出血性障害の処置のための第ＩＸＡ因子
【課題】第ＩＸａ因子を含む薬学的調製物による、血液凝固病理の処置方法の提供。
【解決手段】本発明は、第ＩＸａ因子が濃縮された調製物の投与によって被験体における出血性障害を処置する方法を提供し、この方法は、少なくとも１０％の第ＩＸａ因子（ｍｇ／総タンパク質ｍｇ）を含む薬学的調製物を投与する工程を包含する。第ＩＸａ因子は、組み換え技術により産生された第ＩＸ因子をタンパク質分解によって活性化することによって産生され得る。本発明はまた、血漿画分から第ＩＸａ因子を産生するための方法を提供し、この方法は、プレカリクレイン活性をほとんど含有しないかまたは全く含有しない第ＩＸａ因子産物をもたらす。
【解決手段】本発明は、第ＩＸａ因子が濃縮された調製物の投与によって被験体における出血性障害を処置する方法を提供し、この方法は、少なくとも１０％の第ＩＸａ因子（ｍｇ／総タンパク質ｍｇ）を含む薬学的調製物を投与する工程を包含する。第ＩＸａ因子は、組み換え技術により産生された第ＩＸ因子をタンパク質分解によって活性化することによって産生され得る。本発明はまた、血漿画分から第ＩＸａ因子を産生するための方法を提供し、この方法は、プレカリクレイン活性をほとんど含有しないかまたは全く含有しない第ＩＸａ因子産物をもたらす。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００４年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／５５４，７２６号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、第ＩＸａ因子を含む薬学的調製物による、血液凝固病理の処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
血液凝固は、一連の相互依存的な生化学的反応に依存する、複雑かつ動的な生物学的プロセスである。その一連の各工程において、活性プロテアーゼが、不活性な前駆体から生成される。新たに生成されたプロテアーゼの各々は、次々に、その基質である別の前駆体プロテアーゼに作用し、カスケード反応を生成する。このカスケードは、最終的に、安定な血塊を生成するのに十分活性なトロンビンをもたらす。
【０００４】
このカスケードの終末部分は、血小板のリン脂質膜上で起こる。この表面上で、第ＩＸａ因子（第ＸＩａ因子または第ＶＩＩａ因子により活性化される（図１に図示される））は、その補因子である第ＶＩＩＩ因子の存在下で、第Ｘ因子を第Ｘａ因子に活性化する。第Ｘａ因子は、プロトロンビンをトロンビンへ活性化し、このトロンビンが次いでフィブリノーゲンを活性化して、フィブリンの血塊を形成する。第ＩＸａ因子単独ではインビトロで第Ｘ因子を緩やかにしか活性化し得ないので、第ＶＩＩＩ因子の具体的な役割は、第ＩＸａ因子の、第Ｘ因子の触媒作用を強化することである（非特許文献１）。
【０００５】
最も一般的な血液凝固病理である血友病Ａは、罹患した個体の血液において循環第ＶＩＩＩ因子レベルの減少に導く、Ｘ連鎖遺伝性欠損である。濃縮された第ＶＩＩＩ因子調製物は、そのような個体を処置し、その個体の循環第ＶＩＩＩ因子レベルを機能レベルまで回復させるのに使用される。しかし、これらの患者の約２０％では、阻害性の同種抗体が第ＶＩＩＩ因子に対して産生され、この処置の有効性を妨げている。
【０００６】
第ＶＩＩＩ因子置換療法に不応性になった患者の処置としては、免疫寛容誘導（ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）（ＩＴＩ）、ブタ第ＶＩＩＩ因子での置換療法、および凝固において第ＶＩＩＩ因子処置に対する必要性をバイパスするといわれている種々の調製物が挙げられる。これらのバイパス調製物としては、組み換え第ＶＩＩａ因子、プロトロンビン複合体濃縮物（Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）および活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ａＰＣＣ）が挙げられる。
【０００７】
ａＰＣＣの治療的に有効な基質は、以下の因子の種々の組み合わせであると推測されている：トロンビン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、プロトロンビン／第Ｘａ因子複合体。しかし、ａＰＣＣに対する正確なインビボでの作用機序は、なお議論の余地がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ｖａｎ Ｄｉｅｉｊｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８１年４月１０日；２５６（７）：ｐ．３４３３−４２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、第ＩＸａ因子が濃縮された調製物を投与することにより、被験体における出血性障害を処置するための方法を提供する。本発明における使用のための第ＩＸａ因子は、組み換え技術により産生された第ＩＸ因子をタンパク質分解で活性化することにより、産生され得る。第ＩＸ因子をコードするｃＤＮＡは、単離、特徴付け、および発現ベクターへのクローニングがされている。例えば、Ｃｈｏｏら、Ｎａｔｕｒｅ ２９９：１７８−１８０（１９８２）；Ｆａｉｒら、Ｂｌｏｏｄ ６４：１９４−２０４（１９８４）およびＫｕｒａｃｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６４６１−６４６４（１９８２）を参照のこと。組み換え第ＩＸ因子は、米国特許第４，７７０，９９９号（Ｋａｕｆｍａｎｎら、Ｓｅｐ．１３，１９８８；これは本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、組み換え技術により産生されている。本発明はまた、コーン画分ＩＶ．１ペースト（Ｃｏｈｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ＩＶ．１ ｐａｓｔｅ）のような血漿画分から第ＩＸａ因子を調製および単離するための方法も提供する。これは、現存する手順の改変として、第ＩＸａ因子への第ＩＸ因子の変換を意図的に触媒し、アニオン交換工程を導入して（米国特許第３，５６０，４７５号および同第４，２８６，０５６号に記載される）、存在する不純物から第ＩＸａ因子を選択的に精製することによって達成される。第ＩＸａ因子が濃縮されたこの調製物は、第ＶＩＩＩ因子欠損マウス（ｆｖｉｉｉ−／−マウス）の第ＶＩＩＩ因子の出血表現型を補正し得る。従って、その調製物は、血友病に関連する出血性障害の処置における臨床的有用性を有する。さらに、本発明のさらなる有用性は、その調製物が出発物質のＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔからプレカリクレイン（ＰＫＡ）活性を除去することである。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
出血性病理を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、
少なくとも１０％の第ＩＸａ因子（ｍｇ／総タンパク質ｍｇ）を含む薬学的調製物を投与する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記薬学的調製物が、プレカリクレイン活性化因子の活性を本質的に有さない、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記出血性病理が、前記被験体の血液中の第ＶＩＩＩ因子インヒビターの存在によって引き起こされる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記出血性病理が、前記被験体の血液中の内在性第ＶＩＩＩ因子活性の不在によって引き起こされる、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記出血性病理が、前記被験体の血液中の内在性第ＩＸ因子活性の不在によって引き起こされる、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記第ＩＸａ因子が、組み換え技術により産生された第ＩＸ因子のタンパク質分解活性化によって産生される、項目１に記載の方法。
