分子インプリントポリマーの調製
重合方法、好ましくはリビングラジカル重合方法が、テンプレート物質の存在下で実行され、分子インプリントポリマー（「ＭＩＰｓ」）を製造する。それは、生成物が非常に小さく（５００〜１０６ダルトン）、溶解可能である又はコロイド懸濁液を生成するように制御される。テンプレート物質は、固定されたテンプレートであり、再利用することができる。固定されたテンプレートは、アフィニティクロマトグラフィーによるＭＩＰ溶液／懸濁液の精製にも役立つ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、有機合成及び高分子化学の分野に関し、特に、テンプレート指示合成（template-directed synthesis）及びテンプレート重合による有機分子の調製のための方法論についての領域に関する。
【０００２】
（背景技術）
「テンプレート指示合成」という用語は、基質の化学的変性による、又は新規構造を生成するための型として働くテンプレートの存在下での２つまたはそれより多い分子のカップリングによる、新規物質の生成を含んでいる。このプロセスの最も知られた例は、遺伝子転写である。テンプレート指示合成の特別な例は、ポリマーレセプター（レプリカ）の生成が、他のポリマー又は小分子量の有機物質（テンプレート）の存在下で進行するテンプレート重合である。重合を開始する前、そして重合の間、モノマーは、テンプレートのサイズ、極性及び機能に従ってテンプレート分子の周辺に空間的に広がる（自己集合プロセス）。モノマーは重合して、直鎖状又は剛性のある三次元網目構造のいずれかになる。テンプレート重合の具体例は、テンプレートの存在下でのビニル又はアクリルモノマーの重合に基づく分子インプリンティングである（参考文献１，２参照）。従来のアプローチは、水性及び有機性の溶媒に不溶である、高度に架橋されたインプリントポリマー（imprinted polymers）の製造を含んでいる。それらの固有の不溶性が原因で、薬理学及び医療において分子インプリントポリマー（ＭＩＰｓ）を使用する可能性は、制限されている。
【０００３】
最近、溶解可能であるか、少なくともコロイド状で存在可能な比較的低分子量のインプリントポリマー調製のためのプロトコルを開発するために、いくつかの試みが実行された。この計画によって、ポリマーは、薬理学及び医療における生物学的活性分子（薬、エフェクター、モジュレーター、禁止剤）として、センサー又はアフィニティ分離において生体分子を置き換える「プラスチック抗体」として、並びに、酵素のような特性を有する触媒として用いることができる。
【０００４】
そのような１つの例では、ＭＩＰ分子は、生物学的レセプター、酵素、核酸、細胞、ウイルス、ミクロ微生物、組織サンプル又は薬の周辺でのアミノ酸とヌクレオチドとの重縮合によって合成された（米国特許第６８５２８１８号参照）。他の例では、種々の方法がＭＩＰｓオリゴマー及びポリマーの製造に用いられた（米国特許第６１２７１５４号参照）。従来技術の大部分の例では、溶解可能な又はコロイド状の粒子を溶液中で安定に供給するために、加水分解を必要とする高分子量架橋ポリマーの調製が説明されている。そのような１つの例（ＵＳ６１２７１５４参照）では、研究者は、照明によりカップリング可能な光活性パーフルオロフェニルアジド基を有する特別に設計された化合物を用いた。このケースでは、アフィニティリガンドは、溶解可能な粒子として合成することができた。これらのケースの全てにおいて、合成された化合物は、サイズ及び特性の制御が不十分な多数の留分を含んでいる。生物学的活性を有する分子を合成する他の方法が、ＷＯ９６／４０８２２号及び米国特許第５６３０９７８号に記載されており、そこでは、化学物質がテンプレートをインプリントしたポリマーの存在下で調製され、このインプリントポリマーは別のテンプレート、通常はヘパリンのような薬、の存在下で調製された。その結果得られたレプリカは、テンプレートに対してアフィニティを有さず、むしろオリジナルの薬の分子そのものの構造に似たリガンド分子である。
【０００５】
ナノ粒子を製造する方法の１つは、制御された縮合又は付加ラジカル「リビング」重合を利用するものである。イニファーター重合、ニトロキシド媒介ラジカル重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、及び可逆的付加開裂型連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合等のリビングフリーラジカル重合の技術は、比較的制御された低分子量のポリマーの合成のための新規ルートを開くものである（参考文献３〜９参照）。制御された／リビング重合の技術は、系中における成長種の濃度を効果的に低下させて停止反応の程度を最小化する、不活性種及び活性種の間の微妙なバランスに基づいている。リビング重合は、停止や連鎖移動などの副反応をなくすことができ、それによって明確に決められた分子量分布及び構造を有するポリマーを生成させることができる。同じ方法が共重合体の製造に適用でき、したがって適切な順序でモノマーを添加することによってフリーラジカル重合によりブロックコポリマーの製造が可能となる。リビング重合は、以前、バルクのグラフト化されたＭＩＰｓの製造に用いられた（参考文献１０，１１参照）。溶解可能なポリマーもリビング重合によって製造され、後にＭＩＰの製造に用いられた（参考文献１２参照）。最近、制御リビング重合は、ＭＩＰナノ粒子の調製に用いられた（参考文献１３）。
【０００６】
ＭＩＰの合成を複雑化させる要因の１つは、タンパク質や幾つかの毒素などの高価及び／又は入手困難なテンプレートを頻繁に使用する必要がある点であり、これらは重合後の回収が困難であって、また、得られるＭＩＰの量が限定的である。理想的には、これらの限界を克服するため、テンプレートは再利用可能とすべきである。これを達成する最適な方法は、固定された形態でテンプレートを用いることである。固定されたテンプレートは、以前に用いられた（ＵＳ７３９３９０９参照）。ここでは、テンプレートはシリカ表面上に固定され、ポリマーはその周辺にある細孔の中で生成された。シリカ担体の溶解及びテンプレートの除去により、種々のモルフォロジーのＭＩＰｓが得られた。ＵＳ７３９３９０９に開示された全ての実施例において、固定されたテンプレートを担持する表面は、溶解プロセス中に失われ、再利用することができない。他の例において、固定されたテンプレートが、インプリントされた表面の製造に用いられた（ＵＳ６１２７１５４；ＵＳ６４５８５９９；ＵＳ７２８８４１５）。潜在的には、これらの報告において開示されたテンプレートを担持している表面は再生することができ、かつ何回か用いることができる。これらの方法は、センサーまたはアレイの製造のために用いることができるが、ナノ粒子又は小さい溶解可能な分子の製造に適応させるのは困難である。
【０００７】
ＭＩＰｓに関連した更なる１つの大きな課題は、製造された結合部位の異質性であり、これが、一般に高水準での非特異的結合の原因となっている。この課題は、固定されたテンプレートを有するカラム上で別々に製造されたＭＩＰナノ粒子のアフィニティ分離により是正された（参考文献１３）。アフィニティ分離を可能とするため、ＭＩＰｓが、適切な形態、好ましくはナノ粒子の形態でなければならないことは、明らかである。
【０００８】
本発明は、２つの技術：（ｉ）インプリントナノ粒子を生成するための、固定されたテンプレートを担持している１つ又は複数の表面の存在下での制御重合（任意選択で制御ラジカル重合でもよい）の実行、及び（ｉｉ）選択及び精製用の固定されたテンプレートとのアフィニティ相互作用によりナノ粒子を保持すること、の組合せを提案することによって、高性能架橋ＭＩＰナノ粒子の開発に関するこれらの課題の全てに対処するものである。
【０００９】
背景における材料は、以下の参考文献で見つけることができる。
1.Wulff,G. Makromol.Chem.Macromol.Symp.,1993,70/71,285.
2.Vlatakis,G.;et al. Nature,1993,361,645.
3.Moad,G.;Rizzardo E.;Solomon,D.H. Macromolecules 1982,15,909;
4.Matyjaszewski,K.;Xia,J.Chem.Rev.2001,101,2921.
5.Kamigaito,M.;Ando,T.;Sawamoto,M.Chem.Rev.2001,101,3689.
6.Hawker,C.J.;Bosman,A.W.;Harth,E. Chem.Rev.2001,101,3661.
7.Fischer,H. Chem.Rev.2001,101,3581.
8.Otsu,T.;Matsumoto,A. Adv.Polym.Sci.1998,136,75-137.
9.Moad,G.;et al. Polym.Int.2000,49,993-1001.
10.Ruckert,B.;Hall,A.J.;Sellergren B.J. Mater.Sci.2002,12,2275.
11.Hattori,K.;et al. J.Membr.Sci.2004,233,169.
12.Li,Z.;Day,M.;Ding,J.F.;Faid,K. Macromolecules.2005,38,2620.
13.Guerreiro A.R.,Chianella I.,Piletska E.,Whitcombe M.J.,Piletsky S.A. (2009).Biosens.Bioelectron.,24,2740-2743.
14.Jagur-Grodzinski, J.Reactive & Functional Polymers.2001,1,1.
15.Shim,S.E.et al. Macromolecules.2003,36,7994-8000.
16.Yu,Q.;Zeng,F.;Zhu S. Macromolecules.2005,34,1612.
17.米国特許第7019072号-コーティング紙用ラテックスの製造方法、2006.
