外分泌膵臓細胞から、膵島ベータ−細胞を生成する方法
本発明は、哺乳動物ベータ−細胞分化が、ＥＧＦおよびＬＩＦのような、ＥＧＦレセプターおよびＧＰ１３０レセプターのリガンドを含む培地中での、脱分化外分泌膵臓細胞中で誘導可能である、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を開示している。この方法によって入手可能な、インスリン分泌細胞は、膵島移植による、糖尿病治療のための方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓細胞を分化させる方法に関する。本発明はさらに、糖尿病の処置のための、インスリン分泌細胞集団に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓内でのベータ−細胞新生の調節の理解によって、糖尿病に対する細胞置換または再生治療の領域での適用が導かれる［Ｙａｍａｏｋａ Ｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．（２００２）、２９６、１０３９−４３］。たとえば、膵島移植によって、糖尿病患者における機能的なベータ−細胞質量を復元することが可能である［Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２０００）３４３，２３０−２３８］が、ドナー組織における不足によってひどく妨げられる。この問題は、新生の工程によって利用可能な膵臓組織からより膵島細胞を産出する方法を見つけることによって解決可能である［Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆ Ｋｌｏｐｐｅｌ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．（１９９６）４２７，５５３−５６０］。ここ１０年の間に、膵臓発達の理解が非常に進展したにもかかわらず、胚における膵島細胞分化を特定する細胞外因子は依然として未知である［Ｅｄｌｕｎｄ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．（２００２）３，５２４−５３２］。成体哺乳動物において、内分泌膵臓は、特定の実験条件で、主には、始原細胞からの膵島細胞新生の結果として、膨張させるか、または再生可能である［Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆ Ｋｌｏｐｐｅｌ、前掲］。後者の実際の性質は分かりにくいままである一方で、導管細胞、腺房細胞または膵島内細胞が、始原能力を持つと示唆されている［Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆ Ｋｌｏｐｐｅｌ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．（１９９６）４２７，５５３−５６０、Ｅｄｌｕｎｄ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．（２００２）３，５２４−５３２、Ｂｏｕｗｅｎｓ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（１９９８）４３，３３２−３３６、Ｇｕｚ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．（２００１）１４２，４９５６−４９６８、Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２０００）９７，７９９９−８００４、Ｒａｍｉｙａ ＶＫ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０００）６，２７８−２８２］。
【０００３】
細胞誘導に関して、そして特異的な制御因子に関して両方で、全膵臓の研究から、確固たる結論を引き出すのは難しい。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルが、膵臓から単離された、定義された細胞調製物から開始した、膵島新生を研究するために好ましい。ごくわずかなｉｎ ｖｉｔｒｏ研究によってしか、成体組織から膵島新生を誘導する実現可能性が示されえていない。さらなる膵島細胞が、成体膵臓組織の単層培養より生成されうることがすでに報告されている。始原細胞の、調節因子の性質を明らかにするため、そして膵島細胞を生成する効果を改善するために、これらの発見を確認することがいまだに欠けている。
【０００４】
ＫＧＦ（ケラチノサイト増殖因子）とニコチンアミドによって処置されたヒト膵臓誘導細胞培養は、結果として、３〜４週間後、インスリン含有量の増加となる。また、膵島細胞を含む嚢胞性構造が、細胞外マトリックスの影響下で、単層から出芽した［Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．前掲］。この新生に関連する前駆体は、導管マーカー、サイトケラチン−１９を発現している細胞として特徴づけられる［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．前掲］。他の研究においては、長期間の培養が、グルコースを含まない条件下で、糖尿病ＮＯＤマウス膵臓より得られ、これらを、グルコースの存在下で、膵島様構造を生成するために刺激可能であった［Ｒａｍｉｙａ ＶＫ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０００）６、２７８−２８２］。これらの細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて、機能的な成熟に至らな
かった。現在のところ、後者の発見が、ＮＯＤマウスで最近発見された、血液循環から由来した「パッセンジャー」幹細胞によるものであるかどうか、は明らかではない［Ｋｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３０２，１２２３−１２２７］。
【０００５】
分化外分泌細胞を、部分的に脱分化した状態に戻し、それによって、胚可塑性を再獲得させることが可能である［Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆ Ｋｌｏｐｐｅｌ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．（１９９６）４２７，５５３−５６０、Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４３，９０７−９１４（２０００）、Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２１，９４０−９４９（２００１）、Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５１，６８６−６９０（２００２）］。このことは、外分泌細胞、本器官中の大部分の細胞を、適切な条件下で、内分泌細胞へ、変換分化に持って行くことが可能であることを示している。
【０００６】
外分泌腺房細胞は、内分泌ベータ−細胞に変換分化可能であり［Ｂｏｕｗｅｎｓ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（１９９８）４３，３３２−３３６］、これは、腺房−膵島変換細胞に関するｉｎ ｖｉｖｏ試験より示唆された［Ｇｕ ｅｔ ａｌ．Ｐａｎｃｒｅａｓ（１９９７）１５，２４６−２５０１、Ｂｅｒｔｅｌｌｉ Ｅ．Ｂｅｎｄａｙａｎ Ｍ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９７）２７３，Ｃ１６４１−Ｃ１６４９］。腺房細胞が、アミラーゼを欠き、導管特性を獲得することが可能である［Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）＆（２００１）、前掲の引用］ので、サイトケラチンのような導管マーカーと、インスリンを共発現している、変換細胞の発現［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．（１９９５）３８，１４０５−１４１１］がまた、最初に腺房細胞から由来した細胞を表しうる。腺房腫瘍から由来した、アミラーゼ−分泌細胞株ＡＲ４２Ｊが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて、ベータ−細胞表現系に変換分化可能であることが示されてきた［Ｍａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９６）９７，１６４７−１６５４］。本発明は、特定の組み合わせの増殖因子での、初代培養モデルにおける、腺房細胞のベータ−細胞への、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変換分化を報告している。
【０００７】
ＬＩＦ（白血病阻害因子）は、膵臓発達における機能が、現在までのところ、記述されていない、多面発現性サイトカインである。幹細胞増殖および分化の調節がよく知られており、胚管細胞の分化を防止するために広く使用されている。最近、ＥＧＦおよびＰＤＧＦとの組み合わせで（細胞の分化なしで）、多型潜在性成体始原細胞の増殖を刺激することが報告された。［Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ （２００２）４１８，４１−４９］。
【０００８】
ＥＧＦ（上皮増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ））および他のＥＧＦ−ファミリーメンバーが、胚発達の調節、ならびに内分泌膵臓の再生に関連してきた。ＥＧＦは、未分化膵臓前駆細胞の増殖を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて刺激する［Ｃｒａｓ−Ｍｅｎｅｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．（２００１）５０、１５７１−１５７９］。機能的ＥＧＦ−レセプターを欠くトランスジェニックマウスにおいて、膵島形態形成が障害を受け、ベータ−細胞分化が遅延する［Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．（２０００）１２７、２６１７−２６２７］。またＥＧＦ−レセプターを介して働く増殖因子である、ベータセルリンが、ほぼ完全な膵臓切除ラット（２５ｌｉ）にて、およびアロキサン−糖尿病マウスにて、膵島再発生を促進したことが発見された［Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．（２０００）４９，２０２１−２０２７］。ベータ−細胞新生を刺激する他の因子である、Ｇｌｐ−１［Ｄｒｕｃｋｅｒ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（２００３）１７，１６１−１７１）はまた、ＥＧＦ−レセプターを変換活性化することが示された［Ｂｕｔｅａｕ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．（２００３）５２，１２４−１３２］。ガストリンホルモンとの組み合わ
せで、ＥＧＦが、ストレプトゾトシン−糖尿病ラットにて、ベータ−細胞再生を刺激することが示された［Ｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．（２００２）９１，４１４−４２０］。
【０００９】
ＬＩＦおよびＥＧＦは、胚中のニューロンおよびグリア細胞の分化を制御するシグナルとして、相乗的に働くことが報告された［Ｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）１５，３３８５−３３９３］。星状細胞において、始原ＥＧＦは、増加したＳＴＡＴ３リン酸化反応を介して、星状細胞−誘導シグナルとして、ＬＩＦを読み取る機能を増加させる。ＬＩＦはまた、成体における傷−誘導神経形成のために、鍵となるシグナルとも考えられている［Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２３，１７９２−１８０３］。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
１つの態様にしたがって、本発明は、第一の哺乳動物の脱分化した外分泌膵臓細胞を含む、またはからなる集団から、インスリン産生ベータ細胞を生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関し、前記方法には、以下の、ａ）培養培地中で、脱分化外分泌膵臓細胞の前記集団を提供すること、ｂ）前記培養培地中に、第二の哺乳動物のｇｐ１３０レセプターの１つまたはそれ以上のリガンドを加えること、および／または第三の哺乳動物のＥＧＦレセプターの１つまたはそれ以上のリガンドを加えること、ｃ）前記１つまたはそれ以上の、ｇｐ１３０レセプターのリガンド、およびまたは、前記１つまたはそれ以上のＥＧＦレセプターのリガンドを含む、前記培養培地中で前記脱分化外分泌膵臓細胞をインキュベートすること、のステップを含む。
【００１１】
１つの実施様態において、本方法は、ステップｂ）にて、前記培養培地に、第三の哺乳動物のＥＧＦレセプターの、１つまたはそれ以上のリガンドを加えることなしに、第二の哺乳動物のｇｐ１３０レセプターの１つまたはそれ以上のリガンドを加えることによって実施される。特定の実施様態において、本方法は、ステップｂ）において、前記培養培地に、第二の哺乳動物のｇｐ１３０レセプターの１つまたはそれ以上のリガンドと、第三の哺乳動物のＥＧＦレセプターの１つまたはそれ以上のリガンド両方を加えることによって実施される。１つの実施様態にしたがって、前記ｇｐ１３０レセプターのリガンドは、ヒトまたはヒト化ＬＩＦのような、ＬＩＦである。１つの実施様態にしたがって、ＬＩＦは、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度、または１０〜２５ｎｇ／ｍｌの間、または１００〜５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、培養培地に加えられる。１つの実施様態において、前記ＥＧＦレセプターのリガンドは、前記ＥＧＦレセプターのヒトまたはヒト化リガンドである。他の実施様態にしたがって、前記ＥＧＦレセプターのリガンドは、ヒトまたはヒト化ＥＧＦのようなＥＧＦである。１つの実施様態にしたがって、ＥＧＦは、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度、または１０〜２５ｎｇ／ｍｌの間、または１００〜５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、培養培地に加えられる。一般的に、ｇｐ１３０レセプターの１つまたはそれ以上のリガンド、および／またはＥＧＦレセプターの１つまたはそれ以上のリガンドは、１〜１００００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で培養培地に加えられる。特定の実施様態にしたがって、本方法はさらに、ステップｂの間に、前記培養培地中にｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞増殖因子）を加えるステップを含む。特定の実施様態にしたがって、培地は、ＫＧＦ（ケラチノサイト増殖因子）またはガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドは含まない。特定の実施様態において、本方法におけるインキュベーションステップは、７日，６日、５日または５日未満でも、すなわち４日または３日でも実施する。本発明の方法のために使用可能である脱分化外分泌膵臓細胞の集団は、導管細胞、腺房細胞および膵島細胞からなる群より選択される、１つの実施様態にしたがう。また、導管細胞、腺房細胞および膵島細胞からなる群からなる１つまたはそれ以上の細胞型の、任意の比を含む、これらの型の細胞、また細胞集団の混合を、本発明で使用可能である。他の実施様態にしたがっ
て、ステップａ）より前に追加ステップを実施し、そこで、ベータ細胞を枯渇させる。他の実施様態にしたがって、繊維芽細胞の増殖を減少させるために、脱分化および再分化を、ゼニチマイシンの存在下で実施する。本発明の方法にしたがって使用可能な細胞は、齧歯類、ブタ、サルおよびヒト細胞を含む、全ての型の哺乳動物細胞である。特定の実施様態において、哺乳動物細胞は、ラット細胞であり、１つまたはそれ以上の前記ＥＧＦレセプターのリガンドには、ヒトＥＧＦが含まれ、１つまたはそれ以上のｇｐ１３０レセプターのリガンドには、マウスＬＩＦが含まれる。
【００１２】
本発明の他の態様は、本発明の方法の実施態様を記述している、上記本明細書のいずれかによって入手可能な、哺乳動物インスリン生成ベータ細胞を含む、哺乳動物膵臓細胞の集団に関する。１つの実施様態において、哺乳動物膵臓細胞のこの集団は、約５〜約１５パーセントのインスリン−陽性細胞からなる。他の実施様態において、この哺乳動物膵臓細胞集団は、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃にて４時間、２０ｍＭのグルコースに対してのような条件に暴露した後に、前記グルコースへの暴露の前の、インスリン分泌と比較した場合に、インスリン分泌に関して、２倍を超える増加を示す。
【００１３】
他の実施様態において、この哺乳動物膵臓細胞の集団は、１０％胎児ウシを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃にて４時間、２０ｍＭ グルコースのような条件への、前記集団の暴露の後、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌで、インスリン分泌を提供可能である。
【００１４】
本発明の他の態様は、哺乳動物インスリン産生ベータ細胞を含む細胞の集団に関し、そこで、前記細胞集団に、分化ベータ細胞の少なくとも１つの特徴、および同一の個々の細胞における、未分化ベータ細胞の少なくとも１つの特徴を持つ細胞が含まれる。分化ベータ細胞の特徴は、たとえば、インスリン分泌であり得、未分化ベータ細胞の特徴は、ＣＫ２０発現および／または二核性でありうる。本発明はまた、以上で記述した再分化方法の任意の実施態様によって入手可能な、そのような哺乳動物膵臓細胞の集団にも関する。
【００１５】
