向上したクロマトグラフィー媒体の製造方法および使用方法
【課題】向上したタンパク質結合容量および選択性を有するクロマトグラフィー精製に適したポリマー担体の製造および使用方法を提供する。
【解決手段】官能性モノマーの重合によって得たポリマーリガンドと、フリーラジカルグラフト化部位を有するポリマー担体とを用い、ポリマーリガンドをポリマー担体のフリーラジカル部位に共有結合させることにより吸着材材料を得る。ポリマーリガンドは、イオン交換基等の官能基を有する。ポリマー担体の体積平均粒子径は、０．５〜５００μｍである。
【解決手段】官能性モノマーの重合によって得たポリマーリガンドと、フリーラジカルグラフト化部位を有するポリマー担体とを用い、ポリマーリガンドをポリマー担体のフリーラジカル部位に共有結合させることにより吸着材材料を得る。ポリマーリガンドは、イオン交換基等の官能基を有する。ポリマー担体の体積平均粒子径は、０．５〜５００μｍである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は共有結合したポリマーリガンド鎖を有する単分散マクロポーラスポリマー媒体をフリーラジカル重合によって製造する向上した方法に関する。この媒体はクロマトグラフ精製に適用されることができ、向上したタンパク質結合容量、反応速度、及び選択性を有するポリマー担体、並びにこれを製造する方法および使用する方法をもたらしうる。
【背景技術】
【０００２】
生体から得られる治療用タンパク質は現在のヘルスケアにおいてますます重要な役割を果たしている。これらのタンパク質は従来の医薬品を超える多くの利点、例えば、疾病ターゲットに対して増大した特異性および有効性を提供する。哺乳類の免疫系は疾病の脅威を制御し除去するために広範囲のタンパク質を使用する。遺伝子及びタンパク質工学の出現は多くの「設計された」または組み替えタンパク質治療の開発を可能にしてきた。これら治療は単一のタンパク質、化学修飾タンパク質、タンパク質フラグメントまたはタンパク質複合体をベースにすることができる。クロマトグラフ分離はこれらバイオ医薬品の製造に広範囲に使用される。この産業界が成熟するにつれて、分離を向上させるための新たな／進歩した技術及び方法の実施は、これらの薬剤をより多くの患者により低コストで提供する能力を生物治療プロデューサーに提供するであろう。
【０００３】
タンパク質を精製するのに使用される一般的なクロマトグラフ方法には、特に、アフィニティー、バイオアフィニティー、イオン交換、逆相、疎水性相互作用、親水性相互作用、サイズ排除および混合モード（上記カテゴリーの組み合わせを備える樹脂）が挙げられる。これらの種類のクロマトグラフィー手順のそれぞれの適用および効率はクロマトグラフィーシステムの固定相（クロマトグラフィー媒体）と溶質分子と（それぞれ移動液相と相互作用する）の間の表面−表面相互作用の選択性に頼っている。広範囲の固定相クロマトグラフィー担体材料が市販されている。
【０００４】
不純物から生成物を成功裏に分離することの鍵は多くの場合、固定相、ベースマトリックス（化学組成および孔構造）、およびリガンド特性（リガンド種類、リガンド密度、孔構造、リガンド分布、リガンド長さおよび材料組成）、並びに移動相もしくは溶液特性（緩衝剤種類、ｐＨおよび導電率）の正しい組み合わせに頼っている。ベースマトリックスおよびリガンドの具体的な設計は、いくつかの鍵となる特性、例えば、タンパク質結合容量、プロセススループット、選択性、床透過性および化学的安定性によって特徴付けられうるクロマトグラフィー媒体を生じさせる。精製方法には、生成物を主に結合すること（結合および溶離）、不純物を主に結合すること（フロースルー）、および上記の組み合わせ（いわゆる、弱い分配など）が挙げられる。精製タンパク質製品をもたらす着実な分離を可能にし、かつ確実にするために、上記教示のクロマトグラフィー媒体特性を制御することがこれら技術の設計において重要である。
【０００５】
タンパク質分離は様々なポリマー担体またはベースマトリックス上で達成されうる。樹脂もしくはビーズ構造のための一般的な材料には、ポリサッカライド（アガロース、セルロース）、合成ポリマー（ポリスチレン、ポリメタクリラート、ポリビニルエーテル、およびポリアクリルアミド）、並びにセラミックス、例えば、シリカ、ジルコニアおよび制御された多孔質ガラスが挙げられる。これらの材料は典型的には約２００Å〜３，０００Åである「拡散（ｄｉｆｆｕｓｉｖｅ）孔」を介してタンパク質を主として吸着する。
【０００６】
膜およびモノリス材料もクロマトグラフィーのために、特にフロースルー用途において一般的に使用される。典型的な膜組成には合成ポリマー、例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリエーテルスルホン、ナイロンおよびポリサッカライド、例えば、セルロースが挙げられる。モノリスはポリスチレン、ポリサッカライド、ポリメタクリラート、並びに他の合成ポリマー、ポリサッカライドおよびセラミックスから開発されてきた。膜およびモノリスクロマトグラフィーは、これらの材料が同じ「コンベクティブ（ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ）孔」内にタンパク質を吸着する点でビーズとは異なり、このコンベクティブ孔は膜およびモノリス材料の透過性を制御する。典型的な膜およびモノリスコンベクティブ孔サイズは、約０．６μｍ〜約１０μｍの範囲である。これらの基材へのリガンド付加は様々な充分に開発された技術を通じて達成されうる。
【０００７】
タンパク質結合容量を向上させ樹脂選択性を改変するためのポリマーリガンド「テンタクルズ」または「エキステンダー」の使用は、ポリマーリガンドをベースマトリックス上に、例えば、ベースマトリックス表面から離れるように伸ばすグラフト化によって、結合させることを伴う。ポリマーリガンドエキステンダーは典型的にはより大きな結合容量および反応速度を作り出す、というのは、このエキステンダーはリガンド利用性を増大させるからであり、なぜなら、ポリマーリガンドに結合する標的分子が、ポリマー担体表面上のタンパク質の単層吸着を上回るからである。
【０００８】
タンパク質の分離などのためのクロマトグラフィーにおいて使用されるもののような、ポリマー担体上に表面エキステンダーを作り出すために、ポリマーエクステンダーをグラフト化する２つの標準的な方法論が開発されてきた：１）表面基を介して担体からモノマーをグラフト化する（からモノマーをグラフト化する）、および２）あらかじめ形成されたポリマーを活性化基を介して担体にグラフト化する（にポリマーをグラフト化する）。
【０００９】
ラジカル重合反応を用いてポリマー材料からモノマーをグラフト化することは充分に開発された技術である。一般に、この反応はポリマー表面材料から、または溶液中の開始剤から開始させられうる。
【００１０】
表面からのラジカル重合を開始させることは、反応環境、例えば、温度、放射線、金属酸化、または吸着した開始物質による開始などへの曝露を介した表面でのラジカル発生によって達成されうる。しかし、これら「からモノマーをグラフト化する」アプローチは、かなり制御された溶液条件、特別な装置を必要とし、および／または重合性リンカー、開始物質もしくは特別な官能基での前処理によるような何らかの方法で担体があらかじめ活性化されることを必要とするが、これはその実施を複雑にしかつ時間がかかるものにする。
【００１１】
多孔性材料からポリマーをグラフト化する一方法は米国特許第５４５３１８６号に開示されている。この先行技術はジヒドロキシル官能性を有するポリマー担体上にポリマーリガンドをグラフト化する方法を開示する。この先行技術は鎖長を制御し、かつレドックス重合の使用によってヒドロキシル基を含む担体にグラフト化する方法を開示する。Ｃｅ（ＩＶ）レドックス方法は不活性雰囲気下でのセリウム（ＩＶ）塩の使用を採用し、ポリマー担体表面からのポリマーリガンドをグラフト化する。混合物に添加されるモノマーおよびセリウム塩濃度の水準を制御することにより、ポリマーリガンド鎖長は制御される。
【００１２】
この先行技術はポリマー材料からポリマーをグラフト化する方法を開示し、その方法は特定の官能基でポリマー担体を前処理することを必要とする。全体的なポリマークロマトグラフ材料の得られる性能を維持しつつ、この追加の前処理工程がプロセスから除かれうる方法が必要とされる。
【００１３】
ポリマー担体材料表面へのポリマーリガンドの付加は向上したタンパク質結合容量、タンパク質結合速度およびタンパク質選択性における潜在的変化を提供する。しかし、タンパク質分離の要求がより厳しくなるにつれて、新たなポリマー構造を作り出すために新たな技術および方法を開発することがより重要になっている。よって、タンパク質分離に使用される様々なポリマー担体基材の向上したタンパク質結合特性およびタンパク質選択性を開発することが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５４５３１８６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
