回転荷重加圧培養装置
【課題】回転培養装置に力学的荷重負荷を簡便で高性能な培養方法の提供と、長期の培養可能な無菌状態で種種の細胞の培養可能な培養装置、培養方法を提供する。
【解決手段】回転駆動装置で培地と細胞を培地槽タンク内に満たし回転させる。培地槽タンクには回転荷重装置を装着し回転すると内部の荷重ピストンが上下し仕切シートを介して培地に荷重、圧力をかける。また培地槽タンクを上下振動駆動装置で揺さぶり、胎児が母体から受ける鼓動、呼吸による体液の圧迫、歩行時や運動等の動的な物理的刺激を生体外で再生させる回転荷重加圧培養装置。
【解決手段】回転駆動装置で培地と細胞を培地槽タンク内に満たし回転させる。培地槽タンクには回転荷重装置を装着し回転すると内部の荷重ピストンが上下し仕切シートを介して培地に荷重、圧力をかける。また培地槽タンクを上下振動駆動装置で揺さぶり、胎児が母体から受ける鼓動、呼吸による体液の圧迫、歩行時や運動等の動的な物理的刺激を生体外で再生させる回転荷重加圧培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、母体が胎児に与える物理的刺激に類似した刺激環境を生体外で物理的刺激を可能とした、培養装置及び培養方法、培養物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の細胞・組織は生理化学的な刺激のみでなく、色々な物理的刺激も受けており、その刺激により、分化・増殖・代謝などの生理学的な機能を発揮している。近年、医療あるいはその関連分野で、生体から採取した細胞あるいは組織を生体外培養し、細胞あるいは組織の再生を図る研究が盛んに行われてきた。
【０００３】
まず培養皿での静止培養、試験管を回転させ培養する回転培養、組織を収縮させる収縮培養、電気による刺激の電気培養、培地に圧力をかけ細胞に静水圧をかける静水圧培養等が開発実施されてきた。
【０００４】
これまでこのような物理的刺激を利用した細胞の分化・増殖組織培養方法や培養装置の検討実施は幾つか行われ、その結果、細胞培養を効率よく行うためには、細胞の培養環境を、最適な培養環境条件で細胞培養を行う必要があるとしている。
【０００５】
皮膚、角膜、軟骨については、多くの研究、臨床例が発表されており、培養装置も支持体中の骨、軟骨の培養方法に静水圧荷重培養装置に多くの研究者、研究機関、企業が開発を進めている。この培養方法は細胞に５ＭＰａ〜３０ＭＰａもの水圧がかけられている。多くの研究者がこの静水圧刺激方法が３次元培養に最も効果的としているが、もしこの荷重が水圧でなく機械的荷重であれば生体の細胞、組織は完全に破壊される程の圧力であり、この培地を介しての静水圧は細胞と培地の密度に差が無く、細胞内圧と培地からの加圧による外圧とが、殆ど差がない状態で圧力的に釣り合っていると思われる。深海魚が３，０００メートルもの深海で生息できるのもこのためであると想定される。
【０００６】
また米国のＮＡＳＡが開発した擬微小重力環境の細胞培養装置ＲＷＶ回転バイオリアクターを利用した実験で、マサチューセッツ工科大学のフリードらの実験が有名である。彼女らはウシの関節軟骨細胞を、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）でできた足場材料に播種し、ＲＷＶ回転バイオリアクターに移した後、スペースシャトルでミール宇宙ステーションに運び４ヶ月培養した後、スペースシャトルで地上に帰還させた。地上でＲＷＶ回転バイオリアクターを用いて培養軟骨の比較から、できあがった組織の形状は地上ではもとの形を反映していたが、ミールではほぼ球形であったり、重量はミールより地上のほうが大きく、機械的性質は地上で得られたものの方が軟骨に近かった。これらの事柄からも必ずしも、微小重力環境が３次元組織構築に有利であるわけでなく、適度な力学的刺激が必要であることを物語っていると記されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のように細胞、組織培養には適度な力学刺激が必要とされているが、前記、細胞培養システムは生体本来の力学刺激を再現したシステムであると言うには、十分ではなく欠けた点、改良すべき点も多い。
【０００８】
動物の受精卵から誕生の過程に興味ある違いがある。爬虫類・例えばワニは護岸の地中に受精卵を生み自然環境で誕生させる。鳥類・例えばニワトリは受精卵を親鳥が温め、受精卵を一日数回程度、回転させる。哺乳類は受精卵子を母体内で生育し、栄養、酸素を母体から補給され母体体温に包まれた胎児には母体から栄養等の供給だけでなく、心音、横隔膜からの拍動圧を受け、さらに母体の歩行時や運動時等により上下、前後等に動的刺激を受けている。
【０００９】
爬虫類のように冷血動物は母体からの保温は期待できず自然の温度に頼り、ニワトリ等、恒温動物は親鳥の３７度程度の体温で温め、さらに受精卵を一日数回、回転させる動的刺激も必要であり、哺乳類も母体内の環境、物理的刺激等を負荷させる必要がある。
【００１０】
本発明は簡便な装置で胎児に与える生体環境、心臓による鼓動刺激、横隔膜による拍動圧、運動による胎児が受ける動的刺激等に類似した生体環境の再現と、無菌環境下で長期培養可能環境かつ汎用性を有する培養装置と培養方法、培養物の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決すべく鋭意研究し、回転駆動装置と培地槽タンク、回転荷重装置、ガス透過膜を備えたガス交換器、上下振動駆動装置とからなる細胞培養装置が、簡便な構成でかつ低コストでＥＳ細胞を含め種種の細胞組織の再生に最適な環境を創出する事が可能な培養装置を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は下記のとおりである。
【００１３】
本発明にかかる細胞組織培養装置、細胞の培養に関して細胞の形成しうる組織の培養を行う。回転駆動装置で培地槽タンクを回転させると微小重力環境になり、胎児が羊水に包まれてふわふわと浮いた状態になり、細胞と液体培養培地とは培地槽タンク内に満たされ、培地槽タンクの水平方向に沿って回転させる。回転速度は細胞の沈降速度に同調するように調整を行い、細胞は設定された回転速度の培地中に均一な状態に懸濁される。懸濁した細胞は、最小のシェアストレス（ズリ応力）下で長時間の培養の過程で、細胞間接触による集合体を形成しながら相対的位置に保持される。