本発明の他の態様は、哺乳動物インスリン分泌ベータ細胞を含む、哺乳動物膵臓細胞の集団に関し、前記細胞集団には、未分化または脱分化細胞のマーカーを持つ細胞の第一亜集団が含まれ、分化細胞のマーカーを持つ細胞の第二亜集団が含まれる。分化細胞のマーカーは、たとえば、Ｃ−ペプチド−Ｉ、Ｐｄｘ−１、Ｇｌｕｔ−２またはインスリンである。脱分化または未分化細胞のマーカーは、たとえばサイトケラチン７、サイトケラチン１９、サイトケラチン２０、ガストリンに対するＣＣＫＢレセプター、ＰＧＰ９．５、またはｎｏｔｃｈ−１レセプターである。本発明はまた、以上で記述した再分化方法の任意の実施態様によって入手可能な、そのような哺乳動物膵臓細胞の集団にも関する。
【００１６】
他の態様において、本発明は、治療的に活性な量の、本発明の方法によって入手可能な再分化細胞を含む、哺乳動物膵臓細胞集団を含む、医薬組成物に関する。
【００１７】
他の態様において、本発明は、医薬品の製造のために、本発明の方法によって入手可能な、再分化細胞を含む、哺乳動物膵臓細胞集団の使用に関する。特定の実施様態において、医薬品は、１型糖尿病または２型糖尿病の処置のために使用される。
【００１８】
また他の態様において、本発明は、本発明の培養方法によって入手可能である再分化細胞を含む、治療的に活性な量の哺乳動物膵臓細胞集団を含む、効果的な量の医薬組成物を投与するステップを含む、１型または２型糖尿病の処置のための方法に関する。
【００１９】
また他の態様において、本発明は、医薬品の調製のための、ＥＧＦレセプターのヒトまたはヒト化リガンドと、ｇｐ１３０レセプターのヒトまたはヒト化リガンドの組み合わせ
の使用に関する。１つの実施様態において、前記医薬品は、１型または２型糖尿病の処置のために使用される。他の実施様態において、ＥＧＦレセプターのヒトまたはヒト化リガンドがヒトＥＧＦであり、およびヒトｇｐ１３０レセプターのヒトまたはヒト化リガンドが、ヒトＬＩＦである。
【００２０】
また他の態様において、本発明は、１型または２型糖尿病の処置のための医薬品の調製のための、ｇｐ１３０レセプターのヒトまたはヒト化リガンドの使用に関する。１つの実施様態において、ｇｐ１３０の前記ヒトまたはヒト化リガンドは、ＬＩＦである。
【００２１】
また他の実施様態において、本発明は、ａ）ＣＫ２０、ＣＫ７またはＣＫ１９の存在、ｂ）二核細胞の発生、ｃ）インスリン陽性細胞の存在、ｄ）Ｃ−ペプチド、Ｐｄｘ−１およびＧｌｕｔ−２の存在、ｅ）ガストリンＣＣＫＢレセプター、ＰＧＰ９．５およびｎｏｔｃｈ−１レセプターの、前記哺乳動物膵臓細胞上での存在、からなる群より選択される１つまたはそれ以上のパラメータを決定するステップを含む、脱分化哺乳動物膵臓細胞の再分化の程度を決定するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明はまた、脱分化の再分化の程度を決定するためのこのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法によって同定可能である、哺乳動物膵臓細胞の集団に関する。
【００２２】
本発明は、脱分化膵臓細胞からの、ｉｎ ｖｉｔｒｏインスリン産生哺乳動物ベータ細胞の生成の方法に関する。１つの実施様態において、これは、ＥＧＦレセプターのリガンド、たとえば、ＥＧＦまたはＴＧＦ−アルファを含む培地中で、前記脱分化膵臓細胞をインキュベートすることによって行う。任意に、培地にはさらに、ＬＩＦのような、ｇｐ１３０レセプターのリガンドが含まれる。あるいは、培地には任意にｂＦＧＦが含まれる。本方法にて使用される脱分化膵臓細胞は、たとえば導管細胞、腺房細胞または膵島細胞である。これらの脱分化細胞は、この培地中へのインキュベーションの前に、ベータ細胞より枯渇可能である。脱分化膵臓細胞は、たとえば、齧歯類（ラット、マウス）、蓄牛、ブタおよびヒトを含む霊長類から得られる、哺乳動物細胞である。
【００２３】
他の態様において、本発明は、以上で記述した方法によって、脱分化膵臓細胞より入手可能である、インスリン産生細胞の集団に関する。そのようなインスリン産生細胞の集団は、グルコース（たとえば２０ｍＭ グルコース、４時間）に曝露したときのインスリン分泌において、少なくとも２倍の増加を示す。細胞の集団をさらに、Ｃ−ペプチド−Ｉ、Ｐｄｘ−１およびＧｌｕｔ−２のようなマーカーに対する、それらの免疫応答性によってさらに特徴づけることが可能である。これらはまた、さらに、１０％未満のサイトケラチン陽性細胞の存在、および７％未満の二核細胞の存在によって特徴づけられる。
【００２４】
本発明は、さらなる態様において、本発明の方法によって、脱分化膵臓細胞より入手可能な、インスリン産出細胞の細胞集団を含み、さらに、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物に関する。本発明の方法によって、脱分化膵臓細胞から入手可能な、インスリン産出細胞の細胞集団は、１型または２型糖尿病の処置のための医薬品の製造のために使用可能である。したがって、本発明はまた、本発明の医薬組成物を、必要としている個体に投与する段階を含む、糖尿病の処置のための方法に関する。
【００２５】
他の態様において、本発明は、インスリン分泌ベータ細胞集団の量をｉｎ ｖｉｖｏで増加させるために、糖尿病の処置のための医薬品調製のためのＥＧＦレセプターのリガンド（たとえばＥＧＦ）、またはｇｐ１３０レセプターのリガンド（たとえばＬＩＦ）の使用に関する。
【００２６】
以上で示唆したように、糖尿病に対する処置として、膵島移植の適用が、インスリン−産生細胞の不適切な供給によって妨げられる。本発明において、インスリン−産生ベータ
細胞は、外分泌細胞より産出され、たとえばヒトおよび他の哺乳動物において、膵臓中の細胞の大部分を表す。
【００２７】
本発明は、ベータ−細胞新生が、培地中の２つの可溶性因子、すなわちＥＧＦとＬＩＦの組み合わせによって、外分泌細胞より誘導可能である方法を提供する。本発明は、膵島移植による、そして、不十分なドナーベータ−細胞の問題に打ち勝つ方法を提供することによって、糖尿病の処置における、重要な進展を提供する。
【００２８】
ヒト細胞に適用する場合、本発明は、膵島移植による、そして、不十分なドナーベータ−細胞の問題に打ち勝つ方法を提供することによって、糖尿病の処置における、重要な進展提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明中の「加えた（ａｄｄｅｄ）」、「加えること（ａｄｄｉｎｇ）」または「添加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）」は、培地に別々に添加される、ＬＩＦおよびＥＧＦのような化合物、ＥＧＦレセプターリガンドおよびＧｐ１３０レセプターリガンドを意味する。細胞による分泌による、培地中に存在する未知の量の化合物は意味しない。また、基礎増殖培地に加える、血清中に存在する低量の化合物も意味しない。培地中の添加した化合物の濃度は、ｎｇ／ｍｌ範囲であり、約１、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、〜１０００ｎｇ／ｍｌで変化しうる。特定の実施様態において、各化合物に対する添加化合物の濃度は、別々に、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの間で変化する。他の特異的な実施様態において、各化合物に対する添加化合物の濃度は、別々に２０〜１００ｎｇ／ｍｌの間で変化する。
【００３０】
「脱分化外分泌膵臓細胞（Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｅｘｏｃｒｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）」は、より少なく、またはより多く脱分化しえ、再獲得胚可塑性を持つ細胞を意味する。分化細胞によって失われた、脱分化細胞の典型的な特徴は、膵臓トリプシノーゲン、トリプシンおよびリパーゼ、インスリン−転移活性転写因子Ｐｄｘ−１、ベータ−細胞特異的グルコーストランスポーターＧｌｕｔ−２、および未加工プロインスリンのＣ−ペプチド−Ｉ成分のような、アミラーゼおよび他のチモーゲンの発現である。脱分化細胞によって獲得される胚可塑性の典型的な特徴は、サイトケラチン７、１９および／または２０の発現である。さらに、ガストリンに対するコレシストキニンＢ ＣＣＫＢ−レセプター、神経外分泌マーカーＰＧＰ９．５（ニューロン−特異的ユビキチンｃ−末端ハイドロラーゼ）およびＮｏｔｃｈ−１レセプターの発現がありうる。本発明にしたがって、脱分化可能である典型的な膵臓細胞型は、腺房細胞、導管細胞および非外分泌膵島細胞である。
【００３１】
「ベータ細胞（ｂｅｔａ ｃｅｌｌｓ）」は一般的に、膵臓中の、クラスター（膵島）にて発見される、特異的な細胞として知られている。ベータ細胞は、インスリンを産生し、グルコースレベルをモニタし、グルコースレベルの増加に応答して、インスリンを分泌することによって、血流中でのグルコースレベルを調節する。グルカゴン分泌アルファ細胞とともに、膵臓の外分泌細胞集団の大部分を形成する。
【００３２】
膵島またはランゲルハンス島は、膵臓中の特定の細胞集団である。これらは、体の衰弱を助け、食物を使用するホルモンを産生し、分泌する。これらの細胞は、膵臓のクラスター内に存在する。膵島中には、５つの型の細胞が存在し、それは、ソマトスタトンを産生する、ベータ細胞、アルファ細胞、デルタ細胞と、ＰＰ細胞およびＤ１細胞である。
【００３３】
本発明は、通常、ヒトおよび他の哺乳動物の膵臓からの、ランゲルハンス島の単離の後に捨てられる、外分泌画分を使用する。特定の実施様態において、膵臓外分泌細胞は、成
体、出産後または出産前膵臓から由来する。特定の実施様態において、再分化外分泌膵臓細胞を、異なる種内への移植のために使用する。他の実施様態において、再分化外分泌細胞を、同一の種の異なる個体への移植のために使用する。また他の実施様態細胞において、外分泌膵臓細胞を、個体より得、再分化外分泌細胞を、同一の個体への移植のために使用する。脱分化細胞を、１４日間までのより長い期間、培養中に維持可能である。あるいは、脱分化細胞を、凍結し、保存する。
【００３４】
本発明は、ＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）へ結合し、下流経路を活性化する、ＥＧＦ（上皮増殖因子）の使用に関する。したがって、ＥＧＦレセプターに結合し、活性化する活性を維持する、ＥＧＦの短化または変異形態を、本発明の方法のための変法として使用可能である。同様の文脈で、膵臓細胞を単離した種とは異なる、他の動物種からのＥＧＦのようなリガンドを、レセプターに結合し、活性化するならば、使用可能である。これらの目的のために、１つの種からのそのようなリガンドの配列を、他の種から得た細胞集団上での望む結合および活性化特性を獲得するために、改変可能である。ｉｎ ｖｉｖｏの目的のために、非ヒト哺乳動物からのリガンドを、ヒト内で活性を獲得するため、およびヒト免疫システムによる免疫応答を避けるために、「ヒト化」可能である。同様に、ＥＧＦＲに対するリガンドである、他の天然に存在する、または改変タンパク質を、本発明の方法のために使用可能である。これらの例は、形質転換増殖因子−アルファ、アンフィレグリン、ベータセルリンおよびＰｏｘＶｉｒｕｓ増殖因子がある。
【００３５】
本発明は、ｇｐ１３０レセプターに結合し、下流経路を活性化する、ＬＩＦ（白血病阻害因子）の使用に関する。ＬＩＦは、膵臓発達における機能は現在までに記述されていない、多面性サイトカインである。幹細胞増殖および分化のよく知られている調節物であり、胚幹細胞の分化を防止するために広く使用されている。ｇｐ１３０レセプターに結合し、活性化する能力を保持する、ＬＩＦの短化または変異形態を、本発明の方法のための変法として、使用可能である。同様に、ｇｐ１３０に対するリガンドであり、下流経路を活性化する、他の天然に存在する、または改変タンパク質を、本発明の方法のために使用可能である。その例には、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＯＳＭ（オンコスタチンＭ）、ＣＮＴＦ（Ｃｉｌｉａｒｔ 神経栄養因子）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球−コロニー刺激因子）、ＣＴ−１（カルディオトロフィン−１）、ＩＬ−１２およびレプチンがある。
【００３６】
ＬＩＦに対する齧歯類（マウス、ラット）と霊長類（ヒト、サル）細胞の挙動の違いが、ヒトＥＳ細胞とＭＡＰＣ細胞に関して記述されている［Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．前掲］。１つの実施様態にしたがって、ヒト脱分化膵臓細胞を、ＥＧＦレセプターに対するリガンド（たとえば、ＥＧＦ）およびｇｐ１３０レセプターに対するリガンド（たとえばＬＩＦ）を含む組成物中でインキュベートする。ヒト細胞を使用する特定の実施様態において、ＬＩＦは任意である。
【００３７】
再分化のために、本発明の方法にて使用する、ＥＧＦ、ＬＩＦおよび他の化合物は、同一の種からでありえ、また、化合物がそのレセプターに結合し、レセプターを活性化する限り、他の種からでもあり得る。したがって、一般的に、本発明は、第二の哺乳動物のｇｐ１３０レセプター経路のリガンド、および／または第三の哺乳動物のＥＧＦレセプター経路のリガンドを加えることによる、第一の哺乳動物の細胞の再分化に関し、各第一、第二および第三の哺乳動物は、独立して、限定はしないが、ヒト、霊長類および非霊長類サル、ハムスター、マウスおよびラットのような齧歯類、ウサギ、ヤギ、ウシおよび他の畜牛、イヌおよびブタからなる、哺乳動物の群より選択される。
【００３８】
１つの実施様態において、本発明は、成熟インスリン産出細胞の特徴的な形態、または未熟、脱分化、または胚細胞の特徴的な形態である、個々の細胞、または細胞集団における特性を決定することに関する。外分泌腺房細胞が、上清培養のたった４日以内に、大い
にその表現系を変化させることが、先に示されている（Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）＆（２００１）、前掲）。これらは、膵臓トリプシノーゲン、トリプシンおよびリパーゼのような、アミラーゼおよび他のチモーゲンを欠き、導管マーカーＣＫ２０の発現を開始する。Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックスにおいて、これらは、導管と似ている嚢胞性構造を形成するが、上清培養中に残っている場合に、脱分化し、Ｐｄｘ−１およびＰｔｆ１−ｐ４８転写因子、神経外分泌マーカーＰＧＰ９．５、およびＣＣＫＢガストリンレセプターの組み合わせのような、胚マーカーを発現する傾向にある［Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ
ａｌ．（２０００）＆（２００１）、前掲］。これらのマーカーは別として、分化および脱分化細胞に関する他のマーカーが、当業者に公知であり、細胞または細胞集団の分化の程度を評価するために使用可能である。
【００３９】
本発明は、再分化細胞集団または個々の細胞が、未分化または胚細胞に典型的な特定の特徴を持つことを示す。インスリン産生している再分化細胞のいくつかは、２つの核（二核）およびＣＫ２０免疫応答性の発生のような、同様の細胞特性を維持している。したがって、本発明は、一方で、再分化細胞および再分化細胞を含む細胞集団を、他方で、成熟細胞および成熟細胞を含む細胞集団を見分けるマーカーおよび方法を防ぐ。
【００４０】
本発明の１つの実施様態において、由来した脱分化細胞を、低血清濃度（１％ ＦＢＳ）の存在下で、プラスチックに結合させた単層として培養した。多くの他の条件を、上清培養の使用、ウシ血清以外の他の動物の血清の使用、ＲＰＭＩ−１６４０以外の他の基礎培地の使用、およびグルコース濃度の変更のような、哺乳動物の脱分化細胞の培養のために同定可能である。
【００４１】
本発明は、ベータ−細胞新生が、培地中の２つの可溶性因子の組み合わせ、すなわちＥＧＦとＬＩＦによって、齧歯類、とりわけラットのような、特定の動物で誘導可能である、短期間培養モデルを含む。これは、正常外分泌を、内分泌細胞に表現系スイッチすることを記した、腺房島変換分化の、初めてのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究である。
【００４２】
本発明の１つの実施様態は、再分化インスリン分泌膵臓細胞を含む、哺乳動物細胞の集団を含む、医薬組成物に関する。細胞集団に加えて、前記組成物は通常、当業者によく知られており、たとえば、コラーゲンまたはゼラチンのようなタンパク質、デンプン、ポリサッカライド、糖（デキストロース、グルコースおよびスクロース）のような炭水化物、ナトリウムまたはカルシウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体、プレゼラチン化デンプン、ペクチン寒天、カラゲナン、泥、親水性ガム（アカシアガム、グアーガム、アラビアガムおよびキサンタンガム）、アルギニン酸、アルギニン酸塩、ヒアルロン酸、ポリグリコール酸およびポリ乳酸、デキストラン、ペクチン、水溶性アクリルポリマーまたはポリビニルピロリドンのような合成ポリマー、プロテオグリカン、リン酸カルシウムなどから選択される、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体を含む。
【００４３】
本発明は、ＬＩＦの組み合わせのような、化合物の存在下で、脱分化外分泌細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ再分化を示している。他の実施様態において、細胞の再分化は、処置されるべき個体内で起こることが想定される。例として、脱分化細胞を、さらにたとえばＬＩＦおよびＲＧＦを含む、時間および濃度制御マトリックスを可能とする化合物を含む、生物分解性マトリックス内に埋め込み、これにより、脱分化外分泌膵臓細胞のｉｎ ｖｉｖｏ分化が可能にある。マトリックスの分解の後、分化細胞が放出される。特定の実施様態において、細胞をまず、制限された時間で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて分化誘導増殖因子で処理し、その後、さらにｉｎ ｖｉｖｏ分化のために、増殖因子の存在下で、移植する。したがって、他の態様において、本発明は、脱分化細胞と、細胞の分化のための化合物を含む医薬組成物に関する。
【００４４】
以下の実施例で本発明を説明するが、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
実験設定