【００１０】
（引用した特許）
【表１】
【発明の概要】
【００１１】
（発明の開示）
本発明によれば、溶液の状態で又は分子インプリントポリマー（「ＭＩＰ」）粒子のコロイド懸濁液の状態で、ＭＩＰを調製する方法であって、（ａ）その表面が露出するように、その上にテンプレート材料を固定したキャリア物質を提供する工程と、（ｂ）前記表面に接するように重合性組成物を提供する工程と、（ｃ）前記表面に接する前記重合性組成物の制御重合を行い、溶液又はコロイド懸濁液を生成可能なＭＩＰ粒子が生成されたときに、前記重合を停止する工程と、（ｄ）前記表面から前記ＭＩＰ粒子を分離する工程とを有する方法が提供される。コロイド懸濁液は、安定であることが望ましく、１μｍ未満の微粒子からなることが望ましい。
【００１２】
本発明は、溶解可能な又はコロイド状の架橋ＭＩＰ粒子の製造のための、固定された（凸面の）テンプレートの存在下で行われる制御重合（任意選択で制御ラジカル重合でもよい）の適用を含むものである。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態によれば、以下の１つ又はそれより多い利点が提供される。
１．ＭＩＰナノ粒子は、自動的なプロトコルを用いて（機械により）提供することができる。
２．合成されたＭＩＰｓは、固体の表面に固着したままのテンプレートを含まない。
３．ＭＩＰ調製の間、どんな溶媒でも使用することができる。
４．ＭＩＰの合成、分離及び精製のプロセスは、非常に速い（数分から数時間である）。
５．テンプレートは無駄にならず、ＭＩＰの合成プロセスを数回繰り返すことができる（それにより高価なテンプレートのためのＭＩＰの調製コストが減少する）。
６．固定されたテンプレート上に残存する合成された粒子が、例えば、蛍光ラベル又は非接着性コーティング層を加えることによって更に官能化されるとき、別の工程を追加する可能性がある。
７．合成された粒子のサイズを制御する可能性がある。
８．合成されたナノ粒子を分割して、種々のアフィニティを有する留分を集める可能性がある。
【００１４】
ここに記載されている方法においては、ＭＩＰｓが、制御重合（任意選択で制御ラジカル重合でもよい）の技術を用い、固定されたテンプレートの存在下で製造される。制御重合によりナノ粒子を製造するのに有用な種々の技術は、技術に精通している専門家に知られている。重合反応は、合成された分子のサイズが比較的小さい段階で停止する。このような方法による生成物は、溶液中又は懸濁液中において、溶解状態又は安定なコロイド状態のいずれかで存在することができる。本発明に係るＭＩＰｓのコロイド懸濁液又は溶液は、水性液体でも有機液体のいずれでもよい。
【００１５】
合成された分子は、オリジナルテンプレートと相補的な構造を有しており、適度な高アフィニティでそれを結合する能力を有している。目的を明確にするために、本発明において、「高アフィニティ」及び「高性能」のＭＩＰｓは、典型的な対応するブランクポリマーのアフィニティの少なくとも３倍（好ましくは少なくとも５倍）を上回るアフィニティを有するポリマーと定義される。尚、「ブランク」ポリマーとは、テンプレートを存在させずにＭＩＰを製造するために使用された重合プロセスによる生成物である。これらの合成分子（ポリマー及びオリゴマー）は、所定のアフィニティ及び特異性（ランダムに合成されたポリマーに対する優れた活性）を有しており、特別に設計された個別の有機構造よりもずっと容易に調製することができる。本明細書において記載されているように、ＭＩＰｓを生成する重合プロセスは、不完全であって、結果として、高アフィニティ及び低アフィニティの両粒子が生成（例えばテンプレートが存在しない溶液中での生成）されることになるかもしれない。高アフィニティ粒子は、固定されたテンプレートを持つ表面に選択的に結合され（そして、その後に回収され）、それにより、低アフィニティ粒子から分離することができる。固定されたテンプレートを持つ表面は、ＭＩＰｓの生成に使用される表面と同じであるか、または、固定されたテンプレートを持つ別の表面（例えば、分離カラム内に収納されたもの）でありうる。ここで言う表面とは、アフィニティカラム、センサーデバイス、マイクロ流体装置、マイクロチップ、反応器、ビーズ、繊維、ウェル（wells）、マイクロプレート、膜、フィルタ、穴、ナノ構造、小胞（vesicles）、カプセルなどの表面でありえる。表面は、固体、半固体若しくは液体、又は流体（ミセル又は界面の場合）でありえる。任意選択で、粒子は追加の１つ又は複数のカラムを使用して更に選別して、潜在的に障害となる化合物に対してアフィニティを持たない粒子の副留分を選択することができる。「クラス選択的（class-selective）」バインダーを製造するために、１つ又はそれより多くのテンプレート類似体に対して追加的なアフィニティを有する粒子の副留分を選択することに、同様の手法を採用することができる。
【００１６】
本発明において説明されたように合成された分子（二量体、オリゴマー、ポリマー又はそれらの混合物）は、薬理学及び医療における薬として、分析化学（センサー、分析（assays））におけるレセプター特有のリガンドとして、生物工学、医薬及び食品産業における分離のため、そして合成触媒として、又は、分析、センサー及び他の用途（例えば粉せっけん）における酵素の代わりとして、使用することができる。薬の設計における従来の取り組みは、典型的には、多数の化学構造における構造と活性との関係についての面倒な研究に基づいていた。本発明は、より単純でより直接的な方法を説明する。その方法は、固定されたテンプレートの存在下で架橋ＭＩＰナノ粒子を生成して生物学的活性物質を設計するための制御重合（任意選択で制御ラジカル重合でもよい）であり、その生物学的活性物質は、大きな利点（従来の薬の設計及び発見の方法と比較した場合）を持っており、アフィニティ分離、センサー及び触媒のための有用なリガンドでもある。
【００１７】
本発明の重要な態様として、以下のものが挙げられる。
（１）生物学的レセプター、核酸、細胞、胞子、ウイルス、微生物、組織サンプル、炭水化物、オリゴ糖、多糖、ペプチド、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成タンパク質、グリコプロテイン、グルコサミノグリカン、ステロイド、免疫抑制薬、ホルモン、ヘパリン、抗生物質、ビタミン、病的若しくは病気の生物指標化合物、毒素、農薬、除草剤、爆発物、神経ガス、汚染物質、内分泌かく乱化学物質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、代謝産物、二次代謝産物、薬代謝産物、薬中間体又は薬でありえる、固定化されたテンプレートの存在下での制御重合（任意選択で制御ラジカル重合でもよい）による架橋ＭＩＰナノ粒子の合成。このリストは限定を意図するものではなく、テンプレートとして可能性のある代表例であり、その及ぶ範囲は当業者であれば理解できる。
（２）比較的小さいサイズの粒子を生成するための反応条件の最適化。
（３）ビニルモノマー、アリルモノマー、アセチレン、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、クロロアクリレート、イタコネート、トリフルオロメチルアクリレート、アミノ酸誘導体、ヌクレオシド、ヌクレオチド及び炭水化物を１つ又はそれより多くを含む機能性モノマーから、生物学的活性分子などを含む分子の合成。
（４）ＭＩＰの調製のために使用された固定されたテンプレートを持つ同一の表面上、又は固定されたテンプレート又はテンプレート類似体を同様に持つ別の表面上で生じるアフィニティ相互作用による、合成された高アフィニティ粒子の保持。
（５）合成された分子の特性又は機能を変えるために、固定されたテンプレートを有する表面上に保持されたインプリントポリマー粒子が、他のタイプの分子によって変性される逐次重合。
（６）薬理学及び医療における薬として、分析化学（センサー、分析）におけるレセプター特有のリガンドとして、生物工学、医薬及び食品産業における分離のため、そして触媒としての、合成された分子の応用。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】固定されたテンプレートで被覆された粒子が充填されたＨＰＬＣカラム中に注入されたブランク（対照）粒子のクロマトグラムを表す。
【図２】固定されたテンプレートで被覆された粒子が充填されたＨＰＬＣカラム中に注入されたＭＩＰ粒子のクロマトグラムを表す。
【図３】メラミンでインプリントされたＭＩＰナノ粒子のサイズ分布を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明にて説明されたように調製されたポリマーは、テンプレートのエフェクター（活性剤、禁止剤又は基質）に類似しており、テンプレートがそのような分子又は構造の生理的プロセス又は有効な類似プロセスに関与している場合には、生物学的活性を有することができる。この種のポリマーは、例えば、薬理学及び医療における薬として用いることができる。この手法による利点は数え切れないほど多く、例えば、ＭＩＰ合成のための固定されたテンプレートを再利用する可能性、低アフィニティ粒子及び未反応モノマーから高アフィニティを有するＭＩＰｓを分別する可能性、テンプレートから合成ＭＩＰｓの除去が容易なこと、固定されたテンプレートに付着したＭＩＰｓを後に機能化する可能性、製造方法を完全に又は部分的に自動化する可能性などが挙げられる。本発明の他の利点は、当業者にとって明らかである。
【００２０】
具体的には、１つの態様において、本発明は、固定されたテンプレートの存在下における、制御重合（任意選択で制御リビングラジカル重合（ＬＲＰ）でもよい）、リビングアニオン重合、リビングカチオン重合、及び制御重縮合による架橋ＭＩＰｓの合成に関する。テンプレートとしては、生物学的レセプター、核酸、細胞、胞子、ウイルス、微生物、組織サンプル、炭水化物、オリゴ糖、多糖、ペプチド、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成タンパク質、グリコプロテイン、グルコサミノグリカン、ステロイド、ホルモン、免疫抑制薬、ヘパリン、抗生物質、ビタミン、病的若しくは病態の生物指標化合物、毒素、農薬、除草剤、爆発物、神経ガス、汚染物質、内分泌かく乱化学物質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、代謝産物、二次代謝産物、薬代謝産物、薬中間体又は薬、あるいは当業者に知られている他のクラスのテンプレートが挙げられる。テンプレートは、ポリマー、多糖若しくはガラスの表面上に、例えばビーズ、導波路、ファイバー、薄膜又は毛細管の形態で、又は当業者に知られている目的とする用途に適した任意の他の表面上に固定することができる。
【００２１】
重合は、例えば加熱により、電流を流すことにより（電解重合）、レドックス触媒、過硫酸塩又は過酸化物の添加により、ガンマ線等の照射により、マイクロ波の照射により、又は好ましくはＵＶもしくは可視光の照射により開始することができ、通常、種の反応性に応じて、数分間又は数時間行われる。
【００２２】
制御重合の幾つかの異なる形態は、本発明に包含される。それらは、全て、連続重合層又は網目状ではなくむしろ溶解可能なナノ粒子が主に生成されるようなレベルで、付加又は縮合反応を制御する能力に基づいている。リビングラジカル重合の例において、開始剤分子は、熱的、化学的、又は光化学的刺激によって可逆的な変換を起こし、不活性種を、鎖成長種（chain propagators）として機能する活性なフリーラジカル又はイオンに、可逆的に変換する。このため、反応の平衡定数を適用する条件は、不活性種の生成を助け、不活性種と成長種間の高速変換を可能するものでなければならない。したがって、成長種の濃度は非常に低く、その滞留時間は非常に短くなり、それによって、成長中のポリマー鎖の成長を停止させる副反応が起きる可能性が低下する。リビング重合の幾つかの例としては、もちろん特に限定されないが、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、及び可逆的付加開裂型連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）が挙げられる。ＲＡＦＴ重合は、活性種と不活性種の間での変換が起こる可逆的な付加開裂型連鎖移動平衡に基づいている。開始工程で生成するラジカルは、連鎖移動剤として働くことが可能な分子と衝突しそこに可逆的な形態で付加するまで、モノマーの添加により成長する。一般的に、リビング重合プロセスでは、重合にリビング性を与えるために、任意選択で従来型の開始剤と組み合わせることもできるイニファーター（開始剤、移動剤、停止剤）を使用することができる。イニファーターは、ジチオカルバミル基を持つ光イニファーター、又は炭素−炭素若しくはアゾ基を持つ熱イニファーター（例えば参考文献１４参照）、又は当業者に知られている他の種類の化合物であることができる。好ましい種類のイニファーターは、異なるラジカルを生成するものであり、１つは反応性のある炭素ラジカルで、別の１つはより反応性の低いラジカル（例えばジチオカルバミルラジカル）である。炭素ラジカル（典型的にはベンジルラジカル）は、不飽和モノマーと反応して、重合を開始することができる。より反応性の低いラジカル（例えばジチオカルバミルラジカル）は、成長ポリマー鎖と再結合することで重合を停止させるが、停止した生成物は、継続した刺激、例えばＵＶ照射（例えば文献１５参照）の適用に応答して、更に新しい成長ラジカル及び停止剤に解離することができる。
【００２３】
本発明の範囲に包含される、種々のタイプのリビング重合（原子移動、アニオン、カチオンなど）用の開始剤として使用できる他の化合物としては、特に限定されないが、以下のものが挙げられる。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミンと錯形成したＣｕ（Ｉ）Ｂｒを含む２−ブロモプロピオニトリル、Ｃｕ（Ｉ）ＣＩ／ＰＭＤＥＴＡを含むポリスチレンブロモマクロ開始剤、ＣｕＣｌ／ビピリジンを含むエチル２−ブロモイソブチレート；１，４−ビス（２，６−ジイソプロピルフェニル）アセナファテンジイミンニッケル（ＩＩ）ジブロミド；テトラエチルチウラムジスルフィドと結合した２，２−ジメトキシ−２−フェニルエースフェノン；テトラフェニルビホスフィン、ジ−ターシャリィ−ブチルパーオキシド等の３級過酸化物；ＳｍＭｅ（Ｃ５Ｍｅ５）２（ＴＨＦ）；ＴｉＣｌ４が結合されたスチレン系エポキシド；メチルスチレン４量体ジナトリウム；ＭｏＯＣｌ４−ｎ−ＢｕＳｎ−ＥｔＯＨ；ＨＣｌ／ＺｎＣｌ２；メチルｐ−トルエンスルホネート；２，１０，１５，２０−テトラフェニルポルフィナトアルミニウムメチル；３−メチル−１，１−ジフェニルペンチルリチウム；ＴＨＦ中のブチルリチウム；モリブデンアルキリジン化合物；２官能性有機ランタノイド（ＩＩＩ）；Ｍｏ（ＣＨ−ｔ−Ｂｕ）（ＮＡｒ）（ＯＣＭｅ３）２及びＭｏ（ＣＨＣＰｈＭｅ２）（ＮＡｒ）（ＯＣＭｅ（ＣＦ３）２）２；ＨＩ／Ｉ２；メチルアルミノキサン又はフェニルボレートと結合したＺｒ、Ｔｉ及びＨｆ錯体；Ｐｄ、Ｎｉ、Ｆｅ又はＣｏのジイミド錯体；均一なＴａ、Ｔｉ、Ｍｏ、Ｗカルベン錯体；メタロセン型又は非メタロセン型錯体からなる希土類金属錯体；カチオン性モノシクロペンタジエニルジルコニウムアセトアミジナート錯体；銅媒介リビング重合用の開始剤として１又は２の水酸基を有するエステル型フッ化テロマ；Ｙｂ［Ｃ（ＳｉＭｅ３）３］２。
【００２４】
従来のラジカル重合と比べてリビング重合の１つの利点は、従来のラジカル重合がしばしば強い自己加速を起こしながら進行するのに対し、リビング重合は低速度で目立った自己加速なしに進行するという点である（参考文献１６参照）。本発明では、比較的低分子量のポリマーを生成する条件でリビング重合を行うことによって、これを生かしている。典型的には、その反応は、５００〜１，０００，０００Ｄａの間の分子量を有するポリマーを生成するために、初期の段階で停止される。
【００２５】
比較的小さいサイズの粒子を生成するために、反応条件を最適化することができる。そのプロセスの重要な部分は、適切なリビング開始剤の選択及び重合反応条件の最適化である。あるいは、ラジカルの生成及び成長の速度は、反応禁止剤の添加又はメルカプト誘導体等の連鎖移動剤を加えることで制御することができる（参考文献１７）。
