初乳又は初乳由来組成物、及び、初乳又は初乳由来組成物を用いた方法
【課題】
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整し、アレルギー性疾患、潰瘍性大腸炎などの症状を抑制又は改善すること。
【解決手段】
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する初乳又は初乳由来組成物、及び、初乳又は初乳由来組成物を用いた、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する方法、を提供する。本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが、通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して、Ｔｈ１細胞が弱まりＴｈ２細胞が優位になる方向に偏向する病態を示す疾患、例えば、アレルギー性疾患、潰瘍性大腸炎などに適用できる。本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、医薬組成物として用いたり、飲食物（食品、菓子、ガム、飲料、ジュース、サプリメントなど）、飲食物などに含有させたりすることもできる。
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整し、アレルギー性疾患、潰瘍性大腸炎などの症状を抑制又は改善すること。
【解決手段】
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する初乳又は初乳由来組成物、及び、初乳又は初乳由来組成物を用いた、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する方法、を提供する。本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが、通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して、Ｔｈ１細胞が弱まりＴｈ２細胞が優位になる方向に偏向する病態を示す疾患、例えば、アレルギー性疾患、潰瘍性大腸炎などに適用できる。本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、医薬組成物として用いたり、飲食物（食品、菓子、ガム、飲料、ジュース、サプリメントなど）、飲食物などに含有させたりすることもできる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する初乳又は初乳由来組成物、抗アレルギー剤である初乳又は初乳由来組成物、潰瘍性大腸炎治療剤である初乳又は初乳由来組成物、及び、前記初乳又は初乳由来組成物を少なくとも含有する医薬組成物及び飲食物、並びに、初乳又は初乳由来組成物を用いた、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス調整方法、アレルギー抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの偏向が、アレルギー性疾患発症の重要な要因となっていることが明らかになりつつある。
【０００３】
リンパ球の一種であるヘルパーＴ細胞は、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞に分類される。Ｔｈ１細胞は、細菌・ウイルスなどの異物を破壊するなど、細胞性免疫に関与し、また、ＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）、ＩＬ−２（インターロイキン２）などのサイトカインを分泌する。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３などのサイトカインを分泌してＢ細胞の抗体産生を促進するなど、体液性免疫に関与している。
【０００４】
Ｔｈ１細胞の分泌するサイトカイン（ＩＦＮ−γなど）はＴｈ２細胞を抑制し、Ｔｈ２細胞の分泌するサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３など）はＴｈ１細胞を抑制する。従って、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞のいずれかが優位になり、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが偏向することは、さまざまな免疫疾患の原因となる。Ｔｈ１細胞が通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して優位な場合は、炎症性疾患や自己免疫性疾患を発症し、Ｔｈ２細胞が通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して優位な場合は、生体防御能が低下したり、アレルギー疾患や潰瘍性大腸炎を発症したりすることが知られている。
【０００５】
アレルギー性疾患の具体的な発症機序は、概ね次のとおりであると考えられている。通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して、Ｔｈ２細胞がＴｈ１細胞よりも優位になると、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮ−γなどの分泌が抑制されるため、Ｔｈ２細胞の活性は増強され、Ｔｈ２細胞からＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３などのサイトカインが過剰に分泌される。ＩＬ−４及びＩＬ−１３は、Ｂ細胞のＩｇＥ産生を促進し、ＩＬ−５は、好酸球の分化を促進する。そして、ＩｇＥの過剰産生と好酸球の過剰亢進は、アレルギー反応を惹起する。また、Ｔｈ２細胞から過剰に分泌されたサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３など）によりＴｈ１細胞の分化がさらに抑制されるため、Ｔｈ２細胞の分化がさらに促進され、アレルギー反応が増強される（非特許文献１参照）。
【０００６】
特許文献１〜３は、抗アレルギー疾患に関連する先行文献である。特許文献１は、牛乳アレルギーの原因物質を酵素的に分解した抗アレルギー栄養組成物について、特許文献２は、酸乳ホエー（乳清）を用いた抗アレルギー剤について、特許文献３は、タンパク質加水分解物調合乳によるアレルギー予防方法について、それぞれ記載されている。
【特許文献１】特開平８−２１４８３６号公報
【特許文献２】特開２０００−２３９１７５号公報
【特許文献３】特表平１１−５１０７９１号公報
【非特許文献１】東京化学同人発行、「免疫学辞典 第２版」、Ｐ４１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の通り、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの偏向が、アレルギー性疾患発症の重要な要因となっている。そこで、本発明は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整すること、及び、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが、通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して、Ｔｈ１細胞が弱まりＴｈ２細胞が優位になる方向に偏向する病態を示す疾患、例えば、アレルギー性疾患、潰瘍性大腸炎などの症状を抑制又は改善することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らの研究の結果、初乳又は初乳由来組成物には、Ｔｈ２細胞によるＩＬ−４及びＩＬ−１０の分泌を抑制する作用があることが明らかになった。また、初乳又は初乳由来組成物を用いることにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを、Ｔｈ１細胞を優位にしＴｈ２細胞を弱める方向に調整できることが明らかになった。
【０００９】
