再発癌の予防または治療用医薬
【課題】原発巣以外における癌の再発を予防または治療する医薬を提供すること。
【解決手段】少なくとも１回以上の癌治療を行った後にＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質を有効成分とする医薬を投与することにより、ＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における癌の再発を予防または治療することができる。
【解決手段】少なくとも１回以上の癌治療を行った後にＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質を有効成分とする医薬を投与することにより、ＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における癌の再発を予防または治療することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再発癌の予防または治療用医薬に関するものであり、詳細には、ＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における再発を予防または治療するために用いられる医薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
急性リンパ芽球性白血病（以下「ＡＬＬ」という。）は、小児の最も一般的な悪性疾患である。治療方法の向上により小児科患者の５年生存率は８０％に上昇したが、様々なリスクファクターを有する少数の患者には、未だ予後不良が予想される。特に、再発したＡＬＬの生存率は３０％に過ぎない。
【０００３】
近年、骨髄微小環境は白血病治療反応に必須の要素であることが観察された（非特許文献１）。骨髄微小環境は、特異的なシグナリング分子、成長因子、サイトカインおよびケモカインを産生または分泌する特定の間質細胞から成る（非特許文献２）。骨髄微小環境は、正常な造血細胞の生存、増殖および分化を調節することが知られている（非特許文献３）。白血病細胞と造血微小環境との相互作用は、骨髄における正常な造血前駆細胞間の相互作用と様々な点で類似していることが報告されている（非特許文献４）。骨髄微小環境は白血病細胞に生存および成長のための因子を与え、化学療法に対する反応を変化させる。さらに白血病の再発に寄与する可能性がある（非特許文献１、４）。
【０００４】
髄外臓器へ広範に浸潤することが白血病の特徴である。白血病細胞は、末梢血中を移動することによってすべての臓器に容易に広がることができるが、最も顕著な変化は肝臓、脾臓およびリンパ節で見出される。特に、肝腫大は最も頻繁に観察される髄外浸潤の１つであり、ＡＬＬ患者の３０−５０％という高率で診断時に検出される（非特許文献５）。生検および剖検標本の病理組織学的解析から、ＡＬＬ患者の肝臓の門脈域にＡＬＬ細胞が蓄積することが示されている（非特許文献６）。しかし、この病変に寄与する分子レベルのメカニズムについてはほとんど解明されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Iwamoto, S., Mihara, K., Downing, J.R., Pui, C.H., and Campana, D. 2007. Mesenchymal cells regulate the response of acute lymphoblastic leukemia cells to asparaginase. J Clin Invest 117:1049-1057.
【非特許文献２】Yin, T., and Li, L. 2006. The stem cell niches in bone. J Clin Invest 116:1195-1201.
【非特許文献３】Ara, T., Tokoyoda, K., Sugiyama, T., Egawa, T., Kawabata, K., and Nagasawa, T. 2003. Long-term hematopoietic stem cells require stromal cell-derived factor-1 for colonizing bone marrow during ontogeny. Immunity 19:257-267.
【非特許文献４】Ishikawa, F., Yoshida, S., Saito, Y., Hijikata, A., Kitamura, H., Tanaka, S., Nakamura, R., Tanaka, T., Tomiyama, H., Saito, N., et al. 2007. Chemotherapy-resistant human AML stem cells home to and engraft within the bone-marrow endosteal region. Nat Biotechnol 25:1315-1321.
【非特許文献５】Reiter, A., Schrappe, M., Ludwig, W.D., Hiddemann, W., Sauter, S., Henze, G., Zimmermann, M., Lampert, F., Havers, W., Niethammer, D., et al. 1994. Chemotherapy in 998 unselected childhood acute lymphoblastic leukemia patients. Results and conclusions of the multicenter trial ALL-BFM 86. Blood 84:3122-3133.
【非特許文献６】Alastair D. Burt, B.C.P., Linda D. Ferrell. 2007. MacSween's Pathology of the Liver 992 pp.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、癌の原発巣以外における再発の分子レベルのメカニズムを解明し、当該メカニズムを阻害する物質を用いることにより、少なくとも１回以上の癌治療を行った後に投与することで原発巣以外における癌の再発を予防または治療する医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質を有効成分とし、ＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における再発を予防または治療するために用いられ、少なくとも１回以上の癌治療を行った後に投与されることを特徴とする再発癌の予防または治療用医薬。
［２］ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質が、抗ＣＸＣＲ４中和抗体、抗ＳＤＦ−１中和抗体、ＡＭＤ３１００およびＡＭＤ３４６５からなる群より選択されることを特徴とする前記［１］に記載の医薬。
［３］ＣＸＣＲ４を発現する癌が、白血病、悪性リンパ腫、乳癌、肺癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、直腸癌、前立腺癌、メラノーマ、腎細胞癌および卵巣癌からなる群より選択されることを特徴とする前記［１］に記載の医薬。
［４］癌治療が、化学療法、放射線療法または免疫療法であることを特徴とする前記［１］に記載の医薬。
［５］ＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における再発を予防または治療するために用いられ、少なくとも１回以上の癌治療を行った後に投与される医薬の製造のためのＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、少なくとも１回以上の癌治療を行った後に投与することで原発巣以外における癌の再発を予防または治療する医薬を提供することができる。本発明は、癌患者に福音をもたらすものであり、その社会的意義は極めて大きなものである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】症例１，２，３からそれぞれ白血病細胞を移植されたＮＯＧマウスにおいて全骨髄細胞中の白血病細胞の割合の推移を示す図である。
【図２】移植後５か月目のＮＯＧマウスの骨髄における白血病細胞の割合を症例ごとに示す図である。
【図３】症例１由来の白血病細胞を移植されたＮＯＧマウスから経時的に採取した骨髄標本にヘマトキシリン−エオジン染色（Ｈ−Ｅ染色）および抗ヒトＣＤ４５抗体を用いた免疫染色を施し、顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図４】（Ａ）は、症例１の患者骨髄、初代異種移植ＮＯＧマウスの骨髄および３代目異種移植ＮＯＧマウスの骨髄から採取した細胞の形態を観察した結果を示す図であり、（Ｂ）は症例１，２，３の患者骨髄、初代異種移植ＮＯＧマウスの骨髄および３代目の異種移植ＮＯＧマウスの骨髄から採取した細胞をフローサイトメトリー分析した結果を示す図である。
【図５】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスおよび正常マウスから採取した臓器を比較した図である。
【図６】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの骨髄、脾臓、肝臓および腎臓の組織標本にＨ−Ｅ染色を施し、顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図７】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓組織標本（Ｈ−Ｅ染色）を作製し、門脈域を顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図８】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓について経時的に組織標本（Ｈ−Ｅ染色）を作製し、門脈域および類洞域を顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図９】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの骨髄、肝臓および脾臓から回収した白血病細胞における表面抗原の発現を分析した結果を示す図である。
【図１０】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの代表的な一例の骨髄、肝臓および脾臓から回収した白血病細胞表面のＣＸＣＲ４発現をフローサイトメトリー分析した結果を示す図である。
【図１１】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓におけるＳＤＦ−１陽性細胞、ヒトＣＤ４５陽性細胞、ＢｒｄＵ陽性細胞を観察した結果を示す図である。
【図１２】門脈域と類洞域におけるＢｒｄＵ陽性細胞率を比較した結果を示す図である。
【図１３】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓、末梢血および骨髄中の白血病細胞についてＳ期およびＧ２／Ｍ期（ピロニンＹ陽性＋Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３２４陽性）の細胞の割合を測定した結果を示す図である。
【図１４】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの代表的な一例の肝臓、末梢血および骨髄中の白血病細胞について細胞周期をフローサイトメトリー分析した結果を示す図である。
【図１５】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓から回収した白血病細胞を用いて、ＳＤＦ−１に対する遊走性を試験した結果を示す図である。
【図１６】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓から回収した白血病細胞を用いて、ＳＤＦ−１に対する遊走性をチェッカーボード法で試験した結果を示す図である。
【図１７】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓から回収した白血病細胞を用いて、ＳＤＦ−１の存在下または非存在下でコロニーアッセイを行った結果を示す図である。
【図１８】ＳＤＦ−１刺激がＥＲＫ１／２およびＡＫＴのリン酸化を誘導すること、およびＡＭＤ３１００がリン酸化を抑制することを確認したウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図１９】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの骨髄および肝臓から回収した白血病細胞を別のＮＯＧマウスに移植して、その増殖速度を比較した結果を示す図である。
【図２０】Ａｒａ−Ｃを単回腹腔内投与したヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの末梢血中白血病細胞数を経時的に測定した結果を示す図である。
【図２１】Ａｒａ−Ｃ投与前後のヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓組織標本（Ｈ−Ｅ染色）を顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図２２】ＡＭＤ３１００の効果確認試験のプロトコールを示す図である。
【図２３】ＡＭＤ３１００投与マウスと生理食塩液投与マウスの肝臓組織標本（Ｈ−Ｅ染色）を作製し、顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図２４】ＡＭＤ３１００投与マウスと生理食塩液投与マウスからそれぞれ摘出した肝臓および脾臓を比較した図である。
