固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定方法
【目的】 蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定法において、測定感度および信頼性の向上を計る。
【構成】 （１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブと（２）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡを、（３）該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させた固定化試薬と競合反応させて、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを形成させ、２本鎖形成前の蛍光偏光度と２本鎖形成後の蛍光偏光度との変位を測定して、検体中のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに対応する塩基配列を測定する。
【効果】 蛍光標識されたＤＮＡまたはＲＮＡと測定対象と相補的な塩基配列を含む固定化ＤＮＡまたはＲＮＡとの相補的結合反応による実効的な分子量変化が大きいため、蛍光偏光度の変化が大きくなり、測定感度および信頼性が向上する。
【構成】 （１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブと（２）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡを、（３）該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させた固定化試薬と競合反応させて、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを形成させ、２本鎖形成前の蛍光偏光度と２本鎖形成後の蛍光偏光度との変位を測定して、検体中のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに対応する塩基配列を測定する。
【効果】 蛍光標識されたＤＮＡまたはＲＮＡと測定対象と相補的な塩基配列を含む固定化ＤＮＡまたはＲＮＡとの相補的結合反応による実効的な分子量変化が大きいため、蛍光偏光度の変化が大きくなり、測定感度および信頼性が向上する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定法においては、測定のための試薬として、蛍光標識された測定対象と同一の塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡおよび測定対象に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを用いる競合方法がある（特開昭２−７５９５８号公報参照）。この方法においては、蛍光標識された測定対象と同一の塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）、測定対象に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（相補ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）および測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡを混合させ、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと相補ＤＮＡまたはＲＮＡとが、相補的に結合する際の蛍光偏光度の変化を測定することにより、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡを測定する。（図２参照）
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】この方法では、蛍光偏光度の変化は、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡが相補ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する際の実効的な分子量の変化に対応している。したがって、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に大きな差がない場合には、蛍光偏光度の変化は小さい。そのために、この測定法の感度および信頼性は低いものとなる。この問題を解決するためには蛍光偏光度の変化を大きくすればよいが、このためには相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量を蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に対して充分に大きくする必要がある。すなわち、相補ＤＮＡまたはＲＮＡを長鎖にする必要がある。しかし、このような相補ＤＮＡまたはＲＮＡを準備することは、通常、困難である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブと（２）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡを、（３）該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させた固定化試薬と競合反応させて、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを形成させ、該２本鎖形成前の蛍光偏光度と該２本鎖形成後の蛍光偏光度との変化を測定することにより、検体中のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する、上記１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに対応する塩基配列を測定することを特徴とする固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定方法である。
【０００５】本発明における（１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブとは、測定対象のＤＮＡまたはＲＮＡと同一の塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡに標識物質として蛍光物質を結合させたＤＮＡまたはＲＮＡ（以下、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）である。蛍光物質としては、例えばフルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどがある。ＤＮＡまたはＲＮＡに蛍光物質を結合させる方法としては、例えばチオカルバミド結合などの共有結合によるものがある。
【０００６】本発明における（２）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡとは、例えば血清、尿、各種培養液などの測定検体における細菌、ウイルスなどのＤＮＡまたはＲＮＡ、また組織細胞やそれらの遊離ＤＮＡまたはＲＮＡなどがある。