【００１４】
これらの培養方法に関しては多くの研究者によって立証されている。国内においてもＲＷＶ回転バイオリアクターを用いて長径１．５ｃｍの軟骨塊を構築したとしている。しかし軟骨細胞の集合体ではあるが生体に移植可能な軟骨とは言い難い。
【００１５】
必ずしも、微小重力環境が３次元組織構築に有利であるわけでなく、適度な力学的刺激が必要であることを物語っている。骨という硬い組織は最初から硬かったわけではなく、胎生期にまず軟骨が作られ、これが除除に石灰化しているようで、適度の力学刺激を回転培養装置に付加することができれば、生物の発生や進化を考える上でも、とても重要な技術に発展する可能性を秘めている。
【００１６】
ここで本発明は前記培養方法に荷重加圧刺激を加え、より完熟した細胞組織の培養方法である。まず回転駆動装置で培地槽タンク内に培地、細胞を満たした培地槽タンクを回転させ、培地槽タンクに備えられた回転荷重装置内のピストンが培地槽タンクを回転させると回転荷重装置内の荷重用ピストンは上昇、下降を行い培地と回転荷重装置内ピストンとの仕切シートに自重荷重あるいは衝撃荷重をかけ、培地を介して細胞、細胞を含む担体に荷重、加圧、振動刺激を与える。
【００１７】
また荷重用ピストンの形状、重量が可変可能であり、回転荷重装置の形状を変えることで、荷重刺激を変化させることが出来る。例えば荷重部のパイプ形状の上部を回転逆方向に曲げ、内部ピストンを球形状にし、回転荷重部が直立方向に上昇するまで、球形状ピストンを留め、直立方向になった時点で球状荷重ピストンは急斜面を転がり落ちるようになり衝撃落下荷重となる。これはトントンとした心臓の鼓動に類似した刺激になる。
【００１８】
また回転荷重部内に円柱形状ピストンとし回転荷重部のパイプ形状が直立になるような構造とし、回転荷重装置が直立方向に上昇移動すると、早い位地で円柱形状ピストンは仕切フイルムに接触し、直立時に円柱形状ピストン重量の殆どが仕切シートにかかる。これは横隔膜が生体内部の体液に加圧する環境に類似した環境の再生を目指す。
【００１９】
さらに生体の歩行時、あるいは運動時にかかる大きな荷重刺激の再生には、回転駆動装置、培地槽タンク、回転荷重装置、ガス交換器を上下振動駆動装置で上下と前後に揺さぶり、母体の歩行、運動時と類似した刺激の再現を細胞、組織に加える。
【００２０】
培地槽タンクの両面はガス透過膜で構成されたガス交換器を取り付けており、これは長期培養の目的だけでなく、培地にシェアストレス（ズリ応力）を発生させるための構造でもある。液体を入れたゴム風船に上下運動をかけると、風船は液体の重さ、重力で変形し、ゴム風船内部の液体もゴム風船の変形に伴って変形しシェアストレス（ズリ応力）刺激効果が発生する。
【００２１】
培地槽タンクの形状は太鼓の形状に類似し、培地槽タンクの両側にガス透過膜で構成したことで内部培地細胞、細胞を含んだ担体にシェアストレス（ズリ応力）、振動、変形加圧の発生を起こしやすい構造とした。
【００２２】
細胞を含んだ培地を培地槽タンク内に注入し、混濁した培地内の細胞を培養する場合に、ただ細胞の塊を培養を行うことが目的でなく、移植医療に利用しやすい形状、性質が求められている。
【００２３】
そのために培地槽タンク内に細胞の足場、または細胞が播種するための細胞サポートを形成する必要がある。その解決方法として、フレーム（生体適合材）に絹糸等（生体適合材繊維）で網状の形状を作り、その網状の形状は目的形状以外の部分は編み目を粗にし、目的の形状、例えば径１０ｍｍの円形状培養物が希望の場合、培地槽タンク中央部の位地に絹糸等で編み目の間隔を５ミクロンから９０ミクロン程度の間隔の編み目で、外径１０ｍｍの形状に作り、その編み目形状に細胞が捕らえられ、培養を行い、細胞間結合を行う。
【００２４】
また足場サポートの一部を二層、三層になるよう構成し、その網の間に細胞を播種したシートを重ね二層、三層の細胞組織になるようにする多層足場サポートで目的の３次元細胞、組織の再生を行う。
【００２５】
この足場サポートに直接、足場フイルムから絹糸等（生体適合材繊維）でフレームに固定し、培養皿で静止培養を行う場合でも、フレーム径だけ足場と培養皿の底面が離れ、培養皿に培養フイルムが接着されることはなく、またフイルムと培養皿底面との間隔には、培地があり、培養フイルムは両面から培養される可能性もある。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の回転荷重加圧培養装置は生体のあらゆる部分の細胞組織培養用として応用可能なシステムであるが、さらに国内でも研究実験が解禁されたＥＳ細胞培養への応用が挙げられる。生体の胎児の環境は羊膜に包まれた羊水中をふわふわとした環境で、母体の心臓による心音刺激、横隔膜からの拍動圧力、歩行、運動時からの動的刺激等を周期的あるいは変動的な圧力刺激を受けている。本発明は、まさにこの環境の再現で、ＥＳ細胞の培養により細胞の分化等のメカニズムが解明できれば、細胞分化の逆方向からの培養の可能性もでてくる。回転荷重圧力培養装置培養方法は、まさに再生医療の培養方法の奔流になる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の実施のための形態の例を図１を用いて説明する。
【００２８】
本発明にかかる回転荷重加圧培養装置は、図１にも示すように、回転駆動装置（２）、培地槽タンク（５）、培地槽タンク（５）の両側に装置されたガス交換器（４）、円柱用回転荷重装置（７）、球状用回転荷重装置（８）と上下振動駆動装置（３）を備え、培養実験によっては密封ケース（６）を装備する。またこれらは炭酸ガスインキュベーター（１４）内に備えるられることが望ましい。
【００２９】
回転駆動装置（２）から回転板（１３）を通じて培地槽タンク（５）に回転運動が伝達される。培地槽タンク（５）に備えられたガス交換器（４）から挿入された細胞を含む培地を満タンにした培地槽タンク（５）を回転させる。回転速度は培地より比重の大きい細胞の沈降速度に同調するよう調節を行い、回転を行うと細胞は培地中に均一に懸濁される。
【００３０】
前記の環境に円柱用回転加重装置（７）と球状用回転加重装置（８）の荷重が細胞を含む培地に力学刺激が加えられる。まず円柱用回転荷重装置（７）はゆっくりと円柱ピストン荷重がかけられ、生体の呼吸による加圧刺激に類似した刺激、球状用回転荷重装置（８）は球状ピストンが落下し衝撃荷重をかけ、心音の刺激に類似した力学刺激が加えられる。
