固相作製用試薬及び該試薬を使用して作製した固相
【課題】非特異的反応の抑制・回避方法の提供を課題とする。
【解決手段】測定対象物を特異的に捕捉するための試薬及び植物由来ポリペプチドを有効成分として含有する、標識結合アッセイ法における固相作製用試薬を用いることで上記課題を解決する。
【解決手段】測定対象物を特異的に捕捉するための試薬及び植物由来ポリペプチドを有効成分として含有する、標識結合アッセイ法における固相作製用試薬を用いることで上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識結合アッセイ法用の固相作製用試薬及び該試薬を使用して作製した標識結合アッセイ法用の固相に関するものである。
【技術背景】
【０００２】
抗原と抗体、核酸鎖とその相補鎖、アプタマーとアプタマーに対する特定の分子、リガンドとレセプターなど、その組み合わせに依存して特異的結合対を形成する反応を利用し、該組み合わせの一方を直接又は間接的に標識し、特異的結合対形成の結果生じる該標識の集積又は集積の阻害の程度から試料中の測定対象物を測定する標識結合アッセイ法が種々考案され、実用化されている。
なかでもその組み合わせに依存して特異的結合対を形成する反応に抗原抗体反応を利用する免疫学的測定方法は、多くの測定対象物に適用でき、操作性、迅速性にも優れるため、患者のそばで行う臨床検査（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ：ＰＯＣ検査）に利用され、診療の現場で多数使用されている。
免疫学的測定方法によるＰＯＣ検査としては、メンブレンイムノアッセイ法を使用した検査が普及している。該メンブレンイムノアッセイ法は、例えば、標識抗体と試料中の抗原（この場合の測定対象物）を混合して特異的結合対を形成させた後、該特異的結合対を、抗体を固定化したメンブレン（固相）上で展開し、標識抗体−抗原−固定化された抗体の三元特異的結合対をメンブレン（固相）上で形成させ、集積した標識量を測定することにより行うものである。
【０００３】
標識結合アッセイ法たる免疫学的測定方法の課題として、測定対象物の存在・不存在にかかわらず標識の集積が生じるいわゆる非特異的反応の抑制・回避があげられる。上記のメンブレンイムノアッセイ法のように、抗体を固定化した固相を利用して標識の集積量を測定する方法の場合、生じる非特異的反応は大きく二つあり、一つは、測定対象物（上記の例では抗原）の存在・不存在によらず、固相上の抗体が固定化されている部位でも固定化されていない部位でも標識の集積が観察されるバックグランドに係る非特異的反応、もう一つは、試料中に抗原が存在しないにもかかわらず、あたかも抗原が存在するかのように抗体固定化部位に標識が集積してしまう、いわゆる偽陽性である。
【０００４】
前者（バックグランドに係る非特異的反応）の原因としては、抗体が固定化されていない部位への標識それ自体及び／又は標識抗体の集積が考えられ、後者（偽陽性）の原因としては、固定化された抗体への標識それ自体及び／又は標識抗体の集積が考えられる。またさらに、上記非特異的な標識の集積に、試料由来の測定対象物以外の成分（例えば、変性したタンパク質や粘着性の物質）が関与している場合も考えられる。
【０００５】
これらの非特異的反応を抑制・回避する方法として、二つの方法が採用されている。一つはブロッキングによる方法であり、もう一つは、試料や標識抗体を、固相上で展開する際に特定の成分を含む溶液中に含有させる方法である。
【０００６】
ブロッキングによる方法としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、卵白アルブミン等の動物由来のタンパク質（非特許文献１、特許文献１、２など）や、大豆ペプチド等の植物由来のタンパク質（特許文献３）等をブロッキング剤として使用してブロッキングを行う方法が従来より報告されている。また、最近では、ブロッキング効果の優劣のほかに、ＢＳＥなど人畜共通感染の予防の見地から、ポリエチレングリコールなどの高分子物質（特許文献４）、蚕繭に由来するセリシン（特許文献５）等をブロッキング剤として使用する方法や植物由来のポリペプチドを有効成分とするブロッキング剤（特許文献６）等が報告されている。
【０００７】
試料や標識抗体を、固相上で展開する際に特定の成分を含む溶液中に含有させる方法の具体例としては、いわゆる試料希釈液や標識抗体液に非特異的反応を抑制・回避できる成分を含有させる方法があげられ、ブロッキング剤として使用される成分（ＢＳＡなど）や特定のアミノ酸、特定の界面活性剤を含有させる方法（特許文献７、８など）が報告されている。
【０００８】
しかしながら、上記、ブロッキング剤を使用する方法は、いずれも抗体を不溶性担体に固定化して固相とした後、該固相全体あるいは抗体固定化部位をブロッキング剤で被覆するものであり、ブロッキング効果向上を目的としてブロッキング剤の濃度を上げた場合、ブロッキング剤自体が不溶化して析出したり、抗体の抗原認識部位をマスクしてしまうなどの問題があった。
また、上記した試料希釈液や標識抗体液の組成を工夫する方法は、メンブレンイムノアッセイ法の検出感度が、試料や標識抗体と抗体を固定化した固相との接触時間（試料や標識抗体の流速）の影響を受けることがあるため、採用できない場合があった。
【特許文献１】特開平０６−１３００６２
【特許文献２】特開平０６−１６０３８５
【特許文献３】特開平０７−２７０４１３
【特許文献４】特開２００６−２２６９８２
【特許文献５】特開２００７−２４８３７３
【特許文献６】特開２００６−０４７２５５
【特許文献７】特開２００５−２９１７８０
【特許文献８】特開２００５−２９１７８３
【非特許文献１】新生化学実験講座１２、分子免疫学III（東京化学同人）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のようにブロッキングや試料希釈液あるいは標識抗体液の組成を工夫する従来の非特異的反応の抑制・回避方法には課題がある一方、抗体を不溶性担体に固定化し固相を作製する時点で、抗体と抗体以外の物質を共存させたうえで抗体を固定化する方法は全く報告されていない。この理由の一つとして、不溶性担体に固定化する抗体は、その比活性が高いことが好ましいとの一般的な理解があり、抗体以外の成分（緩衝液、塩類、保存剤、防腐剤等は除く）を共存させて抗体の比活性を下げるのは不利益と考えられていることが推測される。なお、前記比活性の語は、力価あるいは純度等の概念を包含しており、以降も同様である。
【００１０】
本発明は、上記の状況のもと、ブロッキングや試料希釈液あるいは標識抗体液の組成を工夫する従来の非特異的反応の抑制・回避方法以外の非特異的反応の抑制・回避方法の提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これまで不溶性担体に固定化して固相を作製する際の抗体（固相作製用試薬）は比活性が高いことが好ましいと考えられており、抗体を主成分とする固相作製用試薬では、抗体以外の成分（緩衝液、塩類、安定剤、保存剤、防腐剤等は除く）を共存させず、抗体の比活性が高い状態で固相作製用試薬として使用するのが一般的であった。これに対して、本発明者らは、抗体と植物由来ポリペプチドとを混合した溶液を固相作製用試薬として使用し、抗体を不溶性担体に固定化し、この固相を標識結合アッセイ法に使用したところ、意外にも陽性試料の測定に影響を与えることなく、陰性試料で生じる偽陽性を抑制・回避できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明は、抗体及び植物由来ポリペプチドを有効成分として含有する、標識結合アッセイ法における固相作製用試薬ならびに該試薬を使用して作製した標識結合アッセイ法用固相、さらには該固相を使用することを特徴とする標識結合アッセイ法を提供するものである。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
（１）測定対象物を特異的に捕捉するための試薬及び植物由来ポリペプチドを有効成分として含有する、標識結合アッセイ法における固相作製用試薬。
（２）植物由来ポリペプチドが、植物由来のタンパク質を分解して得られうるポリペプチドである、前記（１）に記載の固相作製用試薬。
（３）植物が、小麦、大麦、トウモロコシ、米、大豆、小豆、インゲン豆、そら豆、アーモンド、ピーナッツ、ジャガイモ、サツマイモ、サトイモ及びタロイモからなる群より選択される植物である、前記（２）に記載の固相作製用試薬。
（４）植物由来のタンパク質が、グリアジン、ツェイン（ゼイン）、グルテニン、グルテン、ホルデイン、オリゼニン、グリシニン、パタチン及びコングリシニンからなる群より選択されるタンパク質である、前記（３）に記載の固相作製用試薬。
（５）測定対象物を特異的に捕捉するための試薬が、抗体、抗原、核酸鎖、アプタマー、アプターマーに対する特定の物質、リガンド及びレセプターからなる群より選択されるいずれかを含む、前記（１）〜前記（４）のいずれか一つに記載の固相作製用試薬。
（６）前記（１）〜前記（５）のいずれか一つに記載の固相作製用試薬を不溶性担体に塗布して作製した、標識結合アッセイ法用の固相。