（項目７）
第ＩＸａ因子を含み、かつプレカリクレイン活性を本質的に有さない薬学的調製物を作製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）コーン画分ＩＶ−１のペーストを溶解する工程；
ｂ）該コーン画分ＩＶ−１に含まれる凝固因子を、リン酸カルシウム上に吸着する工程；
ｃ）該リン酸カルシウムから該凝固因子を溶出し、第一の溶出液を形成する工程；
ｄ）該第一の溶出液をアニオン交換樹脂に加え、それにより第ＩＸａ因子を該樹脂に吸着し、プレカリクレイン活性を有する不純物を廃棄画分へ流出させる工程；ならびに
ｅ）該第ＩＸａ因子を該樹脂から溶出および回収する工程、
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、第ＩＸ因子の、第ＸＩａ因子およびカルシウムまたは第ＶＩＩａ因子−組織因子による活性化を示す。これは、アルギニン（Ａｒｇ）アラニン（Ａｌａ）結合の切断および第ＩＸａ因子の不活性中間体である第ＩＸα因子の形成をもたらす。第二の結合であるＡｒｇ１８０−バリン１８１（Ｖａｌ）の切断は、第ＩＸ因子の活性形態（第ＩＸａ因子と呼ばれる）である第ＩＸαβ因子の形成および約１０ｋＤａのペプチドフラグメントの放出をもたらす（図は、Ｒｏｙａｌ Ａ ＭｃＧｒａｗら、Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ−Ｖｏｌ １４．２ Ｊｕｎｅ １９８５から改変した）。その後の図において使用された免疫ブロット実験は、特定の調製物においてタンパク質を分離するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いる。これらのゲルが還元条件下で泳動された場合、ヘテロ二量体を一緒に保持しているジスルフィド結合が破壊され、第ＩＸ因子の重鎖および軽鎖が別個の種として分離する。例えば、第ＩＸαβ因子の場合、その重鎖および軽鎖は、それぞれ約３０ｋＤａおよび約２０ｋＤａに分離する。このストラテジーにおいて、触媒性酵素の濃度は第ＩＸ因子よりも有意に低く、これはその触媒性酵素の、さらなるクロマトグラフ（例えば、第ＩＸ因子に対するモノクローナルアフィニティーカラム）によるその後の除去を容易にする。
【図２】図２Ａは、第ＩＸ因子の重鎖に特異的なモノクローナル抗体を使用する、特定のＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ調製物における活性化第ＩＸ因子の量を測定する免疫ブロットである。示された量の精製された活性化第ＩＸａ因子をゲルにロードした。各Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ調製物の５μｌを、各レーンにロードした。従って、２８３９Ｂ０６５および２８３９Ｂ０５５における活性化第ＩＸ因子のおよその濃度は、およそ２０ｎｇ／μｌと５０ｎｇ／μｌとの間にある。各Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ調製物（ロット番号 ２８３９Ｂ０６５、２８３９Ｂ０５５、２８３９Ｂ０５３）に対する第８因子補正単位（Ｆａｃｔｏｒ Ｅｉｇｈｔ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ）（ＦＥＣＵ）は、適切なレーンの下に示される。これらの結果はまた、活性化第ＩＸ因子の量がＦＥＣＵ効力と正に相関することも示す。
【図３】図３は、最小の受容可能な効力よりも大きい効力（１ｍｌ当たり６ＦＥＣＵ単位よりも大きい）を有する、２００２年および２００３年に生産されたＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ製造ロットのパネルを使用する、第ＩＸ因子の重鎖に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫ブロットである。各Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ調製物に対する第８因子補正単位（ＦＥＣＵ）は、適切なレーンの下に示される。全ての場合において、第ＩＸ因子は、第ＩＸａ因子へ活性化されている。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、ＦＥＣＵ凝固アッセイにおける精製された活性化第ＩＸ因子の用量応答を示す。この実験において、増加する量の第ＸＩａ因子（１ｍｌ当たり０ｎｇ、１０ｎｇ、２０ｎｇ、３０ｎｇ、５０ｎｇおよび７５ｎｇ）が、ＦＥＣＵ凝固アッセイにおいて引き続いて使用された活性化第ＩＸａ因子の量を制御するために使用される。図４Ａは、クマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。これは、第ＸＩａ因子の濃度が増加すると、より活性化された第ＩＸ因子が産生されることを示す。第ＩＸａおよび第ＩＸ因子の精製された標準が、比較のために同じゲル上で分離された。図４Ｂ。消化物の各アリコートを、次いで、第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイによって分析する。加えられた第ＸＩａ因子（０〜７５ｎｇ／ｍｌ）の量は、この実験においては有意なＦＥＣＵ活性を有さない。これらの結果は、活性化第ＩＸ因子が、第ＶＩＩＩ因子のバイパス活性を有する。
【図５】図５Ａは、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ調製物から第ＩＸａ因子を精製するための精製スキームを示す図である。図５Ｂは、免疫ブロット（第ＩＸ因子の重鎖に特異的なモノクローナル抗体を用いる）により、プールされたＱ−セファロース溶出液における活性化第ＩＸ因子の濃度がＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ調製物と類似していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、出血性障害を有する患者を、濃縮第ＩＸａ因子を含む薬学的調製物を投与することによって処置する方法を提供する。この調製物は、検出可能なＰＫＡ活性を含まない。驚くべきことに、その第ＩＸａ因子は、内在性第ＶＩＩＩ因子を有さないかまたは不活性である内在性形態の第ＶＩＩＩ因子を有する被験体において、凝固を開始させる。
【００１２】
第ＩＸａ因子を濃縮させるために、米国特許第４，７７０，９９９号（これは本明細書中に参考として援用される）に提供されるように、出発物質は、組み換え技術により産生された第ＩＸ因子であり得る。簡単に述べると、１１４μｇ／ｍｌ（２μＭ）の組み換え第ＩＸ因子を、５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む７．４のＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水中の２．４μｇ／ｍｌ（３０ｎＭ）の第ＸＩａ因子と、３７℃でインキュベートする。この反応により、３７℃で２時間消化させる。あるいは、１１４μｇ／ｍｌ（２μＭ）の組み換え第ＩＸ因子を、５ｍＭ Ｃａ２＋およびＺｈｏｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９４ Ａｐｒ ２６；９１（９）：３５７４−８から適応した１ｍＭを含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水中の第ＶＩＩａ因子および組織因子の両方（１μｇ／ｍｌ（２０ｎｍ））と、３７℃でインキュベートする。さらに、両方の活性化反応においてアリコートを回収し、等量の２×還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に加え、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離して、第ＩＸ因子が定量的に第ＩＸａ因子に変換することを確実にする。活性化第ＩＸ因子の調製物を、哺乳動物被験体への投与に適した個々のアリコート中のヘパリン化クエン酸生理食塩水中に希釈する。所望される場合、触媒である第ＸＩａ因子またはＴＦ／第ＶＩＩａ因子は、Ｗｏｊｃｉｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９７）３２３（６２９−６３６）に記載されるように、抗第ＩＸ因子：Ｍｇ（ＩＩ）ＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラム（ゲル１ｍｌ当たり１ｍｇのＩｇＧ）を使用して第ＩＸａ因子を選択的に精製することによって除去され得る。結合した第ＩＸａ因子を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭベンズアミジンおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液によってカラムから溶出する。溶出した第ＩＸａ因子を、続いてヘパリン化クエン酸生理食塩水を含む緩衝液に透析し、哺乳動物被験体への投与に適した濃度へ等分する。