【００３１】
回転駆動部（２）と円柱用回転荷重装置（７）、球状用回転荷重装置（８）、ガス交換器（４）を装着した培地槽タンク（５）、実験によっては密封ケース（６）を備えた回転荷重圧力培養装置を上下振動駆動装置（３）で上下、前後移動等の母体が胎児に与える心音、呼吸による拍動圧力、歩行等の運動刺激を細胞、あるいは組織に力学刺激を発生させる。
【００３２】
培地槽タンク（５）内に図５の足場サポート（４０）、（４１）のフレーム（３１）を固定できるような構造にし、培地槽タンク（５）内に図５の足場サポートを装着し、足場サポートは中央部を求める形状が密に（５ミクロンから９０ミクロン程度の間隔）編まれた網状足場（３３）に細胞を求める形状に播種し、前記、回転加重加圧培養装置、培養方法で培養を行う。網状足場（３３）以外は培地や細胞に影響を与えないよ絹糸（３２）を粗く編む特徴の網とする。
【００３３】
培地槽タンク（５）内に図６の多層足場サポート（４２）のフレーム（３１）を固定できるような構造にし、図６の多層足場サボート（４２）の目的に応じた形状、大きさの細胞を含んだ培養担体（３７）を上下の網で挟み培地槽タンク（５）に固定し、前記、回転荷重加圧培養装置、培養方法で力学刺激を加え３次元培養を行う。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例を揚げて更に詳しく本発明を説明する。しかし本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３５】
（実施例１）足場サポート無しの培養方法。
以下、本発明の回転荷重加圧培養装置を図１を用いて説明する。
回転駆動装置（２）の回転は制御コンピューター（１）で回転を制御し、制御された回転を回転板（１３）に伝え、回転板（１３）に固定された培地槽タンク（５）が回転される。培地槽タンク（５）両側には脱着可能なガス交換器（４）と円柱用回転荷重装置（７）と球状用回転荷重装置（８）が装備され、培地槽タンク（５）を回転させると円柱用回転荷重装置（７）内と球状用回転荷重装置（８）内の荷重ピストンが培地との仕切シート（２３）に荷重をかけ、培地を介して細胞に荷重、圧力がかかる。培地槽タンク（５）の回転荷重装置の固定面を４面とし、球状用回転荷重装置（８）を４面に取り付け、円柱用回転荷重装置を１面とし、培地槽タンクを４秒１回転とすると、球状用回転荷重装置（８）は１秒に１回荷重を行い、１分間に６０回の荷重刺激になる。この荷重は球状ピストンが荷重装置内を転がり落ち、心臓の鼓動に類似した、トントンとした荷重を仕切シートにかける。また円柱用回転荷重装置（７）は４秒間で１荷重を行い１分間に１６回程度となり、この刺激はゆっくりと、傾きに沿って自重をかけ直立時に最大荷重になり、呼吸による刺激に類似した刺激となる。
【００３６】
さらに制御コンピューター（１）でアクチュエーターを制御し上下振動駆動装置（３）により培地槽タンク（５）を上下させ、目的荷重時間を設定し、母体が歩行、運動による胎児に与える刺激に類似した環境の刺激を体外で発生させる。生体の胎児は母親の心音、呼吸による拍動圧迫、歩行、運動による動的刺激を絶えず受けており、母体の環境に類似した環境を体外で再現する回転荷重圧力培養装置。
【００３７】
（実施例２）足場サポトを装着した培養方法。
回転荷重加圧培養装置の培地槽タンク（５）内に、図５の足場サポート（４０）を装着し、培地に細胞を混濁し、制御コンピューター（１）で回転駆動装置（２）で培地槽タンク（５）を回転させ、細胞の沈降速度に同調するように調整を行い、細胞は設定された回転速度の培地中に均一な状態で懸濁する。この状態の細胞を足場サポート（４０）の網状足場（３３）にすくわれ播種する。
【００３８】
図６の多層足場サポート（４２）に、シート状の細胞を含む担体シート（３７）をフレーム（３１）の絹糸（３２）に載せ、上部固定用フレーム（３５）を被せ、上部固定用絹糸（３６）で挟み、回転荷重加圧培養装置の培地槽タンク（５）内に装着し、制御コンピューター（１）で回転駆動装置（２）を回転させ、回転板（１３）に取り付けられた培地槽タンク（５）を回転させ、円柱用回転荷重装置（７）、球状用回転荷重装置（８）に内装された円柱ピストン（２６）、球状ピストン（２７）から仕切シート（２３）に荷重、加圧をかけ、培地を介して細胞を含む担体シート（３７）に物理的刺激を付加する。また上下振動駆動装置（３）に制御コンピューター（１）に指定された時間内で上下に培地槽タンク（５）を揺さぶり、ガス交換器（４）にセットされたガス透過膜を伸縮させ、培地にシェアストレス（ズリ応力）をかける。
【００３９】
回転板（１３）に培地槽タンク（５）、円柱用回転荷重装置（７）、球状用回転荷重装置（８）、ガス交換器（４）を内装できる密封ケース（６）を留め、酸素、炭酸ガス、気圧等を変化させ細胞に及ぼす影響を調べる実験装置。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、生体組織のあらゆる部分の細胞培養として応用可能なシステムであるが、特にＥＳ細胞の培養への応用が挙げられる。現在、ＥＳ細胞の培養には未知の部分も多く、倫理的問題もあり実験、研究を禁止した国も多くある。しかし、この分野の研究は無限の可能性も含んでいるのも事実で、米国ではＥＳ細胞の実験、研究は盛んに行われている。国内も実験に限ってＥＳ細胞の培養研究が昨年、認可された。この分野の実験装置としても、また再生医療分野においても、角膜、軟骨、臓器の培養等にも利用でき、骨、軟骨はつねに圧力負荷の中にあり、本発明は生体の圧力負荷を忠実に再現し、軟骨細胞の増殖、機能再現、軟骨組織の強化、軟骨の形状（半月板等）も、目的に応じた形に培養可能である。また本発明の培養システムは極めて簡単な構造で数種類の物理的刺激を発生させ、また細胞、組織の培養部分は培地槽タンクとそれに付随した部品で構成しており、医療用に培養を行うときは、他人の細胞や培養組織、感染症等の発生が無いように、培地槽タンクと付属部分は全て使い捨てが可能である。このように本発明は安全の面からも、自家培養組織の移植医療とされている再生医療分野での産業応用まで可能な培養装置である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に係る細胞培養装置の一例を模式的に表した概略図である。
