固相酵素免疫測定法用化学発光試薬
【課題】
酵素結合リガンド量が多い場合であっても、基質が供給不足にならず、化学発光量が低下することがなく、広範囲の酵素結合リガンドの量を測定することができること。
【解決手段】化学発光物質（ａ）、化学発光増強剤（ｂ）、免疫複合体解離剤（ｃ）及び緩衝液（ｄ）を含んでなる固相酵素免疫測定法用化学発光試薬を用いる。
酵素結合リガンド量が多い場合であっても、基質が供給不足にならず、化学発光量が低下することがなく、広範囲の酵素結合リガンドの量を測定することができること。
【解決手段】化学発光物質（ａ）、化学発光増強剤（ｂ）、免疫複合体解離剤（ｃ）及び緩衝液（ｄ）を含んでなる固相酵素免疫測定法用化学発光試薬を用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相酵素免疫測定法用化学発光試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、酵素結合リガンド含有検体中に、化学発光物質、化学発光増強剤、緩衝剤、キレート剤及び酸化剤からなる試薬成分を配合して、化学発光の強さにより検体中の酵素結合リガンドを測定するための固相酵素免疫測定法用化学発光試薬が知られている（非特許文献１）。
【非特許文献１】METHODS IN ENZYMOLOGY,VOL.133[Academic Press,Inc.,1986],p331〜353
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、従来の化学発光試薬では、固相上に形成される免疫複合体中の酵素結合リガンドが多い場合、固相に接している化学発光物質が急激に酵素反応により消費され、反応により生じる化学発光量は短時間に増加する反面、急激に低下する（基質となる新たな化学発光物質が酵素反応の場に供給されない）ため、広範囲の酵素結合リガンド量を測定する必要のある臨床検査薬への適用が困難であるという問題がある。また、この問題を低減する方策として、反応及び化学発光量の計測を撹拌しながら行うことも挙げられるが、測定装置が複雑になる等、装置上の制約などの問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の固相酵素免疫測定法用化学発光試薬の特徴は、化学発光物質（ａ）、化学発光増強剤（ｂ）、免疫複合体解離剤（ｃ）及び緩衝液（ｄ）を含んでなる点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の化学発光試薬は、酵素結合リガンド量が多い場合であっても、基質が供給不足にならず、化学発光量が低下することがないため、広範囲の酵素結合リガンドの量を測定することができる。従って、本発明の化学発光試薬を適用することにより、酵素結合リガンドを用いた固相酵素免疫測定を臨床検査薬へ適用できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
化学発光物質（ａ）及び化学発光増強剤（ｂ）としては、固相酵素免疫測定法に使用される酵素に対応して公知の物質を組み合わせて選択できる。
化学発光物質（ａ）としては、例えば「生物発光と化学発光−基礎と実験−」（廣川書店，昭和６４年発行）に記載の２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物、１，２−ジオキセタン化合物、アクリジン化合物、インドール化合物等が含まれる。化学発光物質（ａ）のうち、測定感度及び溶液状態での保存安定性の観点から、好ましいのは２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（酵素がペルオキシダーゼの場合）｛ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）及びこれらの金属（アルカリ金属等）塩等｝及び１，２−ジオキセタン化合物（酵素がアルカリフォスファターゼの場合）｛３−ガラクトシドキシフェニルジオキセタン、４−メトキシ−４−（３−フォスフェートフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタン］等｝、さらに好ましくは２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物、特に好ましいのはルミノール及びルミノールの金属塩、最も好ましいのはルミノールのナトリウム塩である。
【０００７】
化学発光増強剤（ｂ）としては、化学発光物質（ａ）の種類に対応して選択され、例えば、化学発光物質（ａ）がルミノール又はルミノールの金属塩の場合、特開昭５９−５００２５２号、特開昭５９−１７１８３９号、特開平７−１４３８９９号又は特開平４−２９３４９８号の各公報に記載された化合物［チアゾール化合物｛６−ヒドロキシベンゾチアゾール、４−［２’−（４’−メチル）チアゾリル］フェノール、４−［４’−（２’−メチル）チアゾリル］フェノール等｝、ナフトール化合物、フェノール化合物｛４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−（２’−チエニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール等｝〕が挙げられ、また、（ａ）が１，２−ジオキセタン化合物の場合、特開平３−５３８９７号又は特開平４−１２４１８５号の各公報記載の化合物〔重合性４級アンムニウム塩｛ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド）、ポリ｛ビニルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロリド）｝等〕が挙げられる。特に（ａ）が４−メトキシ−４−（３−フォスフェートフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタン］の場合、蛍光ミセル（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミドと５−Ｎ−テトラデカノイル−アミノフルオレセインで形成したミセル）等が挙げられる。
これらのうち、化学発光増強効果の観点から、チアゾール化合物、フェノール化合物が好ましく、さらに好ましいのはフェノール化合物、次にさらに好ましいのはｐ−ヨードフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール及び４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノールである。
【０００８】
免疫複合体解離剤（ｃ）は、固相酵素免疫測定法により固相表面上に形成される免疫複合体から酵素結合リガンドを解離する作用を有し、化学発光反応を阻害しないものであれば制限がない。
なお、固相酵素免疫測定法により固相表面上に形成される免疫複合体とは、少なくとも１種類の酵素結合リガンド（例えば酵素結合抗体）と、リガンドが認識する物質（例えば抗原）とが、結合して形成される複合体を意味する。
【０００９】
免疫複合体解離剤（ｃ）のうち、測定レンジ拡大の観点から、固相上に形成された免疫複合体から、免疫複合体中に含まれる酵素結合リガンドを、酵素活性の比として５〜９０％を解離させるものが好ましく、さらに好ましくは７〜８５％、特に好ましくは１０〜８０％である。酵素活性の比は、解離前の固相上の免疫複合体中に含まれる酵素結合リガンドの酵素活性と解離した酵素結合リガンドの酵素活性との比である。
酵素活性の比は、例えば次の方法で測定される。免疫複合体が形成された固相を免疫複合体解離剤（ｃ）を含む化学発光試薬に浸漬した後、化学発光試薬と固相を分離し、それぞれについて酵素活性を測定する。化学発光試薬中の酵素活性をＸ、固相中の酵素活性をＹとすると、解離した酵素結合リガンドの酵素活性の比（％）は、Ｘ／（Ｘ＋Ｙ）×１００で求められる。なお、この場合の浸漬条件（浸漬時間、温度等）は、本発明による化学発光試薬を固相酵素免疫測定法に適用する条件に合わせて設定する。酵素活性の測定法は、用いる酵素により適宜設定することができるが、酵素結合リガンドの存在様式（遊離状態と固相に結合した状態等）により活性に差がない測定法であることが必要である。
【００１０】
免疫複合体解離剤（ｃ）としては、タンパク質変性剤、界面活性剤及び下記一般式（１）で表される２環式ジアミン（有機酸塩）からなる群より選ばれる少なくとも１種が含まれる。これらは２種以上を併用してもよい。
一般式（１）で表される２環式ジアミン（有機酸塩）とは、一般式（１）で表される２環式ジアミン及び／又は該ジアミンの有機酸塩を意味する。
【００１１】
【化１】
【００１２】
タンパク質変性剤としては、グアニジル基を有する物質であるアルギニン、プロタミン、グアニジン塩（グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン硫酸塩及びグアニジン炭酸塩等）から選ばれる１種以上の物質及び水溶性アミド｛尿素及びアセトアミド等｝が使用できる。これらは２種以上を併用してもよい。これらのうち、測定レンジ拡大の観点から、グアニジン塩が好ましく、さらに好ましいのは、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、特に好ましいのはグアニジン塩酸塩である。
【００１３】
界面活性剤としては、カチオン界面活性剤（臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウム、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、ベンズアルコニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド及びセチルトリメチルアンモニウムクロリド等）、アニオン界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、トリエタノールアミンラウリル硫酸、ジエタノールアミンラウリル硫酸、セチル硫酸ナトリウム、スルホニル琥珀酸ジオクチルナトリウム、スルホニル琥珀酸ジスコリウムモノココアミド、イソステアリル−２−ラクトイル酸ナトリウム、セテアリル硫酸ナトリウム及びココイルイセチオン酸ナトリウム等）、両性界面活性剤｛ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート）、ポリエチレングリコールモノオクチルフェニルエーテル、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ラウリン酸アミドプロピルベタイン及び３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート等｝、及び非イオン界面活性剤［高級アルコールエチレンオキサイド（エチレンオキサイドは以下ＥＯと略記）付加物、脂肪酸ＥＯ付加物、脂肪酸アミドＥＯ付加物、ソルビタン脂肪酸エステルＥＯ付加物、ポリプロピレングリコールＥＯ付加物等］が含まれ、公知（特開平８−２６１９４３号公報等に記載）の界面活性剤が使用できる。これらは２種以上を併用してもよい。
これらのうち、測定レンジ拡大の観点から、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤及び非イオン界面活性剤が好ましく、さらに好ましいのは非イオン界面活性剤、よりさらに好ましいのは、高級アルコールＥＯ付加物、脂肪酸ＥＯ付加物、脂肪酸アミドＥＯ付加物、ソルビタン脂肪酸エステルＥＯ付加物及びポリプロピレングリコールＥＯ付加物、とくに好ましいのはソルビタン脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物、最も好ましいのはソルビタンオレイン酸モノエステルＥＯ付加物である。
【００１４】
一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して水素原子、炭素数（以下Ｃと略記）１〜２０のアルキル、Ｃ２〜２０のアルケニル、Ｃ２〜２０のアルキニル、Ｃ６〜２０の（アルキル）アリール、Ｃ７〜２０のアリールアルキル基を表し、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール及びアリールアルキル基中の水素原子の一部又は全部が水酸基、アミノ基、（ジ）アルキル（Ｃ１〜１６）アミノ基、（ジ）ヒドロキシアルキル（Ｃ２〜４）アミノ基、メルカプト基又はハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）によってさらに置換されていてもよい。また２つのＲ1及び２つのＲ2は、同一であってもよいし異なっていてもよく、互いに結合（炭素−炭素結合、エーテル結合等）してＣ４〜１６の環を形成してもよい。ｍ及びｎは互いに独立して１〜１２の整数を表す。
【００１５】
Ｃ１〜２０のアルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｎ−へキシル、２−エチルヘキシル、ｎ−デシル、ｎ−ドデシル、ｓｅｃ−トリデシル、オクタデシル、イソオクダデシル及びエイコシル基等が挙げられる。
【００１６】
Ｃ２〜２０のアルケニル基としては、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−又は２−ドデシニル、１−又は２−トリデシニル、１−又は２−テトラデシニル、１−又は２−ヘキサデシニル、１−又は２−ステアリニル及び１−又は２−ノナデシニル、１−又は２−エイコシニル基等が挙げられる。
【００１７】
Ｃ６〜２０の（アルキル）アリール基としては、フェニル、ノニルフェニル、３，５−ジノニルフェニル、オクチルフェニル、ナフチル及び６−ブチルナフチル基等が挙げられる。
【００１８】
Ｃ７〜２０のアリールアルキル基としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル、５−フェニルペンチル、６−フェニルヘキシル、７−フェニルヘプチル、８−フェニルオクチル、１０−フェニルデシル、１２−フェニルドデシル、ナフチルメチル及びナフチルエチル基等が挙げられる。
【００１９】
２つのＲ1又は２つのＲ2が互いに結合してＣ４〜１６の環を形成する場合、２つのＲ1又は２つのＲ2は、２価の有機基を形成する。
２価の有機基としては、Ｃ４〜１６のアルキレン、Ｃ４〜１６のアルケニレン、Ｃ４〜１６のアリーレン基等が挙げられる。
【００２０】
一般式（１）で表されるアミンの具体例としては、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン−７（以下、ＤＢＵと略記する。：ＤＢＵはサンアプロ（株）の登録商標である。）、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノネン−５（以下、ＤＢＮと略記する）、１，８−ジアザビシクロ［５．３．０］デセン−７、１，４−ジアザビシクロ［３．３．０］オクテン−４、１，５−ジアザビシクロ［４．４．０］デセン−５、６−ジメチルアミノ−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン−７、６−ジブチルアミノ−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン−７、６−（２−ヒドロキシエチル）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン、６−（２−ヒドロキシプロピル）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン、７−（２−ヒドロキシエチル）−１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］−５−ノネン、７−（２−ヒドロキシプロピル）−１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］−５−ノネン、６−ジ（２−ヒドロキシエチル）アミノ−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン等が挙げられる。
【００２１】