【図２５】（Ａ）は、ＡＭＤ３１００投与群および溶媒対照群からそれぞれ摘出した肝臓および脾臓中の白血病細胞数を示す図であり、（Ｂ）は、各群の肝臓および脾臓の重量を示す図である。
【図２６】溶媒対照群の各臓器の白血病細胞数に対するＡＭＤ３１００投与群の白血病細胞数の減少率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明者らは、自ら開発した高度免疫不全マウスであるＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌマウス（以下「ＮＯＧマウス」（登録商標）と称する。特許第３７５３３２１号、Ito, M., et al. 2002. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood 100:3175-3182.）にヒト白血病細胞を移植することで、ヒト髄外における白血病細胞の動態が再現可能な白血病動物モデルを構築できることを見出し、当該モデルを用いてＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスがＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における癌細胞の浸潤および増殖に関与することを世界に先駆けて見出した。さらに、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質を癌治療後に投与することにより、原発巣以外における癌細胞の浸潤および増殖を抑制できることを見出した。
【００１１】
本発明の医薬は、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質を有効成分とし、少なくとも１回以上の癌治療を行った後に投与されることを特徴とするものである。本発明の医薬を用いることにより、ＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における再発を予防または治療することができる。
【００１２】
ＣＸＣＲ４を発現する癌としては、白血病、悪性リンパ腫、乳癌、肺癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、直腸癌、前立腺癌、メラノーマ、腎細胞癌、卵巣癌などが挙げられる。中でも、白血病、悪性リンパ腫、直腸癌、メラノーマおよび腎細胞癌が好ましく、さらに好ましくは白血病および悪性リンパ腫であり、特に好ましくは白血病である。
癌治療は特に限定されないが、好ましくは、化学療法、放射線療法または免疫療法である。
「少なくとも１回以上の癌治療を行った後」とは、対象の原発癌に対して第１回目の治療を行った後であればいつでもよく、特に限定されない。好ましくは、癌治療を行った後、できるだけ早期に投与を開始する。投与期間も特に限定されないが、好ましくは１〜２年である。
「原発巣以外における再発」とは、癌治療前に癌細胞の存在が認められていない臓器や組織、または癌治療により癌細胞の減少が確認された原発巣以外の臓器や組織において、癌治療後に癌細胞の存在や増加が認められる現象を意味する。
【００１３】
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質は、ＣＸＣＲ４とＳＤＦ−１との結合によるシグナル伝達を遮断または減弱できる物質を意味し、その具体的な作用機序は限定されない。例えば、ＣＸＣＲ４に作用してＣＸＣＲ４とＳＤＦ−１との結合を阻害する物質、ＳＤＦ−１に作用してＣＸＣＲ４とＳＤＦ−１との結合を阻害する物質、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４複合体に作用してそのシグナル伝達を阻害する物質、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスのシグナル伝達の下流に作用してそのシグナル伝達を阻害する物質などが挙げられる。また、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質としては、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物などが含まれる。
【００１４】
公知のＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質として、抗ＣＸＣＲ４中和抗体、抗ＳＤＦ−１中和抗体（Journal of Biological Chemistry 283.34.23189-23199,2008）、ＡＭＤ３１００（Journal of Biological Chemistry 279.4.3033-3041,2004）、ＡＭＤ３４６５などが知られており、これらは本発明の医薬の有効成分として好適に使用することができる。好ましくはＡＭＤ３１００である。ＡＭＤ３１００はすでに自家移植用幹細胞動員薬としてＦＤＡに承認されて臨床で使用されており（商品名：Ｍｏｚｏｂｉｌ）、抗癌剤のような重篤な副作用は報告されていないので、癌の再発予防または治療用医薬として、また長期間投与する医薬として、患者の治療生活におけるＱＯＬ向上に寄与することが期待できる。
【００１５】
抗ＣＸＣＲ４中和抗体および抗ＳＤＦ−１中和抗体は本発明の医薬の有効成分として好適に使用することができる。抗ＣＸＣＲ４中和抗体はＣＸＣＲ４に結合してその活性を減退または消失させる抗体であればよい。抗ＣＸＣＲ４中和抗体はＣＸＣＲ４またはそのフラグメントを免疫原として用い、後述する公知の方法で作製することができる。得られた抗体が中和抗体であることは、得られた抗体によりＣＸＣＲ４の活性が中和されることを調べることによって確認することができる。また、抗ＳＤＦ−１中和抗体はＳＤＦ−１に結合してその活性を減退または消失させる抗体であればよい。抗ＳＤＦ−１中和抗体はＳＤＦ−１またはそのフラグメントを免疫原として用い、後述する公知の方法で作製することができる。得られた抗体が中和抗体であることは、得られた抗体によりＳＤＦ−１の活性が中和されることを調べることによって確認することができる。
【００１６】
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質が抗体の場合、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等）でもよい。ポリクローナル抗体は、例えば以下のようにして作製し、取得することができる。すなわち、抗原をＰＢＳ等に溶解し、必要に応じて通常のアジュバント（例えばフロイント完全アジュバント）を適量混合したものを免疫原として哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を免疫する。免疫方法は特に限定されないが、例えば、１回または適当な間隔で複数回、皮下注射または腹腔内注射する方法が好ましい。次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより取得することができる。モノクローナル抗体は、上記免疫された哺乳動物から得た免疫細胞（例えば脾細胞）とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによって得ることができる。また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換え型のモノクローナル抗体を産生させることもできる。
【００１７】
抗体をヒトに適用する場合には、ヒトの抗体と同じ定常領域を持つように改変したキメラ抗体、ＣＤＲ（complementarity determining region：相補性決定領域）以外の領域をヒト由来としたヒト化抗体を用いることが好ましく、さらには、抗体産生に関与するヒト遺伝子を導入したマウス等のトランスジェニック動物を用いて産生したヒト型モノクローナル抗体を用いることがさらに好ましい。また、ヒト型抗体産生にはファージディスプレー法を用いることもできる。このようにして得られた抗体の抗原認識領域をプローテアーゼ等で切り出し、Ｆｖ、ＦａｂやＦ（ａｂ’）２として用いることもできる。
【００１８】
本発明の医薬は、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とし、医薬品分野で通常使用される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００１９】
このような添加剤として、具体的には、乳糖、白糖、マンニトール、塩化ナトリウム、ブドウ糖、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸塩等の賦形剤；水、エタノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースＮａ、セラック、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、デキストリン、プルラン等の結合剤；クエン酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、無水リン酸一水素ナトリウム、無水リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；カルメロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピセルロース、カルメロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスポビドン、ポリソルベート８０等の崩壊剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の他の吸収促進剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール、コロイド状ケイ酸、ショ糖脂肪酸類等の滑沢剤；黄酸化鉄、黄色三二酸化鉄、三二酸化鉄、βカロテン、酸化チタン、食用色素（例えば、食用青色１号等）、銅クロロフィル、リボフラビン等の着色剤；並びにアスコルビン酸、アスパルテーム、アマチャ、塩化ナトリウム、果糖、サッカリン、粉糖等の矯味剤等が例示できる。
【００２０】
本発明の医薬の投与量は、癌種、重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。約６５〜７０ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日当たり０．０５ｍｇ〜２０００ｍｇ程度が好ましく、０．１ｍｇ〜２００ｍｇ程度が好ましい。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
【００２１】
本発明の医薬と、癌治療に用いられる医薬（例えば化学療法剤、免疫療法剤等）とをキットの形態で組み合わせることも、本発明の範囲に含まれる。すなわち、本発明によるキットは、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質を有効成分とする医薬と癌治療用医薬とを別々に保持するための別れた容器、分かれたボトル、分かれたホイルパケットなどの手段を含む。本発明のキットは、様々な剤形の別々の医薬を、様々な投与間隔で投与するのに適している。通常、キットは投与説明書を含み、投与説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
〔実験材料および実験方法〕
（１）マウス
ＮＯＧマウスは財団法人実験動物中央研究所より入手した。すべてのマウスは、施設のガイドラインに従って、ＳＰＦ条件下で飼育した。
【００２４】
（２）ヒトサンプル
ヒト骨髄サンプルは、京都大学病院の倫理委員会ガイドライン従って、インフォームドコンセントを得た小児ＡＬＬ患者から採取した。単核細胞は、吸引直後にフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離法を用いて分離した。分離した単核球を白血病細胞としてＮＯＧマウスに移植した。
【００２５】
（３）白血病細胞のＮＯＧマウスへの初代および継代異種移植
白血病細胞の異種移植および分析はＨｉｒａｍａｔｓｕら（Hiramatsu, H., et al. 2003. Complete reconstitution of human lymphocytes from cord blood CD34+ cells using the NOD/SCID/gammacnull mice model. Blood 102:873-880.）に記載の方法に基づいて行った。すなわち、８〜１０週齢の無処置のＮＯＧマウスに白血病細胞（１×１０６個）を尾静脈から注射した。白血病の発症を検査するために、３週間ごとに脛骨から骨髄を吸引した。ヒトＣＤ４５またはＣＤ１９陽性細胞の割合が５％以上の場合に移植成立と判定した。継代移植のために、レシピエントの骨髄から白血病細胞を採取し、無処置のＮＯＧマウスの尾静脈内に注射して移植した。
【００２６】
（４）フローサイトメトリー分析