（７）不溶性担体がメンブレンよりなる、前記（６）に記載の固相。
（８）前記（６）又は（７）に記載の固相を使用することを特徴とする、標識結合アッセイ法。
（９）フロースルー式、ラテラルフロー式又はディップスティック式メンブレンアッセイ法である、前記（８）に記載の標識結合アッセイ法。
（１０）標識が金属コロイド粒子又は着色ラテックス粒子である、前記（８）又は前記（９）に記載の標識結合アッセイ法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により提供される固相作製用試薬は、非特異的反応を抑制・回避した標識結合アッセイ法用の固相を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明における、「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」は、「測定対象物を特異的に捕捉するための試薬」及び「植物由来ポリペプチド」を有効成分として含有するものである。
【００１５】
本発明において「標識結合アッセイ法」とは、抗原と抗体、核酸鎖とその相補鎖、アプタマーとアプタマーに対する特定の分子、リガンドとレセプターなど、その組み合わせに依存して特異的結合対を形成する反応を利用し、組み合わせの一方を直接又は間接的に標識し、該標識の集積又は集積の阻害の程度から試料中の測定対象物を測定するアッセイ法をいう。
【００１６】
本発明において「測定対象物を特異的に捕捉するための試薬」とは、不溶性担体に固定化しようとする対象を指し、測定対象物と特異的な結合対を形成することによって測定対象物を捕捉する物質をいう。具体的には、抗原と抗体、核酸鎖とその相補鎖、アプタマーとアプタマーに対する特定の分子、リガンドとレセプターなど、その組み合わせに依存して特異的な結合対を形成する物質の一方をいう。これらは、いずれであっても本発明の「測定対象物を特異的に捕捉するための試薬」として使用することができる。
【００１７】
以下、「測定対象物を特異的に捕捉するための試薬」として抗体を用い、不溶性担体に固定化する場合を例として本発明を詳細に説明する。
【００１８】
「測定対象物を特異的に捕捉するための試薬」として使用できる抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗原認識部位を含むこれらの断片のいずれでもよい。抗体を採取するための動物の種類や免疫方法、抗体産生細胞の株化（ハイブリドーマの調製）、抗体の精製方法などは、当業者に周知の方法を使用することができる。「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」中の抗体の濃度は１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬがより好ましい。
【００１９】
本発明の「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」に含有させることができる「植物由来のポリペプチド」を得るための植物としては、小麦、大麦、カラス麦、トウモロコシ、ジャポニカ米、インディカ米、ジャバンカ米、アフリカ米、餅米、大豆、小豆、インゲン豆、そら豆、アーモンド、ピーナッツ、ジャガイモ、サツマイモ、サトイモ、タロイモ等をあげることができる。これらのうち大豆、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ及び米が好ましく、大豆及びトウモロコシがより好ましい。
【００２０】
「植物由来のポリペプチド」は、前記した植物に由来するタンパク質を分解して得られるポリペプチドが好ましい。前記「植物由来のタンパク質」は前記植物から抽出されたタンパク質又はタンパク質を含む画分があげられ、タンパク質の具体例としては、グリアジン、ツェイン（ゼイン）、グルテニン、グルテン、ホルデイン、オリゼニン、グリシニン、パタチン及びコングリシニン等の貯蔵タンパク質、レクチン、アミラーゼ、呼吸及び光合成に関与する酵素等の機能タンパク質、根、茎、葉、花、果実、種子などに由来する構造タンパク質があげられる。なかでも貯蔵タンパク質が好ましい。
【００２１】
「植物由来のポリペプチド」は、該タンパク質を酵素、酸、アルカリなどの処理により分解することで得ることができるが、これらに限定されるものではない。また化学的に合成したものや遺伝子組み換えにより産生されたものであってもよい。
分解の方法としては、酵素による加水分解が好ましい。加水分解に使用できる酵素は、プロテアーゼに属するもので、タンパク質をポリペプチドに分解できるものあれば良く、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等の動物由来のプロテイナーゼ、パパイン、フィシン、ブロメライン等の植物由来のプロテアーゼ、その他、細菌、カビ、放射菌等の微生物由来のプロテアーゼ等があげられる。また、酸分解の場合、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸等の酸があげられ、アルカリ分解の場合は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム等があげられる。
【００２２】
分解された後の「ポリペプチド」は、重量平均分子量２００Ｄａ〜３０万Ｄａであることが好ましく、重量平均分子量３００Ｄａ〜２０万Ｄａであることがより好ましい。また、タンパク質加水分解時に生ずる遊離アミノ酸は、本発明の「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」の性能を損なわないことを限度として混入していても構わない。また、２種類以上の植物または同一植物の２種類以上のタンパク質に由来するポリペプチドを併用してもよい。
【００２３】
好ましい「植物由来ポリペプチド」としては、ダイズタンパク質、コムギタンパク質、ジャガイモタンパク質、トウモロコシタンパク質、コメヌカタンパク質の加水分解物などがあげられ、その中でもトウモロコシタンパク質の加水分解物が好ましい。
【００２４】
トウモロコシタンパク質の加水分解物としては、例えば、分子量２００Ｄａ〜４０００Ｄａのペプチドで、遊離アミノ酸含量が全アミノ酸に対して１％以下であるものが好ましい。また、その中でも、アミノ酸組成（重量％）が、アスパラギン酸２．５〜１２．５、スレオニン２．５〜６．０、セリン４．０〜６．０、グルタミン酸１５．０〜５０．０、グリシン２．０〜５．５、アラニン２．０〜１３．５、バリン４．０〜８．０、システイン０．０〜１．５、メチオニン１．０〜２．０、イソロイシン３．０〜６．０、ロイシン６．０〜１５．０、チロシン１．０〜４．０、フェニルアラニン２．０〜５．５、リジン０．５〜７．０、ヒスチジン０．５〜３．０、アルギニン１．０〜８．０、プロリン５．０〜１３．０であるものがより好ましい。
【００２５】
本発明の「植物由来ポリペプチド」として使用することが可能な市販品として、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（登録商標、生化学バイオビジネス株式会社、Ｃｏｄｅ＃２００１４０）をあげることができる。
【００２６】
「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」中の「植物由来ポリペプチド」の濃度は０．００５〜３０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．０１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０３〜５％である。
【００２７】
本発明の「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」は、使用時には溶液状態である。以下、溶液状態での各種条件について記載する。本発明の「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」は緩衝液に溶解させて使用することが好ましい。緩衝液の種類としては、りん酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨは６．０〜９．５の範囲が好ましく、６．５〜８．５がより好ましく、７．０〜８．０がさらに好ましい。
緩衝液には、さらにＮａＣｌなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリンなどの防腐剤等を含んでもよい。塩類はＮａＣｌなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する工程で存在するようになるものも含まれる。
これら、本発明の「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」の有効成分以外の成分は、本発明の非特異的反応の抑制・回避効果を低下させたり、「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」の性能（例えば、不溶性担体に固定化される量や特異的結合対を形成する能力）を損なわないことを限度として適宜、処方することができる。