【図２】図２は、細胞培養装置本体装置部分の一例を模式的に表した概略図である。
【図３】図３は、回転荷重装置で円柱ピストンを内装した断面図。
【図４】図４は、回転荷重装置で球状ピストンを内装した断面図。
【図５】図５は、培地槽タンク内に固定する足場サポートの概略図。
【図６】図６は、培地槽タンク内に固定する多層足場サポートの概略図。
【符号の説明】
１：制御コンピューター
２：回転駆動装置
３：上下振動駆動装置
４：ガス交換器
５：培地槽タンク
６：密封ケース
７：円柱用回転荷重装置
８：球状用回転荷重装置
９：上下移動用支柱
１０：アクチュエーターシリンダー
１１：培地注入排出調節コック
１２：ガス注入排出調節コック
１３：回転板
１４：炭酸ガスインキュベーター
２０：回転荷重装置ピストン移動パイプ
２１：ピストン移動用パイプ固定ネジ
２２：培地槽タンク荷重装置取り付け部分
２３：仕切シート
２４：パッキン
２５：回転荷重装置ジョイントネジ
２６：円柱ピストン
２７：球状ピストン
３１：フレーム
３２：絹糸
３３：網状足場
３５：上部固定用フレーム
３６：上部固定用絹糸
３７：細胞を含む担体シート
４０：角形網状足場サポート
４１：丸形網状足場サポート
４２：多層足場サポート
【技術分野】
【０００１】
本発明は、母体が胎児に与える物理的刺激に類似した刺激環境を生体外で物理的刺激を可能とした、培養装置及び培養方法、培養物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の細胞・組織は生理化学的な刺激のみでなく、色々な物理的刺激も受けており、その刺激により、分化・増殖・代謝などの生理学的な機能を発揮している。近年、医療あるいはその関連分野で、生体から採取した細胞あるいは組織を生体外培養し、細胞あるいは組織の再生を図る研究が盛んに行われてきた。
【０００３】
まず培養皿での静止培養、試験管を回転させ培養する回転培養、組織を収縮させる収縮培養、電気による刺激の電気培養、培地に圧力をかけ細胞に静水圧をかける静水圧培養等が開発実施されてきた。
【０００４】
これまでこのような物理的刺激を利用した細胞の分化・増殖組織培養方法や培養装置の検討実施は幾つか行われ、その結果、細胞培養を効率よく行うためには、細胞の培養環境を、最適な培養環境条件で細胞培養を行う必要があるとしている。
【０００５】
皮膚、角膜、軟骨については、多くの研究、臨床例が発表されており、培養装置も支持体中の骨、軟骨の培養方法に静水圧荷重培養装置に多くの研究者、研究機関、企業が開発を進めている。この培養方法は細胞に５ＭＰａ〜３０ＭＰａもの水圧がかけられている。多くの研究者がこの静水圧刺激方法が３次元培養に最も効果的としているが、もしこの荷重が水圧でなく機械的荷重であれば生体の細胞、組織は完全に破壊される程の圧力であり、この培地を介しての静水圧は細胞と培地の密度に差が無く、細胞内圧と培地からの加圧による外圧とが、殆ど差がない状態で圧力的に釣り合っていると思われる。深海魚が３，０００メートルもの深海で生息できるのもこのためであると想定される。
【０００６】
また米国のＮＡＳＡが開発した擬微小重力環境の細胞培養装置ＲＷＶ回転バイオリアクターを利用した実験で、マサチューセッツ工科大学のフリードらの実験が有名である。彼女らはウシの関節軟骨細胞を、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）でできた足場材料に播種し、ＲＷＶ回転バイオリアクターに移した後、スペースシャトルでミール宇宙ステーションに運び４ヶ月培養した後、スペースシャトルで地上に帰還させた。地上でＲＷＶ回転バイオリアクターを用いて培養軟骨の比較から、できあがった組織の形状は地上ではもとの形を反映していたが、ミールではほぼ球形であったり、重量はミールより地上のほうが大きく、機械的性質は地上で得られたものの方が軟骨に近かった。これらの事柄からも必ずしも、微小重力環境が３次元組織構築に有利であるわけでなく、適度な力学的刺激が必要であることを物語っていると記されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のように細胞、組織培養には適度な力学刺激が必要とされているが、前記、細胞培養システムは生体本来の力学刺激を再現したシステムであると言うには、十分ではなく欠けた点、改良すべき点も多い。
【０００８】
動物の受精卵から誕生の過程に興味ある違いがある。爬虫類・例えばワニは護岸の地中に受精卵を生み自然環境で誕生させる。鳥類・例えばニワトリは受精卵を親鳥が温め、受精卵を一日数回程度、回転させる。哺乳類は受精卵子を母体内で生育し、栄養、酸素を母体から補給され母体体温に包まれた胎児には母体から栄養等の供給だけでなく、心音、横隔膜からの拍動圧を受け、さらに母体の歩行時や運動時等により上下、前後等に動的刺激を受けている。
【０００９】
爬虫類のように冷血動物は母体からの保温は期待できず自然の温度に頼り、ニワトリ等、恒温動物は親鳥の３７度程度の体温で温め、さらに受精卵を一日数回、回転させる動的刺激も必要であり、哺乳類も母体内の環境、物理的刺激等を負荷させる必要がある。
【００１０】
本発明は簡便な装置で胎児に与える生体環境、心臓による鼓動刺激、横隔膜による拍動圧、運動による胎児が受ける動的刺激等に類似した生体環境の再現と、無菌環境下で長期培養可能環境かつ汎用性を有する培養装置と培養方法、培養物の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決すべく鋭意研究し、回転駆動装置と培地槽タンク、回転荷重装置、ガス透過膜を備えたガス交換器、上下振動駆動装置とからなる細胞培養装置が、簡便な構成でかつ低コストでＥＳ細胞を含め種種の細胞組織の再生に最適な環境を創出する事が可能な培養装置を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は下記のとおりである。
【００１３】
本発明にかかる細胞組織培養装置、細胞の培養に関して細胞の形成しうる組織の培養を行う。回転駆動装置で培地槽タンクを回転させると微小重力環境になり、胎児が羊水に包まれてふわふわと浮いた状態になり、細胞と液体培養培地とは培地槽タンク内に満たされ、培地槽タンクの水平方向に沿って回転させる。回転速度は細胞の沈降速度に同調するように調整を行い、細胞は設定された回転速度の培地中に均一な状態に懸濁される。懸濁した細胞は、最小のシェアストレス（ズリ応力）下で長時間の培養の過程で、細胞間接触による集合体を形成しながら相対的位置に保持される。