上記アミンの有機酸塩としては、フェノール塩、Ｃ４〜１８のアルキル酸塩（オクチル酸塩、オレイン酸塩等）、芳香族スルホン酸塩（ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等）、ギ酸塩及び芳香族カルボン酸塩（フタル酸塩等）等が挙げられる。
【００２２】
これらは２種以上を併用してもよい。
【００２３】
一般式（１）で表される２環式ジアミン（有機酸塩）のうち、測定レンジ拡大の観点から、ＤＢＵ、ＤＢＵの有機酸塩（ｃ１）、ＤＢＮ、及びＤＢＮの有機酸塩（ｃ２）が好ましく、さらに好ましいのはＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）、ＤＢＵ−オクチル酸塩（ｃ１２）、ＤＢＵ−オレイン酸塩（ｃ１３）、ＤＢＵ−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ｃ１４）、ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）、ＤＢＵ−フタル酸塩（ｃ１６）、ＤＢＮ−フェノール塩（ｃ２１）、ＤＢＮ−オクチル酸塩（ｃ２２）、ＤＢＮ−オレイン酸塩（ｃ２３）、ＤＢＮ−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ｃ２４）、ＤＢＮ−ギ酸塩（ｃ２５）及びＤＢＮ−フタル酸塩（ｃ２６）、とくに好ましいのは（ｃ１１）、（ｃ１２）、（ｃ１３）、（ｃ１４）及び（ｃ１５）、最も好ましいのは（ｃ１４）及び（ｃ１５）である。
【００２４】
緩衝液（ｄ）としては、公知（たとえば、特開平１０−３１９０１５号公報又は特開２００３−２７９４８９号公報）の緩衝液等が使用できる。これらのうち、化学発光増強効果及び保存安定性の観点から、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物／水酸化ナトリウム緩衝液及びピペラジニル−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）・２水和物／水酸化ナトリウム緩衝液が好ましく、さらに好ましいのは３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液及び２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物／水酸化ナトリウム緩衝液、特に好ましいのは３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液である。
緩衝液（ｄ）中の緩衝剤の含有量（ｍM。２５℃）は、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、１〜５００が好ましく、さらに好ましくは５〜３００、特に好ましくは１０〜２００である。
【００２５】
化学発光物質（ａ）の含有量（ｍＭ：ミリモル／リットル。化学発光試薬を基準とする。２５℃）は、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、０．５〜８０が好ましく、さらに好ましくは１．８〜４０、特に好ましくは３．５〜２１である。
化学発光増強剤（ｂ）の含有量（ｍＭ。化学発光試薬を基準とする。２５℃）は、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、０．１〜１５が好ましく、さらに好ましくは０．３〜７．０、特に好ましくは０．６〜３．４である。
免疫複合体解離剤（ｃ）の含有量（ｍＭ。化学発光試薬を基準とする。２５℃）は、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、０．０２〜３，０００が好ましく、さらに好ましくは０．１〜２，５００、特に好ましくは１〜２，０００である。
免疫複合体解離剤（ｃ）がタンパク変性剤であるときの含有量（ｍＭ。化学発光試薬を基準とする。２５℃）は、２００〜３，０００が好ましく、さらに好ましくは４００〜２，５００、特に好ましくは５００〜２，０００である。また、（ｃ）が界面活性剤であるときの含有量（ｍＭ。化学発光試薬を基準とする。２５℃）は、０．０２〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．１〜２０、特に好ましくは１〜１０である。さらに、（ｃ）が有機酸塩であるときの含有量（ｍＭ。化学発光試薬を基準とする。２５℃）は、１０〜２，０００が好ましく、さらに好ましくは２５〜１，０００、特に好ましくは５０〜５００である。
これらの範囲であると、さらに広範囲の酵素結合リガンドの濃度を測定できる。
【００２６】
本発明の化学発光試薬には、化学発光物質（ａ）、化学発光増強剤（ｂ）、免疫複合体解離剤（ｃ）及び緩衝液（ｄ）以外に、キレート剤等を含ませることができる。
【００２７】
キレート剤としては、公知（たとえば、特開平９−７５０９９号公報又は特開２００３−２７９４８９号公報）のキレート剤が使用できる。これらのうち、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、４配位キレート剤が好ましく、さらに好ましいのはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びこの塩（ナトリウム、カリウム等）、並びにトランス−１，２ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、特に好ましいのはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びこのナトリウム塩である。
【００２８】
キレート剤を含有する場合、化学発光試薬中のキレート剤含有量（ｍＭ）は、０．２〜５．０が好ましく、さらに好ましくは０．４〜２．５、特に好ましくは０．７〜１．３である。この範囲であると、化学発光増強効果及び保存安定性がさらに良好となる。
【００２９】
本発明の化学発光試薬の形態としては、液体であることが好ましい。
本発明の化学発光試薬は、酵素の蛍光強度の観点から、アルカリ性であることが好ましく、さらに好ましくはｐＨが７〜１１であること、特に好ましくはｐＨが８〜１０であることである。
なお、ｐＨは、ＪＩＳ Ｋ０４００−１２−１０：２０００に準拠して測定される（測定温度２５℃）。
【００３０】
本発明の化学発光試薬は、化学発光物質（ａ）、化学発光増強剤（ｂ）、免疫複合体解離剤（ｃ）及び緩衝液（ｄ）、並びに必要に応じてキレート剤を均一混合することにより容易に得られる。
【００３１】
本発明の化学発光試薬は、酸化剤を含む試薬と組み合わせて、試薬キットとすることが好適である。酸化剤を含む試薬としては、例えば、特開平８−２６１９４３号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報に記載の酸化剤の水溶液｛無機の過酸化物（過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過ホウ酸カリウム等）、有機過酸化物（過酸化ジアルキル、過酸化アシル等）、ペルオクソ酸化合物（ペルオクソ硫酸、ペルオクソリン酸等）等の水溶液等｝が挙げられる。これらのうち、保存安定性等の観点から、過酸化水素水溶液、過ホウ酸ナトリウム水溶液及び過ホウ酸カリウム水溶液が好ましく、さらに好ましくは過酸化水素水溶液である。
【００３２】
酸化剤を含む試薬中の酸化剤の濃度（ｍＭ）は、その種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、化学発光増強効果等の観点から、０．５〜４０が好ましく、さらに好ましくは１〜２０、特に好ましくは２．５〜１０である。
【００３３】
本発明の化学発光試薬は、固相酵素免疫測定法に使用されるものである。固相酵素免疫測定法としては、例えば、「生物発光と化学発光−基礎と実験−」（廣川書店，昭和６４年発行）に記載の化学発光酵素免疫測定法等が挙げられる。又、酵素結合リガンドは、酵素とリガンドを結合したもので、従来免疫測定法で使用されるものが使用できる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等が挙げられる。これらのうち、取り扱いの容易さ等の観点から、ペルオキシダーゼが好ましい。
リガンドとしては、例えば「免疫化学的同定法（第３版）」（1993，東京化学同人）に記載の抗原に対する抗体や、MSRS catalog［Manufacturers' Specification & Reference Synopsis catalog Primary Antibodies（ISBN No.0-9643268-3-3, 1995, Aerie Corporation）］に記載の抗体や、特開２００１−２６４３３２号公報に記載の特異的結合物質等が挙げられる。これらのうち、特異的結合の観点から、抗体が好ましく、さらに好ましいのは癌マーカー（ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＳＡ、ＣＡ１９−９及びＣＡ１２５等）に対する抗体、高分子ホルモン（甲状腺刺激ホルモン、インシュリン及びプロラクチン等）に対する抗体、血清蛋白（β２−ミクログロブリン、フェリチン及びＣＲＰ等）に対する抗体、及びウイルス及びウイルス関連抗原（ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＢｓ抗原及びＨＢｅ抗原等）に対する抗体である。なお、これらの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又はこれらの混合のいずれであってもよい。モノクローナル抗体の場合、測定対象物に対する認識部位の異なる複数の抗体を組み合わせて使用することが好ましい。さらに、抗体は、抗体の分解物であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等であってもよい。酵素とリガンドの結合は、従来公知の方法、例えばImmunochemistry 6, 43-52 (1969)、Immunochemistry 6, 53-66 (1969)、Immobilised Affinity Ligand Techniques, Academic Press (1992)、Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)、又はAnal. Lett. 18(B9), 1143-1155 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5374-5378 (1987)に記載された方法等が適用できる。
【００３４】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
＜実施例１＞
１）第１液の調製
ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ １｝９．９ｇを秤量し１，０００ｍｌメスフラスコに仕込んだ。３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）を仕込んで２５℃で均一混合して溶液量を１，０００ｍｌとし、第１液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。（調整した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）３．５ｍＭ、（ｂ１）０．６ｍＭ、（ｃ１１）５０ｍＭ。）
２）第２液の調製
ＰＳＡ測定用臨床検査薬｛三洋化成工業（株）製、商品名：スフィアライトＰＳＡ｝の過酸化水素液（過酸化水素０．０１７％水溶液）を第２液としてそのまま使用した。
３）第３液の調製
ＰＳＡ測定用臨床検査薬｛三洋化成工業（株）製、商品名：スフィアライトＰＳＡ｝の免疫反応用緩衝液[アジ化ナトリウム０．０９％含有リン酸緩衝液]を第３液としてそのまま使用した。
４）抗ＰＳＡモノクローナル抗体（マウス）結合ビーズの調製
ＰＳＡ測定用臨床検査薬｛三洋化成工業（株）製、商品名：スフィアライトＰＳＡ｝の抗ヒトＰＳＡモノクローナル抗体（マウス）結合ビーズ[１／８インチガラスビーズ１個あたりに、抗ヒトＰＳＡモノクローナル抗体（マウス）を１．０U／個結合させたもの。｝をそのまま使用した。
５）酵素標識抗体液の調製
ＰＳＡ測定用臨床検査薬｛三洋化成工業（株）製、商品名：スフィアライトＰＳＡ｝のペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡモノクローナル抗体（マウス）｛標識抗体０．１７μｇ／ｍL含有リン酸緩衝液｝をそのまま使用した。
これら第１液、第２液、第３液、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（マウス）結合ビーズ及び酵素標識抗体液を使用してペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１）を得た｛第１液、第２液、第３液、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（マウス）結合ビーズ及び酵素標識抗体液から構成される｝。
【００３５】
次いで、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットと全自動酵素免疫測定装置｛スフィアライト１８０（オリンパス（株）製）｝を用い、「ＰＳＡ測定用臨床検査薬｛三洋化成工業（株）製、商品名：スフィアライトＰＳＡ｝添付文書記載の方法」（ａ．抗体ビーズ1個が入った反応層に検体４０μＬ及び第３液１００μＬを加え、３７℃、約7分間反応させる（第１反応）。ｂ．Ｂ／Ｆ分離、洗浄を行なう。ｃ．酵素標識抗体液１４０μＬを加えて、３７℃、７分間反応させる（第２反応）。ｄ．Ｂ／Ｆ分離、洗浄を行なう。ｅ．第１液７０μＬ及び第２液７０μＬを加える（酵素反応）。ｅ．発光量を測定する。）に準じて、複数濃度の標準ＰＳＡ溶液（ＰＳＡ濃度０、０．０５、０．２、１０、５０、１００、２００、１００００ｎｇ／ｍＬ）を測定した。得られた化学発光量（Ｃ）を、表１に示した。 なお、ＰＳＡ濃度０ｎｇ／ｍＬを用いた場合の発光量を、ブランクの発光量（Ｄ）とした。また、酵素活性を示す化学発光量（Ｃ）を、ブランクの発光量（Ｄ）で除した比（Ｃ／Ｄ）を測定感度とした。結果を表１に示す。
【００３６】
６）解離溶液の調製
ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ １｝９．９ｇを秤量し１，０００ｍｌメスフラスコに仕込んだ。次いでメスフラスコに、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）を仕込んで２５℃で均一混合して溶液量を１，０００ｍｌとし、ＤＢＵ−フェノール塩溶液（Ｘ１１）を調製した。
７）免疫複合体ビーズの作成
標準ＰＳＡ溶液１２０μＬ（ＰＳＡ濃度１００ｎｇ／ｍＬ）と、第３液３００μＬとを混合し、測定用試料を調製した。この測定用試料４２０μＬと、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（マウス）結合ビーズ１個とを、試験管（１２×７５ｍｍ）内で１時間反応（３７℃）させた。
引き続き、試験管内から反応液をアスピレーターで除去した後、生理食塩水３ｍＬを加えてビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去して、反応ビーズを得た。
次に、酵素標識抗体液４２０μＬを反応ビーズの入った試験管に加え、３７℃、１時間反応させた。反応液をアスピレーターで除去し、生理食塩水３ｍＬを加えビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去して、免疫複合体ビーズを得た。
【００３７】
８）酵素活性の比の測定
（Ｘ１１）２００μＬに免疫複合体ビーズ１個を加え、３７℃、１時間反応させた。反応後液（Ｘ１１ａ）及び反応後ビーズ（Ｙ１１ｂ）をそれぞれ回収した。