【００２８】
本発明の「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」は、「測定対象物を特異的に捕捉するための試薬」を不溶性担体に固定化する直前に「植物由来ポリペプチド」と混合して調製してもよいし、予め混合したものを凍結保存し使用時に融解して用いたり、凍結乾燥保存してあるものを蒸留水等で溶解して用いてもよい。
【００２９】
上記のようにして調製された「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」溶液は、フロースルー式の場合、点あるいは＋など特定のシンボル状に、ラテラルフロー式（代表例としてイムノクロマト法用のテストスティック）の場合には、ライン状にメンブレン不溶性担体に塗布することにより、本発明の「標識結合アッセイ法用の固相」を製造することができる。
なお、本発明において、「フロースルー式メンブレンアッセイ」という場合は、測定試料等が本発明の「標識結合アッセイ法用の固相」（この場合、抗体固定化メンブレン）を垂直に通過するように展開する方式を指し、「ラテラルフロー式メンブレンアッセイ」という場合は、測定試料が抗体固定化メンブレンを水平に移動するように展開する方式を指す。また、「ディップスティック式メンブレンアッセイ」という場合は、測定試料溶液にラテラルフロー式用の抗体固定化メンブレンを倒立させてその一端を浸漬し、毛細管現象を利用して測定試料が上部に吸い上げられるように展開させる方式を指す。
【００３０】
本発明の「標識結合アッセイ法用の固相」は、本発明の固相作製用試薬を用いて「測定対象物を特異的に捕捉するための試薬」を不溶性担体に固定化した後、さらに、上述した通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
本発明の「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」を用いて、本発明の「標識結合アッセイ法の固相」を作製する場合の固相（不溶性担体）の形態は、ウエル状、粒子状、板状、膜状のいずれでもよい。固相の材質は、プラスチック、ラテックス、セルロースなどを使用することができる。「標識結合アッセイ法用の固相」がＰＯＣ検査用である場合、ニトロセルロース等で製された多孔性のメンブレンを使用することが好ましい。
【００３１】
本発明の「標識結合アッセイ法」における標識物質は、酵素、色素、蛍光物質、金コロイドなどの金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子など、いわゆるイムノアッセイやハイブリダイズアッセイに使用される物質であれば、いずれでも使用できる。簡便性を要求されるＰＯＣ検査の場合、金属コロイド粒子や着色ラテックス粒子が標識集積の可視化の点ですぐれており、好ましい。
【００３２】
本明細書において使用される「測定」の語は、特に断らないかぎり、最も広義に解釈されるべき語であり、通常使用される「検査」、「検出」、「分析」、「同定」、「判定」などの概念を包含し、また、測定の結果が「定量」的である場合、「半定量」的である場合、「定性」的である場合のいずれも包含する。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【００３４】
〔実施例１〕
本発明の固相作製用試薬により作製した固相を用いた抗原の測定／標識が金属コロイド粒子の場合
（１）標識結合アッセイ法用の固相（抗体固定化メンブレン）の作製
２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に対し、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を０．７５ｍｇ／ｍＬ、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（登録商標、生化学バイオビジネス株式会社、Ｃｏｄｅ＃２００１４０、本発明の植物由来ポリペプチドを含む）を０％（無添加）〜５．０％（ｖ／ｖ）（本発明の植物由来ポリペプチドの濃度は、ＢＳＡ換算のタンパク濃度として０％〜０．３％（ｗ／ｖ））、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、Ａ型インフルエンザ用固相作製用試薬（Ａ型用抗体）とした。
同様に、１０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．２）にマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏを０％（無添加）〜２．５％（ｖ／ｖ）（本発明の植物由来ポリペプチドの濃度は、ＢＳＡ換算のタンパク濃度として０％〜０．１５％（ｗ／ｖ））、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、Ｂ型用インフルエンザ用固相作製用試薬（Ｂ型用抗体）とした。
また、１０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．２）に、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を０．７５ｍｇ／ｍＬ、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、コントロールライン（ＣＴＲＬ）用固相作製用試薬とした。
上記３種の固相作製用試薬を、ニトロセルロースメンブレンにＡ型用抗体、Ｂ型用抗体、ＣＴＲＬ用抗体の順序で、ライン状に相互に間隔を開けて塗布し、乾燥機で乾燥させたものを抗体固定化メンブレンとした。なお、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ中の植物由来ポリペプチドの主たる分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見積もりで６０００Ｄａ以下である。
【００３５】
（２）標識抗体パッドの作製
１．３％（ｗ／ｖ）カゼイン及び４％スクロースを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）に、金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体及び金コロイド標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を加えて混合し、標識抗体液とした。標識抗体液をグラスファイバーシートに塗布し、乾燥機で乾燥させたものを標識抗体パッドとした。
【００３６】
（３）本発明の標識結合アッセイ法用の固相を使用したテストスティックの作製
プラスチック製粘着シートに前記（１）で作製した抗体固定化メンブレンを貼り、図１のように標識抗体パッド、サンプルパッド、吸水パッドを配置した。すなわち、抗Ａ型用抗体が塗布されている側（測定試料の固相上での展開における上流）の末端近傍に前記（２）で作製した標識抗体パッドを配置し、この標識抗体パッドに一部重なるようにサンプルパッドを配置した。一方、ＣＴＲＬ用抗体が塗布されている側（測定試料の固相上での展開における下流）の末端に吸水パッドを配置した。さらにその上から、透明プラスチックシールで覆った。張り合わせたシートは、４ｍｍ幅で裁断し、テストスティックとした。なおこのときのシート長は９８ｍｍであった。
【００３７】
（４）測定（ディップスティック式メンブレンアッセイ）
健常成人から採取した、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス陰性の鼻腔ぬぐい試料（１例）について、ウイルス抗原の抽出処理を行った後、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．２５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．６）で希釈し、測定試料を調製した。該測定試料を含むチューブにテストスティックを浸漬し、１０分後にテストスティックの各抗体塗布部位に現れる赤色ラインの有無を測定した。ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ各添加条件における測定は、ウイルス抗原の抽出処理から２回（ｎ＝２）行った。その結果を表１に示す。なお、表中、＋は赤色ラインが観察されたことを意味し、数値が大きいほど着色が濃いことを表す。また、Ｎは赤色ラインが観察されなかったことを表す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ無添加の固相作製用試薬により作製した固相を用いた場合、Ａ型インフルエンザウイルス陰性の試料にもかかわらず２回の測定ともＡ型用抗体塗布部位で赤色ラインが観察された。１．０％ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ添加の固相作製用試薬により作製した固相を用いた場合、赤色ラインの着色が、無添加の場合の２．５＋から１．５＋に低下し、２．５％及び５．０％ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ添加の固相作製用試薬により作製した固相を用いた場合には、赤色ラインは観察されなかった。以上より、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏを添加した固相作製用試薬を使用して固相を作製することにより非特異的反応（偽陽性）を、抑制・回避できることが確認された。