【００２６】
リビングラジカル重合開始剤は、別々の有機分子から、又は高分子から調製することができる。ヒドロキシル基、カルボキシル基又はアミノ基を含む大部分の化合物は、開始剤に変換することができ、したがって容易にポリマーに組み込むことができる。これは、単官能開始剤の場合にはポリマーの末端に、又、多官能開始剤の場合にはポリマーの中間に存在させることもできる。
【００２７】
比較的低分子量のポリマーを生成するための反応条件は、特に限定されないが、以下が挙げられる：（ｉ）開始剤とモノマーとの間において化学量論比を利用すること；（ｉｉ）反応系を冷やすか又はＵＶもしくは他の照射源を除去することで、反応の初期段階において新しい成長種の生成を停止させること；（ｉｉｉ）例えば濾過又はクロマトグラフィーにより、成長しているポリマー鎖と接触するモノマーの除去；（ｉｖ）禁止剤を反応に加えること；（ｖ）かなり希釈した溶液中で重合を行うこと；（ｖｉ）連鎖移動剤を加えること。好ましい選択は、照射源の除去又はその遮断である。あるいは、モノマー及び他の反応剤は、固定されたテンプレートに付着した成長中のＭＩＰから、溶出によって除去することができる。制御リビング重合の結果、ＭＩＰ粒子を５００〜１，０００，０００Ｄａのサイズ範囲で生成することができ、そのＭＩＰ粒子は、溶解可能な状態で、又は溶液において安定でかつアフィニティクロマトグラフィーの条件に適合する微細なコロイドの状態で存在しうる大きめの粒子（ただし１マイクロメートル未満）で存在することができる。
【００２８】
ＭＩＰの調製に用いることができるモノマーとしては、以下のものが挙げられる：ビニルモノマー、アリルモノマー、アセチレン、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、クロロアクリレート、イタコネート、トリフルオロメチルアクリレート、アミノ酸誘導体（例えばエステル又はアミド）、ヌクレオシド、ヌクレオチド及び炭水化物。提案された本発明の他の態様において、重合は、二重結合を有する粒子の存在下、又はその表面上で行われる。架橋モノマーは、結果として生じるレプリカ分子の構造を、テンプレートの構造と相補的なままで維持できるように固定又は安定させるために用いられる。ＭＩＰｓに好適な架橋剤の典型例としては、特に限定されないが、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ジビニルベンゼン、メチレンビスアクリルアミド、エチレンビスアクリルアミド及びＮ，Ｎ’−ビスアクリロイルピペラジンが挙げられる。架橋剤の機能は、二重結合を有する粒子若しくは前駆体ポリマー、又は、官能性モノマーと結合することができる複数の機能が付与された粒子又はポリマー、により発現することができる。当業者であれば、特定のシステムに好適なモノマー及び架橋剤を選択することができる。あるいは、種々の組合せと計算による方法を、この選択を補助するために用いることができる。
【００２９】
合成されたナノ粒子は、固定されたテンプレートに対して、モノマー、非特異性のオリゴマー及び低アフィニティポリマー（例えば、テンプレート非存在下でバルク状に生成されたもの）よりも、高いアフィニティを有する。したがって、提案された発明の１つの態様において、弱く結合した材料は、洗浄により、固定されたテンプレートに付着したナノ粒子から除去される。固定されたテンプレートからの高アフィニティナノ粒子の分離は、加熱により錯体の形成を阻害することで、溶液ｐＨの変更によりイオン強度を変えることで、又は、尿素、グアニジン、若しくはＭＩＰより強くテンプレートと相互作用する物質を追加することで、達成される。
【００３０】
合成されたアフィニティＭＩＰナノ粒子は、更に、クロマトグラフィー、濾過及び／又は電気泳動により精製することができる。合成されたポリマーの分離は、テンプレートに対して最も高いアフィニティを有するポリマー留分の精製のために同一若しくは類似の固定化されたテンプレートが用いられる場合はアフィニティクロマトグラフィー又は選択的溶出により、又は／及び、異なるサイズのポリマー留分を分離するゲル浸透クロマトグラフィーにより、達成できる。分別、分離及び精製は、異なるｐＨ、すなわちイオン強度を有する緩衝液を用いて、又は、尿素、グアニジン、若しくはポリマーよりも強くテンプレートと相互作用する物質の追加により、達成できる。あるいは、高アフィニティを有する粒子の分別は、濾過、電気泳動、クロマトグラフィー分離、洗浄、遠心分離又は透析により達成できる。テンプレートに対するアフィニティの分布が狭いＭＩＰｓの調製が可能であることから、アフィニティクロマトグラフィーは特に強力なツールであり、特に好ましい。
【００３１】
成長中のポリマー鎖は、ＭＩＰｓにその抽出又は他の態様の分離を促進するような特定の特性を与える目的で、他のポリマー又は官能基により変性することができる。これの例は、やはり、例えば有機溶剤により水溶液からポリマーの抽出を可能にする疎水性末端を有するポリマーでありえる。アフィニティ吸着剤によりポリマーの選択的除去を可能とする特定の結合基（例えば、ビオチン）を導入することが可能である。当業者は、この変性及びそれにより実行される分離を可能とする多様な実験手順を知っている。その変性は、固定されたテンプレートにポリマーが結合した状態の表面上において直接達成でき、又は別個に達成できる。
【００３２】
したがって、本発明では、インプリントポリマーが合成された分子の特性又は機能を変えるために他のタイプの分子で変性される場合、逐次重合を採用することができる。成長中のポリマー鎖がその分離を促進するために他のポリマー又は官能基によって変性できることは、既に述べた。リビング重合の１つの重要な特性は、単に、例えば反応混合物へのＵＶ照射を止めることで反応を停止させ、後にそれを継続できる点にある。成長中のポリマー鎖の末端は、再度活性化されて新たな重合段階を開始できる開始剤を含んでいる。したがって、成長中のポリマー鎖は、他のモノマーにさらされることで、重合を継続することができ、結果としてブロックコポリマーが生成される。新しいモノマーは、新しい機能をポリマーに導入することができる。すなわち、第１のＭＩＰによってもたらされる第１のテンプレートに対するアフィニティに加えて、延長されたポリマーは、系に導入された第２のテンプレートに対するアフィニティを有するものとして生成できる。延長されたブロックポリマーは、診断において有用な、末端基に取り付けられた蛍光タグを有することができる。殺菌性を有する活性種、触媒基、同位体ラベル、固定化、検出及び造影に有用な基（例えば造影剤）などをもたらす能力等の他の機能を導入するために、他の形態の変性をすることも可能である。これらの機能は、対応する機能化された開始剤を用いることで、ポリマーに導入することもできる。その変性は、固定されたテンプレートに粒子が結合した状態の表面上において直接達成でき、又は別個に達成できる。
【００３３】
１つの態様では、本発明は、薬理学及び医療における薬としての、分析化学（センサー、分析）におけるレセプター特有のリガンドとしての、生物工学、薬理学及び食品産業における分離のための、そして触媒としての、合成された分子の応用に関する。合成されたポリマーは、その溶解可能な性質によって、薬としての使用に理想的な候補となる。酵素、レセプター又は他の生体分子への選択的な結合は、これらの分子の生物学的機能に影響を与えるために用いることができる。したがって、リビング重合によって合成されたＭＩＰｓは、生物学的プロセスの変調のためにインビボで使うことができる。同位体又は蛍光タグに結合する場合、ＭＩＰｓは、選択的な造影剤として、又は他の形態の診断法で用いることができる。ある条件で、例えば１重項分子酸素を製造可能なリガンドと結合したＭＩＰｓは、選択的な殺菌剤として用いることができる。様々な他の変性が当業者によって提案されており、リビング重合によって調製されたＭＩＰｓ中に抗生特性（antibiotic properties）を導入することができる。
【００３４】
合成されたＭＩＰｓは、天然抗体又は種々の形態の分析及びセンサーにおけるレセプターのため代替品として用いることができる。幾つかの特徴により、リビング重合により調製されたＭＩＰｓは、特にセンサー用途として魅力的な対象となる。このようにして合成されたＭＩＰ分子は、ポリマーを固体の表面に共有結合的に結合させるために用いることができる開始剤を依然として含んでいる。したがって、二重結合で被われた表面にＭＩＰｓを結合させるためには、単純なＵＶ照射で十分であろう。
【００３５】
ＭＩＰリガンドを種々のアフィニティを有する幾つか留分に分割するためにアフィニティクロマトグラフィーを用いることができることは、検出範囲を変化させることによるセンサー／分析の製造のために有利である。幾つかの応用として、テンプレート非存在下でのリビング重合で調製したブランクポリマーを用いることもできる。しかしながら、あるアフィニティ又はこの特別な用途のために必要な他の特性を有するモノマーを用いて、そのようなポリマーを調製することが必要となるであろう。当業者は、例えば計算的な又は組合せ的な手法を用いて、この種のモノマーを選択する方法を知っている。ＭＩＰｓ及び対応する実施形態おいて説明した態様で調製されたブランクポリマーを用いることが本発明の範囲に包含されることを明らかにしなければならない。
【００３６】
以下の非限定的な実施例を参照しつつ、本発明を更に説明する。
【実施例】
【００３７】
〔実施例１〕：メラミンとアフィニティを有するＭＩＰ粒子の合成
１．１７ｇのアセトニトリル、０．３２ｇのメタクリル酸、０．３６ｇのトリメチロールプロパントリメタクリレート（ＴＲＩＭ）、０．３６ｇのエチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）、０．０８７ｇのジエチルジチオカルバミン酸ベンジルエステル（リビング開始剤）及び０．０２ｇのペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）（連鎖移動剤）の混合物に窒素パージし、メラミンで誘導体化されたガラスビーズ（直径９〜１３μｍ）が充填されたガラスカラム（７０×４ｍｍ）内で、ＵＶ照射（強度０．１６３Ｗ／ｃｍ２のＵＶＡＰＲＩＮＴ １００ ＣＶＩ ＵＶ源、Ｄｒ．Ｈｏｎｌｅ）により３分間重合した。同じサイズの非誘導体化ガラスビーズでカラムが充填されていること以外は同様にして、ブランク（対照）粒子を合成した。重合後、カラムを１ｍｌのアセトニトリルによって洗浄し、ナノ粒子及び未反応モノマーを溶出した。
得られた溶解可能なインプリントナノ粒子の平均径は６０ｎｍであった。平均径はＮａｎｏｓｉｚｅｒ（マルバーンインスツルメント）の動的光散乱により算出した。３つの異なる実験における粒度分布を図３に示す。
【００３８】
〔実施例２〕合成ポリマーのアフィニティ分離
ａ）アフィニティ吸着体の調製−テンプレートの固定
ガラスビーズを４Ｍ−ＮａＯＨ中で１０分間煮沸させることで活性化し、脱イオン水及びアセトンで洗浄し、その後８０℃で２時間乾燥した。そのビーズを、（３−アミノプロピル）トリメトキシシランが２％ｖ／ｖのトルエン中に３時間放置し、アセトンで洗浄し、グルタルアルデヒドが７％ｖ／ｖのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に３０分間置き、その後水で洗浄した。テンプレート（メラミン）を、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（１０％ｖ／ｖ）及びメラミンが０．１ｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）中に４時間放置することによって、ビーズの表面上に固定した。
メラミンで被覆された粒子は、インプリントナノ粒子の合成のため、及びアフィニティクロマトグラフィーのために用いた。
【００３９】
ｂ）アフィニティクロマトグラフィー
実施例１のガラスカラムから溶出されたサンプルを、０．２２μｍの細孔サイズを有するＰＴＦＥシリンジフィルタで濾過することによって、大きなポリマー集合体を取り除いた。その後、未反応モノマーを除去するために、濾液を１００００Ｄａカットオフの遠心分離機フィルタカートリッジに配置し、３０００ｇで４時間遠心分離した。その後、粒子をアセトニトリル中に再懸濁し、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００シリーズＨＰＬＣを用いて、上記（実施例２ａ）で調製したアフィニティ吸着剤を充填したカラム（１００×４．６ｍｍ）を有するＨＰＬＣでテストした。注入容量は４０μｌであり、使用した移動相は１ｍｌ／ｍｉｎのアセトニトリルであり、検出は２１０ｎｍで行った。溶出を補助するための酸の使用を回避するために、分析は８０℃で行った。ＭＩＰと対照ポリマーの両方を、同じようにして調製した。アフィニティ相上のブランク及びインプリント粒子の両方のクロマトグラムを、以下の図１及び図２に示す。
【００４０】
〔実施例３〕メラミン用ナノ粒子の調製
ガラスビーズ（直径７５μｍ）を４Ｍ−ＮａＯＨ中で１０分間煮沸させることで活性化し、再蒸留水及びアセトンで徹底的に洗浄し、８０℃で２時間乾燥した。その後、ビーズを、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）が２％ｖ／ｖのトルエン溶液中に夜通し放置し、アセトンで洗浄し、グルタルアルデヒド（ＧＡ）が５％ｖ／ｖのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）２５ｍｌ中に１時間放置し、再蒸留水で洗浄した。Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）が１０％ｖ／ｖで、メラミンが０．０１ｇ／ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液中に、このビーズを４時間置くことにより、テンプレートを固定した。物理的に吸着された過剰なメラミンを、再蒸留水及びメタノールで洗浄することで除去した。誘導体化されたガラスビーズを、真空下で乾燥し、石英カラム（１．５ｍｍの壁を含む外径６．４ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）に充填した。０．３２ｇのメタクリル酸（ＭＡＡ）、０．３６ｇのトリメチロールプロパントリメタクリレート（ＴＲＩＭ）、０．３６ｇのエチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）、０．０８７ｇのＮ、Ｎ’−ジエチルジチオカルバミン酸ベンジルエステル及び０．０２ｇのペンタエリトリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）（ＣＴＡ）を、１．１７ｇのアセトニトリル（ＡＣＮ）中で混合し、２分間窒素パージした。その後、５００μｌを、アフィニティ媒体を充填したカラムに注入し、３６６ｎｍの紫外線（ＨＢ １７１／Ａ ｌａｍｐ、強度４×１５Ｗ、フィリップス）下で２分間重合した。重合後、カラムを、ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ１ １００シリーズＨＰＬＣ）に接続した。２２０ｎｍでＵＶ検出しながら、１ｍｌ／ｍｉｎの流量で溶出した。最初の９０分間は、カラムを氷浴中で０℃に保ちつつ、ＡＣＮを移動相として使用した。その後の４５分間は、移動相をギ酸（１０ｍＭ）を含むＡＣＮに切り替え、温度を２５℃に上げた。最後の３５分間は、ナノ粒子の高アフィニティ留分の溶出を６０℃で行った。非誘導体化ガラスビーズを使用したこと以外は、上記の通りにして、ブランクのナノ粒子を調製した。様々な留分中の合成ナノ粒子のサイズは、Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ（マルバーンインスツルメント）の動的光散乱により算出したが、１２０〜４６０ｎｍの間を変動した。
【００４１】
〔実施例４〕ペプチド用ナノ粒子の調製