（Ｘ１１ａ）に後述する比較例で作成した第１液１４０μＬと第２液１４０μＬを加え、ルミネッセンスリーダー｛アロカ（株）社製：ＢＬＲ−２１０）｝を用いて化学発光反応を開始した。化学発光反応の開始５０秒後から２秒間の発光量（積算量）を計測し、この積算量を酵素活性を示す発光量とした。同様に（Ｙ１１ｂ）を使用して発光量を計測した。以下のようにして酵素活性の比を算出した。結果を表１に示す。
酵素活性の比 ＝ （Ｘ１１ａ）の発光量／｛（Ｘ１１ａ）の発光量＋（Ｙ１１ｂ）の発光量｝×１００
【００３８】
＜実施例２＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝４．２ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．５６ｇ、ＤＢＵ−オクチル酸塩（ｃ１２）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ １０２｝１２３ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２）を得た。（調整した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）２１ｍＭ、（ｂ１）３．４ｍＭ、（ｃ１２）５００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表１に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−オクチル酸塩（ｃ１２）１２３ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表１に示す。
【００３９】
＜実施例３＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝２．４ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３３ｇ、ＤＢＵ−オレイン酸塩（ｃ１３）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ １０６｝７４ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０５ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（３）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１２．３ｍＭ、（ｂ１）２．０ｍＭ、（ｃ１３）２７５ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（３）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表１に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−オレイン酸塩（ｃ１３）７４ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表１に示す。
【００４０】
＜実施例４＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ＤＢＵ−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ｃ１４）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ５０６｝８１ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（４）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ１４）２５０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（４）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表１に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ｃ１４）８１ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表１に示す。
【００４１】
＜実施例５＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ６０３｝４９．５ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（５）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ１５）２５０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（５）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表１に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）４９．５ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表１に示す。
【００４２】
＜実施例６＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ＤＢＵ−フタル酸塩（ｃ１６）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ８１０｝１０３ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（６）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ１６）２５０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（６）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表１に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−フタル酸塩（ｃ１６）１０３ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表１に示す。
【００４３】
＜実施例７＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ＤＢＮ−オクチル酸塩（ｃ２２）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ １１０２｝６７ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（７）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ２２）２５０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（７）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表１に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＮ−オクチル酸塩（ｃ２２）６７ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表１に示す。
【００４４】
＜実施例８＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、グアニジン塩酸塩（ｃ３）｛ナカライテスク（株）製、生化学研究用特製試薬｝４７．８ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（８）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ３）５００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（８）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表２に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「グアニジン塩酸塩（ｃ３）４７．８ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表２に示す。
【００４５】
＜実施例９＞
第１製の調整において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、グアニジン塩酸塩（ｃ３）｛ナカライテスク（株）製、生化学研究用特製試薬｝１９１ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（９）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ３）２０００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（９）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表２に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「グアニジン塩酸塩（ｃ３）１９１ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表２に示す。
【００４６】
＜実施例１０＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、グアニジン塩酸塩（ｃ３）｛ナカライテスク（株）製、生化学研究用特製試薬｝１１９ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１０）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ３）１２５０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１０）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表２に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「グアニジン塩酸塩（ｃ３）１１９ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表２に示す。
【００４７】
＜実施例１１＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）｛ナカライテスク（株）製、商品名：ツイン８０｝１．５ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１１）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ４）１ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１１）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表２に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）１．５ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表２に示す。
【００４８】
＜実施例１２＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）｛ナカライテスク（株）製、商品名：ツイン８０｝１５ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１２）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ４）１０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１２）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表２に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）１５ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表２に示す。
【００４９】
＜実施例１３＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）｛ナカライテスク（株）製、商品名：ツイン８０｝７．５ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１３）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ４）５ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１３）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表２に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）７．５ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表２に示す。
【００５０】
＜実施例１４＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝０．１ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．０２ｇ、ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ６０３｝１．９８ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１４）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）０．５ｍＭ、（ｂ１）０．１ｍＭ、（ｃ１５）１０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１４）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表３に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）１．９８ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表３に示す。
【００５１】
＜実施例１５＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝０．４ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．０５ｇ、ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ６０３｝４．９５ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１５）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１．８ｍＭ、（ｂ１）０．３ｍＭ、（ｃ１５）２５ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１５）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表３に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）４．９５ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表３に示す。
【００５２】
