂ．Ｅ．及びＦｕｃｈｓ，Ｇ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，１２１３７−１２１３に記載の図１を引用）を利用した（図１参照）。この経路では、アセチル−ＣｏＡを出発物質として、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニル−ＣｏＡ還元酵素、及びプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素中の３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素ドメイン（本明細書中「３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素」と記載する。）の３つの酵素により３ＨＰ−ＣｏＡが生成する。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、微生物一般に存在する酵素であることから、マロニル−ＣｏＡ還元酵素及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素の両遺伝子を導入したＰ（３ＨＢ）生産菌では、菌体内で３ＨＰ−ＣｏＡを生成し、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体が合成可能となる（図２参照）。なお、本発明の製造方法で使用する３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子（配列番号３）の１ドメインを構成する（Ａｌｂｅｒ，Ｂ．Ｅ．及びＦｕｃｈｓ，Ｇ．、上述）が、具体的には、配列番号３においてヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列からなる。
【００１５】
すなわち、本発明は、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（Ｐ（３ＨＢ））生産能を有するクプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ヒドロゲノモナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ）属、又はワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属に属する微生物をマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換し、炭素源を含有する培地で形質転換体を増殖させることにより、形質転換体内でポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ））を製造する方法を提供する。
【００１６】
また、本発明の好ましい態様として、本発明の製造方法に使用することができる微生物は、限定されないが、クプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、ヒドロゲノモナス・ユートロファ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ワウテルシア・ユートロファ（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）を含む。さらに好ましい態様として、クプリアビダス・ネカトールは、限定されないが、ＪＭＰ１３４株（ＤＳＭ４０５８）、Ｈ１６株（ＤＳＭ４２８）、及びこれらに由来する株を含む。
【００１７】
本発明によれば、本発明の製造方法に使用されるマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸であることができる。また、本発明の製造方法に使用されるマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸であることができる。
【００１８】
本発明によれば、本発明の製造方法に使用される３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸であることができる。また、本発明の製造方法に使用される３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、（ａ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列を含む核酸；又は（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する活性を有するタンパク質をコードする核酸であることができる。
【００１９】
本発明によれば、製造されるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）共重合体における３−ヒドロキシプロピオン酸分率が０．０１〜２０モル％であることを特徴とする前記共重合体を製造する方法が提供される。好ましい態様として、重量平均分子量１×１０5〜３×１０6の前記共重合体を製造する方法が提供される。
【００２０】
さらに、本発明によれば、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）の製造方法において使用される、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及びプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換した形質転換体が提供される。
【発明の効果】
【００２１】
従来より問題とされていた高価な３ＨＰを含む混合炭素源を使用せずに、微生物内に人工代謝系を構築することによって、より安価なバイオマスを基本炭素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）を生産することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
前述の通り、本発明は、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）生産能を有するクプリアビダス属、ラルストニア属、アルカリゲネス属、ヒドロゲノモナス属、又はワウテルシア属に属する微生物をマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換し、炭素源を含有する培地で形質転換体を増殖させることにより、形質転換体内でポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）を製造する方法に関する。
【００２３】
（１）マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子のクローニング
本発明の製造方法に使用されるマロニル−ＣｏＡ還元酵素をコードする核酸及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素をコードする核酸は、一本鎖又は二本鎖型ＤＮＡ、及びそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用される核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、各々のマロニル−ＣｏＡ還元酵素をコードする核酸の塩基配列及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素をコードする核酸の塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有する核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