移植後一定時間ごとにマウスを安楽死させて、臓器中の白血病細胞の分析に供した。末梢血を全採血した後、骨髄、肝臓および脾臓を摘出して機械的に分散した。各臓器から単核細胞を分離し、抗体で染色した。死細胞はＤＡＰＩ（4'-6-Diamidino-2-phenylindole）染色により排除した。分析にはＦＡＣＳ ＬＳＲおよびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Becton Dickinson）を使用し、製造者のプロトコールに従って行った。フローサイトメトリー分析には、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ−４５抗体（BD Pharmingen）、ＡＰＣ標識抗ヒトＮ−ＣＭＡ抗体（BD Pharmingen）、ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ−４５抗体（BD Pharmingen）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ−１９抗体（eBiosciences）、ＰＥ標識抗ヒトＣＸＣＲ４抗体（BD Pharmingen）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ−４４抗体（BD Pharmingen）、ＰＥ標識抗ヒトＶＬＡ−４抗体（BD Pharmingen）、ＰＥ標識抗ヒトＣＣＲ７抗体（R&D systems）、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ−４５抗体（BD Pharmingen）、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ−１９抗体（Dako）を使用した。
【００２７】
（５）組織学的分析
患者サンプルおよびマウス骨髄の組織学的分析は、標準的な手順で作製したサイトスピン標本にメイグリュンワルドギムザ染色を施して行った。レシピエントマウス由来の組織切片標本には、ヘマトキシリン−エオジン染色（Ｈ−Ｅ染色）を施した。マウス臓器中のヒト白血病細胞の検出は、Ｆｕｊｉｎｏら（Fujino, H., et al. 2007. Human cord blood CD34+ cells develop into hepatocytes in the livers of NOD/SCID/gamma(c)null mice through cell fusion. FASEB J 21:3499-3510.）に記載の方法で行った。使用した抗体とその希釈倍率は、以下のとおりである。抗ヒトＣＤ４５マウス抗体（1:100、Dako）、抗ヒト／マウスＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１マウス抗体（1:100、R&D systems）、Ｃｙ−３標識抗マウスＩｇＧロバ抗体（1:100、Jackson ImmunoResearch Laboratories）、ＦＩＴＣ抗ウサギＩｇＧロバ抗体（1:100、Jackson ImmunoResearch Laboratories）。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３２４（Invitrogen）は核染色に使用した。サンプル標本は光学顕微鏡（オリンパス）または蛍光顕微鏡（オリンパス）を用いて検査した。
【００２８】
（６）ＢｒｄＵ（5-bromo-2-deoxyuridine）染色
分析の４、２４および４８時間前に３回、０．２ｍＬのＢｒｄＵ（5mg/ml、Sigma）を白血病マウスの腹腔内に投与して、ＢｒｄＵのＩｎ ｖｉｖｏラベリングを行った。ＢｒｄＵの免疫組織学的染色は、ＢｒｄＵ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ（Invitrogen）を用い、製造者のプロトコールに従って行った。
【００２９】
（７）細胞周期分析
細胞周期のＳ／Ｇ２／Ｍ期の細胞を定量するために、白血病細胞を移植されたレシピエントマウスの骨髄、末梢血および肝臓からそれぞれ回収した白血病細胞を定法に従いＨｏｅｃｈｓｔ３３３２４およびピロニンＹで標識した。サンプルは、ＦＡＣＳ ＬＳＲおよびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Becton Dickinson）で分析した。
【００３０】
（８）遊走試験
白血病細胞を移植されたレシピエントマウスの肝臓から白血球細胞を回収した。２４穴マルチウェルプレート（商品名、Becton Dickinson）のトップチャンバーに、５×１０５個／０．５ｍＬ／チャンバーの白血病細胞を添加した。ウェルはポリカーボネートフィルター（ポアサイズ３．０ｐｍ）で上下に分離されており、下のコンパートメントにはＳＤＦ−１α（250ng/mL）を含む、または含まない１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩを０．５ｍＬ添加した。走化性分析は３７℃で４時間行った。また、ＡＭＤ３１００（0.1mg/mL、Sigma）の存在下３７℃で３０分間プレインキュベーションした白血病細胞を使用する群を設けた。
【００３１】
（９）コロニーアッセイ
コロニーアッセイは、Ｕｅｄａら（Ueda, T., et al. 2000. Expansion of human NOD/SCID-repopulating cells by stem cell factor, Flk2/Flt3 ligand, thrombopoietin, IL-6, and soluble IL-6 receptor. J Clin Invest 105:1013-1021.）に記載の方法に基づいて行った。メチルセルロース培地を用いて、白血病細胞を１×１０６個／ｍＬの濃度で培養した。コロニーアッセイの前にＡＭＤ３１００（0.1mg/mL）の存在下３７℃で３０分間プレインキュベーションした白血病細胞を使用する群を設けた。ＳＤＦ−１α（250ng/mL、R&D Systems）をコントロールサイトカインに添加した。コロニーを回収して２回洗浄し、サイトスピン標本を作製してメイグリュンワルドギムザ染色を施し、観察に供した。
【００３２】
（１０）ウエスタンブロッティング分析
５×１０５個の白血病細胞をＡＭＤ３１００（0.1mg/mL）の存在下３７℃で３０分間プレインキュベーションし、続いてＳＤＦ−１α（100ng/mL）の存在下または非存在下で５分間インキュベートした。次に、プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク）を添加した氷冷溶解バッファー（Thermo Scientific）で細胞を溶解した。細胞溶解液を１０％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分離し、イモビロン−Ｐメンブレン（商品名、ミリポア）転写し、各種抗体（抗ヒトＡＫＴ抗体、抗ヒトリン酸化（S473）ＡＫＴ抗体、抗ヒトＥＲＫ抗体、抗ヒトリン酸化ＥＲＫ抗体、いずれもSignaling Technologies）で染色してＥＣＬ Ｐｌｕｓキット（GE Healthcare）で可視化した。
【００３３】
（１１）シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）治療およびＡＭＤ３１００投与
白血病細胞を移植されたＮＯＧマウスに対して、Ａｒａ−Ｃ（Sigma）７５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。Ａｒａ−Ｃを投与した日から７日間、２００μｇのＡＭＤ３１００（Sigma）を腹腔内投与した。
【００３４】
（１２）統計処理
連続型変数は平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で表した。統計的有意性は、平均値とＳ．Ｅ.の単純な比較にはスチューデントのｔテストを使用して決定し、３群間以上の比較にはボンフェローニ補正を行った後にペアｔテストを使用して決定した。
【００３５】
〔結果〕
（１）前処置を施さないＮＯＧマウスへの白血病細胞の異種移植
９人のＡＬＬ小児患者（症例番号１〜９）の原発骨髄由来の白血病細胞１×１０６個を無処置ＮＯＧマウスの尾静脈内に注射した。図１に、症例１，２，３からそれぞれ白血病細胞を移植されたＮＯＧマウスについて全骨髄細胞中の白血病細胞の割合の推移を示した。また、図２に、全症例について移植後５か月目のＮＯＧマウスの骨髄における白血病細胞の割合を症例ごとに示した。なお、ヒトＣＤ４５陽性細胞およびヒトＣＤ１９陽性細胞を白血病細胞としてカウントした。
データを示していないが、移植後３週間目に骨髄のフローサイトメトリー分析を行ったところ、マウスに移植された９症例のうち８症例の白血病細胞が検出できた。図１から明らかなように、症例１，２，３は、いずれも移植後１５週目に、全骨髄細胞中の白血病細胞の割合が８０％を超えた。また、図２に示したように、症例６を除く８症例において、移植後５か月以内に全骨髄細胞中の白血病細胞の割合が４０％を超えることが明らかとなった。
図３に、症例１由来の白血病細胞を移植されたＮＯＧマウスから経時的に採取した骨髄標本をＨ−Ｅ染色および抗ヒトＣＤ４５抗体を用いた免疫染色し、顕微鏡観察した結果を示した。図３中のスケールバーは５０μｍを表す。図３から明らかなように、ヒトＣＤ４５陽性細胞が移植後１５週を経過してもＮＯＧマウスの骨髄中で存在し続けていることを組織学的に確認できた。
【００３６】
初代異種移植が成立したＮＯＧマウスの骨髄から白血病細胞を採取し、無処置のＮＯＧマウスの尾静脈内に移植することにより２代目の異種移植ＮＯＧマウスを作製した。さらに２代目の異種移植が成立したＮＯＧマウスの骨髄から白血病細胞を採取し、無処置のＮＯＧマウスの尾静脈内に移植することにより３代目の異種移植ＮＯＧマウスを作製した。図４に患者骨髄、初代異種移植ＮＯＧマウスの骨髄および３代目の異種移植ＮＯＧマウスの骨髄から採取した細胞について、（Ａ）にそれらの形態、（Ｂ）にそれらの免疫表現型の解析結果をそれぞれ示した。図４（Ａ）のスケールバーは２０μｍを表す。図４（Ａ）から明らかなように、各移植世代の細胞において患者細胞の形態が維持されていた。また、図４（Ｂ）から明らかなように、各移植世代の細胞において患者細胞の免疫表現型が維持されていた。なお、細胞の破片（低前方散乱）、死細胞（ＤＡＰＩ陽性）およびマウスＣＤ４５陽性細胞は、分析から除外した。
【００３７】
いずれの実験においても正常ヒト造血は観察されなかった。以上の結果から、ヒトＡＬＬの病態を再現可能なＮＯＧマウスモデルが確立できたことが証明された。以下、このマウスモデルを「ヒト白血病ＮＯＧモデル」と称する。
【００３８】
（２）ヒト白血病ＮＯＧモデルの肝臓の病理学的分析
症例１の白血病細胞を移植したヒト白血病ＮＯＧモデルおよび正常マウス（無処置ＮＯＧマウス）から各種臓器を採取して比較した結果を図５に示した。図５中のスケールバーは１ｃｍを表す。上段左が大腿骨（Ｂｏｎｅ）、上段右が脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、中段が肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、下段が腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）であり、それぞれ左側がヒト白血病ＮＯＧモデル、右側が正常マウスである。図４から明らかなように、ヒト白血病ＮＯＧモデルは、大腿骨が青白く、脾臓、肝臓および腎臓は腫大していた。
そこで、ヒト白血病ＮＯＧモデルから採取した大腿骨（骨髄）、脾臓、肝臓および腎臓について組織標本を作製し、Ｈ−Ｅ染色を行って顕微鏡で観察した。結果を図６に示した。図６中のスケールバーは５０μｍを表す。図６から明らかなように、いずれの臓器においても大量のリンパ芽球の浸潤が観察された。このリンパ芽球は、初期の白血病細胞と同じ形態的特徴を示すものであった。
【００３９】
ヒトにおいて、白血病細胞の肝臓への浸潤は門脈域に特徴的に限定されることが知られている。そこで、ヒト白血病ＮＯＧモデルの肝臓組織標本（Ｈ−Ｅ染色）を作製し、門脈域を顕微鏡観察した。結果を図７に示した。図７中ｐｖは門脈を表し、矢印は胆管を表し、スケールバーは５０μｍを表す。図７から明らかなように、いずれのヒト白血病ＮＯＧモデルの肝臓においても、門脈域に白血病細胞の大きなクラスターが観察され、ヒトの病変と一致していた。
さらに、ヒト白血病ＮＯＧモデルの肝臓について経時的に組織標本（Ｈ−Ｅ染色）を作製し、観察した。結果を図８に示した。図８中ｐｖは門脈を表し、矢印は胆管を表し、スケールバーは５０μｍを表す。門脈域（図中左列）では、最初に胆管周囲に白血病細胞が見出され（３ｗ）、その後門脈域に大きなクラスターが形成されていく（６ｗ、９ｗ）ことが観察された。一方、類洞域（図中右列）では白血病細胞の単一細胞または小クラスターが点在していることが観察された。
【００４０】
これらの結果から、門脈域には白血病細胞を引きよせて保持する何らかの特異的な、未同定のメカニズムが存在することが示唆された。したがって、ヒト白血病ＮＯＧモデルはヒト白血病の肝臓を再現し、白血病患者の肝臓転移の発症機序の研究を可能にするものと考えられた。
【００４１】
（３）肝臓白血病細胞のＣＸＣＲ４発現
いくつかの接着分子やケモカイン（例えば、ＣＸＣＲ４、ＶＬＡ−４、ＣＣＲ７、Ｎ−ＣＡＭ、ＣＤ４４など）が、微小環境における白血病細胞の保持や増殖に寄与していること、および微小環境が媒介する白血病の抵抗性を増強する可能性があることが報告されている。そこでそのような分子が、白血病肝臓の病変と関連があるか否かについてヒト白血病ＮＯＧモデルを用いて検討した。
最初に、症例１由来の白血病細胞を移植されたヒト白血病ＮＯＧモデルの骨髄、肝臓および脾臓から回収した白血病細胞における表面抗原の発現を分析した。結果を図９に示した。図９から明らかなように、肝臓から回収した白血病細胞には、ＣＸＣＲ４を発現している細胞が多く存在し、ＣＸＣＲ４陽性細胞の割合は、骨髄由来の白血病細胞と比較して有意に高かった（P<0.0001、ボンフェローニ補正によるペアｔテスト）。一方、ＶＬＡ４、ＣＤ４４、ＣＣＲ７およびＮ−ＣＡＭについては、臓器による差が認められなかった。なお、データを示していないが、症例２，３についても同様の結果を示した。図１０にはヒト白血病ＮＯＧモデルの代表的な一例における上記各臓器のＣＸＣＲ４陽性白血病細胞のフローサイトメトリー分析結果を示した。図１０から明らかなように、骨髄から回収した白血病細胞にはＣＸＣＲ４陽性細胞が１３％しか存在しなかったが、肝臓から回収した白血病細胞のＣＸＣＲ４陽性率は７８％であった。なお、細胞の破片（低前方散乱）、死細胞（ＤＡＰＩ陽性）およびマウスＣＤ４５陽性細胞は、分析から除外した。