【００４０】
〔実施例２〕
本発明の固相作製用試薬により作製した固相を用いた抗原の測定／標識が着色ラテックスの場合
（１）抗体固定化メンブレンの作製
１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．２）に対し、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を０.７５ｍｇ／ｍＬ、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏを０％（無添加）、１％（ｖ／ｖ）（本発明の植物由来ポリペプチドの濃度は、ＢＳＡ換算のタンパク濃度として０．０６％（ｗ／ｖ））、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、Ａ型用固相作製用試薬とした。
同様に、１０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．２）にマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬ、Ａｐｐｌｉｅ Ｄｕｏを０％、１％（ｖ／ｖ）（本発明の植物由来ポリペプチドの濃度は、ＢＳＡ換算のタンパク濃度として０．０６％（ｗ／ｖ））、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、Ｂ型用固相作製用試薬とした。
また、１０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．２）に、抗ＨＲＰ（西洋ワサビパーオキシダーゼ）抗体を１．８ｍｇ／ｍＬ、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、ＣＴＲＬ用固相作製用試薬とした。
上記３種の固相作製用試薬を、ニトロセルロースメンブレンにＡ型用抗体、Ｂ型用抗体、ＣＴＲＬ用抗体の順序で、ライン状に相互に間隔を開けて塗布し、乾燥機で乾燥させたものを抗体固定化メンブレンとした。なお、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ中の植物由来ポリペプチドの主たる分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見積もりで６０００Ｄａ以下である。
【００４１】
（２）標識抗体パッドの作製
２％（ｗ／ｖ）カゼイン及び１０％スクロースを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．５）に、着色ラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体、着色ラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体及び着色ラテックス標識ＨＲＰを加えて混合し、標識抗体液とした。標識抗体液をグラスファイバーシートに塗布し、乾燥機で乾燥させたものを標識抗体パッドとした。
【００４２】
（３）本発明の標識結合アッセイ法用固相を使用したテストスティックの作製
プラスチック製粘着シートに前記（１）で作製した抗体固定化メンブレンを貼り、図１のように標識抗体パッド、サンプルパッド、吸水パッドを配置した。すなわち、抗Ａ型用抗体が塗布されている側（測定試料の固相上での展開における上流）の末端近傍に前記（２）で作製した標識抗体パッドを配置し、この標識抗体パッドに一部重なるようにサンプルパッドを配置した。一方、ＣＴＲＬ用（抗ＨＲＰ）抗体が塗布されている側（測定試料の固相上での展開における下流）の末端に吸水パッドを配置した。さらにその上から、透明プラスチックシールで覆った。張り合わせたシートは、４ｍｍ幅で裁断し、テストスティックとした。なお、このときのシート長は９８ｍｍであった。
【００４３】
（４）測定（ディップスティック式メンブレンアッセイ）
健常成人から採取した、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス陰性の鼻腔ぬぐい試料（１０例）について、ウイルス抗原の抽出処理を行った後、０．３（ｗ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．２５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、測定試料を調製した。該測定試料を含むチューブにテストスティックを浸漬し、１０分後にテストスティックの各抗体塗布部位に現れる着色ライン（Ａ型、Ｂ型）の有無で判定した。各添加条件における測定は、ウイルス抗原の抽出処理から２回（ｎ＝２）行った。その結果を表２に示す。なお、表中、＋は着色ラインが観察されたことを意味し、数値が大きいほど着色が濃いことを表す。また、Ｎは着色が観察されなかったことを表す。
【００４４】
【表２】
【００４５】
ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ無添加の固相作製用試薬により作製した固相を用いた場合、Ａ型インフルエンザウイルス陰性の試料にもかかわらず、試料番号７、８、９の３試料においてＡ型用抗体塗布部位で着色ラインが観察された。一方、１．０％ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ添加の固相作製用試薬により作製した固相を用いた場合、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ無添加の場合に観察された着色ラインは観察されなかった。
以上より、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏを添加した固相作製用試薬を使用して固相を作製することにより非特異的反応（偽陽性）を、抑制・回避できることが確認された。
実施例１の結果とあわせ、本発明の固相作製用試薬により固相を作製した場合、標識が金属コロイド粒子であっても着色ラテックス粒子であっても、非特異的反応（偽陽性）を抑制・回避できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
測定対象物を特異的に捕捉するための試薬と植物由来ポリペプチドとを混合した溶液を固相作製用試薬として使用し、前記試薬を不溶性担体に固定化して出来た固相を標識結合アッセイ法に使用すれば、非特異的反応を抑制・回避することができ、正確な測定を実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明のテストスティックの一例を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識結合アッセイ法用の固相作製用試薬及び該試薬を使用して作製した標識結合アッセイ法用の固相に関するものである。
【技術背景】
【０００２】
抗原と抗体、核酸鎖とその相補鎖、アプタマーとアプタマーに対する特定の分子、リガンドとレセプターなど、その組み合わせに依存して特異的結合対を形成する反応を利用し、該組み合わせの一方を直接又は間接的に標識し、特異的結合対形成の結果生じる該標識の集積又は集積の阻害の程度から試料中の測定対象物を測定する標識結合アッセイ法が種々考案され、実用化されている。
なかでもその組み合わせに依存して特異的結合対を形成する反応に抗原抗体反応を利用する免疫学的測定方法は、多くの測定対象物に適用でき、操作性、迅速性にも優れるため、患者のそばで行う臨床検査（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ：ＰＯＣ検査）に利用され、診療の現場で多数使用されている。
免疫学的測定方法によるＰＯＣ検査としては、メンブレンイムノアッセイ法を使用した検査が普及している。該メンブレンイムノアッセイ法は、例えば、標識抗体と試料中の抗原（この場合の測定対象物）を混合して特異的結合対を形成させた後、該特異的結合対を、抗体を固定化したメンブレン（固相）上で展開し、標識抗体−抗原−固定化された抗体の三元特異的結合対をメンブレン（固相）上で形成させ、集積した標識量を測定することにより行うものである。
【０００３】
標識結合アッセイ法たる免疫学的測定方法の課題として、測定対象物の存在・不存在にかかわらず標識の集積が生じるいわゆる非特異的反応の抑制・回避があげられる。上記のメンブレンイムノアッセイ法のように、抗体を固定化した固相を利用して標識の集積量を測定する方法の場合、生じる非特異的反応は大きく二つあり、一つは、測定対象物（上記の例では抗原）の存在・不存在によらず、固相上の抗体が固定化されている部位でも固定化されていない部位でも標識の集積が観察されるバックグランドに係る非特異的反応、もう一つは、試料中に抗原が存在しないにもかかわらず、あたかも抗原が存在するかのように抗体固定化部位に標識が集積してしまう、いわゆる偽陽性である。