（ｉ）マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子のクローニング
マロニル−ＣｏＡ還元酵素は、ＮＡＤＰＨの存在下でマロニル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する酵素である（図１、２を参照）。本発明の製造方法においては、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子として、例えば、公知のマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ５３００１９）を利用することができる。該酵素をコードする遺伝子は、ＡＹ５３００１９に示されるヌクレオチド１−３８９８のうちヌクレオチド７９−３７４１である。本明細書では、該遺伝子の塩基配列（ＡＹ５３００１９のヌクレオチド７９−３７４１に相当）及びそれがコードする推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２として配列表に記載する。
【００２５】
本発明の一態様として、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる。
【００２６】
本発明の好ましい態様として、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質；又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる。
【００２７】
本発明の別の態様として、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【００２８】
本発明の別の好ましい態様として、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列から成る核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列から成る核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【００２９】
マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（本明細書中「ｍｃｒ」と称することがある。）は、例えば、後述する実施例１に記載するように、配列番号１の塩基配列に基づいてプライマーとして合成ヌクレオチド（配列番号５及び６）を設計し、クロロフレクサス・アウランティアカスＤＳＭ６３６株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅することができる。
【００３０】
（ｉｉ）３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子のクローニング
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子（配列番号３）の１ドメインを構成することが知られている（Ａｌｂｅｒ，Ｂ．Ｅ．及びＦｕｃｈｓ，Ｇ．、上述）。典型的には、該酵素の遺伝子は、配列番号３においてヌクレオチド１−２６４３に相当する塩基配列からなる。この合成酵素は、３−ヒドロキシプロピオン酸サイクルのうちＣｏＡ及びＡＴＰの存在下で３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを合成する酵素である（図１、２を参照）。本発明の製造方法においては、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素を使用することもできるが、該遺伝子の１ドメインである３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素を使用することが好ましい。
【００３１】
本発明の製造方法においては、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素として、例えば、公知のプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４４５０７９）を利用することができる。該酵素をコードする遺伝子は、ＡＦ４４５０７９に示されるヌクレオチド１−５４６９の塩基配列を有する。本明細書では、該遺伝子の塩基配列及びそれがコードする推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４として配列表に記載する。
【００３２】
本発明の一態様として、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ配列で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる。
【００３３】
本発明の好ましい態様として、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ配列で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質；又は
（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる。
【００３４】
本発明の別の態様として、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【００３５】
本発明の別の好ましい態様として、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、
（ａ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列から成る核酸；又は
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列から成る核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【００３６】
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子（本明細書中「ａｃｓ」と称することがある。）は、例えば、後述する実施例１に記載するように、配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列に基づいてプライマーとして合成ヌクレオチド（配列番号７及び８）を設計し、クロロフレクサス・アウランティアカスＤＳＭ６３６株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅することができる。
【００３７】
なお、実施例１に示すように、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子については、配列番号５及び６のプライマー、そして、３−ヒドロキシプロピオニル合成酵素遺伝子については、配列番号７及び８のプライマーを使用した場合、ＰＣＲ産物としてそれぞれ約３．７ｋｂｐ及び約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られるので、例えば、これらをアガロースゲル電気泳動等の分子量によりＤＮＡ断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って核酸を単離することができる。
【００３８】