【００４２】
ＣＸＣＲ４はＳＤＦ−１と相互作用する。また、ＣＸＣＲ４はアミノ酸配列が非常によく保存されたケモカインであり、マウスとヒトの相同性は９９％である。この高い相同性は、種の違いを超えてＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスが作動することを許容する。したがって、これらの結果は、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスが白血病細胞の肝臓浸潤に何らかの役割を果たすことを強く示唆するものである。
【００４３】
（４）胆管上皮細胞におけるＳＤＦ−１の発現と白血病細胞の増殖
ヒトおよびマウスの門脈域の胆管上皮細胞がＳＤＦ−１を発現していることは既に報告されている（Kollet, O., et al. 2003. HGF, SDF-1, and MMP-9 are involved in stress-induced human CD34+ stem cell recruitment to the liver. J Clin Invest 112:160-169、Kawaguchi, et al. 2009. Inhibition of the SDF-1alpha-CXCR4 axis by the CXCR4 antagonist AMD3100 suppresses the migration of cultured cells from ATL patients and murine lymphoblastoid cells from HTLV-I Tax transgenic mice. Blood 114:2961-2968.）そこで、ヒト白血病ＮＯＧモデルの肝臓におけるＳＤＦ−１の発現を確認した。すなわち、肝臓の連続切片を作製し、同一領域のＨ−Ｅ染色標本、Ｃｙ３標識抗ＳＤＦ−１抗体を用いた免疫染色標本、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４５抗体を用いた免疫染色標本、およびＢｒｄＵを用いた免疫染色標本を作製し、それぞれ観察した。陰性対照として、無処置のＮＯＧマウスの肝臓を用いた。
【００４４】
結果を図１１に示した。図１１中ｐｖは門脈を表し、ｂｄは胆管を表し、スケールバーは５０μｍを表す。左上の写真は観察領域（ａ、ｂ：門脈域、ｃ：類洞域）を示す。ｄは陰性対照を表す。図１１から明らかなように、門脈域の胆管上皮細胞表面にＳＤＦ−１が発現しており、胆管周囲にヒトＣＤ４５陽性の白血病細胞が多数存在した（ａ、ｂ）。さらに、白血病細胞のクラスター中にはＢｒｄＵ陽性細胞が観察され、白血病細胞が旺盛に増殖していることが確認された（ａ、ｂ）。一方、類洞域にはＳＤＦ−１陽性細胞は観察されず、ヒトＣＤ４５陽性の単一細胞または小さいクラスターが散在することが観察された（ｃ）。また、図１２に門脈域と類洞域におけるＢｒｄＵ陽性細胞率を比較した結果を示した。図１２から明らかなように、門脈域のＢｒｄＵ陽性細胞率は類洞域のそれより有意に高かった。
【００４５】
続いて、ヒト白血病ＮＯＧモデルの肝臓、末梢血および骨髄中の白血病細胞の細胞周期を調べた。Ｓ期およびＧ２／Ｍ期の細胞（ピロニンＹ陽性＋Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３２４陽性）の割合をフローサイトメトリー分析により測定した結果を図１３に示した。末梢血中の白血病細胞はＳ期およびＧ２／Ｍ期の細胞の割合が低く、非増殖細胞が大多数であったが、肝臓および骨髄中の白血病細胞はＳ期およびＧ２／Ｍ期の細胞の割合が、末梢血と比較して有意に高いことが明らかとなった。図１４には、ヒト白血病ＮＯＧモデルの代表的な一例における白血病細胞の細胞周期のフローサイトメトリー分析結果を示した。図１４から明らかなように、この一例では増殖中の細胞（ピロニンＹ陽性＋Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３２４陽性）の割合は、肝臓２４．２％、末梢血７．２％、骨髄２１．０％であった。この結果から、肝臓中の白血病細胞の増殖を評価するときに、末梢血中の白血病細胞の増殖が指標とならないことが示された。
以上の結果を総合すると、胆管上皮細胞に発現するＳＤＦ−１が肝臓における白血病細胞の増殖に影響を及ぼすものと考えられた。
【００４６】
（５）ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス刺激による白血病細胞の遊走および増殖
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスは、腫瘍細胞を含む種々の細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの遊走と増殖において鍵となる因子であることが知られている。そこで、ヒト白血病ＮＯＧモデルの肝臓から回収した白血球細胞を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの遊走と増殖に対するＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスの影響を直接的に試験した。
遊走試験の結果を図１５に示した。図１５から明らかなように、白血病細胞の遊走はＳＤＦ−１を培地に添加することにより顕著に増加した。一方、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を可逆的に阻害する薬剤であるＡＭＤ３１００でプレインキュベーションを行った場合、ＳＤＦ−１を培地に添加しても白血病細胞の遊走が顕著に抑制された。さらに、チェッカーボード法で遊走試験を行った結果を図１６に示した。遊走細胞数はＳＤＦ−１の濃度勾配に沿って用量依存的に増加した。これらの結果から、白血病細胞の遊走にＳＤＦ−１が影響を及ぼすことが確認できた。
【００４７】
コロニーアッセイの結果を図１７に示した。図１７から明らかなように、ＳＤＦ−１を培地に添加することによりコロニー数が顕著に増加した。一方、ＡＭＤ３１００のプレインキュベーションにより、ＳＤＦ−１添加によるコロニー形成が顕著に抑制された。
図１８に示したウエスタンブロット分析の結果から、ＳＤＦ−１刺激がＥＲＫ１／２およびＡＫＴのリン酸化を誘導することが示された。また、ＡＭＤ３１００のプレインキュベーションにより、これらのリン酸化が抑制されることが示された。なお、ＥＲＫ１／２およびＡＫＴは、様々なタイプの細胞の遊走および増殖の重要なメディエーターであることが知られている。
【００４８】
ヒト白血病ＮＯＧモデルの骨髄および肝臓からそれぞれＣＸＣＲ４陽性率の異なる白血病細胞集団を回収し、それぞれＮＯＧマウスに移植して、移植後の細胞増殖速度を比較した。結果を図１９に示した。図１９から明らかなように、白血病細胞の増殖速度は、肝臓から回収した白血病細胞の方が顕著に速いことが示された。興味深いことに、移植後の増殖速度は、細胞集団中のＣＸＣＲ４陽性率と非常によく相関した。
以上の結果から、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において、白血病細胞の遊走と増殖を活性化することが明らかとなった。
【００４９】
（６）ＡＭＤ３１００による肝臓および脾臓の腫大抑制、ならびに、胆管周囲における白血病細胞浸潤の抑制
肝臓微小環境における白血病細胞に関するＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスの役割とＡＭＤ３１００の抑制効果を検討した。臨床的には、化学療法による寛解後においても骨髄および髄外部位に隠れた白血病細胞がそれらの微小環境から解放され、ついには病気を再発すると考えられている。
そこで、まず、化学療法による寛解後の再発モデル構築の検討を行った。Ａｒａ−Ｃを７５ｍｇ／ｋｇの用量でヒト白血病ＮＯＧモデルの腹腔内に単回投与し、３日ごとに末梢血中の白血病細胞数をカウントした。また、Ａｒａ−Ｃ投与前と投与後４日目に肝臓の組織標本（Ｈ−Ｅ染色）を作製して、病理組織学的観察を行った。末梢血中の白血病細胞数の経時的変化の結果を図２０に示した。また、Ａｒａ−Ｃ投与前後の肝臓組織標本の顕微鏡観察結果を図２１に示した。図２１中ｐｖは門脈を表し、矢印は胆管を表し、スケールバーは１００μｍを表す。図２０から明らかなように、末梢血中の白血病細胞数は一過的ではあるが十分に減少した。また、図２１から明らかなように、Ａｒａ−Ｃ投与前は門脈域に多数の白血病細胞が集まっていたが、Ａｒａ−Ｃ投与後４日目には、ごくわずかな白血病細胞が門脈域の胆管上皮細胞に隣接して観察されるに過ぎなかった。この結果から、白血病の化学療法による寛解と再発モデルとして、このプロトコールを採用した。
【００５０】
実験方法の項および図２２に示したように、ＮＯＧマウスに白血病細胞を移植し、白血病生着後、Ａｒａ−Ｃを７５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与し、その日から７日間２００μｇのＡＭＤ３１００を１日１回腹腔内投与した。溶媒対照群にはＡＭＤ３１００の代わりに生理食塩液を腹腔内投与した。７日間のＡＭＤ３１００投与終了後にマウスを安楽死させ、臓器を摘出して重量を測定し、肉眼的観察および病理組織学的観察に供した。また、骨髄、肝臓および脾臓から白血病細胞を回収し、溶媒対照群の白血病細胞数に対する減少率を算出した。
【００５１】
肝臓の組織標本の観察結果を図２３に示した。図２３中ｐｖは門脈を表し、矢印は胆管を表し、スケールバーは１００μｍを表す。また、ａは門脈域、ｂは類洞域を表す。図２３の左列に示したように、溶媒対照群のマウスでは、主として門脈域に白血病細胞の再増殖が観察された。一方図２３の右列に示したＡＭＤ３１００投与群のマウスでは、門脈域の白血病細胞の数が劇的に減少していることが明らかとなった。両群とも、類洞域には白血病細胞はほとんど観察されなかった。
図２４に、ＡＭＤ３１００投与群のマウスおよび溶媒対照群のマウスからそれぞれ摘出した肝臓および脾臓を比較して示した。図２４中スケールバーは１ｃｍを表す。図２４からわかるように、ＡＭＤ３１００投与群の肝臓および脾臓は、溶媒対照群の肝臓および脾臓より肉眼的に明らかに小さかった。
図２５（Ａ）に、ＡＭＤ３１００投与群のマウスと溶媒対照群のマウスからそれぞれ摘出した肝臓および脾臓中の白血病細胞数を示した。また、図２５（Ｂ）に、臓器重量を示した。図２５（Ａ）および（Ｂ）から明らかなように、ＡＭＤ３１００投与群では、肝臓および脾臓中の白血病細胞数、ならびに、各臓器重量が、溶媒対照群のそれらと比較して有意に減少していた。
図２６に、溶媒対照群の各臓器の白血病細胞数に対するＡＭＤ３１００投与群の白血病細胞数の減少率を示した。図２６から明らかなように、肝臓の減少率が骨髄および脾臓の減少率より有意に高いという興味深い結果が得られた。この結果は、図９に示した各臓器におけるＣＸＣＲ４陽性白血病細胞の検出率と相関すると考えられた。
【００５２】
以上の結果から、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４シグナル経路が白血球細胞の拡張、特に白血病肝臓の病変の進展において重要な役割を演じることが、強く示唆された。
【００５３】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再発癌の予防または治療用医薬に関するものであり、詳細には、ＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における再発を予防または治療するために用いられる医薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
急性リンパ芽球性白血病（以下「ＡＬＬ」という。）は、小児の最も一般的な悪性疾患である。治療方法の向上により小児科患者の５年生存率は８０％に上昇したが、様々なリスクファクターを有する少数の患者には、未だ予後不良が予想される。特に、再発したＡＬＬの生存率は３０％に過ぎない。
【０００３】
近年、骨髄微小環境は白血病治療反応に必須の要素であることが観察された（非特許文献１）。骨髄微小環境は、特異的なシグナリング分子、成長因子、サイトカインおよびケモカインを産生または分泌する特定の間質細胞から成る（非特許文献２）。骨髄微小環境は、正常な造血細胞の生存、増殖および分化を調節することが知られている（非特許文献３）。白血病細胞と造血微小環境との相互作用は、骨髄における正常な造血前駆細胞間の相互作用と様々な点で類似していることが報告されている（非特許文献４）。骨髄微小環境は白血病細胞に生存および成長のための因子を与え、化学療法に対する反応を変化させる。さらに白血病の再発に寄与する可能性がある（非特許文献１、４）。
【０００４】
髄外臓器へ広範に浸潤することが白血病の特徴である。白血病細胞は、末梢血中を移動することによってすべての臓器に容易に広がることができるが、最も顕著な変化は肝臓、脾臓およびリンパ節で見出される。特に、肝腫大は最も頻繁に観察される髄外浸潤の１つであり、ＡＬＬ患者の３０−５０％という高率で診断時に検出される（非特許文献５）。生検および剖検標本の病理組織学的解析から、ＡＬＬ患者の肝臓の門脈域にＡＬＬ細胞が蓄積することが示されている（非特許文献６）。しかし、この病変に寄与する分子レベルのメカニズムについてはほとんど解明されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Iwamoto, S., Mihara, K., Downing, J.R., Pui, C.H., and Campana, D. 2007. Mesenchymal cells regulate the response of acute lymphoblastic leukemia cells to asparaginase. J Clin Invest 117:1049-1057.