【００１４】
これらの培養方法に関しては多くの研究者によって立証されている。国内においてもＲＷＶ回転バイオリアクターを用いて長径１．５ｃｍの軟骨塊を構築したとしている。しかし軟骨細胞の集合体ではあるが生体に移植可能な軟骨とは言い難い。
【００１５】
必ずしも、微小重力環境が３次元組織構築に有利であるわけでなく、適度な力学的刺激が必要であることを物語っている。骨という硬い組織は最初から硬かったわけではなく、胎生期にまず軟骨が作られ、これが除除に石灰化しているようで、適度の力学刺激を回転培養装置に付加することができれば、生物の発生や進化を考える上でも、とても重要な技術に発展する可能性を秘めている。
【００１６】
ここで本発明は前記培養方法に荷重加圧刺激を加え、より完熟した細胞組織の培養方法である。まず回転駆動装置で培地槽タンク内に培地、細胞を満たした培地槽タンクを回転させ、培地槽タンクに備えられた回転荷重装置内のピストンが培地槽タンクを回転させると回転荷重装置内の荷重用ピストンは上昇、下降を行い培地と回転荷重装置内ピストンとの仕切シートに自重荷重あるいは衝撃荷重をかけ、培地を介して細胞、細胞を含む担体に荷重、加圧、振動刺激を与える。
【００１７】
また荷重用ピストンの形状、重量が可変可能であり、回転荷重装置の形状を変えることで、荷重刺激を変化させることが出来る。例えば荷重部のパイプ形状の上部を回転逆方向に曲げ、内部ピストンを球形状にし、回転荷重部が直立方向に上昇するまで、球形状ピストンを留め、直立方向になった時点で球状荷重ピストンは急斜面を転がり落ちるようになり衝撃落下荷重となる。これはトントンとした心臓の鼓動に類似した刺激になる。
【００１８】
また回転荷重部内に円柱形状ピストンとし回転荷重部のパイプ形状が直立になるような構造とし、回転荷重装置が直立方向に上昇移動すると、早い位地で円柱形状ピストンは仕切フイルムに接触し、直立時に円柱形状ピストン重量の殆どが仕切シートにかかる。これは横隔膜が生体内部の体液に加圧する環境に類似した環境の再生を目指す。
【００１９】
さらに生体の歩行時、あるいは運動時にかかる大きな荷重刺激の再生には、回転駆動装置、培地槽タンク、回転荷重装置、ガス交換器を上下振動駆動装置で上下と前後に揺さぶり、母体の歩行、運動時と類似した刺激の再現を細胞、組織に加える。
【００２０】
培地槽タンクの両面はガス透過膜で構成されたガス交換器を取り付けており、これは長期培養の目的だけでなく、培地にシェアストレス（ズリ応力）を発生させるための構造でもある。液体を入れたゴム風船に上下運動をかけると、風船は液体の重さ、重力で変形し、ゴム風船内部の液体もゴム風船の変形に伴って変形しシェアストレス（ズリ応力）刺激効果が発生する。
【００２１】
培地槽タンクの形状は太鼓の形状に類似し、培地槽タンクの両側にガス透過膜で構成したことで内部培地細胞、細胞を含んだ担体にシェアストレス（ズリ応力）、振動、変形加圧の発生を起こしやすい構造とした。
【００２２】
細胞を含んだ培地を培地槽タンク内に注入し、混濁した培地内の細胞を培養する場合に、ただ細胞の塊を培養を行うことが目的でなく、移植医療に利用しやすい形状、性質が求められている。
【００２３】
そのために培地槽タンク内に細胞の足場、または細胞が播種するための細胞サポートを形成する必要がある。その解決方法として、フレーム（生体適合材）に絹糸等（生体適合材繊維）で網状の形状を作り、その網状の形状は目的形状以外の部分は編み目を粗にし、目的の形状、例えば径１０ｍｍの円形状培養物が希望の場合、培地槽タンク中央部の位地に絹糸等で編み目の間隔を５ミクロンから９０ミクロン程度の間隔の編み目で、外径１０ｍｍの形状に作り、その編み目形状に細胞が捕らえられ、培養を行い、細胞間結合を行う。
【００２４】
また足場サポートの一部を二層、三層になるよう構成し、その網の間に細胞を播種したシートを重ね二層、三層の細胞組織になるようにする多層足場サポートで目的の３次元細胞、組織の再生を行う。
【００２５】
この足場サポートに直接、足場フイルムから絹糸等（生体適合材繊維）でフレームに固定し、培養皿で静止培養を行う場合でも、フレーム径だけ足場と培養皿の底面が離れ、培養皿に培養フイルムが接着されることはなく、またフイルムと培養皿底面との間隔には、培地があり、培養フイルムは両面から培養される可能性もある。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の回転荷重加圧培養装置は生体のあらゆる部分の細胞組織培養用として応用可能なシステムであるが、さらに国内でも研究実験が解禁されたＥＳ細胞培養への応用が挙げられる。生体の胎児の環境は羊膜に包まれた羊水中をふわふわとした環境で、母体の心臓による心音刺激、横隔膜からの拍動圧力、歩行、運動時からの動的刺激等を周期的あるいは変動的な圧力刺激を受けている。本発明は、まさにこの環境の再現で、ＥＳ細胞の培養により細胞の分化等のメカニズムが解明できれば、細胞分化の逆方向からの培養の可能性もでてくる。回転荷重圧力培養装置培養方法は、まさに再生医療の培養方法の奔流になる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の実施のための形態の例を図１を用いて説明する。
【００２８】
本発明にかかる回転荷重加圧培養装置は、図１にも示すように、回転駆動装置（２）、培地槽タンク（５）、培地槽タンク（５）の両側に装置されたガス交換器（４）、円柱用回転荷重装置（７）、球状用回転荷重装置（８）と上下振動駆動装置（３）を備え、培養実験によっては密封ケース（６）を装備する。またこれらは炭酸ガスインキュベーター（１４）内に備えるられることが望ましい。
【００２９】
回転駆動装置（２）から回転板（１３）を通じて培地槽タンク（５）に回転運動が伝達される。培地槽タンク（５）に備えられたガス交換器（４）から挿入された細胞を含む培地を満タンにした培地槽タンク（５）を回転させる。回転速度は培地より比重の大きい細胞の沈降速度に同調するよう調節を行い、回転を行うと細胞は培地中に均一に懸濁される。
【００３０】