動物：体重２５０〜３００ｇのオス１０〜１２週齢Ｗｉｓｔａｒラット（Ｊａｎｖｉｅｒ，Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を、膵臓からの細胞の単離のために使用した。体重２２〜２４ｇの８週齢オスＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌ−ｎｕＢＲヌードマウス（チャールス リバー ラボラトリー社（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，），Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を、移植のためのレシピエントとして使用した。全ての動物実験は、ブリュッセルのフリー大学（Ｆｒｅｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＥｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【００４６】
外分泌組織の単離：膵臓を、コラゲナーゼと共に、部分的に溶解させ、外分泌腺房を、すでに発行されているように（Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）＆（２００１）、前掲）、遠心希釈によって精製した。
【００４７】
培養手順：外分泌細胞を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ、ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）、ペニシリン（７５ｍｇ／ｌ）（コンチネンタル ファーマ（Ｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａ）、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ），Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）を含むＲＰＭＩ−１６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ培地中の懸濁培養中で、細菌学ペトリディッシュ（ヌンク（Ｎｕｎｃ）、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，Ｉｌｌ，ＵＳＡ）内で、４日間、前培養し、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ Ｓｕｌｐｈａｔｅ（５０μｇ／ｍｌ）（シグマ）を使用して、培養液から繊維芽細胞を禁止した。培地をこの前培養機関の間、毎日取り替えた。単離後第４日目に、細胞を、２４−ウェルプレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、ＢＤバイオサイエンセス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）上、１０００μｌ−分液中に分配した。この手順を、１ウェルあたりおよそ７５ｎｇ ＤＮＡを得るために標準化した。いくつかの実験では、細胞を、プレーティング前に、１０分間、１０ｍＭ アロキサンで処置した。一晩の培養後、非接着細胞を洗浄して除去し、ついで、対照培地または増殖因子含有培地をウェルに加えた。対照培地は、１％ ＦＢＳおよび抗生物質（ストレプトマイシン ０．１ｇ／ｌおよびペニシリン ０．０７５ｇ／ｌ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地からなる。増殖因子培地は、５０ｎｇ／ｍｌ ヒト組換え体上皮増殖因子（ＥＧＦ）（シグマ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および４０ｎｇ／ｍｌ 組換え体マウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）（シグマ）を含む、対照培地からなる。細胞単層を、後者の培地中３日間の培養期間後に、解析した。
【００４８】
免疫細胞組織学およびＤＮＡ測定；ウェルあたりの細胞の数を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８色素の結合に基づく、ＤＮＡ蛍光アッセイによって測定した［Ｌｏｏｎｔｉｅｎｓ
ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（１９９０）２９、９０２９−９０３９］。少なくとも６ウェルを、１実験条件あたりで使用し、三重培養を、ＤＮＡ−抽出のために使用し、平衡して、細胞組成の免疫細胞化学解析のために使用可能である。単層の免疫細胞化学染色を、２４−ウェルプレート中で直接実施した。この目的のために、細胞単層を、４％緩衝ホルムアルデヒドにて１０分間固定し、続いて、細胞透過性のために、２０分間、メタノール（−２０℃）で処理した。１つの抗原の単独染色のために、ストレプトアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ法を使用した［Ｂｏｕｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．（１９９４）４３，１２７９−１２８３、Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆ Ｄｅ Ｂｌａｙ Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．（１９９６）４４，９４７−９５１］。二重染色のために、ＦＩＴＣ−およびＴＲＩＴＣ−標識台に抗体での、間接法を使用
した（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）。この研究で使用した第一抗体は、ポリクローナル抗−インスリン（Ｃ．Ｖａｎ Ｓｃｈｒａｖｅｎｄｉｊｋ，ＶＵＢ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ）［Ｂｏｕｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、前掲、Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆ Ｄｅ Ｂｌａｙ、前掲］、ポリクローナル抗−ラットＣ−ペプチド−Ｉ（Ｏ．Ｄ．Ｍａｄｓｅｎ，Ｈａｇｅｄｏｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｅｎｔｏｆｔｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ［Ｂｌｕｍｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９９２）６，２９９−３０７］、ポリクロナール抗−Ｐｄｘ１（Ｏ．Ｄ．Ｍａｄｓｅｎ）［Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）前掲］、ポリクローナル抗−Ｇｌｕｔ−２（Ｗａｋ−Ｃｈｅｍｉｅ，Ｂａｄ Ｓｏｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、モノクローナル抗−サイトケラチン−２０（ＣＫ２０）（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ−ｕｐｏｎ−Ｔｙｎｅ，ＵＫ）（Ｂｏｕｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）前掲、Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆ Ｄｅ Ｂｌａｙ、前掲）、ポリクローナル抗−アルファ−アミラーゼ（シグマ）、およびマウスモノクローナル抗−ＢｒｄＵ（ＩＣＮ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）である。増殖細胞による５’−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを査定するために、１０μＭ ＢｒｄＵ（シグマ）を、固定の１時間前に、培養培地に加えた（Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）前掲）。ＢｒｄＵパルス−追跡標識のために、ＢｒｄＵを、接着細胞培養の第一日目に、培養培地に加え、２４時間後に取り除いた。細胞を、パルスの２４時間後、および細胞培養の３日目、すなわちＢｒｄＵの存在しない状態での４８時間追跡後に、解析した。ＢｒｄＵ取り込みを、インスリン−発現細胞中、およびサイトケラチン−発現細胞中両方でスコア化した。
【００４９】
ＲＴ−ＰＣＲ解析：全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ ＲＮＡ単離法（インビトロジェン ライフ テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ラット膵臓細胞の単層細胞培養から抽出した。ｎｏｔｃｈ−１およびグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼをコードしている転写物の半定量的解析のために、製造業者（インビトロジェン ライフ テクノロジーズ）によって記述されたように、全ＲＮＡを逆転写し、増幅した。ＰＣＲ産物を、１．５〜２．５％ アガロースゲル中での電気泳動によって分離し、臭化エチジウム染色によって視覚化した。解析を、少なくとも３回実施した。
【００５０】
形態計測：コンピュータ−補助形態計測［Ｂｏｕｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）前掲］を使用して、２４−ウェルプレート中の単層の面積を測定した。
【００５１】
インスリン測定：細胞インスリン含量および培地中に放出されたインスリンを、放射−免疫アッセイによって測定した［Ｐｉｐｅｌｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．前掲］。グルコース−刺激インスリン放出を研究するために、培養培地中のインスリンを、２．５ｍＭ グルコースを含む基礎培地中での４時間のインキュベーション、続いて２０ｍＭ グルコース中の４時間インキュベーション後に測定した（血清およびグルコースを含まないＨＡＭ−１０培地、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））［Ｌｏｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００２）５１，２９８２−２９８８］。
【００５２】
移植：単層細胞を移植するために、これらを、子牛皮膚からのコラーゲンＳ（Ｉ型、ロッシュ モレキュラー バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で培養し、コラゲナーゼＰ（ロッシュ モレキュラー バイオケミカルズ）で脱離させた。細胞ペレットを、移植３時間前に、７０ｍｇ／ｋｇアロキサンを静脈内に注射した、ヌードマウスの肝臓カプセル（１７）下で移植した。血液グルコースレベルを、Ｇｌｕｃｏｃａｒｄ Ｍｅｍｏｒｙストリップ（Ａ．Ｍｅｎａｒｉｎｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂｅｎｅｌｕｘ，Ｚａｖｅｎｔｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いることによって、給餌マウスの尾錠脈から得た試料中で、２日ごとにモニタした。
【００５３】
統計：両側対ステューデントｔ−検定を使用し、信頼区間＜０．０５で、統計学的有意と判断した。平均値を±ＳＥＭで示す。独立した実験の繰り返しを、ｎ＝ｘ（ｎは、繰り返し数）として示し、それぞれの細胞調製物は、合計５匹のラットからのプールである。
【実施例２】
【００５４】
外分泌細胞単層の産出と組成
単離および前培養外分泌腺房細胞凝集体を、先に記述されたようにして得（Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）＆（２００１）、前掲）、続いて、これらの細胞をプラスチック上で単層を形成させた。９０％を超える細胞が、導管マーカーＣＫ２０に対して免疫応答性であり、腺房細胞のアミラーゼマーカーを失っていた。（これらの細胞のうち、７９．０±０．４％（ｎ＝７）は二核化しており、これは腺房細胞の部分の特徴である）。これらの培養は最初、３．７±０．４６％（ｎ＝７）のインスリン−陽性細胞を含んでいた。細胞調製物を、単層形成の前に、アロキサンで前処理した場合、単層は、０．５％未満のインスリン−陽性細胞を含んだ。ゲニチシンを培養の間に使用した場合、繊維芽細胞の生産物は阻害された。
【００５５】
発行されたデータによって、外分泌腺房細胞が、上清培養の４日以内に、アミラーゼや他のチモーゲンのような、その分化特性を欠き、ＣＫ２０、Ｐｄｘ−１とＰｔｆ１−ｐ４８転写因子の組み合わせ、神経内分泌マーカーＰＧＰ９．５およびＣＣＫＢガストリンレセプターのような、腺房細胞および胚特性を発現し始める（Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ，（２０００）＆（２００１）、前掲、Ｌａｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．４４４，６１−６５）。デキサメタゾンの存在下で、これらの細胞が、肝細胞様細胞に変換分化可能であることが示された［Ｌａｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３９，１４９９−１５０７］。本研究のために、これらの細胞を、低血清濃度（１％ＦＢＳ）の存在下で、プラスチックに接着した単層として培養し、ＬＩＦとＥＧＦの組み合わせの効果に関して試験した。これらの因子は、成体および胚神経幹細胞の分化を制御することが知られている（Ｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，３３８５−３３９３）。
【実施例３】
【００５６】
細胞数とベータ−細胞頻度における増殖因子の効果
単層培養を、ＬＩＦとＥＧＦで、３日間処理すると、培養の開始および両方の増殖因子のない状態での培養と比較して、ＤＮＡ含量の有意な増加が観察された（図１Ａ）。形態計測によって測定された、細胞に覆われている総表面は、同程度の増加を示した。
【００５７】
ＬＩＦとＥＧＦでの処理はまた、インスリン−陽性細胞の頻度の、有意な増加を誘導した。全ての細胞のパーセンテージとして示す（図１Ｂ）。インスリン−陽性細胞の頻度を、総ＤＮＡ含量で掛け合わせ、絶対ベータ−細胞数の測定を行った場合、ベータ−細胞数の１１倍の増加が、３日間の培養期間にわたり、ＬＩＦおよびＥＧＦの存在下で観察された（図１ｃ）。総細胞インスリン含量の、放射免疫アッセイでの解析によって、対照培養と比較して、ＬＩＦおよびＥＧＦ処置培養において、６倍の増加が示された。
【００５８】
ＬＩＦまたはＥＧＦいずれかのみの存在下でも、ベータ−細胞数の有意な増加があり、開始物質と比較して、それぞれ６倍および５倍であるが、これらの増加は、両方の因子が一緒に存在する場合よりも、有意に低かった。
【００５９】
ＬＩＦおよびＥＧＦの存在下での培養３日後、ベータ−細胞の汚染を枯渇させた、アロキサン前処理培養において、９．２±１．５％インスリン−陽性細胞が見られた（ｎ＝４）。増殖因子のない場合、０．４±０．１％のインスリン−陽性細胞が存在した。両方の
因子の組み合わせで見られた、インスリン−陽性細胞のアップレギュレーションは、ＥＧＦまたはＬＩＦいずれかのみを与えた場合には観察されなかった。
【００６０】
本発明の方法にしたがってえられる細胞集団を、さらに、たとえば欧州特許第１１４６１１７号で示されたように、ＦＡＣＳソーティング、サイズ分画および溶出のような方法によって、インスリン分泌細胞に関して濃縮可能である。
【００６１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＥＧＦまたはＬＩＦのみはまた、ベータ細胞の数に効果を持つ。このことは、これらの因子がまた、培養細胞によって産出され、パラクラインまたはオートクライン様式で働きうる、という観察（未発表観察）によって説明可能である。本発明において、ＬＩＦがベータ細胞より産生されることが示され、したがって、ベータ細胞が、前駆体細胞からのその独自の再生を刺激可能であることが示唆されている。ベータ細胞はまた、たとえばネトリン［Ｄｅ Ｂｒｅｕｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（２００３）４６，９２６−９３３］および血管上皮増殖因子［Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．７６，２２５−２３２］のような、膵島新生を調節可能な他の因子も産出する。これらの観察によって、なぜ、毒性または自己免疫損傷に続く「自発的」膵島新生が、制限されるのかが説明されうる。
【００６２】
分化外分泌細胞の本モデルにおいて、ＬＩＦとＥＧＦとの組み合わせが、全ＤＮＡにおける有意な増加、および単層によって占領された広い面積によって明らかなように、細胞増殖を刺激することがわかった。ＬＩＦとＥＧＦとの組み合わせはまた、インスリン−陽性細胞パーセンテージのおよそ６倍の増加となった。観察されたＤＮＡの増加と共に、インスリン−含有細胞の数の１０倍以上の増加を与える。
【実施例４】
【００６３】
表現系解析
二重免疫蛍光染色による解析によって、これらのインスリン−陽性細胞のほとんどがまた、プロインスリンＣ−ペプチド−Ｉ、転写因子Ｐｄｘ−１、およびグルコーストランスポーターＧｌｕｔ−２を含む、他のベータ−細胞マーカーも発現することが示された。Ｃ−ペプチドに対する免疫応答性は、インスリン−免疫応答性細胞の頻度の増加の説明として、培地からの、インスリン取り込みの可能性を排除する（インスリンを培地に加えなかった）。
【００６４】
ＥＧＦ＋ＬＩＦ−処置培養中、およそ１０％のインスリン−陽性細胞が、ＣＫ２０に対して免疫応答性であり、インスリン−陰性細胞と比較して多少低い染色度であった。インスリンとＣＫ２０の共発現は、増殖因子を加えず、開始物質中で見られなかった場合に、対照培養中でほとんど観察されなかった。この共発現によって、外分泌からインスリン−陽性細胞への表現系転移が示唆されている。著しく、インスリンおよびＣＫ２０−二重−陽性細胞が、二核であると観察され得た。二核インスリン−陽性細胞は、対照培養中ではほとんど見られず、開始時点では存在しなかったが、ＥＧＦ＋ＬＩＦ−処置培養で高い頻度で見られ、そこでは、全てのインスリン−陽性細胞の、６．２±０．４７％（ｎ＝７）と計数された。本発明の外分泌細胞由来単層において、ほぼ８０％の細胞が二核であった。二核性が、腺房細胞外分泌細胞の基本特徴であるので［Ｒａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．前掲］、これらの観察は、外分泌細胞から、インスリン−陽性細胞への転換に関する、他の示唆である。本発明の方法を用いて得た再分化細胞は、全体として、しかしまたいくつかの個々の細胞として、集団が、完全に分化した細胞の、しかしまた、不完全に分化した胚または成体前駆体細胞の特徴を維持するという、際だつ特徴を持つ。これらの特徴は、本実施例および以下の実施例で例示されている。分化および未分化細胞の両方のマーカーを持つこの特徴によって、本発明によって得られた細胞と、膵臓、とりわけ成体の膵臓から新たに単離された細胞を見分けることが可能になる。