【非特許文献２】Yin, T., and Li, L. 2006. The stem cell niches in bone. J Clin Invest 116:1195-1201.
【非特許文献３】Ara, T., Tokoyoda, K., Sugiyama, T., Egawa, T., Kawabata, K., and Nagasawa, T. 2003. Long-term hematopoietic stem cells require stromal cell-derived factor-1 for colonizing bone marrow during ontogeny. Immunity 19:257-267.
【非特許文献４】Ishikawa, F., Yoshida, S., Saito, Y., Hijikata, A., Kitamura, H., Tanaka, S., Nakamura, R., Tanaka, T., Tomiyama, H., Saito, N., et al. 2007. Chemotherapy-resistant human AML stem cells home to and engraft within the bone-marrow endosteal region. Nat Biotechnol 25:1315-1321.
【非特許文献５】Reiter, A., Schrappe, M., Ludwig, W.D., Hiddemann, W., Sauter, S., Henze, G., Zimmermann, M., Lampert, F., Havers, W., Niethammer, D., et al. 1994. Chemotherapy in 998 unselected childhood acute lymphoblastic leukemia patients. Results and conclusions of the multicenter trial ALL-BFM 86. Blood 84:3122-3133.
【非特許文献６】Alastair D. Burt, B.C.P., Linda D. Ferrell. 2007. MacSween's Pathology of the Liver 992 pp.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、癌の原発巣以外における再発の分子レベルのメカニズムを解明し、当該メカニズムを阻害する物質を用いることにより、少なくとも１回以上の癌治療を行った後に投与することで原発巣以外における癌の再発を予防または治療する医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質を有効成分とし、ＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における再発を予防または治療するために用いられ、少なくとも１回以上の癌治療を行った後に投与されることを特徴とする再発癌の予防または治療用医薬。
［２］ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質が、抗ＣＸＣＲ４中和抗体、抗ＳＤＦ−１中和抗体、ＡＭＤ３１００およびＡＭＤ３４６５からなる群より選択されることを特徴とする前記［１］に記載の医薬。
［３］ＣＸＣＲ４を発現する癌が、白血病、悪性リンパ腫、乳癌、肺癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、直腸癌、前立腺癌、メラノーマ、腎細胞癌および卵巣癌からなる群より選択されることを特徴とする前記［１］に記載の医薬。
［４］癌治療が、化学療法、放射線療法または免疫療法であることを特徴とする前記［１］に記載の医薬。
［５］ＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における再発を予防または治療するために用いられ、少なくとも１回以上の癌治療を行った後に投与される医薬の製造のためのＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、少なくとも１回以上の癌治療を行った後に投与することで原発巣以外における癌の再発を予防または治療する医薬を提供することができる。本発明は、癌患者に福音をもたらすものであり、その社会的意義は極めて大きなものである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】症例１，２，３からそれぞれ白血病細胞を移植されたＮＯＧマウスにおいて全骨髄細胞中の白血病細胞の割合の推移を示す図である。
【図２】移植後５か月目のＮＯＧマウスの骨髄における白血病細胞の割合を症例ごとに示す図である。
【図３】症例１由来の白血病細胞を移植されたＮＯＧマウスから経時的に採取した骨髄標本にヘマトキシリン−エオジン染色（Ｈ−Ｅ染色）および抗ヒトＣＤ４５抗体を用いた免疫染色を施し、顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図４】（Ａ）は、症例１の患者骨髄、初代異種移植ＮＯＧマウスの骨髄および３代目異種移植ＮＯＧマウスの骨髄から採取した細胞の形態を観察した結果を示す図であり、（Ｂ）は症例１，２，３の患者骨髄、初代異種移植ＮＯＧマウスの骨髄および３代目の異種移植ＮＯＧマウスの骨髄から採取した細胞をフローサイトメトリー分析した結果を示す図である。
【図５】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスおよび正常マウスから採取した臓器を比較した図である。
【図６】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの骨髄、脾臓、肝臓および腎臓の組織標本にＨ−Ｅ染色を施し、顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図７】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓組織標本（Ｈ−Ｅ染色）を作製し、門脈域を顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図８】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓について経時的に組織標本（Ｈ−Ｅ染色）を作製し、門脈域および類洞域を顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図９】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの骨髄、肝臓および脾臓から回収した白血病細胞における表面抗原の発現を分析した結果を示す図である。
【図１０】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの代表的な一例の骨髄、肝臓および脾臓から回収した白血病細胞表面のＣＸＣＲ４発現をフローサイトメトリー分析した結果を示す図である。
【図１１】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓におけるＳＤＦ−１陽性細胞、ヒトＣＤ４５陽性細胞、ＢｒｄＵ陽性細胞を観察した結果を示す図である。
【図１２】門脈域と類洞域におけるＢｒｄＵ陽性細胞率を比較した結果を示す図である。
【図１３】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓、末梢血および骨髄中の白血病細胞についてＳ期およびＧ２／Ｍ期（ピロニンＹ陽性＋Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３２４陽性）の細胞の割合を測定した結果を示す図である。
【図１４】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの代表的な一例の肝臓、末梢血および骨髄中の白血病細胞について細胞周期をフローサイトメトリー分析した結果を示す図である。
【図１５】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓から回収した白血病細胞を用いて、ＳＤＦ−１に対する遊走性を試験した結果を示す図である。
【図１６】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓から回収した白血病細胞を用いて、ＳＤＦ−１に対する遊走性をチェッカーボード法で試験した結果を示す図である。
【図１７】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓から回収した白血病細胞を用いて、ＳＤＦ−１の存在下または非存在下でコロニーアッセイを行った結果を示す図である。
【図１８】ＳＤＦ−１刺激がＥＲＫ１／２およびＡＫＴのリン酸化を誘導すること、およびＡＭＤ３１００がリン酸化を抑制することを確認したウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図１９】ヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの骨髄および肝臓から回収した白血病細胞を別のＮＯＧマウスに移植して、その増殖速度を比較した結果を示す図である。
【図２０】Ａｒａ−Ｃを単回腹腔内投与したヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの末梢血中白血病細胞数を経時的に測定した結果を示す図である。
【図２１】Ａｒａ−Ｃ投与前後のヒト白血病細胞を移植したＮＯＧマウスの肝臓組織標本（Ｈ−Ｅ染色）を顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図２２】ＡＭＤ３１００の効果確認試験のプロトコールを示す図である。
【図２３】ＡＭＤ３１００投与マウスと生理食塩液投与マウスの肝臓組織標本（Ｈ−Ｅ染色）を作製し、顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図２４】ＡＭＤ３１００投与マウスと生理食塩液投与マウスからそれぞれ摘出した肝臓および脾臓を比較した図である。
【図２５】（Ａ）は、ＡＭＤ３１００投与群および溶媒対照群からそれぞれ摘出した肝臓および脾臓中の白血病細胞数を示す図であり、（Ｂ）は、各群の肝臓および脾臓の重量を示す図である。
【図２６】溶媒対照群の各臓器の白血病細胞数に対するＡＭＤ３１００投与群の白血病細胞数の減少率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明者らは、自ら開発した高度免疫不全マウスであるＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌマウス（以下「ＮＯＧマウス」（登録商標）と称する。特許第３７５３３２１号、Ito, M., et al. 2002. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood 100:3175-3182.）にヒト白血病細胞を移植することで、ヒト髄外における白血病細胞の動態が再現可能な白血病動物モデルを構築できることを見出し、当該モデルを用いてＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスがＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における癌細胞の浸潤および増殖に関与することを世界に先駆けて見出した。さらに、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質を癌治療後に投与することにより、原発巣以外における癌細胞の浸潤および増殖を抑制できることを見出した。
【００１１】
本発明の医薬は、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質を有効成分とし、少なくとも１回以上の癌治療を行った後に投与されることを特徴とするものである。本発明の医薬を用いることにより、ＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における再発を予防または治療することができる。
【００１２】
ＣＸＣＲ４を発現する癌としては、白血病、悪性リンパ腫、乳癌、肺癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、直腸癌、前立腺癌、メラノーマ、腎細胞癌、卵巣癌などが挙げられる。中でも、白血病、悪性リンパ腫、直腸癌、メラノーマおよび腎細胞癌が好ましく、さらに好ましくは白血病および悪性リンパ腫であり、特に好ましくは白血病である。
癌治療は特に限定されないが、好ましくは、化学療法、放射線療法または免疫療法である。
「少なくとも１回以上の癌治療を行った後」とは、対象の原発癌に対して第１回目の治療を行った後であればいつでもよく、特に限定されない。好ましくは、癌治療を行った後、できるだけ早期に投与を開始する。投与期間も特に限定されないが、好ましくは１〜２年である。
「原発巣以外における再発」とは、癌治療前に癌細胞の存在が認められていない臓器や組織、または癌治療により癌細胞の減少が確認された原発巣以外の臓器や組織において、癌治療後に癌細胞の存在や増加が認められる現象を意味する。
【００１３】