そこで、本発明では、まず、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する初乳又は初乳由来組成物、及び、初乳又は初乳由来組成物を用いた、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する方法、を提供する。
【００１０】
また、本発明では、抗アレルギー剤である初乳又は初乳由来組成物、潰瘍性大腸炎治療剤である初乳又は初乳由来組成物、及び、初乳又は初乳由来組成物を用いたアレルギー抑制方法、を提供する。
【００１１】
前記の通り、本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを、Ｔｈ１細胞を優位にしＴｈ２細胞を弱める方向に調整できるため、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが、Ｔｈ１細胞が弱まりＴｈ２細胞が優位になる方向に偏向する病態を示す疾患、例えば、アレルギー性疾患、潰瘍性大腸炎などに適用できる。
【００１２】
例えば、アレルギー性疾患の場合、前記の通り、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが、通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して、Ｔｈ２細胞優位の方向に偏向することが、発症の主な原因となっている。本発明に係る初乳又は初乳由来組成物を用いるにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを、Ｔｈ２細胞を弱める方向に調整できるため、アレルギー症状を抑制又は改善することができる。
【００１３】
また、例えば、潰瘍性大腸炎の場合も、腸管内におけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスが、通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して、Ｔｈ２細胞優位の方向に偏向することが、発症の主な原因となっている。本発明に係る初乳又は初乳由来組成物を用いるにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを、Ｔｈ２細胞を弱める方向に調整できるため、潰瘍性大腸炎の症状を抑制又は改善することができる。
【００１４】
なお、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの偏向は、アレルギー性疾患に共通な発症メカニズムであるため、本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、特定のアレルギー性疾患だけでなく、アレルギー性疾患全般に広く適用可能であると推定できる。
【００１５】
具体的には、本発明を適用できるアレルギー疾患として、例えば、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、花粉症、蕁麻疹、ダニ・チリアレルギー、食物アレルギー、薬物アレルギー、アトピー性皮膚炎、などを想定できる。
【００１６】
加えて、本発明における抗アレルギー作用は、初乳又は初乳組成物自体を用いている点で、従来の抗アレルギー性の乳組成物などとは異なった特質を持つ。
従来、牛乳をはじめ乳製品はアレルギーの原因となる場合があるため、乳組成物自体を、アレルギー症状を抑制又は改善する用途で用いることはなかった。即ち、従来の抗アレルギー性の乳組成物は、乳中のアレルギー原因物質を除去・分解などしたものに限られていた。
それに対し、本発明は、初乳又は初乳由来組成物自体に、アレルギー症状を抑制又は改善する作用があることを新規に見い出した点で、従来の抗アレルギー性の乳組成物などとは異なる。
【００１７】
その他、本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、天然物由来であり、化学合成物を用いた医薬組成物・飲食物などと比較して、安全性が高いという有利性もある。
【００１８】
なお、本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、医薬組成物（錠剤、液剤、顆粒剤、カプセル剤など）として用いたり、医薬組成物に含有させたりすることができる。本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、飲食物（食品、菓子、ガム、飲料、ジュース、サプリメントなど）として用いたり、飲食物に含有させたりすることもできる。
【００１９】
本発明において、「初乳」は、哺乳類の分娩後に分泌される乳をいい、乳タンパク質、ミネラル、新生児に受動免疫を与える抗体などに富む。最も好適なものは、分娩後一週間以内に分泌された牛の初乳である。本発明において、「初乳由来組成物」は、初乳を濃縮・乾燥した液状物・粉状物など、初乳から作製される組成物を広く包含する。
【００２０】
本発明において、「Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス」とは、Ｔｈ１細胞・Ｔｈ２細胞の産生するサイトカインによって調節される免疫バランスをいう。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整することができる。また、本発明により、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが、通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して、Ｔｈ１細胞が弱まりＴｈ２細胞が優位になる方向に偏向する病態を示す疾患、例えば、アレルギー性疾患、潰瘍性大腸炎などの症状を抑制又は改善できる。
【実施例１】
【００２２】
実施例１では、初乳又は初乳由来組成物に、Ｔｈ２細胞によるＩＬ−４及びＩＬ−１０の分泌を抑制する作用があるかどうか、調べた。実験手順の概要は次の通りである。
【００２３】
まず、マウスに、初乳溶液を、１日４００μＬずつ、３ヶ月間、又は、６ヶ月間経口投与した。
【００２４】
初乳溶液は、初乳を限外濾過濃縮し、乾燥させて粉末状にした後、該粉末３５ｍｇを、殺菌済みの生理食塩水４００μＬで溶解して用いた（溶液の濃度は、８．８重量／容量％）。初乳は、ＮＵＭＩＣＯ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａ製の、分娩後４日間に作られた牛の初期乳で、１６．５重量％の免疫グロブリンＧを含有したものを用いた。
【００２５】
マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６系統の３週齢のメスを、日本ＳＬＣ株式会社から購入し、用いた。マウスは、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ−Ｆｒｅｅ）条件を維持したものを用いた。エサと水は、適宜与えた。
【００２６】
次に、初乳溶液を投与したマウスの小腸組織から、ｉ−ＩＥＬ（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ−ＩｎｔｒａＥｐｉｔｈｅｒｉａｌ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；腸管上皮細胞間リンパ球）を回収した。なお、ｉ−ＩＥＬには、腸管上皮細胞間に存在するＴｈ１細胞及びＴｈ２細胞なども含まれている。具体的な手順は次の通りである。
【００２７】
マウス小腸組織を摘出して５ｍｍ以下の小片にし、最終濃度１０容量％の不活性化Ｎｕ−ｓｅｒｕｍ（商品名、血清代替品）と１ｍＭＤＴＴ（ジチオトレイトール）を添加した１９９培地（ＧＩＢＣＯ社製）に入れ、３７℃、３０分、振盪培養した。次に、撹拌後、遠心分離し、沈殿物をＲＰＭＩ培地で溶解し、３７℃、３０分振盪培養した。次に、ガーゼで残渣をろ過・除去し、通過物を、Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈｅｒｍａｃｉａ製）を用いて６００×Ｇ、２５℃、２０分、４５％／６７％密度勾配遠心し、ｉ−ＩＥＬを回収した。
【００２８】