【００６５】
これらのインスリン−含有細胞の大部分が、インスリン−変換活性化転写因子Ｐｄｘ−１、ベータ−細胞特異的グルコーストランスポーターＧｌｕｔ−２、および未処理プロインスリンのＣ−ペプチド−Ｉ成分のような、ベータ細胞の他の表現系特徴を発現しているので、成熟ベータ−細胞として考えることができる。ＢｒｄＵ−標識ベータ−細胞は非常に少ないので、３日間の期間内での、観察されたその数の増加は、前駆体細胞の分化、または新生に起因すると考えられる。
【００６６】
外分泌細胞が、新しく形成されたベータ−細胞の前駆体細胞として利用されたことの２つの示唆が存在した。第一に、ＣＫ２０免疫応答性は、インスリン−陽性細胞の部分として考えられた。これ以前に、ＣＫ２０を含むベータ−細胞が、胎児［Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆
ＤｅＢｌａｙ、前掲］、および新生が、導管−ライゲーションによって誘導される場合に、成体膵臓［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．前掲］にてのみ見られることが示された。したがって、ＣＫ２０発現は、ＣＫ２０−陽性外分泌細胞から、ベータ−細胞への変換に対する、良い示唆である。第二に、二核性が、インスリン−陽性細胞の部分で言及される。二核性は、腺房外分泌細胞の特徴であり、正常ラットベータ−細胞では観察されない［Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）、前掲］。これは、外分泌細胞のベータ細胞への変換の他の示唆である。二核ベータ細胞は、非常に小さなベータ−細胞有糸分裂活性（ＢｒｄＵ−取り込み）しかないので、細胞質分裂前に、細胞分裂が阻止されていることを示しうる。観察された増加の代わりに、ベータ細胞数の減少を導きうるけれども、ベータ細胞間の細胞融合は完全に除外不可能である。マイトマイシン−ｃとサイトカラシン−Ｂでの未発表の発見によって、インスリン−陽性細胞がまた、遅延細胞質分裂または開裂工程の種類によって、二核化（外分泌）細胞からえられうることが予想される。細胞質細胞開裂または収縮−分裂が、四倍体ハイブリッド細胞から間接的に示されたが、機構はいまだに特定されていない［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００３）４２２，８９７−９０１］。
【実施例５】
【００６７】
増殖
インスリン−陽性細胞中のＢｒｄＵ−取り込みの解析によって、０．１％以下のインスリン−陽性細胞が、１時間のパルスの後、ＢｒｄＵ−標識されたことが示された。このことによって、これらの細胞における二核化が、有糸分裂ベータ−細胞における停止核分裂の結果であること、またはベータ−細胞数の増加が、含有ベータ−細胞の増殖によるものでありうることは非常にあり得ないことになる。およそ１．５％の外分泌細胞が、ＢｒｄＵ標識された。
【００６８】
７２時間期間にわたるＢｒｄＵパルス−追跡実験（２４時間のパルス期間および４８時間の追跡）によって、追跡期間の間の、ＥＧＦおよびＬＩＦの存在下での、ＢｒｄＵ−標識ベータ−細胞の有意な増加が明らかになった（図２Ｂ）。この増加は、単に、増殖外分泌細胞の、非増殖ベータ−細胞の分化によって説明しうる。
【００６９】
マイトマイシン−Ｃ（増殖の阻害剤）およびサイトカラシン−Ｂ（細胞質分裂の阻害剤）での結果によって、二核細胞が、細胞周期を介さないで、単核化細胞（インスリンを発現している）に分裂可能であったことが示され、これは、一種の遅延細胞質分裂と開裂減少の存在を示唆している。
【実施例６】
【００７０】
成熟および胚マーカーのＰＣＲ解析
ＲＴ−ＰＣＲ解析によって、Ｎｏｔｃｈ発現が、対照−培地（８日目）中で培養した単層では存在しないこと、およびＮｏｔｃｈが、ＥＧＦおよびＬＩＦの存在下で、単層中で
アップレギュレートされたことが明らかにされた。Ｎｏｔｃｈは、ラット膵島には存在しない。
【実施例７】
【００７１】
インスリン分泌
インスリン分泌研究を、上記細胞培養条件下で、４時間にわたって実施した。２．５ｍＭ グルコース中でのその基礎分泌と比較して、２０ｍＭ グルコースによる刺激によって、分泌インスリンの４倍の増加が起こり、すなわち、２．３から９．５ｎｇ／ｍｌであった。
【実施例８】
【００７２】
移植
ＬＩＦおよびＥＧＦで処理した脱分化膵臓ラット細胞の脱離単層を、アロキサン−処理ヌードマウスに移植し、観察した。７０ｍｇ／ｋｇ アロキサンで処置したマウスは、恒久的に高血糖性のままであるか、または１週間以内に死亡する［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（１９９５）３８、１４０５−１４１１］。移植によって、１４日にわたり維持される、血中血糖の正常化となるが、移植片含有肝臓が除去されると、急速に高血糖に戻った（図３）。このことは、本発明にしたがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて、ＬＩＦおよびＥＧＦで得た再分化ベータ細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏで、血中血糖を制御可能であることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、本発明の実施様態にしたがって、ＥＧＦおよびＬＩＦの存在下で、これらの増殖因子のない状態と比較した、ＤＮＡの増加（Ａ）、％インスリン−陽性細胞（Ｂ）、ベータ−細胞数（Ｃ）および培養増殖の細胞インスリン含量（Ｄ）を示している（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１）。細胞を、ＥＧＦ＋ＬＩＦがない状態（中間）またはある状態（右）での３日間前に、培地中で５日間維持する（左）。
【図２】図２は、本発明にしたがって、対照培地対ＥＧＦおよびＬＩＦ両方で処置した培養での、アロキサンでの前処理後の、インスリン−陽性ベータ細胞の増加（Ａ）（ｎ＝４）、パルスおよび追跡期間の間の、ＥＧＦとＬＩＦの存在下での、ＢｒｄＵ−標識化インスリン陽性ベータ−細胞の数（Ｂ）（ｎ＝４）を示している（＊＊＝ｐ＜０．０１）。
【図３】図３は、本発明にしたがって、本発明のＥＧＦ＋ＬＩＦ再分化細胞を用いる、ｉｎ ｖｉｖｏ糖尿病マウスモデルを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓細胞を分化させる方法に関する。本発明はさらに、糖尿病の処置のための、インスリン分泌細胞集団に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓内でのベータ−細胞新生の調節の理解によって、糖尿病に対する細胞置換または再生治療の領域での適用が導かれる［Ｙａｍａｏｋａ Ｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．（２００２）、２９６、１０３９−４３］。たとえば、膵島移植によって、糖尿病患者における機能的なベータ−細胞質量を復元することが可能である［Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２０００）３４３，２３０−２３８］が、ドナー組織における不足によってひどく妨げられる。この問題は、新生の工程によって利用可能な膵臓組織からより膵島細胞を産出する方法を見つけることによって解決可能である［Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆ Ｋｌｏｐｐｅｌ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．（１９９６）４２７，５５３−５６０］。ここ１０年の間に、膵臓発達の理解が非常に進展したにもかかわらず、胚における膵島細胞分化を特定する細胞外因子は依然として未知である［Ｅｄｌｕｎｄ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．（２００２）３，５２４−５３２］。成体哺乳動物において、内分泌膵臓は、特定の実験条件で、主には、始原細胞からの膵島細胞新生の結果として、膨張させるか、または再生可能である［Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆ Ｋｌｏｐｐｅｌ、前掲］。後者の実際の性質は分かりにくいままである一方で、導管細胞、腺房細胞または膵島内細胞が、始原能力を持つと示唆されている［Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆ Ｋｌｏｐｐｅｌ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．（１９９６）４２７，５５３−５６０、Ｅｄｌｕｎｄ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．（２００２）３，５２４−５３２、Ｂｏｕｗｅｎｓ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（１９９８）４３，３３２−３３６、Ｇｕｚ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．（２００１）１４２，４９５６−４９６８、Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２０００）９７，７９９９−８００４、Ｒａｍｉｙａ ＶＫ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０００）６，２７８−２８２］。
【０００３】
細胞誘導に関して、そして特異的な制御因子に関して両方で、全膵臓の研究から、確固たる結論を引き出すのは難しい。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルが、膵臓から単離された、定義された細胞調製物から開始した、膵島新生を研究するために好ましい。ごくわずかなｉｎ ｖｉｔｒｏ研究によってしか、成体組織から膵島新生を誘導する実現可能性が示されえていない。さらなる膵島細胞が、成体膵臓組織の単層培養より生成されうることがすでに報告されている。始原細胞の、調節因子の性質を明らかにするため、そして膵島細胞を生成する効果を改善するために、これらの発見を確認することがいまだに欠けている。
【０００４】
ＫＧＦ（ケラチノサイト増殖因子）とニコチンアミドによって処置されたヒト膵臓誘導細胞培養は、結果として、３〜４週間後、インスリン含有量の増加となる。また、膵島細胞を含む嚢胞性構造が、細胞外マトリックスの影響下で、単層から出芽した［Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．前掲］。この新生に関連する前駆体は、導管マーカー、サイトケラチン−１９を発現している細胞として特徴づけられる［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．前掲］。他の研究においては、長期間の培養が、グルコースを含まない条件下で、糖尿病ＮＯＤマウス膵臓より得られ、これらを、グルコースの存在下で、膵島様構造を生成するために刺激可能であった［Ｒａｍｉｙａ ＶＫ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０００）６、２７８−２８２］。これらの細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて、機能的な成熟に至らな
かった。現在のところ、後者の発見が、ＮＯＤマウスで最近発見された、血液循環から由来した「パッセンジャー」幹細胞によるものであるかどうか、は明らかではない［Ｋｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３０２，１２２３−１２２７］。
【０００５】
分化外分泌細胞を、部分的に脱分化した状態に戻し、それによって、胚可塑性を再獲得させることが可能である［Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆ Ｋｌｏｐｐｅｌ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．（１９９６）４２７，５５３−５６０、Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４３，９０７−９１４（２０００）、Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２１，９４０−９４９（２００１）、Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５１，６８６−６９０（２００２）］。このことは、外分泌細胞、本器官中の大部分の細胞を、適切な条件下で、内分泌細胞へ、変換分化に持って行くことが可能であることを示している。
【０００６】
外分泌腺房細胞は、内分泌ベータ−細胞に変換分化可能であり［Ｂｏｕｗｅｎｓ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（１９９８）４３，３３２−３３６］、これは、腺房−膵島変換細胞に関するｉｎ ｖｉｖｏ試験より示唆された［Ｇｕ ｅｔ ａｌ．Ｐａｎｃｒｅａｓ（１９９７）１５，２４６−２５０１、Ｂｅｒｔｅｌｌｉ Ｅ．Ｂｅｎｄａｙａｎ Ｍ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９７）２７３，Ｃ１６４１−Ｃ１６４９］。腺房細胞が、アミラーゼを欠き、導管特性を獲得することが可能である［Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）＆（２００１）、前掲の引用］ので、サイトケラチンのような導管マーカーと、インスリンを共発現している、変換細胞の発現［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．（１９９５）３８，１４０５−１４１１］がまた、最初に腺房細胞から由来した細胞を表しうる。腺房腫瘍から由来した、アミラーゼ−分泌細胞株ＡＲ４２Ｊが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて、ベータ−細胞表現系に変換分化可能であることが示されてきた［Ｍａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９６）９７，１６４７−１６５４］。本発明は、特定の組み合わせの増殖因子での、初代培養モデルにおける、腺房細胞のベータ−細胞への、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変換分化を報告している。
【０００７】
ＬＩＦ（白血病阻害因子）は、膵臓発達における機能が、現在までのところ、記述されていない、多面発現性サイトカインである。幹細胞増殖および分化の調節がよく知られており、胚管細胞の分化を防止するために広く使用されている。最近、ＥＧＦおよびＰＤＧＦとの組み合わせで（細胞の分化なしで）、多型潜在性成体始原細胞の増殖を刺激することが報告された。［Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ （２００２）４１８，４１−４９］。
【０００８】
ＥＧＦ（上皮増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ））および他のＥＧＦ−ファミリーメンバーが、胚発達の調節、ならびに内分泌膵臓の再生に関連してきた。ＥＧＦは、未分化膵臓前駆細胞の増殖を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて刺激する［Ｃｒａｓ−Ｍｅｎｅｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．（２００１）５０、１５７１−１５７９］。機能的ＥＧＦ−レセプターを欠くトランスジェニックマウスにおいて、膵島形態形成が障害を受け、ベータ−細胞分化が遅延する［Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．（２０００）１２７、２６１７−２６２７］。またＥＧＦ−レセプターを介して働く増殖因子である、ベータセルリンが、ほぼ完全な膵臓切除ラット（２５ｌｉ）にて、およびアロキサン−糖尿病マウスにて、膵島再発生を促進したことが発見された［Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．（２０００）４９，２０２１−２０２７］。ベータ−細胞新生を刺激する他の因子である、Ｇｌｐ−１［Ｄｒｕｃｋｅｒ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（２００３）１７，１６１−１７１）はまた、ＥＧＦ−レセプターを変換活性化することが示された［Ｂｕｔｅａｕ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．（２００３）５２，１２４−１３２］。ガストリンホルモンとの組み合わ
せで、ＥＧＦが、ストレプトゾトシン−糖尿病ラットにて、ベータ−細胞再生を刺激することが示された［Ｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．（２００２）９１，４１４−４２０］。
【０００９】
ＬＩＦおよびＥＧＦは、胚中のニューロンおよびグリア細胞の分化を制御するシグナルとして、相乗的に働くことが報告された［Ｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）１５，３３８５−３３９３］。星状細胞において、始原ＥＧＦは、増加したＳＴＡＴ３リン酸化反応を介して、星状細胞−誘導シグナルとして、ＬＩＦを読み取る機能を増加させる。ＬＩＦはまた、成体における傷−誘導神経形成のために、鍵となるシグナルとも考えられている［Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２３，１７９２−１８０３］。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