【０００７】本発明における（３）該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させた固定化試薬（以下、固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）とは、上記（１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡにおける１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に固定化することにより用意される。固定化担体としては、ポリスチレン、ナイロンなどの合成樹脂のビーズ、ラテックス粒子、ガラスビーズやＡｕ，Ａｇなどの金属微粒子などを用いることができる。またタンパク質などの高分子物質を用いることもできる。本発明の固定化担体の分子量は、上述の蛍光偏光法の原理に基づき、相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量が蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に対して充分に大きくなるように選択される。固定化担体の分子量は蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量より５倍以上であることが好ましい。粒子などの固定化担体の分子量は、厳密には定義できないが、この場合には粒子の担体１個の平均質量にアボガドロ数をかけたものと定義する。また、固定化担体は必ずしも球状でなくてもよく、線状や板状でもよい。
【０００８】例えば、粒径１５ｎｍの銀微粒子は、分子量に換算するとおよそ１×１０7 の物質であり、例えば３００塩基対を有する測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量（約９万）に対して約１００倍である。したがって、この測定対象と全く同一の塩基配列をもつ蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと上記担体を用いた固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡが相補的に結合した場合、実効的な分子量の変化は、約１００倍である。これは蛍光偏光法によって測定を行う場合に充分な値である。
【０００９】ＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させる方法としては、吸着法、共有結合法、アビジンとビオチンとの特異的結合を利用する方法などがある。
【００１０】本発明の測定法に使用する蛍光偏光測定装置の一例を図３に示す。ここで測定の原理について簡単に説明すると、図３において、光源１１から出る光はフィルター１２によって試薬に含まれる蛍光物質の励起波長に濾光され、偏光板１３によって偏光される。この励起波長の偏光は、測定物質（サンプル）を入れたセル１４に投射され、サンプル中の蛍光物質を励起する。励起された蛍光物質は、物質に応じた波長の蛍光を発するが、この際ブラウン運動の激しさに対応して、該蛍光は偏光の分散を起こす。該蛍光はその波長を透過するフィルター１５を透過し、偏光板１６を透過し、光検知器１７によって電気信号に変換される。偏光板１６を回転することにより、サンプルの蛍光に対して励起偏光と同じ向きの偏光成分Ｉａとこれと垂直の偏光成分Ｉｂを求める。これらの値を用いて、次の示すサンプルの蛍光偏光度Ｐが求められる。
【００１１】
【数１】
【００１２】この場合、蛍光物質または蛍光物質を結合している物質のブラウン運動が激しいほど、励起偏光と垂直な向きの偏光成分Ｉｂは、これと平行の偏光成分Ｉａに比して大きくなり、すなわちＰは小さくなる。
【００１３】本発明では、サンプルセル（図３の１４）に蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を入れ、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を含む溶液を加え、続いて固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を加える。ただし、これらの３種の溶液を加える順序は限定しない。加える蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡおよび固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度は、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの測定濃度範囲に応じて適切に選定される。
【００１４】本発明では、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡは、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡと競合しつつ、相補的結合反応により固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する。蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡが固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する際、見掛け上大きな分子量変化が生じるので、結合した量に対応して上述した蛍光偏光度Ｐの値が求められる。測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度に対応して固定化ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの量が決定される。したがって、偏光度Ｐが求められれば、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度が求められる。
【００１５】
【実施例】以下に本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとするが、これら実施例によって本発明の範囲は限定されない。
（実施例１）
各種ＤＮＡ試薬の調製■コントロールＤＮＡ断片の調製法ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ社製、３９１型）を用いて、ホスホアミダイト法により、チミン塩基からなる２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成した。精製はＦＰＬＣ（ファルマシア社製）で逆相カラムにて行った。これを希釈用緩衝液（１×ＳＳＣ，ｐＨ７．０，０．１％ＳＤＳ、これを希釈バッファーと呼ぶ）によって８×１０-10 〜１０-7ｍｏｌ／ｌの範囲の７通りの濃度の溶液に希釈し、これをコントロールＤＮＡ断片試薬とした。
【００１６】■固定化相補ＤＮＡの調製法■の場合と同様に、シンセサイザーによって、アデニン塩基からなる２７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成し、さらに末端に以下の式に示すｄＵ誘導体を付加した。これを■と同様に精製した。
【００１７】
【化１】
【００１８】このオリゴヌクレオチドを希釈バッファーによって１０-6ｍｏｌ／ｌの濃度に調製し、この溶液１ｍｌに炭酸緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ８．５）１００μｌを加えた。この溶液に、スクシニミジルＤ−ビオチン（モレキュラー・プローブ社製、Ｓ−１５１３）１０μｇを加え、室温にて３時間攪拌の後、ＦＰＬＣにて精製した。この操作によって、上記オリゴヌクレオチドはビオチン標識された。このビオチン標識オリゴヌクレオチドに希釈バッファーを加え１ｍｌとし、こてにストレプトアビジン固定化シルバーコロイド（Ｅ・Ｙラボラトリーズ社製），０．０２％，０．５ｍｌを加え、室温にて３時間攪拌した。さらに１％ＢＳＡ，１００μｌを加え室温にて３０分間インキュベートした。この溶液を２００００×ｇで４分間遠心して上清を除去し、再び希釈バッファーにて溶解し１ｍｌとした。これを１０倍希釈したものを固定化相補ＤＮＡ試薬とした。