ガラスビーズ（直径７５μｍ）を、４Ｍ−ＮａＯＨ中で１０分間煮沸させることで活性化し、再蒸留水及びアセトンで洗浄し、８０℃で２時間乾燥した。その後、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）が２％ｖ／ｖのトルエン溶液中に、そのビーズを夜通し放置し、その後アセトンで洗浄し、グルタルアルデヒド（ＧＡ）が７％ｖ／ｖのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）２５ｍｌ中に１時間放置し、再蒸留水でリンスし、ペプチド（ＴＡＴＴＳＶＬＧ−ＮＨ２）が０．０５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液中に４時間放置した。その誘導体化されたビーズを再蒸留水で洗浄し、ＭＩＰナノ粒子の調製に利用した。１９．５ｍｇのＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡｍ）、１ｍｇのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）、１６．５ｍｇのＮ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＴＢＡｍ）及び１．１１μｌのアクリル酸（ＡＡｃ）を、１０ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む５０ｍｌの水に溶かした。この溶液を１０分間超音波処理し、３０分間窒素パージした。この溶液の１０ｍｌを、４ｇの誘導体化されたビーズを含む２０ｍｌのねじ口瓶に入れた。６０ｍｇ／ｍｌの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）１００μｌとＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）３μｌを加えることによって重合を開始し、室温で２２時間行った。ＭＩＰ生成物及びアフィニティ媒体を含む瓶を氷中で１０分間０℃に保ち、その後ＳＰＥカートリッジ中に投入して、ナノ粒子が付着したビーズを他の成分から分離した。毎回１０ｍｌの冷たい再蒸留水を用いて洗浄工程を５回行うことによって、低いアフィニティ又は全くアフィニティのない材料を除去した。ナノ粒子の高アフィニティ留分の溶出を、６０℃でＰＢＳ（ｐＨ７．２）により行った。非誘導体化ガラスビーズを使用したこと以外は、上記の通りにして、ブランクのナノ粒子を調製した。様々な留分中の合成ナノ粒子のサイズは、Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ（マルバーンインスツルメント）の動的光散乱により算出したが、３０〜１３０ｎｍの間を変動した。
【００４２】
（合成ナノ粒子のアフィニティの分析）
金被覆チップ（ＳＩＡ Ｋｉｔ Ａｕ）を、ピラニア溶液（Ｈ２ＳＯ４／Ｈ２Ｏ２、３：１ ｖ／ｖ）に５分間浸漬することで洗浄した。その後、それらを再蒸留水及びエタノールで徹底的にリンスした。グリシンスペーサ（ＣＧＧＧＧＴＡＴＴＳＶＬＧ−ＮＨ２）を有するペプチドテンプレートのチオレート化された誘導体、及びチオレート化された参照ペプチド（ＣＱＬＰＥＬＫＱＫＳＳ−ＮＨ２）の固定化を、清浄された金チップ上に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中０．１ｍｇ／ｍｌのペプチド溶液１００μｌを、２５℃で１５μｌ／ｍｉｎ分の流量で注入することによって実行し、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００ ＳＰＲを用いてオンラインで記録した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１：１０、１：２０、１：４０、１：６０、１：８０及び１：１００に希釈されたナノ粒子１００μｌを注入し（流量：１５μｌ／ｍｉｎ）、センサー応答を、Ｂｉａｃｏｒｅソフトウェアを用いて２分間分析した。見かけの解離定数ＫＤ＝２．５ｐＭが、ＭＩＰナノ粒子とテンプレートペプチド（ＣＧＧＧＧＴＡＴＴＳＶＬＧ−ＮＨ２）の間の相互作用について得られた。参照ペプチド（ＣＱＬＰＥＬＫＱＫＳＳ−ＮＨ２）について記録された見かけの解離定数はＫＤ＝３．３ｎＭであり、これは、ＭＩＰナノ粒子がテンプレートペプチドに対して約１０００倍特異的であることを示している。
【００４３】
〔実施例５〕バンコマイシン用ナノ粒子の調製
ガラスビーズ（直径７５μｍ）を４Ｍ−ＮａＯＨ中で１０分間煮沸させ、再蒸留水及びアセトンで洗浄し、８０℃で２時間乾燥した。その後、ビーズを、（３−アミノプロピル）トリメトキシシランが２％ｖ／ｖの溶液中に夜通し放置し、アセトンで洗浄し、グルタルアルデヒド（ＧＡ）が７％ｖ／ｖのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中に１時間放置し、再蒸留水でリンスし、バンコマイシンＨＣｌが０．５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に４時間放置した。誘導体化されたビーズを再蒸留水で洗浄し、ＭＩＰナノ粒子の調製に利用した。１９．５ｍｇのＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡｍ）、１ｍｇのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）、１６．５ｍｇのＮ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＴＢＡｍ）及び１．１１μｌのアクリル酸（ＡＡｃ）を、１０ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む５０ｍｌの水に溶かした。溶液を１０分間超音波処理し、３０分間窒素パージした。この溶液の５０ｍｌを、２０ｇの誘導体化されたビーズを含む１００ｍｌのねじ口瓶に入れた。６０ｍｇ／ｍｌの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）５００μｌとＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）３μｌを加えることによって重合を開始し、室温で２２時間行った。ＭＩＰ生成物及びアフィニティ媒体を含む瓶を氷中で１０分間０℃に保ち、その後ＳＰＥカートリッジ中に投入して、ナノ粒子が付着したビーズを他の成分から分離した。毎回２０ｍｌの冷たい再蒸留水を用いて洗浄工程を５回行い、低いアフィニティ又は全くアフィニティのない材料を除去した。その後、高アフィニティのナノ粒子を、６０℃で２０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）の５つの留分を通過させことによって、アフィニティ媒体から分離した。クロロトリメチルシランによって誘導体化されたガラスビーズを使用したこと以外は同様にして、非インプリントナノ粒子を調製した。その結果得られた溶解可能なインプリントナノ粒子は、２２８ｎｍの平均径を有していた。平均径は、マルバーンインスツルメント社（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）製のＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｎａｎｏ−Ｓ）を用いて、動的光散乱（ＤＬＳ）により算出した。
【００４４】
（合成ナノ粒子のアフィニティの分析）
Ｂｉａｃｏｒｅから購入した金被覆チップ（ＳＩＡ Ｋｉｔ Ａｕ）を、ピラニア溶液（Ｈ２ＳＯ４／Ｈ２Ｏ２、３：１ ｖ／ｖ）に５分間浸漬することで洗浄した。その後、それらを再蒸留水及びエタノールで徹底的にリンスし、４−アミノチオフェノールが０．２ｍｇ／ｍｌのエタノール溶液中に４℃で２４時間放置した。この後、チップを再蒸留水でリンスし、ＧＡが７％ｖ／ｖのＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液中に室温で１時間放置した。チップを更に再蒸留水でリンスし、バンコマイシンが１．２ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液中に室温で２４時間放置し、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００に結合した。ナノ粒子、及びＰＢＳ（ｐＨ７．４）中において１：１０、１：１００、１：１０００、１：１００００に希釈されたナノ粒子１００μｌを３０℃で注入した（流量：１５μｌ／ｍｉｎ）。センサー応答を、Ｂｉａｃｏｒｅソフトウェアを用いて分析した。ＭＩＰナノ粒子についてのバンコマイシンの見かけの解離定数ＫＤは、０．９ｎＭであった。
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、有機合成及び高分子化学の分野に関し、特に、テンプレート指示合成（template-directed synthesis）及びテンプレート重合による有機分子の調製のための方法論についての領域に関する。
【０００２】
（背景技術）
「テンプレート指示合成」という用語は、基質の化学的変性による、又は新規構造を生成するための型として働くテンプレートの存在下での２つまたはそれより多い分子のカップリングによる、新規物質の生成を含んでいる。このプロセスの最も知られた例は、遺伝子転写である。テンプレート指示合成の特別な例は、ポリマーレセプター（レプリカ）の生成が、他のポリマー又は小分子量の有機物質（テンプレート）の存在下で進行するテンプレート重合である。重合を開始する前、そして重合の間、モノマーは、テンプレートのサイズ、極性及び機能に従ってテンプレート分子の周辺に空間的に広がる（自己集合プロセス）。モノマーは重合して、直鎖状又は剛性のある三次元網目構造のいずれかになる。テンプレート重合の具体例は、テンプレートの存在下でのビニル又はアクリルモノマーの重合に基づく分子インプリンティングである（参考文献１，２参照）。従来のアプローチは、水性及び有機性の溶媒に不溶である、高度に架橋されたインプリントポリマー（imprinted polymers）の製造を含んでいる。それらの固有の不溶性が原因で、薬理学及び医療において分子インプリントポリマー（ＭＩＰｓ）を使用する可能性は、制限されている。
【０００３】
最近、溶解可能であるか、少なくともコロイド状で存在可能な比較的低分子量のインプリントポリマー調製のためのプロトコルを開発するために、いくつかの試みが実行された。この計画によって、ポリマーは、薬理学及び医療における生物学的活性分子（薬、エフェクター、モジュレーター、禁止剤）として、センサー又はアフィニティ分離において生体分子を置き換える「プラスチック抗体」として、並びに、酵素のような特性を有する触媒として用いることができる。
【０００４】
そのような１つの例では、ＭＩＰ分子は、生物学的レセプター、酵素、核酸、細胞、ウイルス、ミクロ微生物、組織サンプル又は薬の周辺でのアミノ酸とヌクレオチドとの重縮合によって合成された（米国特許第６８５２８１８号参照）。他の例では、種々の方法がＭＩＰｓオリゴマー及びポリマーの製造に用いられた（米国特許第６１２７１５４号参照）。従来技術の大部分の例では、溶解可能な又はコロイド状の粒子を溶液中で安定に供給するために、加水分解を必要とする高分子量架橋ポリマーの調製が説明されている。そのような１つの例（ＵＳ６１２７１５４参照）では、研究者は、照明によりカップリング可能な光活性パーフルオロフェニルアジド基を有する特別に設計された化合物を用いた。このケースでは、アフィニティリガンドは、溶解可能な粒子として合成することができた。これらのケースの全てにおいて、合成された化合物は、サイズ及び特性の制御が不十分な多数の留分を含んでいる。生物学的活性を有する分子を合成する他の方法が、ＷＯ９６／４０８２２号及び米国特許第５６３０９７８号に記載されており、そこでは、化学物質がテンプレートをインプリントしたポリマーの存在下で調製され、このインプリントポリマーは別のテンプレート、通常はヘパリンのような薬、の存在下で調製された。その結果得られたレプリカは、テンプレートに対してアフィニティを有さず、むしろオリジナルの薬の分子そのものの構造に似たリガンド分子である。
【０００５】
ナノ粒子を製造する方法の１つは、制御された縮合又は付加ラジカル「リビング」重合を利用するものである。イニファーター重合、ニトロキシド媒介ラジカル重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、及び可逆的付加開裂型連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合等のリビングフリーラジカル重合の技術は、比較的制御された低分子量のポリマーの合成のための新規ルートを開くものである（参考文献３〜９参照）。制御された／リビング重合の技術は、系中における成長種の濃度を効果的に低下させて停止反応の程度を最小化する、不活性種及び活性種の間の微妙なバランスに基づいている。リビング重合は、停止や連鎖移動などの副反応をなくすことができ、それによって明確に決められた分子量分布及び構造を有するポリマーを生成させることができる。同じ方法が共重合体の製造に適用でき、したがって適切な順序でモノマーを添加することによってフリーラジカル重合によりブロックコポリマーの製造が可能となる。リビング重合は、以前、バルクのグラフト化されたＭＩＰｓの製造に用いられた（参考文献１０，１１参照）。溶解可能なポリマーもリビング重合によって製造され、後にＭＩＰの製造に用いられた（参考文献１２参照）。最近、制御リビング重合は、ＭＩＰナノ粒子の調製に用いられた（参考文献１３）。
【０００６】
ＭＩＰの合成を複雑化させる要因の１つは、タンパク質や幾つかの毒素などの高価及び／又は入手困難なテンプレートを頻繁に使用する必要がある点であり、これらは重合後の回収が困難であって、また、得られるＭＩＰの量が限定的である。理想的には、これらの限界を克服するため、テンプレートは再利用可能とすべきである。これを達成する最適な方法は、固定された形態でテンプレートを用いることである。固定されたテンプレートは、以前に用いられた（ＵＳ７３９３９０９参照）。ここでは、テンプレートはシリカ表面上に固定され、ポリマーはその周辺にある細孔の中で生成された。シリカ担体の溶解及びテンプレートの除去により、種々のモルフォロジーのＭＩＰｓが得られた。ＵＳ７３９３９０９に開示された全ての実施例において、固定されたテンプレートを担持する表面は、溶解プロセス中に失われ、再利用することができない。他の例において、固定されたテンプレートが、インプリントされた表面の製造に用いられた（ＵＳ６１２７１５４；ＵＳ６４５８５９９；ＵＳ７２８８４１５）。潜在的には、これらの報告において開示されたテンプレートを担持している表面は再生することができ、かつ何回か用いることができる。これらの方法は、センサーまたはアレイの製造のために用いることができるが、ナノ粒子又は小さい溶解可能な分子の製造に適応させるのは困難である。
【０００７】
ＭＩＰｓに関連した更なる１つの大きな課題は、製造された結合部位の異質性であり、これが、一般に高水準での非特異的結合の原因となっている。この課題は、固定されたテンプレートを有するカラム上で別々に製造されたＭＩＰナノ粒子のアフィニティ分離により是正された（参考文献１３）。アフィニティ分離を可能とするため、ＭＩＰｓが、適切な形態、好ましくはナノ粒子の形態でなければならないことは、明らかである。
【０００８】
本発明は、２つの技術：（ｉ）インプリントナノ粒子を生成するための、固定されたテンプレートを担持している１つ又は複数の表面の存在下での制御重合（任意選択で制御ラジカル重合でもよい）の実行、及び（ｉｉ）選択及び精製用の固定されたテンプレートとのアフィニティ相互作用によりナノ粒子を保持すること、の組合せを提案することによって、高性能架橋ＭＩＰナノ粒子の開発に関するこれらの課題の全てに対処するものである。
【０００９】
背景における材料は、以下の参考文献で見つけることができる。
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17.米国特許第7019072号-コーティング紙用ラテックスの製造方法、2006.