１つの態様にしたがって、本発明は、第一の哺乳動物の脱分化した外分泌膵臓細胞を含む、またはからなる集団から、インスリン産生ベータ細胞を生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関し、前記方法には、以下の、ａ）培養培地中で、脱分化外分泌膵臓細胞の前記集団を提供すること、ｂ）前記培養培地中に、第二の哺乳動物のｇｐ１３０レセプターの１つまたはそれ以上のリガンドを加えること、および／または第三の哺乳動物のＥＧＦレセプターの１つまたはそれ以上のリガンドを加えること、ｃ）前記１つまたはそれ以上の、ｇｐ１３０レセプターのリガンド、およびまたは、前記１つまたはそれ以上のＥＧＦレセプターのリガンドを含む、前記培養培地中で前記脱分化外分泌膵臓細胞をインキュベートすること、のステップを含む。
【００１１】
１つの実施様態において、本方法は、ステップｂ）にて、前記培養培地に、第三の哺乳動物のＥＧＦレセプターの、１つまたはそれ以上のリガンドを加えることなしに、第二の哺乳動物のｇｐ１３０レセプターの１つまたはそれ以上のリガンドを加えることによって実施される。特定の実施様態において、本方法は、ステップｂ）において、前記培養培地に、第二の哺乳動物のｇｐ１３０レセプターの１つまたはそれ以上のリガンドと、第三の哺乳動物のＥＧＦレセプターの１つまたはそれ以上のリガンド両方を加えることによって実施される。１つの実施様態にしたがって、前記ｇｐ１３０レセプターのリガンドは、ヒトまたはヒト化ＬＩＦのような、ＬＩＦである。１つの実施様態にしたがって、ＬＩＦは、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度、または１０〜２５ｎｇ／ｍｌの間、または１００〜５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、培養培地に加えられる。１つの実施様態において、前記ＥＧＦレセプターのリガンドは、前記ＥＧＦレセプターのヒトまたはヒト化リガンドである。他の実施様態にしたがって、前記ＥＧＦレセプターのリガンドは、ヒトまたはヒト化ＥＧＦのようなＥＧＦである。１つの実施様態にしたがって、ＥＧＦは、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度、または１０〜２５ｎｇ／ｍｌの間、または１００〜５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、培養培地に加えられる。一般的に、ｇｐ１３０レセプターの１つまたはそれ以上のリガンド、および／またはＥＧＦレセプターの１つまたはそれ以上のリガンドは、１〜１００００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で培養培地に加えられる。特定の実施様態にしたがって、本方法はさらに、ステップｂの間に、前記培養培地中にｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞増殖因子）を加えるステップを含む。特定の実施様態にしたがって、培地は、ＫＧＦ（ケラチノサイト増殖因子）またはガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドは含まない。特定の実施様態において、本方法におけるインキュベーションステップは、７日，６日、５日または５日未満でも、すなわち４日または３日でも実施する。本発明の方法のために使用可能である脱分化外分泌膵臓細胞の集団は、導管細胞、腺房細胞および膵島細胞からなる群より選択される、１つの実施様態にしたがう。また、導管細胞、腺房細胞および膵島細胞からなる群からなる１つまたはそれ以上の細胞型の、任意の比を含む、これらの型の細胞、また細胞集団の混合を、本発明で使用可能である。他の実施様態にしたがっ
て、ステップａ）より前に追加ステップを実施し、そこで、ベータ細胞を枯渇させる。他の実施様態にしたがって、繊維芽細胞の増殖を減少させるために、脱分化および再分化を、ゼニチマイシンの存在下で実施する。本発明の方法にしたがって使用可能な細胞は、齧歯類、ブタ、サルおよびヒト細胞を含む、全ての型の哺乳動物細胞である。特定の実施様態において、哺乳動物細胞は、ラット細胞であり、１つまたはそれ以上の前記ＥＧＦレセプターのリガンドには、ヒトＥＧＦが含まれ、１つまたはそれ以上のｇｐ１３０レセプターのリガンドには、マウスＬＩＦが含まれる。
【００１２】
本発明の他の態様は、本発明の方法の実施態様を記述している、上記本明細書のいずれかによって入手可能な、哺乳動物インスリン生成ベータ細胞を含む、哺乳動物膵臓細胞の集団に関する。１つの実施様態において、哺乳動物膵臓細胞のこの集団は、約５〜約１５パーセントのインスリン−陽性細胞からなる。他の実施様態において、この哺乳動物膵臓細胞集団は、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃にて４時間、２０ｍＭのグルコースに対してのような条件に暴露した後に、前記グルコースへの暴露の前の、インスリン分泌と比較した場合に、インスリン分泌に関して、２倍を超える増加を示す。
【００１３】
他の実施様態において、この哺乳動物膵臓細胞の集団は、１０％胎児ウシを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃にて４時間、２０ｍＭ グルコースのような条件への、前記集団の暴露の後、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌで、インスリン分泌を提供可能である。
【００１４】
本発明の他の態様は、哺乳動物インスリン産生ベータ細胞を含む細胞の集団に関し、そこで、前記細胞集団に、分化ベータ細胞の少なくとも１つの特徴、および同一の個々の細胞における、未分化ベータ細胞の少なくとも１つの特徴を持つ細胞が含まれる。分化ベータ細胞の特徴は、たとえば、インスリン分泌であり得、未分化ベータ細胞の特徴は、ＣＫ２０発現および／または二核性でありうる。本発明はまた、以上で記述した再分化方法の任意の実施態様によって入手可能な、そのような哺乳動物膵臓細胞の集団にも関する。
【００１５】
本発明の他の態様は、哺乳動物インスリン分泌ベータ細胞を含む、哺乳動物膵臓細胞の集団に関し、前記細胞集団には、未分化または脱分化細胞のマーカーを持つ細胞の第一亜集団が含まれ、分化細胞のマーカーを持つ細胞の第二亜集団が含まれる。分化細胞のマーカーは、たとえば、Ｃ−ペプチド−Ｉ、Ｐｄｘ−１、Ｇｌｕｔ−２またはインスリンである。脱分化または未分化細胞のマーカーは、たとえばサイトケラチン７、サイトケラチン１９、サイトケラチン２０、ガストリンに対するＣＣＫＢレセプター、ＰＧＰ９．５、またはｎｏｔｃｈ−１レセプターである。本発明はまた、以上で記述した再分化方法の任意の実施態様によって入手可能な、そのような哺乳動物膵臓細胞の集団にも関する。
【００１６】
他の態様において、本発明は、治療的に活性な量の、本発明の方法によって入手可能な再分化細胞を含む、哺乳動物膵臓細胞集団を含む、医薬組成物に関する。
【００１７】
他の態様において、本発明は、医薬品の製造のために、本発明の方法によって入手可能な、再分化細胞を含む、哺乳動物膵臓細胞集団の使用に関する。特定の実施様態において、医薬品は、１型糖尿病または２型糖尿病の処置のために使用される。
【００１８】
また他の態様において、本発明は、本発明の培養方法によって入手可能である再分化細胞を含む、治療的に活性な量の哺乳動物膵臓細胞集団を含む、効果的な量の医薬組成物を投与するステップを含む、１型または２型糖尿病の処置のための方法に関する。
【００１９】
また他の態様において、本発明は、医薬品の調製のための、ＥＧＦレセプターのヒトまたはヒト化リガンドと、ｇｐ１３０レセプターのヒトまたはヒト化リガンドの組み合わせ
の使用に関する。１つの実施様態において、前記医薬品は、１型または２型糖尿病の処置のために使用される。他の実施様態において、ＥＧＦレセプターのヒトまたはヒト化リガンドがヒトＥＧＦであり、およびヒトｇｐ１３０レセプターのヒトまたはヒト化リガンドが、ヒトＬＩＦである。
【００２０】
また他の態様において、本発明は、１型または２型糖尿病の処置のための医薬品の調製のための、ｇｐ１３０レセプターのヒトまたはヒト化リガンドの使用に関する。１つの実施様態において、ｇｐ１３０の前記ヒトまたはヒト化リガンドは、ＬＩＦである。
【００２１】
また他の実施様態において、本発明は、ａ）ＣＫ２０、ＣＫ７またはＣＫ１９の存在、ｂ）二核細胞の発生、ｃ）インスリン陽性細胞の存在、ｄ）Ｃ−ペプチド、Ｐｄｘ−１およびＧｌｕｔ−２の存在、ｅ）ガストリンＣＣＫＢレセプター、ＰＧＰ９．５およびｎｏｔｃｈ−１レセプターの、前記哺乳動物膵臓細胞上での存在、からなる群より選択される１つまたはそれ以上のパラメータを決定するステップを含む、脱分化哺乳動物膵臓細胞の再分化の程度を決定するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明はまた、脱分化の再分化の程度を決定するためのこのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法によって同定可能である、哺乳動物膵臓細胞の集団に関する。
【００２２】
本発明は、脱分化膵臓細胞からの、ｉｎ ｖｉｔｒｏインスリン産生哺乳動物ベータ細胞の生成の方法に関する。１つの実施様態において、これは、ＥＧＦレセプターのリガンド、たとえば、ＥＧＦまたはＴＧＦ−アルファを含む培地中で、前記脱分化膵臓細胞をインキュベートすることによって行う。任意に、培地にはさらに、ＬＩＦのような、ｇｐ１３０レセプターのリガンドが含まれる。あるいは、培地には任意にｂＦＧＦが含まれる。本方法にて使用される脱分化膵臓細胞は、たとえば導管細胞、腺房細胞または膵島細胞である。これらの脱分化細胞は、この培地中へのインキュベーションの前に、ベータ細胞より枯渇可能である。脱分化膵臓細胞は、たとえば、齧歯類（ラット、マウス）、蓄牛、ブタおよびヒトを含む霊長類から得られる、哺乳動物細胞である。
【００２３】
他の態様において、本発明は、以上で記述した方法によって、脱分化膵臓細胞より入手可能である、インスリン産生細胞の集団に関する。そのようなインスリン産生細胞の集団は、グルコース（たとえば２０ｍＭ グルコース、４時間）に曝露したときのインスリン分泌において、少なくとも２倍の増加を示す。細胞の集団をさらに、Ｃ−ペプチド−Ｉ、Ｐｄｘ−１およびＧｌｕｔ−２のようなマーカーに対する、それらの免疫応答性によってさらに特徴づけることが可能である。これらはまた、さらに、１０％未満のサイトケラチン陽性細胞の存在、および７％未満の二核細胞の存在によって特徴づけられる。
【００２４】
本発明は、さらなる態様において、本発明の方法によって、脱分化膵臓細胞より入手可能な、インスリン産出細胞の細胞集団を含み、さらに、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物に関する。本発明の方法によって、脱分化膵臓細胞から入手可能な、インスリン産出細胞の細胞集団は、１型または２型糖尿病の処置のための医薬品の製造のために使用可能である。したがって、本発明はまた、本発明の医薬組成物を、必要としている個体に投与する段階を含む、糖尿病の処置のための方法に関する。
【００２５】
他の態様において、本発明は、インスリン分泌ベータ細胞集団の量をｉｎ ｖｉｖｏで増加させるために、糖尿病の処置のための医薬品調製のためのＥＧＦレセプターのリガンド（たとえばＥＧＦ）、またはｇｐ１３０レセプターのリガンド（たとえばＬＩＦ）の使用に関する。
【００２６】
以上で示唆したように、糖尿病に対する処置として、膵島移植の適用が、インスリン−産生細胞の不適切な供給によって妨げられる。本発明において、インスリン−産生ベータ
細胞は、外分泌細胞より産出され、たとえばヒトおよび他の哺乳動物において、膵臓中の細胞の大部分を表す。
【００２７】
本発明は、ベータ−細胞新生が、培地中の２つの可溶性因子、すなわちＥＧＦとＬＩＦの組み合わせによって、外分泌細胞より誘導可能である方法を提供する。本発明は、膵島移植による、そして、不十分なドナーベータ−細胞の問題に打ち勝つ方法を提供することによって、糖尿病の処置における、重要な進展を提供する。
【００２８】
ヒト細胞に適用する場合、本発明は、膵島移植による、そして、不十分なドナーベータ−細胞の問題に打ち勝つ方法を提供することによって、糖尿病の処置における、重要な進展提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明中の「加えた（ａｄｄｅｄ）」、「加えること（ａｄｄｉｎｇ）」または「添加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）」は、培地に別々に添加される、ＬＩＦおよびＥＧＦのような化合物、ＥＧＦレセプターリガンドおよびＧｐ１３０レセプターリガンドを意味する。細胞による分泌による、培地中に存在する未知の量の化合物は意味しない。また、基礎増殖培地に加える、血清中に存在する低量の化合物も意味しない。培地中の添加した化合物の濃度は、ｎｇ／ｍｌ範囲であり、約１、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、〜１０００ｎｇ／ｍｌで変化しうる。特定の実施様態において、各化合物に対する添加化合物の濃度は、別々に、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの間で変化する。他の特異的な実施様態において、各化合物に対する添加化合物の濃度は、別々に２０〜１００ｎｇ／ｍｌの間で変化する。
【００３０】
「脱分化外分泌膵臓細胞（Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｅｘｏｃｒｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）」は、より少なく、またはより多く脱分化しえ、再獲得胚可塑性を持つ細胞を意味する。分化細胞によって失われた、脱分化細胞の典型的な特徴は、膵臓トリプシノーゲン、トリプシンおよびリパーゼ、インスリン−転移活性転写因子Ｐｄｘ−１、ベータ−細胞特異的グルコーストランスポーターＧｌｕｔ−２、および未加工プロインスリンのＣ−ペプチド−Ｉ成分のような、アミラーゼおよび他のチモーゲンの発現である。脱分化細胞によって獲得される胚可塑性の典型的な特徴は、サイトケラチン７、１９および／または２０の発現である。さらに、ガストリンに対するコレシストキニンＢ ＣＣＫＢ−レセプター、神経外分泌マーカーＰＧＰ９．５（ニューロン−特異的ユビキチンｃ−末端ハイドロラーゼ）およびＮｏｔｃｈ−１レセプターの発現がありうる。本発明にしたがって、脱分化可能である典型的な膵臓細胞型は、腺房細胞、導管細胞および非外分泌膵島細胞である。
【００３１】
「ベータ細胞（ｂｅｔａ ｃｅｌｌｓ）」は一般的に、膵臓中の、クラスター（膵島）にて発見される、特異的な細胞として知られている。ベータ細胞は、インスリンを産生し、グルコースレベルをモニタし、グルコースレベルの増加に応答して、インスリンを分泌することによって、血流中でのグルコースレベルを調節する。グルカゴン分泌アルファ細胞とともに、膵臓の外分泌細胞集団の大部分を形成する。
【００３２】
膵島またはランゲルハンス島は、膵臓中の特定の細胞集団である。これらは、体の衰弱を助け、食物を使用するホルモンを産生し、分泌する。これらの細胞は、膵臓のクラスター内に存在する。膵島中には、５つの型の細胞が存在し、それは、ソマトスタトンを産生する、ベータ細胞、アルファ細胞、デルタ細胞と、ＰＰ細胞およびＤ１細胞である。
【００３３】
本発明は、通常、ヒトおよび他の哺乳動物の膵臓からの、ランゲルハンス島の単離の後に捨てられる、外分泌画分を使用する。特定の実施様態において、膵臓外分泌細胞は、成
体、出産後または出産前膵臓から由来する。特定の実施様態において、再分化外分泌膵臓細胞を、異なる種内への移植のために使用する。他の実施様態において、再分化外分泌細胞を、同一の種の異なる個体への移植のために使用する。また他の実施様態細胞において、外分泌膵臓細胞を、個体より得、再分化外分泌細胞を、同一の個体への移植のために使用する。脱分化細胞を、１４日間までのより長い期間、培養中に維持可能である。あるいは、脱分化細胞を、凍結し、保存する。
【００３４】
本発明は、ＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）へ結合し、下流経路を活性化する、ＥＧＦ（上皮増殖因子）の使用に関する。したがって、ＥＧＦレセプターに結合し、活性化する活性を維持する、ＥＧＦの短化または変異形態を、本発明の方法のための変法として使用可能である。同様の文脈で、膵臓細胞を単離した種とは異なる、他の動物種からのＥＧＦのようなリガンドを、レセプターに結合し、活性化するならば、使用可能である。これらの目的のために、１つの種からのそのようなリガンドの配列を、他の種から得た細胞集団上での望む結合および活性化特性を獲得するために、改変可能である。ｉｎ ｖｉｖｏの目的のために、非ヒト哺乳動物からのリガンドを、ヒト内で活性を獲得するため、およびヒト免疫システムによる免疫応答を避けるために、「ヒト化」可能である。同様に、ＥＧＦＲに対するリガンドである、他の天然に存在する、または改変タンパク質を、本発明の方法のために使用可能である。これらの例は、形質転換増殖因子−アルファ、アンフィレグリン、ベータセルリンおよびＰｏｘＶｉｒｕｓ増殖因子がある。
【００３５】
本発明は、ｇｐ１３０レセプターに結合し、下流経路を活性化する、ＬＩＦ（白血病阻害因子）の使用に関する。ＬＩＦは、膵臓発達における機能は現在までに記述されていない、多面性サイトカインである。幹細胞増殖および分化のよく知られている調節物であり、胚幹細胞の分化を防止するために広く使用されている。ｇｐ１３０レセプターに結合し、活性化する能力を保持する、ＬＩＦの短化または変異形態を、本発明の方法のための変法として、使用可能である。同様に、ｇｐ１３０に対するリガンドであり、下流経路を活性化する、他の天然に存在する、または改変タンパク質を、本発明の方法のために使用可能である。その例には、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＯＳＭ（オンコスタチンＭ）、ＣＮＴＦ（Ｃｉｌｉａｒｔ 神経栄養因子）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球−コロニー刺激因子）、ＣＴ−１（カルディオトロフィン−１）、ＩＬ−１２およびレプチンがある。
【００３６】
ＬＩＦに対する齧歯類（マウス、ラット）と霊長類（ヒト、サル）細胞の挙動の違いが、ヒトＥＳ細胞とＭＡＰＣ細胞に関して記述されている［Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．前掲］。１つの実施様態にしたがって、ヒト脱分化膵臓細胞を、ＥＧＦレセプターに対するリガンド（たとえば、ＥＧＦ）およびｇｐ１３０レセプターに対するリガンド（たとえばＬＩＦ）を含む組成物中でインキュベートする。ヒト細胞を使用する特定の実施様態において、ＬＩＦは任意である。