次に、抗ＣＤ−３モノクローナル抗体を固定した各ウエルに、ｉ−ＩＥＬ細胞液を２００μＬ（５×１０５ｃｅｌｌ／２００μＬ）入れ、３７℃、９６時間培養後、培養上清を採取した。具体的な手順は次の通りである。
【００２９】
平底の９６ウエルプレートに、抗ＣＤ−３モノクローナル抗体を入れ、４℃、オーバーナイトでインキュベートし、各ウエルの底面に固定した。次に、各ウエルに、ｉ−ＩＥＬ細胞液（ＲＰＭＩ培地で希釈したもの）を２００μＬ入れた（ｉ−ＩＥＬの細胞数は、約５×１０５ｃｅｌｌ／２００μＬになるように調製した）。次に、３７℃、９６時間培養し、培養上清を採取した。
【００３０】
各ウエルには抗ＣＤ−３モノクローナル抗体が固定されているため、ｉ−ＩＥＬのうち、ＣＤ−３の発現している細胞（Ｔ細胞）が、抗ＣＤ−３モノクローナル抗体と結合し、各ウエル内に固定される。そして、それらの細胞が、それぞれの機能に基づき、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０などを、培養液中に分泌する。
【００３１】
次に、ＥＬＩＳＡ法を用いて、培養上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０を検出した。結果を、図１に示す。
【００３２】
図１中、左上の棒グラフは培養上清のＩＦＮ−γ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、左下の棒グラフは培養上清のＩＬ−４濃度（ｐｇ／ｍＬ）を、右下の棒グラフは培養上清のＩＬ−１０濃度（ｐｇ／ｍＬ）を、それぞれ示している。
【００３３】
図１の各グラフにおいて、縦軸は、培養上清中の各サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０）の濃度、即ち、ウエル内に固定されたｉ−ＩＥＬが生成・分泌したサイトカイン量を示している。横軸の「３ｍｏ」は初乳溶液などの投与期間が三ヶ月であることを、「６ｍｏ」は六ヶ月であることを、それぞれ示している。
【００３４】
図１中、「ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ」は初乳溶液投与群であることを、「ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｌｋ」は成熟ミルク溶液投与群であることを、「ｓａｌｉｎｅ」は生理食塩水投与群であることを示す。「ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｌｋ」及び「ｓａｌｉｎｅ」は対照群である。対照群では、生理食塩水又は成熟ミルク溶液を初乳溶液の代わりに用いて、同様の実験を行った。成熟ミルク溶液は、初乳溶液と同様の手順で作製した。成熟ミルクは、ＤＭＶ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（オランダ）製のものを用いた。
【００３５】
図１の左上の棒グラフが示すとおり、ＩＦＮ−γ量については、初乳溶液投与群と生理食塩水投与群又は成熟ミルク投与群とで、有意な差は見られなかった。一方、ＩＬ−４量とＩＬ−１０量については、図１の左下及び右下の棒グラフが示すとおり、初乳溶液投与群は、生理食塩水投与群又は成熟ミルク投与群と比較して、有意に低下した。
【００３６】
上記の通り、Ｔｈ１細胞はＩＦＮ−γを、Ｔｈ２細胞はＩＬ−４、ＩＬ−１０を、それぞれ分泌し、また、ＩＬ−４、ＩＬ−１０はＴｈ１細胞を、ＩＦＮ−γはＴｈ２細胞を、それぞれ抑制することが分かっている。従って、この実験結果は、まず、初乳又は初乳由来組成物がＴｈ２細胞のＩＬ−４及びＩＬ−１０分泌を抑制する作用を持つことを示している。
【００３７】
加えて、この実験結果は、初乳又は初乳由来組成物が、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを、Ｔｈ１細胞を優位にしＴｈ２細胞を弱める方向に調整する作用を持つことを示唆している。即ち、初乳又は初乳由来組成物が、Ｔｈ２細胞のＩＬ−４、ＩＬ−１０分泌を抑制することにより、Ｔｈ１細胞の分化を促進し、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを、Ｔｈ１細胞が優位の方向に偏向させることができることを示唆している。
【００３８】
従って、初乳又は初乳由来組成物は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが、通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して、Ｔｈ１細胞が弱まりＴｈ２細胞が優位になる方向に偏向する病態を示す疾患（例えば、アレルギー性疾患、潰瘍性大腸炎など）の症状を抑制又は改善する作用があることを示唆している。
【実施例２】
【００３９】
実施例２では、アレルギー感作成立時における、初乳又は初乳由来組成物の抗アレルギー作用について、検討した。実験手順の概要は次の通りである。
【００４０】
はじめに、実験に用いるマウスを準備した。
まず、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス（メス、３週齢、日本ＳＬＣ株式会社より購入）を、数日間、馴化した後、初乳粉末投与群（Ｃｏｌ）、常乳粉末投与群（ＣＭ）、基本食投与群（ＢＳ）、の三群に分けた。各群は５匹ずつとした。
初乳粉末投与群には、ＡＩＮ９３Ｇ組成の飼料（市販の精製粉末飼料、「ＡＩＮ」はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎの略、以下同じ）に初乳粉末を１０重量％添加した初乳添加飼料を、常乳粉末投与群には、ＡＩＮ９３Ｇ組成の飼料に常乳粉末を１０重量％添加した常乳添加飼料を、基本食投与群には、ＡＩＮ９３Ｇ組成の基本飼料を、それぞれ与えた。各飼料は、実験終了まで与え、また、その飼料及び水は、マウスが常時摂取できるようにケージ内にセットした。
【００４１】
続いて、各群のマウスに、アレルゲンを投与することにより、アレルゲン感作した。アレルゲンにはＯＶＡ（卵白アルブミン）を用いた。
具体的には、試験食投与開始から２８日後、各マウスに、ＯＶＡ／ＣＦＡを腹腔内投与し、さらに、その７日後（試験食投与開始から３５日後）に、ＯＶＡ／ＩＦＡを腹腔内投与した。
ここで、「ＣＦＡ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）」は完全フロイントアジュバントを、「ＩＦＡ（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）」は不完全フロイントアジュバントを、それぞれ示す。
ＯＶＡ／ＣＦＡは、ＯＶＡ１００μｇ、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）１００μＬ、ＣＦＡ１００μＬの組成で調製した。ＯＶＡ／ＩＦＡは、ＯＶＡ１００μｇ、ＰＢＳ１００μＬ、ＩＦＡ１００μＬの組成で調製した。
【００４２】
続いて、最初のアレルゲン投与から２１日後（試験食投与開始から４９日後）、アレルゲン感作マウスから脾臓を採取した。採取した脾臓は、アレルゲン特異的サイトカイン産生量の分析に用いた。具体的な手順は次の通りである。
まず、採取した脾臓をすりつぶし、溶血処理を行った。次に、ナイロンウールに通し、Ｔ細胞が豊富に存在する画分を回収した。
次に、９６穴培養プレートに、回収したＴ細胞と抗原提示細胞（細胞数５×１０５／ｗｅｌｌ）とを入れ、ＯＶＡを１００μｇ／ｗｅｌｌを添加した後、４８時間培養した。抗原提示細胞には、本実験で用いたマウスと同系統のナイーブマウス（アレルゲン感作を受けていないマウス）から脾臓を採取し、マイトマイシン処理したものを用いた（後述の実施例においても同じ）。なお、前記手順において回収したＴ細胞は、アレルゲン感作を受けたマウス由来であるため、アレルゲンと抗原提示細胞の存在下で培養することにより、アレルゲン特異的にサイトカインを分泌する。
次に、培養上清中に存在するサイトカイン（アレルゲンの添加により、アレルゲン応答性Ｔ細胞から分泌されたサイトカイン）を、ＥＬＩＳＡ法により定量した。本実験で定量したサイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３の三種類である。