【００１０】
（引用した特許）
【表１】
【発明の概要】
【００１１】
（発明の開示）
本発明によれば、溶液の状態で又は分子インプリントポリマー（「ＭＩＰ」）粒子のコロイド懸濁液の状態で、ＭＩＰを調製する方法であって、（ａ）その表面が露出するように、その上にテンプレート材料を固定したキャリア物質を提供する工程と、（ｂ）前記表面に接するように重合性組成物を提供する工程と、（ｃ）前記表面に接する前記重合性組成物の制御重合を行い、溶液又はコロイド懸濁液を生成可能なＭＩＰ粒子が生成されたときに、前記重合を停止する工程と、（ｄ）前記表面から前記ＭＩＰ粒子を分離する工程とを有する方法が提供される。コロイド懸濁液は、安定であることが望ましく、１μｍ未満の微粒子からなることが望ましい。
【００１２】
本発明は、溶解可能な又はコロイド状の架橋ＭＩＰ粒子の製造のための、固定された（凸面の）テンプレートの存在下で行われる制御重合（任意選択で制御ラジカル重合でもよい）の適用を含むものである。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態によれば、以下の１つ又はそれより多い利点が提供される。
１．ＭＩＰナノ粒子は、自動的なプロトコルを用いて（機械により）提供することができる。
２．合成されたＭＩＰｓは、固体の表面に固着したままのテンプレートを含まない。
３．ＭＩＰ調製の間、どんな溶媒でも使用することができる。
４．ＭＩＰの合成、分離及び精製のプロセスは、非常に速い（数分から数時間である）。
５．テンプレートは無駄にならず、ＭＩＰの合成プロセスを数回繰り返すことができる（それにより高価なテンプレートのためのＭＩＰの調製コストが減少する）。
６．固定されたテンプレート上に残存する合成された粒子が、例えば、蛍光ラベル又は非接着性コーティング層を加えることによって更に官能化されるとき、別の工程を追加する可能性がある。
７．合成された粒子のサイズを制御する可能性がある。
８．合成されたナノ粒子を分割して、種々のアフィニティを有する留分を集める可能性がある。
【００１４】
ここに記載されている方法においては、ＭＩＰｓが、制御重合（任意選択で制御ラジカル重合でもよい）の技術を用い、固定されたテンプレートの存在下で製造される。制御重合によりナノ粒子を製造するのに有用な種々の技術は、技術に精通している専門家に知られている。重合反応は、合成された分子のサイズが比較的小さい段階で停止する。このような方法による生成物は、溶液中又は懸濁液中において、溶解状態又は安定なコロイド状態のいずれかで存在することができる。本発明に係るＭＩＰｓのコロイド懸濁液又は溶液は、水性液体でも有機液体のいずれでもよい。
【００１５】
合成された分子は、オリジナルテンプレートと相補的な構造を有しており、適度な高アフィニティでそれを結合する能力を有している。目的を明確にするために、本発明において、「高アフィニティ」及び「高性能」のＭＩＰｓは、典型的な対応するブランクポリマーのアフィニティの少なくとも３倍（好ましくは少なくとも５倍）を上回るアフィニティを有するポリマーと定義される。尚、「ブランク」ポリマーとは、テンプレートを存在させずにＭＩＰを製造するために使用された重合プロセスによる生成物である。これらの合成分子（ポリマー及びオリゴマー）は、所定のアフィニティ及び特異性（ランダムに合成されたポリマーに対する優れた活性）を有しており、特別に設計された個別の有機構造よりもずっと容易に調製することができる。本明細書において記載されているように、ＭＩＰｓを生成する重合プロセスは、不完全であって、結果として、高アフィニティ及び低アフィニティの両粒子が生成（例えばテンプレートが存在しない溶液中での生成）されることになるかもしれない。高アフィニティ粒子は、固定されたテンプレートを持つ表面に選択的に結合され（そして、その後に回収され）、それにより、低アフィニティ粒子から分離することができる。固定されたテンプレートを持つ表面は、ＭＩＰｓの生成に使用される表面と同じであるか、または、固定されたテンプレートを持つ別の表面（例えば、分離カラム内に収納されたもの）でありうる。ここで言う表面とは、アフィニティカラム、センサーデバイス、マイクロ流体装置、マイクロチップ、反応器、ビーズ、繊維、ウェル（wells）、マイクロプレート、膜、フィルタ、穴、ナノ構造、小胞（vesicles）、カプセルなどの表面でありえる。表面は、固体、半固体若しくは液体、又は流体（ミセル又は界面の場合）でありえる。任意選択で、粒子は追加の１つ又は複数のカラムを使用して更に選別して、潜在的に障害となる化合物に対してアフィニティを持たない粒子の副留分を選択することができる。「クラス選択的（class-selective）」バインダーを製造するために、１つ又はそれより多くのテンプレート類似体に対して追加的なアフィニティを有する粒子の副留分を選択することに、同様の手法を採用することができる。
【００１６】
本発明において説明されたように合成された分子（二量体、オリゴマー、ポリマー又はそれらの混合物）は、薬理学及び医療における薬として、分析化学（センサー、分析（assays））におけるレセプター特有のリガンドとして、生物工学、医薬及び食品産業における分離のため、そして合成触媒として、又は、分析、センサー及び他の用途（例えば粉せっけん）における酵素の代わりとして、使用することができる。薬の設計における従来の取り組みは、典型的には、多数の化学構造における構造と活性との関係についての面倒な研究に基づいていた。本発明は、より単純でより直接的な方法を説明する。その方法は、固定されたテンプレートの存在下で架橋ＭＩＰナノ粒子を生成して生物学的活性物質を設計するための制御重合（任意選択で制御ラジカル重合でもよい）であり、その生物学的活性物質は、大きな利点（従来の薬の設計及び発見の方法と比較した場合）を持っており、アフィニティ分離、センサー及び触媒のための有用なリガンドでもある。
【００１７】
本発明の重要な態様として、以下のものが挙げられる。
（１）生物学的レセプター、核酸、細胞、胞子、ウイルス、微生物、組織サンプル、炭水化物、オリゴ糖、多糖、ペプチド、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成タンパク質、グリコプロテイン、グルコサミノグリカン、ステロイド、免疫抑制薬、ホルモン、ヘパリン、抗生物質、ビタミン、病的若しくは病気の生物指標化合物、毒素、農薬、除草剤、爆発物、神経ガス、汚染物質、内分泌かく乱化学物質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、代謝産物、二次代謝産物、薬代謝産物、薬中間体又は薬でありえる、固定化されたテンプレートの存在下での制御重合（任意選択で制御ラジカル重合でもよい）による架橋ＭＩＰナノ粒子の合成。このリストは限定を意図するものではなく、テンプレートとして可能性のある代表例であり、その及ぶ範囲は当業者であれば理解できる。
（２）比較的小さいサイズの粒子を生成するための反応条件の最適化。
（３）ビニルモノマー、アリルモノマー、アセチレン、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、クロロアクリレート、イタコネート、トリフルオロメチルアクリレート、アミノ酸誘導体、ヌクレオシド、ヌクレオチド及び炭水化物を１つ又はそれより多くを含む機能性モノマーから、生物学的活性分子などを含む分子の合成。
（４）ＭＩＰの調製のために使用された固定されたテンプレートを持つ同一の表面上、又は固定されたテンプレート又はテンプレート類似体を同様に持つ別の表面上で生じるアフィニティ相互作用による、合成された高アフィニティ粒子の保持。
（５）合成された分子の特性又は機能を変えるために、固定されたテンプレートを有する表面上に保持されたインプリントポリマー粒子が、他のタイプの分子によって変性される逐次重合。
（６）薬理学及び医療における薬として、分析化学（センサー、分析）におけるレセプター特有のリガンドとして、生物工学、医薬及び食品産業における分離のため、そして触媒としての、合成された分子の応用。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】固定されたテンプレートで被覆された粒子が充填されたＨＰＬＣカラム中に注入されたブランク（対照）粒子のクロマトグラムを表す。
【図２】固定されたテンプレートで被覆された粒子が充填されたＨＰＬＣカラム中に注入されたＭＩＰ粒子のクロマトグラムを表す。
【図３】メラミンでインプリントされたＭＩＰナノ粒子のサイズ分布を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明にて説明されたように調製されたポリマーは、テンプレートのエフェクター（活性剤、禁止剤又は基質）に類似しており、テンプレートがそのような分子又は構造の生理的プロセス又は有効な類似プロセスに関与している場合には、生物学的活性を有することができる。この種のポリマーは、例えば、薬理学及び医療における薬として用いることができる。この手法による利点は数え切れないほど多く、例えば、ＭＩＰ合成のための固定されたテンプレートを再利用する可能性、低アフィニティ粒子及び未反応モノマーから高アフィニティを有するＭＩＰｓを分別する可能性、テンプレートから合成ＭＩＰｓの除去が容易なこと、固定されたテンプレートに付着したＭＩＰｓを後に機能化する可能性、製造方法を完全に又は部分的に自動化する可能性などが挙げられる。本発明の他の利点は、当業者にとって明らかである。
【００２０】
具体的には、１つの態様において、本発明は、固定されたテンプレートの存在下における、制御重合（任意選択で制御リビングラジカル重合（ＬＲＰ）でもよい）、リビングアニオン重合、リビングカチオン重合、及び制御重縮合による架橋ＭＩＰｓの合成に関する。テンプレートとしては、生物学的レセプター、核酸、細胞、胞子、ウイルス、微生物、組織サンプル、炭水化物、オリゴ糖、多糖、ペプチド、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成タンパク質、グリコプロテイン、グルコサミノグリカン、ステロイド、ホルモン、免疫抑制薬、ヘパリン、抗生物質、ビタミン、病的若しくは病態の生物指標化合物、毒素、農薬、除草剤、爆発物、神経ガス、汚染物質、内分泌かく乱化学物質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、代謝産物、二次代謝産物、薬代謝産物、薬中間体又は薬、あるいは当業者に知られている他のクラスのテンプレートが挙げられる。テンプレートは、ポリマー、多糖若しくはガラスの表面上に、例えばビーズ、導波路、ファイバー、薄膜又は毛細管の形態で、又は当業者に知られている目的とする用途に適した任意の他の表面上に固定することができる。
【００２１】
重合は、例えば加熱により、電流を流すことにより（電解重合）、レドックス触媒、過硫酸塩又は過酸化物の添加により、ガンマ線等の照射により、マイクロ波の照射により、又は好ましくはＵＶもしくは可視光の照射により開始することができ、通常、種の反応性に応じて、数分間又は数時間行われる。
【００２２】
制御重合の幾つかの異なる形態は、本発明に包含される。それらは、全て、連続重合層又は網目状ではなくむしろ溶解可能なナノ粒子が主に生成されるようなレベルで、付加又は縮合反応を制御する能力に基づいている。リビングラジカル重合の例において、開始剤分子は、熱的、化学的、又は光化学的刺激によって可逆的な変換を起こし、不活性種を、鎖成長種（chain propagators）として機能する活性なフリーラジカル又はイオンに、可逆的に変換する。このため、反応の平衡定数を適用する条件は、不活性種の生成を助け、不活性種と成長種間の高速変換を可能するものでなければならない。したがって、成長種の濃度は非常に低く、その滞留時間は非常に短くなり、それによって、成長中のポリマー鎖の成長を停止させる副反応が起きる可能性が低下する。リビング重合の幾つかの例としては、もちろん特に限定されないが、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、及び可逆的付加開裂型連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）が挙げられる。ＲＡＦＴ重合は、活性種と不活性種の間での変換が起こる可逆的な付加開裂型連鎖移動平衡に基づいている。開始工程で生成するラジカルは、連鎖移動剤として働くことが可能な分子と衝突しそこに可逆的な形態で付加するまで、モノマーの添加により成長する。一般的に、リビング重合プロセスでは、重合にリビング性を与えるために、任意選択で従来型の開始剤と組み合わせることもできるイニファーター（開始剤、移動剤、停止剤）を使用することができる。イニファーターは、ジチオカルバミル基を持つ光イニファーター、又は炭素−炭素若しくはアゾ基を持つ熱イニファーター（例えば参考文献１４参照）、又は当業者に知られている他の種類の化合物であることができる。好ましい種類のイニファーターは、異なるラジカルを生成するものであり、１つは反応性のある炭素ラジカルで、別の１つはより反応性の低いラジカル（例えばジチオカルバミルラジカル）である。炭素ラジカル（典型的にはベンジルラジカル）は、不飽和モノマーと反応して、重合を開始することができる。より反応性の低いラジカル（例えばジチオカルバミルラジカル）は、成長ポリマー鎖と再結合することで重合を停止させるが、停止した生成物は、継続した刺激、例えばＵＶ照射（例えば文献１５参照）の適用に応答して、更に新しい成長ラジカル及び停止剤に解離することができる。
【００２３】