【００３７】
再分化のために、本発明の方法にて使用する、ＥＧＦ、ＬＩＦおよび他の化合物は、同一の種からでありえ、また、化合物がそのレセプターに結合し、レセプターを活性化する限り、他の種からでもあり得る。したがって、一般的に、本発明は、第二の哺乳動物のｇｐ１３０レセプター経路のリガンド、および／または第三の哺乳動物のＥＧＦレセプター経路のリガンドを加えることによる、第一の哺乳動物の細胞の再分化に関し、各第一、第二および第三の哺乳動物は、独立して、限定はしないが、ヒト、霊長類および非霊長類サル、ハムスター、マウスおよびラットのような齧歯類、ウサギ、ヤギ、ウシおよび他の畜牛、イヌおよびブタからなる、哺乳動物の群より選択される。
【００３８】
１つの実施様態において、本発明は、成熟インスリン産出細胞の特徴的な形態、または未熟、脱分化、または胚細胞の特徴的な形態である、個々の細胞、または細胞集団における特性を決定することに関する。外分泌腺房細胞が、上清培養のたった４日以内に、大い
にその表現系を変化させることが、先に示されている（Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）＆（２００１）、前掲）。これらは、膵臓トリプシノーゲン、トリプシンおよびリパーゼのような、アミラーゼおよび他のチモーゲンを欠き、導管マーカーＣＫ２０の発現を開始する。Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックスにおいて、これらは、導管と似ている嚢胞性構造を形成するが、上清培養中に残っている場合に、脱分化し、Ｐｄｘ−１およびＰｔｆ１−ｐ４８転写因子、神経外分泌マーカーＰＧＰ９．５、およびＣＣＫＢガストリンレセプターの組み合わせのような、胚マーカーを発現する傾向にある［Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ
ａｌ．（２０００）＆（２００１）、前掲］。これらのマーカーは別として、分化および脱分化細胞に関する他のマーカーが、当業者に公知であり、細胞または細胞集団の分化の程度を評価するために使用可能である。
【００３９】
本発明は、再分化細胞集団または個々の細胞が、未分化または胚細胞に典型的な特定の特徴を持つことを示す。インスリン産生している再分化細胞のいくつかは、２つの核（二核）およびＣＫ２０免疫応答性の発生のような、同様の細胞特性を維持している。したがって、本発明は、一方で、再分化細胞および再分化細胞を含む細胞集団を、他方で、成熟細胞および成熟細胞を含む細胞集団を見分けるマーカーおよび方法を防ぐ。
【００４０】
本発明の１つの実施様態において、由来した脱分化細胞を、低血清濃度（１％ ＦＢＳ）の存在下で、プラスチックに結合させた単層として培養した。多くの他の条件を、上清培養の使用、ウシ血清以外の他の動物の血清の使用、ＲＰＭＩ−１６４０以外の他の基礎培地の使用、およびグルコース濃度の変更のような、哺乳動物の脱分化細胞の培養のために同定可能である。
【００４１】
本発明は、ベータ−細胞新生が、培地中の２つの可溶性因子の組み合わせ、すなわちＥＧＦとＬＩＦによって、齧歯類、とりわけラットのような、特定の動物で誘導可能である、短期間培養モデルを含む。これは、正常外分泌を、内分泌細胞に表現系スイッチすることを記した、腺房島変換分化の、初めてのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究である。
【００４２】
本発明の１つの実施様態は、再分化インスリン分泌膵臓細胞を含む、哺乳動物細胞の集団を含む、医薬組成物に関する。細胞集団に加えて、前記組成物は通常、当業者によく知られており、たとえば、コラーゲンまたはゼラチンのようなタンパク質、デンプン、ポリサッカライド、糖（デキストロース、グルコースおよびスクロース）のような炭水化物、ナトリウムまたはカルシウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体、プレゼラチン化デンプン、ペクチン寒天、カラゲナン、泥、親水性ガム（アカシアガム、グアーガム、アラビアガムおよびキサンタンガム）、アルギニン酸、アルギニン酸塩、ヒアルロン酸、ポリグリコール酸およびポリ乳酸、デキストラン、ペクチン、水溶性アクリルポリマーまたはポリビニルピロリドンのような合成ポリマー、プロテオグリカン、リン酸カルシウムなどから選択される、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体を含む。
【００４３】
本発明は、ＬＩＦの組み合わせのような、化合物の存在下で、脱分化外分泌細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ再分化を示している。他の実施様態において、細胞の再分化は、処置されるべき個体内で起こることが想定される。例として、脱分化細胞を、さらにたとえばＬＩＦおよびＲＧＦを含む、時間および濃度制御マトリックスを可能とする化合物を含む、生物分解性マトリックス内に埋め込み、これにより、脱分化外分泌膵臓細胞のｉｎ ｖｉｖｏ分化が可能にある。マトリックスの分解の後、分化細胞が放出される。特定の実施様態において、細胞をまず、制限された時間で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて分化誘導増殖因子で処理し、その後、さらにｉｎ ｖｉｖｏ分化のために、増殖因子の存在下で、移植する。したがって、他の態様において、本発明は、脱分化細胞と、細胞の分化のための化合物を含む医薬組成物に関する。
【００４４】
以下の実施例で本発明を説明するが、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
実験設定
動物：体重２５０〜３００ｇのオス１０〜１２週齢Ｗｉｓｔａｒラット（Ｊａｎｖｉｅｒ，Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を、膵臓からの細胞の単離のために使用した。体重２２〜２４ｇの８週齢オスＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌ−ｎｕＢＲヌードマウス（チャールス リバー ラボラトリー社（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，），Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を、移植のためのレシピエントとして使用した。全ての動物実験は、ブリュッセルのフリー大学（Ｆｒｅｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＥｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【００４６】
外分泌組織の単離：膵臓を、コラゲナーゼと共に、部分的に溶解させ、外分泌腺房を、すでに発行されているように（Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）＆（２００１）、前掲）、遠心希釈によって精製した。
【００４７】
培養手順：外分泌細胞を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ、ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）、ペニシリン（７５ｍｇ／ｌ）（コンチネンタル ファーマ（Ｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａ）、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ），Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）を含むＲＰＭＩ−１６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ培地中の懸濁培養中で、細菌学ペトリディッシュ（ヌンク（Ｎｕｎｃ）、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，Ｉｌｌ，ＵＳＡ）内で、４日間、前培養し、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ Ｓｕｌｐｈａｔｅ（５０μｇ／ｍｌ）（シグマ）を使用して、培養液から繊維芽細胞を禁止した。培地をこの前培養機関の間、毎日取り替えた。単離後第４日目に、細胞を、２４−ウェルプレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、ＢＤバイオサイエンセス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）上、１０００μｌ−分液中に分配した。この手順を、１ウェルあたりおよそ７５ｎｇ ＤＮＡを得るために標準化した。いくつかの実験では、細胞を、プレーティング前に、１０分間、１０ｍＭ アロキサンで処置した。一晩の培養後、非接着細胞を洗浄して除去し、ついで、対照培地または増殖因子含有培地をウェルに加えた。対照培地は、１％ ＦＢＳおよび抗生物質（ストレプトマイシン ０．１ｇ／ｌおよびペニシリン ０．０７５ｇ／ｌ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地からなる。増殖因子培地は、５０ｎｇ／ｍｌ ヒト組換え体上皮増殖因子（ＥＧＦ）（シグマ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および４０ｎｇ／ｍｌ 組換え体マウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）（シグマ）を含む、対照培地からなる。細胞単層を、後者の培地中３日間の培養期間後に、解析した。
【００４８】
免疫細胞組織学およびＤＮＡ測定；ウェルあたりの細胞の数を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８色素の結合に基づく、ＤＮＡ蛍光アッセイによって測定した［Ｌｏｏｎｔｉｅｎｓ
ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（１９９０）２９、９０２９−９０３９］。少なくとも６ウェルを、１実験条件あたりで使用し、三重培養を、ＤＮＡ−抽出のために使用し、平衡して、細胞組成の免疫細胞化学解析のために使用可能である。単層の免疫細胞化学染色を、２４−ウェルプレート中で直接実施した。この目的のために、細胞単層を、４％緩衝ホルムアルデヒドにて１０分間固定し、続いて、細胞透過性のために、２０分間、メタノール（−２０℃）で処理した。１つの抗原の単独染色のために、ストレプトアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ法を使用した［Ｂｏｕｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．（１９９４）４３，１２７９−１２８３、Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆ Ｄｅ Ｂｌａｙ Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．（１９９６）４４，９４７−９５１］。二重染色のために、ＦＩＴＣ−およびＴＲＩＴＣ−標識台に抗体での、間接法を使用
した（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）。この研究で使用した第一抗体は、ポリクローナル抗−インスリン（Ｃ．Ｖａｎ Ｓｃｈｒａｖｅｎｄｉｊｋ，ＶＵＢ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ）［Ｂｏｕｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、前掲、Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆ Ｄｅ Ｂｌａｙ、前掲］、ポリクローナル抗−ラットＣ−ペプチド−Ｉ（Ｏ．Ｄ．Ｍａｄｓｅｎ，Ｈａｇｅｄｏｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｅｎｔｏｆｔｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ［Ｂｌｕｍｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９９２）６，２９９−３０７］、ポリクロナール抗−Ｐｄｘ１（Ｏ．Ｄ．Ｍａｄｓｅｎ）［Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）前掲］、ポリクローナル抗−Ｇｌｕｔ−２（Ｗａｋ−Ｃｈｅｍｉｅ，Ｂａｄ Ｓｏｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、モノクローナル抗−サイトケラチン−２０（ＣＫ２０）（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ−ｕｐｏｎ−Ｔｙｎｅ，ＵＫ）（Ｂｏｕｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）前掲、Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆ Ｄｅ Ｂｌａｙ、前掲）、ポリクローナル抗−アルファ−アミラーゼ（シグマ）、およびマウスモノクローナル抗−ＢｒｄＵ（ＩＣＮ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）である。増殖細胞による５’−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを査定するために、１０μＭ ＢｒｄＵ（シグマ）を、固定の１時間前に、培養培地に加えた（Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）前掲）。ＢｒｄＵパルス−追跡標識のために、ＢｒｄＵを、接着細胞培養の第一日目に、培養培地に加え、２４時間後に取り除いた。細胞を、パルスの２４時間後、および細胞培養の３日目、すなわちＢｒｄＵの存在しない状態での４８時間追跡後に、解析した。ＢｒｄＵ取り込みを、インスリン−発現細胞中、およびサイトケラチン−発現細胞中両方でスコア化した。
【００４９】
ＲＴ−ＰＣＲ解析：全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ ＲＮＡ単離法（インビトロジェン ライフ テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ラット膵臓細胞の単層細胞培養から抽出した。ｎｏｔｃｈ−１およびグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼをコードしている転写物の半定量的解析のために、製造業者（インビトロジェン ライフ テクノロジーズ）によって記述されたように、全ＲＮＡを逆転写し、増幅した。ＰＣＲ産物を、１．５〜２．５％ アガロースゲル中での電気泳動によって分離し、臭化エチジウム染色によって視覚化した。解析を、少なくとも３回実施した。
【００５０】
形態計測：コンピュータ−補助形態計測［Ｂｏｕｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）前掲］を使用して、２４−ウェルプレート中の単層の面積を測定した。
【００５１】
インスリン測定：細胞インスリン含量および培地中に放出されたインスリンを、放射−免疫アッセイによって測定した［Ｐｉｐｅｌｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．前掲］。グルコース−刺激インスリン放出を研究するために、培養培地中のインスリンを、２．５ｍＭ グルコースを含む基礎培地中での４時間のインキュベーション、続いて２０ｍＭ グルコース中の４時間インキュベーション後に測定した（血清およびグルコースを含まないＨＡＭ−１０培地、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））［Ｌｏｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００２）５１，２９８２−２９８８］。
【００５２】
移植：単層細胞を移植するために、これらを、子牛皮膚からのコラーゲンＳ（Ｉ型、ロッシュ モレキュラー バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で培養し、コラゲナーゼＰ（ロッシュ モレキュラー バイオケミカルズ）で脱離させた。細胞ペレットを、移植３時間前に、７０ｍｇ／ｋｇアロキサンを静脈内に注射した、ヌードマウスの肝臓カプセル（１７）下で移植した。血液グルコースレベルを、Ｇｌｕｃｏｃａｒｄ Ｍｅｍｏｒｙストリップ（Ａ．Ｍｅｎａｒｉｎｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂｅｎｅｌｕｘ，Ｚａｖｅｎｔｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いることによって、給餌マウスの尾錠脈から得た試料中で、２日ごとにモニタした。
【００５３】
統計：両側対ステューデントｔ−検定を使用し、信頼区間＜０．０５で、統計学的有意と判断した。平均値を±ＳＥＭで示す。独立した実験の繰り返しを、ｎ＝ｘ（ｎは、繰り返し数）として示し、それぞれの細胞調製物は、合計５匹のラットからのプールである。
【実施例２】
【００５４】
外分泌細胞単層の産出と組成
単離および前培養外分泌腺房細胞凝集体を、先に記述されたようにして得（Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）＆（２００１）、前掲）、続いて、これらの細胞をプラスチック上で単層を形成させた。９０％を超える細胞が、導管マーカーＣＫ２０に対して免疫応答性であり、腺房細胞のアミラーゼマーカーを失っていた。（これらの細胞のうち、７９．０±０．４％（ｎ＝７）は二核化しており、これは腺房細胞の部分の特徴である）。これらの培養は最初、３．７±０．４６％（ｎ＝７）のインスリン−陽性細胞を含んでいた。細胞調製物を、単層形成の前に、アロキサンで前処理した場合、単層は、０．５％未満のインスリン−陽性細胞を含んだ。ゲニチシンを培養の間に使用した場合、繊維芽細胞の生産物は阻害された。
【００５５】