【００１３】
第ＩＸａ因子濃縮物を作製するために、出発物質はまた、コーンの血漿画分ＩＶ−１沈殿物であり得る。この沈殿物を、米国特許第３，５６０，４７５号に記載されるように、約２０℃で生理食塩水中１０％重量／体積の濃度に溶解し、次いで三塩基リン酸カルシウム上への吸収によって部分的に精製する。
【００１４】
この三塩基リン酸カルシウムによって溶出される物質を、米国特許第３，５６０，４７５号にて議論されるように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によってさらに精製および濃縮する。得られた沈殿を、米国特許第４，２８６，０５６号に記載されるように、０．２Ｍクエン酸ナトリウム溶液に溶解し、ｐＨを調節する。
【００１５】
０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のシリカが、第ＸＩ因子を第ＸＩａ因子へ活性化するのに使用される。第ＸＩ因子は、画分ＩＶ．１ペーストの成分である。第ＸＩａ因子は、ペースト中の第ＩＸ因子を、第ＩＸａ因子に活性化する。
【００１６】
活性化第ＩＸａ因子を含むバルク溶液を、次いで、Ｑ−セファロース樹脂上でさらに精製および濃縮する。フロースルー（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）を廃棄し、結合したタンパク質を、増加するＮａＣｌ濃度勾配でクエン酸ナトリウム溶液を使用して溶出する。溶離液画分の適切な試験を、次いで実施する。最も高濃度の第ＩＸａ因子を含む画分をプールする。このＱ−セファロース画分は、第ＩＸａ因子について濃縮されており、かつＰＫＡ活性を欠いている。
【００１７】
本発明は、ａＰＣＣ（Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ）の生化学的特徴付けの後に行われた。この特徴付けにより、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔが予想外に高濃度の活性化第ＩＸ因子（１ｍｌ当たり２０μｇ〜５０μｇ）を含むことが明らかになった。さらに、活性化第ＩＸ因子の濃度は、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔの第８因子補正単位活性（ＦＥＣＵ）と相関する（図２）。このＦＥＣＵ活性アッセイは、Ａｕｔｏｐｌｅｘ調製物が第ＶＩＩＩ因子欠損血漿をいかに早く凝固するかを測定する（米国特許第４，２８６，０５６号に記載される）。Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ産物はＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔの臨床的有用性（すなわち、凝固において第ＶＩＩＩ因子をバイパスする能力）を模倣すると考えられているので、このアッセイはＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ産物の効力を決めるのに使用される。
【００１８】
図２および図３は、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔの複数の製造ロットにおいて、第ＩＸ因子が第ＩＸａ因子に活性化されることを実証する。Ａｕｔｏｐｌｅｘの第ＩＸａ因子含量とＦＥＣＵ活性との間の相関は、第ＩＸａ因子がＡｕｔｏｐｌｅｘの活性な薬学的成分であり得ることを示唆する。図４は、精製された第ＩＸａ因子が、用量依存的な様式で第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の凝固時間を補正することを実証する。これは、上記の考え方と一致する。この仮定を評価するために、本発明者らは、アニオン交換クロマトグラフィー工程：Ｑ−セファロースを使用して、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔから第ＩＸａ因子の精製調製物を調製した（図５Ａおよび図５Ｂ）。次いで、本発明者らは、ｆｖｉｉｉ−／−遺伝子を欠損するマウスにおける出血研究を使用して、この調製物の生物学的有効性を比較した。その結果（表３および表４）は、精製された第ＩＸａ因子調製物が、これらの血友病マウスの出血表現型をレスキューし得ることを示す。
【００１９】
Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔは、第ＸＩＩ因子のタンパク質分解フラグメントである第ＸＩＩａ因子βの存在に起因して、顕著な量のプレカリクレイン活性を含む。ＰＫＡ活性は、重大な臨床的症状（例えば、疼痛および低血圧）と関連するため、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔの望ましくない特性であるというレッテルを貼られている。本発明のさらなる有用性は、Ｑ−セファロースカラム上での第ＩＸａ因子の精製が、調製物からＰＫＡ活性を実質的に除去することである（表１）。
【００２０】
以下の実施例は、第ＩＸａ因子のこのような調製物の初期単離およびそれが出血性障害を処置するのに効果的であることの実証を示す。
【実施例】
【００２１】
（実施例Ｉ）
十分量の画分（コーン画分ＩＶ−１沈殿物）を０．９％生理食塩水に懸濁して、１０％溶液（ｗ／ｖ）を作製した。この溶液は、米国特許第３，５６０，４７５号および同４，２８６，０５６号に記載されるような代表的な様式で製造された。ｐＨを、１Ｎの水酸化ナトリウムで７．２に調節し、沈殿物を生じさせた。遠心分離の後で、リン酸カルシウムを上清に加えた。この溶液を、混合し、遠心分離して、リン酸カルシウム吸着沈殿物を回収した。この沈殿物を、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム中に、懸濁したＩＶ−１ペーストの容量の４％に匹敵する容量で、再懸濁した。この懸濁液を、遠心分離し、そして凝固因子を含有する上清を回収した。
【００２２】
（実施例ＩＩ）
この上清を、上述のアリコートを用いたＳ−２２２２ペプチドベース色素生産性アッセイによって測定される場合に、約０．０２Ｕ／ｍｌの第Ｘｌａ因子レベルに達すると規定された時間の間、０．５ｇ／Ｌのシリカを用いて調節した。活性化を、１．５μフィルタを通す混合物の濾過によって止めた。
【００２３】
（実施例ＩＩＩ）
実施例ＩＩからの生成物を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって、さらに精製した。最初に、この溶液を、平均分子量４０００のＰＥＧ固体を添加することによって、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧにした。この懸濁液を遠心分離し、この上清のｐＨを、１Ｎの塩酸で５．２に調節し、次いでさらなるＰＥＧ固体を添加することにより２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ溶液にした。この懸濁液を遠心分離し、この沈殿物を、０．７２％の塩化ナトリウムおよび１ｍｌ当たり１．５単位のヘパリンを含有する０．０２Ｍのクエン酸ナトリウム溶液中に溶解し（以後、ヘパリン化クエン酸生理食塩水を呼ぶ）、そしてｐＨを７．０に調節した。この物質の効力を、２３ＦＥＣＵ単位／ｍｌであると決定した。