本発明の範囲に包含される、種々のタイプのリビング重合（原子移動、アニオン、カチオンなど）用の開始剤として使用できる他の化合物としては、特に限定されないが、以下のものが挙げられる。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミンと錯形成したＣｕ（Ｉ）Ｂｒを含む２−ブロモプロピオニトリル、Ｃｕ（Ｉ）ＣＩ／ＰＭＤＥＴＡを含むポリスチレンブロモマクロ開始剤、ＣｕＣｌ／ビピリジンを含むエチル２−ブロモイソブチレート；１，４−ビス（２，６−ジイソプロピルフェニル）アセナファテンジイミンニッケル（ＩＩ）ジブロミド；テトラエチルチウラムジスルフィドと結合した２，２−ジメトキシ−２−フェニルエースフェノン；テトラフェニルビホスフィン、ジ−ターシャリィ−ブチルパーオキシド等の３級過酸化物；ＳｍＭｅ（Ｃ５Ｍｅ５）２（ＴＨＦ）；ＴｉＣｌ４が結合されたスチレン系エポキシド；メチルスチレン４量体ジナトリウム；ＭｏＯＣｌ４−ｎ−ＢｕＳｎ−ＥｔＯＨ；ＨＣｌ／ＺｎＣｌ２；メチルｐ−トルエンスルホネート；２，１０，１５，２０−テトラフェニルポルフィナトアルミニウムメチル；３−メチル−１，１−ジフェニルペンチルリチウム；ＴＨＦ中のブチルリチウム；モリブデンアルキリジン化合物；２官能性有機ランタノイド（ＩＩＩ）；Ｍｏ（ＣＨ−ｔ−Ｂｕ）（ＮＡｒ）（ＯＣＭｅ３）２及びＭｏ（ＣＨＣＰｈＭｅ２）（ＮＡｒ）（ＯＣＭｅ（ＣＦ３）２）２；ＨＩ／Ｉ２；メチルアルミノキサン又はフェニルボレートと結合したＺｒ、Ｔｉ及びＨｆ錯体；Ｐｄ、Ｎｉ、Ｆｅ又はＣｏのジイミド錯体；均一なＴａ、Ｔｉ、Ｍｏ、Ｗカルベン錯体；メタロセン型又は非メタロセン型錯体からなる希土類金属錯体；カチオン性モノシクロペンタジエニルジルコニウムアセトアミジナート錯体；銅媒介リビング重合用の開始剤として１又は２の水酸基を有するエステル型フッ化テロマ；Ｙｂ［Ｃ（ＳｉＭｅ３）３］２。
【００２４】
従来のラジカル重合と比べてリビング重合の１つの利点は、従来のラジカル重合がしばしば強い自己加速を起こしながら進行するのに対し、リビング重合は低速度で目立った自己加速なしに進行するという点である（参考文献１６参照）。本発明では、比較的低分子量のポリマーを生成する条件でリビング重合を行うことによって、これを生かしている。典型的には、その反応は、５００〜１，０００，０００Ｄａの間の分子量を有するポリマーを生成するために、初期の段階で停止される。
【００２５】
比較的小さいサイズの粒子を生成するために、反応条件を最適化することができる。そのプロセスの重要な部分は、適切なリビング開始剤の選択及び重合反応条件の最適化である。あるいは、ラジカルの生成及び成長の速度は、反応禁止剤の添加又はメルカプト誘導体等の連鎖移動剤を加えることで制御することができる（参考文献１７）。
【００２６】
リビングラジカル重合開始剤は、別々の有機分子から、又は高分子から調製することができる。ヒドロキシル基、カルボキシル基又はアミノ基を含む大部分の化合物は、開始剤に変換することができ、したがって容易にポリマーに組み込むことができる。これは、単官能開始剤の場合にはポリマーの末端に、又、多官能開始剤の場合にはポリマーの中間に存在させることもできる。
【００２７】
比較的低分子量のポリマーを生成するための反応条件は、特に限定されないが、以下が挙げられる：（ｉ）開始剤とモノマーとの間において化学量論比を利用すること；（ｉｉ）反応系を冷やすか又はＵＶもしくは他の照射源を除去することで、反応の初期段階において新しい成長種の生成を停止させること；（ｉｉｉ）例えば濾過又はクロマトグラフィーにより、成長しているポリマー鎖と接触するモノマーの除去；（ｉｖ）禁止剤を反応に加えること；（ｖ）かなり希釈した溶液中で重合を行うこと；（ｖｉ）連鎖移動剤を加えること。好ましい選択は、照射源の除去又はその遮断である。あるいは、モノマー及び他の反応剤は、固定されたテンプレートに付着した成長中のＭＩＰから、溶出によって除去することができる。制御リビング重合の結果、ＭＩＰ粒子を５００〜１，０００，０００Ｄａのサイズ範囲で生成することができ、そのＭＩＰ粒子は、溶解可能な状態で、又は溶液において安定でかつアフィニティクロマトグラフィーの条件に適合する微細なコロイドの状態で存在しうる大きめの粒子（ただし１マイクロメートル未満）で存在することができる。
【００２８】
ＭＩＰの調製に用いることができるモノマーとしては、以下のものが挙げられる：ビニルモノマー、アリルモノマー、アセチレン、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、クロロアクリレート、イタコネート、トリフルオロメチルアクリレート、アミノ酸誘導体（例えばエステル又はアミド）、ヌクレオシド、ヌクレオチド及び炭水化物。提案された本発明の他の態様において、重合は、二重結合を有する粒子の存在下、又はその表面上で行われる。架橋モノマーは、結果として生じるレプリカ分子の構造を、テンプレートの構造と相補的なままで維持できるように固定又は安定させるために用いられる。ＭＩＰｓに好適な架橋剤の典型例としては、特に限定されないが、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ジビニルベンゼン、メチレンビスアクリルアミド、エチレンビスアクリルアミド及びＮ，Ｎ’−ビスアクリロイルピペラジンが挙げられる。架橋剤の機能は、二重結合を有する粒子若しくは前駆体ポリマー、又は、官能性モノマーと結合することができる複数の機能が付与された粒子又はポリマー、により発現することができる。当業者であれば、特定のシステムに好適なモノマー及び架橋剤を選択することができる。あるいは、種々の組合せと計算による方法を、この選択を補助するために用いることができる。
【００２９】
合成されたナノ粒子は、固定されたテンプレートに対して、モノマー、非特異性のオリゴマー及び低アフィニティポリマー（例えば、テンプレート非存在下でバルク状に生成されたもの）よりも、高いアフィニティを有する。したがって、提案された発明の１つの態様において、弱く結合した材料は、洗浄により、固定されたテンプレートに付着したナノ粒子から除去される。固定されたテンプレートからの高アフィニティナノ粒子の分離は、加熱により錯体の形成を阻害することで、溶液ｐＨの変更によりイオン強度を変えることで、又は、尿素、グアニジン、若しくはＭＩＰより強くテンプレートと相互作用する物質を追加することで、達成される。
【００３０】
合成されたアフィニティＭＩＰナノ粒子は、更に、クロマトグラフィー、濾過及び／又は電気泳動により精製することができる。合成されたポリマーの分離は、テンプレートに対して最も高いアフィニティを有するポリマー留分の精製のために同一若しくは類似の固定化されたテンプレートが用いられる場合はアフィニティクロマトグラフィー又は選択的溶出により、又は／及び、異なるサイズのポリマー留分を分離するゲル浸透クロマトグラフィーにより、達成できる。分別、分離及び精製は、異なるｐＨ、すなわちイオン強度を有する緩衝液を用いて、又は、尿素、グアニジン、若しくはポリマーよりも強くテンプレートと相互作用する物質の追加により、達成できる。あるいは、高アフィニティを有する粒子の分別は、濾過、電気泳動、クロマトグラフィー分離、洗浄、遠心分離又は透析により達成できる。テンプレートに対するアフィニティの分布が狭いＭＩＰｓの調製が可能であることから、アフィニティクロマトグラフィーは特に強力なツールであり、特に好ましい。
【００３１】
成長中のポリマー鎖は、ＭＩＰｓにその抽出又は他の態様の分離を促進するような特定の特性を与える目的で、他のポリマー又は官能基により変性することができる。これの例は、やはり、例えば有機溶剤により水溶液からポリマーの抽出を可能にする疎水性末端を有するポリマーでありえる。アフィニティ吸着剤によりポリマーの選択的除去を可能とする特定の結合基（例えば、ビオチン）を導入することが可能である。当業者は、この変性及びそれにより実行される分離を可能とする多様な実験手順を知っている。その変性は、固定されたテンプレートにポリマーが結合した状態の表面上において直接達成でき、又は別個に達成できる。
【００３２】
したがって、本発明では、インプリントポリマーが合成された分子の特性又は機能を変えるために他のタイプの分子で変性される場合、逐次重合を採用することができる。成長中のポリマー鎖がその分離を促進するために他のポリマー又は官能基によって変性できることは、既に述べた。リビング重合の１つの重要な特性は、単に、例えば反応混合物へのＵＶ照射を止めることで反応を停止させ、後にそれを継続できる点にある。成長中のポリマー鎖の末端は、再度活性化されて新たな重合段階を開始できる開始剤を含んでいる。したがって、成長中のポリマー鎖は、他のモノマーにさらされることで、重合を継続することができ、結果としてブロックコポリマーが生成される。新しいモノマーは、新しい機能をポリマーに導入することができる。すなわち、第１のＭＩＰによってもたらされる第１のテンプレートに対するアフィニティに加えて、延長されたポリマーは、系に導入された第２のテンプレートに対するアフィニティを有するものとして生成できる。延長されたブロックポリマーは、診断において有用な、末端基に取り付けられた蛍光タグを有することができる。殺菌性を有する活性種、触媒基、同位体ラベル、固定化、検出及び造影に有用な基（例えば造影剤）などをもたらす能力等の他の機能を導入するために、他の形態の変性をすることも可能である。これらの機能は、対応する機能化された開始剤を用いることで、ポリマーに導入することもできる。その変性は、固定されたテンプレートに粒子が結合した状態の表面上において直接達成でき、又は別個に達成できる。
【００３３】
１つの態様では、本発明は、薬理学及び医療における薬としての、分析化学（センサー、分析）におけるレセプター特有のリガンドとしての、生物工学、薬理学及び食品産業における分離のための、そして触媒としての、合成された分子の応用に関する。合成されたポリマーは、その溶解可能な性質によって、薬としての使用に理想的な候補となる。酵素、レセプター又は他の生体分子への選択的な結合は、これらの分子の生物学的機能に影響を与えるために用いることができる。したがって、リビング重合によって合成されたＭＩＰｓは、生物学的プロセスの変調のためにインビボで使うことができる。同位体又は蛍光タグに結合する場合、ＭＩＰｓは、選択的な造影剤として、又は他の形態の診断法で用いることができる。ある条件で、例えば１重項分子酸素を製造可能なリガンドと結合したＭＩＰｓは、選択的な殺菌剤として用いることができる。様々な他の変性が当業者によって提案されており、リビング重合によって調製されたＭＩＰｓ中に抗生特性（antibiotic properties）を導入することができる。
【００３４】
合成されたＭＩＰｓは、天然抗体又は種々の形態の分析及びセンサーにおけるレセプターのため代替品として用いることができる。幾つかの特徴により、リビング重合により調製されたＭＩＰｓは、特にセンサー用途として魅力的な対象となる。このようにして合成されたＭＩＰ分子は、ポリマーを固体の表面に共有結合的に結合させるために用いることができる開始剤を依然として含んでいる。したがって、二重結合で被われた表面にＭＩＰｓを結合させるためには、単純なＵＶ照射で十分であろう。
【００３５】
ＭＩＰリガンドを種々のアフィニティを有する幾つか留分に分割するためにアフィニティクロマトグラフィーを用いることができることは、検出範囲を変化させることによるセンサー／分析の製造のために有利である。幾つかの応用として、テンプレート非存在下でのリビング重合で調製したブランクポリマーを用いることもできる。しかしながら、あるアフィニティ又はこの特別な用途のために必要な他の特性を有するモノマーを用いて、そのようなポリマーを調製することが必要となるであろう。当業者は、例えば計算的な又は組合せ的な手法を用いて、この種のモノマーを選択する方法を知っている。ＭＩＰｓ及び対応する実施形態おいて説明した態様で調製されたブランクポリマーを用いることが本発明の範囲に包含されることを明らかにしなければならない。
【００３６】
以下の非限定的な実施例を参照しつつ、本発明を更に説明する。
【実施例】
【００３７】
〔実施例１〕：メラミンとアフィニティを有するＭＩＰ粒子の合成
１．１７ｇのアセトニトリル、０．３２ｇのメタクリル酸、０．３６ｇのトリメチロールプロパントリメタクリレート（ＴＲＩＭ）、０．３６ｇのエチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）、０．０８７ｇのジエチルジチオカルバミン酸ベンジルエステル（リビング開始剤）及び０．０２ｇのペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）（連鎖移動剤）の混合物に窒素パージし、メラミンで誘導体化されたガラスビーズ（直径９〜１３μｍ）が充填されたガラスカラム（７０×４ｍｍ）内で、ＵＶ照射（強度０．１６３Ｗ／ｃｍ２のＵＶＡＰＲＩＮＴ １００ ＣＶＩ ＵＶ源、Ｄｒ．Ｈｏｎｌｅ）により３分間重合した。同じサイズの非誘導体化ガラスビーズでカラムが充填されていること以外は同様にして、ブランク（対照）粒子を合成した。重合後、カラムを１ｍｌのアセトニトリルによって洗浄し、ナノ粒子及び未反応モノマーを溶出した。
得られた溶解可能なインプリントナノ粒子の平均径は６０ｎｍであった。平均径はＮａｎｏｓｉｚｅｒ（マルバーンインスツルメント）の動的光散乱により算出した。３つの異なる実験における粒度分布を図３に示す。
【００３８】
〔実施例２〕合成ポリマーのアフィニティ分離
ａ）アフィニティ吸着体の調製−テンプレートの固定
ガラスビーズを４Ｍ−ＮａＯＨ中で１０分間煮沸させることで活性化し、脱イオン水及びアセトンで洗浄し、その後８０℃で２時間乾燥した。そのビーズを、（３−アミノプロピル）トリメトキシシランが２％ｖ／ｖのトルエン中に３時間放置し、アセトンで洗浄し、グルタルアルデヒドが７％ｖ／ｖのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に３０分間置き、その後水で洗浄した。テンプレート（メラミン）を、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（１０％ｖ／ｖ）及びメラミンが０．１ｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）中に４時間放置することによって、ビーズの表面上に固定した。