前記の環境に円柱用回転加重装置（７）と球状用回転加重装置（８）の荷重が細胞を含む培地に力学刺激が加えられる。まず円柱用回転荷重装置（７）はゆっくりと円柱ピストン荷重がかけられ、生体の呼吸による加圧刺激に類似した刺激、球状用回転荷重装置（８）は球状ピストンが落下し衝撃荷重をかけ、心音の刺激に類似した力学刺激が加えられる。
【００３１】
回転駆動部（２）と円柱用回転荷重装置（７）、球状用回転荷重装置（８）、ガス交換器（４）を装着した培地槽タンク（５）、実験によっては密封ケース（６）を備えた回転荷重圧力培養装置を上下振動駆動装置（３）で上下、前後移動等の母体が胎児に与える心音、呼吸による拍動圧力、歩行等の運動刺激を細胞、あるいは組織に力学刺激を発生させる。
【００３２】
培地槽タンク（５）内に図５の足場サポート（４０）、（４１）のフレーム（３１）を固定できるような構造にし、培地槽タンク（５）内に図５の足場サポートを装着し、足場サポートは中央部を求める形状が密に（５ミクロンから９０ミクロン程度の間隔）編まれた網状足場（３３）に細胞を求める形状に播種し、前記、回転加重加圧培養装置、培養方法で培養を行う。網状足場（３３）以外は培地や細胞に影響を与えないよ絹糸（３２）を粗く編む特徴の網とする。
【００３３】
培地槽タンク（５）内に図６の多層足場サポート（４２）のフレーム（３１）を固定できるような構造にし、図６の多層足場サボート（４２）の目的に応じた形状、大きさの細胞を含んだ培養担体（３７）を上下の網で挟み培地槽タンク（５）に固定し、前記、回転荷重加圧培養装置、培養方法で力学刺激を加え３次元培養を行う。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例を揚げて更に詳しく本発明を説明する。しかし本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３５】
（実施例１）足場サポート無しの培養方法。
以下、本発明の回転荷重加圧培養装置を図１を用いて説明する。
回転駆動装置（２）の回転は制御コンピューター（１）で回転を制御し、制御された回転を回転板（１３）に伝え、回転板（１３）に固定された培地槽タンク（５）が回転される。培地槽タンク（５）両側には脱着可能なガス交換器（４）と円柱用回転荷重装置（７）と球状用回転荷重装置（８）が装備され、培地槽タンク（５）を回転させると円柱用回転荷重装置（７）内と球状用回転荷重装置（８）内の荷重ピストンが培地との仕切シート（２３）に荷重をかけ、培地を介して細胞に荷重、圧力がかかる。培地槽タンク（５）の回転荷重装置の固定面を４面とし、球状用回転荷重装置（８）を４面に取り付け、円柱用回転荷重装置を１面とし、培地槽タンクを４秒１回転とすると、球状用回転荷重装置（８）は１秒に１回荷重を行い、１分間に６０回の荷重刺激になる。この荷重は球状ピストンが荷重装置内を転がり落ち、心臓の鼓動に類似した、トントンとした荷重を仕切シートにかける。また円柱用回転荷重装置（７）は４秒間で１荷重を行い１分間に１６回程度となり、この刺激はゆっくりと、傾きに沿って自重をかけ直立時に最大荷重になり、呼吸による刺激に類似した刺激となる。
【００３６】
さらに制御コンピューター（１）でアクチュエーターを制御し上下振動駆動装置（３）により培地槽タンク（５）を上下させ、目的荷重時間を設定し、母体が歩行、運動による胎児に与える刺激に類似した環境の刺激を体外で発生させる。生体の胎児は母親の心音、呼吸による拍動圧迫、歩行、運動による動的刺激を絶えず受けており、母体の環境に類似した環境を体外で再現する回転荷重圧力培養装置。
【００３７】
（実施例２）足場サポトを装着した培養方法。
回転荷重加圧培養装置の培地槽タンク（５）内に、図５の足場サポート（４０）を装着し、培地に細胞を混濁し、制御コンピューター（１）で回転駆動装置（２）で培地槽タンク（５）を回転させ、細胞の沈降速度に同調するように調整を行い、細胞は設定された回転速度の培地中に均一な状態で懸濁する。この状態の細胞を足場サポート（４０）の網状足場（３３）にすくわれ播種する。
【００３８】
図６の多層足場サポート（４２）に、シート状の細胞を含む担体シート（３７）をフレーム（３１）の絹糸（３２）に載せ、上部固定用フレーム（３５）を被せ、上部固定用絹糸（３６）で挟み、回転荷重加圧培養装置の培地槽タンク（５）内に装着し、制御コンピューター（１）で回転駆動装置（２）を回転させ、回転板（１３）に取り付けられた培地槽タンク（５）を回転させ、円柱用回転荷重装置（７）、球状用回転荷重装置（８）に内装された円柱ピストン（２６）、球状ピストン（２７）から仕切シート（２３）に荷重、加圧をかけ、培地を介して細胞を含む担体シート（３７）に物理的刺激を付加する。また上下振動駆動装置（３）に制御コンピューター（１）に指定された時間内で上下に培地槽タンク（５）を揺さぶり、ガス交換器（４）にセットされたガス透過膜を伸縮させ、培地にシェアストレス（ズリ応力）をかける。
【００３９】
回転板（１３）に培地槽タンク（５）、円柱用回転荷重装置（７）、球状用回転荷重装置（８）、ガス交換器（４）を内装できる密封ケース（６）を留め、酸素、炭酸ガス、気圧等を変化させ細胞に及ぼす影響を調べる実験装置。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、生体組織のあらゆる部分の細胞培養として応用可能なシステムであるが、特にＥＳ細胞の培養への応用が挙げられる。現在、ＥＳ細胞の培養には未知の部分も多く、倫理的問題もあり実験、研究を禁止した国も多くある。しかし、この分野の研究は無限の可能性も含んでいるのも事実で、米国ではＥＳ細胞の実験、研究は盛んに行われている。国内も実験に限ってＥＳ細胞の培養研究が昨年、認可された。この分野の実験装置としても、また再生医療分野においても、角膜、軟骨、臓器の培養等にも利用でき、骨、軟骨はつねに圧力負荷の中にあり、本発明は生体の圧力負荷を忠実に再現し、軟骨細胞の増殖、機能再現、軟骨組織の強化、軟骨の形状（半月板等）も、目的に応じた形に培養可能である。また本発明の培養システムは極めて簡単な構造で数種類の物理的刺激を発生させ、また細胞、組織の培養部分は培地槽タンクとそれに付随した部品で構成しており、医療用に培養を行うときは、他人の細胞や培養組織、感染症等の発生が無いように、培地槽タンクと付属部分は全て使い捨てが可能である。このように本発明は安全の面からも、自家培養組織の移植医療とされている再生医療分野での産業応用まで可能な培養装置である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に係る細胞培養装置の一例を模式的に表した概略図である。