発行されたデータによって、外分泌腺房細胞が、上清培養の４日以内に、アミラーゼや他のチモーゲンのような、その分化特性を欠き、ＣＫ２０、Ｐｄｘ−１とＰｔｆ１−ｐ４８転写因子の組み合わせ、神経内分泌マーカーＰＧＰ９．５およびＣＣＫＢガストリンレセプターのような、腺房細胞および胚特性を発現し始める（Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ，（２０００）＆（２００１）、前掲、Ｌａｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．４４４，６１−６５）。デキサメタゾンの存在下で、これらの細胞が、肝細胞様細胞に変換分化可能であることが示された［Ｌａｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３９，１４９９−１５０７］。本研究のために、これらの細胞を、低血清濃度（１％ＦＢＳ）の存在下で、プラスチックに接着した単層として培養し、ＬＩＦとＥＧＦの組み合わせの効果に関して試験した。これらの因子は、成体および胚神経幹細胞の分化を制御することが知られている（Ｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，３３８５−３３９３）。
【実施例３】
【００５６】
細胞数とベータ−細胞頻度における増殖因子の効果
単層培養を、ＬＩＦとＥＧＦで、３日間処理すると、培養の開始および両方の増殖因子のない状態での培養と比較して、ＤＮＡ含量の有意な増加が観察された（図１Ａ）。形態計測によって測定された、細胞に覆われている総表面は、同程度の増加を示した。
【００５７】
ＬＩＦとＥＧＦでの処理はまた、インスリン−陽性細胞の頻度の、有意な増加を誘導した。全ての細胞のパーセンテージとして示す（図１Ｂ）。インスリン−陽性細胞の頻度を、総ＤＮＡ含量で掛け合わせ、絶対ベータ−細胞数の測定を行った場合、ベータ−細胞数の１１倍の増加が、３日間の培養期間にわたり、ＬＩＦおよびＥＧＦの存在下で観察された（図１ｃ）。総細胞インスリン含量の、放射免疫アッセイでの解析によって、対照培養と比較して、ＬＩＦおよびＥＧＦ処置培養において、６倍の増加が示された。
【００５８】
ＬＩＦまたはＥＧＦいずれかのみの存在下でも、ベータ−細胞数の有意な増加があり、開始物質と比較して、それぞれ６倍および５倍であるが、これらの増加は、両方の因子が一緒に存在する場合よりも、有意に低かった。
【００５９】
ＬＩＦおよびＥＧＦの存在下での培養３日後、ベータ−細胞の汚染を枯渇させた、アロキサン前処理培養において、９．２±１．５％インスリン−陽性細胞が見られた（ｎ＝４）。増殖因子のない場合、０．４±０．１％のインスリン−陽性細胞が存在した。両方の
因子の組み合わせで見られた、インスリン−陽性細胞のアップレギュレーションは、ＥＧＦまたはＬＩＦいずれかのみを与えた場合には観察されなかった。
【００６０】
本発明の方法にしたがってえられる細胞集団を、さらに、たとえば欧州特許第１１４６１１７号で示されたように、ＦＡＣＳソーティング、サイズ分画および溶出のような方法によって、インスリン分泌細胞に関して濃縮可能である。
【００６１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＥＧＦまたはＬＩＦのみはまた、ベータ細胞の数に効果を持つ。このことは、これらの因子がまた、培養細胞によって産出され、パラクラインまたはオートクライン様式で働きうる、という観察（未発表観察）によって説明可能である。本発明において、ＬＩＦがベータ細胞より産生されることが示され、したがって、ベータ細胞が、前駆体細胞からのその独自の再生を刺激可能であることが示唆されている。ベータ細胞はまた、たとえばネトリン［Ｄｅ Ｂｒｅｕｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（２００３）４６，９２６−９３３］および血管上皮増殖因子［Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．７６，２２５−２３２］のような、膵島新生を調節可能な他の因子も産出する。これらの観察によって、なぜ、毒性または自己免疫損傷に続く「自発的」膵島新生が、制限されるのかが説明されうる。
【００６２】
分化外分泌細胞の本モデルにおいて、ＬＩＦとＥＧＦとの組み合わせが、全ＤＮＡにおける有意な増加、および単層によって占領された広い面積によって明らかなように、細胞増殖を刺激することがわかった。ＬＩＦとＥＧＦとの組み合わせはまた、インスリン−陽性細胞パーセンテージのおよそ６倍の増加となった。観察されたＤＮＡの増加と共に、インスリン−含有細胞の数の１０倍以上の増加を与える。
【実施例４】
【００６３】
表現系解析
二重免疫蛍光染色による解析によって、これらのインスリン−陽性細胞のほとんどがまた、プロインスリンＣ−ペプチド−Ｉ、転写因子Ｐｄｘ−１、およびグルコーストランスポーターＧｌｕｔ−２を含む、他のベータ−細胞マーカーも発現することが示された。Ｃ−ペプチドに対する免疫応答性は、インスリン−免疫応答性細胞の頻度の増加の説明として、培地からの、インスリン取り込みの可能性を排除する（インスリンを培地に加えなかった）。
【００６４】
ＥＧＦ＋ＬＩＦ−処置培養中、およそ１０％のインスリン−陽性細胞が、ＣＫ２０に対して免疫応答性であり、インスリン−陰性細胞と比較して多少低い染色度であった。インスリンとＣＫ２０の共発現は、増殖因子を加えず、開始物質中で見られなかった場合に、対照培養中でほとんど観察されなかった。この共発現によって、外分泌からインスリン−陽性細胞への表現系転移が示唆されている。著しく、インスリンおよびＣＫ２０−二重−陽性細胞が、二核であると観察され得た。二核インスリン−陽性細胞は、対照培養中ではほとんど見られず、開始時点では存在しなかったが、ＥＧＦ＋ＬＩＦ−処置培養で高い頻度で見られ、そこでは、全てのインスリン−陽性細胞の、６．２±０．４７％（ｎ＝７）と計数された。本発明の外分泌細胞由来単層において、ほぼ８０％の細胞が二核であった。二核性が、腺房細胞外分泌細胞の基本特徴であるので［Ｒａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．前掲］、これらの観察は、外分泌細胞から、インスリン−陽性細胞への転換に関する、他の示唆である。本発明の方法を用いて得た再分化細胞は、全体として、しかしまたいくつかの個々の細胞として、集団が、完全に分化した細胞の、しかしまた、不完全に分化した胚または成体前駆体細胞の特徴を維持するという、際だつ特徴を持つ。これらの特徴は、本実施例および以下の実施例で例示されている。分化および未分化細胞の両方のマーカーを持つこの特徴によって、本発明によって得られた細胞と、膵臓、とりわけ成体の膵臓から新たに単離された細胞を見分けることが可能になる。
【００６５】
これらのインスリン−含有細胞の大部分が、インスリン−変換活性化転写因子Ｐｄｘ−１、ベータ−細胞特異的グルコーストランスポーターＧｌｕｔ−２、および未処理プロインスリンのＣ−ペプチド−Ｉ成分のような、ベータ細胞の他の表現系特徴を発現しているので、成熟ベータ−細胞として考えることができる。ＢｒｄＵ−標識ベータ−細胞は非常に少ないので、３日間の期間内での、観察されたその数の増加は、前駆体細胞の分化、または新生に起因すると考えられる。
【００６６】
外分泌細胞が、新しく形成されたベータ−細胞の前駆体細胞として利用されたことの２つの示唆が存在した。第一に、ＣＫ２０免疫応答性は、インスリン−陽性細胞の部分として考えられた。これ以前に、ＣＫ２０を含むベータ−細胞が、胎児［Ｂｏｕｗｅｎｓ ＆
ＤｅＢｌａｙ、前掲］、および新生が、導管−ライゲーションによって誘導される場合に、成体膵臓［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．前掲］にてのみ見られることが示された。したがって、ＣＫ２０発現は、ＣＫ２０−陽性外分泌細胞から、ベータ−細胞への変換に対する、良い示唆である。第二に、二核性が、インスリン−陽性細胞の部分で言及される。二核性は、腺房外分泌細胞の特徴であり、正常ラットベータ−細胞では観察されない［Ｒｏｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）、前掲］。これは、外分泌細胞のベータ細胞への変換の他の示唆である。二核ベータ細胞は、非常に小さなベータ−細胞有糸分裂活性（ＢｒｄＵ−取り込み）しかないので、細胞質分裂前に、細胞分裂が阻止されていることを示しうる。観察された増加の代わりに、ベータ細胞数の減少を導きうるけれども、ベータ細胞間の細胞融合は完全に除外不可能である。マイトマイシン−ｃとサイトカラシン−Ｂでの未発表の発見によって、インスリン−陽性細胞がまた、遅延細胞質分裂または開裂工程の種類によって、二核化（外分泌）細胞からえられうることが予想される。細胞質細胞開裂または収縮−分裂が、四倍体ハイブリッド細胞から間接的に示されたが、機構はいまだに特定されていない［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００３）４２２，８９７−９０１］。
【実施例５】
【００６７】
増殖
インスリン−陽性細胞中のＢｒｄＵ−取り込みの解析によって、０．１％以下のインスリン−陽性細胞が、１時間のパルスの後、ＢｒｄＵ−標識されたことが示された。このことによって、これらの細胞における二核化が、有糸分裂ベータ−細胞における停止核分裂の結果であること、またはベータ−細胞数の増加が、含有ベータ−細胞の増殖によるものでありうることは非常にあり得ないことになる。およそ１．５％の外分泌細胞が、ＢｒｄＵ標識された。
【００６８】
７２時間期間にわたるＢｒｄＵパルス−追跡実験（２４時間のパルス期間および４８時間の追跡）によって、追跡期間の間の、ＥＧＦおよびＬＩＦの存在下での、ＢｒｄＵ−標識ベータ−細胞の有意な増加が明らかになった（図２Ｂ）。この増加は、単に、増殖外分泌細胞の、非増殖ベータ−細胞の分化によって説明しうる。
【００６９】
マイトマイシン−Ｃ（増殖の阻害剤）およびサイトカラシン−Ｂ（細胞質分裂の阻害剤）での結果によって、二核細胞が、細胞周期を介さないで、単核化細胞（インスリンを発現している）に分裂可能であったことが示され、これは、一種の遅延細胞質分裂と開裂減少の存在を示唆している。
【実施例６】
【００７０】
成熟および胚マーカーのＰＣＲ解析
ＲＴ−ＰＣＲ解析によって、Ｎｏｔｃｈ発現が、対照−培地（８日目）中で培養した単層では存在しないこと、およびＮｏｔｃｈが、ＥＧＦおよびＬＩＦの存在下で、単層中で
アップレギュレートされたことが明らかにされた。Ｎｏｔｃｈは、ラット膵島には存在しない。
【実施例７】
【００７１】
インスリン分泌
インスリン分泌研究を、上記細胞培養条件下で、４時間にわたって実施した。２．５ｍＭ グルコース中でのその基礎分泌と比較して、２０ｍＭ グルコースによる刺激によって、分泌インスリンの４倍の増加が起こり、すなわち、２．３から９．５ｎｇ／ｍｌであった。
【実施例８】
【００７２】
移植
ＬＩＦおよびＥＧＦで処理した脱分化膵臓ラット細胞の脱離単層を、アロキサン−処理ヌードマウスに移植し、観察した。７０ｍｇ／ｋｇ アロキサンで処置したマウスは、恒久的に高血糖性のままであるか、または１週間以内に死亡する［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（１９９５）３８、１４０５−１４１１］。移植によって、１４日にわたり維持される、血中血糖の正常化となるが、移植片含有肝臓が除去されると、急速に高血糖に戻った（図３）。このことは、本発明にしたがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて、ＬＩＦおよびＥＧＦで得た再分化ベータ細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏで、血中血糖を制御可能であることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、本発明の実施様態にしたがって、ＥＧＦおよびＬＩＦの存在下で、これらの増殖因子のない状態と比較した、ＤＮＡの増加（Ａ）、％インスリン−陽性細胞（Ｂ）、ベータ−細胞数（Ｃ）および培養増殖の細胞インスリン含量（Ｄ）を示している（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１）。細胞を、ＥＧＦ＋ＬＩＦがない状態（中間）またはある状態（右）での３日間前に、培地中で５日間維持する（左）。
【図２】図２は、本発明にしたがって、対照培地対ＥＧＦおよびＬＩＦ両方で処置した培養での、アロキサンでの前処理後の、インスリン−陽性ベータ細胞の増加（Ａ）（ｎ＝４）、パルスおよび追跡期間の間の、ＥＧＦとＬＩＦの存在下での、ＢｒｄＵ−標識化インスリン陽性ベータ−細胞の数（Ｂ）（ｎ＝４）を示している（＊＊＝ｐ＜０．０１）。
【図３】図３は、本発明にしたがって、本発明のＥＧＦ＋ＬＩＦ再分化細胞を用いる、ｉｎ ｖｉｖｏ糖尿病マウスモデルを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の哺乳動物の脱分化外分泌膵臓細胞を含む集団から、インスリン産生ベータ細胞を生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、以下のステップ
−ａ）培養培地中の、脱分化外分泌膵臓細胞を含む集団を提供すること、
−ｂ）前記培養培地に、第二の哺乳動物のｇｐ１３０レセプターの１つまたはそれ以上のリガンドを加えること、および／または第三の哺乳動物のＥＧＦレセプターの１つまたはそれ以上のリガンドを加えること、
−ｃ）前記１以上のｇｐ１３０レセプターのリガンド、および／または前記１以上のＥＧＦレセプターのリガンドを含む、前記培養培地中で、前記脱分化外分泌膵臓細胞をインキュベートすること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ｇｐ１３０レセプターの前記リガンドが、前記ｇｐ１３０レセプターのヒトまたはヒト化リガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｇｐ１３０レセプターの前記リガンドが、ＬＩＦである、請求項３または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｇｐ１３０レセプターのリガンドが、ヒトまたはヒト化ＬＩＦである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＬＩＦを、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、前記培養培地に加える、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＧＦレセプターの前記リガンドが、前記ＥＧＦレセプターのヒトまたはヒト化リガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＧＦレセプターの前記リガンドが、ＥＧＦである、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＧＦレセプターの前記リガンドが、ヒトまたはヒト化ＥＧＦである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ＥＧＦを、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、前記培養培地に加える、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、さらに、ステップｂ）の間に、前記培養培地に、ｂＦＧＦを加えるステップを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ステップｂ）にて、ｇｐ１３０の１つまたはそれ以上の前記リガンド、および／または前記ＥＧＦの１つまたはそれ以上の前記リガンドを、１〜１００００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、前記培養培地に加える、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記培地が、ＫＧＦまたはガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドを含まない、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記インキュベーションステップを、５日未満の間、実施する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
脱分化外分泌膵臓細胞を含む前記集団が、導管細胞、腺房細胞および膵島細胞からなる
群より選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ステップａ）の前に、ベータ細胞から前記集団を枯渇させる予備ステップを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物細胞がラット細胞であり、前記ＥＧＦレセプターの１つまたはそれ以上のリガンドが、ヒトＥＧＦを含み、および／またはｇｐ１３０レセプターの前記１つまたはそれ以上のリガンドが、マウスＬＩＦを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の方法によって入手可能な、哺乳動物インスリン産生ベータ細胞を含む、哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項１９】
前記集団が、約５〜約１５パーセントのインスリン−陽性細胞を含む、請求項１８に記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２０】
１０％ウシ胎児血清を含む、ＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃にて、４時間、２０ｍＭ グルコースに曝露した後、前記細胞集団が、グルコースへの前記暴露の前のインスリン分泌と比較すると、インスリン分泌に関して、２倍以上の増加を示す、請求項１８または１９に記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２１】
１０％ウシ胎児血清を含む、ＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃にて、４時間、２０ｍＭ グルコースへ、前記集団を曝露した後に、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌのインスリン分泌を産出可能である、請求項１８または１９に記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２２】