【０００４】
前者（バックグランドに係る非特異的反応）の原因としては、抗体が固定化されていない部位への標識それ自体及び／又は標識抗体の集積が考えられ、後者（偽陽性）の原因としては、固定化された抗体への標識それ自体及び／又は標識抗体の集積が考えられる。またさらに、上記非特異的な標識の集積に、試料由来の測定対象物以外の成分（例えば、変性したタンパク質や粘着性の物質）が関与している場合も考えられる。
【０００５】
これらの非特異的反応を抑制・回避する方法として、二つの方法が採用されている。一つはブロッキングによる方法であり、もう一つは、試料や標識抗体を、固相上で展開する際に特定の成分を含む溶液中に含有させる方法である。
【０００６】
ブロッキングによる方法としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、卵白アルブミン等の動物由来のタンパク質（非特許文献１、特許文献１、２など）や、大豆ペプチド等の植物由来のタンパク質（特許文献３）等をブロッキング剤として使用してブロッキングを行う方法が従来より報告されている。また、最近では、ブロッキング効果の優劣のほかに、ＢＳＥなど人畜共通感染の予防の見地から、ポリエチレングリコールなどの高分子物質（特許文献４）、蚕繭に由来するセリシン（特許文献５）等をブロッキング剤として使用する方法や植物由来のポリペプチドを有効成分とするブロッキング剤（特許文献６）等が報告されている。
【０００７】
試料や標識抗体を、固相上で展開する際に特定の成分を含む溶液中に含有させる方法の具体例としては、いわゆる試料希釈液や標識抗体液に非特異的反応を抑制・回避できる成分を含有させる方法があげられ、ブロッキング剤として使用される成分（ＢＳＡなど）や特定のアミノ酸、特定の界面活性剤を含有させる方法（特許文献７、８など）が報告されている。
【０００８】
しかしながら、上記、ブロッキング剤を使用する方法は、いずれも抗体を不溶性担体に固定化して固相とした後、該固相全体あるいは抗体固定化部位をブロッキング剤で被覆するものであり、ブロッキング効果向上を目的としてブロッキング剤の濃度を上げた場合、ブロッキング剤自体が不溶化して析出したり、抗体の抗原認識部位をマスクしてしまうなどの問題があった。
また、上記した試料希釈液や標識抗体液の組成を工夫する方法は、メンブレンイムノアッセイ法の検出感度が、試料や標識抗体と抗体を固定化した固相との接触時間（試料や標識抗体の流速）の影響を受けることがあるため、採用できない場合があった。
【特許文献１】特開平０６−１３００６２
【特許文献２】特開平０６−１６０３８５
【特許文献３】特開平０７−２７０４１３
【特許文献４】特開２００６−２２６９８２
【特許文献５】特開２００７−２４８３７３
【特許文献６】特開２００６−０４７２５５
【特許文献７】特開２００５−２９１７８０
【特許文献８】特開２００５−２９１７８３
【非特許文献１】新生化学実験講座１２、分子免疫学III（東京化学同人）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のようにブロッキングや試料希釈液あるいは標識抗体液の組成を工夫する従来の非特異的反応の抑制・回避方法には課題がある一方、抗体を不溶性担体に固定化し固相を作製する時点で、抗体と抗体以外の物質を共存させたうえで抗体を固定化する方法は全く報告されていない。この理由の一つとして、不溶性担体に固定化する抗体は、その比活性が高いことが好ましいとの一般的な理解があり、抗体以外の成分（緩衝液、塩類、保存剤、防腐剤等は除く）を共存させて抗体の比活性を下げるのは不利益と考えられていることが推測される。なお、前記比活性の語は、力価あるいは純度等の概念を包含しており、以降も同様である。
【００１０】
本発明は、上記の状況のもと、ブロッキングや試料希釈液あるいは標識抗体液の組成を工夫する従来の非特異的反応の抑制・回避方法以外の非特異的反応の抑制・回避方法の提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これまで不溶性担体に固定化して固相を作製する際の抗体（固相作製用試薬）は比活性が高いことが好ましいと考えられており、抗体を主成分とする固相作製用試薬では、抗体以外の成分（緩衝液、塩類、安定剤、保存剤、防腐剤等は除く）を共存させず、抗体の比活性が高い状態で固相作製用試薬として使用するのが一般的であった。これに対して、本発明者らは、抗体と植物由来ポリペプチドとを混合した溶液を固相作製用試薬として使用し、抗体を不溶性担体に固定化し、この固相を標識結合アッセイ法に使用したところ、意外にも陽性試料の測定に影響を与えることなく、陰性試料で生じる偽陽性を抑制・回避できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明は、抗体及び植物由来ポリペプチドを有効成分として含有する、標識結合アッセイ法における固相作製用試薬ならびに該試薬を使用して作製した標識結合アッセイ法用固相、さらには該固相を使用することを特徴とする標識結合アッセイ法を提供するものである。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
（１）測定対象物を特異的に捕捉するための試薬及び植物由来ポリペプチドを有効成分として含有する、標識結合アッセイ法における固相作製用試薬。
（２）植物由来ポリペプチドが、植物由来のタンパク質を分解して得られうるポリペプチドである、前記（１）に記載の固相作製用試薬。
（３）植物が、小麦、大麦、トウモロコシ、米、大豆、小豆、インゲン豆、そら豆、アーモンド、ピーナッツ、ジャガイモ、サツマイモ、サトイモ及びタロイモからなる群より選択される植物である、前記（２）に記載の固相作製用試薬。
（４）植物由来のタンパク質が、グリアジン、ツェイン（ゼイン）、グルテニン、グルテン、ホルデイン、オリゼニン、グリシニン、パタチン及びコングリシニンからなる群より選択されるタンパク質である、前記（３）に記載の固相作製用試薬。
（５）測定対象物を特異的に捕捉するための試薬が、抗体、抗原、核酸鎖、アプタマー、アプターマーに対する特定の物質、リガンド及びレセプターからなる群より選択されるいずれかを含む、前記（１）〜前記（４）のいずれか一つに記載の固相作製用試薬。
（６）前記（１）〜前記（５）のいずれか一つに記載の固相作製用試薬を不溶性担体に塗布して作製した、標識結合アッセイ法用の固相。
（７）不溶性担体がメンブレンよりなる、前記（６）に記載の固相。
（８）前記（６）又は（７）に記載の固相を使用することを特徴とする、標識結合アッセイ法。
（９）フロースルー式、ラテラルフロー式又はディップスティック式メンブレンアッセイ法である、前記（８）に記載の標識結合アッセイ法。
（１０）標識が金属コロイド粒子又は着色ラテックス粒子である、前記（８）又は前記（９）に記載の標識結合アッセイ法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により提供される固相作製用試薬は、非特異的反応を抑制・回避した標識結合アッセイ法用の固相を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明における、「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」は、「測定対象物を特異的に捕捉するための試薬」及び「植物由来ポリペプチド」を有効成分として含有するものである。
【００１５】
本発明において「標識結合アッセイ法」とは、抗原と抗体、核酸鎖とその相補鎖、アプタマーとアプタマーに対する特定の分子、リガンドとレセプターなど、その組み合わせに依存して特異的結合対を形成する反応を利用し、組み合わせの一方を直接又は間接的に標識し、該標識の集積又は集積の阻害の程度から試料中の測定対象物を測定するアッセイ法をいう。
【００１６】
本発明において「測定対象物を特異的に捕捉するための試薬」とは、不溶性担体に固定化しようとする対象を指し、測定対象物と特異的な結合対を形成することによって測定対象物を捕捉する物質をいう。具体的には、抗原と抗体、核酸鎖とその相補鎖、アプタマーとアプタマーに対する特定の分子、リガンドとレセプターなど、その組み合わせに依存して特異的な結合対を形成する物質の一方をいう。これらは、いずれであっても本発明の「測定対象物を特異的に捕捉するための試薬」として使用することができる。
【００１７】
以下、「測定対象物を特異的に捕捉するための試薬」として抗体を用い、不溶性担体に固定化する場合を例として本発明を詳細に説明する。
【００１８】