ここで、核酸を増幅するための手法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ Ｄ．Ｙ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９））、及び転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ Ｄ．Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）； Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２））、自己保持配列複製（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０））、及びＱβレプリカーゼシステム（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１１９７−１２０２（１９８８））等の恒温反応を利用することができるが、これらに限定されない。本発明の製造法においては、ＰＣＲ法を使用することが好ましい。
【００３９】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，７．４２−７．４５（２００１）に示されるが、ニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０〜５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及び約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度及び洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
【００４０】
上記のような核酸増幅反応又はハイブリダイゼーション等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号１又は３に記載の塩基配列に対して少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する。
【００４１】
なお、同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３）を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。
【００４２】
タンパク質に関して、一般に、酵素のような生理活性を有するタンパク質において、そのアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維持されることがあることは周知である。また、天然産のタンパク質の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在等に起因して、１から数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは知られている。
【００４３】
したがって、上記の通り、本発明の製造方法において使用されるマロニル−ＣｏＡ還元酵素及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素は、典型的には、それぞれ配列番号２及び４に記載のアミノ酸配列を有するが、各酵素がそれぞれの活性を有する限り、当該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加等の変異が生じてもよい。ここで、用語「数個」とは、本明細書中で使用するとき、好ましくは２〜１００個、より好ましくは２〜５０個、さらにより好ましくは２〜２０個、最も好ましくは２〜１０個である。一般的には、部位特異的な変異によってアミノ酸が置換された場合に、元々のタンパク質が有する活性を保持する程度に置換が可能なアミノ酸の個数は、好ましくは１〜１０個である。
【００４４】
本発明の最も好ましい態様として、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする核酸、又は配列番号１で表される塩基配列から成る核酸である。
【００４５】
本発明の最も好ましい態様として、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子が配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする核酸、又は配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列から成る核酸である。
【００４６】
（２）組換えベクターの構築及び形質転換体の作製
本発明によれば、単離したマロニル−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターが提供される。各遺伝子は、同一のベクター又は別個のベクターに組み込むことができる。別個のベクターに各遺伝子を組み込む場合、各ベクターの種類は同一であるか又は異なっていてもよい。なお、上述の通り、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素は、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子の１ドメインを構成するため、本発明の製造方法においては、プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子（配列番号３）を組み込んだベクターを使用することもできる。
【００４７】
プラスミド等のベクターに遺伝子を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、タカラバイオ製等）を用いることもできる。
【００４８】
ベクターは、簡単には当業界において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、グラム陰性菌で自律複製することが知られている広宿主域ベクターｐＢＢＲ１−ＭＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ２３７５１）、ｐＪＲＤ２１５（Ｍ１６１９８）（Ｄａｖｉｓｉｏｎ，Ｊ．ら、（１９８７）Ｇｅｎｅ，５１，２７５−８０を参照）、ｐＪＢ８６１（Ｕ８２０００）、ｐＨＲＰ３１１（Ｐａｒａｌｅｓ，Ｒ．Ｅ．及びＨａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｓ．（１９９３）Ｇｅｎｅ，１３３，２３−３０を参照）が例示されるが、これらに限定されない。また、大腸菌用のプラスミドとして、例えば、ｐＢＡＤ２４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ８１８３７）、ｐＤＯＮＲ２０１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等を使用することができる。
【００４９】
当業者であれば、発現ベクターに適合するように制限末端を適宜選択することが可能である。また、当業者であれば、所望のタンパク質を発現させるために、宿主細胞に適した発現ベクターを適宜選択することができる。このようにベクターは、本発明で使用する遺伝子が目的の宿主細胞中で発現し得るように遺伝子発現に関与する領域（必要に応じて、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（カナマイシン耐性遺伝子など）、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列））が適切に配列されており又は導入することにより、該核酸が適切に発現するように構築されている又は構築することが好ましい。後述する実施例２に示すように、大腸菌においてアラビノースの添加で発現を誘導できるＢＡＤプロモーターを有するプラスミドｐＢＡＤ２４（上述）から転写因子ａｒａＣ、ＢＡＤプロモーター領域、マルチクローニングサイト、ｒｒｎＢターミネーター領域を含むＤＮＡ断片を切り出し、これらＤＮＡ断片、ｍｃｒ及びａｃｓ（上述）を広宿主域ベクターｐＢＢＲ−ＭＣＳ２に連結することにより、目的とする発現ベクター（ｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓ）を構築することができる。なお、本発明の製造方法においては、既存のベクターを使用することもでき、その種類は、原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されない。