メラミンで被覆された粒子は、インプリントナノ粒子の合成のため、及びアフィニティクロマトグラフィーのために用いた。
【００３９】
ｂ）アフィニティクロマトグラフィー
実施例１のガラスカラムから溶出されたサンプルを、０．２２μｍの細孔サイズを有するＰＴＦＥシリンジフィルタで濾過することによって、大きなポリマー集合体を取り除いた。その後、未反応モノマーを除去するために、濾液を１００００Ｄａカットオフの遠心分離機フィルタカートリッジに配置し、３０００ｇで４時間遠心分離した。その後、粒子をアセトニトリル中に再懸濁し、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００シリーズＨＰＬＣを用いて、上記（実施例２ａ）で調製したアフィニティ吸着剤を充填したカラム（１００×４．６ｍｍ）を有するＨＰＬＣでテストした。注入容量は４０μｌであり、使用した移動相は１ｍｌ／ｍｉｎのアセトニトリルであり、検出は２１０ｎｍで行った。溶出を補助するための酸の使用を回避するために、分析は８０℃で行った。ＭＩＰと対照ポリマーの両方を、同じようにして調製した。アフィニティ相上のブランク及びインプリント粒子の両方のクロマトグラムを、以下の図１及び図２に示す。
【００４０】
〔実施例３〕メラミン用ナノ粒子の調製
ガラスビーズ（直径７５μｍ）を４Ｍ−ＮａＯＨ中で１０分間煮沸させることで活性化し、再蒸留水及びアセトンで徹底的に洗浄し、８０℃で２時間乾燥した。その後、ビーズを、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）が２％ｖ／ｖのトルエン溶液中に夜通し放置し、アセトンで洗浄し、グルタルアルデヒド（ＧＡ）が５％ｖ／ｖのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）２５ｍｌ中に１時間放置し、再蒸留水で洗浄した。Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）が１０％ｖ／ｖで、メラミンが０．０１ｇ／ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液中に、このビーズを４時間置くことにより、テンプレートを固定した。物理的に吸着された過剰なメラミンを、再蒸留水及びメタノールで洗浄することで除去した。誘導体化されたガラスビーズを、真空下で乾燥し、石英カラム（１．５ｍｍの壁を含む外径６．４ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）に充填した。０．３２ｇのメタクリル酸（ＭＡＡ）、０．３６ｇのトリメチロールプロパントリメタクリレート（ＴＲＩＭ）、０．３６ｇのエチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）、０．０８７ｇのＮ、Ｎ’−ジエチルジチオカルバミン酸ベンジルエステル及び０．０２ｇのペンタエリトリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）（ＣＴＡ）を、１．１７ｇのアセトニトリル（ＡＣＮ）中で混合し、２分間窒素パージした。その後、５００μｌを、アフィニティ媒体を充填したカラムに注入し、３６６ｎｍの紫外線（ＨＢ １７１／Ａ ｌａｍｐ、強度４×１５Ｗ、フィリップス）下で２分間重合した。重合後、カラムを、ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ１ １００シリーズＨＰＬＣ）に接続した。２２０ｎｍでＵＶ検出しながら、１ｍｌ／ｍｉｎの流量で溶出した。最初の９０分間は、カラムを氷浴中で０℃に保ちつつ、ＡＣＮを移動相として使用した。その後の４５分間は、移動相をギ酸（１０ｍＭ）を含むＡＣＮに切り替え、温度を２５℃に上げた。最後の３５分間は、ナノ粒子の高アフィニティ留分の溶出を６０℃で行った。非誘導体化ガラスビーズを使用したこと以外は、上記の通りにして、ブランクのナノ粒子を調製した。様々な留分中の合成ナノ粒子のサイズは、Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ（マルバーンインスツルメント）の動的光散乱により算出したが、１２０〜４６０ｎｍの間を変動した。
【００４１】
〔実施例４〕ペプチド用ナノ粒子の調製
ガラスビーズ（直径７５μｍ）を、４Ｍ−ＮａＯＨ中で１０分間煮沸させることで活性化し、再蒸留水及びアセトンで洗浄し、８０℃で２時間乾燥した。その後、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）が２％ｖ／ｖのトルエン溶液中に、そのビーズを夜通し放置し、その後アセトンで洗浄し、グルタルアルデヒド（ＧＡ）が７％ｖ／ｖのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）２５ｍｌ中に１時間放置し、再蒸留水でリンスし、ペプチド（ＴＡＴＴＳＶＬＧ−ＮＨ２）が０．０５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液中に４時間放置した。その誘導体化されたビーズを再蒸留水で洗浄し、ＭＩＰナノ粒子の調製に利用した。１９．５ｍｇのＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡｍ）、１ｍｇのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）、１６．５ｍｇのＮ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＴＢＡｍ）及び１．１１μｌのアクリル酸（ＡＡｃ）を、１０ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む５０ｍｌの水に溶かした。この溶液を１０分間超音波処理し、３０分間窒素パージした。この溶液の１０ｍｌを、４ｇの誘導体化されたビーズを含む２０ｍｌのねじ口瓶に入れた。６０ｍｇ／ｍｌの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）１００μｌとＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）３μｌを加えることによって重合を開始し、室温で２２時間行った。ＭＩＰ生成物及びアフィニティ媒体を含む瓶を氷中で１０分間０℃に保ち、その後ＳＰＥカートリッジ中に投入して、ナノ粒子が付着したビーズを他の成分から分離した。毎回１０ｍｌの冷たい再蒸留水を用いて洗浄工程を５回行うことによって、低いアフィニティ又は全くアフィニティのない材料を除去した。ナノ粒子の高アフィニティ留分の溶出を、６０℃でＰＢＳ（ｐＨ７．２）により行った。非誘導体化ガラスビーズを使用したこと以外は、上記の通りにして、ブランクのナノ粒子を調製した。様々な留分中の合成ナノ粒子のサイズは、Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ（マルバーンインスツルメント）の動的光散乱により算出したが、３０〜１３０ｎｍの間を変動した。
【００４２】
（合成ナノ粒子のアフィニティの分析）
金被覆チップ（ＳＩＡ Ｋｉｔ Ａｕ）を、ピラニア溶液（Ｈ２ＳＯ４／Ｈ２Ｏ２、３：１ ｖ／ｖ）に５分間浸漬することで洗浄した。その後、それらを再蒸留水及びエタノールで徹底的にリンスした。グリシンスペーサ（ＣＧＧＧＧＴＡＴＴＳＶＬＧ−ＮＨ２）を有するペプチドテンプレートのチオレート化された誘導体、及びチオレート化された参照ペプチド（ＣＱＬＰＥＬＫＱＫＳＳ−ＮＨ２）の固定化を、清浄された金チップ上に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中０．１ｍｇ／ｍｌのペプチド溶液１００μｌを、２５℃で１５μｌ／ｍｉｎ分の流量で注入することによって実行し、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００ ＳＰＲを用いてオンラインで記録した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１：１０、１：２０、１：４０、１：６０、１：８０及び１：１００に希釈されたナノ粒子１００μｌを注入し（流量：１５μｌ／ｍｉｎ）、センサー応答を、Ｂｉａｃｏｒｅソフトウェアを用いて２分間分析した。見かけの解離定数ＫＤ＝２．５ｐＭが、ＭＩＰナノ粒子とテンプレートペプチド（ＣＧＧＧＧＴＡＴＴＳＶＬＧ−ＮＨ２）の間の相互作用について得られた。参照ペプチド（ＣＱＬＰＥＬＫＱＫＳＳ−ＮＨ２）について記録された見かけの解離定数はＫＤ＝３．３ｎＭであり、これは、ＭＩＰナノ粒子がテンプレートペプチドに対して約１０００倍特異的であることを示している。
【００４３】
〔実施例５〕バンコマイシン用ナノ粒子の調製
ガラスビーズ（直径７５μｍ）を４Ｍ−ＮａＯＨ中で１０分間煮沸させ、再蒸留水及びアセトンで洗浄し、８０℃で２時間乾燥した。その後、ビーズを、（３−アミノプロピル）トリメトキシシランが２％ｖ／ｖの溶液中に夜通し放置し、アセトンで洗浄し、グルタルアルデヒド（ＧＡ）が７％ｖ／ｖのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中に１時間放置し、再蒸留水でリンスし、バンコマイシンＨＣｌが０．５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に４時間放置した。誘導体化されたビーズを再蒸留水で洗浄し、ＭＩＰナノ粒子の調製に利用した。１９．５ｍｇのＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡｍ）、１ｍｇのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）、１６．５ｍｇのＮ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＴＢＡｍ）及び１．１１μｌのアクリル酸（ＡＡｃ）を、１０ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む５０ｍｌの水に溶かした。溶液を１０分間超音波処理し、３０分間窒素パージした。この溶液の５０ｍｌを、２０ｇの誘導体化されたビーズを含む１００ｍｌのねじ口瓶に入れた。６０ｍｇ／ｍｌの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）５００μｌとＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）３μｌを加えることによって重合を開始し、室温で２２時間行った。ＭＩＰ生成物及びアフィニティ媒体を含む瓶を氷中で１０分間０℃に保ち、その後ＳＰＥカートリッジ中に投入して、ナノ粒子が付着したビーズを他の成分から分離した。毎回２０ｍｌの冷たい再蒸留水を用いて洗浄工程を５回行い、低いアフィニティ又は全くアフィニティのない材料を除去した。その後、高アフィニティのナノ粒子を、６０℃で２０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）の５つの留分を通過させことによって、アフィニティ媒体から分離した。クロロトリメチルシランによって誘導体化されたガラスビーズを使用したこと以外は同様にして、非インプリントナノ粒子を調製した。その結果得られた溶解可能なインプリントナノ粒子は、２２８ｎｍの平均径を有していた。平均径は、マルバーンインスツルメント社（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）製のＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｎａｎｏ−Ｓ）を用いて、動的光散乱（ＤＬＳ）により算出した。
【００４４】
（合成ナノ粒子のアフィニティの分析）
Ｂｉａｃｏｒｅから購入した金被覆チップ（ＳＩＡ Ｋｉｔ Ａｕ）を、ピラニア溶液（Ｈ２ＳＯ４／Ｈ２Ｏ２、３：１ ｖ／ｖ）に５分間浸漬することで洗浄した。その後、それらを再蒸留水及びエタノールで徹底的にリンスし、４−アミノチオフェノールが０．２ｍｇ／ｍｌのエタノール溶液中に４℃で２４時間放置した。この後、チップを再蒸留水でリンスし、ＧＡが７％ｖ／ｖのＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液中に室温で１時間放置した。チップを更に再蒸留水でリンスし、バンコマイシンが１．２ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液中に室温で２４時間放置し、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００に結合した。ナノ粒子、及びＰＢＳ（ｐＨ７．４）中において１：１０、１：１００、１：１０００、１：１００００に希釈されたナノ粒子１００μｌを３０℃で注入した（流量：１５μｌ／ｍｉｎ）。センサー応答を、Ｂｉａｃｏｒｅソフトウェアを用いて分析した。ＭＩＰナノ粒子についてのバンコマイシンの見かけの解離定数ＫＤは、０．９ｎＭであった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液の状態又はコロイド懸濁液の状態で、分子インプリントポリマー（「ＭＩＰ」）を調製する方法であって、
（ａ）その表面が露出するように、その上にテンプレート材料を固定したキャリア物質を提供する工程と、
（ｂ）前記表面に接触するように重合性組成物を提供する工程と、
（ｃ）前記表面に接触した前記重合性組成物の制御重合を行い、溶液又はコロイド懸濁液を生成可能なＭＩＰ粒子が生成されたときに、前記重合を停止する工程と、
（ｄ）前記表面から前記ＭＩＰ粒子を分離する工程と
を有する方法。
【請求項２】