【００４３】
結果を、図２に示す。
図２は、マウス脾臓由来のアレルゲン応答性Ｔ細胞から分泌されたサイトカイン産生量を示すグラフ、である。
図中、左上のグラフはＩＦＮ−γの定量結果、右上のグラフはＩＬ−４の定量結果、左下のグラフはＩＬ−１３の定量結果、である。各グラフの縦軸は各サイトカインの産生量（単位はｐｇ／ｍｌ）を、「ＯＶＡ（−）」及び「ＯＶＡ（＋）」はのアレルゲン応答性Ｔ細胞の培養時にＯＶＡを添加したかどうかを、「Ｃｏｌ」は初乳投与群の結果を、「ＣＭ」は常乳投与群の結果を、「ＢＳ」は基本食投与群の結果を、それぞれ示す。
【００４４】
図２に示す通り、アレルゲン感作マウスから採取した脾臓由来Ｔ細胞をアレルゲン存在下で培養した場合、初乳投与群では、アレルゲン応答性Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生量が有意に高かった。また、初乳投与群では、アレルゲン応答性Ｔ細胞のＩＬ−４産生量及びＩＬ−１３産生量が、基本食投与群と比較して、低くなる傾向が見られた。
【００４５】
上述の通り、ＩＦＮ−γは、Ｔｈ１細胞から産生され、Ｔｈ２細胞を抑制するサイトカインであり、ＩＬ−４及びＩＬ−１３は、Ｔｈ２細胞から産生され、Ｔｈ１細胞を抑制するサイトカインである。
従って、この実験結果は、初乳又は初乳由来組成物を投与することにより、アレルギー感作時におけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスの偏向（Ｔｈ２細胞優位の方向への偏向）を、緩和できることを示唆する。
即ち、この実験結果は、初乳又は初乳由来組成物が、アレルギー感作成立を抑制する方向に作用することを示唆する。
【実施例３】
【００４６】
実施例３では、アレルギー発症時（２次応答時）における、初乳又は初乳由来組成物の抗アレルギー作用について、検討した。実験手順の概要は次の通りである。
【００４７】
はじめに、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス（メス、３週齢、日本ＳＬＣ株式会社より購入）を、数日間、馴化した後、初乳粉末投与群（Ｃｏｌ）と基本食投与群（ＢＳ）の二群に分け、それぞれ、初乳添加飼料、基本食を与えて飼育した。飼料の調製及び飼育方法は、実施例２と同様に行った。なお、本実験では、各群は１０匹ずつとした。
【００４８】
続いて、各群のマウスに、アレルゲンを投与することにより、アレルゲン感作した。アレルゲンには、実施例２と同様、ＯＶＡ（卵白アルブミン）を用いた。
具体的には、試験食投与開始から２８日後、各マウスに、ＯＶＡ／ＣＦＡを腹腔内投与し、さらに、その７日後（試験食投与開始から３５日後）に、ＯＶＡ／ＩＦＡを腹腔内投与した。
【００４９】
続いて、最初のアレルゲン投与から２１日目より７日間（試験開始から４９日〜５６日）、感作マウスにアレルゲン刺激を再付加し、アレルギーを発症させた（２次応答）。
アレルゲン刺激は、ＯＶＡをＰＢＳ（リン酸緩衝液）に１容量％添加し、その溶液を２０μＬ経鼻投与することにより行った。なお、対照では、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）を２０μＬ経鼻投与した。
【００５０】
そして、アレルゲン刺激再付加開始から７日目（試験開始から５６日目）に、経鼻投与直後の１０分間における、くしゃみの回数を計測した。
【００５１】
また、その次の日（試験開始から５７日目）に、頚部リンパ節を採取した。採取した頚部リンパ節は、アレルゲン特異的サイトカイン産生量の分析に用いた。具体的な手順は実施例２とほぼ同様である。
即ち、まず、ナイロンウールに通し、Ｔ細胞が豊富に存在する画分を回収し、次に、９６穴培養プレートに、回収したＴ細胞と抗原提示細胞とを入れ、ＯＶＡを１００μｇ／ｗｅｌｌを添加した後、４８時間培養し、次に、アレルゲン応答性Ｔ細胞によるサイトカイン産生量を、ＥＬＩＳＡ法により定量した。本実験で定量したサイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３の三種類である。
【００５２】
結果を、図３及び図４に示す。
図３は、マウス頚部リンパ節由来のアレルゲン応答性Ｔ細胞から分泌されたサイトカイン産生量を示すグラフ、図４は、アレルゲン経鼻投与後のくしゃみの回数を示すグラフ、である。
図３中、左上のグラフはＩＦＮ−γの定量結果、右上のグラフはＩＬ−４の定量結果、左下のグラフはＩＬ−１３の定量結果、である。図中、各グラフの縦軸はサイトカイン産生量（単位はｐｇ／ｍｌ）を、「Ｃｏｌ」は初乳投与群の結果を、「ＢＳ」は基本食投与群の結果を、それぞれ示す。各グラフ中、「ｉ．ｎ． ｃｈａｌｌｅｎｇｅ（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）」の項目は、アレルゲン感作マウスにアレルゲン刺激を再付加したかどうかを示し、「−」はＰＢＳを経鼻投与した場合（対照）を、「＋」はＯＶＡ（アレルゲン）を経鼻投与した場合を、それぞれ示す。各グラフ中、「ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ」の項目は、アレルゲン応答性Ｔ細胞の培養時にＯＶＡを添加したかどうかを示し、「ＯＶＡ（−）」はＯＶＡを添加せずに培養した場合（対照）を、「ＯＶＡ（＋）」はＯＶＡを添加して培養した場合を、それぞれ示す。
図４中、グラフの縦軸はくしゃみの回数を、「Ｃｏｌ」は初乳投与群の結果を、「ＢＳ」は基本食投与群の結果を、それぞれ示す。また、「ＰＢＳ」はＰＢＳによる経鼻投与を行った場合（対照）の結果を、「ＯＶＡ」はＯＶＡによる経鼻投与を行った場合の結果を、それぞれ示す。
【００５３】
図３に示す通り、感作マウスにアレルゲン刺激を再付加した場合（２次応答時）において、初乳投与群（Ｃｏｌ）では基本食投与群（ＢＳ）と比較して、ＩＬ−１３の産生量が有意に抑制された（右下のグラフ中、右から二番目のバーを参照）。また、初乳投与群（Ｃｏｌ）では基本食投与群（ＢＳ）と比較して、ＩＬ−４産生量の抑制傾向がみられ（右上のグラフ中、右から二番目のバーを参照）、ＩＦＮ−γ産生量の増加傾向がみられた（左上のグラフ中、右から二番目のバーを参照）。
【００５４】
また、図４に示す通り、感作マウスにアレルゲン刺激を再付加した場合（２次応答時）において、初乳投与群（Ｃｏｌ）では基本食投与群（ＢＳ）と比較して、くしゃみ回数の減少する傾向がみられた。
【００５５】
以上の結果は、初乳又は初乳由来組成物を投与することにより、アレルギー発症時（２次応答時）におけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスの偏向（Ｔｈ２細胞優位の方向への偏向）を、緩和できることを示唆する。
即ち、この実験結果は、初乳又は初乳由来組成物が、アレルギー症状を緩和する方向に作用することを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、医薬品、特定保健用食品、飲食物、飲食品添加物などに利用できる可能性がある。本発明に係る初乳又は初乳由来組成物を含有する医薬組成物及び飲食物は、医薬品、食品、飲料品などとして、生産・販売できる可能性がある。Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する方法及びアレルギー抑制方法は、健康増進サービス業などでの適用可能性がある。
その他、例えば、初乳又は初乳由来組成物を日常的に摂取して体質改善を行うことにより、アレルギー感作を抑制できる可能性があり、また、アレルギーが発症した際にも、その症状を緩和できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】実施例１において、初乳を投与したマウスの、ｉ−ＩＥＬから分泌されたサイトカイン量を示すグラフ。
【図２】実施例２において、マウス脾臓由来のアレルゲン応答性Ｔ細胞から分泌されたサイトカイン産生量を示すグラフ。
【図３】実施例３において、マウス頚部リンパ節由来のアレルゲン応答性Ｔ細胞から分泌されたサイトカイン産生量を示すグラフ。