「測定対象物を特異的に捕捉するための試薬」として使用できる抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗原認識部位を含むこれらの断片のいずれでもよい。抗体を採取するための動物の種類や免疫方法、抗体産生細胞の株化（ハイブリドーマの調製）、抗体の精製方法などは、当業者に周知の方法を使用することができる。「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」中の抗体の濃度は１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬがより好ましい。
【００１９】
本発明の「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」に含有させることができる「植物由来のポリペプチド」を得るための植物としては、小麦、大麦、カラス麦、トウモロコシ、ジャポニカ米、インディカ米、ジャバンカ米、アフリカ米、餅米、大豆、小豆、インゲン豆、そら豆、アーモンド、ピーナッツ、ジャガイモ、サツマイモ、サトイモ、タロイモ等をあげることができる。これらのうち大豆、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ及び米が好ましく、大豆及びトウモロコシがより好ましい。
【００２０】
「植物由来のポリペプチド」は、前記した植物に由来するタンパク質を分解して得られるポリペプチドが好ましい。前記「植物由来のタンパク質」は前記植物から抽出されたタンパク質又はタンパク質を含む画分があげられ、タンパク質の具体例としては、グリアジン、ツェイン（ゼイン）、グルテニン、グルテン、ホルデイン、オリゼニン、グリシニン、パタチン及びコングリシニン等の貯蔵タンパク質、レクチン、アミラーゼ、呼吸及び光合成に関与する酵素等の機能タンパク質、根、茎、葉、花、果実、種子などに由来する構造タンパク質があげられる。なかでも貯蔵タンパク質が好ましい。
【００２１】
「植物由来のポリペプチド」は、該タンパク質を酵素、酸、アルカリなどの処理により分解することで得ることができるが、これらに限定されるものではない。また化学的に合成したものや遺伝子組み換えにより産生されたものであってもよい。
分解の方法としては、酵素による加水分解が好ましい。加水分解に使用できる酵素は、プロテアーゼに属するもので、タンパク質をポリペプチドに分解できるものあれば良く、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等の動物由来のプロテイナーゼ、パパイン、フィシン、ブロメライン等の植物由来のプロテアーゼ、その他、細菌、カビ、放射菌等の微生物由来のプロテアーゼ等があげられる。また、酸分解の場合、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸等の酸があげられ、アルカリ分解の場合は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム等があげられる。
【００２２】
分解された後の「ポリペプチド」は、重量平均分子量２００Ｄａ〜３０万Ｄａであることが好ましく、重量平均分子量３００Ｄａ〜２０万Ｄａであることがより好ましい。また、タンパク質加水分解時に生ずる遊離アミノ酸は、本発明の「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」の性能を損なわないことを限度として混入していても構わない。また、２種類以上の植物または同一植物の２種類以上のタンパク質に由来するポリペプチドを併用してもよい。
【００２３】
好ましい「植物由来ポリペプチド」としては、ダイズタンパク質、コムギタンパク質、ジャガイモタンパク質、トウモロコシタンパク質、コメヌカタンパク質の加水分解物などがあげられ、その中でもトウモロコシタンパク質の加水分解物が好ましい。
【００２４】
トウモロコシタンパク質の加水分解物としては、例えば、分子量２００Ｄａ〜４０００Ｄａのペプチドで、遊離アミノ酸含量が全アミノ酸に対して１％以下であるものが好ましい。また、その中でも、アミノ酸組成（重量％）が、アスパラギン酸２．５〜１２．５、スレオニン２．５〜６．０、セリン４．０〜６．０、グルタミン酸１５．０〜５０．０、グリシン２．０〜５．５、アラニン２．０〜１３．５、バリン４．０〜８．０、システイン０．０〜１．５、メチオニン１．０〜２．０、イソロイシン３．０〜６．０、ロイシン６．０〜１５．０、チロシン１．０〜４．０、フェニルアラニン２．０〜５．５、リジン０．５〜７．０、ヒスチジン０．５〜３．０、アルギニン１．０〜８．０、プロリン５．０〜１３．０であるものがより好ましい。
【００２５】
本発明の「植物由来ポリペプチド」として使用することが可能な市販品として、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（登録商標、生化学バイオビジネス株式会社、Ｃｏｄｅ＃２００１４０）をあげることができる。
【００２６】
「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」中の「植物由来ポリペプチド」の濃度は０．００５〜３０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．０１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０３〜５％である。
【００２７】
本発明の「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」は、使用時には溶液状態である。以下、溶液状態での各種条件について記載する。本発明の「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」は緩衝液に溶解させて使用することが好ましい。緩衝液の種類としては、りん酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨは６．０〜９．５の範囲が好ましく、６．５〜８．５がより好ましく、７．０〜８．０がさらに好ましい。
緩衝液には、さらにＮａＣｌなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリンなどの防腐剤等を含んでもよい。塩類はＮａＣｌなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する工程で存在するようになるものも含まれる。
これら、本発明の「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」の有効成分以外の成分は、本発明の非特異的反応の抑制・回避効果を低下させたり、「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」の性能（例えば、不溶性担体に固定化される量や特異的結合対を形成する能力）を損なわないことを限度として適宜、処方することができる。
【００２８】
本発明の「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」は、「測定対象物を特異的に捕捉するための試薬」を不溶性担体に固定化する直前に「植物由来ポリペプチド」と混合して調製してもよいし、予め混合したものを凍結保存し使用時に融解して用いたり、凍結乾燥保存してあるものを蒸留水等で溶解して用いてもよい。
【００２９】
上記のようにして調製された「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」溶液は、フロースルー式の場合、点あるいは＋など特定のシンボル状に、ラテラルフロー式（代表例としてイムノクロマト法用のテストスティック）の場合には、ライン状にメンブレン不溶性担体に塗布することにより、本発明の「標識結合アッセイ法用の固相」を製造することができる。
なお、本発明において、「フロースルー式メンブレンアッセイ」という場合は、測定試料等が本発明の「標識結合アッセイ法用の固相」（この場合、抗体固定化メンブレン）を垂直に通過するように展開する方式を指し、「ラテラルフロー式メンブレンアッセイ」という場合は、測定試料が抗体固定化メンブレンを水平に移動するように展開する方式を指す。また、「ディップスティック式メンブレンアッセイ」という場合は、測定試料溶液にラテラルフロー式用の抗体固定化メンブレンを倒立させてその一端を浸漬し、毛細管現象を利用して測定試料が上部に吸い上げられるように展開させる方式を指す。
【００３０】
本発明の「標識結合アッセイ法用の固相」は、本発明の固相作製用試薬を用いて「測定対象物を特異的に捕捉するための試薬」を不溶性担体に固定化した後、さらに、上述した通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
本発明の「標識結合アッセイ法における固相作製用試薬」を用いて、本発明の「標識結合アッセイ法の固相」を作製する場合の固相（不溶性担体）の形態は、ウエル状、粒子状、板状、膜状のいずれでもよい。固相の材質は、プラスチック、ラテックス、セルロースなどを使用することができる。「標識結合アッセイ法用の固相」がＰＯＣ検査用である場合、ニトロセルロース等で製された多孔性のメンブレンを使用することが好ましい。
【００３１】