タンパク質分離に有用で、向上したタンパク質結合容量および樹脂選択性を有する新たなポリマー基材についての上記必要性に応えて、ポリマーリガンドをポリマー担体基材上にグラフト化するための新たな方法が開発された。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に従って、ポリマー担体が好適なフリーラジカルグラフト化部位を含み、さらにポリマーリガンドが１以上の共有結合によってポリマー担体の好適なフリーラジカルグラフト化部位に結合されている、ポリマー担体上に固定化されたポリマーリガンドを含むクロマトグラフィーのための吸着剤材料が提供される。
本発明の第２の形態においては、
（ｉ）好適なフリーラジカルグラフト化部位を含むポリマー担体を提供し；
（ｉｉ）官能性モノマーの重合によってポリマーリガンドを生じさせ；並びに
（ｉｉｉ）ポリマー担体とポリマーリガンドとの間の反応を開始させる：
ことを含み、
ポリマーリガンドはポリマー担体上の好適なフリーラジカルグラフト化部位と反応する、クロマトグラフィーのための吸着剤材料を製造する方法が提供される。
【００１７】
本発明の第３の形態においては、
（ｉ）混合物を提供し、並びに
（ｉｉ）ポリマー担体上に固定化されたポリマーリガンドを含むクロマトグラフィーのための吸着剤材料と前記混合物とを接触させる：
ことを含む、混合物から化合物を分離する方法であって、
ポリマー担体が好適なフリーラジカルグラフト化部位を含み、さらにポリマーリガンドは１以上の共有結合によってポリマー担体の好適なフリーラジカルグラフト化部位に結合されている、
混合物から化合物を分離する方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書において教示される全ての範囲は、その中に包含されるすべての部分的な範囲を網羅することが理解される。例えば、「１〜１０」の範囲は、最小値１および最大値１０の間の何らかおよび全ての部分的な範囲（すなわち、１以上の最小値および１０以下の最大値を有する何らかおよび全ての部分的な範囲、例えば、５．５〜１０）（並びに、最小値１および最大値１０を含む）を含む。
【００１９】
本明細書において使用される場合、用語「好ましくは」、「より好ましくは」および「最も好ましくは」は、優れているとみなされるモードを示唆することを意図するものではなく、より広い範囲またはグループの好適なより狭い範囲を具体化することを意味する。
【００２０】
先行技術のプロセスと比較して、本発明はポリマー担体前処理またはポリマー担体への重合性リンカーの添加を必要としない。官能性モノマー並びに／または連鎖移動剤および開始剤の重合によって生じるポリマーリガンドは、ポリマー担体および／またはポリマー担体骨格上の好適なフリーラジカルグラフト化部位と反応し、共有結合されることとなるであろう。開始剤は溶液中でモノマーの重合を開始させるであろうし、このモノマーはポリマー担体の好適なフリーラジカルグラフト化部位で表面上へグラフト化するであろう。
【００２１】
本発明のポリマー担体には、フリーラジカル種を有するポリマーリガンドをグラフト化するのに好適な表面を有するあらゆるポリマー材料が挙げられる。本発明によって重合性リンカーは必要とされないが、破壊的な効果がなければこのシステム中に存在することができる。本発明のポリマー担体は懸濁、乳化もしくは分散重合もしくはその組み合わせによって製造されうる。
【００２２】
ポリマー担体材料は粒子状材料、またはかけら、シート、チューブ、ロッドもしくはキャピラリーコーティングの形態であることができる。好ましくは、担体材料は粒子状材料であり、好適には、約０．５〜約１５００μｍ、好ましくは約０．７〜約８００μｍ、最も好ましくは約１０〜約１５０μｍの体積平均粒子サイズを有する。この粒子は好ましくは実質的に球状である。粒子状材料は好適には孔を含む。粒子状担体材料の孔サイズ、孔体積、および比表面積は、使用される担体材料の種類、担体に結合されるポリマーの特性、および使用の際に望まれる分離特性に応じて変動しうる。粒子状粒子の孔サイズ範囲は約２０〜約４０００Å、好ましくは約２００〜約４０００Å、最も好ましくは約３００〜約１５００Åであることができる。孔体積は好適には、約０．１〜約４ｍｌ／ｇ、好ましくは約０．３〜約２ｍｌ／ｇ、最も好ましくは約０．５〜約１．５ｍｌ／ｇである。比表面積は好適には約１〜約１０００ｍ２／ｇ、好ましくは約２５〜約７００ｍ２／ｇ、最も好ましくは約５０〜約５００ｍ２／ｇである。
【００２３】
本明細書において使用されうる他の「ポリマー担体」もしくは「ベースマトリックス」には、これに限定されないが、拡散孔を有する材料が挙げられる。本明細書において使用されうるポリマー担体もしくはベースマトリックスに好ましい材料には、ポリサッカライド、合成ポリマー、アガロース、セルロース、ポリメタクリラート、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルエーテルおよび上述のもののハイブリッドもしくは組み合わせが挙げられる。本発明のポリマー担体は、ポリマーリガンドが共有結合により結合することができる好適なフリーラジカルグラフト化部位を有する。
【００２４】
フリーラジカルポリマーリガンドグラフト化反応中の温度は好適には、約０〜約１００℃、好ましくは１５〜５０℃、あるいは５０〜９０℃である。好適には反応混合物は空気雰囲気下に維持されるが、不活性雰囲気下で行われることができた。
【００２５】
ある実施形態においては、ポリマーリガンドは官能基を含むことができる。本明細書において使用されうる「官能基」の例は、これに限定されないが、イオン交換基、バイオアフィニティー基、疎水性基、チオフィリック相互作用基、キレートもしくはキレート化基、標的化合物とのいわゆるｐｉ−ｐｉ相互作用を有する基、水素結合性基、親水性基、および別の官能基にさらに変換可能な非官能性モノマーもしくは中間体モノマー（例えば、イオン交換リガンドに変換されるグリシジルメタクリラート）、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【００２６】
本明細書において使用されうる「ポリマーリガンド」の例には、これに限定されないが、イオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、チオフィリック相互作用基、金属アフィニィティー基、アフィニティー基、バイオアフィニティー基、混合モード基を含むポリマー、および別の官能基にさらに変換可能な非官能性ポリマーもしくは中間体ポリマー（例えば、イオン交換ポリマーリガンドに変換されるポリグリシジルメタクリラート）、並びにこれらの混合物が挙げられる。本明細書において使用されうるある好ましいリガンドには、これに限定されないが、強カチオン交換基、例えば、スルホプロピル、スルホン酸；強アニオン交換基、例えば、トリメチルアンモニウムクロリド；弱カチオン交換基、例えば、カルボン酸、；弱アニオン交換基、例えば、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルを含むポリマーが挙げられる。
【００２７】
この化学反応のいくつかの実施形態においては、ポリマーリガンドが生じる際に反応混合物に連鎖移動剤を添加することに関連する場合がある。好適な連鎖移動剤には、例えば、ハロメタン、ジスルフィド、チオール（メルカプタンとも称される）、および金属錯体が挙げられる。さらなる好適な連鎖移動剤には、少なくとも１つの容易に引き抜き可能な水素原子を有する様々な他の化合物、及びその混合物が挙げられる。連鎖移動剤は１回以上の添加でまたは連続的に、線形的にまたはそうではなく、全反応期間のほとんどもしくは全てにわたって、または反応期間の限定された部分で添加されうる。連鎖移動剤は反応に０．０１％〜１５％、より好ましくは０．１％〜３％、最も好ましくは約０．１％〜１％の濃度で添加されうる。
【００２８】
本明細書において使用されうる「フリーラジカル開始剤」の例には、これに限定されないが、ビニルモノマーと反応することができポリマーリガンドを形成することができるあらゆるフリーラジカル開始剤、例えば、ペルオキシド、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、クメンヒドロペルオキシド；ペルオキシアセタート、例えば、過酢酸、クロロ過安息香酸；過硫酸塩、例えば、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム、カリウムペルオキソジスルファート、アゾ開始剤、例えば、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、イルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ登録商標）２９５９（ニューヨーク州ホースロンのチバガイギー）、２，２’−アゾビス（２−アミジノ−プロパン）ヒドロクロリドなど、並びにこれらの混合物が挙げられる。グラフト化反応は当該技術分野において知られている方法、好ましくは熱開始（加熱）、もしくはＵＶ照射で開始されうる。フリーラジカル開始剤は水溶性もしくは油溶性でありうる。この開始剤は反応に０．０１％〜５％、より好ましくは０．１％〜２％の濃度で添加される。