【図２】図２は、細胞培養装置本体装置部分の一例を模式的に表した概略図である。
【図３】図３は、回転荷重装置で円柱ピストンを内装した断面図。
【図４】図４は、回転荷重装置で球状ピストンを内装した断面図。
【図５】図５は、培地槽タンク内に固定する足場サポートの概略図。
【図６】図６は、培地槽タンク内に固定する多層足場サポートの概略図。
【符号の説明】
１：制御コンピューター
２：回転駆動装置
３：上下振動駆動装置
４：ガス交換器
５：培地槽タンク
６：密封ケース
７：円柱用回転荷重装置
８：球状用回転荷重装置
９：上下移動用支柱
１０：アクチュエーターシリンダー
１１：培地注入排出調節コック
１２：ガス注入排出調節コック
１３：回転板
１４：炭酸ガスインキュベーター
２０：回転荷重装置ピストン移動パイプ
２１：ピストン移動用パイプ固定ネジ
２２：培地槽タンク荷重装置取り付け部分
２３：仕切シート
２４：パッキン
２５：回転荷重装置ジョイントネジ
２６：円柱ピストン
２７：球状ピストン
３１：フレーム
３２：絹糸
３３：網状足場
３５：上部固定用フレーム
３６：上部固定用絹糸
３７：細胞を含む担体シート
４０：角形網状足場サポート
４１：丸形網状足場サポート
４２：多層足場サポート
【特許請求の範囲】
【請求項１】
回転駆動装置と連結さた培地槽タンクで構成し、培養槽タンクには脱着可能なガス透過膜を備えたガス交換器と、生体適合材仕切シート（ガス透過膜を含む）で培地と仕切られた回転荷重装置で、回転荷重装置内部には荷重用ピストンを内装し、回転駆動装置で培地槽タンクを回転させる事で培地槽タンク内の培地に生体適合材仕切シート（ガス透過膜を含む）を介して荷重用ピストンが荷重加圧を加え、細胞または細胞を含む担体に荷重加圧を行い、母体が胎児に与える心臓による鼓動刺激や呼吸による横隔膜の拍動加圧刺激に類似した刺激の再現を可能にした回転荷重加圧培養装置。
【請求項２】
回転荷重ピストンと培地槽タンク内培地の間は、生体適合材仕切シート（ガス透過膜を含む）で仕切られ、培地槽タンクを回転させる事で回転荷重装置内荷重用ピストンが上下運動を行い生体適合材仕切シート（ガス透過膜を含む）を介して培地に荷重加圧を行う。回転荷重装置と培地槽タンクとは脱着可能で０本荷重から複数本荷重まで可変可能で、培地槽タンクの回転数により回転荷重装置を複数本装着し、刺激方法を回転荷重装置の数、内部のピストンの重量、形状を取り替える事で荷重加圧刺激を可変可能とした回転荷重加圧培養装置。
【請求項３】
請求項１、請求項２を備えた培地槽タンクと回転荷重装置とは着脱可能で回転荷重装置を変えることで、荷重や加圧方法を可変可能とした請求項１、請求項２記載の回転荷重加圧培養装置、培養方法で得られる細胞、組織培養物。
【請求項４】
請求項１、請求項２記載の回転荷重加圧培養装置をアクチュエーターで上下に上げ下げを繰り返す上下振動駆動装置を備え、培地槽タンク内の培地を上下に揺さぶり、生体の羊水に包まれた胎児が母体歩行時に受ける動的刺激環境に類似した動的刺激環境を発生させる回転荷重加圧培養装置。
【請求項５】
請求項１、請求項２、請求項４を備えた回転荷重加圧培養装置、培養方法で得られた細胞、組織培養物。
【請求項６】
前記培地槽タンク、ガス交換器を、回転荷重装置、回転駆動装置、上下振動駆動装置は炭酸ガスインキュベーター内で操作できることを特徴とした請求項１、請求項２、請求項４に記載された回転荷重加圧培養装置。
【請求項７】
前記記載の培地槽タンク、ガス交換器、回転荷重装置をガス注入可能な密封ケース内に納め、酸素、窒素の含有量や気圧を可変とした請求項１、請求項２、請求項４に記載された回転荷重加圧培養装置。
【請求項８】
回転荷重装置はピストンの移動速度を変化させるよう、回転荷重装置のパイプ形状を直線的な構造や、上部一部を曲げ、ピストンが上部傾斜角が直立方向に近くなるまで留め、荷重速度を変化させ、落下衝撃や緩やかな自重荷重が行える請求項１、請求項２、請求項４と請求項６、請求項７に記載された回転荷重加圧培養装置。
【請求項９】
請求項８に記載された荷重部の上部一部を曲げた荷重部内のピストン形状を球形状とし、真っ直ぐな形状の荷重部内部のピストンは円柱形状とし、球体荷重は落下衝撃を発生させ、円柱荷重は自重をかける荷重とし、ピストン形状を変える事で荷重を変化させる請求項１、請求項２，請求項４と請求項６、請求項７に記載された回転荷重加圧培養装置。
【請求項１０】
請求項８、請求項９記載の回転荷重加圧培養装置の培地槽タンクを回転させ細胞あるいは細胞を含む担体を培地中央部で培養し、回転荷重ピストンの荷重を１回転で１荷重とし、４秒１回転とした場合は１分間の呼吸数となるよう生体の呼吸による横隔膜の刺激に類似した荷重加圧になるように構成し、さらに４秒１回転とした場合、１分間の心臓の鼓動と類似した回数に成るよう、一回転で４回荷重加圧となるよう荷重部を４セット装着し、歩行時の運動による振動に類似した物理的刺激を上下振動駆動装置で培地槽タンクを上下する。上下振動駆動装置は１秒に１回を上下サイクルとし、羊水に包まれた胎児の環境に類似した、回転荷重加圧培養装置、培養方法で得られた細胞、組織培養物。
【請求項１１】
培地槽タンク内に収納固定出来る事を特色としフレーム（ステンレス等生体適合材）に絹糸等（生体適合材繊維）で網を張り、細胞が付着しやすいように、網の中央部の指定位置に５ミクロンから９０ミクロン程度の間隔で編み目を目的の形状に作り培地槽内の培養細胞を播種し培養を行う回転荷重加圧培養装置用足場培養網。
【請求項１２】
請求項１１に記載された培養網の一部を袋状（二重構造、三重構造）にし、その中に細胞を播種した足場（生体適合材）を挟み、三次元、あるいは三種類三層の細胞組織培養が出来る回転荷重加圧培養装置用多層足場培養固定網。
【請求項１３】
請求項１１、に記載された回転荷重加圧培養装置用足場培養網を装着して請求項１、請求項２、請求項４、請求項８、請求項９に記載された回転荷重加圧培養装置、培養方法で得られた細胞、組織培養物。
【請求項１４】
請求項１２に記載された回転荷重加圧培養装置用三層足場固定網を装着して、請求項１、請求項２、請求項４、請求項８、請求項９に記載された回転荷重加圧培養装置、培養方法で得られた細胞、組織培養物。