【００５０】
一般的に、形質転換体は、発現ベクターを宿主細胞に組み込むことによって作製することができる。この場合、宿主細胞として原核細胞（例えば、大腸菌（Ｓ１７−１株等）、枯草菌）であっても真核細胞（哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても使用することができる。発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転換）は公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９））やコンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１））、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ラルストニア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属等に属する菌体への発現ベクターの導入では、接合伝達法を使用することができる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４７，１９８（１９８１））。
【００５１】
この接合伝達法は、簡単には、細胞同士の接触によって染色体ゲノム又はプラスミドを一方の細胞から他方の細胞に移行させる細胞の性質を利用したものであり、例えば、目的のＤＮＡを担持する自己伝達性プラスミドが導入された供与菌と該プラスミドを有しない受容菌との接合に始まり、両菌体における橋の形成、該プラスミドの複製と移行、並びにＤＮＡ合成の完了と共に菌体の分離といった一連の工程によって遺伝子導入を可能にする手段である。
【００５２】
本発明の製造方法に使用される宿主細胞は、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（Ｐ（３ＨＢ）生産能を有する機能を有する微生物であれば、特に限定されない。本発明によれば、このような機能を有する天然に存在する細胞（細菌）を使用してもよく、又は、遺伝子工学的手法により作製したこのような機能を発現する形質転換体（細胞株、菌株など）を使用してもよい。
【００５３】
本発明に使用されるＰ（３ＨＢ）生産能を有する微生物は、限定されないが、クプリアビダス属、ラルストニア属、アルカリゲネス属、ヒドロゲノモナス属、又はワウテルシア属に属する微生物を含む。好ましい態様として、本発明の製造方法に使用される微生物は、限定されないが、クプリアビダス・ネカトール、ラルストニア・ユートロファ、アルカリゲネス・ユートロファス、ヒドロゲノモナス・ユートロファ、又はワウテルシア・ユートロファである。さらに、クプリアビダス・ネカトールに属する菌体は、ＪＭＰ１３４株（ＤＳＭ４０５８）、Ｈ１６株（ＤＳＭ４２８）、ＤＳＭ５３１株、これらに由来する株、より好ましくはＪＭＰ１３４株、Ｈ１６株、最も好ましくはＪＭＰ１３４株である。本発明の製造方法に使用されるこれらの株は、例えば、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）又はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から容易に入手可能である。なお、後述する実施例３では、作製した発現ベクター（ｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓ）を大腸菌に塩化カルシウム法によって遺伝子導入した後に、接合伝達法を用いて、この大腸菌からＰ（３ＨＢ）合成能を有するクプリアビダス・ネカトールＪＭＰ１３４株に発現ベクターを移入させ、これを形質転換体として使用した。
【００５４】
（３）共重合ポリエステルの合成
ポリエステル合成は、上述した形質転換体を所定の培地で培養し、培養細胞（例えば、菌体）内又は培養物（例えば、培地）中に共重合ポリエステルを生成及び蓄積させ、培養細胞又は培養物から目的とする共重合ポリエステルを採取することにより行われる。なお、本発明の製造方法に使用される形質転換体の培養法は、通常、宿主細胞の培養に使用される方法に従って行われる。
【００５５】
クプリアビダス属、ラルストニア属、アルカリゲネス属、ヒドロゲノモナス属、ワウテルシア属、シュードモナス属等に属する菌体を宿主とした場合の培地として、微生物が資化し得る炭素源を添加し、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源のいずれかを制限した培地が挙げられる。典型的には、培地温度を２５℃〜３７℃の範囲にし、好気的に１〜１０日培養することにより、共重合ポリエステルを菌体内に生成し蓄積させ、その後、回収・精製することによって所望の共重合ポリエステルを調製することができる。
【００５６】
本発明の製造方法で使用される菌体は、水素細菌であり、分子状水素と酸素の反応（爆鳴気反応）によって得られるエネルギーを利用し、炭酸を唯一の炭素源として成長し得る細菌として知られている。ここで、炭素源として、限定されないが、フルクトース、グルコース、スクロース、マルトース等が挙げられる。また、その他の炭素源として、グルコン酸、オクタン酸、大豆油、コーン油、オリーブ油、ヤシ油、ドデカン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸等の脂肪酸、又はこれらの脂肪酸エステル、アルコール類を使用してもよい。また、当業者であれば、使用する炭素源の濃度、種類等を適宜選択することができる。
【００５７】
また、必要であれば、培地中に窒素源や無機物を添加してもよい。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニア、ペプトン、酵母エキス等が列挙される。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化ナトリウム等が列挙される。
【００５８】
培養は、通常、振とう培養が用いられ、好気的条件下で、２５℃〜３７℃で遺伝子発現誘導後少なくとも１日以上行うことが好ましい。抗生物質として、カナマイシン、アンピシリン等を培地に添加してもよい。また、遺伝子発現誘導剤として、アラビノース、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を使用することができる。当業者であれば、所望の遺伝子発現のために可能な培養条件、遺伝子発現の誘導条件等を適宜選択できる。
【００５９】
（４）共重合ポリエステルの精製と構造解析
本発明において、共重合ポリエステルは、下記の通り精製することができる：培地から遠心分離によって形質転換体を回収し、蒸留水で洗浄後、乾燥又は凍結乾燥させる。その後、クロロホルムに乾燥した形質転換体を懸濁させ、室温で所定時間撹拌し、共重合ポリエステルを抽出する。抽出の段階で、必要であれば加熱してもよい。濾過によって残渣を除去し、上清にメタノールを加えて共重合ポリエステルを沈殿させ、沈殿物を濾過又は遠心分離によって、上清を除去し、乾燥させて精製した共重合ポリエステルを得ることができる。
【００６０】