＜実施例１６＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝８．０ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）１．１６ｇ、ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ６０３｝１９８ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（３００ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１６）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）４０ｍＭ、（ｂ１）７ｍＭ、（ｃ１５）１０００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１６）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表３に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）１９８ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表３に示す。
【００５３】
＜実施例１７＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝１５．９ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）２．４８ｇ、ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ６０３｝３９６ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１７）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）８０ｍＭ、（ｂ１）１５ｍＭ、（ｃ１５）２０００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１７）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表３に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）３９６ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表３に示す。
【００５４】
＜実施例１８＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、グアニジン塩酸塩（ｃ３）｛ナカライテスク（株）製、生化学研究用特製試薬｝１９ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１８）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ３）２００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１８）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表３に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「グアニジン塩酸塩（ｃ３）１９ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表３に示す。
【００５５】
＜実施例１９＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、グアニジン塩酸塩（ｃ３）｛ナカライテスク（株）製、生化学研究用特製試薬｝３８ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１９）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ３）４００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１９）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表３に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「グアニジン塩酸塩（ｃ３）３８ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表３に示す。
【００５６】
＜実施例２０＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、グアニジン塩酸塩（ｃ３）｛ナカライテスク（株）製、生化学研究用特製試薬｝２３９ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２０）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ３）２５００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２０）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表３に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「グアニジン塩酸塩（ｃ３）２３９ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表３に示す。
【００５７】
＜実施例２１＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、グアニジン塩酸塩（ｃ３）｛ナカライテスク（株）製、生化学研究用特製試薬｝２８７ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２１）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ３）３０００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２１）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表４に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「グアニジン塩酸塩（ｃ３）２８７ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表４に示す。
【００５８】
＜実施例２２＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）｛ナカライテスク（株）製、商品名：ツイン８０｝０．０３ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２２）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ４）０．０２ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２２）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表４に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）０．０３ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表４に示す。
【００５９】
＜実施例２３＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）｛ナカライテスク（株）製、商品名：ツイン８０｝０．１５ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２３）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ４）０．１ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２３）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表４に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）０．１５ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表４に示す。
【００６０】
＜実施例２４＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）｛ナカライテスク（株）製、商品名：ツイン８０｝３０ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２４）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ４）２０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２４）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表４に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）３０ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表４に示す。
【００６１】
＜実施例２５＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）｛ナカライテスク（株）製、商品名：ツイン８０｝６０ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２５）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ４）４０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２５）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表４に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）６０ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表４に示す。
【００６２】
＜実施例２６＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ６０３｝２４．８ｇ、ＤＢＮ−オクチル酸塩（ｃ２２）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ １１０２｝３３．５ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２６）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ１５）１２５ｍＭ、（ｃ２２）１２５ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２６）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表４に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）２４．８ｇ、ＤＢＮ−オクチル酸塩（ｃ２２）３３．５ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表４に示す。
【００６３】
＜比較例＞
ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝１７．６ｍＭ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）２．１ｍＭ、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（４９．９ｍＭ、ｐＨ８．６）を均一混合して、第１液を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。実施例１における第１液をこの第１液に変更した以外、実施例１と同様にして、比較用のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た。
化学発光試薬キット（１）の代わりに、比較用の化学発光試薬キットを使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表２に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「生理食塩水 ９．９ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表２に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】
本発明の化学発光試薬は、比較用の化学発光試薬を用いた場合に比べて、標準ＰＳＡ溶液が高濃度の場合でも、発光量の低下がなく測定範囲が大幅に広がった。特に実施例４及び５において、極めて広い測定範囲を示した。実施例４及び５と比較例を比較すると、比較例の場合、１００ｎｇ／ｍＬ以上のＰＳＡ濃度では、ほぼ同等の化学発光量であり、検量できない。すなわち比較例では、測定可能範囲はＰＳＡ濃度が０〜約１００ｎｇ／ｍＬの範囲となる。一方、実施例４及び５の場合では、１００〜１０，０００ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ濃度の値に対しても、それぞれ異なる化学発光量となっている。すなわち実施例４及び５では、比較例よりも広い測定範囲となる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の化学発光試薬は、酵素結合リガンド量が多い場合であっても、基質が供給不足にならず、化学発光量が低下することがないため、広範囲の酵素結合リガンドの量を測定することができる。従って、本発明の化学発光試薬を適用することにより、酵素結合リガンドを用いた固相酵素免疫測定を臨床検査薬へ適用できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】実施例４及び５と比較例のＰＳＡ濃度と化学発光量との関係を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相酵素免疫測定法用化学発光試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、酵素結合リガンド含有検体中に、化学発光物質、化学発光増強剤、緩衝剤、キレート剤及び酸化剤からなる試薬成分を配合して、化学発光の強さにより検体中の酵素結合リガンドを測定するための固相酵素免疫測定法用化学発光試薬が知られている（非特許文献１）。
【非特許文献１】METHODS IN ENZYMOLOGY,VOL.133[Academic Press,Inc.,1986],p331〜353
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、従来の化学発光試薬では、固相上に形成される免疫複合体中の酵素結合リガンドが多い場合、固相に接している化学発光物質が急激に酵素反応により消費され、反応により生じる化学発光量は短時間に増加する反面、急激に低下する（基質となる新たな化学発光物質が酵素反応の場に供給されない）ため、広範囲の酵素結合リガンド量を測定する必要のある臨床検査薬への適用が困難であるという問題がある。また、この問題を低減する方策として、反応及び化学発光量の計測を撹拌しながら行うことも挙げられるが、測定装置が複雑になる等、装置上の制約などの問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の固相酵素免疫測定法用化学発光試薬の特徴は、化学発光物質（ａ）、化学発光増強剤（ｂ）、免疫複合体解離剤（ｃ）及び緩衝液（ｄ）を含んでなる点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の化学発光試薬は、酵素結合リガンド量が多い場合であっても、基質が供給不足にならず、化学発光量が低下することがないため、広範囲の酵素結合リガンドの量を測定することができる。従って、本発明の化学発光試薬を適用することにより、酵素結合リガンドを用いた固相酵素免疫測定を臨床検査薬へ適用できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