本発明の「標識結合アッセイ法」における標識物質は、酵素、色素、蛍光物質、金コロイドなどの金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子など、いわゆるイムノアッセイやハイブリダイズアッセイに使用される物質であれば、いずれでも使用できる。簡便性を要求されるＰＯＣ検査の場合、金属コロイド粒子や着色ラテックス粒子が標識集積の可視化の点ですぐれており、好ましい。
【００３２】
本明細書において使用される「測定」の語は、特に断らないかぎり、最も広義に解釈されるべき語であり、通常使用される「検査」、「検出」、「分析」、「同定」、「判定」などの概念を包含し、また、測定の結果が「定量」的である場合、「半定量」的である場合、「定性」的である場合のいずれも包含する。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【００３４】
〔実施例１〕
本発明の固相作製用試薬により作製した固相を用いた抗原の測定／標識が金属コロイド粒子の場合
（１）標識結合アッセイ法用の固相（抗体固定化メンブレン）の作製
２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に対し、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を０．７５ｍｇ／ｍＬ、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（登録商標、生化学バイオビジネス株式会社、Ｃｏｄｅ＃２００１４０、本発明の植物由来ポリペプチドを含む）を０％（無添加）〜５．０％（ｖ／ｖ）（本発明の植物由来ポリペプチドの濃度は、ＢＳＡ換算のタンパク濃度として０％〜０．３％（ｗ／ｖ））、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、Ａ型インフルエンザ用固相作製用試薬（Ａ型用抗体）とした。
同様に、１０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．２）にマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏを０％（無添加）〜２．５％（ｖ／ｖ）（本発明の植物由来ポリペプチドの濃度は、ＢＳＡ換算のタンパク濃度として０％〜０．１５％（ｗ／ｖ））、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、Ｂ型用インフルエンザ用固相作製用試薬（Ｂ型用抗体）とした。
また、１０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．２）に、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を０．７５ｍｇ／ｍＬ、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、コントロールライン（ＣＴＲＬ）用固相作製用試薬とした。
上記３種の固相作製用試薬を、ニトロセルロースメンブレンにＡ型用抗体、Ｂ型用抗体、ＣＴＲＬ用抗体の順序で、ライン状に相互に間隔を開けて塗布し、乾燥機で乾燥させたものを抗体固定化メンブレンとした。なお、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ中の植物由来ポリペプチドの主たる分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見積もりで６０００Ｄａ以下である。
【００３５】
（２）標識抗体パッドの作製
１．３％（ｗ／ｖ）カゼイン及び４％スクロースを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）に、金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体及び金コロイド標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を加えて混合し、標識抗体液とした。標識抗体液をグラスファイバーシートに塗布し、乾燥機で乾燥させたものを標識抗体パッドとした。
【００３６】
（３）本発明の標識結合アッセイ法用の固相を使用したテストスティックの作製
プラスチック製粘着シートに前記（１）で作製した抗体固定化メンブレンを貼り、図１のように標識抗体パッド、サンプルパッド、吸水パッドを配置した。すなわち、抗Ａ型用抗体が塗布されている側（測定試料の固相上での展開における上流）の末端近傍に前記（２）で作製した標識抗体パッドを配置し、この標識抗体パッドに一部重なるようにサンプルパッドを配置した。一方、ＣＴＲＬ用抗体が塗布されている側（測定試料の固相上での展開における下流）の末端に吸水パッドを配置した。さらにその上から、透明プラスチックシールで覆った。張り合わせたシートは、４ｍｍ幅で裁断し、テストスティックとした。なおこのときのシート長は９８ｍｍであった。
【００３７】
（４）測定（ディップスティック式メンブレンアッセイ）
健常成人から採取した、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス陰性の鼻腔ぬぐい試料（１例）について、ウイルス抗原の抽出処理を行った後、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．２５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．６）で希釈し、測定試料を調製した。該測定試料を含むチューブにテストスティックを浸漬し、１０分後にテストスティックの各抗体塗布部位に現れる赤色ラインの有無を測定した。ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ各添加条件における測定は、ウイルス抗原の抽出処理から２回（ｎ＝２）行った。その結果を表１に示す。なお、表中、＋は赤色ラインが観察されたことを意味し、数値が大きいほど着色が濃いことを表す。また、Ｎは赤色ラインが観察されなかったことを表す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ無添加の固相作製用試薬により作製した固相を用いた場合、Ａ型インフルエンザウイルス陰性の試料にもかかわらず２回の測定ともＡ型用抗体塗布部位で赤色ラインが観察された。１．０％ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ添加の固相作製用試薬により作製した固相を用いた場合、赤色ラインの着色が、無添加の場合の２．５＋から１．５＋に低下し、２．５％及び５．０％ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ添加の固相作製用試薬により作製した固相を用いた場合には、赤色ラインは観察されなかった。以上より、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏを添加した固相作製用試薬を使用して固相を作製することにより非特異的反応（偽陽性）を、抑制・回避できることが確認された。
【００４０】
〔実施例２〕
本発明の固相作製用試薬により作製した固相を用いた抗原の測定／標識が着色ラテックスの場合
（１）抗体固定化メンブレンの作製
１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．２）に対し、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を０.７５ｍｇ／ｍＬ、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏを０％（無添加）、１％（ｖ／ｖ）（本発明の植物由来ポリペプチドの濃度は、ＢＳＡ換算のタンパク濃度として０．０６％（ｗ／ｖ））、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、Ａ型用固相作製用試薬とした。
同様に、１０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．２）にマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬ、Ａｐｐｌｉｅ Ｄｕｏを０％、１％（ｖ／ｖ）（本発明の植物由来ポリペプチドの濃度は、ＢＳＡ換算のタンパク濃度として０．０６％（ｗ／ｖ））、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、Ｂ型用固相作製用試薬とした。
また、１０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．２）に、抗ＨＲＰ（西洋ワサビパーオキシダーゼ）抗体を１．８ｍｇ／ｍＬ、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、ＣＴＲＬ用固相作製用試薬とした。