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質は、ＣＸＣＲ４とＳＤＦ−１との結合によるシグナル伝達を遮断または減弱できる物質を意味し、その具体的な作用機序は限定されない。例えば、ＣＸＣＲ４に作用してＣＸＣＲ４とＳＤＦ−１との結合を阻害する物質、ＳＤＦ−１に作用してＣＸＣＲ４とＳＤＦ−１との結合を阻害する物質、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４複合体に作用してそのシグナル伝達を阻害する物質、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスのシグナル伝達の下流に作用してそのシグナル伝達を阻害する物質などが挙げられる。また、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質としては、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物などが含まれる。
【００１４】
公知のＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質として、抗ＣＸＣＲ４中和抗体、抗ＳＤＦ−１中和抗体（Journal of Biological Chemistry 283.34.23189-23199,2008）、ＡＭＤ３１００（Journal of Biological Chemistry 279.4.3033-3041,2004）、ＡＭＤ３４６５などが知られており、これらは本発明の医薬の有効成分として好適に使用することができる。好ましくはＡＭＤ３１００である。ＡＭＤ３１００はすでに自家移植用幹細胞動員薬としてＦＤＡに承認されて臨床で使用されており（商品名：Ｍｏｚｏｂｉｌ）、抗癌剤のような重篤な副作用は報告されていないので、癌の再発予防または治療用医薬として、また長期間投与する医薬として、患者の治療生活におけるＱＯＬ向上に寄与することが期待できる。
【００１５】
抗ＣＸＣＲ４中和抗体および抗ＳＤＦ−１中和抗体は本発明の医薬の有効成分として好適に使用することができる。抗ＣＸＣＲ４中和抗体はＣＸＣＲ４に結合してその活性を減退または消失させる抗体であればよい。抗ＣＸＣＲ４中和抗体はＣＸＣＲ４またはそのフラグメントを免疫原として用い、後述する公知の方法で作製することができる。得られた抗体が中和抗体であることは、得られた抗体によりＣＸＣＲ４の活性が中和されることを調べることによって確認することができる。また、抗ＳＤＦ−１中和抗体はＳＤＦ−１に結合してその活性を減退または消失させる抗体であればよい。抗ＳＤＦ−１中和抗体はＳＤＦ−１またはそのフラグメントを免疫原として用い、後述する公知の方法で作製することができる。得られた抗体が中和抗体であることは、得られた抗体によりＳＤＦ−１の活性が中和されることを調べることによって確認することができる。
【００１６】
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質が抗体の場合、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等）でもよい。ポリクローナル抗体は、例えば以下のようにして作製し、取得することができる。すなわち、抗原をＰＢＳ等に溶解し、必要に応じて通常のアジュバント（例えばフロイント完全アジュバント）を適量混合したものを免疫原として哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を免疫する。免疫方法は特に限定されないが、例えば、１回または適当な間隔で複数回、皮下注射または腹腔内注射する方法が好ましい。次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより取得することができる。モノクローナル抗体は、上記免疫された哺乳動物から得た免疫細胞（例えば脾細胞）とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによって得ることができる。また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換え型のモノクローナル抗体を産生させることもできる。
【００１７】
抗体をヒトに適用する場合には、ヒトの抗体と同じ定常領域を持つように改変したキメラ抗体、ＣＤＲ（complementarity determining region：相補性決定領域）以外の領域をヒト由来としたヒト化抗体を用いることが好ましく、さらには、抗体産生に関与するヒト遺伝子を導入したマウス等のトランスジェニック動物を用いて産生したヒト型モノクローナル抗体を用いることがさらに好ましい。また、ヒト型抗体産生にはファージディスプレー法を用いることもできる。このようにして得られた抗体の抗原認識領域をプローテアーゼ等で切り出し、Ｆｖ、ＦａｂやＦ（ａｂ’）２として用いることもできる。
【００１８】
本発明の医薬は、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とし、医薬品分野で通常使用される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００１９】
このような添加剤として、具体的には、乳糖、白糖、マンニトール、塩化ナトリウム、ブドウ糖、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸塩等の賦形剤；水、エタノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースＮａ、セラック、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、デキストリン、プルラン等の結合剤；クエン酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、無水リン酸一水素ナトリウム、無水リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；カルメロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピセルロース、カルメロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスポビドン、ポリソルベート８０等の崩壊剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の他の吸収促進剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール、コロイド状ケイ酸、ショ糖脂肪酸類等の滑沢剤；黄酸化鉄、黄色三二酸化鉄、三二酸化鉄、βカロテン、酸化チタン、食用色素（例えば、食用青色１号等）、銅クロロフィル、リボフラビン等の着色剤；並びにアスコルビン酸、アスパルテーム、アマチャ、塩化ナトリウム、果糖、サッカリン、粉糖等の矯味剤等が例示できる。
【００２０】
本発明の医薬の投与量は、癌種、重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。約６５〜７０ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日当たり０．０５ｍｇ〜２０００ｍｇ程度が好ましく、０．１ｍｇ〜２００ｍｇ程度が好ましい。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
【００２１】
本発明の医薬と、癌治療に用いられる医薬（例えば化学療法剤、免疫療法剤等）とをキットの形態で組み合わせることも、本発明の範囲に含まれる。すなわち、本発明によるキットは、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質を有効成分とする医薬と癌治療用医薬とを別々に保持するための別れた容器、分かれたボトル、分かれたホイルパケットなどの手段を含む。本発明のキットは、様々な剤形の別々の医薬を、様々な投与間隔で投与するのに適している。通常、キットは投与説明書を含み、投与説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
〔実験材料および実験方法〕
（１）マウス
ＮＯＧマウスは財団法人実験動物中央研究所より入手した。すべてのマウスは、施設のガイドラインに従って、ＳＰＦ条件下で飼育した。
【００２４】
（２）ヒトサンプル
ヒト骨髄サンプルは、京都大学病院の倫理委員会ガイドライン従って、インフォームドコンセントを得た小児ＡＬＬ患者から採取した。単核細胞は、吸引直後にフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離法を用いて分離した。分離した単核球を白血病細胞としてＮＯＧマウスに移植した。
【００２５】
（３）白血病細胞のＮＯＧマウスへの初代および継代異種移植
白血病細胞の異種移植および分析はＨｉｒａｍａｔｓｕら（Hiramatsu, H., et al. 2003. Complete reconstitution of human lymphocytes from cord blood CD34+ cells using the NOD/SCID/gammacnull mice model. Blood 102:873-880.）に記載の方法に基づいて行った。すなわち、８〜１０週齢の無処置のＮＯＧマウスに白血病細胞（１×１０６個）を尾静脈から注射した。白血病の発症を検査するために、３週間ごとに脛骨から骨髄を吸引した。ヒトＣＤ４５またはＣＤ１９陽性細胞の割合が５％以上の場合に移植成立と判定した。継代移植のために、レシピエントの骨髄から白血病細胞を採取し、無処置のＮＯＧマウスの尾静脈内に注射して移植した。
【００２６】
（４）フローサイトメトリー分析
移植後一定時間ごとにマウスを安楽死させて、臓器中の白血病細胞の分析に供した。末梢血を全採血した後、骨髄、肝臓および脾臓を摘出して機械的に分散した。各臓器から単核細胞を分離し、抗体で染色した。死細胞はＤＡＰＩ（4'-6-Diamidino-2-phenylindole）染色により排除した。分析にはＦＡＣＳ ＬＳＲおよびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Becton Dickinson）を使用し、製造者のプロトコールに従って行った。フローサイトメトリー分析には、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ−４５抗体（BD Pharmingen）、ＡＰＣ標識抗ヒトＮ−ＣＭＡ抗体（BD Pharmingen）、ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ−４５抗体（BD Pharmingen）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ−１９抗体（eBiosciences）、ＰＥ標識抗ヒトＣＸＣＲ４抗体（BD Pharmingen）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ−４４抗体（BD Pharmingen）、ＰＥ標識抗ヒトＶＬＡ−４抗体（BD Pharmingen）、ＰＥ標識抗ヒトＣＣＲ７抗体（R&D systems）、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ−４５抗体（BD Pharmingen）、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ−１９抗体（Dako）を使用した。
【００２７】
（５）組織学的分析
患者サンプルおよびマウス骨髄の組織学的分析は、標準的な手順で作製したサイトスピン標本にメイグリュンワルドギムザ染色を施して行った。レシピエントマウス由来の組織切片標本には、ヘマトキシリン−エオジン染色（Ｈ−Ｅ染色）を施した。マウス臓器中のヒト白血病細胞の検出は、Ｆｕｊｉｎｏら（Fujino, H., et al. 2007. Human cord blood CD34+ cells develop into hepatocytes in the livers of NOD/SCID/gamma(c)null mice through cell fusion. FASEB J 21:3499-3510.）に記載の方法で行った。使用した抗体とその希釈倍率は、以下のとおりである。抗ヒトＣＤ４５マウス抗体（1:100、Dako）、抗ヒト／マウスＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１マウス抗体（1:100、R&D systems）、Ｃｙ−３標識抗マウスＩｇＧロバ抗体（1:100、Jackson ImmunoResearch Laboratories）、ＦＩＴＣ抗ウサギＩｇＧロバ抗体（1:100、Jackson ImmunoResearch Laboratories）。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３２４（Invitrogen）は核染色に使用した。サンプル標本は光学顕微鏡（オリンパス）または蛍光顕微鏡（オリンパス）を用いて検査した。
【００２８】
（６）ＢｒｄＵ（5-bromo-2-deoxyuridine）染色