得られた共重合ポリエステルが所望のものであることを確認するための手段は、限定されないが、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、ガスクロマトグラフィーを用いる方法を含む。本発明によれば、共重合ポリエステルのモノマーユニットの比、即ち、３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）の比を遺伝子発現条件、培養条件等を変えることにより適宜調節することができる。本発明の製造方法によって得られる共重合ポリエステルの３ＨＰ分率は、好ましくは０．０１〜２０モル％、より好ましくは０．０５〜２０モル％、さらにより好ましくは０．１〜１０モル％、さらになおより好ましくは０．１〜５．０モル％、最も好ましくは０．１〜２．０モル％である。用語「モル％」は、本明細書中で使用するとき、多成分系における各成分のモル数の和で、ある成分のモル数を割ったものをいう。例えば、本発明の製造方法により得られる共重合体の一般式を３ＨＢ及び３ＨＰのモノマーユニットの数として、それぞれ「ｘ」及び「ｙ」を用いて表記した場合（図６を参照）、３ＨＰ分率は、式：ｙ×１００／（ｘ＋ｙ）により求めることができる。なお、後述する実施例５で示すように、本発明の製造方法により、３ＨＰ分率が異なる共重合ポリエステルを得ることができた（表１等）。また、ＮＭＲによって、共重合体であることを確認した（図６）。
【００６１】
また、本発明の製造方法によって得られる共重合ポリエステルの平均分子量（例えば、重量平均分子量（Ｍｗ）及び数平均分子量（Ｍｎ））は、当業者に周知な方法、例えば、クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法、粘度法、末端基定量法、浸透圧法、光散乱法、沈降速度法により測定することができる。本明細書中で使用するとき、用語「重量平均分子量（Ｍｗ）」は、多分散系高分子化合物の分子量を意味する。具体的には、分子量Ｍｉの分子がｎｉ個（ｉ＝１、２、・・・）ある多分散系における重量平均分子量は、下式：
【化１】
で表される。本発明の製造方法によって得られる共重合ポリエステルの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは１×１０5〜３×１０6、より好ましくは５×１０5〜２×１０6、さらにより好ましくは１×１０6〜１．５×１０6である。また、用語「数平均分子量（Ｍｎ）」は、２個以上の原子より分子が構成されているときの平均分子量でｉ番目の原子量をＭｉ、その数をＮｉ個とすると、下式：
【化２】
で表される。本発明の共重合ポリエステルの数平均分子量（Ｍｎ）は、好ましくは５×１０4〜１．５×１０6、より好ましくは１×１０5〜１×１０6、さらにより好ましくは１×１０5〜５×１０5である。なお、後述する実施例６において共重合ポリエステルの分子量測定を行った結果、Ｍｗ＝約１．１６×１０6、Ｍｎ＝約３．３６×１０5であったことから、本発明の共重合ポリエステルは、従来技術によって得られる一般的な共重合ポリエステル（重量平均分子量：約１×１０3〜５×１０4）と比較して、非常に大きな分子量を有すると言える。
【００６２】
本発明の共重合ポリエステルの分子量分布は、Ｍｗ／Ｍｎ（分散比）によって表すことができる。分散比は、好ましくは２以上、より好ましくは３以上である。分散比が２以上の場合、共重合ポリエステルの網目が良好であることが予測される。
【００６３】
また、本発明の製造方法によって製造された共重合ポリエステルは、乾燥菌体重量当り１重量％以上、好ましくは１０重量％以上、より好ましくは２０重量％以上、さらにより好ましくは３０重量％以上、最も好ましくは５０重量％以上の割合で菌体に蓄積される。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１ マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子のクローニング
緑色非硫黄細菌クロロフレクサス・アウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＤＳＭ６３６株（ＤＳＭＺより入手）の凍結乾燥菌体を３ｍｌの滅菌生理食塩水に懸濁した後、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻、２．４．３頁、１９９４年；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ出版）により染色体ＤＮＡを得た。
【００６５】
また、公知のクロロフレクサス・アウランティアカス由来のマロニル−ＣｏＡ還元酵素の遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ５３００１９）（配列番号１を参照）に基づいて、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ｍｃｒ）を増幅するために、該遺伝子配列に相同な下記のプライマー：
配列１：GGGGAATTCATGAGCGGAACAGGACGACTGG（配列番号５）
（下線部：配列番号１のヌクレオチド１−２２に対応）
配列２：GTAGAATTTACACGGTAATCGC（配列番号６）
（下線部：配列番号１のヌクレオチド３６６３−３６４９に対応）
を設計した。
【００６６】
公知のクロロフレクサス・アウランティアカス由来のプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素の遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４４５０７９）（配列番号３を参照）に基づいて、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子（ａｃｓ）を増幅するために、該遺伝子配列中の３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子に相当する部分に相同な下記のプライマー：
配列３：GCAGGAGGAATTACCATGATCGACACTGCGCCCCTTG（配列番号７）
（下線部：配列番号２のヌクレオチド１−２２に対応）
配列４：GGGGAATTCTTATGTCACCGTCACTACCGCG（配列番号８）
（下線部：配列番号２のヌクレオチド２６４３−２６２５に対応）
を設計した。なお、配列番号８の塩基１２−１０（ＡＴＴ）は、終始コドン（ＴＡＡ）の相補配列に対応し、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素が、配列番号３のヌクレオチド１−２６４３のみから翻訳されるよう付加した。
【００６７】
抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列１及び配列２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｍｃｒを増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤプラス（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で３０秒、７０℃で４分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。また、ａｃｓは配列３及び配列４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ法によって同様に増幅した。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で３０秒、６２℃で３０秒、６８℃で４分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
【００６８】