上記３種の固相作製用試薬を、ニトロセルロースメンブレンにＡ型用抗体、Ｂ型用抗体、ＣＴＲＬ用抗体の順序で、ライン状に相互に間隔を開けて塗布し、乾燥機で乾燥させたものを抗体固定化メンブレンとした。なお、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ中の植物由来ポリペプチドの主たる分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見積もりで６０００Ｄａ以下である。
【００４１】
（２）標識抗体パッドの作製
２％（ｗ／ｖ）カゼイン及び１０％スクロースを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．５）に、着色ラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体、着色ラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体及び着色ラテックス標識ＨＲＰを加えて混合し、標識抗体液とした。標識抗体液をグラスファイバーシートに塗布し、乾燥機で乾燥させたものを標識抗体パッドとした。
【００４２】
（３）本発明の標識結合アッセイ法用固相を使用したテストスティックの作製
プラスチック製粘着シートに前記（１）で作製した抗体固定化メンブレンを貼り、図１のように標識抗体パッド、サンプルパッド、吸水パッドを配置した。すなわち、抗Ａ型用抗体が塗布されている側（測定試料の固相上での展開における上流）の末端近傍に前記（２）で作製した標識抗体パッドを配置し、この標識抗体パッドに一部重なるようにサンプルパッドを配置した。一方、ＣＴＲＬ用（抗ＨＲＰ）抗体が塗布されている側（測定試料の固相上での展開における下流）の末端に吸水パッドを配置した。さらにその上から、透明プラスチックシールで覆った。張り合わせたシートは、４ｍｍ幅で裁断し、テストスティックとした。なお、このときのシート長は９８ｍｍであった。
【００４３】
（４）測定（ディップスティック式メンブレンアッセイ）
健常成人から採取した、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス陰性の鼻腔ぬぐい試料（１０例）について、ウイルス抗原の抽出処理を行った後、０．３（ｗ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．２５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、測定試料を調製した。該測定試料を含むチューブにテストスティックを浸漬し、１０分後にテストスティックの各抗体塗布部位に現れる着色ライン（Ａ型、Ｂ型）の有無で判定した。各添加条件における測定は、ウイルス抗原の抽出処理から２回（ｎ＝２）行った。その結果を表２に示す。なお、表中、＋は着色ラインが観察されたことを意味し、数値が大きいほど着色が濃いことを表す。また、Ｎは着色が観察されなかったことを表す。
【００４４】
【表２】
【００４５】
ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ無添加の固相作製用試薬により作製した固相を用いた場合、Ａ型インフルエンザウイルス陰性の試料にもかかわらず、試料番号７、８、９の３試料においてＡ型用抗体塗布部位で着色ラインが観察された。一方、１．０％ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ添加の固相作製用試薬により作製した固相を用いた場合、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ無添加の場合に観察された着色ラインは観察されなかった。
以上より、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏを添加した固相作製用試薬を使用して固相を作製することにより非特異的反応（偽陽性）を、抑制・回避できることが確認された。
実施例１の結果とあわせ、本発明の固相作製用試薬により固相を作製した場合、標識が金属コロイド粒子であっても着色ラテックス粒子であっても、非特異的反応（偽陽性）を抑制・回避できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
測定対象物を特異的に捕捉するための試薬と植物由来ポリペプチドとを混合した溶液を固相作製用試薬として使用し、前記試薬を不溶性担体に固定化して出来た固相を標識結合アッセイ法に使用すれば、非特異的反応を抑制・回避することができ、正確な測定を実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明のテストスティックの一例を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物を特異的に捕捉するための試薬及び植物由来ポリペプチドを有効成分として含有する、標識結合アッセイ法における固相作製用試薬。
【請求項２】
植物由来ポリペプチドが、植物由来のタンパク質を分解して得られうるポリペプチドである、請求項１に記載の固相作製用試薬。
【請求項３】
植物が、小麦、大麦、トウモロコシ、米、大豆、小豆、インゲン豆、そら豆、アーモンド、ピーナッツ、ジャガイモ、サツマイモ、サトイモ及びタロイモからなる群より選択される植物である、請求項２に記載の固相作製用試薬。
【請求項４】
植物由来のタンパク質が、グリアジン、ツェイン（ゼイン）、グルテニン、グルテン、ホルデイン、オリゼニン、グリシニン、パタチン及びコングリシニンからなる群より選択されるタンパク質である、請求項３に記載の固相作製用試薬。
【請求項５】
測定対象物を特異的に捕捉するための試薬が、抗体、抗原、核酸鎖、アプタマー、アプタマーに対する特定の分子、リガンド及びレセプターからなる群より選択されるいずれかを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の固相作製用試薬。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の固相作製用試薬を不溶性担体に塗布して作製した、標識結合アッセイ法用の固相。
【請求項７】
不溶性担体がメンブレンよりなる、請求項６に記載の固相。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の固相を使用することを特徴とする、標識結合アッセイ法。
【請求項９】
フロースルー式、ラテラルフロー式又はディップスティック式メンブレンアッセイ法である、請求項８に記載の標識結合アッセイ法。
【請求項１０】
標識が金属コロイド粒子又は着色ラテックス粒子である、請求項８又は９に記載の標識結合アッセイ法。
【請求項１】
測定対象物を特異的に捕捉するための試薬及び植物由来ポリペプチドを有効成分として含有する、標識結合アッセイ法における固相作製用試薬。
【請求項２】
植物由来ポリペプチドが、植物由来のタンパク質を分解して得られうるポリペプチドである、請求項１に記載の固相作製用試薬。
【請求項３】
植物が、小麦、大麦、トウモロコシ、米、大豆、小豆、インゲン豆、そら豆、アーモンド、ピーナッツ、ジャガイモ、サツマイモ、サトイモ及びタロイモからなる群より選択される植物である、請求項２に記載の固相作製用試薬。
【請求項４】
植物由来のタンパク質が、グリアジン、ツェイン（ゼイン）、グルテニン、グルテン、ホルデイン、オリゼニン、グリシニン、パタチン及びコングリシニンからなる群より選択されるタンパク質である、請求項３に記載の固相作製用試薬。
【請求項５】
測定対象物を特異的に捕捉するための試薬が、抗体、抗原、核酸鎖、アプタマー、アプタマーに対する特定の分子、リガンド及びレセプターからなる群より選択されるいずれかを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の固相作製用試薬。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の固相作製用試薬を不溶性担体に塗布して作製した、標識結合アッセイ法用の固相。
【請求項７】
不溶性担体がメンブレンよりなる、請求項６に記載の固相。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の固相を使用することを特徴とする、標識結合アッセイ法。
【請求項９】
フロースルー式、ラテラルフロー式又はディップスティック式メンブレンアッセイ法である、請求項８に記載の標識結合アッセイ法。
【請求項１０】
標識が金属コロイド粒子又は着色ラテックス粒子である、請求項８又は９に記載の標識結合アッセイ法。
【図１】
【公開番号】特開２００９−１６２５３５（Ｐ２００９−１６２５３５Ａ）
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３４０００８（Ｐ２００７−３４０００８）
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
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