化学発光物質（ａ）及び化学発光増強剤（ｂ）としては、固相酵素免疫測定法に使用される酵素に対応して公知の物質を組み合わせて選択できる。
化学発光物質（ａ）としては、例えば「生物発光と化学発光−基礎と実験−」（廣川書店，昭和６４年発行）に記載の２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物、１，２−ジオキセタン化合物、アクリジン化合物、インドール化合物等が含まれる。化学発光物質（ａ）のうち、測定感度及び溶液状態での保存安定性の観点から、好ましいのは２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（酵素がペルオキシダーゼの場合）｛ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）及びこれらの金属（アルカリ金属等）塩等｝及び１，２−ジオキセタン化合物（酵素がアルカリフォスファターゼの場合）｛３−ガラクトシドキシフェニルジオキセタン、４−メトキシ−４−（３−フォスフェートフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタン］等｝、さらに好ましくは２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物、特に好ましいのはルミノール及びルミノールの金属塩、最も好ましいのはルミノールのナトリウム塩である。
【０００７】
化学発光増強剤（ｂ）としては、化学発光物質（ａ）の種類に対応して選択され、例えば、化学発光物質（ａ）がルミノール又はルミノールの金属塩の場合、特開昭５９−５００２５２号、特開昭５９−１７１８３９号、特開平７−１４３８９９号又は特開平４−２９３４９８号の各公報に記載された化合物［チアゾール化合物｛６−ヒドロキシベンゾチアゾール、４−［２’−（４’−メチル）チアゾリル］フェノール、４−［４’−（２’−メチル）チアゾリル］フェノール等｝、ナフトール化合物、フェノール化合物｛４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−（２’−チエニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール等｝〕が挙げられ、また、（ａ）が１，２−ジオキセタン化合物の場合、特開平３−５３８９７号又は特開平４−１２４１８５号の各公報記載の化合物〔重合性４級アンムニウム塩｛ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド）、ポリ｛ビニルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロリド）｝等〕が挙げられる。特に（ａ）が４−メトキシ−４−（３−フォスフェートフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタン］の場合、蛍光ミセル（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミドと５−Ｎ−テトラデカノイル−アミノフルオレセインで形成したミセル）等が挙げられる。
これらのうち、化学発光増強効果の観点から、チアゾール化合物、フェノール化合物が好ましく、さらに好ましいのはフェノール化合物、次にさらに好ましいのはｐ−ヨードフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール及び４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノールである。
【０００８】
免疫複合体解離剤（ｃ）は、固相酵素免疫測定法により固相表面上に形成される免疫複合体から酵素結合リガンドを解離する作用を有し、化学発光反応を阻害しないものであれば制限がない。
なお、固相酵素免疫測定法により固相表面上に形成される免疫複合体とは、少なくとも１種類の酵素結合リガンド（例えば酵素結合抗体）と、リガンドが認識する物質（例えば抗原）とが、結合して形成される複合体を意味する。
【０００９】
免疫複合体解離剤（ｃ）のうち、測定レンジ拡大の観点から、固相上に形成された免疫複合体から、免疫複合体中に含まれる酵素結合リガンドを、酵素活性の比として５〜９０％を解離させるものが好ましく、さらに好ましくは７〜８５％、特に好ましくは１０〜８０％である。酵素活性の比は、解離前の固相上の免疫複合体中に含まれる酵素結合リガンドの酵素活性と解離した酵素結合リガンドの酵素活性との比である。
酵素活性の比は、例えば次の方法で測定される。免疫複合体が形成された固相を免疫複合体解離剤（ｃ）を含む化学発光試薬に浸漬した後、化学発光試薬と固相を分離し、それぞれについて酵素活性を測定する。化学発光試薬中の酵素活性をＸ、固相中の酵素活性をＹとすると、解離した酵素結合リガンドの酵素活性の比（％）は、Ｘ／（Ｘ＋Ｙ）×１００で求められる。なお、この場合の浸漬条件（浸漬時間、温度等）は、本発明による化学発光試薬を固相酵素免疫測定法に適用する条件に合わせて設定する。酵素活性の測定法は、用いる酵素により適宜設定することができるが、酵素結合リガンドの存在様式（遊離状態と固相に結合した状態等）により活性に差がない測定法であることが必要である。
【００１０】
免疫複合体解離剤（ｃ）としては、タンパク質変性剤、界面活性剤及び下記一般式（１）で表される２環式ジアミン（有機酸塩）からなる群より選ばれる少なくとも１種が含まれる。これらは２種以上を併用してもよい。
一般式（１）で表される２環式ジアミン（有機酸塩）とは、一般式（１）で表される２環式ジアミン及び／又は該ジアミンの有機酸塩を意味する。
【００１１】
【化１】
【００１２】
タンパク質変性剤としては、グアニジル基を有する物質であるアルギニン、プロタミン、グアニジン塩（グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン硫酸塩及びグアニジン炭酸塩等）から選ばれる１種以上の物質及び水溶性アミド｛尿素及びアセトアミド等｝が使用できる。これらは２種以上を併用してもよい。これらのうち、測定レンジ拡大の観点から、グアニジン塩が好ましく、さらに好ましいのは、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、特に好ましいのはグアニジン塩酸塩である。
【００１３】
界面活性剤としては、カチオン界面活性剤（臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウム、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、ベンズアルコニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド及びセチルトリメチルアンモニウムクロリド等）、アニオン界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、トリエタノールアミンラウリル硫酸、ジエタノールアミンラウリル硫酸、セチル硫酸ナトリウム、スルホニル琥珀酸ジオクチルナトリウム、スルホニル琥珀酸ジスコリウムモノココアミド、イソステアリル−２−ラクトイル酸ナトリウム、セテアリル硫酸ナトリウム及びココイルイセチオン酸ナトリウム等）、両性界面活性剤｛ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート）、ポリエチレングリコールモノオクチルフェニルエーテル、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ラウリン酸アミドプロピルベタイン及び３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート等｝、及び非イオン界面活性剤［高級アルコールエチレンオキサイド（エチレンオキサイドは以下ＥＯと略記）付加物、脂肪酸ＥＯ付加物、脂肪酸アミドＥＯ付加物、ソルビタン脂肪酸エステルＥＯ付加物、ポリプロピレングリコールＥＯ付加物等］が含まれ、公知（特開平８−２６１９４３号公報等に記載）の界面活性剤が使用できる。これらは２種以上を併用してもよい。
これらのうち、測定レンジ拡大の観点から、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤及び非イオン界面活性剤が好ましく、さらに好ましいのは非イオン界面活性剤、よりさらに好ましいのは、高級アルコールＥＯ付加物、脂肪酸ＥＯ付加物、脂肪酸アミドＥＯ付加物、ソルビタン脂肪酸エステルＥＯ付加物及びポリプロピレングリコールＥＯ付加物、とくに好ましいのはソルビタン脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物、最も好ましいのはソルビタンオレイン酸モノエステルＥＯ付加物である。
【００１４】
一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して水素原子、炭素数（以下Ｃと略記）１〜２０のアルキル、Ｃ２〜２０のアルケニル、Ｃ２〜２０のアルキニル、Ｃ６〜２０の（アルキル）アリール、Ｃ７〜２０のアリールアルキル基を表し、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール及びアリールアルキル基中の水素原子の一部又は全部が水酸基、アミノ基、（ジ）アルキル（Ｃ１〜１６）アミノ基、（ジ）ヒドロキシアルキル（Ｃ２〜４）アミノ基、メルカプト基又はハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）によってさらに置換されていてもよい。また２つのＲ1及び２つのＲ2は、同一であってもよいし異なっていてもよく、互いに結合（炭素−炭素結合、エーテル結合等）してＣ４〜１６の環を形成してもよい。ｍ及びｎは互いに独立して１〜１２の整数を表す。
【００１５】
Ｃ１〜２０のアルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｎ−へキシル、２−エチルヘキシル、ｎ−デシル、ｎ−ドデシル、ｓｅｃ−トリデシル、オクタデシル、イソオクダデシル及びエイコシル基等が挙げられる。
【００１６】
Ｃ２〜２０のアルケニル基としては、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−又は２−ドデシニル、１−又は２−トリデシニル、１−又は２−テトラデシニル、１−又は２−ヘキサデシニル、１−又は２−ステアリニル及び１−又は２−ノナデシニル、１−又は２−エイコシニル基等が挙げられる。
【００１７】
Ｃ６〜２０の（アルキル）アリール基としては、フェニル、ノニルフェニル、３，５−ジノニルフェニル、オクチルフェニル、ナフチル及び６−ブチルナフチル基等が挙げられる。
【００１８】
Ｃ７〜２０のアリールアルキル基としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル、５−フェニルペンチル、６−フェニルヘキシル、７−フェニルヘプチル、８−フェニルオクチル、１０−フェニルデシル、１２−フェニルドデシル、ナフチルメチル及びナフチルエチル基等が挙げられる。
【００１９】
２つのＲ1又は２つのＲ2が互いに結合してＣ４〜１６の環を形成する場合、２つのＲ1又は２つのＲ2は、２価の有機基を形成する。
２価の有機基としては、Ｃ４〜１６のアルキレン、Ｃ４〜１６のアルケニレン、Ｃ４〜１６のアリーレン基等が挙げられる。
【００２０】
一般式（１）で表されるアミンの具体例としては、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン−７（以下、ＤＢＵと略記する。：ＤＢＵはサンアプロ（株）の登録商標である。）、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノネン−５（以下、ＤＢＮと略記する）、１，８−ジアザビシクロ［５．３．０］デセン−７、１，４−ジアザビシクロ［３．３．０］オクテン−４、１，５−ジアザビシクロ［４．４．０］デセン−５、６−ジメチルアミノ−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン−７、６−ジブチルアミノ−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン−７、６−（２−ヒドロキシエチル）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン、６−（２−ヒドロキシプロピル）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン、７−（２−ヒドロキシエチル）−１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］−５−ノネン、７−（２−ヒドロキシプロピル）−１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］−５−ノネン、６−ジ（２−ヒドロキシエチル）アミノ−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン等が挙げられる。
【００２１】
上記アミンの有機酸塩としては、フェノール塩、Ｃ４〜１８のアルキル酸塩（オクチル酸塩、オレイン酸塩等）、芳香族スルホン酸塩（ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等）、ギ酸塩及び芳香族カルボン酸塩（フタル酸塩等）等が挙げられる。
【００２２】
これらは２種以上を併用してもよい。
【００２３】
一般式（１）で表される２環式ジアミン（有機酸塩）のうち、測定レンジ拡大の観点から、ＤＢＵ、ＤＢＵの有機酸塩（ｃ１）、ＤＢＮ、及びＤＢＮの有機酸塩（ｃ２）が好ましく、さらに好ましいのはＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）、ＤＢＵ−オクチル酸塩（ｃ１２）、ＤＢＵ−オレイン酸塩（ｃ１３）、ＤＢＵ−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ｃ１４）、ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）、ＤＢＵ−フタル酸塩（ｃ１６）、ＤＢＮ−フェノール塩（ｃ２１）、ＤＢＮ−オクチル酸塩（ｃ２２）、ＤＢＮ−オレイン酸塩（ｃ２３）、ＤＢＮ−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ｃ２４）、ＤＢＮ−ギ酸塩（ｃ２５）及びＤＢＮ−フタル酸塩（ｃ２６）、とくに好ましいのは（ｃ１１）、（ｃ１２）、（ｃ１３）、（ｃ１４）及び（ｃ１５）、最も好ましいのは（ｃ１４）及び（ｃ１５）である。
【００２４】
緩衝液（ｄ）としては、公知（たとえば、特開平１０−３１９０１５号公報又は特開２００３−２７９４８９号公報）の緩衝液等が使用できる。これらのうち、化学発光増強効果及び保存安定性の観点から、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物／水酸化ナトリウム緩衝液及びピペラジニル−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）・２水和物／水酸化ナトリウム緩衝液が好ましく、さらに好ましいのは３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液及び２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸・１水和物／水酸化ナトリウム緩衝液、特に好ましいのは３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液である。