【図４】実施例３において、アレルゲン経鼻投与後のくしゃみの回数を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する初乳又は初乳由来組成物、抗アレルギー剤である初乳又は初乳由来組成物、潰瘍性大腸炎治療剤である初乳又は初乳由来組成物、及び、前記初乳又は初乳由来組成物を少なくとも含有する医薬組成物及び飲食物、並びに、初乳又は初乳由来組成物を用いた、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス調整方法、アレルギー抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの偏向が、アレルギー性疾患発症の重要な要因となっていることが明らかになりつつある。
【０００３】
リンパ球の一種であるヘルパーＴ細胞は、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞に分類される。Ｔｈ１細胞は、細菌・ウイルスなどの異物を破壊するなど、細胞性免疫に関与し、また、ＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）、ＩＬ−２（インターロイキン２）などのサイトカインを分泌する。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３などのサイトカインを分泌してＢ細胞の抗体産生を促進するなど、体液性免疫に関与している。
【０００４】
Ｔｈ１細胞の分泌するサイトカイン（ＩＦＮ−γなど）はＴｈ２細胞を抑制し、Ｔｈ２細胞の分泌するサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３など）はＴｈ１細胞を抑制する。従って、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞のいずれかが優位になり、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが偏向することは、さまざまな免疫疾患の原因となる。Ｔｈ１細胞が通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して優位な場合は、炎症性疾患や自己免疫性疾患を発症し、Ｔｈ２細胞が通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して優位な場合は、生体防御能が低下したり、アレルギー疾患や潰瘍性大腸炎を発症したりすることが知られている。
【０００５】
アレルギー性疾患の具体的な発症機序は、概ね次のとおりであると考えられている。通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して、Ｔｈ２細胞がＴｈ１細胞よりも優位になると、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮ−γなどの分泌が抑制されるため、Ｔｈ２細胞の活性は増強され、Ｔｈ２細胞からＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３などのサイトカインが過剰に分泌される。ＩＬ−４及びＩＬ−１３は、Ｂ細胞のＩｇＥ産生を促進し、ＩＬ−５は、好酸球の分化を促進する。そして、ＩｇＥの過剰産生と好酸球の過剰亢進は、アレルギー反応を惹起する。また、Ｔｈ２細胞から過剰に分泌されたサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３など）によりＴｈ１細胞の分化がさらに抑制されるため、Ｔｈ２細胞の分化がさらに促進され、アレルギー反応が増強される（非特許文献１参照）。
【０００６】
特許文献１〜３は、抗アレルギー疾患に関連する先行文献である。特許文献１は、牛乳アレルギーの原因物質を酵素的に分解した抗アレルギー栄養組成物について、特許文献２は、酸乳ホエー（乳清）を用いた抗アレルギー剤について、特許文献３は、タンパク質加水分解物調合乳によるアレルギー予防方法について、それぞれ記載されている。
【特許文献１】特開平８−２１４８３６号公報
【特許文献２】特開２０００−２３９１７５号公報
【特許文献３】特表平１１−５１０７９１号公報
【非特許文献１】東京化学同人発行、「免疫学辞典 第２版」、Ｐ４１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の通り、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの偏向が、アレルギー性疾患発症の重要な要因となっている。そこで、本発明は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整すること、及び、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが、通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して、Ｔｈ１細胞が弱まりＴｈ２細胞が優位になる方向に偏向する病態を示す疾患、例えば、アレルギー性疾患、潰瘍性大腸炎などの症状を抑制又は改善することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らの研究の結果、初乳又は初乳由来組成物には、Ｔｈ２細胞によるＩＬ−４及びＩＬ−１０の分泌を抑制する作用があることが明らかになった。また、初乳又は初乳由来組成物を用いることにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを、Ｔｈ１細胞を優位にしＴｈ２細胞を弱める方向に調整できることが明らかになった。
【０００９】
そこで、本発明では、まず、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する初乳又は初乳由来組成物、及び、初乳又は初乳由来組成物を用いた、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する方法、を提供する。
【００１０】
また、本発明では、抗アレルギー剤である初乳又は初乳由来組成物、潰瘍性大腸炎治療剤である初乳又は初乳由来組成物、及び、初乳又は初乳由来組成物を用いたアレルギー抑制方法、を提供する。
【００１１】
前記の通り、本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを、Ｔｈ１細胞を優位にしＴｈ２細胞を弱める方向に調整できるため、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが、Ｔｈ１細胞が弱まりＴｈ２細胞が優位になる方向に偏向する病態を示す疾患、例えば、アレルギー性疾患、潰瘍性大腸炎などに適用できる。
【００１２】
例えば、アレルギー性疾患の場合、前記の通り、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが、通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して、Ｔｈ２細胞優位の方向に偏向することが、発症の主な原因となっている。本発明に係る初乳又は初乳由来組成物を用いるにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを、Ｔｈ２細胞を弱める方向に調整できるため、アレルギー症状を抑制又は改善することができる。
【００１３】
また、例えば、潰瘍性大腸炎の場合も、腸管内におけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスが、通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して、Ｔｈ２細胞優位の方向に偏向することが、発症の主な原因となっている。本発明に係る初乳又は初乳由来組成物を用いるにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを、Ｔｈ２細胞を弱める方向に調整できるため、潰瘍性大腸炎の症状を抑制又は改善することができる。
【００１４】
なお、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの偏向は、アレルギー性疾患に共通な発症メカニズムであるため、本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、特定のアレルギー性疾患だけでなく、アレルギー性疾患全般に広く適用可能であると推定できる。