【００２４】
ＦＥＣＵアッセイにおいて、１単位のＦＥＣＵを、１：２０で希釈した活性化プロトロンビン複合体の量として規定し、これは、等量の第ＶＩＩＩ欠損血漿、または第ＶＩＩＩ因子インヒビターを含有する血漿を加える際に、凝固時間（エラグ酸活性化した部分トロンボプラスチン時間）を３５秒間（正常）に補正する。
【００２５】
（実施例ＩＶ）
滅菌カラムを、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でパック（ｐａｃｋｅｄ）した。このカラムを、０．０２５ＭのＮａＣｌを含有する滅菌ヘパリン化クエン酸生理食塩水を用いて平衡化した。実施例ＩＩＩからの生成物の適用の後で、上記カラムを、同じ緩衝液で洗浄した。第ＩＸａ因子を、０．０２５〜０．２５Ｍまで増加する量のＮａＣｌを含有する、ヘパリン化クエン酸生理食塩水を用いて溶出した。サンプルを、溶出の間中、間隔を空けて採取し、そして、免疫ブロット法によって決定されるような、最高濃度の第ＩＸａ因子を有するサンプルをプールした。次いで、このプールを、ヘパリン化クエン酸生理食塩水（ｐＨ７．０）中に希釈し、クロマトグラフィーの間、濃度における増加を制御した。バルクの少量のアリコートを、ヘパリン化クエン酸生理食塩水で希釈し、そして第ＶＩＩＩ因子補正活性について試験し、どの希釈が、効力レベルを２３ＦＥＣＵ／ｍｌまで下げるかを決定した。調製物中の活性化された第ＩＸａ因子の量を、免疫ブロット法によって決定し（図４ｂ）、そしてＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔの調製物に類似することを示した。
【００２６】
カリクレイン（血漿カリクレイン）は、キニノーゲンをキニンへと変換することに関与する酵素である。これは、次々と低血圧を促進し得、そして患者において望まれない症状に関連し得る。プレカリクレイン活性化因子（ＰＫＡ）は、プレカリクレインをカリクレインへ変換する酵素である。ＰＫＡアッセイのための標準物質として使用されるＣＢＥＲ参照は、ＰＫＡの成分として第ＸＩＩａ因子βを列挙する（ＣＢＥＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ ＤＭＰＱ／ＣＢＥＲ／ＦＤＡ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｍ Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｆｏｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＰＫＡ）ロット番号３、印刷年月日；１９９９年３月３１日）。プレカリクレイン活性化因子（ＰＫＡ）の濃度を、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ中で測定し、そして精製された第ＩＸａ因子調製物を色素非産生アッセイ（Ｔａｎｋｅｒｓｌｅｙら； Ｂｌｏｏｄ，６２（２）：４４８−４５６，１９８３）を使用して測定した。
【００２７】
表１は、ＰＫＡ活性がＱセファロース工程の導入によって調製物から除去されることを示す。ＰＫＡ活性を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＣＢＥＲ）の百分率で表す。結果は、出発物質における大部分のＰＫＡ活性が、Ｑセファロース溶出液中に回収されないことを示す。
【００２８】
【表１】
（実施例Ｖ）
以下に、ｆｖｉｉｉ−／−マウスにおいて出血および凝固を評価する実験プロトコルを説明する。試験サンプルのアリコートを、ヘパリン化クエン酸生理食塩水中で、−７０℃まで凍結させ、そして急速に解凍して使用した。ｆｖｉｉｉ−／−マウスの５群を、第ＩＸａ因子かまたは抗インヒビター血液凝固複合体（Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ）のいずれかを、増加する投与量で注射した。第ＩＸａ因子群を、以下の活性化ＩＸ因子の投与量で注射した（０．００２μｇ／ｇ、０．０１μｇ／ｇ、０．０２μｇ／ｇ、０．１３μｇ／ｇ、または０．２６μｇ／ｇ）。Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ群を、ポジティブコントロールとして、０．０１ＦＥＣＵ／ｇ、０．０７５ＦＥＣＵ／ｇ、または０．１５０ＦＥＣＵ／ｇで注射した。５匹のｆｖｉｉｉ−／−マウスを、滅菌ヘパリン化クエン酸生理食塩水で注射した。すべてのマウスについて３０分間以上のインキュベーション期間の後、外側尾静脈出血研究を実施した。具体的には、切開を外側尾静脈上で行い、そして流出された血液の量を、３０分間の期間の間、収集した。この期間の最後において、血液が大量に失われることによる死亡を防ぐために、創傷を焼灼した。加えて、１４匹のｆｖｉｉｉ−／−マウスの１群に、何も処置をしないで切開を行い、そして特定の時点において収集された血液量を、測定した。
【００２９】
これらの調製物の止血効力の評価は、出血が原因による死亡したマウスを測定することによって、最もよく評価される。所定の期間内で失血量を記録することにより止血を測定する方法は、表３の結果に実証されるように、出血速度がマウスごとに大きく変動することに悩まされる。しかし、不要なマウスの死亡を避けるために、本発明者らは、各処置群において必ずしもすべてのマウスが、失血が記録された３０分間の枠内で出血が止まるわけではないという理解とともに、これらの調製物で処置された個々のマウスにおける止血の明確な証拠を探すためのアッセイを設計した。
【００３０】
【表２】
【００３１】
【表３】
表３の結果から理解され得るように、第ＶＩＩＩ因子欠損マウスは、その尾に切開がなされる際に出血する。各マウスから収集された血液量は、可変であり、そして６５μｌ〜４００μｌの範囲である。
【００３２】
【表４−１】
【００３３】
【表４−２】
表３の血友病のマウスとは対照的に、外側尾静脈出血を、表４に示されるように野生型マウスに実施した場合、それらは、低い収集血液量（０〜８０μｌ）で示されているように、血塊を形成することが可能である。
【００３４】
第ＩＸａ因子を、３つの低い投与量にて、特定のｆｖｉｉｉ−／−マウスの出血表現型を補正することが可能であった。これらの３投与量における１５匹のマウスのうちの４匹において、失血量は、６５μｌの下限範囲よりも低く、かつ野生型において測定された失血量（０〜８０μｌ）と一致した。これらの例は、出血が第ＩＸａ因子調製物によって効果的に止められていることの明確な証拠を提供する。同様に、１５匹のうちの３匹について、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔは、野生型レベルまで止血を回復することが可能であった。この研究を実施した技術者はまた、失血アッセイでは止血の証拠を示さなかったＡｕｔｏｐｌｅｘ処置マウスおよび第ＩＸａ因子処置マウスにおいて、部分的止血栓が形成されたことを注目した。従って、これらの結果は、第ＩＸａ因子が、市販製品のＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔと同様のインビボでの効力を有することを示す。
【００３５】
興味深いことに、第ＩＸａ因子のより高い投与量およびＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔの最高の投与量のうちの２つにおいて、出血が増加したように見え、これらの試薬が散在性血管内凝固（ＤＩＣ）を生じることと一致した。ＤＩＣは高投与量のバイパス治療のよく認識された合併症であるので、このことは驚くべきことではない。
【００３６】
これらの結果は、第ＩＸａ因子が出血障害の処置において生物学的効力を有するという明確な証拠を提供する：第ＩＸａ因子は、特定のマウスにおいて野生型レベルまで出血を減少し、そしてその効力範囲は、現在市販されているバイパス治療剤のＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔに匹敵した。第ＩＸａ因子は、処置されたマウスの体重（ｇ）あたり、０．００２μｇと０．０２μｇとの間で、治療的に活性である。これらの結果に基づいて、第ＩＸａ因子を、体重１ｋｇ当たり２ｍｇと２０ｍｇの間で、患者に投与し得た。
【００３７】