緩衝液（ｄ）中の緩衝剤の含有量（ｍM。２５℃）は、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、１〜５００が好ましく、さらに好ましくは５〜３００、特に好ましくは１０〜２００である。
【００２５】
化学発光物質（ａ）の含有量（ｍＭ：ミリモル／リットル。化学発光試薬を基準とする。２５℃）は、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、０．５〜８０が好ましく、さらに好ましくは１．８〜４０、特に好ましくは３．５〜２１である。
化学発光増強剤（ｂ）の含有量（ｍＭ。化学発光試薬を基準とする。２５℃）は、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、０．１〜１５が好ましく、さらに好ましくは０．３〜７．０、特に好ましくは０．６〜３．４である。
免疫複合体解離剤（ｃ）の含有量（ｍＭ。化学発光試薬を基準とする。２５℃）は、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、０．０２〜３，０００が好ましく、さらに好ましくは０．１〜２，５００、特に好ましくは１〜２，０００である。
免疫複合体解離剤（ｃ）がタンパク変性剤であるときの含有量（ｍＭ。化学発光試薬を基準とする。２５℃）は、２００〜３，０００が好ましく、さらに好ましくは４００〜２，５００、特に好ましくは５００〜２，０００である。また、（ｃ）が界面活性剤であるときの含有量（ｍＭ。化学発光試薬を基準とする。２５℃）は、０．０２〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．１〜２０、特に好ましくは１〜１０である。さらに、（ｃ）が有機酸塩であるときの含有量（ｍＭ。化学発光試薬を基準とする。２５℃）は、１０〜２，０００が好ましく、さらに好ましくは２５〜１，０００、特に好ましくは５０〜５００である。
これらの範囲であると、さらに広範囲の酵素結合リガンドの濃度を測定できる。
【００２６】
本発明の化学発光試薬には、化学発光物質（ａ）、化学発光増強剤（ｂ）、免疫複合体解離剤（ｃ）及び緩衝液（ｄ）以外に、キレート剤等を含ませることができる。
【００２７】
キレート剤としては、公知（たとえば、特開平９−７５０９９号公報又は特開２００３−２７９４８９号公報）のキレート剤が使用できる。これらのうち、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、４配位キレート剤が好ましく、さらに好ましいのはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びこの塩（ナトリウム、カリウム等）、並びにトランス−１，２ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、特に好ましいのはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びこのナトリウム塩である。
【００２８】
キレート剤を含有する場合、化学発光試薬中のキレート剤含有量（ｍＭ）は、０．２〜５．０が好ましく、さらに好ましくは０．４〜２．５、特に好ましくは０．７〜１．３である。この範囲であると、化学発光増強効果及び保存安定性がさらに良好となる。
【００２９】
本発明の化学発光試薬の形態としては、液体であることが好ましい。
本発明の化学発光試薬は、酵素の蛍光強度の観点から、アルカリ性であることが好ましく、さらに好ましくはｐＨが７〜１１であること、特に好ましくはｐＨが８〜１０であることである。
なお、ｐＨは、ＪＩＳ Ｋ０４００−１２−１０：２０００に準拠して測定される（測定温度２５℃）。
【００３０】
本発明の化学発光試薬は、化学発光物質（ａ）、化学発光増強剤（ｂ）、免疫複合体解離剤（ｃ）及び緩衝液（ｄ）、並びに必要に応じてキレート剤を均一混合することにより容易に得られる。
【００３１】
本発明の化学発光試薬は、酸化剤を含む試薬と組み合わせて、試薬キットとすることが好適である。酸化剤を含む試薬としては、例えば、特開平８−２６１９４３号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報に記載の酸化剤の水溶液｛無機の過酸化物（過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過ホウ酸カリウム等）、有機過酸化物（過酸化ジアルキル、過酸化アシル等）、ペルオクソ酸化合物（ペルオクソ硫酸、ペルオクソリン酸等）等の水溶液等｝が挙げられる。これらのうち、保存安定性等の観点から、過酸化水素水溶液、過ホウ酸ナトリウム水溶液及び過ホウ酸カリウム水溶液が好ましく、さらに好ましくは過酸化水素水溶液である。
【００３２】
酸化剤を含む試薬中の酸化剤の濃度（ｍＭ）は、その種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、化学発光増強効果等の観点から、０．５〜４０が好ましく、さらに好ましくは１〜２０、特に好ましくは２．５〜１０である。
【００３３】
本発明の化学発光試薬は、固相酵素免疫測定法に使用されるものである。固相酵素免疫測定法としては、例えば、「生物発光と化学発光−基礎と実験−」（廣川書店，昭和６４年発行）に記載の化学発光酵素免疫測定法等が挙げられる。又、酵素結合リガンドは、酵素とリガンドを結合したもので、従来免疫測定法で使用されるものが使用できる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等が挙げられる。これらのうち、取り扱いの容易さ等の観点から、ペルオキシダーゼが好ましい。
リガンドとしては、例えば「免疫化学的同定法（第３版）」（1993，東京化学同人）に記載の抗原に対する抗体や、MSRS catalog［Manufacturers' Specification & Reference Synopsis catalog Primary Antibodies（ISBN No.0-9643268-3-3, 1995, Aerie Corporation）］に記載の抗体や、特開２００１−２６４３３２号公報に記載の特異的結合物質等が挙げられる。これらのうち、特異的結合の観点から、抗体が好ましく、さらに好ましいのは癌マーカー（ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＳＡ、ＣＡ１９−９及びＣＡ１２５等）に対する抗体、高分子ホルモン（甲状腺刺激ホルモン、インシュリン及びプロラクチン等）に対する抗体、血清蛋白（β２−ミクログロブリン、フェリチン及びＣＲＰ等）に対する抗体、及びウイルス及びウイルス関連抗原（ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＢｓ抗原及びＨＢｅ抗原等）に対する抗体である。なお、これらの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又はこれらの混合のいずれであってもよい。モノクローナル抗体の場合、測定対象物に対する認識部位の異なる複数の抗体を組み合わせて使用することが好ましい。さらに、抗体は、抗体の分解物であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等であってもよい。酵素とリガンドの結合は、従来公知の方法、例えばImmunochemistry 6, 43-52 (1969)、Immunochemistry 6, 53-66 (1969)、Immobilised Affinity Ligand Techniques, Academic Press (1992)、Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)、又はAnal. Lett. 18(B9), 1143-1155 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5374-5378 (1987)に記載された方法等が適用できる。
【００３４】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
＜実施例１＞
１）第１液の調製
ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ １｝９．９ｇを秤量し１，０００ｍｌメスフラスコに仕込んだ。３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）を仕込んで２５℃で均一混合して溶液量を１，０００ｍｌとし、第１液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。（調整した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）３．５ｍＭ、（ｂ１）０．６ｍＭ、（ｃ１１）５０ｍＭ。）
２）第２液の調製
ＰＳＡ測定用臨床検査薬｛三洋化成工業（株）製、商品名：スフィアライトＰＳＡ｝の過酸化水素液（過酸化水素０．０１７％水溶液）を第２液としてそのまま使用した。
３）第３液の調製
ＰＳＡ測定用臨床検査薬｛三洋化成工業（株）製、商品名：スフィアライトＰＳＡ｝の免疫反応用緩衝液[アジ化ナトリウム０．０９％含有リン酸緩衝液]を第３液としてそのまま使用した。
４）抗ＰＳＡモノクローナル抗体（マウス）結合ビーズの調製
ＰＳＡ測定用臨床検査薬｛三洋化成工業（株）製、商品名：スフィアライトＰＳＡ｝の抗ヒトＰＳＡモノクローナル抗体（マウス）結合ビーズ[１／８インチガラスビーズ１個あたりに、抗ヒトＰＳＡモノクローナル抗体（マウス）を１．０U／個結合させたもの。｝をそのまま使用した。
５）酵素標識抗体液の調製
ＰＳＡ測定用臨床検査薬｛三洋化成工業（株）製、商品名：スフィアライトＰＳＡ｝のペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡモノクローナル抗体（マウス）｛標識抗体０．１７μｇ／ｍL含有リン酸緩衝液｝をそのまま使用した。
これら第１液、第２液、第３液、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（マウス）結合ビーズ及び酵素標識抗体液を使用してペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１）を得た｛第１液、第２液、第３液、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（マウス）結合ビーズ及び酵素標識抗体液から構成される｝。
【００３５】
次いで、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットと全自動酵素免疫測定装置｛スフィアライト１８０（オリンパス（株）製）｝を用い、「ＰＳＡ測定用臨床検査薬｛三洋化成工業（株）製、商品名：スフィアライトＰＳＡ｝添付文書記載の方法」（ａ．抗体ビーズ1個が入った反応層に検体４０μＬ及び第３液１００μＬを加え、３７℃、約7分間反応させる（第１反応）。ｂ．Ｂ／Ｆ分離、洗浄を行なう。ｃ．酵素標識抗体液１４０μＬを加えて、３７℃、７分間反応させる（第２反応）。ｄ．Ｂ／Ｆ分離、洗浄を行なう。ｅ．第１液７０μＬ及び第２液７０μＬを加える（酵素反応）。ｅ．発光量を測定する。）に準じて、複数濃度の標準ＰＳＡ溶液（ＰＳＡ濃度０、０．０５、０．２、１０、５０、１００、２００、１００００ｎｇ／ｍＬ）を測定した。得られた化学発光量（Ｃ）を、表１に示した。 なお、ＰＳＡ濃度０ｎｇ／ｍＬを用いた場合の発光量を、ブランクの発光量（Ｄ）とした。また、酵素活性を示す化学発光量（Ｃ）を、ブランクの発光量（Ｄ）で除した比（Ｃ／Ｄ）を測定感度とした。結果を表１に示す。
【００３６】
６）解離溶液の調製
ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ １｝９．９ｇを秤量し１，０００ｍｌメスフラスコに仕込んだ。次いでメスフラスコに、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）を仕込んで２５℃で均一混合して溶液量を１，０００ｍｌとし、ＤＢＵ−フェノール塩溶液（Ｘ１１）を調製した。
７）免疫複合体ビーズの作成
標準ＰＳＡ溶液１２０μＬ（ＰＳＡ濃度１００ｎｇ／ｍＬ）と、第３液３００μＬとを混合し、測定用試料を調製した。この測定用試料４２０μＬと、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（マウス）結合ビーズ１個とを、試験管（１２×７５ｍｍ）内で１時間反応（３７℃）させた。
引き続き、試験管内から反応液をアスピレーターで除去した後、生理食塩水３ｍＬを加えてビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去して、反応ビーズを得た。
次に、酵素標識抗体液４２０μＬを反応ビーズの入った試験管に加え、３７℃、１時間反応させた。反応液をアスピレーターで除去し、生理食塩水３ｍＬを加えビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去して、免疫複合体ビーズを得た。
【００３７】
８）酵素活性の比の測定
（Ｘ１１）２００μＬに免疫複合体ビーズ１個を加え、３７℃、１時間反応させた。反応後液（Ｘ１１ａ）及び反応後ビーズ（Ｙ１１ｂ）をそれぞれ回収した。
（Ｘ１１ａ）に後述する比較例で作成した第１液１４０μＬと第２液１４０μＬを加え、ルミネッセンスリーダー｛アロカ（株）社製：ＢＬＲ−２１０）｝を用いて化学発光反応を開始した。化学発光反応の開始５０秒後から２秒間の発光量（積算量）を計測し、この積算量を酵素活性を示す発光量とした。同様に（Ｙ１１ｂ）を使用して発光量を計測した。以下のようにして酵素活性の比を算出した。結果を表１に示す。
酵素活性の比 ＝ （Ｘ１１ａ）の発光量／｛（Ｘ１１ａ）の発光量＋（Ｙ１１ｂ）の発光量｝×１００
【００３８】
＜実施例２＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝４．２ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．５６ｇ、ＤＢＵ−オクチル酸塩（ｃ１２）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ １０２｝１２３ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２）を得た。（調整した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）２１ｍＭ、（ｂ１）３．４ｍＭ、（ｃ１２）５００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表１に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−オクチル酸塩（ｃ１２）１２３ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表１に示す。
【００３９】
＜実施例３＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝２．４ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３３ｇ、ＤＢＵ−オレイン酸塩（ｃ１３）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ １０６｝７４ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０５ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（３）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１２．３ｍＭ、（ｂ１）２．０ｍＭ、（ｃ１３）２７５ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（３）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表１に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−オレイン酸塩（ｃ１３）７４ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表１に示す。