前記表面から前記ＭＩＰ粒子を分離する前記工程の後に、固定された前記テンプレート材料を有する前記キャリア物質を工程（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）において再利用する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キャリア物質が、ポリマー樹脂、多糖、ガラス又は金属の表面である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記キャリア物質が、ビーズ、導波路の表面、光ファイバーを含むファイバー、薄膜、又は毛細管である請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記表面から前記ＭＩＰ粒子を分離する前記工程の後に、
（ｉ）前記分離されたＭＩＰ粒子を含む溶液又は懸濁液を、表面が露出するように固定された前記テンプレート材料を有するキャリア物質に接触させて、その結果、前記ＭＩＰ粒子を前記固定されたテンプレート材料に固着させ、（ｉｉ）固着されていない材料を前記キャリア物質から分離し、その後、（ｉｉｉ）ＭＩＰ粒子を前記固定されたテンプレート材料から回収して、精製された溶液又はコロイド懸濁液を生成する精製工程（ｅ）を、更に有する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
精製工程（ｅ）で使用される前記キャリア物質が、請求項３又は４で定義されたものであり、工程（ｃ）で使用される前記キャリア物質と同一又は異なる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記制御重合が、ラジカル重合である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記制御重合が、制御リビングラジカル重合（ＬＲＰ）、リビングアニオン重合、リビングカチオン重合、及び制御重縮合から選択される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記制御重合が、イニファーター媒介重合、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、及び可逆的付加開裂型連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）から選択される請求項７又は請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｃ）において、５００〜１，０００，０００ダルトンの範囲の分子質量を有する溶解可能なＭＩＰ粒子を製造するように、重合を停止する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）において、粒子径が１マイクロメートル未満でかつ溶液中で安定なコロイド粒子を製造するように、重合を停止する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記重合性組成物が、ビニルモノマー、アリルモノマー、アセチレン、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、クロロアクリレート、イタコネート、トリフルオロメチルアクリレート、アミノ酸誘導体、ヌクレオシド、ヌクレオチド、及び炭水化物から選択される１つ又はそれより多いモノマーを含む請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記重合性組成物が、少なくとも１つの架橋剤を更に含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの架橋剤が、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ジビニルベンゼン、メチレンビスアクリルアミド、エチレンビスアクリルアミド、及びＮ，Ｎ’−ビスアクリロイルピペラジンから選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記表面から前記ＭＩＰ粒子を分離する前記工程（ｄ）が、加熱、溶液ｐＨの変更、イオン強度の変更により、又は尿素、グアニジン、若しくはＭＩＰよりも強くテンプレートと相互作用する物質の添加により行われる請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
制御重合を行う前記工程（ｃ）において逐次重合が採用され、そこでは、工程（ｂ）で提供される前記重合性組成物が第１の重合工程で使用され、その後に別の重合性組成物が提供され、更に重合工程が実行されて、溶液又はコロイド懸濁液を依然として生成可能な変性ＭＩＰ粒子を製造する請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）の後に、洗浄によって前記固定されたテンプレート材料から固着が不十分な低アフィニティ材料を除去し、その後の工程（ｄ）において、高アフィニティ粒子の溶出及び回収のために、より強い溶出条件を適用する請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）において、モノマー混合物の希釈、低温での重合の実施、連鎖停止剤の添加、又は禁止剤の添加、の１つ以上を含む、溶解可能なコロイド微粒子の生成に有利に働く、重合条件が採用される請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｃ）において、加熱、ＵＶ光若しくは可視光の照射、マイクロ波の照射、電解重合、酸化、又は触媒の添加によって、重合が開始する請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
溶液の状態又はコロイド懸濁液の状態で、分子インプリントポリマー（「ＭＩＰ」）を調製する方法であって、
（ａ）その表面が露出するように、その上にテンプレート材料を固定したキャリア物質を提供する工程と、
（ｂ）前記表面に接触するように重合性組成物を提供する工程と、
（ｃ）前記表面に接触した前記重合性組成物の制御重合を行い、溶液又はコロイド懸濁液を生成可能なＭＩＰ粒子が生成されたときに、前記重合を停止する工程と、
（ｄ）前記表面から前記ＭＩＰ粒子を分離する工程と
を有する方法。
【請求項２】
前記表面から前記ＭＩＰ粒子を分離する前記工程の後に、固定された前記テンプレート材料を有する前記キャリア物質を工程（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）において再利用する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キャリア物質が、ポリマー樹脂、多糖、ガラス又は金属の表面である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記キャリア物質が、ビーズ、導波路の表面、光ファイバーを含むファイバー、薄膜、又は毛細管である請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記表面から前記ＭＩＰ粒子を分離する前記工程の後に、
（ｉ）前記分離されたＭＩＰ粒子を含む溶液又は懸濁液を、表面が露出するように固定された前記テンプレート材料を有するキャリア物質に接触させて、その結果、前記ＭＩＰ粒子を前記固定されたテンプレート材料に固着させ、（ｉｉ）固着されていない材料を前記キャリア物質から分離し、その後、（ｉｉｉ）ＭＩＰ粒子を前記固定されたテンプレート材料から回収して、精製された溶液又はコロイド懸濁液を生成する精製工程（ｅ）を、更に有する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
精製工程（ｅ）で使用される前記キャリア物質が、請求項３又は４で定義されたものであり、工程（ｃ）で使用される前記キャリア物質と同一又は異なる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記制御重合が、ラジカル重合である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記制御重合が、制御リビングラジカル重合（ＬＲＰ）、リビングアニオン重合、リビングカチオン重合、及び制御重縮合から選択される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記制御重合が、イニファーター媒介重合、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、及び可逆的付加開裂型連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）から選択される請求項７又は請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｃ）において、５００〜１，０００，０００ダルトンの範囲の分子質量を有する溶解可能なＭＩＰ粒子を製造するように、重合を停止する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）において、粒子径が１マイクロメートル未満でかつ溶液中で安定なコロイド粒子を製造するように、重合を停止する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記重合性組成物が、ビニルモノマー、アリルモノマー、アセチレン、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、クロロアクリレート、イタコネート、トリフルオロメチルアクリレート、アミノ酸誘導体、ヌクレオシド、ヌクレオチド、及び炭水化物から選択される１つ又はそれより多いモノマーを含む請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記重合性組成物が、少なくとも１つの架橋剤を更に含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの架橋剤が、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ジビニルベンゼン、メチレンビスアクリルアミド、エチレンビスアクリルアミド、及びＮ，Ｎ’−ビスアクリロイルピペラジンから選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記表面から前記ＭＩＰ粒子を分離する前記工程（ｄ）が、加熱、溶液ｐＨの変更、イオン強度の変更により、又は尿素、グアニジン、若しくはＭＩＰよりも強くテンプレートと相互作用する物質の添加により行われる請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
制御重合を行う前記工程（ｃ）において逐次重合が採用され、そこでは、工程（ｂ）で提供される前記重合性組成物が第１の重合工程で使用され、その後に別の重合性組成物が提供され、更に重合工程が実行されて、溶液又はコロイド懸濁液を依然として生成可能な変性ＭＩＰ粒子を製造する請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）の後に、洗浄によって前記固定されたテンプレート材料から固着が不十分な低アフィニティ材料を除去し、その後の工程（ｄ）において、高アフィニティ粒子の溶出及び回収のために、より強い溶出条件を適用する請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）において、モノマー混合物の希釈、低温での重合の実施、連鎖停止剤の添加、又は禁止剤の添加、の１つ以上を含む、溶解可能なコロイド微粒子の生成に有利に働く、重合条件が採用される請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｃ）において、加熱、ＵＶ光若しくは可視光の照射、マイクロ波の照射、電解重合、酸化、又は触媒の添加によって、重合が開始する請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１３−５１２３２４（Ｐ２０１３−５１２３２４Ａ）
【公表日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４１５７２（Ｐ２０１２−５４１５７２）
【出願日】平成２２年１２月１日（２０１０．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００２２１３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６７５６３
【国際公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【出願人】（５０４４５５４０３）クランフィールド ユニヴァーシティー (5)
【氏名又は名称原語表記】ＣＲＡＮＦＩＥＬＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１日（２０１０．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００２２１３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６７５６３
【国際公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【出願人】（５０４４５５４０３）クランフィールド ユニヴァーシティー (5)
【氏名又は名称原語表記】ＣＲＡＮＦＩＥＬＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
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