【００２９】
本明細書におけるポリマーリガンドを製造するために使用されうる「官能性モノマー」もしくは「グラフト化モノマーの混合物」の例には、これに限定されないが、メタクリラート、アクリラート、メタクリルアミドおよびアクリルアミドが挙げられる。官能性モノマーには、これに限定されないが、アクリル酸、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド、２−アクリルアミド−グリコール酸、イタコン酸もしくはエチルビニルケトン、グリシジルメタクリラート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、アクリルアミド、ヒドロキシプロピルメタクリラート、Ｎ−フェニルアクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３０】
本明細書において教示されるグラフト化方法においては、ポリマーリガンドの重合は、ポリマー担体の表面からのポリマーリガンドの生長よりも少ない制限された条件下で溶液中で開始される。
【００３１】
架橋剤、分岐剤および非官能性モノマーはポリマーリガンドの形態もしくは相互作用を制御する目的のために、ポリマーリガンド上に結合されうる。しかし、ポリマーリガンド上のこれら架橋剤もしくは分岐剤は好適には５％未満、より好ましくは１％未満の低い水準で存在する。好適な架橋剤もしくは分岐剤には、これに限定されないが、モノマー、例えば、エチレングリコールジメタクリラート、ジビニルベンゼン、トリメチルプロピルトリメタクリラート、およびメチレンビスアクリルアミド、または多官能性連鎖移動剤が挙げられる。
【００３２】
本発明はクロマトグラフ分離方法におけるクロマトグラフィーのために吸着剤材料の使用をさらに含む。このようなクロマトグラフ分離方法は、例えば、低圧液体クロマトグラフィー、中圧液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）、および擬似移動床（ＳＭＢ）でありうる。
【００３３】
本発明は、本発明に従うクロマトグラフィーのための吸着剤材料と混合物を接触させることを含む、混合物から化合物を分離する方法をさらに含む。
【００３４】
本発明の主たる利点は、分子、より具体的には生体分子のクロマトグラフィー捕捉および／または精製のためのリガンドグラフト化を使用する高容量イオン交換樹脂の形成である。
【００３５】
試験方法
取り込み結合容量の決定
溶液１の調製（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．８）
１２．１ｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（フィッシャーサイエンティフィックから市販）を２Ｌの容量フラスコに入れた。２リットルの印まで０．０１ＮのＨＣｌ溶液（フィッシャーサイエンティフィックから市販）をフラスコに満たした。容量フラスコに蓋をした後でこの内容物を振とうした。この溶液を５分間静置し、溶液の体積を再度チェックした。２Ｌの印まで体積を調節するために追加のＨＣｌを入れた。ｐＨは８．８±０．０５であると測定された。この溶液をラベルし、４℃に冷却した。
【００３６】
溶液２の調製：２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清からのアルブミン、シグマアルドリッチから市販）溶液
０．８０６ｇのＢＳＡがガラスジャーに秤量され、４０３ｇの溶液１に添加された。この内容物は穏やかに混合されて溶解させられた。ＢＳＡの完全な溶解を確実にするためにこの溶液を０．５時間静置した。
【００３７】
ＢＳＡ容量取り込み手順
空気を捕捉するのを妨げるために、１ｍｌのＤＩ水が１本のＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラムにゆっくりと添加された。水の高さの印を付けた。カラムのエンドプラグ取り除いた。カラムは排気フード内のマニホルドに取り付けられた。より多くのＤＩ水がカラムに添加され、空気の捕捉を妨げるためにカラムの底に留まる水のレベルが１〜２ｃｍになるまで穏やかな真空がカラムに適用された。実施例７のスラリー溶液がカラムに添加された。樹脂上方の水のヘッドが常に維持された。カラム内に樹脂の１ｍｌの樹脂が量り入れられた。樹脂上方の溶液１〜２ｃｍ以外の全てを除去するために穏やかな真空が適用された。樹脂のレベルが１ｍｌの印より下になったら、さらなる樹脂スラリーが追加の真空をかけつつ添加された。樹脂床は決して空気に曝されなかった。充填された１ｍｌの樹脂は約１０ｍｌのＤＩ水ですすがれ、スラリー溶液を置き換え、水のレベルが充填床の１〜２ｃｍ上方になるまで液体が排出された。次いで、充填された１ｍｌの樹脂は実施例６からの１０ｍｌの溶液１でフラッシュされた。真空によって溶液１はカラムから除去され、空気は１分間にわたってカラムを通して吸引された。湿潤ケーキを収容するディスポーサブルカラムはマニホルドから取り外された。
【００３８】
カラムからの湿潤ケーキは、スパチュラで８オンスのガラスジャーに移され、２００ｍＬの溶液２（２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液）を添加した。ガラスジャー内のサンプルは１８時間穏やかに振とうされた。
【００３９】
１８時間後、サンプルは振とう器から取り外され、樹脂は１５分間静置された。
【００４０】
ＢＳＡ結合容量は１８時間のインキュベーション後のろ過された上澄ＢＳＡ溶液の２７８ｎｍＵＶ吸収から決定された。溶液１を満たしたキュベットがＵＶ分光計をゼロにするのに使用された。２７８ｎｍでの吸光度は全てのサンプル、標準溶液および対照サンプルについて測定された（ＧＥへスルケアから市販のＱセファロース商標ファストフローイオン交換樹脂）
【００４１】
ＢＳＡ結合容量の計算
サンプルおよび対照の双方についての結合していないＢＳＡの値が記録された（ＱセファロースＦＦ）。
結合容量を決定するのに以下の式が適用された：
【数１】
【実施例】
【００４２】
実施例１
６０μｍＧＭＡ／ＧｌｙＤＭＡ多孔質アニオン交換樹脂の製造
オーバーヘッドスターラー、凝縮器および温度プローブを備えた２５０ｍｌのガラス反応器に、５０ｇのモノサイズのＧＭＡ／ＧｌｙＤＭＡ（６０μｍポリＧＭＡ−ＧｌｙＤＭＡビーズグリシジルメタクリラート（ＧＭＡ）およびグリセロール１，３−ジメタクリラート（ＧｌｙＤＭＡ）、米国特許出願第１１／５２１，６６８号の実施例２５：６０マイクロメートルＧＭＡ／ＥＧＤＭＡポリマー樹脂の製造に開示された方法により製造）コポリマー湿潤ケーキ（〜２５％固形分）、この湿潤ケーキに対して１８グラム添加量で反応器に入れられる７５％（３−アクリルアミドプロピル）−トリメチルアンモニウムクロリド（シグマアルドリッチケミカルカンパニーから市販）を入れた。次いで、０．６グラムの過硫酸アンモニウム（アクロスオーガニクス−フィッシャーサイエンティフィックから市販）、０．６の２，２−アゾビス（２メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド（シグマアルドリッチケミカルカンパニーから市販）および６８グラムのＤＩ水を反応器に添加した。
攪拌しつつ反応器の温度を３０分間２５℃に維持した。この反応器を８０℃で４５分間にわたって空気中で加熱した。反応器を８０℃の温度で空気中で５時間維持し、５０℃まで冷却した。６０ｍｌの添加漏斗を用い、攪拌しつつ５０℃の一定温度を維持しつつ、１時間にわたって１２０ｍｌのＤＩ水を添加した。この反応混合物を５００ｍｌのフリット付きブフナー漏斗を用いてろ過し、ポリマー溶液のビーズを洗浄した。１リットルのＤＩ水が使用された。その樹脂に対するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）平衡結合容量を測定した。ＢＳＡ容量１４１ｍｇ／ｍｌ。
【００４３】
実施例２
Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎテトラメチルエチレンジアミンを有する６０μｍＧＭＡ／ＧｌｙＤＭＡ多孔質アニオン交換樹脂の製造
オーバーヘッドスターラー、凝縮器および温度プローブを備えた２５０ｍｌのガラス反応器に、５０ｇのモノサイズのＧＭＡ／ＧｌｙＭＡコポリマー湿潤ケーキ（〜２５％固形分）、この湿潤ケーキに対して３０グラム添加量の反応器に入れられる７５％（３−アクリルアミドプロピル）−トリメチルアンモニウムクロリド（シグマアルドリッチケミカルカンパニーから市販）を入れた。次いで、０．６グラムの過硫酸アンモニウム（アクロスオーガニクス−フィッシャーサイエンティフィックから市販）、０．６の２，２−アゾビス（２メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド（シグマアルドリッチケミカルカンパニーから市販）、２０μｌのＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎテトラメチルエチレンジアミン（シグマアルドリッチケミカルカンパニーから市販）および６８グラムのＤＩ水を反応器に添加した。