増幅したｍｃｒをＴ４キナーゼ（トーヨーボー社製）を用いて５’−末端をリン酸化した。また、ベクタープラスミドｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）を制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、脱リン酸化した状態で市販されているもの（タカラバイオ社製）と、リン酸化したｍｃｒ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（トーヨーボー社製）を用いて連結した。次いで、得られた組換えプラスミドを制限酵素ＳｍａＩで切断し、アルカリホスファターゼ（ロシュ社製）で脱リン酸化した。これと５’−リン酸化したａｃｓ断片を連結した。この際、ｍｃｒ−ａｃｓの順で同方向に連結された組換えプラスミドｐＵＣ−ｍｃｒａｃｓを選抜した。
【００６９】
実施例２ 組換えベクターの構築
多くのグラム陰性菌で自律複製することが知られている広宿主域ベクターｐＢＢＲ１−ＭＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ２３７５１）を制限酵素ＳｓｐＩで切断し、複製起点等を含むＤＮＡ断片を単離して脱リン酸化処理を行った。また、大腸菌においてアラビノースの添加で発現を誘導できるＢＡＤプロモーターを有するプロモーターを有するプラスミドｐＢＡＤ２４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ８１８３７）を制限酵素ＢａｎＩＩＩとＡｌｗ４４Ｉで切断し、転写因子ａｒａＣ、ＢＡＤプロモーター領域、マルチクローニングサイト、ｒｒｎＢターミネーター領域を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片をＢｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈ（トーヨーボー社製）を用いて末端平滑化し、次いで、上述のｐＢＢＲ１−ＭＣＳ２ ＳｓｐＩ断片と連結した。得られたｐＢＢＲ−ＢＡＤ（図３）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して脱リン酸化処理し、ｐＵＣ−ｍｃｒａｃｓから制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出したｍｃｒ−ａｃｓ断片と連結することで発現ベクターｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓ（図４）を構築した。また、このｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓを制限酵素ＸｂａＩで切断した後に、セルフライゲーションした。この処理によって、ａｃｓ領域を除去し、ｍｃｒ領域のみを含むｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒ（図５）を得た。
【００７０】
実施例３ 形質転換体の作製
得られた組換えプラスミドを用いて、Ｐ（３ＨＢ）生産菌であるクプリアビダス・ネカトールＪＭＰ１３４株（ＤＳＭ４０５８）又はＨ１６株（ＤＳＭ４２８）（ＤＳＭＺより入手）を接合伝達法によって形質転換した。まず、塩化カルシウム法によって、ｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓを大腸菌Ｓ１７−１株に導入した。次に、この組換え大腸菌をＬＢ培地（１％イーストエキス、０．５％トリプトン、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）１．５ｍｌ中で、３７℃で終夜培養した。これと並行して、クプリアビダス・ネカトールＪＭＰ１３４株又はＨ１６株をＮＲ培地（１％魚肉エキス、１％ポリペプトン、２％酵母エキス）１．５ｍｌ中で、３０℃で終夜培養した。その後、それぞれの培養液０．１ｍｌを混合して３０℃で４時間培養した。この菌体混合液を０．３ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＳｉｍｍｏｎｓ Ｃｉｔｒａｔｅ寒天培地（ディフコ社製）に塗布し、３０℃で５日間培養した。組換え大腸菌中のプラスミドが、クプリアビダス・ネカトールに伝達された場合、該菌体はカナマイシン耐性を示し、一方、組換え大腸菌はＳｉｍｍｏｎｓ Ｃｉｔｒａｔｅ寒天培地では増殖不能であるため、上記培地上で増殖したコロニーは、組換え大腸菌からｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓが伝達したクプリアビダス・ネカトール形質転換体である。ｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓをＪＭＰ１３４株に接合伝達した株を「ＪＭＡ６４株」、ｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒを伝達した株を「ＪＭ３７株」、ｐＢＢＲ−ＢＡＤを伝達した株を「ＪＢＡＤ株」と命名した。また、Ｈ１６株にｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓを接合伝達した株を「ＨＭＡ６４株」と命名した。
【００７１】
実施例４ クプリアビダス・ネカトール形質転換体による共重合ポリエステル合成
クプリアビダス・ネカトール形質転換体による共重合ポリエステル合成は、下記に示すように一段培養及び二段培養で行った。
（ａ）一段培養
ＮＲ培地（前述）で前培養したクプリアビダス・ネカトール形質転換体を１００ｍｌのＭＢ−Ｆｒｃ培地（０．９％ リン酸二ナトリウム、０．１５％ リン酸一カリウム、０．０５％ 塩化アンモニウム、１％ 微量金属溶液、０．５％又は２％ フルクトース）に植菌し、坂口フラスコ中、３０℃で７２時間振とう培養した。培養開始後８〜２４時間で遺伝子発現誘導剤であるアラビノースを所定量（０〜０．１％、表１等を参照）で添加した。
【００７２】
（ｂ）二段培養
０．１ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＮＲ培地でクプリアビダス・ネカトール形質転換体を３０℃、２４時間培養した。その後、遠心分離及び洗浄した菌体を０．１ｍｇ／ｍｌのカナマイシン及び所定量（０〜０．１％、表１等を参照）のアラビノースを添加した１００ｍｌ ＭＢ−Ｆｒｃ培地（塩化アンモニウム不含）に移し、３０℃で４８時間培養した。
【００７３】
いずれの場合も培養終了後に遠心分離によって菌体を回収し、蒸留水で洗浄して凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
乾燥菌体１０〜３０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することにより、菌体内ポリエステル分解物のメチルエステルを得た。これに１ｍｌの蒸留水を添加して激しく撹拌した。静置して二層に分離させた後、下層の有機層を取り出した。有機層０．１ｍｌに０．１％のオクタン酸メチル・クロロホルム溶液を０．１ｍｌ、ジメチルホルムアミドを０．３ｍｌとビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドを０．１ｍｌを添加し、７０℃で３０分加熱して水酸基をトリメチルシリル化した。室温まで冷却し、１ｍＬのヘキサン及び１ｍＬのＨ2Ｏを添加して激しく撹拌し、静置後、上層の有機層をキャピラリーガスクロマトグラフィーによって分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所製ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＩｎｅｒｔＣａｐ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。温度条件は、初発温度１００℃から８℃／分の速度で昇温した。
【００７４】