分析の４、２４および４８時間前に３回、０．２ｍＬのＢｒｄＵ（5mg/ml、Sigma）を白血病マウスの腹腔内に投与して、ＢｒｄＵのＩｎ ｖｉｖｏラベリングを行った。ＢｒｄＵの免疫組織学的染色は、ＢｒｄＵ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ（Invitrogen）を用い、製造者のプロトコールに従って行った。
【００２９】
（７）細胞周期分析
細胞周期のＳ／Ｇ２／Ｍ期の細胞を定量するために、白血病細胞を移植されたレシピエントマウスの骨髄、末梢血および肝臓からそれぞれ回収した白血病細胞を定法に従いＨｏｅｃｈｓｔ３３３２４およびピロニンＹで標識した。サンプルは、ＦＡＣＳ ＬＳＲおよびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Becton Dickinson）で分析した。
【００３０】
（８）遊走試験
白血病細胞を移植されたレシピエントマウスの肝臓から白血球細胞を回収した。２４穴マルチウェルプレート（商品名、Becton Dickinson）のトップチャンバーに、５×１０５個／０．５ｍＬ／チャンバーの白血病細胞を添加した。ウェルはポリカーボネートフィルター（ポアサイズ３．０ｐｍ）で上下に分離されており、下のコンパートメントにはＳＤＦ−１α（250ng/mL）を含む、または含まない１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩを０．５ｍＬ添加した。走化性分析は３７℃で４時間行った。また、ＡＭＤ３１００（0.1mg/mL、Sigma）の存在下３７℃で３０分間プレインキュベーションした白血病細胞を使用する群を設けた。
【００３１】
（９）コロニーアッセイ
コロニーアッセイは、Ｕｅｄａら（Ueda, T., et al. 2000. Expansion of human NOD/SCID-repopulating cells by stem cell factor, Flk2/Flt3 ligand, thrombopoietin, IL-6, and soluble IL-6 receptor. J Clin Invest 105:1013-1021.）に記載の方法に基づいて行った。メチルセルロース培地を用いて、白血病細胞を１×１０６個／ｍＬの濃度で培養した。コロニーアッセイの前にＡＭＤ３１００（0.1mg/mL）の存在下３７℃で３０分間プレインキュベーションした白血病細胞を使用する群を設けた。ＳＤＦ−１α（250ng/mL、R&D Systems）をコントロールサイトカインに添加した。コロニーを回収して２回洗浄し、サイトスピン標本を作製してメイグリュンワルドギムザ染色を施し、観察に供した。
【００３２】
（１０）ウエスタンブロッティング分析
５×１０５個の白血病細胞をＡＭＤ３１００（0.1mg/mL）の存在下３７℃で３０分間プレインキュベーションし、続いてＳＤＦ−１α（100ng/mL）の存在下または非存在下で５分間インキュベートした。次に、プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク）を添加した氷冷溶解バッファー（Thermo Scientific）で細胞を溶解した。細胞溶解液を１０％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分離し、イモビロン−Ｐメンブレン（商品名、ミリポア）転写し、各種抗体（抗ヒトＡＫＴ抗体、抗ヒトリン酸化（S473）ＡＫＴ抗体、抗ヒトＥＲＫ抗体、抗ヒトリン酸化ＥＲＫ抗体、いずれもSignaling Technologies）で染色してＥＣＬ Ｐｌｕｓキット（GE Healthcare）で可視化した。
【００３３】
（１１）シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）治療およびＡＭＤ３１００投与
白血病細胞を移植されたＮＯＧマウスに対して、Ａｒａ−Ｃ（Sigma）７５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。Ａｒａ−Ｃを投与した日から７日間、２００μｇのＡＭＤ３１００（Sigma）を腹腔内投与した。
【００３４】
（１２）統計処理
連続型変数は平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で表した。統計的有意性は、平均値とＳ．Ｅ.の単純な比較にはスチューデントのｔテストを使用して決定し、３群間以上の比較にはボンフェローニ補正を行った後にペアｔテストを使用して決定した。
【００３５】
〔結果〕
（１）前処置を施さないＮＯＧマウスへの白血病細胞の異種移植
９人のＡＬＬ小児患者（症例番号１〜９）の原発骨髄由来の白血病細胞１×１０６個を無処置ＮＯＧマウスの尾静脈内に注射した。図１に、症例１，２，３からそれぞれ白血病細胞を移植されたＮＯＧマウスについて全骨髄細胞中の白血病細胞の割合の推移を示した。また、図２に、全症例について移植後５か月目のＮＯＧマウスの骨髄における白血病細胞の割合を症例ごとに示した。なお、ヒトＣＤ４５陽性細胞およびヒトＣＤ１９陽性細胞を白血病細胞としてカウントした。
データを示していないが、移植後３週間目に骨髄のフローサイトメトリー分析を行ったところ、マウスに移植された９症例のうち８症例の白血病細胞が検出できた。図１から明らかなように、症例１，２，３は、いずれも移植後１５週目に、全骨髄細胞中の白血病細胞の割合が８０％を超えた。また、図２に示したように、症例６を除く８症例において、移植後５か月以内に全骨髄細胞中の白血病細胞の割合が４０％を超えることが明らかとなった。
図３に、症例１由来の白血病細胞を移植されたＮＯＧマウスから経時的に採取した骨髄標本をＨ−Ｅ染色および抗ヒトＣＤ４５抗体を用いた免疫染色し、顕微鏡観察した結果を示した。図３中のスケールバーは５０μｍを表す。図３から明らかなように、ヒトＣＤ４５陽性細胞が移植後１５週を経過してもＮＯＧマウスの骨髄中で存在し続けていることを組織学的に確認できた。
【００３６】
初代異種移植が成立したＮＯＧマウスの骨髄から白血病細胞を採取し、無処置のＮＯＧマウスの尾静脈内に移植することにより２代目の異種移植ＮＯＧマウスを作製した。さらに２代目の異種移植が成立したＮＯＧマウスの骨髄から白血病細胞を採取し、無処置のＮＯＧマウスの尾静脈内に移植することにより３代目の異種移植ＮＯＧマウスを作製した。図４に患者骨髄、初代異種移植ＮＯＧマウスの骨髄および３代目の異種移植ＮＯＧマウスの骨髄から採取した細胞について、（Ａ）にそれらの形態、（Ｂ）にそれらの免疫表現型の解析結果をそれぞれ示した。図４（Ａ）のスケールバーは２０μｍを表す。図４（Ａ）から明らかなように、各移植世代の細胞において患者細胞の形態が維持されていた。また、図４（Ｂ）から明らかなように、各移植世代の細胞において患者細胞の免疫表現型が維持されていた。なお、細胞の破片（低前方散乱）、死細胞（ＤＡＰＩ陽性）およびマウスＣＤ４５陽性細胞は、分析から除外した。
【００３７】
いずれの実験においても正常ヒト造血は観察されなかった。以上の結果から、ヒトＡＬＬの病態を再現可能なＮＯＧマウスモデルが確立できたことが証明された。以下、このマウスモデルを「ヒト白血病ＮＯＧモデル」と称する。
【００３８】
（２）ヒト白血病ＮＯＧモデルの肝臓の病理学的分析
症例１の白血病細胞を移植したヒト白血病ＮＯＧモデルおよび正常マウス（無処置ＮＯＧマウス）から各種臓器を採取して比較した結果を図５に示した。図５中のスケールバーは１ｃｍを表す。上段左が大腿骨（Ｂｏｎｅ）、上段右が脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、中段が肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、下段が腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）であり、それぞれ左側がヒト白血病ＮＯＧモデル、右側が正常マウスである。図４から明らかなように、ヒト白血病ＮＯＧモデルは、大腿骨が青白く、脾臓、肝臓および腎臓は腫大していた。
そこで、ヒト白血病ＮＯＧモデルから採取した大腿骨（骨髄）、脾臓、肝臓および腎臓について組織標本を作製し、Ｈ−Ｅ染色を行って顕微鏡で観察した。結果を図６に示した。図６中のスケールバーは５０μｍを表す。図６から明らかなように、いずれの臓器においても大量のリンパ芽球の浸潤が観察された。このリンパ芽球は、初期の白血病細胞と同じ形態的特徴を示すものであった。
【００３９】
ヒトにおいて、白血病細胞の肝臓への浸潤は門脈域に特徴的に限定されることが知られている。そこで、ヒト白血病ＮＯＧモデルの肝臓組織標本（Ｈ−Ｅ染色）を作製し、門脈域を顕微鏡観察した。結果を図７に示した。図７中ｐｖは門脈を表し、矢印は胆管を表し、スケールバーは５０μｍを表す。図７から明らかなように、いずれのヒト白血病ＮＯＧモデルの肝臓においても、門脈域に白血病細胞の大きなクラスターが観察され、ヒトの病変と一致していた。
さらに、ヒト白血病ＮＯＧモデルの肝臓について経時的に組織標本（Ｈ−Ｅ染色）を作製し、観察した。結果を図８に示した。図８中ｐｖは門脈を表し、矢印は胆管を表し、スケールバーは５０μｍを表す。門脈域（図中左列）では、最初に胆管周囲に白血病細胞が見出され（３ｗ）、その後門脈域に大きなクラスターが形成されていく（６ｗ、９ｗ）ことが観察された。一方、類洞域（図中右列）では白血病細胞の単一細胞または小クラスターが点在していることが観察された。
【００４０】
これらの結果から、門脈域には白血病細胞を引きよせて保持する何らかの特異的な、未同定のメカニズムが存在することが示唆された。したがって、ヒト白血病ＮＯＧモデルはヒト白血病の肝臓を再現し、白血病患者の肝臓転移の発症機序の研究を可能にするものと考えられた。
【００４１】
（３）肝臓白血病細胞のＣＸＣＲ４発現
いくつかの接着分子やケモカイン（例えば、ＣＸＣＲ４、ＶＬＡ−４、ＣＣＲ７、Ｎ−ＣＡＭ、ＣＤ４４など）が、微小環境における白血病細胞の保持や増殖に寄与していること、および微小環境が媒介する白血病の抵抗性を増強する可能性があることが報告されている。そこでそのような分子が、白血病肝臓の病変と関連があるか否かについてヒト白血病ＮＯＧモデルを用いて検討した。
最初に、症例１由来の白血病細胞を移植されたヒト白血病ＮＯＧモデルの骨髄、肝臓および脾臓から回収した白血病細胞における表面抗原の発現を分析した。結果を図９に示した。図９から明らかなように、肝臓から回収した白血病細胞には、ＣＸＣＲ４を発現している細胞が多く存在し、ＣＸＣＲ４陽性細胞の割合は、骨髄由来の白血病細胞と比較して有意に高かった（P<0.0001、ボンフェローニ補正によるペアｔテスト）。一方、ＶＬＡ４、ＣＤ４４、ＣＣＲ７およびＮ−ＣＡＭについては、臓器による差が認められなかった。なお、データを示していないが、症例２，３についても同様の結果を示した。図１０にはヒト白血病ＮＯＧモデルの代表的な一例における上記各臓器のＣＸＣＲ４陽性白血病細胞のフローサイトメトリー分析結果を示した。図１０から明らかなように、骨髄から回収した白血病細胞にはＣＸＣＲ４陽性細胞が１３％しか存在しなかったが、肝臓から回収した白血病細胞のＣＸＣＲ４陽性率は７８％であった。なお、細胞の破片（低前方散乱）、死細胞（ＤＡＰＩ陽性）およびマウスＣＤ４５陽性細胞は、分析から除外した。
【００４２】
ＣＸＣＲ４はＳＤＦ−１と相互作用する。また、ＣＸＣＲ４はアミノ酸配列が非常によく保存されたケモカインであり、マウスとヒトの相同性は９９％である。この高い相同性は、種の違いを超えてＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスが作動することを許容する。したがって、これらの結果は、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスが白血病細胞の肝臓浸潤に何らかの役割を果たすことを強く示唆するものである。
【００４３】
（４）胆管上皮細胞におけるＳＤＦ−１の発現と白血病細胞の増殖
ヒトおよびマウスの門脈域の胆管上皮細胞がＳＤＦ−１を発現していることは既に報告されている（Kollet, O., et al. 2003. HGF, SDF-1, and MMP-9 are involved in stress-induced human CD34+ stem cell recruitment to the liver. J Clin Invest 112:160-169、Kawaguchi, et al. 2009. Inhibition of the SDF-1alpha-CXCR4 axis by the CXCR4 antagonist AMD3100 suppresses the migration of cultured cells from ATL patients and murine lymphoblastoid cells from HTLV-I Tax transgenic mice. Blood 114:2961-2968.）そこで、ヒト白血病ＮＯＧモデルの肝臓におけるＳＤＦ−１の発現を確認した。すなわち、肝臓の連続切片を作製し、同一領域のＨ−Ｅ染色標本、Ｃｙ３標識抗ＳＤＦ−１抗体を用いた免疫染色標本、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４５抗体を用いた免疫染色標本、およびＢｒｄＵを用いた免疫染色標本を作製し、それぞれ観察した。陰性対照として、無処置のＮＯＧマウスの肝臓を用いた。
【００４４】