【００１９】■ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）標識ＤＮＡ断片の調製法■の場合と同様に、シンセサイザーによって、チミン塩基からなる２７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成し、さらに末端に■の場合と同じくｄＵ誘導体を付加した。これをＦＰＬＣにて精製した。このオリゴヌクレオチドを希釈バッファーによって１０-6ｍｏｌ／ｌの濃度に調製し、この溶液１ｍｌに炭酸緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ９．３）１００μｌを加えた。この溶液に、ＦＩＴＣ（カッペル社製）１０μｇを加え、室温にて６時間攪拌の後、ＦＰＬＣにて精製した。この操作によって、上記オリゴヌクレオチドはＦＩＴＣ標識とされた。これを希釈バッファーによって４×１０-9 ｍｏｌ／ｌの濃度とし、これをＦＩＴＣ標識ＤＮＡ断片試薬とした。濃度の測定は、２６０ｎｍＵＶ光における吸光度法に従った。
【００２０】（実施例２）
測定装置および検量線の作成測定装置の構成は、図３を用いて説明したものである。蛍光励起波長は４８５ｎｍ、蛍光の受光波長は５２５ｎｍとした。装置の励起側、蛍光側の波長フィルターの分光バンド幅はともに半値幅１０ｎｍとした。反応用セルは５０℃に加温・保持した。
【００２１】次に、コントロールＤＮＡ断片の検量線（校正曲線）を得るための手続きを示す。実施例１の■〜■に示した３種の試薬、コントロールＤＮＡ断片、固定化相補ＤＮＡ、ＦＩＴＣ標識ＤＮＡ断片試薬はすべて５０℃に加温・保持した。また反応用緩衝液（１５×ＳＳＣ，ｐＨ７．０，０．５％ＢＳＣ、これをハイブリダイゼーションバッファーと呼ぶ）を用意し、同じく５０℃に保持した。まず、反応用セルにハイブリダイゼーションバッファー１ｍｌ、続いてコントロールＤＮＡ断片試薬１ｍｌ、続いて固定化相補ＤＮＡ試薬１ｍｌを加え、５０℃にて１０分間インキュベートした。その後、ＦＩＴＣ標識ＤＮＡ断片試薬１ｍｌを加え、５０℃にて５分間インキュベートした後、偏光度を４回測定し、平均値をプロットした。この操作を、実施例１の■に示した７通りの濃度のコントロールＤＮＡ断片試薬に対して行った。このようにして得られたコントロールＤＮＡ断片の検量線を図４に示す。同図におけるコントロールＤＮＡ断片の濃度は上記４種の試薬溶液混合後の濃度である。この例により、本発明に基づく測定法によるチミン塩基からなる２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの測定が可能であることが明らかとなった。
【００２２】
【発明の効果】実施例から明かなように、本発明では蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡとの相補的結合反応による実効的な分子量変化が大きいので、測定の感度および信頼性が向上できる。また、固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡ試薬および蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡ試薬の作成において、長鎖の相補ＤＮＡまたはＲＮＡ試薬を用意する必要がないので、従来技術よりも簡単に測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片測定法の一例を示す。
【図２】従来法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片測定法の一例を示す。
【図３】蛍光偏光測定装置の構成例を示す。
【符号の説明】
１．測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡ
２．蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡ
３．固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡ
４．蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡ
５．相補ＤＮＡまたはＲＮＡ
１１．光源
１２．フィルター
１３．偏光板
１４．セル
１５．フィルター
１６．偏光板
１７．光検知器
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定法においては、測定のための試薬として、蛍光標識された測定対象と同一の塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡおよび測定対象に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを用いる競合方法がある（特開昭２−７５９５８号公報参照）。この方法においては、蛍光標識された測定対象と同一の塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）、測定対象に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（相補ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）および測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡを混合させ、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと相補ＤＮＡまたはＲＮＡとが、相補的に結合する際の蛍光偏光度の変化を測定することにより、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡを測定する。（図２参照）
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】この方法では、蛍光偏光度の変化は、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡが相補ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する際の実効的な分子量の変化に対応している。したがって、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に大きな差がない場合には、蛍光偏光度の変化は小さい。そのために、この測定法の感度および信頼性は低いものとなる。この問題を解決するためには蛍光偏光度の変化を大きくすればよいが、このためには相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量を蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に対して充分に大きくする必要がある。すなわち、相補ＤＮＡまたはＲＮＡを長鎖にする必要がある。しかし、このような相補ＤＮＡまたはＲＮＡを準備することは、通常、困難である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブと（２）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡを、（３）該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させた固定化試薬と競合反応させて、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを形成させ、該２本鎖形成前の蛍光偏光度と該２本鎖形成後の蛍光偏光度との変化を測定することにより、検体中のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する、上記１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに対応する塩基配列を測定することを特徴とする固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定方法である。