【００１５】
具体的には、本発明を適用できるアレルギー疾患として、例えば、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、花粉症、蕁麻疹、ダニ・チリアレルギー、食物アレルギー、薬物アレルギー、アトピー性皮膚炎、などを想定できる。
【００１６】
加えて、本発明における抗アレルギー作用は、初乳又は初乳組成物自体を用いている点で、従来の抗アレルギー性の乳組成物などとは異なった特質を持つ。
従来、牛乳をはじめ乳製品はアレルギーの原因となる場合があるため、乳組成物自体を、アレルギー症状を抑制又は改善する用途で用いることはなかった。即ち、従来の抗アレルギー性の乳組成物は、乳中のアレルギー原因物質を除去・分解などしたものに限られていた。
それに対し、本発明は、初乳又は初乳由来組成物自体に、アレルギー症状を抑制又は改善する作用があることを新規に見い出した点で、従来の抗アレルギー性の乳組成物などとは異なる。
【００１７】
その他、本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、天然物由来であり、化学合成物を用いた医薬組成物・飲食物などと比較して、安全性が高いという有利性もある。
【００１８】
なお、本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、医薬組成物（錠剤、液剤、顆粒剤、カプセル剤など）として用いたり、医薬組成物に含有させたりすることができる。本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、飲食物（食品、菓子、ガム、飲料、ジュース、サプリメントなど）として用いたり、飲食物に含有させたりすることもできる。
【００１９】
本発明において、「初乳」は、哺乳類の分娩後に分泌される乳をいい、乳タンパク質、ミネラル、新生児に受動免疫を与える抗体などに富む。最も好適なものは、分娩後一週間以内に分泌された牛の初乳である。本発明において、「初乳由来組成物」は、初乳を濃縮・乾燥した液状物・粉状物など、初乳から作製される組成物を広く包含する。
【００２０】
本発明において、「Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス」とは、Ｔｈ１細胞・Ｔｈ２細胞の産生するサイトカインによって調節される免疫バランスをいう。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整することができる。また、本発明により、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが、通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して、Ｔｈ１細胞が弱まりＴｈ２細胞が優位になる方向に偏向する病態を示す疾患、例えば、アレルギー性疾患、潰瘍性大腸炎などの症状を抑制又は改善できる。
【実施例１】
【００２２】
実施例１では、初乳又は初乳由来組成物に、Ｔｈ２細胞によるＩＬ−４及びＩＬ−１０の分泌を抑制する作用があるかどうか、調べた。実験手順の概要は次の通りである。
【００２３】
まず、マウスに、初乳溶液を、１日４００μＬずつ、３ヶ月間、又は、６ヶ月間経口投与した。
【００２４】
初乳溶液は、初乳を限外濾過濃縮し、乾燥させて粉末状にした後、該粉末３５ｍｇを、殺菌済みの生理食塩水４００μＬで溶解して用いた（溶液の濃度は、８．８重量／容量％）。初乳は、ＮＵＭＩＣＯ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａ製の、分娩後４日間に作られた牛の初期乳で、１６．５重量％の免疫グロブリンＧを含有したものを用いた。
【００２５】
マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６系統の３週齢のメスを、日本ＳＬＣ株式会社から購入し、用いた。マウスは、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ−Ｆｒｅｅ）条件を維持したものを用いた。エサと水は、適宜与えた。
【００２６】
次に、初乳溶液を投与したマウスの小腸組織から、ｉ−ＩＥＬ（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ−ＩｎｔｒａＥｐｉｔｈｅｒｉａｌ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；腸管上皮細胞間リンパ球）を回収した。なお、ｉ−ＩＥＬには、腸管上皮細胞間に存在するＴｈ１細胞及びＴｈ２細胞なども含まれている。具体的な手順は次の通りである。
【００２７】
マウス小腸組織を摘出して５ｍｍ以下の小片にし、最終濃度１０容量％の不活性化Ｎｕ−ｓｅｒｕｍ（商品名、血清代替品）と１ｍＭＤＴＴ（ジチオトレイトール）を添加した１９９培地（ＧＩＢＣＯ社製）に入れ、３７℃、３０分、振盪培養した。次に、撹拌後、遠心分離し、沈殿物をＲＰＭＩ培地で溶解し、３７℃、３０分振盪培養した。次に、ガーゼで残渣をろ過・除去し、通過物を、Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈｅｒｍａｃｉａ製）を用いて６００×Ｇ、２５℃、２０分、４５％／６７％密度勾配遠心し、ｉ−ＩＥＬを回収した。
【００２８】
次に、抗ＣＤ−３モノクローナル抗体を固定した各ウエルに、ｉ−ＩＥＬ細胞液を２００μＬ（５×１０５ｃｅｌｌ／２００μＬ）入れ、３７℃、９６時間培養後、培養上清を採取した。具体的な手順は次の通りである。
【００２９】
平底の９６ウエルプレートに、抗ＣＤ−３モノクローナル抗体を入れ、４℃、オーバーナイトでインキュベートし、各ウエルの底面に固定した。次に、各ウエルに、ｉ−ＩＥＬ細胞液（ＲＰＭＩ培地で希釈したもの）を２００μＬ入れた（ｉ−ＩＥＬの細胞数は、約５×１０５ｃｅｌｌ／２００μＬになるように調製した）。次に、３７℃、９６時間培養し、培養上清を採取した。
【００３０】
各ウエルには抗ＣＤ−３モノクローナル抗体が固定されているため、ｉ−ＩＥＬのうち、ＣＤ−３の発現している細胞（Ｔ細胞）が、抗ＣＤ−３モノクローナル抗体と結合し、各ウエル内に固定される。そして、それらの細胞が、それぞれの機能に基づき、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０などを、培養液中に分泌する。
【００３１】
次に、ＥＬＩＳＡ法を用いて、培養上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０を検出した。結果を、図１に示す。
【００３２】
図１中、左上の棒グラフは培養上清のＩＦＮ−γ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、左下の棒グラフは培養上清のＩＬ−４濃度（ｐｇ／ｍＬ）を、右下の棒グラフは培養上清のＩＬ−１０濃度（ｐｇ／ｍＬ）を、それぞれ示している。
【００３３】
図１の各グラフにおいて、縦軸は、培養上清中の各サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０）の濃度、即ち、ウエル内に固定されたｉ−ＩＥＬが生成・分泌したサイトカイン量を示している。横軸の「３ｍｏ」は初乳溶液などの投与期間が三ヶ月であることを、「６ｍｏ」は六ヶ月であることを、それぞれ示している。
【００３４】
図１中、「ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ」は初乳溶液投与群であることを、「ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｌｋ」は成熟ミルク溶液投与群であることを、「ｓａｌｉｎｅ」は生理食塩水投与群であることを示す。「ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｌｋ」及び「ｓａｌｉｎｅ」は対照群である。対照群では、生理食塩水又は成熟ミルク溶液を初乳溶液の代わりに用いて、同様の実験を行った。成熟ミルク溶液は、初乳溶液と同様の手順で作製した。成熟ミルクは、ＤＭＶ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（オランダ）製のものを用いた。