前記細胞集団が、少なくとも１つの、分化ベータ細胞の特徴と、少なくとも１つの未分化ベータ細胞の特徴を、同一の個々の細胞内で持つ細胞を含む、哺乳動物インスリン産出ベータ細胞を含む、哺乳動物細胞の集団。
【請求項２３】
分化ベータ細胞の特徴が、インスリン分泌であり、未分化ベータ細胞の特徴が、ＣＫ２０発現および／または二核性である、請求項２２に記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２４】
請求項１〜１８のいずれかに記載の方法によって入手可能である、請求項２２または２３に記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２５】
前記細胞集団が、未分化または脱分化細胞のマーカーを持つ、細胞の第一の亜集団を含み、分化細胞のマーカーを持つ細胞の第二の亜集団を含む、哺乳動物インスリン産出ベータ細胞を含む哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２６】
前記分化細胞のマーカーが、Ｃ−ペプチド−Ｉ、Ｐｄｘ−１、Ｇｌｕｔ−２およびインスリンからなる群より選択される、請求項２５に記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２７】
脱分化または未分化細胞の前記マーカーが、サイトケラチン７、サイトケラチン１９、サイトケラチン２０、ガストリンに対するＣＣＫＢレセプター、ＰＧＰ９．５およびｎｏｔｃｈ−１レセプターの群から選択される、請求項２６に記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の方法によって入手可能である、請求項１８〜２７のいずれかに記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２９】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項１８〜２８のいずれかに記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項３０】
前記哺乳動物細胞が、ブタ細胞である、請求項１８〜２９のいずれかに記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項３１】
前記哺乳動物細胞が、ラット細胞である、請求項１８〜３０のいずれかに記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項３２】
治療的に活性な量の請求項１８〜３１のいずれかに記載の哺乳動物膵臓細胞集団と、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項３３】
医薬品の製造のための、請求項１８〜３１のいずれかに記載の哺乳動物膵臓細胞集団の使用。
【請求項３４】
前記医薬品を、１型または２型糖尿病の処置のために使用する、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
効果的な量の、請求項３２に記載の医薬組成物を、必要とする個体に投与するステップを含む、１型または２型糖尿病の処置のための方法。
【請求項３６】
医薬品の調製のための、ＥＧＦレセプターのヒトまたはヒト化リガンドと、ｇｐ１３０レセプターのヒトまたはヒト化リガンドの組み合わせの使用。
【請求項３７】
前記医薬品を、１型または２型糖尿病の処置のために使用する、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記ＥＧＦレセプターのヒトまたはヒト化リガンドが、ヒトＥＧＦであり、前記ｇｐ１３０レセプターのヒトまたはヒト化リガンドが、ヒトＬＩＦである、請求項３６または３７に記載の使用。
【請求項３９】
１型または２型糖尿病の処置のための、医薬品の調製のための、ｇｐ１３０レセプターのヒトまたはヒト化リガンドの使用。
【請求項４０】
ｇｐ１３０レセプターの前記ヒトまたはヒト化リガンドが、ＬＩＦである、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
脱分化哺乳動物膵臓細胞の再分化の程度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、前記哺乳動物膵臓細胞上の、以下の、
ａ）ＣＫ２０、ＣＫ７またはＣＫ１９の存在、
ｂ）二核細胞の発生、
ｃ）インスリン陽性細胞の存在、
ｄ）Ｃ−ペプチド、Ｐｄｘ−１およびＧｌｕｔ−２の存在、
ｅ）ガストリンＣＣＫＢレセプター、ＰＧＰ９．５およびｎｏｔｃｈ−１レセプターの存在、
からなる群から選択される１つまたはそれ以上のパラメータを決定するステップを含む、方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法によって同定可能である、請求項１８〜３１のいずれかに記載
の、哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項４３】
脱分化膵臓細胞から、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて、インスリン産生哺乳動物ベータ細胞を生成する方法であって、
−ｇｐ１３０レセプターのリガンドを含む培地中で、前記脱分化膵臓細胞をインキュベートすることを含む方法。
【請求項４４】
前記培地がさらに、ＥＧＦレセプターのリガンドを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項１】
第一の哺乳動物の脱分化外分泌膵臓細胞を含む集団から、インスリン産生ベータ細胞を生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、以下のステップ
−ａ）培養培地中の、脱分化外分泌膵臓細胞を含む集団を提供すること、
−ｂ）前記培養培地に、第二の哺乳動物のｇｐ１３０レセプターの１つまたはそれ以上のリガンドを加えること、および／または第三の哺乳動物のＥＧＦレセプターの１つまたはそれ以上のリガンドを加えること、
−ｃ）前記１以上のｇｐ１３０レセプターのリガンド、および／または前記１以上のＥＧＦレセプターのリガンドを含む、前記培養培地中で、前記脱分化外分泌膵臓細胞をインキュベートすること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ｇｐ１３０レセプターの前記リガンドが、前記ｇｐ１３０レセプターのヒトまたはヒト化リガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｇｐ１３０レセプターの前記リガンドが、ＬＩＦである、請求項３または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｇｐ１３０レセプターのリガンドが、ヒトまたはヒト化ＬＩＦである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＬＩＦを、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、前記培養培地に加える、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＧＦレセプターの前記リガンドが、前記ＥＧＦレセプターのヒトまたはヒト化リガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＧＦレセプターの前記リガンドが、ＥＧＦである、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＧＦレセプターの前記リガンドが、ヒトまたはヒト化ＥＧＦである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ＥＧＦを、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、前記培養培地に加える、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、さらに、ステップｂ）の間に、前記培養培地に、ｂＦＧＦを加えるステップを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ステップｂ）にて、ｇｐ１３０の１つまたはそれ以上の前記リガンド、および／または前記ＥＧＦの１つまたはそれ以上の前記リガンドを、１〜１００００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、前記培養培地に加える、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記培地が、ＫＧＦまたはガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドを含まない、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記インキュベーションステップを、５日未満の間、実施する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
脱分化外分泌膵臓細胞を含む前記集団が、導管細胞、腺房細胞および膵島細胞からなる
群より選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ステップａ）の前に、ベータ細胞から前記集団を枯渇させる予備ステップを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物細胞がラット細胞であり、前記ＥＧＦレセプターの１つまたはそれ以上のリガンドが、ヒトＥＧＦを含み、および／またはｇｐ１３０レセプターの前記１つまたはそれ以上のリガンドが、マウスＬＩＦを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の方法によって入手可能な、哺乳動物インスリン産生ベータ細胞を含む、哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項１９】
前記集団が、約５〜約１５パーセントのインスリン−陽性細胞を含む、請求項１８に記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２０】
１０％ウシ胎児血清を含む、ＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃にて、４時間、２０ｍＭ グルコースに曝露した後、前記細胞集団が、グルコースへの前記暴露の前のインスリン分泌と比較すると、インスリン分泌に関して、２倍以上の増加を示す、請求項１８または１９に記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２１】
１０％ウシ胎児血清を含む、ＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃にて、４時間、２０ｍＭ グルコースへ、前記集団を曝露した後に、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌのインスリン分泌を産出可能である、請求項１８または１９に記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２２】
前記細胞集団が、少なくとも１つの、分化ベータ細胞の特徴と、少なくとも１つの未分化ベータ細胞の特徴を、同一の個々の細胞内で持つ細胞を含む、哺乳動物インスリン産出ベータ細胞を含む、哺乳動物細胞の集団。
【請求項２３】
分化ベータ細胞の特徴が、インスリン分泌であり、未分化ベータ細胞の特徴が、ＣＫ２０発現および／または二核性である、請求項２２に記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２４】
請求項１〜１８のいずれかに記載の方法によって入手可能である、請求項２２または２３に記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２５】
前記細胞集団が、未分化または脱分化細胞のマーカーを持つ、細胞の第一の亜集団を含み、分化細胞のマーカーを持つ細胞の第二の亜集団を含む、哺乳動物インスリン産出ベータ細胞を含む哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２６】
前記分化細胞のマーカーが、Ｃ−ペプチド−Ｉ、Ｐｄｘ−１、Ｇｌｕｔ−２およびインスリンからなる群より選択される、請求項２５に記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２７】
脱分化または未分化細胞の前記マーカーが、サイトケラチン７、サイトケラチン１９、サイトケラチン２０、ガストリンに対するＣＣＫＢレセプター、ＰＧＰ９．５およびｎｏｔｃｈ−１レセプターの群から選択される、請求項２６に記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の方法によって入手可能である、請求項１８〜２７のいずれかに記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項２９】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項１８〜２８のいずれかに記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項３０】
前記哺乳動物細胞が、ブタ細胞である、請求項１８〜２９のいずれかに記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項３１】
前記哺乳動物細胞が、ラット細胞である、請求項１８〜３０のいずれかに記載の哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項３２】
治療的に活性な量の請求項１８〜３１のいずれかに記載の哺乳動物膵臓細胞集団と、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項３３】
医薬品の製造のための、請求項１８〜３１のいずれかに記載の哺乳動物膵臓細胞集団の使用。
【請求項３４】
前記医薬品を、１型または２型糖尿病の処置のために使用する、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
効果的な量の、請求項３２に記載の医薬組成物を、必要とする個体に投与するステップを含む、１型または２型糖尿病の処置のための方法。
【請求項３６】
医薬品の調製のための、ＥＧＦレセプターのヒトまたはヒト化リガンドと、ｇｐ１３０レセプターのヒトまたはヒト化リガンドの組み合わせの使用。
【請求項３７】
前記医薬品を、１型または２型糖尿病の処置のために使用する、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記ＥＧＦレセプターのヒトまたはヒト化リガンドが、ヒトＥＧＦであり、前記ｇｐ１３０レセプターのヒトまたはヒト化リガンドが、ヒトＬＩＦである、請求項３６または３７に記載の使用。
【請求項３９】
１型または２型糖尿病の処置のための、医薬品の調製のための、ｇｐ１３０レセプターのヒトまたはヒト化リガンドの使用。
【請求項４０】
ｇｐ１３０レセプターの前記ヒトまたはヒト化リガンドが、ＬＩＦである、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
脱分化哺乳動物膵臓細胞の再分化の程度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、前記哺乳動物膵臓細胞上の、以下の、
ａ）ＣＫ２０、ＣＫ７またはＣＫ１９の存在、
ｂ）二核細胞の発生、
ｃ）インスリン陽性細胞の存在、
ｄ）Ｃ−ペプチド、Ｐｄｘ−１およびＧｌｕｔ−２の存在、
ｅ）ガストリンＣＣＫＢレセプター、ＰＧＰ９．５およびｎｏｔｃｈ−１レセプターの存在、
からなる群から選択される１つまたはそれ以上のパラメータを決定するステップを含む、方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法によって同定可能である、請求項１８〜３１のいずれかに記載
の、哺乳動物膵臓細胞の集団。
【請求項４３】
脱分化膵臓細胞から、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて、インスリン産生哺乳動物ベータ細胞を生成する方法であって、
−ｇｐ１３０レセプターのリガンドを含む培地中で、前記脱分化膵臓細胞をインキュベートすることを含む方法。
【請求項４４】
前記培地がさらに、ＥＧＦレセプターのリガンドを含む、請求項４４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５２０１９４（Ｐ２００７−５２０１９４Ａ）
【公表日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１５５６５（Ｐ２００６−５１５５６５）
【出願日】平成１６年６月２１日（２００４．６．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＢＥ２００４／００００８９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１３５１２
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５９６０９９５６１）
【氏名又は名称原語表記】ＶＲＩＪＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＩＴ ＢＲＵＳＳＥＬ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２１日（２００４．６．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＢＥ２００４／００００８９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１３５１２
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５９６０９９５６１）
【氏名又は名称原語表記】ＶＲＩＪＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＩＴ ＢＲＵＳＳＥＬ
【Ｆターム（参考）】
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