【０００５】本発明における（１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブとは、測定対象のＤＮＡまたはＲＮＡと同一の塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡに標識物質として蛍光物質を結合させたＤＮＡまたはＲＮＡ（以下、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）である。蛍光物質としては、例えばフルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどがある。ＤＮＡまたはＲＮＡに蛍光物質を結合させる方法としては、例えばチオカルバミド結合などの共有結合によるものがある。
【０００６】本発明における（２）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡとは、例えば血清、尿、各種培養液などの測定検体における細菌、ウイルスなどのＤＮＡまたはＲＮＡ、また組織細胞やそれらの遊離ＤＮＡまたはＲＮＡなどがある。
【０００７】本発明における（３）該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させた固定化試薬（以下、固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）とは、上記（１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡにおける１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に固定化することにより用意される。固定化担体としては、ポリスチレン、ナイロンなどの合成樹脂のビーズ、ラテックス粒子、ガラスビーズやＡｕ，Ａｇなどの金属微粒子などを用いることができる。またタンパク質などの高分子物質を用いることもできる。本発明の固定化担体の分子量は、上述の蛍光偏光法の原理に基づき、相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量が蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に対して充分に大きくなるように選択される。固定化担体の分子量は蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量より５倍以上であることが好ましい。粒子などの固定化担体の分子量は、厳密には定義できないが、この場合には粒子の担体１個の平均質量にアボガドロ数をかけたものと定義する。また、固定化担体は必ずしも球状でなくてもよく、線状や板状でもよい。
【０００８】例えば、粒径１５ｎｍの銀微粒子は、分子量に換算するとおよそ１×１０7 の物質であり、例えば３００塩基対を有する測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量（約９万）に対して約１００倍である。したがって、この測定対象と全く同一の塩基配列をもつ蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと上記担体を用いた固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡが相補的に結合した場合、実効的な分子量の変化は、約１００倍である。これは蛍光偏光法によって測定を行う場合に充分な値である。
【０００９】ＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させる方法としては、吸着法、共有結合法、アビジンとビオチンとの特異的結合を利用する方法などがある。
【００１０】本発明の測定法に使用する蛍光偏光測定装置の一例を図３に示す。ここで測定の原理について簡単に説明すると、図３において、光源１１から出る光はフィルター１２によって試薬に含まれる蛍光物質の励起波長に濾光され、偏光板１３によって偏光される。この励起波長の偏光は、測定物質（サンプル）を入れたセル１４に投射され、サンプル中の蛍光物質を励起する。励起された蛍光物質は、物質に応じた波長の蛍光を発するが、この際ブラウン運動の激しさに対応して、該蛍光は偏光の分散を起こす。該蛍光はその波長を透過するフィルター１５を透過し、偏光板１６を透過し、光検知器１７によって電気信号に変換される。偏光板１６を回転することにより、サンプルの蛍光に対して励起偏光と同じ向きの偏光成分Ｉａとこれと垂直の偏光成分Ｉｂを求める。これらの値を用いて、次の示すサンプルの蛍光偏光度Ｐが求められる。
【００１１】
【数１】
【００１２】この場合、蛍光物質または蛍光物質を結合している物質のブラウン運動が激しいほど、励起偏光と垂直な向きの偏光成分Ｉｂは、これと平行の偏光成分Ｉａに比して大きくなり、すなわちＰは小さくなる。
【００１３】本発明では、サンプルセル（図３の１４）に蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を入れ、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を含む溶液を加え、続いて固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を加える。ただし、これらの３種の溶液を加える順序は限定しない。加える蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡおよび固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度は、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの測定濃度範囲に応じて適切に選定される。
【００１４】本発明では、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡは、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡと競合しつつ、相補的結合反応により固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する。蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡが固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する際、見掛け上大きな分子量変化が生じるので、結合した量に対応して上述した蛍光偏光度Ｐの値が求められる。測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度に対応して固定化ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの量が決定される。したがって、偏光度Ｐが求められれば、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度が求められる。