攪拌しつつ反応器の温度を３０分間２５℃に維持し、次いで、この反応器を８０℃で４５分間にわたって空気中で加熱した。反応器を８０℃の温度で空気中で５時間維持し、５０℃まで冷却した。６０ｍｌの添加漏斗を用い、攪拌しつつ５０℃の一定温度を維持しつつ、１時間にわたって１２０ｍｌのＤＩ水を添加した。この反応混合物を５００ｍｌのフリット付きブフナー漏斗を用いてろ過し、ビーズを洗浄して、ポリマー溶液を含まないようにした。ビーズを洗浄するために１リットルのＤＩ水が使用された。その樹脂に対してＢＳＡ（ウシ血清からのアルブミン、シグマアルドリッチから市販）バッチ平衡結合容量を測定した。ウシ血清アルブミンＢＳＡ容量１８８ｍｇ／ｍｌ。
【００４４】
実施例３
加水分解コポリマーを介した６０μｍＧＭＡ／ＧｌｙＤＭＡ多孔質アニオン交換樹脂の製造
オーバーヘッドスターラー、凝縮器および温度プローブを備えた２５０ｍｌのガラス反応器に、５０ｇのモノサイズのＧＭＡ／ＧｌｙＭＡコポリマー湿潤ケーキ（〜２５％固形分）を入れ、この反応器に、１５０ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液（フィッシャーサイエンティフィックカンパニーから市販）を添加した。この混合物を２５℃で４８時間攪拌しつつ、反応混合物を５００ｍｌのフリット付きブフナー漏斗を用いてろ過し、ビーズを洗浄して、水酸化ナトリウム溶液を含まないようにした。ビーズを洗浄するのに１リットルのＤＩ水が使用された。
次いで、このウェットケーキ材料３０ｇを２５０ｍｌのガラス反応器に戻し、１８ｇ添加量の７５％（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド（アルドリッチケミカルカンパニーから市販）を反応器に添加した。次いで、０．３６ｇの過硫酸アンモニウム（アクロスオーガニクス−フィッシャーサイエンティフィックから市販）、４０．５グラムのＤＩ水を反応器に添加した。
攪拌しつつ反応器の温度を３０分間２５℃に維持した。この反応器を８０℃で４５分間にわたって空気中で加熱した。反応器を８０℃の温度で空気中で１８時間維持し、５０℃まで冷却した。６０ｍｌの添加漏斗を用い、攪拌しつつ５０℃の一定温度を維持しつつ、１時間にわたって１２０ｍｌのＤＩ水を添加した。この反応混合物を５００ｍｌのフリット付きブフナー漏斗を用いてろ過し、ビーズを洗浄して、ポリマー溶液を含まないようにした。１リットルのＤＩ水が使用された。その樹脂に対してＢＳＡ（ウシ血清からのアルブミン、シグマアルドリッチから市販）バッチ平衡結合容量を測定した。ウシ血清アルブミンＢＳＡ容量１０１ｍｇ／ｍｌ。
【００４５】
実施例４
６０μｍＧＭＡ／ＧｌｙＤＭＡ多孔質弱塩基アニオン交換樹脂の製造
オーバーヘッドスターラー、凝縮器および温度プローブを備えた２５０ｍｌのガラス反応器に、３０ｇのモノサイズのＧＭＡ／ＧｌｙＤＭＡコポリマー湿潤ケーキ（〜２５％固形分）を入れた。
この反応器に、１８グラムのＮ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド（アルドリッチケミカルカンパニーから市販）、０．３６グラムの過硫酸アンモニウム（フィッシャーサイエンティフィックカンパニーから市販）および４０．５グラムのＤＩ水を添加した。
この反応器を室温で３０分間攪拌し、次いで、４５分間８０℃に加熱した。反応器の温度を空気中で２２時間８０℃に維持し、次いで反応器を５０℃に冷却した。漏斗によって、攪拌しつつ３０分間にわたって６０ｍｌのＤＩ水を添加し、５０℃の定温に維持した。
反応混合物を室温に冷却した。次いで、反応混合物を６００ｍｌのフリット付きブフナー漏斗に移し、ビーズをろ過して、ポリマー溶液を含まないようにした。１リットルのＤＩ水で１時間にわたってビーズを洗浄した。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）容量１１０ｍｇ／ｍｌ。
【００４６】
実施例５
連鎖移動剤を用いた６０μｍＧＭＡ／ＧｌｙＤＭＡ多孔質アニオン交換樹脂の製造
オーバーヘッドスターラー、凝縮器および温度プローブを備えた２０００ｍｌのガラス反応器に、３００ｇのモノサイズのＧＭＡ／ＧｌｙＭＡコポリマー湿潤ケーキ（〜２５％固形分）を入れて、この湿潤ケーキに対して１８０ｇの反応器に添加される７５％（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド（シグマアルドリッチケミカルカンパニーから市販）を入れた。次いで、０．９グラムの過硫酸アンモニウム（アクロスオーガニクス−フィッシャーサイエンティフィックから市販）、６０ｍｇのブチル３−メルカプトプロピオナート（シグマアルドリッチケミカルカンパニーから市販）および４０５グラムのＤＩ水を反応器に添加した。
攪拌しつつこの反応器の温度を２５℃で３０分間維持した。この反応器を空気中で４５分間にわたって８０℃に加熱した。反応器を空気中で２２時間８０℃の温度に維持し、５０℃に冷却した。６００ｍｌの添加漏斗を用いて、攪拌しつつ５０℃の定温を維持しつつ、１時間にわたって５００ｍｌのＤＩ水を添加した。この反応混合物を２０００ｍｌのフリット付きブフナー漏斗を用いてろ過して、ビーズを洗浄し、ポリマー溶液を含まないようにした。１０リットルのＤＩ水が使用された。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、シグマアルドリッチ）バッチ１７１ｍｇ／ｍｌ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は共有結合したポリマーリガンド鎖を有する単分散マクロポーラスポリマー媒体をフリーラジカル重合によって製造する向上した方法に関する。この媒体はクロマトグラフ精製に適用されることができ、向上したタンパク質結合容量、反応速度、及び選択性を有するポリマー担体、並びにこれを製造する方法および使用する方法をもたらしうる。
【背景技術】
【０００２】
生体から得られる治療用タンパク質は現在のヘルスケアにおいてますます重要な役割を果たしている。これらのタンパク質は従来の医薬品を超える多くの利点、例えば、疾病ターゲットに対して増大した特異性および有効性を提供する。哺乳類の免疫系は疾病の脅威を制御し除去するために広範囲のタンパク質を使用する。遺伝子及びタンパク質工学の出現は多くの「設計された」または組み替えタンパク質治療の開発を可能にしてきた。これら治療は単一のタンパク質、化学修飾タンパク質、タンパク質フラグメントまたはタンパク質複合体をベースにすることができる。クロマトグラフ分離はこれらバイオ医薬品の製造に広範囲に使用される。この産業界が成熟するにつれて、分離を向上させるための新たな／進歩した技術及び方法の実施は、これらの薬剤をより多くの患者により低コストで提供する能力を生物治療プロデューサーに提供するであろう。
【０００３】
タンパク質を精製するのに使用される一般的なクロマトグラフ方法には、特に、アフィニティー、バイオアフィニティー、イオン交換、逆相、疎水性相互作用、親水性相互作用、サイズ排除および混合モード（上記カテゴリーの組み合わせを備える樹脂）が挙げられる。これらの種類のクロマトグラフィー手順のそれぞれの適用および効率はクロマトグラフィーシステムの固定相（クロマトグラフィー媒体）と溶質分子と（それぞれ移動液相と相互作用する）の間の表面−表面相互作用の選択性に頼っている。広範囲の固定相クロマトグラフィー担体材料が市販されている。
【０００４】
不純物から生成物を成功裏に分離することの鍵は多くの場合、固定相、ベースマトリックス（化学組成および孔構造）、およびリガンド特性（リガンド種類、リガンド密度、孔構造、リガンド分布、リガンド長さおよび材料組成）、並びに移動相もしくは溶液特性（緩衝剤種類、ｐＨおよび導電率）の正しい組み合わせに頼っている。ベースマトリックスおよびリガンドの具体的な設計は、いくつかの鍵となる特性、例えば、タンパク質結合容量、プロセススループット、選択性、床透過性および化学的安定性によって特徴付けられうるクロマトグラフィー媒体を生じさせる。精製方法には、生成物を主に結合すること（結合および溶離）、不純物を主に結合すること（フロースルー）、および上記の組み合わせ（いわゆる、弱い分配など）が挙げられる。精製タンパク質製品をもたらす着実な分離を可能にし、かつ確実にするために、上記教示のクロマトグラフィー媒体特性を制御することがこれら技術の設計において重要である。
【０００５】
タンパク質分離は様々なポリマー担体またはベースマトリックス上で達成されうる。樹脂もしくはビーズ構造のための一般的な材料には、ポリサッカライド（アガロース、セルロース）、合成ポリマー（ポリスチレン、ポリメタクリラート、ポリビニルエーテル、およびポリアクリルアミド）、並びにセラミックス、例えば、シリカ、ジルコニアおよび制御された多孔質ガラスが挙げられる。これらの材料は典型的には約２００Å〜３，０００Åである「拡散（ｄｉｆｆｕｓｉｖｅ）孔」を介してタンパク質を主として吸着する。