一段培養では、親株であるＪＭＰ１３４株は、Ｐ（３ＨＢ）ホモポリマーのみが蓄積するが、これに対して、ＪＭＡ６４株は、アラビノースを０．０１％以上添加した場合に、３ＨＰ分率が０．７〜１．０モル％であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体を乾燥菌体重量当り５３〜５６重量％蓄積した。この際、アラビノースを添加しない、又は低濃度０．００１％の場合では、３ＨＰユニットの導入が見られなかったことから、導入したｍｃｒ−ａｃｓ遺伝子がアラビノースによって発現誘導され機能することがＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体の合成において必要であることがわかる（表１）。
【００７５】
二段培養の場合でも、ＪＭＰ６４株はアラビノース０．０１％以上の添加で３ＨＰ分率０．９〜１．９モル％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体を乾燥菌体重量当り２５〜２９重量％蓄積した。フルクトース濃度の違いによる影響は見られなかった（表１）。
【００７６】
【表１】
【００７７】
炭素源を脂肪酸（ドデカン酸）としても、３ＨＰ分率０．８モル％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体を乾燥菌体重量当り４９．１重量％蓄積した（表２）。
【００７８】
【表２】
【００７９】
また、ａｃｓを有しないｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒを伝達したＪＭ３７株、及びｍｃｒ、ａｃｓを両方とも有しないｐＢＢＲ−ＢＡＤを伝達したＪＢＡＤ株では、Ｐ（３ＨＢ）ホモポリマーのみが蓄積したことからも、ｍｃｒ、ａｃｓ両遺伝子が発現し機能することがＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体の合成において必要であることがわかる（表３）。さらに、Ｈ１６株を宿主としたＨＭＡ６４株においてもＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体の合成が確認できた。Ｈ１６株由来のＨＭＡ６４株では、糖質や脂肪酸に加え、植物油を炭素源とすることができる（表４）。
【００８０】
【表３】
【００８１】
【表４】
【００８２】
実施例５ 共重合ポリエステルの精製と構造解析
０．５％フルクトースで二段培養したクプリアビダス・ネカトールＪＭＰ６４株（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−１．９ｍｏｌ％３ＨＰ）を２４．５重量％で蓄積）の凍結乾燥菌体１５０ｍｇをクロロホルムに懸濁し、室温で４８時間撹拌した。フィルターで濾過し、上清の５倍量のメタノールを加え、沈殿したポリエステルを濾過により回収した。真空乾燥後の秤量により、２９．３ｍｇのポリエステルを得た。全量を重クロロホルムに溶解し、1Ｈ−ＮＭＲにより構造解析した（図６）。３−ヒドロキシプロピオニル基中の３位の炭素に結合したメチレン基に由来する水素のシグナルが４．３５ｐｐｍ付近に観察されたことから、このポリエステルがＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体であることが確認できた。ピーク面積積分値から３ＨＰ分率１．６モル％と産出された。これはガスクロマトグラフィーによる結果（１．９モル％）とほぼ一致している。
【００８３】
実施例６ 共重合ポリエステルの分子量測定
実施例５により得られた共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−１．９ｍｏｌ％３ＨＰの分子量測定は、クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法により行った。高速液体クロマトグラフィーは、島津製作所製ＬＣ−１０Ａ ＧＰＣを用い、カラムはショーデックス社製Ｋ８０６ＭカラムとＫ８０２カラムを連結して用いた。移動相は、クロロホルム０．８ｍｌ／分とし、乾燥菌体より精製した共重合体のクロロホルム溶液（濃度１ｍｇ／ｍｌ）を分析サンプルとした。分子量計算のための検量線はポリスチレン標準品により作製した。これにより、重量平均分子量（Ｍｗ）＝約１．１６×１０6、数平均分子量（Ｍｎ）＝３．３６×１０5が得られた。また、この共重合体の分散比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、約３．４５となる。したがって、本発明の製造方法によって、高分子量であり、かつ分子量分布のやや広い共重合ポリエステルが得られた。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の製造方法によって、安価なバイオマスを基本炭素源としてポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ））を生産することができ、さらに、３ＨＰ分率の高い共重合体を得ることができる。このような共重合ポリエステルは、熱安定や成形性に優れており、Ｐ（３ＨＢ）と比べて耐衝撃性に優れた生分解性プラスチックとなる点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、緑色非硫黄細菌クロロフレクサス・アウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）で提唱されている３−ヒドロキシプロピオン酸サイクルの概略図を示す。各酵素は、（１）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、（２）マロニル−ＣｏＡレダクターゼ、（３）プロピオニル−ＣｏＡ合成酵素、（４）プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、（５）メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、（６）メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、（７）スクシニル−ＣｏＡ：Ｌ−リンゴ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、（８）スクシニル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、（９）フマラーゼ、（１０）Ｌ−マリル−ＣｏＡリアーゼである。この概略図は、Ｂ．Ｅ．Ａｌｂｅｒ及びＧ．Ｆｕｃｈｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１２１３７−１２１４３（２００２）より転載した。
【図２】図２は、人工代謝経路によるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）共重合体の生合成のスキームを示す。
【図３】図３は、構築した組換えベクターｐＢＢＲ−ＢＡＤを示す。
【図４】図４は、構築した組換えベクターｐＢＢＲ−ＢＡＤ−ｍｃｒａｃｓを示す。
【図５】図５は、構築した組換えベクターｐＢＢ−ＢＡＤ−ｍｃｒを示す。
【図６】図６は、ラルストニア・ユートロファＪＭＰ６４株でフラクトースより合成したＰ（３ＨＢ−ｃｏ−１．６ｍｏｌ％３ＨＰ）の1Ｈ−ＮＭＲによる解析結果を示す。式中の各番号は、ＮＭＲデータ中の各ピークの番号に対応する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）生産能を有するクプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ヒドロゲノモナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ）属、又はワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属に属する微生物をマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換し、炭素源を含有する培地で形質転換体を増殖させることにより、形質転換体内でポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）を製造する方法。