【請求項１５】
フレーム内に絹糸等（生体適合材繊維）で網を作りその中央部に絹製のシートや羊膜等を絹糸等（生体適合材繊維）でシートからフレームまで固定し、固定されたシート上に細胞を播種培養し、培養物が直接培養皿等に接着しないように構成した足場培養網。
【請求項１】
回転駆動装置と連結さた培地槽タンクで構成し、培養槽タンクには脱着可能なガス透過膜を備えたガス交換器と、生体適合材仕切シート（ガス透過膜を含む）で培地と仕切られた回転荷重装置で、回転荷重装置内部には荷重用ピストンを内装し、回転駆動装置で培地槽タンクを回転させる事で培地槽タンク内の培地に生体適合材仕切シート（ガス透過膜を含む）を介して荷重用ピストンが荷重加圧を加え、細胞または細胞を含む担体に荷重加圧を行い、母体が胎児に与える心臓による鼓動刺激や呼吸による横隔膜の拍動加圧刺激に類似した刺激の再現を可能にした回転荷重加圧培養装置。
【請求項２】
回転荷重ピストンと培地槽タンク内培地の間は、生体適合材仕切シート（ガス透過膜を含む）で仕切られ、培地槽タンクを回転させる事で回転荷重装置内荷重用ピストンが上下運動を行い生体適合材仕切シート（ガス透過膜を含む）を介して培地に荷重加圧を行う。回転荷重装置と培地槽タンクとは脱着可能で０本荷重から複数本荷重まで可変可能で、培地槽タンクの回転数により回転荷重装置を複数本装着し、刺激方法を回転荷重装置の数、内部のピストンの重量、形状を取り替える事で荷重加圧刺激を可変可能とした回転荷重加圧培養装置。
【請求項３】
請求項１、請求項２を備えた培地槽タンクと回転荷重装置とは着脱可能で回転荷重装置を変えることで、荷重や加圧方法を可変可能とした請求項１、請求項２記載の回転荷重加圧培養装置、培養方法で得られる細胞、組織培養物。
【請求項４】
請求項１、請求項２記載の回転荷重加圧培養装置をアクチュエーターで上下に上げ下げを繰り返す上下振動駆動装置を備え、培地槽タンク内の培地を上下に揺さぶり、生体の羊水に包まれた胎児が母体歩行時に受ける動的刺激環境に類似した動的刺激環境を発生させる回転荷重加圧培養装置。
【請求項５】
請求項１、請求項２、請求項４を備えた回転荷重加圧培養装置、培養方法で得られた細胞、組織培養物。
【請求項６】
前記培地槽タンク、ガス交換器を、回転荷重装置、回転駆動装置、上下振動駆動装置は炭酸ガスインキュベーター内で操作できることを特徴とした請求項１、請求項２、請求項４に記載された回転荷重加圧培養装置。
【請求項７】
前記記載の培地槽タンク、ガス交換器、回転荷重装置をガス注入可能な密封ケース内に納め、酸素、窒素の含有量や気圧を可変とした請求項１、請求項２、請求項４に記載された回転荷重加圧培養装置。
【請求項８】
回転荷重装置はピストンの移動速度を変化させるよう、回転荷重装置のパイプ形状を直線的な構造や、上部一部を曲げ、ピストンが上部傾斜角が直立方向に近くなるまで留め、荷重速度を変化させ、落下衝撃や緩やかな自重荷重が行える請求項１、請求項２、請求項４と請求項６、請求項７に記載された回転荷重加圧培養装置。
【請求項９】
請求項８に記載された荷重部の上部一部を曲げた荷重部内のピストン形状を球形状とし、真っ直ぐな形状の荷重部内部のピストンは円柱形状とし、球体荷重は落下衝撃を発生させ、円柱荷重は自重をかける荷重とし、ピストン形状を変える事で荷重を変化させる請求項１、請求項２，請求項４と請求項６、請求項７に記載された回転荷重加圧培養装置。
【請求項１０】
請求項８、請求項９記載の回転荷重加圧培養装置の培地槽タンクを回転させ細胞あるいは細胞を含む担体を培地中央部で培養し、回転荷重ピストンの荷重を１回転で１荷重とし、４秒１回転とした場合は１分間の呼吸数となるよう生体の呼吸による横隔膜の刺激に類似した荷重加圧になるように構成し、さらに４秒１回転とした場合、１分間の心臓の鼓動と類似した回数に成るよう、一回転で４回荷重加圧となるよう荷重部を４セット装着し、歩行時の運動による振動に類似した物理的刺激を上下振動駆動装置で培地槽タンクを上下する。上下振動駆動装置は１秒に１回を上下サイクルとし、羊水に包まれた胎児の環境に類似した、回転荷重加圧培養装置、培養方法で得られた細胞、組織培養物。
【請求項１１】
培地槽タンク内に収納固定出来る事を特色としフレーム（ステンレス等生体適合材）に絹糸等（生体適合材繊維）で網を張り、細胞が付着しやすいように、網の中央部の指定位置に５ミクロンから９０ミクロン程度の間隔で編み目を目的の形状に作り培地槽内の培養細胞を播種し培養を行う回転荷重加圧培養装置用足場培養網。
【請求項１２】
請求項１１に記載された培養網の一部を袋状（二重構造、三重構造）にし、その中に細胞を播種した足場（生体適合材）を挟み、三次元、あるいは三種類三層の細胞組織培養が出来る回転荷重加圧培養装置用多層足場培養固定網。
【請求項１３】
請求項１１、に記載された回転荷重加圧培養装置用足場培養網を装着して請求項１、請求項２、請求項４、請求項８、請求項９に記載された回転荷重加圧培養装置、培養方法で得られた細胞、組織培養物。
【請求項１４】
請求項１２に記載された回転荷重加圧培養装置用三層足場固定網を装着して、請求項１、請求項２、請求項４、請求項８、請求項９に記載された回転荷重加圧培養装置、培養方法で得られた細胞、組織培養物。
【請求項１５】
フレーム内に絹糸等（生体適合材繊維）で網を作りその中央部に絹製のシートや羊膜等を絹糸等（生体適合材繊維）でシートからフレームまで固定し、固定されたシート上に細胞を播種培養し、培養物が直接培養皿等に接着しないように構成した足場培養網。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−２１２０１７（Ｐ２００６−２１２０１７Ａ）
【公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−６１５１６（Ｐ２００５−６１５１６）
【出願日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【出願人】（５０５０８２７７４）株式会社大竹 (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【出願人】（５０５０８２７７４）株式会社大竹 (8)
【Ｆターム（参考）】
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