【０００６】
膜およびモノリス材料もクロマトグラフィーのために、特にフロースルー用途において一般的に使用される。典型的な膜組成には合成ポリマー、例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリエーテルスルホン、ナイロンおよびポリサッカライド、例えば、セルロースが挙げられる。モノリスはポリスチレン、ポリサッカライド、ポリメタクリラート、並びに他の合成ポリマー、ポリサッカライドおよびセラミックスから開発されてきた。膜およびモノリスクロマトグラフィーは、これらの材料が同じ「コンベクティブ（ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ）孔」内にタンパク質を吸着する点でビーズとは異なり、このコンベクティブ孔は膜およびモノリス材料の透過性を制御する。典型的な膜およびモノリスコンベクティブ孔サイズは、約０．６μｍ〜約１０μｍの範囲である。これらの基材へのリガンド付加は様々な充分に開発された技術を通じて達成されうる。
【０００７】
タンパク質結合容量を向上させ樹脂選択性を改変するためのポリマーリガンド「テンタクルズ」または「エキステンダー」の使用は、ポリマーリガンドをベースマトリックス上に、例えば、ベースマトリックス表面から離れるように伸ばすグラフト化によって、結合させることを伴う。ポリマーリガンドエキステンダーは典型的にはより大きな結合容量および反応速度を作り出す、というのは、このエキステンダーはリガンド利用性を増大させるからであり、なぜなら、ポリマーリガンドに結合する標的分子が、ポリマー担体表面上のタンパク質の単層吸着を上回るからである。
【０００８】
タンパク質の分離などのためのクロマトグラフィーにおいて使用されるもののような、ポリマー担体上に表面エキステンダーを作り出すために、ポリマーエクステンダーをグラフト化する２つの標準的な方法論が開発されてきた：１）表面基を介して担体からモノマーをグラフト化する（からモノマーをグラフト化する）、および２）あらかじめ形成されたポリマーを活性化基を介して担体にグラフト化する（にポリマーをグラフト化する）。
【０００９】
ラジカル重合反応を用いてポリマー材料からモノマーをグラフト化することは充分に開発された技術である。一般に、この反応はポリマー表面材料から、または溶液中の開始剤から開始させられうる。
【００１０】
表面からのラジカル重合を開始させることは、反応環境、例えば、温度、放射線、金属酸化、または吸着した開始物質による開始などへの曝露を介した表面でのラジカル発生によって達成されうる。しかし、これら「からモノマーをグラフト化する」アプローチは、かなり制御された溶液条件、特別な装置を必要とし、および／または重合性リンカー、開始物質もしくは特別な官能基での前処理によるような何らかの方法で担体があらかじめ活性化されることを必要とするが、これはその実施を複雑にしかつ時間がかかるものにする。
【００１１】
多孔性材料からポリマーをグラフト化する一方法は米国特許第５４５３１８６号に開示されている。この先行技術はジヒドロキシル官能性を有するポリマー担体上にポリマーリガンドをグラフト化する方法を開示する。この先行技術は鎖長を制御し、かつレドックス重合の使用によってヒドロキシル基を含む担体にグラフト化する方法を開示する。Ｃｅ（ＩＶ）レドックス方法は不活性雰囲気下でのセリウム（ＩＶ）塩の使用を採用し、ポリマー担体表面からのポリマーリガンドをグラフト化する。混合物に添加されるモノマーおよびセリウム塩濃度の水準を制御することにより、ポリマーリガンド鎖長は制御される。
【００１２】
この先行技術はポリマー材料からポリマーをグラフト化する方法を開示し、その方法は特定の官能基でポリマー担体を前処理することを必要とする。全体的なポリマークロマトグラフ材料の得られる性能を維持しつつ、この追加の前処理工程がプロセスから除かれうる方法が必要とされる。
【００１３】
ポリマー担体材料表面へのポリマーリガンドの付加は向上したタンパク質結合容量、タンパク質結合速度およびタンパク質選択性における潜在的変化を提供する。しかし、タンパク質分離の要求がより厳しくなるにつれて、新たなポリマー構造を作り出すために新たな技術および方法を開発することがより重要になっている。よって、タンパク質分離に使用される様々なポリマー担体基材の向上したタンパク質結合特性およびタンパク質選択性を開発することが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５４５３１８６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
タンパク質分離に有用で、向上したタンパク質結合容量および樹脂選択性を有する新たなポリマー基材についての上記必要性に応えて、ポリマーリガンドをポリマー担体基材上にグラフト化するための新たな方法が開発された。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に従って、ポリマー担体が好適なフリーラジカルグラフト化部位を含み、さらにポリマーリガンドが１以上の共有結合によってポリマー担体の好適なフリーラジカルグラフト化部位に結合されている、ポリマー担体上に固定化されたポリマーリガンドを含むクロマトグラフィーのための吸着剤材料が提供される。
本発明の第２の形態においては、
（ｉ）好適なフリーラジカルグラフト化部位を含むポリマー担体を提供し；
（ｉｉ）官能性モノマーの重合によってポリマーリガンドを生じさせ；並びに
（ｉｉｉ）ポリマー担体とポリマーリガンドとの間の反応を開始させる：
ことを含み、
ポリマーリガンドはポリマー担体上の好適なフリーラジカルグラフト化部位と反応する、クロマトグラフィーのための吸着剤材料を製造する方法が提供される。
【００１７】
本発明の第３の形態においては、
（ｉ）混合物を提供し、並びに
（ｉｉ）ポリマー担体上に固定化されたポリマーリガンドを含むクロマトグラフィーのための吸着剤材料と前記混合物とを接触させる：
ことを含む、混合物から化合物を分離する方法であって、
ポリマー担体が好適なフリーラジカルグラフト化部位を含み、さらにポリマーリガンドは１以上の共有結合によってポリマー担体の好適なフリーラジカルグラフト化部位に結合されている、
混合物から化合物を分離する方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書において教示される全ての範囲は、その中に包含されるすべての部分的な範囲を網羅することが理解される。例えば、「１〜１０」の範囲は、最小値１および最大値１０の間の何らかおよび全ての部分的な範囲（すなわち、１以上の最小値および１０以下の最大値を有する何らかおよび全ての部分的な範囲、例えば、５．５〜１０）（並びに、最小値１および最大値１０を含む）を含む。
【００１９】
本明細書において使用される場合、用語「好ましくは」、「より好ましくは」および「最も好ましくは」は、優れているとみなされるモードを示唆することを意図するものではなく、より広い範囲またはグループの好適なより狭い範囲を具体化することを意味する。
【００２０】
先行技術のプロセスと比較して、本発明はポリマー担体前処理またはポリマー担体への重合性リンカーの添加を必要としない。官能性モノマー並びに／または連鎖移動剤および開始剤の重合によって生じるポリマーリガンドは、ポリマー担体および／またはポリマー担体骨格上の好適なフリーラジカルグラフト化部位と反応し、共有結合されることとなるであろう。開始剤は溶液中でモノマーの重合を開始させるであろうし、このモノマーはポリマー担体の好適なフリーラジカルグラフト化部位で表面上へグラフト化するであろう。
【００２１】
本発明のポリマー担体には、フリーラジカル種を有するポリマーリガンドをグラフト化するのに好適な表面を有するあらゆるポリマー材料が挙げられる。本発明によって重合性リンカーは必要とされないが、破壊的な効果がなければこのシステム中に存在することができる。本発明のポリマー担体は懸濁、乳化もしくは分散重合もしくはその組み合わせによって製造されうる。
【００２２】
ポリマー担体材料は粒子状材料、またはかけら、シート、チューブ、ロッドもしくはキャピラリーコーティングの形態であることができる。好ましくは、担体材料は粒子状材料であり、好適には、約０．５〜約１５００μｍ、好ましくは約０．７〜約８００μｍ、最も好ましくは約１０〜約１５０μｍの体積平均粒子サイズを有する。この粒子は好ましくは実質的に球状である。粒子状材料は好適には孔を含む。粒子状担体材料の孔サイズ、孔体積、および比表面積は、使用される担体材料の種類、担体に結合されるポリマーの特性、および使用の際に望まれる分離特性に応じて変動しうる。粒子状粒子の孔サイズ範囲は約２０〜約４０００Å、好ましくは約２００〜約４０００Å、最も好ましくは約３００〜約１５００Åであることができる。孔体積は好適には、約０．１〜約４ｍｌ／ｇ、好ましくは約０．３〜約２ｍｌ／ｇ、最も好ましくは約０．５〜約１．５ｍｌ／ｇである。比表面積は好適には約１〜約１０００ｍ２／ｇ、好ましくは約２５〜約７００ｍ２／ｇ、最も好ましくは約５０〜約５００ｍ２／ｇである。
【００２３】