【請求項２】
微生物が、クプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）、ラルストニア・ユートロファス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、ヒドロゲノモナス・ユートロファ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、又はワウテルシア・ユートロファ（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
クプリアビダス・ネカトールが、ＪＭＰ１３４株（ＤＳＭ４０５８）又はＨ１６株（ＤＳＭ４２８）である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子が、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸から成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子が、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子が、
（ａ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を含み、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子が、
（ａ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
製造されるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）に含有する３−ヒドロキシプロピオン酸分率が０．０１〜２０モル％であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
製造されるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）が重量平均分子量１×１０5〜３×１０6を有することを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法において使用される、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換した形質転換体。
【請求項１】
ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）生産能を有するクプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ヒドロゲノモナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ）属、又はワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属に属する微生物をマロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換し、炭素源を含有する培地で形質転換体を増殖させることにより、形質転換体内でポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）を製造する方法。
【請求項２】
微生物が、クプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）、ラルストニア・ユートロファス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、ヒドロゲノモナス・ユートロファ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、又はワウテルシア・ユートロファ（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
クプリアビダス・ネカトールが、ＪＭＰ１３４株（ＤＳＭ４０５８）又はＨ１６株（ＤＳＭ４２８）である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子が、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸から成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子が、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマロニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子が、
（ａ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；又は
（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１−８８１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を含み、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子が、
（ａ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１−２６４３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−ヒドロキシプロピオン酸から３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
製造されるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）に含有する３−ヒドロキシプロピオン酸分率が０．０１〜２０モル％であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
製造されるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）が重量平均分子量１×１０5〜３×１０6を有することを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法において使用される、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子及び３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換した形質転換体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−２１２１１４（Ｐ２００８−２１２１１４Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５７２６９（Ｐ２００７−５７２６９）
【出願日】平成１９年３月７日（２００７．３．７）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月７日（２００７．３．７）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【Ｆターム（参考）】
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