【００３５】
図１の左上の棒グラフが示すとおり、ＩＦＮ−γ量については、初乳溶液投与群と生理食塩水投与群又は成熟ミルク投与群とで、有意な差は見られなかった。一方、ＩＬ−４量とＩＬ−１０量については、図１の左下及び右下の棒グラフが示すとおり、初乳溶液投与群は、生理食塩水投与群又は成熟ミルク投与群と比較して、有意に低下した。
【００３６】
上記の通り、Ｔｈ１細胞はＩＦＮ−γを、Ｔｈ２細胞はＩＬ−４、ＩＬ−１０を、それぞれ分泌し、また、ＩＬ−４、ＩＬ−１０はＴｈ１細胞を、ＩＦＮ−γはＴｈ２細胞を、それぞれ抑制することが分かっている。従って、この実験結果は、まず、初乳又は初乳由来組成物がＴｈ２細胞のＩＬ−４及びＩＬ−１０分泌を抑制する作用を持つことを示している。
【００３７】
加えて、この実験結果は、初乳又は初乳由来組成物が、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを、Ｔｈ１細胞を優位にしＴｈ２細胞を弱める方向に調整する作用を持つことを示唆している。即ち、初乳又は初乳由来組成物が、Ｔｈ２細胞のＩＬ−４、ＩＬ−１０分泌を抑制することにより、Ｔｈ１細胞の分化を促進し、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを、Ｔｈ１細胞が優位の方向に偏向させることができることを示唆している。
【００３８】
従って、初乳又は初乳由来組成物は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが、通常のＴｈ１／Ｔｈ２バランスと比較して、Ｔｈ１細胞が弱まりＴｈ２細胞が優位になる方向に偏向する病態を示す疾患（例えば、アレルギー性疾患、潰瘍性大腸炎など）の症状を抑制又は改善する作用があることを示唆している。
【実施例２】
【００３９】
実施例２では、アレルギー感作成立時における、初乳又は初乳由来組成物の抗アレルギー作用について、検討した。実験手順の概要は次の通りである。
【００４０】
はじめに、実験に用いるマウスを準備した。
まず、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス（メス、３週齢、日本ＳＬＣ株式会社より購入）を、数日間、馴化した後、初乳粉末投与群（Ｃｏｌ）、常乳粉末投与群（ＣＭ）、基本食投与群（ＢＳ）、の三群に分けた。各群は５匹ずつとした。
初乳粉末投与群には、ＡＩＮ９３Ｇ組成の飼料（市販の精製粉末飼料、「ＡＩＮ」はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎの略、以下同じ）に初乳粉末を１０重量％添加した初乳添加飼料を、常乳粉末投与群には、ＡＩＮ９３Ｇ組成の飼料に常乳粉末を１０重量％添加した常乳添加飼料を、基本食投与群には、ＡＩＮ９３Ｇ組成の基本飼料を、それぞれ与えた。各飼料は、実験終了まで与え、また、その飼料及び水は、マウスが常時摂取できるようにケージ内にセットした。
【００４１】
続いて、各群のマウスに、アレルゲンを投与することにより、アレルゲン感作した。アレルゲンにはＯＶＡ（卵白アルブミン）を用いた。
具体的には、試験食投与開始から２８日後、各マウスに、ＯＶＡ／ＣＦＡを腹腔内投与し、さらに、その７日後（試験食投与開始から３５日後）に、ＯＶＡ／ＩＦＡを腹腔内投与した。
ここで、「ＣＦＡ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）」は完全フロイントアジュバントを、「ＩＦＡ（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）」は不完全フロイントアジュバントを、それぞれ示す。
ＯＶＡ／ＣＦＡは、ＯＶＡ１００μｇ、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）１００μＬ、ＣＦＡ１００μＬの組成で調製した。ＯＶＡ／ＩＦＡは、ＯＶＡ１００μｇ、ＰＢＳ１００μＬ、ＩＦＡ１００μＬの組成で調製した。
【００４２】
続いて、最初のアレルゲン投与から２１日後（試験食投与開始から４９日後）、アレルゲン感作マウスから脾臓を採取した。採取した脾臓は、アレルゲン特異的サイトカイン産生量の分析に用いた。具体的な手順は次の通りである。
まず、採取した脾臓をすりつぶし、溶血処理を行った。次に、ナイロンウールに通し、Ｔ細胞が豊富に存在する画分を回収した。
次に、９６穴培養プレートに、回収したＴ細胞と抗原提示細胞（細胞数５×１０５／ｗｅｌｌ）とを入れ、ＯＶＡを１００μｇ／ｗｅｌｌを添加した後、４８時間培養した。抗原提示細胞には、本実験で用いたマウスと同系統のナイーブマウス（アレルゲン感作を受けていないマウス）から脾臓を採取し、マイトマイシン処理したものを用いた（後述の実施例においても同じ）。なお、前記手順において回収したＴ細胞は、アレルゲン感作を受けたマウス由来であるため、アレルゲンと抗原提示細胞の存在下で培養することにより、アレルゲン特異的にサイトカインを分泌する。
次に、培養上清中に存在するサイトカイン（アレルゲンの添加により、アレルゲン応答性Ｔ細胞から分泌されたサイトカイン）を、ＥＬＩＳＡ法により定量した。本実験で定量したサイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３の三種類である。
【００４３】
結果を、図２に示す。
図２は、マウス脾臓由来のアレルゲン応答性Ｔ細胞から分泌されたサイトカイン産生量を示すグラフ、である。
図中、左上のグラフはＩＦＮ−γの定量結果、右上のグラフはＩＬ−４の定量結果、左下のグラフはＩＬ−１３の定量結果、である。各グラフの縦軸は各サイトカインの産生量（単位はｐｇ／ｍｌ）を、「ＯＶＡ（−）」及び「ＯＶＡ（＋）」はのアレルゲン応答性Ｔ細胞の培養時にＯＶＡを添加したかどうかを、「Ｃｏｌ」は初乳投与群の結果を、「ＣＭ」は常乳投与群の結果を、「ＢＳ」は基本食投与群の結果を、それぞれ示す。
【００４４】
図２に示す通り、アレルゲン感作マウスから採取した脾臓由来Ｔ細胞をアレルゲン存在下で培養した場合、初乳投与群では、アレルゲン応答性Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生量が有意に高かった。また、初乳投与群では、アレルゲン応答性Ｔ細胞のＩＬ−４産生量及びＩＬ−１３産生量が、基本食投与群と比較して、低くなる傾向が見られた。
【００４５】
上述の通り、ＩＦＮ−γは、Ｔｈ１細胞から産生され、Ｔｈ２細胞を抑制するサイトカインであり、ＩＬ−４及びＩＬ−１３は、Ｔｈ２細胞から産生され、Ｔｈ１細胞を抑制するサイトカインである。
従って、この実験結果は、初乳又は初乳由来組成物を投与することにより、アレルギー感作時におけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスの偏向（Ｔｈ２細胞優位の方向への偏向）を、緩和できることを示唆する。
即ち、この実験結果は、初乳又は初乳由来組成物が、アレルギー感作成立を抑制する方向に作用することを示唆する。
【実施例３】
【００４６】
実施例３では、アレルギー発症時（２次応答時）における、初乳又は初乳由来組成物の抗アレルギー作用について、検討した。実験手順の概要は次の通りである。
【００４７】
はじめに、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウス（メス、３週齢、日本ＳＬＣ株式会社より購入）を、数日間、馴化した後、初乳粉末投与群（Ｃｏｌ）と基本食投与群（ＢＳ）の二群に分け、それぞれ、初乳添加飼料、基本食を与えて飼育した。飼料の調製及び飼育方法は、実施例２と同様に行った。なお、本実験では、各群は１０匹ずつとした。
【００４８】
続いて、各群のマウスに、アレルゲンを投与することにより、アレルゲン感作した。アレルゲンには、実施例２と同様、ＯＶＡ（卵白アルブミン）を用いた。
具体的には、試験食投与開始から２８日後、各マウスに、ＯＶＡ／ＣＦＡを腹腔内投与し、さらに、その７日後（試験食投与開始から３５日後）に、ＯＶＡ／ＩＦＡを腹腔内投与した。
【００４９】