【００４０】
＜実施例４＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ＤＢＵ−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ｃ１４）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ５０６｝８１ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（４）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ１４）２５０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（４）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表１に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ｃ１４）８１ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表１に示す。
【００４１】
＜実施例５＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ６０３｝４９．５ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（５）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ１５）２５０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（５）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表１に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）４９．５ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表１に示す。
【００４２】
＜実施例６＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ＤＢＵ−フタル酸塩（ｃ１６）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ８１０｝１０３ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（６）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ１６）２５０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（６）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表１に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−フタル酸塩（ｃ１６）１０３ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表１に示す。
【００４３】
＜実施例７＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ＤＢＮ−オクチル酸塩（ｃ２２）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ １１０２｝６７ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（７）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ２２）２５０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（７）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表１に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＮ−オクチル酸塩（ｃ２２）６７ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表１に示す。
【００４４】
＜実施例８＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、グアニジン塩酸塩（ｃ３）｛ナカライテスク（株）製、生化学研究用特製試薬｝４７．８ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（８）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ３）５００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（８）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表２に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「グアニジン塩酸塩（ｃ３）４７．８ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表２に示す。
【００４５】
＜実施例９＞
第１製の調整において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、グアニジン塩酸塩（ｃ３）｛ナカライテスク（株）製、生化学研究用特製試薬｝１９１ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（９）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ３）２０００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（９）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表２に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「グアニジン塩酸塩（ｃ３）１９１ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表２に示す。
【００４６】
＜実施例１０＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、グアニジン塩酸塩（ｃ３）｛ナカライテスク（株）製、生化学研究用特製試薬｝１１９ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１０）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ３）１２５０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１０）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表２に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「グアニジン塩酸塩（ｃ３）１１９ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表２に示す。
【００４７】
＜実施例１１＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）｛ナカライテスク（株）製、商品名：ツイン８０｝１．５ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１１）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ４）１ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１１）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表２に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）１．５ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表２に示す。
【００４８】
＜実施例１２＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）｛ナカライテスク（株）製、商品名：ツイン８０｝１５ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１２）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ４）１０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１２）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表２に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）１５ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表２に示す。
【００４９】
＜実施例１３＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）｛ナカライテスク（株）製、商品名：ツイン８０｝７．５ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１３）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ４）５ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１３）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表２に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）７．５ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表２に示す。
【００５０】
＜実施例１４＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝０．１ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．０２ｇ、ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ６０３｝１．９８ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１４）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）０．５ｍＭ、（ｂ１）０．１ｍＭ、（ｃ１５）１０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１４）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表３に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）１．９８ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表３に示す。
【００５１】
＜実施例１５＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝０．４ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．０５ｇ、ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ６０３｝４．９５ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１５）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１．８ｍＭ、（ｂ１）０．３ｍＭ、（ｃ１５）２５ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１５）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表３に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）４．９５ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表３に示す。
【００５２】
＜実施例１６＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝８．０ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）１．１６ｇ、ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ６０３｝１９８ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（３００ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１６）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）４０ｍＭ、（ｂ１）７ｍＭ、（ｃ１５）１０００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１６）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表３に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）１９８ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表３に示す。
【００５３】
＜実施例１７＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝１５．９ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）２．４８ｇ、ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ６０３｝３９６ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１７）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）８０ｍＭ、（ｂ１）１５ｍＭ、（ｃ１５）２０００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１７）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表３に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）３９６ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表３に示す。
【００５４】