結果を図１１に示した。図１１中ｐｖは門脈を表し、ｂｄは胆管を表し、スケールバーは５０μｍを表す。左上の写真は観察領域（ａ、ｂ：門脈域、ｃ：類洞域）を示す。ｄは陰性対照を表す。図１１から明らかなように、門脈域の胆管上皮細胞表面にＳＤＦ−１が発現しており、胆管周囲にヒトＣＤ４５陽性の白血病細胞が多数存在した（ａ、ｂ）。さらに、白血病細胞のクラスター中にはＢｒｄＵ陽性細胞が観察され、白血病細胞が旺盛に増殖していることが確認された（ａ、ｂ）。一方、類洞域にはＳＤＦ−１陽性細胞は観察されず、ヒトＣＤ４５陽性の単一細胞または小さいクラスターが散在することが観察された（ｃ）。また、図１２に門脈域と類洞域におけるＢｒｄＵ陽性細胞率を比較した結果を示した。図１２から明らかなように、門脈域のＢｒｄＵ陽性細胞率は類洞域のそれより有意に高かった。
【００４５】
続いて、ヒト白血病ＮＯＧモデルの肝臓、末梢血および骨髄中の白血病細胞の細胞周期を調べた。Ｓ期およびＧ２／Ｍ期の細胞（ピロニンＹ陽性＋Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３２４陽性）の割合をフローサイトメトリー分析により測定した結果を図１３に示した。末梢血中の白血病細胞はＳ期およびＧ２／Ｍ期の細胞の割合が低く、非増殖細胞が大多数であったが、肝臓および骨髄中の白血病細胞はＳ期およびＧ２／Ｍ期の細胞の割合が、末梢血と比較して有意に高いことが明らかとなった。図１４には、ヒト白血病ＮＯＧモデルの代表的な一例における白血病細胞の細胞周期のフローサイトメトリー分析結果を示した。図１４から明らかなように、この一例では増殖中の細胞（ピロニンＹ陽性＋Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３２４陽性）の割合は、肝臓２４．２％、末梢血７．２％、骨髄２１．０％であった。この結果から、肝臓中の白血病細胞の増殖を評価するときに、末梢血中の白血病細胞の増殖が指標とならないことが示された。
以上の結果を総合すると、胆管上皮細胞に発現するＳＤＦ−１が肝臓における白血病細胞の増殖に影響を及ぼすものと考えられた。
【００４６】
（５）ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス刺激による白血病細胞の遊走および増殖
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスは、腫瘍細胞を含む種々の細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの遊走と増殖において鍵となる因子であることが知られている。そこで、ヒト白血病ＮＯＧモデルの肝臓から回収した白血球細胞を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの遊走と増殖に対するＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスの影響を直接的に試験した。
遊走試験の結果を図１５に示した。図１５から明らかなように、白血病細胞の遊走はＳＤＦ−１を培地に添加することにより顕著に増加した。一方、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を可逆的に阻害する薬剤であるＡＭＤ３１００でプレインキュベーションを行った場合、ＳＤＦ−１を培地に添加しても白血病細胞の遊走が顕著に抑制された。さらに、チェッカーボード法で遊走試験を行った結果を図１６に示した。遊走細胞数はＳＤＦ−１の濃度勾配に沿って用量依存的に増加した。これらの結果から、白血病細胞の遊走にＳＤＦ−１が影響を及ぼすことが確認できた。
【００４７】
コロニーアッセイの結果を図１７に示した。図１７から明らかなように、ＳＤＦ−１を培地に添加することによりコロニー数が顕著に増加した。一方、ＡＭＤ３１００のプレインキュベーションにより、ＳＤＦ−１添加によるコロニー形成が顕著に抑制された。
図１８に示したウエスタンブロット分析の結果から、ＳＤＦ−１刺激がＥＲＫ１／２およびＡＫＴのリン酸化を誘導することが示された。また、ＡＭＤ３１００のプレインキュベーションにより、これらのリン酸化が抑制されることが示された。なお、ＥＲＫ１／２およびＡＫＴは、様々なタイプの細胞の遊走および増殖の重要なメディエーターであることが知られている。
【００４８】
ヒト白血病ＮＯＧモデルの骨髄および肝臓からそれぞれＣＸＣＲ４陽性率の異なる白血病細胞集団を回収し、それぞれＮＯＧマウスに移植して、移植後の細胞増殖速度を比較した。結果を図１９に示した。図１９から明らかなように、白血病細胞の増殖速度は、肝臓から回収した白血病細胞の方が顕著に速いことが示された。興味深いことに、移植後の増殖速度は、細胞集団中のＣＸＣＲ４陽性率と非常によく相関した。
以上の結果から、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において、白血病細胞の遊走と増殖を活性化することが明らかとなった。
【００４９】
（６）ＡＭＤ３１００による肝臓および脾臓の腫大抑制、ならびに、胆管周囲における白血病細胞浸潤の抑制
肝臓微小環境における白血病細胞に関するＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシスの役割とＡＭＤ３１００の抑制効果を検討した。臨床的には、化学療法による寛解後においても骨髄および髄外部位に隠れた白血病細胞がそれらの微小環境から解放され、ついには病気を再発すると考えられている。
そこで、まず、化学療法による寛解後の再発モデル構築の検討を行った。Ａｒａ−Ｃを７５ｍｇ／ｋｇの用量でヒト白血病ＮＯＧモデルの腹腔内に単回投与し、３日ごとに末梢血中の白血病細胞数をカウントした。また、Ａｒａ−Ｃ投与前と投与後４日目に肝臓の組織標本（Ｈ−Ｅ染色）を作製して、病理組織学的観察を行った。末梢血中の白血病細胞数の経時的変化の結果を図２０に示した。また、Ａｒａ−Ｃ投与前後の肝臓組織標本の顕微鏡観察結果を図２１に示した。図２１中ｐｖは門脈を表し、矢印は胆管を表し、スケールバーは１００μｍを表す。図２０から明らかなように、末梢血中の白血病細胞数は一過的ではあるが十分に減少した。また、図２１から明らかなように、Ａｒａ−Ｃ投与前は門脈域に多数の白血病細胞が集まっていたが、Ａｒａ−Ｃ投与後４日目には、ごくわずかな白血病細胞が門脈域の胆管上皮細胞に隣接して観察されるに過ぎなかった。この結果から、白血病の化学療法による寛解と再発モデルとして、このプロトコールを採用した。
【００５０】
実験方法の項および図２２に示したように、ＮＯＧマウスに白血病細胞を移植し、白血病生着後、Ａｒａ−Ｃを７５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与し、その日から７日間２００μｇのＡＭＤ３１００を１日１回腹腔内投与した。溶媒対照群にはＡＭＤ３１００の代わりに生理食塩液を腹腔内投与した。７日間のＡＭＤ３１００投与終了後にマウスを安楽死させ、臓器を摘出して重量を測定し、肉眼的観察および病理組織学的観察に供した。また、骨髄、肝臓および脾臓から白血病細胞を回収し、溶媒対照群の白血病細胞数に対する減少率を算出した。
【００５１】
肝臓の組織標本の観察結果を図２３に示した。図２３中ｐｖは門脈を表し、矢印は胆管を表し、スケールバーは１００μｍを表す。また、ａは門脈域、ｂは類洞域を表す。図２３の左列に示したように、溶媒対照群のマウスでは、主として門脈域に白血病細胞の再増殖が観察された。一方図２３の右列に示したＡＭＤ３１００投与群のマウスでは、門脈域の白血病細胞の数が劇的に減少していることが明らかとなった。両群とも、類洞域には白血病細胞はほとんど観察されなかった。
図２４に、ＡＭＤ３１００投与群のマウスおよび溶媒対照群のマウスからそれぞれ摘出した肝臓および脾臓を比較して示した。図２４中スケールバーは１ｃｍを表す。図２４からわかるように、ＡＭＤ３１００投与群の肝臓および脾臓は、溶媒対照群の肝臓および脾臓より肉眼的に明らかに小さかった。
図２５（Ａ）に、ＡＭＤ３１００投与群のマウスと溶媒対照群のマウスからそれぞれ摘出した肝臓および脾臓中の白血病細胞数を示した。また、図２５（Ｂ）に、臓器重量を示した。図２５（Ａ）および（Ｂ）から明らかなように、ＡＭＤ３１００投与群では、肝臓および脾臓中の白血病細胞数、ならびに、各臓器重量が、溶媒対照群のそれらと比較して有意に減少していた。
図２６に、溶媒対照群の各臓器の白血病細胞数に対するＡＭＤ３１００投与群の白血病細胞数の減少率を示した。図２６から明らかなように、肝臓の減少率が骨髄および脾臓の減少率より有意に高いという興味深い結果が得られた。この結果は、図９に示した各臓器におけるＣＸＣＲ４陽性白血病細胞の検出率と相関すると考えられた。
【００５２】
以上の結果から、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４シグナル経路が白血球細胞の拡張、特に白血病肝臓の病変の進展において重要な役割を演じることが、強く示唆された。
【００５３】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質を有効成分とし、ＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における再発を予防または治療するために用いられ、少なくとも１回以上の癌治療を行った後に投与されることを特徴とする再発癌の予防または治療用医薬。
【請求項２】
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質が、抗ＣＸＣＲ４中和抗体、抗ＳＤＦ−１中和抗体、ＡＭＤ３１００およびＡＭＤ３４６５からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
ＣＸＣＲ４を発現する癌が、白血病、悪性リンパ腫、乳癌、肺癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、直腸癌、前立腺癌、メラノーマ、腎細胞癌および卵巣癌からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
癌治療が、化学療法、放射線療法または免疫療法であることを特徴とする請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
ＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における再発を予防または治療するために用いられ、少なくとも１回以上の癌治療を行った後に投与される医薬の製造のためのＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質の使用。
【請求項１】
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質を有効成分とし、ＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における再発を予防または治療するために用いられ、少なくとも１回以上の癌治療を行った後に投与されることを特徴とする再発癌の予防または治療用医薬。
【請求項２】
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質が、抗ＣＸＣＲ４中和抗体、抗ＳＤＦ−１中和抗体、ＡＭＤ３１００およびＡＭＤ３４６５からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
ＣＸＣＲ４を発現する癌が、白血病、悪性リンパ腫、乳癌、肺癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、直腸癌、前立腺癌、メラノーマ、腎細胞癌および卵巣癌からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
癌治療が、化学療法、放射線療法または免疫療法であることを特徴とする請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
ＣＸＣＲ４を発現する癌の原発巣以外における再発を予防または治療するために用いられ、少なくとも１回以上の癌治療を行った後に投与される医薬の製造のためのＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４アクシス阻害物質の使用。
【図２】
【図１５】
【図１７】
【図１９】
【図２０】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図１８】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図１５】
【図１７】
【図１９】
【図２０】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図１８】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公開番号】特開２０１１−１６８５６７（Ｐ２０１１−１６８５６７Ａ）
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３６６３４（Ｐ２０１０−３６６３４）
【出願日】平成２２年２月２２日（２０１０．２．２２）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２２日（２０１０．２．２２）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]