本開示が与えられると、当業者は、自然に本発明のさらなる実施形態を考える。そして、上記の請求項は、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００４年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／５５４，７２６号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、第ＩＸａ因子を含む薬学的調製物による、血液凝固病理の処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
血液凝固は、一連の相互依存的な生化学的反応に依存する、複雑かつ動的な生物学的プロセスである。その一連の各工程において、活性プロテアーゼが、不活性な前駆体から生成される。新たに生成されたプロテアーゼの各々は、次々に、その基質である別の前駆体プロテアーゼに作用し、カスケード反応を生成する。このカスケードは、最終的に、安定な血塊を生成するのに十分活性なトロンビンをもたらす。
【０００４】
このカスケードの終末部分は、血小板のリン脂質膜上で起こる。この表面上で、第ＩＸａ因子（第ＸＩａ因子または第ＶＩＩａ因子により活性化される（図１に図示される））は、その補因子である第ＶＩＩＩ因子の存在下で、第Ｘ因子を第Ｘａ因子に活性化する。第Ｘａ因子は、プロトロンビンをトロンビンへ活性化し、このトロンビンが次いでフィブリノーゲンを活性化して、フィブリンの血塊を形成する。第ＩＸａ因子単独ではインビトロで第Ｘ因子を緩やかにしか活性化し得ないので、第ＶＩＩＩ因子の具体的な役割は、第ＩＸａ因子の、第Ｘ因子の触媒作用を強化することである（非特許文献１）。
【０００５】
最も一般的な血液凝固病理である血友病Ａは、罹患した個体の血液において循環第ＶＩＩＩ因子レベルの減少に導く、Ｘ連鎖遺伝性欠損である。濃縮された第ＶＩＩＩ因子調製物は、そのような個体を処置し、その個体の循環第ＶＩＩＩ因子レベルを機能レベルまで回復させるのに使用される。しかし、これらの患者の約２０％では、阻害性の同種抗体が第ＶＩＩＩ因子に対して産生され、この処置の有効性を妨げている。
【０００６】
第ＶＩＩＩ因子置換療法に不応性になった患者の処置としては、免疫寛容誘導（ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）（ＩＴＩ）、ブタ第ＶＩＩＩ因子での置換療法、および凝固において第ＶＩＩＩ因子処置に対する必要性をバイパスするといわれている種々の調製物が挙げられる。これらのバイパス調製物としては、組み換え第ＶＩＩａ因子、プロトロンビン複合体濃縮物（Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）および活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ａＰＣＣ）が挙げられる。
【０００７】
ａＰＣＣの治療的に有効な基質は、以下の因子の種々の組み合わせであると推測されている：トロンビン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、プロトロンビン／第Ｘａ因子複合体。しかし、ａＰＣＣに対する正確なインビボでの作用機序は、なお議論の余地がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ｖａｎ Ｄｉｅｉｊｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８１年４月１０日；２５６（７）：ｐ．３４３３−４２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、第ＩＸａ因子が濃縮された調製物を投与することにより、被験体における出血性障害を処置するための方法を提供する。本発明における使用のための第ＩＸａ因子は、組み換え技術により産生された第ＩＸ因子をタンパク質分解で活性化することにより、産生され得る。第ＩＸ因子をコードするｃＤＮＡは、単離、特徴付け、および発現ベクターへのクローニングがされている。例えば、Ｃｈｏｏら、Ｎａｔｕｒｅ ２９９：１７８−１８０（１９８２）；Ｆａｉｒら、Ｂｌｏｏｄ ６４：１９４−２０４（１９８４）およびＫｕｒａｃｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６４６１−６４６４（１９８２）を参照のこと。組み換え第ＩＸ因子は、米国特許第４，７７０，９９９号（Ｋａｕｆｍａｎｎら、Ｓｅｐ．１３，１９８８；これは本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、組み換え技術により産生されている。本発明はまた、コーン画分ＩＶ．１ペースト（Ｃｏｈｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ＩＶ．１ ｐａｓｔｅ）のような血漿画分から第ＩＸａ因子を調製および単離するための方法も提供する。これは、現存する手順の改変として、第ＩＸａ因子への第ＩＸ因子の変換を意図的に触媒し、アニオン交換工程を導入して（米国特許第３，５６０，４７５号および同第４，２８６，０５６号に記載される）、存在する不純物から第ＩＸａ因子を選択的に精製することによって達成される。第ＩＸａ因子が濃縮されたこの調製物は、第ＶＩＩＩ因子欠損マウス（ｆｖｉｉｉ−／−マウス）の第ＶＩＩＩ因子の出血表現型を補正し得る。従って、その調製物は、血友病に関連する出血性障害の処置における臨床的有用性を有する。さらに、本発明のさらなる有用性は、その調製物が出発物質のＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔからプレカリクレイン（ＰＫＡ）活性を除去することである。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
出血性病理を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、
少なくとも１０％の第ＩＸａ因子（ｍｇ／総タンパク質ｍｇ）を含む薬学的調製物を投与する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記薬学的調製物が、プレカリクレイン活性化因子の活性を本質的に有さない、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記出血性病理が、前記被験体の血液中の第ＶＩＩＩ因子インヒビターの存在によって引き起こされる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記出血性病理が、前記被験体の血液中の内在性第ＶＩＩＩ因子活性の不在によって引き起こされる、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記出血性病理が、前記被験体の血液中の内在性第ＩＸ因子活性の不在によって引き起こされる、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記第ＩＸａ因子が、組み換え技術により産生された第ＩＸ因子のタンパク質分解活性化によって産生される、項目１に記載の方法。
（項目７）
第ＩＸａ因子を含み、かつプレカリクレイン活性を本質的に有さない薬学的調製物を作製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）コーン画分ＩＶ−１のペーストを溶解する工程；
ｂ）該コーン画分ＩＶ−１に含まれる凝固因子を、リン酸カルシウム上に吸着する工程；
ｃ）該リン酸カルシウムから該凝固因子を溶出し、第一の溶出液を形成する工程；
ｄ）該第一の溶出液をアニオン交換樹脂に加え、それにより第ＩＸａ因子を該樹脂に吸着し、プレカリクレイン活性を有する不純物を廃棄画分へ流出させる工程；ならびに
ｅ）該第ＩＸａ因子を該樹脂から溶出および回収する工程、