本明細書において使用されうる他の「ポリマー担体」もしくは「ベースマトリックス」には、これに限定されないが、拡散孔を有する材料が挙げられる。本明細書において使用されうるポリマー担体もしくはベースマトリックスに好ましい材料には、ポリサッカライド、合成ポリマー、アガロース、セルロース、ポリメタクリラート、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルエーテルおよび上述のもののハイブリッドもしくは組み合わせが挙げられる。本発明のポリマー担体は、ポリマーリガンドが共有結合により結合することができる好適なフリーラジカルグラフト化部位を有する。
【００２４】
フリーラジカルポリマーリガンドグラフト化反応中の温度は好適には、約０〜約１００℃、好ましくは１５〜５０℃、あるいは５０〜９０℃である。好適には反応混合物は空気雰囲気下に維持されるが、不活性雰囲気下で行われることができた。
【００２５】
ある実施形態においては、ポリマーリガンドは官能基を含むことができる。本明細書において使用されうる「官能基」の例は、これに限定されないが、イオン交換基、バイオアフィニティー基、疎水性基、チオフィリック相互作用基、キレートもしくはキレート化基、標的化合物とのいわゆるｐｉ−ｐｉ相互作用を有する基、水素結合性基、親水性基、および別の官能基にさらに変換可能な非官能性モノマーもしくは中間体モノマー（例えば、イオン交換リガンドに変換されるグリシジルメタクリラート）、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【００２６】
本明細書において使用されうる「ポリマーリガンド」の例には、これに限定されないが、イオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、チオフィリック相互作用基、金属アフィニィティー基、アフィニティー基、バイオアフィニティー基、混合モード基を含むポリマー、および別の官能基にさらに変換可能な非官能性ポリマーもしくは中間体ポリマー（例えば、イオン交換ポリマーリガンドに変換されるポリグリシジルメタクリラート）、並びにこれらの混合物が挙げられる。本明細書において使用されうるある好ましいリガンドには、これに限定されないが、強カチオン交換基、例えば、スルホプロピル、スルホン酸；強アニオン交換基、例えば、トリメチルアンモニウムクロリド；弱カチオン交換基、例えば、カルボン酸、；弱アニオン交換基、例えば、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルを含むポリマーが挙げられる。
【００２７】
この化学反応のいくつかの実施形態においては、ポリマーリガンドが生じる際に反応混合物に連鎖移動剤を添加することに関連する場合がある。好適な連鎖移動剤には、例えば、ハロメタン、ジスルフィド、チオール（メルカプタンとも称される）、および金属錯体が挙げられる。さらなる好適な連鎖移動剤には、少なくとも１つの容易に引き抜き可能な水素原子を有する様々な他の化合物、及びその混合物が挙げられる。連鎖移動剤は１回以上の添加でまたは連続的に、線形的にまたはそうではなく、全反応期間のほとんどもしくは全てにわたって、または反応期間の限定された部分で添加されうる。連鎖移動剤は反応に０．０１％〜１５％、より好ましくは０．１％〜３％、最も好ましくは約０．１％〜１％の濃度で添加されうる。
【００２８】
本明細書において使用されうる「フリーラジカル開始剤」の例には、これに限定されないが、ビニルモノマーと反応することができポリマーリガンドを形成することができるあらゆるフリーラジカル開始剤、例えば、ペルオキシド、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、クメンヒドロペルオキシド；ペルオキシアセタート、例えば、過酢酸、クロロ過安息香酸；過硫酸塩、例えば、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム、カリウムペルオキソジスルファート、アゾ開始剤、例えば、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、イルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ登録商標）２９５９（ニューヨーク州ホースロンのチバガイギー）、２，２’−アゾビス（２−アミジノ−プロパン）ヒドロクロリドなど、並びにこれらの混合物が挙げられる。グラフト化反応は当該技術分野において知られている方法、好ましくは熱開始（加熱）、もしくはＵＶ照射で開始されうる。フリーラジカル開始剤は水溶性もしくは油溶性でありうる。この開始剤は反応に０．０１％〜５％、より好ましくは０．１％〜２％の濃度で添加される。
【００２９】
本明細書におけるポリマーリガンドを製造するために使用されうる「官能性モノマー」もしくは「グラフト化モノマーの混合物」の例には、これに限定されないが、メタクリラート、アクリラート、メタクリルアミドおよびアクリルアミドが挙げられる。官能性モノマーには、これに限定されないが、アクリル酸、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド、２−アクリルアミド−グリコール酸、イタコン酸もしくはエチルビニルケトン、グリシジルメタクリラート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、アクリルアミド、ヒドロキシプロピルメタクリラート、Ｎ−フェニルアクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３０】
本明細書において教示されるグラフト化方法においては、ポリマーリガンドの重合は、ポリマー担体の表面からのポリマーリガンドの生長よりも少ない制限された条件下で溶液中で開始される。
【００３１】
架橋剤、分岐剤および非官能性モノマーはポリマーリガンドの形態もしくは相互作用を制御する目的のために、ポリマーリガンド上に結合されうる。しかし、ポリマーリガンド上のこれら架橋剤もしくは分岐剤は好適には５％未満、より好ましくは１％未満の低い水準で存在する。好適な架橋剤もしくは分岐剤には、これに限定されないが、モノマー、例えば、エチレングリコールジメタクリラート、ジビニルベンゼン、トリメチルプロピルトリメタクリラート、およびメチレンビスアクリルアミド、または多官能性連鎖移動剤が挙げられる。
【００３２】
本発明はクロマトグラフ分離方法におけるクロマトグラフィーのために吸着剤材料の使用をさらに含む。このようなクロマトグラフ分離方法は、例えば、低圧液体クロマトグラフィー、中圧液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）、および擬似移動床（ＳＭＢ）でありうる。
【００３３】
本発明は、本発明に従うクロマトグラフィーのための吸着剤材料と混合物を接触させることを含む、混合物から化合物を分離する方法をさらに含む。
【００３４】
本発明の主たる利点は、分子、より具体的には生体分子のクロマトグラフィー捕捉および／または精製のためのリガンドグラフト化を使用する高容量イオン交換樹脂の形成である。
【００３５】
試験方法
取り込み結合容量の決定
溶液１の調製（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．８）
１２．１ｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（フィッシャーサイエンティフィックから市販）を２Ｌの容量フラスコに入れた。２リットルの印まで０．０１ＮのＨＣｌ溶液（フィッシャーサイエンティフィックから市販）をフラスコに満たした。容量フラスコに蓋をした後でこの内容物を振とうした。この溶液を５分間静置し、溶液の体積を再度チェックした。２Ｌの印まで体積を調節するために追加のＨＣｌを入れた。ｐＨは８．８±０．０５であると測定された。この溶液をラベルし、４℃に冷却した。
【００３６】
溶液２の調製：２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清からのアルブミン、シグマアルドリッチから市販）溶液
０．８０６ｇのＢＳＡがガラスジャーに秤量され、４０３ｇの溶液１に添加された。この内容物は穏やかに混合されて溶解させられた。ＢＳＡの完全な溶解を確実にするためにこの溶液を０．５時間静置した。
【００３７】
ＢＳＡ容量取り込み手順