【００１５】
【実施例】以下に本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとするが、これら実施例によって本発明の範囲は限定されない。
（実施例１）
各種ＤＮＡ試薬の調製
【００１６】
【００１７】
【化１】
【００１８】このオリゴヌクレオチドを希釈バッファーによって１０-6ｍｏｌ／ｌの濃度に調製し、この溶液１ｍｌに炭酸緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ８．５）１００μｌを加えた。この溶液に、スクシニミジルＤ−ビオチン（モレキュラー・プローブ社製、Ｓ−１５１３）１０μｇを加え、室温にて３時間攪拌の後、ＦＰＬＣにて精製した。この操作によって、上記オリゴヌクレオチドはビオチン標識された。このビオチン標識オリゴヌクレオチドに希釈バッファーを加え１ｍｌとし、こてにストレプトアビジン固定化シルバーコロイド（Ｅ・Ｙラボラトリーズ社製），０．０２％，０．５ｍｌを加え、室温にて３時間攪拌した。さらに１％ＢＳＡ，１００μｌを加え室温にて３０分間インキュベートした。この溶液を２００００×ｇで４分間遠心して上清を除去し、再び希釈バッファーにて溶解し１ｍｌとした。これを１０倍希釈したものを固定化相補ＤＮＡ試薬とした。
【００１９】
【００２０】（実施例２）
測定装置および検量線の作成測定装置の構成は、図３を用いて説明したものである。蛍光励起波長は４８５ｎｍ、蛍光の受光波長は５２５ｎｍとした。装置の励起側、蛍光側の波長フィルターの分光バンド幅はともに半値幅１０ｎｍとした。反応用セルは５０℃に加温・保持した。
【００２１】次に、コントロールＤＮＡ断片の検量線（校正曲線）を得るための手続きを示す。実施例１の
【００２２】
【発明の効果】実施例から明かなように、本発明では蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡとの相補的結合反応による実効的な分子量変化が大きいので、測定の感度および信頼性が向上できる。また、固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡ試薬および蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡ試薬の作成において、長鎖の相補ＤＮＡまたはＲＮＡ試薬を用意する必要がないので、従来技術よりも簡単に測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片測定法の一例を示す。
【図２】従来法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片測定法の一例を示す。
【図３】蛍光偏光測定装置の構成例を示す。
【符号の説明】
１．測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡ
２．蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡ
３．固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡ
４．蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡ
５．相補ＤＮＡまたはＲＮＡ
１１．光源
１２．フィルター
１３．偏光板
１４．セル
１５．フィルター
１６．偏光板
１７．光検知器
【特許請求の範囲】
【請求項１】 （１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブと（２）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡを、（３）該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させた固定化試薬と競合反応させて、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを形成させ、該２本鎖形成前の蛍光偏光度と該２本鎖形成後の蛍光偏光度との変化を測定することにより、検体中のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する、上記１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに対応する塩基配列を測定することを特徴とする固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定方法。
【請求項２】 固定化試薬の固定化担体の分子量が、蛍光標識させた一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブの少なくとも５倍であることを特徴とする請求項１記載の固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定方法。
【請求項１】 （１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブと（２）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡを、（３）該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させた固定化試薬と競合反応させて、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを形成させ、該２本鎖形成前の蛍光偏光度と該２本鎖形成後の蛍光偏光度との変化を測定することにより、検体中のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する、上記１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに対応する塩基配列を測定することを特徴とする固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定方法。
【請求項２】 固定化試薬の固定化担体の分子量が、蛍光標識させた一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブの少なくとも５倍であることを特徴とする請求項１記載の固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開平５−１２３１９６
【公開日】平成５年（１９９３）５月２１日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平３−４９２０４
【出願日】平成３年（１９９１）２月２０日
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【公開日】平成５年（１９９３）５月２１日
【国際特許分類】
【出願日】平成３年（１９９１）２月２０日
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
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