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、第ＩＸ因子の、第ＸＩａ因子およびカルシウムまたは第ＶＩＩａ因子−組織因子による活性化を示す。これは、アルギニン（Ａｒｇ）アラニン（Ａｌａ）結合の切断および第ＩＸａ因子の不活性中間体である第ＩＸα因子の形成をもたらす。第二の結合であるＡｒｇ１８０−バリン１８１（Ｖａｌ）の切断は、第ＩＸ因子の活性形態（第ＩＸａ因子と呼ばれる）である第ＩＸαβ因子の形成および約１０ｋＤａのペプチドフラグメントの放出をもたらす（図は、Ｒｏｙａｌ Ａ ＭｃＧｒａｗら、Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ−Ｖｏｌ １４．２ Ｊｕｎｅ １９８５から改変した）。その後の図において使用された免疫ブロット実験は、特定の調製物においてタンパク質を分離するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いる。これらのゲルが還元条件下で泳動された場合、ヘテロ二量体を一緒に保持しているジスルフィド結合が破壊され、第ＩＸ因子の重鎖および軽鎖が別個の種として分離する。例えば、第ＩＸαβ因子の場合、その重鎖および軽鎖は、それぞれ約３０ｋＤａおよび約２０ｋＤａに分離する。このストラテジーにおいて、触媒性酵素の濃度は第ＩＸ因子よりも有意に低く、これはその触媒性酵素の、さらなるクロマトグラフ（例えば、第ＩＸ因子に対するモノクローナルアフィニティーカラム）によるその後の除去を容易にする。
【図２】図２Ａは、第ＩＸ因子の重鎖に特異的なモノクローナル抗体を使用する、特定のＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ調製物における活性化第ＩＸ因子の量を測定する免疫ブロットである。示された量の精製された活性化第ＩＸａ因子をゲルにロードした。各Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ調製物の５μｌを、各レーンにロードした。従って、２８３９Ｂ０６５および２８３９Ｂ０５５における活性化第ＩＸ因子のおよその濃度は、およそ２０ｎｇ／μｌと５０ｎｇ／μｌとの間にある。各Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ調製物（ロット番号 ２８３９Ｂ０６５、２８３９Ｂ０５５、２８３９Ｂ０５３）に対する第８因子補正単位（Ｆａｃｔｏｒ Ｅｉｇｈｔ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ）（ＦＥＣＵ）は、適切なレーンの下に示される。これらの結果はまた、活性化第ＩＸ因子の量がＦＥＣＵ効力と正に相関することも示す。
【図３】図３は、最小の受容可能な効力よりも大きい効力（１ｍｌ当たり６ＦＥＣＵ単位よりも大きい）を有する、２００２年および２００３年に生産されたＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ製造ロットのパネルを使用する、第ＩＸ因子の重鎖に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫ブロットである。各Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ調製物に対する第８因子補正単位（ＦＥＣＵ）は、適切なレーンの下に示される。全ての場合において、第ＩＸ因子は、第ＩＸａ因子へ活性化されている。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、ＦＥＣＵ凝固アッセイにおける精製された活性化第ＩＸ因子の用量応答を示す。この実験において、増加する量の第ＸＩａ因子（１ｍｌ当たり０ｎｇ、１０ｎｇ、２０ｎｇ、３０ｎｇ、５０ｎｇおよび７５ｎｇ）が、ＦＥＣＵ凝固アッセイにおいて引き続いて使用された活性化第ＩＸａ因子の量を制御するために使用される。図４Ａは、クマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。これは、第ＸＩａ因子の濃度が増加すると、より活性化された第ＩＸ因子が産生されることを示す。第ＩＸａおよび第ＩＸ因子の精製された標準が、比較のために同じゲル上で分離された。図４Ｂ。消化物の各アリコートを、次いで、第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイによって分析する。加えられた第ＸＩａ因子（０〜７５ｎｇ／ｍｌ）の量は、この実験においては有意なＦＥＣＵ活性を有さない。これらの結果は、活性化第ＩＸ因子が、第ＶＩＩＩ因子のバイパス活性を有する。
【図５】図５Ａは、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ調製物から第ＩＸａ因子を精製するための精製スキームを示す図である。図５Ｂは、免疫ブロット（第ＩＸ因子の重鎖に特異的なモノクローナル抗体を用いる）により、プールされたＱ−セファロース溶出液における活性化第ＩＸ因子の濃度がＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ調製物と類似していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、出血性障害を有する患者を、濃縮第ＩＸａ因子を含む薬学的調製物を投与することによって処置する方法を提供する。この調製物は、検出可能なＰＫＡ活性を含まない。驚くべきことに、その第ＩＸａ因子は、内在性第ＶＩＩＩ因子を有さないかまたは不活性である内在性形態の第ＶＩＩＩ因子を有する被験体において、凝固を開始させる。
【００１２】
第ＩＸａ因子を濃縮させるために、米国特許第４，７７０，９９９号（これは本明細書中に参考として援用される）に提供されるように、出発物質は、組み換え技術により産生された第ＩＸ因子であり得る。簡単に述べると、１１４μｇ／ｍｌ（２μＭ）の組み換え第ＩＸ因子を、５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む７．４のＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水中の２．４μｇ／ｍｌ（３０ｎＭ）の第ＸＩａ因子と、３７℃でインキュベートする。この反応により、３７℃で２時間消化させる。あるいは、１１４μｇ／ｍｌ（２μＭ）の組み換え第ＩＸ因子を、５ｍＭ Ｃａ２＋およびＺｈｏｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９４ Ａｐｒ ２６；９１（９）：３５７４−８から適応した１ｍＭを含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水中の第ＶＩＩａ因子および組織因子の両方（１μｇ／ｍｌ（２０ｎｍ））と、３７℃でインキュベートする。さらに、両方の活性化反応においてアリコートを回収し、等量の２×還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に加え、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離して、第ＩＸ因子が定量的に第ＩＸａ因子に変換することを確実にする。活性化第ＩＸ因子の調製物を、哺乳動物被験体への投与に適した個々のアリコート中のヘパリン化クエン酸生理食塩水中に希釈する。所望される場合、触媒である第ＸＩａ因子またはＴＦ／第ＶＩＩａ因子は、Ｗｏｊｃｉｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９７）３２３（６２９−６３６）に記載されるように、抗第ＩＸ因子：Ｍｇ（ＩＩ）ＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラム（ゲル１ｍｌ当たり１ｍｇのＩｇＧ）を使用して第ＩＸａ因子を選択的に精製することによって除去され得る。結合した第ＩＸａ因子を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭベンズアミジンおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液によってカラムから溶出する。溶出した第ＩＸａ因子を、続いてヘパリン化クエン酸生理食塩水を含む緩衝液に透析し、哺乳動物被験体への投与に適した濃度へ等分する。
【００１３】
第ＩＸａ因子濃縮物を作製するために、出発物質はまた、コーンの血漿画分ＩＶ−１沈殿物であり得る。この沈殿物を、米国特許第３，５６０，４７５号に記載されるように、約２０℃で生理食塩水中１０％重量／体積の濃度に溶解し、次いで三塩基リン酸カルシウム上への吸収によって部分的に精製する。