空気を捕捉するのを妨げるために、１ｍｌのＤＩ水が１本のＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラムにゆっくりと添加された。水の高さの印を付けた。カラムのエンドプラグ取り除いた。カラムは排気フード内のマニホルドに取り付けられた。より多くのＤＩ水がカラムに添加され、空気の捕捉を妨げるためにカラムの底に留まる水のレベルが１〜２ｃｍになるまで穏やかな真空がカラムに適用された。実施例７のスラリー溶液がカラムに添加された。樹脂上方の水のヘッドが常に維持された。カラム内に樹脂の１ｍｌの樹脂が量り入れられた。樹脂上方の溶液１〜２ｃｍ以外の全てを除去するために穏やかな真空が適用された。樹脂のレベルが１ｍｌの印より下になったら、さらなる樹脂スラリーが追加の真空をかけつつ添加された。樹脂床は決して空気に曝されなかった。充填された１ｍｌの樹脂は約１０ｍｌのＤＩ水ですすがれ、スラリー溶液を置き換え、水のレベルが充填床の１〜２ｃｍ上方になるまで液体が排出された。次いで、充填された１ｍｌの樹脂は実施例６からの１０ｍｌの溶液１でフラッシュされた。真空によって溶液１はカラムから除去され、空気は１分間にわたってカラムを通して吸引された。湿潤ケーキを収容するディスポーサブルカラムはマニホルドから取り外された。
【００３８】
カラムからの湿潤ケーキは、スパチュラで８オンスのガラスジャーに移され、２００ｍＬの溶液２（２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液）を添加した。ガラスジャー内のサンプルは１８時間穏やかに振とうされた。
【００３９】
１８時間後、サンプルは振とう器から取り外され、樹脂は１５分間静置された。
【００４０】
ＢＳＡ結合容量は１８時間のインキュベーション後のろ過された上澄ＢＳＡ溶液の２７８ｎｍＵＶ吸収から決定された。溶液１を満たしたキュベットがＵＶ分光計をゼロにするのに使用された。２７８ｎｍでの吸光度は全てのサンプル、標準溶液および対照サンプルについて測定された（ＧＥへスルケアから市販のＱセファロース商標ファストフローイオン交換樹脂）
【００４１】
ＢＳＡ結合容量の計算
サンプルおよび対照の双方についての結合していないＢＳＡの値が記録された（ＱセファロースＦＦ）。
結合容量を決定するのに以下の式が適用された：
【数１】
【実施例】
【００４２】
実施例１
６０μｍＧＭＡ／ＧｌｙＤＭＡ多孔質アニオン交換樹脂の製造
オーバーヘッドスターラー、凝縮器および温度プローブを備えた２５０ｍｌのガラス反応器に、５０ｇのモノサイズのＧＭＡ／ＧｌｙＤＭＡ（６０μｍポリＧＭＡ−ＧｌｙＤＭＡビーズグリシジルメタクリラート（ＧＭＡ）およびグリセロール１，３−ジメタクリラート（ＧｌｙＤＭＡ）、米国特許出願第１１／５２１，６６８号の実施例２５：６０マイクロメートルＧＭＡ／ＥＧＤＭＡポリマー樹脂の製造に開示された方法により製造）コポリマー湿潤ケーキ（〜２５％固形分）、この湿潤ケーキに対して１８グラム添加量で反応器に入れられる７５％（３−アクリルアミドプロピル）−トリメチルアンモニウムクロリド（シグマアルドリッチケミカルカンパニーから市販）を入れた。次いで、０．６グラムの過硫酸アンモニウム（アクロスオーガニクス−フィッシャーサイエンティフィックから市販）、０．６の２，２−アゾビス（２メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド（シグマアルドリッチケミカルカンパニーから市販）および６８グラムのＤＩ水を反応器に添加した。
攪拌しつつ反応器の温度を３０分間２５℃に維持した。この反応器を８０℃で４５分間にわたって空気中で加熱した。反応器を８０℃の温度で空気中で５時間維持し、５０℃まで冷却した。６０ｍｌの添加漏斗を用い、攪拌しつつ５０℃の一定温度を維持しつつ、１時間にわたって１２０ｍｌのＤＩ水を添加した。この反応混合物を５００ｍｌのフリット付きブフナー漏斗を用いてろ過し、ポリマー溶液のビーズを洗浄した。１リットルのＤＩ水が使用された。その樹脂に対するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）平衡結合容量を測定した。ＢＳＡ容量１４１ｍｇ／ｍｌ。
【００４３】
実施例２
Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎテトラメチルエチレンジアミンを有する６０μｍＧＭＡ／ＧｌｙＤＭＡ多孔質アニオン交換樹脂の製造
オーバーヘッドスターラー、凝縮器および温度プローブを備えた２５０ｍｌのガラス反応器に、５０ｇのモノサイズのＧＭＡ／ＧｌｙＭＡコポリマー湿潤ケーキ（〜２５％固形分）、この湿潤ケーキに対して３０グラム添加量の反応器に入れられる７５％（３−アクリルアミドプロピル）−トリメチルアンモニウムクロリド（シグマアルドリッチケミカルカンパニーから市販）を入れた。次いで、０．６グラムの過硫酸アンモニウム（アクロスオーガニクス−フィッシャーサイエンティフィックから市販）、０．６の２，２−アゾビス（２メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド（シグマアルドリッチケミカルカンパニーから市販）、２０μｌのＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎテトラメチルエチレンジアミン（シグマアルドリッチケミカルカンパニーから市販）および６８グラムのＤＩ水を反応器に添加した。
攪拌しつつ反応器の温度を３０分間２５℃に維持し、次いで、この反応器を８０℃で４５分間にわたって空気中で加熱した。反応器を８０℃の温度で空気中で５時間維持し、５０℃まで冷却した。６０ｍｌの添加漏斗を用い、攪拌しつつ５０℃の一定温度を維持しつつ、１時間にわたって１２０ｍｌのＤＩ水を添加した。この反応混合物を５００ｍｌのフリット付きブフナー漏斗を用いてろ過し、ビーズを洗浄して、ポリマー溶液を含まないようにした。ビーズを洗浄するために１リットルのＤＩ水が使用された。その樹脂に対してＢＳＡ（ウシ血清からのアルブミン、シグマアルドリッチから市販）バッチ平衡結合容量を測定した。ウシ血清アルブミンＢＳＡ容量１８８ｍｇ／ｍｌ。
【００４４】
実施例３
加水分解コポリマーを介した６０μｍＧＭＡ／ＧｌｙＤＭＡ多孔質アニオン交換樹脂の製造
オーバーヘッドスターラー、凝縮器および温度プローブを備えた２５０ｍｌのガラス反応器に、５０ｇのモノサイズのＧＭＡ／ＧｌｙＭＡコポリマー湿潤ケーキ（〜２５％固形分）を入れ、この反応器に、１５０ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液（フィッシャーサイエンティフィックカンパニーから市販）を添加した。この混合物を２５℃で４８時間攪拌しつつ、反応混合物を５００ｍｌのフリット付きブフナー漏斗を用いてろ過し、ビーズを洗浄して、水酸化ナトリウム溶液を含まないようにした。ビーズを洗浄するのに１リットルのＤＩ水が使用された。
次いで、このウェットケーキ材料３０ｇを２５０ｍｌのガラス反応器に戻し、１８ｇ添加量の７５％（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド（アルドリッチケミカルカンパニーから市販）を反応器に添加した。次いで、０．３６ｇの過硫酸アンモニウム（アクロスオーガニクス−フィッシャーサイエンティフィックから市販）、４０．５グラムのＤＩ水を反応器に添加した。
攪拌しつつ反応器の温度を３０分間２５℃に維持した。この反応器を８０℃で４５分間にわたって空気中で加熱した。反応器を８０℃の温度で空気中で１８時間維持し、５０℃まで冷却した。６０ｍｌの添加漏斗を用い、攪拌しつつ５０℃の一定温度を維持しつつ、１時間にわたって１２０ｍｌのＤＩ水を添加した。この反応混合物を５００ｍｌのフリット付きブフナー漏斗を用いてろ過し、ビーズを洗浄して、ポリマー溶液を含まないようにした。１リットルのＤＩ水が使用された。その樹脂に対してＢＳＡ（ウシ血清からのアルブミン、シグマアルドリッチから市販）バッチ平衡結合容量を測定した。ウシ血清アルブミンＢＳＡ容量１０１ｍｇ／ｍｌ。
【００４５】
実施例４
６０μｍＧＭＡ／ＧｌｙＤＭＡ多孔質弱塩基アニオン交換樹脂の製造
オーバーヘッドスターラー、凝縮器および温度プローブを備えた２５０ｍｌのガラス反応器に、３０ｇのモノサイズのＧＭＡ／ＧｌｙＤＭＡコポリマー湿潤ケーキ（〜２５％固形分）を入れた。
この反応器に、１８グラムのＮ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド（アルドリッチケミカルカンパニーから市販）、０．３６グラムの過硫酸アンモニウム（フィッシャーサイエンティフィックカンパニーから市販）および４０．５グラムのＤＩ水を添加した。
この反応器を室温で３０分間攪拌し、次いで、４５分間８０℃に加熱した。反応器の温度を空気中で２２時間８０℃に維持し、次いで反応器を５０℃に冷却した。漏斗によって、攪拌しつつ３０分間にわたって６０ｍｌのＤＩ水を添加し、５０℃の定温に維持した。
反応混合物を室温に冷却した。次いで、反応混合物を６００ｍｌのフリット付きブフナー漏斗に移し、ビーズをろ過して、ポリマー溶液を含まないようにした。１リットルのＤＩ水で１時間にわたってビーズを洗浄した。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）容量１１０ｍｇ／ｍｌ。
【００４６】
実施例５
連鎖移動剤を用いた６０μｍＧＭＡ／ＧｌｙＤＭＡ多孔質アニオン交換樹脂の製造