続いて、最初のアレルゲン投与から２１日目より７日間（試験開始から４９日〜５６日）、感作マウスにアレルゲン刺激を再付加し、アレルギーを発症させた（２次応答）。
アレルゲン刺激は、ＯＶＡをＰＢＳ（リン酸緩衝液）に１容量％添加し、その溶液を２０μＬ経鼻投与することにより行った。なお、対照では、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）を２０μＬ経鼻投与した。
【００５０】
そして、アレルゲン刺激再付加開始から７日目（試験開始から５６日目）に、経鼻投与直後の１０分間における、くしゃみの回数を計測した。
【００５１】
また、その次の日（試験開始から５７日目）に、頚部リンパ節を採取した。採取した頚部リンパ節は、アレルゲン特異的サイトカイン産生量の分析に用いた。具体的な手順は実施例２とほぼ同様である。
即ち、まず、ナイロンウールに通し、Ｔ細胞が豊富に存在する画分を回収し、次に、９６穴培養プレートに、回収したＴ細胞と抗原提示細胞とを入れ、ＯＶＡを１００μｇ／ｗｅｌｌを添加した後、４８時間培養し、次に、アレルゲン応答性Ｔ細胞によるサイトカイン産生量を、ＥＬＩＳＡ法により定量した。本実験で定量したサイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３の三種類である。
【００５２】
結果を、図３及び図４に示す。
図３は、マウス頚部リンパ節由来のアレルゲン応答性Ｔ細胞から分泌されたサイトカイン産生量を示すグラフ、図４は、アレルゲン経鼻投与後のくしゃみの回数を示すグラフ、である。
図３中、左上のグラフはＩＦＮ−γの定量結果、右上のグラフはＩＬ−４の定量結果、左下のグラフはＩＬ−１３の定量結果、である。図中、各グラフの縦軸はサイトカイン産生量（単位はｐｇ／ｍｌ）を、「Ｃｏｌ」は初乳投与群の結果を、「ＢＳ」は基本食投与群の結果を、それぞれ示す。各グラフ中、「ｉ．ｎ． ｃｈａｌｌｅｎｇｅ（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）」の項目は、アレルゲン感作マウスにアレルゲン刺激を再付加したかどうかを示し、「−」はＰＢＳを経鼻投与した場合（対照）を、「＋」はＯＶＡ（アレルゲン）を経鼻投与した場合を、それぞれ示す。各グラフ中、「ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ」の項目は、アレルゲン応答性Ｔ細胞の培養時にＯＶＡを添加したかどうかを示し、「ＯＶＡ（−）」はＯＶＡを添加せずに培養した場合（対照）を、「ＯＶＡ（＋）」はＯＶＡを添加して培養した場合を、それぞれ示す。
図４中、グラフの縦軸はくしゃみの回数を、「Ｃｏｌ」は初乳投与群の結果を、「ＢＳ」は基本食投与群の結果を、それぞれ示す。また、「ＰＢＳ」はＰＢＳによる経鼻投与を行った場合（対照）の結果を、「ＯＶＡ」はＯＶＡによる経鼻投与を行った場合の結果を、それぞれ示す。
【００５３】
図３に示す通り、感作マウスにアレルゲン刺激を再付加した場合（２次応答時）において、初乳投与群（Ｃｏｌ）では基本食投与群（ＢＳ）と比較して、ＩＬ−１３の産生量が有意に抑制された（右下のグラフ中、右から二番目のバーを参照）。また、初乳投与群（Ｃｏｌ）では基本食投与群（ＢＳ）と比較して、ＩＬ−４産生量の抑制傾向がみられ（右上のグラフ中、右から二番目のバーを参照）、ＩＦＮ−γ産生量の増加傾向がみられた（左上のグラフ中、右から二番目のバーを参照）。
【００５４】
また、図４に示す通り、感作マウスにアレルゲン刺激を再付加した場合（２次応答時）において、初乳投与群（Ｃｏｌ）では基本食投与群（ＢＳ）と比較して、くしゃみ回数の減少する傾向がみられた。
【００５５】
以上の結果は、初乳又は初乳由来組成物を投与することにより、アレルギー発症時（２次応答時）におけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスの偏向（Ｔｈ２細胞優位の方向への偏向）を、緩和できることを示唆する。
即ち、この実験結果は、初乳又は初乳由来組成物が、アレルギー症状を緩和する方向に作用することを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明に係る初乳又は初乳由来組成物は、医薬品、特定保健用食品、飲食物、飲食品添加物などに利用できる可能性がある。本発明に係る初乳又は初乳由来組成物を含有する医薬組成物及び飲食物は、医薬品、食品、飲料品などとして、生産・販売できる可能性がある。Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する方法及びアレルギー抑制方法は、健康増進サービス業などでの適用可能性がある。
その他、例えば、初乳又は初乳由来組成物を日常的に摂取して体質改善を行うことにより、アレルギー感作を抑制できる可能性があり、また、アレルギーが発症した際にも、その症状を緩和できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】実施例１において、初乳を投与したマウスの、ｉ−ＩＥＬから分泌されたサイトカイン量を示すグラフ。
【図２】実施例２において、マウス脾臓由来のアレルゲン応答性Ｔ細胞から分泌されたサイトカイン産生量を示すグラフ。
【図３】実施例３において、マウス頚部リンパ節由来のアレルゲン応答性Ｔ細胞から分泌されたサイトカイン産生量を示すグラフ。
【図４】実施例３において、アレルゲン経鼻投与後のくしゃみの回数を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する初乳又は初乳由来組成物。
【請求項２】
抗アレルギー剤である初乳又は初乳由来組成物。
【請求項３】
潰瘍性大腸炎治療剤である初乳又は初乳由来組成物。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか一項記載の初乳又は初乳由来組成物を少なくとも含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
請求項１から請求項３のいずれか一項記載の初乳又は初乳由来組成物を少なくとも含有することを特徴とする飲食物。
【請求項６】
初乳又は初乳由来組成物を用いて、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する方法。
【請求項７】
初乳又は初乳由来組成物を用いたアレルギー抑制方法。
【請求項１】
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する初乳又は初乳由来組成物。
【請求項２】
抗アレルギー剤である初乳又は初乳由来組成物。
【請求項３】
潰瘍性大腸炎治療剤である初乳又は初乳由来組成物。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか一項記載の初乳又は初乳由来組成物を少なくとも含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
請求項１から請求項３のいずれか一項記載の初乳又は初乳由来組成物を少なくとも含有することを特徴とする飲食物。
【請求項６】
初乳又は初乳由来組成物を用いて、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する方法。
【請求項７】
初乳又は初乳由来組成物を用いたアレルギー抑制方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−９６７５２（Ｐ２００６−９６７５２Ａ）
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２４８９９４（Ｐ２００５−２４８９９４）
【出願日】平成１７年８月３０日（２００５．８．３０）
【出願人】（５９７０４０７８４）オルト株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月３０日（２００５．８．３０）
【出願人】（５９７０４０７８４）オルト株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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