【００１４】
この三塩基リン酸カルシウムによって溶出される物質を、米国特許第３，５６０，４７５号にて議論されるように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によってさらに精製および濃縮する。得られた沈殿を、米国特許第４，２８６，０５６号に記載されるように、０．２Ｍクエン酸ナトリウム溶液に溶解し、ｐＨを調節する。
【００１５】
０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のシリカが、第ＸＩ因子を第ＸＩａ因子へ活性化するのに使用される。第ＸＩ因子は、画分ＩＶ．１ペーストの成分である。第ＸＩａ因子は、ペースト中の第ＩＸ因子を、第ＩＸａ因子に活性化する。
【００１６】
活性化第ＩＸａ因子を含むバルク溶液を、次いで、Ｑ−セファロース樹脂上でさらに精製および濃縮する。フロースルー（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）を廃棄し、結合したタンパク質を、増加するＮａＣｌ濃度勾配でクエン酸ナトリウム溶液を使用して溶出する。溶離液画分の適切な試験を、次いで実施する。最も高濃度の第ＩＸａ因子を含む画分をプールする。このＱ−セファロース画分は、第ＩＸａ因子について濃縮されており、かつＰＫＡ活性を欠いている。
【００１７】
本発明は、ａＰＣＣ（Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ）の生化学的特徴付けの後に行われた。この特徴付けにより、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔが予想外に高濃度の活性化第ＩＸ因子（１ｍｌ当たり２０μｇ〜５０μｇ）を含むことが明らかになった。さらに、活性化第ＩＸ因子の濃度は、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔの第８因子補正単位活性（ＦＥＣＵ）と相関する（図２）。このＦＥＣＵ活性アッセイは、Ａｕｔｏｐｌｅｘ調製物が第ＶＩＩＩ因子欠損血漿をいかに早く凝固するかを測定する（米国特許第４，２８６，０５６号に記載される）。Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ産物はＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔの臨床的有用性（すなわち、凝固において第ＶＩＩＩ因子をバイパスする能力）を模倣すると考えられているので、このアッセイはＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ産物の効力を決めるのに使用される。
【００１８】
図２および図３は、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔの複数の製造ロットにおいて、第ＩＸ因子が第ＩＸａ因子に活性化されることを実証する。Ａｕｔｏｐｌｅｘの第ＩＸａ因子含量とＦＥＣＵ活性との間の相関は、第ＩＸａ因子がＡｕｔｏｐｌｅｘの活性な薬学的成分であり得ることを示唆する。図４は、精製された第ＩＸａ因子が、用量依存的な様式で第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の凝固時間を補正することを実証する。これは、上記の考え方と一致する。この仮定を評価するために、本発明者らは、アニオン交換クロマトグラフィー工程：Ｑ−セファロースを使用して、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔから第ＩＸａ因子の精製調製物を調製した（図５Ａおよび図５Ｂ）。次いで、本発明者らは、ｆｖｉｉｉ−／−遺伝子を欠損するマウスにおける出血研究を使用して、この調製物の生物学的有効性を比較した。その結果（表３および表４）は、精製された第ＩＸａ因子調製物が、これらの血友病マウスの出血表現型をレスキューし得ることを示す。
【００１９】
Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔは、第ＸＩＩ因子のタンパク質分解フラグメントである第ＸＩＩａ因子βの存在に起因して、顕著な量のプレカリクレイン活性を含む。ＰＫＡ活性は、重大な臨床的症状（例えば、疼痛および低血圧）と関連するため、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔの望ましくない特性であるというレッテルを貼られている。本発明のさらなる有用性は、Ｑ−セファロースカラム上での第ＩＸａ因子の精製が、調製物からＰＫＡ活性を実質的に除去することである（表１）。
【００２０】
以下の実施例は、第ＩＸａ因子のこのような調製物の初期単離およびそれが出血性障害を処置するのに効果的であることの実証を示す。
【実施例】
【００２１】
（実施例Ｉ）
十分量の画分（コーン画分ＩＶ−１沈殿物）を０．９％生理食塩水に懸濁して、１０％溶液（ｗ／ｖ）を作製した。この溶液は、米国特許第３，５６０，４７５号および同４，２８６，０５６号に記載されるような代表的な様式で製造された。ｐＨを、１Ｎの水酸化ナトリウムで７．２に調節し、沈殿物を生じさせた。遠心分離の後で、リン酸カルシウムを上清に加えた。この溶液を、混合し、遠心分離して、リン酸カルシウム吸着沈殿物を回収した。この沈殿物を、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム中に、懸濁したＩＶ−１ペーストの容量の４％に匹敵する容量で、再懸濁した。この懸濁液を、遠心分離し、そして凝固因子を含有する上清を回収した。
【００２２】
（実施例ＩＩ）
この上清を、上述のアリコートを用いたＳ−２２２２ペプチドベース色素生産性アッセイによって測定される場合に、約０．０２Ｕ／ｍｌの第Ｘｌａ因子レベルに達すると規定された時間の間、０．５ｇ／Ｌのシリカを用いて調節した。活性化を、１．５μフィルタを通す混合物の濾過によって止めた。
【００２３】
（実施例ＩＩＩ）
実施例ＩＩからの生成物を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって、さらに精製した。最初に、この溶液を、平均分子量４０００のＰＥＧ固体を添加することによって、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧにした。この懸濁液を遠心分離し、この上清のｐＨを、１Ｎの塩酸で５．２に調節し、次いでさらなるＰＥＧ固体を添加することにより２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ溶液にした。この懸濁液を遠心分離し、この沈殿物を、０．７２％の塩化ナトリウムおよび１ｍｌ当たり１．５単位のヘパリンを含有する０．０２Ｍのクエン酸ナトリウム溶液中に溶解し（以後、ヘパリン化クエン酸生理食塩水を呼ぶ）、そしてｐＨを７．０に調節した。この物質の効力を、２３ＦＥＣＵ単位／ｍｌであると決定した。
【００２４】
ＦＥＣＵアッセイにおいて、１単位のＦＥＣＵを、１：２０で希釈した活性化プロトロンビン複合体の量として規定し、これは、等量の第ＶＩＩＩ欠損血漿、または第ＶＩＩＩ因子インヒビターを含有する血漿を加える際に、凝固時間（エラグ酸活性化した部分トロンボプラスチン時間）を３５秒間（正常）に補正する。
【００２５】
（実施例ＩＶ）
滅菌カラムを、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でパック（ｐａｃｋｅｄ）した。このカラムを、０．０２５ＭのＮａＣｌを含有する滅菌ヘパリン化クエン酸生理食塩水を用いて平衡化した。実施例ＩＩＩからの生成物の適用の後で、上記カラムを、同じ緩衝液で洗浄した。第ＩＸａ因子を、０．０２５〜０．２５Ｍまで増加する量のＮａＣｌを含有する、ヘパリン化クエン酸生理食塩水を用いて溶出した。サンプルを、溶出の間中、間隔を空けて採取し、そして、免疫ブロット法によって決定されるような、最高濃度の第ＩＸａ因子を有するサンプルをプールした。次いで、このプールを、ヘパリン化クエン酸生理食塩水（ｐＨ７．０）中に希釈し、クロマトグラフィーの間、濃度における増加を制御した。バルクの少量のアリコートを、ヘパリン化クエン酸生理食塩水で希釈し、そして第ＶＩＩＩ因子補正活性について試験し、どの希釈が、効力レベルを２３ＦＥＣＵ／ｍｌまで下げるかを決定した。調製物中の活性化された第ＩＸａ因子の量を、免疫ブロット法によって決定し（図４ｂ）、そしてＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔの調製物に類似することを示した。