オーバーヘッドスターラー、凝縮器および温度プローブを備えた２０００ｍｌのガラス反応器に、３００ｇのモノサイズのＧＭＡ／ＧｌｙＭＡコポリマー湿潤ケーキ（〜２５％固形分）を入れて、この湿潤ケーキに対して１８０ｇの反応器に添加される７５％（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド（シグマアルドリッチケミカルカンパニーから市販）を入れた。次いで、０．９グラムの過硫酸アンモニウム（アクロスオーガニクス−フィッシャーサイエンティフィックから市販）、６０ｍｇのブチル３−メルカプトプロピオナート（シグマアルドリッチケミカルカンパニーから市販）および４０５グラムのＤＩ水を反応器に添加した。
攪拌しつつこの反応器の温度を２５℃で３０分間維持した。この反応器を空気中で４５分間にわたって８０℃に加熱した。反応器を空気中で２２時間８０℃の温度に維持し、５０℃に冷却した。６００ｍｌの添加漏斗を用いて、攪拌しつつ５０℃の定温を維持しつつ、１時間にわたって５００ｍｌのＤＩ水を添加した。この反応混合物を２０００ｍｌのフリット付きブフナー漏斗を用いてろ過して、ビーズを洗浄し、ポリマー溶液を含まないようにした。１０リットルのＤＩ水が使用された。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、シグマアルドリッチ）バッチ１７１ｍｇ／ｍｌ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー担体が好適なフリーラジカルグラフト化部位を含み、さらにポリマーリガンドが１以上の共有結合によってポリマー担体の好適なフリーラジカルグラフト化部位に結合されている、ポリマー担体上に固定化されたポリマーリガンドを含む、クロマトグラフィーのための吸着剤材料。
【請求項２】
ポリマーリガンドがフリーラジカル種を含む、請求項１に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料。
【請求項３】
ポリマーリガンドが官能基を含む、請求項１に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料。
【請求項４】
ポリマーリガンドがイオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、チオフィリック相互作用基、金属アフィニィティー基、アフィニティー基、バイオアフィニティー基、混合モード基、および別の官能基にさらに変換可能な非官能性モノマーもしくは中間体モノマー、並びにこれらの混合物を含む、請求項１に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料。
【請求項５】
ポリマー担体が０．５〜約５００μｍの体積平均粒子サイズを有する、請求項１に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料。
【請求項６】
（ｉ）好適なフリーラジカルグラフト化部位を含むポリマー担体を提供し
（ｉｉ）官能性モノマーの重合によってポリマーリガンドを生じさせ、並びに
（ｉｉｉ）前記ポリマー担体と前記ポリマーリガンドとの間の反応を開始させることを含み、
前記ポリマーリガンドは前記ポリマー担体上の好適なフリーラジカルグラフト化部位と反応する、
クロマトグラフィーのための吸着剤材料を製造する方法。
【請求項７】
フリーラジカル開始剤が添加されて、ポリマー担体とポリマーリガンドとの間の反応を開始させる、請求項６に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料を製造する方法。
【請求項８】
フリーラジカル開始剤がペルオキシド、ペルオキシアセタート、過硫酸塩、アゾ開始剤、またはこれらの混合物である、請求項７に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料を製造する方法。
【請求項９】
ポリマー担体が０．５〜約５００μｍの体積平均粒子サイズを有する、請求項６に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料を製造する方法。
【請求項１０】
官能性モノマーの重合によってポリマーリガンドを生じさせることが連鎖移動剤の存在下で行われる、請求項６に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料を製造する方法。
【請求項１１】
（ｉ）混合物を提供し、並びに
（ｉｉ）ポリマー担体上に固定化されたポリマーリガンドを含むクロマトグラフィーのための吸着剤材料と前記混合物とを接触させる
ことを含む、混合物から化合物を分離する方法であって、
前記ポリマー担体が好適なフリーラジカルグラフト化部位を含み、さらに前記ポリマーリガンドは１以上の共有結合によって前記ポリマー担体の好適なフリーラジカルグラフト化部位に結合されている、
混合物から化合物を分離する方法。
【請求項１】
ポリマー担体が好適なフリーラジカルグラフト化部位を含み、さらにポリマーリガンドが１以上の共有結合によってポリマー担体の好適なフリーラジカルグラフト化部位に結合されている、ポリマー担体上に固定化されたポリマーリガンドを含む、クロマトグラフィーのための吸着剤材料。
【請求項２】
ポリマーリガンドがフリーラジカル種を含む、請求項１に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料。
【請求項３】
ポリマーリガンドが官能基を含む、請求項１に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料。
【請求項４】
ポリマーリガンドがイオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、チオフィリック相互作用基、金属アフィニィティー基、アフィニティー基、バイオアフィニティー基、混合モード基、および別の官能基にさらに変換可能な非官能性モノマーもしくは中間体モノマー、並びにこれらの混合物を含む、請求項１に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料。
【請求項５】
ポリマー担体が０．５〜約５００μｍの体積平均粒子サイズを有する、請求項１に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料。
【請求項６】
（ｉ）好適なフリーラジカルグラフト化部位を含むポリマー担体を提供し
（ｉｉ）官能性モノマーの重合によってポリマーリガンドを生じさせ、並びに
（ｉｉｉ）前記ポリマー担体と前記ポリマーリガンドとの間の反応を開始させることを含み、
前記ポリマーリガンドは前記ポリマー担体上の好適なフリーラジカルグラフト化部位と反応する、
クロマトグラフィーのための吸着剤材料を製造する方法。
【請求項７】
フリーラジカル開始剤が添加されて、ポリマー担体とポリマーリガンドとの間の反応を開始させる、請求項６に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料を製造する方法。
【請求項８】
フリーラジカル開始剤がペルオキシド、ペルオキシアセタート、過硫酸塩、アゾ開始剤、またはこれらの混合物である、請求項７に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料を製造する方法。
【請求項９】
ポリマー担体が０．５〜約５００μｍの体積平均粒子サイズを有する、請求項６に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料を製造する方法。
【請求項１０】
官能性モノマーの重合によってポリマーリガンドを生じさせることが連鎖移動剤の存在下で行われる、請求項６に記載のクロマトグラフィーのための吸着剤材料を製造する方法。
【請求項１１】
（ｉ）混合物を提供し、並びに
（ｉｉ）ポリマー担体上に固定化されたポリマーリガンドを含むクロマトグラフィーのための吸着剤材料と前記混合物とを接触させる
ことを含む、混合物から化合物を分離する方法であって、
前記ポリマー担体が好適なフリーラジカルグラフト化部位を含み、さらに前記ポリマーリガンドは１以上の共有結合によって前記ポリマー担体の好適なフリーラジカルグラフト化部位に結合されている、
混合物から化合物を分離する方法。
【公開番号】特開２０１２−３２３９０（Ｐ２０１２−３２３９０Ａ）
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１４９７７６（Ｐ２０１１−１４９７７６）
【出願日】平成２３年７月６日（２０１１．７．６）
【出願人】（５９０００２０３５）ローム アンド ハース カンパニー (524)
【氏名又は名称原語表記】ＲＯＨＭ ＡＮＤ ＨＡＡＳ ＣＯＭＰＡＮＹ
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４９７７６（Ｐ２０１１−１４９７７６）
【出願日】平成２３年７月６日（２０１１．７．６）
【出願人】（５９０００２０３５）ローム アンド ハース カンパニー (524)
【氏名又は名称原語表記】ＲＯＨＭ ＡＮＤ ＨＡＡＳ ＣＯＭＰＡＮＹ
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