＜実施例１８＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、グアニジン塩酸塩（ｃ３）｛ナカライテスク（株）製、生化学研究用特製試薬｝１９ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１８）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ３）２００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１８）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表３に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「グアニジン塩酸塩（ｃ３）１９ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表３に示す。
【００５５】
＜実施例１９＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、グアニジン塩酸塩（ｃ３）｛ナカライテスク（株）製、生化学研究用特製試薬｝３８ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（１９）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ３）４００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（１９）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表３に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「グアニジン塩酸塩（ｃ３）３８ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表３に示す。
【００５６】
＜実施例２０＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、グアニジン塩酸塩（ｃ３）｛ナカライテスク（株）製、生化学研究用特製試薬｝２３９ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２０）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ３）２５００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２０）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表３に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「グアニジン塩酸塩（ｃ３）２３９ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表３に示す。
【００５７】
＜実施例２１＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、グアニジン塩酸塩（ｃ３）｛ナカライテスク（株）製、生化学研究用特製試薬｝２８７ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２１）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ３）３０００ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２１）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表４に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「グアニジン塩酸塩（ｃ３）２８７ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表４に示す。
【００５８】
＜実施例２２＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）｛ナカライテスク（株）製、商品名：ツイン８０｝０．０３ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２２）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ４）０．０２ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２２）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表４に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）０．０３ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表４に示す。
【００５９】
＜実施例２３＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）｛ナカライテスク（株）製、商品名：ツイン８０｝０．１５ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２３）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ４）０．１ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２３）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表４に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）０．１５ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表４に示す。
【００６０】
＜実施例２４＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）｛ナカライテスク（株）製、商品名：ツイン８０｝３０ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２４）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ４）２０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２４）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表４に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）３０ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表４に示す。
【００６１】
＜実施例２５＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）｛ナカライテスク（株）製、商品名：ツイン８０｝６０ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２５）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ４）４０ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２５）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表４に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｃ４）６０ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表４に示す。
【００６２】
＜実施例２６＞
第１液の調製において「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）０．７ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．１ｇ、ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝３．５ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）０．３５ｇ、ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ ＳＡ ６０３｝２４．８ｇ、ＤＢＮ−オクチル酸塩（ｃ２２）｛サンアプロ（株）製、商品名：Ｕ−ＣＡＴ １１０２｝３３．５ｇ」に変更し、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）」を、「３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．６）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、ペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キット（２６）を得た。（調製した第１液の各試薬の濃度は、（ａ１）１７．６ｍＭ、（ｂ１）２．１ｍＭ、（ｃ１５）１２５ｍＭ、（ｃ２２）１２５ｍＭ。）
化学発光試薬キット（１）の代わりに、化学発光試薬キット（２６）を使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表４に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「ＤＢＵ−ギ酸塩（ｃ１５）２４．８ｇ、ＤＢＮ−オクチル酸塩（ｃ２２）３３．５ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表４に示す。
【００６３】
＜比較例＞
ルミノールのナトリウム塩（ａ１）｛シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製｝１７．６ｍＭ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｂ１）２．１ｍＭ、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（４９．９ｍＭ、ｐＨ８．６）を均一混合して、第１液を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。実施例１における第１液をこの第１液に変更した以外、実施例１と同様にして、比較用のペルオキシターゼ測定用化学発光試薬キットを得た。
化学発光試薬キット（１）の代わりに、比較用の化学発光試薬キットを使用したこと以外は、実施例１と同様にして化学発光量（Ｃ）を測定し、同様にして測定感度を求めた。結果を表２に示す。
また、解離溶液の調製において「ＤＢＵ−フェノール塩（ｃ１１）９．９ｇ」を、「生理食塩水 ９．９ｇ」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、酵素活性の比を算出した。結果を表２に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】
本発明の化学発光試薬は、比較用の化学発光試薬を用いた場合に比べて、標準ＰＳＡ溶液が高濃度の場合でも、発光量の低下がなく測定範囲が大幅に広がった。特に実施例４及び５において、極めて広い測定範囲を示した。実施例４及び５と比較例を比較すると、比較例の場合、１００ｎｇ／ｍＬ以上のＰＳＡ濃度では、ほぼ同等の化学発光量であり、検量できない。すなわち比較例では、測定可能範囲はＰＳＡ濃度が０〜約１００ｎｇ／ｍＬの範囲となる。一方、実施例４及び５の場合では、１００〜１０，０００ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ濃度の値に対しても、それぞれ異なる化学発光量となっている。すなわち実施例４及び５では、比較例よりも広い測定範囲となる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の化学発光試薬は、酵素結合リガンド量が多い場合であっても、基質が供給不足にならず、化学発光量が低下することがないため、広範囲の酵素結合リガンドの量を測定することができる。従って、本発明の化学発光試薬を適用することにより、酵素結合リガンドを用いた固相酵素免疫測定を臨床検査薬へ適用できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】実施例４及び５と比較例のＰＳＡ濃度と化学発光量との関係を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学発光物質（ａ）、化学発光増強剤（ｂ）、免疫複合体解離剤（ｃ）及び緩衝液（ｄ）を含んでなることを特徴とする固相酵素免疫測定法用化学発光試薬。
【請求項２】
（ｃ）が、固相上に形成された免疫複合体から免疫複合体中に含まれる酵素結合リガンドを、酵素活性の比として５〜９０％を解離させるものである請求項１に記載の化学発光試薬。
【請求項３】
（ｃ）が、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン−７（ＤＢＵ）の有機酸塩（ｃ１）及び／又は１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノネン−５（ＤＢＮ）の有機酸塩（ｃ２）である請求項１又は２に記載の化学発光試薬。
【請求項４】
化学発光試薬中の（ａ）の含有量（ｍM；２５℃）が０．５〜８０、（ｂ）の含有量（ｍM；２５℃）が０．１〜１５、（ｃ）の含有量（ｍM；２５℃）が０．０２〜３，０００である請求項１〜３のいずれかに記載の化学発光試薬。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の化学発光試薬を使用することを特徴とする固相酵素免疫測定法。
【請求項１】
化学発光物質（ａ）、化学発光増強剤（ｂ）、免疫複合体解離剤（ｃ）及び緩衝液（ｄ）を含んでなることを特徴とする固相酵素免疫測定法用化学発光試薬。
【請求項２】
（ｃ）が、固相上に形成された免疫複合体から免疫複合体中に含まれる酵素結合リガンドを、酵素活性の比として５〜９０％を解離させるものである請求項１に記載の化学発光試薬。
【請求項３】
（ｃ）が、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン−７（ＤＢＵ）の有機酸塩（ｃ１）及び／又は１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノネン−５（ＤＢＮ）の有機酸塩（ｃ２）である請求項１又は２に記載の化学発光試薬。
【請求項４】
化学発光試薬中の（ａ）の含有量（ｍM；２５℃）が０．５〜８０、（ｂ）の含有量（ｍM；２５℃）が０．１〜１５、（ｃ）の含有量（ｍM；２５℃）が０．０２〜３，０００である請求項１〜３のいずれかに記載の化学発光試薬。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の化学発光試薬を使用することを特徴とする固相酵素免疫測定法。
【図１】
【公開番号】特開２００８−１９１１４０（Ｐ２００８−１９１１４０Ａ）
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３１９０６３（Ｐ２００７−３１９０６３）
【出願日】平成１９年１２月１１日（２００７．１２．１１）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１１日（２００７．１２．１１）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
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