【００２６】
カリクレイン（血漿カリクレイン）は、キニノーゲンをキニンへと変換することに関与する酵素である。これは、次々と低血圧を促進し得、そして患者において望まれない症状に関連し得る。プレカリクレイン活性化因子（ＰＫＡ）は、プレカリクレインをカリクレインへ変換する酵素である。ＰＫＡアッセイのための標準物質として使用されるＣＢＥＲ参照は、ＰＫＡの成分として第ＸＩＩａ因子βを列挙する（ＣＢＥＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ ＤＭＰＱ／ＣＢＥＲ／ＦＤＡ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｍ Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｆｏｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＰＫＡ）ロット番号３、印刷年月日；１９９９年３月３１日）。プレカリクレイン活性化因子（ＰＫＡ）の濃度を、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ中で測定し、そして精製された第ＩＸａ因子調製物を色素非産生アッセイ（Ｔａｎｋｅｒｓｌｅｙら； Ｂｌｏｏｄ，６２（２）：４４８−４５６，１９８３）を使用して測定した。
【００２７】
表１は、ＰＫＡ活性がＱセファロース工程の導入によって調製物から除去されることを示す。ＰＫＡ活性を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＣＢＥＲ）の百分率で表す。結果は、出発物質における大部分のＰＫＡ活性が、Ｑセファロース溶出液中に回収されないことを示す。
【００２８】
【表１】
（実施例Ｖ）
以下に、ｆｖｉｉｉ−／−マウスにおいて出血および凝固を評価する実験プロトコルを説明する。試験サンプルのアリコートを、ヘパリン化クエン酸生理食塩水中で、−７０℃まで凍結させ、そして急速に解凍して使用した。ｆｖｉｉｉ−／−マウスの５群を、第ＩＸａ因子かまたは抗インヒビター血液凝固複合体（Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ）のいずれかを、増加する投与量で注射した。第ＩＸａ因子群を、以下の活性化ＩＸ因子の投与量で注射した（０．００２μｇ／ｇ、０．０１μｇ／ｇ、０．０２μｇ／ｇ、０．１３μｇ／ｇ、または０．２６μｇ／ｇ）。Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔ群を、ポジティブコントロールとして、０．０１ＦＥＣＵ／ｇ、０．０７５ＦＥＣＵ／ｇ、または０．１５０ＦＥＣＵ／ｇで注射した。５匹のｆｖｉｉｉ−／−マウスを、滅菌ヘパリン化クエン酸生理食塩水で注射した。すべてのマウスについて３０分間以上のインキュベーション期間の後、外側尾静脈出血研究を実施した。具体的には、切開を外側尾静脈上で行い、そして流出された血液の量を、３０分間の期間の間、収集した。この期間の最後において、血液が大量に失われることによる死亡を防ぐために、創傷を焼灼した。加えて、１４匹のｆｖｉｉｉ−／−マウスの１群に、何も処置をしないで切開を行い、そして特定の時点において収集された血液量を、測定した。
【００２９】
これらの調製物の止血効力の評価は、出血が原因による死亡したマウスを測定することによって、最もよく評価される。所定の期間内で失血量を記録することにより止血を測定する方法は、表３の結果に実証されるように、出血速度がマウスごとに大きく変動することに悩まされる。しかし、不要なマウスの死亡を避けるために、本発明者らは、各処置群において必ずしもすべてのマウスが、失血が記録された３０分間の枠内で出血が止まるわけではないという理解とともに、これらの調製物で処置された個々のマウスにおける止血の明確な証拠を探すためのアッセイを設計した。
【００３０】
【表２】
【００３１】
【表３】
表３の結果から理解され得るように、第ＶＩＩＩ因子欠損マウスは、その尾に切開がなされる際に出血する。各マウスから収集された血液量は、可変であり、そして６５μｌ〜４００μｌの範囲である。
【００３２】
【表４−１】
【００３３】
【表４−２】
表３の血友病のマウスとは対照的に、外側尾静脈出血を、表４に示されるように野生型マウスに実施した場合、それらは、低い収集血液量（０〜８０μｌ）で示されているように、血塊を形成することが可能である。
【００３４】
第ＩＸａ因子を、３つの低い投与量にて、特定のｆｖｉｉｉ−／−マウスの出血表現型を補正することが可能であった。これらの３投与量における１５匹のマウスのうちの４匹において、失血量は、６５μｌの下限範囲よりも低く、かつ野生型において測定された失血量（０〜８０μｌ）と一致した。これらの例は、出血が第ＩＸａ因子調製物によって効果的に止められていることの明確な証拠を提供する。同様に、１５匹のうちの３匹について、Ａｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔは、野生型レベルまで止血を回復することが可能であった。この研究を実施した技術者はまた、失血アッセイでは止血の証拠を示さなかったＡｕｔｏｐｌｅｘ処置マウスおよび第ＩＸａ因子処置マウスにおいて、部分的止血栓が形成されたことを注目した。従って、これらの結果は、第ＩＸａ因子が、市販製品のＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔと同様のインビボでの効力を有することを示す。
【００３５】
興味深いことに、第ＩＸａ因子のより高い投与量およびＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔの最高の投与量のうちの２つにおいて、出血が増加したように見え、これらの試薬が散在性血管内凝固（ＤＩＣ）を生じることと一致した。ＤＩＣは高投与量のバイパス治療のよく認識された合併症であるので、このことは驚くべきことではない。
【００３６】
これらの結果は、第ＩＸａ因子が出血障害の処置において生物学的効力を有するという明確な証拠を提供する：第ＩＸａ因子は、特定のマウスにおいて野生型レベルまで出血を減少し、そしてその効力範囲は、現在市販されているバイパス治療剤のＡｕｔｏｐｌｅｘ−Ｔに匹敵した。第ＩＸａ因子は、処置されたマウスの体重（ｇ）あたり、０．００２μｇと０．０２μｇとの間で、治療的に活性である。これらの結果に基づいて、第ＩＸａ因子を、体重１ｋｇ当たり２ｍｇと２０ｍｇの間で、患者に投与し得た。
【００３７】
本開示が与えられると、当業者は、自然に本発明のさらなる実施形態を考える。そして、上記の請求項は、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【図１】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１２６７４３（Ｐ２０１２−１２６７４３Ａ）
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−７３８３９（Ｐ２０１２−７３８３９）
【出願日】平成２４年３月２８日（２０１２．３．２８）
【分割の表示】特願２００７−５０３９２０（Ｐ２００７−５０３９２０）の分割
【原出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−７３８３９（Ｐ２０１２−７３８３９）
【出願日】平成２４年３月２８日（２０１２．３．２８）
【分割の表示】特願２００７−５０３９２０（Ｐ２００７−５０３９２０）の分割
【原出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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